CN116601298A - 转化用质粒、使用该质粒制备转化体的方法和转化方法 - Google Patents

转化用质粒、使用该质粒制备转化体的方法和转化方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116601298A
CN116601298A CN202180082161.8A CN202180082161A CN116601298A CN 116601298 A CN116601298 A CN 116601298A CN 202180082161 A CN202180082161 A CN 202180082161A CN 116601298 A CN116601298 A CN 116601298A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
plasmid
transformation
host
homologous recombination
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180082161.8A
Other languages
English (en)
Inventor
大西彻
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toyota Motor Corp
Original Assignee
Toyota Motor Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toyota Motor Corp filed Critical Toyota Motor Corp
Publication of CN116601298A publication Critical patent/CN116601298A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/102—Plasmid DNA for yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明旨在产生稳定的转化体，该转化体包含以简单有效的方式并入基因组中的目的基因。这样的转化体包含欲并入目的基因的位点、一对同源重组序列、一对核酸内切酶靶序列和反选择标志物。

Description

转化用质粒、使用该质粒制备转化体的方法和转化方法
技术领域
本发明涉及将目的基因导入宿主时使用的转化用质粒、使用该转化用质粒制备转化体的方法以及使用该转化用质粒的转化方法。
背景技术
通常，将目的基因从外部导入宿主细胞的技术称为转化或基因重组，并且将导入了目的基因的细胞称为转化体或重组体。通过利用转化技术有效地制备这样的转化体，例如，利用合成生物学技术，可以促进微生物代谢工程的加速和/或效率。这里，合成生物学技术是指迅速回到由生产宿主的设计、构建、评估和学习组成的循环的技术。特别地，在涉及使用酵母或原核宿主的合成生物学中，有效构建宿主，即有效产生重组酵母是重要的。
使用酵母作为宿主的转化大致分为涉及使用导入了目的基因的环状质粒的方法和涉及使用包含目的基因的线性载体的方法。使用环状质粒容易将目的基因导入酵母中，并且可以以大约10-2高效率产生经转化的酵母(非专利文献1)。另一方面，当使用线性载体将目的基因导入酵母时，有必要通过同源重组将目的基因并入基因组。因此，只能以大约10-6的效率产生经转化的酵母(非专利文献2)。
如上所述，使用环状质粒将目的基因导入酵母的方法是高效的。然而，在某些情况下，这样的环状质粒可能脱落，因此，不能产生稳定的重组酵母。另一方面，在使用线性载体将目的基因导入酵母的方法中，目的基因稳定地并入基因组中。然而，如上所述，不认为这种方法是高效的。
为了提高将目的基因导入基因组的效率，已知这样的技术，为将靶特异性核酸内切酶如归巢核酸内切酶的靶序列预先导入基因组中的预定导入位点，然后预先切割该位点处的双链(非专利文献2)。此外，还已知这样的技术，其不使用靶特异性核酸内切酶，而是使用例如CRISPR-Cas9或TALEN这样的能够切割任何给定核苷酸序列的技术来预先切割基因组中预定导入位点的双链(非专利文献3)。因此，可以通过预先在目的基因欲导入的位点处切割双链，将同源重组效率提高到约10-2至10-1。
然而，在这些提高目的基因导入效率的方法中，有必要预先将核酸内切酶靶序列导入基因组中的预定导入位点，或者有必要产生对应于靶位点的引导RNA等。因此，这些提高目的基因导入效率的方法是复杂的，并且除了产生含有目的基因的用于同源重组的DNA片段和随后使用所产生的DNA片段进行转化之外，还需要多个步骤。
此外，专利文献1公开了一种具有内含子的、包含选择标志物的质粒，所述内含子用端粒种子序列(telomere seed sequences)夹着归巢核酸内切酶识别序列而构成。在专利文献1中公开的质粒的情况下，由于归巢核酸内切酶的表达，可以将环状质粒转化为线性分子，并且由于末端的端粒种子序列而可以稳定存在。
此外，在原核细胞如大肠杆菌中，涉及使用质粒的转化效率非常高。然而，与酵母相比，通过使用环状或线性载体的经同源重组进行基因组修饰的效率非常低。为了提高同源重组的效率，制备预先导入有包含涉及λ噬菌体同源重组机制的红色重组酶(Redrecombinase)操纵子的质粒的大肠杆菌菌株，并将线性载体导入这种大肠杆菌菌株中的方法是标准技术(非专利文献4)。也将这种技术用于乳酸菌(Lactobacillus)或棒杆菌(Coryncbacterium)(非专利文献5和非专利文献6)。然而，根据这种技术，需要进行两次转换，并且不利的是，这使操作复杂化。
引用文献列表
专利文献
PTL 1：US 2016/0017344
非专利文献
NPL 1：Gietz,R.D.等人,"使用LiAc/SS载体DNA/PEG方法的高效酵母转化(High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method)"Nature Protocols,2,2007:31-34
NPL 2：Storici,F.等人,"酵母中的寡核苷酸有效地靶向修复染色体位点特异性双链断裂(Chromosomal site-specific double-strand breaks are efficientlytargeted for repair by oligonucleotides in yeast)"Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,100,2003:14994-14999
NPL 3：DiCarlo,J.E.等人,"使用CRISPR-Cas系统在酿酒酵母中进行基因组工程(Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems)"Nucleic Acids Res.,41,2013:4336-4343
NPL 4：Zhang,Y.等人,"在大肠杆菌中使用重组的DNA工程的新逻辑(A new logicfor DNA engineering using recombination in Escherichia coli)"Nature Genetics20,1998:123-128
