KR20220164748A - 게놈 개변 방법 및 게놈 개변 키트 - Google Patents

게놈 개변 방법 및 게놈 개변 키트 Download PDF

Info

Publication number
KR20220164748A
KR20220164748A KR1020227038024A KR20227038024A KR20220164748A KR 20220164748 A KR20220164748 A KR 20220164748A KR 1020227038024 A KR1020227038024 A KR 1020227038024A KR 20227038024 A KR20227038024 A KR 20227038024A KR 20220164748 A KR20220164748 A KR 20220164748A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sequence
homology arm
recombination
alleles
donor dna
Prior art date
Application number
KR1020227038024A
Other languages
English (en)
Inventor
야스노리 아이자와
도모유키 오노
Original Assignee
가부시키가이샤 로고믹스
고쿠리츠다이가쿠호진 토쿄고교 다이가꾸
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가부시키가이샤 로고믹스, 고쿠리츠다이가쿠호진 토쿄고교 다이가꾸 filed Critical 가부시키가이샤 로고믹스
Publication of KR20220164748A publication Critical patent/KR20220164748A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1135—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against oncogenes or tumor suppressor genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/905—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y201/00—Transferases transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12Y201/01—Methyltransferases (2.1.1)
    • C12Y201/01107—Uroporphyrinogen-III C-methyltransferase (2.1.1.107)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

2개 이상의 알렐을 효율 좋게 개변할 수 있고, 또한 비교적 큰 영역의 개변이 가능한, 게놈 개변 방법 및 상기 게놈 개변 키트를 제공한다. 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐을 개변하는 게놈 개변 방법으로서, (a) 하기 (i) 및 (ii)를, 상기 염색체를 포함하는 세포에 도입하는 공정과, (i) 상기 염색체 게놈의 표적 영역을 표적으로 하는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템, (ii) 서로 상이한 선택 마커 유전자를 갖는, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA(상기 선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 게놈 개변의 대상으로 하는 상기 알렐의 수와 동수 이상이다), (b) 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA가 갖는 모든 선택 마커 유전자에 기초하여, 상기 세포를 선택하는 공정을 포함하는, 게놈 개변 방법.

