JP2022009293A - ヌクレオチド標的認識を利用した標的配列特異的改変技術 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、細胞中に、(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas5d、Cas6d、およびCas7d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および(ii)前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA、または該ガイドRNAをコードするDNAを導入することを含む方法等が提供される。
【選択図】なし
Description
[1]標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、細胞中に、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas5d、Cas6d、およびCas7d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA、または該ガイドRNAをコードするDNA
を導入することを含む方法、
[2]標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、細胞中に、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas3d、Cas5d、Cas6d、Cas7d、およびCas10d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA、または該ガイドRNAをコードするDNA
を導入することを含む方法、
[3]標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、細胞中に、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas5d、Cas6d、およびCas7d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
(ii)前記標的遺伝子の配列の少なくとも一部に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA、または該ガイドRNAをコードするDNA
を導入することを含む方法、
[4]前記ガイドRNAが、前記標的ヌクレオチド配列に相補的な20~50塩基からなる配列を含む、[1]~[3]のいずれか1項記載の方法、
[5]前記細胞中にドナーポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、[2]または[4]記載の方法、
[6]改変が塩基の欠失、挿入、または置換である、[2]、[4]および[5]のいずれか1項記載の方法、
[7]前記Cas5dがプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列として5’-GTH-3’(H=A、C、またはT)を認識する、[1]~[6]のいずれか1項記載の方法、
[8](i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas5d、Cas6d、およびCas7d、および
(ii)標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA
を含む複合体、
[9]Cas3dおよびCas10dをさらに含む、[8]記載の複合体、
[10]前記ガイドRNAが、前記標的ヌクレオチド配列に相補的な20~50塩基からなる配列を含む、[8]または[9]記載の複合体、
[11](i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas5d、Cas6d、およびCas7dをコードする核酸、および
(ii)標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNAをコードするDNA
を含む発現ベクター、
[12]Cas3dおよびCas10dをコードする核酸をさらに含む、[11]記載の発現ベクター、および
[13][8]~[10]のいずれか1項記載の複合体をコードするDNA分子、ならびに
[14]標的ヌクレオチド配列を標的化するための、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas5d、Cas6d、およびCas7d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA、または該ガイドRNAをコードするDNA
