CN114574517A - 用于酿酒酵母多拷贝整合的质粒工具包 - Google Patents

用于酿酒酵母多拷贝整合的质粒工具包 Download PDF

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CN114574517A CN202210208817.2A CN202210208817A CN114574517A CN 114574517 A CN114574517 A CN 114574517A CN 202210208817 A CN202210208817 A CN 202210208817A CN 114574517 A CN114574517 A CN 114574517A
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Abstract

本发明公开了用于酿酒酵母多拷贝整合的质粒工具包，属于基因工程和代谢工程领域。通过更换起始密码子降低了TPR1的表达强度，获得了可用于酿酒酵母基因组高拷贝整合的重组质粒。更换TRP1的启动子为AAG或者GUG后的TRR1AAGdeg和TRR1GUGdeg具有良好的高拷贝整合能力，使转化后的菌株的荧光强度显著提升且降低了转化子数量，提升了筛选效率并有助于获得更高拷贝的菌株。对基因在酵母中过量表达基因和蛋白质有广阔的应用前景。

Description

用于酿酒酵母多拷贝整合的质粒工具包
技术领域
本发明涉及用于酿酒酵母多拷贝整合的质粒工具包，属于基因工程和代谢工程领域。
背景技术
酿酒酵母是常用的真核微生物底盘微生物。在酿酒酵母中异源导入基因，可以用于化合物的合成或蛋白质的合成。但是，在酿酒酵母中一般只能导入质粒或者在基因组上进行整合表达，导入的质粒需要在选择性培养基中生长，并且容易丢失造成基因表达量的下降；而在基因组上整合表达虽然稳定，但是每次仅能整合一个拷贝，基因的表达强度不高。因此，需要开发一种可以在酿酒酵母基因上进行多拷贝整合的技术，又保证外源基因稳定性的同时，又能增加基因的表达强度。
酿酒酵母的基因组上存在Ty转座子序列，分为Ty1Cons、Ty2Cons、Ty3Cons、Ty4Cons和Ty5Cons，这些Ty转座子位点的两端存在一段约200bp左右的保守序列，并且每种Ty转座子在酿酒酵母基因组上都存在20-50个左右的拷贝。因此，将Ty转座子两端的保守作为同源臂，构建整合框，理论上经过一次转化，就可以在酿酒酵母基因组上实现多个拷贝的整合。为了增加工程菌株的整合拷贝数，需要对筛选标签的表达强度进行下调，使得仅当外源基因的整合拷贝数较高时，才能在筛选压力下生长，而整合拷贝数较低的菌株则无法生长或者生长较慢，以此达到筛选高拷贝工程菌株的目的。
氨基酸缺陷型是酿酒酵母转化时常用的筛选标签，其中，色氨酸缺陷型(TRP1-289)是由于色氨酸代谢通路中磷酸核糖基苯胺异构酶(phosphoribosylanthranilateisomerase，TRP1)发生单点突变，造成酿酒酵母无法正常合成色氨酸，只能从环境中摄取色氨酸。因此，在整合外源基因时，完整功能的TRP1可以用于筛选标签。但是TRP1用于高拷贝整合时，由于基因的表达强度较高，拷贝数较低的工程菌株也可以正常生长，从而难以筛选出高拷贝的工程菌株。而限制了其在筛选基因工程菌株中的应用。
发明内容
为了降低TRP1的表达强度，从而实现高拷贝菌株的筛选，本发明采用非常规起始密码子AAG和GUG替换TRP1的启动子AUG，显著降低了TRP1表达强度，其中，使用AAG替换AUG后的基因拷贝数高于GUG替换的情况。分别将AGG和GUG替换后的基因命名为TRP1AAG和TRP1GUG，将整合拷贝数较高的TRP1AAG与4种Ty转座子的上下游保守序列组合后即获得了一组用于酿酒酵母多拷贝整合的工具包。工具包的适用范围广泛，可应用于各种酿酒酵母中，经过一次转化，即可实现酿酒酵母基因组的多拷贝整合，整合菌株的稳定性好，可用于基因的过量表达。
本发明基于公开号为CN113403334A的专利中公开的以TRP1为筛选基因的质粒pcT111、pcT112、pcT21、pcT31和pcT41为出发质粒，更换出发质粒中TRP1的起始密码子为AAG或GUG。
本发明的第一个目的是提供酿酒酵母基因表达框，所述表达框由弱启动子和带有降解标签deg的筛选基因组成；所述弱启动子包括PADE6，所述筛选基因为ScTRP1，将筛选基因ScTRP1的起始密码子替换为GUG或AAG。
在一种实施方式中，将起始密码子替换为AAG的筛选基因ScTRP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；将起始密码子替换为GUG的筛选基因ScTRP1的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
在一种实施方式中，所述降解标签deg的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
在一种实施方式中，所述启动子PADE6的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第二个目的是提供酿酒酵母整合质粒，所述酿酒酵母整合质粒含有所述的基因酿酒酵母基因表达框。
在一种实施方式中，所述整合质粒由Ty转座子的上下游同源臂序列、终止子序列及目的蛋白表达框及所述的基因酿酒酵母基因表达框组成；按Ty转座子的上游同源臂、上游终止子序列、绿色荧光蛋白表达框、下游终止子序列、反向的基因表达框、Ty转座子的下游同源臂的顺序连接。
在一种实施方式中，所述Ty转座子包括酿酒酵母基因组上的Ty1Cons、Ty2Cons、Ty3Cons和Ty4Cons；所述上游终止子序列包括TRFC5-TPOL30、TMTD1-TRPF2、TDSF1-THXT13、TRRP12-TTAF3或TADH1；所述下游终止子序列包括TSEC13-TPNP1、TLEU2-TNFS1、TTIM21-TGSC2、TRNA14-TBUB2或TCYC1与反向的TTDH3终止子。