Description

게놈 개변 방법 및 게놈 개변 키트
본 발명은, 게놈 개변 방법 및 게놈 개변 키트에 관한 것이다.
신규 게놈 편집 툴로서 CRISPR/Cas 시스템이 보고되고 나서, CRISPR/Cas 시스템을 이용한 다양한 연구가 행해지고 있다(예를 들어, 특허문헌 1). CRISPR/Cas 시스템을 이용한 게놈 편집에서는, 가이드 RNA에 의해 표적화된 표적 영역이 Cas9 뉴클레아제에 의해 2본쇄 절단된다. 2본쇄 절단된 DNA는, 상동 재조합 수복(Homology Directed Repair: HDR) 또는 비상동 말단 재결합(Non-Homologous End-Joining Repair: NHEJ)에 의해 수복됨이 알려져 있다. HDR에서는, 표적 영역의 주변 영역과 상동인 서열을 갖는 도너 DNA를 CRISPR/Cas 시스템과 함께 세포에 도입하는 것에 의해, 임의의 서열을 표적 영역에 짜넣을 수 있다.
국제 공개 제2014/093661호
종래의 게놈 개변 기술에서는, HDR에 의해, 2개 이상의 알렐(allele)을 동시에 효율적으로 개변할 수는 없었다. 또한, HDR에 의해, 개변할 수 있는 게놈 영역의 사이즈에는 한계가 있어, 게놈의 대규모 개변(예를 들어, 10kbp)을 효율 좋게 행하는 것은 곤란했다.
그래서, 본 발명은, 2개 이상의 알렐을 효율 좋게 개변할 수 있고, 또한 비교적 큰 영역의 개변이 가능한, 게놈 개변 방법 및 상기 게놈 개변 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명은 일례로서 이하의 태양을 포함한다.
［1］ 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐을 개변하는 게놈 개변 방법으로서,
(a) 하기 (i) 및 (ii)를, 상기 염색체를 포함하는 세포에 도입하는 공정과,
(i) 상기 염색체 게놈의 표적 영역을 표적으로 하는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
(ii) 상기 표적 영역의 상류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암 사이에, 선택 마커 유전자의 염기 서열을 포함하는, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA로서, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA는, 서로 상이한 선택 마커 유전자를 갖고, 상기 선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 게놈 개변의 대상으로 하는 상기 알렐의 수와 동수 이상인, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA,
(b) 상기 공정(a) 후, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA가 갖는 모든 선택 마커 유전자에 기초하여, 상기 세포를 선택하는 공정을 포함하는, 게놈 개변 방법.
［2］ 상기 선택 마커 유전자가 포지티브 선택 마커 유전자이며, 상기 공정(b)가, 상기 알렐의 수와 동수의 상기 포지티브 선택 마커 유전자를 발현하는 세포를 선택하는 공정인, ［1］에 기재된 게놈 개변 방법.
［3］ 상기 선택 마커용 도너 DNA가, 상기 상류 호몰로지 암과 상기 하류 호몰로지 암 사이에, 네거티브 선택 마커 유전자를 추가로 갖는, ［2］에 기재된 게놈 개변 방법.
［4］(c) 상기 공정(b) 후, 상기 표적 영역의 상류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암 사이에, 소망의 염기 서열을 포함하는 재조합용 도너 DNA를, 상기 세포에 도입하는 공정과, (d) 상기 공정(c) 후, 상기 네거티브 선택 마커 유전자를 발현하지 않는 세포를 선택하는 공정을 추가로 포함하는, ［3］에 기재된 게놈 개변 방법.
［5］ 상기 포지티브 선택 마커 유전자가 약제 내성 유전자이며, 상기 네거티브 선택 마커 유전자가 형광 단백질 유전자인, ［3］ 또는 ［4］에 기재된 게놈 개변 방법.
［6］ 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자가, 서열 특이적 엔도뉴클레아제인, ［1］∼［5］ 중 어느 하나에 기재된 게놈 개변 방법.
［7］ 상기 게놈 개변 시스템이, Cas 단백질과, 상기 표적 영역 내의 염기 서열에 상동인 염기 서열을 갖는 가이드 RNA를 포함하는, ［6］에 기재된 게놈 개변 방법.
［8］ 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는, 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐을 개변하는 게놈 개변 키트.
(i) 상기 염색체 게놈의 표적 영역을 표적으로 하는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템
(ii) 상기 표적 영역의 상류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암 사이에, 선택 마커 유전자의 염기 서열을 포함하는, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA로서, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA는, 서로 상이한 선택 마커 유전자를 갖고, 상기 선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 게놈 개변의 대상으로 하는 상기 알렐의 수와 동수 이상인, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA.
［9］ 상기 선택 마커 유전자가 포지티브 선택 마커 유전자인, ［8］에 기재된 게놈 개변 키트.
［10］ 상기 선택 마커용 도너 DNA가, 상기 상류 호몰로지 암과 상기 하류 호몰로지 암 사이에, 네거티브 선택 마커 유전자를 추가로 갖는, ［9］에 기재된 게놈 개변 키트.
［11］ 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자가, 서열 특이적 엔도뉴클레아제인, ［8］∼［10］ 중 어느 하나에 기재된 게놈 개변 키트.
［12］ 상기 게놈 개변 시스템이, Cas 단백질과, 상기 표적 영역 내의 염기 서열에 상동인 염기 서열을 갖는 가이드 RNA를 포함하는, ［8］∼［11］ 중 어느 하나에 기재된 게놈 개변 키트.
본 발명은 일례로서 이하의 태양을 포함한다.
〔1〕 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐이 개변된 세포를 제작하는 방법으로서,
(a) 하기 (i) 및 (ii)를, 2개 이상의 알렐을 포함하는 세포에 도입하여, 상기 2개 이상의 알렐 각각에 선택 마커 유전자를 도입하는 공정과,
(i) 상기 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐 중의 표적 영역을 표적으로 하여, 당해 표적 영역을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
(ii) 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA로서, 각각이 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖고, 또한, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에, 선택 마커 유전자의 염기 서열을 포함하고, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA는, 서로 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자를 각각 갖고, 상기 선택 마커 유전자는, 선택 마커용 도너 DNA의 종류마다 고유하고, 상기 선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 게놈 개변의 대상으로 하는 상기 알렐의 수와 동수 이상인, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA,
(b) 상기 공정(a) 후, 상기 2 이상의 알렐에 대해서 상이한 종류의 선택 마커용 도너 DNA가 각각 상동 재조합되는 것에 의해, 당해 2 이상의 알렐에 각각 구별 가능하게 상이한 고유의 선택 마커 유전자가 도입되고, 도입된 당해 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자의 모두를 발현하는 세포를 선택하는 공정(포지티브 선택을 위한 공정)
을 포함하는, 방법.
〔2〕 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐을 개변하는 방법으로서,
(a) 하기 (i) 및 (ii)를, 2개 이상의 알렐을 포함하는 세포에 도입하여, 상기 2개 이상의 알렐 각각에 선택 마커 유전자를 도입하는 공정과,
(i) 상기 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐 중의 표적 영역을 표적으로 하여, 당해 표적 영역을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
(ii) 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA로서, 각각이 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖고, 또한, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에, 선택 마커 유전자의 염기 서열을 포함하고, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA는, 서로 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자를 각각 갖고, 상기 선택 마커 유전자는, 선택 마커용 도너 DNA의 종류마다 고유하고, 상기 선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 게놈 개변의 대상으로 하는 상기 알렐의 수와 동수 이상인, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA,
(b) 상기 공정(a) 후, 상기 2 이상의 알렐에 대해서 상이한 종류의 선택 마커용 도너 DNA가 각각 상동 재조합되는 것에 의해, 당해 2 이상의 알렐에 각각 구별 가능하게 상이한 고유의 선택 마커 유전자가 도입되고, 도입된 당해 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자의 모두를 발현하는 세포를 선택하는 공정(포지티브 선택을 위한 공정)
을 포함하는, 방법.
〔3〕 표적 영역이 5kbp 이상의 길이를 갖는, 상기 〔1〕 또는 〔2〕에 기재된 방법.
〔4〕 표적 영역이 8kbp 이상의 길이를 갖는, 상기 〔3〕에 기재된 방법.
〔5〕 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA가 각각, 상기 상류 호몰로지 암과 상기 하류 호몰로지 암 사이에, 포지티브 선택용의 선택 마커 유전자와 네거티브 선택용의 마커 유전자와 표적 서열을 갖고, 여기에서, 당해 선택 마커 유전자가 포지티브 선택용으로도 네거티브 선택용으로도 이용되는 경우에는, 별도의 네거티브 선택용의 선택 마커 유전자를 갖고 있지 않아도 되고,
(c) 상기 공정(b) 후, 하기 (iii) 및 (iv)를 선택된 세포에 도입하여 상기 2 이상의 알렐에 재조합용 도너 DNA를 도입하는 공정과,
(iii) 상기 표적 서열을 표적으로 하여, 당해 표적 서열을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
(iv) 소망의 염기 서열을 포함하는 재조합용 도너 DNA로서, 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖는,
재조합용 도너 DNA,
(d) 상기 공정(c) 후, 상기 네거티브 선택용의 마커 유전자를 발현하지 않는 세포를 선택하는 공정(네거티브 선택을 위한 공정)
을 추가로 포함하는, 상기 〔1〕∼〔4〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔6〕 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA가 각각, 상기 상류 호몰로지 암과 상기 하류 호몰로지 암 사이에, 포지티브 선택용의 선택 마커 유전자와 네거티브 선택용의 마커 유전자와 표적 서열을 갖고, 여기에서, 당해 선택 마커 유전자가 포지티브 선택용으로도 네거티브 선택용으로도 이용되는 경우에는, 별도의 네거티브 선택용의 선택 마커 유전자를 갖고 있지 않아도 되고,
(c) 상기 공정(b) 후, 하기 (iii) 및 (iv)를 선택된 세포에 도입하여 상기 2 이상의 알렐에 재조합용 도너 DNA를 도입하는 공정과,
(iii) 상기 표적 서열을 표적으로 하여, 당해 표적 서열을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
(iv) 소망의 염기 서열을 포함하는 재조합용 도너 DNA로서, 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖는,
재조합용 도너 DNA,
(d) 상기 공정(c) 후, 상기 네거티브 선택용의 마커 유전자를 발현하지 않는 세포를 선택하는 공정(네거티브 선택을 위한 공정)
을 추가로 포함하는, 상기 〔3〕에 기재된 방법.
〔7〕 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA가 각각, 상기 상류 호몰로지 암과 상기 하류 호몰로지 암 사이에, 포지티브 선택용의 선택 마커 유전자와 네거티브 선택용의 마커 유전자와 표적 서열을 갖고, 여기에서, 당해 선택 마커 유전자가 포지티브 선택용으로도 네거티브 선택용으로도 이용되는 경우에는, 별도의 네거티브 선택용의 선택 마커 유전자를 갖고 있지 않아도 되고,
(c) 상기 공정(b) 후, 하기 (iii) 및 (iv)를 선택된 세포에 도입하여 상기 2 이상의 알렐에 재조합용 도너 DNA를 도입하는 공정과,
(iii) 상기 표적 서열을 표적으로 하여, 당해 표적 서열을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
(iv) 소망의 염기 서열을 포함하는 재조합용 도너 DNA로서, 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖는, 재조합용 도너 DNA,
(d) 상기 공정(c) 후, 상기 네거티브 선택용의 마커 유전자를 발현하지 않는 세포를 선택하는 공정(네거티브 선택을 위한 공정)
을 추가로 포함하는, 상기 〔4〕에 기재된 방법.
〔8〕 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 5kbp 이상의 길이를 갖는, 상기 〔5〕∼〔7〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔9〕 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 5kbp 이상의 길이를 갖는, 상기 〔6〕 또는 〔7〕에 기재된 방법.
〔10〕 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 5kbp 이상의 길이를 갖는, 상기 〔7〕에 기재된 방법.
〔11〕 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 8kbp 이상의 길이를 갖는, 상기 〔8〕에 기재된 방법.
〔12〕 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는, 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐을 개변하는 게놈 개변 키트.
(i) 상기 염색체 게놈의 표적 영역을 표적으로 하여, 표적 영역을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
(ii) 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA로서, 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖고, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에, 선택 마커 유전자의 염기 서열을 포함하고,
상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA는, 서로 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자를 갖고, 상기 선택 마커 유전자는, 선택 마커용 도너 DNA의 종류마다 고유하고, 상기 선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 게놈 개변의 대상으로 하는 상기 알렐의 수와 동수 이상인, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA.
〔13〕 표적 영역이 5kbp 이상의 길이를 갖는, 상기 〔12〕에 기재된 키트.
〔14〕 표적 영역이 8kbp 이상의 길이를 갖는, 상기 〔13〕에 기재된 키트.
〔15〕 재조합용 도너 DNA를 추가로 포함하는, 상기 〔12〕∼〔14〕 중 어느 하나에 기재된 키트.
〔16〕 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 5kbp 이상의 길이를 갖는, 상기 〔12〕∼〔15〕 중 어느 하나에 기재된 키트.
〔17〕 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 8kbp 이상의 길이를 갖는, 상기 〔12〕∼〔16〕 중 어느 하나에 기재된 키트.
〔18〕 표적 영역이 5kbp 이상의 길이를 갖고, 또한, 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 5kbp 이상의 길이를 갖는, 상기 〔12〕에 기재된 키트.
〔19〕 표적 영역이 8kbp 이상의 길이를 갖고, 또한, 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 8kbp 이상의 길이를 갖는, 상기 〔18〕에 기재된 키트.
〔20〕 재조합용 도너 DNA가, 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역에 염기 서열을 갖지 않고, 개변 후에 얻어지는 염색체 게놈의 상기 2개 이상의 알렐에 있어서, 표적 영역의 상류 및 하류의 서열이, 염기의 삽입, 치환 및 결실 없이, 심리스(seamless)로 연결되어 있는, 상기 〔5〕에 기재된 방법.
〔21〕 재조합용 도너 DNA가, 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역에 염기 서열을 갖지 않고, 개변 후에 얻어지는 염색체 게놈의 상기 2개 이상의 알렐에 있어서, 표적 영역의 상류 및 하류의 서열이, 염기의 삽입, 치환 및 결실 없이, 심리스로 연결되어 있는, 상기 〔6〕 또는 〔7〕에 기재된 방법.
〔22〕 개변 후에 얻어지는 염색체 게놈의 상기 2개 이상의 알렐에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 표적 서열이 존재하지 않는, 상기 〔3〕에 기재된 방법.
〔23〕 개변 후에 얻어지는 염색체 게놈의 상기 2개 이상의 알렐에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 표적 서열이 존재하지 않는, 상기 〔4〕에 기재된 방법.
〔24〕 개변 후에 얻어지는 염색체 게놈의 상기 2개 이상의 알렐에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 표적 서열이 존재하지 않는, 상기 〔5〕에 기재된 방법.
〔25〕 개변 후에 얻어지는 염색체 게놈의 상기 2개 이상의 알렐에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 표적 서열이 존재하지 않는, 상기 〔6〕 또는 〔7〕에 기재된 방법.
〔26〕 공정(b)에 있어서, 2 이상의 알렐이 개변된 세포를 선택할 때까지의 과정에서는 단일 세포 클로닝은 행해지지 않는, 상기 〔1〕∼〔11〕, 및 〔20〕∼〔25〕 중 어느 하나에 기재된 방법.
〔27〕 표적 영역에 관해서 염색체 게놈 상에 2개 이상의 알렐을 갖는 세포에 있어서, 상기 2개 이상의 알렐의 각각의 표적 영역이 결실되고, 또한, 표적 영역의 상류 및 하류의 서열이, 염기의 삽입, 치환 및 결실 없이, 심리스로 연결되어 있는, 세포.
〔28〕 표적 영역이 5kbp 이상의 길이를 갖는, 상기 〔27〕에 기재된 세포.
〔29〕 그 게놈 중에 부위 특이적 재조합 효소의 표적 서열을 갖지 않는, 상기 〔27〕 또는 〔28〕에 기재된 세포.
〔30〕 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 8kbp 이상의 길이를 갖는, 상기 〔6〕 또는 〔7〕에 기재된 방법.
〔31〕 재조합용 도너 DNA가, 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역에 염기 서열을 갖지 않는, 상기 〔15〕에 기재된 키트.
본 발명에 의하면, 2개 이상의 알렐을 효율 좋게 개변할 수 있고, 또한 비교적 큰 영역의 개변이 가능한, 게놈 개변 방법 및 상기 게놈 개변 키트가 제공된다.
[도 1] 실험예 1에서 제작한 도너 DNA의 구조를 나타낸다.
[도 2] 실험예 1에서 제작한 도너 DNA를 세포에 도입하는 공정을 나타낸다. 또한, 도너 DNA의 노크인을 확인하기 위해서 이용한 junction Primer의 설계 위치를 나타낸다.
[도 3] 도너 DNA의 노크인 후에 정션 PCR을 행한 결과를 나타낸다.
[도 4] 참고 실험예에서 제작한 도너 DNA를 세포에 도입하는 공정을 나타낸다. 또한, 도너 DNA의 노크인을 확인하기 위해서 이용한 junction Primer의 설계 위치, 및 도너 DNA의 노크인 후에 정션 PCR을 행한 결과를 나타낸다.
[도 5] 실험예 1에서 제작한 도너 DNA를 도입한 세포(실험예 2에서 제작한 세포)에, 야생형 TP53 플라스미드를 도너 DNA로서 도입하는 공정을 나타낸다. 또한, 야생형 TP53 플라스미드의 노크인을 확인하기 위해서 이용한 프라이머의 설계 위치를 나타낸다.
[도 6] 야생형 TP53 플라스미드의 노크인 후에 도 5의 프라이머를 이용하여 PCR을 행한 결과를 나타낸다.
[도 7] 실험예 4에서 제작한 4종류의 도너 DNA를, 실험예 2에서 제작한 세포에 도입하는 공정을 나타낸다. 또한, 상기 4종류의 도너 DNA의 노크인을 확인하기 위해서 이용한 프라이머의 설계 위치를 나타낸다.
[도 8] 실험예 4에서 제작한 4종류의 도너 DNA의 노크인 후에, 도 7의 프라이머를 이용하여 PCR을 행한 결과를 나타낸다.
[도 9] 실시예 5에서 행한 인간 iPS 세포에 있어서의 TP53 유전자의 양 알렐에 있어서의 결실을 유도한 실험의 결과를 나타낸다.
[도 10] 실시예 6에서 행한 MLH1 유전자의 양 알렐에 있어서의 결실을 유도한 실험의 결과를 나타낸다.
[도 11] 실시예 6에서 행한 CD44 유전자의 양 알렐에 있어서의 결실을 유도한 실험의 결과를 나타낸다.
[도 12] 실시예 6에서 행한 MET 유전자의 양 알렐에 있어서의 결실을 유도한 실험의 결과를 나타낸다.
[도 13] 실시예 6에서 행한 APP 유전자의 양 알렐에 있어서의 결실을 유도한 실험의 결과를 나타낸다.
[도 14a] 본 발명의 방법의 선택 마커용 도너 DNA를 도입하는 공정에 있어서 게놈의 표적 영역을 끼우도록 2개소의 절단을 유도하는 것을 나타내는 모식도이다.
[도 14b] 본 발명의 방법의 선택 마커용 도너 DNA를 도입하는 공정에 있어서 게놈의 표적 영역의 근방의 1개소의 절단을 유도하는 것을 나타내는 모식도이다.
［정의］
「폴리뉴클레오티드」 및 「핵산」이라고 하는 용어는, 서로 호환적으로 사용되고, 뉴클레오티드가 포스포다이에스터 결합에 의해 결합한 뉴클레오티드 폴리머를 가리킨다. 「폴리뉴클레오티드」 및 「핵산」은, DNA여도 되고, RNA여도 되고, DNA와 RNA의 조합으로 구성되어도 된다. 또한, 「폴리뉴클레오티드」 및 「핵산」은, 천연 뉴클레오티드의 폴리머여도 되고, 천연 뉴클레오티드와 비천연 뉴클레오티드(천연 뉴클레오티드의 유사체, 염기 부분, 당 부분 및 인산 부분 중 적어도 하나의 부분이 수식되어 있는 뉴클레오티드(예를 들어, 포스포로싸이오에이트 골격) 등)의 폴리머여도 되고, 비천연 뉴클레오티드의 폴리머여도 된다.
「폴리뉴클레오티드」 또는 「핵산」의 염기 서열은, 특별히 명시하지 않는 한, 일반적으로 인정되고 있는 1문자 코드로 기재된다. 특별히 명시하지 않는 한, 염기 서열은, 5＇측으로부터 3＇측을 향해 기재한다. 「폴리뉴클레오티드」 또는 「핵산」을 구성하는 뉴클레오티드 잔기는, 간단히, 아데닌, 티민, 시토신, 구아닌, 또는 우라실 등, 혹은 그들의 1문자 코드로 기재되는 경우가 있다.
「유전자」라고 하는 용어는, 특정의 단백질을 코딩하는 적어도 1개의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 가리킨다. 유전자는, 엑손 및 인트론의 양쪽을 포함할 수 있다.
「폴리펩티드」, 「펩티드」 및 「단백질」이라고 하는 용어는, 서로 호환적으로 사용되고, 아마이드 결합에 의해 결합한 아미노산의 폴리머를 가리킨다. 「폴리펩티드」, 「펩티드」 또는 「단백질」은, 천연 아미노산의 폴리머여도 되고, 천연 아미노산과 비천연 아미노산(천연 아미노산의 화학적 유사체, 수식 유도체 등)의 폴리머여도 되고, 비천연 아미노산의 폴리머여도 된다. 특별히 명시하지 않는 한, 아미노산 서열은, N말단측으로부터 C말단측을 향해 기재한다.
「알렐」이라고 하는 용어는, 염색체 게놈 상의 동일 좌위에 존재하는 염기 서열 세트를 가리킨다. 어느 태양에서는, 2배체의 세포에서는 동일 좌위에 2알렐 존재하고, 3배체의 세포에서는 동일 좌위에 3알렐 존재한다. 또한, 어느 태양에서는, 염색체의 이상한 카피 또는 당해 좌위의 이상한 추가의 카피에 의해 추가의 알렐이 형성되고 있는 경우가 있다.
「게놈 개변」 또는 「게놈 편집」이라고 하는 용어는, 서로 호환적으로 이용되고, 게놈 상의 소망의 위치(표적 영역)에 변이를 유도하는 것을 가리킨다. 게놈 개변은, 표적 영역 DNA를 절단하도록 설계된 서열 특이적 핵산 절단 분자의 사용을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 게놈 개변은, 표적 영역의 DNA를 절단하도록 조작된 뉴클레아제의 사용을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 게놈 개변은, 표적 영역 중의 특정의 염기 서열을 갖는 표적 서열을 절단하도록 조작된 뉴클레아제(예를 들어, TALEN나 ZFN)의 사용을 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에 있어서, 게놈 개변은, 표적 영역 중의 특정의 염기 서열을 갖는 표적 서열을 절단하도록, 메가뉴클레아제 등의 게놈에 1개밖에 절단 부위를 갖지 않는 제한 효소(예를 들어, 16베이스의 서열 특이성을 갖는 제한 효소(이론상은 416 염기에 1개의 비율로 존재한다), 17베이스의 서열 특이성을 갖는 제한 효소(이론상은 417 염기에 1개의 비율로 존재한다), 및 18베이스의 서열 특이성을 갖는 제한 효소(이론상은 418 염기에 1개의 비율로 존재한다)) 등의 서열 특이적 엔도뉴클레아제를 이용할 수 있는 경우도 있다. 전형적으로는, 부위 특이적 뉴클레아제의 사용에 의해, 표적 영역의 DNA에 2본쇄 절단(DSB)이 유도되고, 그 후, 상동 재조합 수복(Homology Directed Repair: HDR) 및 비상동 말단 재결합(Non-Homologous End-Joining Repair: NHEJ)과 같은, 세포의 내인성 프로세스에 의해 게놈이 수복된다. NHEJ는, 도너 DNA를 이용하지 않고 2본쇄 절단된 말단을 연결하는 수복 방법이며, 수복 시에 삽입 및/또는 결실(indel)이 고빈도로 유도된다. HDR은, 도너 DNA를 이용한 수복 기구이며, 표적 영역에 소망의 변이를 도입하는 것도 가능하다. 게놈 개변 기술로서는, 예를 들어, CRISPR/Cas 시스템이 바람직하게 예시된다. 메가뉴클레아제로서는, 예를 들어, I-SceI, I-SceII, I-SceIII, I-SceIV, I-SceV, I-SceVI, I-SceVII, I-CeuI, I-CeuAIIP, I-CreI, I-CrepsbIP, I-CrepsbIIP, I-CrepsbIIIP, I-CrepsbIVP, I-TliI, I-PpoI, PI-PspI, F-SceI, F-SceII, F-SuvI, F-TevI, F-TevII, I-AmaI, I-AniI, I-ChuI, I-CmoeI, I-CpaI, I-CpaII, I-CsmI, I-CvuI, I-CvuAIP, I-DdiI, I-DdiII, I-DirI, I-DmoI, I-HmuI, I-HmuII, I-HsNIP, I-LlaI, I-MsoI, I-NaaI, I-NanI, I-NclIP, I-NgrIP, I-NitI, I-NjaI, I-Nsp236IP, I-PakI, I-PboIP, I-PcuIP, I-PcuAI, I-PcuVI, I-PgrIP, I-PobIP, I-PorI, I-PorIIP, I-PbpIP, I-SpBetaIP, I-ScaI, I-SexIP, I-SneIP, I-SpomI, I-SpomCP, I-SpomIP, I-SpomIIP, I-SquIP, I-Ssp68031, I-SthPhiJP, I-SthPhiST3P, I-SthPhiSTe3bP, I-TdeIP, I-TevI, I-TevII, I-TevIII, I-UarAP, I-UarHGPAIP, I-UarHGPA13P, I-VinIP, I-ZbiIP, PI-Mtul, PI-MtuHIPPI-MtuHIIP, PI-PfuI, PI-PfuII, PI-PkoI, PI-PkoII, PI-Rma43812IP, PI-SpBetaIP, PI-SceI, PI-TfuI, PI-TfuII, PI-ThyI, PI-TliI, 및 PI-TliII, 및 이들의 기능적인 유도체 제한 효소로 이루어지는 군으로부터 선택되는 메가뉴클레아제 및 그 절단 부위(또는 인식 부위), 바람직하게는, 18염기 이상의 서열 특이성을 갖는 제한 효소인 메가뉴클레아제 및 그 절단 부위(또는 인식 부위), 특히 세포의 게놈을 1개소 또는 복수 개소 이상 절단하지 않는 메가뉴클레아제 및 그 절단 부위를 이용할 수 있다.
「표적 영역」이라고 하는 용어는, 게놈 개변의 대상이 되는 게놈 영역을 가리킨다.
「도너 DNA」라고 하는 용어는, DNA의 2본쇄 절단의 수복에 이용되는 DNA로서, 표적 영역 주변의 DNA와 상동 재조합 가능한 DNA를 가리킨다. 도너 DNA는, 호몰로지 암으로서 표적 영역의 상류의 염기 서열 및 하류의 염기 서열(예를 들어, 표적 영역에 인접하는 염기 서열)을 포함한다. 본 명세서에 있어서는, 표적 영역의 상류측의 염기 서열(예를 들어, 상류측에 인접하는 염기 서열)로 이루어지는 호몰로지 암을 「상류 호몰로지 암」, 표적 서열의 하류측의 염기 서열(예를 들어, 하류측에 인접하는 염기 서열)로 이루어지는 호몰로지 암을 「하류 호몰로지 암」이라고 기재하는 경우가 있다. 도너 DNA는, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에, 소망의 염기 서열을 포함할 수 있다. 각 호몰로지 암의 길이는, 300bp 이상이 바람직하고, 통상 500∼3000bp 정도이다. 상류 호몰로지 암 및 하류 호몰로지 암의 길이는, 서로 동일해도 되고, 상이해도 된다. 표적 영역은, 서열 의존적인 절단 후에 도너 DNA와의 사이에 상동 재조합의 유발에 성공하면, 표적 영역의 상류의 염기 서열 및 하류의 염기 서열 사이의 서열이, 도너 DNA의 서열로 치환되게 된다.
표적 영역의 「상류」란, 표적 영역의 2본쇄 DNA에 있어서, 기준이 되는 뉴클레오티드쇄의 5＇측에 위치하는 DNA 영역을 의미한다. 표적 영역의 「하류」란, 기준이 되는 뉴클레오티드쇄의 3＇측에 위치하는 DNA를 의미한다. 표적 영역이 단백질 코드 서열을 포함하는 경우, 기준이 되는 뉴클레오티드쇄는, 통상, 센스쇄이다. 일반적으로, 프로모터는, 단백질 코드 서열의 상류에 위치한다. 터미네이터는, 단백질 코드 서열의 하류에 위치한다.
「서열 특이적 핵산 절단 분자」라고 하는 용어는, 특정의 핵산 서열을 인식하고, 상기 특정의 핵산 서열로 핵산을 절단할 수 있는 분자를 가리킨다. 서열 특이적 핵산 절단 분자는, 서열 특이적으로 핵산 절단하는 활성(서열 특이적 핵산 절단 활성)을 갖는 분자이다.
「표적 서열」이라고 하는 용어는, 서열 특이적 핵산 절단 분자에 의한 절단의 대상이 되는 게놈 중의 DNA 서열을 가리킨다. 서열 특이적 핵산 절단 분자가 Cas 단백질인 경우, 표적 서열은, Cas 단백질에 의한 절단의 대상이 되는 게놈 중의 DNA 서열을 가리킨다. Cas 단백질로서 Cas9 단백질을 이용하는 경우, 표적 서열은, 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)의 5＇측에 인접하는 서열일 필요가 있다. 표적 서열은, 통상, PAM의 5＇측 직전에 인접하는 17∼30염기(바람직하게는 18∼25염기, 보다 바람직하게는 19∼22염기, 더 바람직하게는 20염기)의 서열이 선택된다. 표적 서열의 설계에는, CRISPRDESIGN(crispr.mit.edu/) 등의 공지된 디자인 툴을 이용할 수 있다.
