CN116555318A - 一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：先将解脂耶氏酵母内源的HMGR基因导入解脂耶氏酵母中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02‑16；然后再将1个拷贝的优化的含有点突变的FaNES1G498Q基因导入解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02‑16中获得解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02‑18，其中，优化的含有点突变的FaNES1G498Q基因的序列如SEQ ID No.1所示。本发明还公开了用上述的构建方法构建获得的解脂耶氏酵母基因工程菌及其在生产反式橙花叔醇中的应用。本发明的解脂耶氏酵母基因工程菌能极大幅度地提高反式橙花叔醇的产量。

Description

一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方 法和应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，更具体地讲，涉及一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
反式橙花叔醇(trans-nerolidol，3,7,11-三甲基-1,6,10-十二碳三烯-3-醇)是一种含氧倍半萜衍生物，其存在于红檀香、花生油和橙花油中。高纯度的反式橙花叔醇是一种透明液体，其具有挥发性气味，可溶于醚、酯类和其他有机溶剂，不溶于水，主要由植物来生产。反式橙花叔醇具有消炎、抗衰老特性，因此被广泛用于食品、制药和营养行业。
反式橙花叔醇的生产方法主要包括化学合成法、天然提取法和微生物发酵法。首先，反式橙花叔醇可以用化学方法合成，但技术路线复杂，成本昂贵，且所合成的一般为顺式和反式橙花叔醇的混合物。其次，反式橙花叔醇也可从植物中提取，如秘鲁香、吐鲁香、降香黄檀等，并且提取获得的反式橙花叔醇具有多种功能活性。然而，提取率低，污染环境等问题限制了反式橙花叔醇提取技术的发展。第三，反式橙花叔醇还可以用工程微生物来进行生产，该方法具有原料成本低、环境污染小等优点。此外，微生物的代谢工程提供了另一种方法，通过异源生物合成途径的引入，基因工程的应用，在细菌和酵母中非天然生产具有安全性和高生物活性的反式橙花叔醇。因此微生物发酵法生产反式橙花叔醇具有明显的优势。特别是随着生物技术的快速发展，利用微生物发酵生产反式橙花叔醇成为目前研究的热点之一。
解脂耶氏酵母作为一种油脂酵母可以为反式橙花叔醇提供储存空间，具有利用广泛底物的能力，是公认的安全性菌株。但迄今为止，利用酵母生产反式橙花叔醇的报道并不多，并且普遍产量较低，更未有在解脂耶氏酵母中将反式橙花叔醇作为目标代谢产物的研究报道。因此亟需开发反式橙花叔醇合成的解脂耶氏酵母基因工程菌。
发明内容
本发明通过构建解脂耶氏酵母生产反式橙花叔醇的合成途径，所构建的基因工程菌株含有1个拷贝的含有点突变的优化的Fragaria×ananassa Duch.来源的反式橙花叔醇合成酶基因FaNES1G498Q和1个拷贝的Yarrowia lipolytica内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMGR。优选的，所述的重组菌株整合了甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(ERG19)、S-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶(ERG13)和融合表达反式橙花叔醇合成酶(FaNES1G498Q)和法尼基二磷酸酯合成酶(ERG20)的 FaNES1G498QLERG20。所述菌株过表达了Yarrowialipolytica内源的肉碱乙酰转移酶 CAT 2。优选的，所述的重组菌株中过表达了携带有过氧化物酶体定位标签ePTS1的 S-3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶ERG13、磷酸甲羟戊酸激酶ERG8、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶ERG19、将HMG-CoA还原为甲羟戊酸的内源HMGR、异戊烯基二磷酸酯δ-异构酶IDI和融合表达反式橙花叔醇合成酶(FaNES1G498Q)和法尼基二磷酸酯合成酶(ERG20)的FaNES1G498QLERG20，成功获得了高产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母生产菌株。因此，本发明的第一个目的是提供一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法。本发明的第二个目的是提供一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌。本发明的第三个目的是一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌的应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
作为本发明的第一个目的，一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-18的构建方法，包括如下步骤：先将解脂耶氏酵母内源的HMGR基因导入解脂耶氏酵母中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-16；然后再将1个拷贝的优化的含有点突变的FaNES1G498Q基因导入解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-16中获得解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-18，其中，优化的含有点突变的FaNES1G498Q基因的序列如SEQ ID No.1所示。
具体的，所述的构建方法为：
A、将解脂耶氏酵母菌内源的基因HMGR片段经NheI和BssHII双酶切连接到质粒pHR_XPR2_hrGFP中，得到质粒pHR_XPR2_HMGR；
B、将质粒pHR_XPR2_HMGR和质粒pCRISPRyl_XPR2转化到解脂耶氏酵母中，获得解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-16；
C、将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的反式橙花叔醇合成酶基因FaNES1G498Q的优化序列片段经NheI和BssHII双酶切连接到质粒pHR_A08_hrGFP中，得到质粒 pHR_A08_FaNES1G498Q；
D、所得的质粒pHR_A08_FaNES1G498Q和质粒pCRISPRyl_A08转化到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-16中，获得解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-18。
根据本发明，所述构建方法还包括：将解脂耶氏酵母内源的基因ERG13、ERG19、FaNES1G498QLERG20整合到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-18中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-19。
具体的，所述构建方法为：
A、将解脂耶氏酵母内源的ERG13基因、启动子PUB8T和终止子CYC1t先经重叠 PCR获得表达盒PUB8T-ERG13-CYC1t序列片段，再经EcoRI和HindIII双酶切连接到质粒pUC19中，得到质粒pUC19-PUB8T-ERG13-CYC1t；
B、将解脂耶氏酵母内源的ERG19基因、启动子PGPD和终止子XPR2t先经重叠 PCR获得表达盒PGPD-ERG19-XPR2t序列片段，再经EcoRI和HindIII双酶切连接到质粒pUC19中，得到质粒pUC19-PGPD-ERG19-XPR2t；
C、将解脂耶氏酵母内源的启动子PFBA、FaNES1G498QLERG20融合基因和终止子PEX20t先经重叠PCR获得表达盒PFBA-FaNES1G498QLERG20-PEX20t序列片段，再经EcoRI和HindIII双酶切连接到质粒pUC19中，得到质粒 pUC19-PFBA-FaNES1G498QLERG20-PEX20t；
D、以质粒pINA1312为模板，扩增得到LOXP-URA3d1-LOXP；将解脂耶氏酵母rDNA位点上下游同源臂、片段LOXP-URA3d1-LOXP无缝连接到质粒pUC19中，得到质粒pUC19-rDNA-LUL；
