CN112029699A - 一种基于内源CRISPR-Cas系统的丁酸梭菌基因编辑系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种基于内源CRISPR‑Cas系统的丁酸梭菌基因编辑系统。本发明的人工设计的CRISPR array由启动子、两个重复序列、引导寻找靶位点的一个spacer序列和终止子序列组成。本发明不需要再额外表达Cas基因，仅需要构建携带CRISPR array和两个重组臂的质粒即可完成基因编辑目标，过程简单、效率高，为丁酸梭菌基因功能的验证和高性能益生菌株的构建提供了平台。

Description

一种基于内源CRISPR-Cas系统的丁酸梭菌基因编辑系统及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于内源CRISPR-Cas系统的丁酸梭菌基因编辑系统及其应用。

背景技术

丁酸梭菌是一种新型产芽孢益生菌，具有维护肠道微生态平衡的作用。丁酸梭菌在提高机体免疫力、抗癌抗肿瘤等方面也有一定的作用，但具体分子机制仍不清楚。因此需要对丁酸梭菌的代谢通路进行系统性改造，以解析其益生机理、提升其益生效果。

丁酸梭菌属于厚壁菌门，是较难改造的细菌之一，因而适用于丁酸梭菌的基因改造方法非常有限。CRISPR-Cas系统是细菌和古菌内的一种RNA介导的免疫系统，可被改造为高效的基因编辑工具。来源于酿脓链球菌的CRISPR-Cas9系统已被成功应用于包括植物细胞、动物细胞、酵母菌、细菌等许多生物中。但由于丁酸梭菌转化效率很低，且CRISPR-Cas9系统本身对细胞具有一定的毒性，因此该系统在丁酸梭菌中的应用受到很大的限制。

丁酸梭菌的内源CRISPR-Cas系统可通过内源Cas蛋白和能与靶位点DNA结合的spacer序列完成对外源入侵因子DNA的切割。但要利用该系统开发基因编辑工具，实现内源CRISPR-Cas系统对丁酸梭菌自身基因组的编辑，需要确认该内源CRISPR-Cas系统所识别的protospacer adjacent motif（PAM）序列和引导寻找靶位点的spacer序列的长度。另外，由于丁酸梭菌转化效率较低且CRISPR-Cas系统的表达会进一步降低转化效率，因此应选择合适的启动子，特别是严谨的诱导表达启动子，来启动CRISPR-Cas系统的表达，以保证转化成功。本发明成功解决了上述问题，并建立了一种高效的基于丁酸梭菌内源CRISPR-Cas系统的基因编辑工具，在丁酸梭菌代谢工程改造中具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是在丁酸梭菌内源CRISPR-Cas系统的基础上建立针对丁酸梭菌的基因编辑工具，该工具构建简单，转化效率高，能够对丁酸梭菌基因组进行高效的基因编辑。

根据本发明的丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框从5’至3’方向依次包括：

启动子-重复序列-间隔序列-重复序列和终止子，其中，所述间隔序列来自靶基因，为自靶基因中的任意PAM序列的3’端下游的34-37bp长度的序列，所述PAM序列为5’-ACA-3’或5’-TAA-3’。

根据本发明的丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框，其中，所述启动子为乳糖诱导启动子，所述终止子为CA终止子。

根据本发明的丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框，其中，所述重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

根据本发明的丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

根据本发明的基于丁酸梭菌内源CRISPR-Cas系统的丁酸梭菌基因组编辑载体，包括上述丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框。

根据本发明的技术方案，间隔序列引导Cas蛋白寻找靶位点，Cas-间隔序列复合体与靶位点结合后，Cas蛋白还会去识别靶位点5’端的PAM，如果PAM正确，则靶位点被切割；但是如果PAM不匹配，则不会切割。间隔序列长度低于34 bp会降低基因编辑效率，例如间隔序列长度为31 bp，基因编辑不成功。

本发明筛选得到有效的PAM序列为 ACA和TAA，PAM序列在基因中的位置也是没有特殊的要求。

根据本发明的使用所述丁酸梭菌基因组编辑载体进行丁酸梭菌基因编辑的方法，具体步骤如下：

步骤（1），将所述的丁酸梭菌基因组编辑载体通过接合转移方法转化到丁酸梭菌中；

步骤（2），获得的转化子在含有乳糖的培养基中培养，以诱导丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框的表达；

