CN112852860A - 质粒载体及其在构建多拷贝表达系统中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及质粒载体及其在构建多拷贝表达系统中的应用。本发明基于CRISPR/cas9基因编辑技术构建了质粒载体，从而能够在酿酒酵母内通过增加基因拷贝数来过表达目的基因。通过直接编辑酿酒酵母内源性2μ质粒，将目标基因直接插入到2μ质粒中，可使得目标基因可以多拷贝的形式在酿酒酵母内进行稳定的过表达。以二氢青蒿酸的表达为例，使用pE2μ多拷贝质粒系统的菌株SyBE_Sc01130584的产量达到620.9mg/L,而使用pC2μ质粒进行过表达仅仅产生131.0mg/L。

Description

质粒载体及其在构建多拷贝表达系统中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及质粒载体及其在构建多拷贝表达系统中的应用。

背景技术

多拷贝质粒普遍用于对目的基因进行多拷贝表达，由于其易于操作，转化效率高等优点，在各种细胞中被开发为重要的工具。在酿酒酵母中，传统的2μ穿梭质粒(pC2μ)如pYES2、pRS426和pESC被广泛用于重组蛋白的生产和代谢途径的构建(Karim et al.,2013)。传统的2μ质粒源于酵母内源性2μ质粒(pE2μ)。传统的2μ质粒为了操作方便，只保留了pE2μ的2μori，加上了酵母的筛选标记(营养缺陷型标记或抗生素标记)和大肠杆菌的克隆元件。通过基因操作，可将外源目的基因连入质粒中，再导入宿主酿酒酵母后，可实现外源插入基因的多拷贝过表达，以及对异源合成代谢路径的优化。

酵母内源性2μ质粒pE2μ存在于大多数野生型和实验室酿酒酵母菌株中。pE2μ是酿酒酵母中天然的可自主复制的环状DNA分子(Gnügge and Rudolf,2017)。它包含一个特殊的复制起始位点(2μori)、两个FRT位点(FLP1识别的靶位点)和编码四个已知基因的序列：REP1、REP2、RAF1和FLP1。FLP1和两个FRT位点对pE2μ的扩增至关重要(Rizvi et al.,2017)。该扩增系统以FLP1介导的重组为基础，遵循特殊的Futcher模型(Futcher,1986)，因此每个质粒在一个细胞周期内可以复制多个拷贝，以在质粒拷贝数分配不均衡和其他外界对质粒拷贝数扰动的情况下恢复质粒拷贝数(PCN)的稳定状态(Rizvi et al.,2017)。REP1和REP2对于pE2μ的分配体系是必不可少的。REP1和REP2形成复合物REP1-REP2，它与位于2μori内的STB位点结合，以协助质粒在细胞分裂的时候平均分配到字母细胞中；RAF1负责调节分配和扩增系统的功能，以使pE2μ的拷贝数保持在最小的细胞间变化(McQuaid et al.,2017)。基于上述严格控制的质粒分配系统和多拷贝扩增系统，pE2μ可以被均匀分离，从而导致非常低的丢失频率(<0.01％)(Gnügge and Rudolf,2017)。

传统的pC2μ质粒在细胞中的存活率通常取决于培养基产生的选择性压力(含抗生素的培养基或者营养缺陷型的培养基)。在没有选择压力的丰富的培养条件下，pC2μ很难保持较高的拷贝数，并且细胞会不断地丢失质粒，细胞在非选择性培养基中培养约24小时后，有近50％-60％的细胞失去质粒(Christianson et al.,1992)。对于含有pC2μ菌株，使用YPD等营养丰富的天然的培养基，虽然生长速度较快，但由于质粒丢失，会让细胞失去重要的特性，因此不适合长期发酵；而对于有抗生素标记的菌株，则需要添加昂贵的抗生素以维持质粒的存在，也不适合工业化规模的发酵。

此外，pC2μ质粒只含有一个FRT位点。因此pC2μ不能以Futcher模型的形式进行扩增，pC2μ的扩增效率也不如pE2μ高。pC2μ需要pE2μ来维持分配时的稳定性，在没有pE2μ的菌株中不适合使用pC2μ来进行基因的过表达。在没有pE2μ的酵母菌株中使用传统的2μ质粒，其质粒丢失频率约为50％(Christianson et al.,1992)。

因此，为了使目的基因可以更加稳定表达，且不受培养条件的限制，构建多拷贝质粒系统十分必要。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种质粒载体，从而使目的基因直接插入到野生pE2μ，以实现目的基因的多拷贝表达。

本发明提供了如下I)～IV)中至少一种在构建多拷贝基因表达系统中的应用：

I)、RAF1基因或其同源片段；

II)、REP2基因或其同源片段；

III)、靶向RAF1基因或靶向RAF1基因上下游片段的gRNA；

IV)、靶向REP2基因或靶向REP2基因上下游片段的gRNA；

V)、与I)～IV)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

本发明中，所述RAF1基因或REP2基因为酿酒酵母的RAF1基因或REP2基因，其位于酿酒酵母的2μ质粒。本发明利用CRISPR技术进行胞内编辑，切割酿酒酵母野生内源2μ质粒并目的基因片段整合到2μ质粒上的RAF1或REP2基因下游，从而实现目的基因的多拷贝表达。

为此，本发明提供了两种质粒，其中一种是用于在胞内切割内源性野生pE2μ的CRISPR工具质粒，另一种是便于导入目标基因的Donor质粒。将经线性化的pDonor质粒，与相应CRISPR工具质粒混合后导入含有野生pE2μ的酿酒酵母中，可使目的基因直接插入到野生pE2μ，以实现目的基因的多拷贝。

本发明提供的CRISPR工具质粒，包括骨架载体、编码Cas9的核酸和gRNA；

所述gRNA靶向REP2基因下游片段或RAF1基因下游片段。

本发明所述的CRISPR工具质粒，包括顺序连接的：P_TEF1、Cas9、T_CYC1、P_SNR52、gRNA、T_SUP4。

本发明所述的CRISPR工具质粒还包括ori片段、抗性标记、CEN/ARS片段和营养缺陷型标记。

本发明中，所述CRISPR工具质粒的骨架载体为pRS416载体；所述抗性标记为AmpR标记，所述营养缺陷型标记为URA3标记；所述编码Cas9的核酸序列如SEQ ID NO:1所述；所述靶向RAF1基因下游片段的gRNA的序列如SEQ ID NO:2所示，所述靶向REP2基因下游片段的gRNA的序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明提供的CRISPR工具质粒，为着丝粒质粒，Cas9蛋白与gRNA都在该质粒上表达，以避免与pE2μ之间发生重组。通过替换gRNA，以满足对不同的pE2μ质粒及其衍生质粒进行编辑的需求。

本发明还提供了一种Donor质粒，包括骨架载体和i)～ii)中至少一种；

i)、RAF1同源片段；ii)、REP2同源片段。

本发明中，所述RAF1同源片段包括RAF1同源臂A和RAF1同源臂B，所述RAF1同源臂A的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述RAF1同源臂B的核酸序列如SEQ ID NO:5所示。

本发明中，所述REP2同源片段包括REP2同源臂a和REP2同源臂b，所述REP2同源臂a的核酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述REP2同源臂b的核酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明所述Donor载体还包括：线性化酶切位点、终止子、抗性筛选标记、营养缺陷型筛选标记和目的基因插入位点；

本发明所述Donor载体中，线性化酶切位点位于所述同源片段的同源臂A和同源臂B之间。

本发明所述Donor载体中，所述线性化酶切位点为PmeI；所述终止子为T_CPS1；所述抗性筛选标记为KanMX6；所述营养缺陷型筛选标记为G418；所述目的基因插入位点包括BsaI位点。

本发明提供的Donor质粒拥有两段野生2μ质粒的同源臂，可通过同源重组，整合到2μ质粒上的RAF1或REP2基因的下游。两段同源臂之间添加了PmeI酶切位点，便于线性化。

利用RAF1的表达质粒组合中，CRISPR工具质粒中靶向RAF1基因下游片段的gRNA的序列如SEQ ID NO:2所示；Donor质粒中包括RAF1同源臂A和RAF1同源臂B，所述RAF1同源臂A的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述RAF1同源臂B的核酸序列如SEQ ID NO:5所示。

利用REF2的表达质粒组合中，CRISPR工具质粒中靶向REF2基因下游片段的gRNA的序列如SEQ ID NO:3所示；Donor质粒中包括REP2同源臂a和REP2同源臂b，所述REP2同源臂a的核酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述REP2同源臂b的核酸序列如SEQ ID NO:7所示。