の使用、
[15]標的ヌクレオチド配列を改変するための、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas3d、Cas5d、Cas6d、Cas7d、およびCas10d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA、または該ガイドRNAをコードするDNA
の使用、
[16]標的遺伝子の発現を抑制するための、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas5d、Cas6d、およびCas7d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
(ii)前記標的遺伝子の配列の少なくとも一部に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA、または該ガイドRNAをコードするDNA
の使用、
[17]前記ガイドRNAが、前記標的ヌクレオチド配列に相補的な20~50塩基からなる配列を含む、[14]~[16]のいずれか1項記載の使用、
[18]改変が塩基の欠失、挿入、または置換である、[15]または[17]記載の使用、
[19]前記Cas5dがプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列として5’-GTH-3’(H=A、C、またはT)を認識する、[14]~[18]のいずれか1項記載の使用、
[20]標的ヌクレオチド配列を標的化するための、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas5d、Cas6d、およびCas7d、および
(ii)標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA
を含む複合体の使用、
[21]標的ヌクレオチド配列を改変するための、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas3d、Cas5d、Cas6d、Cas7d、およびCas10dおよび
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA
を含む複合体の使用、
[22]標的遺伝子の発現を抑制するための、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas5d、Cas6d、およびCas7d、および
(ii)前記標的遺伝子の配列の少なくとも一部に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA
を含む複合体の使用、および
[23]前記ガイドRNAが、前記標的ヌクレオチド配列に相補的な20~50塩基からなる配列を含む、[20]~[22]のいずれか1項記載の複合体の使用
を提供する。
1)標的ヌクレオチド配列の標的化(以下、「ターゲティング」ともいう)に必要な、該標的ヌクレオチド配列に相補的な配列と、CRISPRタイプI-D遺伝子座に存在する共通繰り返し配列とを含むgRNA、
2)標的ヌクレオチド配列の近傍に存在するPAM配列を認識するCas5d、
3)上記1)のgRNAに結合し、標的ヌクレオチド配列のターゲティングに必要なCas7d、および
4)上記1)のgRNAのプロセシングを行うCas6d
を含む複合体、および
5)上記1)から4)を含む複合体に相互作用し、標的ヌクレオチド配列のリモデリングを行うCas10dと、ポリヌクレオチドの分解を行うCas3dを含む複合体
が細胞に提供され、該細胞において、
6)上記1)から4)を含む複合体による標的ヌクレオチド配列へのターゲティング、すなわち、
7)上記4)のCas6dにより上記1)のgRNAがプロセシングされて得られる成熟型gRNAと、上記2)および3)とからなる複合体による、標的ヌクレオチド配列へのターゲティングが行われ、
8)上記5)の複合体により、標的ヌクレオチド配列上のポリヌクレオチドが切断される。
本発明において、細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれの細胞であってもよく、特に限定されない。例えば、細菌、古細菌、酵母、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞(例えば、ヒト細胞、非ヒト細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞等)が挙げられる。
本発明において、「RNA誘導性エンドヌクレアーゼ」とは、少なくとも1つのヌクレアーゼドメイン、およびgRNAと結合する少なくとも1つのドメインを含み、gRNAによって標的ヌクレオチド配列(または標的ヌクレオチド部位)に誘導されるエンドヌクレアーゼをいう。本発明で使用されるRNA誘導性エンドヌクレアーゼは、CRISPRタイプI-D由来のRNA誘導性エンドヌクレアーゼであり、CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas3d、Cas5d、Cas6d、Cas7d、およびCas10dを含む。本発明において、Cas5d、Cas6d、およびCas7dは、標的認識に寄与する「標的認識モジュール」を構成し、Cas3dおよびCas10dは、ポリヌクレオチドの切断に寄与する「ポリヌクレオチド切断モジュール」を構成することが見出された。すなわち、本発明で使用されるRNA誘導性エンドヌクレアーゼは、Cas5d、Cas6d、およびCas7dを含む標的認識モジュールと、Cas3dおよびCas10dを含むポリヌクレオチド切断モジュールとを含む。
本発明において、ガイドRNA(gRNA)は、上記標的認識モジュール(Cas5d、Cas6d、およびCas7d)と複合体を形成して、これらのCasタンパク質と共に標的ヌクレオチド配列をターゲティングする分子である。本発明において、gRNAは、標的認識モジュールのCas7dに結合する。本発明において、gRNAは、Cas5d、Cas6d、およびCas7dを含む複合体に結合して、該複合体を標的ヌクレオチド配列に誘導する。例えば、gRNAは、上記RNA誘導性エンドヌクレアーゼの標的認識モジュールに結合し、該RNA誘導性エンドヌクレアーゼを標的ヌクレオチド配列に誘導する。また、上記標的認識モジュールが上記RNA誘導性エンドヌクレアーゼ以外の融合タンパク質の一部として存在する場合、gRNAは、該標的認識モジュールに結合し、当該融合タンパク質を標的ヌクレオチド配列に誘導する。
本発明において、標的ヌクレオチド配列(本明細書において、単に「標的配列」ともいう)は、任意の核酸の配列であり、プロトスペーサー近接モチーフ(PAM)の近傍に位置する配列を標的配列として選択することを除き、特に限定されない。標的ヌクレオチド配列は、二本鎖DNA配列、一本鎖DNA配列、またはRNA配列のいずれであってもよい。DNAとしては、例えば、真核生物核ゲノムDNA、ミトコンドリアDNA、プラスチドDNA、原核生物ゲノムDNA,ファージDNA,あるいはプラスミドDNA等が挙げられる。本発明において、標的ヌクレオチド配列は、好ましくは、ゲノム上の二本鎖DNAである。なお、本明細書において、「近傍に位置する」とは、隣接すること、および近くにあることの両方を包含する。また、本明細書において、「近傍」とは、隣接する位置または近くの位置の両方を包含する。
本発明の標的配列ターゲティング方法は、上記標的認識モジュール(Cas5d、Cas6d、およびCas7d)と上記gRNAとを上記細胞中に導入することを特徴とする。すなわち、本発明の標的配列ターゲティング方法は、(i)Cas5d、Cas6d、およびCas7d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および(ii)上記gRNA、または該gRNAをコードするDNAを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的配列ターゲティング方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。
本発明の標的配列改変方法は、上記RNA誘導性エンドヌクレアーゼと上記gRNAとを上記細胞中に導入することを特徴とする。すなわち、本発明の標的配列改変方法は、細胞中に、(i)Cas3d、Cas5d、Cas6d、Cas7d、およびCas10d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および(ii)上記gRNAまたは該gRNAをコードするDNAを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的配列改変方法は、本発明の標的配列ターゲティング方法により標的化したヌクレオチド配列を、上記ポリヌクレオチド切断モジュールにより切断することを含む。本発明の標的配列改変方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。本発明において、改変には、少なくとも1つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。
本発明の標的遺伝子発現抑制方法は、上記標的認識モジュール(Cas5d、Cas6d、およびCas7d)と上記gRNAとを上記細胞中に導入することを特徴とする。すなわち、本発明の標的配列ターゲティング方法は、(i)Cas5d、Cas6d、およびCas7d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および(ii)上記gRNA、または該gRNAをコードするDNAを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的遺伝子発現抑制方法では、標的ヌクレオチド配列として、標的遺伝子の配列の少なくとも一部の配列が選択され、該配列に相補的な配列を含むgRNAを使用する。本発明の標的遺伝子発現抑制方法は、本発明の標的配列ターゲティング方法によりヌクレオチド配列を標的化する際に、標的認識モジュールとgRNAとの複合体が標的配列に結合することにより、該標的配列を含む遺伝子の発現が抑制されることを含む。本発明の標的遺伝子発現抑制方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。本発明の標的遺伝子発現抑制方法によれば、標的遺伝子配列は切断されないが、上記標的認識モジュールとgRNAとの複合体が標的ヌクレオチド配列に結合することにより、該標的配列を含む遺伝子領域の機能または該遺伝子の発現が阻害される。
本発明の複合体は、上記CRISPRタイプI-D Casタンパク質および上記gRNAを含む。本発明は、特に、上記標的認識モジュールと上記gRNAを含む複合体、および上記RNA誘導性エンドヌクレアーゼとgRNAを含む複合体を提供する。さらに具体的には、Cas5d、Cas6d、およびCas7dとgRNAを含む複合体、ならびにCas5d、Cas6d、Cas7d、Cas3dおよびCas10dとgRNAを含む複合体を提供する。さらに、上記複合体をコードするDNA分子も提供される。本発明の複合体は、上記した本発明の標的配列改変方法、標的遺伝子発現抑制方法、および標的配列ターゲティング方法に使用することができる。RNA誘導性エンドヌクレアーゼ(Cas5d、Cas6d、Cas7d、Cas3dおよびCas10dを含む複合体)とgRNAとを含む複合体を細胞に導入して、該細胞内で該複合体を機能させることにより、該細胞のゲノム上の標的配列を改変することができる。また、標的認識モジュール(Cas5d、Cas6d、およびCas7dを含む複合体)とgRNAとを含む複合体を細胞に導入して、該細胞内で該複合体を機能させることにより、該細胞中の標的配列を標的化することができ、また、該標的配列領域がコードする遺伝子の発現を抑制することができる。上記標的認識モジュールとgRNAとを含む複合体は、さらにCas10dを含んでいてもよい。
本発明はさらに、Cas3d、Cas5d、Cas6d、Cas7d、およびCas10dを含むRNA誘導性エンドヌクレアーゼをコードする核酸、および標的配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNAをコードするDNAを含む発現ベクター、ならびにCRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas5d、Cas6d、およびCas7dをコードする核酸、および標的配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNAをコードするDNAを含む発現ベクターを提供する。
本発明は、さらに、上記標的認識モジュールおよび機能性ポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。該融合タンパク質および上記gRNAを細胞中に導入すると、標的認識モジュールおよびgRNAの作用により融合タンパク質が細胞中の標的ヌクレオチド配列または標的遺伝子に誘導され、上記機能性ポリペプチドの作用により該標的ヌクレオチド配列または標的遺伝子が改変または修飾される。したがって、本発明はさらに、上記融合タンパク質および上記gRNAを細胞中に導入することを特徴とする、標的ヌクレオチド配列または標的遺伝子の改変または修飾方法を提供する。さらに、本発明では、上記融合タンパク質と上記gRNAを含む複合体も提供される。
本実施例では、代表的な細菌のモデル生物である大腸菌において本発明の技術が有効に機能することを実証した。
Microcystis aeruginosa(以下、「M. aeruginosa」ともいう)のCRISPRタイプI-D遺伝子座(以下、「TiD遺伝子座」ともいう)由来の遺伝子群をクローン化した。TiD遺伝子座からM. aeruginosa由来のCas5d、Cas6d、Cas7d、Cas3d、およびCas10dのアミノ酸配列情報を基に、各Casタンパク質をコードする大腸菌コドン型の配列(配列番号7~11)を人工化学合成した。各遺伝子の上流にJ23108合成プロモーター(配列番号12)、あるいは合成リボゾーム結合配列(配列番号13)を、各遺伝子の下流にターミネーター配列(配列番号14~17)を付与したDNA断片をプラスミドベクターpACYC184(Nippon gene社製)に連結し、pEcTiD1を構築した。さらにM. aeruginosa由来のCRISPRタイプI-D遺伝子座の近傍に存在するCRISPRリピート配列(crRNA、配列番号18)を抽出し、T7プロモーター(配列番号19)の制御下にcrRNA発現カセット(配列番号20)を合成した。crRNA発現カセットには本実施例の標的配列となる大腸菌ccdB遺伝子のプロモーター領域配列を含んでいる。crRNA発現カセット配列をpEcTiD1に組込み、pEcTiD2(図2a)を構築した。また、DNA二重鎖切断を伴わないゲノム編集を行うTiD発現プラスミドベクターとして、Cas5d、Cas6dおよびCas7d遺伝子発現カセットを含むpEcTiD3の構築を行った(図2b)。本実施例で使用したプロモーター、ターミネーター、CRISPRリピート配列、およびcrRNA発現カセット配列を表2に示す。
本実施例においては、標的DNAとして大腸菌ccdB遺伝子の上流にT7プロモーター配列を連結した合成ccdB遺伝子カセット(配列番号21)(表3)を利用し、ccdB遺伝子上流のT7プロモーター領域を含む35塩基をTiDの標的配列とした。合成ccdB遺伝子カセットをプラスミドベクターpMW219(Nippon gene社製)のマルチクローニングサイトに連結し、pMW_ccdB1を構築した(図3a)。
pMW_ccdB-PAMライブラリープラスミド上のT7プロモーター領域と相補的な35塩基配列を組込んだpEcTiD3-T7を用いて、TiDにおけるPAM配列決定を行った。pEcTiD3-T7を大腸菌BL21AI株(Thermo Fisher Scientific社製)に導入し、ccdB遺伝子ゲノム編集用大腸菌ホスト株とした。BL21AI[pEcTiD3-T7]株は、標的配列認識に必要なCas5d、Cas6dおよびCas7dタンパク質を産生する。Cas5d/Cas6d/Cas7d-crRNA複合体は、適切なPAM配列に隣接する標的配列を認識し、標的配列の切断は行わないが、標的配列に結合することにより標的配列としたT7プロモーターの機能を阻害する。
pEcTiD3-T7とpMW_ccdB-PAMライブラリープラスミドを用いて決定した3種のPAM配列を含むpMW_ccdB-PAMgta、pMW_ccdB-PAMgtcおよびpMW_ccdB-PAMgttを構築し、それぞれpEcTiD2-T7とともにBL21AI株に導入した。pMW_ccdB-PAMgta/pEcTiD2-T7、pMW_ccdB-PAMgtc/pEcTiD2-T7およびpMW_ccdB-PAMgtt/pEcTiD2-T7を保持するBL21AI株を25mg/Lクロラムフェニコール、25mg/Lカナマイシンおよび1%グルコースを含むLB寒天培地上で選抜し、それぞれの菌株に導入したプラスミドが含まれることをシーケンス解析により確認した。次いで、正しいプラスミドを保持するBL21AI株を25mg/Lクロラムフェニコール、25mg/Lカナマイシンおよび1%アラビノースを含むLB寒天培地に塗布し、37℃で一晩培養したところ、すべての菌株において生育が認められず、Cas3およびCas10dの存在下によるプラスミドDNAの二重鎖切断によるものと考えられた。
本実施例では、高等真核生物のゲノム編集の実施例の一形態として、Nicotiana benthamianaおよびSolanum lycopersicumにおいて本発明の技術が有効に機能することを実証した。
M. aeruginosa由来のTiD遺伝子座からCas5d、Cas6d、Cas7d、Cas3d、およびCas10dのアミノ酸配列情報を基に、シロイヌナズナおよびタバコにおけるコドン頻度を参照し、各Casタンパク質をコードする双子葉植物コドン型の配列を人工化学合成した。各遺伝子の5’側上流には、タンデムに並べられた2つの核移行シグナルを含む核移行シグナル配列(配列番号22、配列番号23)を付与し、さらに各遺伝子間を自己開裂ペプチド2A配列(配列番号24~28)によりつなげたDNA断片を作製した。2Aペプチド配列により連結した5つのTiD遺伝子断片の5’側上流に、カリフラワーモザイクウイルス35S遺伝子プロモーターをタンデムに2つ並べ、さらに翻訳エンハンサーΩ配列を付加したプロモーター配列(2x35Sプロモーター;配列番号29)を、また3’側下流にシロイヌナズナ熱ショックタンパク質18.2kDa遺伝子ターミネーター配列(配列番号30)を連結したTiD遺伝子発現カセットを作製した。TiD遺伝子発現カセットをバイナリープラスミドベクターpCAMBIA2300にクローン化し、pEgPTiD1を構築した(図4a)。植物用crRNA発現カセットには、2つのcrRNA配列の間に、任意の35塩基配列を連結出来るように2ヶ所の制限酵素BsaIサイトを含むスペーサー配列を配置したDNAを人工化学合成した(配列番号31)。発現制御配列として5’側上流にシロイヌナズナU6 snRNA-26遺伝子のプロモーター配列(配列番号32)を、また3’側下流にポリT配列を付加した植物用crRNA発現カセットを構築した(図4b)。植物用crRNA発現カセットをpEgPTiD1のRB配列と2x35Sプロモーターの間に連結し、pEgPTiD2を構築し、植物ゲノム編集用のTiD遺伝子発現バイナリープラスミドベクターとした(図4c)。pEgPTiD1およびpEgPTiD2中における、核移行シグナルが付加された各Casタンパク質をコードする双子葉植物コドン型の配列を配列番号33~37に示す。本実施例で使用した核移行シグナル配列、自己開裂ペプチド2A配列、プロモーター、ターミネーター、およびcrRNA発現カセット配列を表4に示す。
タバコにおける実施例においては、標的配列および該配列に導入する変異として、フィトエン不飽和化酵素(PDS)遺伝子を選んだ(図5-1のa)。タバコPDS遺伝子中の第3エクソンから標的配列1(Target 1、配列番号38)を選び、人工化学合成により植物用crRNA発現カセットに組込んだ、pEgPTiD2-pds(1)を構築した。同様に、第6エクソンから標的配列2(Target 2、配列番号39)を選び、人工化学合成により植物用crRNA発現カセットに組込んだ、pEgPTiD2-pds(2)を構築した。構築したバイナリーベクターは、それぞれAgrobacterium tumefaciens GV2260株に導入した。タバコPDSを標的とするTiD発現ベクターのタバコ細胞への導入は、アグロインフィルトレーション法により行った。pEgPTiD2-pds(1)あるいはpEgPTiD2-pds(2)を保持するアグロバクテリウム菌株とGFP発現バイナリーベクターを保持するアグロバクテリウム菌株をそれぞれ培養し、ベンサミアナタバコ本葉に共感染を行った(図5-1のb)。共感染後、3日経過後の葉片においてGFP蛍光を発する領域から調製したゲノムDNAを鋳型とし、標的配列を含む300~500bpのPDS遺伝子断片をPCR増幅した。増幅したPCR断片を用いてCel-1アッセイを行い、PDS遺伝子上に導入された変異の有無を解析した。コントロールとしてGFP発現バイナリーベクターのみを導入したタバコ葉片を用いた。GFP発現ベクターのみを導入した場合には、PDS遺伝子上に変異は認められなかったが、pEgPTiD2-pdsおよびGFP発現ベクターを同時に導入した場合には、それぞれのPDS遺伝子の標的配列上に変異導入が認められた(図5-2のc)。標的配列1および2を表5に示す。
トマトにおける実施例においては、標的配列および該配列に導入する変異として、Aux/IAA転写因子 IAA9遺伝子を選んだ(図6a)。トマトIAA9遺伝子中の第2エクソンから標的配列1(配列番号40)(表6)を選び、人工化学合成により植物用crRNA発現カセットに組込んだ、pEgPTiD2-iaa9を構築した。構築したバイナリーベクターは、Agrobacterium tumefaciens GV2260株に導入した。トマトIAA9遺伝子を標的とするTiD発現ベクターのトマト細胞への導入は、トマト子葉由来のリーフディスクをもちいたアグロバクテリウム法により行った。アグロバクテリウムと共存培養したリーフディスクを100mg/L カナマイシンおよび1.5mg/L t-ゼアチンを含むMS固化培地上で培養することにより、pEgPTiD2-iaa9上のT-DNA領域の遺伝子導入が生じたカルスを得た(図6b)。IAA9の標的配列には制限酵素AccIの認識配列が存在し、TiDによるゲノム編集の結果、変異が導入されればAccI認識部位が消失する。これを利用しAccIを用いたPCR-制限酵素長多型(RFLP)解析により、IAA9の標的配列に生じた変異解析を行った。得られた形質転換カルスから調製したゲノムDNAを鋳型とし、IAA9の標的配列を含む約300b領域をPCRにより増幅した。PCR断片をAccIにより制限酵素切断を行ったところ、pEgPTiD2-iaa9を導入したカルス培養物由来PCR断片中には、IAA9標的配列に変異導入が起きた結果、AccIにより切断を受けない配列が含まれていることがわかった(図6c)。pEgPTiD2-iaa9導入を行ったカルス由来のPCR断片の塩基配列を決定したところ、IAA9の標的配列上のPAM配列の直後に1bから4bまでの塩基欠失型あるいは塩基挿入型の変異が導入されていることが明らかとなった(図7)。
本実施例では、高等動物におけるゲノム編集の実施例の一形態として、ヒト胚性腎細胞由来細胞株HEK293細胞において本発明の技術が有効に機能することを実証した。
M. aeruginosa由来のTiD遺伝子座からCas5d、Cas6d、Cas7d、Cas3d、およびCas10dのアミノ酸配列情報を基に、各Casタンパク質をコードする遺伝子配列を人工化学合成した。各遺伝子の5’側上流には、タンデムに並べられた2つの核移行シグナルを含む核移行シグナル配列(配列番号22、配列番号23)を付与し、さらに各遺伝子間を自己開裂ペプチド2A配列(配列番号24~28)によりつなげたDNA断片を作製した。2Aペプチド配列により連結した5つのTiD遺伝子断片の5’側上流に、サイトメガロウィルスエンハンサー+トリβ-アクチン遺伝子プロモーターハイブリッド配列(CBhプロモーター;配列番号41)を、また3’側下流にウシ由来成長ホルモン遺伝子ターミネーター配列(bGHターミネーター配列番号42)を連結したTiD遺伝子発現カセットを作製し、pCR8TOPOベクター(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)に連結したpCR_hTiDを構築した。crRNA発現カセットとして、2つのcrRNA配列の間に、任意の35塩基配列を連結出来るように2ヶ所の制限酵素BsaIサイトを含むスペーサー配列を配置したDNA(配列番号31)を人工化学合成した。発現制御配列として5’側上流にヒトU6 snRNA遺伝子のプロモーター配列(配列番号43)を、また3’側下流にポリT配列を付加し、pCR8TOPOベクター(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)に連結したpCR_crRNAを構築した。pCR_hTiD中における核移行シグナルが付加された各Casタンパク質をコードする配列を配列番号33~37に示す。CBhプロモーター、bGHターミネーター、およびヒトU6 snRNA遺伝子プロモーター配列を表7に示す。
動物培養細胞における実施例として、細胞株にヒト胚性腎細胞由来細胞株(HEK293細胞株)を用い、標的配列および該配列に導入する変異として、EMX1遺伝子を選んだ。EMX1遺伝子中の標的配列としてターゲット1(配列番号44)およびターゲット2(配列番号45)を選び、人工化学合成により、上記(1)で作製したヒト培養細胞用crRNA発現カセットに組込んだ、ターゲット1を含むpUC_crRNA-T1およびターゲット2を含むpUC_crRNA-T2を構築した。構築したプラスミドベクターはそれぞれ大腸菌HST08株(タカラバイオ社製)において増幅しPureYield(登録商標)Plasmid Miniprep System(プロメガ社製)を用いて精製を行った。精製したプラスミドのうち、pCR_hTiDおよびpUC_crRNA-T1の混合物あるいは、pCR_hTiDおよびpUC_crRNA-T2の混合物をそれぞれHEK293細胞株にトランスフェクションし、導入した。プラスミドベクター導入3日目における細胞株を回収し、Blood&Cell Culture DNA Mini Kit(キアゲン社製)を用いてゲノムDNAを調製した。調製したゲノムDNAを鋳型として、ターゲット1およびターゲット2を含むゲノム配列領域をPCRにより増幅し、自動電気泳動装置MultiNA(島津製作所製)を用いたヘテロ二本鎖移動度分析により変異解析を行った。また、増幅したPCR断片をpNEB193ベクター(New England Biolab社製)にクローン化し、シーケンス解析により変異配列を同定した。体細胞変異効率は、それぞれ変異配列が確認されたクローン数/解析クローン総数により算出した。コントロールとして、プラスミド未導入、あるいはpCR_hTiD、pUC_crRNA-T1またはpUC_crRNA-T2を単独で導入した細胞株を用いて、同様に変異解析を行った。図9にHEK293細胞株を用いたゲノム編集の実験スキームを示す。
SEQ ID NO:2 ; Microcystis aeruginosa Cas6d amino acid sequence
SEQ ID NO:3 ; Microcystis aeruginosa Cas7d amino acid sequence
SEQ ID NO:4 ; Microcystis aeruginosa Cas3d amino acid sequence
SEQ ID NO:5 ; Microcystis aeruginosa Cas10d amino acid sequence
SEQ ID NO:6 ; TiDcrRNA containing direct repeat (37b) and spacer (35b of N). N is any nucleotide constituting a complementary sequence to a target nucleotide sequence.
SEQ ID NO:7 ; Cas5d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli
SEQ ID NO:8 ; Cas6d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli
SEQ ID NO:9 ; Cas7d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli
SEQ ID NO:10 ; Cas3d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli
SEQ ID NO:11 ; Cas10d nucleotide sequence for expression in Escherichia coli
SEQ ID NO:12 ; J23108 synthesis promoter
SEQ ID NO:13 ; Ribosomal binding sequence
SEQ ID NO:14 ; Terminator sequence STOP767
SEQ ID NO:15 ; Terminator sequence STOP768(1)
SEQ ID NO:16 ; Terminator sequence TOP768(2)
SEQ ID NO:17 ; T7 terminator sequence
SEQ ID NO:18 ; CRISPR repeat sequence
SEQ ID NO:19 ; T7 promoter sequence
SEQ ID NO:20 ; crRNA expression cassette
SEQ ID NO:21 ; Synthesis cccdB gene expression cassette
SEQ ID NO:22 ; Nuclear localizing signal (NLS) amino acid sequence
SEQ ID NO:23 ; NLS nucleotide sequence
SEQ ID NO:24 ; Self-cleaving peptide 2A amino acid sequence
SEQ ID NO:25 ; Self-cleaving peptide 2A(1) coding sequence
SEQ ID NO:26 ; Self-cleaving peptide 2A(2) coding sequence
SEQ ID NO:27 ; Self-cleaving peptide 2A(3) coding sequence
SEQ ID NO:28 ; Self-cleaving peptide 2A(4) coding sequence
SEQ ID NO:29 ; 2 x cauliflower mosaic virus 35S gene promoter + omega sequence
SEQ ID NO:30 ; Arabidopsis shock protein 18.2kDa gene terminator
SEQ ID NO:31 ; crRNA expression cassette
SEQ ID NO:32 ; Arabidopsis U6 snRNA-26 gene promoter sequence
SEQ ID NO:33 ; 2xNLS + Cas5d
SEQ ID NO:34 ; 2xNLS + Cas6d
SEQ ID NO:35 ; 2xNLS + Cas7d
SEQ ID NO:36 ; 2xNLS + Cas3d
SEQ ID NO:37 ; 2xNLS + Cas10d
SEQ ID NO:38 ; Target sequence 1 on tobacco PDS gene
SEQ ID NO:39 ; Target sequence 2 on tobacco PDS gene
SEQ ID NO:40 ; Target sequence on tomato IAA9 gene
SEQ ID NO:41 ; Cytomegalovirus enhancer + universal chicken beta-actin gene hybrid promoter
SEQ ID NO:42 ; Bovine-derived growth hormone gene terminator sequence
SEQ ID NO:43 ; Human U6 snRNA gene promoter
SEQ ID NO:44 ; Target 1 sequence on human EMX1 gene
SEQ ID NO:45 ; Target 2 sequence on human EMX1 gene
Claims (10)
- 標的ヌクレオチド配列を標的化するための組成物であって、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas5d、Cas6d、およびCas7d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA、または該ガイドRNAをコードするDNA
を含む組成物。 - 標的ヌクレオチド配列を改変または切断するための組成物であって、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas3d、Cas5d、Cas6d、Cas7d、およびCas10d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA、または該ガイドRNAをコードするDNA
を含み、前記標的ヌクレオチド配列が二本鎖DNAである、組成物。 - 標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、細胞中に、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas5d、Cas6d、およびCas7d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA、または該ガイドRNAをコードするDNA
を導入することを含む方法。 - 細胞中に、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas3d、Cas5d、Cas6d、Cas7d、およびCas10d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA、または該ガイドRNAをコードするDNA
を導入することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された細胞の製造方法。 - 請求項4に記載の製造方法によって標的ヌクレオチド配列が改変された植物細胞を製造することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された植物の製造方法。
- 請求項4に記載の製造方法によって標的ヌクレオチド配列が改変された非ヒト動物細胞を製造することを含む、標的ヌクレオチド配列が改変された非ヒト動物の製造方法。
- イン・ビトロで核酸における標的ヌクレオチド配列を標的化する方法であって、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas5d、Cas6d、およびCas7d、および
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA
を使用することを含む方法。 - イン・ビトロで核酸における標的ヌクレオチド配列を切断する方法であって、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas3d、Cas5d、Cas6d、Cas7d、およびCas10d、および
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA
を使用することを含む方法。 - 標的ヌクレオチド配列を標的化するためのキットであって、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas5d、Cas6d、およびCas7d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA、または該ガイドRNAをコードするDNA
を含むキット。 - 標的ヌクレオチド配列を改変または切断するためのキットであって、
(i)CRISPRタイプI-D関連タンパク質Cas3d、Cas5d、Cas6d、Cas7d、およびCas10d、またはこれらのタンパク質をコードする核酸、および
(ii)前記標的ヌクレオチド配列に相補的な配列および該配列の前後にCRISPR遺伝子座に由来する共通繰り返し配列を含むガイドRNA、または該ガイドRNAをコードするDNA
を含み、前記標的ヌクレオチド配列が二本鎖DNAである、キット。
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