JP2021000051A

JP2021000051A - 形質転換用プラスミド及びこれを用いた形質転換体の製造方法、並びに形質転換方法

Info

Publication number: JP2021000051A
Application number: JP2019116540A
Authority: JP
Inventors: 大西　徹; Toru Onishi; 徹大西; 宣紀多田; Nobuki Tada
Original assignee: Toyota Motor Corp
Current assignee: Toyota Motor Corp
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2019-06-24
Publication date: 2021-01-07

Abstract

【課題】目的遺伝子をゲノムへ組み込んだ安定した形質転換体を簡便且つ効率よく作製する。【解決手段】形質転換用プラスミドは、目的遺伝子を組み入れる部位と、当該部位を挟み込む一対の相同組換え配列と、一対の相同組換え配列を挟み込む一対のエンドヌクレアーゼ標的配列とを備える。【選択図】図３

Description

本発明は、宿主に対して目的遺伝子を導入する際に使用される形質転換用プラスミド、当該形質転換用プラスミドを用いた形質転換体の製造方法、当該形質転換用プラスミドを用いた形質転換方法に関する。

一般に、宿主細胞に外部から目的遺伝子を導入する技術を形質転換或いは遺伝子組換えと呼び、当該目的遺伝子が導入された細胞を形質転換体或いは組換え体と呼ぶ。形質転換技術を利用して形質転換体を効率よく作製することで、例えば、合成生物学的手法を利用して微生物代謝工学の加速・効率化を進めることができる。ここで、合成生物学的手法とは、生産宿主の設計・構築・評価・学習のサイクルを迅速に回すことで成立する技術である。なかでも、酵母を宿主とした合成生物学においては、効率的な宿主構築、すなわち組換え酵母を効率的に作製できることが重要な課題の一つである。

酵母を宿主とした形質転換には、目的遺伝子を組み込んだ環状ブラスミドを使用する方法と、目的遺伝子を含む線状ベクターを使用する方法とに大別される。環状プラスミドを用いて目的遺伝子を酵母に導入することは容易で、10^-2程度の高効率で形質転換酵母を作製することができる(非特許文献１)。一方、線状ベクターを使用して目的遺伝子を酵母に導入する場合、相同組換えによって目的遺伝子をゲノムに組み込む必要があるため、10^-6程度の効率でしか形質転換酵母を作製することができない(非特許文献２)。

環状プラスミドを用いて目的遺伝子を酵母に導入する方法は、上述のように効率が良いものの、環状プラスミドが脱落する場合もあり、安定的な組換え酵母を作製することができない。一方、線状ベクターを用いて目的遺伝子を酵母に導入する方法では、目的遺伝子がゲノムに組み込まれるために安定的ではあるが、上述のように効率の良い方法とは言えない。

ゲノムに対する目的遺伝子の導入効率を向上させるために、ゲノムにおける導入予定部位にホーミングエンドヌクレアーゼ等の標的特異的エンドヌクレアーゼの標的配列を予め導入し、当該部位の２本鎖を切断しておく技術が知られている（非特許文献２）。また、標的特異的エンドヌクレアーゼに代えて、CRISPR-Cas9やTALEN等の任意の塩基配列を切断できる技術を用いて、同様にゲノムにおける導入予定部位の２本鎖を切断しておく技術が知られている（非特許文献３）。このように、目的遺伝子を導入する部位の２本鎖を切断しておくことで相同組換え効率を10^-2〜10^-1程度まで向上させることが可能とされている。

しかしながら、これら目的遺伝子の導入効率を向上させる方法では、ゲノムにおける導入予定部位にエンドヌクレアーゼの標的配列を予め導入する必要があり、或いは、標的部位に対するガイドRNA等を作製する必要があった。このように、これら目的遺伝子の導入効率を向上させる方法は、目的遺伝子を含む相同組換え用DNA断片を作製し、これを用いて形質転換する以外に様々な工程を必要とする複雑な方法であった。