本发明还提供了多拷贝基因表达系统，其包括：含有pE2μ质粒的酵母菌、所述的CRISPR工具质粒和所述的Donor质粒。

本发明还提供了一种多拷贝基因表达方法，其包括：

将目的基因插入所述的Donor质粒，制得pDonor Target载体；

所述pDonor Target载体经线性化，与所述的CRISPR工具质粒共转化至宿主进行表达；

所述宿主为含有pE2μ质粒的酵母菌。

利用本发明提供的CRISPR工具质粒和所述的Donor质粒对酿酒酵母(含有野生2μ质粒)可以获得编辑后的质粒，本发明中将该质粒记为多拷贝基因表达质粒。这种质粒可用于在没有野生2μ质粒的酿酒酵母中构建pE2μ多拷贝系统。

TPI1是酿酒酵母基因组上的必需基因，将其迁移至2μ质粒上有助于进一步提高质粒的拷贝数和稳定性。因此，本发明所述多拷贝基因表达方法中，所述宿主pE2μ质粒中插入TPI 1基因，且其基因组中TPI 1基因被敲除。一些具体实施例中，所述TPI 1基因的核酸序列如SEQ ID NO:8所示。

本发明中，以二氢青蒿酸的表达为例，构建多拷贝基因表达菌株。其中，所述目的基因为ADS、CYP71AV1和DBR2。

本发明所述方法构建的表达二氢青蒿酸的酵母菌株，其宿主为酿酒酵母CEN.PK2-1C。

构建所得菌株的保藏编号为CGMCC NO. 21335。

本发明还提供了另一种多拷贝基因表达质粒，其包括：骨架载体和2μori片段、REP2片段、FLP片段、REP1片段、RAF1片段。

本发明所述的多拷贝基因表达质粒中所述骨架载体为pSB1C3；所述2μori和RAF1之间还包括：抗性标记和目的基因插入位点；所述抗性标记为kanMX6。

本发明所述的多拷贝基因表达质粒的构建方法，其包括，以所述的CRISPR工具质粒和所述的Donor质粒对含有pE2μ质粒的酵母菌进行编辑。

本发明还提供了多拷贝基因表达系统，其包括：不含有pE2μ质粒的酵母菌和所述的多拷贝基因表达质粒。

本发明还提供了一种多拷贝基因表达方法，包括：

将目的基因插入所述多拷贝基因表达质粒，然后转化至宿主进行表达；所述宿主为不含有pE2μ质粒的酵母菌。

本发明基于CRISPR/cas9基因编辑技术构建了质粒载体，从而能够在酿酒酵母内通过增加基因拷贝数来过表达目的基因。通过直接编辑酿酒酵母内源性2μ质粒，将目标基因直接插入到2μ质粒中，可使得目标基因可以多拷贝的形式在酿酒酵母内进行稳定的过表达。以二氢青蒿酸的表达为例，使用pE2μ多拷贝质粒系统的菌株SyBE_Sc01130584的产量达到620.9mg/L,而使用pC2μ质粒进行过表达仅仅产生131.0mg/L。

生物保藏说明

生物材料SyBE_Sc01130584，分类命名:酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，于2020年12月08日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.21335

附图说明

图1示菌株SyBE_Sc01130534,SyBE_Sc01130438和SyBE_Sc01130382传代实验，在各个代时下的流式细胞测定结果，每个图横轴为荧光强度，纵轴为各个荧光强度所对应的细胞个数，CV％为变异系数，描述分布的发散程度；

图2示菌株SyBE_Sc01130534，SyBE_Sc01130438及SyBE_Sc01130382传代实验，在各个代时下质粒存活率的测定；

图3示菌株SyBE_Sc01130534，SyBE_Sc01130438及SyBE_Sc01130382在0代时的质粒拷贝数；

图4示菌株SyBE_Sc01130534，SyBE_Sc01130438及SyBE_Sc01130382在0代，10代，20代，30代时的相对平均荧光值；

图5示SyBE_Sc01130530及SyBE_Sc01130594在经过90代传代实验后在YPD平板上涂布；

图6示菌株SyBE_Sc01130594,SyBE_Sc01130530传代实验，在各个代时下的流式细胞测定结果；

图7示菌株SyBE_Sc01130594,SyBE_Sc01130530在0代和90代时的拷贝数；

图8示菌株SyBE_Sc01130366,SyBE_Sc01130343,SyBE_Sc01130584发酵测试结果；

图9示CRISPR工具质粒pCasRAF1的质粒图谱；

图10示Donor质粒pDonorRAF1的质粒图谱；

图11示Donor质粒pDonorREP2的质粒图谱；

图12示Donor质粒pDonorDCA的质粒图谱；

图13示pE2μRAF1构建过程及获得的载体图谱；

图14示菌株SyBE_Sc01130594的构建过程，及获得的载体图谱；

图15示CRISRP工具质粒切割位点。

具体实施方式

本发明提供了质粒载体及其在构建多拷贝表达系统中的应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明中，RAF1基因或REP2基因来自酿酒酵母的2μ质粒，所述同源片段是指基因的两个同源臂，其中一个同源臂位于基因的3’端，另一个同源臂位于基因的5’端。

本发明中gRNA靶向的位置是RAF1基因或REP2基因中，或在基因的上游，或在基因的下游。在本发明实施例中，gRNA靶向的位置是RAF1基因或REP2基因的下游。具体实施例中，本发明构建的CRISPR工具质粒中gRNA引导切割的位点如图15所示。

本发明提供的CRISPR工具质粒中，Cas9或gRNA的启动子和终止子可以选自本领域任意可行的方案。在本发明的实施例中，Cas9的启动子为P_TEF1，终止子为T_CYC1。gRNA的启动子为P_SNR52，终止子为T_SUP4。

本发明提供的CRISPR工具质粒用于切割酵母菌内天然存在的2μ质粒，本发明中，构建的2个CRISPR工具质粒分别为pCasREP2和pCasRAF1。其中：

pCasREP2的基因型为：pRS416_P_TEF1-Cas9-T_CYC1_P_SNR52-gRNA.2μ.REP2-T_SUP4-T_CYC1

pCasRAF1的基因型为：pRS416_P_TEF1-Cas9-T_CYC1_P_SNR52-gRNA.2μ.RAF1-T_SUP4-T_CYC1

本发明对CRISPR工具质粒的构建方法不做限定，其可以采用本领域熟知的任意手段制备获得。例如，对于核酸片段的获得，可以从已知的质粒中扩增获得，也可以采用其他任意人工合成的手段获得。对于核酸片段的来源，可以来自商业化的载体、菌株，本发明对此不做限定。作为一个实施例，本发明提供的CRISPR工具质粒的构建方法包括：

从质粒pNA0306中扩增获得Cas9表达模块(包括启动子，编码Cas9的核酸和终止子)；

从质粒pNA0304中扩增获得含有gRNA片段(包括启动子、gRNA序列和终止子)；

将Cas9表达模块、gRNA片段连接入骨架载体pRS416，获得所述CRISPR工具质粒。

本发明构建的Donor载体中，主要包括RAF1或REP2的同源片段。为了构建方便，还包括线性化的酶切位点。在本发明的实施例中，所述Donor质粒中连接有RFP片段，其为红色荧光蛋白。RFP在Donor质粒中可以作为表达的目标片段，在对其他目的片段进行表达时，可将其他片段对RFP片段进行替换。RFP在Donor质粒中也可作为荧光标记，在对其他目的片段进行表达时，将其他片段直接插入Donor质粒中。

本发明提供的Donor质粒用于导入目标基因，本发明中，构建的2个Donor质粒分别为pDonorRAF1和pDonorREP2。其中：

pDonorREP2的基因型为：pSB1C3_P_TDH3-RFP-T_ADH1_KanMX6(RC)_T_CPS1(RC)_homoREP2(RC)_T_REP2(RC)。

pDonorRAF1的基因型为：pSB1C3_P_TDH3-RFP-T_ADH1_KanMX6(RC)_T_PGI1(RC)_homoRAF1(RC)_T_RAF1(RC)

本发明对Donor质粒的构建方法不做限定，其可以采用本领域熟知的任意手段制备获得。例如，对于核酸片段的获得，可以从已知的质粒中扩增获得，也可以采用其他任意人工合成的手段获得。对于核酸片段的来源，可以来自商业化的载体、菌株，本发明对此不做限定。

