CN111909918B - 一种内溶素突变体及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种内溶素突变体Lysmeta1^M及其编码基因与应用。本发明提供的内溶素突变体Lysmeta1^M如序列表的序列1所示。本发明利用温度诱导表达系统表达内溶素，构建了程序化的、在不同大肠杆菌菌株中具有普适性的裂解系统；该系统由热生物开关控制，避免了为开启裂解系统而添加诱导剂，从而进一步简化了该系统的应用。本发明利用裂解活性增强的突变体lysmeta1^M裂解体系成功地释放了在大肠杆菌胞质中过表达的GFP。首次实现利用SAR内溶素单个裂解基因构建大肠杆菌细胞裂解系统，为细胞内产物的检测和筛选提供一种快速、简便的工具。

Description

一种内溶素突变体及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种内溶素突变体Lysmeta1^M及其编码基因与应用。

背景技术

在自然界中，几乎所有的细菌都有相应的噬菌体，许多噬菌体具有内溶素，在深海环境下也发现了噬菌体的存在，因此利用海洋资源可以获得大量内溶素的基因。

内溶素是一类双链DNA噬菌体增殖周期末期产生的酶，用来降解细菌肽聚糖层。典型的内溶素由孔蛋白驱动后从细胞质中逃逸出来，然后攻击肽聚糖。与此相反，一类新型的含有N端SAR(信号锚定释放)结构域的内溶素则由宿主细胞sec转运系统分泌，并以一种非活性形式结合在膜上。内溶素蛋白表现为一种相对稳定的跨膜形式，它可以以较低的自发速率出膜；或者当针孔蛋白使膜去极化时，更高效地出膜。不同于典型的孔蛋白，针孔蛋白只形成使膜去极化的小孔，而不允许内溶素通过膜。

内溶素在农业上能够预防植物疾病之外，也能应用于畜牧业和乳制品行业。例如，可以应用于由多种病原菌引起的牛乳腺炎症(尤其是葡萄球菌和链球菌)，还可以应用于食品中的致病菌检测等各个方面。

发明内容

本发明的目的是提供一种内溶素突变体Lysmeta1^M及其编码基因与应用。

本发明首先提供了一种蛋白质(命名为蛋白质Lysmeta1^M)，是如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(a2)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列1衍生的蛋白质；

(a3)与序列表的序列1自所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使(a1)中的蛋白质便于纯化和检测，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述(a2)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

本发明还保护与所述蛋白质相关的生物材料，为如下(b1)或(b2)：

(b1)所述蛋白质的编码基因(命名为Lysmeta1^M基因)；

(b2)含有(b1)所述编码基因的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。

所述编码基因为如下(1)-(3)中任一所述的DNA分子：

(1)序列表中序列2所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

本发明还保护下述任一应用；

(1)所述蛋白质作为内溶素的应用；

(2)所述生物材料在制备内溶素中的应用；

(3)所述蛋白质，或，所述生物材料在裂解细胞中的应用。

本发明还保护一种内溶素的制备方法，包括如下步骤：培养含有所述编码基因的重组菌，从重组菌中获得内溶素。

所述重组菌是将Lysmeta1^M基因导入宿主菌中得到的。

所述Lysmeta1^M基因可通过含有Lysmeta1^M基因的重组表达载体导入宿主菌。

所述重组表达载体具体可为序列表的序列7所示的环状质粒。

所述宿主菌可为大肠杆菌，具体可为大肠杆菌TransT1。

本发明还保护一种表达载体，包括表达盒A和表达盒B；

所述表达盒A表达温敏阻遏蛋白TcI₃₈的编码基因；

所述表达盒B中由P_RP_L启动子启动内溶素的编码基因表达。

所述内溶素为如下(c1)或(c2)：

(c1)蛋白质Lysmeta1^M；

(c2)蛋白质Lysmeta1；

所述蛋白质Lysmeta1是如下(d1)或(d2)或(d3)：

(d1)由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(d2)将序列3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与具有相同功能的由序列3衍生的蛋白质；

(d3)与序列表的序列3自所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

所述蛋白质Lysmeta1的编码基因为如下(a)-(c)中任一所述的DNA分子：

(a)序列表中序列4所示的DNA分子；

(b)在严格条件下与(a)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子；

(c)与(a)或(b)限定的DNA序列具有90％以上同源性且编码所述蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA杂交实验中65℃下杂交并洗膜。