步骤（3），通过克隆PCR扩增检测靶位点基因编辑效率，在靶基因两个重组臂外侧序列上设计一对引物，以单克隆菌体为模板进行PCR扩增，与野生株对照相比条带变小为敲除成功。

本发明的有益效果：本发明利用丁酸梭菌内源CRISPR-Cas系统构建基因编辑工具，基因编辑载体构建简单，基因编辑效率高，弥补了丁酸梭菌缺乏基因编辑工具的现状，为丁酸梭菌益生基因的验证和高性能益生菌株的构建提供了平台。

附图说明

图1为人工设计CRISPR array表达框图谱；

图2为载体-CRISPR array-重组臂质粒图谱；

图3显示丁酸梭菌spo0A基因敲除突变株PCR验证，其中，M：1kb DNA marker；WT：野生菌对照；1-8：随机挑选的单克隆，野生菌条带大小为2095 bp，突变株条带大小为1261 bp，阳性率达100%；

图4显示间隔序列的长度对丁酸梭菌spo0A基因敲除的影响，其中，M：1kb DNA marker；WT：野生菌对照；1-6：随机挑选的单克隆；

图5显示PAM序列的组成对丁酸梭菌spo0A基因敲除的影响，其中，M：1kb DNA marker；WT：野生菌对照；1-7：随机挑选的单克隆（PAM为5’-TCA-3’）；8-14：随机挑选的单克隆（PAM为5’-TCC-3’）。

具体实施方式

根据本发明的丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框从5’至3’方向依次包括：启动子-重复序列-间隔序列-重复序列和终止子，其中，所述间隔序列来自靶基因，为自靶基因中的任意PAM序列的3’端下游的34-37bp长度的序列，所述PAM序列为5’-ACA-3’或5’-TAA-3’。

如图1所示，本发明的人工设计的CRISPR array表达框包括乳糖诱导启动子、两个重复序列、一个spacer序列和CA终止子序列。

根据本发明的具体实施例，选择目的靶基因序列中的任意“ACA”，然后该ACA后面的34-37个碱基序列就是我们需要的spacer。在构建CRISPR-Cas阵列表达框时只需要将该34-37个碱基序列放到两个重复序列中间，即：启动子-重复序列-间隔序列-重复序列-终止子。

根据本发明的具体实施方式，首先选取丁酸梭菌内源CRISPR-Cas系统作用于靶位点时所需spacer序列。根据本发明的具体实施例优化筛选了多种spacer序列，优化确定所述spacer序列的长度为34-37个核苷酸；确定所述丁酸梭菌内源CRISPR-Cas系统所识别的protospacer adjacent motif（PAM）序列为位于spacer序列5’端的5’-ACA-3’或5’-TAA-3’。

根据本发明的具体实施方式，通过将上述人工设计CRISPR array表达框和图谱如附图2所示的两个重组臂整合到载体中，获得基于丁酸梭菌内源CRISPR-Cas系统的丁酸梭菌基因组编辑载体。

跟本发明的具体实施方式，人工设计的CRISPR array表达框的序列如SEQ ID NO：1所示，其中，乳糖诱导启动子序列如SEQ ID NO：2所示，重复序列如SEQ ID NO：3所示，多条引导寻找spo0A靶位点的spacer序列如SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7所示，CA终止子序列如SEQ ID NO：8所示，两个重组臂序列如SEQ ID NO：9和SEQ IDNO：10所示。

根据本发明的具体实施方式，所述基于丁酸梭菌内源CRISPR-Cas系统的丁酸梭菌基因组编辑载体的制备方法，具体包括如下步骤：

步骤（1），通过PCR扩增获得含有一条spacer序列的CRISPR array表达框和两个重组臂片段；

步骤（2），将含有一条spacer序列的CRISPR array表达框通过基因克隆的方法整合到载体中，获得载体-CRISPR array；

步骤（3），将两个重组臂通过基因克隆的方法整合到载体-CRISPR array中，构建载体-CRISPR array-重组臂（附图2），获得所述的丁酸梭菌基因组编辑载体。

根据本发明的具体实施方式，使用所述丁酸梭菌基因组编辑载体进行丁酸梭菌基因编辑的方法，具体步骤如下：

步骤（1），将所述的丁酸梭菌基因组编辑载体通过接合转移方法（J. Biotechnol.，155：269-274，2011）转化到丁酸梭菌中；

步骤（2），获得的转化子在含有乳糖的培养基中培养，以诱导CRISPR array表达框的表达；

步骤（3），通过克隆PCR扩增检测靶位点基因编辑效率，在靶基因两个重组臂外侧序列上设计一对引物，以单克隆菌体为模板进行PCR扩增，与野生株对照相比，条带变小为敲除成功。