E、经测序验证正确后，通过PCR将表达盒PUB8T-ERG13-CYC1t、 PGPD-ERG19-XPR2t和PFBA-FaNES1G498QLERG20-PEX20t从对应质粒中扩增纯化后，无缝连接到质粒pUC19-rDNA-LUL中，得到质粒 pUC19-rDNALUL-U13C-G19X-FN*LEP，序列如SEQ ID No.2所示；
F、将质粒pUC19-rDNALUL-U13C-G19X-FN*LEP经SwaI酶切线性化后转化到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-18中，获得解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-19。
根据本发明，所述构建方法还包括将质粒pUB4-CRE转化到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-19中，获得解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-24。
根据本发明，所述构建方法还包括：将解脂耶氏酵母内源的CAT2基因整合到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-24中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-21。
具体的，所述构建方法为：
A、将解脂耶氏酵母来源的基因CAT2片段经BamHI和PmlI双酶切连接到质粒pINA1312中，得到质粒pINA1312-CAT2，序列如SEQ ID No.3所示；
B、将质粒pINA1312-CAT2经NotI线性化后，转化到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-24中，构建获得解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-21。
根据本发明，所述构建方法还包括：将含有过氧化物酶体定位标签ePTS1的基因ERG19、HMGR和ERG13整合到工程菌株SBT02-21中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-26，其中，过氧化物酶体定位标签ePTS1的序列如SEQ ID No.4所示。
具体的，所述构建方法为：
A、将过氧化物酶体定位信号ePTS1(序列如SEQ ID No.4所示)添加到MVA 途径基因ERG19、HMGR、ERG13的3’端，将经重叠PCR扩增获得的表达盒 PGPD-ERG19-ePTS1-XPR2t、PEXP-HMGR-ePTS1-MIGt、PFBA-ERG13-ePTS1-PEX20t 无缝连接到经Acc65I酶切线性化的质粒JMP114中得到质粒JM618，所述的质粒 JM618、JM620序列如SEQ ID No.5所示。
B、将经SwaI线性化后的JM618质粒转化到菌株SBT02-21中得到工程菌株 SBT02-26。
根据本发明，所述构建方法还包括：将含有过氧化物酶体定位标签ePTS1的ERG8、ERG12、IDI和FaNES1G498QLERG20整合到工程菌株SBT02-21中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-27，其中，过氧化物酶体定位标签ePTS1的序列如SEQ ID No.4 所示。
具体的，所述构建方法为：
A、将过氧化物酶体定位信号ePTS1(序列如SEQ ID No.4所示)添加到MVA 途径基因IDI、ERG20、ERG8、ERG12的3’端，将经重叠PCR扩增获得的表达盒 PGPD-ERG8-ePTS1-XPR2t、PUB8T-ERG12-ePTS1-CYC1t、PUB8T-IDI-ePTS1-CYC1t、 PEXP-FaNES1G498QLERG20-ePTS1-MIGt无缝连接到经Acc65I酶切线性化的质粒 JM617中得到质粒JM620，所述的质粒JM620序列如SEQ ID No.6所示。
B、再将经NotI线性化后的质粒JM620转化到菌株SBT02-26中，得到工程菌株SBT02-27。
作为本发明的第二个方面，一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌，其采用上述所述的构建方法构建获得。
作为本发明的第三个方面，上述所述的产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌在生产反式橙花叔醇中的应用。所述的解脂耶氏酵母基因工程菌能够利用但不限于葡萄糖高产反式橙花叔醇。
本发明的产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法的有益效果：本发明过表达了基因HMGR、ERG 13、ERG 19和FaNES1G498QLERG20，使碳通量尽可能多的流入反式橙花叔醇合成途径，减少对底物的浪费，能极大幅度地提高反式橙花叔醇的产量。本发明中将反式橙花叔醇的生物合成路径定位到过氧化物酶体中，为反式橙花叔醇的生产提供了更多的生产场所，从而能够更大幅度地提高反式橙花叔醇的产量。
本发明的产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌，其有益效果：
(1)反式橙花叔醇的产量高：本发明的产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌能使反式橙花叔醇在摇瓶水平达到930mg/L以上的产量。
(2)获得的菌株经过连续传代培养稳定性良好，能够用于大规模的商业化生产，所得的反式橙花叔醇能够被安全的利用，产业化应用前景良好。
附图说明
图1为解脂耶氏酵母异源生物合成反式橙花叔醇的代谢途径。
图2为菌株SBT02-16、SBT02-18、SBT02-19、SBT02-24、SBT02-21、 SBT02-26、SBT02-27的摇瓶发酵生产反式橙花叔醇的结果图。
图3为菌株的传代稳定性实验图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
1、以下实施例中的生物材料来源：
(1)解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)采用解脂耶氏酵母ATCC MYA2613作为出发菌株。
(2)质粒pHR_XPR2_hrGFP、pCRISPRyl_XPR2、pHR_A08_hrGFP和 pCRISPRyl_A08参见Schwartz,C.,Shabbir-Hussain,M.,Frogue,K.,Blenner,M., Wheeldon,I.2017.Standardized markerless gene integration for pathway engineering inYarrowia lipolytica.ACS Synth Biol,6(3),402-409所记载的方法制备而成。
(3)质粒pINA1312参见Nicaud,J.M.；Madzak,C.；van den Broek,P.；Gysler,C.；Duboc,P.；Niederberger,P.；Gaillardin,C.(2002)Protein expression and secretionin the yeast Yarrowia lipolytica.FEMS Yeast Res.2,371-379.所记载的方法制备而成；质粒 JMP114、质粒pUB4-CRE、JMP113参见Fickers,P.,Le Dall,M.T.,Gaillardin,C.,Thonart,P.,and Nicaud,J.M.(2003)New disruption cassettes for rapid genedisruption and marker rescue in the yeast Yarrowialipolytica.J.Microbiol.Methods 55,727-737.所记载的方法制备而成。PGPD-ERG19-ePTS1-XPR2t、PEXP-Yl-HMGR-ePTS1-MIGt、 PFBA-ERG13-ePTS1-PEX20t、PGPD-ERG8-ePTS1-XPR2t、PUB8T-ERG12-ePTS1-CYC1t、 PUB8T-IDI-ePTS1-CYC1t、PEXP-FaNES1G498QLERG20-ePTS1-MIGt表达盒中的启动子和终止子参见Celinska,E.,Ledesma-Amaro,R.,Larroude,M.,Rossignol,T., Pauthenier,C.,and Nicaud,J.M.(2017)Golden gate assemblysystem dedicated to complex pathway manipulation in Yarrowialipolytica.Microb.Biotechnol.10,450-455.所记载的方法制备而成。
实施例1构建菌株SBT02-16