在一种实施方式中，所述TRFC5-TPOL30、TMTD1-TRPF2、TDSF1-THXT13、TRRP12-TTAF3、TSEC13-TPNP1、TLEU2-TNFS1、TTIM21-TGSC2、TRNA14-TBUB2为双向终止子。
在一种实施方式中，所述TADH1、TCYC1和TTDH3为单向终止子。
在一种实施方式中，Ty1Con1的上下游同源臂分别如SEQ ID NO.16和SEQ IDNO.17所示；Ty1Cons2的上下游同源臂分别如SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19所示；Ty2 Cons的上下游同源臂分别如SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21所示；Ty3Cons的上下游同源臂分别如SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示；Ty4Cons的上下游同源臂分别如SEQ ID NO.24和SEQID NO.25所示；所有的Ty元件的上下游序列已经公开于文献Maury,J.；Germann,S.M.；Baallal Jacobsen,S.A.,et al.,EasyCloneMulti:A Set of Vectors for Simultaneousand Multiple Genomic Integrations in Saccharomyces cerevisiae[J].PloSOne2016,11(3),e0150394.(公开于2016年)。
在一种实施方式中，所述终止子TRFC5-TPOL30、TMTD1-TRPF2、TDSF1-THXT13、TRRP12-TTAF3、TCYC1、TTDH3、TADH1、TSEC13-TPNP1、TLEU2-TNFS1、TTIM21-TGSC2和TRNA14-TBUB2的序列分别如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.15所示。
在一种实施方式中，所述目的蛋白表达框包括一个启动子PGAL7，启动子PGAL7的上游包含一个终止子序列TGAL10，启动子PGAL7下游为绿色荧光蛋白。
本发明第三个目的是提供所述基因表达框，或所述酿酒酵母整合质粒在构建及筛选高拷贝酿酒酵母中的应用。
在一种实施方式中，所述酿酒酵母包括酿酒酵母CEN.PK2-1及其衍生菌株和/或酿酒酵母S288c及其衍生菌株。
在一种实施方式中，所述酿酒酵母为酿酒酵母C800(MATα；ura3-52；leu2-3,112；trp1-289；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2；gal80::KanMX)，所述是以酿酒酵母CEN.PK2-1为出发菌株，具体构建方法公开于Gao,S.；Zhou,H.；Zhou,J.等人2020年发表的《Promoter-library-based pathway optimization for efficient(2S)-naringenin production from p-coumaric acid in Saccharomyces cerevisiae》的文献中。
本发明的有益效果：本发明通过将筛选基因TRP1的起始密码子替换为AAG或GUG，降低了TRP1的表达强度，从而构建得到了能够筛选出高拷贝酿酒酵母的重组质粒，通过一次转化即可实现外源基因在基因组上的稳定、整合表达。起始密码子替换后的菌株荧光强度较原始密码子分别提升了1.18和3.72倍以上，转化子数量显著降低，有效提升了筛选效率。对于菌株中基因的过量表达有广阔的应用前景。
附图说明
图1为多拷贝质粒工具包的基因型示意图。
图2为一次转化后可以获得的转化子数量分布图。
图3为多拷贝重组菌株的荧光强度分布图。
图4为转化子荧光强度和整合拷贝数之间的关系分布图。
具体实施方式
YNB培养基：1.74g/L酵母氮源基础培养基、5g/L硫酸铵、20g/L葡萄糖、50mg/L亮氨酸、50mg/L组氨酸和50mg/L尿嘧啶。
YPD培养基：10g/L酵母粉、20g/L蛋白胨、20g/L葡萄糖。
固体培养基中添加20g/L的琼脂粉。
酿酒酵母C800(MATα；ura3-52；leu2-3,112；trp1-289；his3Δ1；MAL2-8C；SUC2；gal80::KanMX)用于基因的表达。
E.coli JM109用于分子克隆。
实施例1：构建多拷贝的质粒表达工具包
本发明中使用引物对AAG-F/AAG-R分别扩增pcT111、pcT112、pcT21、pcT31和pcT41；使用引物GUG-F/GUG-R扩增pcT31，将上述PCR产物纯化后，经过吉布森组装技术(Gibson assembly)进行组装，即依次获得pcTA111、pcTA112、pcTA21、pcTA31、pcTA41和pcTG31。获得的质粒中所有TRP1的启动子被替换为AAG或GUG。
本发明中所有核苷酸序列见表1。质粒和菌株的基因型见表2。所有引物序列见表3。
表1所有的核苷酸序列
Figure BDA0003532241950000041
表2质粒和菌株的基因型
Figure BDA0003532241950000051
表3关键引物序列
Figure BDA0003532241950000052
Figure BDA0003532241950000061
实施例2：多拷贝整合质粒工具整合能力验证
使用表3中的引物Ty11-inte-up/down、Ty12-inte-up/down、Ty2-inte-up/down、Ty3-inte-up/down和Ty4-inte-up/down分别扩增pcTA111、pcTA112、pcTA21、pcTA31和pcTA41，使用引物Ty3-inte-up/down扩增pcTG31中的整合表达框。将PCR产物回收精制后通过酿酒酵母高效转化方法整合到酿酒酵母菌株C800中。将转化后的菌体涂布在YNB筛选平板上，30℃，培养3-5d，获得单菌落。对获得的单菌落进行计数，同时接种单菌落进行培养，检测荧光强度，并检测每个菌落中的拷贝数。根据获得的转化子数目和转化子荧光强度分布确定工具包中每个组合的整合效率。