根据本发明的技术方案，Cas-间隔序列复合体与靶位点结合并识别正确的PAM后会切割靶位点双链DNA，造成基因组染色体的断裂，从而造成菌株无法复制完整DNA而死亡。但菌株中存在同源重组机制，依靠该机制，质粒上携带的重组臂和基因组上重组臂序列之间会发生一定几率的同源重组，重组之后靶基因会从基因组上转移到质粒上。由于此时基因组上已经没有了该基因（因此缺少了spacer作用的靶位点），所以这样的突变株会在内源CRISPR-Cas系统发挥作用时存活下来。通过这样的筛选机制，野生型被内源CRISPR-Cas系统杀死，突变株被筛选出来。即，内源CRISPR-Cas系统可以杀死野生株，让基因敲除的突变株存活下来。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

一、基于丁酸梭菌内源CRISPR-Cas系统的基因组编辑载体的构建

以丁酸梭菌spo0A基因为靶位点，以5’-ACA-3’为PAM序列，选取长度分别为34和37个核苷酸的spacer序列（见SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5）；以5’-TAA-3’为PAM序列，选取长度分别为34和37个核苷酸的spacer序列（见SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7）。

选择来源于产气荚膜梭菌的乳糖诱导启动子（SEQ ID NO：2）和来源于酪丁酸梭菌的CA终止子（SEQ ID NO：8）来构建所述的人工设计CRISPR array。具体的构建过程包括：

1）设计引物用以PCR扩增乳糖诱导启动子和CA终止子，其中扩增乳糖诱导启动子的反向引物包含一个重复序列（SEQ ID NO：3）和部分spacer序列，扩增CA终止子的正向引物包含一个重复序列（SEQ ID NO：3）和部分spacer序列。通过重叠PCR将乳糖诱导启动子、两个重复序列、一个spacer序列和CA终止子融合到一起，获得完整人工设计CRISPR array表达框（附图1，SEQ ID NO：1）。

2）通过基因克隆的方法将上述表达框整合到载体中，获得载体-CRISPR array。

3）设计引物用以PCR扩增两个重组臂（SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10），其中一个重组臂位于靶基因spo0A的上游，一个重组臂位于靶基因spo0A的下游。

4）通过基因克隆的方法将上述两个重组臂整合到载体-CRISPR array中，获得载体-CRISPR array-重组臂（附图2）。

二、 通过接合转移将载体转化到丁酸梭菌中

1）将新构建的载体转化大肠杆菌CA434菌株：取1 μg载体加入到冰上融化的100 μL大肠杆菌CA434感受态细胞中，混匀，放入0.1 cm电转杯进行点击。电转仪参数设置为：1800V，25 μF，200 Ω。电转化后的菌液涂布含有卡那霉素和氯霉素的LB平板，37 °C培养12 h。

2）通过大肠杆菌CA434将载体转化到丁酸梭菌中：挑选含有新构建载体的大肠杆菌CA434单克隆到含有卡那霉素和氯霉素的LB液体培养基中培养，当OD600达到约1.5时，5000 rpm，5 min离心收集菌体，使用不含抗生素的LB液体培养基洗涤2次后取菌体。丁酸梭菌在RCM液体培养基中37 °C条件下生长到OD600=1.0-1.5，取100 μL丁酸梭菌培养液与大肠杆菌CA434菌体混合并点到RCM固体平板上，37 °C培养12 h，然后用500 μL新鲜RCM液体培养基将固体平板表面的菌体洗下来，并涂布到含有D-环丝氨酸和甲砜霉素的RCM固体平板上，37 °C下培养直至长出菌落（约2-3天）。该菌落即为阳性转化子。

三、丁酸梭菌基因敲除菌株的筛选

通过接合转移获得的转化子在含有甲砜霉素的RCM液体培养基中37 °C培养12 h，培养液经梯度稀释后，取200 μL涂布于含有乳糖和甲砜霉素的RCM固体平板上，37 °C下培养2-3天，直至长出菌落。随机挑选8个单克隆用菌落PCR进行验证，并用野生型菌株（WT）的基因组作为对照进行PCR。结果显示，8个单克隆的PCR条带均比WT的扩增条带小，与预期的1261 bp相符，因此计算成功编辑的克隆比例为100%（附图3）。