(1)将Yarrowia lipolytica内源的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因HMGR的片段(NCBI中登录号为GB:NC_006071)经NheI和BssHII双酶切连接到质粒 pHR_XPR2_hrGFP中，得到质粒pHR_XPR2_HMGR。
(2)将步骤(1)中所得的质粒pHR_XPR2_HMGR和质粒pCRISPRyl_XPR2 转化入解脂耶氏酵母ATCC MYA2613中，获得重组菌株SBT02-16。其中，转化使用试剂盒Frozen EZYeast Transformation IITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
实施例2：构建菌株SBT02-18
(1)将含有点突变的优化的Fragaria×ananassa Duch.来源的反式橙花叔醇合成酶基因FaNES1G498Q的优化序列(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)经NheI和BssHII 双酶切连接到质粒pHR_A08_hrGFP中，得到质粒pHR_A08_FaNES1G498Q。
(2)将步骤(1)中所得的质粒pHR_A08_FaNES1G498Q和质粒pCRISPRyl_A08 转化到解脂耶氏酵母SBT02-16中，获得工程菌SBT02-18。其中，转化使用试剂盒 Frozen EZ YeastTransformation IITM(购自Zymo Research)，按照该试剂盒说明书记载的方法进行操作。
实施例3：构建菌株SBT02-19、SBT02-24
(1)将Yarrowia lipolytica内源的基因ERG13、启动子PUB8T和终止子CYC1t进行重叠PCR获得PUB8T-ERG13-CYC1t表达盒，经EcoRI和HindIII双酶切连接到质粒pUC19中，得到质粒pUC19-PUB8T-ERG13-CYC1t。将解脂耶氏酵母内源的基因 ERG19、启动子PGPD和终止子XPR2t进行重叠PCR获得PGPD-ERG19-XPR2t表达盒，经EcoRI和HindIII双酶切连接到质粒pUC19中，得到质粒 pUC19-PGPD-ERG19-XPR2t。将解脂耶氏酵母内源的启动子PFBA、FaNES1G498QLERG20和终止子PEX20t进行重叠PCR获得 PFBA-FaNES1G498QLERG20-PEX20t表达盒，经EcoRI和HindIII双酶切连接到质粒 pUC19中，得到质粒pUC19-PFBA-FaNES1G498QLERG20-PEX20t。最后，将表达盒 PUB8T-ERG13-CYC1t、PGPD-ERG19-XPR2t和PFBA-FaNES1G498QLERG20-PEX20t连接到质粒pUC19-rDNA-LUL中，得到质粒pUC19-rDNALUL-U13C-G19X-FN*LEP，序列如SEQ ID No.2所示。
(2)将步骤(1)中所得的质粒pUC19-rDNALUL-U13C-G19X-FN*LEP经SwaI 酶切线性化后转化到工程菌SBT02-18中，获得解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-19。经验证，工程菌SBT02-19基因组中导入了表达盒PUB8T-ERG13-CYC1t、 PGPD-ERG19-XPR2t和PFBA-FaNES1G498QLERG20-PEX20t。
(3)将质粒pUB4-CRE转化到SBT02-19菌株中进行筛选标记的回收。将所得菌株命名为SBT02-24，SBT02-24的反式橙花叔醇产量为445mg/L。
实施例3：构建过表达CAT2基因的菌株SBT02-21
本实施例的基因CAT2为解脂耶氏酵母内源乙酰肉碱转移酶。
(1)将解脂耶氏酵母来源的基因CAT2片段经BamHI和PmlI双酶切连接到质粒pINA1312中，得到质粒pINA1312-CAT2，序列如SEQ ID No.3所示；
(2)将质粒pINA1312-CAT2经NotI线性化后，转化到解脂耶氏酵母SBT02-24 中，构建获得工程菌SBT02-21，SBT02-21的反式橙花叔醇产量为616mg/L。
实施例4：构建过氧化物酶体定位的反式橙花叔醇高产菌株SBT02-27
(1)将过氧化物酶体定位信号ePTS1(序列如SEQ ID No.4所示)添加到MVA 途径基因ERG19、HMGR、ERG13、IDI、ERG8、ERG12和FaNES1G498QLERG20融合基因的3’端，先分别进行重叠PCR扩增获得表达盒PGPD-ERG19-ePTS1-XPR2t、 PEXP-Yl-HMGR-ePTS1-MIGt、PFBA-ERG13-ePTS1-PEX20t、PGPD-ERG8-ePTS1-XPR2t、 PUB8T-ERG12-ePTS1-CYC1t、PUB8T-IDI-ePTS1-CYC1t、 PEXP-FaNES1G498QLERG20-ePTS1-MIGt，然后将表达盒PGPD-ERG19-ePTS1-XPR2t、 PEXP-Yl-HMGR-ePTS1-MIGt、PFBA-ERG13-ePTS1-PEX20t无缝连接到经Acc65I线性化后的质粒JMP114中得到质粒JM618，序列如SEQ ID No.5所示。
以质粒pUB4-CRE为模板，扩增得到片段HYG。以经AvrII和ApaI线性化的质粒JMP113为载体，通过无缝克隆的方式连接得到质粒JM617。将表达盒 PGPD-ERG8-ePTS1-XPR2t、PUB8T-ERG12-ePTS1-CYC1t、PUB8T-IDI-ePTS1-CYC1t、 PEXP-FaNES1G498QLERG20-ePTS1-MIGt无缝连接到经Acc65I线性化后的质粒JM617 中得到质粒JM620，序列如SEQ ID No.6所示。
(2)将经SwaI线性化后的JM618质粒转化到菌株SBT02-21中得到工程菌 SBT02-26。工程菌SBT02-26的反式橙花叔醇的产量为667mg/L。结果如图2所示。
(3)将经NotI线性化后的质粒JM620转化到工程菌SBT02-26中，得到工程菌SBT02-27。工程菌株SBT02-27的反式橙花叔醇的产量为930mg/L。结果如图2所示。
实施例5：测定菌株产反式橙花叔醇的产量
将菌株解脂耶氏酵母SBT02-16，实施例1制备的菌株SBT02-18，实施例2制备的菌株SBT02-19和SBT02-24，实施例3制备的菌株SBT02-21，实施例4制备的 SBT02-26，SBT02-27，分别接种于2mL YPD培养基(该YPD培养基由2％葡萄糖、2％蛋白胨和1％酵母提取物组成，余量为水，所述百分比为质量百分比)，培养24小时，然后以初始OD600为0.01的接种量接种于新的50mL YPD培养基进行培养,培养基中添加2mL十二烷用于反式橙花叔醇的收集及后续的检测。发酵培养3天后，利用高效气相色谱仪反式橙花叔醇进行定性和定量分析。检测的结果参见图2。
图2结果显示，菌株SBT02-18、SBT02-19、SBT02-24、SBT02-21、SBT02-26 和SBT02-27在发酵的第3天的反式橙花叔醇的产量分别为379mg/L、594mg/L、445 mg/L、513mg/L、665mg/L、930mg/L。其中，菌株SBT02-27产反式橙花叔醇的能力大幅度提升。
实施例6：测定菌株的传代稳定性
将菌株SBT02-27接种于2mL YPD培养基中，培养24h后，将培养液一方面进行发酵实验，一方面转接至新鲜的2mL YPD培养基中进行传代，连续传代培养10 代。对10次传代的菌株的发酵实验结果如图3所示。
图3结果显示，菌株SBT02-27经过10代的培养后，反式橙花叔醇的产量均稳定在900mg/L左右，证明该菌株传代稳定性较好。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 华东理工大学
浙江赫凯生物科技有限公司
<120> 一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌及其应用
<130> 221013
<141> 2022-01-29
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1560
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaacgtgg agaccaagca cacccgaacc atgggcgaca ttttcgtgca gcactctcag 60
aagctggagc tgctgaagac cgtcctgcga aacgtggccg agctggacgc cctggagggc 120
cttaacatga tcgacgccgt ccagcgactg ggtattgact acaacttcca gcgagagatt 180
gacgagatcc tgcacaagca gatgtccatc gtctccgccc gagacgacct gcacgaggtc 240
gccctgcgat tccgactgct gcgacagcac ggttacttcg tccccgagga cgtcttcaac 300