「Cas 단백질」이라고 하는 용어는, CRISPR 관련(CRISPR-associated) 단백질을 가리킨다. 바람직한 태양에 있어서, Cas 단백질은, 가이드 RNA와 복합체를 형성하여, 엔도뉴클레아제 활성 또는 니카제 활성을 나타낸다. Cas 단백질로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, Cas9 단백질, Cpf1 단백질, C2c1 단백질, C2c2 단백질, 및 C2c3 단백질 등을 들 수 있다. Cas 단백질은, 가이드 RNA와 협동하여 엔도뉴클레아제 활성 또는 니카제 활성을 나타내는 한, 야생형 Cas 단백질 및 그 호몰로그(파라로그 및 오소로그), 및 그들의 변이체를 포함한다.
바람직한 태양에 있어서, Cas 단백질은, 클래스 2의 CRISPR/Cas계에 관여하는 것이고, 보다 바람직하게는 II형의 CRISPR/Cas계에 관여하는 것이다. Cas 단백질의 바람직한 예로서는, Cas9 단백질이 예시된다.
「Cas9 단백질」이라고 하는 용어는, II형의 CRISPR/Cas계에 관여하는 Cas 단백질을 가리킨다. Cas9 단백질은, 가이드 RNA와 복합체를 형성하여, 가이드 RNA와 협동하여 표적 영역의 DNA를 절단하는 활성을 나타낸다. Cas9 단백질은, 상기의 활성을 갖는 한, 야생형 Cas9 단백질 및 그 호몰로그(파라로그 및 오소로그), 및 그들의 변이체를 포함한다. 야생형 Cas9 단백질은, 뉴클레아제 도메인으로서 RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 갖지만, 본 명세서에 있어서의 Cas9 단백질은, RuvC 도메인 및 HNH 도메인 중 어느 한쪽이 불활성화된 것이어도 된다. RuvC 도메인 및 HNH 도메인 중 어느 한쪽이 불활성화된 Cas9는, 2본쇄 DNA에 대해서 1본쇄 절단(닉)을 도입한다. 그 때문에, RuvC 도메인 및 HNH 도메인 중 어느 한쪽이 불활성화된 Cas9를 2본쇄 DNA의 절단에 이용하는 경우에는, 센스쇄와 안티센스쇄 각각에 대해 Cas9의 표적 서열을 설정하여, 센스쇄 및 안티센스 차의 닉이 충분히 가까운 위치에서 생기고, 그것에 의해 2본쇄 절단이 유발되도록, 개변 시스템을 구성할 수 있다.
Cas9 단백질이 유래하는 생물종은 특별히 한정되지 않지만, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 스타필로코커스(Staphylococcus)속, 나이세리아(Neisseria)속, 또는 트레포네마(Treponema)속에 속하는 세균 등이 바람직하게 예시된다. 보다 구체적으로는, S. pyogenes, S. thermophilus, S. aureus, N. meningitidis, 또는 T. denticola 등에서 유래하는 Cas9 단백질이 바람직하게 예시된다. 바람직한 태양에 있어서, Cas9 단백질은, S. pyogenes 유래의 Cas9 단백질이다.
각종 Cas 단백질의 아미노산 서열, 및 그 코드 서열의 정보는, GenBank, UniProt, Addgene 등의 각종 데이타베이스 상에서 얻을 수 있다. 예를 들어, S. pyogenes의 Cas9 단백질의 아미노산 서열은, 플라스미드 번호 42230으로서 Addgene에 등록된 것 등을 이용할 수 있다. S. pyogenes의 Cas9 단백질의 아미노산 서열의 일례를 서열 번호 1에 나타낸다.
「가이드 RNA」 및 「gRNA」라고 하는 용어는, 서로 호환적으로 사용되고, Cas 단백질과 복합체를 형성하여, Cas 단백질을 표적 영역에 유도할 수 있는 RNA를 가리킨다. 바람직한 태양에 있어서, 가이드 RNA는, CRISPRRNA(crRNA) 및 트랜스 활성화형 CRISPRRNA(tracrRNA)를 포함한다. crRNA는, 게놈 상의 표적 영역에의 결합에 관여하고, tracrRNA는, Cas 단백질과의 결합에 관여한다. 바람직한 태양에 있어서, crRNA는, 스페이서 서열과 리피트 서열을 포함하고, 스페이서 서열이 표적 영역에 있어서 표적 서열의 상보쇄와 결합한다. 바람직한 태양에 있어서, tracrRNA는, 안티리피트 서열과 3＇테일 서열을 포함한다. 안티리피트 서열은 crRNA의 리피트 서열과 상보적인 서열을 갖고, 리피트 서열과 염기쌍을 형성하고, 3＇테일 서열은 통상 3개의 스템 루프를 형성한다.
가이드 RNA는, crRNA의 3＇말단에 tracrRNA의 5＇말단을 연결한 단일 가이드 RNA(sgRNA)여도 되고, crRNA 및 tracrRNA를 따로따로의 RNA 분자로 하고, 리피트 서열 및 안티리피트 서열로 염기쌍을 형성시킨 것이어도 된다. 바람직한 태양에 있어서, 가이드 RNA는 sgRNA이다.
crRNA의 리피트 서열 및 tracrRNA의 서열은, Cas 단백질의 종류에 따라서 적절히 선택할 수 있고, Cas 단백질과 동일한 세균종에서 유래하는 것을 이용할 수 있다.
예를 들어, S. pyogenes 유래의 Cas9 단백질을 이용하는 경우, sgRNA의 길이는, 50∼220뉴클레오티드(nt) 정도로 할 수 있고, 60∼180nt 정도가 바람직하고, 80∼120nt 정도가 보다 바람직하다. crRNA의 길이는, 스페이서 서열을 포함하여 약 25∼70염기 길이로 할 수 있고, 25∼50nt 정도가 바람직하다. tracrRNA의 길이는 10∼130nt 정도로 할 수 있고, 30∼80nt 정도가 바람직하다.
crRNA의 리피트 서열은, Cas 단백질이 유래하는 세균종에 있어서의 것과 동일해도 되고, 3＇말단의 일부를 삭제한 것이어도 된다. tracrRNA는, Cas 단백질이 유래하는 세균종에 있어서의 성숙 tracrRNA와 동일하게 서열을 갖고 있어도 되고, 당해 성숙 tracrRNA의 5＇말단 및/또는 3＇말단을 절단한 말단 절단형이어도 된다. 예를 들어, tracrRNA는, 성숙 tracrRNA의 3＇말단으로부터 1∼40개 정도의 뉴클레오티드 잔기를 제거한 말단 절단형일 수 있다. 또한, tracrRNA는, 성숙 tracrRNA의 5＇말단으로부터 1∼80개 정도의 뉴클레오티드 잔기를 제거한 말단 절단형일 수 있다. 또한, tracrRNA는, 예를 들어, 5＇말단으로부터 1∼20 정도의 뉴클레오티드 잔기를 제거하고, 또한 3＇말단으로부터 1∼40개 정도의 뉴클레오티드 잔기를 제거한 말단 절단형일 수 있다.
sgRNA 설계를 위한 crRNA 리피트 서열 및 tracrRNA의 서열은, 여러 가지 제안되어 있고, 당업자는, 공지 기술에 기초하여 sgRNA를 설계할 수 있다(예를 들어, Jinek et al. (2012) Science, 337, 816-21; Mali et al. (2013) Science, 339: 6121, 823-6; Cong et al. (2013) Science, 339: 6121, 819-23; Hwang et al. (2013) Nat. Biotechnol. 31: 3, 227-9; Jinek et al. (2013) eLife, 2, e00471).
「프로토스페이서 인접 모티프」 및 「PAM」이라고 하는 용어는, 서로 호환적으로 사용되고, Cas 단백질에 의한 DNA 절단 시에, Cas 단백질에 인식되는 서열을 가리킨다. PAM의 서열 및 위치는, Cas 단백질의 종류에 따라서 상이하다. 예를 들어, Cas9 단백질의 경우, PAM는 표적 서열의 3＇측 직후에 인접할 필요가 있다. Cas9 단백질에 대응하는 PAM의 서열은, Cas9 단백질이 유래하는 세균종에 따라 상이하다. 예를 들어, S. pyogenes의 Cas9 단백질에 대응하는 PAM은 「NGG」이고, S. thermophilus의 Cas9 단백질에 대응하는 PAM은 「NNAGAA」이며, S. aureus의 Cas9 단백질에 대응하는 PAM은 「NNGRRT」 또는 「NNGRR(N)」이고, N. meningitidis의 Cas9 단백질에 대응하는 PAM은 「NNNNGATT」이며, T. denticola의 Cas9 단백질에 대응하는 「NAAAAC」이다(「R」은 A 또는 G; 「N」은, A, T, G 또는 C).
「스페이서 서열」 및 「가이드 서열」이라고 하는 용어는, 서로 호환적으로 사용되고, 가이드 RNA에 포함되는 서열로서, 표적 서열의 상보쇄와 결합할 수 있는 서열을 가리킨다. 통상, 스페이서 서열은, 표적 서열과 동일한 서열이다(단, 표적 서열 중의 T는, 스페이서 서열에서는 U가 된다). 본 발명의 실시태양에 있어서, 스페이서 서열은, 표적 서열에 대해서 1염기 또는 복수 염기의 미스매치를 포함할 수 있다. 복수 염기의 미스매치를 포함하는 경우, 인접한 위치에 미스매치를 갖고 있어도 되고, 멀어진 위치에 미스매치를 갖고 있어도 된다. 바람직한 태양에 있어서, 스페이서 서열은, 표적 서열에 대해서 1∼5염기의 미스매치를 포함할 수 있다. 특히 바람직한 태양에 있어서, 스페이서 서열은, 표적 서열에 대해서 1염기의 미스매치를 포함할 수 있다.
가이드 RNA에 있어서, 스페이서 서열은, crRNA의 5＇측에 배치된다.
폴리뉴클레오티드에 관해서 이용하는 「기능적으로 연결」이라고 하는 용어는, 제1 염기 서열이 제2 염기 서열에 충분히 근처에 배치되어, 제1 염기 서열이 제2 염기 서열 또는 제2 염기 서열의 제어하의 영역에 영향을 미칠 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드가 프로모터에 기능적으로 연결된다는 것은, 당해 폴리뉴클레오티드가, 당해 프로모터의 제어하에서 발현하도록 연결되어 있는 것을 의미한다.
「발현 가능한 상태」라고 하는 용어는, 폴리뉴클레오티드가 도입된 세포 내에서, 해당 폴리뉴클레오티드가 전사될 수 있는 상태에 있음을 가리킨다.
「발현 벡터」라고 하는 용어는, 대상 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로서, 해당 벡터를 도입한 세포 내에서, 대상 폴리뉴클레오티드를 발현 가능한 상태로 하는 시스템을 구비한 벡터를 가리킨다. 예를 들어, 「Cas 단백질의 발현 벡터」란, 해당 벡터를 도입한 세포 내에서, Cas 단백질을 발현 가능한 벡터를 의미한다. 또한, 예를 들어, 「가이드 RNA의 발현 벡터」란, 해당 벡터를 도입한 세포 내에서, 가이드 RNA를 발현 가능한 벡터를 의미한다.
본 명세 명세서에 있어서, 염기 서열끼리 또는 아미노산 서열끼리의 서열 동일성(또는 상동성)은, 2개의 염기 서열 또는 아미노산 서열을, 대응하는 염기 또는 아미노산이 가장 많이 일치하도록, 삽입 및 결실에 해당되는 부분에 갭을 넣으면서 병설하여, 얻어진 얼라인먼트 중의 갭을 제외한, 염기 서열 전체 또는 아미노산 서열 전체에 대한 일치한 염기 또는 아미노산의 비율로서 구해진다. 염기 서열 또는 아미노산 서열끼리의 서열 동일성은, 당해 기술 분야에서 공지된 각종 상동성 검색 소프트웨어를 이용하여 구할 수 있다. 예를 들어, 염기 서열의 서열 동일성의 값은, 공지된 상동성 검색 소프트웨어 BLASTN에 의해 얻어진 얼라인먼트를 바탕으로 한 계산에 의해 얻을 수 있고, 아미노산 서열의 서열 동일성의 값은, 공지된 상동성 검색 소프트웨어 BLASTP에 의해 얻어진 얼라인먼트를 바탕으로 한 계산에 의해 얻을 수 있다.
［게놈 개변 방법］
일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐을 개변하는 게놈 개변 방법을 제공한다. 상기 게놈 개변 방법은, 하기 (a) 및 (b)의 공정을 포함한다:
(a) 하기 (i) 및 (ii)를, 상기 염색체를 포함하는 세포에 도입하는 공정; 및
(i) 상기 염색체 게놈의 표적 영역을 표적으로 하는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
(ii) 상기 표적 영역의 상류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암 사이에, 선택 마커 유전자의 염기 서열을 포함하는, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA로서, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA는, 서로 상이한 선택 마커 유전자를 갖고, 상기 선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 게놈 개변의 대상으로 하는 상기 알렐의 수와 동수 이상인, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA,
(b) 상기 공정(a) 후, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA가 갖는 모든 선택 마커 유전자에 기초하여, 상기 세포를 선택하는 공정. 이 태양에 있어서, 상기 선택 마커 유전자는, 선택 마커용 도너 DNA의 종류마다 고유할 수 있다. 이 태양에 있어서는 또한, 공정(b)는, 상기 공정(a) 후, 상기 2 이상의 알렐에 대해서 상이한 종류의 선택 마커용 도너 DNA가 각각 상동 재조합되는 것에 의해, 당해 2 이상의 알렐에 각각 구별 가능하게 상이한 고유의 선택 마커 유전자가 도입되고, 도입된 당해 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자의 모두를 발현하는 세포를 선택하는 공정(포지티브 선택을 위한 공정)일 수 있다. 상기 방법은, 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐이 개변된 세포를 제작하는 방법이어도 된다.
일 실시태양에 있어서, 본 발명은, 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐이 개변된 세포를 제작하는 방법으로서,
(a) 하기 (i) 및 (ii)를, 2개 이상의 알렐을 포함하는 세포에 도입하여, 상기 2개 이상의 알렐 각각에 선택 마커 유전자를 도입하는 공정과,
(i) 상기 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐 중의 표적 영역을 표적으로 하여, 당해 표적 영역을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
(ii) 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA로서, 각각이 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖고, 또한, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에, 선택 마커 유전자의 염기 서열을 포함하고, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA는, 서로 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자를 각각 갖고, 상기 선택 마커 유전자는, 선택 마커용 도너 DNA의 종류마다 고유하고, 상기 선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 게놈 개변의 대상으로 하는 상기 알렐의 수와 동수 이상인, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA,
(b) 상기 공정(a) 후, 상기 2 이상의 알렐에 대해서 상이한 종류의 선택 마커용 도너 DNA가 각각 상동 재조합되는 것에 의해, 당해 2 이상의 알렐에 각각 구별 가능하게 상이한 고유의 선택 마커 유전자가 도입되고, 도입된 당해 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자의 모두를 발현하는 세포를 선택하는 공정(포지티브 선택을 위한 공정)
을 포함하는, 방법일 수 있다.
(공정(a))
공정(a)에서는, 상기 (i) 및 (ii)를, 염색체를 포함하는 세포에 도입한다.
본 실시형태의 게놈 개변 방법에서 이용하는 세포는, 특별히 한정되지 않고, 2배체 이상의 염색체 게놈을 갖는 세포이면 된다. 세포는, 2배체여도 되고, 3배체여도 되고, 4배체 이상이어도 된다. 세포로서는, 특별히 한정되지 않지만, 진핵생물의 세포를 들 수 있다. 세포는, 식물 세포여도 되고, 동물 세포여도 되고, 진균 세포여도 된다. 동물 세포는, 특별히 한정되지 않지만, 인간, 인간 이외의 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충, 그 외의 무척추 동물의 어느 세포여도 된다. 본 실시형태의 게놈 개변 방법에서 이용하는 세포는, 알렐이 존재하지 않는 세포(예를 들어, 1배체의 염색체 게놈을 갖는 세포, 예를 들어, 원핵세포)는 아니다.
게놈 개변의 대상이 되는 표적 영역은, 1 이상의 알렐을 갖는 게놈 상의 임의의 영역으로 할 수 있다. 표적 영역의 사이즈는, 특별히 한정되지 않는다. 본 실시형태의 게놈 개변 방법에서는, 종래보다도 큰 사이즈의 영역을 개변할 수 있다. 표적 영역은, 예를 들어, 10kbp 이상이어도 된다. 표적 영역은, 예를 들어, 100bp 이상, 200bp 이상, 400bp 이상, 800bp 이상, 1kbp 이상, 2kbp 이상, 3kbp 이상, 4kbp 이상, 5kbp 이상, 8kbp 이상, 10kbp 이상, 20kbp 이상, 40kbp 이상, 80kbp 이상, 100kbp 이상, 200kbp 이상, 300kbp 이상, 또는 400kbp 이상이어도 된다. 표적 영역은, 예를 들어, 1 내지 수개의 유전자를 포함하는 영역, 1개의 유전자를 포함하는 영역, 1개의 유전자의 일부분의 영역일 수 있다. 어느 태양에서는, 개변된 세포에 있어서, 상기 표적 영역이 결실되어 있다.
＜(i) 게놈 개변 시스템＞
「게놈 개변 시스템」이란, 소망의 표적 영역을 개변하는 것이 가능한 분자 기구를 의미한다. 게놈 개변 시스템은, 염색체 게놈의 표적 영역을 표적으로 하는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
서열 특이적 핵산 절단 분자는, 서열 특이적 핵산 절단 활성을 갖는 분자이면, 특별히 한정되지 않고, 합성 유기 화합물이어도 되고, 단백질 등의 생체 고분자 화합물이어도 된다. 서열 특이적 핵산 절단 활성을 갖는 합성 유기 화합물로서는, 예를 들어, 피롤·이미다졸 폴리아마이드 등을 들 수 있다. 서열 특이적 부위 절단 활성을 갖는 단백질로서는, 예를 들어, 서열 특이적 엔도뉴클레아제를 들 수 있다.
서열 특이적 엔도뉴클레아제는, 소정의 서열에서 핵산을 절단할 수 있는 효소이다. 서열 특이적 엔도뉴클레아제는, 소정의 서열에서, 2본쇄 DNA를 절단할 수 있다. 서열 특이적 엔도뉴클레아제로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 징크 핑거 뉴클레아제(Zinc finger nuclease(ZFN)), TALEN(Transcription activator-like effector nuclease), Cas 단백질 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
ZFN은, 징크 핑거 어레이를 포함하는 결합 도메인에 컨주게이트한 핵산 절단 도메인을 포함하는 인공 뉴클레아제이다. 절단 도메인으로서는, II형 제한 효소 FokI의 절단 도메인을 들 수 있다. 표적 서열을 절단 가능한 징크 핑거 뉴클레아제의 설계는, 공지된 방법으로 행할 수 있다.
TALEN은, DNA 절단 도메인(예를 들어, FokI 도메인)에 더하여 전사 활성화 인자양(樣)(TAL) 이펙터의 DNA 결합 도메인을 포함하는 인공 뉴클레아제이다. 표적 서열을 절단 가능한 TALE 구축물의 설계는, 공지된 방법으로 행할 수 있다(예를 들어, Zhang, Feng et. al.(2011) Nature Biotechnology 29(2)).
서열 특이적 핵산 절단 분자로서, Cas 단백질을 이용하는 경우, 게놈 개변 시스템은, CRISPR/Cas 시스템을 포함한다. 즉, 게놈 개변 시스템은, Cas 단백질과, 표적 영역 내의 염기 서열에 상동인 염기 서열을 갖는 가이드 RNA를 포함하는 것이 바람직하다. 가이드 RNA는, 스페이서 서열로서, 표적 영역 내의 서열(표적 서열)과 상동인 서열을 포함하고 있으면 된다. 가이드 RNA는, 표적 영역 내의 DNA에 결합할 수 있는 것이면 되고, 표적 서열과 완전히 동일한 서열을 가지고 있을 필요는 없다. 이 결합은, 세포핵 내의 생리적 조건하에서 형성되면 된다. 가이드 RNA는, 예를 들어, 표적 서열에 대해서, 예를 들어, 0∼3염기의 미스매치를 포함할 수 있다. 상기 미스매치의 수는, 0∼2염기가 바람직하고, 0∼1이 보다 바람직하고, 미스매치를 갖지 않는 것이 더 바람직하다. 가이드 RNA의 설계는, 공지된 방법에 기초하여 행할 수 있다. 게놈 개변 시스템은, CRISPR/Cas 시스템인 것이 바람직하고, Cas 단백질과 가이드 RNA를 포함하는 것이 바람직하다. Cas 단백질은, Cas9 단백질인 것이 바람직하다.
서열 특이적 엔도뉴클레아제는, 단백질로서 세포에 도입해도 되고, 서열 특이적 엔도뉴클레아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 세포에 도입해도 된다. 예를 들어, 서열 특이적 엔도뉴클레아제의 mRNA를 도입해도 되고, 서열 특이적 엔도뉴클레아제의 발현 벡터를 도입해도 된다. 발현 벡터에 있어서, 서열 특이적 엔도뉴클레아제의 코드 서열(서열 특이적 엔도뉴클레아제 유전자)은, 프로모터에 기능적으로 연결되어 있다. 프로모터는, 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, polII계 프로모터를 각종 사용할 수 있다. polII계 프로모터로서는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어 CMV 프로모터, EF1 프로모터(EF1α 프로모터), SV40 프로모터, MSCV 프로모터, hTERT 프로모터, β 액틴 프로모터, CAG 프로모터, CBh 프로모터 등을 들 수 있다.
프로모터는, 유도성 프로모터여도 된다. 유도성 프로모터는, 프로모터를 구동하는 유도 인자의 존재하에서만, 당해 프로모터에 기능적으로 연결된 폴리뉴클레오티드의 발현을 유도할 수 있는 프로모터이다. 유도성 프로모터로서는, 히트쇼크 프로모터 등의 가열에 의해 유전자 발현을 유도하는 프로모터를 들 수 있다. 또한, 유도성 프로모터에는, 프로모터를 구동하는 유도 인자가 약제인 프로모터를 들 수 있다. 이와 같은 약제 유도성 프로모터로서는, 예를 들어, Cumate 오퍼레이터 서열, λ 오퍼레이터 서열(예를 들어, 12×λOp), 테트라사이클린계 유도성 프로모터 등을 들 수 있다. 테트라사이클린계 유도성 프로모터로서는, 예를 들어, 테트라사이클린 혹은 그 유도체(예를 들어, 독시사이클린), 또는 리버스 테트라사이클린 제어성 트랜스 활성화 인자(rtTA)의 존재하에서 유전자 발현을 구동하는 프로모터를 들 수 있다. 테트라사이클린계 유도성 프로모터로서는, 예를 들어, TRE3G 프로모터를 들 수 있다.
발현 벡터는, 공지된 것을 특별히 제한 없이 이용할 수 있다. 발현 벡터로서는, 예를 들어, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터를 들 수 있다. 서열 특이적 엔도뉴클레아제가 Cas 단백질인 경우, 발현 벡터는, Cas 단백질의 코드 서열(Cas 단백질 유전자)에 더하여, 가이드 RNA 코드 서열(가이드 RNA 유전자)을 포함하고 있어도 된다. 이 경우, 가이드 RNA 코드 서열(가이드 RNA 유전자)은, polIII계 프로모터로 기능적으로 되어 있는 것이 바람직하다. polIII계 프로모터로서는, 예를 들어, 마우스 및 인간의 U6-snRNA 프로모터, 인간 H1-RNasePRNA 프로모터, 인간 발린-tRNA 프로모터 등을 들 수 있다.
＜(ii) 선택 마커용 도너 DNA＞
선택 마커용 도너 DNA는, 선택 마커를 표적 영역에 노크인하기 위한 도너 DNA이다. 선택 마커용 도너 DNA는, 표적 영역의 상류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 표적 영역의 하류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암 사이에, 1 이상의 선택 마커 유전자의 염기 서열을 포함한다.
선택 마커용 도너 DNA는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 1kb 이상, 2kb 이상, 3kb 이상, 4kb 이상, 5kb 이상, 6kb 이상, 7kb 이상, 8kb 이상, 9kb 이상, 9. 5kb 이상, 또는 10kb 이상의 길이를 가질 수 있다. 선택 마커용 도너 DNA는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 50kb 이하, 45kb 이하, 40kb 이하, 35kb 이하, 30kb 이하, 25kb 이하, 20kb 이하, 15kb 이하, 14kb 이하, 13kb 이하, 12kb 이하, 11kb 이하, 10kb 이하, 9kb 이하, 8kb 이하, 7kb 이하, 6kb 이하, 5kb 이하, 또는 4kb 이하의 길이를 가질 수 있다.
「선택 마커」란, 그 발현의 유무에 기초하여, 세포를 선택할 수 있는 단백질을 의미한다. 선택 마커 유전자는, 선택 마커를 코딩하는 유전자이다. 선택 마커 발현 세포 및 비발현 세포가 혼재하는 세포 집단에 있어서, 선택 마커 발현 세포를 선택하는 경우, 당해 선택 마커를 「포지티브 선택 마커」 또는 「포지티브 선택용의 선택 마커」라고 한다. 선택 마커 발현 세포 및 비발현 세포가 혼재하는 세포 집단에 있어서, 선택 마커 비발현 세포를 선택하는 경우, 당해 선택 마커를 「네거티브 선택 마커」 또는 「네거티브 선택용의 선택 마커」라고 한다. 선택 마커가 서로 상이하다는 것은, 서로 구별할 수 있는 것(예를 들어, 구별 가능하게 상이한 것)을 의미하고, 예를 들어, 선택 마커가 도입된 세포에 부여하는 약제 내성의 성질 등의 생리학적 성질 또는 그 외의 물리화학적 성질에 있어서 적어도 서로 구별할 수 있는 것을 의미한다. 즉, 선택 마커가 서로 상이하다는 것은, 상이한 복수의 선택 마커가 다른 선택 마커와 구별 가능하게 검출될 수 있는 것, 또는 다른 선택 마커와는 구별 가능하게 약제 선택할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 상기 선택 마커 유전자가 선택 마커용 도너 DNA의 종류마다 고유하다는 것은, 선택 마커용 도너 DNA의 1종이 갖는 선택 마커 유전자가, 상기 이외의 종류의 선택 마커용 도너 DNA에는 포함되지 않는 것, 또는, 복수 종류의 도너 DNA에 포함되어 있는 경우에는, 동시에 2종류 이상의 도너 DNA로부터 발현하지 않도록 구성되어 있는 것을 의미한다. 이 때, 2종류 이상의 도너 DNA는, 선택 마커 이외에는 동일해도 되고, 선택 마커 이외의 서열 및/또는 구성에 있어서 상위(相違)가 있어도 된다.
포지티브 선택 마커는, 그것을 발현하는 세포를 선택 가능한 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 포지티브 선택 마커 유전자로서는, 예를 들어, 약제 내성 유전자, 형광 단백질 유전자, 발광 효소 유전자, 발색 효소 유전자 등을 들 수 있다.
네거티브 선택 마커는, 그것을 발현하지 않는 세포를 선택 가능한 것이면, 특별히 한정되지 않는다. 네거티브 선택 마커 유전자로서는, 예를 들어, 자살 유전자(티미딘 키나제 등), 형광 단백질 유전자, 발광 효소 유전자, 발색 효소 유전자 등을 들 수 있다. 네거티브 선택 마커 유전자가, 세포의 생존에 음의 영향을 주는 유전자(예를 들어, 자살 유전자)인 경우, 당해 네거티브 선택 마커 유전자는, 유도성 프로모터에 기능적으로 연결될 수 있다. 유도성 프로모터에 기능적으로 연결함으로써, 네거티브 선택 마커 유전자를 갖는 세포를 제거하고 싶을 때에만, 네거티브 선택 마커 유전자를 발현시킬 수 있다. 네거티브 선택 마커 유전자가, 형광, 발광, 및 발색 등의 광학적으로 검출 가능한 마커 유전자(가시화 마커 유전자; visible marker gene)인 경우 등, 세포의 생존에 음의 영향이 적은 경우에는, 항상적으로 발현시켜도 된다.
약제 내성 유전자로서는, 예를 들어, 퓨로마이신 내성 유전자, 블라스티사이딘 내성 유전자, 제네티신 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자, 카나마이신 내성 유전자, 제오신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 클로람페니콜 내성 유전자 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
형광 단백질 유전자로서는, 예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자, 황색 형광 단백질(YFP) 유전자, 적색 형광 단백질(RFP) 유전자 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
발광 효소 유전자로서는, 예를 들어, 루시페라제 유전자 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
발색 효소 유전자로서는, 예를 들어, β갈락토시다제 유전자, β글루쿠로니다제 유전자, 알칼리포스파타제 유전자 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
자살 유전자로서는, 예를 들어, 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제(HSV-TK), 유도성 카스파제 9(inducible caspase 9) 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다.
선택 마커용 도너 DNA가 갖는 선택 마커 유전자는, 포지티브 선택 마커 유전자인 것이 바람직하다. 즉, 선택 마커를 발현하는 세포를, 선택 마커 유전자가 노크인된 세포로서, 선택할 수 있다.
상류 호몰로지 암은, 개변 대상의 게놈에 있어서, 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖고, 예를 들어, 표적 서열의 상류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는다. 하류 호몰로지 암은, 개변 대상의 게놈에 있어서, 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖고, 예를 들어, 표적 서열의 하류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는다. 상류 호몰로지 암 및 하류 호몰로지 암은, 표적 영역의 주변 영역과 상동 재조합 가능하면, 그 길이 및 서열은 특별히 한정되지 않는다. 상류 호몰로지 암 및 하류 호몰로지 암은, 상동 재조합 가능한 한, 표적 영역의 상류측 서열 혹은 하류측 서열과 반드시 완전 일치할 필요는 없다. 예를 들어, 상류 호몰로지 암은, 표적 영역의 상류측에 인접하는 염기 서열과 90% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 서열일 수 있고, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하다. 예를 들어, 하류 호몰로지 암은, 표적 영역의 하류측에 인접하는 염기 서열과 90% 이상의 서열 동일성(상동성)을 갖는 서열일 수 있고, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하다. 또한, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암은, 적어도 그 어느 하나가 표적 영역 중 또는 그 근방의 절단 개소에 보다 가까우면 알렐의 개변 효율을 보다 높일 수 있다. 여기에서, 「가까운」은, 2개의 서열의 거리가 100bp 이하, 50bp 이하, 40bp 이하, 30bp 이하, 20bp 이하, 또는 10bp 이하인 것을 의미 할 수 있다. 어느 태양에서는, 절단은, 1개소로 한다. 어느 태양에서는, 절단은 2개소 이상으로 할 수 있다. 게놈에 복수의 절단을 도입하는 경우에는, 절단의 1개소는 표적 영역의 상류측에 설정하고, 다른 1개소는 표적 영역의 하류측에 설정할 수 있다. 선택 마커용 도너 DNA의 존재하에서, 표적 영역의 전체 또는 거의 전체를 2개소의 절단에 의해 게놈으로부터 절출하면, 선택 마커용 도너 DNA가 표적 영역의 상류 및 하류와 상동 재조합 수복을 일으켜, 결실 영역이 선택 마커용 도너 DNA의 서열에 의해 치환된다. 이와 같이 함으로써, 절단을 1개소로 하는 경우보다도 재조합의 효율을 높일 수 있다. 더욱이 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암은, 적어도 그 어느 하나, 바람직하게는 양쪽이 표적 영역 중 또는 그 근방의 절단 개소에 보다 가까우면 알렐의 개변 효율을 보다 높일 수 있다.
선택 마커용 도너 DNA에 있어서, 선택 마커 유전자는, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에 위치한다. 이것에 의해, 상기 (i)의 게놈 개변 시스템과 함께 선택 마커용 도너 DNA를 세포에 도입했을 경우에, HDR에 의해, 선택 마커 유전자가 표적 영역에 도입된다(이것에 의해 유전자가 파괴되는 경우, 유전자 녹아웃이라고 하고, 이것에 의해 소망의 유전자가 도입되는 경우, 유전자 노크인이라고 하며, 유전자를 녹아웃하면서, 다른 유전자를 노크인할 수도 있다).
선택 마커 유전자는, 적절한 프로모터의 제어하에서 발현되도록, 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 것이 바람직하다. 프로모터는, 도너 DNA를 도입하는 세포의 종류에 따라서 적절히 선택할 수 있다. 프로모터로서는, 예를 들어, SRα 프로모터, SV40 초기 프로모터, RNA 종양 바이러스의 LTR, CMV(사이토메갈로바이러스) 프로모터, RSV(라우스 육종 바이러스) 프로모터, HSV-TK(단순 헤르페스 바이러스 티미딘 키나제) 프로모터, EF1α 프로모터, 메탈로싸이오네인 프로모터, 히트쇼크 프로모터 등을 들 수 있다. 선택 마커용 도너 DNA는, 인핸서, 폴리 A 부가 시그널, 터미네이터 등의 임의의 제어 서열 등을 갖고 있어도 된다.
