WO2020184723A1 - Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的配列改変技術 - Google Patents

Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的配列改変技術 Download PDF

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WO2020184723A1
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dna
sequence
vector
expression cassette
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PCT/JP2020/011283
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敬史 刑部
祐里子 刑部
和田　直樹
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国立大学法人徳島大学
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression

Definitions

  • the present invention relates to a method for specifically modifying a target nucleotide sequence using a CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) type ID system, and the Cas (CRISPR-associated) protein and crRNA (CRISPRRNA) used in the method. ) Containing the kit.
  • CRISPR Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats
  • Cas CRISPR-associated protein and crRNA
  • the CRISPR-Cas system is an adaptive immune system found in bacteria and archaea that protects bacteria and archaea from viruses, plasmids and other foreign genetic elements.
  • the CRISPR-Cas system is divided into two classes, six different types (I-VI), and at least 16 subtypes, depending on the Cas proteins and molecular mechanisms that make up the system.
  • the complex of crRNA and Cas effector protein recognizes a short (typically 3-5 base length) sequence element called the protospacer flanking motif (PAM) in foreign DNA. To do. After PAM recognition, the complex of type I or II crRNA and Cas effector protein locally disrupts the DNA pair to form an R-loop structure, and the crRNA guide element base pairs with the complementary target strand. It forms and replaces non-target DNA strands. Binding and unwinding of double-stranded DNA targets by the crRNA-Cas complex is required for DNA cleavage and degradation by type-specific Cas effector nucleases such as Cas3, Cas9 and Cas12 nucleases.
  • type-specific Cas effector nucleases such as Cas3, Cas9 and Cas12 nucleases.
  • CRISPR type I there are various subtypes of CRISPR type I.
  • a target recognition module such as Cas5, Cas6, Cas7 and Cas8 called Cascade (CRISPR-associated-complex for antiviral defense) and a DNA cleavage module such as Cas3 (Non-Patent Document 1).
  • the Class 1 CRISPR system is less common than Class 2, but as a genome editing tool, with Cas9 and Cpf1, for example, a long region genome deletion and a variety of mutation profiles involving long gRNA sequences. It was suggested that it may have some advantages in comparison (Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 In the class 1 type IE CRISPR-Cas3 system studied so far, it has been reported that base deletions of 2-300b to 100 kb occur mainly on the 5'upstream side of the PAM sequence (Non-Patent Document 1). ..
  • Type ID (hereinafter referred to as "TiD") system.
  • the genomic locus was identified and found that the system contained five Cas proteins, Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d (Patent Document 1).
  • Patent Document 1 it was unclear how the TiD system degrades DNA.
  • An object of the present invention is to elucidate the mechanism of action of the TiD system and thereby to develop a more efficient target sequence modification method using the TiD system.
  • the CRISPR TiD system contains a Cas3 effector protein (Cas3d), but the protein lacks a nuclease domain and instead Cas10d has a typical nuclease domain. It was. Cas10d is a TiD-specific effector protein not found in other CRISPR systems. Furthermore, they have found that the off-target effect of the TiD system can be reduced by selecting a target sequence that does not have a specific similarity sequence.
  • Cas3d Cas3 effector protein
  • a method of modifying a target nucleotide sequence in a cell wherein the cell is (I) A vector system or expression cassette system containing a DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, a DNA encoding Cas7d, and a DNA encoding Cas10d, which are CRISPR type ID Cas proteins Cas3d. And (ii) a crRNA containing a sequence that forms a base pair with the target nucleotide sequence, or a DNA encoding the crRNA.
  • the vector system comprises a first vector and a second vector.
  • the expression cassette system includes a first expression cassette and a second expression cassette.
  • the first vector or the first expression cassette is selected from the group consisting of DNA encoding Cas3d, DNA encoding Cas5d, DNA encoding Cas6d, DNA encoding Cas7d, and DNA encoding Cas10d. Contains at least one DNA and a first regulatory element that regulates transcription of said DNA.
  • a method, wherein the second vector or the second expression cassette comprises at least one DNA selected from the group and a second regulatory element that regulates transcription of the DNA.
  • a nuclear localization signal is sent to the 5'end and / or 3'end side of the DNA encoding Cas3d, the DNA encoding Cas5d, the DNA encoding Cas6d, the DNA encoding Cas7d, and the DNA encoding Cas10d.
  • a DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, a DNA encoding Cas7d, and a DNA encoding Cas10d are included in the vector system, and the first vector encodes Cas3d.
  • a DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, a DNA encoding Cas7d, and a DNA encoding Cas10d are included in the vector system, and the first vector encodes Cas3d.
  • the second vector contains a DNA encoding Cas7d and encodes a monopartite nuclear localization signal linked in two or three tandems on the 5'end and / or 3'end side of the DNA.
  • the vector system further contains a third to fifth vector, and each of the DNA encoding Cas3d, the DNA encoding Cas5d, the DNA encoding Cas6d, the DNA encoding Cas7d, and the DNA encoding Cas10d are included.
  • the method according to any one of [1] to [8] which is separately contained in the first to fifth vectors.
  • a DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, a DNA encoding Cas7d, and a DNA encoding Cas10d are included in the expression cassette system, and the first expression cassette is Cas3d.
  • the second expression cassette contains a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas7d, and a DNA encoding Cas10d
  • the first expression cassette contains a DNA encoding Cas6d and a DNA encoding Cas6d.
  • [15] The method according to any one of [1] to [14], wherein the modification is a deletion, insertion, or substitution of a base.
  • [16] The method of [15], wherein the modification is a deletion on a kilobase to tens of kilobases.
  • [17] A kit for modifying an intracellular target nucleotide sequence.
  • (I) A vector system or expression cassette system containing a DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, a DNA encoding Cas7d, and a DNA encoding Cas10d, which are CRISPR type ID Cas proteins Cas3d.
  • the vector system comprises a first vector and a second vector.
  • the expression cassette system includes a first expression cassette and a second expression cassette.
  • the first vector or the first expression cassette is selected from the group consisting of DNA encoding Cas3d, DNA encoding Cas5d, DNA encoding Cas6d, DNA encoding Cas7d, and DNA encoding Cas10d.
  • a kit, wherein the second vector or the second expression cassette comprises at least one DNA selected from the group and a second regulatory element that regulates transcription of the DNA.
  • a DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, a DNA encoding Cas7d, and a DNA encoding Cas10d are included in the vector system, and the vector system is the third to fifth.
  • the first to fifth vectors further include a vector, which further comprises a DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, a DNA encoding Cas7d, and a DNA encoding Cas10d, respectively.
  • the kit [19] A DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, a DNA encoding Cas7d, and a DNA encoding Cas10d are included in the expression cassette system, and the first expression cassette is Cas3d.
  • a method for specifically targeting an intracellular target nucleotide sequence wherein the cell is (I) CRISPR type ID Cas proteins Cas5d, Cas6d and Cas7d, or nucleic acids encoding these proteins, and (ii) a crRNA containing a sequence forming a base pair with the target nucleotide sequence, or the crRNA.
  • DNA to do Including the introduction of The target nucleotide sequence is any one base selected from the group consisting of 1, 6, 12, 18 and 24th bases from the 3'side of the PAM sequence with respect to the target nucleotide sequence, or the 24th and subsequent bases.
  • a method which is designed so that there are no similar sequences that differ in one or two bases.
  • a method of specifically modifying a target nucleotide sequence in a cell wherein the cell is (I) CRISPR type I-D Cas proteins Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d and Cas10d, or nucleic acids encoding these proteins, and (ii) crRNAs containing sequences that base pair with the target nucleotide sequence, or DNA encoding the crRNA Including the introduction of
  • the target nucleotide sequence is any one base selected from the group consisting of 1, 6, 12, 18 and 24th bases from the 3'side of the PAM sequence with respect to the target nucleotide sequence, or the 24th and subsequent bases.
  • the method is designed so that there are no similar sequences that differ in one or two bases, and [22] the target nucleotide sequence is 6 from the 3'side of the PAM sequence with respect to the target nucleotide sequence. , 12, 18 and 24th base is designed so that there is no one base selected from the group, or a similar sequence in which one or two bases after the 24th base are different. 20 or 21.
  • the present invention it is possible to efficiently induce site-specific mutations in cells, preferably animal and plant cells, by using a TiD system containing TiD crRNA engineered to target a particular DNA. it can.
  • the expression level of Cas effector protein in the TiD system can be improved, not only inducing insertion and / or deletion of short regions, but also on a kilobase to tens of kilobases. Deletions in long regions of the base and bi-directional base deletions can also be induced.
  • the TiD system is used to genetically transfer the desired phenotype in the resulting mutant transgenic organism to the next generation.
  • the methods of the invention result in specific targeting and modification of the target sequence with suppressed off-target effects. Therefore, the present invention provides a novel genome editing tool for organisms, especially eukaryotes, using the CRISPR effector module pathway of the TiD system.
  • gRNAs target the AAVS locus shown in Table 2.
  • the effect of gRNA target sequence length on TiD activity is shown.
  • the effect of the crRNA structure used in the TiD system is shown.
  • the results of a luc reporter assay performed using gRNA containing a 3-base mismatch at various positions of the gRNA sequence against the target sequence of AAVS GTC_70-107 (+) are shown.
  • the results of a luc reporter assay performed using a gRNA containing a 1-base mismatch at various positions of a 30b-long gRNA sequence against the target sequence of AAVS GTC_70-107 (+) are shown.
  • N-Cas-C-bpNLS N-Cas-C-bpNLS
  • bpNLS having both an N-terminal Myc tag and a C-terminal 6xHis tag in each of Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d.
  • E. Is. ** P ⁇ 0.1 and ** P ⁇ 0.05 were determined by Student's t-test.
  • N-SV40NLS-Cas Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d with SV40NLS with different tags added to the N-terminus. 2A; self-cleaving peptide. promoter; promoter. Ter; Terminator. Western blotting results of expression levels of Cas protein in HEK293T cells.
  • C Control without vector. EV; control of an empty vector (without gRNA). 1; Individual Cas expression cassettes were separated into individual vectors. 2; Cas3d and Cas10d were inserted into the same vector, Cas5d, Cas6d and Cas7d were inserted into the same vector and transfected into HEK293T cells as separate vectors.
  • Cas3d and Cas10d were inserted into the same vector, Cas5d, Cas6d, and Cas7d were inserted into separate vectors and transfected into HEK293T cells as separate vectors. 4; Cas3d and Cas10d were inserted into separate vectors, and Cas5d, Cas6d and Cas7d were inserted into the same vector and transfected into HEK293T cells as separate vectors. 5; An all-in-one vector containing an entire Cas expression cassette. Western blotting results of Cas5d and Cas6d expression levels using different promoters in HEK293T cells.
  • C Control without vector.
  • the distribution image of the deletion mutation is shown in FIG. 6c.
  • a long-chain region deletion mutation ( ⁇ 5235 nt and ⁇ 17902 nt + 87 nt insertion) is shown. Nucleotide positions from PAM are shown on the sequence.
  • the TiD expression vector for plants is shown. Luc reporter assay to determine the target of the SlIAA9 gene.
  • the gRNAs sequences are shown in Table 2. Structure of Cas expression vector cassette in tomato plants.
  • pTiDP1.2 is an all-in-one vector used in slIAA9 mutagenesis.
  • pMGTTiDP20 two Cas cassettes were arranged in the same vector under two promoters and used for slRIN mutagenesis.
  • AtU6-26 crRNA Arabidopsis U6 snRNA-26 promoter and gRNA sequence.
  • P35S CaMV35S promoter.
  • Pubi4 Parsley ubiquitin 4-2 promoter.
  • NptII Kanamycin resistance marker expression cassette.
  • RB Right border sequence of T-DNA.
  • LB Left boundary sequence of T-DNA.
  • Ter Terminator.
  • GFP Green fluorescent protein.
  • Plant genome editing using CRISPR TiD Detection of long-chain region deletion mutations in the SlIAA9 and SlRIN genes induced by CRISPR TiD. The gene structure, gRNA position, and various primer sets for mutation amplification are shown. The PCR amplified fragment separated on the agarose gel is shown. The numbers indicate the primer set.
  • the results of the long region deletion mutation analyzed by Sanger sequencing of cloned DNA derived from CRISPR TiD transgenic tomato callus are shown.
  • Nucleotide positions from PAM are shown on the sequence. Arrows indicate specific bands used for cloning and sequencing. Detection of long-chain region deletion mutations in the SlRIN gene induced by CRISPR TiD in tomato shoots (T0 generation). PCR-amplified fragments isolated on an agarose gel show long-chain region deletion mutations. WT; wild type. 1-12; transgenic shoot line (T0). Long chain region deletions were detected in strains # 4, 5, 6 and 12. The band of the same length as the wild type was a non-specific band. Arrows indicate specific bands. The bands indicated by the arrows were further subjected to sequencing analysis. The red arrow (upper band) indicates fragment 1 and the blue arrow (lower band) indicates fragment 2.
  • WT wild-type sequence.
  • the gRNA target sequence is indicated by a box and the PAM is indicated by a filled box.
  • the sequence frequency in the cloned PCR product is shown to the right of the sequence.
  • Genome editing using CRISPR TiD in commercially available tomato cultivated species.
  • WT wild-type sequence. Box
  • Off-target effect of CRISPR TiD in commercial tomato cultivated varieties is achieved in commercial tomato cultivated varieties.
  • Mi-seq for transgenic T0 shoots of Ailsa Craig (SlIAA9-tid_gRNA1 (+) AC T0s_ # 1, 2, and 4) and wild-type (WT) -derived off-target site cloned PCR products. It was calculated from the number of read counts in the deep amplicon according to.
  • the TiD system used in the present invention includes Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d and Cas10d, and TiD crRNA as Cas effector proteins among TiD Cas proteins.
  • Cas5d, Cas6d and Cas7d are known to constitute a target recognition module (Cascade), and Cas3d and Cas10d are known to constitute a polynucleotide cleavage module (Patent Document 1).
  • the TiD crRNA contains a sequence complementary to the target nucleotide sequence. The above five Cas proteins and TiD crRNA form a complex to target and modify the target nucleotide sequence.
  • Cas10d among the components of the cleavage module has a polynucleotide-degrading action (nuclease activity), and Cas3d is a nuclease. It was revealed that it has no activity. That is, in the TiD system, the TiD crRNA and the target recognition module target the target nucleotide sequence, guide the polynucleotide cleavage module to the vicinity of the target nucleotide sequence, and the target nucleotide sequence is cleaved by the action of Cas10d.
  • the present invention is used in a method of modifying a target nucleotide sequence in a target cell by introducing the TiD system into the target cell (hereinafter, also referred to as “the target sequence modification method of the present invention”), and the method.
  • Kit hereinafter, also referred to as “kit of the present invention”.
  • the present invention specifically targets a target sequence and specifically targets the target sequence by designing a target sequence in which a similar sequence containing a mutation at a specific position does not exist with respect to the target nucleotide sequence.
  • methods for modifying hereinafter, referred to as “target sequence targeting method in which the off-target effect of the present invention is suppressed” and “target sequence modification method in which the off-target effect of the present invention is suppressed”).
  • the cell may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, and is not particularly limited.
  • bacteria, paleontology, fungi (eg, filamentous fungi, yeast, etc.), plant cells, insect cells, animal cells (eg, human cells, non-human cells, non-mammalian vertebrate cells, invertebrate cells, etc.) Can be mentioned.
  • eukaryotic cells are used.
  • a "cell” is a cell isolated from an organism, a cell present in an organism (eg, in an animal or plant), or an organism (eg, animal, or plant). Includes any of the body).
  • the method of the present invention may be applied to cells isolated from a living body, cells existing in the living body, or cells in the living body. For example, it may be applied to cells existing in the body of a non-human animal or a non-human animal body.
  • Cas effector protein used in the present invention includes Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d among the Cas proteins of TiD.
  • Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d may be derived from any bacteria or archaea, for example, Microcystis aeruginosa, Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Anabaena cylindrica, Anabaena variabilis, Caldicellulosiruptor lactoaceticus, Caldilinea aerophila, Bacteria epipsimmum, Cyanothece Sp.
  • Thermofilum pendens may be derived from a strain such as Thermofilum pendens.
  • the amino acid sequence and nucleotide sequence information of the Cas protein can be obtained from a public database such as NCBI GenBank.
  • NCBI GenBank a public database
  • BLAST program from the microbial genome data obtained by metagenomic analysis or the like, it is possible to acquire sequences from new microbial species.
  • a codon optimized for translation in the host cell into which the nucleic acid is introduced may be selected based on the amino acid sequence information and constructed by chemical synthesis or the like. Protein expression can be increased by using codons that are frequently used in host cells.
  • the nucleic acid include RNA such as mRNA or DNA.
  • the Cas proteins of Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d or the nucleic acids encoding them are used as long as the effects of the present invention are achieved, that is, the complex of the Cas protein and crRNA targets the target sequence.
  • it may have one or more amino acid mutations or one or more nucleotide mutations as long as it is modified.
  • Cas3d SEQ ID NO: 1
  • Cas5d SEQ ID NO: 2
  • Cas6d SEQ ID NO: 3
  • Cas7d derived from Microcystis aeruginosa hereinafter referred to as M. aeruginosa
  • SEQ ID NO: 4 Cas10d
  • SEQ ID NO: 5 Cas10d
  • nucleic acid encoding Cas6d a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a protein containing an amino acid sequence, a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 and a nucleic acid encoding Cas7d
  • a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a protein containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a nucleotide sequence encoding a nucleic acid containing the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 as an example of a nucleic acid encoding Cas10d.
  • Nucleic acids contained include.
  • a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and as an example of a nucleic acid encoding Cas5d, in SEQ ID NO: 2.
  • nucleic acid encoding Cas6d a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the indicated amino acid sequence, a nucleic acid containing a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, a nucleic acid encoding Cas7d.
  • nucleic acid containing the nucleotide sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 and as an example of the nucleic acid encoding Cas10d, the nucleotide sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 Nucleic acid containing.
  • nucleic acid encoding Cas3d used in the present invention, a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 and a nucleic acid encoding Cas5d, SEQ ID NO: 2
  • a nucleic acid encoding Cas6d a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in, Cas7d, a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, is encoded.
  • nucleic acid a nucleic acid consisting of a nucleotide sequence encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and as an example of a nucleic acid encoding Cas10d, a nucleotide encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5. Nucleic acids consisting of sequences can be mentioned.
  • nucleic acid encoding the Cas protein used in the present invention 80% or more, preferably 80% or more, respectively, of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5.
  • nucleic acid encoding the Cas protein used in the present invention 80% or more of each of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5 is preferable. Consists of an amino acid sequence having a sequence identity of 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, or even more preferably 99% or more. Nucleic acids that contain a nucleotide sequence that encodes a protein can be mentioned.
  • nucleic acid encoding the Cas protein used in the present invention 80% or more of each of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, respectively. From an amino acid sequence having sequence identity of preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 96% or more, still more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, or even more preferably 99% or more.
  • the Cas protein expressed from any of the above nucleic acids has the ability to target or modify the target sequence when complexed with the Cas protein and crRNA expressed from the other nucleic acids described above.
  • nucleotide sequence encoding a nuclear localization signal is preferably added to the end of the nucleic acid encoding the Cas protein.
  • the nuclear localization signal sequence is known in the art and can be appropriately selected depending on the species from which the cell to be introduced is derived. For example, a monopartite nuclear localization signal or a bipartite nuclear localization signal (bpNLS) may be used. Examples of monopartite nuclear localization signals include, but are not limited to, those containing the sequence set forth in KKKKRK (SEQ ID NO: 6).
  • examples of the vipertite-type nuclear localization signal include, but are not limited to, those containing the sequence represented by DPKRTADGSEFESPKKKRKVEGT (SEQ ID NO: 7).
  • nuclear localization signal sequences may be arranged in tandem and added to the nucleic acid encoding the Cas protein.
  • two or more, for example, two or three monopartite nuclear localization signal sequences are arranged in tandem and added to the nucleic acid encoding the Cas protein.
  • the nuclear localization signal sequence may be added to the 5'end or 3'end of the nucleic acid encoding the Cas protein, or both the 5'end and the 3'end.
  • At least one DNA selected from the group consisting of DNA encoding Cas3d, DNA encoding Cas5d, DNA encoding Cas6d, and DNA encoding Cas10d is located at the 5'end side.
  • a sequence encoding one monopartite nuclear localization signal may be added, or a sequence encoding a monopartite nuclear localization signal linked in two or three tandems may be added.
  • At least one DNA selected from the group consisting of DNA encoding Cas3d, DNA encoding Cas5d, DNA encoding Cas6d, and DNA encoding Cas10d is 5'terminal and A sequence encoding a vipertite-type nuclear localization signal may be added to both the 3'ends.
  • the DNA encoding Cas7d has a sequence encoding a monopartite nuclear localization signal linked to two or three tandems added to the 5'end and / or 3'end side. You may. These embodiments are preferred for introduction into animal cells.
  • the crRNA comprises one or more structural units (“repeat-spacer-repeat”) consisting of a repeat sequence derived from the CRISPR locus and a spacer sequence sandwiched between the repeat sequences.
  • the repeat sequence preferably comprises a palindrome-like sequence.
  • the crRNA contributes to target recognition of the CRISPR-Cas system by including an RNA sequence that binds to the target nucleotide sequence as a spacer sequence (ie, a protospacer sequence).
  • An RNA molecule containing a structure consisting of a repeat sequence of crRNA and a protospacer sequence sandwiched between the repeat sequences is also called a guide RNA (gRNA).
  • the crRNA is processed by the action of the Cas effector protein and its repeat sequence is cleaved to become a mature crRNA consisting of a partial sequence of the repeat sequence and a protospacer sequence sandwiched between the partial sequences of the repeat sequence.
  • the crRNA before it is processed is called a pre-mature crRNA.
  • the crRNA used in the present invention contains a repeat sequence derived from the CRISPR type ID locus and a sequence forming a base pair with the target nucleotide sequence as a protospacer sequence sandwiched between the repeat sequences.
  • the crRNA used in the present invention is preferably a pre-mature crRNA.
  • the pre-mature crRNA is processed by Cas6d before being incorporated into Cascade (complex of Cas5d, Cas6d, and Cas7d) to become a mature crRNA. If the pre-mature crRNA contains two or more "repeat-spacer-repeat" structural units, the pre-mature crRNA may contain two or more protospacer sequences. Premature crRNAs containing two or more protospacer sequences yield two or more mature crRNAs, which are then individually incorporated into Cascade.
  • the protospacer sequence contained in crRNA is a sequence that forms a base pair with the target nucleotide sequence.
  • the "sequence forming a base pair with a target nucleotide sequence” is, for example, a sequence complementary to an RNA sequence target nucleotide sequence or a sequence substantially complementary to an RNA sequence target nucleotide sequence.
  • substantially complementary includes sequences that are not completely complementary to the target sequence but can bind to the target sequence (base pair with the target sequence).
  • RNA sequences Substantially complementary sequences to target nucleotide sequences may contain mismatches to sequence target sequences as long as they base pair with the target sequence.
  • the repeat sequence portion of crRNA may have at least one hairpin structure.
  • the repeat sequence portion on the 5'end side of the protospacer sequence may have a hairpin structure
  • the repeat sequence portion on the 3'end side of the protospacer sequence may be single-strand.
  • crRNA preferably has one hairpin structure.
  • the repeat sequence derived from the CRISPR type ID locus can be found from the crRNA gene sequence region adjacent to the type ID gene group by using a tandem repeat search program.
  • the repeat sequence from the Type ID locus may be from any bacterium or archaea, eg, from the bacteria and archaea exemplified for the Cas effector protein described above. ..
  • the base length of the repeat sequence contained in crRNA is not particularly limited as long as the purpose of targeting the target nucleotide sequence by interacting with Cascade is achieved.
  • the repeat sequences before and after the protospacer sequence may each be about 10 to 70 bases long, for example, about 30 to 50 bases long, preferably about 35 to 45 bases long. May be good.
  • the crRNA used in the present invention can contain a protospacer sequence having a length of about 10 to 70 bases.
  • the protospacer sequence contained in the crRNA is preferably a sequence consisting of 20 to 50 bases, more preferably 25 to 45 bases, and further preferably a sequence consisting of 30 to 40 bases, for example, 31 bases and 32 bases. It is a sequence consisting of 33 bases, 34 bases, 35 bases, 36 bases, 37 bases, 38 bases, or 39 bases.
  • the longer the targetable sequence the greater the sequence specificity of target recognition by crRNA.
  • the longer the targetable sequence the higher the Tm value of the base pair formed between the crRNA and the target sequence, and the more stable the target recognition.
  • the length of the sequence that crRNA can target is about 20 to 24 bases, so in the present invention, the sequence is more specific than the conventional method. Excellent in sex and stability.
  • crRNA used in the present invention examples include those containing a repeat sequence of crRNA derived from aeruginosa.
  • a premature cRNA comprising a sequence represented by GUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAAC (SEQ ID NO: 8; N is any nucleotide that constitutes a sequence that forms a base pair with the target nucleotide sequence).
  • the number of N may be changed in the range of 10 to 70, preferably 20 to 50, more preferably 25 to 45, and further preferably 30 to 40.
  • the crRNA may be introduced into cells as RNA or as DNA encoding crRNA.
  • the DNA encoding crRNA may be contained, for example, in a vector or expression cassette, and the DNA sequence is preferably operably linked to regulatory sequences such as promoters and terminators.
  • the vector and the regulatory sequence can be appropriately selected by those skilled in the art based on, for example, a host cell or the like.
  • a pol III promoter eg, SNR6, SNR52, SCR1, RPR1, U6, H1 promoter, etc.
  • a pol II promoter eg, a terminator (eg, T6 sequence), or a human U6 snRNA promoter.
  • the DNA encoding the crRNA may be contained in the same vector or in the same expression cassette as any of the DNA encoding the five Cas proteins, or is separate from any of the DNAs encoding the five Cas proteins. It may be contained in the vector of the above or in another expression cassette.
  • the target nucleotide sequence (also simply referred to as “target sequence” in the present specification) is a sequence of an arbitrary nucleic acid and is located in the vicinity of the protospacer proximity motif (PAM) of the TiD system. It is not particularly limited except that the located sequence is selected as the target sequence.
  • the target nucleotide sequence may be either a double-stranded DNA sequence, a single-stranded DNA sequence, or an RNA sequence. Examples of DNA include eukaryotic nuclear genomic DNA, mitochondrial DNA, plastide DNA, prokaryotic genomic DNA, phage DNA, plasmid DNA and the like.
  • the target nucleotide sequence is preferably a sequence on genomic DNA. Therefore, in the sense strand of the target nucleic acid, a sequence located near the PAM sequence, preferably a sequence located near the 3'downstream of the PAM sequence, and more preferably a sequence adjacent to the 3'downstream of the PAM sequence. Is selected as the target nucleotide sequence. Further, in the antisense strand of the target nucleic acid, the target nucleotide sequence is a sequence located near the PAM sequence, preferably a sequence located near the 5'side of the PAM sequence, and more preferably adjacent to the 5'side of the PAM sequence. It is selected from the array to be used.
  • located in the vicinity includes both being adjacent and being close to each other. Also, as used herein, the term “neighborhood” includes both adjacent and near positions. In addition, in this specification, unless otherwise specified, it is described based on the sense strand of nucleic acid.
  • the target nucleotide sequence may be a sequence located in the vicinity of the PAM sequence and existing in the intron, coding region, non-coding region, or control region of the target gene.
  • the target gene is an arbitrary gene and may be arbitrarily selected.
  • the length of the target nucleotide sequence is, for example, in the range of 10 to 70 bases, preferably 20 to 50 bases, more preferably 25 to 45 bases, and even more preferably 30 to 40 bases.
  • Target sequence modification method of the present invention a vector system or an expression cassette system containing DNA encoding the above five Cas proteins and a crRNA or DNA encoding crRNA are used in the above cells. It is characterized by being introduced inside.
  • the target sequence modification method of the present invention comprises specifically cleaving the target nucleotide sequence in the cell by the TiD system.
  • the target sequence modification method of the present invention may be carried out in vitro or in vivo.
  • modifications include deletion, insertion, or substitution of at least one nucleotide, or a combination thereof.
  • the DNA encoding the Cas protein is included in a vector system or an expression cassette system.
  • vector system and “expression cassette system” refer to a group containing two or more vectors (that is, a group containing a first vector and a second vector) and two or more expression cassettes, respectively. It means a group containing (that is, a group containing a first expression cassette and a second expression cassette).
  • the vector is an expression vector for carrying a DNA encoding a target protein into a target cell and expressing the target protein in the cell.
  • the expression cassette means a nucleic acid molecule that directs transcription of the DNA encoding the target protein and enables expression of the target protein.
  • the expression cassette may be included in the vector.
  • vector various vectors generally used in the art can be used, and the vector is not particularly limited and can be appropriately selected depending on the cell to be introduced or the method of introduction.
  • plasmid vectors viral vectors, retroviral vectors, phages, phagemids, cosmids, artificial / minichromas, transposons and the like can be mentioned.
  • the vector or expression cassette contains a regulatory element for regulating transcription of the DNA, and the DNA sequence is operably linked to the regulatory element.
  • Regulatory elements for regulating transcription include, for example, promoters, enhancers, terminators, internal ribosome entry sites (IRESs), polyadenylation signals, poly U sequences and the like.
  • the vector or expression cassette preferably comprises a promoter.
  • the vector or expression cassette may further contain other regulatory elements. Other adjusting elements include, for example, translation enhancers and the like.
  • the regulatory element is not particularly limited and can be appropriately selected by those skilled in the art based on, for example, a host cell or the like.
  • the promoter when the host is a plant cell, the promoter includes CaMV35S promoter, 2xCaMV35S promoter, CaMV19S promoter, NOS promoter and the like, and when the host is an animal cell, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, RSV. Examples thereof include a promoter, MoMuLV LTR promoter, HSV-TS promoter, human translation elongation factor gene promoter, CAG chimeric synthesis promoter and the like.
  • the human translation elongation factor gene promoter, or CAG chimeric synthesis promoter is preferably used to introduce the DNA encoding the Cas protein into animal cells.
  • the vector system or expression cassette system includes a DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, a DNA encoding Cas7d, and a DNA encoding Cas10d, wherein the first vector or expression cassette system is included.
  • the first expression cassette contains at least one DNA selected from the group consisting of DNA encoding Cas3d, DNA encoding Cas5d, DNA encoding Cas6d, DNA encoding Cas7d, and DNA encoding Cas10d.
  • the second vector or the second expression cassette is composed of a group consisting of a DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, a DNA encoding Cas7d, and a DNA encoding Cas10d. Contains at least one DNA of choice.
  • Two or more or all of the DNA encoding the above five Cas proteins Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d and Cas10d may be contained in a single vector or expression cassette, or contained in separate vectors or expression cassettes. It may be. There are no restrictions on the number of vectors or expression cassettes, and the type and combination of Cas proteins encoded by the DNA incorporated into each vector or expression cassette.
  • these DNA sequences are mutually expressed so as to be polycistronically expressed, for example, via a sequence encoding a self-cleaving peptide. It may be connected to.
  • the order in which the two or more DNAs encoding the Cas protein are linked may be any order.
  • the second vector or the second expression cassette is a DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, a DNA encoding Cas7d, and Cas10d. At least one DNA selected from the group consisting of DNAs encoding the above, including DNA not contained in the first vector or first expression cassette.
  • the vector system or expression cassette system may include a first to fifth vector or expression cassette, and encodes a DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, and Cas7d.
  • the DNA and the DNA encoding Cas10d may be contained in separate vectors or expression cassettes.
  • the vector system comprises a first to fifth vector, a DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, a DNA encoding Cas7d, and a DNA encoding Cas10d. May be contained in the above vectors separately. Such an embodiment is preferably used for introducing the DNA encoding the Cas protein into animal cells.
  • the first vector or expression cassette contains a DNA encoding Cas3d and a DNA encoding Cas6d
  • the second vector or expression cassette is a DNA encoding Cas5d, Cas7d.
  • the DNA encoding Cas10d and the DNA encoding Cas10d may be included.
  • the first expression cassette comprises DNA encoding Cas3d and DNA encoding Cas6d
  • the second expression cassette contains DNA encoding Cas5d, DNA encoding Cas7d, and Cas10d.
  • the DNA to be encoded may be contained, and the first expression cassette and the second expression cassette may be loaded in one vector.
  • Such an embodiment is preferably used for introducing the DNA encoding the Cas protein into plant cells.
  • a donor polynucleotide may be introduced into cells in addition to the vector system or expression cassette system containing the DNA encoding the Cas protein and the DNA encoding crRNA or crRNA.
  • the donor polynucleotide comprises at least one donor sequence containing the modification desired to be introduced at the target site.
  • the donor polynucleotide has a sequence that is highly homologous to the sequences upstream and downstream of the target sequence at both ends of the donor sequence (preferably, a sequence that is substantially identical to the sequences upstream and downstream of the target sequence. ) May be included.
  • the donor polynucleotide may be single-stranded or double-stranded DNA. Donor polynucleotides can be appropriately designed by those skilled in the art based on techniques known in the art.
  • cleavage in the target nucleotide sequence can be repaired by non-homologous end binding (NHEJ).
  • NHEJ non-homologous end binding
  • deletions, insertions, or substitutions of at least one nucleotide, or combinations thereof, can occur during repair of the cleavage.
  • the sequence is modified at the target sequence site, thereby inducing a frameshift or immature stop codon, inactivating or knocking out the expression of the gene encoded by the target sequence region.
  • the donor sequence of the donor polynucleotide is inserted into or inserted into the target sequence site by homologous recombination repair (HDR) of the cleaved target nucleotide sequence.
  • HDR homologous recombination repair
  • the vector system or expression cassette system containing the DNA encoding the Cas protein and the crRNA or the DNA encoding the crRNA can be introduced into cells by various means known in the art.
  • the donor polynucleotide may also be introduced into the cell by various means known in the art.
  • transfection for example, calcium phosphate-mediated transfection, electroporation, liposome transfection, etc., virus transduction, lipofection, gene gun, microinjection, Agrobacterium method, agroinfiltration method, PEG-calcium method, etc. Can be mentioned.
  • the vector system or expression cassette system containing the DNA encoding the Cas protein, and the crRNA or the DNA encoding the crRNA may be introduced into the cell simultaneously or continuously.
  • two or more vectors or expression cassettes contained in the above vector system or expression cassette system may be introduced into cells simultaneously or continuously.
  • the donor polynucleotide may be introduced into the cell simultaneously or continuously with the vector system or expression cassette system containing the DNA encoding the Cas protein and the DNA encoding crRNA or crRNA.
  • the cells Upon introduction of the vector system or expression cassette system containing the DNA encoding the Cas protein and the crRNA or the DNA encoding the crRNA into the cells, the cells are cultured under conditions suitable for cleavage at the target sequence site. Will be done. The cells are then cultured under conditions suitable for cell proliferation and maintenance. The same applies when introducing a donor polynucleotide.
  • the culture conditions may be any culture conditions suitable for the species from which the cells to be introduced are derived, and can be appropriately determined by those skilled in the art based on, for example, known cell culture techniques.
  • the site on the target nucleotide sequence is cleaved by the TiD system introduced into the cell, and the target sequence is modified when the cleaved sequence is repaired.
  • the method for modifying a target sequence of the present invention can be used for modifying a target nucleotide sequence on the genome, in which the double-stranded DNA on the genome is cleaved and the target site is modified.
  • the expression of the target gene can be suppressed by selecting at least a part of the sequence of the target gene as the target nucleotide sequence.
  • a method of suppressing the expression of a target gene in a cell which is used in the cell.
  • the vector system comprises a first vector and a second vector.
  • the expression cassette system includes a first expression cassette and a second expression cassette.
  • the first vector or the first expression cassette is selected from the group consisting of DNA encoding Cas3d, DNA encoding Cas5d, DNA encoding Cas6d, DNA encoding Cas7d, and DNA encoding Cas10d.
  • a method is provided in which the second vector or the second expression cassette comprises at least one DNA selected from the group and a second regulatory element that regulates transcription of the DNA.
  • the DNA encoding the above five Cas proteins is present in a vector system or an expression cassette system, that is, in two or more vectors or expression cassettes.
  • the Cas protein acts with the simultaneously introduced crRNA to specifically and efficiently modify the target nucleotide sequence.
  • the target sequence modification method of the present invention is a vector system or expression cassette system containing the above-mentioned first vector or expression cassette and a second vector or expression cassette, the second vector or expression cassette system.
  • the second expression cassette is at least one DNA selected from the group consisting of a DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, a DNA encoding Cas7d, and a DNA encoding Cas10d.
  • a vector system or an expression cassette system containing DNA not contained in the first vector or the first expression cassette is used.
  • At least one DNA selected from the group consisting of a DNA encoding Cas3d, a DNA encoding Cas5d, a DNA encoding Cas6d, a DNA encoding Cas7d, and a DNA encoding Cas10d is the first DNA. It may be contained in both one vector or the first expression cassette and the second vector or the second expression cassette. As described above, when five DNAs encoding Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d and Cas10d are separately contained in two or more different vectors or expression cassettes, the TiD utilizing the vector or expression cassette is contained in the cell. It leads to higher levels of expression of Cas protein, resulting in a stronger target sequence modification effect.
  • the target sequence modification method of the present invention is preferably a vector system containing five vectors, in which the DNAs encoding the above five Cas proteins are contained in different vectors.
  • the vector comprises a human translational elongation factor gene promoter or a CAG chimeric synthesis promoter.
  • one monopartite nuclear localization is performed on the 5'terminal side of the DNA encoding Cas3d, the DNA encoding Cas5d, the DNA encoding Cas6d, and the DNA encoding Cas10d.
  • a sequence encoding a signal has been added, or a sequence encoding a monopartite nuclear localization signal linked in two or three tandems has been added.
  • a sequence encoding a monopartite nuclear localization signal linked in two or three tandems has been added.
  • both the 5'-terminal side and the 3'-terminal side of the DNA encoding Cas3d, the DNA encoding Cas5d, the DNA encoding Cas6d, and the DNA encoding Cas10d are A sequence encoding a vipertite-type nuclear localization signal has been added.
  • a sequence encoding a monopartite nuclear localization signal linked to two or three tandems is located on the 5'end and / or 3'end side of the DNA encoding Cas7d. It has been added.
  • the expression cassette system contains two expression cassettes, and the DNA encoding Cas3d and the DNA encoding Cas6d are contained in the first expression cassette, and the DNA encoding Cas5d.
  • the DNA encoding Cas7d and the DNA encoding Cas10d are included in the second expression cassette, and the first and second expression cassettes are loaded in one vector.
  • the target sequence modification method of the present invention not only the insertion and / or deletion of a short chain region of several bases to several tens of bases is introduced into the target sequence, but also a long chain of several kilobases to several tens of kilobases is introduced. Base deletions in the region can also be introduced.
  • the number of kilobases to several tens of kilobases is not limited, but is, for example, 1000 to 90,000 base length, preferably 2000 to 80,000 base length, more preferably 2000 to 70,000 base length, and further preferably 2000 to 60,000 base length. , 2000 to 50,000 base lengths, 2000 to 40,000 base lengths, 2000 to 30,000 base lengths, or 2000 to 20000 base lengths.
  • Deletions that are too long can result in deletions of non-intended sequences of the target gene (eg, sequences of other adjacent genes) or deletions of the required exon sequence adjacent as well as the target exon region.
  • the deletion is in a moderately long region of "several kilobases to several tens of kilobases" as in the present invention, only the long chain deletion of the gene of interest should be introduced. Can be done. Therefore, using the target sequence modification method of the present invention, it is possible to delete an entire locus by designing one guide RNA.
  • the target sequence modification method of the present invention it is possible to completely eliminate a specific exon even in the presence of a long intron such as an animal gene.
  • the target sequence modification method of the present invention it is possible to collectively delete a group of genes existing adjacent to each other.
  • the target sequence modification method of the present invention it is possible to result in base deletion in the upstream or downstream direction of the PAM sequence, or both upstream and downstream (that is, bidirectional) of the PAM sequence.
  • Kit of the present invention is a kit for use in the above-mentioned method for modifying a target sequence of the present invention, and is a vector system or an expression cassette system containing DNA encoding the above five Cas proteins. And the above crRNA or the DNA encoding the above crRNA.
  • the components of the kit of the present invention are as described in (2) to (5) above.
  • Target sequence targeting method in which the off-target effect of the present invention is suppressed is the above-mentioned target recognition module (Cas5d, Cas6d and Cas7d) or a nucleic acid encoding the Cas protein. And the introduction of the crRNA or the DNA encoding the crRNA into the cells, and from the bases 1, 6, 12, 18, and 24 from the 3'side of the PAM sequence with respect to the target sequence.
  • the target sequence is designed (or selected) so that there is no one base selected from the group, or a similar sequence in which one or two bases after the 24th base are different.
  • the target sequence is relatively short (eg, 30 bases or less), any one base selected from the group consisting of the 6, 12, 18 and 24th bases from the 3'side of the PAM sequence, or 24
  • the target sequence may be designed (or selected) so that there are no similar sequences in which one or two bases after the second are different.
  • the target sequence targeting method in which the off-target effect of the present invention is suppressed may be performed by either in vitro or in vivo.
  • crRNA, the target recognition module and crRNA form a complex, and at the same time, the crRNA forms a base pair with the target nucleotide sequence, and the target recognition module forms a base pair with the target nucleotide sequence.
  • the target nucleotide sequence is targeted in a sequence-specific manner.
  • the target recognition module may be introduced into the cell as an isolated complex containing Cas5d, Cas6d, and Cas7d, or each of Cas5d, Cas6d, and Cas7d alone in the cell as an isolated protein. May be introduced in.
  • the target recognition module may be introduced into cells as nucleic acids encoding the Cas proteins Cas5d, Cas6d, and Cas7d. Examples of the nucleic acid include RNA such as mRNA or DNA.
  • the DNA encoding the Cas protein may be contained, for example, in one or more vectors or expression cassettes, the DNA sequence being preferably operably linked to a regulatory element.
  • a nuclear localization signal sequence is preferably added to the DNA encoding the Cas protein.
  • Two or more or all of the DNAs encoding the Cas proteins Cas5d, Cas6d, and Cas7d may be contained in a single vector or expression cassette, or may be contained in separate vectors or expression cassettes. ..
  • DNA sequences encoding the Cas protein are contained in one vector or expression cassette, these DNA sequences are arranged so as to be polycistronically expressed, for example, via a sequence encoding a self-cleaving peptide. And may be interconnected.
  • the order in which the two or more DNAs encoding the Cas protein are linked may be any order.
  • the vector, expression cassette, regulatory element, nuclear localization signal sequence, etc. are as described in (5) above.
  • the crRNA is as described in (3) above.
  • the target recognition module and crRNA or DNA encoding crRNA can be introduced into cells by various means known in the art.
  • transfection for example, calcium phosphate-mediated transfection, electroporation, liposome transfection, etc., virus transduction, lipofection, gene gun, microinjection, Agrobacterium method, agroinfiltration method, PEG-calcium method, etc. Can be mentioned.
  • the target recognition module and the crRNA or the DNA encoding crRNA may be introduced into the cell simultaneously or continuously.
  • Cas5d, Cas6d, and Cas7d constituting the target recognition module, or nucleic acids encoding each of these Cas proteins may be introduced into cells simultaneously or continuously.
  • the Cas proteins Cas5d, Cas6d and Cas7d synthesized in in vitro or in vivo, respectively, and crRNA synthesized in in vitro or in vivo are incubated in in vitro to form a complex.
  • the complex can be introduced into the cell.
  • the cells Upon introduction of the target recognition module and the crRNA or DNA encoding the crRNA, the cells are cultured under conditions suitable for targeting the target nucleotide sequence. The cells are then cultured under conditions suitable for cell proliferation and maintenance.
  • the culture conditions may be any culture conditions suitable for the species from which the cells are derived, and can be appropriately determined by those skilled in the art based on, for example, known cell culture techniques.
  • Target sequence modification method that suppresses the off-target effect of the present invention comprises the above five Cas proteins or nucleic acids encoding the proteins, and the above crRNA or crRNA. Which of the following is selected from the group consisting of the 1, 6, 12, 18 and 24th bases from the 3'side of the PAM sequence with respect to the target sequence, which comprises introducing the DNA encoding the above into the cell. It is characterized in that the target sequence is designed (or selected) so that there is no similar sequence in which one base or one or two bases after the 24th base are different.
  • the target sequence is relatively short (eg, 30 bases or less), any one base selected from the group consisting of the 6, 12, 18 and 24th bases from the 3'side of the PAM sequence, or 24
  • the target sequence may be designed (or selected) so that there are no similar sequences in which one or two bases after the second are different.
  • modifications include deletion, insertion, or substitution of at least one nucleotide, or a combination thereof.
  • the target sequence modification method that suppresses the off-target effect of the present invention may be carried out by either in vitro or in vivo.
  • a donor polynucleotide may be introduced into cells in addition to the Cas protein and crRNA described above.
  • the donor polynucleotide is as described in (5) above.
  • the Cas protein may be introduced into cells as an isolated complex containing Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d, and Cas10d, or Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d, and Cas10d are each isolated. It may be introduced into cells alone as a protein. Alternatively, it may be introduced into cells as a nucleic acid encoding the Cas proteins Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas3d, and Cas10d. Examples of the nucleic acid include RNA such as mRNA or DNA.
  • the DNA encoding the Cas protein may be contained, for example, in one or more vectors or expression cassettes, the DNA sequence being preferably operably linked to a regulatory element.
  • a nuclear localization signal sequence is preferably added to the DNA encoding the Cas protein.
  • Two or more or all of the DNA encoding the Cas proteins Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d may be contained in a single vector or expression cassette, or may be contained in separate vectors or expression cassettes. You may be.
  • DNA sequences encoding the Cas protein are contained in one vector or expression cassette, these DNA sequences are arranged so as to be polycistronically expressed, for example, via a sequence encoding a self-cleaving peptide. And may be interconnected.
  • the order in which the two or more DNAs encoding the Cas protein are linked may be any order.
  • the vector, expression cassette, regulatory element, nuclear localization signal sequence, etc. are as described in (5) above.
  • the crRNA is as described in (3) above.
  • the introduction of the Cas protein or the nucleic acid encoding the Cas protein, the crRNA or the DNA encoding the crRNA, and the donor polynucleotide into the cell can be performed by various means known in the art.
  • transfection for example, calcium phosphate-mediated transfection, electroporation, liposome transfection, etc., virus transduction, lipofection, gene gun, microinjection, Agrobacterium method, agroinfiltration method, PEG-calcium method, etc.
  • transfection for example, calcium phosphate-mediated transfection, electroporation, liposome transfection, etc.
  • virus transduction lipofection
  • gene gun microinjection
  • Agrobacterium method agroinfiltration method
  • PEG-calcium method etc.
  • the Cas protein or the nucleic acid encoding the Cas protein, the crRNA or the DNA encoding the crRNA, and the donor polynucleotide may be introduced into the cell simultaneously or continuously.
  • Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d, which constitute the RNA-inducible endonuclease, or nucleic acids encoding each of these Cas proteins may be introduced into cells simultaneously or continuously.
  • the cells Upon introduction of the Cas protein or the nucleic acid encoding the Cas protein and the crRNA or the DNA encoding the crRNA, or the Cas protein or the nucleic acid encoding the Cas protein, the crRNA or the DNA encoding the crRNA, and the donor polynucleotide, the cells , Cultivated under conditions suitable for cleavage at the target sequence site. The cells are then cultured under conditions suitable for cell proliferation and maintenance.
  • the culture conditions may be any culture conditions suitable for the species from which the cells are derived, and can be appropriately determined by those skilled in the art based on, for example, known cell culture techniques.
  • M.I Genes derived from the TiD locus derived from aeruginosa (Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, Cas10d) were cloned and used. M. Based on the amino acid sequence information (SEQ ID NOs: 1 to 5) of Cas3d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d derived from aeruginosa, a DNA sequence encoding each Cas protein was artificially synthesized. For the processing and construction operation of the DNA sequence in the examples, any one of artificial gene chemical synthesis, PCR method, restriction enzyme treatment, ligation, and Gibson Assembly method was used. In addition, the Sanger method or the next-generation sequencing method was used to determine the base sequence.
  • the HA-tag was added to Cas3d
  • the Strep-tag was added to Cas5d
  • the Myc-tag was added to Cas6d
  • the FLAG-tag was added to Cas7d
  • the 6xHis-tag was added to Cas10d.
  • all Cas genes were combined in the all-in-one vector pEFs-All by fusion with a sequence encoding a 2A self-cleaving peptide.
  • a pEFs_Cas3d-Cas10d expression vector and a pEFs_Cas6d-Cas5d-Cas7d expression vector (two-set vector) were also constructed by linking to a 2A self-cleaving peptide.
  • the Cas10d gene fragment in the pEFs-Myc-bpNLS-Cas10d-bpNLS-6xHis vector was replaced with the Cas3d, Cas5d, Cas6d and Cas7d gene fragments, respectively, to replace pEFs-Myc-bpNLS-Cas3d-bpNLs-Cas3d-bpNLS-6xH -Cas5d-bpNLS-6xHis, pEFs-Myc-bpNLS-Cas7d-bpNLS-6xHis, and pEFs-Myc-bpNLS-Cas10d-bpNLS-6xHis were obtained.
  • H177A a mutant Cas10d (H177A) expression vector
  • a dCas10d (H177A) fragment was synthesized (IDT) and the wild-type Cas10d fragment pEFs-Myc-bpNLS-Cas10d-bpNLS-6xHis was replaced with dCas10d (H177A).
  • pEFs-myc-bpNLS-Cas (H177A) -bpNLS-6xHis was obtained.
  • the Myc-bpNLS-Cas7d-bpNLS-6xHis fragment in pEFs-Myc-bpNLS-Cas7d-bpNLS was replaced with a 6xHis-myc-Cas7d-bpNLS fragment to obtain pEFs-6xHis-MycCbpN.
  • a DNA fragment containing the repeat-spacer-repeat sequence (SEQ ID NO: 9) was artificially synthesized and cloned under the human U6 promoter in pEX-A2J1 (Eurofins Genomics) to obtain pAEX-hU6 crRNA. Obtained.
  • pAEX-hU6crRNA_mature the two repeat sequences were replaced with predicted processed repeat sequences (SEQ ID NO: 10).
  • two oligonucleotides containing the target sequence were annealed and cloned into a crRNA expression vector using a Golden Gate cloning with the restriction enzyme BsaI (NEB).
  • NLUxxUC_Block1 includes first 351bp and the multiple cloning site of NanoLUC TM (TM) gene (Promega Corp.) sequence. The XbaI site was added to the 5'end of the NanoLUC gene.
  • NLUxxUC_Block2 contains 465 bp at the 3'end of the NanoLUC gene. The XhoI site was added to the 3'end of the NanoLUC gene.
  • Each split-type NLUxxUC reporter was constructed by removing NLUxxUC_Block1 from the pCAG-NLUxxUC vector by XbaI and BamHI digestion and NLUxxUC_Block2 by XbaI and EcoRI digestion. Each digestion vector was assembled with a multicloning site to give pCAG-NLUxxUC_Block1 and pCAG-NLUxxUC_Block2.
  • a DNA fragment containing a repeat-spacer-repeat sequence was cloned under the Arabidopsis U6-26 snRNA promoter in pDONR P3-P2 to obtain pE (L3-L2) AtU6 crRNA. ..
  • the AtU6 promoter-repeat-spacer-repeat fragment in pE (L3-L2) AtU6crRNA was recloned into pEgP1.2-TiD to give pTiDP1.2.
  • intermediate vectors pE (L1-L4) P1.2-Cas3d-Cas6d-GFP and pE (R4-R3) Ppubi4-Cas10d-Cas5d-Cas7d for multisite gatorway assembly were constructed. ..
  • the Cas3d, Cas6d and GFP gene fragments driven by the 2xCaMV35S promoter, and the Arabidopsis HSP18.2 gene terminator were cloned into pDONR P1-P4 to give pE (L1-L4) P1.2-Cas3d-Cas6d-GFP. ..
  • the terminator was cloned into pDONR P4r-P3r to give pE (R4-R3) Ppubi4-Cas10d-Cas5d-Cas7d.
  • the Cas protein was eluted in a buffer (20 mM HEPES pH 7.5, 150 mM KCl, 1 mM DTT, 10% glycerol).
  • the nuclease reaction was performed in buffers [10 mM HEPES pH 7.5, 75 mM KCl, 0.5 mM DTT, 5% glycerol, 2 mM ATP, 100 ⁇ M NiCl 2 , 100 ⁇ M CoCl 2 , 1xCut Smart Buffer (New England Biolabs Japan, 4N, manufactured by New England Biolabs Japan). 0.75 ⁇ M Cas protein] at 37 ° C. for 30 minutes, 1 hour and 2 hours.
  • Chloroform was added to stop the reaction, and then chloroform extraction was performed.
  • the aqueous phase was separated, mixed with a gel loading die Purple (6X) (NEB) and then subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel. DNA was visualized by staining with GelRed® Nucleic Acid Gel Stein (Biotium, USA). The experiment was independently repeated 3 times with similar results.
  • HEK293T cells were seeded on 96-well plates (Corning) at a density of 2.0x10 4 cells / well. Cells were transfected using TurboFect Transmission Regent (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's recommended protocol. For each well of the 96-well plate, (1) the pGL4.53 vector (Promega, USA) encoding the Fluc gene, (2) the pCAG-nLUxxUC vector with the target DNA fragment inserted, and (3) the TiD component were encoded. A total of 200 ng of plasmid DNA containing the plasmid DNA was used.
  • NanoLuc and Fluc luciferase activity was measured 3 days after transfection using the Nano-Glo® Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega). Firefly (Fluc) activity was used as an internal control. The NanoLuc / Fluc ratio was calculated for each sample and compared to the NanoLuc / Fluc ratio of control samples transfected with untargeted gRNA. Relative NanoLuc / Fluc activity was used to assess gRNA activity. The experiment was independently repeated 3 times with similar results.
  • the extracted protein was quantified using PierceTM BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). Samples were mixed with 4x Laemmli Sample buffer (Bio-Rad, USA) and 2.5% ⁇ -mercaptoethanol and then heat treated at 95 ° C. for 5 minutes. The denatured protein was loaded onto a 12% SDS-PAGE gel containing Tris-Glycine-SDS buffer [0.25M Tris, 1.92M glycine, 1% (w / v) SDS] and SDS-PAGE at 150V for 60 minutes. Separated by.
  • the protein was transferred onto an Immuno-P polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Millipore, USA) at 50 V for 2 hours in a Tris-glycine-SDS buffer containing 20% methanol.
  • the blot was washed 3 times in 5 minutes with TTBS (25 mM Tris, 137 nM NaCl, 2.68 nM KCl) and blocked in Blocking One (Nacalai Tesque, Japan) for 60 minutes at room temperature.
  • the primary antibody reaction was carried out at room temperature for 60 minutes.
  • Anti-DDDDDK-tag mAb (1: 10,000) (MBL, Japan), anti-HA-tag mAb (1: 10,000) (MBL), anti-His-tag mAb (1: 10,000) ( MBL), anti-Myc-tag mAb (1: 10,000) (MBL), anti-Strept-tag mAb (1: 1000) (MBL), anti- ⁇ -actin mAb (1: 10000) (MBL).
  • the experiment was independently repeated 3 times with similar results.
  • Protein extraction was performed 48 hours after transfection according to the protocol described in Katoh et al., (2015) J. Cell Sci., 128, 2351-2362. Simply put, the medium is a lysis buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.1% on) containing Protease Inhibitor Cocktail for Use with Mammalian Cell and Tissue Extracts (Nacalai Tesque). It was replaced with (w / v) glycerol) and incubated on ice for 5 minutes. Cell lysates were mixed by pipetting, transferred to 1.5 ml tubes and then incubated on ice for 15 minutes.
  • a lysis buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 0.1% on) containing Protease Inhibitor Cocktail for Use with Mammalian Cell and Tissue Extracts (Nacalai Tesque). It was replaced with (w / v) glycerol) and incubated on ice for 5 minutes. Cell lysates were mixed by
  • Plant transformation Tomato plant (Solanum lycopersicum L.) cv. Micro-Tom and Ailsa Craig were used in site-specific mutagenesis experiments. The plants were grown in a growing chamber at 24 ° C. for 16 hours 4000-6000 lx irradiation / 8 hours dark conditions.
  • Transgenic tomato plants were prepared using a TiD vector for plants. Leaf discs derived from tomato cotyledons were transformed with the Agrobacterium tumefaciens GV2260 strain carrying the TiD vector. Transgenic callus and shoots were selected and regenerated according to the method of Ueta et al. (Supra) on MS medium containing 100 ⁇ g / mL kanamycin.
  • DNA Deletion Analysis by Long Range PCR In order to detect DNA deletion in HEK293T cells, long-chain DNA region PCR and a pool of long-chain DNA region PCR products were cloned. First, genomic DNA was extracted from HEK293T cells using the Genome Plus® Genomic DNA Exhibition Miniprep System (Biogene-BioTek, Taiwan). Next, nested PCR was performed to specifically amplify the long DNA region. First, several specific primer sets for long-chain DNA region PCR designed to amplify target DNA regions of various lengths (3.5 kb to 25 mb) using the extracted genomic DNA as a template. (Table 5) was used to amplify the target DNA region.
  • the first PCR reaction was performed using KOD ONE Master Mix (TOYOBO, Osaka, Japan) under the following conditions. 35 cycles of 10 seconds 98 ° C, 5 seconds 60 ° C and 50 seconds (amplicon: 15-20 kb) or 150 seconds (amplicon: 10-15 kb) or 200 seconds (amplicon: ⁇ 10 kb) 68 ° C.
  • the PCR product was then diluted 100-10,000 times and used as a template for nested PCR. Nested PCR was also performed under the same conditions as above. PCR products were separated by electrophoresis on a 1% agarose gel and visualized by staining with GelRed® Nucleic Acid Gel Stein (Biotium).
  • Nested PCR products were pooled and purified using Monofas® DNA purification Kit I (GL Sciences, Japan).
  • a purified mixture of PCR products was cloned into a pMD20-T vector using a Mighty TA-cloning Kit (Takara Bio, Japan).
  • 119 clones for AAVS-tid GTC_70-107 (+) and 20 clones for hEMX1-tid GTT_9 (-) were picked up and sanger sequenced using M13 Uni and M13 RV primers.
  • the results of Sanger sequencing were analyzed using a Blatná search and the ClustalW program to identify DNA deletions.
  • SlRIN GTC_4003 from 20 T0 transgenic TiD tomato calluses for SlIAA9 GTC_gRNA1 (+) and GTT + GTT_gRNA5 (-) (+) independently for mutation analysis by long-chain DNA region PCR in tomato plants.
  • SlIAA9 GTC_gRNA1 (+) and GTT + GTT_gRNA5 (-) (+) independently for mutation analysis by long-chain DNA region PCR in tomato plants.
  • -4238 (+) 30 T0 callus and 12 T0 shoots were isolated using NucleoSpin® Plant II (TaKaRa Bio).
  • TaKaRa Bio NucleoSpin® Plant II
  • a region of about 5-6 kbp containing the target site of each gRNA was subjected to PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (TaKaRa Bio) and several primer sets for long DNA region PCR (Table 5).
  • Nested PCR was performed for SlIAA9 GTT + GTT_gRNA5 (-) (+) and SlRIN GTC_4003-4238 (+) transgenic callus, and only small DNA fragments separated on an agarose gel were extracted from the gel and purified for further analysis. ..
  • SlRIN GTC_4003-4238 (+) transgenic shoots nested PCR was performed twice using the same primer set and small DNA fragments were extracted after gel electrophoresis. Cloning of the extracted fragment was performed as described above. Each cloned plasmid was analyzed by Sanger sequencing. The number of clones for sequencing was different for each sample as described in the results.
  • the PCR amplicon was also cloned into a TA cloning vector (TaKaRa Bio) and sequenced by the Sanger method. Amplicon deep sequences for on-target and off-target mutation analysis were performed using Multiplex identifiers-labelled PCR (Ueta et al., 2017, supra). The PCR product was subjected to Truseq on the MiSeq platform (Illumina, USA). MiSeq data was analyzed using CLC Genomics Workbench software version 7.5.1 (CLC bio, Denmark). All primers for short-region PCR used in the mutation analysis are shown in Table 4.
  • Example 1 Identification of the nuclease module of the TiD system M.I.
  • the components of the Cas effector protein derived from aeruginosa and the crRNA sequence were evaluated using the BLAST program.
  • M. The CRISPR / Cas TiD locus of the aeruginosa PCC9808 strain spans 7.6 kb and consists of eight Cas genes: Cas1d, Cas2d, Cas3d, Cas4d, Cas5d, Cas6d, Cas7d, and Cas10d, followed by 36 repeat-spacer units. Become.
  • Cas3d did not have an HD domain that functions in DNA cleavage of CRISPR types I-A, B, C, E and F systems, but Cas10d has an HD-like nuclease domain in its N-terminal region.
  • ATP and metal ions Ni 2+ and Co 2+
  • An in vitro nuclease assay was performed in the presence. As a result, it was shown that Cas10d can cleave single-stranded DNA, and that Cas10d acts as a nuclease in the TiD system (Fig. 1).
  • Example 2 Biological activity of TiD as a genome editing tool in cells (1) Endonuclease activity of TiD Each single Cas expression vector and crRNA expression vector are infected with HEK293T cells, and Cas3d, by a pull-down assay, It was confirmed that Cas5d, Cas6d, Cas7d and Cas10d and crRNA form an in vivo complex.
  • a luciferase (luc) reporter assay using a luciferase single-strand annealing (SSA) recombination system was performed (Fig. 2a).
  • NanoLuc luciferase containing a human AAVS1 gene fragment containing a 300 bp homology arm separated by a stop codon and a TiD target site was used as the recombination reporter.
  • Each single Cas expression vector, TiD crRNA expression vector, and LUC reporter vector into which the target sequence was introduced were co-transfected into HEK293T cells, and endonuclease cleavage was detected by luminescence 72 hours after transfection.
  • the target sequences used are shown in Table 2.
  • a TiD Cas gene expression vector containing dCas10d having a mutation (H177A) in the wild-type Cas10d and the HD-like domain and gRNA AAVS1 GTC_70-170 (+) and AAVS1 GTC_159-196.
  • a luc reporter assay was performed using (+) and non-target gRNAs.
  • Cas10d actually has a nuclease activity that can be used for genome editing in cells.
  • Expression of TiD resulted in significantly higher (2-4 fold) activity in the luc reporter assay than non-target controls (FIGS. 2b-2e).
  • a TiD Cas gene other than Cas10d or Cas3d was transfected into HEK293T cells, the luciferase activity was comparable to that of the non-target control (Fig. 2c). This result indicates that Cas10d is essential for the activity of TiD in addition to Cas3d.
  • M. Specific genomic DNA was targeted at the original CRISPR locus of the aeruginosa PCC9808 strain using both 35 and 36 base protospacer sequences.
  • TiD activity was assessed using either 35 or 36 base gRNAs, both gRNAs functioning for genome editing in cells (Fig. 2d). TiD activity was also tested using either mature crRNA or pre-mature crRNA (Fig. 2e). As a result, it was found that the expression of premature crRNA is effective in TiD.
  • TiD target sequence design Furthermore, important nucleotides in the TiD target gRNA sequence required for genome editing were evaluated using a split-type vector and a luc reporter assay in HEK293T cells. Simply put, AAVS1 _ GTC _ 70-107 (+) target gRNAs with mutations at each position of the 35 base sequence adjacent to the PAM sequence were prepared, and TiD activity using each gRNA was measured by a luc reporter assay. .. The results are shown in FIG. 3a. As a result, TiD activity was retained even when there was a nucleotide mismatch at the 1, 6, 12, 18 or 24 nt position on the PAM sequence 3'side.
  • bpNLS functioned more effectively by adding to both the N- and C-termini of Cas3d, Cas5d, Cas6d, and Cas10d than to adding to the N-terminus or C-terminus alone (Fig. 4b).
  • bpNLS added to Cas7d was strongly expressed in the nucleus (Fig. 4d), it disrupted TiD activity (Fig. 4b).
  • SV40NLS functioned effectively by adding each Cas protein to the N-terminus (Fig. 4a).
  • Example 3 Optimization of TiD Expression Vectors in Animal Cells
  • the expression level of Cas protein in HEK293T cells was re-evaluated.
  • Several types of TiD Cas gene expression vectors [separate expression vectors for each Cas gene, two-set vectors containing three gene (Cas5-Cas6-Cas7) expression cassettes and two gene (Cas3-Cas10) expression cassettes, respectively. And an all-in-one vector containing a 5 gene (total Cas) expression cassette] was constructed (Fig. 5a).
  • Cas3 and Cas10 in the two-set vector, or Cas5, Cas6 and Cas7, and all Cas genes in the all-in-one vector are fused via a 2A self-cleaving peptide to yield a single transcript that is co-expressed.
  • SV40NLS with different tags was added to the N-terminus of each Cas gene.
  • Various combinations of each of the above Cas expression vectors and two-set vectors, or all-in-one vectors were transfected into HEK293T cells to measure the expression of each Cas protein in the cells. Expression levels were detected by Western blotting using antibodies specific for each tag fused to Cas (Fig. 5b).
  • the Cas protein expression level when the translation elongation factor 1 ⁇ promoter in the pEF vector and the chicken ⁇ -actin promoter in the pCAG were used was similarly detected (Fig. 5c).
  • Example 4 Inducing long-chain region deletion by a genome-editing TiD system induced by CRISPR TiD in animal cells was examined using the luciferase SSA assay.
  • targets hEMX1 GTT9 ( ⁇ ) for the human EMX1 gene and AAVS GTC_70-107 (+) for the AAVS gene were selected.
  • the above target sequence was integrated into a gRNA expression vector and transfected into HEK293T cells with each single Cas expression vector. DNA fragments were PCR amplified from the total DNA of HEK293T cells with a TiD system using several primer sets located on the flanks of hEMX1 and 5-19 kb near the AAVS target site (Table 5) (FIGS. 6a, 6b). , Clone and sequenced by Sanger method. The results are shown in FIGS. 6ac.
  • FIGS. 6c, 7a, b Sexual deletions were detected (FIGS. 6c, 7a, b). These characteristics were different from those after mutation by type IE (Non-Patent Document 1) and type II effectors (Cas9 and Cpf1). Microhomology and insertions were also observed at the TiD mutation site (FIGS. 6a, 7a, b). Mutation rates for long-chain region deletion by TiD in cloned DNA fragments were 55.0% and 57.1% for hEMX1 GTT_9 (-) and AAVS GTC_70-107 (+), respectively.
  • Example 5 Target mutagenesis by TiD in plants
  • a TiD vector containing a plant cell-specific promoter and crRNA for codon-optimized Cas gene expression was constructed to introduce site-specific mutagenesis into tomato plants. ..
  • As TiD vectors a vector containing 5 Cas genes in a single expression cassette (pTiDP1.2) and a vector containing 5 Cas genes divided into 2 expression cassettes (pMGTiDP20) were constructed (FIG. 8b).
  • the TiD gRNA was designed to target the 35 nucleotide sequences in the tomato IAA9 (SlIAA9) gene (important for parthenocarpy) and the tomato RIN (SlRIN) gene (involved in fruit maturation).
  • a luc reporter assay was performed to select GTT_gRNA5-A ( ⁇ ) and GTC_gRNA1 (+) (FIG. 8a). Both a single gRNA for GTC_gRNA1 (+) and multiple gRNAs for GTT_gRNA5-A (-) and GTT_gRNA5-B (+) (Table 2) were used for further analysis.
  • the designed gRNA-containing TiD vector was transformed into the tomato cultivar Micro-Tom or Ailsa Craig by Agrobacterium-mediated transformation. Mutations efficiently introduced by TiD in transgenic tomato curls were analyzed by Cel-1, PCR-RFLP, long DNA region PCR, and sequencing.
  • TiD allows for long-region chromosomal editing that allows simple and effective multi-gene function screening.
  • CRISPR toolbox As a new technology in the CRISPR toolbox, TiD opens up new possibilities in genome editing.
  • SEQ ID NO: 1 Microcystis aeruginosa Cas3d amino acid sequence SEQ ID NO: 2; Microcystis aeruginosa Cas5d amino acid sequence SEQ ID NO: 3; Microcystis aeruginosa Cas6d amino acid sequence SEQ ID NO: 4; Microcystis aeruginosa Cas7d amino acid sequence SEQ ID NO: 5; Microcystis aeruginosa Cas10d amino acid sequence SEQ ID NO: 6; Monopartite nuclear localizing signal (NLS) amino acid sequence SEQ ID NO: 7; Bipartite NLS amino acid sequence SEQ ID NO: 8; TiDcrRNA containing repeat (37b) and spacer (35b of N).
  • NLS nuclear localizing signal
  • N is any nucleotides a sequence that forms base pairs with a target nucleotide sequence SEQ ID NO: 9; DNA fragment for pre-mature crRNA SEQ ID NO: 10; DNA fragment for mature crRNA SEQ ID NO: 47; Primer SEQ ID NO: 48; Primer SEQ ID NO: 49; Primer SEQ ID NO: 50; Primer SEQ ID NO: 51; Primer SEQ ID NO: 52; Primer SEQ ID NO: 53; Primer SEQ ID NO: 54; Primer SEQ ID NO: 55; Primer SEQ ID NO: 56; Primer SEQ ID NO: 57; Primer SEQ ID NO: 58; Primer SEQ ID NO: 59; Primer SEQ ID NO: 60; Primer SEQ ID NO: 61; Primer SEQ ID NO: 62; Primer SEQ ID NO: 63; Primer SEQ ID NO: 64; Primer SEQ ID NO: 65; Primer SEQ ID NO: 66; Primer SEQ ID NO: 67; Primer SEQ ID

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Abstract

細胞内の標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、該細胞に、（ｉＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含むベクター系又は発現カセット系、及び（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを導入することを含み、前記ベクター系が、第一のベクター及び第二のベクターを含み、前記発現カセット系が、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含み、前記第一のベクター又は前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第一の調節エレメントを含み、前記第二のベクター又は前記第二の発現カセットが、前記群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第二の調節エレメントを含む、方法等が提供される。

Description

ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄシステムを利用した標的配列改変技術
　本発明は、ＣＲＩＳＰＲ（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）タイプＩ－Ｄシステムを利用した標的ヌクレオチド配列を特異的に改変する方法、および該方法に用いられるＣａｓ（CRISPR-associated）タンパク質およびｃｒＲＮＡ（CRISPR RNA）を含むキットに関する。
　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、ウイルス、プラスミドおよびその他の外来遺伝子エレメントから細菌および古細菌を保護する、細菌および古細菌に見られる獲得免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、該システムを構成しているＣａｓタンパク質および分子メカニズムの違いによって、２つのクラス、６つの異なるタイプ（Ｉ～ＶＩ）、および少なくとも１６種類のサブタイプに分類される。
　タイプＩおよびＩＩシステムのメカニズムでは、ｃｒＲＮＡとＣａｓエフェクタータンパク質との複合体が、外来ＤＮＡ中のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短い（典型的には３～５塩基長の）配列エレメントを認識する。タイプＩまたはＩＩ　ｃｒＲＮＡとＣａｓエフェクタータンパク質との複合体は、ＰＡＭ認識後、局所的にＤＮＡ対合を崩壊してＲ－ループ構造を形成し、ｃｒＲＮＡガイドエレメントが相補的な標的鎖と塩基対を形成して非標的ＤＮＡ鎖と置き換わる。該ｃｒＲＮＡ－Ｃａｓ複合体による二本鎖ＤＮＡ標的の結合および巻き戻しが、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９およびＣａｓ１２ヌクレアーゼなどのタイプ特異的ＣａｓエフェクターヌクレアーゼによるＤＮＡ切断および分解に必要とされる。
　ＣＲＩＳＰＲタイプＩには、種々のサブタイプが存在する。クラス１システムには、Ｃａｓｃａｄｅ（CRISPR-associated-complex for antiviral defense）と呼ばれる、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７およびＣａｓ８などの標的認識モジュールと、Ｃａｓ３などのＤＮＡ切断モジュールが存在する（非特許文献１）。ゲノム編集技術において、クラス１　ＣＲＩＳＰＲシステムは、クラス２よりも一般的ではないが、ゲノム編集ツールとして、例えば長い領域のゲノム欠失および長いｇＲＮＡ配列を包含する多様な変異プロフィールなど、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１と比べていくつかの利点を有する可能性が示唆された（非特許文献１）。今までに研究されたクラス１　タイプＩ－Ｅ　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ３システムでは、２－３００ｂから１００ｋｂの塩基欠失が主にＰＡＭ配列の５’上流側に生じることが報告された（非特許文献１）。
　クラス１システム内のゲノム編集ツールの新たな候補を見出すために、発明者らは以前に、ＣＲＩＳＰＲクラス１タイプＩのサブタイプ：タイプＩ－Ｄ（以下、「ＴｉＤ」いう）システムをコードするＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座を同定し、該システムがＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄの５つのＣａｓタンパク質を含むことを見出した（特許文献１）。しかしながら、ＴｉＤシステムがどのようにＤＮＡを分解するのかは不明であった。
国際公開第２０１９／０３９４１７
Dolan, A.E. et al. Mol Cell 74, 936-950 (2019)
　本発明は、ＴｉＤシステムの作用機序を解明し、それにより、ＴｉＤシステムを利用した、より効率的な標的配列改変方法を開発することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、ＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤシステムは、Ｃａｓ３エフェクタータンパク質（Ｃａｓ３ｄ）を含有するが、該タンパク質はヌクレアーゼドメインを欠き、その代わり、Ｃａｓ１０ｄが典型的なヌクレアーゼドメインを有することを見出した。Ｃａｓ１０ｄは、他のＣＲＩＳＰＲシステムでは見られないＴｉＤに特有のエフェクタータンパク質である。さらに、特定の類似配列を有しない標的配列を選択することによって、ＴｉＤシステムのオフターゲット効果を減少させることができることを見出した。
　したがって、本発明は、下記の態様を提供する。
［１］細胞内の標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、該細胞に、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含むベクター系又は発現カセット系、及び
　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
　前記ベクター系が、第一のベクター及び第二のベクターを含み、
　前記発現カセット系が、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含み、
　前記第一のベクター又は前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第一の調節エレメントを含み、
　前記第二のベクター又は前記第二の発現カセットが、前記群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第二の調節エレメントを含む、方法、
［２］細胞内の標的遺伝子の発現を抑制するための方法であって、前記標的ヌクレオチド配列が標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列である、［１］記載の方法、
［３］前記Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの５’末端および／または３’末端側に核移行シグナルをコードする配列が付加されている、［１］または［２］記載の方法、
［４］前記核移行シグナルが、モノパータイト型核移行シグナルまたはバイパータイト型核移行シグナルである、［３］記載の方法、
［５］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがベクター系に含まれ、前記第一のベクターが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端側に、１個のモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されているか、あるいは２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、［４］記載の方法、
［６］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがベクター系に含まれ、前記第一のベクターが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端側及び３’末端側の両方に、バイパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、［４］記載の方法、
［７］前記第二のベクターがＣａｓ７ｄをコードするＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端および／または３’末端側に、２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、［５］又は［６］記載の方法、
［８］前記第一の調節エレメントおよび／または前記第二の調節エレメントが、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーター又はＣＡＧキメラ合成プロモーターである、［１］～［７］のいずれか１項記載の方法、
［９］前記ベクター系が第三ないし第五のベクターをさらに含み、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがそれぞれ別々に第一ないし第五のベクターに含まれる、［１］～［８］のいずれか１項記載の方法、
［１０］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡが発現カセット系に含まれ、前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ及びＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡを含み、前記第二の発現カセットが、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含み、かつ、前記第一の発現カセット及び前記第二の発現カセットが１つのベクターに搭載されている、［１］～［４］のいずれか１項記載の方法、
［１１］前記ｃｒＲＮＡ又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡの細胞への導入がベクターを介して行われる、［１］～［１０］のいずれか１項記載の方法、
［１２］前記ｃｒＲＮＡがプレ成熟型ｃｒＲＮＡである、［１］～［１１］のいずれか１項記載の方法、
［１３］前記Ｃａｓ３ｄ、前記Ｃａｓ５ｄ、前記Ｃａｓ６ｄ、前記Ｃａｓ７ｄ及び前記Ｃａｓ１０ｄがＭ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のものである、［１］～［１２］のいずれか１項記載の方法、
［１４］前記細胞が真核細胞である、［１］～［１３］のいずれか１項記載の方法、
［１５］改変が塩基の欠失、挿入、又は置換である、［１］～［１４］のいずれか１項記載の方法、
［１６］改変が数キロベース～数十キロベースの欠失である、［１５］記載の方法、
［１７］細胞内の標的ヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含むベクター系又は発現カセット系、及び
　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を含み、
　前記ベクター系が、第一のベクター及び第二のベクターを含み、
　前記発現カセット系が、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含み、
　前記第一のベクター又は前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第一の調節エレメントを含み、
　前記第二のベクター又は前記第二の発現カセットが、前記群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第二の調節エレメントを含む、キット、
［１８］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがベクター系に含まれ、前記ベクター系が第三ないし第五のベクターをさらに含み、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがそれぞれ別々に第一ないし第五のベクターに含まれる、［１７］記載のキット、
［１９］Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡが発現カセット系に含まれ、前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ及びＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡを含み、前記第二の発現カセットが、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含む、［１７］記載のキット、
［２０］細胞内の標的ヌクレオチド配列を特異的に標的化する方法であって、該細胞に、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ及びＣａｓ７ｄ、又はこれらのタンパク質をコードする核酸、及び
　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
　前記標的ヌクレオチド配列は、該標的ヌクレオチド配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から１、６、１２、１８及び２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つ又は２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように設計される、方法、
［２１］細胞内の標的ヌクレオチド配列を特異的に改変する方法であって、該細胞に、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ及びＣａｓ１０ｄ、又はこれらのタンパク質をコードする核酸、及び
　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
　前記標的ヌクレオチド配列は、該標的ヌクレオチド配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から１、６、１２、１８及び２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つ又は２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように設計される、方法、および
［２２］前記標的ヌクレオチド配列は、該標的ヌクレオチド配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から６、１２、１８及び２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つ又は２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように設計される、請求項２０又は２１記載の方法。
　本発明によれば、特定のＤＮＡを標的化するように操作されたＴｉＤ　ｃｒＲＮＡを含むＴｉＤシステムを用いることにより、細胞、好ましくは動物および植物細胞において効率的に部位特異的変異を誘導することができる。驚くべきことに、本発明によれば、ＴｉＤシステムのＣａｓエフェクタータンパク質の発現量を向上させることができ、短い領域の挿入および／または欠失を誘導するだけでなく、数キロベースないし数十キロベースの長い領域の塩基欠失および二方向性（bi-directional）の塩基欠失も誘導することができる。さらに、ＴｉＤシステムを用いると、生じた変異トランスジェニック生物における所望の表現型が、次世代に遺伝的に伝達される。さらに、本発明の方法によれば、オフターゲット効果を抑制した、標的配列の特異的な標的化および改変がもたらされる。したがって、本発明は、ＴｉＤシステムのＣＲＩＳＰＲエフェクターモジュール経路を用いる、生物、特に真核生物のための、新規なゲノム編集ツールを提供する。
イン・ビトロＤＮＡ切断アッセイにおけるＣａｓ１０ｄ活性の検出結果。Ｃｔｒｌ：Ｃａｓタンパク質を用いないコントロールアッセイ。矢印：消化されていないＤＮＡ。 ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるゲノム編集を検出するために使用されたルシフェラーゼレポーターアッセイの概略図。 Ｃａｓ１０ｄのＨＤドメインの効果を示す。上図：白色バーは、野生型Ｃａｓ１０ｄを用いるＴｉＤシステムのｌｕｃレポーターアッセイを示し、黒色バーは、ＨＤ－変異ｄＣａｓ１０ｄ（Ｈ１７７Ａ）を用いるＴｉＤシステムのｌｕｃレポーターアッセイを示す。データは、独立実験（ｎ＝４）の平均±Ｓ．Ｅ．である。アスタリスクは、スチューデントｔ検定によって決定された統計学的有意差を示す。＊Ｐ＜０．０７。下図：Ｎ末（Ｍｙｃ）またはＣ末（Ｈｉｓ）融合タグに対する抗体によって検出されたＣａｓ１０ｄおよびｄＣａｓ１０ｄの発現レベルを示す。Ｃａｓ１０ｄおよびｄＣａｓ１０ｄについて、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄまたはｄＣａｓ１０ｄ（Ｈ１７７Ａ）－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、およびｐＥＦｓ－ＳＶ４０ＮＬＳ　ＨＡ－Ｃａｓ３ｄ、Ｓｔｒｅｐｔ－Ｃａｓ５ｄ、Ｍｙｃ－Ｃａｓ６ｄ、またはＦＬＡＧ－Ｃａｓ７ｄをｌｕｃレポーターアッセイに用いた。 Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄの両方がＴｉＤ活性に必要とされることを示す。黒色バー：非標的ｇＲＮＡ。他のｇＲＮＡｓは、表２に示されるＡＡＶＳ遺伝子座を標的とする。データは、独立実験（ｎ＝３）の平均±Ｓ．Ｅ．である。スチューデントｔ検定によって決定された、＊Ｐ＜０．０１および＊＊Ｐ＜０．０５。 ＴｉＤ活性に対するｇＲＮＡ標的配列長の影響を示す。データは、独立実験（ｎ＝４）の平均±Ｓ．Ｅ．である。スチューデントｔ検定によって決定された、＊Ｐ＜０．００５、＊＊Ｐ＜０．０１、および＊＊＊Ｐ＜０．０５。 ＴｉＤシステムに使用されるｃｒＲＮＡ構造の影響を示す。データは、独立実験（ｎ＝４）の平均±Ｓ．Ｅ．である。スチューデントｔ検定によって決定された、＊Ｐ＜０．０１および＊＊Ｐ＜０．０５。 ＴｉＤのゲノム編集活性における決定的なヌクレオチドの評価。上図；ＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）の標的配列に対し、ｇＲＮＡ配列の様々な位置に１塩基のミスマッチを含む各ｇＲＮＡを用いて行ったｌｕｃレポーターアッセイの結果を示す。下図：ＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）の標的ｇＲＮＡ配列における決定的なヌクレオチドを示す。データは、独立実験（ｎ＝３）の平均±Ｓ．Ｅ．である。スチューデントｔ検定によって決定された、＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．００５、および＊＊＊Ｐ＜０．０１。 標的に対して２塩基のミスマッチを含むｇＲＮＡによるＴｉＤのゲノム編集活性の評価。ＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）の標的配列に対し、ｇＲＮＡ配列の様々な位置に２塩基のミスマッチを含むｇＲＮＡを用いて行ったｌｕｃレポーターアッセイの結果を示す。データは、独立実験（ｎ＝３）の平均±Ｓ．Ｅ．である。スチューデントｔ検定によって決定された、＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．００５、および＊＊＊Ｐ＜０．０１。 標的に対して３塩基のミスマッチを含むｇＲＮＡによるＴｉＤのゲノム編集活性の評価。ＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）の標的配列に対し、ｇＲＮＡ配列の様々な位置に３塩基のミスマッチを含むｇＲＮＡを用いて行ったｌｕｃレポーターアッセイの結果を示す。データは、独立実験（ｎ＝３）の平均±Ｓ．Ｅ．である。スチューデントｔ検定によって決定された、＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．００５、および＊＊＊Ｐ＜０．０１。 標的に対して１塩基のミスマッチを含む３０ｂ長のｇＲＮＡによるＴｉＤのゲノム編集活性の評価。ＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）の標的配列に対し、３０ｂ長のｇＲＮＡ配列の様々な位置に１塩基のミスマッチを含むｇＲＮＡを用いて行ったｌｕｃレポーターアッセイの結果を示す。データは、独立実験（ｎ＝３）の平均±Ｓ．Ｅ．である。スチューデントｔ検定によって決定された、＊Ｐ＜０．００１、＊＊Ｐ＜０．００５、および＊＊＊Ｐ＜０．０１。 ＴｉＤ活性に対するＣａｓタンパク質の核移行シグナルの影響を示す。左：Ｃａｓ発現ベクターカセットの構造。Ｎ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ；Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄそれぞれにおける、異なるタグを有するＮ末端のＳＶ４０ＮＬＳ。Ｎ－Ｃａｓ－Ｃ－ｂｐＮＬＳ；Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄそれぞれにおける、Ｎ末端のＭｙｃタグおよびＣ末端の６ｘＨｉｓタグの両方を有するｂｐＮＬＳ。右：ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｌｕｃレポーターアッセイによって決定された、ＡＡＶＳの種々のｇＲＮＡ標的に対するＴｉＤ活性における、Ｃａｓタンパク質のＮＬＳの影響を示す。データは、独立実験（ｎ＝４）の平均±Ｓ．Ｅ．である。＊Ｐ＜０．１および＊＊Ｐ＜０．０５は、スチューデントｔ検定によって決定された。 左：各ＣａｓのＮ末端にＳＶ４０ＮＬＳを付加した場合と比べて、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端およびＣ末端の両方に付加したｂｐＮＬＳが有効に機能したことを示す。しかしながら、Ｃａｓ7ｄに付加したｂｐＮＬＳはＴｉＤ活性を破壊した。データは、Ｃａｓ７ｄの不活性化が図４ａにおけるＴｉＤ活性抑制に影響したことを示唆する。データは、独立実験（ｎ＝４）の平均±Ｓ．Ｅ．である。＊Ｐ＜０．０１、＊＊Ｐ＜０．０５、および＊＊＊Ｐ＜０．０７は、スチューデントｔ検定によって決定された。右：ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｌｕｃレポーターアッセイによって決定された、ＡＡＶＳの種々のｇＲＮＡ標的に対するＴｉＤ活性における、Ｃａｓ７ｄのｂｐＮＬＳの影響を示す。 ｌｕｃレポーターアッセイにおいて使用されたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出されたＣａｓ－ＮＬＳタンパク質のタンパク質ブロット分析を示す。Ｃ；サイトソルフラクション。Ｎ；核フラクション。 ｌｕｃレポーターアッセイにおいて使用されたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出されたＣａｓ－ＮＬＳタンパク質のタンパク質ブロット分析を示す。Ｃ；サイトソルフラクション。Ｎ；核フラクション。 ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノム編集を用いるＣａｓ発現ベクターの構造を示す。Ｎ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ；Ｎ末端に異なるタグを有するＳＶ４０ＮＬＳを付加した、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ。２Ａ；自己切断ペプチド。ｐｒｏｍｏｔｅｒ；プロモーター。Ｔｅｒ；ターミネーター。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＣａｓタンパク質の発現レベルのウェスタンブロッティング結果。Ｃ；ベクター無しのコントロール。ＥＶ；空のベクター（ｇＲＮＡ無し）のコントロール。１；個々のＣａｓ発現カセットが個々のベクターに分けられた。２；Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄが同じベクター中に挿入され、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄが同じベクター中に挿入されて、セパレート型ベクターとしてＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトされた。３；Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄが同じベクター中に挿入され、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄがそれぞれ別々のベクター中に挿入されて、セパレート型ベクターとしてＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトされた。４；Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄがそれぞれ別々のベクター中に挿入され、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄが同じベクター中に挿入されて、セパレート型ベクターとしてＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトされた。５；全Ｃａｓ発現カセットを含むオールインワン型ベクター。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における異なるプロモーターを用いたＣａｓ５ｄおよびＣａｓ６ｄ発現レベルのウェスタンブロッティング結果。Ｃ；ベクター無しのコントロール。 ＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤによって誘導されるｈＥＭＸ１およびＡＡＶＳ遺伝子における長鎖領域欠失変異の検出。上図；遺伝子構造、ｇＲＮＡ位置、および変異を増幅するための種々のプライマーセット。下図（左）；アガロースゲル上で分離したＰＣＲ増幅フラグメント。数字は、遺伝子構造中に示されるプライマーセットを示す。下図(右）；ＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤ感染細胞由来のクローン化ＤＮＡのサンガー配列決定によって分析された長鎖領域欠失変異。ＰＡＭに相対的なヌクレオチド位置が配列上に示される。 ＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤによって誘導されるｈＥＭＸ１およびＡＡＶＳ遺伝子における長鎖領域欠失変異の検出。上図；遺伝子構造、ｇＲＮＡ位置、および変異を増幅するための種々のプライマーセット。下図（左）；アガロースゲル上で分離したＰＣＲ増幅フラグメント。数字は、遺伝子構造中に示されるプライマーセットを示す。下図(右）；ＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤ感染細胞由来のクローン化ＤＮＡのサンガー配列決定によって分析された長鎖領域欠失変異。ＰＡＭに相対的なヌクレオチド位置が配列上に示される。 ＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）によって誘導された長鎖領域欠失パターン。図中の各バーは、ＰＡＭの５’上流領域の欠失およびＰＡＭの３’下流領域の欠失を示す。欠失変異の分布は、図７に示す。 ＡＡＶＳ遺伝子におけるＴｉＤ変異誘発の変異プロフィール。ＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）によって誘導された長鎖欠失パターン。欠失変異の分布イメージは、図６ｃに示す。 長鎖領域欠失変異（Δ５２３５ｎｔおよびΔ１７９０２ｎｔ　＋　８７ｎｔ挿入）を示す。ＰＡＭからのヌクレオチド位置を配列上に示す。 植物用ＴｉＤ発現ベクターを示す。ＳｌＩＡＡ９遺伝子の標的を決定するためのＬｕｃレポーターアッセイ。ｇＲＮＡｓ配列は、表２に示される。 トマト植物におけるＣａｓ発現ベクターカセットの構造。Ｎ末端に異なるタグおよびＳＶ４０ＮＬＳを付加した、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄを、単一の転写産物を生じ、同時に発現するように、２Ａ自己切断ぺプチドを介して融合した。ｐＴｉＤＰ１．２は、ＳｌＩＡＡ９変異誘発で使用されたオールインワン型ベクターである。ｐＭＧＴＴｉＤＰ２０は、２つのＣａｓカセットが２つのプロモーター下で、同じベクター中に並べられ、ＳｌＲＩＮ変異誘発に用いられた。ＡｔＵ６－２６　ｃｒＲＮＡ：Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｕ６　ｓｎＲＮＡ－２６プロモーターおよびｇＲＮＡ配列。Ｐ３５Ｓ：ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター。Ｐｕｂｉ４：パセリユビキチン４－２プロモーター。２Ａ：２Ａ自己切断ペプチド。ＮｐｔＩＩ：カナマイシン耐性マーカー発現カセット。ＲＢ：Ｔ－ＤＮＡの右境界配列。ＬＢ：Ｔ－ＤＮＡの左境界配列。Ｔｅｒ：ターミネーター。ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質。 ＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤを用いる植物ゲノム編集。ＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤによって誘導されるＳｌＩＡＡ９およびＳｌＲＩＮ遺伝子における長鎖領域欠失変異の検出。遺伝子構造、ｇＲＮＡ位置、および変異増幅のための種々のプライマーセットを示す。アガロースゲル上で分離されたＰＣＲ増幅フラグメントを示す。数字は、プライマーセットを示す。ＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤトランスジェニックトマトカルス由来のクローン化ＤＮＡのサンガー配列決定によって分析された、長領域欠失変異の結果を示す。ＰＡＭからのヌクレオチド位置を配列上に示す。矢印は、クローニングおよびシークエンシングに使用された特異的なバンドを示す。 トマトシュート（Ｔ０世代）におけるＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤによって誘導されたＳｌＲＩＮ遺伝子における長鎖領域欠失変異の検出。アガロースゲル上で分離されたＰＣＲ増幅フラグメントは、長鎖領域欠失変異を示す。ＷＴ；野生型。１－１２；トランスジェニックシュート系統（Ｔ０）。長鎖領域欠失は、系統＃４、５、６および１２において検出された。野生型と同じ長さのバンドは、非特異的バンドであった。矢印は特異的バンドを示す。矢印によって示されるバンドをさらにシークエンシング分析に付した。赤い矢印（上のバンド）はフラグメント１を示し、青い矢印（下のバンド）はフラグメント２を示す。 トマトシュート（Ｔ０世代）におけるＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤによって誘導されたＳｌＲＩＮ遺伝子における長鎖領域欠失変異の検出。ＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤトランスジェニックトマトシュート（Ｔ０；＃４、５、６、および１２）由来のクローン化ＤＮＡを用いるサンガー配列決定は、長鎖領域欠失変異が等しく起こったことを示したが、変異頻度は系統間で異なった。 トマトシュート（Ｔ０世代）におけるＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤによって誘導されたＳｌＲＩＮ遺伝子における長鎖領域欠失変異の検出。図１０ａ由来のクローン化ＤＮＡの変異配列。ＰＡＭからのヌクレオチド位置を配列上に示す。 サンガー法によって分析されたＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤで形質転換されたＭｉｃｒｏ－Ｔｏｍのトランスジェニックシュート（Ｔ０およびＴ１世代）における変異配列。ＷＴ；野生型配列。ｇＲＮＡ標的配列をボックスで示し、ＰＡＭを塗りつぶしたボックスで示す。クローン化ＰＣＲ産物における配列頻度は、配列の右に示される。 市販トマト栽培種におけるＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤを用いてゲノム編集。Ｍｉ－ｓｅｑ（Illumina）を用いるアンプリコンディープシークエンシングによって検出された、ＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤによって生じたトランスジェニックＡｉｌｓａ　Ｃｒａｉｇシュート（Ｔ０世代）における変異配列。ＷＴ；野生型配列。ボックス；ｇＲＮＡ標的配列。塗りつぶしたボックス；ＰＡＭ。ディープシークエンシングにおいてリードカウント数を配列の右に示す。 市販トマト栽培種におけるＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤのオフターゲット効果。上図：ＳｌＩＡＡ９　ＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）標的配列のオフターゲット配列。小文字；ミスマッチヌクレオチド。下図；Ａｉｌｓａ　ＣｒａｉｇのトランスジェニックＴ０シュート（ＳｌＩＡＡ９－ｔｉｄ＿ｇＲＮＡ１（＋）　ＡＣ　Ｔ０ｓ＿＃１、２、および４）および野生型（ＷＴ）由来のオフターゲット部位のクローン化ＰＣＲ産物における変異頻度は、Ｍｉ－ｓｅｑによるディープアンプリコンにおけるリードカウント数から算出された。
　本発明で使用されるＴｉＤシステムは、具体的には、ＴｉＤ　Ｃａｓタンパク質のうち、Ｃａｓエフェクタータンパク質として、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄと、ＴｉＤ　ｃｒＲＮＡとを含む。ＴｉＤシステムにおいて、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄは標的認識モジュール（Ｃａｓｃａｄｅ）を構成し、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄはポリヌクレオチド切断モジュールを構成することが知られていた（特許文献１）。ＴｉＤシステムにおいて、ＴｉＤ　ｃｒＲＮＡは、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列を含む。上記５つのＣａｓタンパク質とＴｉＤ　ｃｒＲＮＡは複合体を形成して、標的ヌクレオチド配列を標的化し、改変する。
　本発明によれば、ＴｉＤシステムの新規なＣａｓエフェクタータンパク質の機能を探求した結果、驚くべきことに、切断モジュールの構成要素のうちＣａｓ１０ｄがポリヌクレオチド分解作用（ヌクレアーゼ活性）を有し、Ｃａｓ３ｄはヌクレアーゼ活性を有しないことが明らかにされた。すなわち、ＴｉＤシステムでは、ＴｉＤ　ｃｒＲＮＡと標的認識モジュールとが標的ヌクレオチド配列を標的化して、ポリヌクレオチド切断モジュールを該標的ヌクレオチド配列付近に導き、Ｃａｓ１０ｄの作用により該標的ヌクレオチド配列が切断される。
　したがって、本発明は、ＴｉＤシステムを標的細胞に導入することにより、該細胞中の標的ヌクレオチド配列を改変する方法（以下、「本発明の標的配列改変方法」ともいう）、および該方法に使用されるキット（以下、「本発明のキット」ともいう）を提供する。
　さらに本発明では、ＴｉＤシステムのオフターゲット効果に関与する標的配列における塩基の位置を同定した。したがって、本発明は、標的ヌクレオチド配列に対して、特定の位置に変異を含む類似配列が存在しない標的配列を設計することにより、標的配列を特異的に標的化する方法および標的配列を特異的に改変する方法（以下、「本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列ターゲティング方法」および「本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列改変方法」という）を提供する。
（１）細胞
　本発明において、細胞は、原核細胞または真核細胞のいずれの細胞であってもよく、特に限定されない。例えば、細菌、古細菌、真菌類（例えば、糸状菌、酵母等）、植物細胞、昆虫細胞、動物細胞（例えば、ヒト細胞、非ヒト細胞、非哺乳動物脊椎動物細胞、無脊椎動物細胞等）が挙げられる。好ましくは、真核細胞が使用される。本明細書において使用される場合、「細胞」とは、生体から単離された細胞、生体内（例えば、動物体または植物の体内）に存在する細胞、または生体（例えば、動物体、または植物体）のいずれも包含する。本発明の方法は、生体から単離された細胞、生体内に存在する細胞、または生体のいずれの細胞に適用してもよい。例えば、ヒト以外の動物の体内に存在する細胞またはヒト以外動物体に適用してもよい。
（２）Ｃａｓエフェクタータンパク質および該タンパク質をコードする核酸
　本発明で使用されるＣａｓエフェクタータンパク質は、ＴｉＤのＣａｓタンパク質のうち、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄを含む。Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄは、いずれの細菌または古細菌由来のものであってもよく、例えば、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ　ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ　ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ａｎａｂａｅｎａ　ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａ、Ａｎａｂａｅｎａ　ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ　ｌａｃｔｏａｃｅｔｉｃｕｓ、Ｃａｌｄｉｌｉｎｅａ　ａｅｒｏｐｈｉｌａ、Ｃｒｉｎａｌｉｕｍ　ｅｐｉｐｓａｍｍｕｍ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ　Ｓｐ．、Ｃｙｌｉｎｄｒｏｓｐｅｒｍｕｍ　ｓｔａｇｎａｌｅ、Ｈａｌｏｑｕａｄｒａｔｕｍ　ｗａｌｓｂｙｉ、Ｈａｌｏｒｕｂｒｕｍ　ｌａｃｕｓｐｒｏｆｕｎｄｉ、Ｍｅｔｈａｎｏｃａｌｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｖｕｌｃａｎｉｕｓ、Ｍｅｔｈａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ　ｈｕｎｇａｔｅｉ、Ｎａｔｒｉａｌｂａ　ａｓｉａｔｉｃａ、Ｎａｔｒｏｎｏｍｏｎａｓ　ｐｈａｒａｏｎｉｓ、Ｎｏｓｔｏｃ　ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｐｈｏｒｍｉｄｅｓｍｉｓ　ｐｒｉｅｓｔｌｅｙｉ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ　ａｃｕｍｉｎａｔａ、Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ　ｔｏｒｒｉｄｕｓ、Ｓｐｉｒｏｃｈａｅｔａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｔａｎｉｅｒｉａ　ｃｙａｎｏｓｐｈａｅｒａ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ　ｉｓｌａｎｄｉｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ　Ｓｐ．、Ｔｈｅｒｍａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ　ｐｈａｅｕｍ、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｌｕｍ　ｐｅｎｄｅｎｓなどの菌株由来のものであってもよい。上記Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列情報は、例えば、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ等の公開されたデータベースから入手可能である。また、メタゲノム解析などにより得られた微生物ゲノムデータからＢＬＡＳＴプログラムを利用することで、新規の微生物種からの配列取得も可能である。
　上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、例えば、アミノ酸配列情報を基に、該核酸を導入する宿主細胞における翻訳に最適化されたコドンを選択し、化学合成等により構築してもよい。宿主細胞において使用頻度の高いコドンを使用することにより、タンパク質の発現量の増加させることができる。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
　Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄの各Ｃａｓタンパク質またはそれらをコードする核酸は、本発明の効果が達成されるかぎりにおいて、すなわち、上記Ｃａｓタンパク質とｃｒＲＮＡとの複合体が標的配列を標的化または改変するかぎりにおいて、１以上のアミノ酸変異または１以上のヌクレオチド変異を有していてもよい。
　例えば、上記Ｃａｓタンパク質の例として、限定するものではないが、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（以下、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａという）由来のＣａｓ３ｄ（配列番号１）、Ｃａｓ５ｄ（配列番号２）、Ｃａｓ６ｄ（配列番号３）、Ｃａｓ７ｄ（配列番号４）、およびＣａｓ１０ｄ（配列番号５）が挙げられる。したがって、本発明に用いられるＣａｓ３ｄをコードする核酸の例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ５ｄをコードする核酸の例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ６ｄをコードする核酸の例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ７ｄをコードする核酸の例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ３ｄをコードする核酸の例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ５ｄをコードする核酸の例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ６ｄをコードする核酸の例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、Ｃａｓ７ｄをコードする核酸の例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。さらに好ましくは、本発明に用いられるＣａｓ３ｄをコードする核酸の例として、配列番号１で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、Ｃａｓ５ｄをコードする核酸の例として、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、Ｃａｓ６ｄをコードする核酸の例として、配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、Ｃａｓ７ｄをコードする核酸の例として、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸の例として、配列番号５で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。
　また、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。好ましくは、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸が挙げられる。さらに好ましくは、本発明に用いられる上記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸のさらなる例として、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、および配列番号５に対してそれぞれ、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、またはさらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするヌクレオチド配列からなる核酸が挙げられる。上記のいずれかの核酸から発現するＣａｓタンパク質は、上記の他の核酸から発現するＣａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡと複合体を形成した場合に標的配列を標的化または改変する能力を有するものである。
　ＴｉＤシステムを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の末端に核移行シグナルをコードするヌクレオチド配列（以下、「核移行シグナル配列」という）が付加される。核移行シグナル配列は、当該分野で公知であり、導入対象の細胞が由来する生物種に応じて適宜選択することができる。例えば、モノパータイト型核移行シグナルまたはバイパータイト型核移行シグナル（ｂｐＮＬＳ）を使用してもよい。モノパータイト型核移行シグナルの例として、限定するものではないが、KKKKRK（配列番号６）で示される配列を含むものが挙げられる。また、バイパータイト型核移行シグナルの例として、限定するものではないが、DPKRTADGSEFESPKKKRKVEGT（配列番号７）で示される配列を含むものが挙げられる。
　また、核移行シグナル配列は、２個以上をタンデムに並べてＣａｓタンパク質をコードする核酸に付加してもよい。好ましくは、２個以上の、例えば、２個又は３個のモノパータイト型核移行シグナル配列をタンデムに並べて、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸に付加する。核移行シグナル配列は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸の５’末端側または３’末端側、あるいは５’末端側および３’末端側の両方に付加されていてもよい。
　例えば、一の態様において、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡは、５’末端側に、１個のモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されているか、あるいは２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されていてもよい。例えば、また別の態様において、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡは、５’末端側および３’末端側の両方に、バイパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されていてもよい。例えば、また別の態様において、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡは、５’末端および／または３’末端側に、２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されていてもよい。これらの態様は、動物細胞への導入に好ましい。
（３）ｃｒＲＮＡ
　ｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に由来するリピート配列および該リピート配列に挟まれたスペーサー配列からなる１以上の構造単位（「リピート－スペーサー－リピート」）を含む。リピート配列は、好ましくは、パリンドローム様配列を含む。ｃｒＲＮＡは、スペーサー配列として標的ヌクレオチド配列に結合するＲＮＡ配列（すなわち、プロトスペーサー配列）を含むことによって、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの標的認識に寄与する。ｃｒＲＮＡのリピート配列および該リピート配列に挟まれたプロトスペーサー配列からなる構造を含むＲＮＡ分子は、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とも呼ばれる。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓエフェクタータンパク質の作用によりプロセッシングされてそのリピート配列が切断され、リピート配列の部分配列と該リピート配列の部分配列に挟まれたプロトスペーサー配列からなる成熟型（ｍａｔｕｒｅ）ｃｒＲＮＡになる。プロセッシングされる前のｃｒＲＮＡはプレ成熟型（ｐｒｅ－ｍａｔｕｒｅ）ｃｒＲＮＡと呼ばれる。
　本発明で使用されるｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ遺伝子座に由来するリピート配列と、該リピート配列に挟まれたプロトスペーサー配列として、標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含む。本発明で使用されるｃｒＲＮＡは、好ましくは、プレ成熟型ｃｒＲＮＡである。
　プレ成熟型ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓｃａｄｅ（Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄの複合体）に取り込まれる前にＣａｓ６ｄによるプロセッシングを受けて、成熟型ｃｒＲＮＡとなる。プレ成熟型ｃｒＲＮＡが２以上の「リピート－スペーサー－リピート」構造単位を含む場合、該プレ成熟型ｃｒＲＮＡは、２種以上のプロトスペーサー配列を含んでいてもよい。２種以上のプロトスペーサー配列を含むプレ成熟型ｃｒＲＮＡからは、２種以上の成熟型ｃｒＲＮＡが生じ、次いで、これらの成熟型ｃｒＲＮＡは個別にＣａｓｃａｄｅに取り込まれる。
　ｃｒＲＮＡに含まれるプロトスペーサー配列は、標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列である。「標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列」は、例えば、ＲＮＡ配列標的ヌクレオチド配列に相補的な配列、またはＲＮＡ配列標的ヌクレオチド配列に対し実質的に相補的な配列である。ここで、「実質的に相補的」とは、標的配列に対して完全に相補的ではないが、標的配列に結合できる（標的配列と塩基対を形成する）配列を包含する。ＲＮＡ配列標的ヌクレオチド配列に対し実質的に相補的な配列は、標的配列と塩基対を形成するかぎりにおいて、配列標的配列に対しミスマッチを含んでいてもよい。
　ｃｒＲＮＡのリピート配列部分は、少なくとも１つのヘアピン構造を有していてもよい。例えば、プロトスペーサー配列の５’末端側にあるリピート配列部分がヘアピン構造を有し、プロトスペーサー配列の３’末端側にあるリピート配列部分は一本鎖であってもよい。本発明において、ｃｒＲＮＡは、好ましくは１つのヘアピン構造を有する。
　ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ｄ遺伝子座に由来するリピート配列は、タイプＩ－Ｄ遺伝子群に隣接するｃｒＲＮＡ遺伝子配列領域から、タンデムリピート検索プログラムを利用して見出すことができる。タイプＩ－Ｄ遺伝子座に由来するリピート配列は、いずれの細菌または古細菌由来のものであってもよく、例えば、上記のＣａｓエフェクタータンパク質に関して例示した細菌および古細菌由来のものであってもよい。
　ｃｒＲＮＡに含まれるリピート配列の塩基長は、Ｃａｓｃａｄｅと相互作用して標的ヌクレオチド配列を標的化するという目的が達成されるかぎり、特に限定されない。例えば、プロトスペーサー配列の前後のリピート配列は各々、約１０～７０塩基長であってもよく、例えば、約３０～５０塩基長であってもよく、好ましくは約３５～４５塩基長であってもよい。
　本発明で使用されるｃｒＲＮＡは、約１０塩基～７０塩基長のプロトスペーサー配列を含むことができる。該ｃｒＲＮＡに含まれるプロトスペーサー配列は、好ましくは２０塩基～５０塩基、より好ましくは２５塩基～４５塩基からなる配列、さらに好ましくは３０塩基～４０塩基からなる配列、例えば、３１塩基、３２塩基、３３塩基、３４塩基、３５塩基、３６塩基、３７塩基、３８塩基、または３９塩基からなる配列である。標的化可能な配列が長いほど、ｃｒＲＮＡによる標的認識の配列特異性が増す。また、標的化可能な配列が長いほど、ｃｒＲＮＡと標的配列との間に形成される塩基対のＴｍ値が高くなり、標的認識の安定性が増す。従来のゲノム編集技術に用いられるＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１）ではｃｒＲＮＡが標的化できる配列の長さは約２０～２４塩基であるので、本発明では、従来法よりも配列特異性および安定性が優れている。
　本発明で使用されるｃｒＲＮＡの例として、限定するものではないが、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のｃｒＲＮＡのリピート配列を含むものが挙げられる。例えば、GUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUCCAAUUAAUCUUAAGCCCUAUUAGGGAUUGAAAC（配列番号８；Ｎは、標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を構成する任意のヌクレオチドである）で示される配列を含むプレ成熟型ｃｒＲＮＡが挙げられる。上記ｃｒＲＮＡの配列中、Ｎの数は１０～７０の範囲で変更してもよく、好ましくは２０～５０、より好ましくは２５～４５、さらに好ましくは３０～４０の範囲で変更してもよい。
　上記ｃｒＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとして細胞中に導入されてもよい。ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、例えば、ベクターまたは発現カセットに含まれていてもよく、該ＤＮＡ配列は、好ましくは、プロモーターおよびターミネーター等の調節配列に作動可能に連結される。ベクターおよび調節配列は、例えば宿主細胞等に基づいて、当業者が適宜選択することができる。例えば、限定するものではないが、ｐｏｌ　ＩＩＩ系のプロモーター（例えば、ＳＮＲ６、ＳＮＲ５２、ＳＣＲ１、ＲＰＲ１、Ｕ６、Ｈ１プロモーター等）、ｐｏｌ　ＩＩ系のプロモーター、ターミネーター（例えばＴ６配列）、またはヒトＵ６　ｓｎＲＮＡプロモーターを用いることができる。
　上記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、上記５つのＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡのいずれかと同じベクター中または同じ発現カセット中に含まれていてもよく、または上記５つのＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡのいずれとも別のベクター中または別の発現カセット中に含まれていてもよい。
（４）標的ヌクレオチド配列
　本発明において、標的ヌクレオチド配列（本明細書において、単に「標的配列」ともいう）は、任意の核酸の配列であり、ＴｉＤシステムのプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）の近傍に位置する配列を標的配列として選択することを除き、特に限定されない。標的ヌクレオチド配列は、二本鎖ＤＮＡ配列、一本鎖ＤＮＡ配列、またはＲＮＡ配列のいずれであってもよい。ＤＮＡとしては、例えば、真核生物核ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、原核生物ゲノムＤＮＡ、ファージＤＮＡ、あるいはプラスミドＤＮＡ等が挙げられる。本発明において、標的ヌクレオチド配列は、好ましくは、ゲノムＤＮＡ上の配列である。したがって、標的とする核酸のセンス鎖において、ＰＡＭ配列の近傍に位置する配列、好ましくはＰＡＭ配列の３’側下流の近傍に位置する配列、さらに好ましくはＰＡＭ配列の３’側下流に隣接する配列を標的ヌクレオチド配列として選択する。また、標的核酸のアンチセンス鎖において、標的ヌクレオチド配列は、ＰＡＭ配列の近傍に位置する配列、好ましくはＰＡＭ配列の５’側の近傍に位置する配列、さらに好ましくはＰＡＭ配列の５’側に隣接する配列から選択される。なお、本明細書において、「近傍に位置する」とは、隣接すること、および近くにあることの両方を包含する。また、本明細書において、「近傍」とは、隣接する位置または近くの位置の両方を包含する。なお、本明細書においては、特記しないかぎり、核酸のセンス鎖に基づいて記載される。
　ＣＲＩＳＰＲシステムの標的認識に利用されるＰＡＭ配列は、ＣＲＩＳＰＲシステムの種類によって異なる。Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＴｉＤシステムを用いる発明者らの以前の研究により、ＴｉＤシステムのＰＡＭ配列は、標的とする核酸のセンス鎖において、５’－ＧＴＨ－３’（Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ）であり、標的核酸のアンチセンス鎖において、５’－ＨＴＧ－３’（Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ）であることが明らかにされた（特許文献１）。
　例えば、標的ヌクレオチド配列は、上記ＰＡＭ配列の近傍に位置し、かつ、標的遺伝子のイントロン内、コーディング領域内、非コーディング領域内、または制御領域内に存在する配列であってもよい。標的遺伝子は、任意の遺伝子であり、随意に選択すればよい。
　標的ヌクレオチド配列の長さは、例えば、１０～７０塩基長、好ましくは２０～５０塩基長、より好ましくは２５～４５塩基長、さらに好ましくは３０～４０塩基長の範囲である。
（５）本発明の標的配列改変方法
　本発明の標的配列改変方法は、上記の５つのＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター系または発現カセット系と、ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとを上記細胞中に導入することを特徴とする。本発明の標的配列改変方法は、ＴｉＤシステムにより、細胞中の標的ヌクレオチド配列が特異的に切断されることを含む。本発明の標的配列改変方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。本発明において、改変には、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。
　上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、ベクター系または発現カセット系に含まれる。本明細書において、「ベクター系」および「発現カセット系」とは、それぞれ、２以上のベクターを含む群（すなわち、第一のベクターおよび第二のベクターを含む群）および２以上の発現カセットを含む群（すなわち、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットを含む群）を意味する。ここで、ベクターは、対象細胞中に目的タンパク質をコードするＤＮＡを運び、該細胞中で該目的タンパク質を発現させるための発現ベクターである。発現カセットとは、目的タンパク質をコードするＤＮＡの転写を指示して該目的タンパク質の発現を可能にする核酸分子を意味する。発現カセットは、ベクターに含まれていてもよい。ベクターとしては、当該分野において一般的に使用される種々のベクターを使用することができ、特に限定されず、導入される細胞又は導入方法に応じて適宜選択することができる。例えば、限定するものではないが、プラスミドベクター、ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ファージ、ファージミド、コスミド、人工／ミニ染色体、トランスポゾン等が挙げられる。
　上記ベクターまたは発現カセットは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡのほかに、該ＤＮＡの転写を調節するための調節エレメントを含み、該ＤＮＡ配列は該調節エレメントに作動可能に連結されている。転写を調節するための調節エレメントとしては、例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、ポリアデニル化シグナル、ポリＵ配列等が包含される。上記ベクターまたは発現カセットは、好ましくはプロモーターを含む。上記ベクターまたは発現カセットは、さらに、他の調節エレメントを含んでいてもよい。他の調節エレメントとしては、例えば、翻訳エンハンサー等が挙げられる。調節エレメントは、特に限定されず、例えば宿主細胞等に基づき当業者が適宜選択することができる。例えば、プロモーターとして、宿主が植物細胞である場合、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、２ｘＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター等が挙げられ、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＭｏＭｕＬＶ　ＬＴＲプロモーター、ＨＳＶ－ＴＳプロモーター、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーター、ＣＡＧキメラ合成プロモーター等が挙げられる。特に、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーター、またはＣＡＧキメラ合成プロモーターは、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを動物細胞へ導入するために使用される。
　上記ベクター系または発現カセット系は、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含み、ここに、第一のベクターまたは第一の発現カセットは、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡを含み、また、上記第二のベクターまたは第二の発現カセットは、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡを含む。
　上記５つのＣａｓタンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの２以上または全てが単一のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、または別々のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよい。ベクターまたは発現カセットの数、ならびに各ベクターまたは発現カセットに組み込むＤＮＡがコードするＣａｓタンパク質の種類および組み合わせに制限はない。上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡが一つのベクター中に含まれる場合、これらのＤＮＡ配列は、ポリシストロニックに発現するように、例えば自己開裂型ペプチドをコードする配列等を介して、相互に連結されていてもよい。なお、上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡを連結する順番は、いずれであってもよい。
　好ましくは、上記ベクター系または発現カセット系において、第二のベクターまたは第二の発現カセットは、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡであって、第一のベクターまたは第一の発現カセットに含まれていないＤＮＡを含む。
　例えば、上記ベクター系または発現カセット系は、第一ないし第五のベクターまたは発現カセットを含んでいてもよく、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがそれぞれ別々の上記ベクターまたは発現カセットに含まれていてもよい。
　例えば、一の態様において、ベクター系が第一ないし第五のベクターを含み、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがそれぞれ別々の上記ベクターに含まれていてもよい。かかる態様は、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを動物細胞へ導入するために使用される。
　例えば、上記ベクター系または発現カセット系において、第一のベクターまたは発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡおよびＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡを含み、第二のベクターまたは発現カセットが、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含んでいてもよい。
　例えば、一の態様において、第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡおよびＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡを含み、第二の発現カセットが、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含み、かつ、第一の発現カセットおよび第二の発現カセットが１つのベクターに搭載されていてもよい。かかる態様は、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを植物細胞へ導入するために使用される。
　本発明の標的配列改変方法においては、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター系または発現カセット系およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡに加えて、ドナーポリヌクレオチドを細胞中に導入してもよい。ドナーポリヌクレオチドは、標的部位に導入したい改変を含む少なくとも１つのドナー配列を含む。ドナーポリヌクレオチドは、ドナー配列に加えて、該ドナー配列の両端に標的配列の上流および下流の配列と相同性の高い配列（好ましくは、標的配列の上流および下流の配列と実質的に同一の配列）を含んでいてもよい。ドナーポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖のＤＮＡであってもよい。ドナーポリヌクレオチドは、当該分野で既知の技術に基づいて当業者が適宜設計することができる。
　本発明の標的配列改変方法においてドナーポリヌクレオチドが存在しない場合、標的ヌクレオチド配列における切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）により修復されうる。ＮＨＥＪはエラーが発生しやすいことが知られており、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが該切断の修復中に起こりうる。かくして、該配列は、標的配列部位において改変され、それにより、フレームシフトや未成熟終止コドンを誘発し、標的配列領域がコードしている遺伝子の発現が不活性化またはノックアウトされる。
　本発明の標的配列改変方法においてドナーポリヌクレオチドが存在する場合、ドナーポリヌクレオチドのドナー配列は、切断された標的ヌクレオチド配列の相同組換え修復（ＨＤＲ）により、標的配列部位に挿入されるか、または標的配列部位がドナー配列に置換される。その結果、標的配列部位に所望の改変が導入される。
　上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター系または発現カセット系およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡの細胞中への導入は、当該分野で知られた種々の手段によって行うことができる。ドナーポリヌクレオチドを用いる場合、ドナーポリヌクレオチドもまた、当該分野で知られた種々の手段によって細胞中に導入すればよい。例えば、トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション等、ウイルス形質導入、リポフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム法、アグロインフィルトレーション法、ＰＥＧ－カルシウム法等が挙げられる。
　上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター系または発現カセット系、およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。また、上記のベクター系または発現カセット系に含まれる２以上のベクターまたは発現カセットは、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。ドナーポリヌクレオチドを用いる場合、該ドナーポリヌクレオチドは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター系または発現カセット系およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡと同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。
　上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター系または発現カセット系、およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡの細胞中への導入の際、該細胞は、標的配列部位での切断に適当な条件下で培養される。次いで、該細胞は、細胞増殖および維持に適当な条件下で培養される。ドナーポリヌクレオチドを導入する際も同様である。培養条件は、導入される細胞が由来する生物種に適切な培養条件であればよく、例えば、既知の細胞培養技術に基づいて当業者により適宜決定可能である。
　本発明の標的配列改変方法によれば、細胞中に導入されたＴｉＤシステムにより標的ヌクレオチド配列上の部位が切断され、該切断配列の修復時に、標的配列が改変される。例えば、本発明の標的配列改変方法は、ゲノム上の標的ヌクレオチド配列の改変のために用いることができ、該方法によりゲノム上の二本鎖ＤＮＡが切断され、標的部位が改変される。
　さらに、本発明の標的配列改変方法において、標的ヌクレオチド配列として、標的遺伝子の配列の少なくとも一部の配列を選択することにより、当該標的遺伝子の発現を抑制することができる。かくして、本発明の標的配列改変方法のさらなる態様として、細胞内の標的遺伝子の発現を抑制する方法であって、該細胞に、
　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含むベクター系又は発現カセット系、及び
　（ｉｉ）前記標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
を導入することを含み、
　前記ベクター系が、第一のベクター及び第二のベクターを含み、
　前記発現カセット系が、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含み、
　前記第一のベクター又は前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第一の調節エレメントを含み、
　前記第二のベクター又は前記第二の発現カセットが、前記群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第二の調節エレメントを含む、方法が提供される。
　本発明の標的配列改変方法によれば、上記の５つのＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡがベクター系または発現カセット系、すなわち、２以上のベクターまたは発現カセット中に存在していることを特徴とする。上記Ｃａｓタンパク質は、該ベクター系または発現カセット系を介して細胞中で発現することにより、同時に導入されたｃｒＲＮＡと共に作用して、標的ヌクレオチド配列を特異的かつ効率よく改変する。
　好ましい一の態様において、本発明の標的配列改変方法は、上記の第一のベクターまたは発現カセットおよび第二のベクターまたは発現カセットを含むベクター系または発現カセット系であって、第二のベクターまたは第二の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡであって、第一のベクターまたは第一の発現カセットに含まれていないＤＮＡを含む、ベクター系または発現カセット系を用いる。また別の態様において、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡは、第一のベクターまたは第一の発現カセットおよび第二のベクターまたは第二の発現カセットの両方に含まれていてもよい。このように、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄをそれぞれコードする５つのＤＮＡが２以上の異なるベクターまたは発現カセットに別れて含まれる場合、該ベクターまたは発現カセットを利用するＴｉＤは、細胞中でＣａｓタンパク質のより高レベルの発現を導き、より強力な標的配列改変効果をもたらす。
　例えば、本発明の標的配列改変方法は、好ましくは、５つのベクターを含むベクター系であって、上記の５つのＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡの各々が互いに異なるベクター中に含まれているベクター系を用いる。さらに好ましくは、上記ベクターは、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーターまたはＣＡＧキメラ合成プロモーターを含む。また、本発明の方法において、好ましくは、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの５’末端側には、１個のモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されているか、あるいは２個または３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている。あるいは、本発明の方法において、好ましくは、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの５’末端側および３’末端側の両方には、バイパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている。さらに、本発明の方法において、好ましくは、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡの５’末端および／または３’末端側には、２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている。また、本発明の方法において、好ましくは、上記発現カセット系が２つの発現カセットを含み、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡおよびＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡが第一の発現カセットに含まれ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡ第二の発現カセットに含まれ、該第一および第二の発現カセットは１つのベクターに搭載されている。
　本発明の標的配列改変方法によれば、標的配列に、数塩基から数十塩基の短鎖領域の挿入および／または欠失を導入するだけでなく、数キロベースないし数十キロベースの長鎖領域の塩基欠失も導入することができる。数キロベースないし数十キロベースとしては、限定するものではないが、例えば１０００～９００００塩基長、好ましくは２０００～８００００塩基長、より好ましくは２０００～７００００塩基長、さらに好ましくは２０００～６００００塩基長、２０００～５００００塩基長、２０００～４００００塩基長、２０００～３００００塩基長、または２０００～２００００塩基長が挙げられる。あまりに長い欠失では、標的とする遺伝子の目的以外の配列（例えば、隣接する別の遺伝子の配列）の欠失を生じたり、標的とするエキソン領域のみならず隣接する必要なエキソン配列の欠失を生じたりすることもあるが、本発明のように「数キロベースないし数十キロベース」程度の適度に長い領域の欠失であれば、目的の遺伝子の長鎖欠失のみを導入することができる。したがって、本発明の標的配列改変方法を用いれば、１つのガイドＲＮＡを設計するだけで、１遺伝子座全体を欠失させることが可能となる。また、本発明の標的配列改変方法を用いれば、動物の遺伝子のように長いイントロンが存在する場合でも、特定のエキソンを完全に欠落させることも可能である。さらに、本発明の標的配列改変方法を用いれば、隣接して存在する遺伝子群をまとめて欠落させることも可能である。
　本発明の標的配列改変方法によれば、ＰＡＭ配列の上流方向または下流方向、あるいはＰＡＭ配列の上流および下流の両方（すなわち、二方向性）の塩基欠失をもたらすことができる。
（６）本発明のキット
　本発明のキットは、上記の本発明の標的配列改変方法に使用するためのキットであり、上記の５つのＣａｓタンパク質をコードするＤＮＡを含む上記ベクター系または発現カセット系と、上記ｃｒＲＮＡまたは上記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡを含む。本発明のキットの構成成分については、上記（２）～（５）に記載のとおりである。
（７）本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列ターゲティング方法
　本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列ターゲティング方法は、上記標的認識モジュール（Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄ）または該Ｃａｓタンパク質をコードする核酸と、上記ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとを上記細胞中に導入することを含み、かつ、標的配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から１、６、１２、１８および２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つまたは２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように標的配列を設計（または選択）することを特徴とする。さらに、標的配列が比較的短い（例えば、３０塩基長以下）場合は、ＰＡＭ配列の３’側から６、１２、１８および２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つまたは２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように標的配列を設計（または選択）してもよい。このような標的配列を選択することにより、ＴｉＤの標的認識モジュールによるオフターゲット効果が抑制され、より効率的かつ特異的な標的配列の標的化（ターゲティング）が実現する。本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列ターゲティング方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。本発明の標的配列ターゲティング方法によれば、ｃｒＲＮＡと、上記標的認識モジュールとｃｒＲＮＡが複合体を形成し、同時に、該ｃｒＲＮＡが標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成し、該標的認識モジュールが標的ヌクレオチド配列近傍のＰＡＭ配列を認識することにより、配列特異的に標的ヌクレオチド配列を標的化する。
　上記標的認識モジュールは、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄを含む単離された複合体として細胞中に導入されてもよく、またはＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄの各々が単離されたタンパク質として単独で細胞中に導入されてもよい。また、上記標的認識モジュールは、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄをコードする核酸として細胞中に導入されてもよい。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
　上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、１以上のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、該ＤＮＡ配列は、好ましくは、調節エレメントに作動可能に連結されている。上記標的認識モジュールを導入する細胞が真核細胞である場合、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡに核移行シグナル配列が付加される。上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄをコードするＤＮＡの２以上または全てが単一のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、または別々のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよい。上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡが一つのベクターまたは発現カセット中に含まれる場合、これらのＤＮＡ配列は、ポリシストロニックに発現するように、例えば自己開裂型ペプチドをコードする配列等を介して、相互に連結されていてもよい。なお、上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡを連結する順番は、いずれであってもよい。ベクター、発現カセット、調節エレメント、核移行シグナル配列等については、上記（５）に記載のとおりである。ｃｒＲＮＡについては、上記（３）に記載のとおりである。
　上記標的認識モジュールおよびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡの細胞中への導入は、当該分野で知られた種々の手段によって行うことができる。例えば、トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション等、ウイルス形質導入、リポフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム法、アグロインフィルトレーション法、ＰＥＧ－カルシウム法等が挙げられる。
　上記標的認識モジュールおよびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。また、上記標的認識モジュールを構成するＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、およびＣａｓ７ｄ、またはこれらの各Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。例えば、イン・ビトロまたはイン・ビボにおいてそれぞれ合成した上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄと、イン・ビトロまたはイン・ビボにおいて合成したｃｒＲＮＡを、イン・ビトロにおいてインキュベートして複合体を形成させ、該複合体を細胞中に導入することができる。
　上記標的認識モジュールおよびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡの導入の際、細胞は、標的ヌクレオチド配列のターゲティングに適当な条件下で培養される。次いで、該細胞は、細胞増殖および維持に適当な条件下で培養される。培養条件は、該細胞が由来する生物種に適切な培養条件であればよく、例えば、既知の細胞培養技術に基づいて当業者により適宜決定可能である。
（８）本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列改変方法
　本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列改変方法は、上記の５つのＣａｓタンパク質または該タンパク質をコードする核酸と、上記ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡとを上記細胞中に導入することを含み、かつ、標的配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から１、６、１２、１８および２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つまたは２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように標的配列を設計（または選択）することを特徴とする。さらに、標的配列が比較的短い（例えば、３０塩基長以下）場合は、ＰＡＭ配列の３’側から６、１２、１８および２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つまたは２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように標的配列を設計（または選択）してもよい。このような標的配列を選択することにより、ＴｉＤのオフターゲット効果が抑制され、より効率的かつ特異的な標的配列の改変が実現する。本発明において、改変には、少なくとも１つのヌクレオチドの欠失、挿入、または置換、あるいはそれらの組み合わせが含まれる。本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列改変方法は、イン・ビトロおよびイン・ビボのいずれで行ってもよい。
　本発明のオフターゲット効果を抑制した標的配列改変方法においては、上記のＣａｓタンパク質およびｃｒＲＮＡに加えて、ドナーポリヌクレオチドを細胞中に導入してもよい。ドナーポリヌクレオチドについては、上記（５）に記載のとおりである。
　上記Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄを含む単離された複合体として細胞中に導入されてもよく、またはＣａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄの各々が単離されたタンパク質として単独で細胞中に導入されてもよい。あるいは、上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ３ｄ、およびＣａｓ１０ｄをコードする核酸として細胞中に導入されてもよい。該核酸としては、例えば、ｍＲＮＡ等のＲＮＡ、またはＤＮＡが挙げられる。
　上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡは、例えば、１以上のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、該ＤＮＡ配列は、好ましくは、調節エレメントに作動可能に連結されている。上記細胞が真核細胞である場合、好ましくは、上記Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡに核移行シグナル配列が付加される。上記Ｃａｓタンパク質Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの２以上または全てが単一のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよく、または別々のベクターまたは発現カセット中に含まれていてもよい。上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡが一つのベクターまたは発現カセット中に含まれる場合、これらのＤＮＡ配列は、ポリシストロニックに発現するように、例えば自己開裂型ペプチドをコードする配列等を介して、相互に連結されていてもよい。なお、上記Ｃａｓタンパク質をコードする２以上のＤＮＡを連結する順番は、いずれであってもよい。ベクター、発現カセット、調節エレメント、核移行シグナル配列等については、上記（５）に記載のとおりである。ｃｒＲＮＡについては、上記（３）に記載のとおりである。
　上記Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびドナーポリヌクレオチドの細胞中への導入は、当該分野で知られた種々の手段によって行うことができる。例えば、トランスフェクション、例えば、リン酸カルシウム仲介性トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクション等、ウイルス形質導入、リポフェクション、遺伝子銃、マイクロインジェクション、アグロバクテリウム法、アグロインフィルトレーション法、ＰＥＧ－カルシウム法等が挙げられる。
　上記Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびドナーポリヌクレオチドは、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。また、上記ＲＮＡ誘導性エンドヌクレアーゼを構成するＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、またはこれらの各Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、同時にまたは連続的に細胞中に導入すればよい。
　上記Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸およびｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、または上記Ｃａｓタンパク質またはＣａｓタンパク質をコードする核酸、ｃｒＲＮＡまたはｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ、およびドナーポリヌクレオチドの導入の際、細胞は、標的配列部位での切断に適当な条件下で培養される。次いで、該細胞は、細胞増殖および維持に適当な条件下で培養される。培養条件は、該細胞が由来する生物種に適切な培養条件であればよく、例えば、既知の細胞培養技術に基づいて当業者により適宜決定可能である。
　以下に、本発明の実施例を示した。ただし、本発明はこれらの実施例に限定されない。
　実施の一形態として、Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＴｉＤ遺伝子座由来の遺伝子群（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、Ｃａｓ１０ｄ）を、クローン化して用いた。Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄのアミノ酸配列情報（配列番号１～５）を基に、各Ｃａｓタンパク質をコードするＤＮＡ配列を人工合成した。実施例中のＤＮＡ配列の加工および構築操作には、人工遺伝子化学合成、ＰＣＲ法、制限酵素処理、ライゲーション、Ｇｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ法のいずれかを用いた。また、塩基配列の決定にはサンガー法あるいは次世代シーケンス法を用いた。
＜方法＞
（１）ベクターの構築
　遺伝子フラグメントのクローニングのためのＰＣＲ増幅は、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ（ＴａＫａＲａ）を用いて行た。アセンブリングのためのクローニングは、Ｑｕｉｃｋ　ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＮＥＢ）、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ　ＨｉＦｉ　ＤＮＡ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）、およびＭｕｌｔｉｓｉｔｅ　ｇａｔｅｗａｙ　Ｐｒｏ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて行った。
（１－１）哺乳動物ベクター
　ヒトコドンに最適化したＣａｓエフェクター遺伝子（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ）をＮ末端のＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）（配列番号６）と共に合成し（ｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標））（ＩＤＴ）、アセンブルし、ｐＥＦｓベクター（Lopez-Perrote et al,(2016), Nucleic Acids Res, 44:1909-1923. doi:10.1093/nar/gkv1527）中に別々にクローン化して、ｐＥＦｓ－ＨＡ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ３ｄ、ｐＥＦｓ－Ｓｔｒｅｐｔ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄ、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ６ｄ、ｐＥＦｓ－ＦＬＡＧ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ、およびｐＥＦｓ－６ｘＨｉｓ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄを得た（単一Ｃａｓ発現ベクター）。各Ｃａｓタンパク質に融合したタグは以下のとおりである。すなわち、ＨＡ－タグをＣａｓ３ｄに、Ｓｔｒｅｐ－タグをＣａｓ５ｄに、Ｍｙｃ－タグをＣａｓ６ｄに、ＦＬＡＧ－タグをＣａｓ７ｄに、６ｘＨｉｓ－タグをＣａｓ１０ｄに付加した。さらに、すべてのＣａｓ遺伝子を、２Ａ自己切断ペプチドをコードしている配列との融合によって、オールインワンベクターｐＥＦｓ－Ａｌｌ中で組み合わせた。２Ａ自己切断ペプチドに連結することによって、ｐＥＦｓ＿Ｃａｓ３ｄ－Ｃａｓ１０ｄ発現ベクターおよびｐＥＦｓ＿Ｃａｓ６ｄ－Ｃａｓ５ｄ－Ｃａｓ７ｄ発現ベクター（２セット型ベクター）も構築した。
　Ｃａｓ５ｄおよびＣａｓ６ｄを発現するための異なるプロモーターを評価するために、ｐＥＦｓ－Ｓｔｒｅｐｔ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄおよびｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ６ｄにおいてヒトＥＦｓプロモーターをＣＡＧプロモーターに置き換えて、ｐＣＡＧ－Ｓｔｒｅｐｔ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄまたはｐＣＡＧ－Ｍｙｃ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ６ｄを得た。
　バイパータイトＮＬＳ（ｂｐＮＬＳ）（配列番号７）を用いてＣａｓ－発現ベクターを構築するために、ＤＮＡフラグメント（ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ）をまず合成し（ＩＤＴ）、ｐＥＦｓベクター中にクローン化して、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓベクターを得た。ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓベクター中のＣａｓ１０ｄ遺伝子フラグメントを、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＣａｓ７ｄ遺伝子フラグメントでそれぞれ置き換えて、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ３ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、およびｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓを得た。
　変異Ｃａｓ１０ｄ（Ｈ１７７Ａ）発現ベクターを構築するために、ｄＣａｓ１０ｄ（Ｈ１７７Ａ）フラグメントを合成し（ＩＤＴ）、野生型Ｃａｓ１０ｄフラグメントｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓをｄＣａｓ１０ｄ（Ｈ１７７Ａ）で置換して、ｐＥＦｓ－ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ（Ｈ１７７Ａ）－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓを得た。ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ－ｂｐＮＬＳ中のＭｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓフラグメントを６ｘＨｉｓ－ｍｙｃ－Ｃａｓ７ｄ－ｂｐＮＬＳフラグメントで置換して、ｐＥＦｓ－６ｘＨｉｓ－ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ－ｂｐＮＬＳを得た。
　ｃｒＲＮＡ発現ベクターのために、リピート－スペーサー－リピート配列（配列番号９）を含有するＤＮＡフラグメントを人工合成し、ｐＥＸ－Ａ２Ｊ１（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）中、ヒトＵ６プロモーター下でクローン化して、ｐＡＥＸ－ｈＵ６ｃｒＲＮＡを得た。ｐＡＥＸ－ｈＵ６ｃｒＲＮＡ＿ｍａｔｕｒｅを構築するために、２つのリピート配列を予測されたプロセスリピート配列（predicted processed repeat sequences）（配列番号１０）に置き換えた。ｇＲＮＡ配列の挿入のために、標的配列を含有する２つのオリゴヌクレオチドをアニールし、制限酵素ＢｓａＩ（ＮＥＢ）を用いるＧｏｌｄｅｎ　Ｇａｔｅクローニングを用いて、ｃｒＲＮＡ発現ベクター中にクローン化した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（１－２）ルシフェラーゼレポーターアッセイプラスミド
　ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーターアッセイのために、ＮａｎｏＬＵｘｘＵＣ発現ベクターを構築した。まず、ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１およびＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２　ＤＮＡフラグメントを合成した（ＩＤＴ社製）。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１は、ＮａｎｏＬＵＣＴＭ（登録商標）遺伝子（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）配列の最初の３５１ｂｐおよびマルチクローニングサイトを含む。ＸｂａＩ部位をＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の５’末端に付加した。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２は、ＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の３’末端の４６５ｂｐを含む。ＸｈｏＩ部位をＮａｎｏＬＵＣ遺伝子の３’末端に付加した。これらのフラグメントをアセンブルし、ｐＣＡＧ－ＥＧｘｘＦＰベクター（ａｄｄｇｅｎｅ、＃５０７１６）中にクローン化した。ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１をＸｂａＩおよびＢａｍＨＩ消化によって、ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２をＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ消化によって、ｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣベクターから除去することによって、各スプリットタイプＮＬＵｘｘＵＣレポーターを構築した。各消化ベクターをマルチクローニングサイトと共にアセンブルし、ｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ１およびｐＣＡＧ－ＮＬＵｘｘＵＣ＿Ｂｌｏｃｋ２を得た。
（１－３）植物ベクター
　トマトコドン最適化Ｃａｓエフェクター遺伝子（Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ）に対応する遺伝子フラグメントを、Ｎ末端の２ｘＳＶ４０核移行シグナル（ＮＬＳ）と共に合成し（ＩＤＴ社製）、アセンブルし、ｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｊａｐａｎ製）ベクター中にクローン化した。配列を確認後、５つのＣａｓ遺伝子を２Ａ自己切断ペプチド配列を介して連結することによってリアセンブルし、Ｃａｓ遺伝子発現カセットを、ｐＥｇＰ２３７－２Ａ－ＧＦＰ（Ueta et al., 2017, Sci. Rep, 7:507. doi: 0.1038/s41598-017-00501-4）の２ｘＣａＭＶ３５ＳプロモーターとＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＨＳＰ１８．２遺伝子ターミネーターとの間にクローン化して、ｐＥｇＰ１．２－ＴｉＤを得た。
　ｃｒＲＮＡ発現ベクターを構築するために、リピート－スペーサー－リピート配列を含有するＤＮＡフラグメントを、ｐＤＯＮＲ　Ｐ３－Ｐ２中のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｕ６－２６　ｓｎＲＮＡプロモーター下にクローン化して、ｐＥ（Ｌ３－Ｌ２）ＡｔＵ６ｃｒＲＮＡを得た。ｐＥ（Ｌ３－Ｌ２）ＡｔＵ６ｃｒＲＮＡ中のＡｔＵ６プロモーター－リピート－スペーサー－リピートフラグメントをｐＥｇＰ１．２－ＴｉＤ中に再クローン化して、ｐＴｉＤＰ１．２を得た。
　ｐＭＧＴｉＤＰ２０を構築するために、マルチサイトゲータウェイアセンブリングのための中間ベクターｐＥ（Ｌ１－Ｌ４）Ｐ１．２－Ｃａｓ３ｄ－Ｃａｓ６ｄ－ＧＦＰおよびｐＥ（Ｒ４－Ｒ３）Ｐｐｕｂｉ４－Ｃａｓ１０ｄ－Ｃａｓ５ｄ－Ｃａｓ７ｄを構築した。２ｘＣａＭＶ３５Ｓプロモーターによって駆動されるＣａｓ３ｄ、Ｃａｓ６ｄおよびＧＦＰ遺伝子フラグメント、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＨＳＰ１８．２遺伝子ターミネーターをｐＤＯＮＲ　Ｐ１－Ｐ４中にクローン化して、ｐＥ（Ｌ１－Ｌ４）Ｐ１．２－Ｃａｓ３ｄ－Ｃａｓ６ｄ－ＧＦＰを得た。ｐＥｇＰｕｂｉ４＿２３７－２Ａ－ＧＦＰ由来のＰ．ｃｒｉｓｐｕｍユビキチン４－２プロモーター（Ｐｐｕｂｉ４）(Ueta et al.　2017　上掲）によって駆動されるＣａｓ１０ｄ、Ｃａｓ５ｄおよびＣａｓ７ｄ遺伝子フラグメント、およびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓリブロース－１，５－ビホスフェート カルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ小サブユニット２ｂ（ｒｂｃ）ターミネーターをｐＤＯＮＲ　Ｐ４ｒ－Ｐ３ｒ中にクローン化して、ｐＥ（Ｒ４－Ｒ３）Ｐｐｕｂｉ４－Ｃａｓ１０ｄ－Ｃａｓ５ｄ－Ｃａｓ７ｄを得た。ｐＥ（Ｌ１－Ｌ４）Ｐ１．２－Ｃａｓ３ｄ－Ｃａｓ６ｄ－ＧＦＰ、ｐＥ（Ｒ４－Ｒ３）Ｐｐｕｂｉ４－Ｃａｓ１０ｄ－Ｃａｓ５ｄ－Ｃａｓ７ｄ、ｐＥ（Ｌ３－Ｌ２）ＡｔＵ６ｃｒＲＮＡ、および目的のバイナリーベクターｐＴＧＷ１２を用いてマルチサイトゲータウェイＬＲ反応を行って、ｐＭＧＴｉＤＰ２０を得た。
　ｇＲＮＡ配列の挿入のために、標的配列を含有する２つのオリゴヌクレオチドをアニールし、制限酵素ＢｓａＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｊａｐａｎ製）を用いてｐＴｉＤＰ１．２またはｐＭＧＴｉＤＰ２０のスペーサー配列中にゴールデンゲータウェイクローニングすることによって、ｇＲＮＡ発現ベクター中にクローン化した。
（２）細胞培養およびトランスフェクション
　ヒト胚性腎細胞株２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ，ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ）を、１０％胎仔ウシ血清（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＧｌｕｔａｌＭＡＸ（登録商標）サプリメント（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００単位／ｍＬペニシリン、および１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、３７℃で６０分、５％ＣＯ２インキュベーションで培養した。トランスフェクションの前日にＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，　ＵＳＡ）に播種した。ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の推奨プロトコルに従って用いて、細胞をトランスフェクトした。６ウェルプレートの各ウェルについて、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ－ｇｒａｄｅキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて抽出された全４μｇのプラスミドを用いた。変異分析のために、４８時間後にトランスフェクト細胞を回収した。
（３）イン・ビトロ　ヌクレアーゼアッセイ
　イン・ビトロ　ヌクレアーゼアッセイは、Sinkunas et al. (2011) EMBO J., 30, 1335-42に記載のプロトコルにいくつか修正を加えて行った。Ｍ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｊａｐａｎ製）を基質として用いた。Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄタンパク質は、Ｕｎｉｔｅｃｈ，　Ｃｏ．（Ｋａｓｈｉｗａ，　Ｊａｐａｎ）によって調製された。簡単に言うと、Ｃａｓ３ｄおよびＣａｓ１０ｄタンパク質を、各Ｈｉｓ－タグ付加したＣａｓタンパク質を発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞から、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　増加　１０／３００　ＧＬカラム）を用いて精製した。Ｃａｓタンパク質をバッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５、１５０ｍＭ　ＫＣｌ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１０％グリセロール）中で溶出させた。ヌクレアーゼ反応は、バッファー［１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５、７５ｍＭ　ＫＣｌ、０．５ｍＭ　ＤＴＴ、５％グリセロール、２ｍＭ　ＡＴＰ、１００μＭ　ＮｉＣｌ２、１００μＭ　ＣｏＣｌ２、１ｘＣｕｔ　Ｓｍａｒｔ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　Ｊａｐａｎ製）、４ｎＭ　Ｍ１３ｍｐ１８　ｓｓＤＮＡ、０．７５μＭ　Ｃａｓタンパク質］中、３７℃で３０分、１時間および２時間行った。クロロホルムを加えて反応を停止し、次いで、クロロホルム抽出を行った。水相を分離し、ゲルローディングダイＰｕｒｐｌｅ（６Ｘ）（ＮＥＢ）と混合し、次いで、１％アガロースゲル上の電気泳動に付した。ＤＮＡは、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｇｅｌ　Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ，ＵＳＡ）での染色によって可視化した。実験は独立して３回繰り返し、同様の結果を得た。
（４）ルシフェラーゼレポーターアッセイ
　トランスフェクションの前日に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に、密度２．０ｘ１０４細胞／ウェルで播種した。ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者の推奨するプロトコルに従って用いて、細胞をトランスフェクトした。９６ウェルプレートの各ウェルについて、（１）Ｆｌｕｃ遺伝子をコードするｐＧＬ４．５３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）、（２）標的ＤＮＡ　フラグメントを挿入したｐＣＡＧ－ｎＬＵｘｘＵＣベクター、および（３）ＴｉＤ成分をコードしているプラスミドＤＮＡを含む全２００ｎｇのプラスミドＤＮＡを用いた。ＮａｎｏＬｕｃおよびＦｌｕｃルシフェラーゼ活性は、トランスフェクションの３日後に、Ｎａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｄｕａｌ－Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）Ｒｅｐｏｒｔｅｒ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。ホタル（Ｆｌｕｃ）活性を内部対照として用いた。ＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ比を各サンプルについて計算し、非標的化ｇＲＮＡでトランスフェクトした対照サンプルのＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ比と比較した。相対的ＮａｎｏＬｕｃ／Ｆｌｕｃ活性を用いて、ｇＲＮＡ活性を評価した。実験は独立して３回繰り返し、同様の結果を得た。
（５）ウェスタンブロッティング
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレート中、４μｇのプラスミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ　ｆｏｒ　Ｕｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｎａｋａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，　Ｊａｐａｎ）を補足したＲＩＰＡ　Ｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者のプロトコルに従って用いて、全タンパク質をＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出した。核および細胞質タンパク質の単離について、ＮＥ－ＰＥＲ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｒ　ａｎｄ　Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた。
　抽出したタンパク質を、ＰｉｅｒｃｅＴＭ　ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて定量した。サンプルを４ｘ　Ｌａｅｍｍｌｉ　Ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，ＵＳＡ）および２．５％β－メルカプトエタノールと混合し、次いで、９５℃で５分間熱処理した。変性タンパク質をＴｒｉｓ－Ｇｌｙｃｉｎｅ－ＳＤＳバッファー［０．２５Ｍ　Ｔｒｉｓ、１．９２Ｍグリシン、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ］を含有する１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルにロードし、１５０Ｖで６０分間のＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質を２０％メタノールを含有するＴｒｉｓ－グリシン－ＳＤＳバッファー中、５０Ｖで２時間、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐ　ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＳＡ）上に移した。ＴＴＢＳ（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、１３７ｎＭ　ＮａＣｌ、２．６８ｎＭ　ＫＣｌ）によって、５分で３回ブロットを洗浄し、室温にて、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｏｎｅ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，Ｊａｐａｎ）中で６０分間ブロックした。一次抗体反応は、室温で６０分間行った。膜をＴＴＢＳで５分間３回洗浄後、二次抗体　抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ＨＲＰコンジュゲート（Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　ｏｎｅ中１：１００００）を膜に加えた。室温で６０分間インキュベーション後、膜をＴＴＢＳで５分間３回洗浄した。シグナルは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標）Ｗｅｓｔ　Ｐｉｃｏ　ＰＬＵＳ　Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて製造者のプロトコルに従って検出した。画像は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ　ＬＡＳ４０００　ｍｉｎｉ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，　ＵＳＡ）を用いて得た。該実験で用いられた一次抗体は以下の通りである。抗－ＤＤＤＤＫ－タグｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ，　Ｊａｐａｎ）、抗－ＨＡ－タグｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－Ｈｉｓ－タグｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－Ｍｙｃ－タグｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－Ｓｔｒｅｐ－タグｍＡｂ（１：１０００）（ＭＢＬ）、抗－β－アクチンｍＡｂ（１：１００００）（ＭＢＬ）。実験は独立して３回繰り返し、同様の結果を得た。
（６）免疫沈降
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６０ｍｍディッシュ上で、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔ　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、１μｇの各Ｃａｓ発現ベクター（ｐＥＦｓ－ＦＬＡＧ－ＳＶ４０ＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ３ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ５ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ６ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄ－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ）およびｇＲＮＡ発現ベクターでトランスフェクトした。タンパク質抽出は、Katoh et al., (2015) J. Cell Sci., 128, 2351-2362に記載のプロトコルに従って、トランスフェクションの４８時間後に行った。簡単に言うと、培地をＰｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ　ｆｏｒ　Ｕｓｅ　ｗｉｔｈ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅｌｌ　ａｎｄ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｓ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）を含有する溶解バッファー（２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、０．１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール）に置換し、氷上で５分間インキュベートした。細胞ライゼートをピペッティングによって混合し、１．５ｍｌチューブに移し、次いで、氷上で１５分間インキュベートした。ＦＬＡＧ－ＮＬＳ－Ｃａｓ７ｄタンパク質を含有するＣａｓｃａｄｅ複合体の精製は、ＤＤＤＤＫ－タグ付加したＰｒｏｔｅｉｎ　Ｍａｇｎｅｔｉｃ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＭＢＬ）を製造者のプロトコルに従って用いて行った。得られた溶出物を、以下の抗体：抗－Ｈｉｓ－タグｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－ＤＤＤＤＫ－タグｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－β－アクチンｍＡｂ（１：１０，０００）（ＭＢＬ）、抗－マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），ＨＲＰコンジュゲート（１：１０，０００）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングによって分析した。実験は独立して３回繰り返し、同様の結果を得た。
（７）植物形質転換
　トマト植物（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ　Ｌ．）ｃｖ．　Ｍｉｃｒｏ－ＴｏｍおよびＡｉｌｓａ　Ｃｒａｉｇを部位特異的変異誘発実験に用いた。植物は、２４℃で、１６時間４０００～６０００ｌｘ照射／８時間暗所条件下、生育チャンバー中で生育させた。トランスジェニックトマト植物は、植物用ＴｉＤベクターを用いて作成した。トマト子葉由来の葉ディスクを、ＴｉＤベクターを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＧＶ２２６０株で形質転換した。１００μｇ／ｍＬカナマイシンを含有するＭＳ培地上で、Ueta et al.（上掲）の方法にしたがい、トランスジェニックカルスおよびシュートを選択し、再生させた。
（８）長鎖ＤＮＡ領域（ｌｏｎｇ　ｒａｎｇｅ）ＰＣＲによるＤＮＡ欠失分析
　ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中のＤＮＡ欠失を検出するために、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲおよび長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ産物のプールのクローニングを行った。最初に、Ｇｅｎｏ　Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｖｉｏｇｅｎｅ－ＢｉｏＴｅｋ，　Ｔａｉｗａｎ）を用いて、ゲノムＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞から抽出した。次に、ネステッドＰＣＲを行って、長鎖ＤＮＡ領域を特異的に増幅した。まず、抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として用い、種々の長さ（３．５ｋｂ～２５ｍｂ）の標的ＤＮＡ領域を増幅するように設計された、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ用の何種類かの特異的プライマーセット（表５）を用いて、標的ＤＮＡ領域を増幅した。最初のＰＣＲ反応は、ＫＯＤ　ＯＮＥ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（ＴＯＹＯＢＯ，　Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）を用いて、下記の条件下で行った。１０秒９８℃、５秒６０℃および５０秒（アンプリコン：１５－２０ｋｂ）または１５０秒（アンプリコン：１０－１５ｋｂ）または２００秒（アンプリコン：＜１０ｋｂ）６８℃を３５サイクル。次いで、ＰＣＲ産物を１００～１０，０００倍に希釈し、ネステッドＰＣＲの鋳型として用いた。ネステッドＰＣＲは、また、上記と同じ条件下で行った。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上の電気泳動によって分離し、ＧｅｌＲｅｄ（登録商標）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｇｅｌ　Ｓｔａｉｎ（Ｂｉｏｔｉｕｍ）での染色によって視覚化した。ネステッドＰＣＲ産物をプールし、Ｍｏｎｏｆａｓ（登録商標）ＤＮＡ　ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　Ｉ（ＧＬ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｊａｐａｎ）を用いて精製した。ＰＣＲ産物の精製混合物を、Ｍｉｇｈｔｙ　ＴＡ－ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ　Ｂｉｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いてｐＭＤ２０－Ｔベクター中にクローン化した。ＡＡＶＳ－ｔｉｄ　ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）のための１１９クローン、およびｈＥＭＸ１－ｔｉｄ　ＧＴＴ＿９（－）のための２０クローンをピックアップし、Ｍ１３　ＵｎｉおよびＭ１３　ＲＶプライマーを用いてサンガー配列決定した。サンガー配列決定の結果をＢＬＡＴＮサーチおよびＣｌｕｓｔａｌＷプログラムを用いて分析して、ＤＮＡ欠失を同定した。
　トマト植物における長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲによる変異分析のために、ゲノムＤＮＡを独立して、ＳｌＩＡＡ９　ＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）およびＧＴＴ＋ＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５（－）（＋）についてそれぞれ２０個のＴ０トランスジェニックＴｉＤトマトカルスから、ＳｌＲＩＮ　ＧＴＣ＿４００３－４２３８（＋）について３０個のＴ０カルスおよび１２個のＴ０シュートから、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｎｔ　ＩＩ（ＴａＫａＲａ　Ｂｉｏ）を用いて単離した。大きい欠失を分析するために、各ｇＲＮＡの標的部位を含む約５～６ｋｂｐの領域を、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（ＴａＫａＲａ　Ｂｉｏ）および長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲのための数種類のプライマーセット（表５）を用いて、ＳｌＩＡＡ９　ＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）のための最初のＰＣＲによって、およびＳｌＩＡＡ９　ＧＴＴ＋ＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５（－）（＋）およびＳｌＲＩＮ　ＧＴＣ＿４００３－４２３８（＋）のためのネステッドＰＣＲによって、下記の条件下で増幅した。１０秒９８℃、１５秒６０℃、および７分６８℃を３５サイクル。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル電気泳動によって分析し、エチジウムブロマイドで染色した。ＳｌＩＡＡ９　ＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）について最初のラウンドのＰＣＲ産物をプールし、哺乳動物ＤＮＡための方法において記載したようにクローニングのために精製した。ＳｌＩＡＡ９　ＧＴＴ＋ＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５（－）（＋）およびＳｌＲＩＮ　ＧＴＣ＿４００３－４２３８（＋）トランスジェニックカルスのためのネステッドＰＣＲを行い、アガロースゲルで分離された小さいＤＮＡフラグメントだけをさらなる分析のためにゲルから抽出し、精製した。ＳｌＲＩＮ　ＧＴＣ＿４００３－４２３８（＋）トランスジェニックシュートのために、ネステッドＰＣＲを同じプライマーセットを用いて２回行い、小さいＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動後に抽出した。抽出フラグメントのクローニングは上記の通りに行った。各クローン化プラスミドをサンガーシークエンシングによって分析した。シークエンシング用のクローン数は、結果に記載するように各サンプルで異なった。
（９）短鎖ＤＮＡ領域（short range）ＰＣＲ産物における変異分析
　トランスフェクトされたヒト細胞およびトランスジェニックトマトカルスおよびシュートに導入された変異を分析するために、ｇＲＮＡの標的座周辺の約４００ｂｐの領域を、上記のＰＣＲキットを用いる短鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲによって増幅した。Ｃｅｌ－１アッセイにおいて、トランスフェクトされたヒト細胞およびトランスジェニック植物由来のＰＣＲ産物をＳｕｒｖｅｙｏｒ（登録商標）Ｍｕｔａｔｉｏｎ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ＩＤＴ）を用いて消化した。ＰＣＲ－ＲＦＬＰにおいて、トランスジェニックトマト植物由来のＰＣＲ産物をＡｃｃＩで消化した。変異および野生型ＤＮＡフラグメントを２～２．５％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ＧｅｌＲｅｄによって染色した。ＰＣＲアンプリコンは、また、ＴＡ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒ（ＴａＫａＲａ　Ｂｉｏ）中にクローン化して、サンガー法によってその配列を決定した。オンターゲットおよびオフターゲット変異分析のためのアンプリコンディープ配列を、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ－ｌａｂｅｌｌｅｄ　ＰＣＲ（Ueta et al., 2017、上掲）を用いて行った。ＰＣＲ産物をＴｒｕｓｅｑ　ｏｎ　ｔｈｅ　ＭｉＳｅｑ　ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，　ＵＳＡ）に付した。ＭｉＳｅｑデータを、ＣＬＣ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　ｖｅｒｓｉｏｎ　７．５．１（ＣＬＣ　ｂｉｏ，　Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて分析した。変異分析に用いられた短領域ＰＣＲ用の全プライマーは、表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
実施例１：ＴｉＤシステムのヌクレアーゼモジュールの同定
　Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のＣａｓエフェクタータンパク質の成分、およびｃｒＲＮＡ配列をＢＬＡＳＴプラグラムを用いて評価した。Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＰＣＣ９８０８株のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ　ＴｉＤ遺伝子座は、７．６ｋｂにわたり、８つのＣａｓ遺伝子：Ｃａｓ１ｄ、Ｃａｓ２ｄ、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ４ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ、およびＣａｓ１０ｄ、次いで３６個のリピート－スペーサー単位のアレイからなる。ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－Ａ、Ｂ、Ｃ、ＥおよびＦシステムのＤＮＡ切断において機能するＨＤドメインは、Ｃａｓ３ｄには無かったが、Ｃａｓ１０ｄがそのＮ末端領域にＨＤ様ヌクレアーゼドメインを有することを見出した。該ＨＤ様ドメインがヌクレアーゼとして機能するかどうかを確認するために、イン・ビトロで合成したＣａｓ１０ｄタンパク質および基質としてＭ１３ｍｐ１８一本鎖ＤＮＡを含有する反応ミックスにおいて、ＡＴＰおよび金属イオンＮｉ２＋およびＣｏ２＋の存在下でイン・ビトロ　ヌクレアーゼアッセイを行った。その結果、Ｃａｓ１０ｄが一本鎖ＤＮＡを切断できることが示され、Ｃａｓ１０ｄがＴｉＤシステムにおいてヌクレアーゼとして作用することが示された（図１）。
実施例２：細胞中でのゲノム編集ツールとしてのＴｉＤの生物学的活性
（１）ＴｉＤのエンドヌクレアーゼ活性
　各単一Ｃａｓ発現ベクターおよびｃｒＲＮＡ発現ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に感染させ、プルダウンアッセイにより、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄおよびＣａｓ１０ｄとｃｒＲＮＡとがイン・ビボで複合体を形成することを確認した。
　上記ＴｉＤ複合体の生物学的ゲノム編集活性を評価するために、ルシフェラーゼ一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）組換えシステムを用いたルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーターアッセイを行った(図２ａ）。終止コドンによって分離される３００ｂｐ相同性アームならびにＴｉＤ標的部位を含有するヒトＡＡＶＳ１遺伝子フラグメントを含有するＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼを組換えレポーターとして用いた。各単一Ｃａｓ発現ベクター、ＴｉＤ　ｃｒＲＮＡ発現ベクター、および標的配列が導入されたＬＵＣレポーターベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に同時トランスフェクトし、トランスフェクション後７２時間、ルミネッセンスによりエンドヌクレアーゼ切断を検出した。使用した標的配列を表２に示す。
　Ｃａｓ１０ｄ　ＨＤ様ドメインの機能を評価するために、野生型Ｃａｓ１０ｄおよびＨＤ様ドメイン中に変異（Ｈ１７７Ａ）を有するｄＣａｓ１０ｄを含むＴｉＤ　Ｃａｓ遺伝子発現ベクターと、ｇＲＮＡ　ＡＡＶＳ１　ＧＴＣ＿７０－１７０（＋）およびＡＡＶＳ１　ＧＴＣ＿１５９－１９６（＋）、および非標的ｇＲＮＡを用いるｌｕｃレポーターアッセイを行った。各単一Ｃａｓ遺伝子の発現ベクターとして、ｐＥＦｓ－Ｍｙｃ－ｂｐＮＬＳ－Ｃａｓ１０ｄまたはｄＣａｓ１０ｄ（Ｈ１７７Ａ）－ｂｐＮＬＳ－６ｘＨｉｓ、およびｐＥＦｓ－ＳＶ４０ＮＬＳ　ＨＡ－Ｃａｓ３ｄ、Ｓｔｒｅｐｔ－Ｃａｓ５ｄ、Ｍｙｃ－Ｃａｓ６ｄ、またはＦＬＡＧ－Ｃａｓ７ｄをｌｕｃレポーターアッセイに用いた。結果を図２ｂに示す。
　この結果により、Ｃａｓ１０ｄが実際に細胞におけるゲノム編集に利用できるヌクレアーゼ活性を有することが分かった。ＴｉＤの発現は、ｌｕｃレポーターアッセイにおいて、非標的対照よりも顕著に高い（２～４倍）活性をもたらした（図２ｂ～図２ｅ）。Ｃａｓ１０ｄまたはＣａｓ３ｄ以外のＴｉＤ　Ｃａｓ遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした場合、ルシフェラーゼ活性は、非標的対照のそれに匹敵した(図２ｃ）。この結果は、ＴｉＤの活性にはＣａｓ３ｄの他にＣａｓ１０ｄが必須であることを示す。Ｍ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＰＣＣ９８０８株のもともとのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座において、３５塩基および３６塩基の両方のプロトスペーサー配列を用いて特定のゲノムＤＮＡを標的化した。ＴｉＤ活性は、３５塩基または３６塩基ｇＲＮＡのいずれかを用いて評価し、両方のｇＲＮＡが細胞におけるゲノム編集のために機能した（図２ｄ）。また、成熟ｃｒＲＮＡまたはプレ成熟ｃｒＲＮＡのいずれかを用いてＴｉＤ活性を試験した（図２ｅ）。その結果、ＴｉＤでは、プレ成熟ｃｒＲＮＡの発現が有効であることが分かった。
（２）ＴｉＤの標的配列設計
　さらに、ゲノム編集に必要とされるＴｉＤの標的ｇＲＮＡ配列における重要なヌクレオチドについて、スプリットタイプのベクターを用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｌｕｃレポーターアッセイを用いて評価した。簡単に言うと、ＰＡＭ配列に隣接する３５塩基配列の各位置に変異を入れたＡＡＶＳ１＿ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）標的ｇＲＮＡを調製し、各ｇＲＮＡを用いるＴｉＤ活性をｌｕｃレポーターアッセイによって測定した。結果を図３ａに示す。その結果、ＰＡＭ配列３’側の１、６、１２、１８または２４ｎｔ位置にヌクレオチドのミスマッチがあった場合でも、ＴｉＤ活性が保持されていた。すなわち、ＰＡＭ配列３’側の１、６、１２、１８または２４ｎｔ位置の１塩基ミスマッチに対するオフターゲット変異導入の可能性が高いことが判明した。しかし、ＰＡＭ配列３’側の１、６、１２、１８または２４ｎｔ位置に加えて、１～２４ｎｔ位置にさらなる１つのミスマッチ、すなわち１～２４ｎｔ位置に２つのミスマッチを持つ標的に対しては、ＴｉＤ活性は有意に減少することが判明した（図３ｂ）。さらには、標的配列に対していずれか３つのミスマッチが見いだされた場合は、その標的に対して、ほぼ完全にＴｉＤ活性を抑制することができ、３塩基のミスマッチを含む類似配列に対するオフターゲット変異導入を抑制できることが明らかとなった（図３ｃ）。さらに、ＰＡＭ配列３’側の２４ｎｔ以降（例えば、２４～３５ｎｔ）の位置に１つまたは２つのミスマッチを持つ標的に対しては、ＴｉＤ活性が保持されていた（図３ａおよび図３ｂ）。
　さらに、ＡＡＶＳ１＿ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）の５’側から１～３０塩基配列を標的として、上記の３５塩基配列の場合と同様に、ＰＡＭ配列に隣接する３０塩基配列の各位置に変異を入れたｇＲＮＡを調製し、各ｇＲＮＡを用いるＴｉＤ活性をｌｕｃレポーターアッセイによって測定した。結果を図３ｄに示す。その結果、ＰＡＭ配列３’側の６、１２、１８、２４～３０ｎｔのいずれかの位置にヌクレオチドのミスマッチがあった場合に、ＴｉＤ活性が保持されていた。したがって、標的配列が３５塩基長である場合は、ＰＡＭ配列の３’側の１、６、１２、１８、２４～３５番目のそれぞれの位置（１６箇所）における１塩基ミスマッチがオフターゲット変異を引き起こすリスクがあるのに対して、標的配列が３０塩基長である場合は、１塩基ミスマッチによるオフターゲット変異リスクが、ＰＡＭ配列の３’側の６、１２、１８、２４～３０番目のそれぞれの位置（１０箇所）へと低減した。
（３）Ｃａｓ遺伝子へのＮＬＳの付加の効果
　さらに、Ｎ末端および／またはＣ末端にモノパータイト型核ＮＬＳ（ＳＶ４０ＮＬＳ）またはバイパータイト型ＮＬＳ（ｂｐＮＬＳ）を付加した各Ｃａｓ遺伝子を含む発現カセット（図４ａ）をそれぞれ別々のベクターに搭載させ、標的配列が導入されたＬＵＣレポーターベクターと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし導入し、ｌｕｃレポーターアッセイを行った。さらに、トランスフェクト細胞の抽出液（サイトソルおよび核）から各Ｃａｓ－ＮＬＳタンパク質を各タグに対する抗体を用いて検出した（図４ｃおよび図４ｄ）。その結果、興味深いことに、ｂｐＮＬＳは、Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ１０ｄのＮ末端およびＣ末端の両方に付加することにより、Ｎ末端あるいはＣ末端に単独で付加するよりも効果的に機能した（図４ｂ）。しかし、Ｃａｓ７ｄに付加したｂｐＮＬＳは、核内で強く発現したものの（図４ｄ）、ＴｉＤ活性を破壊した（図４ｂ)。ＳＶ４０ＮＬＳは各Ｃａｓタンパク質のＮ末端への付加により効果的に機能した（図４ａ）。
実施例３：動物細胞におけるＴｉＤ発現ベクターの最適化
　ＴｉＤ　ｇＲＮＡ標的に対応する内在性ゲノムＤＮＡ領域を標的とするゲノム編集を行うため、まず、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中におけるＣａｓタンパク質の発現レベルを再評価した。いくつかの型のＴｉＤ　Ｃａｓ遺伝子発現ベクター［各Ｃａｓ遺伝子について別々の発現ベクター、３遺伝子（Ｃａｓ５－Ｃａｓ６－Ｃａｓ７）発現カセットおよび２遺伝子（Ｃａｓ３－Ｃａｓ１０）発現カセットをそれぞれ含有する２セット型ベクター、および５遺伝子（全Ｃａｓ）発現カセットを含有するオールインワン型ベクター］を構築した（図５ａ）。２セット型ベクター中のＣａｓ３およびＣａｓ１０、またはＣａｓ５、Ｃａｓ６およびＣａｓ７、およびオールインワン型ベクター中の全Ｃａｓ遺伝子は、同時に発現する単一の転写産物を生じるように、２Ａ自己切断型ペプチドを介して融合させた。各Ｃａｓ遺伝子のＮ末端には異なるタグを有するＳＶ４０ＮＬＳを付加した。上記の各Ｃａｓ発現ベクターおよび２セット型ベクターの種々の組み合わせ、またはオールインワン型ベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトして、細胞中での各Ｃａｓタンパク質の発現を測定した。発現レベルは、Ｃａｓに融合させた各タグに特異的な抗体を用いてウェスタンブロッティングによって検出した（図５ｂ）。さらに、単一Ｃａｓ発現ベクターにおいて、ｐＥＦベクター中の翻訳伸長因子１αプロモーター、およびｐＣＡＧ中のチキンβアクチンプロモーターを用いた場合のＣａｓタンパク質発現レベルを同様に検出した（図５ｃ）。
　その結果、上記のベクターのうち、単一Ｃａｓ遺伝子発現ベクターでのトランスフェクションが、ヒト細胞において最も高いＣａｓタンパク質発現をもたらした。また、オールインワン型ベクターよりも、それぞれ１または２以上のＣａｓ遺伝子を含む２以上のＣａｓ発現ベクター（セパレート型ベクター）を用いた方が高いＣａｓタンパク質発現をもたらすことが分かった。
実施例４：動物細胞におけるＣＲＩＳＰＲ　ＴｉＤにより誘導されるゲノム編集
　ＴｉＤシステムにより長鎖領域欠失を誘導するか、ルシフェラーゼＳＳＡアッセイを用いて調べた。標的として、ヒトＥＭＸ１遺伝子に関してｈＥＭＸ１　ＧＴＴ９（－）、およびＡＡＶＳ遺伝子に関してＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）を選択した。上記の標的配列をｇＲＮＡ発現ベクター中に組み込み、各単一Ｃａｓ発現ベクターと共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中にトランスフェクトした。ｈＥＭＸ１およびＡＡＶＳ標的部位付近の５－１９ｋｂの側面に位置する数種類のプライマーセットを用いて（表５）、ＴｉＤシステムを有するＨＥＫ２９３Ｔ細胞の全ＤＮＡから、ＤＮＡフラグメントをＰＣＲ増幅し（図６ａ、ｂ）、クローン化し、サンガー法によって配列決定した。結果を図６ａ－ｃに示す。
　結果は、ＴｉＤが、両標的部位で５ｋｂから１９ｋｂを超える長鎖領域欠失を導入したことを示した。興味深いことに、クローン化したＰＣＲ産物中の変異分布は標的によって異なった。すなわち、ｈＥＭＸ１　ＧＴＴ＿９（－）による変異は低モザイクを示したが、ＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）による変異はより変化した変異配列を示した(図６ｂ、ｃ）。ＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）範囲配列は、いくつかの特異的な特徴を共有した。すなわち、主要な長鎖領域欠失のサイズは、ランダムではなく、標的ＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）の場合、５．２－５．５ｋｂおよび１７ｋｂ欠失としていくつかの限定を示し、主として二方向性の欠失が検出された（図６ｃ、図７ａ、ｂ）。これらの特徴は、タイプＩ－Ｅ（非特許文献１）やタイプＩＩエフェクター（Ｃａｓ９やＣｐｆ１）による変異後のものと異なっていた。また、マイクロホモロジーおよび挿入がＴｉＤ変異部位に観察された(図６ａ、図７ａ、ｂ）。クローン化ＤＮＡフラグメントにおけるＴｉＤによる長鎖領域欠失に関する変異率は、ｈＥＭＸ１　ＧＴＴ＿９（－）およびＡＡＶＳ　ＧＴＣ＿７０－１０７（＋）でそれぞれ、５５．０％および５７．１％であった。
実施例５：植物におけるＴｉＤによる標的変異導入
　コドン最適化したＣａｓ遺伝子の発現のための植物細胞特異的プロモーターおよびｃｒＲＮＡを含むＴｉＤベクターを構築して、トマト植物中に部位特異的変異誘発を導入した。ＴｉＤベクターとして、５つのＣａｓ遺伝子を単一発現カセットに含むベクター（ｐＴｉＤＰ１．２）、および５つのＣａｓ遺伝子を２つの発現カセットに分けて含むベクター（ｐＭＧＴｉＤＰ２０）を構築した（図８ｂ）。ＴｉＤのｇＲＮＡは、トマトＩＡＡ９（ＳｌＩＡＡ９）遺伝子（単為結実に重要）およびトマトＲＩＮ（ＳｌＲＩＮ）遺伝子（果実成熟に関与）中の３５塩基配列を標的化するように設計された。ＳｌＩＡＡ９遺伝子について、ｌｕｃレポーターアッセイを行ってＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５－Ａ（－）およびＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）を選択した（図８ａ）。ＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）のための単一のｇＲＮＡ、およびＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５－Ａ（－）およびＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５－Ｂ（＋）のための複数のｇＲＮＡ（表２)の両方を更なる分析に用いた。設計されたｇＲＮＡを含有するＴｉＤベクターを、アグロバクテリウム媒介形質転換によってトマト栽培種Ｍｉｃｒｏ－ＴｏｍまたはＡｉｌｓａ　Ｃｒａｉｇ中に形質転換した。トランスジェニックトマトのカルスにおけるＴｉＤによって効率よく導入された変異を、Ｃｅｌ－１、ＰＣＲ－ＲＦＬＰ、長鎖ＤＮＡ領域ＰＣＲ、およびシークエンシングによって分析した。
　ｐＭＧＴｉＤＰ２０ベクターを用いたトマト栽培種Ｍｉｃｒｏ－Ｔｏｍのトランスジェニックトマトにおいて、長鎖領域欠失（図９、図１０ａ－ｃ）が検出された。長鎖領域欠失の向きおよび変異率は、配列分析によって決定された（図９）。トランスジェニックカルスにおいて、ＳｌＩＡＡ９　ＧＴＣ＿ｇＲＮＡ１（＋）によって導入されたいくつかの型の長鎖欠失がＰＣＲによって検出され、クローン化ＤＮＡの配列決定により、１つのカルス系統において、６．７％の変異率（１／１５シークエンシングクローン）を有する混合ＰＣＲ産物から二方向性の欠失（Δ２４６３ｎｔ）が同定された（＃５、図９、上左パネルレーン５）。対照的に、ＳｌＡＡ９　ＧＴＴ＋ＧＴＴ＿ｇＲＮＡ５－（－）（＋）およびＳｌＲＩＮ　ＧＴＣ＿４００３－４２３８（＋）を用いて、それぞれ１／２０および１／３０トランスジェニックカルスにおいて特異的欠失バンドが検出された（図９、真ん中の左パネルレーン３および下の左パネルレーン６）。これらの特異的バンドをアガロースゲルから精製し、配列分析した結果、それぞれΔ４３０５ｎｔおよびΔ４９３０ｎｔの二方向性欠失を有するこれらのクローンにおいて同じ１００％変異フラグメントが示された（図９）。また、ＳｌＲＩＮ　ＧＴＣ＿４００３－４２３８（＋）について再生トマトシュートにおける変異を分析し、トランスジェニックシュート１２個体中、４つが、長領域ＰＣＲによって特異的バンドを示した（図１０ａ）。興味深いことに、２種類の長領域欠失（Δ４９３０ｎｔおよびΔ７２５７ｎｔ）を有する同様のバンドパターンが検出され（図１０ｃ）、これにより、２対立遺伝子変異が示された。
　ｐＴｉＤＰ１．２ベクターを用いたトマト栽培種Ｍｉｃｒｏ－ＴｏｍまたはＡｉｌｓａ　Ｃｒａｉｇのトランスジェニックトマトにおいて、短鎖領域の挿入および／または欠失が検出された。これらのトランスジェニックシュートは、１００％変異ＤＮＡを含有していた（図１１）。これらの結果は、トマトカルスからの再生の間にトランスフェクトトマトシュートにおいて変異率が増加したことを示唆した。該シュート由来の標的ＤＮＡでのクローン化ＰＣＲ産物の配列分析は、ＴｉＤが２対立遺伝子変異をもたらしたことを示した。２対立遺伝子変異は、また、市販のトマト栽培種Ａｉｌｓａ　Ｃｒａｉｇを用いても生じた（図１１、図１２）。成熟２対立遺伝子トマト植物は、明白な典型的なＳｌＩＡＡ９破壊表現型、すなわち、単為結実および葉形態における変化を示した。ホモ接合体変異体は、Ｔ０世代から有効に単離された（図１１）。したがって、ＴｉＤによる変異植物のトランスジェニック世代における所望の表現型は、遺伝的に次世代に受け継がれることが分かった。
　次に、明らかなＩＡＡ９遺伝子ノックアウト表現型を示しているトマト植物Ａｉｌｓａ　ＣｒａｉｇのＴ０世代におけるオフターゲット変異を分析した。９～１１個のミスマッチを有する３つの潜在的なオフターゲット部位を選択した（図１３)。該オフターゲット部位付近のＰＣＲ産物を増幅し、次世代シークエンサー（ＭｉＳｅｑ）を用いて配列決定した。標的配列上のいくつかの塩基位置に単一ミスマッチを有する種々のｇＲＮＡを用いてｌｕｃレポーターアッセイを行い、いくつかのミスマッチ位置でＴｉＤ活性が可能であったことを示されたが（図３ａ－ｄ）、トマト植物のＴ０世代において、オフターゲット変異は皆無かそれに近かった（図１３）。
　本発明のＴｉＤシステムの、種々の範囲の長い欠失を単一の標的部位に生じさせる能力は、単純かつ効果的な多重遺伝子機能スクリーニングを可能とする長領域染色体編集を可能にする。ＣＲＩＳＰＲツールボックスにおける新規なテクノロジーとして、ＴｉＤはゲノム編集における新たな可能性に通ずる。
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SEQ ID NO:6; Monopartite nuclear localizing signal (NLS) amino acid sequence
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SEQ ID NO:8; TiDcrRNA containing repeat (37b) and spacer (35b of N).  N is any nucleotide constituting a sequence that forms base pairs with a target nucleotide sequence
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Claims (22)

  1. 　細胞内の標的ヌクレオチド配列を改変する方法であって、該細胞に、
    　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含むベクター系又は発現カセット系、及び
    　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を導入することを含み、
    　前記ベクター系が、第一のベクター及び第二のベクターを含み、
    　前記発現カセット系が、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含み、
    　前記第一のベクター又は前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第一の調節エレメントを含み、
    　前記第二のベクター又は前記第二の発現カセットが、前記群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第二の調節エレメントを含む、方法。
  2. 　細胞内の標的遺伝子の発現を抑制するための方法であって、前記標的ヌクレオチド配列が標的遺伝子の少なくとも一部のヌクレオチド配列である、請求項１記載の方法。
  3. 　前記Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡの５’末端および／または３’末端側に核移行シグナルをコードする配列が付加されている、請求項１または２記載の方法。
  4. 　前記核移行シグナルが、モノパータイト型核移行シグナルまたはバイパータイト型核移行シグナルである、請求項３記載の方法。
  5. 　Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがベクター系に含まれ、前記第一のベクターが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端側に、１個のモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されているか、あるいは２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、請求項４記載の方法。
  6. 　Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがベクター系に含まれ、前記第一のベクターが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端側及び３’末端側の両方に、バイパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、請求項４記載の方法。
  7. 　前記第二のベクターがＣａｓ７ｄをコードするＤＮＡを含み、該ＤＮＡの５’末端および／または３’末端側に、２個又は３個のタンデムに連結したモノパータイト型核移行シグナルをコードする配列が付加されている、請求項５又は６項記載の方法。
  8. 　前記第一の調節エレメントおよび／または前記第二の調節エレメントが、ヒト翻訳伸長因子遺伝子プロモーター又はＣＡＧキメラ合成プロモーターである、請求項１～７のいずれか１項記載の方法。
  9. 　前記ベクター系が第三ないし第五のベクターをさらに含み、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがそれぞれ別々に第一ないし第五のベクターに含まれる、請求項１～８のいずれか１項記載の方法。
  10. 　Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡが発現カセット系に含まれ、前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ及びＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡを含み、前記第二の発現カセットが、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含み、かつ、前記第一の発現カセット及び前記第二の発現カセットが１つのベクターに搭載されている、請求項１～４のいずれか１項記載の方法。
  11. 　前記ｃｒＲＮＡ又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡの細胞への導入がベクターを介して行われる、請求項１～１０のいずれか１項記載の方法。
  12. 　前記ｃｒＲＮＡがプレ成熟型ｃｒＲＮＡである、請求項１～１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 　前記Ｃａｓ３ｄ、前記Ｃａｓ５ｄ、前記Ｃａｓ６ｄ、前記Ｃａｓ７ｄ及び前記Ｃａｓ１０ｄがＭ．　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来のものである、請求項１～１２のいずれか１項記載の方法。
  14. 　前記細胞が真核細胞である、請求項１～１３のいずれか１項記載の方法。
  15. 　改変が塩基の欠失、挿入、又は置換である、請求項１～１４のいずれか１項記載の方法。
  16. 　改変が数キロベース～数十キロベースの欠失である、請求項１５記載の方法。
  17. 　細胞内の標的ヌクレオチド配列を改変するためのキットであって、
    　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含むベクター系又は発現カセット系、及び
    　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を含み、
    　前記ベクター系が、第一のベクター及び第二のベクターを含み、
    　前記発現カセット系が、第一の発現カセット及び第二の発現カセットを含み、
    　前記第一のベクター又は前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡからなる群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第一の調節エレメントを含み、
    　前記第二のベクター又は前記第二の発現カセットが、前記群より選択される少なくとも１つのＤＮＡ、及び前記ＤＮＡの転写を調節する第二の調節エレメントを含む、キット。
  18. 　Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがベクター系に含まれ、前記ベクター系が第三ないし第五のベクターをさらに含み、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡがそれぞれ別々に第一ないし第五のベクターに含まれる、請求項１７記載のキット。
  19. 　Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ６ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡが発現カセット系に含まれ、前記第一の発現カセットが、Ｃａｓ３ｄをコードするＤＮＡ及びＣａｓ６ｄをコードするＤＮＡを含み、前記第二の発現カセットが、Ｃａｓ５ｄをコードするＤＮＡ、Ｃａｓ７ｄをコードするＤＮＡ、及びＣａｓ１０ｄをコードするＤＮＡを含む、請求項１７記載のキット。
  20. 　細胞内の標的ヌクレオチド配列を特異的に標的化する方法であって、該細胞に、
    　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ及びＣａｓ７ｄ、又はこれらのタンパク質をコードする核酸、及び
    　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を導入することを含み、
    　前記標的ヌクレオチド配列は、該標的ヌクレオチド配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から１、６、１２、１８及び２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つ又は２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように設計される、方法。
  21. 　細胞内の標的ヌクレオチド配列を特異的に改変する方法であって、該細胞に、
    　（ｉ）ＣＲＩＳＰＲタイプＩ－ＤのＣａｓタンパク質　Ｃａｓ３ｄ、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ６ｄ、Ｃａｓ７ｄ及びＣａｓ１０ｄ、又はこれらのタンパク質をコードする核酸、及び
    　（ｉｉ）前記標的ヌクレオチド配列と塩基対を形成する配列を含むｃｒＲＮＡ、又は前記ｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡ
    を導入することを含み、
    　前記標的ヌクレオチド配列は、該標的ヌクレオチド配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から１、６、１２、１８及び２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つ又は２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように設計される、方法。
  22. 　前記標的ヌクレオチド配列は、該標的ヌクレオチド配列に対して、ＰＡＭ配列の３’側から６、１２、１８及び２４番目の塩基からなる群から選ばれるいずれか１つの塩基、あるいは２４番目以降の１つ又は２つの塩基が相違している類似配列が存在しないように設計される、請求項２０又は２１記載の方法。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022075419A1 (ja) 2020-10-08 2022-04-14 国立大学法人徳島大学 Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的ヌクレオチド配列改変技術
WO2023177310A1 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Type i-d crispr-cas systems and uses thereof

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018225858A1 (ja) * 2017-06-08 2018-12-13 国立大学法人大阪大学 Ｄｎａが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット
WO2019039417A1 (ja) * 2017-08-21 2019-02-28 国立大学法人徳島大学 ヌクレオチド標的認識を利用した標的配列特異的改変技術

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018225858A1 (ja) * 2017-06-08 2018-12-13 国立大学法人大阪大学 Ｄｎａが編集された真核細胞を製造する方法、および当該方法に用いられるキット
WO2019039417A1 (ja) * 2017-08-21 2019-02-28 国立大学法人徳島大学 ヌクレオチド標的認識を利用した標的配列特異的改変技術

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MULEPATI, SABIN , ANNIE HÉROUX, SCOTT BAILEY: "Crystal structure of a CRISPR RNA-guided surveillance complex bound to a ssDNA target", SCIENCE, vol. 345, 2014, pages 1479 - 1484, XP055739231 *
RYAN N JACKSON , SARAH M GOLDEN , PAUL B G VAN ERP , JOSHUA CARTER , EDZE R WESTRA , STAN J J BROUNS , JOHN VAN DER OOST , THOMAS : "Crystal structure of the CRISPR RNA-guided surveillance complex from Escherichia coli", SCIENCE, vol. 345, 2014, pages 1473 - 1479, XP055739228 *
ZHAO HONGTU, SHENG GANG, WANG JIUYU, WANG MIN, BUNKOCZI GABOR, GONG WEIMIN, WEI ZHIYI, WANG YANLI: "Crystal structure of the RNA-guided immune surveillance Cascade complex in Escherichia coli", NATURE, vol. 515, 2014, pages 147 - 150, XP055739222 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022075419A1 (ja) 2020-10-08 2022-04-14 国立大学法人徳島大学 Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的ヌクレオチド配列改変技術
JPWO2022075419A1 (ja) * 2020-10-08 2022-04-14
JP7454881B2 (ja) 2020-10-08 2024-03-25 国立大学法人徳島大学 Ｃｒｉｓｐｒタイプｉ－ｄシステムを利用した標的ヌクレオチド配列改変技術
WO2023177310A1 (en) * 2022-03-18 2023-09-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Type i-d crispr-cas systems and uses thereof

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