所述温敏阻遏蛋白TcI₃₈的编码基因具体可如序列表的序列7自5’端第1425-2138位所示。

所述P_RP_L启动子的编码基因的反向互补序列如序列表的序列7自5’端第636-1100位所示。

所述表达载体具体可为序列表的序列6所示的环状质粒。

所述表达载体具体可为序列表的序列7所示的环状质粒。

本发明还保护上述表达载体的应用，为如下(e1)或(e2)：

(e1)裂解细胞；

(e2)通过控制温度的变化裂解细胞。

本发明还保护一种表达系统，包括元件A和元件B；

所述元件A为上述表达载体；

所述元件B为组成型表达荧光报告基因的表达载体。

所述元件B中，所述荧光报告基因具体可为eGFP基因。

所述eGFP基因具体可由启动子PCP6启动表达。

所述PCP6启动子的编码序列具体可如序列表的序列8自5’端第531-590位所示。

所述eGFP基因具体可如序列表的序列8自5’端第617-1333位所示。

所述元件B具体可为序列表的序列8所述的环状质粒。

本发明还保护上述表达系统的应用，为如下(f1)或(f2)或(f3)：

(f1)裂解细胞；

(f2)通过控制温度的变化裂解细胞；

(f3)裂解细胞并检测细胞内容物释放情况。

本发明还保护下述任一方法；

(A)裂解细胞的方法，包括如下步骤：将Lysmeta1^M基因基因导入受体细胞，实现受体细胞的裂解；

(B)裂解细胞的方法，包括如下步骤：将上述表达载体导入受体细胞，通过调整受体细胞的培养温度实现受体细胞的裂解；

(C)裂解细胞并检测细胞内容物释放情况的方法，包括如下步骤：将上述表达载体和组成型表达荧光报告基因的表达载体导入受体菌，通过调整受体细胞的培养温度实现受体细胞的裂解，并通过检测受体细胞裂解后释放到环境中的荧光报告基因的表达情况实现检测细胞内容物释放情况的目的。

所述方法(A)中，所述“将Lysmeta1^M基因导入受体细胞”具体可通过将表达Lysmeta1^M基因的重组表达载体导入受体细胞实现。

所述重组表达载体具体可为序列表的序列7所示的环状质粒。

以上任一所述“通过调整受体细胞的培养温度实现受体细胞的裂解”具体可表现为：当所述受体细胞的培养温度低于34.2℃(具体可为30℃)时，细胞不裂解，当将所述受体细胞的培养温度提升至34.2℃以上(具体可为40℃)时，细胞裂解。

以上任一所述受体细胞具体可为细菌，更具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌TransT1、大肠杆菌BL21、大肠杆菌BW25113、大肠杆菌Top10或大肠杆菌DH5a菌株。

本发明利用温度诱导表达系统表达内溶素，构建了程序化的、在不同大肠杆菌菌株中具有普适性的裂解系统；该系统由热生物开关控制，避免了为开启裂解系统而添加诱导剂，从而进一步简化了该系统的应用。

本发明利用裂解活性增强的突变体lysmeta1^M裂解体系成功地释放了在大肠杆菌胞质中过表达的GFP。首次实现利用SAR内溶素单个裂解基因构建大肠杆菌细胞裂解系统，为细胞内产物的检测和筛选提供一种快速、简便的工具。

附图说明

图1为实施例2中大肠杆菌TransT1的生长曲线。

图2为实施例2中四种重组菌的生长曲线。

图3为实施例3中重组菌Lysmeta1^MT1的生长曲线。

图4为实施例3中重组菌的形态观察结果。

图5为实施例4中荧光监测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

大肠杆菌TransT1：TRANSGEN BIOTECH，货号：CD501-01。

大肠杆菌BL21：TRANSGEN BIOTECH，货号：CD901-01。

大肠杆菌BW25113：Thermo Scientific，货号：OEC5042。

大肠杆菌Top10：Biomed，货号：BC101-01。

大肠杆菌DH5a菌株：TIAGEN BIOTECH，货号：CB101-03。

实施例1、内溶素突变体及其编码基因的获得

从来源于西北印度洋的沉积物中提取总DNA，进行高通量测序获得基因组数据。

对基因组数据进行大量分析，得到一个内溶素的编码基因(命名为Lysmeta1基因)，如序列表的序列4所示。该基因编码的蛋白质(命名为Lysmeta1蛋白)如序列表的序列3所示。