선택 마커용 도너 DNA는, 인슐레이터 서열을 갖고 있어도 된다. 「인슐레이터」란, 인접하는 염색체 환경의 영향을 차단 또는 완화하여, 그 영역에 끼워진 DNA의 전사 조절의 독립성을 보증하는 또는 높이는 서열을 말한다. 인슐레이터는, 인핸서 차단 효과(인핸서와 프로모터 사이에 삽입하는 것에 의해, 인핸서에 의한 프로모터 활성에의 영향을 차단하는 효과), 및 위치 효과의 억제 작용(도입 유전자의 양측을 인슐레이터로 끼우는 것에 의해, 도입 유전자의 발현이 삽입된 게놈 상의 위치에 영향을 받지 않게 하는 작용)에 의해 정의된다. 선택 마커용 도너 DNA는, 상류 암과 선택 마커 유전자 사이(또는 상류 암과 선택 마커 유전자를 제어하는 프로모터 사이)에, 인슐레이터 서열을 갖고 있어도 된다. 선택 마커용 도너 DNA는, 하류 암과 선택 마커 유전자 사이에, 인슐레이터 서열을 갖고 있어도 된다.
선택 마커용 도너 DNA는, 직쇄상이어도 되고, 환상이어도 되지만, 환상인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 선택 마커용 도너 DNA는, 플라스미드이다. 선택 마커용 도너 DNA는, 상기의 서열에 더하여, 임의의 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상류 호몰로지 암, 인슐레이터, 선택 마커 유전자, 및 하류 호몰로지 암의 각 서열 사이의 모두 또는 일부에, 스페이서 서열을 포함하고 있어도 된다.
공정(a)에서는, 게놈 개변의 대상으로 하는 알렐의 수와 동수 이상의 종류의 선택 마커용 도너 DNA를 세포에 도입한다. 상이한 종류의 선택 마커용 도너 DNA는, 서로 상이한(구별 가능한) 종류의 선택 마커 유전자를 갖는다. 어느 태양에서는, 상이한 종류의 선택 마커용 도너 DNA는, 완전히 동일한 선택 마커 유전자 또는 그 세트를 갖지 않는다. 즉, 제1 종류의 선택 마커용 도너 DNA는, 제1 종류의 선택 마커 유전자를 갖고, 제2 종류의 선택 마커용 도너 DNA는, 제2 종류의 선택 마커 유전자를 갖는다. 제3 종류의 선택 마커용 도너 DNA는, 제3 종류의 선택 마커 유전자를 갖고, 그 이후의 종류의 선택 마커용 도너 DNA에 대해서도 마찬가지이다. 게놈 개변의 대상으로 하는 알렐이 2개인 경우, 선택 마커용 도너 DNA의 종류는 2종류 이상이다. 게놈 개변의 대상으로 하는 알렐이 3개인 경우, 선택 마커용 도너 DNA의 종류는 3종류 이상이다. 어느 태양에서는, 1개의 선택 마커용 도너 DNA가, 2종류 이상의 서로 상이한(구별 가능한) 선택 마커를 갖고 있어도 된다(이 경우에도, 상이한 종류의 선택 마커용 도너 DNA는, 서로 상이한(구별 가능한) 종류(예를 들어, 고유)의 선택 마커 유전자를 갖고 있지 않으면 안 된다). 어느 태양에서는, 선택 마커용 도너 DNA는, 부위 특이적 재조합 효소의 재조합 서열(예를 들어, Cre 리콤비나제에 의해 재조합되는 loxP 서열 및 그 변종)을 갖지 않는다. 또한, 어느 태양에서는, 본 발명의 방법은, 부위 특이적 재조합 효소 및 그 재조합 서열(예를 들어, Cre 리콤비나제에 의해 재조합되는 loxP 서열 및 그 변종)을 이용하지 않는다. 부위 특이적 재조합 효소를 이용하면, 통상은, 편집 후의 게놈에 부위 특이적 재조합 효소의 재조합 서열이 1개 잔존한다. 이에 반해서, 어느 태양에서는, 본 발명의 방법으로 얻어지는 세포의 개변 게놈은, 부위 특이적 재조합 효소의 재조합 서열(외래이다)을 갖지 않는다.
선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 게놈 개변의 대상으로 하는 알렐의 수와 동수 이상이면 되고, 상한은 특별히 한정되지 않는다. 게놈 개변의 대상으로 하는 알렐의 수와 동수 이상의 종류의 선택 마커용 도너 DNA를 이용함으로써, 2개 이상의 알렐을 안정적으로 개변할 수 있다. 선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 후술하는 공정(b)에서의 선택 조작의 관점에서, 게놈 개변의 대상으로 하는 알렐의 수와 동수 또는 1∼2 많은 정도가 바람직하고, 게놈 개변의 대상으로 하는 알렐의 수와 동수인 것이 보다 바람직하다.
상기 (i)과 (ii)를 세포에 도입하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 공지된 방법을 특별히 제한 없이 이용할 수 있다. (i) 및 (ii)를 세포에 도입하는 방법으로서는, 예를 들어, 바이러스 감염법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법, 칼슘 인산법, DEAE-덱스트란법, 일렉트로포레이션법, 파티클건법 등을 들 수 있지만, 이들로 한정되지 않는다. 상기 (i)과 (ii)를 세포에 도입하는 것에 의해, 상기 (i)의 서열 특이적 핵산 절단 분자에 의해, 표적 영역의 DNA가 절단된 후, HDR에 의해 (ii)의 선택 마커용 도너 DNA 중의 선택 마커가 표적 영역에 노크인된다. 이 때, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA는, 각각의 상류 호몰로지 암 및 하류 호몰로지 암이 동일한 경우에는, 랜덤으로 표적 영역의 2개 이상의 알렐에 노크인될 수 있다. 단, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA는, 2 이상의 알렐 각각의 표적 영역의 상류 서열 및 하류 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 호몰로지 암의 염기 서열을 각각 갖고 있는 한 2 이상의 알렐 각각을 개변할 수 있으므로, 완전히 동일한 호몰로지 암의 염기 서열을 가질 필요는 없다. 어느 태양에서는, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA에 있어서는, 그 상류 및 하류 호몰로지 암의 염기 서열이, 각각의 알렐의 표적 영역의 상류 서열 및 하류 서열과 보다 동일성이 높은 염기 서열을 갖고 있어도 된다(예를 들어, 그와 같이 최적화되어 있어도 된다).
선택 마커용 도너 DNA는, 어느 태양에서는, 상류 호몰로지 암 및 하류 호몰로지 암을 갖고, 상류 호몰로지 암 및 하류 호몰로지 암 사이에, 선택 마커 유전자를 갖고, 바람직하게는, 메가뉴클레아제의 절단 부위 등의 엔도뉴클레아제(염기 서열 특이적 핵산 절단 분자)의 표적 서열을 추가로 가질 수 있다. 이 태양에 있어서, 어느 바람직한 태양에서는, 선택 마커는, 포지티브 선택용의 선택 마커 유전자 및 네거티브 선택용의 마커 유전자를 포함한다. 다른 바람직한 태양에서는, 선택 마커는, 포지티브 선택용의 선택 마커를 포함하지만, 이것과는 별도로 네거티브 선택 마커 유전자를 포함하지 않아도 된다. 어느 바람직한 태양에서는, 포지티브 선택용의 선택 마커 유전자는, 네거티브 선택용으로도 이용될 수 있고, 그와 같은 마커 유전자로서는, 가시화 마커 유전자를 들 수 있다.
2 이상의 선택 마커용 도너 DNA 세트는, 상기의 선택 마커용 도너 DNA의 조합이며, 또한, 각각이 서로 구별 가능한 포지티브 선택용의 선택 마커 유전자를 갖고 있다. 상기 세트에 있어서는, 메가뉴클레아제의 절단 부위 등의 엔도뉴클레아제(염기 서열 특이적 핵산 절단 분자)의 표적 서열을 추가로 가질 수 있고, 당해 표적 서열은 서로 상이해도 되지만, 동일한(또는 동일한 염기 서열 특이적 핵산 절단 분자로 절단할 수 있는) 것이 바람직하다. 선택 마커용 도너 DNA의 길이는 상기와 같지만, 예를 들어, 5kbp 이상, 8kbp 이상, 또는 10kbp 이상일 수 있다.
(공정(b))
상기 공정(a) 후, 공정(b)를 행한다. 공정(b)에서는, 2 이상의 알렐에 각각 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자 또는 그 조합이 도입된 세포를, 당해 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자의 발현에 기초하여, 선택한다. 보다 구체적으로는, 공정(b)에서는, 상기 2 이상의 알렐에 대해서 상이한 종류의 선택 마커용 도너 DNA가 각각 상동 재조합되는 것에 의해, 당해 2 이상의 알렐에 각각 구별 가능하게 상이한 고유의 선택 마커 유전자가 도입되고, 도입된 당해 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자의 모두를 발현하는 세포를 선택한다. 어느 태양에서는, 공정(b)에서는, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA가 갖는 선택 마커 유전자로서 염색체 게놈에 짜넣어진 모든 선택 마커 유전자의 발현에 기초하여, 상이한 선택 마커용 도너 DNA가 도입된 것에 의해 각각의 알렐이 개변된 세포를 선택한다. 어느 태양에서는, 공정(b)에서는, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA가 갖는 모든 선택 마커 유전자에 기초하여, 세포를 선택한다. 어느 태양에서는, 공정(b)에서는, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA가 갖는 선택 마커 유전자로서 염색체 게놈에 짜넣어진 모든 선택 마커 유전자(포지티브 선택용의 마커 유전자)의 발현에 기초하여, 구별 가능한 선택 마커용 도너 DNA가 도입된 것에 의해 각각의 알렐이 개변된 세포를 선택한다. 어느 태양에서는, 공정(b)에서 얻어지는 세포는, 각 알렐이 상이한 포지티브 선택용의 마커 유전자를 갖는다. 어느 태양에서는, 공정(b)에서 얻어지는 세포는, 각 알렐이, 공통된 포지티브 선택용의 마커 유전자를 여기에서, 어느 태양에서는, 공정(b)에서는, 단일 세포 클로닝을 행하지 않는다{단, 공정(b)에서 2개 이상의 알렐이 개변된 세포를 선택한 후에 단일 세포 클로닝을 행하는 것을 포함하고 있어도, 포함하지 않아도 된다}. 어느 태양에서는, 공정(b)에서는, 세포의 선택은, 각 알렐에 도입된 구별 가능한 포지티브 선택용의 마커 유전자의 복수의 발현에 기초하여 행해진다. 어느 태양에서는, 공정(b)는, 단일의 선택 마커 유전자의 발현 강도(예를 들어, 형광 단백질의 발현 강도 또는 형광 강도)에 기초하여 개변 알렐수의 다소를 추정하는 방식으로는 행해지지 않는다. 단일의 선택 마커 유전자의 발현 강도의 강약에 기초하여 개변 알렐수의 다소를 추정하는 방식으로 세포를 선택하는 경우, 세포마다의 유전자 발현량에 변동이 생겨, 2 이상의 알렐이 개변된 세포를 1개의 알렐이 개변된 세포로부터 완전히 분리하는 것이 곤란해지고, 따라서, 공정(b)에 있어서 단일 세포 클로닝이 필요해지기 때문이다.
공정(b)는, 공정(a)에서 이용한 선택 마커 유전자의 종류에 따라서, 적절히, 세포의 선택을 행하면 된다. 이 때, 공정(a)에서 이용한 선택 마커 유전자의 모든 발현에 기초하여 세포를 선택한다.
예를 들어, 선택 마커 유전자가 포지티브 선택 마커 유전자인 경우, 개변 대상의 염색체 게놈에 짜넣어지는(또는 짜넣어진) 모든 선택 마커 유전자를 발현하는 세포를 선택할 수 있고, 예를 들어, 개변 대상의 알렐의 수와 동수의 포지티브 선택 마커를 발현하는 세포를 선택할 수 있다. 포지티브 선택 마커 유전자가 약제 내성 유전자인 경우, 당해 약제를 포함하는 배지에서 세포를 배양하는 것에 의해, 상기 포지티브 선택 마커를 발현하는 세포를 선택할 수 있다. 포지티브 선택 마커 유전자가 형광 단백질 유전자, 발광 효소 유전자, 또는 발색 효소 유전자인 경우, 형광 단백질, 발광 효소, 또는 발색 효소에 의한 형광, 발광, 또는 발색을 나타내는 세포를 선택하는 것에 의해, 상기 포지티브 선택 마커를 발현하는 세포를 선택할 수 있다. 본 공정에서는, 개변되어야 할 알렐의 수와 동수의 선택 마커용 도너 DNA가 게놈에 혼입되었을 경우, 당해 수의 알렐이 개변되어 있다. n배체의 세포에 있어서는, 개변되어야 할 알렐의 수는 n 또는 그것 이하이며, 당해 수 이상 n 이하의 종류의 선택 마커용 도너 DNA가 게놈에 혼입되었을 경우에는, 적어도 개변되어야 할 알렐(2 이상의 알렐이다)이 개변되어 있다. 어느 태양에서는, 개변되어야 할 알렐의 수가 n이며, 당해 수의 종류의 선택 마커용 도너 DNA가 염색체 게놈에 혼입되어, 모든 알렐이 개변되어 있다. 어느 태양에서는, 본 공정에서는, 개변 대상으로 하는 알렐의 수와 동수 이상의 종류의 선택 마커용 도너 DNA를 이용하고 있기 때문에, 세포가 발현하는 포지티브 선택 마커의 수는, 당해 수의 알렐이 확실히 개변되어 있는 것을 의미한다. 공정(b)에 있어서의 세포의 선택 효율을 높이는 관점에서는, 개변 대상으로 하는 알렐의 수는, 선택 마커용 도너 DNA의 종류수와 동일한 것이 바람직하다.
상기와 같이, 본 실시형태의 게놈 개변 방법에서는, n배체의 세포에 있어서 n개의 알렐을 개변하기 위해서 n종류의 선택 마커용 도너 DNA를 이용하여 HDR를 유발시키는 것에 의해, 세포가 갖는 모든 알렐이 개변된 세포를 효율 좋게 취득할 수 있다. 또한, 모든 알렐이 개변된 세포를 확실히 취득할 수 있기 때문에, 표적 영역이 큰 사이즈(예를 들어, 10kbp 이상)여도, 표적 영역이 개변된 세포를 효율 좋게 취득할 수 있다. 그 때문에, 대규모의 게놈 개변도 가능해진다.
어느 태양에서는, 공정(b)에서는, 공정(a)에 의해 얻어진 세포를 포함하는 풀로부터, 세포를 클로닝하지 않고, 개변된 세포를 선택할 수 있다. 클로닝의 공정을 생략하는 것에 의해 공정에 필요한 시간이 단축될 수 있다. 상기 풀은 어느 태양에서는, 105 이상, 106 이상, 107 이상, 또는 108 이상의 세포를 포함하고 있어도 된다.
(임의 공정)
본 실시형태의 게놈 개변 방법은, 상기 공정(a) 및 공정(b)에 더하여, 임의의 공정을 갖고 있어도 된다. 임의의 공정으로서는, 예를 들어, 하기 (c) 및 (d)의 공정을 들 수 있다:
(c) 상기 공정(b) 후, 상기 표적 영역의 상류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암 사이에, 소망의 염기 서열을 포함하는 재조합용 도너 DNA를, 상기 세포에 도입하는 공정; 및
(d) 상기 공정(c) 후, 상기 네거티브 선택 마커를 발현하지 않는 세포를 선택하는 공정.
어느 태양에서는, 본 실시형태의 게놈 개변 방법은, 상기 공정(a) 및 공정(b)에 더하여, 임의의 공정을 갖고 있어도 된다. 어느 태양에서는, 본 실시형태의 게놈 개변 방법 또는, 게놈이 개변된 세포를 얻는 방법에서는, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA가 각각, 상기 상류 호몰로지 암과 상기 하류 호몰로지 암 사이에, 포지티브 선택용의 선택 마커 유전자와 그것과는 별개의 네거티브 선택용의 마커 유전자와 표적 서열을 갖고, 여기에서, 당해 선택 마커 유전자가 포지티브 선택용으로도 네거티브 선택용으로도 이용되는 경우에는, 당해 별개의 네거티브 선택용의 선택 마커 유전자를 갖고 있지 않아도 되고, 예를 들어, 하기 (c) 및 (d)의 공정을 가질 수 있다:
(c) 상기 공정(b) 후, 하기 (iii) 및 (iv)를 선택된 세포에 도입하여 상기 2 이상의 알렐에 재조합용 도너 DNA를 도입하는 공정과,
(iii) 상기 추가적인 표적 서열을 표적으로 하여, 당해 추가적인 표적 서열을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
(iv) 소망의 염기 서열을 포함하는 재조합용 도너 DNA로서, 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖는 재조합용 도너 DNA{당해 재조합용 도너 DNA는, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에, 소망의 염기 서열을 포함하고 있어도, 아무런 염기 서열을 포함하지 않아도 된다},
(d) 상기 공정(c) 후, 상기 네거티브 선택용의 마커 유전자를 발현하지 않는 세포를 선택하는 공정(네거티브 선택을 위한 공정).
＜공정(c)＞
공정(b) 후, 공정(c)을 행해도 된다. 어느 태양에 있어서, 공정(c)에서는, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에, 소망의 염기 서열을 포함하는, 또는 포함하지 않는 재조합용 도너 DNA를, 공정(b)에서 선택한 세포에 도입한다. 어느 태양에 있어서, 공정(c)에서는, 표적 영역의 상류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 표적 영역의 하류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암 사이에, 소망의 염기 서열을 포함하는 재조합용 도너 DNA를, 공정(b)에서 선택한 세포에 도입한다.
≪재조합용 도너 DNA≫
재조합용 도너 DNA는, 노크인하는 소망의 염기 서열을 포함하고 있어도 된다. 상기 소망의 염기 서열은, 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 게놈 개변의 목적이, 표적 영역에 포함되는 유전자의 기능을 녹아웃하는 것에 있는 경우에는, 표적 영역의 일부 또는 전부의 염기 서열을 결실시킨 염기 서열을 소망의 염기 서열로서 이용할 수 있다. 또한, 표적 영역에, 외래 유전자를 짜넣는 경우에는, 당해 유전자를 포함하는 염기 서열을 소망의 염기 서열로서 이용할 수 있다. 소망의 염기 서열의 사이즈는, 특별히 한정되지 않고, 임의의 사이즈로 할 수 있다. 소망의 염기 서열은, 예를 들어, 10bp 이상, 20bp 이상, 40bp 이상, 80bp 이상, 200bp 이상, 400bp 이상, 800bp 이상, 1kbp 이상, 2kbp 이상, 3kbp 이상, 4kbp 이상, 5kbp 이상, 6kbp 이상, 7kbp 이상, 8kbp 이상, 9kbp 이상, 10kbp 이상, 15kbp 이상, 20kbp 이상, 40kbp 이상, 80kbp 이상, 100kbp 이상, 또는 200kbp 이상 등으로 할 수 있다. 본 실시형태의 방법에서는, 소망의 염기 서열이 2 이상의 알렐에 노크인된 세포를 효율적으로 선택할 수 있다. 그 때문에, 예를 들어, 5kbp 이상, 8kbp 이상, 또는 10kbp 이상의 큰 사이즈의 DNA여도 노크인하는 것이 가능하다. 재조합용 도너 DNA는, 예를 들어, 선택 마커용 도너 DNA보다도 길이에 있어서 짧아도 된다.
재조합용 도너 DNA가 갖는 상류 호몰로지 암 및 하류 호몰로지 암은, 상기 선택 마커용 도너 DNA가 갖는 것과, 동일해도 되고, 상이해도 된다. 편의상, 선택 마커용 도너 DNA가 포함하는 상류 호몰로지 암 및 하류 호몰로지 암을 「제1 상류 호몰로지 암」 및 「제1 하류 호몰로지 암」, 재조합용 도너 DNA가 포함하는 상류 호몰로지 암 및 하류 호몰로지 암을 「제2 상류 호몰로지 암」 및 「제2 하류 호몰로지 암」이라고 하는 경우가 있다. 제2 상류 호몰로지 암 및 제2 하류 호몰로지 암은, 예를 들어, 제1 상류 호몰로지 암 또는 그것보다 상류의 영역과 상동 재조합 가능하고, 한편, 제1 하류 호몰로지 암 또는 그것보다 하류의 영역과 상동 재조합 가능하면, 그 길이 및 서열은 특별히 한정되지 않는다(어느 태양에서는, 표적 영역의 주변 영역과 상동 재조합 가능하면, 그 길이 및 서열은 특별히 한정되지 않는다). 재조합용 도너 DNA에 의한 재조합 후에, 선택 마커용 도너 DNA의 염기 서열의 일부가 게놈 상에 잔존하는 것은 허용되지만, 바람직하게는, 선택 마커용 도너 DNA의 염기 서열은, 재조합용 도너 DNA와의 재조합에 의해, 게놈 상으로부터 완전히 제거된다. 선택 마커용 도너 DNA에 탑재되어 있는 다양한 유전자는, 재조합용 도너 DNA에 의한 재조합에 의해 제거된다. 이것에 의해, 어느 태양에서는, 세포의 2개 이상의 알렐은, 각각 재조합용 도너 DNA에 의해 치환될 수 있다. 어느 태양에서는, 재조합용 도너 DNA는, 소망의 염기 서열을 갖고 있어도 되고, 이것에 의해, 2개 이상의 알렐이 개변된 세포는, 당해 개변된 알렐에 당해 소망의 염기 서열을 갖게 된다.
재조합용 도너 DNA에 있어서, 소망의 염기 서열은, 제2 상류 호몰로지 암과 제2 하류 호몰로지 암 사이에 위치한다. 재조합용 도너 DNA가 외래 유전자를 포함하는 경우, 당해 외래 유전자는, 프로모터에 기능적으로 연결되어 있는 것이 바람직하다. 재조합용 도너 DNA는, 인핸서, 폴리 A 부가 시그널, 터미네이터 등의 임의의 제어 서열 등을 갖고 있어도 된다. 또한, 재조합용 도너 DNA가 외래 유전자를 포함하는 경우, 재조합용 도너 DNA는 당해 외래 유전자의 상류 및 하류에 인슐레이터 서열을 갖고 있어도 된다. 어느 태양에서는, 재조합용 도너 DNA는, 제2 상류 호몰로지 암과 제2 하류 호몰로지 암 사이에 스페이서 서열을 포함한다. 어느 태양에서는, 재조합용 도너 DNA는, 선택 마커용 도너 DNA가 갖는 네거티브 선택 마커 유전자를 갖는 세포를 제거할 경우에, 당해 당해 유전자와 동일한(또는 구별할 수 없는) 유전자를 그 독성이 발휘되는 조건하에서 발현시키면, 재조합용 도너 DNA에서 상동 재조합이 생긴 세포를 선택할 수 없다. 따라서, 재조합용 도너 DNA는, 선택 마커용 도너 DNA가 갖는 네거티브 선택 마커 유전자를 갖는 세포를 제거할 경우에, 당해 당해 유전자와 동일한(또는 구별할 수 없는) 유전자를 그 독성이 발휘되는 조건하에서 발현하지 않게 구성되어 있다. 예를 들어, 어느 태양에서는, 재조합용 도너 DNA는, 제2 상류 호몰로지 암과 제2 하류 호몰로지 암 사이에 네거티브 선택 마커 유전자 및 제2 표적 서열을 갖지 않는다.
재조합용 도너 DNA는, 상기 (i)과 함께 세포에 도입되는 것이 바람직하다. 재조합용 도너 DNA를 상기 (i)과 함께 세포에 도입하는 것에 의해, 상기 (i)의 서열 특이적 핵산 절단 분자에 의해, 표적 영역의 DNA가 절단된 후, HDR에 의해 재조합용 도너 DNA 중의 소망의 염기 서열이 표적 영역에 노크인된다. 본 공정에서 재조합용 도너 DNA를 도입하는 세포는, 공정(b)에서 선택된 세포이기 때문에, 표적 영역에 선택 마커용 도너 DNA의 염기 서열이 노크인되어 있다. 그 때문에, (i)의 게놈 개변 시스템의 표적 서열은, 선택 마커용 도너 DNA 노크인 후의 표적 영역에 포함되는 염기 서열이다. 편의상, 공정(a)에 있어서의 게놈 개변 시스템의 표적 서열을 「제1 표적 서열」, 공정(c)에 있어서의 게놈 개변 시스템의 표적 서열을 「제2 표적 서열」이라고 하는 경우가 있다. 제2 표적 서열은, 공정(b) 후의 세포의 표적 영역에 포함되는 임의의 서열을 이용할 수 있다. 어느 태양에서는, 선택 마커용 도너 DNA 중의 제2 표적 서열은, 당해 세포의 게놈 상에 존재하지 않는 서열일 수 있다. 어느 태양에서는, 선택 마커용 도너 DNA 중의 제2 표적 서열은, 당해 세포의 게놈 상에 존재하지 않는 서열이며, 오프타겟에 의한 게놈 상의 다른 서열을 절단하지 않을 정도로 다른 서열과 상이한 서열이다. 어느 태양에서는, 선택 마커용 도너 DNA 중의 제2 표적 서열은, 게놈 상에 존재하지 않는 메가뉴클레아제의 절단 부위일 수 있다. 어느 태양에서는, 제2 표적 서열은, 공정(d)에 있어서의 네거티브 선택 마커 유전자 이외의 영역이다. 당연히, 재조합용 도너 DNA는, 재조합용 도너 DNA에 의한 상동 재조합이 현저하게 저해되지 않도록 구성되어 있다. 제1 표적 서열이, 공정(b) 후의 세포의 표적 영역에 남아 있는 경우 또는 제1 표적 서열이 선택 마커용 도너 DNA에 의해 재도입되었을 경우, 제2 표적 서열은 제1 표적 서열과 동일해도 되고, 상이해도 된다.
재조합용 도너 DNA는, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에 염기 서열을 포함하지 않아도 되지만, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에 10bp 이하, 20bp 이하, 30bp 이하, 40bp 이하, 50bp 이하, 60bp 이하, 70bp 이하, 80bp 이하, 90bp 이하, 100bp 이하, 200bp 이하, 300bp 이하, 400bp 이하, 500bp 이하, 600bp 이하, 700bp 이하, 800bp 이하, 900bp 이하, 또는 1kbp 이하의 염기 서열을 포함하고 있어도 된다. 재조합용 도너 DNA는, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에, 1kbp 이상, 2kbp 이상, 3kbp 이상, 4kbp 이상, 5kbp 이상, 6kbp 이상, 7kbp 이상, 8kbp 이상, 9kbp 이상, 또는 10kbp 이상의 염기 서열을 포함하고 있어도 된다.
재조합용 도너 DNA는, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에, 선택 마커 유전자, 부위 특이적 재조합 효소의 표적 서열, 생리 활성을 갖는 인자를 코딩하는 유전자, 세포 독성을 갖는 인자를 코딩하는 유전자, 및 프로모터 서열로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상 또는 모두를 포함하거나, 혹은 상기 군으로부터 선택되는 1 이상 또는 모두를 포함하지 않는다.
공정(c)에서는, 공정(b)에서 선택 세포에 대해서, 재조합용 도너 DNA를 도입한다. 공정(b)에서 선택한 세포는, 표적 영역에 선택 마커 유전자가 노크인되어 있다. 공정(c)는, 상기 표적 영역에 노크인된 선택 마커 유전자를, 제거하거나 또는 소망의 염기 서열로 치환하는 공정이라고도 말할 수 있다.
(공정(d))
공정(c) 후, 공정(d)를 행해도 된다. 공정(d)에서는, 네거티브 선택 마커를 발현하지 않는 세포를 선택한다.
공정(d)를 행하는 경우, 공정(a)에 있어서, 선택 마커용 도너 DNA는 각각, 포지티브 선택 마커 유전자와 네거티브 선택 마커 유전자를 포함하는 것을 사용할 수 있다. 즉, 공정(a)에서 이용하는 선택 마커용 도너 DNA는, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에, 포지티브 선택 마커 유전자 및 네거티브 선택 마커 유전자를 포함할 수 있다. 포지티브 선택 마커 유전자와 네거티브 선택 마커 유전자의 위치 관계는, 특별히 한정되지 않고, 포지티브 선택 마커 유전자가 네거티브 선택 마커 유전자의 상류에 있어도 되고, 그 반대여도 된다. 선택 마커용 도너 DNA가, 포지티브 선택 마커 유전자와 네거티브 선택 마커 유전자를 갖는 경우, 포지티브 선택 마커 유전자와 네거티브 선택 마커 유전자 사이에는, 자기 절단형 펩티드를 코딩하는 염기 서열, 또는 IRES(internal ribozyme entry site) 서열 등이 개재하고 있어도 된다. 이들 서열을 개재시킴으로써, 1개의 프로모터로부터, 포지티브 선택 마커 유전자와 네거티브 선택 마커 유전자를 독립적으로 발현시킬 수 있다. 2A 펩티드로서는, 예를 들어, 구제역 바이러스(FMDV) 유래의 2A 펩티드(F2A), 말 비염 A 바이러스(ERAV) 유래의 2A 펩티드(E2A), Porcine teschovirus(PTV-1) 유래의 2A 펩티드(P2A) 및 Thosea asigna virus(TaV) 유래의 2A 펩티드(T2A) 등을 들 수 있다.
혹은, 동일한 선택 마커 유전자를, 공정(a)에서는 포지티브 선택 마커로서 이용하고, 공정(d)에서는 네거티브 선택 마커로서 이용해도 된다. 예를 들어, 선택 마커 유전자가 형광 단백질 유전자, 발광 효소 유전자, 혹은 발색 효소 유전자 등의 형광 또는 색소 등의 발색에 관련되는 마커 유전자(가시화 마커 유전자)인 경우, 공정(a)에서는, 형광 단백질, 발광 효소, 또는 발색 효소의 발현에 의한 형광, 발광 또는 발색을 나타내는 세포를 선택하고, 공정(c)에서는, 이들 형광, 발광 또는 발색이 소실한 세포를 선택해도 된다. 동일한 선택 마커 유전자가 포지티브 선택 마커와 네거티브 선택 마커를 겸하는 경우도, 선택 마커용 도너 DNA가, 포지티브 선택 마커에 더하여, 네거티브 선택 마커를 추가로 갖는 경우에 포함된다.
네거티브 선택 마커 유전자는, 선택 마커용 도너 DNA의 종류마다, 상이해도 되고, 동일해도 된다. 네거티브 선택 마커 유전자에 공통의 것을 이용하는 것에 의해, 공정(d)에 있어서의 세포의 선택 작업이 간이해진다.
공정(d)는, 공정(a)에서 이용한 네거티브 선택 마커 유전자의 종류에 따라서, 적절히 세포의 선택을 행하면 된다. 이 때, 공정(a)에서 이용한 네거티브 선택 마커 유전자를 모두가 발현하지 않는 세포를 선택한다.
예를 들어, 네거티브 선택 마커 유전자가 형광 단백질 유전자, 발광 효소 유전자, 또는 발색 효소 유전자 등의 가시화 마커 유전자인 경우, 형광, 발광 또는 발색 등의 가시화 마커가 소실된 세포를 선택하면 된다. 또한, 네거티브 선택 마커 유전자가 자살 유전자인 경우, 당해 자살 유전자의 발현에 의해 독성을 발현하는 약제를 포함하는 배지에서 세포를 배양하는 것에 의해, 상기 네거티브 선택 마커를 발현하지 않는 세포를 선택할 수 있다. 예를 들어, 자살 유전자로서 티미딘 키나제 유전자를 이용했을 경우, 간시클로비르를 포함하는 배지에서 세포를 배양하면 된다. 네거티브 선택 마커 유전자의 발현의 소실은, 공정(a)에서 표적 영역에 짜넣어진 네거티브 선택 마커 유전자가, 재조합용 도너 DNA의 소망의 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 치환된 것을 의미한다. 이 때, 폴리뉴클레오티드의 치환은, 공정(a)에서 노크인된 염기 서열 전체에서 일어나고 있다고 생각된다. 그 때문에, 네거티브 선택 마커 유전자의 발현이 소실된 세포를 선택하는 것에 의해, 공정(a)에서 노크인된 염기 서열이, 재조합용 도너 DNA의 소망의 염기 서열로 치환된 세포를, 효율 좋게 선택할 수 있다. 자살 유전자 등의 네거티브 선택 마커 유전자는, 유도성 프로모터에 기능적으로 연결되어 있어도 되고, 그 독성이 발휘되는 조건하에서 당해 네거티브 선택 마커 유전자가 발현되도록 유도성 프로모터를 구동시키는 약제의 존재하에서, 세포를 배양하는 것에 의해 상기 네거티브 선택 마커를 발현하지 않는 세포를 선택할 수 있다. 이 경우, 네거티브 선택 마커 유전자는, 발현하는 것만으로 세포에 독성을 발생시키는 세포 독소(예를 들어, 리신 및 디프테리아톡신)를 코딩하는 유전자여도 된다.
어느 태양에서는, 공정(d)에서는, 공정(c)에 의해 얻어진 세포를 포함하는 풀로부터, 세포를 클로닝하지 않고, 2 이상의 알렐이 개변된 세포(네거티브 선택 마커 유전자가 비존재인 세포)를 선택할 수 있다. 상기 풀은 어느 태양에서는, 105 이상, 106 이상, 107 이상, 또는 108 이상의 세포를 포함하고 있어도 된다.
상기와 같이, 공정(c) 및 공정(d)를 행하는 것에 의해, 세포가 갖는 모든 알렐이 소망의 서열로 개변된 세포를 효율 좋게 취득할 수 있다. 또한, 모든 알렐이 개변된 세포를 확실히 취득할 수 있기 때문에, 소망의 염기 서열이 큰 사이즈(예를 들어, 10kbp 이상)여도, 당해 염기 서열이 표적 영역에 노크인된 세포를 효율 좋게 취득할 수 있다. 어느 태양에서는, 공정(c) 및 공정(d)를 행하는 것에 의해, 세포가 갖는 모든 알렐에 있어서 표적 영역이 결실되고, 그 전후(즉, 상류 호몰로지 암 및 하류 호몰로지 암이 각각 상동 재조합을 일으키는 서열)가, 염기의 삽입, 치환, 및 결실로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상 없이(예를 들어, 염기의 삽입, 치환 및 결실 없이), 심리스로 연결되어 있다. 어느 태양에서는, 얻어지는 세포에서는, 결손시킨 영역을 끼운 상류측과 하류측의 염기 서열이 심리스로 연결되어 있다.
한편, 공정(b)에 의해, 생존하는 세포의 수가 적은 경우, 또는 생존하는 세포가 얻어지지 않는 경우에는, 상류 호몰로지 암 및 하류 호몰로지 암과 상동 재조합에 의해 게놈으로부터 제거된 표적 영역 중에, 세포의 증식 또는 생존에 영향을 주는 유전자가 포함되어 있는 것이 나타난다. 따라서, 표적 영역에 세포의 증식 또는 생존에 영향을 주는 유전자가 포함되어 있는지 여부를 조사할 수 있다. 또한, 이 경우에는, 상류 호몰로지 암 및 하류 호몰로지 암의 설계 위치를 변화시켜, 게놈 상으로부터 상동 재조합에 의해 소실시키는 유전자를 변화시켜, 세포의 증식 또는 생존에 영향을 주는 유전자를 특정할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 공정(b) 후에, 공정(e)를 행할 수 있다. 즉, 공정(e)는, 공정(b)에 있어서, 생존하는 세포의 수가 적은 경우, 또는 생존하는 세포가 얻어지지 않는 경우에는, 표적 영역을 끼워, 게놈 상으로부터 소실시키는 유전자를 감소시키는 것에 의해, 세포의 증식 또는 생존에 영향을 주는 유전자를 특정하는 것을 포함한다. 표적 영역에는, 1개의 유전자 밖에 포함되지 않은 경우에는, 당해 유전자가, 세포의 증식 또는 생존에 영향을 주는 유전자인 것이 나타난다. 그리고, 세포의 증식 또는 생존에 영향을 주는 유전자가 특정되었을 경우, 공정(f)를 행할 수 있다. 공정(f)는, 특정된 세포의 증식 또는 생존에 영향을 주는 유전자를 개변하는 게놈의 다른 영역(예를 들어, 세이프 하버 영역 등)에 노크인하는 것을 포함한다{노크인에는 재조합용 도너 DNA를 이용해도 된다}. 이것에 의해, 본 발명의 방법에 의해 깎는 영역을 확대할(표적 영역을 상류 및/또는 하류로 넓힐) 수 있다. 생존하는 세포의 수가 적은 것은, 세포의 생존이나 증식에 영향을 주지 않는 영역에 대해서 공정(a) 및 (b)를 실시했을 때에 얻어지는 세포의 수와의 비교에 의해 확인할 수 있다. 어느 태양에서는, 공정(a)는, 세포의 증식이나 생존을 소실시키는 영역을 표적 영역으로 하지 않을 수 있다.
［게놈 개변 키트］
일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐을 개변하는 게놈 개변 키트를 제공한다. 상기 게놈 개변 키트는, 하기 (i) 및 (ii)를 포함한다:
(i) 상기 염색체 게놈의 표적 영역을 표적으로 하는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템; 및
(ii) 상기 표적 영역의 상류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측에 인접하는 염기 서열과 상동인 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암 사이에, 선택 마커 유전자의 염기 서열을 포함하는, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA로서, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA는, 서로 상이한 선택 마커 유전자를 갖고, 상기 선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 게놈 개변의 대상으로 하는 상기 알렐의 수와 동수 이상인, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는, 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐을 개변하는 게놈 개변 키트.
(i) 상기 염색체 게놈의 표적 영역을 표적으로 하여, 표적 영역을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
(ii) 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA로서, 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖고, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에, 선택 마커 유전자의 염기 서열을 포함하고, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA는, 서로 구별 가능한 선택 마커 유전자를 갖고, 상기 선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 게놈 개변의 대상으로 하는 상기 알렐의 수와 동수 이상인, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA. 이 태양에 있어서, 상기 선택 마커 유전자는, 선택 마커용 도너 DNA의 종류마다 고유할 수 있다. 상기 키트는, 상기 키트는 본 발명의 방법에서 이용되는 것일 수 있다. 상기 키트는, 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐이 개변된 세포를 제작하는 방법에서 이용되어도 된다.
본 실시형태의 키트가 포함하는 (i) 및 (ii)는, 상기 ［게놈 개변 방법］의 항에서 설명한 (i) 및 (ii)와 마찬가지이다. 본 실시형태의 키트를 이용하는 것에 의해, 상기의 게놈 개변 방법을 용이하게 행할 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐이 개변된 세포로서, 당해 2개 이상의 알렐의 각각에 있어서 서로 상이한(구별 가능한) 선택 마커 유전자를 갖는, 세포를 제공한다. 어느 태양에서는, 세포는, 단세포 생물의 세포일 수 있다. 어느 태양에서는, 세포는, 단리된 세포일 수 있다. 어느 태양에서는, 세포는, 다능성 세포, 및 다능성 줄기세포(배성 줄기세포 및 유도 다능성 줄기세포 등)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포일 수 있다. 어느 태양에서는, 세포는, 조직 줄기세포일 수 있다. 어느 태양에서는, 세포는, 체세포일 수 있다. 어느 태양에서는, 세포는, 생식 계열 세포(예를 들어, 생식 세포)일 수 있다. 어느 태양에서는, 세포는, 세포주일 수 있다. 어느 태양에서는, 세포는 불사화 세포일 수 있다. 어느 태양에서는, 세포는 암 세포일 수 있다. 어느 태양에서는, 세포는, 비암 세포일 수 있다. 어느 태양에서는, 세포는, 질환 환자의 세포일 수 있다. 어느 태양에서는, 세포는 건상자의 세포일 수 있다. 어느 태양에서는, 세포는, 동물 세포(예를 들어, 인간 세포), 예를 들어, 곤충 세포(예를 들어, 누에 세포), HEK293 세포, HEK293T 세포, Expi293F(상표) 세포, FreeStyle(상표) 293F 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포(CHO 세포), CHO-S 세포, CHO-K1 세포, 및 ExpiCHO 세포, 및 이들 세포로부터의 파생 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 세포일 수 있다. 어느 바람직한 태양에서는, 상기 세포에 있어서는, 염색체 게놈의 표적 영역의 모든 알렐이 개변되고, 개변 후의 영역은, 각각 서로 상이한(구별 가능한) 선택 마커 유전자를 갖는다.
일 실시형태에 있어서, 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐이 개변된 세포로서, 당해 2개 이상의 알렐의 각각에 있어서 서로 상이한(구별 가능한) 선택 마커 유전자를 갖는, 세포의 배양 방법이 제공된다. 선택 마커 유전자가, 약제 내성 마커 유전자인 경우에는, 배양은 각각의 약제 내성 마커 유전자에 대한 약제의 존재하에서 배양될 수 있다. 배양은, 세포의 유지 또는 증식에 적절한 조건하에서 행해질 수 있다.
일 실시형태에 있어서, 본 발명은, 2개 이상의 알렐이 개변된 염색체 게놈을 갖는 비인간 생물로서, 당해 2개 이상의 알렐의 각각에 있어서 서로 상이한(구별 가능한) 선택 마커 유전자를 갖는, 비인간 생물이 제공된다. 어느 태양에서는, 세포는, 단세포 생물의 세포일 수 있다. 어느 태양에서는, 비인간 생물은, 효모(예를 들어, 분열 효모 또는 출아 효모, 예를 들어, 사카로미세스·세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로미세스·칼스베르겐시스(Saccharomyces carlsbergensis), 사카로미세스·프라길리스(Saccharomyces fragilis), 사카로미세스·룩시(Saccharomyces rouxii) 등의 사카로미세스속, 캐디다·유틸리스(Candida utilis), 캐디다·트로피칼리스(Candida tropicalis) 등의 캐디다속, 피키아(Pichia)속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)속, 야로이와(Yarrowia)속, 한제뉼라(Hansenula)속, 엔도마이세스(Endomyces)속 등의 효모로 이루어지는 군으로부터 선택되는 생물일 수 있다. 어느 태양에서는, 비인간 생물은, 사상균(예를 들어, Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Acremonium, Fusarium, 및 Penicillium종)일 수 있다. 어느 태양에서는, 비인간 생물은, 다세포 생물일 수 있다. 어느 태양에서는, 비인간 생물은, 비인간 동물일 수 있다. 어느 태양에서는, 비인간 생물은, 식물일 수 있다. 어느 바람직한 태양에서는, 상기 비인간 생물에서는, 염색체 게놈의 표적 영역의 모든 알렐이 개변되고, 개변 후의 영역은, 각각 서로 상이한(구별 가능한) 선택 마커 유전자를 갖는다.
상기 세포에서는, 세포의 생존이나 증식에 필요한 유전자의 1 이상이, 염색체 게놈의 다른 영역에 포함되거나, 또는 모아져 있어도 된다. 다른 영역은, 예를 들어, 세이프 하버 영역(예를 들어, AAVS1 영역 등)일 수 있다.
실시예
이하, 실험예에 의해 본 발명을 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
［실험예 1］
도너 DNA의 제작
2개의 알렐이 편집된 세포를 선별하기 위해서, 포지티브 선택 마커가 상이한 2종류의 도너 DNA를 제작했다(도 1; PuromycinR plasmid, BlasticidinR plasmid). 네거티브 선택 마커로서는, GFP 유전자를 이용했다. PuromycinR plasmid에서는, EF1 프로모터의 하류에 GFP 유전자가 연결되어 있고, T2A 서열을 끼고, 퓨로마이신 내성 유전자가 연결되어 있다. BlasticidinR plasmid에서는, EF1 프로모터의 하류에 GFP 유전자가 연결되어 있고, T2A 서열을 끼고, 블라스티사이딘 내성 유전자가 연결되어 있다.
도너 플라스미드(도너 DNA)의 백본 서열로서, HR110PA-1 플라스미드(후나코시)를 이용했다. 이 HR110PA-1 플라스미드를, 제한 효소 EcoRI와 BamHI로 절단하고, 복제 기점과 암피실린 내성 유전자를 가지는 서열을 절출하여, 정제를 행했다. 이것을, 향후 이용하는 모든 도너 플라스미드의 백본 서열로서 이용했다.
플라스미드의 선택 마커 서열 및 호몰로지 암의 서열은, 이하의 PCR에 의해 증폭했다. EF1 프로모터 서열은, HR110PA-1 상의 EcoRI 인식 서열로부터, EF1 프로모터 서열까지를 증폭하는 것에 의해 제작했다. GFP 서열은, CS-CDF-CG-PRE 플라스미드(dnaconda.riken.jp/search/RDB_clone/RDB04/RDB04379.html)를 주형으로 제작했다. T2A 서열로부터 퓨로마이신 발현 서열은, HR110PA-1 상의 T2A 서열로부터, BamHI 인식 서열까지 증폭하는 것에 의해 제작했다. 상류 호몰로지 암(810bp: 서열 번호 2) 및 하류 호몰로지 암(792bp: 서열 번호 3)은, HCT116의 게놈을 주형으로 제작했다.
선택 마커 서열과 호몰로지 암 서열에는, 이웃하는 서열에 대응하는 20bp의 상동 서열을 PCR 시에 부가하고 있었다. 이 상동 서열을 개재시켜, 백본 서열과 선택 마커 서열, 호몰로지 암 서열을 NEBuilder HiFi DNA Assembly(NEW ENGLAND BioLabs)에 의해 결합하고, 대장균 내에 도입하여 암피실린 첨가 배지에서 배양하는 것에 의해, 퓨로마이신 플라스미드의 클로닝을 행했다.
블라스티사이딘 플라스미드는, 퓨로마이신 플라스미드를 개변하는 것에 의해 제작했다. PCR에 의해 증폭한 블라스티사이딘의 ORF 서열과, 퓨로마이신 플라스미드를 주형으로 퓨로마이신 ORF 서열 이외를 증폭한 서열을, NEBuilder HiFi DNA Assembly에 의해 결합하고, 퓨로마이신 플라스미드 제작 시와 마찬가지로 클로닝을 행했다.
［실험예 2］
TP53 유전자의 제1 인트론에의 선택 마커의 도입
(세포 및 표적 영역)
세포는, 대장암 유래의 세포주인 HCT116 세포를 이용했다. 이 세포주의 대부분은 2배체이다. 게놈 편집의 표적 영역으로서는, 암 억제 유전자의 TP53의 제1 인트론을 선택했다.
(공정(a))
105개의 HCT116 세포에, 도너 플라스미드(도너 DNA)로서, PuromycinR plasmid 및 BlasticidinR plasmid(각 12.5ng)를 도입했다.
도너 플라스미드 도입의 전날, 24웰 플레이트에, 각 웰당 105개의 HCT116 세포를 파종했다. 배양에는, 각 웰당 500μL의 맥코이 5A 배지(10%가 되도록 FBS를 첨가)를 이용했다.
세포를 파종한 다음날, 하기의 조성으로, 플라스미드 도입 용액을 제작했다.
Opti-MEM 100μL
Cas9＆gRNA 공발현 플라스미드(pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9; Addgene, 플라스미드 번호 42230) 475ng
PuromycinR plasmid 12.5ng
BlasticidinR plasmid 12.5ng
FuGENE HD 1.5μL
Cas9＆gRNA 공발현 플라스미드에 이용한 gRNA의 표적 서열을 이하에 나타낸다.
CTCAGAGGGGGCTCGACGCTAGG(서열 번호 4)
상기의 플라스미드 도입 용액을 피페팅에 의해 혼합 후, 10분간 실온에서 인큐베이트 후, 24웰 플레이트에 가했다.
(공정(b))
양 플라스미드의 도입 후, 퓨로마이신 1μg/mL 및 브라티사이딘을 10μg/mL 첨가한 맥코이 5A 배지(10%가 되도록 FBS를 첨가)에서, 세포를 8일간 배양했다. 배양 후, 독립 콜로니로부터 세포를 피페팅으로 회수했다.
(선택 마커 유전자 노크인의 확인)
회수한 27개의 세포 클론으로부터 페놀/클로로폼 추출법에 의해 DNA를 추출하고, 정션 PCR을 행하여 선택 마커 유전자의 노크인을 확인했다.
HCT116 세포를 1.5mL 튜브에 회수하고, 실온에서 3분간, 150g로 원심했다. 상청을 제거하고, 173μL의 TE 버퍼(100mM NaCl)로 재현탁했다. 95℃에서 5분간 인큐베이트한 후, 실온으로 냉각했다. 20μL의 TE 버퍼(100mM NaCl, 0.5% SDS), 5μL의 Proteinase K(5mg/ml), 2μL의 RNaseA(100mg/ml)를 가하고, 혼합한 후, 37℃에서 2시간 전도 교반을 행했다. 85℃에서 25분간 인큐베이트한 후, 200μL의 페놀/클로로폼/아이소아밀 알코올(25:24:1)을 가하고, 10분간 전도 교반을 행했다. 실온에서 10분간, 15,000g로 원심한 후, 상층을 새로운 1.5mL 튜브에 옮겼다. 상기 1.5mL 튜브에, 옮긴 상층과 동량의 클로로폼을 가하고, 10분간 전도 교반을 행했다. 실온에서 10분간, 15,000g로 원심한 후, 상층을 새로운 1.5mL 튜브에 옮겼다. 상기 1.5mL 튜브에, 옮긴 상층과 동량의 아이소프로판올을 가하고, 4℃에서 30분간, 15,000g로 원심했다. 상청을 제거하고, 70% 에탄올을 150μL 가하고, 4℃에서 5분간, 15,000g로 원심했다. 상청을 완전히 제거하고, 침전을 TE 버퍼 30μL로 용해했다.
상기와 같이 회수한 DNA를 주형으로 하고, 도 2에 나타내는 junction Primer를 이용하여, 정션 PCR을 행했다. junction Primer는, 퓨로마이신 내성 유전자 또는 블라스티사이딘 내성 유전자에 대해서, 5＇ 및 3＇의 양측의 정션을 넘도록 증폭하는 프라이머이다. PCR 산물의 아가로스 겔 전기 영동을 행하여, 증폭 DNA 단편을 확인했다. PCR 조건 및 프라이머 서열을 이하에 나타낸다.
＜PCR 조건＞
PCR 용액(반응계 25μL)의 조성
1x KOD one(TOYOBO)
0.2μM 포워드 프라이머
0.2μM 리버스 프라이머
10ng 게놈 DNA
서멀 사이클러 조건
98℃, 30초
98℃, 10초; 68℃, 20초 50사이클
4℃
＜프라이머 서열＞
Puromycin 5＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: TGCCCCGTTGTTATCCTTAC(서열 번호 5)
리버스 프라이머: GCTCGTAGAAGGGGAGGTTG(서열 번호 6)
Puromycin3＇junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GTCACCGAGCTGCAAGAAC(서열 번호 7)
리버스 프라이머: GAAGACGGCAGCAAAGAAAC(서열 번호 8)
Blasticidin 5＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: TGCCCCGTTGTTATCCTTAC(서열 번호 9)
리버스 프라이머: GCTTCAATATGTACTGCCGAAA(서열 번호 10)
Blasticidin 3＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GAAGCCATTGCGATTGGTAG(서열 번호 11)
리버스 프라이머: GAAGACGGCAGCAAAGAAAC(서열 번호 12)
결과를 도 3에 나타낸다. HCT116의 야생주로부터 추출한 DNA에서는, 퓨로마이신 내성 유전자 및 블라스티사이딘 내성 유전자의 어느 것에 대해서도, 기대되는 사이즈의 밴드는 검출되지 않았다(최우측 레인: WT). 한편, 상기 공정(a) 및 공정(b)에 의해 얻어진 세포 클론으로부터 추출한 DNA에서는, 27클론 중 12클론에서, 퓨로마이신 내성 유전자 및 블라스티사이딘 내성 유전자의 양쪽에서, 기대되는 사이즈의 밴드가 모두 검출되었다(밑줄로 나타내는 클론). 이 결과는, 이들 12클론에서는, TP53의 제1 인트론에 있어서, 한쪽의 알렐이 퓨로마이신 내성 유전자로 치환되고, 다른 쪽의 알렐이 블라스티사이딘 내성 유전자로 치환된 것을 나타내고 있다. 클론 13에 대해서는, PCR 산물의 염기 서열의 서열 해석을 행했다. 그 결과, TP53의 제1 인트론이 퓨로마이신 내성 유전자로 치환된 서열, 및 TP53의 제1 인트론이 블라스티사이딘 내성 유전자로 서열의 양쪽이 확인되었다.
［참고 실험예］
BlasticidinR plasmid를 이용하지 않았던 것 이외에는 상기와 마찬가지의 방법으로, HCT116 세포에, PuromycinR plasmid를 도입했다.
PuromycinR plasmid의 도입 후, 퓨로마이신을 1μg/mL 첨가한 맥코이 5A 배지(10%가 되도록 FBS를 첨가)에서, 세포를 8일간 배양했다. 배양 후, 독립 콜로니로부터 세포를 피페팅으로 회수했다.
회수한 10개의 세포 클론으로부터 상기와 마찬가지의 방법으로 DNA를 추출했다. 퓨로마이신 내성 유전자에 대해서, 5＇ 및 3＇의 양측의 정션을 넘도록 증폭하는 junction Primer(도 4 좌도 참조)를 이용하여, 상기와 마찬가지로 정션 PCR을 행했다. PCR 산물의 아가로스 겔 전기 영동을 행하여, 증폭 DNA 단편을 확인했다.
그 결과, TP53의 제1 인트론에 있어서, 양 알렐이 퓨로마이신 내성 유전자로 치환된 클론은 완전히 얻어지지 않았다. 또한, 편측 알렐만이 퓨로마이신 내성 유전자로 치환된 클론의 취득 효율도 낮았다(도 4 우도).
［실험예 3］
선택 마커의 제거
(공정(c))
도너 DNA로서, 야생형의 TP53 서열을 포함하는 플라스미드(야생형 TP53 플라스미드)를 제작했다. 도너 DNA로서, 야생형 TP53의 제1 인트론 및 그 주변 영역(5＇ arm 및 3＇ arm)의 서열을 포함하는 플라스미드를 이용한 것 이외에는 상기와 마찬가지의 방법으로, 실험예 2에서 취득한 세포 클론(도 3의 클론＃13)에, 야생형 TP53 플라스미드를 도입했다. Cas9＆gRNA 공발현 플라스미드에 이용한 gRNA의 표적 서열을 이하에 나타낸다.
GGCGCAACGCGATCGCGTAAGGG(서열 번호 13)
(공정(d))
야생형 TP53 플라스미드의 도입 후, 셀 소터(SH800, 소니)로 GFP 발현이 소실된 세포 클론을 선별하여, 1세포마다 96웰 플레이트에 회수했다.
(마커 유전자 제거의 확인)
회수한 세포로부터 상기와 마찬가지의 방법으로 DNA를 추출했다. 도 5에 나타내는 Primer를 이용하여, PCR을 행했다. PCR 산물의 아가로스 겔 전기 영동을 행하여, 증폭 DNA 단편을 확인했다. PCR 용액의 조성은 상기와 마찬가지이다. 서멀 사이클러 조건 및 프라이머 서열을 이하에 나타낸다.
서멀 사이클러 조건
98℃, 30초
98℃, 10초; 68℃, 2분 30초 50사이클
4℃
＜프라이머 서열＞
TP53 제 1 인트론 증폭용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: TGCCCCGTTGTTATCCTTAC(서열 번호 14)
리버스 프라이머: GAAGACGGCAGCAAAGAAAC(서열 번호 15)
그 결과를 도 6에 나타낸다. 8클론 중, 7클론에서 기대하는 사이즈의 밴드가 검출되었다(밑줄로 나타내는 클론). 이 결과는, 이들 7클론에서는, 선택 마커(퓨로마이신 내성 유전자 혹은 블라스티사이딘 내성 유전자, 및 GFP 유전자)가 야생형 TP53 유전자의 제1 인트론 서열로 치환된 것을 나타내고 있다. 또한, 상기 7클론에서는, 선택 마커가 한쪽의 알렐에 남았을 경우에 검출되는 5.6kb의 밴드도 검출되지 않았다. 이 결과는, 양 알렐에서 선택 마커가 야생형 제 1 인트론으로 치환된 것을 시사하고 있다.
［실험예 4］
TP53 유전자의 제1 인트론의 개변
도너 DNA로서, 도 7A∼D에 나타내는 플라스미드를 각각 이용한 것 이외에는 실험예 3과 마찬가지로 하여, 공정(c) 및 공정(d)를 행했다.
회수한 세포로부터 상기와 마찬가지의 방법으로 DNA를 추출했다. 도 7A∼D에 각각 나타내는 Primer를 이용하여, PCR을 행했다. PCR 산물의 아가로스 겔 전기 영동을 행하여, 증폭 DNA 단편을 확인했다. PCR 용액의 조성은 상기와 마찬가지이다. 서멀 사이클러 조건 및 프라이머 서열을 이하에 나타낸다.
서멀 사이클러 조건
98℃, 30초
98℃, 10초; 68℃, 2분 30초 50사이클
4℃
＜프라이머 서열＞
TP53 제 1 인트론 증폭용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: TGCCCCGTTGTTATCCTTAC(서열 번호 14)
리버스 프라이머: GAAGACGGCAGCAAAGAAAC(서열 번호 15)
그 결과를 도 8에 나타낸다. 어느 도너 DNA를 이용했을 경우도, 고확률로, 양 알렐이 도너 DNA 중의 서열로 치환된 세포 클론이 얻어졌다(밑줄로 나타내는 클론).
인간 TP53 유전자의 제1 인트론은, 10,762bp라고 하는 비교적 큰 게놈 영역이다. 상기 방법에서는, 양 알렐을 효율 좋게 게놈 편집할 수 있는 것에 더하여, 이와 같은 비교적 큰 게놈 영역에서도, 효율 좋게 게놈 편집할 수 있는 것이 확인되었다.
［실시예 5］
실시예 4에서는, HCT116 세포에 있어서 인간 TP53 유전자의 제1 인트론의 결실을 시도했지만, 본 실시예에서는, HCT116 세포 대신에, 인간 다능성 줄기세포에 있어서 인간 TP53 유전자의 제1 인트론의 결실을 시도했다. 인간 다능성 줄기세포는, 구체적으로는 인간 유도 다능성 줄기세포(iPS 세포)로 했다.
본 실시예에서는, 도 14 A에 나타나는 바와 같이, 선택 마커용 도너 DNA 존재하에서, 표적 유전자의 상류와 하류에 대해서 특이적으로 절단을 유도할 수 있도록 설계된 gRNA를 갖는 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 절단을 도입했다. 절단 개소는, 상류 호몰로지 암이 하이브리다이즈하는 영역과 표적 유전자 사이, 및 하류 호몰로지 암이 하이브리다이즈하는 영역과 표적 유전자 사이에 설계했다. 이것에 의해, 재조합의 제1 단계를 유발시켰다. 이용한 gRNA의 서열은 이하와 같았다.
＜가이드 RNA＞
인간 TP53 상류 gRNA: CUCAGAGGGGGCUCGACGCU(서열 번호 16)
인간 TP53 하류 gRNA: GGUGCUUUAAGAAUUACCGC(서열 번호 17)
실시예 4에서 이용한 2종류의 선택 마커용 도너 DNA의 존재하에서, 인간 iPS 세포의 게놈의 인간 TP53 유전자의 제1 인트론의 상류와 하류에 절단을 가했다. 그 후, 퓨로마이신 및 블라스티사이딘 존재하에서, 각각의 알렐에 퓨로마이신 내성 유전자 및 블라스티사이딘 내성 유전자가 도입된 게놈을 갖는 세포를 취득하여, 클로닝했다. TP53 유전자, 퓨로마이신 내성 유전자 및 블라스티사이딘 내성 유전자는, 상기 프라이머에 의해 각각 증폭했다. 결과는, 도 9에 나타나는 바와 같았다. 도 9에 나타나는 바와 같이, 양 알렐에 있어서, 제1 인트론이 도너 DNA 서열로 치환된 세포(즉, 인간 TP53 유전자의 제1 인트론이 양 알렐에 있어서 결실된 세포)가 취득되었다.
［실시예 6］
TP53과 마찬가지로, HCT116 세포에 있어서, MLH1, CD44, MET, 및 APP를 코딩하는 인간 유전자(이하, 표적 유전자라고 한다)의 각각에 대해 상기 방법을 적용하여 유전자의 결실을 유도시켰다. 도 10∼13에 각각 나타나는 바와 같이, 표적 유전자의 크기는, MLH1이 58kb, CD44가 94kb, MET가 126kb, 및 APP가 290kb였다. 이들 표적 유전자 각각의 상류와 하류에 대한 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암을 각각 설계하여, 암 사이에 서로 구별 가능한 다른 선택용 마커 유전자와 가시화 마커 유전자를 각각 탑재한 선택 마커용 도너 DNA를 준비했다. 구체적으로는, 1개의 선택 마커용 도너 DNA는, GFP와 퓨로마이신 내성 유전자를 갖고, 다른 1개의 선택 마커용 도너 DNA는, GFP와 블라스티사이딘 내성 유전자를 가졌다.
도 14a에 나타나는 바와 같이, 선택 마커용 도너 DNA 존재하에서, 표적 유전자의 상류와 하류에 대해서 특이적으로 절단을 유도할 수 있도록 설계된 gRNA를 갖는 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 절단을 도입했다. 절단 개소는, 상류 호몰로지 암이 하이브리다이즈하는 영역과 표적 유전자 사이, 및 하류 호몰로지 암이 하이브리다이즈하는 영역과 표적 유전자 사이에 설계했다. 이것에 의해, 재조합의 제1 단계를 유발시켰다.
＜가이드 RNA의 서열＞
각 표적 유전자의 상류 및 하류에 대한 가이드 RNA의 서열은 이하와 같았다.
MLH1 상류 gRNA: GCGCCUGACGUCGCGUUCGC(서열 번호 18)
MLH1 하류 gRNA: GGAGGCCUUGGCACGGGUUC(서열 번호 19)
CD44 상류 gRNA: CGAGGAUGGCGGACCGAACC(서열 번호 20)
CD44 하류 gRNA: GCCAAGUGGACUCAACGGAG(서열 번호 21)
MET 상류 gRNA: GGGCCGCGCGCGCCGAUGCC(서열 번호 22)
MET1 하류 gRNA: GUUCCCACCUCGCAAGCAAU(서열 번호 23)
APP 상류 gRNA: CUCCCGGGGGUGUCGUAUAA(서열 번호 24)
APP 하류 gRNA: UUCUAUAAAUGGACACCGAU(서열 번호 25)
＜프라이머 서열＞
각 표적 유전자의 결실 및 약제 내성 유전자의 도입은, 이하의 프라이머를 이용하여 검출했다.
MLH1 증폭용 PCR 프라이머
MLH1 5＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: CCAAGAACGCTTCCATTTCT(서열 번호 26)
리버스 프라이머: CCCTGTGCCTGGTCTGTC(서열 번호 27)
MLH1 3＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: TTCTGAGGTCTCCAGCAAGT(서열 번호 28)
리버스 프라이머: AAGTTGAAGATGAATTGAAAGCAG(서열 번호 29)
Puromycin 5＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: CCAAGAACGCTTCCATTTCT(서열 번호 30)
리버스 프라이머: GCTCGTAGAAGGGGAGGTTG(서열 번호 31)
Puromycin 3＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GTCACCGAGCTGCAAGAAC(서열 번호 32)
리버스 프라이머: AAGTTGAAGATGAATTGAAAGCAG(서열 번호 33)
Blasticidin 5＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: CCAAGAACGCTTCCATTTCT(서열 번호 34)
리버스 프라이머: GCTTCAATATGTACTGCCGAAA(서열 번호 35)
Blasticidin 3＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GAAGCCATTGCGATTGGTAG(서열 번호 36)
리버스 프라이머: AAGTTGAAGATGAATTGAAAGCAG(서열 번호 38)
CD44 증폭용 PCR 프라이머
CD44 5＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: AGTGGATGGACAGGAGGATG(서열 번호 39)
리버스 프라이머: GCGAAAGGAGCTGGAGGA(서열 번호 40)
CD44 3＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: ATGGAGCTGTGGAGGACAGA(서열 번호 41)
리버스 프라이머: GAGTGGGTCTGAGTGGGAAC(서열 번호 42)
Puromycin 5＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: AGTGGATGGACAGGAGGATG(서열 번호 43)
리버스 프라이머: GCTCGTAGAAGGGGAGGTTG(서열 번호 44)
Puromycin 3＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GTCACCGAGCTGCAAGAAC(서열 번호 45)
리버스 프라이머: GAGTGGGTCTGAGTGGGAAC(서열 번호 46)
Blasticidin 5＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: AGTGGATGGACAGGAGGATG(서열 번호 47)
리버스 프라이머: GCTTCAATATGTACTGCCGAAA(서열 번호 48)
Blasticidin 3＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GAAGCCATTGCGATTGGTAG(서열 번호 49)
리버스 프라이머: GAGTGGGTCTGAGTGGGAAC(서열 번호 50)
MET 증폭용 PCR 프라이머
MET 5＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: TGAAATCACTCTTATGTAACCTCTGG(서열 번호 51)
리버스 프라이머: AAGGGGCTGCAATTTTACCT(서열 번호 52)
MET 3＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GGGTGGATGGATTGAAAAGA(서열 번호 53)
리버스 프라이머: TGCAGGTATAGGCAGTGACAAG(서열 번호 54)
Puromycin 5＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: TGAAATCACTCTTATGTAACCTCTGG(서열 번호 55)
리버스 프라이머: GCTCGTAGAAGGGGAGGTTG(서열 번호 56)
Puromycin 3＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GTCACCGAGCTGCAAGAAC(서열 번호 57)
리버스 프라이머: TGCAGGTATAGGCAGTGACAAG(서열 번호 58)
Blasticidin 5＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: TGAAATCACTCTTATGTAACCTCTGG(서열 번호 59)
리버스 프라이머: GCTTCAATATGTACTGCCGAAA(서열 번호 60)
Blasticidin 3＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GAAGCCATTGCGATTGGTAG(서열 번호 61)
리버스 프라이머: TGCAGGTATAGGCAGTGACAAG(서열 번호 62)
APP 증폭용 PCR 프라이머
APP 5＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GGGGAGCTGGTACAGAAATG(서열 번호 63)
리버스 프라이머: CAGGATCAGGGAAAGGTGAG(서열 번호 64)
APP 3＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GAACGGCTACGAAAATCCAA(서열 번호 65)
리버스 프라이머: CTCTTCTCCCCACCCAAAA(서열 번호 66)
Puromycin 5＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GGGGAGCTGGTACAGAAATG(서열 번호 67)
리버스 프라이머: GCTCGTAGAAGGGGAGGTTG(서열 번호 68)
Puromycin 3＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GTCACCGAGCTGCAAGAAC(서열 번호 69)
리버스 프라이머: CTCTTCTCCCCACCCAAAA(서열 번호 70)
Blasticidin 5＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GGGGAGCTGGTACAGAAATG(서열 번호 71)
리버스 프라이머: GCTTCAATATGTACTGCCGAAA(서열 번호 72)
Blasticidin 3＇ junction용 PCR 프라이머
포워드 프라이머: GAAGCCATTGCGATTGGTAG(서열 번호 73)
리버스 프라이머: CTCTTCTCCCCACCCAAAA(서열 번호 74)
결과, 도 10∼13의 「1st step」에 있어서 나타나는 바와 같이, 양 알렐의 표적 유전자가 결실된 복수의 클론을 각각 얻었다. 한편, 도 14b와 같이, 선택 마커용 도너 DNA 존재하에서, 표적 유전자의 하류만, 또는 상류에만 절단을 유도했을 경우보다도, 도 14a와 같이, 선택 마커용 도너 DNA 존재하에서, 표적 유전자의 상류 및 하류의 양쪽에 절단을 도입한 편이, 양 알렐의 표적 유전자가 결실된 클론의 취득 효율은 높았다. 이와 같이 하여, 상기의 각종 유전자에 있어서, 표적 영역을 선택 마커용 도너 DNA의 서열로 치환할 수 있었다.
다음에, 표적 유전자를 결실시키는 대신에 도입한 선택 마커를, 제2 단계의 재조합에 의해 제거했다. 여기에서는, 가시화 마커인 GFP를 지표로 하여, 선택 마커를 포함하는 영역이 결실된 세포를 GFP를 발현하지 않는 것을 지표로서 선택했다. 결과, 도 10∼13의 「2nd step」에 있어서 나타나는 바와 같이, 게놈으로부터 GFP를 포함하는 선택 마커를 양 알렐에 있어서 제거할 수 있었다.
본 발명에 의하면, 2개 이상의 알렐을 효율 좋게 개변할 수 있고, 또한 비교적 큰 영역의 개변이 가능한, 게놈 개변 방법 및 상기 게놈 개변 키트가 제공된다.
SEQUENCE LISTING <110> Logomix, Inc. Tokyo Institute of Technology <120> Genome modification method and genome modification Kit <130> PL19-9001WO <150> JP 2020-068266 <151> 2020-04-06 <150> JP 2020-141335 <151> 2020-08-25 <160> 73 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1423 <212> PRT <213> Staphylococcus pyogenes <400> 1 Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp 1 5 10 15 Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Met Ala Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 20 25 30 Gly Ile His Gly Val Pro Ala Ala Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu 35 40 45 Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr 50 55 60 Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His 65 70 75 80 Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu 85 90 95 Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr 100 105 110 Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu 115 120 125 Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe 130 135 140 Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn 145 150 155 160 Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His 165 170 175 Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu 180 185 190 Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu 195 200 205 Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe 210 215 220 Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile 225 230 235 240 Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser 245 250 255 Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys 260 265 270 Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr 275 280 285 Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln 290 295 300 Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln 305 310 315 320 Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser 325 330 335 Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr 340 345 350 Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His 355 360 365 Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu 370 375 380 Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly 385 390 395 400 Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys 405 410 415 Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu 420 425 430 Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser 435 440 445 Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg 450 455 460 Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu 465 470 475 480 Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg 485 490 495 Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile 500 505 510 Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln 515 520 525 Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu 530 535 540 Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr 545 550 555 560 Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro 565 570 575 Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe 580 585 590 Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe 595 600 605 Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp 610 615 620 Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile 625 630 635 640 Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu 645 650 655 Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu 660 665 670 Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys 675 680 685 Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys 690 695 700 Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp 705 710 715 720 Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile 725 730 735 His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val 740 745 750 Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly 755 760 765 Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp 770 775 780 Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile 785 790 795 800 Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser 805 810 815 Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser 820 825 830 Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu 835 840 845 Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp 850 855 860 Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile 865 870 875 880 Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu 885 890 895 Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu 900 905 910 Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala 915 920 925 Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg 930 935 940 Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu 945 950 955 960 Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser 965 970 975 Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val 980 985 990 Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp 995 1000 1005 Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala 1010 1015 1020 His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys 1025 1030 1035 Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys 1040 1045 1050 Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile 1055 1060 1065 Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn 1070 1075 1080 Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys 1085 1090 1095 Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp 1100 1105 1110 Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met 1115 1120 1125 Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly 1130 1135 1140 Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu 1145 1150 1155 Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe 1160 1165 1170 Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val 1175 1180 1185 Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu 1190 1195 1200 Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile 1205 1210 1215 Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu 1220 1225 1230 Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly 1235 1240 1245 Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn 1250 1255 1260 Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala 1265 1270 1275 Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln 1280 1285 1290 Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile 1295 1300 1305 Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp 1310 1315 1320 Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp 1325 1330 1335 Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr 1340 1345 1350 Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr 1355 1360 1365 Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp 1370 1375 1380 Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg 1385 1390 1395 Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp Lys Arg Pro Ala Ala Thr 1400 1405 1410 Lys Lys Ala Gly Gln Ala Lys Lys Lys Lys 1415 1420 <210> 2 <211> 810 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ttccccagag gtatcttcca tggcttttcc agaccccaac tctggcccgt tcgcttcttc 60 ttcagaaagg ctcccgtttg cttcttctgc aggaaggctt gtattttcag aaagttcttg 120 ctcctcgatt cgaggactca actcactagg ggaaccaaac tctgtttcca ggggagtgga 180 gagagaaact gggtccccct cccgtagctc ctgggacaca gctgagccag ccacaggatc 240 tggggacaac cggggcggat cccccctttc gggaggcggt ggcatcagtt cagagtccgc 300 atttttattc atcggggaag cgtggggaga aggatgggct ggagctgggt cctggtctga 360 aggacagcag tccggagcta acggttgagt ctccaaagtc ttcatactgc agaggaagca 420 cagcggagat tagcctcagc caggatggct tcgaagttct cagggatccg acgcagagct 480 aaagaaaccc acctgtgctt ccctcctctt ctgggagtag gcagaagact cccgggagga 540 gaggcgaaca gcggacgcca attcttttga aagcactgtg ttccttagca ccgcgggtcg 600 ctacgggcct cttgctgtcg cgggatttcg gtccaccttc cgattgggcc gccgcatccc 660 ggatcagatt tcgcgggcga cccacggaac ccgcggagcc gggacgtgaa aggttagaag 720 gtttcccgtt cccatcaagc cctagggctc ctcgtggctg ctgggagttg tagtctgaac 780 gcttctatct tggcgagaag cgcctacgct 810 <210> 3 <211> 792 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ctgagtcagg aaacattttc agacctatgg aaactgtgag tggatccatt ggaagggcag 60 gcccaccacc ccgaccccaa ccccagcccc ctagcagaga cctgtgggaa gcgaaaattc 120 catgggactg actttctgct cttgtctttc agacttcctg aaaacaacgt tctggtaagg 180 acaagggttg ggctggggac ctggagggct ggggggctgg ggggctgagg acctggtcct 240 ctgactgctc ttttcaccca tctacagtcc cccttgccgt cccaagcaat ggatgatttg 300 atgctgtccc cggacgatat tgaacaatgg ttcactgaag acccaggtcc agatgaagct 360 cccagaatgc cagaggctgc tccccccgtg gcccctgcac cagcagctcc tacaccggcg 420 gcccctgcac cagccccctc ctggcccctg tcatcttctg tcccttccca gaaaacctac 480 cagggcagct acggtttccg tctgggcttc ttgcattctg ggacagccaa gtctgtgact 540 tgcacggtca gttgccctga ggggctggct tccatgagac ttcaatgcct ggccgtatcc 600 ccctgcattt cttttgtttg gaactttggg attcctcttc accctttggc ttcctgtcag 660 tgttttttta tagtttaccc acttaatgtg tgatctctga ctcctgtccc aaagttgaat 720 attcccccct tgaatttggg cttttatcca tcccatcaca ccctcagcat ctctcctggg 780 gatgcagaac tt 792 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> taget sequence for gRNA <400> 4 ctcagagggg gctcgacgct agg 23 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 5 tgccccgttg ttatccttac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 6 gctcgtagaa ggggaggttg 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 7 gtcaccgagc tgcaagaac 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 8 gaagacggca gcaaagaaac 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 9 tgccccgttg ttatccttac 20 <210> 10 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 10 gcttcaatat gtactgccga aa 22 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 11 gaagccattg cgattggtag 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 12 gaagacggca gcaaagaaac 20 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> taget sequence for gRNA <400> 13 ggcgcaacgc gatcgcgtaa ggg 23 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 14 tgccccgttg ttatccttac 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer sequence <400> 15 gaagacggca gcaaagaaac 20 <210> 16 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for upstream region of human TP53 <400> 16 cucagagggg gcucgacgcu 20 <210> 17 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for downstream of human TP53 <400> 17 ggugcuuuaa gaauuaccgc 20 <210> 18 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for upstream region of MLH1 <400> 18 gcgccugacg ucgcguucgc 20 <210> 19 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for downstream region of MLH1 <400> 19 ggaggccuug gcacggguuc 20 <210> 20 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for upstream region of human CD44 <400> 20 cgaggauggc ggaccgaacc 20 <210> 21 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for downstream region of human CD44 <400> 21 gccaagugga cucaacggag 20 <210> 22 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for upstream region of human MET <400> 22 gggccgcgcg cgccgaugcc 20 <210> 23 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for downstream region of MET <400> 23 guucccaccu cgcaagcaau 20 <210> 24 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for upsteam region of APP <400> 24 cucccggggg ugucguauaa 20 <210> 25 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gRNA for downstream region of APP <400> 25 uucuauaaau ggacaccgau 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MLH1 5' junction PCR <400> 26 ccaagaacgc ttccatttct 20 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MLH1 5' junction PCR <400> 27 ccctgtgcct ggtctgtc 18 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MLH1 3' junction PCR <400> 28 ttctgaggtc tccagcaagt 20 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MLH1 3' junction PCR <400> 29 aagttgaaga tgaattgaaa gcag 24 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Puromycin 5' junction PCR <400> 30 ccaagaacgc ttccatttct 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Puromycin 5' junction PCR <400> 31 gctcgtagaa ggggaggttg 20 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Puromycin 3' junction PCR <400> 32 gtcaccgagc tgcaagaac 19 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Puromycin 3' junction PCR <400> 33 aagttgaaga tgaattgaaa gcag 24 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Blasticidin 5' junction PCR <400> 34 ccaagaacgc ttccatttct 20 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Blasticidin 5' junction PCR <400> 35 gcttcaatat gtactgccga aa 22 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Blasticidin 3' junction PCR <400> 36 gaagccattg cgattggtag 20 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Blasticidin 3' junction PCR <400> 37 aagttgaaga tgaattgaaa gcag 24 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CD44 5' junction PCR <400> 38 agtggatgga caggaggatg 20 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CD44 5' junction PCR <400> 39 gcgaaaggag ctggagga 18 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CD443' junction PCR <400> 40 atggagctgt ggaggacaga 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CD443' junction PCR <400> 41 gagtgggtct gagtgggaac 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Puromycin 5' junction PCR-2 <400> 42 agtggatgga caggaggatg 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Puromycin 5' junction PCR-2 <400> 43 gctcgtagaa ggggaggttg 20 <210> 44 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Puromycin 3' junction PCR-2 <400> 44 gtcaccgagc tgcaagaac 19 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Puromycin 3' junction PCR-2 <400> 45 gagtgggtct gagtgggaac 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Blasticidin 5' junction PCR-2 <400> 46 agtggatgga caggaggatg 20 <210> 47 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Blasticidin 5' junction PCR-2 <400> 47 gcttcaatat gtactgccga aa 22 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Blasticidin 3' junction PCR-2 <400> 48 gaagccattg cgattggtag 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Blasticidin 3' junction PCR-2 <400> 49 gagtgggtct gagtgggaac 20 <210> 50 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MET 5' junction PCR <400> 50 tgaaatcact cttatgtaac ctctgg 26 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MET 5' junction PCR <400> 51 aaggggctgc aattttacct 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for MET 3' junction PCR <400> 52 gggtggatgg attgaaaaga 20 <210> 53 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for MET 3' junction PCR <400> 53 tgcaggtata ggcagtgaca ag 22 <210> 54 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Puromycin 5' junction PCR-3 <400> 54 tgaaatcact cttatgtaac ctctgg 26 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Puromycin 5' junction PCR-3 <400> 55 gctcgtagaa ggggaggttg 20 <210> 56 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Puromycin 3' junction PCR-3 <400> 56 gtcaccgagc tgcaagaac 19 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Puromycin 3' junction PCR-3 <400> 57 tgcaggtata ggcagtgaca ag 22 <210> 58 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Blasticidin 5' junction PCR-3 <400> 58 tgaaatcact cttatgtaac ctctgg 26 <210> 59 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Blasticidin 5' junction PCR-3 <400> 59 gcttcaatat gtactgccga aa 22 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Blasticidin 3' junction PCR-3 <400> 60 gaagccattg cgattggtag 20 <210> 61 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Blasticidin 3' junction PCR-3 <400> 61 tgcaggtata ggcagtgaca ag 22 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for APP 5' junction PCR <400> 62 ggggagctgg tacagaaatg 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for APP 5' junction PCR <400> 63 caggatcagg gaaaggtgag 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for APP 3' junction PCR <400> 64 gaacggctac gaaaatccaa 20 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for APP 3' junction PCR <400> 65 ctcttctccc cacccaaaa 19 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Puromycin 5' junction PCR-4 <400> 66 ggggagctgg tacagaaatg 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Puromycin 5' junction PCR-4 <400> 67 gctcgtagaa ggggaggttg 20 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Puromycin 3' junction PCR-4 <400> 68 gtcaccgagc tgcaagaac 19 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Puromycin 3' junction PCR-4 <400> 69 ctcttctccc cacccaaaa 19 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Blasticidin 5' junction PCR-4 <400> 70 ggggagctgg tacagaaatg 20 <210> 71 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Blasticidin 5' junction PCR-4 <400> 71 gcttcaatat gtactgccga aa 22 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Blasticidin 3' junction PCR-4 <400> 72 gaagccattg cgattggtag 20 <210> 73 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Blasticidin 3' junction PCR-4 <400> 73 ctcttctccc cacccaaaa 19

Claims (31)

  1. 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐(allele)이 개변된 세포를 제작하는 방법으로서,
    (a) 하기 (i) 및 (ii)를, 2개 이상의 알렐을 포함하는 세포에 도입하여, 상기 2개 이상의 알렐 각각에 선택 마커 유전자를 도입하는 공정과,
    (i) 상기 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐 중의 표적 영역을 표적으로 하여, 당해 표적 영역을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
    (ii) 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA로서, 각각이 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖고, 또한, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에, 선택 마커 유전자의 염기 서열을 포함하고, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA는, 서로 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자를 각각 갖고, 상기 선택 마커 유전자는, 선택 마커용 도너 DNA의 종류마다 고유하고, 상기 선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 게놈 개변의 대상으로 하는 상기 알렐의 수와 동수 이상인, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA,
    (b) 상기 공정(a) 후, 상기 2 이상의 알렐에 대해서 상이한 종류의 선택 마커용 도너 DNA가 각각 상동 재조합되는 것에 의해, 당해 2 이상의 알렐에 각각 구별 가능하게 상이한 고유의 선택 마커 유전자가 도입되고, 도입된 당해 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자의 모두를 발현하는 세포를 선택하는 공정(포지티브 선택을 위한 공정)
    을 포함하는, 방법.
  2. 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐을 개변하는 방법으로서,
    (a) 하기 (i) 및 (ii)를, 2개 이상의 알렐을 포함하는 세포에 도입하여, 상기 2개 이상의 알렐 각각에 선택 마커 유전자를 도입하는 공정과,
    (i) 상기 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐 중의 표적 영역을 표적으로 하여, 당해 표적 영역을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
    (ii) 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA로서, 각각이 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖고, 또한, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에, 선택 마커 유전자의 염기 서열을 포함하고, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA는, 서로 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자를 각각 갖고, 상기 선택 마커 유전자는, 선택 마커용 도너 DNA의 종류마다 고유하고, 상기 선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 게놈 개변의 대상으로 하는 상기 알렐의 수와 동수 이상인, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA,
    (b) 상기 공정(a) 후, 상기 2 이상의 알렐에 대해서 상이한 종류의 선택 마커용 도너 DNA가 각각 상동 재조합되는 것에 의해, 당해 2 이상의 알렐에 각각 구별 가능하게 상이한 고유의 선택 마커 유전자가 도입되고, 도입된 당해 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자의 모두를 발현하는 세포를 선택하는 공정(포지티브 선택을 위한 공정)
    을 포함하는, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    표적 영역이 5kbp 이상의 길이를 갖는, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    표적 영역이 8kbp 이상의 길이를 갖는, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA가 각각, 상기 상류 호몰로지 암과 상기 하류 호몰로지 암 사이에, 포지티브 선택용의 선택 마커 유전자와 네거티브 선택용의 마커 유전자와 표적 서열을 갖고, 여기에서, 당해 선택 마커 유전자가 포지티브 선택용으로도 네거티브 선택용으로도 이용되는 경우에는, 별도의 네거티브 선택용의 선택 마커 유전자를 갖고 있지 않아도 되고,
    (c) 상기 공정(b) 후, 하기 (iii) 및 (iv)를 선택된 세포에 도입하여 상기 2 이상의 알렐에 재조합용 도너 DNA를 도입하는 공정과,
    (iii) 상기 표적 서열을 표적으로 하여, 당해 표적 서열을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
    (iv) 소망의 염기 서열을 포함하는 재조합용 도너 DNA로서, 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖는, 재조합용 도너 DNA,
    (d) 상기 공정(c) 후, 상기 네거티브 선택용의 마커 유전자를 발현하지 않는 세포를 선택하는 공정(네거티브 선택을 위한 공정)
    을 추가로 포함하는, 방법.
  6. 제 3 항에 있어서,
    2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA가 각각, 상기 상류 호몰로지 암과 상기 하류 호몰로지 암 사이에, 포지티브 선택용의 선택 마커 유전자와 네거티브 선택용의 마커 유전자와 표적 서열을 갖고, 여기에서, 당해 선택 마커 유전자가 포지티브 선택용으로도 네거티브 선택용으로도 이용되는 경우에는, 별도의 네거티브 선택용의 선택 마커 유전자를 갖고 있지 않아도 되고,
    (c) 상기 공정(b) 후, 하기 (iii) 및 (iv)를 선택된 세포에 도입하여 상기 2 이상의 알렐에 재조합용 도너 DNA를 도입하는 공정과,
    (iii) 상기 표적 서열을 표적으로 하여, 당해 표적 서열을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
    (iv) 소망의 염기 서열을 포함하는 재조합용 도너 DNA로서, 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖는, 재조합용 도너 DNA,
    (d) 상기 공정(c) 후, 상기 네거티브 선택용의 마커 유전자를 발현하지 않는 세포를 선택하는 공정(네거티브 선택을 위한 공정)
    을 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제 4 항에 있어서,
    2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA가 각각, 상기 상류 호몰로지 암과 상기 하류 호몰로지 암 사이에, 포지티브 선택용의 선택 마커 유전자와 네거티브 선택용의 마커 유전자와 표적 서열을 갖고, 여기에서, 당해 선택 마커 유전자가 포지티브 선택용으로도 네거티브 선택용으로도 이용되는 경우에는, 별도의 네거티브 선택용의 선택 마커 유전자를 갖고 있지 않아도 되고,
    (c) 상기 공정(b) 후, 하기 (iii) 및 (iv)를 선택된 세포에 도입하여 상기 2 이상의 알렐에 재조합용 도너 DNA를 도입하는 공정과,
    (iii) 상기 표적 서열을 표적으로 하여, 당해 표적 서열을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
    (iv) 소망의 염기 서열을 포함하는 재조합용 도너 DNA로서, 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖는, 재조합용 도너 DNA,
    (d) 상기 공정(c) 후, 상기 네거티브 선택용의 마커 유전자를 발현하지 않는 세포를 선택하는 공정(네거티브 선택을 위한 공정)
    을 추가로 포함하는, 방법.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 5kbp 이상의 길이를 갖는, 방법.
  9. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 5kbp 이상의 길이를 갖는, 방법.
  10. 제 7 항에 있어서,
    재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 5kbp 이상의 길이를 갖는, 방법.
  11. 제 8 항에 있어서,
    재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 8kbp 이상의 길이를 갖는, 방법.
  12. 하기 (i) 및 (ii)를 포함하는, 염색체 게놈의 2개 이상의 알렐을 개변하는 게놈 개변 키트.
    (i) 상기 염색체 게놈의 표적 영역을 표적으로 하여, 표적 영역을 절단할 수 있는 서열 특이적 핵산 절단 분자, 또는 상기 서열 특이적 핵산 절단 분자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 게놈 개변 시스템,
    (ii) 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA로서, 상기 표적 영역의 상류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 상류 호몰로지 암과, 상기 표적 영역의 하류측의 염기 서열과 상동 재조합 가능한 염기 서열을 갖는 하류 호몰로지 암을 갖고, 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이에, 선택 마커 유전자의 염기 서열을 포함하고, 상기 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA는, 서로 구별 가능하게 상이한 선택 마커 유전자를 갖고, 상기 선택 마커 유전자는, 선택 마커용 도너 DNA의 종류마다 고유하고, 상기 선택 마커용 도너 DNA의 종류수는, 게놈 개변의 대상으로 하는 상기 알렐의 수와 동수 이상인, 2종 이상의 선택 마커용 도너 DNA.
  13. 제 12 항에 있어서,
    표적 영역이 5kbp 이상의 길이를 갖는, 키트.
  14. 제 13 항에 있어서,
    표적 영역이 8kbp 이상의 길이를 갖는, 키트.
  15. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합용 도너 DNA를 추가로 포함하는, 키트.
  16. 제 12 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 5kbp 이상의 길이를 갖는, 키트.
  17. 제 12 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 8kbp 이상의 길이를 갖는, 키트.
  18. 제 12 항에 있어서,
    표적 영역이 5kbp 이상의 길이를 갖고, 또한, 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 5kbp 이상의 길이를 갖는, 키트.
  19. 제 18 항에 있어서,
    표적 영역이 8kbp 이상의 길이를 갖고, 또한, 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 8kbp 이상의 길이를 갖는, 키트.
  20. 제 5 항에 있어서,
    재조합용 도너 DNA가, 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역에 염기 서열을 갖지 않고, 개변 후에 얻어지는 염색체 게놈의 상기 2개 이상의 알렐에 있어서, 표적 영역의 상류 및 하류의 서열이, 염기의 삽입, 치환 및 결실 없이, 심리스(seamless)로 연결되어 있는, 방법.
  21. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    재조합용 도너 DNA가, 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역에 염기 서열을 갖지 않고, 개변 후에 얻어지는 염색체 게놈의 상기 2개 이상의 알렐에 있어서, 표적 영역의 상류 및 하류의 서열이, 염기의 삽입, 치환 및 결실 없이, 심리스로 연결되어 있는, 방법.
  22. 제 3 항에 있어서,
    개변 후에 얻어지는 염색체 게놈의 상기 2개 이상의 알렐에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 표적 서열이 존재하지 않는, 방법.
  23. 제 4 항에 있어서,
    개변 후에 얻어지는 염색체 게놈의 상기 2개 이상의 알렐에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 표적 서열이 존재하지 않는, 방법.
  24. 제 5 항에 있어서,
    개변 후에 얻어지는 염색체 게놈의 상기 2개 이상의 알렐에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 표적 서열이 존재하지 않는, 방법.
  25. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    개변 후에 얻어지는 염색체 게놈의 상기 2개 이상의 알렐에 있어서, 부위 특이적 재조합 효소의 표적 서열이 존재하지 않는, 방법.
  26. 제 1 항 내지 제 11 항 및 제 20 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정(b)에 있어서, 2 이상의 알렐이 개변된 세포를 선택할 때까지의 과정에서는 단일 세포 클로닝은 행해지지 않는, 방법.
  27. 표적 영역에 관해서 염색체 게놈 상에 2개 이상의 알렐을 갖는 세포에 있어서, 상기 2개 이상의 알렐의 각각의 표적 영역이 결실되고, 또한, 표적 영역의 상류 및 하류의 서열이, 염기의 삽입, 치환 및 결실 없이, 심리스로 연결되어 있는, 세포.
  28. 제 27 항에 있어서,
    표적 영역이 5kbp 이상의 길이를 갖는, 세포.
  29. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서,
    그 게놈 중에 부위 특이적 재조합 효소의 표적 서열을 갖지 않는, 세포.
  30. 제 6 항 또는 제 7 항에 있어서,
    재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역이, 8kbp 이상의 길이를 갖는, 방법.
  31. 제 15 항에 있어서,
    재조합용 도너 DNA가, 재조합용 도너 DNA의 상류 호몰로지 암과 하류 호몰로지 암 사이의 영역에 염기 서열을 갖지 않는, 키트.
KR1020227038024A 2020-04-06 2021-04-05 게놈 개변 방법 및 게놈 개변 키트 KR20220164748A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2020068266 2020-04-06
JPJP-P-2020-068266 2020-04-06
JP2020141335 2020-08-25
JPJP-P-2020-141335 2020-08-25
PCT/JP2021/014495 WO2021206054A1 (ja) 2020-04-06 2021-04-05 ゲノム改変方法及びゲノム改変キット

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220164748A true KR20220164748A (ko) 2022-12-13

Family

ID=78022517

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227038024A KR20220164748A (ko) 2020-04-06 2021-04-05 게놈 개변 방법 및 게놈 개변 키트

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20230147287A1 (ko)
EP (1) EP4134431A4 (ko)
JP (1) JPWO2021206054A1 (ko)
KR (1) KR20220164748A (ko)
CN (1) CN115552002A (ko)
AU (1) AU2021254373A1 (ko)
CA (1) CA3179410A1 (ko)
IL (1) IL297078A (ko)
TW (1) TW202204611A (ko)
WO (1) WO2021206054A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7212982B1 (ja) * 2022-10-05 2023-01-26 株式会社Logomix 細胞ライブラリおよびその製造方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014093661A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3679785A3 (en) * 2013-04-05 2020-09-16 Dow AgroSciences LLC Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants
US10787684B2 (en) * 2013-11-19 2020-09-29 President And Fellows Of Harvard College Large gene excision and insertion
RU2685914C1 (ru) * 2013-12-11 2019-04-23 Регенерон Фармасьютикалс, Инк. Способы и композиции для направленной модификации генома
WO2017191503A1 (en) * 2016-05-05 2017-11-09 Crispr Therapeutics Ag Materials and methods for treatment of hemoglobinopathies
WO2019018534A1 (en) * 2017-07-18 2019-01-24 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University GENOME EDITION WITHOUT SCARCE THROUGH TWO-STEP APPROVED REPAIR BY HOMOLOGY
CN112218945A (zh) * 2018-05-08 2021-01-12 国立大学法人大阪大学 纯合细胞的制作方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014093661A2 (en) 2012-12-12 2014-06-19 The Broad Institute, Inc. Crispr-cas systems and methods for altering expression of gene products

Also Published As

Publication number Publication date
CN115552002A (zh) 2022-12-30
US20230147287A1 (en) 2023-05-11
AU2021254373A1 (en) 2022-11-03
TW202204611A (zh) 2022-02-01
WO2021206054A1 (ja) 2021-10-14
IL297078A (en) 2022-12-01
EP4134431A1 (en) 2023-02-15
JPWO2021206054A1 (ko) 2021-10-14
CA3179410A1 (en) 2021-10-14
EP4134431A4 (en) 2024-06-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6737974B1 (ja) ヌクレアーゼ媒介ｄｎａアセンブリ
KR102127418B1 (ko) 부위-특이적인 뉴클레오티드 치환을 통해 글리포세이트-내성 벼를 수득하는 방법
KR102098915B1 (ko) 키메라 게놈 조작 분자 및 방법
EP3152312B1 (en) Methods and compositions for modifying a targeted locus
US11071289B2 (en) DNA knock-in system
CN107002093B (zh) 用于靶向遗传修饰的方法和组合物，以及这些组合物的使用方法
JP6916188B2 (ja) プロトプラストからの全植物体の製造方法
AU732130B2 (en) System for in vitro transposition using modified Tn5 transposase
CN113444747A (zh) 使用成对向导rna进行靶向遗传修饰的方法和组合物
CN111373041A (zh) 用于基因组编辑和调节转录的crispr/cas系统和方法
KR20220100090A (ko) 대형 유전자 절제 및 삽입
KR20150105635A (ko) 서열 조작을 위한 crispr-cas 성분 시스템, 방법 및 조성물
KR20220164748A (ko) 게놈 개변 방법 및 게놈 개변 키트
JP6867635B1 (ja) ゲノム改変方法及びゲノム改変キット
CN111961686A (zh) 利用CRISPR/Cas9和PiggyBac实现双等位精确基因组编辑的系统
JP7212982B1 (ja) 細胞ライブラリおよびその製造方法
WO2024075756A1 (ja) 細胞ライブラリおよびその製造方法
CA3133359A1 (en) Methods for scarless introduction of targeted modifications into targeting vectors
Graham et al. Engineered minichromosomes in plants: structure, function, and applications
AU2021405456A9 (en) Method for causing large-scale deletions in genomic dna and method for analyzing genomic dna
WO2024076688A2 (en) Synthetic genomic safe harbors and methods thereof
Lopes Easy embryonicStem cell: a new tool to manipulate gene expression in embryoid bodies