NPL 5：Peng,Y.等人,"原噬菌体重组酶介导的在植物乳杆菌中的基因组工程(Prophage recombinases-mediated genome engineering in Lactobacillusplantarum)"Microb.Cell Fact.,14,2015:154
NPL 6：Huang,Y.等人,"使用RecET在谷氨酸棒杆菌ATCC14067中通过自身可切割盒进行重组(Recombineering using RecET in Corynebacterium glutamicum ATCC14067via a self-excisable cassette,"Sci.Rep.,7,2017:7916
发明概述
技术问题
然而，所有上述方法都存在问题，因为根据这些方法不能简单有效地产生目的基因并入基因组中的稳定转化体。在上述情况下，本发明的目的是提供一种转化用质粒、使用该质粒制备转化体的方法和转化方法，所述质粒能够简单有效地产生目的基因并入基因组中的稳定转化体。
解决问题的方案
解决上述问题的本发明包括以下内容。
(1)转化用质粒，所述质粒包含欲并入目的基因的位点、夹所述位点的一对同源重组序列、夹所述一对同源重组序列的一对核酸内切酶靶序列、和反选择标志物。
(2)根据(1)所述的转化用质粒，其进一步包含以可表达的方式特异性切割所述核酸内切酶靶序列的双链的靶特异性核酸内切酶基因。
(3)根据(2)所述的转化用质粒，其中所述靶特异性核酸内切酶基因是归巢核酸内切酶基因。
(4)根据(3)所述的转化用质粒，其中归巢核酸内切酶特异性识别所述核酸内切酶靶序列。
(5)根据(2)所述的转化用质粒，其进一步包含调节所述靶特异性核酸内切酶基因表达的诱导型启动子。
(6)根据上述(1)至(5)中任一项所述的转化用质粒，其包含并入所述位点的目的基因。
(7)一种制备转化体的方法，包括以下步骤：
将根据(6)的转化用质粒导入宿主中；和
选择转化体，其中包含在转化用质粒中的目的基因通过包含在转化用质粒中的同源重组序列并入宿主的基因组中，并且其中目的基因随后在宿主中表达，
其中所述反选择标志物发挥诱导宿主死亡的功能，所述宿主包含含有并入其中的目的基因的转化用质粒。
(8)一种转化方法，包括将根据(6)所述的转化用质粒导入宿主的步骤，其中包含在转化用质粒中的所述目的基因在所述宿主中表达，并且所述反选择标志物发挥诱导宿主死亡的功能，所述宿主包含含有并入其中的目的基因的转化用质粒。
(9)根据(8)所述的转化方法，其中所述目的基因通过包含在转化用质粒中的同源重组序列并入宿主的基因组中。
发明的有利效果
通过使用根据本发明的转化用质粒，反选择标志物发挥诱导宿主死亡的功能，在所述诱导死亡的宿主中，没有自转化用载体上切割出包含目的基因的区域。因此，可以有效地产生将目的基因并入宿主基因组中的转化体。
此外，根据本发明的制备转化体的方法利用根据本发明的转化用质粒。因此，所述方法通过反选择标志物发挥诱导宿主死亡的功能可以有效地制备将目的基因并入宿主基因组中的转化体，在所述诱导死亡的宿主中，没有自转化用载体上切割出包含目的基因的区域。
进一步地，本发明的转化方法利用根据本发明的转化用质粒。因此，本发明的转化方法通过反选择标志物发挥诱导宿主死亡的功能，在制备目的基因并入宿主基因组中的转化体时可以实现优异的转化效率，在所述诱导死亡的宿主中，没有自转化用载体上切割出包含目的基因的区域。
附图简述
[图1]图1是示意性显示根据本发明的转化用质粒的主要部分的配置图。
[图2]图2是示意性显示根据本发明的转化用质粒的一个配置实例的配置图。
[图3]图3是示意性显示使用根据本发明的转化用质粒将目的基因并入基因组中的机制的配置图。
[图4]图4是示意性显示实施例2中制备的转化用质粒的配置图
实施方案的描述
在下文中，将使用附图和实施例更详细地描述本发明。
如图1所示，根据本发明的转化用质粒包含欲并入目的基因的位点、将该位点夹在中间(间插有该位点)的一对同源重组序列、将所述一对同源重组序列夹在中间(间插有该一对同源重组序列)的一对核酸内切酶靶序列、和反选择标志物。换言之，以目的基因的有义链为参考，转化用质粒从5'-侧到3'-侧包含一个核酸内切酶靶序列(也可称为“第一核酸内切酶靶序列”)、一个同源重组序列(也可以称为“第一同源重组序列”)，欲并入目的基因的位点、另一同源重组序列(也可称为“第二同源重组序列”)和另一核酸内切酶靶序列(也可以称为“第二核酸内切酶靶序列”)。反选择标志物可以独立于欲并入目的基因的位点、夹有该位点的一对同源重组序列和夹有该一对同源重组序列的一对核酸内切酶靶序列而包含在转化用质粒中。
本文使用的术语“反选择标志物”是指例如在细胞中表达以诱导细胞死亡的基因，并且使用这种基因作为标志物。在这种情况下，包含反选择标志物的细胞在特定条件下表达反选择标志物基因时被诱导死亡。因此，在存在具有反选择标志物的细胞和不具有反选择标志物的细胞的情况下，可以选择在特定条件下生长的细胞为不具有选择标志物的细胞。
例如，反选择标志物可以是在特定条件下抑制基因表达时具有诱导细胞死亡功能的基因。当反选择标志物发挥作用时，反选择标志物基因的表达在特定条件下被抑制，并且诱导细胞死亡。因此，在存在具有反选择标志物的细胞和不具有反选择标志物的细胞的情况下，可以选择在特定条件下生长的细胞为不具有选择标志物的细胞。
当使用大肠杆菌宿主时，特别地，衍生自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的sacB基因可以用作反选择标志物。sacB基因产物，即果聚糖蔗糖酶，具有将蔗糖转化为果聚糖(levan)的活性。革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌，在周质层中积累果聚糖后被诱导死亡。因此，sacB基因可以用作反选择标志物。
反选择标志物的另一个例子是苯丙氨酰-tRNA合成酶α亚基(PheS)的变体。PheS变体掺入苯丙氨酸类似物，其为4-氯-D,L-苯丙氨酸。因此，表达PheS变体的细胞不能合成正常多肽。因为不能合成正常多肽，所以在4-氯-D,L-苯丙氨酸存在下，表达PheS变体的细胞被诱导死亡。如上所述，通过将氨基酸类似物导入生物合成的蛋白质分子中，其功能将被破坏，并且可以诱导细胞死亡。可以在这种方法中使用的变异基因可以用作反选择标志物。
反选择标志物的另一个例子是胸苷激酶基因。胸苷激酶基因将5-氟-2-脱氧尿苷(5FU)转化为毒性代谢产物5-氟脱氧尿苷-5'-单磷酸，并通过抑制胸苷酸合酶来抑制胸苷生物合成。因此，表达胸苷激酶基因的细胞在5FU存在下抑制胸苷生物合成时被诱导死亡。
此外，pSC101质粒的复制起点(RepA)的温度敏感变体基因可以用作反选择标志物。通过将携带包含这种温度敏感变体基因的质粒的细胞在超过37℃的温度培养，细胞的生长受到抑制。通过使用包含这种温度敏感变体基因的质粒转化细胞并在上述温度范围进行培养，可以选择性地生长脱落了质粒的细胞。
此外，毒素-抗毒素系统也可以用作反选择标志物。当表达抗毒素基因时，通常由表达毒素基因而诱导的细胞死亡得以抑制。因此，通过抑制抗毒素基因表达，可以使毒素基因表达所达到的效果明显，并且可以诱导细胞死亡。例如，通过设计靶向内源性抗毒素基因的反义RNA作为与抗毒素基因mRNA的一部分互补的核苷酸序列，并以条件特异性方式诱导反义RNA，可以抑制抗毒素基因翻译。结果，可以通过毒素基因的表达来诱导细胞死亡。