通过多重序列比对预测在Lysmeta1的N端有一个SAR结构域。采用可剪切信号肽pelB替换Lysmeta1的SAR结构域，得到突变体Lysmeta1^M。突变体Lysmeta1^M的氨基酸序列如序列表的序列1所示，其编码基因如序列表的序列2所示。

实施例2、温控Lysmeta1表达裂解大肠杆菌系统建立

将质粒pLYS-TcI₃₈(序列表的序列5所示的环状质粒)的重组位点间插入Lysmeta1基因，构建得到重组表达载体pLYS-TcI₃₈-Lysmeta1(序列表的序列6所示的环状质粒)。

重组表达载体pLYS-TcI₃₈L-Lysmeta1包括两个表达盒(表达盒A和表达盒B)。

表达盒A为Lysmeta1基因的表达盒。表达盒A中，由P_RP_L启动子启动Lysmeta1基因的表达。P_RP_L启动子基因的反向互补序列如序列表的序列6自5’端第621-1085位所示；Lysmeta1基因的反向互补序列如序列表的序列6自5’端第123-620位所示。

表达盒B为温敏阻遏蛋白TcI₃₈的编码基因的表达盒。表达盒B中，由lacI启动子启动温敏阻遏蛋白TcI₃₈的编码基因的表达。lacI启动子基因如序列表的序列6自5’端第1332-1409位所示；温敏阻遏蛋白TcI₃₈的编码基因如序列表的序列6自5’端第1410-2123位所示。

利用所述重组表达载体pLYS-TcI₃₈-Lysmeta1可实现如下目的：通过控制温度的变化裂解细胞。具体原理为：P_RP_L启动子的转录是受温敏阻遏蛋白TcI₃₈控制，在低温(低于34.2℃)条件下，TcI₃₈结合在P_RP_L启动子上，抑制转录。在较高温度条件下(高于34.2℃)，TcI₃₈失活，允许转录，P_RP_L启动子可启动Lysmeta1基因的表达，从而裂解细胞。

基于上述原理，进行下述实验进行验证。

1、将重组表达载体pLYS-TcI₃₈-Lysmeta1导入大肠杆菌TransT1，得到重组菌Lysmeta1T1。

2、将质粒pLYS-TcI₃₈导入大肠杆菌TransT1，得到重组菌TcI₃₈T1。

3、将重组菌Lysmeta1T1和重组菌TcI₃₈T1分别接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃、200rpm培养至菌液OD600达到0.3～0.4时，将温度提高到40℃，诱导Lysmeta1表达，通过测OD₆₀₀绘制生长曲线。

结果如图1所示。结果表明，热诱导2小时后可以观察到重组菌Lysmeta1T1开始裂解的现象。

4、分别采用大肠杆菌BL21、大肠杆菌BW25113、大肠杆菌Top10、大肠杆菌DH5a菌株替代大肠杆菌TransT1，按照步骤1-3进行操作，通过测OD₆₀₀绘制生长曲线。

结果图2所示。结果表明，所有导入重组表达载体pLYS-TcI₃₈-Lysmeta1的重组菌均观察到菌株生长速率比对照下降。

实施例3、温控表达突变体Lysmeta1^M裂解大肠杆菌系统建立

将质粒pLYS-TcI₃₈(序列表的序列5所示的环状质粒)的重组位点间插入突变体Lysmeta1^M的编码基因，构建得到重组表达载体pLYS-TcI₃₈-Lysmeta1^M(序列表的序列7所示的环状质粒)。

重组表达载体pLYS-TcI₃₈-Lysmeta1^M包括两个表达盒(表达盒A和表达盒B)。

表达盒A为突变体Lysmeta1^M的编码基因的表达盒。表达盒A中，由P_RP_L启动子启动所述编码基因的表达。P_RP_L启动子基因的反向互补序列如序列表的序列7自5’端第636-1100位所示；突变体Lysmeta1^M的编码基因的反向互补序列如序列表的序列7自5’端第123-635位所示。

