CN115552002A - 基因组改造方法及基因组改造试剂盒 - Google Patents

基因组改造方法及基因组改造试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN115552002A
CN115552002A CN202180026858.3A CN202180026858A CN115552002A CN 115552002 A CN115552002 A CN 115552002A CN 202180026858 A CN202180026858 A CN 202180026858A CN 115552002 A CN115552002 A CN 115552002A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
homology arm
selection marker
alleles
genome
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180026858.3A
Other languages
English (en)
Inventor
相泽康则
大野知幸
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Corporation Logo Integration
Tokyo Institute of Technology NUC
Original Assignee
Corporation Logo Integration
Tokyo Institute of Technology NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Corporation Logo Integration, Tokyo Institute of Technology NUC filed Critical Corporation Logo Integration
Publication of CN115552002A publication Critical patent/CN115552002A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/905—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • C12Y201/01107—Uroporphyrinogen-III C-methyltransferase (2.1.1.107)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明提供能够高效地改造2个以上等位基因、并且能够改造较大的区域的基因组改造方法及上述基因组改造试剂盒。一种改造染色体基因组的2个以上等位基因的基因组改造方法，其包括：(a)将下述(i)和(ii)导入包含上述染色体的细胞的步骤，(i)基因组改造系统，其包含以上述染色体基因组的靶区域为靶标的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，(ii)具有相互不同的选择标记基因的2种以上选择标记用供体DNA(上述选择标记用供体DNA的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量)；以及(b)基于上述2种以上选择标记用供体DNA所具有的全部选择标记基因选择出上述细胞的步骤。

Description

基因组改造方法及基因组改造试剂盒
技术领域
本发明涉及基因组改造方法及基因组改造试剂盒。
背景技术
自从CRISPR/Cas系统作为新的基因组编辑工具被报道以来，已经利用CRISPR/Cas系统进行了各种研究(例如专利文献1)。在利用CRISPR/Cas系统的基因组编辑中，指导RNA靶向化的靶区域被Cas9核酸酶双链切割。已知双链切割后的DNA可通过同源重组修复(Homology Directed Repair：HDR)或非同源末端连接修复(Non-Homologous End-JoiningRepair：NHEJ)而进行修复。HDR中，通过将与靶区域的周边区域具有同源序列的供体DNA与CRISPR/Cas系统一起导入细胞，能够将任意序列整合到靶区域中。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2014/093661号
发明内容
发明所要解决的问题
以往的基因组改造技术中，通过HDR不能同时且高效地改造2个以上等位基因。另外，可利用HDR改造的基因组区域的尺寸有限，难以高效地进行基因组的大规模改造(例如10kbp)。
因此，本发明的课题在于，提供能够高效地改造2个以上等位基因、并且能够改造较大的区域的基因组改造方法及上述基因组改造试剂盒。
用于解决问题的方法
作为一例，本发明包括下述方式。
[1]一种基因组改造方法，其是改造染色体基因组的2个以上等位基因的基因组改造方法，其包括：
(a)将下述(i)和(ii)导入包含上述染色体的细胞的步骤，
(i)基因组改造系统，其包含以上述染色体基因组的靶区域为靶标的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(ii)2种以上选择标记用供体DNA，其在具有与上述靶区域的上游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的上游同源臂与具有与上述靶区域的下游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的下游同源臂之间包含选择标记基因的碱基序列，上述2种以上选择标记用供体DNA具有相互不同的选择标记基因，上述选择标记用供体DNA的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量；以及
(b)在上述步骤(a)之后基于上述2种以上选择标记用供体DNA所具有的全部选择标记基因选择出上述细胞的步骤。
[2]根据[1]所述的基因组改造方法，其中，上述选择标记基因为正选择标记基因，上述步骤(b)为选择出表达与上述等位基因的数量相等的上述正选择标记基因的细胞的步骤。
[3]根据[2]所述的基因组改造方法，其中，上述选择标记用供体DNA在上述上游同源臂与上述下游同源臂之间还具有负选择标记基因。
[4]根据[3]所述的基因组改造方法，其还包括：(c)在上述步骤(b)之后将在具有与上述靶区域的上游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的上游同源臂与具有与上述靶区域的下游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的下游同源臂之间包含期望的碱基序列的重组用供体DNA导入上述细胞的步骤；以及(d)在上述步骤(c)之后选择出不表达上述负选择标记基因的细胞的步骤。
[5]根据[3]或[4]所述的基因组改造方法，其中，上述正选择标记基因为抗药性基因，上述负选择标记基因为荧光蛋白基因。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的基因组改造方法，其中，上述序列特异性核酸切割分子为序列特异性核酸内切酶。
[7]根据[6]所述的基因组改造方法，其中，上述基因组改造系统包含Cas蛋白和具有与上述靶区域内的碱基序列同源的碱基序列的指导RNA。
[8]一种改造染色体基因组的2个以上等位基因的基因组改造试剂盒，其包含下述(i)和(ii)：
(i)基因组改造系统，其包含以上述染色体基因组的靶区域为靶标的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(ii)2种以上选择标记用供体DNA，其在具有与上述靶区域的上游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的上游同源臂与具有与上述靶区域的下游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的下游同源臂之间包含选择标记基因的碱基序列，上述2种以上选择标记用供体DNA具有相互不同的选择标记基因，上述选择标记用供体DNA的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量。
[9]根据[8]所述的基因组改造试剂盒，其中，上述选择标记基因为正选择标记基因。
[10]根据[9]所述的基因组改造试剂盒，其中，上述选择标记用供体DNA在上述上游同源臂与上述下游同源臂之间还具有负选择标记基因。
[11]根据[8]～[10]中任一项所述的基因组改造试剂盒，其中，上述序列特异性核酸切割分子为序列特异性核酸内切酶。
[12]根据[8]～[11]中任一项所述的基因组改造试剂盒，其中，上述基因组改造系统包含Cas蛋白和具有与上述靶区域内的碱基序列同源的碱基序列的指导RNA。
作为一例，本发明包括下述方式。
〔1〕一种制备染色体基因组的2个以上等位基因被改造了的细胞的方法，其包括：
(a)将下述(i)和(ii)导入包含2个以上等位基因的细胞而向上述2个以上等位基因分别导入选择标记基因的步骤，
(i)基因组改造系统，其包含能够以上述染色体基因组的2个以上等位基因中的靶区域为靶标并对该靶区域进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(ii)2种以上选择标记用供体DNA，其分别具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂，并且在上游同源臂与下游同源臂之间包含选择标记基因的碱基序列，上述2种以上选择标记用供体DNA分别具有相互能够区分的不同的选择标记基因，上述选择标记基因对于每种选择标记用供体DNA而言是特有的，上述选择标记用供体DNA的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量；以及
(b)在上述步骤(a)之后通过使不同种类的选择标记用供体DNA分别对上述2个以上等位基因进行同源重组而向该2个以上等位基因中分别导入能够区分的不同的特有的选择标记基因、并选择出表达所有导入的该能够区分的不同的选择标记基因的细胞的步骤(用于正选择的步骤)。
〔2〕一种改造染色体基因组的2个以上等位基因的方法，其包括：
(a)将下述(i)和(ii)导入包含2个以上等位基因的细胞而向上述2个以上等位基因分别导入选择标记基因的步骤，
(i)基因组改造系统，其包含能够以上述染色体基因组的2个以上等位基因中的靶区域为靶标并对该靶区域进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(ii)2种以上选择标记用供体DNA，其分别具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂，并且在上游同源臂与下游同源臂之间包含选择标记基因的碱基序列，上述2种以上选择标记用供体DNA分别具有相互能够区分的不同的选择标记基因，上述选择标记基因对于每种选择标记用供体DNA而言是特有的，上述选择标记用供体DNA的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量；以及
(b)在上述步骤(a)之后通过使不同种类的选择标记用供体DNA分别对上述2个以上等位基因进行同源重组而向该2个以上等位基因中分别导入能够区分的不同的特有的选择标记基因、并选择出表达所有导入的该能够区分的不同的选择标记基因的细胞的步骤(用于正选择的步骤)。
〔3〕根据上述〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，靶区域具有5kbp以上的长度。
〔4〕根据上述〔3〕所述的方法，其中，靶区域具有8kbp以上的长度。
〔5〕根据上述〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其中，2种以上选择标记用供体DNA分别在上述上游同源臂与上述下游同源臂之间具有用于正选择的选择标记基因、用于负选择的标记基因和靶序列，在此，在该选择标记基因既可以用于正选择也可以用于负选择的情况下，可以不具有另外的用于负选择的选择标记基因，
所述方法还包括：
(c)在上述步骤(b)之后将下述(iii)和(iv)导入所选择的细胞而向上述2个以上等位基因导入重组用供体DNA的步骤，
(iii)基因组改造系统，其包含能够以上述靶序列为靶标并对该靶序列进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(iv)包含期望的碱基序列的重组用供体DNA，其具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂；以及
(d)在上述步骤(c)之后选择出不表达上述用于负选择的标记基因的细胞的步骤(用于负选择的步骤)。
〔6〕根据上述〔3〕所述的方法，其中，2种以上选择标记用供体DNA分别在上述上游同源臂与上述下游同源臂之间具有用于正选择的选择标记基因、用于负选择的标记基因和靶序列，在此，在该选择标记基因既可以用于正选择也可以用于负选择的情况下，可以不具有另外的用于负选择的选择标记基因，
所述方法还包括：
(c)在上述步骤(b)之后将下述(iii)和(iv)导入所选择的细胞而向上述2个以上等位基因导入重组用供体DNA的步骤，
(iii)基因组改造系统，其包含能够以上述靶序列为靶标并对该靶序列进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(iv)包含期望的碱基序列的重组用供体DNA，其具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂；以及
(d)在上述步骤(c)之后选择出不表达上述用于负选择的标记基因的细胞的步骤(用于负选择的步骤)。
〔7〕根据上述〔4〕所述的方法，其中，2种以上选择标记用供体DNA分别在上述上游同源臂与上述下游同源臂之间具有用于正选择的选择标记基因、用于负选择的标记基因和靶序列，在此，在该选择标记基因既可以用于正选择也可以用于负选择的情况下，可以不具有另外的用于负选择的选择标记基因，
所述方法还包括：
(c)在上述步骤(b)之后将下述(iii)和(iv)导入所选择的细胞而向上述2个以上等位基因导入重组用供体DNA的步骤，
(iii)基因组改造系统，其包含能够以上述靶序列为靶标并对该靶序列进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(iv)包含期望的碱基序列的重组用供体DNA，其具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂；以及
(d)在上述步骤(c)之后选择出不表达上述用于负选择的标记基因的细胞的步骤(用于负选择的步骤)。
〔8〕根据上述〔5〕～〔7〕中任一项所述的方法，其中，重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
〔9〕根据上述〔6〕或〔7〕所述的方法，其中，重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
〔10〕根据上述〔7〕所述的方法，其中，重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
〔11〕根据上述〔8〕所述的方法，其中，重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有8kbp以上的长度。
〔12〕一种改造染色体基因组的2个以上等位基因的基因组改造试剂盒，其包含下述(i)和(ii)：
(i)基因组改造系统，其包含能够以上述染色体基因组的靶区域为靶标并对靶区域进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(ii)2种以上选择标记用供体DNA，其具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂，上游同源臂与下游同源臂之间包含选择标记基因的碱基序列，
上述2种以上选择标记用供体DNA具有相互能够区分的不同的选择标记基因，上述选择标记基因对于每种选择标记用供体DNA而言是特有的，上述选择标记用供体DNA的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量。
〔13〕根据上述〔12〕所述的试剂盒，其中，靶区域具有5kbp以上的长度。
〔14〕根据上述〔13〕所述的试剂盒，其中，靶区域具有8kbp以上的长度。
〔15〕根据上述〔12〕～〔14〕中任一项所述的试剂盒，其还包含重组用供体DNA。
〔16〕根据上述〔12〕～〔15〕中任一项所述的试剂盒，其中，重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
〔17〕根据上述〔12〕～〔16〕中任一项所述的试剂盒，其中，重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有8kbp以上的长度。
〔18〕根据上述〔12〕所述的试剂盒，其中，靶区域具有5kbp以上的长度，并且重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
〔19〕根据上述〔18〕所述的试剂盒，其中，靶区域具有8kbp以上的长度，并且重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有8kbp以上的长度。
〔20〕根据上述〔5〕所述的方法，其中，重组用供体DNA在重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域不具有碱基序列，改造后得到的染色体基因组的上述2个以上等位基因中，靶区域的上游与下游的序列以没有碱基的插入、置换和缺失的方式无缝连接。
〔21〕根据上述〔6〕或〔7〕所述的方法，其中，重组用供体DNA在重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域不具有碱基序列，改造后得到的染色体基因组的上述2个以上等位基因中，靶区域的上游与下游的序列以没有碱基的插入、置换和缺失的方式无缝连接。
〔22〕根据上述〔3〕所述的方法，其中，改造后得到的染色体基因组的上述2个以上等位基因中，不存在位点特异性重组酶的靶序列。
〔23〕根据上述〔4〕所述的方法，其中，改造后得到的染色体基因组的上述2个以上等位基因中，不存在位点特异性重组酶的靶序列。
〔24〕根据上述〔5〕所述的方法，其中，改造后得到的染色体基因组的上述2个以上等位基因中，不存在位点特异性重组酶的靶序列。
〔25〕根据上述〔6〕或〔7〕所述的方法，其中，改造后得到的染色体基因组的上述2个以上等位基因中，不存在位点特异性重组酶的靶序列。
〔26〕根据上述〔1〕～〔11〕和〔20〕～〔25〕中任一项所述的方法，其中，步骤(b)中，在直至选择出改造了2个以上等位基因的细胞为止的过程中，不进行单细胞克隆。
〔27〕一种细胞，其为关于靶区域在染色体基因组上具有2个以上等位基因的细胞，其中，上述2个以上等位基因各自的靶区域缺失、并且靶区域的上游与下游的序列以没有碱基的插入、置换和缺失的方式无缝连接。
〔28〕根据上述〔27〕所述的细胞，其中，靶区域具有5kbp以上的长度。
〔29〕根据上述〔27〕或〔28〕所述的细胞，其基因组中不具有位点特异性重组酶的靶序列。
〔30〕根据上述〔6〕或〔7〕所述的方法，其中，重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有8kbp以上的长度。
