CN111118057B - 用于重组酶介导的特异性位点的基因叠加的大豆目标系 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于重组酶介导的特异性位点的基因叠加的大豆目标系，该目标体系含有attP、Lox重组位点的目标系载体转化大豆，通过分子及BLAST定位分析获得了有利于大豆基因叠加的5个基因组位点。每个起始目标系都具有精确的单拷贝转基因DNA，该DNA不影响内源基因、插入位点离最近的基因编码区至少1kb、远离着丝粒、且其报告基因gfp表达良好。这些起始目标系的特异位点整合性都得验证，有利于基因通过位点特异性重组持续地定点叠加在该基因位点处，从而减少分离位点，大大降低转基因从实验品系渗入到当地优良品种的育种工作量，另外，商业产品开发者也可将整合到现有的转基因位点上，从而大大降低释放评估费用。

Description

用于重组酶介导的特异性位点的基因叠加的大豆目标系

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及用于重组酶介导的特异性位点的基因叠加的大豆目标系。

背景技术

大豆(Glycine max(Linn.)Merr.)是世界上重要的经济作物，是人类和家畜植物性蛋白和脂肪消耗的重要来源。为了提高品质和产量，大豆基因工程为传统育种做出了重大贡献。近些年，生物技术改造的大豆仍是全球种植面积最大的转基因作物，其种植面积达9400万公顷，约占全球转基因作物种植面积的50％(ISAAA,2018)。具有多性状的转基因大豆也越来越普遍。随着更多有用的基因被发现，预期未来的作物改良可能会经历新转基因的逐渐增加聚合。

但是，如何将新转基因性状转入植物的基因组会显著影响开发当地栽培中所需的速度和人力。通常，当一个新的转基因通常被引入到一个品种后，每一个转基因整合“事件”都要经过监管释放的过程。随后，再渗入到当地品种中。如果每个新的转基因插入到不同的位置，就会产生新的遗传位点，育种上就需要聚合到同一个育种系中。近年来，通过杂交育种获得了叠加性状(Bengyella et al.,2018)，但只满足几个位点，测试的性状如抗除草剂和抗虫性。如果需要添加更多的转基因性状，那么将它们全部聚合至一个基因组可能有问题。即使无连锁累赘，对于二倍体或是如二倍体一样分离染色体的多倍体植物，从一个杂合的转化子获得纯合子的概率是四分之一的n次方(n是分离位点的数目)。另外，将一个新性状导入到栽培品种时，也需要导入栽培种的其他优良性状。不难想象，假如仅仅只有3个转基因位点与7个非转基因性状聚合，获得纯合子的概率为百万分之一即(1/4)¹⁰。通常，育种家可通过重复回交来使多性状聚合，但这需要花费更多的时间和人力。

为防止转基因分离位点数量增加，一种方法是将它们在体外包装到一个载体中，并筛选整合到同一位点的事件。当所有要转入的基因都是新的且有时，这种体外基因叠加的方法具有其优势。但如果作物已经进行过某种性状改造，那么添加另外一个新的转基因就意味着重头进行改造以前所有引入的性状。技术上来说也许并难，但从法律上来说，因为被认为是一个新的整合“事件”，所以这可能会引发需要对先前引入性状进行二次监管释放的过程。

第二种方法是将新的性状直接导入到已经建立好的转基因品种中。即使新的DNA整合到一个新的位置，但它仍会是在相同的基因组上，因而省去渗入当地品种的育种过程。然而，大多数的商业品种是难以转化的，获得足够数量的可进行大田评估的的独立转化事件需要极大的努力。更麻烦的是从监管角度而言，即使是同样的DNA的个体转化，不同品种都被认为是不同事件，释放评估要分别进行。而对一个整合事件渗入不同品种情况却是被认为是同一个事件。

第三种方法是将聚合的基因插入到先前导入的转基因。例如，通过宿主介导的由位点特异性核酸酶进行同源重组，这是可实现的。像锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)、归巢核酸内切酶(Meganucleases)和CRISPR/Cas9，它们可以产生精确的基因组DNA链断裂，从而允许来自供体的转基因片段进行同源定向修复(HDR)。尽管效率还有问题，但玉米中已报道通过ZFNs系统实现了两个基因的叠加(Annelies et al.,2013)，在大豆愈伤组织中利用Meganucleases实现了两个基因的叠加(D'Halluin et al.,2013)。