表达盒B为温敏阻遏蛋白TcI₃₈的编码基因的表达盒。表达盒B中，由lacI启动子启动温敏阻遏蛋白TcI₃₈的编码基因的表达。lacI启动子基因如序列表的序列7自5’端第1347-1424位所示；温敏阻遏蛋白TcI₃₈的编码基因如序列表的序列7自5’端第1425-2138位所示。

1、将重组表达载体pLYS-TcI₃₈-Lysmeta1^M导入大肠杆菌TransT1，得到重组菌Lysmeta1^MT1。

2、将重组菌Lysmeta1^MT1、重组菌Lysmeta1T1和重组菌TcI₃₈T1分别接种于含有100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃、200rpm培养至菌液OD600达到0.3～0.4时，将温度提高到40℃，诱导Lysmeta1^M或Lysmeta1表达，通过测OD₆₀₀绘制野生型和突变体的生长曲线。

结果如图3所示。结果表明，重组菌Lysmeta1^MT1相比组菌TcI₃₈T1的生长密度下降时间要明显早于重组菌Lysmeta1T1相比组菌TcI₃₈T1的生长密度下降时间。

间隔相同时间取样，显微镜下观察重组菌的形态差异。结果如图4所示。图4中，a为重组菌TcI₃₈T1，b为重组菌Lysmeta1T1，c为重组菌Lysmeta1^MT1。结果显示，重组菌Lysmeta1^MT1在变温30min后就出现了大量球形的细胞，而重组菌Lysmeta1T1的大肠杆菌只有零星的球形细胞出现。重组菌TcI₃₈T1无球形细胞出现。

实施例4、通过表达eGFP的表达质粒监测细胞裂解后内容物的释放

构建组成型表达eGFP基因的表达质粒pCP6-GFP(序列表的序列8所示的环状质粒)。

序列表的序列8中，自5’端第531-590位为PCP6启动子的编码序列，第617-1333位为eGFP基因序列。

1、将表达质粒pCP6-GFP导入实施例3中的重组菌Lysmeta1^MT1，得到重组菌Lysmeta1^MT1-GFP。

2、将表达质粒pCP6-GFP导入重组菌TcI₃₈T1，得到重组菌TcI₃₈T1-GFP。

3、将重组菌Lysmeta1^MT1-GFP和重组菌TcI₃₈T1-GFP分解接种于含有100μg/ml氨苄青霉素和25μg/ml氯霉素的LB液体培养基中，30℃、200rpm培养至菌液OD₆₀₀达到0.3-0.4时将温度提高到40℃，继续诱导培养两小时后取1ml菌液15557×g离心5分钟，取上清测荧光。

结果如图5所示。结果显示，重组菌Lysmeta1^MT1-GFP裂解后上清中的荧光明显高于重组菌TcI₃₈T1-GFP。可以实现通过荧光观测细胞裂解后内容物的释放情况。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一种内溶素突变体及其编码基因与应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 170

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Asn Arg Ala Gln Lys Ile Gly Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala

1 5 10 15

Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gln Pro Ala Met Ala Met Met

20 25 30

Gly Ile Glu Lys Ile Lys Val His Glu Ala Leu Arg Leu Lys Pro Tyr

35 40 45

Lys Asp Gln Ala Gly Lys Trp Thr Ile Gly Tyr Gly His Leu Leu Leu

50 55 60

Pro Gly Glu Trp Tyr Glu Arg Ile Thr Glu Pro Gln Ala Glu Ala Leu

65 70 75 80

Leu Arg Lys Asp Leu Ala Val Ala Glu Ser Thr Val Asn Asn Leu Val

85 90 95

Lys Thr Ser Leu Asn Lys Asn Gln Tyr Asp Ala Leu Val Ser Phe Val

100 105 110

Tyr Asn Val Gly Thr Gly Ala Phe Ser His Ser Thr Leu Leu Lys Lys

115 120 125

Ile Asn Ala Asn Asp Phe Ile Asn Ala Ala Asn Glu Phe Lys Arg Trp

130 135 140

Lys Tyr Ala Gly Gly Lys Val Ser Asn Gly Leu Leu Ala Arg Arg Glu

145 150 155 160

Arg Glu Lys Thr Leu Phe Thr Thr Val Val

165 170

<210> 2

<211> 513

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgaatcgtg cacagaaaat cggtatgaaa tacctattgc ctacggcagc cgctggattg 60