实施例2 间隔序列的长度对编辑效果的影响

以丁酸梭菌spo0A基因为靶位点，以5’-ACA-3’为PAM序列，选取长度分别为31个核苷酸的spacer序列（见SEQ ID NO：11）。选择来源于产气荚膜梭菌的乳糖诱导启动子（SEQ IDNO：2）和来源于酪丁酸梭菌的CA终止子（SEQ ID NO：8）来构建所述的人工设计CRISPRarray。具体的载体构建、转化及敲除菌株的筛选过程如实施例1中所述。随机挑选6个单克隆用菌落PCR进行验证，并用野生型菌株（WT）的基因组作为对照进行PCR。如图4所示，显示间隔序列的长度对丁酸梭菌spo0A基因敲除的影响。野生菌条带大小为2095 bp，突变株条带大小为1261 bp，阳性率达0%。结果显示，6个单克隆的PCR条带均与WT的扩增条带大小相同，因此计算成功编辑的克隆比例为0%。

实施例3 PAM序列的组成以及位置对编辑效果的影响。

以丁酸梭菌spo0A基因为靶位点，以5’-TCA-3’、5’-TCC-3’为PAM序列，选取长度为34个核苷酸的spacer序列（见SEQ ID NO：4）。选择来源于产气荚膜梭菌的乳糖诱导启动子（SEQ ID NO：2）和来源于酪丁酸梭菌的CA终止子（SEQ ID NO：8）来构建所述的人工设计CRISPR array。具体的载体构建、转化及敲除菌株的筛选过程如实施例1中所述。随机挑选14个单克隆用菌落PCR进行验证，并用野生型菌株（WT）的基因组作为对照进行PCR。如图5所示，WT：野生菌对照；1-7：随机挑选的单克隆（PAM为5’-TCA-3’）；8-14：随机挑选的单克隆（PAM为5’-TCC-3’）。野生菌条带大小为2095 bp，突变株条带大小为1261 bp，阳性率达0%。14个单克隆的PCR条带均与WT的扩增条带大小相同，因此计算成功编辑的克隆比例为0%。

以上所述仅为本申请的优选实施例，本发明不限于上述的实施例。凡在本申请的精神和原则之内，所作的等效变化、替换或修饰等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

<120> 一种基于内源CRISPR-Cas系统的丁酸梭菌基因编辑系统及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1741

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttatatactt ggtttattta cttgattatt tctgtaattt agtggagaca ttgaaaaatg 60

ttttgaaaaa gtttttgaaa ataacaggga gtcactataa cctacactac ttgcgacttc 120

tcctatagga agtttagtgc tttttaataa aagggtggct ttgtacattc taaggtttat 180

taaatatctt tgaggagaaa ttccaaggtt ttttatgaac attttatata aataacttct 240

acttaagttc acataatcag caatttcttg aacagttatg ctatgcatgt aattagaatt 300

aatgaaatta agagcatctt gaatatatgt gtgtaattcc ttatctttgt attcaaaagg 360

ttttgggaat tcttctataa gtgcgtacaa taatgagtaa agttctttta gtaatagtat 420

gtcatcagat cttgaaggat tataagtttt tgatatttcg cacatattta atattatctg 480

tggaattttt gagttttctt cacaattagc aacacaggag ttagtaatag aagttctatt 540

taaatactca ttagcatttg aaccactaaa tcctatccag tagtattccc aaggatcatc 600

aatagaagcc acatactcaa cttgcatacc ttttagtagt ataaaaatat caccttgttt 660

taagttatat accttaccat taaatttaaa agttccatat cccttagtta cgtaatgaat 720

aacagcattt ttcaatactt catagttata tcctaatcct ggtatacctt gttctatacc 780

acattcatct acattcattt caaagttttc tttaacatac tttttccaca atatttgcat 840

ttctacctcc taacctataa aattagccaa ttttatagta gtcttatatt aaacatttac 900

atgagagctt tgcaaagcag tttatcaaca taaaagcttt ttattttaaa ataaattctt 960

ctaaatataa gaatatttta aagaaatatc tttatatatt agttattaaa atttataaga 1020

ttataagaaa cattataaca tattttagaa ctttttaact attctaaaag attaatttac 1080

atattaacat ttaattatgg gtaaaaacta ttttgaaaaa tgatttatat ggaattatgt 1140

ttcttaaata tacaatcatg tttcatgaat acataattat tttaaatgta ttgggagggt 1200

aaaatgatat taaaaaatga ataccatgaa gatactgcag aatctagaat ccgcggtagt 1260

cgacgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacaggaggg ctgaagatta acagtaacat 1320