aacttcaagg actctaaggg caccttcaag caggtcctgg gtgaggacat taagggtctg 360
atgtctctgt acgaggcctc ccagctgggc accgagggcg aggatattct ggtcgaggcc 420
gagaagttct ccggccacct gctgaagact tctctgtccc acctggacca ccaccgagtc 480
cgaatcgtcg ccaacaccct gcgaaacccc caccacaagt ctctggcccc cttcatggcc 540
cgaaacttct tcgtgacctc tcaggccacc aactcctggc tgaacctgct gaaggaggtc 600
gccaagaccg acttcaacat ggtccgatcc ctgcaccaga acgagatcgt ccagatgtcc 660
aagtggtgga aggagctggg tctggccaag gagctgaagt tcgcccgaga ccagcccctg 720
aagtggtaca tttggtctat ggcctgcctg accgacccca agctgtccga ggagcgagtc 780
gagctgacca agcccatctc tttcgtctac ctgattgacg acattttcga cgtctacggt 840
accctggacg acctgattct gttcaccgag gccgtgaacc gatgggagat taccgccatc 900
gaccacctgc ccgactacat gaagatctgc ttcaaggccc tgtacgacat gaccaacgag 960
ttctcctcca aggtgtacct gaagcacggt tggaaccccc tgcagtccct gaagatctcc 1020
tgggcctctc tgtgtaacgc cttcctggtc gaggctaagt ggttcgcctc cggtaaactg 1080
cccaagtccg aggagtacct gaagaacggc atcgtgtcct ccggtgtcaa cgtcgtcctg 1140
gtgcacatgt tcttcctgct gggccagaac attacccgaa agtccgtcga gctgctgaac 1200
gagacccccg ccatcatctc ttcttctgcc gccatcctgc gactgtggga cgacctgggc 1260
tccgccaagg acgagaacca ggacggtaac gacggttctt acgtccgatg ttacctggag 1320
gagcacgagg gctgctccat tgaggaggcc cgagagaaga ccatcaacat gatctctgac 1380
gagtggaaga agctgaaccg agagctgctg tctcccaacc ccttccccgc ctctttcacc 1440
ctggcctccc tgaacctggc ccgaatgatc cccctgatgt actcctacga ccagaaccag 1500
tgtctgccct ctctgaagga gtacatgaag ctgatgctgt acgagaccgt ctccatgtaa 1560
<210> 2
<211> 14422
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtcatat gtcgatccta aggggtggca 420
taactgtcgc gtacggcccg ataagggcct tctccaaaag ggaagccggt tgaaattccg 480
gcacttggat gtggattctc cacggcaacg taactgaatg tggggacggt ggcacaagtc 540
ttggaaggag ttatcttttc tttttaacgg agtcaacacc ctggaattag tttgtctaga 600
gatagggtat cgttccggaa gaggggggca gctttgtccc ctccgatgca cttgtgacgc 660
cccttgaaaa cccgcaggaa ggaatagttt tcacgccaag tcgtactgat aaccgcagca 720
ggtctccaag gtgaacagcc tctagttgat agaataatgt agataaggga agtcggcaaa 780
atagatccgt aacttcggga taaggattgg ctctgggggt tggtggatgg aagcgtggga 840
gaccccaagg gactggcggc tgggcaactg gcagccggac ccgcggcaga cactgcgtcg 900
ctccgtccac atcatcaacc gccccagaac tggtacggac aaggggaatc tgactgtcta 960
attaaaacat agctttgcga tggttgtaaa acaatgttga cgcaaagtga tttctgccca 1020
gtgctctgaa tgtcaaagtg aagaaattca actgaggtgt ctcacaagtg ccgtgcagtc 1080
ccgcccccac ttgcttctct ttgtgtgtag tgtacgtaca ttatcgagac cgttgttccc 1140
gcccacctcg atccggtcta gactgaggtg tctcacaagt gccgtgcagt cccgccccca 1200
cttgcttctc tttgtgtgta gtgtacgtac attatcgaga ccgttgttcc cgcccacctc 1260
gatccgggga tccctgaggt gtctcacaag tgccgtgcag tcccgccccc acttgcttct 1320
ctttgtgtgt agtgtacgta cattatcgag accgttgttc ccgcccacct cgatccgggt 1380
cgacctgagg tgtctcacaa gtgccgtgca gtcccgcccc cacttgcttc tctttgtgtg 1440
tagtgtacgt acattatcga gaccgttgtt cccgcccacc tcgatccggg agctcctgag 1500
gtgtctcaca agtgccgtgc agtcccgccc ccacttgctt ctctttgtgt gtagtgtacg 1560
tacattatcg agaccgttgt tcccgcccac ctcgatccgg tctagactga ggtgtctcac 1620
aagtgccgtg cagtcccgcc cccacttgct tctctttgtg tgtagtgtac gtacattatc 1680
gagaccgttg ttcccgccca cctcgatccg gggatccctg aggtgtctca caagtgccgt 1740
gcagtcccgc ccccacttgc ttctctttgt gtgtagtgta cgtacattat cgagaccgtt 1800
gttcccgccc acctcgatcc gggtcgacct gaggtgtctc acaagtgccg tgcagtcccg 1860
cccccacttg cttctctttg tgtgtagtgt acgtacatta tcgagaccgt tgttcccgcc 1920
cacctcgatc cgggcatgcc tgcagcctag aagcttttgt ggttgggact ttagccaagg 1980
gtataaaaga ccaccgtccc cgaattacct ttcctcttct tttctctctc tccttgtcaa 2040
ctcacacccg aaatcgttaa gcatttcctt ctgagtataa gaatcattca aagatgtcgc 2100
aaccccagaa cgttggaatc aaagccctcg agatctacgt gccttctcga attgtcaacc 2160
aggctgagct cgagaagcac gacggtgtcg ctgctggcaa gtacaccatt ggtcttggtc 2220
agaccaacat ggcctttgtc gacgacagag aggacatcta ttcctttgcc ctgaccgccg 2280
tctctcgact gctcaagaac aacaacatcg accctgcatc tattggtcga atcgaggttg 2340
gtactgaaac ccttctggac aagtccaagt ccgtcaagtc tgtgctcatg cagctctttg 2400
gcgagaacag caacattgag ggtgtggaca acgtcaacgc ctgctacgga ggaaccaacg 2460