ttattactcg ctgcccaacc agcgatggcc atgatgggca tcgaaaagat caaagtccac 120

gaagcgctgc gcctgaaacc gtacaaagat caggcgggca aatggactat cggctatggc 180

cacctgctgc tgccaggtga gtggtacgaa cgtatcacgg aaccgcaggc tgaagcgctc 240

ctgcgtaaag atctggcggt ggccgaatcc acggtgaata acctggtgaa aacgagcctc 300

aacaaaaacc agtacgacgc actcgttagc ttcgtataca acgttggtac tggtgctttc 360

tcccattcca ccctgctgaa aaaaattaac gctaacgact tcattaacgc tgccaacgaa 420

tttaaacgtt ggaaatatgc cggcggtaaa gtttccaacg gcctgctggc acgtcgcgaa 480

cgtgagaaga ctctcttcac gacggtggtt taa 513

<210> 3

<211> 165

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Asn Arg Ala Gln Lys Ile Gly Ile Ile Leu Leu Leu Leu Val Gly

1 5 10 15

Gly Gly Ala Leu Ile Tyr Ser Ile Thr Arg Ser Gly Ile Glu Lys Ile

20 25 30

Lys Val His Glu Ala Leu Arg Leu Lys Pro Tyr Lys Asp Gln Ala Gly

35 40 45

Lys Trp Thr Ile Gly Tyr Gly His Leu Leu Leu Pro Gly Glu Trp Tyr

50 55 60

Glu Arg Ile Thr Glu Pro Gln Ala Glu Ala Leu Leu Arg Lys Asp Leu

65 70 75 80

Ala Val Ala Glu Ser Thr Val Asn Asn Leu Val Lys Thr Ser Leu Asn

85 90 95

Lys Asn Gln Tyr Asp Ala Leu Val Ser Phe Val Tyr Asn Val Gly Thr

100 105 110

Gly Ala Phe Ser His Ser Thr Leu Leu Lys Lys Ile Asn Ala Asn Asp

115 120 125

Phe Ile Asn Ala Ala Asn Glu Phe Lys Arg Trp Lys Tyr Ala Gly Gly

130 135 140

Lys Val Ser Asn Gly Leu Leu Ala Arg Arg Glu Arg Glu Lys Thr Leu

145 150 155 160

Phe Thr Thr Val Val

165

<210> 4

<211> 498

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgaatcgtg cacagaaaat cggtatcatc ctgctgctgc tggtcggtgg tggtgccctg 60

atctactcca ttacgcgttc cggcatcgaa aagatcaaag tccacgaagc gctgcgcctg 120

aaaccgtaca aagatcaggc gggcaaatgg actatcggct atggccacct gctgctgcca 180

ggtgagtggt acgaacgtat cacggaaccg caggctgaag cgctcctgcg taaagatctg 240

gcggtggccg aatccacggt gaataacctg gtgaaaacga gcctcaacaa aaaccagtac 300

gacgcactcg ttagcttcgt atacaacgtt ggtactggtg ctttctccca ttccaccctg 360

ctgaaaaaaa ttaacgctaa cgacttcatt aacgctgcca acgaatttaa acgttggaaa 420

tatgccggcg gtaaagtttc caacggcctg ctggcacgtc gcgaacgtga gaagactctc 480

ttcacgacgg tggtttaa 498

<210> 5

<211> 5272

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atccggatat agttcctcct ttcagcaaaa aacccctcaa gacccgttta gaggccccaa 60