また、特許文献１には、ホーミングエンドヌクレアーゼ認識配列をテロメアシード配列で挟み込んだ構成のイントロンを有する選抜マーカーを備えるプラスミドが開示されている。特許文献１に開示された当該プラスミドは、ホーミングエンドヌクレアーゼが発現することで環状プラスミドから線状分子に変換され、末端のテロメアシード配列により安定して存在できる。

US 2016/0017344

Gietz, R.D., et al. "High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method." Nature Protocols. 2 (2007): 31-34. Storici, F, et al. "Chromosomal site-specific double-strand breaks are efficiently targeted for repair by oligonucleotides in yeast." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (2003): 14994-14999. DiCarlo,J.E., et al. "Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems." Nucleic Acids Res. 41 (2013): 4336-4343.

しかしながら、上述した何れの手法も、目的遺伝子をゲノムへ組み込んだ安定した形質転換体を簡便且つ効率よく作製することはできないといった問題があった。そこで、本発明は、上述したような実情に鑑み、目的遺伝子をゲノムへ組み込んだ安定した形質転換体を簡便且つ効率よく作製することができる形質転換用プラスミド及びこれを用いた形質転換体の製造方法、並びに形質転換方法を提供することを目的とする。

上述した目的を達成した本発明は以下を包含する。
（１）目的遺伝子を組み入れる部位と、当該部位を挟み込む一対の相同組換え配列と、一対の相同組換え配列を挟み込む一対のエンドヌクレアーゼ標的配列とを備える形質転換用プラスミド。
（２）上記エンドヌクレアーゼ標的配列の二本鎖を特異的に切断する標的特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現可能に有することを特徴とする（１）記載の形質転換用プラスミド。
（３）上記標的特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子は、ホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子であることを特徴とする（２）記載の形質転換用プラスミド。
（４）上記エンドヌクレアーゼ標的配列は、ホーミングエンドヌクレアーゼが特異的に認識する配列であることを特徴とする（３）記載の形質転換用プラスミド。
（５）上記標的特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を制御する誘導型プロモーターを有することを特徴とする（２）記載の形質転換用プラスミド。
（６）上記部位に組み入れられた上記目的遺伝子を有することを特徴とする（１）〜（５）いずれかに記載の形質転換用プラスミド。
（７）上記（６）記載の形質転換用プラスミドを宿主に導入する工程と、
上記形質転換用プラスミドに含まれる相同組換え配列を介して、上記形質転換用プラスミドに含まれる目的遺伝子が上記宿主のゲノムに組み込まれ、上記目的遺伝子が発現する形質転換体を選抜する工程とを有する、形質転換体の製造方法。
（８）上記（６）記載の形質転換用プラスミドを宿主に導入する工程を有し、上記形質転換用プラスミドに含まれる目的遺伝子が発現することを特徴とする形質転換方法。
（９）上記形質転換用プラスミドに含まれる相同組換え配列を介して、上記宿主のゲノムに目的遺伝子を組み入れることを特徴とする（８）記載の形質転換方法。

本発明に係る形質転換用プラスミドを利用することで、宿主ゲノムに対して目的遺伝子を組み入れてなる形質転換体を効率よく作製することができる。

また、本発明に係る形質転換用体の製造方法は、本発明に係る形質転換用プラスミドを利用するため、宿主ゲノムに対して目的遺伝子を組み入れてなる形質転換体を効率よく作製することができる。

さらに、本発明に係る形質転換用方法は、本発明に係る形質転換用プラスミドを利用することで、宿主ゲノムに対して目的遺伝子を組み入れてなる形質転換体を作製する優れた形質転換効率を達成することができる。

本発明に係る形質転換用プラスミドの要部を模式的に示す構成図である。本発明に係る形質転換用プラスミドの一構成例を模式的に示す構成図である。本発明に係る形質転換用プラスミドを用いて目的遺伝子をゲノムに組み込むメカニズムを模式的に示す構成図である。