〔31〕根据上述〔15〕所述的试剂盒，其中，重组用供体DNA在重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域不具有碱基序列。
发明效果
根据本发明，可提供能够高效地改造2个以上等位基因、并且能够改造较大的区域的基因组改造方法及上述基因组改造试剂盒。
附图说明
图1示出实验例1中制备的供体DNA的结构。
图2示出将实验例1中制备的供体DNA导入细胞的步骤。另外，示出用于确认供体DNA的敲入的连接引物的设计位置。
图3示出在敲入供体DNA后进行连接PCR的结果。
图4示出将参考实验例中制备的供体DNA导入细胞的步骤。另外，示出用于确认供体DNA的敲入的连接引物的设计位置以及敲入供体DNA后进行连接PCR的结果。
图5示出将野生型TP53质粒作为供体DNA向导入了实验例1中制备的供体DNA的细胞(实验例2中制备的细胞)中导入的步骤。另外，示出用于确认野生型TP53质粒的敲入的引物的设计位置。
图6示出敲入野生型TP53质粒后使用图5的引物进行PCR的结果。
图7示出将实验例4中制备的4种供体DNA导入实验例2中制备的细胞的步骤。另外，示出用于确认上述4种供体DNA的敲入的引物的设计位置。
图8示出敲入实验例4中制备的4种供体DNA后使用图7的引物进行PCR的结果。
图9示出实施例5中进行的诱导人iPS细胞中的TP53基因的两个等位基因的缺失的实验结果。
图10示出实施例6中进行的诱导MLH1基因的两个等位基因的缺失的实验结果。
图11示出实施例6中进行的诱导CD44基因的两个等位基因的缺失的实验结果。
图12示出实施例6中进行的诱导MET基因的两个等位基因的缺失的实验结果。
图13示出实施例6中进行的诱导APP基因的两个等位基因的缺失的实验结果。
图14A为示出本发明的方法的导入选择标记用供体DNA的步骤中诱导以夹着基因组的靶区域的方式进行2个位置的切割的示意图。
图14B为示出本发明的方法的导入选择标记用供体DNA的步骤中诱导基因组的靶区域附近的1个位置的切割的示意图。
具体实施方式
[定义]
“多核苷酸”和“核酸”这一术语可互换使用，是指核苷酸通过磷酸二酯键键合而成的核苷酸聚合物。“多核苷酸”和“核酸”可以是DNA，可以是RNA，可以由DNA与RNA的组合构成。另外，“多核苷酸”和“核酸”可以是天然核苷酸的聚合物，可以是天然核苷酸与非天然核苷酸(天然核苷酸的类似物，碱基部分、糖部分和磷酸部分中的至少一个部分经修饰的核苷酸(例如硫代磷酸酯骨架)等)的聚合物，可以是非天然核苷酸的聚合物。
“多核苷酸”或“核酸”的碱基序列在没有特别声明时以通常认可的单字母符号来记载。没有特别声明时，碱基序列从5’侧向3’侧来记载。构成“多核苷酸”或“核酸”的核苷酸残基有时仅以腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤或尿嘧啶等或它们的单字母符号来记载。
“基因”这一术语是指包含编码特定蛋白的至少1个开放阅读框的多核苷酸。基因可包含外显子和内含子这两者。
“多肽”、“肽”和“蛋白”这些术语可互换使用，是指通过酰胺键键合而成的氨基酸的聚合物。“多肽”、“肽”或“蛋白”可以为天然氨基酸的聚合物，可以为天然氨基酸与非天然氨基酸(天然氨基酸的化学类似物、修饰衍生物等)的聚合物，可以为非天然氨基酸的聚合物。没有特别声明时，氨基酸序列从N末端侧向C末端侧来记载。
“等位基因”这一术语是指存在于染色体基因组上的同一基因座的碱基序列组。一个方式中，2倍体细胞中在同一基因座上存在2个等位基因，3倍体细胞中在同一基因座上存在3个等位基因。另外，一个方式中，有时由于染色体的异常拷贝或该基因座的异常追加拷贝而形成追加的等位基因。
“基因组改造”或“基因组编辑”这一术语可互换使用，是指对基因组上的期望位置(靶区域)诱导变异。基因组改造可包括使用以切割靶区域DNA的方式设计的序列特异性核酸切割分子的步骤。优选实施方式中，基因组改造可包括使用以切割靶区域的DNA的方式操作的核酸酶的步骤。优选实施方式中，基因组改造可包括使用以切割靶区域中的具有特定碱基序列的靶序列的方式操作的核酸酶(例如TALEN、ZFN)的步骤。优选实施方式中，基因组改造中，为了切割靶区域中的具有特定碱基序列的靶序列，有时可以使用兆核酸酶等在基因组中仅具有1个切割位点的限制酶(例如具有16个碱基的序列特异性的限制酶(理论上，以在416个碱基中有1个的比例存在)、具有17个碱基的序列特异性的限制酶(理论上，以在417个碱基中有1个的比例存在)以及具有18个碱基的序列特异性的限制酶(理论上，以在418个碱基中有1个的比例存在))等序列特异性核酸内切酶。典型情况下，通过使用位点特异性核酸酶，在靶区域的DNA中诱导双链切割(DSB)，之后通过同源重组修复(HomologyDirected Repair：HDR)和非同源末端连接(Non-Homologous End-Joining Repair：NHEJ)之类的细胞内源性过程来修复基因组。NHEJ为在不使用供体DNA时使经双链切割的末端连接的修复方法，修复时可高频地诱导插入和/或缺失(indel)。HDR为使用供体DNA的修复机制，也能够向靶区域导入期望的变异。作为基因组改造技术，可优选例示例如CRISPR/Cas系统。作为兆核酸酶，可以使用例如选自由I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-TliI、I-PpoI、PI-PspI、F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HsNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NclIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorI、I-PorIIP、I-PbpIP、I-SpBetaIP、I-ScaI、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomI、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp68031、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiSTe3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-UarAP、I-UarHGPAIP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-Mtul、PI-MtuHIP PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-Rma43812IP、PI-SpBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI和PI-TliII、以及它们的功能性衍生物限制酶组成的组中的兆核酸酶及其切割位点(或识别位点)，优选使用作为具有18个碱基以上的序列特异性的限制酶的兆核酸酶及其切割位点(或识别位点)，特别是使用不将细胞的基因组在1个位置或多个以上位置切割的兆核酸酶及其切割位点。
“靶区域”这一术语是指成为基因组改造对象的基因组区域。
“供体DNA”这一术语是指在DNA的双链切割的修复中使用的、与靶区域周边的DNA能够进行同源重组的DNA。供体DNA包含作为同源臂的靶区域的上游的碱基序列和下游的碱基序列(例如和靶区域相邻的碱基序列)。本说明书中，有时将靶区域上游侧的碱基序列(例如和上游侧相邻的碱基序列)所构成的同源臂称为“上游同源臂”、将靶序列下游侧的碱基序列(例如和下游侧相邻的碱基序列)所构成的同源臂称为“下游同源臂”。供体DNA中，在上游同源臂与下游同源臂之间可以包含期望的碱基序列。各同源臂的长度优选为300bp以上，通常为500～3000bp左右。上游同源臂与下游同源臂的长度彼此可以相同也可以不同。序列依赖性切割后，靶区域与供体DNA之间一旦成功诱发同源重组，则位于靶区域上游的碱基序列与下游的碱基序列之间的序列将被置换为供体DNA的序列。
靶区域的“上游”是指在靶区域的双链DNA中位于成为基准的核苷酸链的5’侧的DNA区域。靶区域的“下游”是指位于成为基准的核苷酸链的3’侧的DNA。靶区域包含蛋白编码序列时，成为基准的核苷酸链通常为有义链。一般，启动子位于蛋白编码序列的上游。终止子位于蛋白编码序列的下游。
“序列特异性核酸切割分子”这一术语是指能够识别特定核酸序列、并且在上述特定核酸序列处切割核酸的分子。序列特异性核酸切割分子为具有序列特异性地切割核酸的活性(序列特异性核酸切割活性)的分子。
“靶序列”这一术语是指成为序列特异性核酸切割分子的切割对象的、基因组中的DNA序列。序列特异性核酸切割分子为Cas蛋白时，靶序列是指成为Cas蛋白切割对象的、基因组中的DNA序列。在使用Cas9蛋白作为Cas蛋白时，靶序列必须为与前间隔序列临近基序(PAM)的5’侧相邻的序列。靶序列通常选择紧挨着PAM的5’侧的17～30个碱基(优选为18～25个碱基、更优选为19～22个碱基、进一步优选为20个碱基)的序列。在设计靶序列时，可以利用CRISPR DESIGN(crispr.mit.edu/)等公知的设计工具。
“Cas蛋白”这一术语是指CRISPR相关(CRISPR-associated)蛋白。优选方式中，Cas蛋白与指导RNA形成复合体而显示核酸内切酶活性或切口酶活性。作为Cas蛋白，没有特别限制，可列举例如Cas9蛋白、Cpf1蛋白、C2c1蛋白、C2c2蛋白和C2c3蛋白等。Cas蛋白只要与指导RNA联动并显示核酸内切酶活性或切口酶活性，则包括野生型Cas蛋白及其同源物(旁系同源物和直系同源物)、以及它们的变异体。
优选方式中，Cas蛋白为与2类CRISPR/Cas系统相关的Cas蛋白，更优选为与II型CRISPR/Cas系统相关的Cas蛋白。作为Cas蛋白的优选例，可例示Cas9蛋白。
“Cas9蛋白”这一术语是指与II型CRISPR/Cas系统相关的Cas蛋白。Cas9蛋白与指导RNA形成复合体、并且与指导RNA联动而显示出切割靶区域的DNA的活性。Cas9蛋白只要具有上述活性，则包含野生型Cas9蛋白及其同源物(旁系同源物和直系同源物)、以及它们的变异体。野生型Cas9蛋白具有作为核酸酶结构域的RuvC结构域和HNH结构域，本说明书中的Cas9蛋白可以为RuvC结构域和HNH结构域中的任一者已失活的蛋白。RuvC结构域和HNH结构域中的任一者已失活的Cas9对双链DNA导入单链切割(切口)。因此可以以如下方式构成改造系统：将RuvC结构域和HNH结构域中的任一者已失活的Cas9用于双链DNA的切割时，对有义链和反义链分别设定Cas9的靶序列，使有义链和反义差的切口在足够近的位置处产生，由此诱发双链切割。
Cas9蛋白的来源物种没有特别限制，可优选例示属于链球菌(Streptococcus)属、葡萄球菌(Staphylococcus)属、奈瑟氏(Neisseria)属或密螺旋体(Treponema)属的细菌等。更具体而言，可优选例示来自酿脓链球菌、嗜热链球菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟氏菌或齿垢密螺旋体等的Cas9蛋白。优选方式中，Cas9蛋白为来自酿脓链球菌的Cas9蛋白。
各种Cas蛋白的氨基酸序列及其编码序列的信息可以从GenBank、UniProt、Addgene等各种数据库得到。例如，酿脓链球菌的Cas9蛋白的氨基酸序列可以使用以质粒编号42230登记于Addgene的序列等。将酿脓链球菌的Cas9蛋白的氨基酸序列的一例示于序列号1。
“指导RNA”和“gRNA”这一术语可互换使用，是指能够与Cas蛋白形成复合体、并且将Cas蛋白诱导至靶区域的RNA。优选方式中，指导RNA包含CRISPR RNA(crRNA)和反式激活型CRISPR RNA(tracrRNA)。crRNA参与对基因组上的靶区域的结合，tracrRNA参与与Cas蛋白的结合。优选方式中，crRNA包含间隔序列和重复序列，间隔序列与靶区域中靶序列的互补链结合。优选方式中，tracrRNA包含反向重复序列和3’尾序列。反向重复序列具有与crRNA的重复序列互补的序列，与重复序列形成碱基对，3’尾序列通常形成3个茎环。
指导RNA可以为在crRNA的3’末端连接有tracrRNA的5’末端的单一指导RNA(sgRNA)，可以为使crRNA和tracrRNA为不同的RNA分子、且通过重复序列和反向重复序列形成碱基对的类型。优选方式中，指导RNA为sgRNA。
crRNA的重复序列和tracrRNA的序列可根据Cas蛋白的种类适当选择，可以使用与Cas蛋白来自相同细菌种属者。
例如，使用来自酿脓链球菌的Cas9蛋白时，sgRNA的长度可以设为50～220个核苷酸(nt)左右，优选为60～180nt左右，更优选为80～120nt左右。包含间隔序列时，crRNA的长度可以设为约25～70个碱基长，优选为25～50nt左右。tracrRNA的长度可以设为10～130nt左右，优选为30～80nt左右。
crRNA的重复序列可以与Cas蛋白的来源细菌种属中的序列相同，也可以是去除了3’末端的一部分的序列。tracrRNA可以具有与Cas蛋白的来源细菌种属中的成熟tracrRNA相同的序列，也可以为将该成熟tracrRNA的5’末端和/或3’末端切割的末端切割型。例如tracrRNA可以为从成熟tracrRNA的3’末端去除1～40个左右的核苷酸残基的末端切割型。另外，tracrRNA可以为从成熟tracrRNA的5’末端去除1～80个左右的核苷酸残基的末端切割型。另外，tracrRNA例如可以为从5’末端去除1～20个左右的核苷酸残基、并且从3’末端去除1～40个左右的核苷酸残基的末端切割型。
用于设计sgRNA的crRNA重复序列和tracrRNA的序列已经提出了各种，本领域技术人员可以基于公知技术来设计sgRNA(例如Jinek et al.(2012)Science，337，816-21；Maliet al.(2013)Science，339：6121，823-6；Cong et al.(2013)Science，339：6121，819-23；Hwang et al.(2013)Nat.Biotechnol.31：3，227-9；Jinek et al.(2013)eLife，2，e00471)。
“前间隔序列临近基序”和“PAM”这一术语可以互换使用，是指利用Cas蛋白切割DNA时，Cas蛋白所识别的序列。PAM的序列和位置根据Cas蛋白的种类而不同。例如Cas9蛋白时，PAM需要紧挨着靶序列的3’侧。与Cas9蛋白对应的PAM序列根据Cas9蛋白的来源细菌种属而不同。例如，与酿脓链球菌的Cas9蛋白对应的PAM为“NGG”，与嗜热链球菌的Cas9蛋白对应的PAM为“NNAGAA”，与金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白对应的PAM为“NNGRRT”或“NNGRR(N)”，与脑膜炎奈瑟氏菌的Cas9蛋白对应的PAM为“NNNNGATT”，与齿垢密螺旋体的Cas9蛋白对应的“NAAAAC”(“R”为A或G；“N”为A、T、G或C)。
“间隔序列”和“指导序列”这一术语可以互换使用，是指指导RNA中所含的、能够与靶序列的互补链结合的序列。通常间隔序列为与靶序列相同的序列(其中，靶序列中的T在间隔序列中变为U)。本发明的实施方式中，间隔序列可以相对于靶序列包含1个碱基或多个碱基的错配。包含多个碱基的错配时，可以在相邻位置具有错配，也可以在较远的位置有错配。优选方式中，间隔序列相对于靶序列可包含1～5个碱基的错配。特别优选方式中，间隔序列相对于靶序列可包含1个碱基的错配。
指导RNA中，间隔序列配置在crRNA的5’侧。
关于多核苷酸使用的“可发挥功能地连接”这一术语是指第一碱基序列以足够靠近第二碱基序列的方式配置、第一碱基序列可被第二碱基序列或第二碱基序列所控制的区域影响。例如，多核苷酸与启动子可发挥功能地连接是指该多核苷酸以能够在启动子控制下表达的方式进行连接。
“能够表达的状态”这一术语是指在导入了多核苷酸的细胞内处于该多核苷酸能够转录的状态。
“表达载体”这一术语是指包含对象多核苷酸、并且具备处于在导入了该载体的细胞内能够表达对象多核苷酸的状态的系统的载体。例如，“Cas蛋白表达载体”是指能够在导入了该载体的细胞内表达Cas蛋白的载体。另外，例如“指导RNA表达载体”是指能够在导入了该载体的细胞内表达指导RNA的载体。
本说明书中，碱基序列彼此或氨基酸序列彼此的序列一致性(或同源性)是指：将2个碱基序列或氨基酸序列以对应的碱基或氨基酸的一致达到最大程度的方式在相当于插入和缺失的部分引入间隔并进行排列，以所得到的比对中的除间隔以外的一致的碱基或氨基酸相对于碱基序列整体或氨基酸序列整体的比例形式求出的值。碱基序列或氨基酸序列彼此的序列一致性可以使用该技术领域中公知的各种同源性检索软件求出。例如，碱基序列的序列一致性的值可以基于利用公知的同源性检索软件BLASTN得到的比对通过计算得到，氨基酸序列的序列一致性的值可以基于利用公知的同源性检索软件BLASTP得到的比对通过计算得到。
[基因组改造方法]
一个实施方式中，本发明提供改造染色体基因组的2个以上等位基因的基因组改造方法。上述基因组改造方法包括下述(a)和(b)的步骤：
(a)将下述(i)和(ii)导入包含上述染色体的细胞的步骤，
(i)基因组改造系统，其包含以上述染色体基因组的靶区域为靶标的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(ii)2种以上选择标记用供体DNA，其在具有与上述靶区域的上游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的上游同源臂与具有与上述靶区域的下游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的下游同源臂之间包含选择标记基因的碱基序列，上述2种以上选择标记用供体DNA具有相互不同的选择标记基因，上述选择标记用供体DNA的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量；以及
(b)在上述步骤(a)之后基于上述2种以上选择标记用供体DNA所具有的全部选择标记基因选择出上述细胞的步骤。
该方式中，上述选择标记基因可以对于每种选择标记用供体DNA而言是特有的。该方式中，步骤(b)还可以为：在上述步骤(a)之后通过使不同种类的选择标记用供体DNA分别对上述2个以上等位基因进行同源重组而向该2个以上等位基因中分别导入能够区分的不同的特有的选择标记基因、并选择出表达所有导入的该能够区分的不同的选择标记基因的细胞的步骤(用于正选择的步骤)。上述方法可以为制备染色体基因组的2个以上等位基因被改造了的细胞的方法。
一个实施方式中，本发明可以为制备染色体基因组的2个以上等位基因被改造了的细胞的方法，其包括：
(a)将下述(i)和(ii)导入包含2个以上等位基因的细胞而向上述2个以上等位基因分别导入选择标记基因的步骤，
(i)基因组改造系统，其包含能够以上述染色体基因组的2个以上等位基因中的靶区域为靶标并对该靶区域进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(ii)2种以上选择标记用供体DNA，其分别具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂，并且在上游同源臂与下游同源臂之间包含选择标记基因的碱基序列，上述2种以上选择标记用供体DNA分别具有相互能够区分的不同的选择标记基因，上述选择标记基因对于每种选择标记用供体DNA而言是特有的，上述选择标记用供体DNA的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量；以及