ccctgttcaa cgctatcaac tgggttgagg gtcgatcttg ggacggccga aacgccatcg 2520
tcgttgccgg tgacattgcc ctctacgcaa agggcgctgc ccgacccacc ggaggtgccg 2580
gctgtgttgc catgctcatt ggccccgacg ctcccctggt tcttgacaac gtccacggat 2640
cttacttcga gcatgcctac gatttctaca agcctgatct gacctccgag tacccctatg 2700
ttgatggcca ctactccctg acctgttaca caaaggccct cgacaaggcc tacgctgcct 2760
acaacgcccg agccgagaag gtcggtctgt tcaaggactc cgacaagaag ggtgctgacc 2820
gatttgacta ctctgccttc cacgtgccca cctgcaagct tgtcaccaag tcttacgctc 2880
gacttctcta caacgactac ctcaacgaca agagcctgta cgagggccag gtccccgagg 2940
aggttgctgc cgtctcctac gatgcctctc tcaccgacaa gaccgtcgag aagaccttcc 3000
ttggtattgc caaggctcag tccgccgagc gaatggctcc ttctctccag ggacccacca 3060
acaccggtaa catgtacacc gcctctgtgt acgcttctct catctctctg ctgacttttg 3120
tccccgctga gcagctgcag ggcaagcgaa tctctctctt ctcttacgga tctggtcttg 3180
cttccactct tttctctctg accgtcaagg gagacatttc tcccatcgtc aaggcctgcg 3240
acttcaaggc taagctcgat gaccgatcca ccgagactcc cgtcgactac gaggctgcca 3300
ccgatctccg agagaaggcc cacctcaaga agaactttga gccccaggga gacatcaagc 3360
acatcaagtc tggcgtctac tacctcacca acatcgatga catgttccga cgaaagtacg 3420
agatcaagca gtagtcatgt aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctccccccac 3480
atccgctcta accgaaaagg aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt 3540
ttttatagtt atgttagtat taagaacgtt atttatattt caaatttttc ttttttttct 3600
gtacagacgc gtgtacgcat gtaacattat actgaaaacc ttgcttgaga aggttttggg 3660
acgctcgaag gctttaattt gccgcagtag gatgtcctgc acgggtcttt ttgtggggtg 3720
tggagaaagg ggtgcttgga gatggaagcc ggtagaaccg ggctgcttgg ggggatttgg 3780
ggccgctggg ctccaaagag gggtaggcat ttcgttgggg ttacgtaatt gcggcatttg 3840
ggtcctgcgc gcatgtccca ttggtcagaa ttagtccgga taggagactt atcagccaat 3900
cacagcgccg gatccacctg taggttgggt tgggtgggag cacccctcca cagagtagag 3960
tcaaacagca gcagcaacat gatagttggg ggtgtgcgtg ttaaaggaaa aaaaaagaag 4020
cttgggttat attcccgctc tatttagagg ttgcgggata gacgccgacg gagggcaatg 4080
gcgccatgga accttgcgga tatcgatacg ccgcggcgga ctgcgtccga accagctcca 4140
gcagcgtttt ttccgggcca ttgagccgac tgcgaccccg ccaacgtgtc ttggcccacg 4200
cactcatgtc atgttggtgt tgggaggcca ctttttaagt agcacaaggc acctagctcg 4260
cagcaaggtg tccgaaccaa agaagcggct gcagtggtgc aaacggggcg gaaacggcgg 4320
gaaaaagcca cgggggcacg aattgaggca cgccctcgaa tttgagacga gtcacggccc 4380
cattcgcccg cgcaatggct cgccaacgcc cggtcttttg caccacatca ggttacccca 4440
agccaaacct ttgtgttaaa aagcttaaca tattataccg aacgtaggtt tgggcgggct 4500
tgctccgtct gtccaaggca acatttatat aagggtctgc atcgccggct caattgaatc 4560
ttttttcttc ttctcttctc tatattcatt cttgaattaa acacacatca acaatgatga 4620
tccaccaggc ctccaccacc gctccggtga acattgcgac actcaagtac tggggcaagc 4680
gagaccctgc tctcaatctg cccactaaca actccatctc cgtgactttg tcgcaggatg 4740
atctgcggac cctcaccaca gcctcgtgtt cccctgattt cacccaggac gagctgtggc 4800
tcaatggcaa gcaggaggac gtgagcggca aacgtctggt tgcgtgtttc cgagagctgc 4860
gggctctgcg acacaaaatg gaggactccg actcttctct gcctaagctg gccgatcaga 4920
agctcaagat cgtgtccgag aacaacttcc ccaccgccgc tggtctcgcc tcatcggctg 4980
ctggctttgc cgccctgatc cgagccgttg caaatctcta cgagctccag gagacccccg 5040
agcagctgtc cattgtggct cgacagggct ctggatccgc ctgtcgatct ctctacggag 5100
gctacgtggc atgggaaatg ggcaccgagt ctgacggaag cgactcgcga gcggtccaga 5160
tcgccaccgc cgaccactgg cccgagatgc gagccgccat cctcgttgtc tctgccgaca 5220
agaaggacac gtcgtccact accggtatgc aggtgactgt gcacacttct cccctcttca 5280
aggagcgagt caccactgtg gttcccgagc ggtttgccca gatgaagaag tcgattctgg 5340
accgagactt ccccaccttt gccgagctca ccatgcgaga ctcaaaccag ttccacgcca 5400
cctgtctgga ctcgtatcct cccattttct acctcaacga cgtgtcgcga gcctccattc 5460
gggtagttga ggccatcaac aaggctgccg gagccaccat tgccgcctac acctttgatg 5520
ctggacccaa ctgtgtcatc tactacgagg acaagaacga ggagctggtt ctgggtgctc 5580
tcaaggccat tctgggccgt gtggagggat gggagaagca ccagtctgtg gacgccaaga 5640
agattgatgt tgacgagcgg tgggagtccg agctggccaa cggaattcag cgggtgatcc 5700
ttaccaaggt tggaggagat cccgtgaaga ccgctgagtc gcttatcaac gaggatggtt 5760
ctctgaagaa cagcaagtag tccatggcct gtccccacgt tgccggtctt gcctcctact 5820