ggggttatgc tagttattgc tcagcggtgg cagcagccaa ctcagcttcc tttcgggctt 120

tgatgtatat ctccttctta aagttaaaca aaattatttc tagaattcga tagatcccaa 180

tgcttcgttt cgtatcacac accccaaagc cttctgcttt gaatgctgcc cttcttcagg 240

gcttaatttt taagagcgtc accttcatgg tggtcagtgc gtcctgctga tgtgctcagt 300

atcaccgcca gtggtattta tgtcaacacc gccagagata atttatcacc gcagatggtt 360

atctgtatgt tttttatatg aatttatttt ttgcaggggg gcattgtttg gtaggtgaga 420

gatctttagc tgtcttggtt tgcccaaagc gcattgcata atctttcagg gttatgcgtt 480

gttccataca acctccttag tacatgcaac cattatcacc gccagaggta aaatagtcaa 540

cacgcacggt gttagatatt tatcccttgc ggtgatagat ttaacgtcca caggtgcggt 600

tgctggcgcc tatatcgccg acatcaccga tggggaagat cgggctcgcc acttcgggct 660

catgagcgct tgtttcggcg tgggtatggt ggcaggcccc gtggccgggg gactgttggg 720

cgccatctcc ttgcatgcac cattccttgc ggcggcggtg ctcaacggcc tcaacctact 780

actgggctgc ttcctaatgc aggagtcgca taagggagag cgtcgagatc ccggacacca 840

tcgaatggcg caaaaccttt cgcggtatgg catgatagcg cccggaagag agtcaattca 900

gggtggtgaa tgtgagcaca aaaaagaaac cattaacaca agagcagctt gaggacgcac 960

gtcgccttaa agcaatttat gaaaaaaaga aaaatgaact tggcttatcc caggaatctg 1020

tcgcagacaa gatggggatg gggcagtcag gcgttggtgc cttatttaat ggcatcaatg 1080

cattaaatgc ttataacgcc gcaagcctta cacgcattct caaagttagc gttgaagaat 1140

ttagcccttc aatcgccaga gaaatctacg agatgtatga agcggttagt atgcagccgt 1200

cacttagaag tgagtatgag taccctgttt tttctcatgt tcaggcaggg atgctgtcac 1260

ctaagcttag aacctttacc aaaggtggtg cggaaaggtg ggtaagcaca accaaaaaag 1320

ccagtgattc tgcattctgg cttgaggttg aaggtaattc catgaccgca ccaacaggct 1380

ccaagccaag ctttcctgac ggaatgttaa ttctcgttga ccctgagcag gctgttgagc 1440

caggtgattt ctgcatagcc agactcgggg gtggtgagtt taccttcaag aaactgatca 1500

gggatagcgg tcaggtgttt ttacaaccac taaacccaca gtacccaatg atcccatgca 1560

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gctgagcgca acgcaattaa tgtaagttag ctcactcatt aggcaccggg atctcgaccg 1680

atgcccttga gagccttcaa cccagtcagc tccttccggt gggcgcgggg catgactatc 1740

gtcgccgcac ttatgactgt cttctttatc atgcaactcg taggacaggt gccggcagcg 1800

ctctgggtca ttttcggcga ggaccgcttt cgctggagcg cgacgatgat cggcctgtcg 1860

cttgcggtat tcggaatctt gcacgccctc gctcaagcct tcgtcactgg tcccgccacc 1920

aaacgtttcg gcgagaagca ggccattatc gccggcatgg cggccccacg ggtgcgcatg 1980

atcgtgctcc tgtcgttgag gacccggcta ggctggcggg gttgccttac tggttagcag 2040

aatgaatcac cgatacgcga gcgaacgtga agcgactgct gctgcaaaac gtctgcgacc 2100

tgagcaacaa catgaatggt cttcggtttc cgtgtttcgt aaagtctgga aacgcggaag 2160

tcagcgccct gcaccattat gttccggatc tgcatcgcag gatgctgctg gctaccctgt 2220

ggaacaccta catctgtatt aacgaagcgc tggcattgac cctgagtgat ttttctctgg 2280

tcccgccgca tccataccgc cagttgttta ccctcacaac gttccagtaa ccgggcatgt 2340

tcatcatcag taacccgtat cgtgagcatc ctctctcgtt tcatcggtat cattaccccc 2400

atgaacagaa atccccctta cacggaggca tcagtgacca aacaggaaaa aaccgccctt 2460

aacatggccc gctttatcag aagccagaca ttaacgcttc tggagaaact caacgagctg 2520

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gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat 5400

cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt 5460

ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt 5520

ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag 5580

gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg 5640

aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc 5700

gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc 5760

gctacagggc gcgtcccatt cgcca 5785

<210> 8

<211> 3652

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc 60

tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga 120

agagcgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg 180

gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta agccagtata cactccgcta 240

tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 300

tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc 360

tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcagca gatcaattcg 420

cgcgcgaagg cgaagcggca tgcataatgt gcctgtcaaa tggacgaagc agggattctg 480

caaaccctat gctactccgt caagccgtca attgtctgat tcgttaccaa catgtgggag 540

tttattcttg acacagatat ttccggatga tataataact gagtactgtt ttttgggcta 600

acaggaggaa ttaaccatga gtaaaggaga agaacttttc actggagttg tcccaattct 660

tgttgaatta gatggtgatg ttaatgggca caaattttct gtcagtggag agggtgaagg 720

tgatgcaaca tacggaaaac ttacccttaa atttatttgc actactggaa aactacctgt 780

tccatggcca acacttgtca ctactttcgc gtatggtctt caatgctttg cgagataccc 840

agatcatatg aaacagcatg actttttcaa gagtgccatg cccgaaggtt atgtacagga 900

aagaactata tttttcaaag atgacgggaa ctacaagaca cgtgctgaag tcaagtttga 960

aggtgatacc cttgttaata gaatcgagtt aaagggtatt gattttaaag aagatggaaa 1020

cattcttgga cacaaattgg aatacaacta taactcacac aatgtataca tcatggcaga 1080

caaacaaaag aatggaatca aagttaactt caaaattaga cacaacattg aagatggaag 1140

cgttcaacta gcagaccatt atcaacaaaa tactccaatt ggcgatggcc ctgtcctttt 1200

accagacaac cattacctgt ccacacaatc tgccctttcg aaagatccca acgaaaagag 1260

agaccacatg gtccttcttg agtttgtaac agctgctggg attacacatg gcatggatga 1320

actatacaaa taaaagcttg gctgttttgg cggatgagag aagattttca gcctgataca 1380

gattaaatca gaacgcagaa gcggtctgat aaaacagaat ttgcctggcg gcagtagcgc 1440

ggtggtccca cctgacccca tgccgaactc agaagtgaaa cgccgtagcg ccgatggtag 1500

tgtggggtct ccccatgcga gagtagggaa ctgccaggca tcaaataaaa cgaaaggctc 1560

agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta 1620

ggacaaatcc gccgggagcg gatttgaacg ttgcgaagca acggcccgga gggtggcggg 1680

caggacgccc gccataaact gccaggcatc aaattaagca gaaggccatc ctgacggatg 1740

gccttacaac ttatatcgta tggggctgac ttcaggtgct acatttgaag agataaattg 1800

cactgaaatc tagaaatatt ttatctgatt aataagatga tcttcttgag atcgttttgg 1860

tctgcgcgta atctcttgct ctgaaaacga aaaaaccgcc ttgcagggcg gtttttcgaa 1920

ggttctctga gctaccaact ctttgaaccg aggtaactgg cttggaggag cgcagtcacc 1980

aaaacttgtc ctttcagttt agccttaacc ggcgcatgac ttcaagacta actcctctaa 2040

atcaattacc agtggctgct gccagtggtg cttttgcatg tctttccggg ttggactcaa 2100

gacgatagtt accggataag gcgcagcggt cggactgaac ggggggttcg tgcatacagt 2160

ccagcttgga gcgaactgcc tacccggaac tgagtgtcag gcgtggaatg agacaaacgc 2220

ggccataaca gcggaatgac accggtaaac cgaaaggcag gaacaggaga gcgcacgagg 2280

gagccgccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccaccactga 2340

tttgagcgtc agatttcgtg atgcttgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacggcttt 2400

gccgcggccc tctcacttcc ctgttaagta tcttcctggc atcttccagg aaatctccgc 2460

cccgttcgta agccatttcc gctcgccgca gtcgaacgac cgagcgtagc gagtcagtga 2520

gcgaggaagc ggaatatatc ctgtatcaca tattctgctg acgcaccggt gcagcctttt 2580

ttctcctgcc acatgaagca cttcactgac accctcatca gtgccaagcg ctgatgtccg 2640

gcggtgcttt tgccgttacg caccaccccg tcagtagctg aacaggaggg acagctgata 2700

gaaacagaag ccactggagc acctcaaaaa caccatcata cactaaatca gtaagttggc 2760

agcatcaccc gacgcacttt gcgccgaata aatacctgtg acggaagatc acttcgcaga 2820

ataaataaat cctggtgtcc ctgttgatac cgggaagccc tgggccaact tttggcgaaa 2880

atgagacgtt gatcggcacg taagaggttc caactttcac cataatgaaa taagatcact 2940

accgggcgta ttttttgagt tatcgagatt ttcaggagct aaggaagcta aaatggagaa 3000

aaaaatcact ggatatacca ccgttgatat atcccaatgg catcgtaaag aacattttga 3060

ggcatttcag tcagttgctc aatgtaccta taaccagacc gttcagctgg atattacggc 3120

ctttttaaag accgtaaaga aaaataagca caagttttat ccggccttta ttcacattct 3180

tgcccgcctg atgaatgctc atccggaatt ccgtatggca atgaaagacg gtgagctggt 3240

gatatgggat agtgttcacc cttgttacac cgttttccat gagcaaactg aaacgttttc 3300

atcgctctgg agtgaatacc acgacgattt ccggcagttt ctacacatat attcgcaaga 3360

tgtggcgtgt tacggtgaaa acctggccta tttccctaaa gggtttattg agaatatgtt 3420

tttcgtctca gccaatccct gggtgagttt caccagtttt gatttaaacg tggccaatat 3480

ggacaacttc ttcgcccccg ttttcaccat gggcaaatat tatacgcaag gcgacaaggt 3540

gctgatgccg ctggcgattc aggttcatca tgccgtctgt gatggcttcc atgtcggcag 3600

aatgcttaat gaattacaac agtactgcga tgagtggcag ggcggggcgt aa 3652

Claims (14)

1.蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为如下（b1）或（b2）：

（b1）权利要求1所述蛋白质的编码基因；

（b2）含有（b1）所述编码基因的重组表达载体、表达盒或重组菌。

3.下述任一应用；

（1）权利要求1所述的蛋白质作为内溶素的应用；

（2）权利要求2所述的生物材料在制备内溶素中的应用；

（3）权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的生物材料在裂解大肠杆菌中的应用。

4.一种内溶素的制备方法，包括如下步骤：培养含有权利要求1所述蛋白质的编码基因的重组菌，从重组菌中获得内溶素。

5.一种表达载体，包括表达盒A和表达盒B；

所述表达盒A表达温敏阻遏蛋白TcI₃₈的编码基因；

所述表达盒B中由pRpL启动子启动内溶素的编码基因表达；

所述内溶素为如下（c1）或（c2）：

（c1）权利要求1所述的蛋白质；

（c2）蛋白质Lysmeta1；

所述蛋白质Lysmeta1是由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

6.权利要求5所述的表达载体在裂解大肠杆菌中的应用。

7.权利要求5所述的表达载体在通过控制温度的变化裂解大肠杆菌中的应用。

8.一种表达系统，包括元件A和元件B；

所述元件A为权利要求5所述的表达载体；

所述元件B为组成型表达荧光报告基因的表达载体。

9.权利要求8所述的表达系统在裂解大肠杆菌中的应用。

10.权利要求8所述的表达系统在通过控制温度的变化裂解大肠杆菌中的应用。

11.权利要求8所述的表达系统在裂解大肠杆菌细胞并检测细胞内容物释放情况中的应用。

12.裂解大肠杆菌细胞的方法，包括如下步骤：将权利要求2中（b1）所述的编码基因导入受体大肠杆菌细胞，实现受体大肠杆菌细胞的裂解。

13.裂解大肠杆菌细胞的方法，包括如下步骤：将权利要求5所述的表达载体导入受体大肠杆菌细胞，通过调整受体细胞的培养温度实现受体细胞的裂解。

14.裂解大肠杆菌细胞并检测细胞内容物释放情况的方法，包括如下步骤：将权利要求5所述的表达载体和组成型表达荧光报告基因的表达载体导入大肠杆菌，通过调整大肠杆菌细胞的培养温度实现大肠杆菌细胞的裂解，并通过检测大肠杆菌细胞裂解后释放到环境中的荧光报告基因的表达情况实现检测细胞内容物释放情况的目的。

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