在转化用质粒中，“欲并入目的基因的位点”是欲并入包含目的基因的核酸片段的区域。因此，这种欲并入目的基因的位点不限于特定的核苷酸序列，并且可以是例如一个或多个限制性酶靶序列。此外，术语“目的基因”是指将被导入宿主基因组的核酸。因此，这种目的基因不限于编码特定蛋白质的核苷酸序列，并且包括由所有类型的核苷酸序列组成的核酸，例如编码siRNA等的核苷酸序列、调节转录产物的转录时期及其产生量的转录调节区例如启动子或增强子的核苷酸序列、以及编码转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)等的核苷酸序列。
此外，这种目的基因优选以可表达的方式并入上述位点中。可表达的方式是指，将目的基因连接到预定的启动子，然后将其并入到上述位点中，从而可以在宿主生物体中在该启动子的控制下表达目的基因。
此外，启动子和终止子，以及根据需要，顺式元件如增强子、剪接信号、多聚A添加信号、选择标志物、核糖体结合序列(SD序列)等可以与这样的目的基因连接。选择标志物的实例包括抗生素抗性基因，例如氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性转基因。
术语“一对同源重组序列”是指与宿主基因组中的某个区域具有同源性的一对核酸区域。所述一对同源重组序列各自与具有与同源重组序列同源的宿主基因组交叉，使得夹在该一对同源重组序列之间的目的基因可以被并入宿主基因组中。因此，这样的一对同源重组序列并不特别限于特定的核苷酸序列，例如可以是与宿主基因组中存在的特定基因的上游区域和下游区域具有高同源性的核苷酸序列。在这种情况下，如果在转化用质粒和宿主基因组之间发生同源重组，则从宿主基因组中删除该基因。因此，可以通过观察由该基因缺失引起的表型来确定同源重组的成功或失败。
例如，这样的一对同源重组序列可以是参与腺嘌呤生物合成途径的ADE1基因编码区上游的区域，以及该ADE1基因编码区下游的区域。在这种情况下，如果在一对同源重组序列和宿主基因组之间发生同源重组，则腺嘌呤的中间代谢产物5-氨基咪唑核糖核苷积累，并且由于该聚合的聚核糖基氨基咪唑使得转化体呈红色。因此，通过检测这种红色，可以确定在该一对同源重组序列和宿主基因组之间发生了同源重组。
在此，该一对同源重组序列与宿主基因组中的重组区具有高的序列同一性，以至于它们可以彼此同源重组(可以交叉)。可以使用常规的序列比较软件“blastn”等计算各区域的核苷酸序列之间的同一性。各区域的核苷酸序列可以具有60％或更多的同一性，并且序列同一性优选为80％或更多，更优选为90％或更多，特别优选为95％或更多，最优选为99％或更多。
更进一步地，该一对同源重组序列可以具有相同的长度，或者可以各自具有不同的长度。该一对同源重组序列的长度没有特别限制，只要长度足以进行可能的同源重组(可能的交叉)即可。该对同源重组序列中的每一序列的长度例如优选为0.1kb至3kb，更优选为0.5kb至3kb，特别优选为0.5kb至2kb。
另外，根据本发明的转化用质粒包含上述一对同源重组序列外侧(即，当将被该对同源重组序列夹在中间的目的基因被定义为内侧时，在上述该对同源重组序列的外侧)的核酸内切酶靶序列。术语“核酸内切酶靶序列”是指被核酸内切酶识别的核苷酸序列。
不特别限制核酸内切酶，它广义地指具有识别预定核苷酸序列和切割双链DNA的活性的酶。核酸内切酶的实例包括限制性酶、归巢核酸内切酶、Cas9核酸酶、大核酸酶(MN)、锌指核酸酶(ZFN)和转录激活样效应核酸酶(TALEN)。此外，术语“归巢核酸内切酶”既包括内含子编码的核酸内切酶(前缀为“I-”)，也包括intein中包括的核酸内切酶(前缀为“PI-”)。归巢核酸内切酶的更具体的例子包括I-Ceu I、I-Sce I、I-Onu I、PI-Psp I和PI-Sce I。此外，被这些具体核酸内切酶特异性识别的靶序列，即核酸内切酶靶序列是已知的，并且本领域技术人员可以合适地获得这样的核酸内切酶靶序列。
此外，如图2所示，根据本发明的转化用质粒可以包含诱导型启动子和核酸内切酶基因。对于核酸内切酶基因的表达，不仅可以使用诱导型启动子，还可以使用组成型表达启动子。
该核酸内切酶基因编码具有特异性识别上述一对核酸内切酶靶序列并切割双链的活性的酶。也就是说，核酸内切酶基因的实例包括限制性酶基因、归巢核酸内切酶酶基因、Cas9核酸酶基因、大核酸酶基因、锌指核酸酶基因和转录激活样效应核酸酶基因。
诱导型启动子是指具有在特定条件下诱导表达功能的启动子。诱导型启动子的实例包括但不特别限于在特定物质存在下诱导表达的启动子、在特定温度条件下诱导表达的启动子、以及响应于各种类型的应激而诱导表达的启动子。所用的启动子可以根据待转化的宿主进行充分选择。
诱导型启动子的实例包括半乳糖诱导型启动子如GAL1和GAL10，通过添加或去除四环素或其衍生物而诱导表达的Tet-on/Tet-off系统启动子，以及编码热休克蛋白(HSP)如HSP10、HSP60和HSP90的基因的启动子。此外，作为这样的诱导型启动子，还可以使用通过添加铜离子而激活的CUP1启动子。此外，当宿主是原核细胞如大肠杆菌时，诱导型启动子的实例包括用IPTG诱导表达的lac启动子、用冷休克诱导表达的cspA启动子和用阿拉伯糖诱导表达的araBAD启动子。
此外，控制核酸内切酶基因表达的方法不限于涉及使用启动子如诱导型启动子或组成型表达启动子的方法。例如，可以应用涉及使用DNA重组酶的方法。使用DNA重组酶开启和关闭基因表达的方法的一个例子可以是FLEx开关法(FLEX开关将通道视紫红质-2靶向多种细胞类型用于成像和远程线路映射(A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2toMultiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping)，Atasoy等人，The Journal of Neuroscience,28,7025-7030,2008)。根据FLEx开关法，由DNA重组酶引起改变启动子序列方向的重组，因此可以开启和关闭基因的表达。
另一方面，根据本发明的转化用质粒可以基于常规的、可获得的质粒来生产。这种质粒的实例包括YCp型大肠杆菌酵母穿梭载体，例如pRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112和pAUR123；YEp型大肠杆菌酵母穿梭载体，如pYES2和YEp13；YIp型大肠杆菌酵母穿梭载体，例如pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101和pAUR135；大肠杆菌衍生的质粒(例如，ColE型质粒，例如pBR322,pBR325,pUC18,pUC19,pUC118,pUC119,pTV118N,pTV119N,pBluescript,pHSG298,pHSG396,和pTrc99A；p15A型质粒，如pACYC177和pACYC184；以及pSC101型质粒，例如pMW118,pMW119,pMW218,和pMW219)；农杆菌衍生的质粒(例如pBI101)；以及枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)衍生的质粒(例如pUB110和pTP5)。