经过一次转化后，每个组合可以获得的转化子数量分布见图2，每个组合获得的多拷贝重组菌株的荧光强度分布范围见图3。使用原始TRP1作为筛选标签时，每次转化可以获得1200-1600个转化子，而使用TRP1AAG作为筛选标签时，转化子数量下降到100-400个之间(图2)。但是转化子的荧光强度从原来绝大部分分布在30 000-50 000之间(图3A)，显著提高到绝大部分分布在200 000-400 000之间(图3B)，平均荧光强度提升了3.72倍(改造后平均荧光强度365005，改造前荧光强度77355)。
而使用TRP1GUG作为筛选标签时，转化子数量下降到400个左右(图2)。但是转化子的荧光强度从原来绝大部分分布在15 000-20 000之间(图3A)，显著提高到绝大部分分布在200000-400 000之间(图3B)，平均荧光强度提升了1.18倍(改造后平均荧光强度168730，改造前荧光强度77355)。
在Ty3Cons位点进行多拷贝验证时，使用TRP1AAG作为筛选标签时，比使用TRP1GUG时获得转化子荧光强度更强，因此使用TRP1AAG作为筛选标签，与其他4个Ty位点进行了组合，由此获得了6个可用于酿酒酵母高拷贝整合的质粒工具包。
实施例3：转化子整合拷贝数计算
挑取不同荧光强度的转化子单菌落，接种在含有10mL的YPD培养基的250mL摇瓶中，220rpm，30℃培养24h后，吸取500μL菌液，13500rpm离心3min后去上清液。菌体沉淀根据已报道的方法，提取基因组DNA(Dymond,J.S.,Preparation of genomic DNA fromSaccharomyces cerevisiae.2013,Methods Enzymol 529,153-60.)。使用诺唯赞qPCR试剂盒(ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，货号Q711-02)进行实时荧光定量PCR实验，所用的实时荧光定量PCR仪为德国罗氏(LightCycler 480II)，所用的引物为qEGFP-F/qEGFP-R，内参基因选择ACT1，内参引物为qACT-F/qACT-R。
挑取上述不同荧光强度的转化子单菌落，接种到含有1.5mL YNB-TRP-培养基的48深孔板中，220rpm，30℃培养20-24h后，取200μL发酵液在酶标仪中检测发酵液的荧光强度。酶标仪为美国BioTek公司(SYNERGY H1)，激发波长488nm，发射波长520nm。对照组为使用高拷贝质粒游离表达EGFP的菌株。
发现随着荧光强度的上升，转化子的拷贝数也在上升，但是拷贝数一旦超过15后，随着荧光强度的上升，转化子的拷贝数上升变得缓慢。游离表达的菌株拷贝数在17-18之间，但是相同拷贝数下的整合型菌株的荧光强度约为游离表达菌株的2-3倍之间。可见在相同拷贝数下，整合型菌株的蛋白质表达强度更高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
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<213> 人工序列
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ttttaaaggt gaactgatct acgcgccctc gatagtaatg actaaatatc ttgggtagag 60
tatatataat gtcgtatttt tgtatattgt tttatttaga caaatagtaa cgtgttatgt 120
tccttcaatc gcatctttca tgatctttaa tcgatcgtca aatggatcca tttagagttt 180
ctcatcacca tccccatatc atttcactcc accccgcttt acgtaaaaaa aaaaaaaaaa 240
attgaataaa tgactaagaa ttagacacaa ttttgtctta atgaatgctt tttacttatg 300
acacatgcca gtttgtacat atgttgatct tcatagctcc gataatcttc ataaattcgt 360
gacaaattaa aattacacat tattatgtaa actataatat acaatgttgc ctatcaagac 420
aaacatatgc actctatga 439
<210> 8
<211> 331
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggtaacaaga ttggcaaaca taataagaaa ggtccaaagt tcaaatctag aaaaaaatta 60
tagaagattg aaactgagca atatggctaa ttacacacct ggagaaaaaa tcagatatgt 120
atatataaga atattataat actgtatatt aaaaatgatt aaaataaaga aaaaaatgaa 180
tcgggcgttt aattgcttat tatcttgaag aagcgaaagt acactatata gtaataatgt 240
gaggttaatt aaatatggat gagataatga cgaaagaaaa tgcagaaatg tcgttttaaa 300
agtaaccccc ataatctagt gaggttcgac g 331
<210> 9
<211> 190
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
atccgctcta accgaaaagg aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt 60
ttttatagtt atgttagtat taagaacgtt atttatattt caaatttttc ttttttttct 120
gtacagacgc gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg 180
acgctcgaag 190
<210> 10
<211> 580
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gtgaatttac tttaaatctt gcatttaaat aaattttctt tttatagctt tatgacttag 60
tttcaattta tatactattt taatgacatt ttcgattcat tgattgaaag ctttgtgttt 120
tttcttgatg cgctattgca ttgttcttgt ctttttcgcc acatgtaata tctgtagtag 180
atacctgata cattgtggat gctgagtgaa attttagtta ataatggagg cgctcttaat 240
aattttgggg atattggctt ttttttttaa agtttacaaa tgaatttttt ccgccaggat 300
aacgattctg aagttactct tagcgttcct atcggtacag ccatcaaatc atgcctataa 360
atcatgccta tatttgcgtg cagtcagtat catctacatg aaaaaaactc ccgcaatttc 420
ttatagaata cgttgaaaat taaatgtacg cgccaagata agataacata tatctagatg 480
cagtaatata cacagattcc cgcggacgtg ggaaggaaaa aattagataa caaaatctga 540
gtgatatgga aattccgctg tatagctcat atctttccct 580
<210> 11
<211> 205
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cattccgttg gtagatacgt tgttgacact tctaaataag cgaatttctt atgatttatg 60
atttttatta ttaaataagt tataaaaaaa ataagtgtat acaaatttta aagtgactct 120
taggttttaa aacgaaaatt cttattcttg agtaactctt tcctgtaggt caggttgctt 180
tctcaggtat agcatgaggt cgctc 205
<210> 12
<211> 352
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
agagtatcaa gaatttaaaa tgaaacatct caaaagaaaa aagaatgcaa atgagtctat 60
cgacgaattt gaagggaaat aaacgcataa tgtacagtaa cgtataacaa ttaaagattt 120
gtggaagttt tcaaaaactt ttcaactttt ttctttgttt tttttttgca acttcttata 180
ttaatattgt catagatatt tcttatacaa aaacaagcga acaaaaataa tcgacgtata 240
tacaatagat atataagact gtttttcttc aatagaacag gcgaaattat tctaccggcc 300
gaaggtacat cttcccgcta tgtaataaat agaggtattt aagttataac aa 352
<210> 13
<211> 358
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
aaagattctc tttttttatg atatttgtac ataaacttta taaatgaaat tcataataga 60
aacgacacga aattacaaaa tggaatatgt tcatagggta gacgaaacta tatacgcaat 120
ctacatacat ttatcaagaa ggagaaaaag gaggatgtaa aggaatacag gtaagcaaat 180
tgatactaat ggctcaacgt gataaggaaa aagaattgca ctttaacatt aatattgaca 240
aggaggaggg caccacacaa aaagttaggt gtaacagaaa atcatgaaac tatgattcct 300
aatttatata ttggaggatt ttctctaaaa aaaaaaaaat acaacaaata aaaaacac 358
<210> 14
<211> 400
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cactcatacg ccatccttaa agacctggtc tacgatcaaa tgattttttt agtttacaat 60
ctatttttgt ttctaagcaa gtttatcacg caaatacata agtatatttt tactttctat 120
tcttcctagt ttatatttat ttcattgtaa ctttcttaga agctcggtcc tctcgctata 180
tagtaggatc tgcaacatat ttggatgtgg gtgggcgttc tccttctttt ttagatgtaa 240
ggtccaacac gtataacagg tgatacacat agaaagacac gtggaaataa cagtcattta 300
cgaatattta aaacctgagc aactccgtca aatttgatct taatcttttc tggggcccca 360
tctaattccc agaaagccct tcgaattaga aaccggatgc 400
<210> 15
<211> 301
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gttaacatta cgttaataaa taggtatata tgaatattta taccaacaca tctattataa 60
taggcgaacc tctgtatgta attaagtaaa aaaaaaacga tgtgacagga tagttaaggt 120
gcctcgtaca taaataaaaa cggaaatagt taattctttc aaaaatatgg caatagccaa 180
actcattcag aaggtacagg aaacactctg tttctgtgcg tttatataac catgcttata 240
aaagaaagat tgaacaaaat atacatgaat ttatgaacgg taatcaccgt taattgttac 300
a 301
<210> 16
<211> 211
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tccgcgctga gggtttaatg gcgcgccgcg gccgcccgcg gtgttggaat aaaaatccac 60
tatcgtctat caactaatag ttatattatc aatatattat catatacggt gttaagatga 120
tgacataagt tatgagaagc tgtcatcgaa gttagaggaa gctgaagtgc aaggattgat 180
aatgtaatag gatcaatgaa tataaacata t 211
<210> 17
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
aaaacggaat gaggaataat cgtaatatta gtatgtagaa atatagattc cattttgagg 60
attcctatat cctcgaggag aacttctagt gtatattctg tatacctaat attatagcct 120
ttatcaacaa tggaatccca acaattatct aattacccac aaatttctca agatctgcgg 180
ccgcactcag acctgaagtg aagttcctat act 213
<210> 18
<211> 208
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ccgcgctgag ggtttaatgg cgcgccgcgg ccgcccgcgg tgttggaata aaaatcaact 60
atcatctact aactagtatt tacgttacta gtatattatc atatacggtg ttagaagatg 120
acgcaaatga tgagaaatag tcatctaaat tagtggaagc tgaaacgcaa ggattgataa 180
tgtaatagga tcaatgaata ttaacata 208
<210> 19
<211> 211
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
taaaacggaa tgatgaataa tatttataga attgtgtaga attgcagatt cccttttatg 60
gattcctaaa tcctcgagga gaacttctag tatattctgt atacctaata ttatagcctt 120
tatcaacaat ggaatcccaa caattatctc aaaattcaca tatttctcaa gatctgcggc 180
cgcactcaga cctgaagtga agttcctata c 211
<210> 20
<211> 209
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
gtgtccgcgc tgagggttta atggcgcgcc gcggccgccc gcggtgttgg aataaaaatc 60
aactatcatc tactaactag tatttacgtt actagtatat tatcatatac ggtgttagaa 120
gatgacgcaa atgatgagaa atagtcatct aaattagtgg aagctgaaac gcaaggattg 180
ataatgtaat aggatcaatg aatattaac 209
<210> 21
<211> 205
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
atataaaatg atgataataa tatttataga attgtgtaga attgcagatt cccttttatg 60
gattcctaaa tcctgaggag aacttctagt atattctaca tacctaatat tattgcctta 120
ttaaaaatgg aatcccaaca attacatcaa aatccacatt ctcagatctg cggccgcact 180
cagacctgaa gtgaagttcc tatac 205
<210> 22
<211> 212
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
gtccgcgctg agggtttaat ggcgcgccgc ggccgcccgc ggtgttgtat ctcaaaatga 60