acctgtccat caatgacgag gttctcaccc ctgcccaggt cgaggctctt attactgagt 5880
ccaacaccgg tgttcttccc accaccaacc tcaagggctc tcccaacgct gttgcctaca 5940
acggtgttgg catttaggca attaacagat agtttgccgg tgataattct cttaacctcc 6000
cacactcctt tgacataacg atttatgtaa cgaaactgaa atttgaccag atattgttgt 6060
aaatagaaaa tctggcttgt aggtggcaaa atcccgtctt tgttcatcaa ttccctctgt 6120
gactactcgt catcccttta tgttcgactg tcgtattttt attttccata catacgcaag 6180
tgagatggct atatttgacg attgacgcaa ctaacatgaa tgaatacgat atacatcaaa 6240
gactatgata cgcagtattg cacactgtac gagtaagagc actagccact gcactcaagt 6300
gaaaccgttg cccgggtacg agtatgagta tgtacagtat gtttagtatt gtacttggac 6360
agtgcttgta tcgtacattc tcaagtgtca aacataaata tccgttgcta tatcctcgca 6420
ccaccacgta gctcgctata tccctgtgtt gaatccatcc atcttggatt gccaattgtg 6480
cacacagaac cgggcactca cttccccatc cacacttccg ctatatttga cgattgacgc 6540
aactaacatg aatgaatacg atatacatca aagactatga tacgcagtat tgcacactgt 6600
acgagtaaga gcactagcca ctgcactcaa gtgaaaccgt tgcccgggta cgagtatgag 6660
tatgtacagt atgtttagta ttgtacttgg acagtgcttg tatcgtacat tctcaagtgt 6720
caaacataaa tatccgttgc tatatcctcg caccaccacg tagctcgcta tatccctgtg 6780
ttgaatccat ccatcttgga ttgccaattg tgcacacaga accgggcact cacttcccca 6840
tccacacttc cttacttctg tcgcttgtaa atcttggcga ggaaagcgtt gagcacctcc 6900
ttcttgaagc ctcggctctc gtcaacctgc tcgatcttct tcttgatgtc gccaacaacc 6960
tcctcctcgt agtcaaggta gtcctgctca atcttcatgt catcatacag tttcttgatg 7020
acgagctcct tggacttgtc cttgacgccg tagttgtcct cgaggatctg tcgctgctcg 7080
ggggtggcct tctgaagggc tttgttaacg agccaggagc acttgttgtc ctggatgtcg 7140
gtgccgatct taccaatgaa ctcggggtct ccaaagttgt caaggtagtc gtcctggacc 7200
tggaagtact ctccgagagg gatcagcaca tccatggcct gctgcaggtc cttggggttg 7260
gtaatgccgg ccacgtacat ggctagaaca acgggcaggt agaaggagta gtaagcagtc 7320
ttgtatcgca caataaagga gtgcttgtcc agagagaacc ggttgagatc aacctcatcc 7380
tcgggggcag tcagaagatc caccagctgg cccagctcgg tcttgaacga aatgtcgtgg 7440
aacagctcga caaggtcaat gtagtacttc tcctgtcgga aatgcttctt aagcagaatg 7500
tagatgccac tctctagcat gaaagcatcg ttgatggcaa tcatgccgac cttgggcttg 7560
aggtaccagc agggctggcc tcgtcgggtc ttggactcat ccataatgtc gtccgacacg 7620
aggaaaaacg cctgcagcag ctcaatcagc cagccgagca gcgcgagtcg gtagtactcc 7680
tcgtcatcga gctccttctt gccggtcagt agctggtagg tgtcgaccac agacaggcct 7740
cggttgagct ttccacccac acagttgtac tgaagtgagt cggaaaacca ctgcacggca 7800
tcctggggca gaccctcgtc tcgcagcagc tgcaccagct cctcggagat tcgggggaac 7860
acgctttcga atttcgcctt ggacatacca gaacccatgg agacggtctc gtacagcatc 7920
agcttcatgt actccttcag agagggcaga cactggttct ggtcgtagga gtacatcagg 7980
gggatcattc gggccaggtt cagggaggcc agggtgaaag aggcggggaa ggggttggga 8040
gacagcagct ctcggttcag cttcttccac tcgtcagaga tcatgttgat ggtcttctct 8100
cgggcctcct caatggagca gccctcgtgc tcctccaggt aacatcggac gtaagaaccg 8160
tcgttaccgt cctggttctc gtccttggcg gagcccaggt cgtcccacag tcgcaggatg 8220
gcggcagaag aagagatgat ggcgggggtc tcgttcagca gctcgacgga ctttcgggta 8280
atgttctggc ccagcaggaa gaacatgtgc accaggacga cgttgacacc ggaggacacg 8340
atgccgttct tcaggtactc ctcggacttg ggcagtttac cggaggcgaa ccacttagcc 8400
tcgaccagga aggcgttaca cagagaggcc caggagatct tcagggactg cagggggttc 8460
caaccgtgct tcaggtacac cttggaggag aactcgttgg tcatgtcgta cagggccttg 8520
aagcagatct tcatgtagtc gggcaggtgg tcgatggcgg taatctccca tcggttcacg 8580
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ttggtggcct gagaggtcac gaagaagttt cgggccatga agggggccag agacttgtgg 8940
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gaagtcttca gcaggtggcc ggagaacttc tcggcctcga ccagaatatc ctcgccctcg 9060
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tgcttgaagg tgcccttaga gtccttgaag ttgttgaaga cgtcctcggg gacgaagtaa 9180
ccgtgctgtc gcagcagtcg gaatcgcagg gcgacctcgt gcaggtcgtc tcgggcggag 9240
acgatggaca tctgcttgtg caggatctcg tcaatctctc gctggaagtt gtagtcaata 9300
cccagtcgct ggacggcgtc gatcatgtta aggccctcca gggcgtccag ctcggccacg 9360
tttcgcagga cggtcttcag cagctccagc ttctgagagt gctgcacgaa aatgtcgccc 9420