以下、本発明を図面及び実施例を用いてより詳細に説明する。

本発明に係る形質転換用プラスミドは、図１に示すように、目的遺伝子を組み入れる部位と、当該部位を挟み込む一対の相同組換え配列と、一対の相同組換え配列を挟み込む一対のエンドヌクレアーゼ標的配列とを備える。言い換えると、形質転換用プラスミドは、目的遺伝子のセンス鎖を基準とすると、5’側から3’側に向かって、一方のエンドヌクレアーゼ標的配列（第１のエンドヌクレアーゼ標的配列と称しても良い）、一方の相同組換え配列（第１の相同組換え配列と称しても良い）、目的遺伝子を組み入れる部位、他方の相同組換え配列（第２の相同組換え配列と称しても良い）及び他方のエンドヌクレアーゼ標的配列（第２のエンドヌクレアーゼ標的配列と称しても良い）の順で備えている。

目的遺伝子を組み入れる部位とは、目的遺伝子を含む核酸断片を組み入れるための領域を意味する。よって、目的遺伝子を組み入れる部位は、具体的な塩基配列に何ら限定されれず、例えば、１又は複数の制限酵素標的配列とすることができる。また、目的遺伝子とは、宿主ゲノムに導入する予定の核酸を意味する。よって、目的遺伝子は、特定のタンパク質をコードする塩基配列に限定されず、siRNA等をコードする塩基配列、転写産物の転写時期と生産量を制御するプロモーターやエンハンサー等の転写調節領域の塩基配列、転移RNA(tRNA)やリボソームRNA(rRNA)等をコードする塩基配列など、あらゆる塩基配列からなる核酸を含む意味である。

また、目的遺伝子は、発現可能な状態で上記部位に組み込まれることが好ましい。発現可能な状態とは、宿主生物において所定のプロモーターの制御下に発現されるように、目的遺伝子とプロモーターとを連結して上記部位に組み込むことを意味する。

さらに、目的遺伝子には、プロモーター及びターミネーター、所望によりエンハンサー等のシスエレメント、スプライシングシグナル、ポリA付加シグナル、選択マーカー、リボソーム結合配列（SD配列）等を連結することができる。なお、選択マーカーとしては、例えば、アンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子やハイグロマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。

一対の相同組換え配列とは、宿主ゲノムにおける所定の領域に対して相同性を有する一対の核酸領域を意味する。一対の相同組換え配列が、相同性を有する宿主ゲノムとの間でそれぞれ交叉することで、当該一対の相同組換え配列に挟み込まれる目的遺伝子を宿主ゲノムに組み入れることができる。したがって、一対の相同組換え配列としては、具体的な塩基配列には何ら限定されないが、例えば、宿主ゲノムに存在する所定の遺伝子の上流領域及び下流領域と相同性の高い塩基配列とすることができる。この場合、形質転換用プラスミドと宿主ゲノムとの間に相同組換えが生じると、当該遺伝子が宿主ゲノムから欠失するため、当該遺伝子の欠失による表現型を観察することで相同組換えの成否を判断することができる。

例えば、一対の相同組換え配列として、アデニン生合成経路に関与するADE1遺伝子のコーディング領域より上流の領域と、同ADE1遺伝子のコーディング領域より下流の領域とすることができる。この場合、一対の相同組換え配列と宿主ゲノムとの間で相同組換えが生じると、アデニンの中間代謝産物の5−アミノイミダゾールリボシドが蓄積し、その重合したポリリボシルアミノイミダゾールに起因して形質転換体が赤く着色する。よって、この赤い着色を検出することで、一対の相同組換え配列と宿主ゲノムとの間で相同組換えが生じたことを判定することができる。

ここで、一対の相同組換え配列と宿主ゲノムの組換え領域との間は、相同組換えしうる（交叉しうる）程度に高い配列同一性を有している。各領域間の塩基配列の同一性は、従来公知の配列比較ソフト：blastn等を使用して計算することができる。各領域間の塩基配列は、６０％以上の同一性を有していればよく、８０％以上が好ましく、９０％以上がさらに好ましく、９５％以上が特に好ましく、９９％以上の同一性を有していることが最も好ましい。

また、一対の相同組換え配列は、それぞれ同じ長さでも良いし、異なる長さでも良い。これら一対の相同組換え配列は、相同組換えしうる（交叉しうる）程度の長さであればよく、例えば、各々０．１ｋｂ〜３ｋｂであることが好ましく、更には０．５ｋｂ〜３ｋｂであることが好ましく、特に０．５ｋｂ〜２ｋｂであることが好ましい。

ところで、本発明に係る形質転換用プラスミドは、上述した一対の相同組換え配列の外側（なお、一対の相同組換え配列に挟まれる目的遺伝子を内側としたときの外側）にエンドヌクレアーゼ標的配列を有している。エンドヌクレアーゼ標的配列とは、エンドヌクレアーゼが認識する塩基配列を意味する。

エンドヌクレアーゼとしては、特に限定されず、所定の塩基配列を認識して二本鎖DNAを切断する活性を有する酵素を広く意味する。エンドヌクレアーゼとしては、例えば、制限酵素、ホーミングエンドヌクレアーゼ、Cas9ヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ（MN）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）等を挙げることができる。また、ホーミングエンドヌクレアーゼとしては、イントロンにコードされたエンドヌクレアーゼ（I-という接頭語が付く）及びインテインに含まれるエンドヌクレアーゼ（PI-という接頭語が付く）の両者を含む意味である。ホーミングエンドヌクレアーゼとしては、より具体的にI-Ceu I、I-Sce I、I-Onu I、PI-Psp I及びPI-Sce Iを挙げることができる。なお、これら具体的なエンドヌクレアーゼが特異的に認識する標的配列、すなわちエンドヌクレアーゼ標的配列は公知であり、当業者であれば適宜入手することができる。

また、本発明に係る形質転換用プラスミドは、図２に示すように、誘導型プロモーターとエンドヌクレアーゼ遺伝子とを含むものであってもよい。なお、エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現は、誘導型プロモーターに限定されず、恒常発現型プロモーターを使用してもよい。

このエンドヌクレアーゼ遺伝子は、上述した一対のエンドヌクレアーゼ標的配列を特異的に認識して二本鎖を切断する活性を有する酵素をコードしている。すなわち、エンドヌクレアーゼ遺伝子としては、制限酵素遺伝子、ホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子、Cas9ヌクレアーゼ遺伝子、メガヌクレアーゼ遺伝子、ジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ遺伝子等を挙げることができる。

誘導型プロモーターとは、特定の条件下で発現誘導する機能を有するプロモーターを意味する。誘導型プロモーターとしては、特に限定されないが、例えば特定の物質の存在下ン発現誘導するプロモーター、特定の温度条件で発現誘導するプロモーター、各種ストレスに応答して発現誘導するプロモーター等を挙げることができる、使用するプロモーターは、形質添加する宿主に応じて適宜選択することができる。

例えば、誘導型プロモーターとしては、GAL1及びGAL10などのガラクトース誘導性プロモーター、テトラサイクリン又はその誘導体の添加又は除去で誘導するTet-onシステム/Tet-off系プロモーター、HSP10、HSP60、HSP90などの熱ショックタンパク質（HSP）をコードする遺伝子のプロモーター等を挙げることができる。また、誘導型プロモーターとしては、銅イオンの添加で活性化するCUP1プロモーターを用いることもできる。さらに、誘導型プロモーターとしては、宿主が大腸菌等の原核細胞である場合、IPTGで誘導するlacプロモーター、コールドショックで誘導するcspAプロモーター、アラビノースで誘導araBADプロモーター等を挙げることができる。

また、エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現制御は、誘導型プロモーターや恒常発現型プロモーターといったプロモーターによる方法に限定されず、例えばDNA組換え酵素を使用する方法を適用しても良い。DNA組換え酵素を用いて、遺伝子の発現のオン・オフを行う方法としては、例えば、FLEx switch法（A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping.Atasoy et al. The Journal of Neuroscience, 28, 7025-7030, 2008.）を挙げることができる。FLEx switch法では、DNA組換え酵素によりプロモーター配列の向きを変える組換えを起こさせることで、遺伝子の発現のオン・オフを行うことができる。

一方、本発明に係る形質転換用プラスミドは、従来公知の入手可能なプラスミドに基づいて作製することができる。このようなプラスミドとしては、例えばpRS413、pRS414、pRS415、pRS416、YCp50、pAUR112又はpAUR123などのYCp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pYES2又はYEp13などのYEp型大腸菌-酵母シャトルベクター、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pAUR101又はpAUR135などのYIp型大腸菌-酵母シャトルベクター、大腸菌由来のプラスミド（pBR322、pBR325、pUC18、pUC19、pUC118、pUC119、pTV118N、pTV119N、pBluescript、pHSG298、pHSG396又はpTrc99AなどのColE系プラスミド、pACYC177又はpACYC184などのp15A系プラスミド、pMW118、pMW119、pMW218又はpMW219などのpSC101系プラスミド等）、アグロバクテリウム由来のプラスミド（例えばpBI101等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110、pTP5等)などが挙げられる。

また、本発明に係る形質転換用プラスミドは、さらに複製開始点や、自律複製配列(ARS)、セントロメア配列（CEN）を含むことができる。これらを含むことで宿主細胞に導入された後に安定的に複製することができる。また、本発明に係る形質転換用プラスミドは、選抜マーカーを含むことができる。選抜マーカーとしては、特に限定されず、例えば薬剤耐性マーカー遺伝子や栄養要求性マーカー遺伝子を挙げることができる。これら選抜マーカーを含むことで、形質転換用プラスミドが導入された宿主細胞を効率的に選択することができる。

以上のように構成された形質転換用プラスミドを使用することで、目的遺伝子をゲノムへ組み込んだ安定した形質転換体を簡便且つ効率よく作製することができる。形質転換体を作製するには、先ず、目的遺伝子を組み入れる部位（図１）に目的遺伝子を組み入れる。このようにして、目的遺伝子を有する形質転換用プラスミドを、定法に従って宿主細胞に導入する。その後、図３に模式的に示すように、誘導型プロモーターの制御下で発現したエンドヌクレアーゼにより、一対のエンドヌクレアーゼ標的配列において二本鎖が切断され、一対の相同組換え配列に挟み込まれた目的遺伝子を含む核酸断片が切り出される。切り出された核酸断片は、当該核酸断片における一対の相同組換え配列と宿主ゲノムにおける相同組換え配列との間で交叉し、ゲノム内に組み込まれる。これにより、目的遺伝子をゲノムに組み込んだ安定した形質転換体を作製することができる。

このとき、目的遺伝子を組み入れた形質転換用プラスミドを宿主細胞に導入する方法としては、特に限定されず、従来公知の方法、例えば塩化カルシウム法、コンピテントセル法、プロトプラスト又はスフェロプラスト法、電気パルス法等を適宜使用することができる。その後、形質転換用プラスミドが選抜マーカーを有する場合には、選抜マーカーを用いて形質転換用プラスミドが導入された宿主細胞を選抜することができる。

また、誘導型プロモーターの制御下でエンドヌクレアーゼを発現させるには、誘導型プロモーターに応じて適宜条件を設定する。例えば、誘導型プロモーターとしてGAL1及びGAL10などのガラクトース誘導性プロモーターを使用した場合には、形質転換用プラスミドを導入した宿主細胞を培養する培地にガラクトースを添加する、或いは当該宿主細胞をガラクトース含有培地に移して培養することで、エンドヌクレアーゼを発現誘導することができる。また、誘導型プロモーターとして熱ショックタンパク質（HSP）をコードする遺伝子のプロモーターを使用する場合には、形質転換用プラスミドを導入した宿主細胞を培養する際に所望のタイミングで熱ショックを負荷することで、当該タイミングでエンドヌクレアーゼを発現誘導することができる。

また、上述した形質転換用プラスミドでは、一対の相同組換え配列を、所定の遺伝子の上流領域及び下流領域と相同性の高い塩基配列とした場合には、相同組換えによって、目的遺伝子を含む断片がゲノムに組み込まれるとともに当該所定の遺伝子がゲノムから欠失することとなる。よって、当該所定の遺伝子の欠失に起因する表現型を観察することで、目的遺伝子を含む核酸断片がゲノムに組み込まれたか否かを判定することができる。例えば、所定の遺伝子としてADE1遺伝子を利用した場合、目的遺伝子を含む核酸断片がゲノムに組み込まれると、ADE1遺伝子がゲノムから欠失することとなる。その結果、宿主には5−アミノイミダゾールリボシドが蓄積し、その重合したポリリボシルアミノイミダゾールに起因して形質転換体が赤く着色する。よって、この赤い着色を検出することで、目的遺伝子を含む核酸断片が宿主のゲノムに組み込まれたことを判定することができる。

なお、上述した例では、形質転換用プラスミドが誘導型プロモーターとエンドヌクレアーゼ遺伝子とを有する構成としたが、本発明に係る形質転換用プラスミドは、誘導型プロモーターとエンドヌクレアーゼ遺伝子を有しない構成であってもよい。この場合、誘導型プロモーターとエンドヌクレアーゼ遺伝子を有する発現ベクターを別途準備し、本発明に係る形質転換用プラスミドとともに宿主細胞に導入すればよい。この場合でも、誘導型プロモーターとエンドヌクレアーゼ遺伝子を有する発現ベクターと、目的遺伝子を有する形質転換用プラスミドとが導入された宿主細胞において、エンドヌクレアーゼ遺伝子が誘導型プロモーターの制御下に発現することで、図３に示したように、一対の相同組換え配列に挟み込まれた目的遺伝子を含む核酸断片が切り出され、目的遺伝子をゲノムに組み込んだ形質転換体を作製することができる。

なお、本発明に係る形質転換補助用プラスミドを利用した形質転換方法、形質転換体の製造方法は、特に限定されず、如何なる宿主細胞に対しても適用することができる。宿主細胞としては、糸状菌や酵母等の真菌、大腸菌や枯草菌等の細菌、植物細胞、ほ乳類や昆虫を含む動物細胞を挙げることができる。これらのなかでも、酵母を宿主細胞とすることが好ましい。酵母としては、特に限定されないが、サッカロマイセス属（Saccharomyces）に属する酵母、クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）に属する酵母、カンジダ属（Candida）に属する酵母、ピキア属（Pichia）に属する酵母、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）に属する酵母、ハンセヌラ属（Hansenula）に属する酵母等を挙げることができる。より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロマイセス・バヤヌス（Saccharomyces bayanus）、サッカロマイセス・ボウラルディ（Saccharomyces boulardii）等のサッカロマイセス属に属する酵母に適用することができる。

以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

〔実施例１〕
本実施例では、1倍体の実験酵母S. cerevisiae BY4742株を供試株として使用した。

＜ゲノム導入用ベクターの作製＞
作製した2種類のベクターは、メチオニン欠乏条件又はガラクトースで誘導されるS. cerevisiae由来のホーミングエンドヌクレアーゼのI-SceI（SCEI遺伝子、NCBIアクセスNo 854590）と、一対のI-SceI標的配列（エンドヌクレアーゼ標的配列）の間にゲノム導入用の一対の相同組換え配列を含むDNA断片が挿入された配列で構成されるYEp型の酵母シャトルベクターpRS436(SAT)-P_MET25-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-SceとpRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sce（図１参照）である。