gatatgtcag tatgacaata cgtcatcctg aacgttcata aaacacatat gaaacaacct 120
tataacaaaa cgaacaacat gagacaaaac ccgtccttcc ctagctgaac tacccaaaag 180
tataaatgcc tgaacaatta gtttagatcc ga 212
<210> 23
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gattccgcgc ttccaccact tagtatgatt catattttat ataatatata agataagtaa 60
cattccgtga attaatctga taaactgttt tgacaactgg ttacttccct aagactgttt 120
atattaggat tgtcaagaca ctccggtatt actcgagccc gtaatacaac aagatctgcg 180
gccgcactca gacctgaagt gaagttccta tac 213
<210> 24
<211> 298
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
gaacttctga agtggggatt taaatgcggc cgcgctgagg gtttaatggc gcgccgcggc 60
cgcccgcggt gttggaacga gagtaattaa tagtgacatg agttgctatg gtaacaatct 120
aatgcttaca tcgtatatta atgtacaact cgtatacgtt taagtgtgat tgcgcctatt 180
gcagaaggaa tgttaaacga gaagctcaga caatactgaa gctgtgttaa agacctatta 240
gttgaacatg ttatgctagc attaagtcct cagcgagctc gcatggaatg cgtgcgat 298
<210> 25
<211> 401
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
taggtgatat cagatccact agtggcctat gcacccaatt cgccctatag tgagtcgtat 60
tacgcgcgct cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc 120
cctacaggac tagtgctgag gcattaattg atcaggtagg tacatatatg aggaatatga 180
gtcgtcacat caatgtatag taactaccgg aatcactatt atattggtca tgattaatat 240
gaccaatcgg cgtgtgtttt atatacctct cttatttagt ataagaagat cagtactcac 300
ttcttcatta atactaattt ttaacctcta attatcaaca agatctgcgg ccgcggccgc 360
aaatttaaat aaaatgaagt gaagttccta tactttctag a 401

Claims (10)

1.酿酒酵母基因表达框，其特征在于，所述表达框由弱启动子和带有降解标签deg的筛选基因组成；所述弱启动子包括PADE6，所述筛选基因为ScTRP1，将筛选基因ScTRP1的起始密码子替换为GUG或AAG。
2.根据权利要求1所述的基因表达框，其特征在于，将起始密码子替换为AAG的筛选基因ScTRP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；将起始密码子替换为GUG的筛选基因ScTRP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述的基因表达框，其特征在于，所述降解标签deg的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求3所述的基因表达框，其特征在于，所述启动子PADE6的核苷酸序列如SEQID NO.3所示。
5.酿酒酵母整合质粒，其特征在于，含有权利要求1～4任一所述基因表达框。
6.根据权利要求5所述的酿酒酵母整合质粒，其特征在于，所述整合质粒由Ty转座子的上下游同源臂序列、终止子序列及目的蛋白表达框及权利要求1～4所述基因表达框组成；按Ty转座子的上游同源臂、上游终止子序列、绿色荧光蛋白表达框、下游终止子序列、反向的基因表达框、Ty转座子的下游同源臂的顺序连接。
7.根据权利要求6所述的酿酒酵母整合质粒，其特征在于，所述Ty转座子包括酿酒酵母基因组上的Ty1Cons、Ty2Cons、Ty3Cons和Ty4Cons；所述上游终止子序列包括TRFC5-TPOL30、TMTD1-TRPF2、TDSF1-THXT13、TRRP12-TTAF3或TADH1；所述下游终止子序列包括TSEC13-TPNP1、TLEU2-TNFS1、TTIM21-TGSC2、TRNA14-TBUB2或TCYC1及反向的TTDH3终止子。
8.根据权利要求6或7所述的酿酒酵母整合质粒，其特征在于，所述目的蛋白表达框包括一个启动子PGAL7，启动子PGAL7的上游包含一个终止子序列TGAL10，启动子PGAL7下游为绿色荧光蛋白。
9.权利要求1～4任一所述基因表达框，或权利要求5～8任一所述重组质粒在构建及筛选高拷贝酿酒酵母、或在酿酒酵母过表达外源基因中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述酿酒酵母包括酿酒酵母CEN.PK2-1及其衍生菌株和/或酿酒酵母S288c及其衍生菌株。
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