(b)在上述步骤(a)之后通过使不同种类的选择标记用供体DNA分别对上述2个以上等位基因进行同源重组而向该2个以上等位基因中分别导入能够区分的不同的特有的选择标记基因、并选择出表达所有导入的该能够区分的不同的选择标记基因的细胞的步骤(用于正选择的步骤)。
(步骤(a))
步骤(a)中，将上述(i)和(ii)导入包含染色体的细胞。
本实施方式的基因组改造方法中使用的细胞没有特别限定，可以为具有2倍体以上的染色体基因组的细胞。细胞可以为2倍体，可以为3倍体，也可以为4倍体以上。作为细胞，没有特别限制，可列举真核生物的细胞。细胞可以为植物细胞，可以为动物细胞，也可以为真菌细胞。动物细胞没有特别限制，可以为人、人以外的哺乳动物、禽类、爬行类、两栖类、鱼类、昆虫、其它无脊椎动物中的任一种的细胞。本实施方式的基因组改造方法中使用的细胞不为不存在等位基因的细胞(例如具有单倍体的染色体基因组的细胞，例如原核细胞)。
作为基因组改造对象的靶区域可以设为具有1对以上等位基因的基因组上的任意区域。靶区域的尺寸没有特别限定。本实施方式的基因组改造方法与以往相比，可以改造更大尺寸的区域。靶区域例如可以为10kbp以上。靶区域例如可以为100bp以上、200bp以上、400bp以上、800bp以上、1kbp以上、2kbp以上、3kbp以上、4kbp以上、5kbp以上、8kbp以上、10kbp以上、20kbp以上、40kbp以上、80kbp以上、100kbp以上、200kbp以上、300kbp以上或400kbp以上。靶区域例如可以为包含1至数个基因的区域、包含1个基因的区域、1个基因的一部分区域。一个方式中，改造后的细胞中，上述靶区域缺失。
<(i)基因组改造系统>
“基因组改造系统”是指能够改造期望的靶区域的分子机构。基因组改造系统包含以染色体基因组的靶区域为靶标的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸。
序列特异性核酸切割分子只要为具有序列特异性核酸切割活性的分子则没有特别限定，可以为合成有机化合物，也可以为蛋白质等生物高分子化合物。作为具有序列特异性核酸切割活性的合成有机化合物，可列举例如吡咯咪唑聚酰胺等。作为具有序列特异性位点切割活性的蛋白质，可列举例如序列特异性核酸内切酶。
序列特异性核酸内切酶为能够在规定序列处切割核酸的酶。序列特异性核酸内切酶能够在规定序列处切割双链DNA。作为序列特异性核酸内切酶，没有特别限制，可列举例如锌指核酸酶(Zinc finger nuclease(ZFN))、TALEN(Transcription activator-likeeffector nuclease，转录激活因子样效应物核酸酶)、Cas蛋白等，但是不限于这些。
ZFN为包含与含锌指阵列的结合结构域结合而成的核酸切割结构域的人工核酸酶。作为切割结构域，可列举II型限制酶FokI的切割结构域。能够切割靶序列的锌指核酸酶的设计可以通过公知的方法进行。
TALEN为除了包含DNA切割结构域(例如FokI结构域)以外还包含转录激活因子样(TAL)效应物的DNA结合结构域的人工核酸酶。能够切割靶序列的TALE构建物的设计可以通过公知的方法进行(例如Zhang，Feng et.al.(2011)Nature Biotechnology 29(2))。
使用Cas蛋白作为序列特异性核酸切割分子时，基因组改造系统包含CRISPR/Cas系统。即，基因组改造系统优选包含Cas蛋白和具有与靶区域内的碱基序列同源的碱基序列的指导RNA。指导RNA含有与靶区域内的序列(靶序列)同源的序列作为间隔序列即可。指导RNA只要能够与靶区域内的DNA结合即可，不需要具有与靶序列完全相同的序列。该结合只要在细胞核内的生理条件下能形成即可。指导RNA例如相对于靶序列可以包含例如0～3个碱基的错配。上述错配的数量优选为0～2个碱基，更优选为0～1个，进一步优选不具有错配。指导RNA的设计可以基于公知的方法进行。基因组改造系统优选为CRISPR/Cas系统，优选包含Cas蛋白和指导RNA。Cas蛋白优选为Cas9蛋白。
序列特异性核酸内切酶可以蛋白质形式导入细胞，也可以以编码序列特异性核酸内切酶的多核苷酸形式导入细胞。例如，可以导入序列特异性核酸内切酶的mRNA，也可以导入序列特异性核酸内切酶的表达载体。表达载体中，序列特异性核酸内切酶的编码序列(序列特异性核酸内切酶基因)与启动子可发挥功能地连接。启动子没有特别限定，例如，可以使用各种pol II系启动子。作为pol II系启动子，没有特别限制，可列举例如CMV启动子、EF1启动子(EF1α启动子)、SV40启动子、MSCV启动子、hTERT启动子、β肌动蛋白启动子、CAG启动子、CBh启动子等。
启动子可以为诱导型启动子。诱导型启动子为仅在用于驱动启动子的诱导因子存在下就能够诱导与该启动子可发挥功能地连接的多核苷酸的表达的启动子。作为诱导型启动子，可列举热休克启动子等通过加热来诱导基因表达的启动子。另外，作为诱导型启动子，可列举用于驱动启动子的诱导因子为药剂的启动子。作为这样的药剂诱导型启动子，可列举例如Cumate操作子序列、λ操作子序列(例如12×λOp)、四环素系诱导型启动子等。作为四环素系诱导型启动子，可列举例如在四环素或其衍生物(例如多西环素)或者反向四环素控制型反式激活因子(rtTA)存在下驱动基因表达的启动子。作为四环素系诱导型启动子，可列举例如TRE3G启动子。
表达载体可以没有特别限制地使用公知的表达载体。作为表达载体，可列举例如质粒载体、病毒载体。序列特异性核酸内切酶为Cas蛋白时，表达载体除了包含Cas蛋白的编码序列(Cas蛋白基因)以外，还可以包含指导RNA编码序列(指导RNA基因)及。这种情况下，指导RNA编码序列(指导RNA基因)优选与pol III系启动子可发挥功能地。作为pol III系启动子，可列举例如小鼠和人的U6-snRNA启动子、人H1-RNase P RNA启动子、人缬氨酸-tRNA启动子等。
<(ii)选择标记用供体DNA>
选择标记用供体DNA为用于将选择标记敲入靶区域的供体DNA。选择标记用供体DNA在具有与靶区域的上游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的上游同源臂与具有与靶区域的下游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的下游同源臂之间包含1个以上选择标记基因的碱基序列。
选择标记用供体DNA没有特别限制，例如，可以具有1kb以上、2kb以上、3kb以上、4kb以上、5kb以上、6kb以上、7kb以上、8kb以上、9kb以上、9.5kb以上或10kb以上的长度。选择标记用供体DNA没有特别限制，例如，可以具有50kb以下、45kb以下、40kb以下、35kb以下、30kb以下、25kb以下、20kb以下、15kb以下、14kb以下、13kb以下、12kb以下、11kb以下、10kb以下、9kb以下、8kb以下、7kb以下、6kb以下、5kb以下或4kb以下的长度。
“选择标记”是指能够基于有无其表达来选择细胞的蛋白质。选择标记基因为编码选择标记的基因。在表达选择标记的细胞与不表达选择标记的细胞混杂存在的细胞群中选择表达选择标记的细胞时，将该选择标记称为“正选择标记”或“用于正选择的选择标记”。在表达选择标记的细胞与不表达选择标记的细胞混杂存在的细胞群中选择不表达选择标记的细胞时，将该选择标记称为“负选择标记”或“用于负选择的选择标记”。选择标记相互不同是指能够相互区分(例如能够区分的不同)，例如是指至少在导入了选择标记的细胞所被赋予的抗药性的性质等生理学性质或其它物理化学性质方面能够相互区分。即，选择标记相互不同是指：不同的两个以上选择标记能够与其它选择标记区分开地检测、或者能够与其它选择标记区分开地进行药剂选择。另外，上述选择标记基因对于每种选择标记用供体DNA而言是特有的是指以下述方式构成：1种选择标记用供体DNA所具有的选择标记基因不包含在上述以外的种类的选择标记用供体DNA中；或者，1种选择标记用供体DNA所具有的选择标记基因包含于多种供体DNA中时不同时由2种以上供体DNA表达。此时，2种以上供体DNA可以除了选择标记以外均相同，也可以在选择标记以外的序列和/或构成方面存在不同。
正选择标记只要能够选择表达该标记的细胞就没有特别限定。作为正选择标记基因，可列举例如抗药性基因、荧光蛋白基因、发光酶基因、显色酶基因等。
负选择标记只要能够选择不表达该标记的细胞就没有特别限定。作为负选择标记基因，可列举例如自杀基因(胸苷激酶等)、荧光蛋白基因、发光酶基因、显色酶基因等。在负选择标记基因为对细胞存活有负面影响的基因(例如自杀基因)时，该负选择标记基因可以与诱导型启动子可发挥功能地连接。通过与诱导型启动子可发挥功能地连接，可以使负选择标记基因仅在想要去除具有负选择标记基因的细胞时表达。在负选择标记基因为可通过荧光、发光和显色等光学方式检测的标记基因(可视化标记基因；visible marker gene)时等对细胞存活的负面影响小的情况下，可以使其稳定地表达。
作为抗药性基因，可列举例如嘌呤霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、遗传霉素抗性基因、新霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、吉欧霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、氯霉素抗性基因等，但是不限于这些。
作为荧光蛋白基因，可列举例如绿色荧光蛋白(GFP)基因、黄色荧光蛋白(YFP)基因、红色荧光蛋白(RFP)基因等，但是不限于这些。
作为发光酶基因，可列举例如荧光素酶基因等，但是不限于这些。
作为显色酶基因，可列举例如β半乳糖苷酶基因、β葡糖醛酸糖苷酶基因、碱性磷酸酶基因等，但是不限于这些。
作为自杀基因，可列举例如单纯疱疹病毒的胸苷激酶(HSV-TK)、诱导型胱天蛋白酶9(inducible caspase 9)等，但是不限于这些。
选择标记用供体DNA所具有的选择标记基因优选为正选择标记基因。即，可以选择表达选择标记的细胞作为敲入有选择标记基因的细胞。
上游同源臂具有能够与改造对象的基因组中的靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列，例如具有与靶序列的上游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列。下游同源臂具有能够与改造对象的基因组中的靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列，例如具有与靶序列的下游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列。上游同源臂和下游同源臂只要能够与靶区域的周边区域进行同源重组，则其长度和序列没有特别限定。上游同源臂和下游同源臂只要能够进行同源重组，则未必需要与靶区域的上游侧序列或下游侧序列完全一致。例如，上游同源臂可以为与和靶区域的上游侧相邻的碱基序列具有90％以上的序列一致性(同源性)的序列，优选具有92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列一致性。例如，下游同源臂可以为与和靶区域的下游侧相邻的碱基序列具有90％以上的序列一致性(同源性)的序列，优选具有92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的序列一致性。另外，上游同源臂和下游同源臂中的至少任意一者更接近靶区域中或其附近的切割位置时，可以进一步提高等位基因的改造效率。在此，“接近”可以指2个序列的距离为100bp以下、50bp以下、40bp以下、30bp以下、20bp以下或10bp以下。一个方式中，切割设为1个位置。一个方式中，切割可以设为2个位置以上。向基因组导入两个以上切割时，可以将切割的1个位置设置于靶区域的上游侧、将另一个位置设定于靶区域的下游侧。在选择标记用供体DNA存在下通过2个位置的切割将靶区域整体或大致整体从基因组切出时，选择标记用供体DNA与靶区域的上游和下游发生同源重组修复，缺失区域被选择标记用供体DNA的序列置换。通过这样进行操作，与将切割设为1个位置的情况相比，能够提高重组的效率。另外，上游同源臂和下游同源臂中的至少一者、优选两者更接近靶区域中或其附近的切割位置时，可以进一步提高等位基因的改造效率。
选择标记用供体DNA中，选择标记基因位于上游同源臂与下游同源臂之间。由此，将选择标记用供体DNA与上述(i)的基因组改造系统一起导入细胞时，选择标记基因通过HDR而被导入靶区域(由此而破坏基因时称为基因敲除，由此而导入期望的基因时称为基因敲入，也可以在敲除基因的同时敲入其它基因)。
选择标记基因优选以在合适的启动子的控制下进行表达的方式与启动子可发挥功能地连接。启动子可根据导入供体DNA的细胞的种类适当选择。作为启动子，可列举例如SRα启动子、SV40早期启动子、逆转录病毒的LTR、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子、EF1α启动子、金属硫蛋白启动子、热休克启动子等。选择标记用供体DNA可以具有增强子、聚A添加信号、终止子等任意的控制序列等。
选择标记用供体DNA可以具有绝缘子序列。“绝缘子”是指阻断或减弱相邻的染色体环境的影响、保障或提高夹持于该区域的DNA的转录调节的独立性的序列。绝缘子可通过增强子阻断效果(通过插入到增强子与启动子之间而阻断增强子对启动子活性的影响的效果)和位置效果的抑制作用(通过将导入基因的两侧用绝缘子夹持而使导入基因的表达不受其插入到基因组上的位置的影响的作用)来定义。选择标记用供体DNA可以在上游臂与选择标记基因之间(或上游臂与控制选择标记基因的启动子之间)具有绝缘子序列。选择标记用供体DNA可以在下游臂与选择标记基因之间具有绝缘子序列。
选择标记用供体DNA可以为直链状，也可以为环状，优选为环状。选择标记用供体DNA优选为质粒。选择标记用供体DNA中，除了包含上述序列以外还可以包含任意的序列。例如，可以在上游同源臂、绝缘子、选择标记基因和下游同源臂各序列之间的全部或一部分中包含间隔序列。
步骤(a)中，将与作为基因组改造对象的等位基因的数量相同或更多种类的选择标记用供体DNA导入细胞。不同种类的选择标记用供体DNA具有相互不同的(能够区分的)种类的选择标记基因。一个方式中，不同种类的选择标记用供体DNA不具有完全相同的选择标记基因或其集。即，第1种选择标记用供体DNA具有第1种选择标记基因，第2种选择标记用供体DNA具有第2种选择标记基因。第3种选择标记用供体DNA具有第3种选择标记基因，对于更多种类的选择标记用供体DNA也同样。作为基因组改造对象的等位基因为2个时，选择标记用供体DNA的种类为2种以上。作为基因组改造对象的等位基因为3个时，选择标记用供体DNA的种类为3种以上。一个方式中，1个选择标记用供体DNA可以具有2种以上相互不同的(能够区分的)选择标记(此时，不同种类的选择标记用供体DNA也必须具有相互不同的(能够区分的)种类(例如特有)的选择标记基因)。一个方式中，选择标记用供体DNA不具有位点特异性重组酶的重组序列(例如通过Cre重组酶进行重组的loxP序列及其变体)。另外，一个方式中，本发明的方法不使用位点特异性重组酶及其重组序列(例如通过Cre重组酶进行重组的loxP序列及其变体)。若使用位点特异性重组酶，则通常会在编辑后的基因组中残留1个位点特异性重组酶的重组序列。与此相对，一个方式中，通过本发明的方法得到的细胞的改造基因组不具有位点特异性重组酶的重组序列(外源序列)。
选择标记用供体DNA的种类数只要大于等于作为基因组改造对象的等位基因的数量即可，上限没有特别限定。通过使用种类数大于等于作为基因组改造对象的等位基因的数量的选择标记用供体DNA，能够稳定地改造2个以上等位基因。从后述的步骤(b)中的选择操作的观点出发，选择标记用供体DNA的种类数优选与作为基因组改造对象的等位基因的数量相等或多1～2种左右，更优选与作为基因组改造对象的等位基因的数量相等。
将上述(i)和(ii)导入细胞的方法没有特别限制，可以没有特别限制地使用公知的方法。作为将(i)和(ii)导入细胞的方法，可列举例如病毒感染法、脂质转染法、显微注射法、磷酸钙法、DEAE-葡聚糖法、电穿孔法、基因枪法等，但是不限于这些。通过将上述(i)和(ii)导入细胞，在利用上述(i)的序列特异性核酸切割分子切割了靶区域的DNA后，通过HDR将(ii)的选择标记用供体DNA中的选择标记敲入到靶区域。此时，在2种以上选择标记用供体DNA各自的上游同源臂和下游同源臂一致时，可随机地敲入到靶区域的2个以上等位基因中。但是，2种以上选择标记用供体DNA只要分别具备具有能够与2个以上等位基因各自的靶区域的上游序列和下游序列进行同源重组的碱基序列的同源臂的碱基序列，就能够分别改造2个以上等位基因，因此不需要具有完全一致的同源臂的碱基序列。一个方式中，2种以上选择标记用供体DNA中，其上游和下游同源臂的碱基序列可以具有与各等位基因的靶区域的上游序列和下游序列一致性更高的碱基序列(例如可以以该方式进行优化)。
在一个方式中，选择标记用供体DNA可以具有上游同源臂和下游同源臂、并且在上游同源臂与下游同源臂之间具有选择标记基因、优选还具有兆核酸酶的切割位点等核酸内切酶(碱基序列特异性核酸切割分子)的靶序列。在该方式的一个优选方式中，选择标记包含用于正选择的选择标记基因和用于负选择的标记基因。另一个优选方式中，选择标记可以包含用于正选择的选择标记而不含另外的负选择标记基因。一个优选方式中，用于正选择的选择标记基因也可以用于负选择，作为这样的标记基因，可列举可视化标记基因。
2个以上选择标记用供体DNA组为上述选择标记用供体DNA的组合，并且分别具有相互能够区分的用于正选择的选择标记基因。上述组中可以还具有兆核酸酶的切割位点等核酸内切酶(碱基序列特异性核酸切割分子)的靶序列，该靶序列可以相互不同，但优选相同(或能够被同一碱基序列特异性核酸切割分子切割)。选择标记用供体DNA的长度如上所述，例如可以为5kbp以上、8kbp以上或10kbp以上。
(步骤(b))
在上述步骤(a)之后进行步骤(b)。步骤(b)中，对于在2个以上等位基因中分别导入了能够区分的不同的选择标记基因或其组合的细胞，基于该能够区分的不同的选择标记基因的表达来进行选择。更具体而言，步骤(b)中，通过使不同种类的选择标记用供体DNA分别对上述2个以上等位基因进行同源重组而向该2个以上等位基因中分别导入能够区分的不同的特有的选择标记基因，并选择出表达所有导入的该能够区分的不同的选择标记基因的细胞。一个方式中，步骤(b)中，基于作为上述2种以上选择标记用供体DNA所具有的选择标记基因的、被整合到染色体基因组中的全部选择标记基因的表达，选择出通过导入不同的选择标记用供体DNA而改造了各等位基因的细胞。一个方式中，步骤(b)中，基于上述2种以上选择标记用供体DNA所具有的全部选择标记基因来选择细胞。一个方式中，步骤(b)中，基于作为上述2种以上选择标记用供体DNA所具有的选择标记基因的、被整合到染色体基因组中的全部选择标记基因(用于正选择的标记基因)的表达，选择出通过导入能够区分的选择标记用供体DNA而改造了各等位基因的细胞。一个方式中，步骤(b)中得到的细胞具有各等位基因不同的用于正选择的标记基因。一个方式中，步骤(b)中得到的细胞具有各等位基因通用的用于正选择的标记基因。在此，一个方式中，步骤(b)中不进行单细胞克隆{但是，步骤(b)可以包括也可以不包括：在选择出改造了2个以上等位基因的细胞后进行单细胞克隆}。一个方式中，步骤(b)中，细胞的选择基于导入到各等位基因中的两个以上能够区分的用于正选择的标记基因的表达来进行。一个方式中，步骤(b)是不进行基于单一选择标记基因的表达强度(例如荧光蛋白的表达强度或荧光强度)来推测改造等位基因数量的多少的方式。这是由于，通过基于单一选择标记基因的表达强度的强弱来推测改造等位基因数量的多少的方式选择细胞时，每个细胞的基因表达量会产生波动，难以将改造了2个以上等位基因的细胞与改造了1个等位基因的细胞完全分离，因此，在步骤(b)中需要进行单细胞克隆。
步骤(b)可以根据步骤(a)中使用的选择标记基因的种类来适当进行细胞的选择。此时，基于步骤(a)中使用的所有选择标记基因的表达来选择细胞。
例如，选择标记基因为正选择标记基因时，可以选择出表达要整合(或已整合)到改造对象的染色体基因组中的所有选择标记基因的细胞，例如，可以选择出表达与改造对象的等位基因的数量相等的正选择标记的细胞。正选择标记基因为抗药性基因时，通过在包含该药剂的培养基中培养细胞，可以选择出表达上述正选择标记的细胞。正选择标记基因为荧光蛋白基因、发光酶基因或显色酶基因时，通过选择呈现出由荧光蛋白、发光酶或显色酶引起的荧光、发光或显色的细胞，能够选择出表达上述正选择标记的细胞。本步骤中，在基因组中被引入了与应改造的等位基因的数量相等的选择标记用供体DNA时，该数量的等位基因被改造。在n倍体细胞中，应改造的等位基因的数量为n或n以下，在基因组中被引入了该数量以上且n以下种类的选择标记用供体DNA时，至少应改造的等位基因(2个以上等位基因)被改造。一个方式中，应改造的等位基因的数量为n，该种数的选择标记用供体DNA被引入染色体基因组，全部等位基因被改造。一个方式中，本步骤中，由于使用了种类大于等于作为改造对象的等位基因的数量的选择标记用供体DNA，因此细胞所表达的正选择标记的数量表明确实改造了该数量的等位基因。从提高步骤(b)的细胞的选择效率的观点出发，作为改造对象的等位基因的数量优选与选择标记用供体DNA的种类数相同。
如上所述，本实施方式的基因组改造方法中，通过为了在n倍体细胞中改造n个等位基因而使用n种选择标记用供体DNA来诱发HDR，可以高效地获得改造了细胞所具有的全部等位基因的细胞。另外，由于确实能够获得改造了全部等位基因的细胞，因此，即使靶区域的尺寸大(例如10kbp以上)，也能够高效地获得改造了靶区域的细胞。因此，还能够进行大规模的基因组改造。
一个方式中，步骤(b)可以在不克隆细胞的情况下从包含由步骤(a)得到的细胞的细胞池中选择出被改造了的细胞。通过省略克隆步骤，可缩短步骤所需的时间。一个方式中，上述细胞池可以包含105个以上、106个以上、107个以上或108个以上的细胞。
(任选步骤)
本实施方式的基因组改造方法除了具有上述步骤(a)和步骤(b)以外，还可以具有任选步骤。作为任选步骤，可列举例如下述(c)和(d)的步骤：
(c)在上述步骤(b)之后将在具有与上述靶区域的上游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的上游同源臂与具有与上述靶区域的下游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的下游同源臂之间包含期望的碱基序列的重组用供体DNA导入上述细胞的步骤；以及
(d)在上述步骤(c)之后选择出不表达上述负选择标记的细胞的步骤。
一个方式中，本实施方式的基因组改造方法除了具有上述步骤(a)和步骤(b)以外，还可以具有任选步骤。一个方式中，本实施方式的基因组改造方法或得到改造了基因组的细胞的方法中，2种以上选择标记用供体DNA分别在上述上游同源臂与上述下游同源臂之间具有用于正选择的选择标记基因、另外的用于负选择的标记基因和靶序列，在此，在该选择标记基因既可以用于正选择也可以用于负选择的情况下，可以不具有该另外的用于负选择的选择标记基因，例如可以具有下述(c)和(d)的步骤：
(c)在上述步骤(b)之后将下述(iii)和(iv)导入所选择的细胞而向上述2个以上等位基因导入重组用供体DNA的步骤，
(iii)基因组改造系统，其包含能够以上述另外的靶序列为靶标并对该另外的靶序列进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(iv)包含期望的碱基序列的重组用供体DNA，其具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂{该重组用供体DNA在上游同源臂与下游同源臂之间可以包含期望的碱基序列，也可以不含任何碱基序列}；以及
(d)在上述步骤(c)之后选择出不表达上述用于负选择的标记基因的细胞的步骤(用于负选择的步骤)。
<步骤(c)>
在步骤(b)之后可以进行步骤(c)。一个方式中，步骤(c)中，将在上游同源臂与下游同源臂之间包含或不包含期望的碱基序列的重组用供体DNA导入步骤(b)中所选择的细胞。一个方式中，步骤(c)中，将在具有与靶区域的上游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的上游同源臂与具有与靶区域的下游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的下游同源臂之间包含期望的碱基序列的重组用供体DNA导入步骤(b)中所选择的细胞。
《重组用供体DNA》
重组用供体DNA可以包含要敲入的期望的碱基序列。上述期望的碱基序列没有特别限定。例如，在基因组改造目标为敲除靶区域中所含的基因的功能时，可以使用使靶区域的一部分或全部碱基序列缺失后的碱基序列作为期望的碱基序列。另外，在向靶区域整合外源基因时，可以使用包含该基因的碱基序列作为期望的碱基序列。期望的碱基序列的尺寸没有特别限定，可以设为任意的尺寸。期望的碱基序列例如可以设为10bp以上、20bp以上、40bp以上、80bp以上、200bp以上、400bp以上、800bp以上、1kbp以上、2kbp以上、3kbp以上、4kbp以上、5kbp以上、6kbp以上、7kbp以上、8kbp以上、9kbp以上、10kbp以上、15kbp以上、20kbp以上、40kbp以上、80kbp以上、100kbp以上或200kbp以上等。本实施方式的方法能够高效地选择出在2个以上等位基因中敲入了期望的碱基序列的细胞。因此，也能敲入例如5kbp以上、8kbp以上或10kbp以上的大尺寸的DNA。重组用供体DNA的长度例如可以比选择标记用供体DNA短。
重组用供体DNA所具有的上游同源臂和下游同源臂可以与上述选择标记用供体DNA所具有的相同，也可以不同。为了方便，有时将选择标记用供体DNA所包含的上游同源臂和下游同源臂称为“第1上游同源臂”和“第1下游同源臂”、将重组用供体DNA所包含的上游同源臂和下游同源臂称为“第2上游同源臂”和“第2下游同源臂”。第2上游同源臂和第2下游同源臂例如只要能够与第1上游同源臂或其上游区域进行同源重组、并且能够与第1下游同源臂或其下游区域进行同源重组，则其长度和序列没有特别限定(一个方式中，只要能够与靶区域的周边区域进行同源重组，则其长度和序列没有特别限定)。在利用重组用供体DNA进行重组后，选择标记用供体DNA的碱基序列的一部分残留在基因组上是可接受的，但是优选选择标记用供体DNA的碱基序列可通过与重组用供体DNA的重组而从基因组上被完全去除。选择标记用供体DNA中所搭载的各种基因可通过利用重组用供体DNA的重组而被去除。由此，一个方式中，细胞的2个以上等位基因可分别被重组用供体DNA置换。一个方式中，重组用供体DNA可以具有期望的碱基序列，由此，改造了2个以上等位基因的细胞在该改造后的等位基因上具有该期望的碱基序列。
重组用供体DNA中，期望的碱基序列位于第2上游同源臂与第2下游同源臂之间。重组用供体DNA包含外源基因时，该外源基因优选与启动子可发挥功能地连接。重组用供体DNA可以具有增强子、聚A添加信号、终止子等任意的控制序列等。另外，重组用供体DNA包含外源基因时，重组用供体DNA可以在该外源基因的上游和下游具有绝缘子序列。一个方式中，重组用供体DNA在第2上游同源臂与第2下游同源臂之间包含间隔序列。一个方式中，在去除具有选择标记用供体DNA所具有的负选择标记基因的细胞时，若重组用供体DNA在能发挥其毒性的条件下使与该基因相同(或无法区分)的基因表达，则无法选择出利用重组用供体DNA产生了同源重组的细胞。因此，重组用供体DNA以下述方式构成：在去除具有选择标记用供体DNA所具有的负选择标记基因的细胞时，在能发挥其毒性的条件下不表达与该基因相同(或无法区分)的基因。例如，一个方式中，重组用供体DNA在第2上游同源臂与第2下游同源臂之间不具有负选择标记基因和第2靶序列。
重组用供体DNA优选与上述(i)一起导入细胞。通过将重组用供体DNA与上述(i)一起导入细胞，在利用上述(i)的序列特异性核酸切割分子切割了靶区域的DNA后，通过HDR将重组用供体DNA中的期望的碱基序列敲入到靶区域。本步骤中要导入重组用供体DNA的细胞是步骤(b)中所选择的细胞，因此靶区域中敲入有选择标记用供体DNA的碱基序列。因此，(i)的基因组改造系统的靶序列为选择标记用供体DNA敲入后的靶区域中所含的碱基序列。为了方便，有时将步骤(a)中的基因组改造系统的靶序列称为“第1靶序列”、将步骤(c)中的基因组改造系统的靶序列称为“第2靶序列”。第2靶序列可以使用步骤(b)后的细胞的靶区域中所含的任意序列。一个方式中，选择标记用供体DNA中的第2靶序列可以为该细胞的基因组上不存在的序列。一个方式中，选择标记用供体DNA中的第2靶序列为该细胞的基因组上不存在的序列，并且为在不发生由于脱靶而切割基因组上的其它序列的程度上与其它序列不同的序列。一个方式中，选择标记用供体DNA中的第2靶序列可以为基因组上不存在的兆核酸酶的切割位点。一个方式中，第2靶序列为步骤(d)中的负选择标记基因以外的区域。当然，重组用供体DNA以不显著抑制利用重组用供体DNA的同源重组的方式构成。第1靶序列残留于步骤(b)后的细胞的靶区域的情况下或者第1靶序列通过选择标记用供体DNA而被再次导入的情况下，第2靶序列与第1靶序列可以相同也可以不同。
重组用供体DNA可以在上游同源臂与下游同源臂之间不含碱基序列，上游同源臂与下游同源臂之间也可以包含10bp以下、20bp以下、30bp以下、40bp以下、50bp以下、60bp以下、70bp以下、80bp以下、90bp以下、100bp以下、200bp以下、300bp以下、400bp以下、500bp以下、600bp以下、700bp以下、800bp以下、900bp以下或1kbp以下的碱基序列。重组用供体DNA可以在上游同源臂与下游同源臂之间包含1kbp以上、2kbp以上、3kbp以上、4kbp以上、5kbp以上、6kbp以上、7kbp以上、8kbp以上、9kbp以上或10kbp以上的碱基序列。
重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间，可以包含选自由选择标记基因、位点特异性重组酶的靶序列、编码具有生理活性的因子的基因、编码具有细胞毒性的因子的基因和启动子序列组成的组中的1种以上或全部，或者不含选自上述组中的1种以上或全部。
步骤(c)中，对步骤(b)中所选择的细胞导入重组用供体DNA。步骤(b)中所选择的细胞在靶区域中敲入有选择标记基因。步骤(c)也可以称为将敲入上述靶区域的选择标记基因去除或置换为期望的碱基序列的步骤。
(步骤(d))
步骤(c)之后可以进行步骤(d)。步骤(d)中，选择出不表达负选择标记的细胞。
在进行步骤(d)的情况下，在步骤(a)中，选择标记用供体DNA可以分别使用包含正选择标记基因和负选择标记基因的DNA。即，步骤(a)中使用的选择标记用供体DNA在上游同源臂与下游同源臂之间可以包含正选择标记基因和负选择标记基因。正选择标记基因与负选择标记基因的位置关系没有特别限定，正选择标记基因可以处于负选择标记基因的上游，也可以相反。选择标记用供体DNA具有正选择标记基因和负选择标记基因的情况下，正选择标记基因与负选择标记基因之间可以夹着编码自切割型肽的碱基序列或IRES(internal ribozyme entry site，内部核酶进入位点)序列等。通过夹着这些序列，可以利用1个启动子使正选择标记基因和负选择标记基因独立地表达。作为2A肽，可列举例如来自口蹄疫病毒(FMDV)的2A肽(F2A)、来自马鼻炎A病毒(ERAV)的2A肽(E2A)、来自猪嗜热病毒(Porcine teschovirus(PTV-1))的2A肽(P2A)以及来自明脉扁刺蛾(Thosea asigna virus(TaV))的2A肽(T2A)等。
或者，可以将相同的选择标记基因在步骤(a)中作为正选择标记使用、在步骤(d)中作为负选择标记使用。例如，选择标记基因为荧光蛋白基因、发光酶基因或显色酶基因等与荧光或色素等的显色相关的标记基因(可视化标记基因)时，可以在步骤(a)中选择表达呈现出荧光蛋白、发光酶或显色酶所引起的荧光、发光或显色的细胞，并且在步骤(c)中选择出这些荧光、发光或显色消失了的细胞。相同的选择标记基因兼作正选择标记和负选择标记的情况也包含在选择标记用供体DNA具有正选择标记、还具有负选择标记的情况中。
负选择标记基因可根据每种选择标记用供体DNA而不同，也可以相同。通过使用通用的负选择标记基因，能够使步骤(d)的细胞的选择操作变得简易。
步骤(d)可以根据步骤(a)中使用的负选择标记基因的种类适当进行细胞的选择。此时，选择出步骤(a)中使用的负选择标记基因全部不表达的细胞。
例如，在负选择标记基因为荧光蛋白基因、发光酶基因或显色酶基因等可视化标记基因时，选择出荧光、发光或显色等可视化标记消失了的细胞即可。另外，在负选择标记基因为自杀基因时，可以通过用包含由于该自杀基因的表达而表现出毒性的药剂的培养基培养细胞选择出不表达上述负选择标记的细胞。例如，使用胸苷激酶基因作为自杀基因时，可以用包含更昔洛韦的培养基培养细胞。负选择标记基因的表达消失意味着步骤(a)中整合到靶区域的负选择标记基因被置换为了包含重组用供体DNA的期望的碱基序列的多核苷酸。此时，认为多核苷酸的置换发生于步骤(a)中敲入的碱基序列整体。因此，通过选择负选择标记基因的表达消失了的细胞，可以高效地选择出步骤(a)中敲入的碱基序列被重组用供体DNA的期望的碱基序列置换了的细胞。自杀基因等负选择标记基因可以与诱导型启动子可发挥功能地连接，以在能发挥其毒性的条件下表达该负选择标记基因的方式在驱动诱导型启动子的药剂存在下培养细胞，由此，可以选择出不表达上述负选择标记的细胞。这种情况下，负选择标记基因可以为编码仅在其表达时才对细胞产生毒性的细胞毒素(例如蓖麻毒素和白喉毒素)的基因。
一个方式中，步骤(d)可以在不克隆细胞的情况下从包含步骤(c)中得到的细胞的细胞池中选择出改造了2个以上等位基因的细胞(不存在负选择标记基因的细胞)。在一个方式中，上述细胞池可以包含105个以上、106个以上、107个以上或108个以上的细胞。
如上所述，通过进行步骤(c)和步骤(d)，能够高效地获得细胞所具有的全部等位基因被改造成了期望序列的细胞。另外，由于确实可以获得改造了全部等位基因的细胞，因此，即使期望的碱基序列的尺寸大(例如10kbp以上)，也能够高效地获得在靶区域敲入了该碱基序列的细胞。一个方式中，通过进行步骤(c)和步骤(d)，细胞所具有的全部等位基因中靶区域均缺失，其前后(即，上游同源臂和下游同源臂分别发生同源重组的序列)以没有选自由碱基的插入、置换和缺失组成的组中的1种以上(例如没有碱基的插入、置换和缺失)的方式无缝连接。一个方式中，得到的细胞中，夹着缺损区域的上游侧与下游侧的碱基序列无缝连接。
需要说明的是，通过步骤(b)得到的存活的细胞的数量少时或者没有得到存活的细胞时，表明通过与上游同源臂和下游同源臂的同源重组而从基因组中去除的靶区域中包含影响细胞的增殖或存活的基因。因此，可以调查靶区域中是否包含影响细胞的增殖或存活的基因。另外，这种情况下，可以改变上游同源臂和下游同源臂的设计位置来改造由于同源重组从基因组上消失的基因，从而确定影响细胞的增殖或存活的基因。因此，本发明中，可以在步骤(b)之后进行步骤(e)。即，步骤(e)包括：步骤(b)中存活的细胞的数量少时或没有得到存活的细胞时，使靶区域变小而减少从基因组上消失的基因，由此确定影响细胞的增殖或存活的基因。靶区域仅包含1个基因时，表明该基因为影响细胞的增殖或存活的基因。然后，在确定了影响细胞的增殖或存活的基因的情况下，可以进行步骤(f)。步骤(f)包括：将所确定的影响细胞的增殖或存活的基因敲入要改造的基因组的其它区域(例如安全港区域等){敲入时可以使用重组用供体DNA}。由此，可以扩大用本发明的方法去除的区域(将靶区域向上游和/或下游扩展)。存活的细胞的数量少可以通过与对不影响细胞的存活、增殖的区域实施步骤(a)和(b)时得到的细胞的数量进行比较来确认。一个方式中，步骤(a)中可以不将使细胞的增殖、存活消失的区域作为靶区域。
[基因组改造试剂盒]
一个实施方式中，本发明提供改造染色体基因组的2个以上等位基因的基因组改造试剂盒。上述基因组改造试剂盒包含下述(i)和(ii)：
(i)基因组改造系统，其包含以上述染色体基因组的靶区域为靶标的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸；以及
(ii)2种以上选择标记用供体DNA，其在具有与上述靶区域的上游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的下游同源臂与具有与上述靶区域的下游侧相邻的碱基序列的同源碱基序列的下游同源臂之间包含选择标记基因的碱基序列，上述2种以上选择标记用供体DNA具有相互不同的选择标记基因，上述选择标记用供体DNA的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量。
一个实施方式中，本发明为包含下述(i)和(ii)的改造染色体基因组的2个以上等位基因的基因组改造试剂盒：
(i)基因组改造系统，其包含能够以上述染色体基因组的靶区域为靶标并对靶区域进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码上述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(ii)2种以上选择标记用供体DNA，其具备具有能够与上述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与上述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂，在上游同源臂与下游同源臂之间包含选择标记基因的碱基序列，上述2种以上选择标记用供体DNA具有相互能够区分的选择标记基因，上述选择标记用供体DNA的种类数大于等于作为基因组改造对象的上述等位基因的数量。
该方式中，上述选择标记基因可以对于每种选择标记用供体DNA而言是特有的。上述试剂盒可以用于本发明的方法。上述试剂盒可以用于制备染色体基因组的2个以上等位基因被改造了的细胞的方法。
本实施方式的试剂盒所包含的(i)和(ii)与上述[基因组改造方法]项目中说明的(i)和(ii)相同。通过使用本实施方式的试剂盒，能够容易地进行上述基因组改造方法。
一个实施方式中，本发明提供改造了染色体基因组的2个以上等位基因、并且该2个以上等位基因中分别具有相互不同的(能够区分的)选择标记基因的细胞。一个方式中，细胞可以为单细胞生物的细胞。一个方式中，细胞可以为分离后的细胞。一个方式中，细胞可以为选自由多能性细胞和多能性干细胞(胚胎干细胞和诱导多能性干细胞等)组成的组中的细胞。一个方式中，细胞可以为组织干细胞。一个方式中，细胞可以为体细胞。一个方式中，细胞可以为生殖系列细胞(例如生殖细胞)。一个方式中，细胞可以为细胞株。一个方式中，细胞可以为永生化细胞。一个方式中，细胞可以为癌细胞。一个方式中，细胞可以为非癌细胞。一个方式中，细胞可以为疾病患者的细胞。一个方式中，细胞可以为健康人的细胞。一个方式中，细胞可以为动物细胞(例如人细胞)，例如选自由昆虫细胞(例如蚕细胞)、HEK293细胞、HEK293T细胞、Expi293F(商标)细胞、FreeStyle(商标)293F细胞、中华仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、CHO-S细胞、CHO-K1细胞和ExpiCHO细胞、以及来自这些细胞的派生细胞组成的组中的细胞。一个优选方式中，上述细胞中的染色体基因组的靶区域的全部等位基因被改造，改造后的区域分别具有相互不同的(能够区分的)选择标记基因。
一个实施方式中，提供改造了染色体基因组的2个以上等位基因、并且该2个以上等位基因中分别具有相互不同的(能够区分的)选择标记基因的细胞的培养方法。选择标记基因为抗药性标记基因时，关于培养，可以在针对各抗药性标记基因的药剂存在下进行培养。培养可在适合于细胞的维持或增殖的条件下进行。
一个实施方式中，本发明提供具有改造了2个以上等位基因的染色体基因组、并且该2个以上等位基因中分别具有相互不同的(能够区分的)选择标记基因的非人生物。一个方式中，细胞可以为单细胞生物的细胞。一个方式中，非人生物可以为酵母(例如裂殖酵母或出芽酵母，例如选自由酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、嘉士伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、脆弱酵母(Saccharomyces fragilis)、鲁氏酵母(Saccharomyces rouxii)等酵母属；产朊甲丝酵母(Candida utilis)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)等假丝酵母属；毕赤酵母(Pichia)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、耶氏酵母(Yarrowia)属、汉逊酵母(Hansenula)属、内孢霉(Endomyces)属等酵母组成的组中的生物。一个方式中，非人生物可以为丝状菌(例如曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、腐质霉属(Humicola)、顶孢霉属(Acremonium)、镰孢菌属(Fusarium)和青霉(Penicillium)种)。一个方式中，非人生物可以为多细胞生物。一个方式中，非人生物可以为非人动物。一个方式中，非人生物可以为植物。一个优选方式中，上述非人生物中，染色体基因组的靶区域的全部等位基因被改造，改造后的区域分别具有相互不同的(能够区分的)选择标记基因。
上述细胞中，细胞的存活、增殖所必需的基因的1个以上可以包含或集中在染色体基因组的其它区域。其它区域例如可以为安全港区域(例如AAVS1区域等)。
实施例
以下通过实验例来说明本发明，但是本发明不受以下实施例限定。
[实验例1]
供体DNA的制备
为了筛选2个等位基因被编辑的细胞，制备正选择标记不同的两种供体DNA(图1；嘌呤霉素(Puromycin)R质粒、杀稻瘟菌素(Blasticidin)R质粒)。作为负选择标记，使用GFP基因。嘌呤霉素R质粒中，在EF1启动子的下游连接GFP基因，夹着T2A序列而连接嘌呤霉素抗性基因。杀稻瘟菌素R质粒中，在EF1启动子的下游连接GFP基因，夹着T2A序列而连接杀稻瘟菌素抗性基因。
作为供体质粒(供体DNA)的骨架序列，使用HR110PA-1质粒(フナコシ)。将该HR110PA-1质粒用限制酶EcoRI和BamHI切割，切出具有复制起点和氨苄青霉素抗性基因的序列，进行纯化。将其用作此后所用的全部供体质粒的骨架序列。
质粒的选择标记序列和同源臂的序列通过以下的PCR来扩增。EF1启动子序列通过从HR110PA-1上的EcoRI识别序列扩增至EF1启动子序列来制备。GFP序列通过以CS-CDF-CG-PRE质粒(dnaconda.riken.jp/search/RDB_clone/RDB04/RDB04379.html)为模板制备。T2A序列至嘌呤霉素表达序列通过从HR110PA-1上的T2A序列扩增至BamHI识别序列来制备。上游同源臂(810bp：序列号2)和下游同源臂(792bp：序列号3)以HCT116的基因组为模板制备。
对于选择标记序列和同源臂序列，在PCR时添加与相邻的序列对应的20bp的同源序列。通过该同源序列，利用NEBuilder HiFi DNA Assembly(NEW ENGLAND BioLabs)将骨架序列与选择标记序列、同源臂序列结合，导入大肠杆菌内，用添加了氨苄青霉素的培养基进行培养。进行嘌呤霉素质粒的克隆。
杀稻瘟菌素质粒通过改造嘌呤霉素质粒来制备。利用NEBuilder HiFi DNAAssembly将利用PCR扩增出的杀稻瘟菌素的ORF序列与以嘌呤霉素质粒为模板扩增了嘌呤霉素ORF序列以外部分而得到的序列结合，与制备嘌呤霉素质粒时同样地进行克隆。
[实验例2]
选择标记向TP53基因的第1内含子中的导入
(细胞和靶区域)
细胞使用作为来自大肠癌的细胞株的HCT116细胞。该细胞株基本为2倍体。作为基因组编辑的靶区域，选择抑癌基因的TP53的第1内含子。
(步骤(a))
向105个HCT116细胞中导入作为供体质粒(供体DNA)的嘌呤霉素R质粒和杀稻瘟菌素R质粒(各12.5ng)。
在导入供体质粒的前一天，以每孔105个将HCT116细胞接种于24孔板。培养中，使用每孔为500μL的McCoy 5A培养基(添加FBS以达到10％)。
在细胞接种次日，以下述组成制备质粒导入溶液。
Opti-MEM 100μL
Cas9&gRNA共表达质粒(pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9；Addgene、质粒编号42230)475ng
嘌呤霉素R质粒12.5ng
杀稻瘟菌素R质粒12.5ng
FuGENE HD 1.5μL
将Cas9&gRNA共表达质粒中使用的gRNA的靶序列示于以下。
CTCAGAGGGGGCTCGACGCTAGG(序列号4)
通过移液操作混合上述质粒导入溶液后，在室温下孵育10分钟，然后加入24孔板。
(步骤(b))
在导入两质粒后，用添加有1μg/mL嘌呤霉素和10μg/mL杀稻瘟菌素的McCoy 5A培养基(以10％添加FBS)将细胞培养8天。培养后，通过移液操作从独立菌落中回收细胞。
(选择标记基因敲入的确认)
从回收的27个细胞克隆中通过苯酚/氯仿提取法提取DNA，进行连接PCR，对选择标记基因的敲入进行确认。
将HCT116细胞回收到1.5mL管中，在室温下以150g离心3分钟。去除上清，重悬于173μL的TE缓冲液(100mM NaCl)。在95℃下孵育5分钟后冷却到室温。加入20μL的TE缓冲液(100mM NaCl，0.5％SDS)、5μL的蛋白酶K(5mg/ml)、2μL的RNaseA(100mg/ml)，混合后在37℃下进行2小时的颠倒搅拌。在85℃下孵育25分钟后，加入200μL的苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，进行10分钟的颠倒搅拌。在室温下以15000g离心10分钟后，将上层转移到新的1.5mL管中。向上述1.5mL管中加入与转移的上层等量的氯仿，进行10分钟的颠倒搅拌。在室温下以15000g离心10分钟后，将上层转移到新的1.5mL管中。向上述1.5mL管中加入与转移的上层等量的异丙醇，在4℃下以15000g离心30分钟。去除上清，加入70％乙醇150μL，在4℃下以15000g离心5分钟。完全去除上清，将沉淀用30μL TE缓冲液溶解。
以如上回收的DNA为模板，使用图2所示的连接引物进行连接PCR。连接引物是以跨越5’和3’两侧的连接的方式对嘌呤霉素抗性基因或杀稻瘟菌素抗性基因进行扩增的引物。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增DNA片段进行确认。PCR条件和引物序列示于以下。
<PCR条件>
PCR溶液(反应体系25μL)的组成
1x KOD one(TOYOBO)
0.2μM正向引物
0.2μM反向引物
10ng基因组DNA
热循环条件
98℃，30秒
98℃，10秒；68℃，20秒50个循环
4℃
<引物序列>
嘌呤霉素5’连接用PCR引物
正向引物：TGCCCCGTTGTTATCCTTAC(序列号5)
反向引物：GCTCGTAGAAGGGGAGGTTG(序列号6)
嘌呤霉素3’连接用PCR引物
正向引物：GTCACCGAGCTGCAAGAAC(序列号7)
反向引物：GAAGACGGCAGCAAAGAAAC(序列号8)
杀稻瘟菌素5’连接用PCR引物
正向引物：TGCCCCGTTGTTATCCTTAC(序列号9)
反向引物：GCTTCAATATGTACTGCCGAAA(序列号10)
杀稻瘟菌素3’连接用PCR引物
正向引物：GAAGCCATTGCGATTGGTAG(序列号11)
反向引物：GAAGACGGCAGCAAAGAAAC(序列号12)
将结果示于图3。提取自HCT116的野生株的DNA的情况下，对于嘌呤霉素抗性基因和杀稻瘟菌素抗性基因均未检测到期待尺寸的条带(最右泳道：WT)。另一方面，提取自通过上述步骤(a)和步骤(b)得到的细胞克隆的DNA的情况下，在27个克隆中的12个克隆中，对于嘌呤霉素抗性基因和杀稻瘟菌素抗性基因这两者全部检测到了期待尺寸的条带(下划线所示的克隆)。该结果表明，这12个克隆的TP53的第1内含子中，一个等位基因被嘌呤霉素抗性基因置换，另一个等位基因被杀稻瘟菌素抗性基因置换。对于克隆13，进行了PCR产物的碱基序列的序列分析。其结果是，确认到了TP53的第1内含子被嘌呤霉素抗性基因置换的序列和TP53的第1内含子被杀稻瘟菌素抗性基因置换的序列这两者。
[参考实验例]
除了不使用杀稻瘟菌素R质粒以外，通过与上述同样的方法向HCT116细胞中导入嘌呤霉素R质粒。
导入嘌呤霉素R质粒后，用添加有1μg/mL嘌呤霉素的McCoy 5A培养基(以10％添加FBS)将细胞培养8天。培养后，通过移液操作从独立菌落中回收细胞。
通过与上述同样的方法从回收的10个细胞克隆中提取DNA。使用对嘌呤霉素抗性基因以跨越5’和3’两侧的连接的方式进行扩增的连接引物(参照图4左图)，与上述同样地进行连接PCR。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增DNA片段进行确认。
其结果是，完全没有得到TP53的第1内含子中的两个等位基因被嘌呤霉素抗性基因置换的克隆。另外，仅单侧的等位基因被嘌呤霉素抗性基因置换的克隆的获得效率也低(图4右图)。
[实验例3]
选择标记的去除
(步骤(c))
作为供体DNA，制备包含野生型的TP53序列的质粒(野生型TP53质粒)。作为供体DNA，使用包含野生型TP53的第1内含子及其周边区域(5’arm和3’arm)的序列的质粒，除此以外通过与上述同样的方法向实验例2中获得的细胞克隆(图3的克隆#13)中导入野生型TP53质粒。将Cas9&gRNA共表达质粒中使用的gRNA的靶序列示于以下。
GGCGCAACGCGATCGCGTAAGGG(序列号13)
(步骤(d))
导入野生型TP53质粒后，用细胞分选仪(SH800、索尼)筛选GFP表达消失了的细胞克隆，将每1个细胞回收到96孔板。
(标记基因去除的确认)
通过与上述同样的方法从回收的细胞中提取DNA。使用图5所示的引物进行PCR。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增DNA片段进行确认。PCR溶液的组成与上述相同。将热循环条件和引物序列示于以下。
热循环条件
98℃，30秒
98℃，10秒；68℃，2分30秒50个循环
4℃
<引物序列>
TP53第1内含子扩增用PCR引物
正向引物：TGCCCCGTTGTTATCCTTAC(序列号14)
反向引物：GAAGACGGCAGCAAAGAAAC(序列号15)
将其结果示于图6。8个克隆中，在7个克隆中检测到了期待尺寸的条带(下划线所示的克隆)。该结果表明，这7个克隆中的选择标记(嘌呤霉素抗性基因或杀稻瘟菌素抗性基因和GFP基因)被野生型TP53基因的第1内含子序列置换。另外，上述7个克隆中，也没有检测到当选择标记残留于一个等位基因时会检测到的5.6kb的条带。该结果表明，两个等位基因中，选择标记已被置换为了野生型第1内含子。
[实验例4]
TP53基因的第1内含子的改造
作为供体DNA，分别使用图7A～D所示的质粒，除此以外与实验例3同样地进行步骤(c)和步骤(d)。
通过与上述相同的方法从回收的细胞中提取DNA。使用图7A～D分别示出的引物进行PCR。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，对扩增DNA片段进行确认。PCR溶液的组成与上述相同。热循环条件和引物序列示于以下。
热循环条件
98℃，30秒
98℃，10秒；68℃，2分30秒50个循环
4℃
<引物序列>
TP53第1内含子扩增用PCR引物
正向引物：TGCCCCGTTGTTATCCTTAC(序列号14)
反向引物：GAAGACGGCAGCAAAGAAAC(序列号15)
将其结果示于图8。使用任一供体DNA时，均以高概率得到了两个等位基因被供体DNA中的序列置换的细胞克隆(下划线所示的克隆)。
人TP53基因的第1内含子为10762bp的较大基因组区域。确认了：通过上述方法，不仅能够对两个等位基因高效地进行基因组编辑，而且即使是这样的较大基因组区域也能够高效地进行基因组编辑。
[实施例5]
实施例4中尝试了使HCT116细胞中人TP53基因的第1内含子缺失，本实施例中尝试了使代替HCT116细胞的人多能性干细胞中人TP53基因的第1内含子缺失。人多能性干细胞具体而言为人诱导多能性干细胞(iPS细胞)。
本实施例中，如图14A所示那样，使用具有设计成在选择标记用供体DNA存在下能够对靶基因的上游和下游诱导特异性切割的gRNA的CRISPR/Cas9系统导入切割。切割位置设计在上游同源臂所杂交的区域与靶基因之间、以及下游同源臂所杂交的区域与靶基因之间。由此诱发重组的第1阶段。使用的gRNA的序列如以下所示。
<指导RNA>
人TP53上游gRNA：CUCAGAGGGGGCUCGACGCU(序列号16)
人TP53下游gRNA：GGUGCUUUAAGAAUUACCGC(序列号17)
在实施例4中使用的2种选择标记用供体DNA存在下，在人iPS细胞的基因组的人TP53基因的第1内含子的上游和下游实施切割。然后在嘌呤霉素和杀稻瘟菌素存在下，获得具有在各等位基因导入了嘌呤霉素抗性基因和杀稻瘟菌素抗性基因的基因组的细胞，进行克隆。TP53基因、嘌呤霉素抗性基因和杀稻瘟菌素抗性基因分别利用上述引物来扩增。结果如图9所示。如图9所示，获得了在两个等位基因中第1内含子被置换为了供体DNA序列的细胞(即，人TP53基因的第1内含子在两个等位基因中缺失了的细胞)。
[实施例6]
与TP53同样地，在HCT116细胞中，对编码MLH1、CD44、MET和APP的人基因(以下称为靶基因)分别应用上述方法来诱导基因缺失。如图10～13分别所示，靶基因的大小是：MLH1为58kb、CD44为94kb、MET为126kb和APP为290kb。分别设计针对这些靶基因各自的上游和下游的上游同源臂和下游同源臂，准备在臂间分别搭载有相互能够区分的不同的选择用标记基因和可视化标记基因的选择标记用供体DNA。具体而言，1个选择标记用供体DNA具有GFP和嘌呤霉素抗性基因，另一个选择标记用供体DNA具有GFP和杀稻瘟菌素抗性基因。
如图14A所示，使用具有设计成在选择标记用供体DNA存在下能够对靶基因的上游和下游诱导特异性切割的gRNA的CRISPR/Cas9系统导入切割。切割位置设计在上游同源臂所杂交的区域与靶基因之间、以及下游同源臂所杂交的区域与靶基因之间。由此诱发重组的第1阶段。
<指导RNA的序列>
针对各靶基因的上游和下游的指导RNA的序列如以下所示。
MLH1上游gRNA：GCGCCUGACGUCGCGUUCGC(序列号18)
MLH1下游gRNA：GGAGGCCUUGGCACGGGUUC(序列号19)
CD44上游gRNA：CGAGGAUGGCGGACCGAACC(序列号20)
CD44下游gRNA：GCCAAGUGGACUCAACGGAG(序列号21)
MET上游gRNA：GGGCCGCGCGCGCCGAUGCC(序列号22)
MET1下游gRNA：GUUCCCACCUCGCAAGCAAU(序列号23)
APP上游gRNA：CUCCCGGGGGUGUCGUAUAA(序列号24)
APP下游gRNA：UUCUAUAAAUGGACACCGAU(序列号25)
<引物序列>
各靶基因的缺失和抗药性基因的导入使用以下引物来检测。
MLH1扩增用PCR引物
MLH1 5’连接用PCR引物
正向引物：CCAAGAACGCTTCCATTTCT(序列号26)
反向引物：CCCTGTGCCTGGTCTGTC(序列号27)
MLH1 3’连接用PCR引物
正向引物：TTCTGAGGTCTCCAGCAAGT(序列号28)
反向引物：AAGTTGAAGATGAATTGAAAGCAG(序列号29)
嘌呤霉素5’连接用PCR引物
正向引物：CCAAGAACGCTTCCATTTCT(序列号30)
反向引物：GCTCGTAGAAGGGGAGGTTG(序列号31)
嘌呤霉素3’连接用PCR引物
正向引物：GTCACCGAGCTGCAAGAAC(序列号32)
反向引物：AAGTTGAAGATGAATTGAAAGCAG(序列号33)
杀稻瘟菌素5’连接用PCR引物
正向引物：CCAAGAACGCTTCCATTTCT(序列号34)
反向引物：GCTTCAATATGTACTGCCGAAA(序列号35)
杀稻瘟菌素3’连接用PCR引物
正向引物：GAAGCCATTGCGATTGGTAG(序列号36)
反向引物：AAGTTGAAGATGAATTGAAAGCAG(序列号38)
CD44扩增用PCR引物
CD445’连接用PCR引物
正向引物：AGTGGATGGACAGGAGGATG(序列号39)
反向引物：GCGAAAGGAGCTGGAGGA(序列号40)
CD443’连接用PCR引物
正向引物：ATGGAGCTGTGGAGGACAGA(序列号41)
反向引物：GAGTGGGTCTGAGTGGGAAC(序列号42)
嘌呤霉素5’连接用PCR引物
正向引物：AGTGGATGGACAGGAGGATG(序列号43)
反向引物：GCTCGTAGAAGGGGAGGTTG(序列号44)
嘌呤霉素3’连接用PCR引物
正向引物：GTCACCGAGCTGCAAGAAC(序列号45)
反向引物：GAGTGGGTCTGAGTGGGAAC(序列号46)
杀稻瘟菌素5’连接用PCR引物
正向引物：AGTGGATGGACAGGAGGATG(序列号47)
反向引物：GCTTCAATATGTACTGCCGAAA(序列号48)
杀稻瘟菌素3’连接用PCR引物
正向引物：GAAGCCATTGCGATTGGTAG(序列号49)
反向引物：GAGTGGGTCTGAGTGGGAAC(序列号50)
MET扩增用PCR引物
MET 5’连接用PCR引物
正向引物：TGAAATCACTCTTATGTAACCTCTGG(序列号51)
反向引物：AAGGGGCTGCAATTTTACCT(序列号52)
MET 3’连接用PCR引物
正向引物：GGGTGGATGGATTGAAAAGA(序列号53)
反向引物：TGCAGGTATAGGCAGTGACAAG(序列号54)
嘌呤霉素5’连接用PCR引物
正向引物：TGAAATCACTCTTATGTAACCTCTGG(序列号55)
反向引物：GCTCGTAGAAGGGGAGGTTG(序列号56)
嘌呤霉素3’连接用PCR引物
正向引物：GTCACCGAGCTGCAAGAAC(序列号57)
反向引物：TGCAGGTATAGGCAGTGACAAG(序列号58)
杀稻瘟菌素5’连接用PCR引物
正向引物：TGAAATCACTCTTATGTAACCTCTGG(序列号59)
反向引物：GCTTCAATATGTACTGCCGAAA(序列号60)
杀稻瘟菌素3’连接用PCR引物
正向引物：GAAGCCATTGCGATTGGTAG(序列号61)
反向引物：TGCAGGTATAGGCAGTGACAAG(序列号62)
APP扩增用PCR引物
APP 5’连接用PCR引物
正向引物：GGGGAGCTGGTACAGAAATG(序列号63)
反向引物：CAGGATCAGGGAAAGGTGAG(序列号64)
APP 3’连接用PCR引物
正向引物：GAACGGCTACGAAAATCCAA(序列号65)
反向引物：CTCTTCTCCCCACCCAAAA(序列号66)
嘌呤霉素5’连接用PCR引物
正向引物：GGGGAGCTGGTACAGAAATG(序列号67)
反向引物：GCTCGTAGAAGGGGAGGTTG(序列号68)
嘌呤霉素3’连接用PCR引物
正向引物：GTCACCGAGCTGCAAGAAC(序列号69)
反向引物：CTCTTCTCCCCACCCAAAA(序列号70)
杀稻瘟菌素5’连接用PCR引物
正向引物：GGGGAGCTGGTACAGAAATG(序列号71)
反向引物：GCTTCAATATGTACTGCCGAAA(序列号72)
杀稻瘟菌素3’连接用PCR引物
正向引物：GAAGCCATTGCGATTGGTAG(序列号73)
反向引物：CTCTTCTCCCCACCCAAAA(序列号74)
结果，如图10～13的“第一步”所示，分别得到了两个等位基因的靶基因缺失的多个克隆。需要说明的是，与如图14B所示在选择标记用供体DNA存在下仅在靶基因的下游或仅在靶基因的上游诱导了切割的情况相比，如图14A所示在选择标记用供体DNA存在下在靶基因的上游和下游这两处导入了切割的情况下，两个等位基因的靶基因缺失的克隆的获得效率更高。因此，对于上述各种基因，能够将靶区域置换为选择标记用供体DNA的序列。
然后，代替使靶基因缺失，通过第2阶段的重组来去除所导入的选择标记。这里，以作为可视化标记的GFP为指标，以不表达GFP为指标选择出缺失了包含选择标记的区域的细胞。结果，如图10～13的“第二步”所示，能够从基因组的两个等位基因中去除包含GFP的选择标记。
产业上的可利用性
根据本发明，可提供能够高效地改造2个以上等位基因、并且能够改造较大的区域的基因组改造方法及上述基因组改造试剂盒。
序列表
<110> 株式会社标志融合
国立大学法人东京工业大学
<120> 基因组改造方法及基因组改造试剂盒
<130> PL19-9001WO
<150> JP 2020-068266
<151> 2020-04-06
<150> JP 2020-141335
<151> 2020-08-25
<160> 73
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1423
<212> PRT
<213> 酿脓葡萄球菌（Staphylococcus pyogenes）
<400> 1
Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp
1 5 10 15
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val
20 25 30
Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu
35 40 45
Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr
50 55 60
Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His
65 70 75 80
Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu
85 90 95
Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr
100 105 110
Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu
115 120 125
Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe
130 135 140
Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn
145 150 155 160
Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His
165 170 175
Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu
180 185 190
Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu
195 200 205
Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe
210 215 220
Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile
225 230 235 240
Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser
245 250 255
Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys
260 265 270
Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr
275 280 285
Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln
290 295 300
Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln
305 310 315 320
Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser
325 330 335
Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr
340 345 350
Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His
355 360 365
Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu
370 375 380
Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly
385 390 395 400
Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys
405 410 415
Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu
420 425 430
Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser
435 440 445
Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg
450 455 460
Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu
465 470 475 480
Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg
485 490 495
Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile
500 505 510
Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln
515 520 525
Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu
530 535 540
Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr
545 550 555 560
Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro
565 570 575
Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe
580 585 590
Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe
595 600 605
Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp
610 615 620
Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile
625 630 635 640
Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu
645 650 655
Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu
660 665 670
Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys
675 680 685
Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys
690 695 700
Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp
705 710 715 720
Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile
725 730 735
His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val
740 745 750
Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly
755 760 765
Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp
770 775 780
Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile
785 790 795 800
Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser
805 810 815
Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser
820 825 830
Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu
835 840 845
Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp
850 855 860
Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile
865 870 875 880
Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu
885 890 895
Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu
900 905 910
Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala
915 920 925
Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg
930 935 940
Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu
945 950 955 960
Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser
965 970 975
Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val
980 985 990
Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp
995 1000 1005
Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala
1010 1015 1020
His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys
1025 1030 1035
Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys
1040 1045 1050
Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile
1055 1060 1065
Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn
1070 1075 1080
Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys
1085 1090 1095
Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp
1100 1105 1110
Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met
1115 1120 1125
Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly
1130 1135 1140
Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu
1145 1150 1155
Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe
1160 1165 1170
Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val
1175 1180 1185
Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu
1190 1195 1200
Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile
1205 1210 1215
Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu
1220 1225 1230
Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly
1235 1240 1245
Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn
1250 1255 1260
Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala
1265 1270 1275
Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln
1280 1285 1290
Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile
1295 1300 1305
Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp
1310 1315 1320
Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp
1325 1330 1335
Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr
1340 1345 1350
Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr
1355 1360 1365
Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp
1370 1375 1380
Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg
1385 1390 1395
Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr
1400 1405 1410
Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys
1415 1420
<210> 2
<211> 810
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
ttccccagag gtatcttcca tggcttttcc agaccccaac tctggcccgt tcgcttcttc 60
ttcagaaagg ctcccgtttg cttcttctgc aggaaggctt gtattttcag aaagttcttg 120
ctcctcgatt cgaggactca actcactagg ggaaccaaac tctgtttcca ggggagtgga 180
gagagaaact gggtccccct cccgtagctc ctgggacaca gctgagccag ccacaggatc 240
tggggacaac cggggcggat cccccctttc gggaggcggt ggcatcagtt cagagtccgc 300
atttttattc atcggggaag cgtggggaga aggatgggct ggagctgggt cctggtctga 360
aggacagcag tccggagcta acggttgagt ctccaaagtc ttcatactgc agaggaagca 420
cagcggagat tagcctcagc caggatggct tcgaagttct cagggatccg acgcagagct 480
aaagaaaccc acctgtgctt ccctcctctt ctgggagtag gcagaagact cccgggagga 540
gaggcgaaca gcggacgcca attcttttga aagcactgtg ttccttagca ccgcgggtcg 600
ctacgggcct cttgctgtcg cgggatttcg gtccaccttc cgattgggcc gccgcatccc 660
ggatcagatt tcgcgggcga cccacggaac ccgcggagcc gggacgtgaa aggttagaag 720
gtttcccgtt cccatcaagc cctagggctc ctcgtggctg ctgggagttg tagtctgaac 780
gcttctatct tggcgagaag cgcctacgct 810
<210> 3
<211> 792
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
ctgagtcagg aaacattttc agacctatgg aaactgtgag tggatccatt ggaagggcag 60
gcccaccacc ccgaccccaa ccccagcccc ctagcagaga cctgtgggaa gcgaaaattc 120
catgggactg actttctgct cttgtctttc agacttcctg aaaacaacgt tctggtaagg 180
acaagggttg ggctggggac ctggagggct ggggggctgg ggggctgagg acctggtcct 240
ctgactgctc ttttcaccca tctacagtcc cccttgccgt cccaagcaat ggatgatttg 300
atgctgtccc cggacgatat tgaacaatgg ttcactgaag acccaggtcc agatgaagct 360
cccagaatgc cagaggctgc tccccccgtg gcccctgcac cagcagctcc tacaccggcg 420
gcccctgcac cagccccctc ctggcccctg tcatcttctg tcccttccca gaaaacctac 480
cagggcagct acggtttccg tctgggcttc ttgcattctg ggacagccaa gtctgtgact 540
tgcacggtca gttgccctga ggggctggct tccatgagac ttcaatgcct ggccgtatcc 600
ccctgcattt cttttgtttg gaactttggg attcctcttc accctttggc ttcctgtcag 660
tgttttttta tagtttaccc acttaatgtg tgatctctga ctcctgtccc aaagttgaat 720
attcccccct tgaatttggg cttttatcca tcccatcaca ccctcagcat ctctcctggg 780
gatgcagaac tt 792
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA的靶序列
<400> 4
ctcagagggg gctcgacgct agg 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 5
tgccccgttg ttatccttac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 6
gctcgtagaa ggggaggttg 20
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 7
gtcaccgagc tgcaagaac 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 8
gaagacggca gcaaagaaac 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 9
tgccccgttg ttatccttac 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 10
gcttcaatat gtactgccga aa 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 11
gaagccattg cgattggtag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 12
gaagacggca gcaaagaaac 20
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> gRNA的靶序列
<400> 13
ggcgcaacgc gatcgcgtaa ggg 23
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 14
tgccccgttg ttatccttac 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物序列
<400> 15
gaagacggca gcaaagaaac 20
<210> 16
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TP53的上游区域的gRNA
<400> 16
cucagagggg gcucgacgcu 20
<210> 17
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TP53的下游区域的gRNA
<400> 17
ggugcuuuaa gaauuaccgc 20
<210> 18
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MLH1的上游区域的gRNA
<400> 18
gcgccugacg ucgcguucgc 20
<210> 19
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MLH1的下游区域的gRNA
<400> 19
ggaggccuug gcacggguuc 20
<210> 20
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD44的上游区域的gRNA
<400> 20
cgaggauggc ggaccgaacc 20
<210> 21
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人CD44的下游区域的gRNA
<400> 21
gccaagugga cucaacggag 20
<210> 22
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MET的上游区域的gRNA
<400> 22
gggccgcgcg cgccgaugcc 20
<210> 23
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人MET的下游区域的gRNA
<400> 23
guucccaccu cgcaagcaau 20
<210> 24
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APP的上游区域的gRNA
<400> 24
cucccggggg ugucguauaa 20
<210> 25
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APP的下游区域的gRNA
<400> 25
uucuauaaau ggacaccgau 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于MLH1 5' 连接PCR的正向引物
<400> 26
ccaagaacgc ttccatttct 20
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于MLH1 5' 连接PCR的反向引物
<400> 27
ccctgtgcct ggtctgtc 18
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于MLH1 3' 连接PCR的正向引物
<400> 28
ttctgaggtc tccagcaagt 20
<210> 29
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于MLH1 3' 连接PCR的反向引物
<400> 29
aagttgaaga tgaattgaaa gcag 24
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素5' 连接PCR的正向引物
<400> 30
ccaagaacgc ttccatttct 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素5' 连接PCR的反向引物
<400> 31
gctcgtagaa ggggaggttg 20
<210> 32
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素3' 连接PCR的正向引物
<400> 32
gtcaccgagc tgcaagaac 19
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素3' 连接PCR的反向引物
<400> 33
aagttgaaga tgaattgaaa gcag 24
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素5' 连接PCR的正向引物
<400> 34
ccaagaacgc ttccatttct 20
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素5' 连接PCR的反向引物
<400> 35
gcttcaatat gtactgccga aa 22
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素3' 连接PCR的正向引物
<400> 36
gaagccattg cgattggtag 20
<210> 37
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素3' 连接PCR的反向引物
<400> 37
aagttgaaga tgaattgaaa gcag 24
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于CD44 5' 连接PCR的正向引物
<400> 38
agtggatgga caggaggatg 20
<210> 39
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于CD44 5' 连接PCR的反向引物
<400> 39
gcgaaaggag ctggagga 18
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于CD443' 连接PCR的正向引物
<400> 40
atggagctgt ggaggacaga 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于CD443' 连接PCR的反向引物
<400> 41
gagtgggtct gagtgggaac 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素5' 连接PCR-2的正向引物
<400> 42
agtggatgga caggaggatg 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素5' 连接PCR-2的反向引物
<400> 43
gctcgtagaa ggggaggttg 20
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素3' 连接PCR-2的正向引物
<400> 44
gtcaccgagc tgcaagaac 19
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素3' 连接PCR-2的反向引物
<400> 45
gagtgggtct gagtgggaac 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素5' 连接PCR-2的正向引物
<400> 46
agtggatgga caggaggatg 20
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素5' 连接PCR-2的反向引物
<400> 47
gcttcaatat gtactgccga aa 22
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素3' 连接PCR-2的正向引物
<400> 48
gaagccattg cgattggtag 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素3' 连接PCR-2的反向引物
<400> 49
gagtgggtct gagtgggaac 20
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于MET 5' 连接PCR的正向引物
<400> 50
tgaaatcact cttatgtaac ctctgg 26
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于MET 5' 连接PCR的反向引物
<400> 51
aaggggctgc aattttacct 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于MET 3' 连接PCR的正向引物
<400> 52
gggtggatgg attgaaaaga 20
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于MET 3' 连接PCR的反向引物
<400> 53
tgcaggtata ggcagtgaca ag 22
<210> 54
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素5' 连接PCR-3的正向引物
<400> 54
tgaaatcact cttatgtaac ctctgg 26
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素5' 连接PCR-3的反向引物
<400> 55
gctcgtagaa ggggaggttg 20
<210> 56
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素3' 连接PCR-3的正向引物
<400> 56
gtcaccgagc tgcaagaac 19
<210> 57
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素3' 连接PCR-3的反向引物
<400> 57
tgcaggtata ggcagtgaca ag 22
<210> 58
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素5' 连接PCR-3的正向引物
<400> 58
tgaaatcact cttatgtaac ctctgg 26
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素5' 连接PCR-3的反向引物
<400> 59
gcttcaatat gtactgccga aa 22
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素3' 连接PCR-3的正向引物
<400> 60
gaagccattg cgattggtag 20
<210> 61
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素3' 连接PCR-3的反向引物
<400> 61
tgcaggtata ggcagtgaca ag 22
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于APP 5' 连接PCR的正向引物
<400> 62
ggggagctgg tacagaaatg 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于APP 5' 连接PCR的反向引物
<400> 63
caggatcagg gaaaggtgag 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于APP 3' 连接PCR的正向引物
<400> 64
gaacggctac gaaaatccaa 20
<210> 65
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于APP 3' 连接PCR的反向引物
<400> 65
ctcttctccc cacccaaaa 19
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素5' 连接PCR-4的正向引物
<400> 66
ggggagctgg tacagaaatg 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素5' 连接PCR-4的反向引物
<400> 67
gctcgtagaa ggggaggttg 20
<210> 68
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素3' 连接PCR-4的正向引物
<400> 68
gtcaccgagc tgcaagaac 19
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于嘌呤霉素3' 连接PCR-4的反向引物
<400> 69
ctcttctccc cacccaaaa 19
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素5' 连接PCR-4的正向引物
<400> 70
ggggagctgg tacagaaatg 20
<210> 71
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素5' 连接PCR-4的反向引物
<400> 71
gcttcaatat gtactgccga aa 22
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素3' 连接PCR-4的正向引物
<400> 72
gaagccattg cgattggtag 20
<210> 73
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用于杀稻瘟菌素3' 连接PCR-4的反向引物
<400> 73
ctcttctccc cacccaaaa 19

Claims (31)

1.一种制备染色体基因组的2个以上等位基因被改造了的细胞的方法，其包括：
(a)将下述(i)和(ii)导入包含2个以上等位基因的细胞而向所述2个以上等位基因分别导入选择标记基因的步骤，