作为一个实施例，本发明所述pDonorRAF1的构建方法包括：

从酵母CEN.PK2.1C基因组扩增获得RAF1同源臂A，和RAF1同源臂B和T_PGI1，连接获得Tho片段；

从质粒pRS425RK中扩增获得KanMX6片段和rfp片段；

将Tho片段、KanMX6片段和rfp片段插入质粒pSB1C3获得pDonorRAF1。

作为一个实施例，本发明所述pDonor REP2的构建方法包括：

从酵母CEN.PK2.1C基因组扩增获得REP2同源片段1和REP2同源片段2；

从pDonorRAF1中酶切获得REP2同源片段3；

将REP2同源片段1、REP2同源片段2、REP2同源片段3连接入线性化的pDonorRAF1，获得pDonor REP2。

本发明所述的多拷贝基因表达质粒是在天然2μ质粒中引入目的片段。本发明对所述多拷贝基因表达质粒的制备方法不做限定，其可采用任意本领域熟知的手段制备获得。在本发明中，所述多拷贝基因表达质粒由所述CRISPR工具质粒和所述的Donor质粒对酿酒酵母编辑获得。在酵母菌中编辑获得所述的多拷贝基因表达质粒后，提取酵母质粒，转化入大肠杆菌中，对所述的多拷贝基因表达质粒进行扩增和保存。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

表1文中涉及缩写及简称

表2本发明中所构建及使用的所有质粒信息

表3本发明中相关的酿酒酵母

表4本发明中所用的引物及gRNA序列

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例

1、CRISPR工具质粒pCasRAF1,pCasE2μ的构建

pCasRAF1用于胞内编辑切割酿酒酵母野生内源2μ质粒以导入目的基因片段，pCasE2μ用于胞内编辑切割质粒pE2μRAF1以插入基因tpi1。

1)、pCasRAF1构建

以质粒pNA0306为模板，以18Q3-cas9-F,18Q3-cas9-R，利用PCR扩增出片段cas9(含有元件P_TEF1-Cas9-T_CYC1)；

以pNA0304为模板，以18Q3-pSNR52-F，18Q0b-pSNR52-R为引物，利用PCR扩增出片段18Q0b-p；

以pNA0304为模板，以18Q0b-gRNA-F，18Q3-cyc1t-R为引物，利用PCR扩增出片段18Q0b-g；

以18Q0b-g和18Q0b-p的混合物为模板，以18Q3-cyc1t-R，18Q3-pSNR52-F为引物，通过OE-PCR的方式扩增得到片段18Q0b-pg；

将质粒pRS416用限制性内切酶NotI和KpnI处理，得到片段pRS416-KN；

片段cas9用限制性内切酶SphI和KpnI处理得到片段cas9-SK；片段18Q0b-pg用限制性内切酶SphI和NotI处理得到片段18Q0b-pg-SN。

将18Q0b-pg-SN,pRS416-KN,cas9-SK三个片段通过T4连接酶连接得到质粒pCasRAF1(图谱如图9)。

2)、pCasREP2构建

pCasREP2的构建与pCasRAF1的构建过程类似，其中片段cas9来自质粒pNA0306，包含gRNA及其启动子和终止子的片段来自质粒pNA0304。

3)、pCasE2μ的构建

以pNA0304为模板，以18Q3-pSNR52-F，18Q0l-pSNR52-R为引物，利用PCR扩增出片段18Q0l-p；

以pNA0304为模板，以18Q0l-gRNA-F，18Q3-cyc1t-R为引物，利用PCR扩增出片段18Q0l-g；

以18Q0l-g和18Q0l-p的混合物为模板，以18Q3-cyc1t-R，18Q3-pSNR52-F为引物，通过OE-PCR的方式扩增得到片段18Q0l-pg；

片段18Q0l-pg用限制性内切酶SphI和NotI处理得到片段18Q0l-pg-SN。将18Q0l-pg-SN,18Q0-SN两个个片段通过T4连接酶连接得到质粒pCasE2μ。

2、Donor质粒的构建

Donor质粒pDonorRAF1和pDonorDCA拥有两段野生2μ质粒的同源臂(T_RAF1和homoRAF1)，可通过同源重组，整合到2μ质粒上的RAF1基因的下游。两段同源臂之间添加了PmeI酶切位点，便于线性化。

1)pDonorRAF1构建

以CEN.PK2.1C的基因组为模板，以18Q2a-pgi1t-R，18Q2a-pgi1t-F为引物扩增出片段T_GPI1；

以CEN.PK2.1C的基因组为模板，以18Q2a-homodown-F和18Q2a-homodown-R为引物扩增出片段homoRAF1；

以CEN.PK2.1C的基因组为模板，以18Q2a-homoup-F和18Q2a-homoup-R为引物扩增出片段T_RAF1。

以homoRAF1，T_GPI1和T_RAF1的混合物为模板，以18Q2a-pgi1t-F和18Q2a-homoup-R为引物通过OE-PCR扩增得到片段Tho.

以pRS425RK为模板，以18Q4-pTDH3-F和18Q4-adh1t-R为引物扩增出片段rfp；

以pRS425RK为模板，以18Q4a-kanMX6-F和18Q4a-kanMX6-R为引物扩增出片段kan；

将片段Tho用限制性内切酶PstI和XbaI处理得到片段Tho-PX；片段rfp用EcoRI,XhoI处理得到片段rfp-EX；kan用XhoI和XbaI处理得到kan-XX；pSB1C3用PstI和EcoRI处理得到片段1C3-PE。

将片段Tho-PX,rfp-EX,kan-XX和1C3-PE用T4连接酶连接得到质粒pDonorRAF1(质粒图谱如图10)。

2)pDonorREP2构建

以CEN.PK2.1C的基因组为模板，以18Q4f0b-2u-F，18Q4f0b-2u-R为引物扩增出片段18Q4f0b；

以CEN.PK2.1C的基因组为模板，以18Q4f0-D-R，18C1a-cps1t-F为引物扩增出片段cps1t；

以18C1a-rep2-R，18Q4f0-D-F为引物扩增出rep2；以rep2，cps1t混合物为模板，以18Q4f0-D-F，18Q4f0-D-R为引物，通过OE-PCR扩增出片段18Q4f0a；

以pDonorRAF1为模板，18Q4f0-g418-F和18Q4f0-adh1t-F为引物扩增出片段18Q4f0c。

18Q4f0a用内切酶BamHI和XbaI处理得到片段18Q4f0a-BX；18Q4f0b用内切酶NotI,BamHI处理得到片段18Q4f0b-NB；18Q4f0c用XbaI,SalI处理得到18Q4f0c-XS；pDonorRAF1用NotI和SalI处理得到片段pDonor-NS。

将18Q4f0a-BX，18Q4f0b-NB，18Q4f0c-XS，pDonor-NS用T4连接酶连接得到质粒pDonorREP2(质粒图谱如图11)。

3)pDonorDCA构建

将pDonorRAF1用BsaI处理，得到片段pDonor-B；

将质粒质粒p425DCA用限制性内切酶BamHI,XhoI，BsaI处理，得到片段DCA-BX(包含DBR2基因、ADS基因和CYP71AV1基因)。

将pDonor-B与DCA-BX用T4连接酶连接得到质粒pDonorDCA(质粒图谱如图12)。3、酿酒酵母菌株及多拷贝基因表达质粒的构建

1)SyBE_Sc01130382和SyBE_Sc01130438的构建，及质粒pE2μRAF1,pE2μREP2的获取(如何构建pE2μ多拷贝质粒系统)

1.1菌株SyBE_Sc01130382和质粒pE2μRAF1的构建

将pDonorRAF1用PmeI处理，然后将所得片段(3μg)与质粒pCasRAF1(500ng)混合后转化至宿主菌株CEN.PK2.1C中，然后涂布在SC-ura+g418的固体培养平板上，于30℃下培养3天。

挑取红色单菌落，划线富集于SC-ura+g418的固体培养平板上，于30℃下培养1天。

利用菌落PCR进行验证，挑取正确的菌落至YPD液体中于30℃培养24h，将培养物涂布于5-FOA+g418固体培养平板上，30℃培养3天，以丢掉质粒pCasRAF1。

挑取单菌落，至YPD液体中于30℃培养12-16h，得到菌株SyBE_Sc01130382。

提取酵母菌株SyBE_Sc01130382的酵母质粒，回转至E.coliDH5α感受态细胞中，涂布于LB+Cm固体培养基中，37℃培养16h，挑取单菌落至LB+Cm液体培养基中，培养12h，存甘油菌，并提取培养物的质粒，获得pE2μRAF1(构建过程如图13)。

1.2菌株SyBE_Sc01130438和质粒pE2μREP2的构建

将pDonorREP2用PmeI处理，然后将所得片段(3μg)与质粒pCasREP2(500ng)混合后转化至宿主菌株CEN.PK2.1C中，然后涂布在SC-ura+g418的固体培养平板上，于30℃下培养3天。