此外，根据本发明的转化用质粒可以进一步包含复制起点、自主复制序列(ARS)和着丝粒序列(CEN)。转化用质粒包含这些元件，使得其在被导入宿主细胞后能够稳定地复制。此外，根据本发明的转化用质粒可以包含选择标志物。不特别限制选择标志物，选择标志物的实例包括耐药性标志物基因和营养缺陷型标志物基因。转化用质粒包含这些选择标志物，从而可以有效地选择已导入了转化用质粒的宿主细胞。
通过使用如此配置的质粒进行转化，可以简单而有效地生产其中将目的基因并入基因组中的稳定转化体。为了产生转化体，首先，将目的基因并入欲并入该目的基因的位点(图1)。然后根据常规方法将包含目的基因的转化用质粒导入宿主细胞中。此后，如图3所示，一对核酸内切酶靶序列的双链被在诱导型启动子控制下表达的核酸内切酶切割，从而切割出包含夹在该对同源重组序列之间的目的基因的核酸片段。如此切割出的核酸片段中的该对同源重组序列与宿主基因组中的同源重组序列交叉，然后将目的基因并入基因组中。从而，可以产生基因组中并入有目的基因的稳定转化体。
在此，不特别限制将并入有目的基因的转化用质粒导入宿主细胞的方法，可以合适地采用常规方法，例如氯化钙法、感受细胞法、原生质体或球质体法(spheroplastmethod)或电脉冲法。当转化用质粒具有选择标志物时，可以使用选择标志物来选择已经导入转化用质粒的宿主细胞。
此外，为了允许在诱导型启动子的控制下表达核酸内切酶，根据诱导型启动基因的类型充分确定条件。当使用半乳糖诱导型启动子如GAL1或GAL10作为这样的诱导型启动子时，例如，将半乳糖添加到已导入转化用质粒的宿主细胞的培养中使用的培养基中，或者将宿主细胞转移到含半乳糖的培养基，然后进行培养，从而可以诱导核酸内切酶的表达。另一方面，当使用编码热休克蛋白(HSP)的基因的启动子作为这样的诱导型启动子时，在宿主细胞的培养过程中，在期望的时间将热休克应用于已导入转化用质粒的宿主细胞，从而可以在期望的时间诱导核酸内切酶的表达。
此外，在上述转化用质粒中，当一对同源重组序列与预定基因的上游区域和下游区域具有高同源性时，通过同源重组将包含目的基因的片段并入基因组中，同时从基因组中缺失预定基因。因此，通过观察由预定基因的缺失引起的表型，可以确定包含目的基因的核酸片段是否已并入基因组中。当使用ADE1基因作为这样的预定基因时，例如，如果将包含目的基因的核酸片段并入基因组中，则从基因组中缺失ADE1基因。结果，在宿主中积累5-氨基咪唑核糖核苷，并且由于聚合的聚核糖基氨基咪唑，转化体呈红色。因此，通过检测这种红色，可以确定包含目的基因的核酸片段已并入宿主的基因组中。
应当注意的是，在上述实例中，转化用质粒被配置为包含诱导型启动子和核酸内切酶基因，但是根据本发明的转化用质粒也可以被配置为不具有这样的诱导型启动子和核酸内切酶基因。在这种情况下，可以分开制备包含诱导型启动子和核酸内切酶基因的表达载体，并且可以将所述表达载体与本发明的转化用质粒一起导入宿主细胞中。即使在这种情况下，在已经导入了包含诱导型启动子和核酸内切酶基因的表达载体和具有目的基因的转化用质粒的宿主细胞中，核酸内切酶的基因在诱导型启动子的控制下表达，因此，如图3所示，可以切割出包含夹在一对同源重组序列之间的目的基因的核酸片段，并且可以产生基因组中并入有目的基因的转化体。在使用预先导入了诱导型启动子和核酸内切酶基因的宿主细胞的情况下，转化用质粒可以不包含诱导型启动子和核酸内切酶基因。
不特别限制本发明的利用转化用质粒的转化方法和制备转化体的方法，并且这些方法可以应用于所有类型的宿主细胞。宿主细胞的实例包括：真菌，例如丝状真菌和酵母；细菌如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌；植物细胞；以及动物细胞，包括哺乳动物细胞和昆虫细胞。不特别限制酵母的类型，其实例包括属于酵母属(Saccharomyces)的酵母、属于克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的酵母、属于念珠菌属(Candida)的酵母，属于毕赤酵母属(Pichia)的酵母、属于裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)的酵母和属于汉森努拉酵母属(Hansenula)的酵母。更具体地，上述方法可以应用于属于酵母属的酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴亚努斯酵母(Saccharomyces bayanus)或布拉酵母(Saccharomyces boulardii)。不特别限制细菌的类型，其实例包括属于芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、埃希氏菌属(Escherichia)、栖热菌属(Thermus)、根瘤菌属(Rhizobium)、乳球菌属(Lactococcus)和乳杆菌属(Lactobacillus)的细菌。
特别地，在根据本发明的使用转化用质粒的转化方法和制备转化体的方法中，转化用质粒包含反选择标志物。在反选择标志物表达后，目的基因保持未被切割出地并入在环状质粒中的宿主细胞可以被诱导死亡。如图1或图2所示，当使用根据本发明的转化用质粒时，存在目的基因可能未并入基因组DNA中的情况。目的基因可以存在于宿主细胞中的环状质粒的形式中。如果转化用质粒不包含反选择标志物，可以基于目的基因的表达或与目的基因一起导入的选择标志物来选择转化的细胞，也可以选择目的基因未并入基因组DNA中但以环状质粒的形式存在的细胞(假阳性细胞)。
当目的基因被核酸内切酶切割出时，如图3所示，转化用质粒变得线性化。因此，质粒不会被复制，并且随着细胞增殖而脱落。因此，当目的基因被核酸内切酶切割出时，可以基于目的基因的表达或与目的基因一起导入的选择标志物来选择阳性细胞，而不受反选择标志物的影响。
实施例
在下文中，将参照以下实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例并不旨在限制本发明的技术范围。
实施例1
方法
1.试验菌株
使用一种大肠杆菌菌株，即NEB Turbo感受态大肠杆菌(NEB)作为试验菌株。
2.制备待导入大肠杆菌基因组的载体
产生的载体是大肠杆菌-酵母穿梭载体pUC-tetR-P_tetA-SCEI-sacB-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA-sacB，其包含被四环素诱导的衍生自酿酒酵母的归巢核酸内切酶的I-SceI基因(SCEI)、反选择用的衍生自枯草芽孢杆菌的sacB基因(NCBI登录号:936413)、以及在I-SceI的两个识别序列之间插入有包含基因组导入用的同源重组序列的DNA片段而形成的序列(见图2)。pUC-tetR-P_tetA-SCEI-sacB-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA-sacB包含插入pUC19载体中的：衍生自转座子Tn10(NCBI登录号：AP000342)的Tet阻遏物基因(tetR)；与四环素可诱导的tetA启动子连接的SCEI基因；氨苄青霉素抗性基因；大肠杆菌MG1655菌株(NCBI登录号:NC_000913.3)的araB基因序列和araA基因序列作为基因组导入用的同源重组序列；GFP同源基因作为通过同源重组导入的基因(该基因不包含启动子序列等基因表达所需的序列，并且该基因本身不表达；NCBI登录号：MI085862)；包含大观霉素抗性基因的基因序列作为同源重组标志物基因(smR标志物；NCBI登录号：X12870)；和sacB基因(见图2)。该载体包含从另外制备的pRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA载体(参见下面的参考例1)中去除P_LtetO启动子、酵母自主复制序列(ARS)和着丝粒序列(CEN)产生的区域。应当注意的是，将araB、araA、GFP同源基因和smR标志物序列插入到两个归巢核酸内切酶I-SceI的切割识别序列之间的区域中，并且通过添加有在含四环素的培养基中诱导的tetA启动子的SCEI基因表达而可以切割出这样的区域。将在大肠杆菌细胞中切割出的片段通过同源重组导入基因组(参见图3)。
可以通过PCR扩增各DNA序列。为了将各DNA片段彼此连接，合成引物以具有DNA序列，从而与邻接其的DNA序列重叠约15bp(表1)。使用pRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA或合成的DNA序列作为模板，使用这些引物扩增目的DNA片段，并且使用InFusion HD克隆试剂盒等将DNA片段彼此连接以产生最终的目的载体。
[表1]
3.大肠杆菌基因组的同源重组方法及导入效率的验证
用pUC-tetR-P_tetA-SCEI-sacB-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA-sacB转化NEB Turbo感受态大肠杆菌，并在氨苄青霉素辅助下选择导入了质粒的菌落。随后，将导入了质粒的菌株接种于包含大观霉素(spectinomycin)和脱水四环素(50ng/ml)的LB培养基中以诱导归巢核酸内切酶，切割出位于归巢核酸酶I-SceI切割识别序列之间的DNA片段，并将与基因组DNA同源重组的菌落使用大观霉素标志物选择同源重组。此外，在包含10％蔗糖、大观霉素和脱水四环素(50ng/ml)的LB培养基中对所选择出的菌落进行反选择。众所周知，果聚糖蔗糖酶(Levansucrase)是一种用于反选择的sacB基因产物，它将蔗糖转化为果聚糖，果聚糖积聚在周质层中，然后诱导细胞死亡。在没有蔗糖的情况下，没有观察到致死性。因此，可以基于蔗糖的存在或不存在来移除包含sacB基因的载体。
对长出的菌落进行PCR，以扩增大肠杆菌基因组和通过同源重组并入的DNA片段之间的区域(如图3所示的引物组合A)，以及基因组两侧之间的区域，该区域夹着通过同源重组并入的DNA片段(如图3所示的引物组合B)。在使用引物组合B的情况下，扩增片段的长度随着导入的DNA片段的长度而增加，并且具有野生型长度的条带已经消失，则将通过两种PCR检测到扩增条带的菌落计数为基因组同源重组产生的菌落。在使用引物组合B的情况下，扩增片段的长度随着导入的DNA片段的长度而增加，并且检测到具有野生型长度的条带，则将通过两种PCR检测到扩增条带的菌落计数为非重组细胞污染的菌落。将选择性检测到具有野生型长度的条带的菌落计数为假阳性菌落。然后计算获得同源重组菌落的效率。表2显示了所使用的引物的序列。
[表2]
结果和讨论
在本实施例中，从已导入pUC-tetR-P_tetA-SCEI-sacB-Ec araB-GFP-SmR-EcaraA-sacB载体的菌株中选择40个在四环素诱导归巢核酸内切酶后保持大观霉素抗性的菌落。此外，使用sacB基因进行反选择，并在反选择之前和之后对菌落进行PCR，以检查同源重组效率(表3)。作为测试的结果，在反选择之前发现假阳性菌落的百分数超过50％。这表明归巢核酸内切酶I-SceI切割识别序列之间的DNA片段没有并入基因组DNA中，并且存在许多保留有转化用环状质粒的宿主细胞(被非重组细胞污染的菌落)。认为被非重组细胞污染的菌落是在菌落生长过程中逐渐发生的菌落同源重组的结果。因此，认为对基因组同源重组获得的细胞通过反选择进行浓缩的工序是消除非重组细胞污染的有效方法。
[表3]
参考例1
在参考例1中，描述了产生上述实施例中使用的pRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-EcaraB-GFP-SmR-Ec araA载体的方法。为了产生pRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA载体，首先产生pRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce载体。由上述产生的载体，随后产生pRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce载体。然后由pRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce载体产生pRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA载体。
<pRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce载体的产生>
制备YEp型酵母穿梭载体，即pRS436(SAT)-P_MET25-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce和pRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce，所述每个载体包含插入了以下的序列：在甲硫氨酸缺乏条件下或由半乳糖诱导的酿酒酵母衍生的归巢核酸内切酶I-SceI(SCEI基因；NCBI登录号：854590)和包含在一对I-SceI靶序列(核酸内切酶靶序列)之间的含有待导入基因组的一对同源重组序列的DNA片段。
pRS436(SAT)-P_MET25-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce中插入有添加了MET25启动子和CYC1终止子的SCEI基因(其中插入了COX5B基因的内含子的序列，并且其中根据酵母的核基因组中的密码子使用频率转换了全长的密码子的序列)，并将含有诺尔丝菌素(nourseothricin)抗性基因的基因序列(nat标志物)，作为基因组导入用的同源重组序列的、位于ADE1基因5’末端侧上游约1000bp区域中的基因序列(5U_ADE1)和位于ADE1基因3’末端侧下游约950bp区域中的DNA序列(3U_ADE1)，作为同源重组用的标志物基因的、包含添加有衍生自棉阿舒囊霉的TEF1启动子和TEF1终止子的G418抗性基因的基因序列(G418标志物)插入自pRS436GAP载体(NCBI登录号：AB304862)去除URA3基因、TDH3启动子和CYC1终止子而制备的载体中。
可以通过PCR扩增各DNA序列。为了将各DNA片段彼此连接，合成引物以具有DNA序列，从而与邻接其的DNA序列重叠约15bp(表4)。使用酿酒酵母OC-2菌株的基因组或合成的DNA序列作为模板，使用这些引物扩增目的DNA片段，并且使用In Fusion HD克隆试剂盒等将DNA片段彼此连接。将所得产物克隆入pRS436GAP载体以产生最终目的质粒。
在目的pRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce中，插入有添加了取代MET25启动子而使用GAL1启动子的SCEI基因。可以在含有半乳糖作为碳源的培养基中表达SCEI基因，并且切割出插入在I-SceI靶序列之间的序列。该载体是通过使用pRS436(SAT)-P_MET25-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce或酿酒酵母OC-2菌株的基因组作为模板扩增目的DNA片段(所用引物如表4所示)，然后使用In-Fusion HD克隆试剂盒等将DNA片段彼此连接而产生的。
[表4]
/>
/>
<pRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA载体的产生>
用于产生pRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA载体的pRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce载体是这样的载体，其中自上述pRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce载体去除2μM质粒来源的复制起点，取代之的是插入自主复制序列(ARS)和着丝粒序列(CEN)。载体在细胞中的拷贝数保持为一个拷贝数。
pRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA载体是包含插入了以下序列的大肠杆菌酵母穿梭载体：包含四环素诱导的衍生自酿酒酵母的归巢核酸内切酶的I-SceI基因(SCEI)和包含插入在I-SceI的两个识别序列之间的待导入基因组的同源重组序列的DNA片段。pRScen-tetR-P_LtetO-SCEI-Ec araB-GFP-SmR-Ec araA包含：衍生自转座子Tn10的Tet阻遏物基因(NCBI登录号：AP000342)(tetR)；与四环素诱导型LtetO-1启动子连接的SCEI基因(Lutz,R.和Bujard,H.,"通过LacR/O、TetR/O和AraC/I1-I2调节元件对大肠杆菌中转录单位的独立和严格调节(Independent and Tight Regulation ofTranscriptional Units in Escherichia Coli Via the LacR/O,the TetR/O and AraC/I1-I2 Regulatory Elements),"Nucleic Acids Research,25,1997:1203-1210)；氨苄青霉素抗性基因；待导入基因组的同源重组序列(即，大肠杆菌MG1655菌株的araB基因序列和araA基因序列(NCBI登录号：NC_000913.3))；待通过同源重组导入的GFP同源基因(该基因不包含基因表达所需的序列如启动子序列，并且该基因不表达；NCBI登录号：MI085862)；和包含大观霉素抗性基因(smR标志物；NCBI登录号：X12870)作为同源重组标志物基因的基因序列，插入酵母穿梭载体中。该酵母穿梭载体包含自单独制备的pRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce载体中去除GAL1启动子、CYC1终止子、ADE1 5'同源重组序列、G418标志物基因和ADE1 3'同源重组序列而得到的区域。
可以通过PCR扩增各DNA序列。为了将各DNA片段彼此连接，合成引物以具有DNA序列，从而与邻接其的DNA序列重叠约15bp(表5)。使用MG1655菌株的基因组、pRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce、TEF-Dasher GFP质粒(ATUM)或合成的DNA序列作为模板，使用这些引物扩增目的DNA片段，并且使用In Fusion HD克隆试剂盒等将DNA片段彼此连接以产生最终的目的载体。
[表5]
/>
/>
实施例2
方法
1.试验菌株
使用单倍体实验酵母：酿酒酵母BY4742作为试验酵母系。
2.制备待导入酵母基因组的载体
产生的载体是YCp型酵母穿梭载体pYC(TK-SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce，其包含被半乳糖诱导的衍生自酿酒酵母的归巢核酸内切酶的I-SceI(SCEI基因)、作为反选择标志物的胸苷激酶、以及在I-SceI的两个识别序列之间插入有包含基因组导入用的同源重组序列的DNA片段而形成的序列(见图4)。pYC(TK-SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce包含添加了GAL1启动子和CYC1终止子的SCEI基因(插入了COX5B基因的内含子并且根据酵母的核基因组的密码子使用频率转换了全长的密码子的序列)，添加了TPI1启动子和BNA4终止子的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶基因(其中已根据酵母核基因组的密码子使用频率转换了全长的密码子的序列；图4中的“TK”)，作为基因组导入用的同源重组序列的、位于ADE1基因5’末端侧上游约1000bp区域中的基因序列(5U_ADE1)和位于ADE1基因3’末端侧下游约950bp区域中的DNA序列(3U_ADE1)，作为同源重组用的标志物基因的、包含添加有衍生自棉阿舒囊霉的TEF1启动子和TEF1终止子的G418抗性基因的基因序列(G418标志物)。将5U_ADE1、3U_ADE1和G418标志物序列插入两个归巢核酸内切酶I-SceI识别序列之间的区域，并且在添加有于含有半乳糖作为碳源的培养基中诱导的GAL1启动子的SCEI基因的辅助下可以切割出包含该区域的区域。
可以通过PCR扩增各DNA序列。为了将各DNA片段彼此连接，合成引物以具有DNA序列，从而与邻接其的DNA序列重叠约15bp(表6)。使用pRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce(参见下面的参考例2)、酿酒酵母OC-2菌株的基因组或合成的DNA作为模板，使用这些引物扩增目的DNA片段，并且使用InFusion HD克隆试剂盒等将DNA片段彼此连接以产生目的质粒。
[表6]
3.酵母基因组的同源重组方法及导入效率的验证
使用产生的YC(TK-SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce载体转化酿酒酵母BY4742菌株，根据Akada等人的方法(Akada,R.等人，"升高的温度极大地改善了酵母中新鲜和冷冻感受态细胞的转化(Elevatedtemperature greatly improves transformation of fresh and frozen competentcells in yeast)"BioTechniques 28,2000:854-856)，在含有G418的YPD琼脂培养基中选择导入了质粒的菌落。所有生长的菌落都是白色菌落。随后，将导入了质粒的菌株接种于含有G418的YPGa琼脂培养基(碳源：半乳糖)，诱导归巢核酸内切酶表达，切割出归巢核酸内切酶I-SceI切割识别序列之间的DNA片段，借助G418选择出与基因组DNA同源重组的菌落，并且根据菌落的着色来计数ADE1基因破坏的菌株。ADE1基因是腺嘌呤生物合成途径的一个基因。在破坏了ADE1基因的菌株中，积累了腺嘌呤的中间代谢产物5-氨基咪唑核糖核苷，且与5-氨基咪唑聚合的聚核糖基氨基咪唑是呈红色的。因此，通过视觉观察可以容易地区分破坏了ADE1基因的菌株。此外，将白色菌落，即未破坏ADE1基因的菌株，接种于含有5-氟-2-脱氧尿苷(50微克/毫升)的SD培养基上，以检查生长。由于胸苷激酶基因将5FU转化为毒性代谢产物，具有胸苷激酶基因的细胞将在含有5FU的培养基中被诱导死亡。相反地，在缺乏5FU的情况下，具有胸苷激酶基因的细胞不会被诱导死亡。通过使这种细胞在含有5FU的培养基中生长，可以去除含有TK基因的质粒。