tagatgtatt taaattcttg atggtttagg ggtgttggaa aagctaaatg attaacagta 1380

acattagatg tatttaaatc ccatagaagc tctatacttg cccatatatc acctgttgaa 1440

ccttaaaatt tttgaaaata ttaaaatcaa acattttaat taaagagaca attattataa 1500

ataaattggt atagaattat attgaataaa tctataccaa tttttaattt gatatcaagc 1560

ctttgttaaa atatctgtta aacccaattt ttctattctc ttttttatct catttttatc 1620

tgtagtatat agtccctttt ctttcattct gttaaaatac tctgcacctg caaaagtgta 1680

tctgtttttt ctaccctctg cagttttaat tttgtaattg gcatagctta ttatatctcc 1740

a 1741

<210> 2

<211> 1305

<212> DNA

<213> Clostridium perfringens

<400> 2

ttatatactt ggtttattta cttgattatt tctgtaattt agtggagaca ttgaaaaatg 60

ttttgaaaaa gtttttgaaa ataacaggga gtcactataa cctacactac ttgcgacttc 120

tcctatagga agtttagtgc tttttaataa aagggtggct ttgtacattc taaggtttat 180

taaatatctt tgaggagaaa ttccaaggtt ttttatgaac attttatata aataacttct 240

acttaagttc acataatcag caatttcttg aacagttatg ctatgcatgt aattagaatt 300

aatgaaatta agagcatctt gaatatatgt gtgtaattcc ttatctttgt attcaaaagg 360

ttttgggaat tcttctataa gtgcgtacaa taatgagtaa agttctttta gtaatagtat 420

gtcatcagat cttgaaggat tataagtttt tgatatttcg cacatattta atattatctg 480

tggaattttt gagttttctt cacaattagc aacacaggag ttagtaatag aagttctatt 540

taaatactca ttagcatttg aaccactaaa tcctatccag tagtattccc aaggatcatc 600

aatagaagcc acatactcaa cttgcatacc ttttagtagt ataaaaatat caccttgttt 660

taagttatat accttaccat taaatttaaa agttccatat cccttagtta cgtaatgaat 720

aacagcattt ttcaatactt catagttata tcctaatcct ggtatacctt gttctatacc 780

acattcatct acattcattt caaagttttc tttaacatac tttttccaca atatttgcat 840

ttctacctcc taacctataa aattagccaa ttttatagta gtcttatatt aaacatttac 900

atgagagctt tgcaaagcag tttatcaaca taaaagcttt ttattttaaa ataaattctt 960

ctaaatataa gaatatttta aagaaatatc tttatatatt agttattaaa atttataaga 1020

ttataagaaa cattataaca tattttagaa ctttttaact attctaaaag attaatttac 1080

atattaacat ttaattatgg gtaaaaacta ttttgaaaaa tgatttatat ggaattatgt 1140

ttcttaaata tacaatcatg tttcatgaat acataattat tttaaatgta ttgggagggt 1200

aaaatgatat taaaaaatga ataccatgaa gatactgcag aatctagaat ccgcggtagt 1260

cgacgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacaggaggg ctgaa 1305

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 丁酸梭菌(Clostridium butyricum)

<400> 3

gattaacagt aacattagat gtatttaaat 30

<210> 4

<211> 34

<212> DNA

<213> 丁酸梭菌(Clostridium butyricum)

<400> 4

tcttgatggt ttaggggtgt tggaaaagct aaat 34

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 丁酸梭菌(Clostridium butyricum)

<400> 5

tcttgatggt ttaggggtgt tggaaaagct aaatact 37

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 丁酸梭菌(Clostridium butyricum)

<400> 6

tagctgacga caacaaggaa ttctgcagta tact 34

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 丁酸梭菌(Clostridium butyricum)

<400> 7

tagctgacga caacaaggaa ttctgcagta tactaaa 37

<210> 8

<211> 342

<212> DNA

<213> 丁酸梭菌(Clostridium butyricum)