挑取红色单菌落，划线富集于SC-ura+g418的固体培养平板上，于30℃下培养1天。

利用菌落PCR进行验证，挑取正确的菌落至YPD液体中于30℃培养24h，将培养物涂布于5-FOA+g418固体培养平板上，30℃培养3天，以丢掉质粒pCasREP2。

挑取单菌落，至YPD液体中于30℃培养12-16h，得到菌株SyBE_Sc01130438。

提取酵母菌株SyBE_Sc01130382的酵母质粒，回转至E.coliDH5α感受态细胞中，涂布于LB+Cm固体培养基中，37℃培养16h，挑取单菌落至LB+Cm液体培养基中，培养12h，存甘油菌，并提取培养物的质粒，获得pE2μREP2。

2)SyBE_Sc01130594的构建(△tpi1，PE2μRT)

以CEN.PK2.1C为模板，以20QRcT-F1，20QRcT-R1为引物，扩增出片段TPI1-1；

以TPI1-1为模板，以20QRcT-F2，20QRcT-R2为引物，扩增出片段TPI1-2；

以TPI1-2为模板，以20QRcT-F3，20QRcT-R3为引物，扩增出片段TPI1-3；

将TPI1-3(3μg)与pCasE2μ(500ng)混合后,转化至菌株SyBE_Sc01130382中，然后涂布在SC-ura+g418的固体培养平板上筛选，经菌落PCR验证后，得到中间菌株SyBE_Sc01130591。

以质粒p425DCA为模板，以20dTPI1-leu2-F1，20dTPI1-leu2-R1为引物，扩增出片段dTL-1；

以dTL-1为模板，以20dTPI1-leu2-F2，20dTPI1-leu2-R2为引物，扩增出片段dTL-2；

以dTL-2为模板，以20dTPI1-leu2-F3,20dTPI1-leu2-R3为引物扩增得到片段dTL-3。

将dTL-3转化至菌株SyBE_Sc01130591中，涂布于SC-leu固体培养平板上筛选，经菌落PCR验证后得到菌株SyBE_Sc01130594(质粒图谱如图14)。

3)SyBE_Sc01130343的构建

将pDonorDCA用PmeI处理，然后将所得片段(3μg)与质粒pCasRAF1(500ng)混合后转化至宿主菌株SyBE_Sc01130341中,然后涂布在SC-ura+g418的固体培养平板上筛选，经菌落PCR验证后，得到中间菌株SyBE_Sc01130343。

4)SyBE_Sc01130584的构建

将TPI1-3(3μg)与pCasE2μ(500ng)混合后,转化至菌株SyBE_Sc01130343中，然后涂布在SC-ura+g418的固体培养平板上筛选，经菌落PCR验证后，得到中间菌株SyBE_Sc01130582。

将dTL-3转化至菌株SyBE_Sc01130582中，涂布于SC-leu固体培养平板上筛选，经菌落PCR验证后得到菌株SyBE_Sc01130584

5)对照菌株SyBE_Sc01130534，SyBE_Sc01130366，SyBE_Sc01130530的构建

将质粒pRS425RK转化至CEN.PK2.1C中,涂布于SC-leu固体培养平板上筛选，挑取单菌落，得到菌株SyBE_Sc01130534；

将质粒p425DCA转化至菌株SyBE_Sc01130341中,涂布于SC-leu固体培养平板上筛选，挑取单菌落，得到菌株SyBE_Sc01130366。将质粒p425RT转化至CEN.PK2.1C中,涂布于SC-leu固体培养平板上筛选，挑取单菌落，得到中间菌株SyBE_Sc01130527，

以20dTPI1-his3-F1，20dTPI1-his3-R1为引物，扩增出片段dTH-1；以dTH-1为模板，以20dTPI1-his3-F2，20dTPI1-his3-R2为引物，扩增出片段dTH-2；以dTH-2为模板，以20dTPI1-his3-F3,20dTPI1-his3-R3为引物扩增得到片段dTH-3。将dTH-3转化至菌株SyBE_Sc01130527中，涂布于SC-his-leu固体培养平板上筛选，经菌落PCR验证后得到菌株SyBE_Sc01130530。

4、pE2μ多拷贝质粒系统表征(传代实验表征)

为了表征pE2μ多拷贝质粒系统的优良特性，本方案以rfp为报告基因，首先对菌株SyBE_Sc01130382与使用传统多拷贝质粒的进行过表达的菌株SyBE_Sc01130534，进行了质粒稳定性的测试。方法如下：

挑取SyBE_Sc01130382，SyBE_Sc01130438和SyBE_Sc01130534的单菌落，至YPD+G418液体培养基中,于30℃培养16h。之后以初始OD600＝0.05转接至新鲜的YPD+G418液体培养基中,于30℃培养10h，该培养物记为0代样品，测定其荧光强度及OD600。将该培养物以初始OD600＝0.05转接至新鲜的YPD，于30℃培养5代(至OD600＝1.6-2.0,约10h,倍增时间约2h)。之后，再将培养物以OD600＝0.05转接至新鲜的YPD，于30℃培养5代，依次类推培养30代。将0代，5代，10代，20代，30代的样品，用流式细胞仪(NovoCyte D2040R)，测定荧光强度分布，用酶标仪(SpectraMAX M2,Molecular Devices)测定平均荧光强度。5代，10代，20代，30代样品经过10000倍稀释，涂布于YPD和YPD+G418固体培养平板上，30℃培养48h，记录菌落数，计算质粒存活率＝菌落数(YPD+G418)/菌落数(YPD)。

表征结果如图1，2，3，4所示。在0代时(有筛选压的情况下)，相较于使用传统2μ质粒(pRS425RK),使用pE2μ系统表达的RFP，细胞个体间的差异性更小(CV％更小)，同时相对平均荧光强度也更高，其中使用pE2μRAF1的菌株的平均荧光强度是对照的3.67倍，使用pE2μREP2的菌株是3.42倍。pE2μ系列的质粒的平均拷贝数也更高，是对照的约1.67倍。

随着在YPD培养基中的传代实验的进行，所有的菌株都在30代后都有大量细胞丢失质粒。对照菌株在传了10代左右时88％-89％的细胞都丢失了质粒，而pE2μ系列的多拷贝质粒，10代的时候只有约20％-23％的细胞丢失了质粒。含pE2μ系列的质粒的菌株在没有筛选压力的条件下拥有更高的质粒稳定性。

5、pE2μ多拷贝质粒系统表征(必需基因tpi1的营养缺陷型优化的表征)

为了解决在没有筛选压条件下质粒会丢失的问题，本方案将必需基因tpi1导入质粒中并敲除了染色体上原有的质粒，使得丢失质粒的细胞在任何条件下都无法存活。

这一策略在使用传统2μ质粒的菌株和用pE2μ质粒系统的菌株上都进行了应用，构建出了菌株SyBE_Sc01130530和SyBE_Sc01130594。之后对这两株菌进行了长达90代的传代实验，并测定了其个体细胞荧光分布，以及拷贝数。结果显示，90代时，所有细胞在平板上均呈现红色，即SyBE_Sc01130530和SyBE_Sc01130594可以在90代无筛选压得培养下保持质粒不丢失。在0代时，SyBE_Sc01130594的拷贝数可以达到18.3，是没有经过优化的SyBE_Sc01130382的1.76倍，SyBE_Sc01130530的质粒拷贝数可达到10.8，是没有经过优化的SyBE_Sc01130534的1.80倍。使用pE2μ多拷贝质粒体系的菌株的质粒拷贝数依然比使用传统的2μ质粒菌株的质粒拷贝数高。经过90代的无筛选压传代实验，SyBE_Sc01130594和SyBE_Sc01130530的拷贝数均有所下降，不过SyBE_Sc01130594的拷贝数仅下降8.74％至16.7，而SyBE_Sc01130530的拷贝数则下降38.2％至6.67。而SyBE_Sc01130594的荧光分布比SyBE_Sc01130530的荧光分布更加收敛(CV％更低)，SyBE_Sc01130594中每个细胞的质粒拷贝数更加均一，并且随着传代进行，SyBE_Sc01130594的CV％的上升幅度(提高20.2％)也小于SyBE_Sc01130530(提高37％)。

6、pE2μ多拷贝质粒系统表征(用pE2μ多拷贝质粒系统对二氢青蒿酸合成路径进行优化)

菌株SyBE_Sc01130366为对照菌株，用传统2μ质粒表达二氢青蒿酸合成关键基因ADS,CYP71AV1,DBR2。利用pE2μ多拷贝质粒系统过表达ADS,CYP71AV1,DBR2构建出菌株SyBE_Sc01130343,再通过将必需基因tpi1导入质粒并敲除染色体上的tpi1来进行优，构建出菌株SyBE_Sc01130584(CGMCC NO.21335)。

(1)培养基配制

发酵测试中所用所有培养基YPD培养基，其配方如下：

40g/L葡萄糖，酵母提取物10g/L,蛋白胨20g/L,无水MgSO₄ 4g/L

(2)种子培养

将菌株SyBE_Sc011300366在SC固体培养基(20g/L葡萄糖，6.7g/L酵母氮源，10ml/L氨基酸溶液，20mg/L腺嘌呤，20g/L琼脂粉)上划线分纯，SyBE_Sc01130584和SyBE_Sc01130343于YPD+G418的培养基上划线分纯，置于30℃培养3天。之后，挑取单菌落，接入3mL有筛选压得液体培养基(SyBE_Sc011300366接入SC-leu培养基，SyBE_Sc01130584和SyBE_Sc01130343于YPD+G418培养基中)，于30℃培养16-20h，此时OD600值为5-8，以初始OD600＝0.05转接至另一个含3ml液体培养基的试管中，置于30℃培养12-16h。

(3)摇瓶发酵过程

将上一步的培养物，以初始OD600＝0.05转接到含25mlYPD培养基的药瓶中中，置于30℃摇床培养，摇床转速为200r/min。在36h左右补充625μl/瓶的无水乙醇，并加入5ml正十二烷进行萃取发酵，发酵条件依旧时30℃，摇床转速为200r/min。总共发酵时间为120小时。

(4)产物提取与测定

从摇瓶中取的样品，12000r/min离心，分离出上层IPM有机相，用甲醇溶解稀释20倍后进紫外-高效液相色谱进行产物测定。高效液相色谱仪器方法如下：色谱柱为ThermoC18高效液相色谱柱(4.6mm×150mm×5μm)，柱温25℃；进样量为10μL，总流速为1mL/min，流动相A为乙腈+0.1％甲酸，流动相B为65％乙腈+0.1％甲酸水溶液，梯度程序如下：0-3min，维持0％A，100％B；3-10min A由0％均匀上升至100％；10-13min维持100％A；13min-15minA相由100％均匀下降至0％，并维持0％A,100％B至20min。

(5)摇瓶发酵结果如下图所示

使用pE2μ多拷贝质粒系统的菌株SyBE_Sc01130343的二氢青蒿酸产量达到519.2mg/L,而使用pC2μ质粒进行过表达仅仅产生131.0mg/L。经过必需基因tpi1优化的菌株(SyBE_Sc01130584)二氢青蒿酸的产量可进一步提高至620.9mg/L，青蒿酸的产量也由351mg/L升至390mg/L。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

参考文献

Christianson,T.W.,Sikorski,R.S.,Dante,M.,Shero,J.H.,and Hieter,P.(1992).Multifunctional yeast high-copy-number shuttle vectors.Gene 110(1),119-122.doi:10.1016/0378-1119(92)90454-w.

Futcher,A.B.(1986).Copy number amplification of the 2 micron circleplasmid of Saccharomyces cerevisiae.Journal of Theoretical Biology 119(2),197-204.

Gnügge,R.,and Rudolf,F.(2017).Saccharomyces cerevisiae Shuttlevectors.Yeast 34(5).

Karim,A.S.,Curran,K.A.,and Alper,H.S.(2013).Characterization ofplasmid burden and copy number in Saccharomyces cerevisiae for optimizationof metabolic engineering applications.Fems Yeast Research(1),1.

McQuaid,M.E.,Pinder,J.B.,Arumuggam,N.,Lacoste,Jessica S.C.,Chew,JoyceS.K.,and Dobso,M.J.(2017).The yeast 2-μm plasmid Raf protein contributes toplasmid inheritance by stabilizing the Rep1 and Rep2 partitioningproteins.Nucleic Acids Research.

Rizvi,S.M.A.,Prajapati,H.K.,and Ghosh,S.K.(2017).The 2 micronplasmid:a selfish genetic element with an optimized survival strategy withinSaccharomyces cerevisiae.Current Genetics.

Xie,Z.X.,Mitchell,L.A.,Liu,H.M.,Li,B.Z.,Liu,D.,Agmon,N.,et al.(2018).Rapid and Efficient CRISPR/Cas9-Based Mating-Type Switching of Saccharomycescerevisiae.G3(Bethesda)8(1),173-183.doi:10.1534/g3.117.300347.

Zeng,B.-X.,Yao,M.-D.,Wang,Y.,Xiao,W.-H.,and Yuan,Y.-J.(2020).Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiae for EnhancedDihydroartemisinic Acid Production.Frontiers in Bioengineering andBiotechnology 8.

序列表

<110> 天津大学

<120> 质粒载体及其在构建多拷贝表达系统中的应用

<130> MP2034954

<160> 50

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4140

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggacaaga agtactccat tgggctcgat atcggcacaa acagcgtcgg ctgggccgtc 60

attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 120

cacagcataa agaagaacct cattggcgcc ctcctgttcg actccgggga gacggccgaa 180

gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa tcggatctgc 240

tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt cttccatagg 300

ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc aatctttggc 360

aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca tctgaggaag 420

aagcttgtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc gctggcgcat 480

atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga caacagcgat 540

gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga agagaacccg 600

atcaacgcat ccggagttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc caaatcccgg 660

cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct gtttggtaat 720

cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga cctggccgaa 780

gatgccaagc ttcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc agacgccatt 900

ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct gagcgctagt 960

atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc ccttgtcaga 1020

cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa tggctacgcc 1080

ggatacattg acggcggagc aagccaggag gaattttaca aatttattaa gcccatcttg 1140

gaaaaaatgg acggcaccga ggagctgctg gtaaagctta acagagaaga tctgttgcgc 1200

aaacagcgca ctttcgacaa tggaagcatc ccccaccaga ttcacctggg cgaactgcac 1260

gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag ggaaaagatt 1320

gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgcccg gggaaattcc 1380

agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gagaccatca ctccctggaa cttcgaggaa 1440

gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa ctttgataaa 1500

aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta cttcacagtt 1560

tataacgagc tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc agcattcctg 1620

tctggagagc agaagaaagc tatcgtggac ctcctcttca agacgaaccg gaaagttacc 1680

gtgaaacagc tcaaagaaga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc tgttgaaatc 1740

agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct cctgaaaatc 1800

attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga ggacattgtc 1860

ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa aacttacgct 1920

catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagaggc gccgatatac aggatggggg 1980

cggctgtcaa gaaaactgat caatgggatc cgagacaagc agagtggaaa gacaatcctg 2040

gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat ccatgatgac 2100

tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagttt ctggccaggg ggacagtctt 2160

cacgagcaca tcgctaatct tgcaggtagc ccagctatca aaaagggaat actgcagacc 2220

gttaaggtcg tggatgaact cgtcaaagta atgggaaggc ataagcccga gaatatcgtt 2280

atcgagatgg cccgagagaa ccaaactacc cagaagggac agaagaacag tagggaaagg 2340

atgaagagga ttgaagaggg tataaaagaa ctggggtccc aaatccttaa ggaacaccca 2400

gttgaaaaca cccagcttca gaatgagaag ctctacctgt actacctgca gaacggcagg 2460

gacatgtacg tggatcagga actggacatc aatcggctct ccgactacga cgtggatcat 2520

atcgtgcccc agtcttttct caaagatgat tctattgata ataaagtgtt gacaagatcc 2580

gataaaaata gagggaagag tgataacgtc ccctcagaag aagttgtcaa gaaaatgaaa 2640

aattattggc ggcagctgct gaacgccaaa ctgatcacac aacggaagtt cgataatctg 2700

actaaggctg aacgaggtgg cctgtctgag ttggataaag ccggcttcat caaaaggcag 2760

cttgttgaga cacgccagat caccaagcac gtggcccaaa ttctcgattc acgcatgaac 2820

accaagtacg atgaaaatga caaactgatt cgagaggtga aagttattac tctgaagtct 2880

aagctggtct cagatttcag aaaggacttt cagttttata aggtgagaga gatcaacaat 2940

taccaccatg cgcatgatgc ctacctgaat gcagtggtag gcactgcact tatcaaaaaa 3000

tatcccaagc ttgaatctga atttgtttac ggagactata aagtgtacga tgttaggaaa 3060

atgatcgcaa agtctgagca ggaaataggc aaggccaccg ctaagtactt cttttacagc 3120

aatattatga attttttcaa gaccgagatt acactggcca atggagagat tcggaagcga 3180

ccacttatcg aaacaaacgg agaaacagga gaaatcgtgt gggacaaggg tagggatttc 3240

gcgacagtcc ggaaggtcct gtccatgccg caggtgaaca tcgttaaaaa gaccgaagta 3300

cagaccggag gcttctccaa ggaaagtatc ctcccgaaaa ggaacagcga caagctgatc 3360

gcacgcaaaa aagattggga ccccaagaaa tacggcggat tcgattctcc tacagtcgct 3420

tacagtgtac tggttgtggc caaagtggag aaagggaagt ctaaaaaact caaaagcgtc 3480

aaggaactgc tgggcatcac aatcatggag cgatcaagct tcgaaaaaaa ccccatcgac 3540

tttctcgagg cgaaaggata taaagaggtc aaaaaagacc tcatcattaa gcttcccaag 3600

tactctctct ttgagcttga aaacggccgg aaacgaatgc tcgctagtgc gggcgagctg 3660

cagaaaggta acgagctggc actgccctct aaatacgtta atttcttgta tctggccagc 3720

cactatgaaa agctcaaagg gtctcccgaa gataatgagc agaagcagct gttcgtggaa 3780

caacacaaac actaccttga tgagatcatc gagcaaataa gcgaattctc caaaagagtg 3840

atcctcgccg acgctaacct cgataaggtg ctttctgctt acaataagca cagggataag 3900

cccatcaggg agcaggcaga aaacattatc cacttgttta ctctgaccaa cttgggcgcg 3960

cctgcagcct tcaagtactt cgacaccacc atagacagaa agcggtacac ctctacaaag 4020

gaggtcctgg acgccacact gattcatcag tcaattacgg ggctctatga aacaagaatc 4080

gacctctctc agctcggtgg agacagcagg gctgacccca agaagaagag gaaggtgtga 4140

<210> 2

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaaaatcacg taatacttct gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtggtgct ttttttgttt tttatgtct 119

<210> 3

<211> 119

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaaatcacg taatacttct gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60

cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtggtgct ttttttgttt tttatgtct 119

<210> 4

<211> 249

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttattataca ggttcaaata tactatctgt ttcagggaaa actcccaggt tcggatgttc 60

aaaattcaat gatgggtaac aagtacgatc gtaaatctgt aaaacagttt gtcggatatt 120

aggctgtatc tcctcaaagc gtattcgaat atcattgaga agctgcagcg tcacatcgga 180

taataatgat ggcagccatt gtagaagtgc cttttgcatt tctagtctct ttctcggtct 240

agctagttt 249

<210> 5

<211> 130

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctacaaaatg aagcacagat gcttcgttaa caaagatatg ctattgaagt gcaagatgga 60

aacgcagaaa atgaaccggg gatgcgacgt gcaagattac ctatgcaata gatgcaatag 120

tttctccagg 130

<210> 6

<211> 382

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcatactctt gatgtgtttc ttgattttct gccccttacc ctcgttgcta ctctcctttt 60

tttcgtggga accgctttag ggccctcagt gatggtgttt tgtaatttat atgctcctct 120

tgcatttgtg tctctacttc ttgttcgcct ggagggaact tcttcatttg tattagcatg 180

gttcacttca gtccttcctt ccaactcact ctttttttgc tgtaaacgat tctctgccgc 240

cagttcattg aaactattga atatatcctt tagagattcc gggatgaata aatcacctat 300

taaagcagct tgacgatctg gtggaactaa agtaagcaat tgggtaacga cgcttacgag 360

cttcataaca tcttcttccg tt 382

<210> 7

<211> 163

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggatgaaag gtagtctagt acctcctgtg atattatccc attccatgcg gggtatcgta 60

tgcttccttc agcactaccc tttagctgtt ctatatgctg ccactcctca attggattag 120

tctcatcctt caatgctatc atttcctttg atattggatc ata 163

<210> 8

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atggctagaa ctttctttgt cggtggtaac tttaaattaa acggttccaa acaatccatt 60

aaggaaattg ttgaaagatt gaacactgct tctatcccag aaaatgtcga agttgttatc 120

tgtcctccag ctacctactt agactactct gtctctttgg ttaagaagcc acaagtcact 180

gtcggtgctc aaaacgccta cttgaaggct tctggtgctt tcaccggtga aaactccgtt 240

gaccaaatca aggatgttgg tgctaagtgg gttattttgg gtcactccga aagaagatct 300

tacttccacg aagatgacaa gttcattgct gacaagacca agttcgcttt aggtcaaggt 360

gtcggtgtca tcttgtgtat cggtgaaact ttggaagaaa agaaggccgg taagactttg 420

gatgttgttg aaagacaatt gaacgctgtc ttggaagaag ttaaggactg gactaacgtc 480

gttgtcgctt acgaaccagt ctgggccatt ggtaccggtt tggctgctac tccagaagat 540

gctcaagata ttcacgcttc catcagaaag ttcttggctt ccaagttggg tgacaaggct 600

gccagcgaat tgagaatctt atacggtggt tccgctaacg gtagcaacgc cgttaccttc 660

aaggacaagg ctgatgtcga tggtttcttg gtcggtggtg cttctttgaa gccagaattt 720

gttgatatca tcaactctag aaactaa 747

<210> 9

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

taacgcggta ccagctcata gcttcaaaat gtttctactc cttttttact c 51

<210> 10

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

gagctcgcat gcccgcaaat taaagccttc gagcgtccca aaac 44

<210> 11

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

taatcgggca tgcgagctct ctttgaaaag ataatgtatg attatgcttt c 51

<210> 12

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

aaacaaatac atacattgtc ttccgatcat ttatctttca ctgcggagaa gtttcg 56

<210> 13

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

cggaagacaa tgtatgtatt tgttttagag ctagaaatag caagttaaaa taaggc 56

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

ggataagaat gcggccgcaa agccttcgag cgtcccaaaa c 41

<210> 15

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

gatcgaaaat cacgtaatac ttctgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggc 59

<210> 16

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

gctctaaaac agaagtatta cgtgattttc gatcatttat ctttcactgc ggagaag 57

<210> 17

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

acgtgcccga tcaactcgag tgccacctat cttcagtggc atgtgagatt ctcc 54

<210> 18

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

cattatggtg aaagttggaa cctcttacgt gcccgatcaa ctcgagtgcc 50

<210> 19

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

caaaaaatac gcccggtagt gatcttattt cattatggtg aaagttggaa cctc 54

<210> 20

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

ttaatgtcat gataataatg gtttcttgta aatctaccgt cccttacaag aac 53

<210> 21

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttgta aatctac 57

<210> 22

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

ttttatctga aattctgcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catg 54

<210> 23

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

ccttttctgg catccagttt tgattcaaga aatatcttga ccgcag 46

<210> 24

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

cagcttcctc tattgatgtt acacctggac accccttttc tggcatccag ttttga 56

<210> 25

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 25

ttggtggaag attacccgtt ctaagacttt tcagcttcct ctattgatgt tacacc 56

<210> 26

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 26

aaaaagcgcc ttgctttttg tttgcaccat atcgactacg tcgtaag 47

<210> 27

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 27

ttcaattgtt aaatgctttt cttcttttta ttagaaaaag cgccttgctt tttgtttg 58

<210> 28

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 28

gttgatatag aggtgttcaa ttgttaaatg cttttcttct ttttattaga aaaagc 56

<210> 29

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 29

gttcggatgt gatgtgagaa ctggtagttt agtgtttttc ttccagtgcg ag 52

<210> 30

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 30

aaacgcggat ccaaatcgct cttaaatata tacctaaaga ac 42

<210> 31

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 31

ttacgcggat ccttattata caggttcaaa tatactatct gtttcaggga aaac 54

<210> 32

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 32

atctgtgctt cattttgtag gtttaaacta gctagaccga gaaagagact agaaatg 57

<210> 33

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 33

ttctcggtct agctagttta aacctacaaa atgaagcaca gatgcttcgt taacaaag 58

<210> 34

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 34

tttaggacta gtcctggaga aactattgca tctattgcat ag 42

<210> 35

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 35

ttaccggaat tcggatccga gaccagttta tcattatcaa tactgccatt tcaaagaat 59

<210> 36

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 36

acatacgtct cagtagctcg aggagaccgg tagaggtgtg gtcaataaga g 51

<210> 37

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 37

tacggtctag agatctgttt agcttgcctc gtccccgccg 40

<210> 38

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 38

tctaccggtc tcctcgagct actggatggc ggcgttagta tcg 43

<210> 39

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 39

tcataatggt ttcttagacg tcgttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataagg 56

<210> 40

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 40

gctctaaaac gacgtctaag aaaccattat gatcatttat ctttcactgc ggagaag 57

<210> 41

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 41

gggcgtcgac agctttggac ttcttcgcc 29

<210> 42

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 42

aatggtctag acccggccag cgacatggag gcccagaata ccctc 45

<210> 43

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 43

cagatctcta gaccatttga cacttgattt gacacttctt ttttttttta tttatg 56

<210> 44

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 44

tcaataggat ccgtttaaac ggaagaagat gttatgaagc tcg 43

<210> 45

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 45

gtttaaacgg atcccggatg aaaggtagtc tagtacctcc tgtg 44

<210> 46

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 46

ttatagcggc cgcactagtt atgatccaat atcaaaggaa atgatagca 49

<210> 47

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 47

atcattgcgc actagtcata ctcttgatgt gtttcttgat tttctgcccc ttaccctcg 59

<210> 48

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 48

aaatcaagaa acacatcaag agtatgacta gtgcgcaatg attgaatagt caaagatt 58

<210> 49

<211> 9909

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 49

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatcga ctacgtcgta aggccgtttc tgacagagta aaattcttga gggaactttc 240

accattatgg gaaatgcttc aagaaggtat tgacttaaac tccatcaaat ggtcaggtca 300

ttgagtgttt tttatttgtt gtattttttt ttttttagag aaaatcctcc aatatcaaat 360

taggaatcgt agtttcatga ttttctgtta cacctaactt tttgtgtggt gccctcctcc 420

ttgtcaatat taatgttaaa gtgcaattct ttttccttat cacgttgagc cattagtatc 480

aatttgctta cctgtattcc tttactatcc tcctttttct ccttcttgat aaatgtatgt 540

agattgcgta tatagtttcg tctaccctat gaacatattc cattttgtaa tttcgtgtcg 600

tttctattat gaatttcatt tataaagttt atgtacaaat atcataaaaa aagagaatct 660

ttttaagcaa ggattttctt aacttcttcg gcgacagcat caccgacttc ggtggtactg 720

ttggaaccac ctaaatcacc agttctgata cctgcatcca aaaccttttt aactgcatct 780

tcaatggcct taccttcttc aggcaagttc aatgacaatt tcaacatcat tgcagcagac 840

aagatagtgg cgatagggtc aaccttattc tttggcaaat ctggagcaga accgtggcat 900

ggttcgtaca aaccaaatgc ggtgttcttg tctggcaaag aggccaagga cgcagatggc 960

aacaaaccca aggaacctgg gataacggag gcttcatcgg agatgatatc accaaacatg 1020

ttgctggtga ttataatacc atttaggtgg gttgggttct taactaggat catggcggca 1080

gaatcaatca attgatgttg aaccttcaat gtagggaatt cgttcttgat ggtttcctcc 1140

acagtttttc tccataatct tgaagaggcc aaaagattag ctttatccaa ggaccaaata 1200

ggcaatggtg gctcatgttg tagggccatg aaagcggcca ttcttgtgat tctttgcact 1260

tctggaacgg tgtattgttc actatcccaa gcgacaccat caccatcgtc ttcctttctc 1320

ttaccaaagt aaatacctcc cactaattct ctgacaacaa cgaagtcagt acctttagca 1380

aattgtggct tgattggaga taagtctaaa agagagtcgg atgcaaagtt acatggtctt 1440

aagttggcgt acaattgaag ttctttacgg atttttagta aaccttgttc aggtctaaca 1500

ctaccggtac cccatttagg accagccaca gcacctaaca aaacggcatc aaccttcttg 1560

gaggcttcca gcgcctcatc tggaagtggg acacctgtag catcgatagc agcaccacca 1620

attaaatgat tttcgaaatc gaacttgaca ttggaacgaa catcagaaat agctttaaga 1680

accttaatgg cttcggctgt gatttcttga ccaacgtggt cacctggcaa aacgacgatc 1740

ttcttagggg cagacatagg ggcagacatt agaatggtat atccttgaaa tatatatata 1800

tattgctgaa atgtaaaagg taagaaaagt tagaaagtaa gacgattgct aaccacctat 1860

tggaaaaaac aataggtcct taaataatat tgtcaacttc aagtattgtg atgcaagcat 1920

ttagtcatga acgcttctct attctatatg aaaagccggt tccggcctct cacctttcct 1980

ttttctccca atttttcagt tgaaaaaggt atatgcgtca ggcgacctct gaaattaaca 2040

aaaaatttcc agtcatcgaa tttgattctg tgcgatagcg cccctgtgtg ttctcgttat 2100

gttgaggaaa aaaataatgg ttgctaagag attcgaactc ttgcatctta cgatacctga 2160

gtattcccac agttaactgc ggtcaagata tttcttgaat caggcgcctt agaccgctcg 2220

gccaaacaac caattacttg ttgagaaata gagtataatt atcctataaa tataacgttt 2280

ttgaacacac atgaacaagg aagtacagga caattgattt tgaagagaat gtggattttg 2340

atgtaattgt tgggattcca tttttaataa ggcaataata ttaggtatgt ggatatacta 2400

gaagttctcc tcgaccgtcg atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa 2460

ataccgcatc aggaaattgt aaacgttaat attttgttaa aattcgcgtt aaatttttgt 2520

taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa 2580

gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag 2640

aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt 2700

gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac 2760

cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag 2820

gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg 2880

cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcgtc gcgccattcg 2940

ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc 3000

cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc 3060

cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gagcgcgcgt aatacgactc actatagggc 3120

gaattgggta ccgggccccc cctcgaggag accggtagag gtgtggtcaa taagagcgac 3180

ctcatgctat acctgagaaa gcaacctgac ctacaggaaa gagttactca agaataagaa 3240

ttttcgtttt aaaacctaag agtcacttta aaatttgtat acacttattt tttttataac 3300

ttatttaata ataaaaatca taaatcataa gaaattcgct tatttagaag tgtcaacaac 3360

gtatctacca acgatttgac ccttttccat cttttcgtaa atttctggca aggtagacaa 3420

gccgacaacc ttgattggag acttgaccaa acctctggcg aagaagtcca aagctgtcga 3480

cgcccttggt ctcactcatt atttatataa ttcatccata ccaccagttg aatgtctacc 3540

ttcagctctt tcatattgtt caacaatagt ataatcttca ttatgtgaag taatatccaa 3600

tttaatatta acattataag cacctggtaa ttgaactggt tttttagctt tataagtagt 3660

tttaacttca gcatcataat gaccaccatc ttttaatttc aatctttgtt taatttcacc 3720

ttttaaagca ccatcttctg gatacattct ttctgatgaa gcttcccaac ccatagtttt 3780

tttttgcata actggaccat ctgatggaaa attagtacct ctcaatttaa ctttataaat 3840

aaattcacca tcttgtaatg atgaatcttg agtaacagta acaacaccac catcttcaaa 3900

attcataact ctttcccatt taaaaccttc tggaaatgac aattttaaat aatctggaat 3960

atcagctgga tgtttaacat aagcttttga accatacata aattgtggtg acaaaatatc 4020

ccaagcaaat ggtaatggac cacctttagt aactttcaat ttagcagttt gagtaccttc 4080

atatggtcta ccttcacctt caccttcaat ttcaaattca tgaccattaa ctgaaccttc 4140

catatgaact ttaaatctca taaattcttt aataatagcc atattatctt cttcaccttt 4200

tgaaaccatt tgagacctct agatatagtt ttttctcctt gacgttaaag tatagaggta 4260

tattaacaat tttttgttga tacttttatg acatttgaat ttgctaagga atatacttac 4320

attcatggtt gtttgtaaat actgctgggt gcagcttttc catttatata cttattagtc 4380

aagtagggga ataatttcag ggaactggtt tcaacctttt ttttcagctt tttccaaatc 4440

agagagagca gaaggtaata gaaggtgtaa gaaaatgaga tagatacatg cgtgggtcaa 4500

ttgccttgtg tcatcattta ctccaggcag gttgcatcac tccattgagg ttgtgcccgt 4560

tttttgcctg tttgtgcccc tgttctctgt agttgcgcta agagaatgga cctatgaact 4620

gatggttggt gaagaaaaca atattttggt gctgggattc tttttttttc tggatgccag 4680

cttaaaaagc gggctccatt atatttagtg gatgccagga ataaactgtt cacccagaca 4740

cctacgatgt tatatattct gtgtaacccg ccccctattt tgggcatgta cgggttacag 4800

cagaattaaa aggctaattt tttgactaaa taaagttagg aaaatcacta ctattaatta 4860

tttacgtatt ctttgaaatg gcagtattga taatgataaa ctggtctcgg atcccagtat 4920

agcgaccagc attcacatac gattgacgca tgatattact ttctgcgcac ttaacttcgc 4980

atctgggcag atgatgtcga ggcgaaaaaa aatataaatc acgctaacat ttgattaaaa 5040

tagaacaact acaatataaa aaaactatac aaatgacaag ttcttgaaaa caagaatctt 5100

tttattgtca gtactgatta gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg caatttattc 5160

atatcaggat tatcaatacc atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac 5220

tcaccgaggc agttccatag gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt 5280

ccaacatcaa tacaacctat taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa 5340

tcaccatgag tgacgactga atccggtgag aatggcaaaa gcttatgcat ttctttccag 5400

acttgttcaa caggccagcc attacgctcg tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg 5460

ttattcattc gtgattgcgc ctgagcgaga cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa 5520

ttacaaacag gaatcgaatg caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt 5580

tcacctgaat caggatattc ttctaatacc tggaatgctg ttttgccggg gatcgcagtg 5640

gtgagtaacc atgcatcatc aggagtacgg ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata 5700

aattccgtca gccagtttag tctgaccatc tcatctgtaa catcattggc aacgctacct 5760

ttgccatgtt tcagaaacaa ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc 5820

gcacctgatt gcccgacatt atcgcgagcc catttatacc catataaatc agcatccatg 5880

ttggaattta atcgcggcct cgaaacgtga gtcttttcct tacccaggtt gtttatgttc 5940

ggatgtgatg tgagaactgt atcctagcaa gattttaaaa ggaagtatat gaaagaagaa 6000

cctcagtggc aaatcctaac cttttatatt tctctacagg ggcgcggcgt ggggacaatt 6060

caacgcgtct gtgaggggag cgtttccctg ctcgcaggtc tgcagcgagg agccgtaatt 6120

tttgcttcgc gccgtgcggc catcaaaatg tatggatgca aatgattata catggggatg 6180

tatgggctaa atgtacgggc gacagtcaca tcatgcccct gagctgcgca cgtcaagact 6240

gtcaaggagg gtattctggg cctccatgtc gcggccgcca ccgcggtgga gctccagctt 6300

ttgttccctt tagtgagggt taattgcgcg cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc 6360

tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc acacaacata ggagccggaa gcataaagtg 6420

taaagcctgg ggtgcctaat gagtgaggta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc 6480

cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg 6540

gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc 6600

ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac 6660

agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa 6720

ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca 6780

caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc 6840

gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata 6900

cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta 6960

tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca 7020

gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga 7080

cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg 7140

tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg 7200

tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg 7260

caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag 7320

aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa 7380

cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat 7440

ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc 7500

tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc 7560

atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc 7620

tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc 7680

aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc 7740

catccagtct attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt 7800

gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc 7860

ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa 7920

aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt 7980

atcactcatg gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg 8040

cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc 8100

gagttgctct tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa 8160

agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt 8220

gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt 8280

caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag 8340

ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta 8400

tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat 8460

aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt gccacctgaa cgaagcatct gtgcttcatt 8520

ttgtagaaca aaaatgcaac gcgagagcgc taatttttca aacaaagaat ctgagctgca 8580

tttttacaga acagaaatgc aacgcgaaag cgctatttta ccaacgaaga atctgtgctt 8640

catttttgta aaacaaaaat gcaacgcgag agcgctaatt tttcaaacaa agaatctgag 8700

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tacttctttt ttgttctaca aaaatgcatc ccgagagcgc tatttttcta acaaagcatc 8820

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

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tcgcttccgt tgttgttttc cttagtagcg tctgcttcca gagagtattt atctcttatt 9660

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gtattcgcaa tattttagta gctcgttaca gtccggtgcg tttttggttt tttgaaagtg 12960

cgtcttcaga gcgcttttgg ttttcaaaag cgctctgaag ttcctatact ttctagagaa 13020

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Claims (22)

1.I)～IV)中至少一种在构建多拷贝基因表达系统中的应用：

I)、RAF1基因或其同源片段；

II)、REP2基因或其同源片段；

III)、靶向RAF1基因或靶向RAF1基因上下游片段的gRNA；

IV)、靶向REP2基因或靶向REP2基因上下游片段的gRNA；

V)、与I)～IV)中任一项部分互补或完全互补的核酸。

2.CRISPR工具质粒，包括骨架载体、编码Cas9的核酸和gRNA；

所述gRNA靶向REP2基因下游片段或RAF1基因下游片段。

3.根据权利要求2所述的CRISPR工具质粒，其特征在于，其包括顺序连接的：P_TEF1、Cas9、T_CYC1、P_SNR52、gRNA、T_SUP4。

4.根据权利要求2或3所述的CRISPR工具质粒，其特征在于，还包括ori片段、抗性标记、CEN/ARS片段和营养缺陷型标记。

5.根据权利要求2～4任一项所述的CRISPR工具质粒，其特征在于，

所述骨架载体为pRS416载体；

所述抗性标记为AmpR标记，所述营养缺陷型标记为URA3标记；

所述编码Cas9的核酸序列如SEQ ID NO:1所述；

所述靶向RAF1基因下游片段的gRNA的序列如SEQ ID NO:2所示，

所述靶向REP2基因下游片段的gRNA的序列如SEQ ID NO:3所示。

6.Donor质粒，包括骨架载体和i)～ii)中至少一种；

i)、RAF1同源片段；ii)、REP2同源片段。

7.根据权利要求6所述的Donor质粒，其特征在于，

所述RAF1同源片段包括RAF1同源臂A和RAF1同源臂B，所述RAF1同源臂A的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述RAF1同源臂B的核酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述REP2同源片段包括REP2同源臂a和REP2同源臂b，所述REP2同源臂a的核酸序列如SEQ ID NO:6所示，所述REP2同源臂b的核酸序列如SEQ ID NO:7所示。

8.根据权利要求6或7所述的Donor质粒，其特征在于，还包括：线性化酶切位点、终止子、抗性筛选标记、营养缺陷型筛选标记和目的基因插入位点；

所述线性化酶切位点位于所述同源片段的同源臂A和同源臂B之间。

9.根据权利要求8所述的Donor质粒，其特征在于，

所述线性化酶切位点为PmeI；

所述终止子为T_CPS1；

所述抗性筛选标记为KanMX6；

所述营养缺陷型筛选标记为G418；

所述目的基因插入位点包括BsaI位点。

10.多拷贝基因表达质粒组合，其包括权利要求2～5任一项所述的CRISPR工具质粒和权利要求6～9任一项所述的Donor质粒。

11.多拷贝基因表达系统，其包括：含有pE2μ质粒的酵母菌、权利要求2～5任一项所述的CRISPR工具质粒和权利要求6～9任一项所述的Donor质粒。

12.一种多拷贝基因表达方法，其包括：

将目的基因插入权利要求6～9任一项所述的Donor质粒，制得pDonor Target载体；

所述pDonor Target载体经线性化，与权利要求2～5任一项所述的CRISPR工具质粒共转化至宿主进行表达；

所述宿主为含有pE2μ质粒的酵母菌。

13.根据权利要求12所述的多拷贝基因表达方法，其特征在于，所述宿主pE2μ质粒中插入TPI 1基因，且其基因组中TPI 1基因被敲除。

14.根据权利要求13所述的多拷贝基因表达方法，其特征在于，所述TPI 1基因的核酸序列如SEQ ID NO:8所示。

15.根据权利要求12～14任一项所述的表达方法，其特征在于，所述目的基因为ADS、CYP71AV1和DBR2。

16.权利要求15所述表达方法构建的表达二氢青蒿酸的酵母菌株，其宿主为酿酒酵母CEN.PK2-1C。

17.权利要求16所述的酵母菌株，其保藏编号为CGMCC NO.21335。

18.多拷贝基因表达质粒，其包括：骨架载体和2μori片段、REP2片段、FLP片段、REP1片段、RAF1片段。

19.根据权利要求18所述的多拷贝基因表达质粒，其特征在于，

所述骨架载体为pSB1C3；

所述2μori和RAF1之间还包括：抗性标记和目的基因插入位点；

所述抗性标记为kanMX6。

20.权利要求18或19所述的多拷贝基因表达质粒的构建方法，其包括，以权利要求2～5任一项所述的CRISPR工具质粒和权利要求6～9任一项所述的Donor质粒对含有pE2μ质粒的酵母菌进行编辑。

21.多拷贝基因表达系统，其包括：不含有pE2μ质粒的酵母菌、权利要求18或19所述的多拷贝基因表达质粒。

22.一种多拷贝基因表达方法，包括：

将目的基因插入权利要求18或19所述的多拷贝基因表达质粒，然后转化至宿主进行表达；所述宿主为不含有pE2μ质粒的酵母菌。

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