结果和讨论
从以pYC(TK-SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce载体作为质粒导入的菌株中，诱导归巢核酸内切酶表达，并检测同源重组到ADE1基因座的效率。结果表明，同源重组到ADE1基因座的效率高，并且也形成了假阳性的白色菌落，但是假阳性结果的频率低(表7)。将3个假阳性菌落转移到含有5FU的培养基中并选择。结果，2个菌落死亡。很可能这两个菌落不能通过反选择除去，因为其保留了质粒而没有通过同源重组从质粒中切割出来。剩下的一个菌落与ADE1以外的区域进行了非同源重组。基于上述结果，认为通过反选择浓缩由基因组同源重组产生的细胞的步骤是除去没有基因组重组的细胞污染的有效方法。
[表7]
参考例2
在参考例2中，描述了制备实施例中使用的pRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce的方法。pRS436cen(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce是一种这样的载体，其中从pRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce中删除了2μM质粒衍生的复制起点，且取而代之的是在其中插入了自主复制序列(ARS)和着丝粒序列(CEN)。该载体在细胞中的拷贝数保持为一个拷贝数。该载体是通过使用RS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce或酿酒酵母OC-2菌株的基因组作为模板(所用引物如表8所示)扩增目的DNA片段并使用In-Fusion试剂盒等将DNA片段彼此连接而产生的。
pRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce包含：添加了GAL1启动子和CYC1终止子的SCEI基因(插入了COX5B基因的内含子的序列，并且其中根据酵母的核基因组中的密码子使用频率转换了全长的密码子的序列)；含有诺尔丝菌素抗性基因的基因序列(nat标志物)；作为基因组导入用的同源重组序列的、位于ADE1基因5’末端侧上游约1000bp区域中的基因序列(5U_ADE1)和位于ADE1基因3’末端侧下游约950bp区域中的DNA序列(3U_ADE1)；和作为同源重组用的标志物基因的、包含添加有衍生自棉阿舒囊霉的TEF1启动子和TEF1终止子的G418抗性基因的基因序列(G418标志物)，其是将所述序列插入到通过从YEp型酵母穿梭载体pRS436GAP(NCBI登录号:AB304862)中去除URA3基因、TDH3启动子和CYC1终止子而制备的载体中。将5U_ADE1、3U_ADE1和G418标志物序列插入到2个归巢核酸内切酶I-SceI识别序列之间的区域中，并且这样的区域可以被添加到在含有半乳糖作为碳源的培养基中诱导的GAL1启动子的SECI基因切割出。
可以通过PCR扩增各DNA序列。为了将各DNA片段彼此连接，合成引物以具有DNA序列，从而与邻接其的DNA序列重叠约15bp(表8)。使用酿酒酵母OC-2菌株的基因组或合成的DNA作为模板，使用这些引物扩增目的DNA片段，并且使用In Fusion HD克隆试剂盒等将DNA片段彼此连接。将所得产物克隆到pRS436GAP载体中以产生最终的目的质粒。
[表8]
/>
/>

Claims (9)

1.转化用质粒，所述质粒包含欲并入目的基因的位点、夹所述位点的一对同源重组序列、夹所述一对同源重组序列的一对核酸内切酶靶序列、和反选择标志物。
2.根据权利要求1所述的转化用质粒，其进一步包含以可表达的方式特异性切割所述核酸内切酶靶序列的双链的靶特异性核酸内切酶基因。
3.根据权利要求2所述的转化用质粒，其中所述靶特异性核酸内切酶基因是归巢核酸内切酶基因。
4.根据权利要求3所述的转化用质粒，其中归巢核酸内切酶特异性识别所述核酸内切酶靶序列。
5.根据权利要求2所述的转化用质粒，其进一步包含调节所述靶特异性核酸内切酶基因表达的诱导型启动子。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的转化用质粒，其包含并入所述位点的目的基因。
7.一种制备转化体的方法，包括以下步骤：
将根据权利要求6的转化用质粒导入宿主中；和
选择转化体，其中包含在转化用质粒中的目的基因通过包含在转化用质粒中的同源重组序列并入宿主的基因组中，并且其中目的基因随后在宿主中表达，
其中所述反选择标志物发挥诱导宿主死亡的功能，所述宿主包含含有并入其中的目的基因的转化用质粒。
8.一种转化方法，包括将根据权利要求6所述的转化用质粒导入宿主的步骤，其中包含在转化用质粒中的所述目的基因在所述宿主中表达，并且所述反选择标志物发挥诱导宿主死亡的功能，所述宿主包含含有并入其中的目的基因的转化用质粒。
9.根据权利要求8所述的转化方法，其中所述目的基因通过包含在转化用质粒中的同源重组序列并入宿主的基因组中。
CN202180082161.8A 2020-12-23 2021-12-21 转化用质粒、使用该质粒制备转化体的方法和转化方法 Pending CN116601298A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020-213177 2020-12-23
JP2020213177A JP2022099419A (ja) 2020-12-23 2020-12-23 形質転換用プラスミド及びこれを用いた形質転換体の製造方法、並びに形質転換方法
PCT/JP2021/047338 WO2022138649A1 (en) 2020-12-23 2021-12-21 A plasmid for transformation, a method for producing a transformant using the same, and a method of transformation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116601298A true CN116601298A (zh) 2023-08-15

Family

ID=80225957

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180082161.8A Pending CN116601298A (zh) 2020-12-23 2021-12-21 转化用质粒、使用该质粒制备转化体的方法和转化方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20240043875A1 (zh)
JP (1) JP2022099419A (zh)
CN (1) CN116601298A (zh)
WO (1) WO2022138649A1 (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7919605B1 (en) * 2010-08-30 2011-04-05 Amyris, Inc. Nucleic acids, compositions and methods for the excision of target nucleic acids
ES2720040T3 (es) * 2012-10-12 2019-07-17 Glaxosmithkline Biologicals Sa Procedimientos de modificación de células hospedadoras
JP2016533719A (ja) * 2013-10-11 2016-11-04 グリコヴァキシン アーゲー 宿主細胞改変方法
MX2016007797A (es) * 2013-12-19 2016-09-07 Amyris Inc Metodos para integracion genomica.

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022138649A1 (en) 2022-06-30
US20240043875A1 (en) 2024-02-08
JP2022099419A (ja) 2022-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2022100158A4 (en) Improved methods for modification of target nucleic acids
Rajkumar et al. Biological parts for Kluyveromyces marxianus synthetic biology
Niu et al. Expanding the potential of CRISPR-Cpf1-based genome editing technology in the cyanobacterium Anabaena PCC 7120
Li et al. Synthetic biology approaches for chromosomal integration of genes and pathways in industrial microbial systems
Vanegas et al. SWITCH: a dynamic CRISPR tool for genome engineering and metabolic pathway control for cell factory construction in Saccharomyces cerevisiae
Riley et al. Approaches to genetic tool development for rapid domestication of non-model microorganisms
US10612043B2 (en) Methods of in vivo engineering of large sequences using multiple CRISPR/cas selections of recombineering events
WO2018045630A1 (zh) 一种为克鲁维酵母优化的CRISPR/Cas9高效基因编辑系统
CN106164271B (zh) Crispr支持的多路基因组工程化
CN103068995B (zh) 直接克隆
Wu et al. Combination of ssDNA recombineering and CRISPR-Cas9 for Pseudomonas putida KT2440 genome editing
US20200399659A1 (en) Helper plasmid for transformation, method for producing transformant using the same, and transformation method
Kim et al. Synthetic biology tools for engineering Corynebacterium glutamicum
Mohanraju et al. Development of a Cas12a-based genome editing tool for moderate thermophiles
Wu et al. Homing endonuclease I-SceI-mediated Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 genome engineering
CN116601298A (zh) 转化用质粒、使用该质粒制备转化体的方法和转化方法
Mund et al. A MAD7‐based genome editing system for Escherichia coli
Gorshkova et al. Mu-driven transposition of recombinant mini-Mu unit DNA in the Corynebacterium glutamicum chromosome
WO2022118866A1 (en) Plasmid for transformation, method for producing transformant using the same, and transformation method
CN113667687A (zh) 基于ai-2分子响应的启动元件及其构建的大肠杆菌动态调控系统和方法
US20100330678A1 (en) Process for the stable gene interruption in clostridia
Chen et al. Multiple-copy-gene integration on chromosome of Escherichia coli for beta-galactosidase production
WO2022138647A1 (en) A helper plasmid for transformation, a method for producing a transformant using the same, and a method of transformation
Maestroni et al. pCEC-red: a new vector for easier and faster CRISPR-Cas9 genome editing in Saccharomyces cerevisiae
JP2021000051A (ja) 形質転換用プラスミド及びこれを用いた形質転換体の製造方法、並びに形質転換方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination