JP7065260B2 - 標的化ベクターへの標的化改変の瘢痕のない導入のための方法 - Google Patents

標的化ベクターへの標的化改変の瘢痕のない導入のための方法 Download PDF

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Description

（関連出願の相互参照）
この出願は、２０１９年４月４日に出願された米国出願第６２／８２９，３２７号の利益を主張し、これは全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＥＦＳ ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表への参照
ファイル５４４９９９ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記述された配列表は、２０．７キロバイトで、２０２０年３月２１日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
制限部位又は他の操作によって生成された瘢痕は、それらが調節にとって重要な領域に着地した場合、遺伝子発現に悪影響を与える可能性があるため、トランスジェニック動物系統を作成する際にはシームレスＤＮＡ構築は特に重要である。哺乳類のゲノムを標的とすることは、相同組換えを指示するための長いＤＮＡアームを備えた大きな標的化ベクターの構築、及び胚性幹細胞クローンの選択のための抗生物質耐性カセットを必要とすることが多い。正しく標的化されたクローンには、耐性カセット自体は言うまでもなく、ベクターの構築に必要な複数の瘢痕が含まれていることが多い。遺伝子破壊の場合、これらの病変は最終結果（ヌル対立遺伝子）にとって問題ではないかもしれないが、隣接遺伝子による発現が悪影響を受ける可能性が常に存在する。ノックアウト以外のノックインなどの改変の場合、通常、標的遺伝子座を忠実に発現させることが問題の研究にとって重要である。
特に、マウスの遺伝子をそのヒトの対応物で直接置き換えるヒト化は、マウスの転写機構が新しい対立遺伝子の発現を忠実に複製するように、マウスとヒトの配列との間のシームレスな接合を必要とする。遺伝子調節に影響を与えない非コード領域に構築瘢痕及び選択カセットを埋め込むように注意しなければならない。動物モデルがより複雑になるにつれて、ヒト化対立遺伝子の上にヒト疾患を引き起こす変異など、既存のモデルの上に更に多くの改変が追加される可能性がある。次いで、更に変化により、既に高度に操作されたマウス遺伝子座に更に多くの瘢痕及び別の選択カセットを付加することができ、発現が変化し、マウスモデルがヒト疾患に忠実でない可能性を増加させる。構築の観点から、既に１つのカセットを含むベクターに新しいカセットを加えることは、２つのカセットが異なる選択をコードする場合であっても、プロモーター及びポリ（Ａ）シグナルなどの共有カセットエレメント間の望ましくない組換えのために複雑になり得る。したがって、複数の変化（例えば、ヒト化対立遺伝子及び上部に層状化された疾患変異）を有する標的化の生成を単純化し、最終動物モデルに組み込まれる瘢痕を最小化するための新しい方法が必要とされる。
既存の標的化ベクターへの標的化遺伝子改変の瘢痕のない導入の方法が提供される。
一態様では、いくつかのそのような方法は、（ａ）細菌細胞の集団において、既存標的化ベクターと改変カセットとの間で細菌相同組換えを実行することであって、改変カセットが、標的遺伝子改変を含み、既存の標的化ベクターの５’標的配列に対応する５’相同性アーム及び前記既存のベクターの３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含み、挿入核酸が、５’から３’の（ｉ）第１の反復配列、（ｉｉ）第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位、（ｉｉｉ）選択カセット、（ｉｖ）第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位、及び（ｖ）第１の反復配列と同一の第２の反復配列を含む、細菌相同組換えを実行することと、（ｂ）選択カセットを含む改変標的化ベクターを含む細菌細胞を選択することと、（ｃ）改変標的化ベクターの第１の標的部位を第１のヌクレアーゼ剤で切断し、改変標的化ベクターの第２の標的部位を第２のヌクレアーゼ剤で切断して、選択カセットを除去し、改変標的化ベクターの第１の反復配列及び第２の反復配列を露出させることと、（ｄ）露出された第１の反復配列を露出された第２の反復配列と分子内インビトロアセンブリ反応においてアセンブルして、瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む標的化ベクターを生成することであって、瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む標的化ベクター中に、第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位も第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位も存在せず、反復配列の単一コピーのみが存在する、標的化ベクターを生成することとを含む。
いくつかのそのような方法では、反復配列は、既存の標的化ベクター中の配列と同一である。いくつかのそのような方法では、標的化遺伝子改変は挿入を含み、反復配列は挿入の５’末端又は３’末端と同一である。
いくつかのそのような方法では、反復配列は少なくとも約２０ヌクレオチド長である。場合により、反復配列は約２０ヌクレオチド長～約１００ヌクレオチド長である。
いくつかのそのような方法では、改変カセットは、直鎖状二本鎖核酸である。いくつかのそのような方法では、改変カセットは、約１ｋｂ～約１５ｋｂ長である。いくつかのそのような方法では、５’相同性アーム及び３’相同性アームはそれぞれ少なくとも約３５ヌクレオチド長である。いくつかのそのような方法では、５’相同性アーム及び３’相同性アームはそれぞれ約３５ヌクレオチド長～約５００ヌクレオチド長である。
いくつかのそのような方法では、第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、レアカットヌクレアーゼ剤である。いくつかのそのような方法では、第１の標的部位及び／又は第２の標的部位は、既存の標的化ベクターに存在しない。いくつかのそのような方法では、第１の標的部位は第２の標的部位と同一であり、第１のヌクレアーゼ剤は第２のヌクレアーゼ剤と同一である。
いくつかのそのような方法では、第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、レアカット制限酵素を含む。場合により、レアカット制限酵素は、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＳｓｔＩＩ、Ｓａｌｌ、ＮｒｕＩ、ＮｈｅＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＣＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＳｂｆＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｗａＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｆｉＩ、ＣｓｐＣＩ、ＡｂｓＩ、ＣｃｉＮＩ、ＦｓｐＡＩ、ＭａｕＢＩ、ＭｒｅＩ、ＭｓｓＩ、ＰａｌＡＩ、ＲｇａＩ、ＲｉｇＩ、ＳｄａＩ、ＳｆａＡＩ、ＳｇｆＩ、ＳｇｒＤＩ、ＳｇｓＩ、ＳｍｉＩ、ＳｒｆＩ、Ｓｓｅ２３２１、Ｓｓｅ８３８７１、ＬｇｕＩ、ＰｃｉＳＩ、ＡａｒＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｒＩ、ＰｐｉＩ、又はＰｓｒＩである。
いくつかのそのような方法では、第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又は操作されたメガヌクレアーゼである。場合により、第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤はＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡであり、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９であり、ｇＲＮＡは、標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＰＳＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。
いくつかのそのような方法では、標的化遺伝子改変は、５’相同性アーム又は３’相同性アームにおける改変を含む。いくつかのそのような方法では、標的化遺伝子改変は、挿入核酸における改変を含む。いくつかのそのような方法では、標的化遺伝子改変は、点変異、欠失、挿入、置換、又はそれらの組み合わせを含む。
いくつかのそのような方法では、選択カセットは抗生物質に対する耐性を付与する。場合により、選択カセットは、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、又はポリミキシンＢに対する耐性を付与する。
いくつかのそのような方法では、既存の標的化ベクターは、少なくとも約１０ｋｂ長の大きな標的化ベクターである。場合により、既存の標的化ベクターは少なくとも約１００ｋｂ長である。
いくつかのそのような方法では、既存の標的化ベクターは、第２の選択カセットを含む。場合により、第２の選択カセットは抗生物質に対する耐性を付与する。場合により、改変カセット中の選択カセット及び既存の標的化ベクター中の第２の選択カセットはそれぞれ、異なる抗生物質に対する耐性を付与する。場合により、第２の選択カセットは、細菌細胞及び哺乳動物細胞の両方での選択を可能にする。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）はインビトロで行われる。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｄ）は、（ｉ）改変標的化ベクターをエキソヌクレアーゼと接触させて、第１の反復配列と第２の反復配列との間の相補配列を露出させること、（ｉｉ）露出した相補配列をアニーリングすること、（ｉｉｉ）アニーリングした相補配列の３’末端を伸長すること、及び（ｉｖ）アニーリングした相補配列をライゲーションすることを含む。場合により、ステップ（ｄ）は、改変標的化ベクターをエキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼと共にインキュベートすることを含む。
いくつかのそのような方法は、更に、（ｅ）ステップ（ｄ）のインビトロアセンブリに続いて、標的化ベクターを第１のヌクレアーゼ剤及び第２のヌクレアーゼ剤で処理して、第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位も第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位も存在しないことを確認することを含む。
別の態様では、いくつかのそのような方法は、（ａ）細菌細胞の集団において、既存標的化ベクターと欠失カセットとの間で細菌相同組換えを実行することであって、欠失カセットが、既存の標的化ベクターの５’標的配列に対応する５’相同性アーム及び既存のベクターの３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含み、５’標的配列及び３’標的配列が、標的遺伝子改変が導入される既存の標的化ベクターの領域に隣接し、挿入核酸が、５’から３’の（ｉ）第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位、（ｉｉ）選択カセット、及び（ｉｉｉ）第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位を含む、細菌相同組換えを実行することと、（ｂ）選択カセットを含む改変標的化ベクターを含む細菌細胞を選択することと、（ｃ）改変標的化ベクターの第１の標的部位を第１のヌクレアーゼ剤で切断し、改変標的化ベクターの第２の標的部位を第２のヌクレアーゼ剤で切断して、選択カセットを除去し、改変標的化ベクターの上流末端配列及び下流末端配列を露出させることと、（ｄ）インビトロアセンブリ反応において、切断された標的化ベクターを、改変標的化ベクターの上流末端配列と重複する上流末端配列及び改変標的化ベクターの下流末端配列と重複する下流末端配列と隣接する標的化遺伝子改変を含む改変カセットとアセンブルして、瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む標的化ベクターを生成することであって、瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む標的化ベクター中に、第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位も第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位も存在しない、標的化ベクターを生成することとを含む。
いくつかのそのような方法では、欠失カセットは、約１ｋｂ～約１５ｋｂ長である。いくつかのそのような方法では、５’相同性アーム及び３’相同性アームはそれぞれ少なくとも約３５ヌクレオチド長である。場合により、５’相同性アーム及び３’相同性アームはそれぞれ約３５ヌクレオチド長～約５００ヌクレオチド長である。いくつかのそのような方法では、欠失カセットは、直鎖状二本鎖核酸である。
いくつかのそのような方法では、第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、レアカットヌクレアーゼ剤である。いくつかのそのような方法では、第１の標的部位及び／又は第２の標的部位は、既存の標的化ベクターに存在しない。いくつかのそのような方法では、第１の標的部位は第２の標的部位と同一であり、第１のヌクレアーゼ剤は第２のヌクレアーゼ剤と同一である。
いくつかのそのような方法では、第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、レアカット制限酵素を含む。場合により、レアカット制限酵素は、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＳｓｔＩＩ、Ｓａｌｌ、ＮｒｕＩ、ＮｈｅＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＣＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＳｂｆＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｗａＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｆｉＩ、ＣｓｐＣＩ、ＡｂｓＩ、ＣｃｉＮＩ、ＦｓｐＡＩ、ＭａｕＢＩ、ＭｒｅＩ、ＭｓｓＩ、ＰａｌＡＩ、ＲｇａＩ、ＲｉｇＩ、ＳｄａＩ、ＳｆａＡＩ、ＳｇｆＩ、ＳｇｒＤＩ、ＳｇｓＩ、ＳｍｉＩ、ＳｒｆＩ、Ｓｓｅ２３２１、Ｓｓｅ８３８７１、ＬｇｕＩ、ＰｃｉＳＩ、ＡａｒＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｒＩ、ＰｐｉＩ、又はＰｓｒＩである。
いくつかのそのような方法では、第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又は操作されたメガヌクレアーゼである。場合により、第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤はＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡであり、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９であり、ｇＲＮＡは、標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＰＳＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。
いくつかのそのような方法では、選択カセットは抗生物質に対する耐性を付与する。場合により、選択カセットは、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、又はポリミキシンＢに対する耐性を付与する。
本発明の他の課題、特徴、及び利点は、以下の発明を実施するための形態及び図面から当業者には明らかであろう。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
既存の標的化ベクターに瘢痕のない標的化遺伝子改変を導入するための方法であって、
（ａ）細菌細胞の集団において、前記既存の標的化ベクターと改変カセットとの間で細菌相同組換えを実行することであって、
前記改変カセットが、標的化遺伝子改変を含み、前記既存の標的化ベクターの５’標的配列に対応する５’相同性アーム及び前記既存のベクターの３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含み、前記挿入核酸が、５’から３’の
（ｉ）第１の反復配列と、
（ｉｉ）第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位と、
（ｉｉｉ）選択カセットと、
（ｉｖ）第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位と、
（ｖ）第１の反復配列と同一の第２の反復配列と、を含む、細菌相同組換えを実行することと、
（ｂ）前記選択カセットを含む改変標的化ベクターを含む細菌細胞を選択することと、
（ｃ）前記改変標的化ベクターの前記第１の標的部位を前記第１のヌクレアーゼ剤で切断し、前記改変標的化ベクターの前記第２の標的部位を第２のヌクレアーゼ剤で切断して、前記選択カセットを除去し、前記改変標的化ベクターの前記第１の反復配列及び前記第２の反復配列を露出させることと、
（ｄ）前記露出された第１の反復配列を前記露出された第２の反復配列と分子内インビトロアセンブリ反応においてアセンブルして、前記瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む前記標的化ベクターを生成することであって、
前記瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む前記標的化ベクター中に、前記第１のヌクレアーゼ剤の前記第１の標的部位も前記第２のヌクレアーゼ剤の前記第２の標的部位も存在せず、前記反復配列の単一コピーのみが存在する、標的化ベクターを生成することとを含む、方法。
(項目２)
前記反復配列が、前記既存の標的化ベクター中の配列と同一である、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記標的化遺伝子改変が挿入を含み、前記反復配列が挿入の５’末端又は３’末端と同一である、項目１に記載の方法。
(項目４)
前記反復配列が少なくとも約２０ヌクレオチド長である、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
(項目５)
前記反復配列が約２０ヌクレオチド長～約１００ヌクレオチド長である、項目４に記載の方法。
(項目６)
前記改変カセットが直鎖状二本鎖核酸である、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
(項目７)
前記改変カセットが約１ｋｂ～約１５ｋｂ長である、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
(項目８)
前記５’相同性アーム及び前記３’相同性アームがそれぞれ少なくとも約３５ヌクレオチド長である、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
(項目９)
前記５’相同性アーム及び前記３’相同性アームがそれぞれ約３５ヌクレオチド長～約５００ヌクレオチド長である、項目８に記載の方法。
(項目１０)
前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤がレアカットヌクレアーゼ剤である、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
(項目１１)
前記第１の標的部位及び／又は前記第２の標的部位が前記既存の標的化ベクターに存在しない、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
(項目１２)
前記第１の標的部位が前記第２の標的部位と同一であり、前記第１のヌクレアーゼ剤が前記第２のヌクレアーゼ剤と同一である、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
(項目１３)
前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤が、レアカット制限酵素を含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１４)
前記レアカット制限酵素が、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＳｓｔＩＩ、Ｓａｌｌ、ＮｒｕＩ、ＮｈｅＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＣＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＳｂｆＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｗａＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｆｉＩ、ＣｓｐＣＩ、ＡｂｓＩ、ＣｃｉＮＩ、ＦｓｐＡＩ、ＭａｕＢＩ、ＭｒｅＩ、ＭｓｓＩ、ＰａｌＡＩ、ＲｇａＩ、ＲｉｇＩ、ＳｄａＩ、ＳｆａＡＩ、ＳｇｆＩ、ＳｇｒＤＩ、ＳｇｓＩ、ＳｍｉＩ、ＳｒｆＩ、Ｓｓｅ２３２１、Ｓｓｅ８３８７１、ＬｇｕＩ、ＰｃｉＳＩ、ＡａｒＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｒＩ、ＰｐｉＩ、又はＰｓｒＩである、項目１３に記載の方法。
(項目１５)
前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又は操作されたメガヌクレアーゼである、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
(項目１６)
前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤がＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９であり、前記ｇＲＮＡが、標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＰＳＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、項目１５に記載の方法。
(項目１７)
前記標的化遺伝子改変が、前記５’相同性アーム又は前記３’相同性アームにおける改変を含む、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１８)
前記標的化遺伝子改変が、前記挿入核酸における改変を含む、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
(項目１９)
前記標的化遺伝子改変が、点変異、欠失、挿入、置換、又はそれらの組み合わせを含む、項目１から１８のいずれか一項に記載の方法。
(項目２０)
前記選択カセットが抗生物質に対する耐性を付与する、項目１から１９のいずれか一項に記載の方法。
(項目２１)
前記選択カセットが、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、又はポリミキシンＢに対する耐性を付与する、項目２０に記載の方法。
(項目２２)
前記既存の標的化ベクターが、少なくとも約１０ｋｂ長の大きな標的化ベクターである、項目１から２１のいずれか一項に記載の方法。
(項目２３)
前記既存の標的化ベクターが少なくとも約１００ｋｂ長である、項目２２に記載の方法。
(項目２４)
前記既存の標的化ベクターが第２の選択カセットを含む、項目１から２３のいずれか一項に記載の方法。
(項目２５)
前記第２の選択カセットが抗生物質に対する耐性を付与する、項目２４に記載の方法。
(項目２６)
前記改変カセット中の前記選択カセット及び前記既存の標的化ベクター中の前記第２の選択カセットがそれぞれ、異なる抗生物質に対する耐性を付与する、項目２５に記載の方法。
(項目２７)
前記第２の選択カセットが、細菌細胞及び哺乳動物細胞の両方での選択を可能にする、項目２４から２６のいずれか一項に記載の方法。
(項目２８)
ステップ（ｃ）がインビトロで行われる、項目１から２７のいずれか一項に記載の方法。
(項目２９)
ステップ（ｄ）が、
（ｉ）前記改変標的化ベクターをエキソヌクレアーゼと接触させて、前記第１の反復配列と前記第２の反復配列との間の相補配列を露出させることと、
（ｉｉ）前記露出した相補配列をアニーリングすることと、
（ｉｉｉ）前記アニーリングした相補配列の３’末端を伸長することと、
（ｉｖ）前記アニーリングした相補配列をライゲーションすることと、を含む、項目１から２８のいずれか一項に記載の方法。
(項目３０)
ステップ（ｄ）が、前記改変標的化ベクターをエキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼと共にインキュベートすることを含む、項目２９に記載の方法。
(項目３１)
更に、
（ｅ）ステップ（ｄ）のインビトロアセンブリに続いて、前記標的化ベクターを前記第１のヌクレアーゼ剤及び前記第２のヌクレアーゼ剤で処理して、前記第１のヌクレアーゼ剤の前記第１の標的部位も前記第２のヌクレアーゼ剤の前記第２の標的部位も存在しないことを確認することを含む、項目１から３０のいずれか一項に記載の方法。
(項目３２)
既存の標的化ベクターに瘢痕のない標的化遺伝子改変を導入するための方法であって、
（ａ）細菌細胞の集団において、前記既存の標的化ベクターと欠失カセットとの間で細菌相同組換えを実行することであって、
前記欠失カセットが、前記既存の標的化ベクターの５’標的配列に対応する５’相同性アーム及び前記既存のベクターの３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含み、前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、前記標的化遺伝子改変が導入される前記既存の標的化ベクターの領域に隣接し、前記挿入核酸が、５’から３’の
（ｉ）第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位と、
（ｉｉ）選択カセットと、
（ｉｉｉ）第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位と、を含む、細菌相同組換えを実行することと、
（ｂ）前記選択カセットを含む改変標的化ベクターを含む細菌細胞を選択することと、
（ｃ）前記改変標的化ベクターの前記第１の標的部位を前記第１のヌクレアーゼ剤で切断し、前記改変標的化ベクターの前記第２の標的部位を第２のヌクレアーゼ剤で切断して、前記選択カセットを除去し、前記改変標的化ベクターの上流末端配列及び下流末端配列を露出させることと、
（ｄ）インビトロアセンブリ反応において、前記切断された標的化ベクターを、前記改変標的化ベクターの上流末端配列と重複する上流末端配列及び前記改変標的化ベクターの下流末端配列と重複する下流末端配列と隣接する標的化遺伝子改変を含む改変カセットとアセンブルして、前記瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む前記標的化ベクターを生成することであって、
前記瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む前記標的化ベクター中に、前記第１のヌクレアーゼ剤の前記第１の標的部位も前記第２のヌクレアーゼ剤の前記第２の標的部位も存在しない、標的化ベクターを生成することとを含む、方法。
(項目３３)
前記欠失カセットが約１ｋｂ～約１５ｋｂ長である、項目３２に記載の方法。
(項目３４)
前記５’相同性アーム及び前記３’相同性アームがそれぞれ少なくとも約３５ヌクレオチド長である、項目３２又は３３に記載の方法。
(項目３５)
前記５’相同性アーム及び前記３’相同性アームがそれぞれ約３５ヌクレオチド長～約５００ヌクレオチド長である、項目３４に記載の方法。
(項目３６)
前記欠失カセットが直鎖状二本鎖核酸である、項目３２から３５のいずれか一項に記載の方法。
(項目３７)
前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤がレアカットヌクレアーゼ剤である、項目３２から３６のいずれか一項に記載の方法。
(項目３８)
前記第１の標的部位及び／又は前記第２の標的部位が前記既存の標的化ベクターに存在しない、項目３２から３７のいずれか一項に記載の方法。
(項目３９)
前記第１の標的部位が前記第２の標的部位と同一であり、前記第１のヌクレアーゼ剤が前記第２のヌクレアーゼ剤と同一である、項目３２から３８のいずれか一項に記載の方法。
(項目４０)
前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤が、レアカット制限酵素を含む、項目３２から３９のいずれか一項に記載の方法。
(項目４１)
前記レアカット制限酵素が、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＳｓｔＩＩ、Ｓａｌｌ、ＮｒｕＩ、ＮｈｅＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＣＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＳｂｆＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｗａＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｆｉＩ、ＣｓｐＣＩ、ＡｂｓＩ、ＣｃｉＮＩ、ＦｓｐＡＩ、ＭａｕＢＩ、ＭｒｅＩ、ＭｓｓＩ、ＰａｌＡＩ、ＲｇａＩ、ＲｉｇＩ、ＳｄａＩ、ＳｆａＡＩ、ＳｇｆＩ、ＳｇｒＤＩ、ＳｇｓＩ、ＳｍｉＩ、ＳｒｆＩ、Ｓｓｅ２３２１、Ｓｓｅ８３８７１、ＬｇｕＩ、ＰｃｉＳＩ、ＡａｒＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｒＩ、ＰｐｉＩ、又はＰｓｒＩである、項目４０に記載の方法。
(項目４２)
前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又は操作されたメガヌクレアーゼである、項目３２から３９のいずれか一項に記載の方法。
(項目４３)
前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤がＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９であり、前記ｇＲＮＡが、標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＰＳＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、項目４２に記載の方法。
(項目４４)
前記選択カセットが抗生物質に対する耐性を付与する、項目３２から４３のいずれか一項に記載の方法。
(項目４５)
前記選択カセットが、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、又はポリミキシンＢに対する耐性を付与する、項目４４に記載の方法。
(項目４６)
前記既存の標的化ベクターが、少なくとも１０ｋｂ長の大きな標的化ベクターである、項目３２から４５のいずれか一項に記載の方法。
(項目４７)
前記既存の標的化ベクターが少なくとも約１００ｋｂ長である、項目４６に記載の方法。
(項目４８)
前記既存の標的化ベクターが第２の選択カセットを含む、項目３２から４７のいずれか一項に記載の方法。
(項目４９)
前記第２の選択カセットが抗生物質に対する耐性を付与する、項目４８に記載の方法。
(項目５０)
前記欠失カセット中の前記選択カセット及び前記既存の標的化ベクター中の前記第２の選択カセットがそれぞれ、異なる抗生物質に対する耐性を付与する、項目４９に記載の方法。
(項目５１)
前記第２の選択カセットが、細菌細胞及び哺乳動物細胞の両方での選択を可能にする、項目４８から５０のいずれか一項に記載の方法。
(項目５２)
前記改変カセットにおける前記上流末端配列と前記改変標的化ベクターにおける前記上流末端配列との間の前記重複の長さ、及び／又は前記改変カセットにおける前記下流末端配列と前記改変標的化ベクターにおける前記下流末端配列との間の前記重複の長さが、少なくとも約２０ヌクレオチド長である、項目３２から５１のいずれか一項に記載の方法。
(項目５３)
前記改変カセットにおける前記上流末端配列と前記改変標的化ベクターにおける前記上流末端配列との間の前記重複の長さ、及び／又は前記改変カセットにおける前記下流末端配列と前記改変標的化ベクターにおける前記下流末端配列との間の前記重複の長さが、約２０～約１００ヌクレオチド長である、項目３２から５２のいずれか一項に記載の方法。
(項目５４)
ステップ（ｃ）がインビトロで行われる、項目３２から５３のいずれか一項に記載の方法。
(項目５５)
ステップ（ｄ）が、
（ｉ）前記切断された標的化ベクター及び前記改変カセットをエキソヌクレアーゼと接触させて、前記改変標的化ベクターの末端配列と前記改変カセットの末端配列との間の相補配列を露出させることと、
（ｉｉ）前記露出した相補配列をアニーリングすることと、
（ｉｉｉ）前記アニーリングした相補配列の３’末端を伸長することと、
（ｉｖ）前記アニーリングした相補配列をライゲーションすることと、を含む、項目３２から５４のいずれか一項に記載の方法。
(項目５６)
ステップ（ｄ）が、前記切断された標的化ベクター及び前記改変カセットを、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼと共にインキュベートすることを含む、項目５５に記載の方法。
(項目５７)
前記改変カセットが直鎖状二本鎖核酸である、項目３２から５６のいずれか一項に記載の方法。
(項目５８)
前記改変カセットが少なくとも約２００ヌクレオチド長である、項目３２から５７のいずれか一項に記載の方法。
(項目５９)
前記改変カセット改変カセットが、ポリメラーゼ連鎖反応によって直接合成又は生成することができないサイズである、項目３２から５８のいずれか一項に記載の方法。
(項目６０)
前記改変カセットが少なくとも約１０ｋｂ長である、項目３２から５９のいずれか一項に記載の方法。
(項目６１)
前記標的化遺伝子改変が、点変異、欠失、挿入、置換、又はそれらの組み合わせを含む、項目３２から６０のいずれか一項に記載の方法。
(項目６２)
（ｅ）ステップ（ｄ）のインビトロアセンブリに続いて、前記標的化ベクターを前記第１のヌクレアーゼ剤及び前記第２のヌクレアーゼ剤で処理して、前記第１のヌクレアーゼ剤の前記第１の標的部位も前記第２のヌクレアーゼ剤の前記第２の標的部位も存在しないことを確認することを更に含む、項目３２から６１のいずれか一項に記載の方法。
いくつかのそのような方法では、既存の標的化ベクターは、第２の選択カセットを含む。場合により、第２の選択カセットは抗生物質に対する耐性を付与する。場合により、欠失カセットの選択カセット及び既存の標的化ベクターの第２の選択カセットはそれぞれ、異なる抗生物質に対する耐性を付与する。場合により、第２の選択カセットは、細菌細胞及び哺乳動物細胞の両方での選択を可能にする。
いくつかのそのような方法では、改変カセットにおける上流末端配列と改変標的化ベクターにおける上流末端配列との間の重複の長さ、及び／又は改変カセットにおける下流末端配列と改変標的化ベクターにおける下流末端配列との間の重複の長さは、少なくとも約２０ヌクレオチド長である。いくつかのそのような方法では、改変カセットにおける上流末端配列と改変標的化ベクターにおける上流末端配列との間の重複の長さ、及び／又は改変カセットにおける下流末端配列と改変標的化ベクターにおける下流末端配列との間の重複の長さは、約２０ヌクレオチド長～約１００ヌクレオチド長である。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｃ）はインビトロで行われる。
いくつかのそのような方法では、ステップ（ｄ）は、（ｉ）切断された標的化ベクター及び改変カセットをエキソヌクレアーゼと接触させて、改変標的化ベクターの末端配列と改変カセットの末端配列との間の相補配列を露出させること、（ｉｉ）露出した相補配列をアニーリングすること、（ｉｉｉ）アニーリングした相補配列の３’末端を伸長すること、及び（ｉｖ）アニーリングした相補配列をライゲーションすることを含む。場合により、ステップ（ｄ）は、切断された標的化ベクター及び改変カセットを、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼと共にインキュベートすることを含む。
いくつかのそのような方法では、改変カセットは、直鎖状二本鎖核酸である。いくつかのそのような方法では、改変カセットは少なくとも約２００ヌクレオチド長である。いくつかのそのような方法では、改変カセット改変カセットは、ポリメラーゼ連鎖反応によって直接合成又は生成することができないサイズである。いくつかのそのような方法では、改変カセットは少なくとも約１０ｋｂ長である。
いくつかのそのような方法では、標的化遺伝子改変は、点変異、欠失、挿入、置換、又はそれらの組み合わせを含む。
いくつかのそのような方法は、更に、（ｅ）ステップ（ｄ）のインビトロアセンブリに続いて、標的化ベクターを第１のヌクレアーゼ剤及び第２のヌクレアーゼ剤で処理して、第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位も第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位も存在しないことを確認することを含む。
図１は（正確な縮尺ではない）は、細菌相同組換え及び分子内ギブソンアセンブリを介した大きな標的化ベクターへの点変異の瘢痕のない導入のための方法の概略図を示す。
図２（正確な縮尺ではない）は、図１の概略図に示されている方法で使用される合成核酸の概略図を示す。
図３は（正確な縮尺ではない）は、細菌相同組換え及び分子間ギブソンアセンブリを介した大きな標的化ベクターへの点変異の瘢痕のない導入のための方法の概略図を示す。
図４Ａは、ベクター構築（図４Ａ）からＦ１マウス生成（図４Ｂ）まで、ベクターとして改変マウスＢＡＣ及び自己欠失カセット技術を使用する従来の標的化戦略を示す。 図４Ｂは、ベクター構築（図４Ａ）からＦ１マウス生成（図４Ｂ）まで、ベクターとして改変マウスＢＡＣ及び自己欠失カセット技術を使用する従来の標的化戦略を示す。マウスプロタミン発現Ｃｒｅリコンビナーゼを介してカセットを欠失すると、単一のｌｏｘＰを含む７８ｂｐの瘢痕が残る。
定義
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、及び「ペプチド」という用語は、コード化及び非コード化アミノ酸並びに化学的又は生化学的に改変又は誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を含む。これらの用語には、また、改変されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの改変されたポリマーが含まれる。「ドメイン」という用語は、特定の機能又は構造を有するタンパク質又はポリペプチドの任意の部分を指す。
本明細書で互換的に使用される、「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、又はそれらの類似体若しくは改変バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を含む。これらには、一本鎖、二本鎖、及び多重鎖ＤＮＡ又はＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、及びプリン塩基、ピリミジン塩基、又は他の天然、化学改変、生化学改変、非天然、若しくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
「標的化ベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介ライゲーション、又は任意の他の組換え手段によって、細胞のゲノム中の標的位置に導入され得る組換え核酸を指す。
「野生型」という用語は、（変異型、病変した、改変したなどとは対照的に）正常な状態又は文脈に見られるような構造及び／又は活性を有する実体を含む。野生型遺伝子及びポリペプチドは、多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
「内因性配列」という用語は、細胞又は非ヒト動物内で自然に発生する核酸配列を指す。例えば、非ヒト動物の内因性Ｒｏｓａ２６配列は、非ヒト動物のＲｏｓａ２６遺伝子座で自然に発生する天然Ｒｏｓａ２６配列を指す。
「外因性」分子又は配列には、その形態又は位置（例えば、ゲノム遺伝子座）で細胞に通常は存在しない分子又は配列が含まれる。通常の存在には、細胞の特定の発生段階及び環境条件に関する存在が含まれる。外因性分子又は配列には、例えば、内因性配列のヒト化バージョンなどの細胞内の対応する内因性配列の変異バージョンが含まれ得るか、又は細胞内であるが、異なる形態の（すなわち、染色体内ではない）内因性配列に対応する配列が含まれ得る。対照的に、内因性分子又は配列には、その形態及び位置で、特定の細胞において、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在する分子又は配列が含まれる。
核酸又はタンパク質の文脈で使用される場合の「異種」という用語は、核酸又はタンパク質が、同じ分子内で一緒に天然に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメント又はタンパク質のセグメントに関して使用される場合、核酸又はタンパク質が、天然では互いに同じ関係で見出されない（例えば、一緒に連結された）２つ以上のサブ配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、天然では他の分子と関連して見出されない別の核酸分子内の、又はそれに結合した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、天然のコード配列に関連して見出されない配列に隣接するコード配列を含むことができる。同様に、タンパク質の「異種」領域は、天然では他のペプチド分子と関連して見出されない別のペプチド分子内の、又はそれに結合したアミノ酸のセグメントである（例えば、融合タンパク質、又はタグを有するタンパク質）。同様に、核酸又はタンパク質は、異種標識又は異種分泌又は局在化配列を含むことができる。
「コドン最適化」は、アミノ酸を特定する多数の３塩基対コドンの組み合わせによって示されるように、コドンの縮重を利用し、一般に、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁に又は最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、特定の宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を改変するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を、天然に存在する核酸配列と比較すると、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、又は任意の他の宿主細胞を含む所与の原核細胞又は真核細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置き換えるように改変することができる。コドン使用量表は、例えば「コドン使用量データベース」で容易に入手できる。これらの表は、様々な方法で適用することができる。全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＮａｋａｍｕｒａら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現のための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズム（例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅを参照されたい）もまた利用可能である。
「遺伝子座」という用語は、遺伝子（又は重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドコード配列、又は生物のゲノムの染色体上の位置の特定の位置を指す。例えば、Ｒｏｓａ２６遺伝子座は、Ｒｏｓａ２６遺伝子の特定の位置、Ｒｏｓａ２６ＤＮＡ配列、又はここでそのような配列が存在するとして同定された生物のゲノムの染色体上Ｒｏｓａ２６位置を指すことができる。「Ｒｏｓａ２６遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、又はそれらの組み合わせを含む、Ｒｏｓａ２６遺伝子の調節エレメントを含み得る。
「遺伝子」という用語は、産物（例えば、ＲＮＡ産物及び／又はポリペプチド産物）をコードする染色体中のＤＮＡ配列を指し、非コードイントロンで中断されたコード領域並びに遺伝子が完全長ｍＲＮＡ（５’及び３’非翻訳配列を含む）に対応するように５’及び３’末端の両方でコード領域に隣接して位置する配列を含む。「遺伝子」という用語はまた、調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、及び転写因子結合部位）、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム侵入部位、サイレンサー、インスレーター配列、及びマトリックス結合領域を含む他の非コード配列を含む。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近接していても（例えば、１０ｋｂ以内）、離れた部位にあってもよく、遺伝子の転写及び翻訳のレベル又は速度に影響を及ぼす。
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始することを指示することができるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域を更に含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節する。プロモーターは、本明細書に開示される１つ又は複数の細胞型（例えば、原核細胞又は真核細胞（哺乳動物細胞など）、又はそれらの組み合わせ）において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、又は空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的又は組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、国際公開第２０１３／１７６７７２号において見出すことができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「作動可能な連結」又は「作動可能に連結されている」とは、その両方の成分が正常に機能し、かつ構成要素の少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに及ぶ機能を媒介し得る可能性を許すような、２つ以上の成分（例えば、プロモーター及び別の配列要素）の並列を含む。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写調節因子の存在又は非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、そのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、そのような配列が相互に近接していること、又はトランスに作用する（例えば、調節配列が、コード配列の転写を制御するために離れて作用し得る）ことを含み得る。
核酸の「相補性」とは、核酸の一方の鎖のヌクレオチド配列が、その核酸塩基基の配向のために、反対側の核酸鎖の別の配列と水素結合を形成することを意味する。ＤＮＡの相補的塩基は、通常、ＡとＴ及びＣとＧである。ＲＮＡでは、通常、ＣとＧ及びＵとＡである。相補性は完全又は実質的／十分であってもよい。２つの核酸間の完全な相補性は、２つの核酸が二本鎖を形成することができ、二本鎖中の全ての塩基がワトソン－クリック対合によって相補的塩基に結合されることを意味する。「実質的」又は「十分な」相補的とは、一方の鎖の配列が反対側の鎖の配列と完全に及び／又は完全に相補的ではないが、２つの鎖の塩基間で十分な結合が起こり、一連のハイブリダイゼーション条件（例えば、塩濃度及び温度）で安定したハイブリッド複合体を形成することを意味する。このような条件は、配列と標準的な数学的計算を使用してハイブリダイズした鎖のＴｍ（融解温度）を予測するか、ルーチンの方法を使用してＴｍを経験的に決定することによって予測することができる。Ｔｍは、２つの核酸鎖の間に形成されたハイブリダイゼーション複合体の集団が５０％変性する（すなわち、二本鎖核酸分子の集団が一本鎖に半分解離する）温度を含む。Ｔｍより低い温度では、ハイブリダイゼーション複合体の形成に有利であるが、Ｔｍより高い温度では、ハイブリダイゼーション複合体中の鎖の融解又は分離に有利である。他の既知のＴｍ計算は核酸の構造的特徴を考慮に入れるが、Ｔｍは、例えば、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）を使用することにより、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液中の既知のＧ＋Ｃ含有量を有する核酸について推定することができる。
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補配列を含むことを必要とするが、塩基間のミスマッチが可能である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、核酸の長さ及び相補性の程度に依存し、これらは公知の変数である。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値が大きくなる。短い長さの相補性（例えば、３５以下、３０以下、２５以下、２２以下、２０以下又は１８以下のヌクレオチドにわたる相補性）を有する核酸間のハイブリダイゼーションについては、ミスマッチの位置が重要になる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出、１１．７－１１．８を参照のこと）。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは少なくとも約１０ヌクレオチドである。ハイブリダイズ可能な核酸の例示的な最小の長さとしては、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２２ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、及び少なくとも約３０ヌクレオチドが挙げられる。更に、温度及び洗浄液の塩濃度は、相補性の領域の長さ及び相補性の程度などの要因に従って、必要に応じて調整することができる。
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズするために、その標的核酸の配列と１００％相補的である必要はない。更に、ポリヌクレオチドは、介在又は隣接するセグメントがハイブリダイゼーションイベント（例えば、ループ構造又はヘアピン構造）に関与しないように、１つ又は複数のセグメントにわたってハイブリダイズすることができる。ポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ）は、それらが標的とする標的核酸配列内の標的領域に対して、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は１００％の配列相補性を含むことができる。例えば、２０ヌクレオチドのうち１８ヌクレオチドが標的領域に相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするｇＲＮＡは、９０％の相補性を表す。この例では、残りの非相補的ヌクレオチドは、相補的ヌクレオチドと共にクラスター化又は散在している可能性があり、互いに又は相補的ヌクレオチドに隣接している必要はない。
核酸内の核酸配列の特定の長さ間の相補性パーセントは、ＢＬＡＳＴプログラム（ベーシックローカルアラインメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０；Ｚｈａｎｇ及びＭａｄｄｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６４９－６５６；これらの各々は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、又は全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２－４８９のアルゴリズムを使用するデフォルト設定を使用して、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ８ｆｏｒ Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋ、ウィスコンシン州マディソン）を使用することにより、日常的に決定することができる。
本明細書で提供される方法及び組成物は、様々な異なる構成要素を使用する。説明全体の一部の構成要素は、活性変異体及びフラグメントを有することができる。このような構成要素には、例えば、Ｃａｓタンパク質、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びガイドＲＮＡが含まれる。これらの構成要素のそれぞれの生物学的活性は、本明細書の他の場所に記載されている。「機能性」という用語は、生物学的活性又は機能を示すタンパク質又は核酸（又はそのフラグメント、アイソフォーム、若しくは変異体）の生来の能力を指す。そのような生物学的活性又は機能には、例えば、Ｃａｓタンパク質がガイドＲＮＡ及び標的ＤＮＡ配列に結合する能力が含まれ得る。機能的フラグメント又は変異体の生物学的機能は、元のものと比較して同じであるか、又は実際に変化してもよい（例えば、それらの特異性又は選択性又は有効性に関して）が、基本的な生物学的機能は維持される。
「変異体」という用語は、集団で最も一般的な配列とは異なるヌクレオチド配列（例えば、１ヌクレオチド）、又は集団で最も一般的な配列とは異なるタンパク質配列（例えば、１アミノ酸）を指す。
「フラグメント」という用語は、タンパク質に言及する場合、全長タンパク質よりも短いか、又は少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。「フラグメント」という用語は、核酸に言及する場合、全長の核酸よりも短いか、又は少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。フラグメントは、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、又は内部断片であってもよい。
２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」又は「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大の一致のためにアラインさせる場合、同じである２つの配列の残基について言及する。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なり、アミノ酸残基は、同様の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを、置換の保存的性質について補正するために、上方に調整してもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われている。この調整を行う手段は、周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、それによって、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換がゼロのスコアを与えられる場合に、保存的置換は、ゼロから１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，マウンテンビュー、カリフォルニア）で実行されるように計算される。
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較することによって決定される値を含み、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加又は欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加又は欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列中に発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割ること、及び結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。特に明記しない限り（例えば、短い方の配列が、連結された非相同配列を含む）、比較ウィンドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の全長である。
特に明記しない限り、配列同一性／類似性の値は、パラメーター：５０のＧＡＰ重量及び３の長さ重量、及びｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列の同一性％及び類似性％；８のＧＡＰ重量及び２の長さ重量、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列の同一性％及び類似性％；又はその任意の同等のプログラムを使用し、ＧＡＰバージョン１０を使用して得られた値を含む。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の一致及び同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、又は極性の、異なるアミノ酸との置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、又はロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、又はグリシンとセリンの間などの、１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換が含まれる。加えて、リシン、アルギニン、若しくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、又はアスパラギン酸若しくはグルタミン酸などのある酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、又はメチオニンから極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、又はリシンへの、及び／又は極性残基から非極性残基への置換が含まれる。典型的なアミノ酸の分類は、以下の表１で要約する。
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「相同」配列（例えば、核酸配列）としては、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるような、既知の参照配列と同一か、又は実質的に同様である配列が挙げられる。相同配列は、例えば、オーソロガス配列及びパラロガス配列を含み得る。例えば、相同遺伝子は通常、種分化イベント（オーソロガス遺伝子）又は遺伝子重複イベント（パラロガス遺伝子）のいずれかを介して、共通の祖先ＤＮＡ配列から派生する。「オーソロガス」遺伝子には、種分化によって共通の祖先遺伝子から進化した様々な種の遺伝子が含まれる。オーソログは通常、進化の過程で同じ機能を保持する。「パラロガス」遺伝子には、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子が含まれる。パラログは、進化の過程で新しい機能を進化させることができる。
「インビトロ」という用語は、人工環境、及び人工環境（例えば、試験管）内で生じるプロセス又は反応を含む。「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、細胞又は生物又は身体）、及び天然環境内で生じるプロセス又は反応を含む。「エクスビボ」という用語は、個体の体から除去された細胞、及びそのような細胞内で起こるプロセス又は反応を含む。
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答した修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路である相同組換え（ＨＲ）及び非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して生じる。全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＫａｓｐａｒｅｋ＆Ｈｕｍｐｈｒｅｙ（２０１１）Ｓｅｍｉｎａｒｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ＆Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２：８８６－８９７を参照されたい。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介される標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換の任意のプロセスを含み得る。
「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間で遺伝情報を交換する任意のプロセスを含み、任意のメカニズムによって起こり得る。組換えは、相同組換え修復（ＨＤＲ）又は相同組換え（ＨＲ）を介して起こり得る。ＨＤＲ又はＨＲには、ヌクレオチド配列の相同性を必要とする可能性のある核酸修復の形式が含まれ、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復のテンプレートとして「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の伝達をもたらす。いかなる特定の理論に拘束されることを望まないが、そのような伝達は、切断された標的とドナーとの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、及び／又は標的の一部となる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される合成依存性鎖アニーリング及び／又は関連プロセスを含み得る。場合によっては、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、又はドナーポリヌクレオチドのコピーの一部が標的ＤＮＡに組み込まれる。それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷａｎｇら、（２０１３）Ｃｅｌｌ １５３：９１０－９１８；Ｍａｎｄａｌｏｓら、（２０１２）ＰＬＯＳ ＯＮＥ ７：ｅ４５７６８：１－９；及びＷａｎｇら（２０１３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたい。
１つ又は複数の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物又は方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、又は他の成分との組み合わせで含有し得る。「本質的にからなる」という移行句は、請求項の範囲が、請求項に記載された特定の要素、及び請求された発明の基本的かつ新規の特性に実質的に影響を及ぼさない要素を包含すると解釈されることを意味する。したがって、本発明の請求項で使用される場合の「本質的にからなる」という用語は、「含む」と同等であると解釈されることを意図するものではない。
「任意選択的の」又は「任意選択で」は、引き続いて記載された事象又は状況が起こってもよいが起こらなくてもよく、及び説明が、当該事象又は状況が起こる場合の例及びそれが起こらない場合の例を含むことを意味する。
値の範囲の指定は、その範囲内の、又はその範囲を定義する全ての整数、及びその範囲内の整数によって定義される全ての部分範囲を含む。
文脈から別段に明確ではない限り、「約」という用語は、規定の値の測定の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
「及び／又は」という用語は、関連する列挙される項目のうちの１つ又は複数の任意及び全ての可能な組み合わせ、並びに代替物（「又は」）で解釈されるときの組み合わせの欠如を指し、これらを包含する。
「又は」という用語は、特定のリストの任意の１つのメンバーを指し、そのリストのメンバーの任意の組み合わせも含む。
冠詞「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が別段に明確に規定していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「タンパク質」又は「少なくとも１つのタンパク質」という用語は、それらの混合物を含む複数のタンパク質を含むことができる。
統計的に有意なとは、ｐ≦０．０５を意味する。
（発明を実施するための形態）
Ｉ．概要
本明細書で提供されるのは、既存の標的化ベクターに瘢痕のない標的化遺伝子改変を導入するための方法である。本方法は、細菌相同組換え（ＢＨＲ）とインビトロアセンブリ法（分子内又は分子間のいずれか）の組み合わせを使用して、そのような標的化遺伝子改変を標的化ベクターに瘢痕のない方法で導入することができる。瘢痕のないという用語は、反応によってアセンブルされたＤＮＡに変化や望ましくない配列が導入されないという事実を指す。組み合わされた配列は、ＢＨＲ又はインビトロアセンブリ手順によって導入される変化又は人工産物のない、望まれる正確な配列に対応する。
遺伝子機能を決定するための最も効果的なアプローチの１つは、マウス胚性幹（ＥＳ）細胞（又は他の非ヒト動物ＥＳ細胞）の遺伝子変異を意図的に操作し、次いで、対応する遺伝子変化を含むマウス（又は他の非ヒト動物）を生成することを含む。２つの制限ステップは、遺伝子標的化ベクターの生成と、その後の標的化ベクターが遺伝子を正しく改変したまれなＥＳ細胞クローンの選択である。ＥＳ細胞において所望の遺伝子改変を生じさせるには、最初にその改変を標的化ベクターに導入する必要があり、これは続いて、相同組換えによってＥＳ細胞のネイティブ遺伝子を置き換えるために使用される。
制限部位又は他の操作によって生成された瘢痕は、それらが調節にとって重要な領域に着床した場合、遺伝子発現に負の影響を及ぼす可能性があるため、瘢痕のないＤＮＡ構築はトランスジェニック動物系統を作成するときに特に重要である。哺乳類のゲノムを標的とすることは、相同組換えを指示するための長いＤＮＡアームを備えた大きな標的化ベクターの構築、及び胚性幹細胞クローンの選択のための抗生物質耐性カセットを必要とすることが多い。正しく標的化されたクローンには、ベクターと耐性カセット自体の構築に必要な複数の瘢痕が含まれていることが多い。自己欠失カセット技術を使用しても、改変された遺伝子座に外因性配列の「瘢痕」を残すことを回避できないことが多い。例えば、図４Ａ～４Ｂを参照されたい。そのような瘢痕は、標的化遺伝子座の忠実な発現、あるいは隣接する遺伝子の発現にさえ影響を及ぼす可能性がある。動物モデルがより複雑になるにつれて、ヒト化対立遺伝子にヒト疾患を引き起こす変異など、既存のモデルの上に更に多くの改変が追加される可能性がある。次いで、更に変化により、既に高度に操作されたマウス遺伝子座に更に多くの瘢痕及び別の選択カセットを付加することができ、発現が変化し、マウスモデルが忠実でない可能性を増加させる。更に、既に１つのカセットを含むベクターに新しいカセットを加えることは、２つのカセットが異なる選択をコードする場合であっても、プロモーター及びポリ（Ａ）シグナルなどの共有カセットエレメント間の望ましくない組換えのために複雑になり得る。しかし、このような選択カセットは、所望の改変について何千ものＥＳ細胞クローンをスクリーニングするために時間及び資源を浪費する必要がないように重要である。
あるいは、最初の標的化ベクターを使用して、最初の標的化ベクターからの改変を含む改変ＥＳ細胞を作成及びスクリーニングし、次いで、それらの細胞を第２の標的化ベクター（例えば、ｓｓＯＤＮ）で再標的化して、既に標的化された遺伝子座に第２の改変を行うことは、時間がかかり、再標的化（例えば、ｓｓＯＤＮを使用）すると、望ましくない挿入、望ましくない欠失、望ましくない点変異などの望ましくない改変をもたらし得るか、又はゲノムの他の場所でのトランスジェニック挿入と組み合わせた標的化が行われない可能性がある。
本明細書に開示される方法は、最初の既存の標的化ベクターを含むＥＳ細胞を作成及びスクリーニングし、次いで、それらの細胞を再標的化して、既に標的化にされた遺伝子座に対する第２の改変を作成する必要がある代わりに、標的化ベクターを調製する段階で、既存の標的化ベクターに対する改変を作成するための効率的かつ瘢痕のない方法を提供する。
ＩＩ．細菌相同組換え及び分子内インビトロアセンブリを介した標的化ベクターへの標的化改変の瘢痕のない導入
既存の標的化ベクターへの標的化遺伝子改変の瘢痕のない導入のために本明細書に開示されるいくつかの方法は、分子内アセンブリのためのインビトロアセンブリ法を利用する。一例として、そのような方法は、細菌細胞の集団において既存の標的化ベクターと改変カセットとの間で細菌相同組換えを実行することを含むことができる。改変カセットは、既存の標的化ベクターの５’標的配列に対応する５’相同性アーム及び既存のベクターの３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含むことができる。挿入核酸は、１つ又は複数のヌクレアーゼ剤（例えば、レアカットヌクレアーゼ剤）及び反復配列の標的部位に隣接する選択カセットを含むことができる。例えば、挿入核酸は、５’から３’の（１）第１の反復配列、（２）第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位、（３）選択カセット、（４）第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位、及び（５）第２の反復配列を含むことができる。
既存の標的化ベクターは、任意のサイズの任意のタイプの標的化ベクターであってもよい。特定の例では、既存の標的化ベクターは、少なくとも約１０ｋｂ長の大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。別の例では、少なくとも約１００ｋｂ長である。標的化ベクター及び大きな標的化ベクターは、本明細書の他の場所でより詳細に論じられている。
改変カセットは、直鎖状核酸又は環状核酸であってもよく、一本鎖核酸又は二本鎖核酸であってもよく、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができる。１つの特定の例では、改変カセットは、直鎖状二本鎖ＤＮＡである。
改変カセット内の相同性アームは、本明細書では５’及び３’（すなわち、上流及び下流）相同性アームと呼ばれる。この用語は、改変カセット内の核酸インサートに対する相同性アームの相対位置に関連している。５’及び３’相同性アームは、改変される既存の標的化ベクター内の領域に対応し、これらは、本明細書では、それぞれ「５’標的配列」及び「３’標的配列」と呼ばれる。
相同性アーム及び標的配列は、２つの領域が、相同組換え反応（例えば、細菌相同組換え）の基質として作用するのに十分なレベルの配列同一性を互いに共有する場合、互いに「対応する」又は「対応している」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるか、又は配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と、外因性修復テンプレートに見られる対応する相同性アームとの間の配列同一性は、相同組換えの発生を可能にする任意の程度の配列同一性であってもよい。例えば、外因性修復テンプレート（又はそのフラグメント）の相同性アーム及び標的配列（又はそのフラグメント）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性であってもよい。更に、相同性アームと対応する標的配列との間の対応する相同性領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであってもよい。例えば、相同性アームは、細菌相同組換えに適した任意のサイズであってもよい。例えば、相同性アームは、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチドであってもよい。例えば、相同性アームは、約３５ヌクレオチド～５００ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド、又は約５０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド（例えば、約１００ヌクレオチド）であってもよい。別の例として、相同性アームは、約３５ヌクレオチド長～約２．５ｋｂ長、約３５ヌクレオチド長～約１．５ｋｂ長、又は約３５～約５００ヌクレオチド長であってもよい。例えば、所与の相同性アーム（又は各相同性アーム）及び／又は対応する標的配列は、相同性アームが標的核酸内の対応する標的配列との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有するように、約３５～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１５０、約１５０～約２００、約２００～約２５０、約２５０～約３００、約３００～約３５０、約３５０～約４００、約４００～約４５０、又は約４５０～約５００ヌクレオチド長である対応する相同性領域含むことができる。あるいは、所与の相同性アーム（又は各相同性アーム）及び／又は対応する標的配列は、約０．５ｋｂ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、又は約２ｋｂ～約２．５ｋｂ長である対応する相同性領域を含み得る。例えば、相同性アームは、それぞれ約１００ヌクレオチド長であってもよい。相同性アームは対称的（それぞれの長さがほぼ同じサイズ）であってもよく、非対称的（一方が他方よりも長い）であってもよい。
改変カセットは任意の長さであってもよい。例えば、改変カセットは、約１０ｋｂ～約４００ｋｂ、約２０ｋｂ～約４００ｋｂ、約２０ｋｂ～約３０ｋｂ、約３０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約５０ｋｂ、約５０ｋｂ～約７５ｋｂ、約７５ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ～約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ～約２００ｋｂ、約２００ｋｂ～約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ～約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ～約２７５ｋｂ、又は約２７５ｋｂ～約３００ｋｂ、約２００ｋｂ～約３００ｋｂ、約３００ｋｂ～約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ～約４００ｋｂであってもよい。一例では、改変カセットは、少なくとも約１００ｋｂ又は１００ｋｂ長であってもよい。改変カセットはまた、約５０ｋｂ～約５００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１２５ｋｂ、約３００ｋｂ～約３２５ｋｂ、約３２５ｋｂ～約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ～約３７５ｋｂ、約３７５ｋｂ～約４００ｋｂ、約４００ｋｂ～約４２５ｋｂ、約４２５ｋｂ～約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ～約４７５ｋｂ、又は約４７５ｋｂ～約５００ｋｂであってもよい。あるいは、改変カセットは、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。一例では、改変カセットは、約１ｋｂ～約１５ｋｂ長、又は約１ｋｂ～約１０ｋｂ長（例えば、約１．２ｋｂ、約５ｋｂ、約８ｋｂ、又は約１５ｋｂ）である。
改変カセットは、標的化遺伝子改変を含むことができる。例えば、標的化遺伝子改変は、５’相同性アーム又は３’相同性アームにあってもよい（例えば、標的配列と組換える相同性アームの能力に負の影響を及ぼさない点変異又は小さな欠失、挿入、又は置換などの小さな改変）。あるいは、標的化された遺伝子改変は、挿入核酸にあってもよい（例えば、標的化遺伝子改変が挿入又は置換である場合）。唯一の標的化遺伝子改変が欠失である場合、５’相同性アーム及び３’相同性アームは、既存の標的化ベクターにおいて欠失の標的とされる配列に隣接する５’及び３’標的配列をそれぞれ標的とするように設計することができる。一例として、標的化遺伝子改変は、挿入核酸の第１の反復配列及び／又は第２の反復配列にあってもよい。可能な標的化遺伝子改変のタイプは、本明細書の他の場所でより詳細に開示されている。いくつかの例としては、点変異、欠失、挿入、置換、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
改変カセットの第１及び第２の反復配列は、互いに同一であってもよい。反復配列は、既存の標的化ベクターの配列と同一であってもよい。あるいは、標的化遺伝子改変が挿入（例えば、挿入のみ、又は欠失と組み合わせた挿入（すなわち、置換））を含む場合、反復配列は、挿入の５’末端又は３’末端と同一であってもよい。
反復配列は、インビトロアセンブリ反応における第１の反復配列と第２の反復配列との間のその後のアセンブリに適した任意のサイズであってもよい。一例として、反復配列は、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、又は少なくとも約５０ヌクレオチドを含むことができる。別の例として、反復配列は、約２０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、又は約４０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドの長さを有することができる。特定の例では、反復配列は、約４０ヌクレオチド長～約５０ヌクレオチド長（例えば、約４０ヌクレオチド又は約５０ヌクレオチド）を有することができる。
細菌相同組換えに続いて、選択カセットを含む（及び標的化遺伝子改変を含む）改変標的化ベクターを含む細菌細胞を選択することができる。選択カセット及び選択方法の例は、本明細書の他の場所でより詳細に開示されている。特定の例では、選択カセットは抗生物質に対する耐性を付与する。例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、又はポリミキシンＢのいずれか１つに耐性を付与することができる。いくつかの方法では、既存の標的化ベクターはまた、第２の選択カセットを含む。第２の選択カセットはまた、例えば、抗生物質に対する耐性を付与することができる。改変カセットの選択カセット及び既存の標的化ベクターの第２の選択カセットは、それぞれ、異なる抗生物質に対する耐性を付与することができる。例えば、改変カセットの選択カセットは、第１の抗生物質に対する耐性を付与することができ、既存の標的化ベクターの第２の選択カセットは、第２の異なる抗生物質に対する耐性を付与することができる。いくつかの方法では、第２の選択カセットは、細菌細胞と真核生物又は哺乳動物細胞の両方での選択を可能にすることができる。
選択に続いて、改変標的化ベクターの第１の標的部位を第１のヌクレアーゼ剤で切断し、改変標的化ベクターの第２の標的部位を第２のヌクレアーゼ剤で切断して、選択カセットを除去し、改変標的化ベクターの第１の反復配列及び第２の反復配列を露出させることができる。例えば、このステップはインビトロで実行することができる。一例として、細菌相同組換え及び選択に続いて細菌細胞からＤＮＡを単離することができ、その後、改変標的化ベクターの第１の標的部位をインビトロで第１のヌクレアーゼ剤で切断し、改変標的化の第２の標的部位をインビトロで第２のヌクレアーゼ剤で切断して、選択カセットを除去し、改変標的化ベクターの第１の反復配列及び第２の反復配列を露出させることができる。
第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、本明細書の他の場所に記載されているように、レアカットヌクレアーゼ剤であってもよい。例えば、いくつかの方法では、第１の標的部位及び／又は第２の標的部位は、既存の標的化ベクターに存在しない。第１及び第２の標的部位は異なっていてもよく、又は第１の標的部位は第２の標的部位と同一であってもよく、第１のヌクレアーゼ剤は第２のヌクレアーゼ剤と同一であってもよい。第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、平滑末端、５’オーバーハング、又は３’オーバーハングを生成することができる。一例では、第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、３’オーバーハングを生成する。
１つの特定の例では、第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、制限酵素又はレアカット制限酵素である。レアカット制限酵素の例としては、本明細書の他の場所に開示されているが、例えば、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＳｓｔＩＩ、Ｓａｌｌ、ＮｒｕＩ、ＮｈｅＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＣＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＳｂｆＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｗａＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｆｉＩ、ＣｓｐＣＩ、ＡｂｓＩ、ＣｃｉＮＩ、ＦｓｐＡＩ、ＭａｕＢＩ、ＭｒｅＩ、ＭｓｓＩ、ＰａｌＡＩ、ＲｇａＩ、ＲｉｇＩ、ＳｄａＩ、ＳｆａＡＩ、ＳｇｆＩ、ＳｇｒＤＩ、ＳｇｓＩ、ＳｍｉＩ、ＳｒｆＩ、Ｓｓｅ２３２１、Ｓｓｅ８３８７１、ＬｇｕＩ、ＰｃｉＳＩ、ＡａｒＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｒＩ、ＰｐｉＩ、及びＰｓｒＩを挙げることができる。
別の特定の例では、第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、操作されたヌクレアーゼ剤であってもよい。例えば、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（例えば、Ｃａｓ９並びにＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むｇＲＮＡ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又は操作されたメガヌクレアーゼであってもよい。
切断／消化に続いて、露出された第１の反復配列を露出された第２の反復配列と分子内インビトロアセンブリ反応においてアセンブルして、瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む標的化ベクターを生成することができる。例えば、いくつかのそのような方法では、瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む標的化ベクター中に、第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位も第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位も存在しない（すなわち、インビトロアセンブリ後）。同様に、いくつかのそのような方法では、瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む標的化ベクター中に、反復配列の単一コピーのみが存在する（すなわち、インビトロアセンブリ後）。
任意の適切なインビトロアセンブリ方法を使用することができる。１つの特定の例では、インビトロアセンブリステップは、改変標的化ベクターをエキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼと共にインキュベートすることを含むことができる。例えば、インビトロアセンブリ法は、改変標的化ベクターをエキソヌクレアーゼと接触させて、第１の反復配列と第２の反復配列との間の相補配列を露出させ、露出した相補配列をアニーリングし、アニーリングした相補配列の３’末端を伸長し、アニーリングした相補配列をライゲーションすることを含むことができる。インビトロアセンブリ法の例は、本明細書の他の場所でより詳細に論じられている。
いくつかの方法では、バックグラウンドを低減するために、インビトロアセンブリによって生成されたベクターを第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤で処理してバックグラウンドを低減することができる（例えば、アセンブルに成功せず、したがって第１のヌクレアーゼ剤又は第２のヌクレアーゼ剤の標的部位を依然として含有する任意の標的化ベクターを切断することによって）。そのようなステップは、第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位も第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位も存在しないことを検証するのに役立ち得る。
ＩＩＩ．細菌相同組換え及び分子間インビトロアセンブリを介した標的化ベクターへの標的化改変の瘢痕のない導入
既存の標的化ベクターへの標的化遺伝子改変の瘢痕のない導入のために本明細書に開示される他の方法は、分子間アセンブリのためのインビトロアセンブリ法を利用する。一例として、そのような方法は、細菌細胞の集団において既存の標的化ベクターと欠失カセットとの間で細菌相同組換えを実施することを含むことができる。欠失カセットは、既存の標的化ベクターの５’標的配列に対応する５’相同性アーム及び既存のベクターの３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含むことができる。５’標的配列及び３’標的配列一族は、標的化遺伝子改変が導入される既存の標的化ベクターの領域に隣接している。挿入核酸は、１つ又は複数のヌクレアーゼ剤（例えば、レアカットヌクレアーゼ剤）の標的部位に隣接する選択カセットを含むことができる。例えば、挿入核酸は、５’から３’の（１）第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位、（２）選択カセット、（３）第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位を含むことができる。
既存の標的化ベクターは、任意のサイズの任意のタイプの標的化ベクターであってもよい。特定の例では、既存の標的化ベクターは、少なくとも約１０ｋｂ長の大きな標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。別の例では、少なくとも約１００ｋｂ長である。標的化ベクターは、本明細書の他の場所でより詳細に論じられている。
欠失カセットは、直鎖状核酸又は環状核酸であってもよく、一本鎖核酸又は二本鎖核酸であってもよく、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができる。１つの特定の例では、改変カセットは、直鎖状二本鎖ＤＮＡである。
欠失カセット内の相同性アームは、本明細書では５’及び３’（すなわち、上流及び下流）相同性アームと呼ばれる。この用語は、欠失カセット内の核酸インサートに対する相同性アームの相対位置に関連している。５’及び３’相同性アームは、改変される既存の標的化ベクター内の領域に対応し、これらは、本明細書では、それぞれ「５’標的配列」及び「３’標的配列」と呼ばれる。
相同性アーム及び標的配列は、２つの領域が、相同組換え反応（例えば、細菌相同組換え）の基質として作用するのに十分なレベルの配列同一性を互いに共有する場合、互いに「対応する」又は「対応している」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるか、又は配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と、外因性修復テンプレートに見られる対応する相同性アームとの間の配列同一性は、相同組換えの発生を可能にする任意の程度の配列同一性であってもよい。例えば、外因性修復テンプレート（又はそのフラグメント）の相同性アーム及び標的配列（又はそのフラグメント）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性であってもよい。更に、相同性アームと対応する標的配列との間の対応する相同性領域は、相同組換えを促進するのに十分な任意の長さであってもよい。例えば、相同性アームは、細菌相同組換えに適した任意のサイズであってもよい。例えば、相同性アームは、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチドであってもよい。例えば、相同性アームは、約３５ヌクレオチド～５００ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド、又は約５０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド（例えば、約１００ヌクレオチド）であってもよい。別の例として、相同性アームは、約３５ヌクレオチド長～約２．５ｋｂ長、約３５ヌクレオチド長～約１．５ｋｂ長、又は約３５～約５００ヌクレオチド長であってもよい。例えば、所与の相同性アーム（又は各相同性アーム）及び／又は対応する標的配列は、相同性アームが標的核酸内の対応する標的配列との相同組換えを受けるのに十分な相同性を有するように、約３５～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１５０、約１５０～約２００、約２００～約２５０、約２５０～約３００、約３００～約３５０、約３５０～約４００、約４００～約４５０、又は約４５０～約５００ヌクレオチド長である対応する相同性領域含むことができる。あるいは、所与の相同性アーム（又は各相同性アーム）及び／又は対応する標的配列は、約０．５ｋｂ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、又は約２ｋｂ～約２．５ｋｂ長である対応する相同性領域を含み得る。例えば、相同性アームは、それぞれ約１００ヌクレオチド長であってもよい。相同性アームは対称的（それぞれの長さがほぼ同じサイズ）であってもよく、非対称的（一方が他方よりも長い）であってもよい。
欠失カセットは任意の長さであってもよい。例えば、欠失カセットは、約１０ｋｂ～約４００ｋｂ、約２０ｋｂ～約４００ｋｂ、約２０ｋｂ～約３０ｋｂ、約３０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約５０ｋｂ、約５０ｋｂ～約７５ｋｂ、約７５ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ～約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ～約２００ｋｂ、約２００ｋｂ～約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ～約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ～約２７５ｋｂ、又は約２７５ｋｂ～約３００ｋｂ、約２００ｋｂ～約３００ｋｂ、約３００ｋｂ～約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ～約４００ｋｂであってもよい。一例では、欠失カセットは、少なくとも約１００ｋｂ又は１００ｋｂ長であってもよい。欠失カセットはまた、約５０ｋｂ～約５００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１２５ｋｂ、約３００ｋｂ～約３２５ｋｂ、約３２５ｋｂ～約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ～約３７５ｋｂ、約３７５ｋｂ～約４００ｋｂ、約４００ｋｂ～約４２５ｋｂ、約４２５ｋｂ～約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ～約４７５ｋｂ、又は約４７５ｋｂ～約５００ｋｂであってもよい。あるいは、欠失カセットは、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。一例では、欠失カセットは、約１ｋｂ～約１５ｋｂ長、又は約１ｋｂ～約１０ｋｂ長（例えば、約１．２ｋｂ、約５ｋｂ、約８ｋｂ、又は約１５ｋｂ）である。
細菌相同組換えに続いて、選択カセットを含む改変標的化ベクターを含む細菌細胞を選択することができる。選択カセット及び選択方法の例は、本明細書の他の場所でより詳細に開示されている。特定の例では、選択カセットは抗生物質に対する耐性を付与する。例えば、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、又はポリミキシンＢのいずれか１つに耐性を付与することができる。いくつかの方法では、既存の標的化ベクターはまた、第２の選択カセットを含む。第２の選択カセットはまた、例えば、抗生物質に対する耐性を付与することができる。欠失カセットの選択カセット及び既存の標的化ベクターの第２の選択カセットは、それぞれ、異なる抗生物質に対する耐性を付与することができる。例えば、欠失カセットの選択カセットは、第１の抗生物質に対する耐性を付与することができ、既存の標的化ベクターの第２の選択カセットは、第２の異なる抗生物質に対する耐性を付与することができる。いくつかの方法では、第２の選択カセットは、細菌細胞と真核生物又は哺乳動物細胞の両方での選択を可能にすることができる。
選択に続いて、改変標的化ベクターの第１の標的部位を第１のヌクレアーゼ剤で切断し、改変標的化ベクターの第２の標的部位を第２のヌクレアーゼ剤で切断して、選択カセットを除去し、改変標的化ベクターの上流末端配列及び下流末端配列を露出させることができる。例えば、このステップはインビトロで実行することができる。一例として、細菌相同組換え及び選択に続いて細菌細胞からＤＮＡを単離することができ、その後、改変標的化ベクターの第１の標的部位をインビトロで第１のヌクレアーゼ剤で切断し、改変標的化の第２の標的部位をインビトロで第２のヌクレアーゼ剤で切断して、選択カセットを除去し、改変標的化ベクターの上流末端配列及び下流末端配列を露出させることができる。
第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、本明細書の他の場所に記載されているように、レアカットヌクレアーゼ剤であってもよい。例えば、いくつかの方法では、第１の標的部位及び／又は第２の標的部位は、既存の標的化ベクターに存在しない。第１及び第２の標的部位は異なっていてもよく、又は第１の標的部位は第２の標的部位と同一であってもよく、第１のヌクレアーゼ剤は第２のヌクレアーゼ剤と同一であってもよい。第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、平滑末端、５’オーバーハング、又は３’オーバーハングを生成することができる。一例では、第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、３’オーバーハングを生成する。
１つの特定の例では、第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、制限酵素又はレアカット制限酵素である。レアカット制限酵素の例としては、本明細書の他の場所に開示されているが、例えば、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＳｓｔＩＩ、Ｓａｌｌ、ＮｒｕＩ、ＮｈｅＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＣＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＳｂｆＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｗａＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｆｉＩ、ＣｓｐＣＩ、ＡｂｓＩ、ＣｃｉＮＩ、ＦｓｐＡＩ、ＭａｕＢＩ、ＭｒｅＩ、ＭｓｓＩ、ＰａｌＡＩ、ＲｇａＩ、ＲｉｇＩ、ＳｄａＩ、ＳｆａＡＩ、ＳｇｆＩ、ＳｇｒＤＩ、ＳｇｓＩ、ＳｍｉＩ、ＳｒｆＩ、Ｓｓｅ２３２１、Ｓｓｅ８３８７１、ＬｇｕＩ、ＰｃｉＳＩ、ＡａｒＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｒＩ、ＰｐｉＩ、及びＰｓｒＩを挙げることができる。
別の特定の例では、第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤は、操作されたヌクレアーゼ剤であってもよい。例えば、ヌクレアーゼ剤は、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（例えば、Ｃａｓ９並びにＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含むｇＲＮＡ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、又は操作されたメガヌクレアーゼであってもよい。
切断／消化に続いて、インビトロ分子間アセンブリ反応において、切断された標的化ベクターを、改変標的化ベクターの上流末端配列と重複する上流末端配列及び改変標的化ベクターの下流末端配列と重複する下流末端配列と隣接する標的化遺伝子改変を含む改変カセットとアセンブルして、瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む標的化ベクターを生成することができる。例えば、いくつかのそのような方法では、瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む標的化ベクター中に、第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位も第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位も存在しない。
任意の適切なインビトロアセンブリ方法を使用することができる。１つの特定の例では、インビトロアセンブリステップは、切断された標的化ベクター及び改変カセットをエキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼと共にインキュベートすることを含むことができる。例えば、インビトロアセンブリ法は、切断された標的化ベクター及び改変カセットをエキソヌクレアーゼと接触させて、改変標的化ベクターの末端配列と改変カセットの末端配列との間の相補配列を露出させ、露出した相補配列をアニーリングして、アニーリングした相補配列の３’末端を伸長し、アニーリングした相補配列をライゲーションすることを含むことができる。
改変カセットは、直鎖状核酸又は環状核酸であってもよく、一本鎖核酸又は二本鎖核酸であってもよく、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができる。１つの特定の例では、改変カセットは、直鎖状二本鎖ＤＮＡである。
改変カセットは任意の長さであってもよい。例えば、改変カセットは、約１０ｋｂ～約４００ｋｂ、約２０ｋｂ～約４００ｋｂ、約２０ｋｂ～約３０ｋｂ、約３０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約５０ｋｂ、約５０ｋｂ～約７５ｋｂ、約７５ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ～約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ～約２００ｋｂ、約２００ｋｂ～約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ～約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ～約２７５ｋｂ、又は約２７５ｋｂ～約３００ｋｂ、約２００ｋｂ～約３００ｋｂ、約３００ｋｂ～約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ～約４００ｋｂであってもよい。一例では、改変カセットは、少なくとも約１００ｋｂ又は１００ｋｂ長であってもよい。改変カセットはまた、約５０ｋｂ～約５００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１２５ｋｂ、約３００ｋｂ～約３２５ｋｂ、約３２５ｋｂ～約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ～約３７５ｋｂ、約３７５ｋｂ～約４００ｋｂ、約４００ｋｂ～約４２５ｋｂ、約４２５ｋｂ～約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ～約４７５ｋｂ、又は約４７５ｋｂ～約５００ｋｂであってもよい。あるいは、改変カセットは、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。１つの特定の例では、改変カセットは、約４００ｂｐ～約２ｋｂ長である。別の例では、改変カセットは、約１ｋｂ～約１５ｋｂ長、又は約１ｋｂ～約１０ｋｂ長（例えば、約１．２ｋｂ、約５ｋｂ、約８ｋｂ、又は約１５ｋｂ）である。特定の例では、改変カセットは少なくとも約２００ヌクレオチド長である。別の特定の例では、改変カセットは、ポリメラーゼ連鎖反応によって直接合成又は生成することができないサイズである。例えば、改変カセットは、少なくとも約５ｋｂ、少なくとも約１０ｋｂ、少なくとも約１５ｋｂ、少なくとも約２０ｋｂ、少なくとも約２５ｋｂ、又は少なくとも約３０ｋｂ長であってもよい。
改変カセットにおける上流末端配列と改変標的化ベクターにおける上流末端配列との間の重複の長さ、及び／又は改変カセットにおける下流末端配列と改変標的化ベクターにおける下流末端配列との間の重複の長さは、インビトロアセンブリ反応に適した任意の長さであってもよい。一例として、重複の長さは、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、又は少なくとも約５０ヌクレオチドを含むことができる。別の例として、重複の長さは、約２０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、又は約４０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドであってもよい。特定の例では、重複の長さは、約４０ヌクレオチド長～約５０ヌクレオチド長（例えば、約４０ヌクレオチド又は約５０ヌクレオチド）であってもよい。
改変カセットは、標的化遺伝子改変を含むことができる。標的化遺伝子改変のタイプは、本明細書の他の場所でより詳細に開示されている。いくつかの例としては、点変異、欠失、挿入、置換、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
いくつかの方法では、バックグラウンドを低減するために、インビトロアセンブリによって生成されたベクターを第１のヌクレアーゼ剤及び／又は第２のヌクレアーゼ剤で処理してバックグラウンドを低減することができる（例えば、アセンブルに成功せず、したがって第１のヌクレアーゼ剤又は第２のヌクレアーゼ剤の標的部位を依然として含有する任意の標的化ベクターを切断することによって）。そのようなステップは、第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位も第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位も存在しないことを検証するのに役立ち得る。
ＩＶ．細菌相同組換え
任意の適切な細菌相同組換え（ＢＨＲ）法を、本明細書に開示される方法で使用することができる。細菌相同組換えは、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）などの細菌細胞における相同組換えを媒介する遺伝子の一過性の制御された発現を伴い、それにより、細菌が、改変カセットと短い相同ストレッチを共有する標的化ベクター（例えば、大きな標的化ベクター）との間の組換えを媒介することを可能にする。例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２００４／００１８６２６及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（６）：６５２－６５９を参照されたい。
短い相同ストレッチは、上流の相同性領域及び下流の相同性領域を含むことができる。相同性領域は、細菌相同組換えに適した任意のサイズであってもよい。例えば、相同性領域は、細菌相同組換えに適した任意のサイズであってもよい。例えば、相同性領域は、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約６０ヌクレオチド、少なくとも約７０ヌクレオチド、少なくとも約８０ヌクレオチド、少なくとも約９０ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチドであってもよい。例えば、相同性領域は、約３５ヌクレオチド～５００ヌクレオチド、約７５ヌクレオチド～約５００ヌクレオチド、又は約５０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド（例えば、約１００ヌクレオチド）であってもよい。別の例として、相同性領域は、約３５ヌクレオチド長～約２．５ｋｂ長、約３５ヌクレオチド長～約１．５ｋｂ長、又は約３５～約５００ヌクレオチド長であってもよい。例えば、相同性領域は、約３５～約４０、約４０～約５０、約５０～約６０、約６０～約７０、約７０～約８０、約８０～約９０、約９０～約１００、約１００～約１５０、約１５０～約２００、約２００～約２５０、約２５０～約３００、約３００～約３５０、約３５０～約４００、約４００～約４５０、又は約４５０～約５００ヌクレオチド長であってもよい。あるいは、相同性領域は、約０．５ｋｂ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約１．５ｋｂ、約１．５ｋｂ～約２ｋｂ、又は約２ｋｂ～約２．５ｋｂ長であってもよい。例えば、相同性領域は、約１００ヌクレオチド長であってもよい。
細菌相同組換えを使用して標的化ベクターを改変する技術は、種々の系において実施することができる（例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＹａｎｇら（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：８５９－６５；Ｍｕｙｒｅｒｓら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２７：１５５５－１５５７；Ａｎｇｒａｎｄら（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２７：ｅ１６；Ｎａｒａｙａｎａｎら（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６：４４２－４４７；及びＹｕら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：５９７８－５９８３を参照されたい）。一例は、ＥＴクローニング（それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈａｎｇら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１２３－１２８及びＮａｒａｙａｎａｎら（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，６：４４２－４４７）、及びこの技術の変形（全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｕら（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：５９７８－５９８３）である。ＥＴとは、相同組換え反応を行うｒｅｃＥ及びｒｅｃＴタンパク質を指す。ＲｅｃＥは、直鎖状二本鎖ＤＮＡの一方の鎖を５’から３’にトリミングし、したがって３’一本鎖オーバーハングを有する直鎖状二本鎖フラグメントを残すエキソヌクレアーゼである。この一本鎖オーバーハングは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）結合活性を有するｒｅｃＴタンパク質でコードされる。ＥＴクローニングは、ｒｅｃＥ及びｒｅｃＴの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）遺伝子産物とバクテリオファージラムダ（λ）タンパク質λｇａｍを一時的に発現する大腸菌を使用して実行される。λｇａｍタンパク質は、ドナーＤＮＡフラグメントをｒｅｃＢＣエキソヌクレアーゼシステムによる分解から保護するために必要であり、頻繁に使用される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ１０ｂなどのｒｅｃＢＣ＋宿主での効率的なＥＴクローニングに必要である。
Ｖ．インビトロアセンブリ
ＤＮＡ分子を結合して実質的に無傷のＤＮＡ分子を形成するのに有効な条件下で少なくとも２つの核酸又は単一の核酸の少なくとも２つの末端をアセンブルするために使用できる任意のインビトロアセンブリ法を本明細書に記載の方法で使用することができる。インビトロアセンブリ法のいくつかの非限定的な例としては、制限酵素を使用する標準アセンブリ、注入アセンブリ、配列及びリガーゼ非依存性クローニング（ＳＬＩＣ）、ギブソンアセンブリ、及びゴールデンゲートアセンブリが挙げられる。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｅｅら、（２０１３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ ３５：３５９－３７０を参照されたい。
適切なインビトロアセンブリ法の一例は、エキソヌクレアーゼ（例えば、５’エキソヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼの協調作用によって重複するＤＮＡ分子をアセンブルするための等温の単一反応法である。重複する末端を有する核酸（又は重複する末端を有する単一の直鎖状核酸）は、リガーゼ、エキソヌクレアーゼ、及びＤＮＡポリメラーゼと組み合わせることができる。例えば、末端配列の重複を共有する２つの隣接するＤＮＡフラグメントは、１ステップの等温反応で共有結合で密封された分子に結合できる。特定の例では、アセンブルされる２つ以上のＤＮＡ分子を、単一の容器内でインビトロで（ａ）３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く単離された非耐熱性５’から３’エキソヌクレアーゼ（例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の末端を破壊して、重複領域を含む一本鎖オーバーハングを露出させる非プロセッシブエキソヌクレアーゼ）、（ｂ）クラウディング剤（他の機能の中でも、核酸アニーリングを加速することができ、その結果、一本鎖オーバーハングが特異的にアニーリング（ハイブリダイズ）される）、（ｃ）３’エキソヌクレアーゼ活性を有する単離された熱安定性非鎖置換ＤＮＡポリメラーゼ、又は３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く第２のＤＮＡポリメラーゼとの当該ＤＮＡポリメラーゼの混合物（アニールされた領域の３’端を伸長することによって、アニールされた分子の残りの一本鎖ギャップを埋めるため）、（ｄ）単離された耐熱性リガーゼ（こうして形成されたニックを密封（結紮）する）、（ｅ）ｄＮＴＰの混合物及び（ｆ）２つ以上のＤＮＡ分子を結合して、ワンステップ反応で最初にアセンブルされたｄｓＤＮＡ分子を形成するのに有効な条件下での適切な緩衝液と接触させることができる。一本鎖分子の場合、エキソヌクレアーゼを省略することができますが、省略する必要はない。特定の例では、Ｔ５エキソヌクレアーゼが二本鎖ＤＮＡ分子の５’末端からヌクレオチドを除去し、相補的な一本鎖ＤＮＡオーバーハングがアニーリングされ、Ｐｈｕｓｉｏｎ ＤＮＡポリメラーゼがギャップを埋め、ＴａｑＤＮＡリガーゼがニックを密封する。例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１０／００３５７６８号、米国特許第２０１５／０３７６６２８号、国際公開第２０１５／２００３３４号、及びＧｉｂｓｏｎら（２００９）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６（５）：３４３－３４５を参照されたい。
第１及び第２の一本鎖核酸は、それらのそれぞれの末端が互いに相補的である場合、重複する末端を有する。第１及び第２の二本鎖核酸は、第１の核酸の鎖の５’末端が第２の核酸の鎖の３’末端に相補的である場合、及びその逆の場合、重複する末端を有する。例えば、二本鎖重複末端配列の場合、１つの核酸の鎖は、他の核酸の対応する鎖に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％の同一性を有することができる。本明細書に開示される方法では、アセンブルされるｄｓＤＮＡ分子の鎖の５’末端は、他のｄｓＤＮＡ分子の鎖の３’末端と重複する末端配列を共有する。重複する末端配列という用語には、ｄｓＤＮＡ分子の両方の鎖が含まれる。したがって、重複配列の相補的領域が、アセンブルされる２つのポリヌクレオチドの５’及び３’末端からの一本鎖オーバーハングで提示される場合、重複領域からの１つの鎖は、その相補鎖に特異的にハイブリダイズすることができる。エキソヌクレアーゼを使用して、５’又は３’末端からヌクレオチドを除去し、オーバーハングした末端配列を生成することができる。
重複領域の長さは、その領域がアセンブルされている核酸のいずれか内で一度だけ発生するように十分な長さであってもよい。したがって、他のポリヌクレオチドは、末端配列とのアニーリングが妨げられ、アセンブリは、標的核酸に特異的であってもよい。一例として、重複の長さは、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、又は少なくとも約５０ヌクレオチドを含むことができる。別の例として、重複の長さは、約２０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、又は約４０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチドであってもよい。特定の例では、重複の長さは、約４０ヌクレオチド長～約５０ヌクレオチド長（例えば、約４０ヌクレオチド又は約５０ヌクレオチド）であってもよい。
重複する配列をエキソヌクレアーゼと接触させて、重複する配列間の相補的な配列（例えば、相補的な一本鎖配列）を露出させることができる。エキソヌクレアーゼ消化は、相補性の露出した一本鎖領域の特異的アニーリングを可能にするのに十分な数のヌクレオチドを除去（破壊する）するのに効果的な条件下で実施することができる。一般に、重複領域の一部又はオーバーラップ領域全体が破壊され、重複領域の一部又は重複領域全体を構成するオーバーハングが残る。いくつかの方法では、エキソヌクレアーゼ消化は、ｄＮＴＰの非存在下でポリメラーゼ（例えば、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ）によって実施することができるが、他の方法では、エキソヌクレアーゼ消化は、ポリメラーゼ活性を欠くｄＮＴＰの存在下でエキソヌクレアーゼ（例えば、エキソヌクレアーゼＩＩＩ）によって実施することができる。
本明細書に開示される方法では、様々な５’から３’の二本鎖特異的エキソデオキシリボヌクレアーゼのいずれかを使用して、核酸の末端を破壊することできる。５’エキソヌクレアーゼという用語は、本明細書では、５’から３’へのエキソヌクレアーゼを指すために使用されることがある。非プロセッシブエキソヌクレアーゼとは、各ＤＮＡ結合イベント中に限られた数（例えば、ほんの数個）のヌクレオチドを分解するエキソヌクレアーゼを指す。５’エキソヌクレアーゼで消化すると、ＤＮＡ分子に３’一本鎖オーバーハングが生成される。インビトロアセンブリ法で使用される５’エキソヌクレアーゼは、３’エキソヌクレアーゼ活性を欠く可能性があり、５’リン酸末端を生成することができ、５’リン酸化末端と非リン酸化末端の両方から分解を開始することができる。本明細書に記載のインビトロアセンブリ法で使用されるエキソヌクレアーゼは、それが平滑末端であるか、又はそれが小さな５’又は３’陥凹末端を有するかにかかわらず、分子の５’末端から消化を開始することができる。適切なエキソヌクレアーゼは公知であり、例えば、ファージＴ５エキソヌクレアーゼ（ファージＴ５遺伝子Ｄ１５産物）、ファージラムダエキソヌクレアーゼ、ＲａｃプロファージのＲｅｃＥ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のエキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、ファージＴ７エキソヌクレアーゼ（ファージＴ７遺伝子６産物）、又は相同組換え反応に関与する様々な５’エキソヌクレアーゼのいずれかが挙げられる。一例として、エキソヌクレアーゼは、Ｔ５エキソヌクレアーゼ又はラムダエキソヌクレアーゼである。特定の例では、エキソヌクレアーゼはＴ５エキソヌクレアーゼである。別の特定の例では、エキソヌクレアーゼはファージＴ７エキソヌクレアーゼではない。
重複領域が長い状況では、このように生成された一本鎖オーバーハングが、特に反応の条件下でアニーリングするのに十分な長さと塩基含有量であるという条件で、領域の一部を破壊することのみが必要であり得る。アニーリングという用語は、具体的には、一本鎖オーバーハングの特定のペアが、反応混合物に存在する他の一本鎖オーバーハング（例えば、非相補的オーバーハング）ではなく、互いに優先的に（又は排他的に）アニーリングする状況を含む。優先的には、オーバーハングの少なくとも約９５％が相補的なオーバーハングにアニーリングすることを意味する。一般に、重複する相同領域（一本鎖オーバーハング又はそれらの補体）は同一の配列を含む。しかし、一本鎖オーバーハングが反応の条件下で特異的にアニーリングできるという条件で、部分的に同一の配列を使用することができる。
一本鎖ＤＮＡ（例えば、結合されるＤＮＡ分子がｄｓＤＮＡである場合にエキソヌクレアーゼの作用によって生成されるオーバーハング又は各鎖の異なる標的部位にニックを作成することによって生成されるオーバーハング）のアニーリングに続いて、エキソヌクレアーゼによって残される一本鎖ギャップは、適切な非鎖置換ＤＮＡポリメラーゼで充填することができ、こうして形成されたニックをリガーゼで密封することができる。本明細書で使用される非鎖置換ＤＮＡポリメラーゼは、ｄｓＤＮＡ分子をコピーするように進行する際にその経路に存在するＤＮＡ鎖に遭遇する場合にＤＮＡの合成を終了するか、又は進行中に遭遇したＤＮＡ鎖を分解し、同時にこのようにして生成されたギャップを充填し、それによって移動ニック（ニックトランスレーション）を生成するＤＮＡポリメラーゼである。
第１のポリヌクレオチドの一本鎖を第２のポリヌクレオチドの相補鎖にアニーリングした後、第１のポリヌクレオチドの３’末端は、第２のポリヌクレオチド鎖のテンプレートに基づいて伸長することができ、第２のポリヌクレオチド鎖の３’末端は、第１のポリヌクレオチド鎖のテンプレートに基づいて伸長することができる。各ポリヌクレオチドの相補的な３’末端を伸長することにより、ポリヌクレオチドをアセンブルすることができる。アセンブリに続いて、一方のフラグメントからの鎖の伸長された３’末端と他方のフラグメントからの鎖の隣接する５’末端との間のニックをライゲーションによって密封することができる。より具体的には、第１のポリヌクレオチドの伸長された３’末端のヒドロキシル基は、第２のポリヌクレオチドの５’末端のリン酸基にライゲーションすることができ、第２のポリヌクレオチドの伸長された３’末端のヒドロキシル基は、第１のポリヌクレオチドの５’末端のリン酸基にライゲーションすることができる。
ライゲーション反応は、様々な適切な耐熱性ＤＮＡリガーゼのいずれかによって実施することができる。適切なリガーゼの中には、例えば、Ｔａｑリガーゼ、アンプリガーゼ熱安定性ＤＮＡリガーゼ、又は全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，５７６，４５３号に開示されている熱安定性リガーゼがある。
反応混合物中の適切な量のＰＥＧなどのクラウディング剤は、分子クラウディングを可能にし、増強し、又は促進することができる。そのようなクラウディング剤は、溶液の構成要素が互いにより密接に接触することを可能にすることができる。例えば、組換えられるＤＮＡ分子はより接近することができ、これにより、一本鎖オーバーハングのアニーリングが容易になる。適切なクラウディング剤は既知であり、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー、フィコール７０などのフィコール、又はデキストラン７０などのデキストランなどの様々な公知の高分子が含まれる。
アセンブリ反応混合物に存在する反応構成要素（塩、バッファ、適切なエネルギー源（ＡＴＰ又はＮＡＤなど）、反応混合物のｐＨなど）は、個々の酵素（エキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、及びリガーゼ）にとって最適ではない可能性があるが、一連の反応全体に有効な妥協点として機能し得る。
ＶＩ．標的化ベクター及びラージ標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）
本明細書に開示される方法で使用される標的化ベクターは、任意の適切な標的化ベクターであってもよい。標的化ベクターは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）を含むことができ、それらは一本鎖又は二本鎖であってもよく、そしてそれらは直鎖状又は環状の形態であってもよい。標的化ベクターは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、改変ＢＡＣ、又はＢＡＣのフラグメントであってもよい。標的化ベクターは、ヒトＤＮＡ、齧歯類ＤＮＡ（例えば、マウスＤＮＡ又はラットＤＮＡ）、合成ＤＮＡ、又はそれらの任意の組み合わせを含むことができる。
本明細書に開示される方法で使用されるいくつかの標的化ベクターは、ラージ標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）である。ＬＴＶＥＣには、細胞内で相同組換えを行うことを目的とした他のアプローチで通常使用されるものよりも大きい核酸配列に対応し、それに由来する相同性アームを含む標的化ベクターが含まれる。ＬＴＶＥＣにはまた、細胞内で相同組換えを行うことを目的とした他のアプローチで通常使用されるものよりも大きい核酸配列を有する核酸インサートを含む標的化ベクターが含まれる。例えば、ＬＴＶＥＣは、サイズの制限のために従来のプラスミドベースの標的化ベクターでは対応できない大きな遺伝子座の変更を可能にする。例えば、標的化された遺伝子座は、従来の方法を使用して標的化できないか、又はヌクレアーゼ剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導されるニックもしくは二本鎖切断の非存在下で不正確にのみ、又は有意に低い効率でのみ標的化され得る細胞の遺伝子座であってもよい（すなわち、５’及び３’相同性アームが対応し得る）。ＬＴＶＥＣの例としては、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）に由来するベクターが挙げられる。ＬＴＶＥＣの非限定的な例及びそれらを作成するための方法は、例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５８６，２５１号、同第６，５９６，５４１号及び同第７，１０５，３４８号、及び国際公開第２００２／０３６７８９号に記載されている。ＬＴＶＥＣは、直鎖状の形態又は環状の形態であってもよい。ＬＴＶＥＣは任意の長さであってもよく、通常は少なくとも１０ｋｂ長である。ＬＴＶＥＣのサイズが大きすぎて、従来のアッセイ、例えばサザンブロッティング及び長距離（例えば、１ｋｂ～５ｋｂ）ＰＣＲによる標的化イベントのスクリーニングができない場合がある。
本明細書に開示される方法で使用される標的化ベクター（例えば、ＬＴＶＥＣ）は、任意の長さであってもよい。例えば、標的化ベクターは、約１０ｋｂ～約４００ｋｂ、約２０ｋｂ～約４００ｋｂ、約２０ｋｂ～約３０ｋｂ、約３０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約５０ｋｂ、約５０ｋｂ～約７５ｋｂ、約７５ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～１２５ｋｂ、約１２５ｋｂ～約１５０ｋｂ、約１５０ｋｂ～約１７５ｋｂ、約１７５ｋｂ～約２００ｋｂ、約２００ｋｂ～約２２５ｋｂ、約２２５ｋｂ～約２５０ｋｂ、約２５０ｋｂ～約２７５ｋｂ、又は約２７５ｋｂ～約３００ｋｂ、約２００ｋｂ～約３００ｋｂ、約３００ｋｂ～約３５０ｋｂ、又は約３５０ｋｂ～約４００ｋｂであってもよい。一例では、標的化ベクターは、少なくとも約１００ｋｂ又は１００ｋｂ長であってもよい。標的化ベクターはまた、約５０ｋｂ～約５００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１２５ｋｂ、約３００ｋｂ～約３２５ｋｂ、約３２５ｋｂ～約３５０ｋｂ、約３５０ｋｂ～約３７５ｋｂ、約３７５ｋｂ～約４００ｋｂ、約４００ｋｂ～約４２５ｋｂ、約４２５ｋｂ～約４５０ｋｂ、約４５０ｋｂ～約４７５ｋｂ、又は約４７５ｋｂ～約５００ｋｂであってもよい。あるいは、標的化ベクターは、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１５０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２５０ｋｂ、少なくとも３００ｋｂ、少なくとも３５０ｋｂ、少なくとも４００ｋｂ、少なくとも４５０ｋｂ、又は少なくとも５００ｋｂ以上であってもよい。
ＶＩＩ．ヌクレアーゼ剤
任意のレアカットヌクレアーゼ剤を、本明細書に開示される方法で使用することができる。レアカットヌクレアーゼ剤は、ゲノム内ではめったに発生しない標的配列又は認識配列を持つヌクレアーゼ剤である。同様に、本明細書に記載の標的化ベクターにおいて意図された切断部位の外側に存在しない標的配列又は認識配列を有する任意のヌクレアーゼ剤を使用することができる。例えば、本明細書に記載の方法において既存の標的化ベクターに標的配列又は認識配列を有さない任意のヌクレアーゼ剤を使用することができる。
所望の標的配列でニック又は二本鎖切断を誘導する上記の任意のヌクレアーゼ剤を、本明細書に開示される方法及び組成物で使用することができる。ヌクレアーゼ剤が所望の標的配列においてニック又は二本鎖切断を誘導する限り、天然に存在する又は天然のヌクレアーゼ剤を使用することができる。あるいは、改変又は操作されたヌクレアーゼ剤を使用することができる。「操作されたヌクレアーゼ剤」は、その天然の形態から操作された（改変又は誘導された）ヌクレアーゼを含み、所望の標的配列においてニック又は二本鎖切断を特異的に認識及び誘導する。したがって、操作されたヌクレアーゼ剤は、天然の天然に存在するヌクレアーゼ剤から誘導することができ、又は人工的に作成又は合成することができる。操作されたヌクレアーゼは、例えば、標的配列においてニック又は二本鎖切断を誘発することができ、標的配列は、天然の（非操作又は非改変）ヌクレアーゼ剤によって認識された配列ではない。ヌクレアーゼ剤の改変は、タンパク質切断剤中のわずか１アミノ酸又は核酸切断剤中の１ヌクレオチドであってもよい。標的配列又は他のＤＮＡにニック又は二本鎖切断を生じさせることは、本明細書では、標的配列又は他のＤＮＡを「切断する（ｃｕｔｔｉｎｇ）」又は「切断する（ｃｌｅａｖｉｎｇ）」と呼ぶことができる。
例示された標的配列の活性変異体及びフラグメントも提供される。そのような活性変異体は、所与の標的配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を含むことができ、活性変異体は生物学的活性を保持し、したがって配列特異的様式でヌクレアーゼ剤によって認識及び切断され得る。ヌクレアーゼ剤による標的配列の二本鎖切断を測定するためのアッセイは公知である。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｒｅｎｄｅｗｅｙら（２０１０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ４７６：２９５－３０７を参照されたい。
ヌクレアーゼ剤の活性変異体及びフラグメント（すなわち、操作されたヌクレアーゼ剤）も提供される。そのような活性変異体は、天然のヌクレアーゼ剤に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性を含むことができ、活性変異体は、所望の標的配列で切断する能力を保持し、したがって、ニック又は二本鎖切断誘導活性を保持する。例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ剤のいずれも、天然のエンドヌクレアーゼ配列から改変することができ、天然のヌクレアーゼ剤によって認識されなかった標的配列でニック又は二本鎖切断を認識及び誘導するように設計することができる。したがって、いくつかの操作されたヌクレアーゼは、対応する天然のヌクレアーゼ剤標的配列とは異なる標的配列でニック又は二本鎖切断を誘導する特異性を有する。ニック又は二本鎖切断誘導活性のアッセイは公知であり、一般に、標的配列を含むＤＮＡ基質上のエンドヌクレアーゼの全体的な活性及び特異性を測定する。
ヌクレアーゼ標的配列は、ヌクレアーゼ剤によってニック又は二本鎖切断が誘導されるＤＮＡ配列を含む。標的配列の長さは様々であり得、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）対について約３０～３６ｂｐ（すなわち、各ＺＦＮについて約１５～１８ｂｐ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）について約３６ｂｐ、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ガイドＲＮＡについて約２０ｂｐである標的配列が含まれる。
Ａ．制限酵素
本明細書に開示される方法での使用に適したヌクレアーゼ剤は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型のエンドヌクレアーゼを含む制限エンドヌクレアーゼを含むことができる。Ｉ型及びＩＩＩ型の制限エンドヌクレアーゼは特定の認識部位を認識するが、通常、ヌクレアーゼ結合部位から可変位置で切断し、これは、切断部位（認識部位）から数百塩基対離れてもよい。ＩＩ型システムでは、制限活性は任意のメチラーゼ活性とは無関係であり、切断は通常、結合部位内又は結合部位付近の特定の部位で起こる。ほとんどのＩＩ型酵素はパリンドローム配列を切断するが、ＩＩａ型酵素は非パリンドローム認識部位を認識して認識部位の外側を切断し、ＩＩｂ型酵素は認識部位の外側の両方の部位で配列を２回切断し、ＩＩｓ型酵素は非対称認識部位を認識し、片側で、認識部位から約１～２０ヌクレオチドの定義された距離で切断する。ＩＶ型制限酵素はメチル化されたＤＮＡを標的とする。制限酵素は、例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍのウェブページ、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：４１８－２０）、Ｒｏｂｅｒｔｓら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３１：１８０５－１２、及びＢｅｌｆｏｒｔら（２００２）Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ＩＩ、ｐｐ．７６１－７８３、Ｃｒａｉｇｉｅら編（ＡＳＭプレス社、ワシントンＤＣ）で更に説明及び分類されている。
いくつかの方法では、レアカット制限酵素が使用される。レアカット制限酵素とは、ゲノム内でまれにしか発生しない標的部位又は認識部位を有する酵素を指す。仮想のランダムゲノムを制限酵素で切断することによって生成される制限フラグメントのサイズは、４Ｎによって概算することができ、Ｎは酵素の認識部位のヌクレオチド数である。例えば、７ヌクレオチドからなる認識部位を有する酵素は、４７ｂｐごとに１回ゲノムを切断し、約１６，３８４ｂｐのフラグメントを生成する。一般的に、レアカッター酵素は６個以上のヌクレオチドを含む認識部位を有する。例えば、レアカッター酵素は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のヌクレオチドを含むか、又はそれらからなる認識部位を有することができる。レアカット制限酵素の例としては、ＮｏｔＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）、ＸｍａＩＩＩ（ＣＧＧＣＣＧ）、ＳｓｔＩＩ（ＣＣＧＣＧＧ）、Ｓａｌｌ（ＧＴＣＧＡＣ）、ＮｒｕＩ（ＴＣＧＣＧＡ）、ＮｈｅＩ（ＧＣＴＡＧＣ）、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ（ＣＣＴＣＡＧＣ）、ＢｂｖＣＩ（ＣＣＴＣＡＧＣ）、ＡｓｃＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）、ＡｓｉＳＩ（ＧＣＧＡＴＣＧＣ）、ＦｓｅＩ（ＧＧＣＣＧＧＣＣ）、ＰａｃＩ（ＴＴＡＡＴＴＡＡ）、ＰｍｅＩ（ＧＴＴＴＡＡＡＣ）、ＳｂｆＩ（ＣＣＴＧＣＡＧＧ）、ＳｇｒＡＩ（ＣＲＣＣＧＧＹＧ）、ＳｗａＩ（ＡＴＴＴＡＡＡＴ）、ＢｓｐＱＩ（ＧＣＴＣＴＴＣ）、ＳａｐＩ（ＧＣＴＣＴＴＣ）、ＳｆｉＩ（ＧＧＣＣＮＮＮＮＮＧＧＣＣ）、ＣｓｐＣＩ（ＣＡＡＮＮＮＮＮＧＴＧＧ）、ＡｂｓＩ（ＣＣＴＣＧＡＧＧ）、ＣｃｉＮＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）、ＦｓｐＡＩ（ＲＴＧＣＧＣＡＹ）、ＭａｕＢＩ（ＣＧＣＧＣＧＣＧ）、ＭｒｅＩ（ＣＧＣＣＧＧＣＧ）、ＭｓｓＩ（ＧＴＴＴＡＡＡＣ）、ＰａｌＡＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）、ＲｇａＩ（ＧＣＧＡＴＣＧＣ）、ＲｉｇＩ（ＧＧＣＣＧＧＣＣ）、ＳｄａＩ（ＣＣＴＧＣＡＧＧ）、ＳｆａＡＩ（ＧＣＧＡＴＣＧＣ）、ＳｇｆＩ（ＧＣＧＡＴＣＧＣ）、ＳｇｒＤＩ（ＣＧＴＣＧＡＣＧ）、ＳｇｓＩ（ＧＧＣＧＣＧＣＣ）、ＳｍｉＩ（ＡＴＴＴＡＡＡＴ）、ＳｒｆＩ（ＧＣＣＣＧＧＧＣ）、Ｓｓｅ２３２１（ＣＧＣＣＧＧＣＧ）、Ｓｓｅ８３８７１（ＣＣＴＧＣＡＧＧ）、ＬｇｕＩ（ＧＣＴＣＴＴＣ）、ＰｃｉＳＩ（ＧＣＴＣＴＴＣ）、ＡａｒＩ（ＣＡＣＣＴＧＣ）、ＡｊｕＩ（ＧＡＡＮＮＮＮＮＮＮＴＴＧＧ）、ＡｌｏＩ（ＧＡＡＣＮＮＮＮＮＮＴＣＣ）、ＢａｒＩ（ＧＡＡＧＮＮＮＮＮＮＴＡＣ）、ＰｐｉＩ（ＧＡＡＣＮＮＮＮＮＣＴＣ）、ＰｓｒＩ（ＧＡＡＣＮＮＮＮＮＮＴＡＣ）などが挙げられる。
Ｂ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系
クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系も、本明細書に開示される方法においてレアカットヌクレアーゼ剤として使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、Ｃａｓ遺伝子の発現に関与する、又はその活性を指示する転写産物やその他の要素が含まれている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型系、又はＶ型系（例えば、サブタイプＶ－Ａ又はサブタイプＶ－Ｂ）であってもよい。本明細書に開示される組成物及び方法で使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に存在しなくてもよい。「天然に存在しない」系は、系の１つ又は複数の構成要素が、それらの天然に存在する状態から改変又は変異されている、それらが天然に関連する少なくとも１つの他の構成要素を少なくとも実質的に含まない、又はそれらが天然に関連しない少なくとも１つの他の構成要素と関連するなど、人の手の関与を示す任意のものを含む。例えば、一部のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、天然に存在しないｇＲＮＡとＣａｓタンパク質を含む天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ複合体を使用するか、天然に存在しないＣａｓタンパク質を使用するか又は、天然に存在しないｇＲＮＡを使用する。
Ｃａｓタンパク質及びＣａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド．Ｃａｓタンパク質は一般に、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と相互作用できる少なくとも１つのＲＮＡ認識又は結合ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ヌクレアーゼドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン又はＲＮａｓｅドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、タンパク質－タンパク質相互作用ドメイン、二量体化ドメイン、及び他のドメインを含むことができる。いくつかのそのようなドメイン（例えば、ＤＮａｓｅドメイン）は、天然のＣａｓタンパク質に由来する可能性がある。他のそのようなドメインを追加して、改変されたＣａｓタンパク質を作成することができる。ヌクレアーゼドメインは、核酸分子の共有結合の切断を含む、核酸切断のための触媒活性を有する。切断は平滑末端又は付着末端を生成することができ、一本鎖又は二本鎖であってもよい。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、通常、平滑切断産物を生成する。あるいは、野生型Ｃｐｆ１タンパク質（例えば、ＦｎＣｐｆ１）は、非標的鎖のＰＡＭ配列から１８番目の塩基対の後及び標的鎖の２３番目の塩基の後に切断が生じる、５－ヌクレオチドの５’オーバーハングを有する切断産物をもたらし得る。Ｃａｓタンパク質は、標的ゲノム遺伝子座で二本鎖切断（例えば、平滑末端を有する二本鎖切断）を生成する完全な切断活性を有することができるか、又は標的ゲノム遺伝子座で一本鎖切断を生成するニッカーゼであってもよい。
Ｃａｓタンパク質の例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（ＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１又はＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１（ＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（ＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（ＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（ＣａｓＣ）、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、及びＣｕ１９６６、並びにそれらの相同性又は改変バージョンが挙げられる。
例示的なＣａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質又はＣａｓ９タンパク質に由来するタンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来するものであり、通常、保存された構造を有する４つの重要なモチーフを共有している。モチーフ１、２、４はＲｕｖＣ様モチーフで、モチーフ３はＨＮＨモチーフである。例示的なＣａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、ノカルジオプシス・ダソンビレイ（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトスポランギウム・ロセウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、ストレプトスポランギウム・ロセウム（Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ）、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、バチルス・シュードマイコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・セレニティレデュセンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ）、エキシグオバクテリウム・シビリカム（Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ）、ラクトバチルス・デルブルエッキイー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、マイクロシーラ・マリナ（Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ）、バークホルデリア目細菌（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ）、ポラロモナス属（Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．）、クロコスファエラ・ワトソニー（Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ）、シアノセイス属（Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．）、ミクロキスティス エルギノーサ（Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シネココッカス属（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、アセトハロビウム・アラバチクム（Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ）、アンモニフェクス・デゲンジイ（Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ）、カルディセルロシルプター・ベシイ（Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ）、カンディダタス・デスルフォルディス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ）、ナトラナエロビウス・サーモフィルス（Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ペロトマキュラム・サーモプロピオニカム（Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、硫黄酸化細菌（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ）、鉄酸化細菌（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、アロクロマチウム・ビノスム（Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ）、マリノバクター属（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ニトロソコッカス・ワッソニ（Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ）、クテドノバクテル・ラセミファー（Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ）、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ノジュラリア・スプミゲナ（Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ）、ノストック属（Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．）、アルスロスピラ・マキシマ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ）、アルスロスピラ・プラテンシス（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）、アルスロスピラ属（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．）、リングビア属（Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．）、ミクロコレス・クソノプラステス（Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ）、オシラトリア属（Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．）、ペトロトガ・モビリス（Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ）、サーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）、アカリオクロリス・マリナ（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、又はカンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）に由来する。Ｃａｓ９ファミリーメンバーの追加の例は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１３１８３３に記載されている。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２が割り当てられている）は、例示的なＣａｓ９タンパク質である。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｊ７ＲＵＡ５が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９（ＣｊＣａｓ９）（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｑ０Ｐ８９７が割り当てられている）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｉｍら（２０１７）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．８：１４５００を参照されたい。ＳａＣａｓ９はＳｐＣａｓ９よりも小さく、ＣｊＣａｓ９はＳａＣａｓ９とＳｐＣａｓ９の両方よりも小さい。髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）は、別の例示的なＣａｓ９タンパク質である。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｄｒａｋｉら（２０１９）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ７３（４）：７１４－７２６を参照されたい。ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ１遺伝子座によってコードされるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＬＭＤ－９Ｃａｓ９（Ｓｔ１Ｃａｓ９）又はＣＲＩＳＰＲ３遺伝子座由来のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ Ｃａｓ９（Ｓｔ３Ｃａｓ９））は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）由来の（Ｃａｓ９）（ＦｎＣａｓ９）又は代替ＰＡＭ（Ｅ１３６９Ｒ／Ｅ１４４９Ｈ／Ｒ１５５６Ａ置換）を認識するＲＨＡ Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｃａｓ９変異体は、他の例示的なＣａｓ９タンパク質である。これら及び他の例示的なＣａｓ９タンパク質は、例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ及びＤａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１で概説されている。例示的なＣａｓ９タンパク質配列は、配列番号１を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。Ｃａｓ９タンパク質をコードする例示的なＤＮＡは、配列番号２を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。
Ｃａｓタンパク質の別の例は、Ｃｐｆ１（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１由来のＣＲＩＳＰＲ）タンパク質である。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９の対応するドメインに相同なＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインと、Ｃａｓ９の特徴的なアルギニンに富むクラスターに対応するものを含む大きなタンパク質（約１３００アミノ酸）である。しかし、Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９タンパク質に存在するＨＮＨヌクレアーゼドメインを欠いており、ＲｕｖＣ様ドメインはＨＮＨドメインを含む長いインサートを含むＣａｓ９とは対照的に、Ｃｐｆ１配列において連続している。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｅｔｓｃｈｅら（２０１５）Ｃｅｌｌ １６３（３）：７５９－７７１を参照されたい。例示的なＣｐｆ１タンパク質は、野兎病菌（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ １）、野兎病菌亜種ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ ｓｕｂｓｐ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）、プレボテラ・アルベンシス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ａｌｂｅｎｓｉｓ）、ラクノスピラ科細菌ＭＣ２０１７ １（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＣ２０１７ １）、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、ペレグリニバクテリア細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ２＿３３＿１０）、パルクバクテリア細菌ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７（Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＧＷ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、スミセラ属ＳＣＡＤＣ（Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ ｓｐ．ＳＣＡＤＣ）、アシダミノコッカス属ＢＶ３Ｌ６（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６）、ラクノスピラ科細菌ＭＡ２０２０（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＭＡ２０２０）、カンディダタス・メタノプラズマ・テルミツム（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ）、ユーバクテリウム・エリゲンス細菌（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ）、モラクセラ・ボーボクリ２３７（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ ２３７）、レプトスピラ・イナダイ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ）、ラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス３（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ ３）、プレボテーラ・ディシエンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ）、及びポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ）に由来する。フランシセラ・ノビシダＵ１１２（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２）由来のＣｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１、割り当てられたＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ａ０Ｑ７Ｑ２）は、例示的なＣｐｆ１タンパク質である。
Ｃａｓタンパク質は、野生型タンパク質（すなわち、自然界に存在するもの）、改変されたＣａｓタンパク質（すなわち、Ｃａｓタンパク質変異体）、又は野生型又は改変されたＣａｓタンパク質のフラグメントであってもよい。Ｃａｓタンパク質はまた、野生型又は改変されたＣａｓタンパク質の触媒活性に関して、活性な変異体又はフラグメントであってもよい。触媒活性に関する活性変異体又はフラグメントは、野生型又は改変されたＣａｓタンパク質又はその一部に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又はそれ以上の配列同一性を含むことができ、活性変異体は、所望の切断部位で切断する能力を保持し、したがってニック誘導又は二本鎖切断誘導活性を保持する。ニック誘導又は二本鎖切断誘導活性のアッセイは公知であり、一般に、切断部位を含むＤＮＡ基質上のＣａｓタンパク質の全体的な活性及び特異性を測定する。
Ｃａｓタンパク質は、核酸結合親和性、核酸結合特異性、及び酵素活性のうちの１つ又は複数を増加又は減少させるように改変することができる。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性など、タンパク質の他の活性や特性を変更するように改変することができます。例えば、Ｃａｓタンパク質の１つ又は複数のヌクレアーゼドメインを改変、欠失、又は不活性化することができ、あるいはＣａｓタンパク質を切断して、タンパク質の機能に必須ではないドメインを除去するか、あるいはＣａｓタンパク質の活性又は特性を最適化（例えば、増強又は低減）することができる。
改変されたＣａｓタンパク質の一例は、改変されたＳｐＣａｓ９－ＨＦ１タンパク質であり、これは、非特異的ＤＮＡ接触を減らすように設計された改変（Ｎ４９７Ａ／Ｒ６６１Ａ／Ｑ６９５Ａ／Ｑ９２６Ａ）を有する化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の忠実度の高い変異体である。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒら（２０１６）Ｎａｔｕｒｅ ５２９（７５８７）：４９０－４９５を参照されたい。改変されたＣａｓタンパク質の別の例は、オフターゲット効果を低減するように設計された改変ｅＳｐＣａｓ９変異体（Ｋ８４８Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａ）である。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｌａｙｍａｋｅｒら（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１（６２６８）：８４－８８を参照されたい。他のＳｐＣａｓ９変異体としては、Ｋ８５５Ａ及びＫ８１０Ａ／Ｋ１００３Ａ／Ｒ１０６０Ａが挙げられる。これら及びその他の改変Ｃａｓタンパク質は、例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｃｅｂｒｉａｎ－Ｓｅｒｒａｎｏ及びＤａｖｉｅｓ（２０１７）Ｍａｍｍ．Ｇｅｎｏｍｅ ２８（７）：２４７－２６１で概説されている。改変Ｃａｓ９タンパク質の別の例はｘＣａｓ９であり、これは、これはＰＡＭ配列の拡大された範囲を認識することができるＳｐＣａｓ９変異体である。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｈｕら（２０１８）Ｎａｔｕｒｅ ５５６：５７－６３を参照されたい。
Ｃａｓタンパク質は、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを含むことができる。例えば、野生型Ｃｐｆ１タンパク質は、一般に、おそらく二量体構成で、標的ＤＮＡの両方の鎖を切断するＲｕｖＣ様ドメインを含む。Ｃａｓタンパク質はまた、ＤＮａｓｅドメインなどの少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含むことができる。例えば、野生型Ｃａｓ９タンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインはそれぞれ、二本鎖ＤＮＡの異なる鎖を切断して、ＤＮＡに二本鎖切断を生成することができる。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎｅｋら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７：８１６－８２１を参照されたい。
ヌクレアーゼドメインの１つ又は複数を欠失又は変異させて、機能しなくなったり、ヌクレアーゼ活性が低下したりすることができる。例えば、ヌクレアーゼドメインの１つがＣａｓ９タンパク質で欠失又は変異している場合、得られたＣａｓ９タンパク質はニッカーゼと呼ばれ、二本鎖標的ＤＮＡ内で一本鎖切断を生成することができるが、二本鎖切断を生成することはできない（すなわち、相補鎖又は非相補鎖を切断することができるが、両方を切断することはできない）。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の例は、化膿レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９のＲｕｖＣドメインにおけるＤ１０Ａ（Ｃａｓ９の位置１０におけるアラニンからアスパラギン酸への）変異である。同様に、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９のＨＮＨドメインにおけるＨ９３９Ａ（アミノ酸位置８３９におけるヒスチジンからアラニンへ）、Ｈ８４０Ａ（アミノ酸位置８４０におけるヒスチジンからアラニン）、又はＮ８６３Ａ（アミノ酸位置Ｎ８６３におけるアスパラギンからアラニン）は、Ｃａｓ９をニッカーゼに変換することができる。Ｃａｓ９をニッカーゼに変換する変異の他の例としては、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９に対する対応する変異が挙げられる。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓら（２０１１）Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄｓＲｅｓ．３９（２１）：９２７５－９２８２及び国際公開第２０１３／１４１６８０号を参照されたい。このような変異は、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ媒介変異誘発、又は全遺伝子合成などの方法を使用して生成することができる。ニッカーゼを作成する他の突然変異の例は、例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１７６７７２号及び国際公開第２０１３／１４２５７８に見出すことができる。
ｘＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例は、ＳｐＣａｓ９について前述したものと同じである。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である。例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９酵素（ＳａＣａｓ９）は、ニッカーゼを生成するために、位置Ｎ５８０での置換（例えば、Ｎ５８０Ａ置換）を含むことができる。あるいは、ＳａＣａｓ９酵素は、ニッカーゼを生成するために、位置Ｄ１０での置換（例えば、Ｄ１０Ａ置換）を含むことができる。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２０１６／１０６２３６号を参照されたい。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である（例えば、Ｄ１６ＡとＨ５８８Ａの組み合わせ）。Ｓｔ１Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である（例えば、Ｄ９Ａ、Ｄ５９８Ａ、Ｈ５９９Ａ、及びＮ６２２Ａの組み合わせ）。Ｓｔ３Ｃａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である（例えば、Ｄ１０ＡとＮ８７０Ａの組み合わせ）。ＣｊＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である（例えば、Ｄ８ＡとＨ５５９Ａの組み合わせ）。ＦｎＣａｓ９及びＲＨＡ ＦｎＣａｓ９の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である（例えば、Ｎ９９５Ａ）。
Ｃｐｆ１タンパク質の触媒ドメインにおける不活性化変異の例も公知である。フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２（ＦｎＣｐｆ１）、アシダミノコッカス属（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）ＢＶ３Ｌ６（ＡｓＣｐｆ１）、ラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６（ＬｂＣｐｆ１）、及びモラクセラ・ボーボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７（ＭｂＣｐｆ１ Ｃｐｆ１）由来のＣｐｆ１タンパク質に関して、そのような変異は、ＡｓＣｐｆ１の位置９０８、９９３又は１２６３あるいはＣｐｆ１オルソログ中の対応する位置、あるいはＬｂＣｐｆ１の位置８３２、９２５、９４７又は１１８０あるいはＣｐｆ１オルソログ中の対応する位置における変異を含むことができる。そのような変異は、例えば、ＡｓＣｐｆ１の変異Ｄ９０８Ａ、Ｅ９９３Ａ、及びＤ１２６３Ａ又はＣｐｆ１オルソログの対応する変異、又はＬｂＣｐｆ１のＤ８３２Ａ、Ｅ９２５Ａ、Ｄ９４７Ａ、及びＤ１１８０Ａ又はＣｐｆ１オルソログの対応する変異の１つ又は複数を含むことができる。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１６／０２０８２４３号を参照されたい。
Ｃａｓタンパク質はまた、融合タンパク質として異種ポリペプチドに作動可能に連結することができる。例えば、Ｃａｓタンパク質を切断ドメインに融合させることができる。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１４／０８９２９０号を参照されたい。Ｃａｓタンパク質はまた、安定性の増加又は減少を提供する異種ポリペプチドに融合することができる。融合ドメイン又は異種ポリペプチドは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質の内部に位置することができる。
一例として、Ｃａｓタンパク質は、細胞内局在化を提供する１つ又は複数の異種ポリペプチドに融合させることができる。そのような異種ポリペプチドは、例えば、核を標的とするための単一部分ＳＶ４０ ＮＬＳ及び／又は二部分α－インポーチンＮＬＳなどの１つ又は複数の核局在化シグナル（ＮＬＳ）、ミトコンドリアを標的とするためのミトコンドリア局在化シグナル、ＥＲ保持シグナルなどを含むことができる。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｎｇｅら（２００７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２（８）：５１０１－５１０５を参照されたい。このような細胞内局在化シグナルは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどこにでも位置することができる。ＮＬＳは、一続きの塩基性アミノ酸を含むことができ、一部分配列又は二部分配列であってもよい。場合により、Ｃａｓタンパク質は、Ｎ末端にＮＬＳ（例えば、α－インポーチンＮＬＳ又は単一部分ＮＬＳ）及びＣ末端にＮＬＳ（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ又は二部分ＮＬＳ）を含む２つ以上のＮＬＳを含むことができる。Ｃａｓタンパク質はまた、Ｎ末端に２つ以上のＮＬＳ及び／又はＣ末端に２つ以上のＮＬＳを含むことができる。
Ｃａｓタンパク質はまた、細胞透過性ドメイン又はタンパク質導入ドメインに操作可能に連結することができる。例えば、細胞透過性ドメインは、ＨＩＶ－１ ＴＡＴタンパク質、ヒトＢ型肝炎ウイルス由来のＴＬＭ細胞透過性モチーフ、ＭＰＧ、Ｐｅｐ－１、ＶＰ２２、単純ヘルペスウイルス由来の細胞透過性ペプチド、又はポリアルギニンペプチド配列に由来することができる。例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／０８９２９０及びＷＯ２０１３／１７６７７２を参照されたい。細胞透過性ドメインは、Ｎ末端、Ｃ末端、又はＣａｓタンパク質内のどこにでも位置することができる。
ｍＲＮＡとして提供されるＣａｓタンパク質は、安定性及び／又は免疫原性の特性を改善するために改変することができる。改変は、ｍＲＮＡ内の１つ又は複数のヌクレオシドに対して行うことができる。ｍＲＮＡ核酸塩基への化学改変の例としては、シュードウリジン、１－メチル－シュードウリジン、及び５－メチル－シチジンが挙げられる。例えば、Ｎ１－メチルシュードウリジンを含むキャップ及びポリアデニル化されたＣａｓ ｍＲＮＡを使用することができる。同様に、Ｃａｓ ｍＲＮＡは、同義のコドンを使用してウリジンを枯渇させることによって改変することができる。
ガイドＲＮＡ．「ガイドＲＮＡ」又は「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）に結合し、Ｃａｓタンパク質を標的ＤＮＡ内の特定の位置に標的化するＲＮＡ分子である。ガイドＲＮＡは、「ＤＮＡ標的セグメント」及び「タンパク質結合セグメント」の２つのセグメントを含むことができる。「セグメント」は、ＲＮＡ中のヌクレオチドの連続したストレッチなどの、分子のセクション又は領域を含む。Ｃａｓ９用などの一部のｇＲＮＡは、「アクチベーターＲＮＡ」（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ）及び「ターゲッターＲＮＡ」（例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ）の２つの別個のＲＮＡ分子を含むことができる。他のｇＲＮＡは単一ＲＮＡ分子（単一ＲＮＡポリヌクレオチド）であり、これはまた、「単一分子ｇＲＮＡ」、「シングルガイドＲＮＡ」、又は「ｓｇＲＮＡ」と呼ぶことができる。例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１３／１７６７７２号、国際公開第２０１４／０６５５９６号、国際公開第２０１４／０８９２９０号、国際公開第２０１４／０９３６２２号、国際公開第２０１４／０９９７５０号、国際公開第２０１３／１４２５７８号、及び国際公開第２０１４／１３１８３３号を参照されたい。例えば、Ｃａｓ９の場合、シングルガイドＲＮＡは、（例えば、リンカーを介して）ｔｒａｃｒＲＮＡに融合したｃｒＲＮＡを含むことができる。例えば、Ｃｐｆ１の場合、標的配列への結合及び／又は切断を達成するために必要なのはｃｒＲＮＡのみである。「ガイドＲＮＡ」及び「ｇＲＮＡ」という用語は、二重分子（すなわち、モジュラー）ｇＲＮＡ及び単一分子ｇＲＮＡの両方を含む。
例示的な２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「ターゲッターＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡ」又は「ｃｒＲＮＡリピート」）分子及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ」又は「アクチベーター－ＲＮＡ」又は「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）分子を含む。ｃｒＲＮＡは、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメント（一本鎖）と、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の半分を形成するヌクレオチドのストレッチ（つまり、ｃｒＲＮＡテール）の両方を含む。ＤＮＡ標的セグメントの下流（３’）に位置するｃｒＲＮＡテールの例は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵ（配列番号３）を含む、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。本明細書に開示されるＤＮＡ標的セグメントのいずれも、配列番号３の５’末端に結合して、ｃｒＲＮＡを形成することができる。
対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（アクチベーター－ＲＮＡ）は、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成するヌクレオチドのストレッチを含む。ｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチは、ｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチドのストレッチと相補的であり、ハイブリダイズして、ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言える。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例は、ＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵ（配列番号４）を含む、本質的にそれからなるか、又はそれらからなる。ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の他の例は、ＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号１２）又はＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号１３）を含む、本質的にそれからなるか、又はそれらからなる。
ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの両方が必要な系では、ｃｒＲＮＡ及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡがハイブリダイズしてｇＲＮＡを形成する。ｃｒＲＮＡのみが必要な系では、ｃｒＲＮＡはｇＲＮＡであってもよい。ｃｒＲＮＡは更に、標的ＤＮＡの相補鎖にハイブリダイズする一本鎖ＤＮＡ標的セグメントを提供する。細胞内での改変に使用する場合、所与のｃｒＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列は、ＲＮＡ分子が使用される種に固有になるように設計することができる。例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍａｌｉら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８２３－８２６、Ｊｉｎｅｋら（２０１２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１、Ｈｗａｎｇら（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２２７－２２９、Ｊｉａｎｇら（２０１３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１（３）：２３３－２３９、及びＣｏｎｇら（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９（６１２１）：８１９－８２３を参照されたい。
所与のｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメント（ｃｒＲＮＡ）は、以下により詳細に記載されるように、標的ＤＮＡの相補鎖上の配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントは、ハイブリダイゼーション（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的に標的ＤＮＡと相互作用する。したがって、ＤＮＡ標的セグメントのヌクレオチド配列は変化する可能性があり、ｇＲＮＡ及び標的ＤＮＡが相互作用する標的ＤＮＡ内の位置を決定する。対象のｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントは、標的ＤＮＡ内の任意の所望の配列にハイブリダイズするように改変することができる。天然に存在するｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系及び生物に応じて異なるが、２１～４６ヌクレオチド長の２つの直接反復（ＤＲ）が隣接する、２１～７２ヌクレオチド長の標的セグメントを含むことがよくある（例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／１３１８３３号を参照されたい）。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）の場合、ＤＲは３６ヌクレオチド長であり、標的セグメントは３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、ハイブリダイズし、これが次に、Ｃａｓタンパク質に結合する。
ＤＮＡ標的セグメントは、例えば、少なくとも約１２、１５、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、又は４０ヌクレオチド長を有することができる。そのようなＤＮＡ標的セグメントは、例えば、約１２～約１００、約１２～約８０、約１２～約５０、約１２～約４０、約１２～約３０、約１２～約２５、又は約１２～約２０ヌクレオチド長を有することができる。例えば、ＤＮＡ標的セグメントは、約１５～約２５ヌクレオチド（例えば、約１７～約２０ヌクレオチド、又は約１７、１８、１９、又は２０ヌクレオチド）であってもよい。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１６／００２４５２３号を参照されたい。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的セグメントは、１６～２０ヌクレオチド長、又は１７～２０ヌクレオチド長である。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９の場合、典型的なＤＮＡ標的セグメントは、２１～２３ヌクレオチド長である。Ｃｐｆ１の場合、典型的なＤＮＡ標的セグメントは、少なくとも１６ヌクレオチド長又は少なくとも１８ヌクレオチド長である。
ｔｒａｃｒＲＮＡは、任意の形態（例えば、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）であってもよく、様々な長さであってもよい。それらには、一次転写物又は処理された形態を含めることができる。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ（シングルガイドＲＮＡの一部として、又は２分子ｇＲＮＡの一部としての別個の分子として）は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の全て又は一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の約２０、２６、３２、４５、４８、５４、６３、６７、８５、又はそれ以上のヌクレオチド）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来の野生型ｔｒａｃｒＲＮＡ配列の例としては、１７１ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、及び６５ヌクレオチドのバージョンが挙げられる。例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅｌｔｃｈｅｖａら（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ ４７１（７３４０）：６０２－６０７、国際公開第２０１４／０９３６６１号を参照されたい。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）内のｔｒａｃｒＲＮＡの例としては、ｓｇＲＮＡの＋４８、＋５４、＋６７、及び＋８５バージョン内に見出されるｔｒａｃｒＲＮＡセグメントが挙げられ、ここで、「＋ｎ」は、野生型ｔｒａｃｒＲＮＡの最大＋ｎヌクレオチドがｓｇＲＮＡに含まれることを示す。全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６９７，３５９号を参照されたい。
ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間のパーセント相補性は、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％）であってもよい。ＤＮＡ標的セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間のパーセント相補性は、約２０個の連続ヌクレオチドにわたって少なくとも６０％であってもよい。一例として、ＤＮＡ標的セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端における１４個の連続ヌクレオチドに対して１００％であってもよく、残りにわたって０％程度であってもよい。このような場合、ＤＮＡ標的セグメントは１４ヌクレオチド長であると見なすことができる。別の例として、ＤＮＡ標的セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖との間のパーセント相補性は、標的ＤＮＡの相補鎖の５’末端における７個の連続ヌクレオチドに対して１００％であってもよく、残りにわたって０％程度であってもよい。このような場合、ＤＮＡ標的セグメントは７ヌクレオチド長であると見なすことができる。一部のガイドＲＮＡでは、ＤＮＡ標的セグメント内の少なくとも１７ヌクレオチドがターゲットＤＮＡの相補鎖に相補的である。例えば、ＤＮＡ標的セグメントは、２０ヌクレオチド長であってもよく、標的ＤＮＡの相補鎖との１、２、又は３つのミスマッチを含むことができる。一例では、ミスマッチは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（すなわち、ＰＡＭ配列の逆相補体）に対応する相補鎖の領域に隣接していない（例えば、ミスマッチは、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントの５’末端にあるか、あるいはミスマッチは、ＰＡＭ配列に対応する相補鎖の領域から少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９塩基対離れている）。
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに相補的な２つのヌクレオチドストレッチを含むことができる。タンパク質結合セグメントの相補的ヌクレオチドは、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ）を形成する。対象のｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、Ｃａｓタンパク質と相互作用し、ｇＲＮＡは、結合したＣａｓタンパク質を、ＤＮＡ標的セグメントを介して標的ＤＮＡ内の特定のヌクレオチド配列に指向させる。
シングルガイドＲＮＡは、足場配列（すなわち、ガイドＲＮＡのタンパク質結合又はＣａｓ結合配列）に結合したＤＮＡ標的セグメントを含むことができる。例えば、そのようなガイドＲＮＡは、５’ＤＮＡ標的セグメント及び３’足場配列を有することができる。例示的な足場配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵ（バージョン１、配列番号５）、ＧＵＵＧＧＡＡＣＣＡＵＵＣＡＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン２、配列番号６）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン３、配列番号７）、及びＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（バージョン４、配列番号８）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。他の例示的な足場配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵＵ（バージョン５、配列番号１４）、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（バージョン６、配列番号１５）、又はＧＵＵＵＡＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＧＡＡＡＣＡＧＣＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＵＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵＵ（バージョン７、配列番号１６）を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなることができる。任意のガイドＲＮＡ標的配列を標的とするガイドＲＮＡは、例えば、ガイドＲＮＡの３’末端の例示的なガイドＲＮＡ足場配列のいずれかに融合したガイドＲＮＡの５’末端のＤＮＡ標的セグメントを含むことができる。すなわち、ＤＮＡ標的セグメントは、配列番号５～８のいずれか１つの５’末端に結合して、シングルガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。同様に、ＤＮＡ標的セグメントは、配列番号１４～１６のいずれか１つの５’末端に結合して、シングルガイドＲＮＡ（キメラガイドＲＮＡ）を形成することができる。本明細書の他の場所に開示されるガイドＲＮＡバージョン１、２、３、及び４は、それぞれ、足場バージョン１、２、３、及び４と結合されたＤＮＡ標的セグメント（すなわち、ガイド配列又はガイド）を指す。本明細書の他の場所に開示されるガイドＲＮＡバージョン５、６、及び７は、それぞれ、足場バージョン５、６、及び７と結合されたＤＮＡ標的セグメント（すなわち、ガイド配列又はガイド）を指す。
ガイドＲＮＡは、追加の所望の特徴（例えば、改変又は調節された安定性、細胞内標的化、蛍光標識による追跡、タンパク質又はタンパク質複合体の結合部位など）を提供する改変又は配列を含むことができる。そのような改変の例としては、例えば、５’キャップ（例えば、７－メチルグアニル酸キャップ（ｍ７Ｇ））、３’ポリアデニル化テール（すなわち、３’ポリ（Ａ）テール）、リボスイッチ配列（例えば、タンパク質及び／又はタンパク質複合体による安定性の調節及び／又は接近性の調節を可能にする）、安定性制御配列、ｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する配列（すなわち、ヘアピン）、ＲＮＡを細胞内の位置（例えば、核、ミトコンドリア、葉緑体など）に標的化する改変又は配列、追跡を提供する改変又は配列（例えば、蛍光分子への直接コンジュゲーション、蛍光検出を容易にする部分へのコンジュゲーション、蛍光検出を可能にする配列など）、タンパク質（例えば、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＤＮＡデメチラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼなどを含む、ＤＮＡに作用するタンパク質）に対する結合部位を提供する改変又は配列、及びそれらの組み合わせが挙げられる。改変の他の例としては、操作されたステムループ二重構造、操作されたバルジ領域、ステムループ二重構造の３’側の操作されたヘアピン、又はそれらの任意の組み合わせが挙げられる。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１５／０３７６５８６号を参照されたい。バルジは、ｃｒＲＮＡ様領域と最小のｔｒａｃｒＲＮＡ様領域で構成される二重鎖内のヌクレオチドの対になっていない領域であってもよい。バルジは、二重鎖の片側に、Ｘが任意のプリンであり、Ｙが反対側の鎖のヌクレオチドとゆらぎ塩基対を形成できるヌクレオチドであってもよい５’－ＸＸＸＹ－３’、及び二重鎖の他方の側に対になっていないヌクレオチド領域を含むことができる。
改変されていない核酸は分解されやすい傾向がある可能性がある。外因性の核酸はまた、自然免疫応答を誘発することができる。改変は、安定性を導入し、免疫原性を低下させるのに役立つことができる。ガイドＲＮＡは、例えば、以下の（１）ホスホジエステル骨格結合における非連結リン酸酸素の一方又は両方及び／又は連結リン酸酸素の１つ又は複数の変更又は置換、（２）リボース糖の２’ヒドロキシルの変更又は置換などのリボース糖の構成要素の変更又は置換、（３）リン酸部分の脱リン酸化リンカーによる置換、（４）天然に存在する核酸塩基の改変又は置換、（５）リボース－リン酸骨格の置換又は改変、（６）オリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端の改変（例えば、末端リン酸基の除去、改変又は置換、又は部分のコンジュゲーション）、及び（７）糖の改変のうちの１つ又は複数を含む改変ヌクレオシド及び改変ヌクレオチドを含むことができる。他の可能なガイドＲＮＡ改変としては、ウラシル又はポリウラシルトラクトの改変又は置換が挙げられる。例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／０４８５７７号及び米国特許第２０１６／０２３７４５５号を参照されたい。同様の改変を、Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓをコードする核酸に加えることができる。
一例として、ガイドＲＮＡの５’又は３’末端のヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合を含むことができる（例えば、塩基は、ホスホロチオアート基である改変リン酸基を有することができる）。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’又は３’末端の２、３、又は４つの末端ヌクレオチド間のホスホロチオアート結合を含むことができる。別の例として、ガイドＲＮＡの５’及び／又は３’末端のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル改変を有することができる。例えば、ガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡの５’及び／又は３’末端（例えば、５’末端）の２、３、又は４末端ヌクレオチドに２’－Ｏ－メチル改変を含むことができる。例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１７／１７３０５４号及びＦｉｎｎら（２０１８）Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２２（９）：２２２７－２２３５を参照されたい。１つの特定の例では、ガイドＲＮＡは、最初の３つの５’及び３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体及び３’ホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含む。別の特定の例では、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用しない全ての２’ＯＨ基が２’－Ｏ－メチル類似体で置き換えられるようにガイドＲＮＡが改変され、Ｃａｓ９との相互作用が最小限であるガイドＲＮＡのテール領域は、５’及び３’ホスホロチオアートヌクレオチド間結合で改変される。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｉｎら（２０１７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３５（１２）：１１７９－１１８７を参照されたい。改変されたガイドＲＮＡの他の例は、例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１８／１０７０２８号で提供される。
ｇＲＮＡは、他の様々な方法で調製することができる。例えば、ｇＲＮＡは、例えば、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用するインビトロ転写によって調製することができる（例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１４／０８９２９０及び国際公開第２０１４／０６５５９６号を参照されたい）。ガイドＲＮＡはまた、化学合成によって調製された合成分子であってもよい。例えば、ガイドＲＮＡを化学的に合成して、最初の３つの５’及び３’末端ＲＮＡ残基に２’－Ｏ－メチル類似体及び３’ホスホロチオアートヌクレオチド間結合を含めることができる。
ガイドＲＮＡ標的配列．ガイドＲＮＡの標的ＤＮＡには、結合に十分な条件が存在する場合に、ｇＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントが結合するＤＮＡに存在する核酸配列が含まれる。適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞に通常存在する生理学的条件が含まれる。他の適切なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当技術分野で公知である（例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ ２００１））を参照されたい）。ｇＲＮＡに相補的であり、ハイブリダイズする標的ＤＮＡの鎖は「相補鎖」と呼ぶことができ、「相補鎖」に相補的である（したがって、Ｃａｓタンパク質又はｇＲＮＡに相補的ではない）標的ＤＮＡの鎖は、「非相補鎖」又は「テンプレート鎖」と呼ぶことができる。
標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の配列と非相補鎖上の（例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接する）対応する配列の両方を含む。本明細書で使用される「ガイドＲＮＡ標的配列」という用語は、特に、ガイドＲＮＡが相補鎖上でハイブリダイズする配列に対応する非相補鎖上の配列（すなわち、その逆相補体）を指す。すなわち、ガイドＲＮＡ標的配列は、ＰＡＭに隣接する非相補鎖上の配列（例えば、Ｃａｓ９の場合、ＰＡＭの上流又は５’）を指す。ガイドＲＮＡ標的配列はガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントと同等であるが、ウラシルの代わりにチミンを使用している。一例として、ＳｐＣａｓ９酵素のガイドＲＮＡ標的配列は、非相補鎖上の５’－ＮＧＧ－３’ＰＡＭの上流の配列を指すことができる。ガイドＲＮＡは、標的ＤＮＡの相補鎖に対して相補性を有するように設計されており、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントと標的ＤＮＡの相補鎖とのハイブリダイゼーションにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成が促進される。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するのに十分な相補性があれば、完全な相補性は必ずしも必要ではない。ガイドＲＮＡが本明細書においてガイドＲＮＡ標的配列を標的とするものとして言及される場合、それは、ガイドＲＮＡが、非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列の逆相補体である標的ＤＮＡの相補鎖配列にハイブリダイズすることを意味する。
標的ＤＮＡ又はガイドＲＮＡ標的配列は、任意のポリヌクレオチドを含むことができ、例えば、細胞の核又は細胞質内、あるいはミトコンドリア又は葉緑体などの細胞の細胞小器官内に位置することができる。標的ＤＮＡ又はガイドＲＮＡ標的配列は、細胞に対して内因性又は外因性の任意の核酸配列であってもよい。ガイドＲＮＡ標的配列は、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列又は非コード配列（例えば、調節配列）であってもよく、又は両方を含むことができる。
Ｃａｓタンパク質による標的ＤＮＡの部位特異的結合及び切断は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡの相補鎖との間の塩基対形成相補性及び（ｉｉ）標的ＤＮＡの非相補鎖におけるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短いモチーフの両方によって決定される位置で生じ得る。ＰＡＭはガイドＲＮＡ標的配列に隣接することができる。場合により、ガイドＲＮＡ標的配列の３’末端にＰＡＭを隣接させることができる（例えば、Ｃａｓ９の場合）。あるいは、ガイドＲＮＡ標的配列は、５’末端にＰＡＭを隣接させることができる（例えば、Ｃｐｆ１の場合）。例えば、Ｃａｓタンパク質の切断部位は、ＰＡＭ配列の上流又は下流（例えば、ガイドＲＮＡ標的配列内）の約１～約１０又は約２～約５塩基対（例えば、３塩基対）であってもよい。ＳｐＣａｓ９の場合、ＰＡＭ配列（すなわち、非相補鎖上）は、５’－Ｎ１ＧＧ－３’であってもよく、ここでＮ１は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ＰＡＭは標的ＤＮＡの非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列のすぐ３’側である。したがって、相補鎖上のＰＡＭに対応する配列（すなわち、逆相補鎖）は５’－ＣＣＮ２－３’であり、ここでＮ２は任意のＤＮＡヌクレオチドであり、ガイドＲＮＡのＤＮＡ標的セグメントが標的ＤＮＡの相補鎖上でハイブリダイズする配列のすぐ５’側である。いくつかのこのような場合には、Ｎ１及びＮ２は、相補的であってもよく、Ｎ１－Ｎ２塩基対は、任意の塩基対であってもよい（例えば、Ｎ１＝Ｃ及びＮ２＝Ｇ；Ｎ１＝Ｇ及びＮ２＝Ｃ；Ｎ１＝Ａ及びＮ２＝Ｔ；又はＮ１＝Ｔ、及びＮ２＝Ａ）。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、ＮＮＧＲＲＴ又はＮＮＧＲＲであってもよく、ここでＮは、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴであってもよく、Ｒは、Ｇ又はＡであってもよい。カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９の場合、ＰＡＭは、例えば、ＮＮＮＮＡＣＡＣ又はＮＮＮＮＲＹＡＣであってもよく、ここでＮは、Ａ、Ｇ、Ｃ、又はＴであってもよく、Ｒは、Ｇ又はＡであってもよい。いくつかの場合（例えば、ＦｎＣｐｆ１の場合）、ＰＡＭ配列は、５’末端の上流であってもよく、配列５’－ＴＴＮ－３’を有することができる。
ガイドＲＮＡ標的配列の例は、ＳｐＣａｓ９タンパク質によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の２０ヌクレオチドのＤＮＡ配列である。例えば、ガイドＲＮＡ標的配列とＰＡＭの２つの例は、ＧＮ１９ＮＧＧ（配列番号９）又はＮ２０ＮＧＧ（配列番号１０）である。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１４／１６５８２５号を参照されたい。５’末端のグアニンは、細胞内のＲＮＡポリメラーゼによる転写を促進することができる。ガイドＲＮＡ標的配列とＰＡＭの他の例には、インビトロでのＴ７ポリメラーゼによる効率的な転写を促進するために、５’末端に２つのグアニンヌクレオチド（例えば、ＧＧＮ２０ＮＧＧ配列番号１１）を含めることができる。例えば、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１４／０６５５９６号を参照されたい。他のガイドＲＮＡ標的配列とＰＡＭは、５’Ｇ又はＧＧ及び３’ＧＧ又はＮＧＧを含む配列番号９～１１の４～２２ヌクレオチド長を有することができる。更に他のガイドＲＮＡ標的配列とＰＡＭは、配列番号９～１１の１４～２０ヌクレオチド長を有することができる。
標的ＤＮＡにハイブリダイズしたＣＲＩＳＰＲ複合体の形成は、ガイドＲＮＡ標的配列（すなわち、標的ＤＮＡの非相補鎖上のガイドＲＮＡ標的配列及びガイドＲＮＡがハイブリダイズする相補鎖上の逆相補体）に対応する領域内又はその近傍の標的ＤＮＡの一方又は両方の鎖の切断をもたらし得る。例えば、切断部位は、ガイドＲＮＡ標的配列内（例えば、ＰＡＭ配列に対して定義された位置）にあってもよい。「切断部位」は、Ｃａｓタンパク質が一本鎖切断又は二本鎖切断を生成する標的ＤＮＡの位置を含む。切断部位は、一本鎖のみ（例えば、ニッカーゼが使用される場合）又は二本鎖ＤＮＡの両方の鎖上にあってもよい。切断部位は、両方の鎖の同じ位置（平滑末端を生成する、例えば、Ｃａｓ９）にあってもよく、又は各鎖の異なる部位（付着末端（すなわち、オーバーハング）を生成する、例えば、Ｃｐｆ１）にあってもよい。付着末端は、例えば、それぞれが異なる鎖の異なる切断部位で一本鎖切断を生成し、それによって二本鎖切断を生成する２つのＣａｓタンパク質を使用することによって生成することができる。例えば、第１のニッカーゼは二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の第１の鎖に一本鎖切断を生成することができ、第２のニッカーゼはｄｓＤＮＡの第２の鎖に一本鎖切断を生成して、オーバーハング配列を生成することができる。場合によっては、第１の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列又は切断部位は、第２の鎖のニッカーゼのガイドＲＮＡ標的配列又は切断部位から、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２５０、５００、又は１，０００塩基対離れている。
Ｃ．その他のヌクレアーゼ剤
他のタイプの既知のレアカットヌクレアーゼ剤はまた、本明細書に記載の方法で使用することができる。そのようなヌクレアーゼ剤の一例は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、ＤＮＡの特定の標的配列で二本鎖切断を行うために使用できる配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然又は操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、又はその機能的部分を、例えば、ＦｏｋＩなどのエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合することによって生成される。独自のモジュラーＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインにより、所与のＤＮＡ認識特異性を備えたタンパク質の設計が可能になる。したがって、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、特定のＤＮＡ標的部位を認識するように操作することができ、したがって、所望の標的配列で二本鎖切断を行うために使用することができる。それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１０／０７９４３０号；Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒら（２０１０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０７（５０）：２１６１７－２１６２２；Ｓｃｈｏｌｚｅ及びＢｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ １：４２８－４３２；ＣｈｒｉｓｔｉａｎらＧｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７－７６１；Ｌｉら（２０１０）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．（２０１０）３９（１）：３５９－３７２；及びＭｉｌｌｅｒら（２０１１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９：１４３－１４８を参照されたい。
適切なＴＡＬヌクレアーゼの例、及び適切なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、これらのそれぞれは、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第２０１１／０２３９３１５号、米国特許第２０１１／０２６９２３４号、米国特許第２０１１／０１４５９４０号、米国特許第２００３／０２３２４１０号、米国特許第２００５／０２０８４８９号、米国特許第２００５／００２６１５７号、米国特許第２００５／００６４４７４号、米国特許第２００６／０１８８９８７号、及び米国特許第２００６／００６３２３１号で開示される。
一部のＴＡＬＥＮでは、ＴＡＬＥＮの各モノマーは、２つの超可変残基を介して単一の塩基対を認識する３３～３５のＴＡＬリピートを含む。ＴＡＬＥＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質であってもよい。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメイン及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むことができ、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結され、第１及び第２のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、様々な長さ（１２～２０ｂｐ）のスペーサー配列によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖における２つの連続した標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットは二量体化して、標的配列で二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを生成する。
適切なヌクレアーゼ剤の別の例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が挙げられる。一部のＺＦＮでは、ＺＦＮの各モノマーは３つ以上のジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、各ジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインは３ｂｐのサブサイトに結合する。他のＺＦＮでは、ＺＦＮは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼなどの独立したヌクレアーゼに作動可能に連結されたジンクフィンガーベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。例えば、ヌクレアーゼ剤は、第１のＺＦＮ及び第２のＺＦＮを含むことができ、第１及び第２のＺＦＮのそれぞれは、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットに作動可能に連結され、第１及び第２のＺＦＮは、約５～７ｂｐのスペーサーで分離された標的ＤＮＡ配列のそれぞれの鎖において２つの連続した標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼサブユニットが二量体化して、二本鎖切断を行う活性ヌクレアーゼを生成する。例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２００６／０２４６５６７号、米国特許第２００８／０１８２３３２号、米国特許第２００２／００８１６１４号、米国特許第２００３／００２１７７６号、国際公開第２００２／０５７３０８号、米国特許第２０１３／０１２３４８４号、米国特許第２０１０／０２９１０４８号、国際公開第２０１１／０１７２９３号、及びＧａｊら（２０１３）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３１（７）：３９７－４０５を参照されたい。
別のタイプの適切なヌクレアーゼ剤は、操作されたメガヌクレアーゼである。メガヌクレアーゼは、保存された配列モチーフに基づいて４つのファミリーに分類されており、ファミリーはＬＡＧＬＩＤＡＤＧ、ＧＩＹ－ＹＩＧ、Ｈ－Ｎ－Ｈ、及びＨｉｓ－Ｃｙｓボックスファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位とホスホジエステル結合の加水分解に関与する。メガヌクレアーゼは、それらの長い標的配列、及びそれらのＤＮＡ基質におけるいくつかの配列多型を許容することで注目に値する。メガヌクレアーゼドメイン、構造及び機能は既知であり、例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕｈａｎ及びＭｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８：１９９－２４８、Ｌｕｃａｓら（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２９：９６０－９、Ｊｕｒｉｃａ及びＳｔｏｄｄａｒｄ（１９９９）Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．５５：１３０４－２６、Ｓｔｏｄｄａｒｄら（２００６）Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．３８：４９－９５、及びＭｏｕｒｅら（２００２）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．９：７６４を参照されたい。いくつかの例では、天然に存在する変異体及び／又は操作された誘導体メガヌクレアーゼが使用される。動態、補因子相互作用、発現、最適条件、及び／又は標的配列特異性を改変するための方法、及び活性のスクリーニングは公知である。例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｐｉｎａｔら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２９５２－６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒら（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ１０：８９５－９０５、Ｇｉｍｂｌｅら（２００３）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３４：９９３－１００８、Ｓｅｌｉｇｍａｎら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：３８７０－９、Ｓｕｓｓｍａｎら（２００４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４２：３１－４１、Ｒｏｓｅｎら（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：４７９１－８００、Ｃｈａｍｅｓら（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ１７８、Ｓｍｉｔｈら（２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：ｅ１４９、Ｇｒｕｅｎら（２００２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３０：ｅ２９、Ｃｈｅｎ及びＺｈａｏ（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３３：ｅ１５４、国際公開第２００５／１０５９８９号、国際公開第２００３／０７８６１９号、国際公開第２００６／０９７８５４号、国際公開第２００６／０９７８５３号、国際公開第２００６／０９７７８４、及び国際公開第２００４／０３１３４６号を参照されたい。
例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｃｅＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ－ＴｌｉＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｆ－ＳｃｅＩ、Ｆ－ＳｃｅＩＩ、Ｆ－ＳｕｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＡｍａＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｍｏｅＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＣｖｕＩ、Ｉ－ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ－ＤｄｉＩ、Ｉ－ＤｄｉＩＩ、Ｉ－ＤｉｒＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＨｓＮＩＰ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、Ｉ－ＮａａＩ、Ｉ－ＮａｎＩ、Ｉ－ＮｃＩＩＰ、Ｉ－ＮｇｒＩＰ、Ｉ－ＮｉｔＩ、Ｉ－ＮｊａＩ、Ｉ－Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ－ＰａｋＩ、Ｉ－ＰｂｏＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＡＩ、Ｉ－ＰｃｕＶＩ、Ｉ－ＰｇｒＩＰ、Ｉ－ＰｏｂＩＰ、Ｉ－ＰｏｒＩ、Ｉ－ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ－ＰｂｐＩＰ、Ｉ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｅｘＩＰ、Ｉ－ＳｎｅＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩ、Ｉ－ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ－ＳｑｕＩＰ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ－ＴｄｅＩＰ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＵａｒＡＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ－ＶｉｎＩＰ、Ｉ－ＺｂｉＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＩ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、ＰＩ－Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩＩ、ＰＩ－ＴｈｙＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、又はそれらのアクティブな変異体又はフラグメントを含む、任意のメガヌクレアーゼを使用することができる。
メガヌクレアーゼは、例えば、１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識することができる。場合によっては、メガヌクレアーゼは、ゲノム内の完全に一致する１つの標的配列を認識する。一部のメガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。ホーミングヌクレアーゼの１つのタイプは、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、及びＩ－Ｄｍｏｌを含むホーミングヌクレアーゼのＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーである。
ＶＩＩＩ．選択カセット
本明細書に記載の方法では、任意の適切な選択カセットを使用することができる。選択カセットという用語は、選択可能なマーカーをコードする核酸に作動可能に連結された１つ又は複数の発現制御配列（例えば、細菌細胞における発現のためのプロモーター及び／又はエンハンサー、転写後調節エレメント、及びポリ（Ａ）配列などの他の調節配列）を含む発現カセットを指す。選択カセットは、細菌細胞での選択を可能にするか、細菌細胞と真核細胞又は哺乳動物細胞の両方での選択を可能にすることができる。一例として、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの遺伝子を使用することができる。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼは、原核細胞にカナマイシン耐性を、真核細胞にＧ４１８耐性を付与する。そのような遺伝子は、例えば、真核生物プロモーター（例えば、真核生物ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター）及び原核生物プロモーター（例えば、原核生物ＥＭ７プロモーター）を組み合わせた二重プロモーターシステムと組み合わせて使用することができる。
本明細書に記載の方法で使用できるいくつかの選択カセットは、そうでなければ細菌細胞を死滅させるか又は増殖を阻害する抗生物質に対する耐性を付与することができる。例えば、選択カセットは、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、テトラサイクリン、又はクロラムフェニコールに対する耐性を付与することができる。これらの抗生物質及び他のものに耐性を付与するそのような選択カセット及び遺伝子は公知である。選択カセットを含む細胞は、細胞を抗生物質で処理することによって選択することができる。抗生物質に耐性のある細胞は、選択カセットを含む。
他の選択カセットは、意図された改変を含む細胞を選択するために使用することができるレポーター遺伝子を含むことができる。レポーター遺伝子という用語は、異種プロモーター及び／又はエンハンサーエレメントに作動可能に連結されたレポーター遺伝子配列を含む構築物が、プロモーター及び／又はエンハンサーエレメントの活性化に必要な因子を含む（又は含むようにすることができる）細胞に導入される際に、容易かつ定量的にアッセイされる遺伝子産物（典型的には酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。レポーター遺伝子の例としては、蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。レポータータンパク質とは、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
蛍光レポータータンパク質は、蛍光に基づいて検出可能なレポータータンパク質であり、蛍光は、レポータータンパク質から直接、蛍光性基質上のレポータータンパク質の活性、又は蛍光タグ付き化合物に結合する親和性を有するタンパク質のいずれかからのものであってもよい。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ－２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、及びＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、及びＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、及びＴ－ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン色蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、及びＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ－Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄモノマー、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄモノマー、ＨｃＲｅｄ－Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、及びＪｒｅｄ）、オレンジ色蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ－Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、及びｔｄＴｏｍａｔｏ）、及びフローサイトメトリー法で細胞内の存在を検出できるその他の適切な蛍光タンパク質メソッドが挙げられる。蛍光レポーター遺伝子を含む細胞は、例えば、遺伝子によってコードされる蛍光レポータータンパク質を含む細胞を選別することによって選択することができる。
ＩＸ．標的化改変
本明細書に記載の方法を使用して、様々なタイプの標的化遺伝子改変を導入することができる。そのような標的化遺伝子改変は、例えば、１つ又は複数のヌクレオチドの挿入、１つ又は複数のヌクレオチドの欠失、又は１つ又は複数のヌクレオチドの置換（置換）を含むことができる。そのような挿入、欠失、又は置換は、例えば、点変異、目的の塩基配列又はその一部のノックアウト、目的の塩基配列又はその一部のノックイン、内因性核酸配列と異種又は外因性核酸配列との置換、内因性核酸配列と同種又はオーソロガス核酸配列との置換（例えば、ドメインスワップ、エキソンスワップ、イントロンスワップ、調節配列スワップ、又は遺伝子スワップ）、調節エレメント（例えば、プロモーター又はエンハンサー）の改変、ミスセンス変異、ナンセンス変異、フレームシフト変異、トランケーション変異、ヌル変異、又はそれらの組み合わせをもたらすことができる。例えば、少なくとも１、２、３、４、５、７、８、９、１０個又はそれ以上のヌクレオチドを変更（例えば、欠失、挿入、又は置換）して、標的化遺伝子改変を形成することができる。本明細書の他の場所に開示されているように、欠失、挿入、又は置換は、任意のサイズであってもよい。例えば、それぞれが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｗａｎｇら（２０１３）Ｃｅｌｌ１５３：９１０－９１８、Ｍａｎｄａｌｏｓら（２０１２）ＰＬＯＳ Ｏｎｅ７：ｅ４５７６８、及びＷａｎｇら（２０１３）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：５３０－５３２を参照されたい。
欠失、挿入、又は置換は任意の長さであってもよい。欠失、挿入、又は置換された核酸は、例えば、約１ｂｐ～約５ｂｐ、約５ｂｐ～約１０ｂｐ、約１０ｂｐ～約５０ｂｐ、約５０ｂｐ～約１００ｂｐ、約１００ｂｐ～約２００ｂｐ、約２００ｂｐ～約３００ｂｐ、約３００ｂｐ～約４００ｂｐ、約４００ｂｐ～約５００ｂｐ、約５００ｂｐ～約１ｋｂ、約１ｋｂ～約５ｋｂ、約５ｋｂ～約１０ｋｂ、約１０ｋｂ～約２０ｋｂ、約２０ｋｂ～約４０ｋｂ、約４０ｋｂ～約６０ｋｂ、約６０ｋｂ～約８０ｋｂ、約８０ｋｂ～約１００ｋｂ、約１００ｋｂ～約１５０ｋｂ、又は約１５０ｋｂ～約２００ｋｂ、約２００ｋｂ～約３００ｋｂ、約３００ｋｂ～約４００ｋｂ、又は約４００ｋｂ～約５００ｋｂであってもよい。
上記又は下記で引用されている全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、各項目が、参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、全ての目的に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが違う時間にアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日においてアクセッション番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、アクセッション番号に関する実際の出願日以前又は優先出願の出願日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。別段に他の指示がない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、又は態様を、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さ及び理解の目的に対し図表及び例を介していくつかの詳細が記載されているが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変化及び改変を実施することができることが明らかになろう。
配列の簡単な説明
添付の配列表に列記されているヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、及びアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進み３’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重変異体もまた提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。
Figure 0007065260000002
例
例１．細菌相同組換え及び分子内ギブソンアセンブリを介した大きな標的化ベクターへの標的改変の瘢痕のない導入
ギブソンアセンブリ技術は、相同末端を有するＤＮＡのセグメントを単一分子に結合する。最小サイズの任意の相補配列を使用できるという点で、制限酵素によって作成された相補的な付着末端間の従来のライゲーションとは異なる。制限部位を介したクローニングは、一般に、外因性のＤＮＡ瘢痕（酵素認識部位）を最終産物に組み込む結果となるため、ギブソンアセンブリはシームレスであり得るので有利である。
ギブソンアセンブリ反応は等温であり、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼの３つの異なる酵素が関与する。例えば、それぞれが全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第２０１０／００３５７６８号、米国特許第２０１５／０３７６６２８号、国際公開第２０１５／２００３３４号、及びＧｉｂｓｏｎら（２００９）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ６（５）：３４３－３４５を参照されたい。反応は一本鎖ＤＮＡの生成から開始され、Ｔ５エキソヌクレアーゼによる５’から３’のエキソヌクレアーゼ活性により終了する。次いで、相補的な一本鎖末端を有するＤＮＡフラグメントは、単純な塩基対形成規則によって整列し、ＤＮＡポリメラーゼは５’から３’に移動してギャップを埋める。ＤＮＡリガーゼが最後のニックを密封し、シームレスな二本鎖ＤＮＡ分子をもたらす。４０塩基対の相補的な末端が効果的であることが示されており、実際の配列は一般的に重要ではない。開始フラグメントは、ＰＣＲ、制限、又は直接合成によって生成することができる。
制限部位又は他の操作によって生成された瘢痕は、それらが調節にとって重要な領域に着地した場合、遺伝子発現に悪影響を与える可能性があるため、トランスジェニック動物系統を作成する際にはシームレスＤＮＡ構築は特に重要である。哺乳類のゲノムを標的とすることは、相同組換えを指示するための長いＤＮＡアームを備えた大きな標的化ベクターの構築、及び胚性幹細胞クローンの選択のための抗生物質耐性カセットを必要とすることが多い。正しく標的化されたクローンには、耐性カセット自体は言うまでもなく、ベクターの構築に必要な複数の瘢痕が含まれていることが多い。遺伝子破壊の場合、これらの病変は最終結果（ヌル対立遺伝子）にとって問題ではないかもしれないが、隣接遺伝子による発現が悪影響を受ける可能性が常に存在する。ノックアウト以外のノックインなどの改変（レポーターや変異対立遺伝子など）の場合、通常、標的遺伝子座を忠実に発現させることが問題の研究にとって重要である。ギブソンアセンブリは、これらの瘢痕のいくつかの必要性を排除することができ、場合によってはベクター自体の構築を容易にすることさえできるが、固有の制限部位を見出すことは困難である可能性がある。
マウスの遺伝子をそのヒトの対応物で直接置き換えるヒト化は、特に、マウスの転写機構が新しい対立遺伝子の発現を忠実に複製するように、マウスとヒトの配列との間のシームレスな接合を必要とする。遺伝子調節に影響を与えない非コード領域に構築瘢痕及び選択カセットを埋め込むように注意しなければならない。動物モデルがより複雑になるにつれて、ヒト化対立遺伝子にヒト疾患を引き起こす変異など、既存のモデルの上に更に多くの改変が追加される可能性がある。次いで、更に変化により、既に高度に操作されたマウス遺伝子座に更に多くの瘢痕及び別の選択カセットを付加することができ、発現が変化し、マウスモデルがヒト疾患に忠実でない可能性を増加させる。構築の観点から、既に１つのカセットを含むベクターに新しいカセットを加えることは、２つのカセットが異なる選択をコードする場合であっても、プロモーター及びポリ（Ａ）シグナルなどの共有カセットエレメント間の望ましくない組換えのために複雑になり得る。
これらのハードルを考慮して、ヒト化対立遺伝子及び上部に層状化された疾患変異などの複数の変化を上に重ねた標的化ベクターの生成を簡素化する方法を開発した。これらの方法は、より簡単な構築を可能にし、最終的な動物モデルに組み込まれる瘢痕を最小限に抑える。
第１の方法では、短い（５００ｂｐ未満）相同性アームに隣接する、目的の変異を有するＤＮＡの小片を合成する。所望の変異の数塩基対下流である４０～５０塩基対の領域を選択し、重複させて、レア制限部位、又は耐性カセットに隣接するＣａｓ９ガイドＲＮＡ標的配列に隣接する直接反復を生成する。次いで、この小さな構築物を、再結合技術によって、確立されたマウス標的化ベクター（独自の耐性カセットを有するヒト化標的化ベクターなど）と相同組換えする。所望の変異が組み込まれていることを確認した後、新しいベクターをレアカッター／Ｃａｓ９ガイドで切断し、カセットを脱落させて、４０～５０塩基対の直接反復を露出させる。ギブソンアセンブリは、分子内反応でシームレスに切断を密封する。得られた標的化ベクターは、ここで、所望の変異を有しており、ヒト化に元々存在していたもの以外に追加の瘢痕又はカセットはない。
特定の例では、ヒト化標的遺伝子１を含む標的構築物（大きな標的化ベクター）に点変異を組み込んだ対立遺伝子を生成した。図１を参照されたい。点変異をこれらのヒト化マウスＥＳ細胞に導入するために、ヒト化標的遺伝子１を含むヒト化マウス胚性幹（ＥＳ）細胞を再標的化しなければならない代わりに、点変異を有するヒト化標的遺伝子１を含む大きな標的化ベクターを効率的かつシームレスに作成することが目標であった。第１の標的構築物は、開始コドンから終止コドンまでの対応するマウス標的遺伝子１のマウスゲノム配列を置換するために、全てのイントロンを含む、開始コドンから終止コドンまでのヒト標的遺伝子１ゲノム配列を含んでいた。更に、標的構築物のインサート核酸は、ポリ（Ａ）配列の下流にある自己欠失型ハイグロマイシン耐性カセットを含んでいた。次いで、この開始ヒト化ベクターを、ＡｓｃＩ制限部位及び点変異のすぐ下流のヒト標的遺伝子１配列の５０塩基対の直接反復に隣接する、点変異及びネオマイシン耐性カセットを用いて上述のように改変した。次いで、レア制限部位（ＡｓｃＩ）に隣接するＥＭ７ネオマイシンカセット、及び変異が導入されるエキソンからの５０ｂｐの直接反復、並びに上流の相同性ボックスに導入される変異を含む上流及び下流の相同性ボックスを含むように核酸を合成した。図２を参照されたい。ネオマイシン耐性カセットをエキソンの中央に挿入して変異させたが、方法がシームレスであるため、方法の最後にエキソンを再現した。核酸は、ＨｉｎｄＩＩＩによる切断によって直鎖状にし、細菌相同組換えを使用して、直鎖状にされた合成核酸を、ヒト化標的遺伝子１を含む大きな標的化ベクターに挿入した。例えば、それぞれが参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＵＳ２００４／００１８６２６及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａら、（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（６）：６５２－６５９を参照されたい。ネオマイシンカセットをＡｓｃＩで切除し、ネオマイシンカセットを脱落させ、直接反復を露出させた。次いで、分子内ギブソンアセンブリによって構築物を再密封し、直接反復を単一コピーに分解し、エキソン（ここでは変異を含む）を瘢痕のない無傷のままにした。ギブソンアセンブリに続いて、ギブソンアセンブリ中にＡｓｃＩ部位を欠失させなかったものを切断し、それによってバックグラウンドを減少させるために、反応物を再びＡｓｃＩで消化した。最終的なシーケンシングにより、点変異の存在が確認され、元の標的化ベクターからの追加の変化はなかった。新たな改変ベクターをマウス胚性幹細胞にエレクトロポレーションし、ＴＡＱＭＡＮとそれに続くサンガーシーケンシングによって陽性クローンを同定し、点変異の取り込みを確認した。
例２．細菌相同組換え及び分子間ギブソンアセンブリを介した大きな標的化ベクターへの標的改変の瘢痕のない導入
第２の方法では、２つの一般的なステップで、所望の変異が細菌人工染色体（ＢＡＣ）ＤＮＡに導入される。第１ステップでは、ＢＡＣの対象領域（変異の両側で約１００～２００ｂｐに及ぶ領域）が、両側にレアカッター制限酵素部位が隣接する選択カセットを使用した細菌相同組換えによって欠失される。第２のステップでは、レアカッター部位に隣接する標的ＢＡＣ配列に相同な異種５’及び３’末端を有する約２００～５００ｂｐのＤＮＡフラグメントを使用して、ギブソンアセンブリによって所望の変異配列にＢＡＣ欠失を置換した。この目的のために、第１のステップで標的化ＢＡＣをレアカッター酵素で消化し、変異フラグメントに相同な両端を露出させる。制限酵素はまた、標的化ＢＡＣを開いたままにし、選択マーカーを追加することなくバックグラウンド反応を低くすることができる。図３を参照されたい。この方法は、例えば、ＰＣＲでは取得できない大きなフラグメント（例えば、１５ｋｂ又は３０ｋｂ）を構築物に挿入する必要がある場合に特に有益である。例えば、このような大きなフラグメントは、ＢＡＣなどのソースから切り取って（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して）、次いで、ギブソンアセンブリを使用して、このフラグメントの５’及び３’末端に相同性を有する改変ＢＡＣを挿入して、最終的な標的構築物を作成することができる。
特定の例では、この方法を使用して、ヒト化標的遺伝子２を含む大きな標的化ベクターにスプライス変異を導入した。最初の標的構築物は、マウス標的遺伝子２の対応するゲノム配列を開始コドンから最後のエキソンの前まで置換するように設計されたイントロンを含む野生型標的遺伝子２ゲノム配列を含有し、イントロン中に自己欠失ネオマイシン耐性カセットを付加した。次いで、この開始ヒト化ベクターを、ＡｓｃＩ制限部位及び所望のスプライス変異の下流及び上流への４０塩基対の相同配列に隣接するハイグロマイシン耐性カセットで上記のように改変した。ハイグロマイシンカセットをＡｓｃＩで切除し、分子間ギブソンアセンブリにより、レアカッター部位に隣接する標的化標的構築物配列に相同な異種５’及び３’末端に隣接するスプライス変異を含むＤＮＡフラグメントを用いて構築物を再密封した。最終的なシーケンシングにより、スプライス変異の存在が確認され、元の標的化ベクターからの追加の変化はなかった。新たな改変ベクターをマウス胚性幹細胞にエレクトロポレーションし、ＴＡＱＭＡＮとそれに続くサンガーシーケンシングによって陽性クローンを同定し、スプライス変異の取り込みを確認した。
第３の方法では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、細菌人工染色体（ＢＡＣ）からヒトＤＮＡフラグメントを切り出す。このヒトＤＮＡフラグメントを、ギブソンアセンブリによって、以前に選択カセットで標的にされたマウスＢＡＣに融合する。レアカッター制限酵素部位は、ヒトのフラグメントが組み込まれる領域に設計されている。標的化マウスＢＡＣでは、このレアカッター制限部位の両側に４０ｂｐの相同性配列がある。相同性配列は、ヒトＤＮＡフラグメントの５’及び３’末端に相同である。最終的な構築物は、標的化された元のマウスＢＡＣと同じ抗生物質で選択される。最終的なギブソンアセンブリ反応に新規の選択が組み込まれていなくても、バックグラウンドが低いことが観察される。ギブソンアセンブリに続くレア制限酵素の追加は、バックグラウンドを低レベルに維持する。
特定の例では、上記の実験は、標的タンパク質３の外部ドメインをコードする標的遺伝子３の領域を含む対立遺伝子をマウス標的遺伝子３に組み込むことであった。最初の標的構築物には、イントロンを含む野生型マウスの標的遺伝子３ゲノム配列が含まれていました。自己削除ネオマイシン耐性カセットは、細菌相同組換えによって追加され、マウスの標的遺伝子３外部ドメインをコードする領域が欠失された。ネオマイシン耐性カセットの上流には、ヒトフラグメントと相互作用するヒト相同性の５’及び３’４０ｂｐ領域を分離するＳｇｒＤＩ制限部位があった。これらの配列は全て、前述の細菌相同組換えによって組み込まれた。３２ｋｂ長のヒトＤＮＡフラグメントをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によってヒトＢＡＣから切り出し、ＳｇｒＤＩ消化によって開かれたマウス標的ＢＡＣとの分子内ギブソンアセンブリ反応のために５’及び３’末端を露出させたままにした。新たな改変ベクターをマウス胚性幹細胞にエレクトロポレーションし、ＴＡＱＭＡＮによって陽性クローンを同定した。

Claims (30)

  1. 既存の標的化ベクターに瘢痕のない標的化遺伝子改変を導入するための方法であって、
    （ａ）細菌細胞の集団において、前記既存の標的化ベクターと改変カセットとの間で細菌相同組換えを実行することであって、
    前記改変カセットが、標的化遺伝子改変を含み、前記既存の標的化ベクターの５’標的配列に対応する５’相同性アーム及び前記既存のベクターの３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含み、前記挿入核酸が、５’から３’の方向に、
    （ｉ）第１の反復配列と、
    （ｉｉ）第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位と、
    （ｉｉｉ）選択カセットと、
    （ｉｖ）第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位と、
    （ｖ）第１の反復配列と同一の第２の反復配列と、を含む、細菌相同組換えを実行することと、
    （ｂ）前記選択カセットを含む改変標的化ベクターを含む細菌細胞を選択することと、
    （ｃ）前記改変標的化ベクターの前記第１の標的部位を前記第１のヌクレアーゼ剤で切断し、前記改変標的化ベクターの前記第２の標的部位を第２のヌクレアーゼ剤で切断して、前記選択カセットを除去し、前記改変標的化ベクターの前記第１の反復配列及び前記第２の反復配列を露出させることと、
    （ｄ）前記露出された第１の反復配列を前記露出された第２の反復配列と分子内インビトロアセンブリ反応においてアセンブルして、前記瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む前記標的化ベクターを生成することであって、
    前記瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む前記標的化ベクター中に、前記第１のヌクレアーゼ剤の前記第１の標的部位も前記第２のヌクレアーゼ剤の前記第２の標的部位も存在せず、前記反復配列の単一コピーのみが存在する、標的化ベクターを生成することとを含む、方法。
  2. （Ｉ）
    （ａ）前記反復配列が、前記既存の標的化ベクター中の配列と同一であるか、もしくは
    （ｂ）前記標的化遺伝子改変が挿入された配列を含み、前記反復配列が前記挿入された配列の５’末端又は３’末端と同一である、及び／又は
    （ＩＩ）
    前記反復配列が少なくとも２０ヌクレオチド長であり、必要に応じて、前記反復配列が２０ヌクレオチド長～１００ヌクレオチド長である、
    請求項１に記載の方法。
  3. （Ｉ）前記改変カセットが直鎖状二本鎖核酸である、及び／又は
    （ＩＩ）前記改変カセットが１ｋｂ～１５ｋｂ長である、
    請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記５’相同性アーム及び前記３’相同性アームがそれぞれ少なくとも３５ヌクレオチド長であるか、または前記５’相同性アーム及び前記３’相同性アームがそれぞれ３５ヌクレオチド長～５００ヌクレオチド長である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤がレアカットヌクレアーゼ剤である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. （Ｉ）前記第１の標的部位及び／又は前記第２の標的部位が前記既存の標的化ベクターに存在しない、及び／又は
    （ＩＩ）前記第１の標的部位が前記第２の標的部位と同一であり、前記第１のヌクレアーゼ剤が前記第２のヌクレアーゼ剤と同一である、
    請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. （Ｉ）前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤が、レアカット制限酵素を含み、必要に応じて、前記レアカット制限酵素が、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＳｓｔＩＩ、Ｓａｌｌ、ＮｒｕＩ、ＮｈｅＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＣＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＳｂｆＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｗａＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｆｉＩ、ＣｓｐＣＩ、ＡｂｓＩ、ＣｃｉＮＩ、ＦｓｐＡＩ、ＭａｕＢＩ、ＭｒｅＩ、ＭｓｓＩ、ＰａｌＡＩ、ＲｇａＩ、ＲｉｇＩ、ＳｄａＩ、ＳｆａＡＩ、ＳｇｆＩ、ＳｇｒＤＩ、ＳｇｓＩ、ＳｍｉＩ、ＳｒｆＩ、Ｓｓｅ２３２１、Ｓｓｅ８３８７１、ＬｇｕＩ、ＰｃｉＳＩ、ＡａｒＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｒＩ、ＰｐｉＩ、もしくはＰｓｒＩであるか、または
    （ＩＩ）前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、もしくは操作されたメガヌクレアーゼであり、
    必要に応じて、前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤がＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質であり、前記ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、
    請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記標的化遺伝子改変が、
    （Ｉ）前記５’相同性アームもしくは前記３’相同性アームにおける改変、または
    （ＩＩ）前記挿入核酸における改変
    を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記標的化遺伝子改変が、点変異、欠失、挿入、置換、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記選択カセットが抗生物質に対する耐性を付与し、必要に応じて、前記選択カセットが、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、又はポリミキシンＢに対する耐性を付与する、
    請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記既存の標的化ベクターが、少なくとも１０ｋｂ長の大きな標的化ベクターであるか、または前記既存の標的化ベクターが少なくとも１００ｋｂ長である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記既存の標的化ベクターが第２の選択カセットを含み、
    必要に応じて、前記第２の選択カセットが抗生物質に対する耐性を付与し、
    必要に応じて、前記改変カセット中の前記選択カセット及び前記既存の標的化ベクター中の前記第２の選択カセットがそれぞれ、異なる抗生物質に対する耐性を付与し、ならびに／又は
    必要に応じて、前記第２の選択カセットが、細菌細胞及び哺乳動物細胞の両方での選択を可能にする、
    請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. ステップ（ｃ）がインビトロで行われる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. ステップ（ｄ）が、
    （ｉ）前記改変標的化ベクターをエキソヌクレアーゼと接触させて、前記第１の反復配列と前記第２の反復配列との間の相補配列を露出させることと、
    （ｉｉ）前記露出した相補配列をアニーリングすることと、
    （ｉｉｉ）前記アニーリングした相補配列の３’末端を伸長することと、
    （ｉｖ）前記アニーリングした相補配列をライゲーションすることと、を含み、
    必要に応じて、ステップ（ｄ）が、前記改変標的化ベクターをエキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼと共にインキュベートすることを含む
    請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 更に、
    （ｅ）ステップ（ｄ）のインビトロアセンブリに続いて、前記標的化ベクターを前記第１のヌクレアーゼ剤及び前記第２のヌクレアーゼ剤で処理して、前記第１のヌクレアーゼ剤の前記第１の標的部位も前記第２のヌクレアーゼ剤の前記第２の標的部位も存在しないことを確認することを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 既存の標的化ベクターに瘢痕のない標的化遺伝子改変を導入するための方法であって、
    （ａ）細菌細胞の集団において、前記既存の標的化ベクターと欠失カセットとの間で細菌相同組換えを実行することであって、
    前記欠失カセットが、前記既存の標的化ベクターの５’標的配列に対応する５’相同性アーム及び前記既存のベクターの３’標的配列に対応する３’相同性アームに隣接する挿入核酸を含み、前記５’標的配列及び前記３’標的配列が、前記標的化遺伝子改変が導入される前記既存の標的化ベクターの領域に隣接し、前記挿入核酸が、５’から３’の方向に、
    （ｉ）第１のヌクレアーゼ剤の第１の標的部位と、
    （ｉｉ）選択カセットと、
    （ｉｉｉ）第２のヌクレアーゼ剤の第２の標的部位と、を含む、細菌相同組換えを実行することと、
    （ｂ）前記選択カセットを含む改変標的化ベクターを含む細菌細胞を選択することと、
    （ｃ）前記改変標的化ベクターの前記第１の標的部位を前記第１のヌクレアーゼ剤で切断し、前記改変標的化ベクターの前記第２の標的部位を第２のヌクレアーゼ剤で切断して、前記選択カセットを除去し、前記改変標的化ベクターの上流末端配列及び下流末端配列を露出させることと、
    （ｄ）インビトロアセンブリ反応において、前記切断された標的化ベクターを、前記改変標的化ベクターの上流末端配列と重複する上流末端配列及び前記改変標的化ベクターの下流末端配列と重複する下流末端配列と隣接する標的化遺伝子改変を含む改変カセットとアセンブルして、前記瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む前記標的化ベクターを生成することであって、
    前記瘢痕のない標的化遺伝子改変を含む前記標的化ベクター中に、前記第１のヌクレアーゼ剤の前記第１の標的部位も前記第２のヌクレアーゼ剤の前記第２の標的部位も存在しない、標的化ベクターを生成することとを含む、方法。
  17. （Ｉ）前記欠失カセットが１ｋｂ～１５ｋｂ長である、及び／又は
    （ＩＩ）前記欠失カセットが直鎖状二本鎖核酸である、
    請求項１６に記載の方法。
  18. 前記５’相同性アーム及び前記３’相同性アームがそれぞれ少なくとも３５ヌクレオチド長であるか、または前記５’相同性アーム及び前記３’相同性アームがそれぞれ３５ヌクレオチド長～５００ヌクレオチド長である、請求項１６又は１７に記載の方法。
  19. 前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤がレアカットヌクレアーゼ剤である、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. （Ｉ）前記第１の標的部位及び／又は前記第２の標的部位が前記既存の標的化ベクターに存在しない、及び／又は
    （ＩＩ）前記第１の標的部位が前記第２の標的部位と同一であり、前記第１のヌクレアーゼ剤が前記第２のヌクレアーゼ剤と同一である、
    請求項１６から１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. （Ｉ）前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤が、レアカット制限酵素を含み、必要に応じて、前記レアカット制限酵素が、ＮｏｔＩ、ＸｍａＩＩＩ、ＳｓｔＩＩ、Ｓａｌｌ、ＮｒｕＩ、ＮｈｅＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、ＢｂｖＣＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、ＦｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｍｅＩ、ＳｂｆＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｗａＩ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＳｆｉＩ、ＣｓｐＣＩ、ＡｂｓＩ、ＣｃｉＮＩ、ＦｓｐＡＩ、ＭａｕＢＩ、ＭｒｅＩ、ＭｓｓＩ、ＰａｌＡＩ、ＲｇａＩ、ＲｉｇＩ、ＳｄａＩ、ＳｆａＡＩ、ＳｇｆＩ、ＳｇｒＤＩ、ＳｇｓＩ、ＳｍｉＩ、ＳｒｆＩ、Ｓｓｅ２３２１、Ｓｓｅ８３８７１、ＬｇｕＩ、ＰｃｉＳＩ、ＡａｒＩ、ＡｌｏＩ、ＢａｒＩ、ＰｐｉＩ、もしくはＰｓｒＩであるか、または
    （ＩＩ）前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤が、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）タンパク質及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、もしくは操作されたメガヌクレアーゼであり、必要に応じて、前記第１のヌクレアーゼ剤及び／又は前記第２のヌクレアーゼ剤がＣａｓタンパク質及びｇＲＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９タンパク質であり、前記ｇＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む、
    請求項１６から２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記選択カセットが抗生物質に対する耐性を付与し、必要に応じて、前記選択カセットが、アンピシリン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、又はポリミキシンＢに対する耐性を付与する、請求項１６から２１のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記既存の標的化ベクターが、少なくとも１０ｋｂ長の大きな標的化ベクターであるか、または前記既存の標的化ベクターが少なくとも１００ｋｂ長である、請求項１６から２２のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記既存の標的化ベクターが第２の選択カセットを含み、
    必要に応じて、前記第２の選択カセットが抗生物質に対する耐性を付与し、
    必要に応じて、前記欠失カセット中の前記選択カセット及び前記既存の標的化ベクター中の前記第２の選択カセットがそれぞれ、異なる抗生物質に対する耐性を付与し、ならびに／又は
    必要に応じて、前記第２の選択カセットが、細菌細胞及び哺乳動物細胞の両方での選択を可能にする、
    請求項１６から２３のいずれか一項に記載の方法。
  25. 前記改変カセットにおける前記上流末端配列と前記改変標的化ベクターにおける前記上流末端配列との間の前記重複の長さ、及び／又は前記改変カセットにおける前記下流末端配列と前記改変標的化ベクターにおける前記下流末端配列との間の前記重複の長さが、少なくとも２０ヌクレオチド長である、または
    前記改変カセットにおける前記上流末端配列と前記改変標的化ベクターにおける前記上流末端配列との間の前記重複の長さ、及び／又は前記改変カセットにおける前記下流末端配列と前記改変標的化ベクターにおける前記下流末端配列との間の前記重複の長さが、２０～１００ヌクレオチド長である、
    請求項１６から２４のいずれか一項に記載の方法。
  26. ステップ（ｃ）がインビトロで行われる、請求項１６から２５のいずれか一項に記載の方法。
  27. ステップ（ｄ）が、
    （ｉ）前記切断された標的化ベクター及び前記改変カセットをエキソヌクレアーゼと接触させて、前記改変標的化ベクターの末端配列と前記改変カセットの末端配列との間の相補配列を露出させることと、
    （ｉｉ）前記露出した相補配列をアニーリングすることと、
    （ｉｉｉ）前記アニーリングした相補配列の３’末端を伸長することと、
    （ｉｖ）前記アニーリングした相補配列をライゲーションすることと、を含み、
    必要に応じて、ステップ（ｄ）が、前記切断された標的化ベクター及び前記改変カセットを、エキソヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、及びＤＮＡリガーゼと共にインキュベートすることを含む、
    請求項１６から２６のいずれか一項に記載の方法。
  28. （Ｉ）前記改変カセットが直鎖状二本鎖核酸である、
    （ＩＩ）前記改変カセットが少なくとも２００ヌクレオチド長であり、必要に応じて、前記改変カセットが少なくとも１０ｋｂ長である、及び／又は
    （ＩＩＩ）前記改変カセットが、ポリメラーゼ連鎖反応によって直接合成又は生成することができないサイズである、
    請求項１６から２７のいずれか一項に記載の方法。
  29. 前記標的化遺伝子改変が、点変異、欠失、挿入、置換、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１６から２８のいずれか一項に記載の方法。
  30. （ｅ）ステップ（ｄ）のインビトロアセンブリに続いて、前記標的化ベクターを前記第１のヌクレアーゼ剤及び前記第２のヌクレアーゼ剤で処理して、前記第１のヌクレアーゼ剤の前記第１の標的部位も前記第２のヌクレアーゼ剤の前記第２の標的部位も存在しないことを確認することを更に含む、請求項１６から２９のいずれか一項に記載の方法。
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