<400> 8

cccatagaag ctctatactt gcccatatat cacctgttga accttaaaat ttttgaaaat 60

attaaaatca aacattttaa ttaaagagac aattattata aataaattgg tatagaatta 120

tattgaataa atctatacca atttttaatt tgatatcaag cctttgttaa aatatctgtt 180

aaacccaatt tttctattct cttttttatc tcatttttat ctgtagtata tagtcccttt 240

tctttcattc tgttaaaata ctctgcacct gcaaaagtgt atctgttttt tctaccctct 300

gcagttttaa ttttgtaatt ggcatagctt attatatctc ca 342

<210> 9

<211> 482

<212> DNA

<213> 丁酸梭菌(Clostridium butyricum)

<400> 9

caagatgcag gaataattaa ataattttaa taagagttga tttaaaaagt tgttgtaagg 60

ataacaaata tttgaatcaa ctcttattat taacaaaaaa atgattattt atttgaagaa 120

aggacaagaa aattatataa tataatagag aaatatttgt taagtagagt gctaagtaac 180

tttctcaaca aaataatata agtatttttt ttcaaggtat ttacttgtag caaaaaaaag 240

tgtataattt acaaatagtg gaagataaat acattaaaac cataaaatta agaaataaat 300

cttataaacc acatatagta gataaatatg gtgagagaaa tatataccct acaataaaag 360

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at 482

<210> 10

<211> 513

<212> DNA

<213> 丁酸梭菌(Clostridium butyricum)

<400> 10

tcttagtaaa atagcgggtt tggaaaaatc ctaagccgat aaactgccta gcaatagtcc 60

tagaaatata aatctatacc aataaatatg gttaaatata catctttgat atattggttt 120

aacaatcaat atattggagg tgttttttta ttgcctagaa ttaagaaaaa tgcaaaagaa 180

atgaatgata ttatattaga ttatcttgat tattgtaatt ttaaaaactt atcaattaaa 240

acaattaagt cgtatcatca aacacttatg ttattttcta aatatttaga ggaagaaaaa 300

gaaattacag atataaataa agttaataag gatattgtgc aagagtatat tacatttact 360

aaagaaagag gaaaatattc atttacttca tgtgaagaag atgtaataaa aagccatatt 420

gataaaagaa gtgatatagg aaaagaagta tcaaattcaa cattaaataa ttatcttaga 480

aatattaaag ctttttcgga tggcttgaag caa 513

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 丁酸梭菌(Clostridium butyricum)

<400> 11

tcttgatggt ttaggggtgt tggaaaagct a 31

Claims (6)

1.丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框，其特征在于，所述丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框从5’至3’方向依次包括：

启动子-重复序列-间隔序列-重复序列和终止子，其中，所述间隔序列来自靶基因，为自靶基因中的任意PAM序列的3’端下游的34-37bp长度的序列，所述PAM序列为5’-ACA-3’或5’-TAA-3’。

2.根据权利要求1所述的丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框，其特征在于，所述启动子为乳糖诱导启动子，所述终止子为CA终止子。

3.根据权利要求1所述的丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框，所述重复序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

4.基于丁酸梭菌内源CRISPR-Cas系统的丁酸梭菌基因组编辑载体，其特征在于，包括权利要求1所述的丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框。

5.一种丁酸梭菌基因编辑的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

寻找靶基因的PAM序列，所述PAM序列为5’-ACA-3’或5’-TAA-3’；

自靶基因中的任意PAM序列的3’端下游的取34-37bp长度的序列，作为间隔序列，

构建丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框，所述表达框从5’至3’方向依次包括：启动子-重复序列-间隔序列-重复序列和终止子，其中，所述间隔序列来自靶基因，

构建含有丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框的丁酸梭菌基因组编辑载体；

将上述丁酸梭菌基因组编辑载体通过接合转移方法转化到丁酸梭菌中；

将转化丁酸梭菌后获得的转化子在含有乳糖的培养基中培养，以诱导丁酸梭菌内源CRISPR-Cas阵列表达框的表达；

检测靶位点基因编辑效率。

6.根据权利要求5所述的丁酸梭菌基因编辑的方法，其特征在于，通过以下方法检测靶位点基因编辑效率：

在靶基因两个重组臂外侧序列上设计一对引物，以单克隆菌体为模板进行PCR扩增，与野生株对照相比条带变小为敲除成功。

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