atggttcggg tgtgcttggt ctccacgttc atggagagct gggttagttt gtgtagagag 9480
tgtgtgttgc tagcgacttt cggattgtgt cattacacaa aacgcgtcgt ctcgacactg 9540
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ttaaggacgt cagtaacagg cattgtgtga tgtgtagttt agatttcgaa tctgtgggga 9660
aagaaaggaa aaaagagact ggcaaccgat tgggagagcc actgtttata tataccctag 9720
acaagccccc cgcttgtaag atgttggtca atgtaaacca gtattaaggt tggcaagtgc 9780
aggagaagca aggtgtgggt accgagcaat ggaaatgtgc ggaaggcaaa aaaatgaggc 9840
cacggcctat tgtcggggct atatccaggg ggcgattgaa gtacactaac atgacatgtg 9900
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tgtgactggg gatgtagttg agaataagtc atacacaagt cagctttctt cgagcctcat 10380
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ccctatctac tatctagcga aaccacagcc aagggaacgg gcttggcaga atcagcgggg 11700
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cgtatcacga ggccctttcg tc 14422
<210> 3
<211> 7120
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aagctagctt atcgatacgc gtgcatgctg aggtgtctca caagtgccgt gcagtcccgc 60
ccccacttgc ttctctttgt gtgtagtgta cgtacattat cgagaccgtt gttcccgccc 120
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ctctatatac acagttaaat tacatatcca tagtctaacc tctaacagtt aatcttctgg 6240
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ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 13080
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accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 13200
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 13260
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cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 14520
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<211> 16108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggctccgcca aggacgagaa ccaggacggt aacgacggtt cttacgtccg atgttacctg 12120
gaggagcacg agggctgctc cattgaggag gcccgagaga agaccatcaa catgatctct 12180
gacgagtgga agaagctgaa ccgagagctg ctgtctccca accccttccc cgcctctttc 12240
accctggcct ccctgaacct ggcccgaatg atccccctga tgtactccta cgaccagaac 12300
cagtgtctgc cctctctgaa ggagtacatg aagctgatgc tgtacgagac cgtctccatg 12360
ggttctggta tgtccaaggc gaaattcgaa agcgtgttcc cccgaatctc cgaggagctg 12420
gtgcagctgc tgcgagacga gggtctgccc caggatgccg tgcagtggtt ttccgactca 12480
cttcagtaca actgtgtggg tggaaagctc aaccgaggcc tgtctgtggt cgacacctac 12540
cagctactga ccggcaagaa ggagctcgat gacgaggagt actaccgact cgcgctgctc 12600
ggctggctga ttgagctgct gcaggcgttt ttcctcgtgt cggacgacat tatggatgag 12660
tccaagaccc gacgaggcca gccctgctgg tacctcaagc ccaaggtcgg catgattgcc 12720
atcaacgatg ctttcatgct agagagtggc atctacattc tgcttaagaa gcatttccga 12780
caggagaagt actacattga ccttgtcgag ctgttccacg acatttcgtt caagaccgag 12840
ctgggccagc tggtggatct tctgactgcc cccgaggatg aggttgatct caaccggttc 12900
tctctggaca agcactcctt tattgtgcga tacaagactg cttactactc cttctacctg 12960
cccgttgttc tagccatgta cgtggccggc attaccaacc ccaaggacct gcagcaggcc 13020
atggatgtgc tgatccctct cggagagtac ttccaggtcc aggacgacta ccttgacaac 13080
tttggagacc ccgagttcat tggtaagatc ggcaccgaca tccaggacaa caagtgctcc 13140
tggctcgtta acaaagccct tcagaaggcc acccccgagc agcgacagat cctcgaggac 13200
aactacggcg tcaaggacaa gtccaaggag ctcgtcatca agaaactgta tgatgacatg 13260
aagattgagc aggactacct tgactacgag gaggaggttg ttggcgacat caagaagaag 13320
atcgagcagg ttgacgagag ccgaggcttc aagaaggagg tgctcaacgc tttcctcgcc 13380
aagatttaca agcgacagaa gcactggccg gtcgataatt taacgtgctg agctcagcac 13440
acgcattgcc cattggctgt atatagatga atgtaatgat accgtaagag aatgagagca 13500
cggtattgta ttacagggga ttaagtacac attacttgga gttctgtacc agaagacact 13560
actatacatg gtatcactta cattagagtc ggtgaccgta ttcgtctcgt atagacataa 13620
tattttccta ccccacattg ttcctgggcc ttcggagcac atctacagtg agtgactgtt 13680
tcagttgagc ttgaggggtt aagtaagtgg gggaagggtt tgcgattctg aaaaagagca 13740
tgactaatct ctctgtggag gagcaatgaa gtcacgtgat gcaatcatac cggtgtatcg 13800
gatctgcctg ggtgtctgat tactaatcat ttactcacct gttttcccca gctatctcat 13860
ccatctcaga gcctcggccc agccttcggc ccttttgggt ttcacagctt ttgttccctt 13920
tagtgagggt taattccgag cttggcgtaa tcatggtcat agctgtttcc tgtgtgaaat 13980
tgttatccgc tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg 14040
ggtgcctaat gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag 14100
tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 14160
ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg 14220
ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg 14280
gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag 14340
gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga 14400
cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct 14460
ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc 14520
tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg 14580
gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc 14640
tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca 14700
ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag 14760
ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagga cagtatttgg tatctgcgct 14820
ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc 14880
accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga 14940
tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 15000
cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat 15060
taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac 15120
caatgcttaa tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt 15180
gcctgactcc ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt 15240
gctgcaatga taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag 15300
ccagccggaa gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct 15360
attaattgtt gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt 15420
gttgccattg ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc 15480
tccggttccc aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt 15540
agctccttcg gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg 15600
gttatggcag cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg 15660
actggtgagt actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct 15720
tgcccggcgt caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc 15780
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tcgatgtaac ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt 15900
tctgggtgag caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg 15960
aaatgttgaa tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat 16020
tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg 16080
cgcacatttc cccgaaaagt gccacctg 16108

Claims (8)

1.一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：先将解脂耶氏酵母内源的HMGR基因导入解脂耶氏酵母中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-16；然后再将1个拷贝的优化的含有点突变的FaNES1G498Q基因导入解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-16中获得解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-18，其中，优化的含有点突变的FaNES1G498Q基因的序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，还包括：将解脂耶氏酵母内源的基因ERG13、ERG19、FaNES1G498QLERG20整合到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-18中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-19。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，还包括将质粒pUB4-CRE转化到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-19中，获得解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-24。
4.如权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：将解脂耶氏酵母内源的CAT2基因整合到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-24中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-21。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：将含有过氧化物酶体定位标签ePTS1的HMGR、ERG13和ERG19整合到工程菌株SBT02-21中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-26，其中，过氧化物酶体定位标签ePTS1的序列如SEQ ID No.4所示。
6.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法还包括：将含有过氧化物酶体定位标签ePTS1的ERG8、ERG12、IDI和FaNES1G498QLERG20整合到工程菌株SBT02-21中，得到解脂耶氏酵母基因工程菌SBT02-27，其中，过氧化物酶体定位标签ePTS1的序列如SEQ IDNo.4所示。
7.一种产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌，其特征在于，其采用如权利要求1-6任一项所述的构建方法构建获得。
8.一种如权利要求7所述的产反式橙花叔醇的解脂耶氏酵母基因工程菌在生产反式橙花叔醇中的应用。
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