pRS436(SAT)-P_MET25-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceには、MET25プロモーターとCYC1ターミネーターが付加されたSCEI遺伝子（COX5B遺伝子のイントロンが挿入され、全長を酵母の核ゲノムのコドン使用頻度に合わせてコドンを変換した配列、配列番号１及び２）、nourseothricin耐性遺伝子を含む遺伝子配列（natマーカー）、ゲノム導入用の相同組換え配列として、ADE1遺伝子の5’側末端より上流約1000bpの領域の遺伝子配列（5U_ADE1）及びADE1遺伝子3’側末端より下流の約950bpの領域のDNA配列（3U_ADE1）、相同組換え用のマーカー遺伝子として、Ashbya gossypii由来のTEF1プロモーターとTEF1ターミネーターが付加されたG418耐性遺伝子を含む遺伝子配列（G418マーカー）が、pRS436GAPベクター（NCBIアクセスNo. AB304862）からURA3遺伝子、TDH3プロモーター、CYC1ターミネーターを除いたベクターに挿入されている。なお、5U_ADE1と3U_ADE1及びG418マーカー配列は2か所のホーミングエンドヌクレアーゼI-SceI標的配列の間に挿入されており、メチオニンが含まれない培地で誘導されるMET25プロモーターに付加されているSCEI遺伝子により切り出すことが可能であり、酵母細胞内で切り出された配列は相同組換えにより、ゲノムに導入される（図３参照）。

各DNA配列はPCRにより増幅することが可能である。各DNA断片を結合するため、プライマーは隣接DNA配列と約15bp重複するようにDNA配列を付加されたものを合成した（表１）。これらプライマーを用いて、S. cerevisiae OC-2株ゲノム又は合成DNAを鋳型として、目的のDNA断片を増幅し、In-Fusion HD Cloning Kit等を用いて順次DNA断片を結合、pRS436GAPベクターにクローニングして最終目的のプラスミドを作製した。

pRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-SceはMET25プロモーターの代わりにGAL1プロモーターが付加されたSCEI遺伝子が挿入されており、炭素源がガラクトースの培地でSCEI遺伝子は発現し、I-SceI標的配列の間に挿入された配列を切り出すことが可能である。本ベクターは、pRS436(SAT)-P_MET25-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceもしくは、S. cerevisiae OC-2株ゲノムを鋳型に目的のDNA断片を増幅（使用プライマーは表１）、In-Fusion HD Cloning Kit等を用いてDNA断片を結合して作製した。

＜ADE1遺伝子座用ゲノム導入用ベクター導入株の作製＞
作製したpRS436(SAT)-P_MET25-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-SceとpRS436(SAT)-P_GAL1-SCEI-T_CYC1-Sce-5U_ADE1-P_AgTEF1-G418-T_AgTEF1-3U_ADE1-Sceを用いて、S. cerevisiae BY4742株の形質転換を行い、nourseothricinを含むYPD寒天培地に塗布し、生育したコロニーを純化した。形質転換はAkada[Akada, R. et al. “Elevated temperature greatly improves transformation of fresh and frozen competent cells in yeast“ BioTechniques 28 (2000): 854-856]らの方法に従って行った。得られた軽質転換体をそれぞれUz3201とUz3255株とした。

＜ゲノム導入用ベクターから相同組換え用DNA配列の切り出しとADE1遺伝子座への導入＞
75μg/ml nourseothricinを含むYPD液体培地に、Uz3201株を1日で培養後、G418を含むSDC-Met寒天培地（メチオニンを含まない完全合成培地）もしくは、YPD培地に塗布した。メチオニンを含まない培地ではホーミングエンドヌクレアーゼI-SceIが誘導され、切り出された相同組換え用DNA断片はADE1遺伝子座で相同組換えが起こり、ADE1遺伝子が破壊されると考えられる。ADE1遺伝子はアデニン生合成経路の遺伝子であり、その破壊株は、アデニンの中間代謝産物の5−アミノイミダゾールリボシドが蓄積し、その重合したポリリボシルアミノイミダゾールが赤く着色するため、ADE1遺伝子破壊株は容易に判別が可能である。

75μg/ml nourseothricinを含むYPD液体培地に、Uz3255株を1日で培養後、G418を含むYPGa寒天培地（炭素源がガラクトース2％）もしくは、YPD寒天培地に塗布した。YPGa培地ではホーミングエンドヌクレアーゼI-SceIが誘導される。

なお、ADE1遺伝子座への相同組換え効率は下記の式で算出した。
Uz3201株のADE1遺伝子破壊効率（％）＝G418を含むSDC-Met寒天培地で生育した赤いコロニー数/YPD培地で生育したコロニー数
Uz3255株のADE1遺伝子破壊効率（％）＝G418を含むYPGa寒天培地で生育した赤いコロニー数/YPD培地で生育したコロニー数

＜結果・考察＞
核酸断片のゲノムへの導入効率をエンドヌクレアーゼの誘導条件の異なる２種類のプラスミドで検討した結果を表２及び３に示した。表２は、メチオニン欠乏条件でI-SceIが誘導されるプラスミドを使用した結果を示している。表３は、炭素源がガラクトースである場合にI-SceIが誘導されるプラスミドを使用した結果を示している。

表２及び３の結果から判るように、プラスミドを導入した酵母内において、当該プラスミドから目的遺伝子を含む核酸断片をエンドヌクレアーゼ（本実施例ではホーミングエンドヌクレアーゼI-SceI）によって切り出し、この核酸断片を相同組換えによってゲノムに導入するといった新規手法を確立できた。また、ADE1遺伝子破壊効率は、１〜５％程度と極めて高効率であった。なお、本実施例で算出したADE1遺伝子破壊効率は、言い換えると、エンドヌクレアーゼによって切り出された核酸断片のゲノムへの導入効率と同義である。

エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を制御する２種類のプロモーターでADE1遺伝子破壊効率が異なっていたが、MET25プロモーターと比較してGAL1プロモーターのほうが、強く発現誘導するプロモーターであることに起因すると考えられた。このことから、エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を制御するプロモーターをより強力なプロモーターとすることで、エンドヌクレアーゼによって切り出された核酸断片のゲノムへの導入効率を更に向上できる可能性がある。

Claims

目的遺伝子を組み入れる部位と、当該部位を挟み込む一対の相同組換え配列と、一対の相同組換え配列を挟み込む一対のエンドヌクレアーゼ標的配列とを備える形質転換用プラスミド。
上記エンドヌクレアーゼ標的配列の二本鎖を特異的に切断する標的特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子を発現可能に有することを特徴とする請求項１記載の形質転換用プラスミド。
上記標的特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子は、ホーミングエンドヌクレアーゼ遺伝子であることを特徴とする請求項２記載の形質転換用プラスミド。
上記エンドヌクレアーゼ標的配列は、ホーミングエンドヌクレアーゼが特異的に認識する配列であることを特徴とする請求項３記載の形質転換用プラスミド。
上記標的特異的エンドヌクレアーゼ遺伝子の発現を制御する誘導型プロモーターを有することを特徴とする請求項２記載の形質転換用プラスミド。
上記部位に組み入れられた上記目的遺伝子を有することを特徴とする請求項１〜５いずれか一項記載の形質転換用プラスミド。
請求項６記載の形質転換用プラスミドを宿主に導入する工程と、
上記形質転換用プラスミドに含まれる相同組換え配列を介して、上記形質転換用プラスミドに含まれる目的遺伝子が上記宿主のゲノムに組み込まれ、上記目的遺伝子が発現する形質転換体を選抜する工程とを有する、形質転換体の製造方法。
請求項６記載の形質転換用プラスミドを宿主に導入する工程を有し、上記形質転換用プラスミドに含まれる目的遺伝子が発現することを特徴とする形質転換方法。
上記形質転換用プラスミドに含まれる相同組換え配列を介して、上記宿主のゲノムに目的遺伝子を組み入れることを特徴とする請求項８記載の形質転換方法。