除了宿主介导的同源重组之外，重组酶(或整合酶)也可以催化并介导新的DNA进行位点特异性整合。但使用重组酶介导系统，植物基因组必须已携带一个靶位点，例如一个attB或attP序列，来允许进入的分子可通过Bxb1整合酶催化位点特异性重组。

大豆是我国重要经济作物，基因工程是遗传改良的一个重要途径。然而，其遗传转化是一瓶颈，效率低(平均～3％)。根据现有技术，本发明致力于建立适用于大豆的基因定点叠加的起始目标系。

发明内容

本发明的目的在于提供用于目的基因定点整合的大豆起始目标系。

本发明的进一步目的在于提供大豆起始目标系的应用/定点整合的方法。

为了在大豆中实现精确、高效的多基因聚合，本发明将重组酶Bxb1和Cre介导的基因定点整合系统应用到在大豆作物中。本发明通过农杆菌转化法将含有attP、lox重组酶位点、筛选标记基因表达盒及报告基因表达盒的目标系载体转入大豆，进行分子分析及基因组插入位点分析，获得5个适于目的基因定点整合的大豆起始目标系；

本发明所采取的技术方案是：

本发明第一方面，提供了大豆基因组位点在插入大豆叠加载体中的应用，该大豆基因组位点为：

1)大豆16号染色体的短臂第4,414,388位碱基和第4,414,393位碱基之间；

2)大豆15号染色体的长臂第8,355,701位碱基和第8,355,726位碱基之间；

3)大豆2号染色体的短臂第9,329,711位碱基和第9,329,900位碱基之间；

4)大豆2号染色体的短臂第9,310,241位碱基和第9,310,243位碱基之间；

5)大豆11号染色体的长臂第5,408,016位碱基和第5,408,042位碱基之间；

基因组信息参考:Glycinemax Wm82.a2.v1。

本发明第二方面，提供了一种建立大豆起始目标系的方法，包括以下步骤：

农杆菌介导法转化含有重组酶位点attP和lox，gfp报告基因表达盒，筛选标记基因hpt表达盒以及RS2重组酶位点的目标载体，并获得转基因植株；

检测上述转基因植株T-DNA左右边界，转基因片段在基因组中的插入位点，获得用于目的基因叠加的大豆起始目标系；

构建含有attB、lox重组酶位点和目的基因的叠加载体；

将叠加载体和Bxb1重组酶DNA共转化起始目标株系胚性愈伤；

获得目的基因定点整合到起始目标系的植株。

进一步的，所述attP重组位点为Mycobacterium smegmati噬菌体Bxb1重组酶识别的attP重组位点。

进一步的，所述同向的attP和attB重组位点能够被Bxb1整合酶识别，将1个或多个目的基因DNA定点整合到大豆基因组。

进一步的，所述lox重组酶位点能够被来源于bacteriophage P1的Cre重组酶识别。

进一步的，所述RS2重组位点为Acetinetobacter质粒中能被重组酶CinH识别的RS2重组位点。

大豆基因组中适合目的基因定点整合的起始目标系(目标位点)，4个起始目标系的基因组位点分别是：

1)大豆16号染色体的短臂第4,414,388位碱基和第4,414,393位碱基之间；

2)大豆15号染色体的长臂第8,355,701位碱基和第8,355,726位碱基之间；

3)大豆2号染色体的短臂第9,329,711位碱基和第9,329,900位碱基之间；

4)大豆2号染色体的短臂第9,310,241位碱基和第9,310,243位碱基之间；

5)大豆11号染色体的长臂第5,408,016位碱基和第5,408,042位碱基之间；

基因组信息参考:Glycinemax Wm82.a2.v1。

本发明的有益效果：

1)大豆遗传转化普遍困难，平均转化率3％左右。本发明将含有attP、lox重组位点的目标载体转化大豆子叶节，通过分子及BLAST定位分析获得了有利于目的基因定点整合的5个大豆起始目标系(目标位点)。每个起始目标株系都具有精确的单拷贝转基因DNA，该DNA不影响内源基因、插入位点离最近的基因编码区至少1kb、远离着丝粒、且其报告基因gus表达良好。利用基因枪法，本发明通过PCR分析5个目标株系的转化愈伤，确认了的Bxb1整合酶介导的位点特异性精确整合性。这些愈伤均gfp表达良好。进一步本发明利用大豆成熟种子的胚尖基因枪转化系统获得了S20的整合植株1株。因此表明这些目标株系可用于新DNA的特异性定点叠加。

2)本发明研发大豆体内基因定点整合系统，可显著促进大豆功能基因聚合及缩短大豆转基因商业产品研发和推广时间；本发明公开的5个适合目的基因定点整合的大豆目标位点，有利于将相关功能基因通过位点特异性重组定点整合在该基因位点处，从而减少分离位点，大大降低转基因从实验品系渗入到当地优良品种的育种工作量，另外，商业产品开发者也可将整合到现有的转基因位点上，从而大大降低释放评估费用。

附图说明

图1定点整合示意图。其中(A)利用农杆菌转化pSOY036B获得大豆起始目标系。包括筛选基因(草丁膦抗性基因bar)和报告基因(β-葡萄糖醛酸酶基因gus)。一对同向的lox位点(黑色三角)位于这两个标记基因两侧，随后则是一个attP位点(褐色箭头)和一个反向的lox位点。在整个转基因元件的两侧设计了同向的RS2位点(红色三角框)。其中(B)用于基因枪转化，进行位点特异性整合的供体质粒pJL210H包含一对attB位点(绿色箭头)，该位点与目标株系上的attP位点相匹配，产生重组。两个attB之间放置了一个绿色荧光蛋白标记基因(gfp)。随后是一个lox位点和潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。(C)Bxb1重组酶表达载体pYQ78的Bxb1编码区C-末端包含一个核定位信号(NLS)。(D)位点特异性整合结构I：由目标株系上的attP位点和供体质粒pJL210H hpt基因远端的attB位点重组产生。(E)位点特异性整合结构II：由目标株系上的attP位点和供体质粒pJL210H hpt基因近端的attB位点重组产生。红色线段代表PCR产物；片段大小单位为kb(蓝色数字)。黑色虚线表示可由Cre重组酶催化删除的部分，红色虚线表示可由CinH重组酶催化删除的部分。各基因的启动子和终止子未显示：bar基因由大豆ubiquitin启动子和CaMV 35S RNA终止子(T35S)控制，gus基因(gus plus版本)由大豆actin启动子和水稻ubiquitin终止子控制。

图2是筛选单拷贝株系及转基因插入位点定位，其中(A)来自bar和gus标记基因的DNA片段作为杂交探针，基因组DNA使用限制性内切SacI酶切的Southern blot。携带有单拷贝转基因的株系(黑色箭头所指)在分别用两种探针杂交时，仅显示单一条带。当使用gus探针时，杂交片段大于6kb；使用bar探针时，大于2kb。其中(B)第二轮和第三轮TAIL-PCR产物。根据整合载体设计的巢式引物，在特异性的PCR产物中，第三轮PCR产物比第二轮产物小约50bp。将大于500bp的第三轮产物送测序。其中(C)无法被TAIL-PCR检出株系采用Inverse-PCR检测的株系。M：DNA marker。N：野生型作阴性对照。

图3是目标系位点信息，其中(A)T-DNA插入位点在大豆染色体上的位置，以红三角标出。(B)靶位点结构示意图。左侧和右侧的染色体位置以蓝色数字标出，基因组碱基缺失或随机插入，则以蓝色数字在小括号中标出，Δ表示缺失。T-DNA的左侧翼(LB)和右侧翼(RB)上方的数字表示转基因插入后剩余的LB和RB序列。LB或RB到RS2位点之间的载体骨架上方的数字表示插入后剩余的碱基数。

图4是目标株系的GUS染色和酶活性，其中(A)目标株系不同组织的GUS染色(花、第2三叶期叶片、根、种子)，标注红色的S20、S78和S80为纯合子，S15和S32为杂合子。(B)根据染色程度评估gus表达水平。+(或–)＝检测到(或未检测到)，+越多表示染色程度越大.(C)提取第4三叶期的纯合目标株系(S20、S78、S80)叶片中的β-葡萄糖醛酸酶活性，测定反应时间从0分钟至180分钟。每个株系测试三个独立植株，实验重复三次，每个点显示平均值及SD。

图5是目标株系位点特异性整合，其中(A)基因枪转化pJL210H&pYQ78后，筛选抗潮霉素的潜在的位点特异性整合事件，同时通过GFP荧光表达筛选。(B)通过PCR，对来自目标株系S20的20个转化愈伤进行位点特异性重组后形成的接合位点进行检测。引物设计如图1中所示。整合结构I和结构II的接合位点都被检测。阴性对照：N泳道，整合质粒pJL210H与目标株系S20的基因组DNA混合、ddH₂O。阳性对照：P泳道，体外重组的pJL210H和pSOY036B整合质粒。M泳道：DNA marker。

图6是胚尖基因枪转化的位点特异性整合植株，其中(A)基因枪转化大豆目标株系S20胚尖。pJL210A和pYQ78共转化胚尖的顶端分生组织。经灭草烟(imazapyr)抗性获得的植株及其观测叶片和茎的DsRED表达。将整合株系INTL1再生出根后移植到土壤中生长。(B-D)S20位点特异性整合pJL210A的结构示意图。整合结构I(C)，和整合结构II(D)。红色线段代表PCR产物；片段大小单位为kb(蓝色数字)。(E)整合植株INTL1结构I和结构II接合位点的PCR结果。阴性对照：N泳道，整合质粒pJL210A与各目标株系的基因组DNA混合、ddH2O。阳性对照：P泳道，体外重组的pJL210A和pSOY036B整合质粒。M泳道：DNA marker。

图7基因组DNA中T-DNA左侧翼PCR检测。M：DNA marker；P：质粒pSOY036B作为阳性对照；WT：野生型大豆基因组DNA作为阴性对照。

图8由pSOY036B转化获得的靶位点：从T-DNA区左侧翼LB至右侧翼RB间的DNA序列。加粗的大写字母表示T-DNA侧翼区；小写字母表示pSOY036B的载体序列；方框中小写字母为重组位点attP或lox位点序列，其他区域由其上方方框中的文字标注。

图9目标株系插入位点两侧的DNA。染色体位置的数字来自数据库http://www.phytozome.net/。因为T-DNA插入靶位点时的方向可能不同，此处T-DNA统一显示从左侧翼到右侧翼的顺序，故染色体的起始方向有所不同，数字会增或减。带星号*的序列表示插入位点处染色体上缺失的碱基；带下划线的小写字母表示既不属于染色体也不属于转化载体的随机插入序列；加粗的大写字母表示T-DNA的左右侧翼区(此处未显示T-DNA全长)。

图10目标株系插入位点两侧的DNA。染色体位置的数字来自数据库http://www.phytozome.net/。因为T-DNA插入靶位点时的方向可能不同，此处T-DNA统一显示从左侧翼到右侧翼的顺序，故染色体的起始方向有所不同，数字会增或减。带星号*的序列表示插入位点处染色体上缺失的碱基；带下划线的小写字母表示既不属于染色体也不属于转化载体的随机插入序列；加粗的大写字母表示T-DNA的左右侧翼区(此处未显示T-DNA全长)。

图11纯合目标株系检测及目标株系位点特异性基因整合PCR。筛选纯合的目标株系。泳道L显示引物j+b的PCR产物；泳道R显示引物k+l的PCR产物；泳道G显示引物j+l的PCR产物。S20、S78和S80均未扩增出G条带，S15和S32扩增出G条带，因此S20、S78和S80的目标位点为纯合，S15和S32为杂合。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。

实施例1适合基因叠加的载体

pSOY036B载体构建

采用标准的PCR程序构建载体，使用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB北京，中国)。目标株系转化载体pSOY036B(图1A)由pZH364(来自韩志国,Ow实验室)改造。pZH364含有水稻启动子控制的hpt筛选标记基因和gus基因，并且含有与pSOY036B一样的attP和lox位点，在T-DNA区末端有多个RS2位点(左侧4个RS2，右侧5个RS2)，用于加快CinH重组酶介导的这些RS2位点之间的DNA删除。为了使该载体在大豆中表达，其启动子被替换，具体为：将pZH364用XbaI和Bsu36I双酶切，将酶切产物与从大豆基因组上PCR扩增的1.2kb大豆ubiquitin启动子片段连接，以替换水稻actin1启动子，产生pZHS36ubi。然后将pZHS36ubi用Bsu36I和BamHI酶切，与从大豆基因组上PCR扩增的1kb大豆actin启动子片段连接，以替换gus的水稻actin2启动子，形成pZHS36。从基础载体pCambia3300上扩增下0.6kb的bar基因CDS片段，与pZHS36由PacI和XbaI酶切的产物连接，替换hpt基因，产生pZHS036B。最后用AscI和PmeI酶切pZHS036B，获得RS2位点之间的片段，将其与相同内切酶处理的pSOYCre0连接，产生pSOY036B。在pSOY036B中，bar基因由大豆ubiquitin启动子和CaMV 35S RNA终止子(T35S)控制，gus基因(gus plus版本)由大豆actin启动子和水稻ubiquitin终止子(Kuroda etal.,2010)控制。

pJL210H载体构建

愈伤整合载体pJL210H(图1B)由pZH210B改造而来。它包括含Scbv启动子和章鱼碱合酶(OCS)终止子的报告基因gfp、由大豆ubiquitin启动子和CaMV 35S RNA终止子(T35s)控制的筛选抗性基因hpt，以及与目标株系中的attP位点相匹配的重组位点attB和位于hpt旁侧的用于标记基因删除的lox位点。从pJL116H(取自Ow实验室)上扩增1kb的hpt基因CDS区，将pZH210B由SpeI和AscI酶切后，采用In-Fusion HD Cloning System(Clontech,CA,USA)连接。

pJL210A载体构建

植物整合载体pJL210A(图6B)与pJL210H结构类似，但报告基因改为DsRed，启动子和终止子不变。筛选抗性基因替换为ahas基因，由拟南芥ahas基因启动子和CaMV 35S RNA终止子(T35s)控制表达。从pZH116-AHAS(未发表，Ow实验室)上扩增2kb的ahas启动子片段和3.6kb的ahas CDS区，将pJL210HR(未发表，Ow实验室)用PspXI和AscI酶切后，采用In-Fusion连接上述两个片段，获得pJL210A。

整合载体pJL210H或pJL210A与Bxb1整合酶表达载体pYQ78共转化。其中Bxb1整合酶基因由CaMV 35S RNA启动子和nos终止子控制表达。另外在Bxb1基因编码区的C端含有一段45bp的核定位信号(NLS)(图1C)。

实施例2起始目标系的筛选

方法：农杆菌介导的转化

利用农杆菌介导的转化(Olhoft and Somers,2001；Paz et al.,2004)获得转基因大豆株系，用以筛选潜在的目标株系。采用含有pSOY036B质粒的A.tumefaciens菌株EHA105侵染“东农50”大豆子叶节。分析具有草丁膦抗性的转基因植株来获得大豆候选目标株系。

Southern blot分析

从大豆的新鲜叶片提取基因组DNA，在CTAB提取液(2％(w/v)CTAB,100mM Tris-HCl,20mM EDTA,1.4M NaCl和2％(w/v)PVP,pH 8.0)中裂解30分钟，65℃。用异丙醇沉淀提取液上清，将干燥后的DNA沉淀重新溶解在双蒸水中。为了进一步纯化DNA，采用NucleoBondAX 100柱(Roche,Genopure Plasmid Midi Kit，Roche，德国)过滤纯化。用Nano drop 2000(Thermo scientific，美国)检测DNA浓度。基因组DNA(30μg)使用限制性内切酶SacI-HF@(NEB，中国)酶切50μl体系，在37℃酶切12小时。酶切产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳分离。将电泳分离好的基因组DNA利用真空转膜系统(Bio rad model 785vacuum blotter，美国)转移到Hybond-N+尼龙膜(GE healthcare，英国)上。将膜上的基因组DNA在紫外灯(UVP CL-1000Ultraviolet Crosslinker,美国)下交联后，与[α-32P]dCTP标记的gus探针或bar探针进行孵育。放射性同位素采用DNA标记系统(Amersham Rediprime II DNA labelingsystem，GE，英国)进行探针标记。随后洗去非特异性结合的探针，杂交膜置于磷屏上曝光12小时，用Typhoon FLA 9500扫屏检测放射信号(IP:635nm,PMT:500V,Pixel size 200μm)。

采用TAIL-PCR(Liu and Chen,2007)和inverse-PCR(Boulin and Bessereau,2007)法对T-DNA插入基因组的位点进行精确定位。TAIL-PCR的第一轮引物由以下任意2条随机引物AD组合，加上特异引物SP1:

SP1,5’CGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTT3’(SEQ ID NO.1)；

AD,5’ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA3’(SEQ ID NO.2)；

5’ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT 3’(SEQ ID NO.3)；

5’ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAA3’(SEQ ID NO.4)；

5’ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGT3’(SEQ ID NO.5).

第一轮PCR产物稀释40倍后取1μL作为第二轮PCR的模板。

第二轮PCR引物：

SP2,5’ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATC3’(SEQ ID NO.6)；

AD2,5’ACGATGGACTCCAGAG3’(SEQ ID NO.7).

第二轮PCR产物稀释10倍后取1μL作为第三轮PCR的模板。

第三轮PCR引物：

SP3,5’GAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTT3’(SEQ ID NO.8)；

AD2,5’ACGATGGACTCCAGAG3’(SEQ ID NO.9).

Inverse-PCR法则首先将基因组DNA利用限制性内切酶BamHI在37℃酶切12小时，75℃灭活酶15分钟。添加T4连接酶和连接缓冲液至100μL体系，于16℃进行自连反应12小时。

第一轮PCR引物：F1,5’GAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTT3’(SEQ ID NO.10)；

R1,5’GATACGCTGATCCTTCAGATAG3’(SEQ ID NO.11).

第一轮PCR产物稀释200倍后取3μL作为第二轮PCR的模板。

第二轮PCR引物：F2,5’GGTAAACCTAAGAGAAAAGAGCGT3’(SEQ ID NO.12)；

R2,5’CAGTCCTTTCCCGTAGTCC3’(SEQ ID NO.13).

PCR分析

T-DNA插入位点进一步利用检测到的基因组信息设计新引物，以高保真酶(Phusion,NEB)进行PCR确认，采用常规PCR程序。转基因和位点特异性重组则利用LA taq酶(TAKARA，中国)进行PCR分析。

T-DNA转基因LB侧翼的检测引物：

a,5’GGCGCGCCGCACGTTCACCG3’(SEQ ID NO.14)；

b,5’TGGCATGACGTGGGTTTCTG3’(SEQ ID NO.15).

目标株系插入位点的检测引物：

jS15,5’AAATCTTGATGAGGCGTGT3’(SEQ ID NO.16)；

jS20,5’GCGTTGGAATACATACTCATC3’(SEQ ID NO.17)；

jS32,5’GGGCCTTGTGAGGTGAGA3’(SEQ ID NO.18)；

jS78,5’TCGAGAAACAATTACAACCC3’(SEQ ID NO.19)；

jS80,5’TGATTAAGTTACACTCAACGC3’(SEQ ID NO.20)；

b,5’TGGCATGACGTGGGTTTCTG3’(SEQ ID NO.21)；

k,5’TGGCAACTGTTGCTCCAGTAATGC3’(SEQ ID NO.22)；

lS15,5’CATTTCTTTGGCAGGGACA3’(SEQ ID NO.23)；

lS20,5’CTACTCTGCGTGGGCATTGGT3’(SEQ ID NO.24)；

lS32,5’GGTGCCTTGAGACTACCC3’(SEQ ID NO.25)；

lS78,5’TTCACCCAAGTATCTTCTCAC3’(SEQ ID NO.26)；

lS80,5’TCTTGGGGATTTCGGGTTGGTT3’.(SEQ ID NO.27)

GUS染色和GUS酶活性分析

取转基因植株的叶片、种子和根浸没至GUS染色液(9mM KH2PO4,61mM K2HPO4·3H2O,1mg/mL X-Gluc,0.5mM铁氰化钾,0.5mM亚铁氰化钾,0.1％(v/v)Triton X-100)中，37℃孵育16小时后观察显色。取50mg大豆叶片进行GUS酶活性的定量分析，将叶片磨碎并加入200μL蛋白提取液(77.4mM Na2HPO4,22.6mM NaH2PO4,1mM EDTA,1％(v/v)TritionX-100,1mM PMSF)。采用BCA法(Pierce BCA Protein Assay Kit,Thermo，美国)测定蛋白总浓度。采用分光光度法分析β-Glucuronidase活性(Jefferson et al.,1987)。

GUS染色和GUS酶活性分析

取转基因植株的叶片、种子和根浸没至GUS染色液(9mM KH2PO4,61mM K2HPO4·3H2O,1mg/mL X-Gluc,0.5mM铁氰化钾,0.5mM亚铁氰化钾,0.1％(v/v)Triton X-100)中，37℃孵育16小时后观察显色。取50mg大豆叶片进行GUS酶活性的定量分析，将叶片磨碎并加入200μL蛋白提取液(77.4mM Na2HPO4,22.6mM NaH2PO4,1mM EDTA,1％(v/v)TritionX-100,1mM PMSF)。采用BCA法(Pierce BCA Protein Assay Kit,Thermo，美国)测定蛋白总浓度。采用分光光度法分析β-Glucuronidase活性(Jefferson et al.,1987)。

结果：

通过转化约36,000个大豆子叶节外植体进行了转化获得了368个再生植株。初步筛选是依赖于对草丁膦的抗性进行的。通过GUS染色法筛选出118个gus正常表达的植株。随后利用PCR分析T-DNA左边界的重组位点片段，116株显示有T-DNA LB区(图7)。

对这116个株系进行Southern blot分析。基因组DNA由SacI酶切并以gus或barDNA片段为探针。预期gus探针与左边界含的片段杂交，bar探针检测右边界含的片段。预期SacI酶切后产生的左边界片段大小大于2kb，右边界的大于6kb。图2A显示了10个检测到的显示有预期单个杂交带的株系例子(黑色箭头所指)。实际有35株显示与预期单拷贝T-DNA插入模式。尽管有多条带的植株可通过后代分离获得单拷贝(假如无连锁)，我们没有开展下去。

我们利用TAIL-PCR来鉴定这35株单拷贝转基因植株。然而，只有13株成功获得定位信息(图2B)。其中，有4个植株因为含有农杆菌双元载体T-DNA区为外的骨架被排除掉，这骨架是aadA基因(用于壮观霉素抗性)；有3株TAIL-PCR结果在基因组上设计引物进行高保真酶PCR，无法得到验证结果；1株定位信息含有大量重复序列，无法准确定位；另有1株插入到内源基因内部；还有2株插入位点距离最近的大豆内源功能基因的编码区太近，分别是637bp和173bp。最后，用TAIL-PCR的方法鉴定获得S20和S80两个候选目标株系。

对剩余的TAIL-PCR没有鉴定出的22个植株，我们用BamHI酶切大豆基因组,尝试了invers-PCR方法(图2C)，并且成功获得了5个植株的插入位点信息。然而其中1株根据进行高保真酶PCR，左右两侧接合位点均未得到验证；另1株右侧接合位点未得到验证。剩余S15,S32和S78这3株符合候选目标株系的要求。

经测序左右两侧的接合位点，所有5个株系(S15、S20、S32、S78、S80)相关的RS2、lox和attP重组位点都是正确的(图8)。因为bar和gus基因代表的DNA将会在新DNA成功叠加后被删除，我们未测序两个同向lox位点之间的DNA片段。bar基因是用于转化的筛选标记基因，转基因植株的获得表示它的功能是有效的。对gus来说，我们对其表达进行了检测。它由大豆actin基因启动子启动，通过对5个株系的T2代植株之花、叶、根和种子进行gus染色，结果显示gus表达良好(图4)。我们同样对纯合目标株系的T2代第四个三叶期叶子进行了GUS酶活检测。有趣的是，这些目标株系之间GUS酶活性并不相同(图4C)：180分钟的实验处理后，S20的GUS酶活性几乎是S78的5倍，这说明不同的染色体位置对gus表达可能有不同的影响。

实施例3起始目标系的基因组定位

TAIL-PCR和inverse-PCR的终产物送测序公司(上海生工，广州，中国)测序。检测到的基因组序列在大豆相关数据库分析:https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htm；https://www.soybase.org/，以Glycinemax Wm82.a2.v1作为参考基因组。PCR产物的载体序列以质粒pSOY036B为参照，在序列比对网站ClustalW2(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行比对分析。

获得的5个目标株系基因组插入信息是：

S15:插入到第16号染色体短臂，第4,414,388位碱基和第4,414,393位碱基之间。第4,414,389位碱基至第4,414,392位碱基间的DNA丢失，即S15在插入位点处有一个4bp的基因组删除(图3B；图9)。在T-DNA的左端，从RS2开始，含有26bp的LB序列和500bp的载体序列，该株系缺失了全部26bp LB和1bp载体序列。在T-DNA的右端，缺失26bp RB和18bp载体序列。在T-DNA的右端，含有26bp的RB序列和277bp的相邻载体序列，该株系缺失了全部26bpLB和18bp载体序列。

S20：插入到第15号染色体长臂，第8,355,701位碱基和第8,355,726位碱基之间。第8,355,702位碱基至第8,355,725位碱基间的DNA丢失，即S20在插入位点处有一个24bp的基因组删除(图3B；图9)。该株系缺失了22bp LB和20bp的RB。

S32:插入到第2号染色体短臂，第9,329,711位碱基和第9,329,900位碱基之间。第9,329,712位碱基至第至第9,329,899位碱基间的188bp的基因组DNA丢失，同时被替换为3bp随机序列插入(图3B)。该株系缺失了9bp LB和9bp的RB，在RB端有一个18bp的随机插入。另外在LB端的RS2区域，发现有多一个拷贝的RS2位点，但该RS2位点缺失了10bp(图9)。

S78:插入到第2号染色体短臂，第9,310,241位碱基和第9,310,243位碱基之间。第9,310,242位碱基丢失。该株系缺失了17bp LB和全部26bp的RB，同时在RB端缺失了10bp的相邻载体序列(图3B；图9)。

S80:插入到第11号染色体长臂，第5,408,016位碱基和第5,408,042位碱基之间。第5,408,017位碱基至第至第5,408,041位碱基间的25bp的基因组DNA丢失。该株系缺失了全部26bp的LB和RB，同时在LB端缺失了215bp的相邻载体序列，在RB端缺失了38bp的载体序列(图3B；图9)

实施例4起始目标系的定点整合测试

1)利用愈伤进行定点整合的测试

大豆种子利用氯气法灭菌(在100mL 10％次氯酸钠溶液中加入3.5ml 12N盐酸)16小时。灭菌后的种子接种到萌发培养基(MS基础培养基加3％(w/v)蔗糖,过滤除菌的1mg/L6-BA和8g/L琼脂,pH 5.8)，25℃，光周期16小时光照，8小时黑暗。一周后取萌发苗的茎部分，横切为薄片，平铺在愈伤诱导培养基上(MS基础培养基加3％(w/v)蔗糖,过滤除菌的2mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA和8g/L琼脂,pH 5.8)。大约16天后诱导产生淡绿色愈伤组织，将愈伤转移至新鲜的诱导培养基进行继代培养。

愈伤转化：转化前3天，将愈伤组织转移到新鲜的诱导培养基。转化当天，将愈伤组织放置于高渗培养基(诱导培养基中添加46.6g/L甘露醇and 46.6g/L山梨醇)黑暗4小时处理。利用基因枪转化系统PDS-1000/He System(Bio-rad,USA)进行轰击转化。轰击后，将愈伤在高渗培养基上继续放置18小时，并在荧光显微镜下检测GFP信号。随后将愈伤转移到筛选培养基(诱导培养基添加100mg/L潮霉素B)，在25℃光照下筛选1个月。

以胚尖为外植体的转化：将成熟种子浸没于灭菌水中16小时以获取胚尖，剥离胚尖放置在轰击培养基(MS基础培养基，3％(w/v)蔗糖和8g/L琼脂,pH 5.8)以进行胚尖基因枪转化。轰击过程与上述愈伤轰击方法(Li et al.,2016)相同，轰击后的胚尖培养及筛选与报道的方法一致(Rech et al.,2008)，但筛选再生苗的抗生素采用100nM灭草烟。

为测试Bxb1整合酶催化新DNA位点特异性整合入靶位点，本发明利用基因枪方法测试这5个目标株系的T2代种子诱导的愈伤。其中S20、S78和S80靶位点为纯合子，S15和S32为杂合子。进行了测序、PCR检测，说明了Bxb1原核位点特异性整合系统在大豆基因组中可精确且有效的实现整合。

2)再生植株中的位点特异性整合

为测试Bxb1介导的位点特异性重组是否可获得可育性植株，本发明使用S20的成熟种子的胚尖作为基因枪转化材料(图6A)。

说明了Bxb1整合系统可有效地在大豆植株中进行新DNA的特异性整合。

综上所述，本发明获得了5个大豆起始目标系：S15、S20、S32、S78、S80。并利用基因枪对5个位点的愈伤上进行了特异性重组的测试，每个起始目标系均显示了Bxb1介导的位点特异性整合。进一步，利用了成熟种子的胚尖进行基因枪转化，获得了一株位点特异性整合的转基因大豆再生植株。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCELISTING

<110>中国科学院华南植物园

<120>用于重组酶介导的特异性位点的基因叠加的大豆目标系

<130>

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<170>PatentInversion3.5

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Claims (1)

1.一种大豆基因组位点作为重组酶介导的基因编辑位点在插入大豆叠加载体中的应用，其特征在于，所述大豆基因组位点为：

大豆15号染色体的长臂第8,355,701位碱基和第8,355,726位碱基之间；

基因组信息参考:GlycinemaxWm82.a2.v1；

所述重组酶为Bxb1重组酶。

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