(i)基因组改造系统，其包含能够以所述染色体基因组的2个以上等位基因中的靶区域为靶标并对该靶区域进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码所述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(ii)2种以上选择标记用供体DNA，其分别具备具有能够与所述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与所述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂，并且在上游同源臂与下游同源臂之间包含选择标记基因的碱基序列，所述2种以上选择标记用供体DNA分别具有相互能够区分的不同的选择标记基因，所述选择标记基因对于每种选择标记用供体DNA而言是特有的，所述选择标记用供体DNA的种类数大于等于作为基因组改造对象的所述等位基因的数量；以及
(b)在所述步骤(a)之后通过使不同种类的选择标记用供体DNA分别对所述2个以上等位基因进行同源重组而向该2个以上等位基因中分别导入能够区分的不同的特有的选择标记基因、并选择出表达所有导入的该能够区分的不同的选择标记基因的细胞的步骤(用于正选择的步骤)。
2.一种改造染色体基因组的2个以上等位基因的方法，其包括：
(a)将下述(i)和(ii)导入包含2个以上等位基因的细胞而向所述2个以上等位基因分别导入选择标记基因的步骤，
(i)基因组改造系统，其包含能够以所述染色体基因组的2个以上等位基因中的靶区域为靶标并对该靶区域进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码所述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(ii)2种以上选择标记用供体DNA，其分别具备具有能够与所述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与所述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂，并且在上游同源臂与下游同源臂之间包含选择标记基因的碱基序列，所述2种以上选择标记用供体DNA分别具有相互能够区分的不同的选择标记基因，所述选择标记基因对于每种选择标记用供体DNA而言是特有的，所述选择标记用供体DNA的种类数大于等于作为基因组改造对象的所述等位基因的数量；以及
(b)在所述步骤(a)之后通过使不同种类的选择标记用供体DNA分别对所述2个以上等位基因进行同源重组而向该2个以上等位基因中分别导入能够区分的不同的特有的选择标记基因、并选择出表达所有导入的该能够区分的不同的选择标记基因的细胞的步骤(用于正选择的步骤)。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，靶区域具有5kbp以上的长度。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，靶区域具有8kbp以上的长度。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，2种以上选择标记用供体DNA分别在所述上游同源臂与所述下游同源臂之间具有用于正选择的选择标记基因、用于负选择的标记基因和靶序列，在此，在该选择标记基因既可以用于正选择也可以用于负选择的情况下，可以不具有另外的用于负选择的选择标记基因，
所述方法还包括：
(c)在所述步骤(b)之后将下述(iii)和(iv)导入所选择的细胞而向所述2个以上等位基因导入重组用供体DNA的步骤，
(iii)基因组改造系统，其包含能够以所述靶序列为靶标并对该靶序列进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码所述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(iv)包含期望的碱基序列的重组用供体DNA，其具备具有能够与所述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与所述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂；以及
(d)在所述步骤(c)之后选择出不表达所述用于负选择的标记基因的细胞的步骤(用于负选择的步骤)。
6.根据权利要求3所述的方法，其中，2种以上选择标记用供体DNA分别在所述上游同源臂与所述下游同源臂之间具有用于正选择的选择标记基因、用于负选择的标记基因和靶序列，在此，在该选择标记基因既可以用于正选择也可以用于负选择的情况下，可以不具有另外的用于负选择的选择标记基因，
所述方法还包括：
(c)在所述步骤(b)之后将下述(iii)和(iv)导入所选择的细胞而向所述2个以上等位基因导入重组用供体DNA的步骤，
(iii)基因组改造系统，其包含能够以所述靶序列为靶标并对该靶序列进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码所述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(iv)包含期望的碱基序列的重组用供体DNA，其具备具有能够与所述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与所述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂；以及
(d)在所述步骤(c)之后选择出不表达所述用于负选择的标记基因的细胞的步骤(用于负选择的步骤)。
7.根据权利要求4所述的方法，其中，2种以上选择标记用供体DNA分别在所述上游同源臂与所述下游同源臂之间具有用于正选择的选择标记基因、用于负选择的标记基因和靶序列，在此，在该选择标记基因既可以用于正选择也可以用于负选择的情况下，可以不具有另外的用于负选择的选择标记基因，
所述方法还包括：
(c)在所述步骤(b)之后将下述(iii)和(iv)导入所选择的细胞而向所述2个以上等位基因导入重组用供体DNA的步骤，
(iii)基因组改造系统，其包含能够以所述靶序列为靶标并对该靶序列进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码所述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(iv)包含期望的碱基序列的重组用供体DNA，其具备具有能够与所述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与所述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂；以及
(d)在所述步骤(c)之后选择出不表达所述用于负选择的标记基因的细胞的步骤(用于负选择的步骤)。
8.根据权利要求5～7中任一项所述的方法，其中，重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其中，重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
11.根据权利要求8所述的方法，其中，重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有8kbp以上的长度。
12.一种改造染色体基因组的2个以上等位基因的基因组改造试剂盒，其包含下述(i)和(ii)：
(i)基因组改造系统，其包含能够以所述染色体基因组的靶区域为靶标并对靶区域进行切割的序列特异性核酸切割分子或编码所述序列特异性核酸切割分子的多核苷酸，
(ii)2种以上选择标记用供体DNA，其具备具有能够与所述靶区域的上游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的上游同源臂和具有能够与所述靶区域的下游侧的碱基序列进行同源重组的碱基序列的下游同源臂，在上游同源臂与下游同源臂之间包含选择标记基因的碱基序列，所述2种以上选择标记用供体DNA具有相互能够区分的不同的选择标记基因，所述选择标记基因对于每种选择标记用供体DNA而言是特有的，所述选择标记用供体DNA的种类数大于等于作为基因组改造对象的所述等位基因的数量。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，靶区域具有5kbp以上的长度。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其中，靶区域具有8kbp以上的长度。
15.根据权利要求12～14中任一项所述的试剂盒，其还包含重组用供体DNA。
16.根据权利要求12～15中任一项所述的试剂盒，其中，重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
17.根据权利要求12～16中任一项所述的试剂盒，其中，重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有8kbp以上的长度。
18.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，靶区域具有5kbp以上的长度，并且重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有5kbp以上的长度。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中，靶区域具有8kbp以上的长度，并且重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有8kbp以上的长度。
20.根据权利要求5所述的方法，其中，重组用供体DNA在重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域不具有碱基序列，改造后得到的染色体基因组的所述2个以上等位基因中，靶区域的上游与下游的序列以没有碱基的插入、置换和缺失的方式无缝连接。
21.根据权利要求6或7所述的方法，其中，重组用供体DNA在重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域不具有碱基序列，改造后得到的染色体基因组的所述2个以上等位基因中，靶区域的上游与下游的序列以没有碱基的插入、置换和缺失的方式无缝连接。
22.根据权利要求3所述的方法，其中，改造后得到的染色体基因组的所述2个以上等位基因中，不存在位点特异性重组酶的靶序列。
23.根据权利要求4所述的方法，其中，改造后得到的染色体基因组的所述2个以上等位基因中，不存在位点特异性重组酶的靶序列。
24.根据权利要求5所述的方法，其中，改造后得到的染色体基因组的所述2个以上等位基因中，不存在位点特异性重组酶的靶序列。
25.根据权利要求6或7所述的方法，其中，改造后得到的染色体基因组的所述2个以上等位基因中，不存在位点特异性重组酶的靶序列。
26.根据权利要求1～11和20～25中任一项所述的方法，其中，步骤(b)中，在直至选择出改造了2个以上等位基因的细胞为止的过程中，不进行单细胞克隆。
27.一种细胞，其为关于靶区域在染色体基因组上具有2个以上等位基因的细胞，其中，所述2个以上等位基因各自的靶区域缺失、并且靶区域的上游与下游的序列以没有碱基的插入、置换和缺失的方式无缝连接。
28.根据权利要求27所述的细胞，其中，靶区域具有5kbp以上的长度。
29.根据权利要求27或28所述的细胞，其基因组中不具有位点特异性重组酶的靶序列。
30.根据权利要求6或7所述的方法，其中，重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域具有8kbp以上的长度。
31.根据权利要求15所述的试剂盒，其中，重组用供体DNA在重组用供体DNA的上游同源臂与下游同源臂之间的区域不具有碱基序列。
CN202180026858.3A 2020-04-06 2021-04-05 基因组改造方法及基因组改造试剂盒 Pending CN115552002A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020-068266 2020-04-06
JP2020068266 2020-04-06
JP2020-141335 2020-08-25
JP2020141335 2020-08-25
PCT/JP2021/014495 WO2021206054A1 (ja) 2020-04-06 2021-04-05 ゲノム改変方法及びゲノム改変キット

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115552002A true CN115552002A (zh) 2022-12-30

Family

ID=78022517

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180026858.3A Pending CN115552002A (zh) 2020-04-06 2021-04-05 基因组改造方法及基因组改造试剂盒

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230147287A1 (zh)
EP (1) EP4134431A4 (zh)
JP (1) JPWO2021206054A1 (zh)
KR (1) KR20220164748A (zh)
CN (1) CN115552002A (zh)
AU (1) AU2021254373A1 (zh)
CA (1) CA3179410A1 (zh)
IL (1) IL297078A (zh)
TW (1) TW202204611A (zh)
WO (1) WO2021206054A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7212982B1 (ja) 2022-10-05 2023-01-26 株式会社Logomix 細胞ライブラリおよびその製造方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8697359B1 (en) 2012-12-12 2014-04-15 The Broad Institute, Inc. CRISPR-Cas systems and methods for altering expression of gene products
JP2016514480A (ja) * 2013-04-05 2016-05-23 ダウ アグロサイエンシィズ エルエルシー 植物のゲノム内に外因性配列を組み込むための方法および組成物
US10787684B2 (en) * 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
RU2685914C1 (ru) * 2013-12-11 2019-04-23 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
WO2017191503A1 (en) * 2016-05-05 2017-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2019018534A1 (en) * 2017-07-18 2019-01-24 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University GENOME EDITION WITHOUT SCARCE THROUGH TWO-STEP APPROVED REPAIR BY HOMOLOGY
JP7055469B2 (ja) * 2018-05-08 2022-04-18 国立大学法人大阪大学 ホモ接合型細胞の作製方法

Also Published As

Publication number Publication date
KR20220164748A (ko) 2022-12-13
WO2021206054A1 (ja) 2021-10-14
JPWO2021206054A1 (zh) 2021-10-14
IL297078A (en) 2022-12-01
AU2021254373A1 (en) 2022-11-03
EP4134431A4 (en) 2024-06-05
TW202204611A (zh) 2022-02-01
EP4134431A1 (en) 2023-02-15
CA3179410A1 (en) 2021-10-14
US20230147287A1 (en) 2023-05-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6737974B1 (ja) ヌクレアーゼ媒介ｄｎａアセンブリ
KR102098915B1 (ko) 키메라 게놈 조작 분자 및 방법
JP6688231B2 (ja) 標的遺伝子座を修飾するための方法及び組成物
US11071289B2 (en) DNA knock-in system
US9115361B2 (en) Methods for dynamic vector assembly of DNA cloning vector plasmids
AU732130B2 (en) System for in vitro transposition using modified Tn5 transposase
US7785871B2 (en) DNA cloning vector plasmids and methods for their use
US20230074594A1 (en) Genome editing using crispr in corynebacterium
KR20200078685A (ko) 부위-특이적인 뉴클레오티드 치환을 통해 글리포세이트-내성 벼를 수득하는 방법
CN111373041A (zh) 用于基因组编辑和调节转录的crispr/cas系统和方法
US20200208146A1 (en) Materials and methods for efficient targeted knock in or gene replacement
CN115552002A (zh) 基因组改造方法及基因组改造试剂盒
JP6867635B1 (ja) ゲノム改変方法及びゲノム改変キット
US20220298494A1 (en) Enzymes with ruvc domains
CN111961686A (zh) 利用CRISPR/Cas9和PiggyBac实现双等位精确基因组编辑的系统
WO2023052774A1 (en) Methods for gene editing
JP7065260B2 (ja) 標的化ベクターへの標的化改変の瘢痕のない導入のための方法
JP7212982B1 (ja) 細胞ライブラリおよびその製造方法
WO2024075756A1 (ja) 細胞ライブラリおよびその製造方法
Graham et al. Engineered minichromosomes in plants: structure, function, and applications
KR20230156665A (ko) CRISPR-Cas9을 이용한 정교한 다중 유전체 편집 방법 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination