WO2022181796A1

WO2022181796A1 - 植物における半合理的なゲノム進化工学手法

Info

Publication number: WO2022181796A1
Application number: PCT/JP2022/008035
Authority: WO
Inventors: 敬二西田; 善平島谷; 潮藤倉
Original assignee: 国立大学法人神戸大学
Priority date: 2021-02-26
Filing date: 2022-02-25
Publication date: 2022-09-01
Also published as: CN117157399A; JPWO2022181796A1; US20240132898A1; EP4299738A1

Abstract

本開示は、個別の変異クローンとして単離できるようなＤＮＡ分子の部位特異的な改変方法を提供する。　本開示によれば、二本鎖ＤＮＡの標的化した部位が改変された植物細胞を生産するための方法であって、（ｉ）目的の二本鎖ＤＮＡを含む植物細胞を提供する工程と、（ｉｉ）該二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体を提供する工程と、（ｉｉｉ）該複合体を、該植物細胞がトランスフェクトされる条件に配置する工程と、（ｉｖ）該トランスフェクトされた植物細胞を、該標的化された部位において該二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の改変を誘導する条件に配置する工程と、（ｖ）該複合体が導入された細胞および／または該改変が導入された細胞を選択する工程とを含む、方法が提供される。

Description

植物における半合理的なゲノム進化工学手法

　本開示は、ＤＮＡの二重鎖切断を行わずに、また外来ＤＮＡ断片の挿入を行わずに、脱塩基反応を利用してゲノムの特定領域内の核酸塩基の改変を可能とするゲノム配列の改変方法に関する。

　近年、植物に遺伝子を導入して形質転換植物を作出する研究が多くなされており、数多くの植物種で成功した例が報告されている。このような植物における育種手法としては、対象の植物にランダムな変異を導入し、目的の形質が得られたものを選抜する従来の方法が多く採用されており、また一部では、一般的なＤＮＡ二重鎖切断を伴うゲノム編集技術を用いて、限られた部位に限られたパターンの変異を導入することで形質転換植物を作出している。

　ところで、本発明者らは既に、ＤＮＡグリコシラーゼを用い、これとＤＮＡ配列認識能のある分子とを連結させることにより、ＤＮＡ二重鎖切断を伴うことなく、特定のＤＮＡ配列を含む領域における核酸塩基変換によるゲノム配列の改変に成功したことを報告している（国際公開第２０１６／０７２３９９号）。そこで本発明者らは、この技術をさらに発展させ、微生物だけではなく、植物を含む高等な多細胞生物（細胞集団）に様々な変異を導入したのち、最終的には個別の変異クローンとして単離できるようなＤＮＡ分子の部位特異的な改変方法を提供する。

　したがって、本開示は以下を提供する。
（項目１）
　二本鎖ＤＮＡの標的化した部位が改変された植物細胞を生産するための方法であって、（ｉ）目的の二本鎖ＤＮＡを含む植物細胞を提供する工程と、
（ｉｉ）該二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体を提供する工程と、
（ｉｉｉ）該複合体を、該植物細胞がトランスフェクトされる条件に配置する工程と、
（ｉｖ）該トランスフェクトされた植物細胞を、該標的化された部位において該二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の改変を誘導する条件に配置する工程と、
（ｖ）該複合体が導入された細胞および／または該改変が導入された細胞を選択する工程と
　を含む、方法。
（項目２）
　前記核酸配列認識モジュールが、Ｃａｓの少なくとも１つのＤＮＡ切断能が失活したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター、およびＰＰＲモチーフからなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目３）
　前記核酸配列認識モジュールが、Ｃａｓの少なくとも１つのＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目４）
　前記核酸配列認識モジュールが、Ｃａｓの両方のＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
　前記改変が、前記標的化した部位の１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または前記標的化した部位への１以上のヌクレオチドの挿入を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
　前記改変が、前記標的化された部位のＰＡＭ配列側に優位に生じる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
　前記ＤＮＡグリコシラーゼが、野生型に比べて二重鎖ＤＮＡへの反応性が減弱された変異体である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
　前記ＤＮＡグリコシラーゼが、シトシン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＣＤＧ）活性またはチミン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）活性を有するものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
　前記ＣＤＧ活性またはＴＤＧ活性を有するＤＮＡグリコシラーゼが、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）の変異体である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
　前記ＤＮＡグリコシラーゼが、ＣＤＧ活性またはＴＤＧ活性を有する、酵母由来のウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）の変異体である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１）
　前記植物細胞は、イネ、シロイヌナズナ、豆、トウモロコシ、綿、ベニバナ、ヒマワリ、タバコ、小麦、麦、麻、バラ、イチイ、バナナ、コーヒー、ゴマ、ソバ、またはレタス由来である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
　前記植物細胞は、イネまたはシロイヌナズナ由来である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
　前記トランスフェクトは、前記複合体の、分離された植物カルスへの送達を通して、またはフローラルディップ法によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
　前記送達は、アグロバクテリウム法によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
　さらに、前記細胞から植物体を作出する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６）
　さらに、得られた前記細胞をクローン分離する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
　上記項目のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な形質転換された植物細胞。
（項目１８）
　上記項目のいずれか一項に記載の植物細胞を含む、形質転換された植物。
（項目１９）
　上記項目のいずれか一項に記載の植物から得られた種子。
（項目２０）
　前記形質転換された形質が当代世代のみに発現される、上記項目のいずれか一項に記載の植物。
（項目２１）
　前記形質転換された形質の発現が世代を超えて継承される、上記項目のいずれか一項に記載の植物。
（項目Ａ１）
　二本鎖ＤＮＡの標的化した部位が改変された細胞を生産するための方法であって、
（ｉ）目的の二本鎖ＤＮＡを含む細胞を提供する工程と、
（ｉｉ）該二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体を提供する工程と、
（ｉｉｉ）該複合体を、該細胞がトランスフェクトされる条件に配置する工程と、
（ｉｖ）該トランスフェクトされた細胞を、該標的化された部位において該二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の改変を誘導する条件に配置する工程と、
（ｖ）該複合体が導入された細胞および／または該改変が導入された細胞を選択する工程と
　を含み、該細胞における改変が少なくとも当代において維持される、方法。
（項目Ａ２）
　前記核酸配列認識モジュールが、Ｃａｓの少なくとも１つのＤＮＡ切断能が失活したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター、およびＰＰＲモチーフからなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目Ａ３）
　前記核酸配列認識モジュールが、Ｃａｓの少なくとも１つのＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ４）
　前記核酸配列認識モジュールが、Ｃａｓの両方のＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ５）
　前記改変が、前記標的化した部位の１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または前記標的化した部位への１以上のヌクレオチドの挿入を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ６）
　前記改変が、前記標的化された部位のＰＡＭ配列側に優位に生じる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ７）
　前記ＤＮＡグリコシラーゼが、野生型に比べて二重鎖ＤＮＡへの反応性が減弱された変異体である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ８）
　前記ＤＮＡグリコシラーゼが、シトシン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＣＤＧ）活性またはチミン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）活性を有するものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ９）
　前記ＣＤＧ活性またはＴＤＧ活性を有するＤＮＡグリコシラーゼが、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）の変異体である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１０）
　前記ＤＮＡグリコシラーゼが、ＣＤＧ活性またはＴＤＧ活性を有する、酵母由来のウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）の変異体である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１１）
　前記植物細胞は、イネ、シロイヌナズナ、豆、トウモロコシ、綿、ベニバナ、ヒマワリ、タバコ、小麦、麦、麻、バラ、イチイ、バナナ、コーヒー、ゴマ、ソバ、またはレタス由来である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１２）
　前記植物細胞は、イネまたはシロイヌナズナ由来である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１３）
　前記トランスフェクトは、前記複合体の、分離された植物カルスへの送達を通して、またはフローラルディップ法によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１４）
　前記送達は、アグロバクテリウム法によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１５）
　さらに、前記細胞から植物体を作出する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１６）
　さらに、得られた前記細胞をクローン分離する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ａ１７）
　上記項目のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な形質転換された植物細胞。
（項目Ａ１８）
　上記項目のいずれか一項に記載の植物細胞を含む、形質転換された植物。
（項目Ａ１９）
　上記項目のいずれか一項に記載の植物から得られた種子。
（項目Ａ２０）
　前記形質転換された形質が当代世代のみに発現される、上記項目のいずれか一項に記載の植物。
（項目Ａ２１）
　前記形質転換された形質の発現が世代を超えて継承される、上記項目のいずれか一項に記載の植物。
（項目Ｂ１）
　所望の特性を有する植物細胞を生産するための方法であって、
（ｉ）所望の特性に関連する二本鎖ＤＮＡを含む植物細胞を提供する工程と、
（ｉｉ）該二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体を提供する工程と、
（ｉｉｉ）該複合体を、該植物細胞がトランスフェクトされる条件に配置する工程と、
（ｉｖ）該トランスフェクトされた植物細胞を、該標的化された部位において該二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の改変を誘導する条件に配置する工程と、
（ｖ）該複合体が導入された細胞および／または該改変が導入された細胞を選択する工程と
（ｖｉ）該導入された細胞から、所望の特性を有する細胞を選択する工程を含む、方法。（項目Ｂ２）
　前記核酸配列認識モジュールが、Ｃａｓの少なくとも１つのＤＮＡ切断能が失活したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター、およびＰＰＲモチーフからなる群より選択される、上記項目に記載の方法。
（項目Ｂ３）
　前記核酸配列認識モジュールが、Ｃａｓの少なくとも１つのＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ４）
　前記核酸配列認識モジュールが、Ｃａｓの両方のＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ５）
　前記改変が、前記標的化した部位の１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または前記標的化した部位への１以上のヌクレオチドの挿入を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ６）
　前記改変が、前記標的化された部位のＰＡＭ配列側に優位に生じる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ７）
　前記ＤＮＡグリコシラーゼが、野生型に比べて二重鎖ＤＮＡへの反応性が減弱された変異体である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ８）
　前記ＤＮＡグリコシラーゼが、シトシン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＣＤＧ）活性またはチミン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）活性を有するものである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ９）
　前記ＣＤＧ活性またはＴＤＧ活性を有するＤＮＡグリコシラーゼが、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）の変異体である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１０）
　前記ＤＮＡグリコシラーゼが、ＣＤＧ活性またはＴＤＧ活性を有する、酵母由来のウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）の変異体である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１１）
　前記植物細胞は、イネ、シロイヌナズナ、豆、トウモロコシ、綿、ベニバナ、ヒマワリ、タバコ、小麦、麦、麻、バラ、イチイ、バナナ、コーヒー、ゴマ、ソバ、またはレタス由来である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１２）
　前記植物細胞は、イネまたはシロイヌナズナ由来である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１３）
　前記トランスフェクトは、前記複合体の、分離された植物カルスへの送達を通して、またはフローラルディップ法によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１４）
　前記送達は、アグロバクテリウム法によって行われる、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１５）
　さらに、前記細胞から植物体を作出する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１６）
　さらに、前記所望の特性を有する細胞をクローン分離する工程を含む、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目Ｂ１７）
　上記項目のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な形質転換された植物細胞。
（項目Ｂ１８）
　上記項目のいずれか一項に記載の植物細胞を含む、形質転換された植物。
（項目Ｂ１９）
　上記項目のいずれか一項に記載の植物から得られた種子。
（項目Ｂ２０）
　前記形質転換された形質が当代世代のみに発現される、上記項目のいずれか一項に記載の植物。
（項目Ｂ２１）
　前記形質転換された形質の発現が世代を超えて継承される、上記項目のいずれか一項に記載の植物。
（項目Ｃ１）
　二本鎖ＤＮＡの標的化した部位が改変された植物細胞を生産するための、植物細胞の二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体であって、該標的化された部位において該二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の改変を誘導する、複合体。
（項目Ｃ２）
　二本鎖ＤＮＡの標的化した部位が改変された細胞を生産するための、細胞の二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体であって、該標的化された部位において該二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の改変を誘導する、複合体。
（項目Ｃ３）
　所望の特性を有する植物細胞を生産するための、植物細胞の二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体であって、該標的化された部位において該二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の改変を誘導する、複合体。
（項目Ｃ４）
　上記項目のいずれか一項に記載の複合体をコードする１または複数の核酸。
（項目Ｃ５）
　上記項目のいずれか一項に記載の複合体をコードする１または複数の核酸であって、該複合体をコードする他の核酸と組み合わされて使用される、核酸。

　本開示において、上記の１つまたは複数の特徴は、明示された組み合わせに加え、さらに組み合わせて提供され得ることが意図される。なお、本開示のさらなる実施形態および利点は、必要に応じて以下の詳細な説明を読んで理解すれば、当業者に認識される。

　なお、上記した以外の本開示の特徴及び顕著な作用・効果は、以下の発明の実施形態の項及び図面を参照することで、当業者にとって明確となる。

　これまでに酵母においては、標的部位の周辺に点変異を誘導することが実証されていたが、植物を含む高等な多細胞生物（細胞集団）では遺伝子改変ができていなかった。本開示の方法により、従来の微生物だけではなく、多細胞生物である植物において、点変異のみならず欠損も生じさせることができるようになり、新たなゲノム編集技術として応用が期待できる。

図１は、本開示の一実施形態に係る単子葉植物用のＴａｒｇｅｔ－Ｇベクターを示す模式図である。図２は、本開示の一実施形態において、ＡＬＳ遺伝子を標的とした場合のＴａｒｇｅｔ－Ｇ（ｎＣａｓ９）による標的遺伝子改変の結果を示す模式図である。図３は、本開示の一実施形態において、ＡＬＳ遺伝子を標的とした場合のＴａｒｇｅｔ－Ｇ（ｄＣａｓ９）による標的遺伝子改変の結果を示す模式図である。図４は、本開示の一実施形態において、ＯｓＦＴＩＰ１ｅ遺伝子を標的とした場合のＴａｒｇｅｔ－Ｇ（ｄＣａｓ９）による標的遺伝子改変の結果を示す模式図である。図５は、本開示の一実施形態において、ＤＬ遺伝子を標的とした場合のＴａｒｇｅｔ－Ｇ（ｄＣａｓ９）による標的遺伝子改変の結果を示す模式図である。図６は、本開示の一実施形態において、ＯｓＣｌｐＰ５遺伝子を標的とした場合のＴａｒｇｅｔ－Ｇによる標的遺伝子改変の結果を示す模式図である。図７は、本開示の一実施形態において、ＡＬＳ遺伝子を標的とした場合のカルス系統においてクローニングシークエンス解析を行った結果を示す模式図である。図８は、本開示の一実施形態において、ＯｓＦＴＩＰ１ｅ遺伝子を標的とした場合のカルス系統においてクローニングシークエンス解析を行った結果を示す模式図である。図９は、本開示の一実施形態において、ＤＬ遺伝子を標的とした場合のカルス系統においてクローニングシークエンス解析を行った結果を示す模式図である。図１０は、本開示の一実施形態において、ＯｓＣｌｐＰ５遺伝子を標的とした場合のカルス系統においてクローニングシークエンス解析を行った結果を示す模式図である。図１１は、本開示の一実施形態において、ＡＬＳ遺伝子を標的とした場合のカルスで確認された変異がＴ０植物にも伝達することを確認した結果を示す模式図である。図１２は、本開示の一実施形態において、ＯｓＦＴＩＰ１ｅ遺伝子を標的とした場合のカルスで確認された変異がＴ０植物にも伝達することを確認した結果を示す模式図である。図１３は、本開示の一実施形態において、ＯｓＣｌｐＰ５遺伝子を標的とした場合のカルスで確認された変異がＴ０植物にも伝達することを確認した結果を示す模式図である。図１４は、本開示の一実施形態において、本開示の方法によって遺伝子を改変したＴ０植物体における変異がＴ１世代の植物体にも伝達していることを示す写真である。

　以下、本開示を最良の形態を示しながら説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本開示の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。

　以下に本明細書において特に使用される用語の定義および／または基本的技術内容を適宜説明する。

　本明細書において、「約」とは、後に続く数値の±１０％を意味する。

　本明細書において、二本鎖ＤＮＡの「改変」とは、ＤＮＡ鎖上のあるヌクレオチド（例えば、ｄＣ）が、他のヌクレオチド（例えば、ｄＴ、ｄＡ又はｄＧ）に変換されるか、欠失すること、あるいはＤＮＡ鎖上のあるヌクレオチド間にヌクレオチドもしくはヌクレオチド配列が挿入されることを意味する。本明細書における「改変」には、二本鎖ＤＮＡの標的化した部位の１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または二本鎖ＤＮＡの標的化した部位への１以上のヌクレオチドの挿入を含む。ここで、改変される二本鎖ＤＮＡは特に制限されないが、好ましくはゲノムＤＮＡである。また、二本鎖ＤＮＡの「標的化した部位」とは、核酸配列認識モジュールが特異的に認識して結合する「標的ヌクレオチド配列」の全部もしくは一部、又はそれと該標的ヌクレオチド配列の近傍（５’上流及び３’下流のいずれか一方又は両方）を意味し、その範囲は目的に応じて、１塩基～数百塩基長の間で適宜調節することができる。

　本明細書において、「核酸配列認識モジュール」とは、ＤＮＡ鎖上の特定のヌクレオチド配列（即ち、標的ヌクレオチド配列）を特異的に認識して結合する能力を有する分子又は分子複合体を意味する。核酸配列認識モジュールが標的ヌクレオチド配列に結合することにより、該モジュールに連結されたＤＮＡグリコシラーゼが二本鎖ＤＮＡの標的化された部位に特異的に作用することを可能にする。

　本明細書において、「ＤＮＡグリコシラーゼ」とは、ＤＮＡのＮ－グリコシド結合を加水分解する酵素を意味する。ＤＮＡグリコシラーゼは、本来塩基除去修復（ＢＥＲ）機構において傷害のある塩基をＤＮＡから除去する役割を担うが、本開示においては、ＤＮＡ中の正常な塩基（即ち、ｄＣ、ｄＴ、ｄＡ又はｄＧ、あるいはそれらがエピジェネティック修飾を受けたもの）に作用し得るものが好ましい。本来は正常な塩基とは反応しないか、反応性が低いが、変異により正常な塩基に対する反応性を獲得、もしくは反応性が向上した変異ＤＮＡグリコシラーゼも、本発明におけるＤＮＡグリコシラーゼに包含され、好ましく使用され得る。該酵素による脱塩基反応の結果生じた塩基の無い部位（ａｐｕｒｉｎｉｃ／ａｐｙｒｉｍｉｄｉｃ（ＡＰ）　ｓｉｔｅ）は、ＡＰエンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ等のＢＥＲ経路の下流の酵素によって処理される。

　本明細書において、「二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低い」とは、細胞の生存に影響を与えない程度に細胞毒性が抑えられる頻度でしか、二重鎖ＤＮＡを形成する領域内での脱塩基反応を起こさないことを意味する。二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとしては、生来的に二重鎖ＤＮＡに対する反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼや、野生型に比べて二重鎖ＤＮＡに対する反応性を低下させる変異が導入された変異ＤＮＡグリコシラーゼ等が挙げられる。さらに、２つの断片に分断されたＤＮＡグリコシラーゼであって、それぞれの断片が２つに分断された核酸配列認識モジュールのいずれか一方と結合して２つの複合体を形成し、両複合体がリフォールディングすると該核酸配列認識モジュールは標的ヌクレオチド配列と特異的に結合することができ、該特異的な結合によって該ＤＮＡグリコシラーゼが脱塩基反応を触媒することが可能となるようにデザインされたスプリット酵素であるＤＮＡグリコシラーゼも、本明細書における「二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼ」に包含される。

　本明細書において、上記のような核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとが結合した「複合体」とは、上記核酸配列認識モジュールと、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとが連結された複合体を含んでなる、特定のヌクレオチド配列認識能が付与された、核酸の脱塩基反応を触媒する活性を有する分子複合体を意味する。ここで「複合体」は複数の分子で構成されるものだけでなく、融合タンパク質のように、核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとを単一の分子内に有するものも包含される。また、２つの断片に分断された核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼの一方の断片同士がそれぞれ連結された、２つの「部分的複合体」を形成し、該部分的複合体同士がリフォールディングすることによってヌクレオチド配列認識能と脱塩基反応の触媒活性とを獲得する分子複合体も、本明細書における「複合体」に包含される。

　本明細書において、「トランスフェクト」とは、核酸などの分子の細胞または宿主生物体への導入をいい、「形質導入」や「形質転換」と互換的に使用される。核酸や上記複合体を導入することによって生じる変異は、受容細胞のゲノム核酸中に生じてもよい。該変異が受容細胞または生物体の核酸（ゲノムＤＮＡ）中に生じた場合には、当該変異は、その細胞または生物体中で安定に維持されることができ、受容細胞または生物体の子孫細胞または生物体にさらに受け渡され、またはそれらによって次世代に継承される。

　本明細書において、「トランスフェクトされた植物細胞」または「形質転換された植物細胞」とは、核酸などの分子や上記複合体が植物細胞にトランスフェクトされたものをいう。「トランスフェクトされた植物細胞」または「形質転換された植物細胞」には、植物ゲノムに組み込まれた外来遺伝子の発現により、遺伝的形質が変化した植物細胞や、外来遺伝子が単に葉、茎、根などに導入されただけの植物細胞も含まれる。また「形質転換された植物」とは、このような細胞からなる植物個体をいう。

　本明細書において、「複合体が導入された細胞」または「改変が導入された細胞」とは、上記のように細胞がトランスフェクトされた結果、上記複合体が導入された細胞、または該複合体の作用によって、二本鎖ＤＮＡの標的化した部位の１以上のヌクレオチドに置換、欠失、または１以上のヌクレオチドの挿入が生じた細胞をいう。

　本開示の形質転換された植物は植物個体であるため、生殖能力（有性生殖能力）を有し、植物ゲノムに導入された変異やその形質が次世代にも受け継がれるという優れた利点を有する。

　（好ましい実施形態）
　以下に本開示の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本開示のよりよい理解のために提供されるものであり、本開示の範囲は以下の記載に限定されるべきでない。したがって、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本開示の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本開示の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができる。

　本開示の一局面において、二本鎖ＤＮＡの標的化した部位が改変された植物細胞を生産するための方法であって、（ｉ）目的の二本鎖ＤＮＡを含む植物細胞を提供する工程と、（ｉｉ）該二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体を提供する工程と、（ｉｉｉ）該複合体を、該植物細胞がトランスフェクトされる条件に配置する工程と、（ｉｖ）該トランスフェクトされた植物細胞を、該標的化された部位において該二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の改変を誘導する条件に配置する工程と、（ｖ）該複合体が導入された細胞および／または該改変が導入された細胞を選択する工程とを含む、方法が提供される。本開示の方法は、多細胞生物のゲノム編集技術、またその後の変異クローンの単離技術として有用である。

　本開示の他の局面において、二本鎖ＤＮＡの標的化した部位が改変された細胞を生産するための方法であって、（ｉ）目的の二本鎖ＤＮＡを含む細胞を提供する工程と、
（ｉｉ）該二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体を提供する工程と、（ｉｉｉ）該複合体を、該細胞がトランスフェクトされる条件に配置する工程と、（ｉｖ）該トランスフェクトされた細胞を、該標的化された部位において該二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の改変を誘導する条件に配置する工程と、（ｖ）該複合体が導入された細胞および／または該改変が導入された細胞を選択する工程とを含み、該細胞における改変が少なくとも当代において維持される、方法が提供される。

　また本開示の他の局面において、所望の特性を有する植物細胞を生産するための方法であって、（ｉ）所望の特性に関連する二本鎖ＤＮＡを含む植物細胞を提供する工程と、（ｉｉ）該二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体を提供する工程と、（ｉｉｉ）該複合体を、該植物細胞がトランスフェクトされる条件に配置する工程と、（ｉｖ）該トランスフェクトされた植物細胞を、該標的化された部位において該二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の改変を誘導する条件に配置する工程と、（ｖ）該複合体が導入された細胞および／または該改変が導入された細胞を選択する工程と（ｖｉ）該導入された細胞から、所望の特性を有する細胞を選択する工程を含む、方法が提供される。

　植物などの多細胞生物において形質転換体を得る場合に、従来のランダムな変異を導入して、目的の形質が得られたものを選抜するではその効率が非常に悪くなってしまう。また一般的な二重鎖切断を生じさせるゲノム編集技術では、限られた部位に、限られたパターンの変異しか導入できない。そこで、本開示では、植物ゲノムなどの目的のゲノムにおいて、目的の範囲の幅広い領域に様々な変異を導入できる新たなゲノム編集技術を提供する。このような技術は、これまでに微生物においては実現できていたが、高等な多細胞生物においては技術的な困難があった。

　本開示に用いられるＤＮＡグリコシラーゼは、ＤＮＡのＮ－グリコシド結合を加水分解して塩基を脱離させる反応を触媒し得るものであれば特に制限はないが、ゲノム編集技術としての汎用性を高める意味で、正常な塩基（即ち、ｄＣ、ｄＴ、ｄＡ又はｄＧ、あるいはそれらがエピジェネティック修飾を受けたもの、例えば、５－メチルシトシン等）に作用し得るものが好ましい。そのような酵素として、例えば、シトシンを脱離する反応を触媒するＣＤＧ活性を有する酵素、チミンを脱離する反応を触媒するＴＤＧ活性を有する酵素、５－メチルシトシンを脱離する反応を触媒する活性（５－ｍＣＤＧ活性）を有する酵素等が挙げられる。生来的にＣＤＧ活性を有するＤＮＡグリコシラーゼはこれまでに報告されていないが、ほとんどの生物種において、ＤＮＡ中に組み込まれたウラシルの除去を担う主要なＵＤＧとして知られるＵＮＧ（真核生物の場合、ミトコンドリア局在性のＵＮＧ１と核局在性のＵＮＧ２の２つのスプライスバリアントがあり、各オルガネラ移行シグナルを含むＮ末端配列を除き、共通のアミノ酸配列を有する）の、ある特定のアミノ酸残基に変異を導入することにより、シチジン又はチミジンを基質として認識するＣＤＧ活性又はＴＤＧ活性を有する変異ＵＤＧを得ることができる。より具体的には、例えば、酵母由来のＵＮＧ１（ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＰ＿０１３６９１）の場合、Ｎ末端から２２２番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換することにより（該変異体をＮ２２２Ｄともいう）、ＣＤＧ活性を付与することが可能となり、１６４番目のチロシンをアラニンに置換することにより（該変異体をＹ１６４Ａともいう）、ＴＤＧ活性を付与することが可能となる（Ｋａｖｌｉ　Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．（１９９６）１５（１３）：３４４２－７）。本発明者らは、１６４番目のチロシンをグリシンで置換することにより（該変異体をＹ１６４Ｇともいう）、Ｙ１６４Ａ変異体より高いＴＤＧ活性を付与し得ることを見出している。さらに、シトシンはウラシルの４位のカルボニル基がアミノ基に置換されたものであり、チミンはウラシルの５位がメチル化されたものであることから、２２２番目のアスパラギン残基と１６４番目のチロシン残基に二重変異（例えば、Ｎ２２２Ｄ／Ｙ１６４Ａ又はＮ２２２Ｄ／Ｙ１６４Ｇ）を導入することにより、シトシンの５位がメチル化した５－メチルシトシンをＤＮＡから脱離する活性（５－ｍＣＤＧ活性）を有するＤＮＡグリコシラーゼを得ることができる。５－メチルシトシンを脱塩基できることにより、ゲノムＤＮＡのメチル化状態を変化させ得るので、本開示のゲノム編集技術は、エピジェネティック修飾を変化させるエピゲノム編集をも可能にするものである。

　また本開示の一実施形態において、ＵＮＧ２を用いる場合も、上記変異部位に対応するアミノ酸残基に同様の変異を導入することにより、ＣＤＧ活性、ＴＤＧ活性又は５－ｍＣＤＧ活性を有する変異ＵＮＧを得ることができる。

　また本開示の一実施形態において、変異ＵＮＧは、正常な塩基に作用し得る限り、上記の部位が上記以外のアミノ酸で置換されたものであっても、あるいは上記以外の部位に変異が導入されたものであってもよい。変異ＵＮＧが正常な塩基に作用し得るか否かは、例えば、Ｋａｖｌｉ　Ｂ．　ｅｔ　ａｌ．，ＥＭＢＯ　Ｊ．（１９９６）１５（１３）：３４４２－７に記載の方法によって確認することができる。

　本開示の一実施形態において、ＵＮＧの由来は特に制限されないが、例えば、大腸菌由来のｕｎｇ（Ｖａｒｓｈｎｅｙ，　Ｕ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８８）　Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，７７７６－７７８４）、酵母、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）など由来のＵＮＧ１又はＵＮＧ２、あるいはウイルス（例、ポックスウイルス科（ワクシニアウイルス等）、ヘルペスウイルス科など）由来のＵＤＧを用いることができる。例えば、ヒトＵＮＧ１及びＵＮＧ２のアミノ酸配列は、それぞれＵｎｉｐｒｏｔＫＢ　Ｎｏ．Ｐ１３０５１－２及びＰ１３０５１－１として参照することができる。また、大腸菌（Ｋ－１２株）ｕｎｇのアミノ酸配列はＵｎｉｐｒｏｔＫＢ　Ｎｏ．Ｐ１２２９５として、ワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）ＵＤＧのアミノ酸配列はＵｎｉｐｒｏｔＫＢ　Ｎｏ．Ｐ２０５３６として、それぞれ参照することができる。ＵＮＧのアミノ酸配列は生物種間で高度に保存されており、所望の生物由来のＵＮＧ１又はＵＮＧ２のアミノ酸配列を、上記の酵母ＵＮＧ１のアミノ酸配列とアラインすることにより、対応する変異部位を同定することができる。例えば、ヒトＵＮＧ１の場合、酵母ＵＮＧ１のＮ２２２に対応するアミノ酸は２０４番目のアスパラギン（Ｎ２０４）であり、Ｙ１６４に対応するアミノ酸は１４７番目のチロシン（Ｙ１４７）である。また、大腸菌ｕｎｇの場合、酵母ＵＮＧ１のＮ２２２に対応するアミノ酸は１２３番目のアスパラギン（Ｎ１２３）であり、Ｙ１６４に対応するアミノ酸は６６番目のチロシン（Ｙ６６）である。ワクシニアウイルス、天然痘ウイルス、サル痘ウイルス、鶏痘ウイルス、豚痘ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス等のポックスウイルス科ウイルス由来のＵＤＧの場合、酵母ＵＮＧ１のＮ２２２に対応するアミノ酸は１２０番目のアスパラギン（Ｎ１２０）であり、Ｙ１６４に対応するアミノ酸は７０番目のチロシン（Ｙ７０）である。

　ＵＮＧは、一本鎖ＤＮＡからも、二本鎖ＤＮＡからもウラシルを除去することができるが、一本鎖ＤＮＡに対してより親和性が高い。この傾向は、ＣＤＧ活性やＴＤＧ活性を付与された上記変異ＵＮＧについても同様である。しかしながら、シトシンやチミンはゲノムＤＮＡ中の至る所に存在するため、ＣＤＧ活性又はＴＤＧ活性を有する変異ＵＮＧは、複製時のエラーやシトシンの脱アミノ化によりゲノムＤＮＡ中に稀に導入されるウラシルのみを基質とする野生型のＵＮＧと異なり、核酸配列認識モジュールにより標的化されるヌクレオチド配列及びその近傍の二本鎖ＤＮＡ中のあらゆる部位に作用してシトシン又はチミンを除去してしまい、強い細胞毒性を引き起こす。そのため、本開示で用いられるＤＮＡグリコシラーゼは、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いものであることが求められる。ＤＮＡグリコシラーゼとして変異ＵＮＧを用いる場合、二重鎖ＤＮＡへの反応性を低下させる変異をさらに導入して、ＣＤＧ活性やＴＤＧ活性を有する変異ＵＮＧによる脱塩基反応が弛緩した二本鎖又は一本鎖ＤＮＡの領域により選択的となるようにすることにより、該酵素による細胞毒性を回避することができる。具体的には、例えばＵＮＧの場合、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで、Ｕ・Ａ　２５ｍｅｒの二本鎖ＤＮＡに対する反応性を、野生型の１／２０以下、より好ましくは１／５０以下、さらに好ましくは１／１００以下に低下させる変異が挙げられるが、ｉｎ　ｖｉｖｏで致死的な細胞毒性を引き起こさない程度に、二重鎖ＤＮＡへの反応性が低下している限り、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの反応性に制限されない。使用しようとするＤＮＡグリコシラーゼが、「二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低い」ものであることは、例えば、国際公開２０１６／０７２３９９に開示されるように、ＤＮＡグリコシラーゼを挿入したコンストラクトを、ガイドＲＮＡとともに目的の細胞に導入し、得られた形質転換体を培養して、その生存可能性を検証することにより確認することができる。あるいは、目安の１つとして、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでの二本鎖ＤＮＡオリゴマーに対する反応性を、Ｃｈｅｎ，　Ｃ．Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　ＤＮＡ　Ｒｅｐａｉｒ　（Ａｍｓｔ）　（２００５）４（７）：７９３－８０５に記載の方法により評価することにより、「二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低い」ＤＮＡグリコシラーゼの候補をスクリーニングすることもできる。一実施形態において、「二重鎖ＤＮＡ」として、強固な二重らせん構造を形成したＤＮＡを意味することができる。例えば、「二重鎖ＤＮＡ」は、対形成する塩基同士が完全に解離した一本鎖ＤＮＡの状態のみならず、塩基対は形成しているものの二重らせん構造がほどけた緩んだ二本鎖（ｒｅｌａｘｅｄ　ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ　ＤＮＡ）の状態のものは含まないものとすることができる。

　上記の条件を充足するＤＮＡグリコシラーゼとして、例えば、酵母由来のＵＮＧ１の場合、Ｎ末端から３０４番目のロイシンをアラニンに置換した変異体が挙げられる（該変異体をＬ３０４Ａともいう）（Ｓｌｕｐｐｈａｕｇ，　Ｇ．　ｅｔ　ａｌ．　Ｎａｔｕｒｅ
　（１９９６）　３８４（６６０４）：　８７－９２）。あるいは、３０８番目のアルギニンをグルタミン酸又はシステインに置換した変異体（該変異体をそれぞれＲ３０８Ｅ、Ｒ３０８Ｃともいう）も、ひずみのない二重らせん構造のＤＮＡへの反応性が顕著に低下している（Ｃｈｅｎ，　Ｃ．Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．　ＤＮＡ　Ｒｅｐａｉｒ　（Ａｍｓｔ）
　（２００５）　４（７）：　７９３－８０５）。他の実施形態において、別の生物種由来のＵＮＧを用いる場合、所望の生物由来のＵＮＧ１又はＵＮＧ２のアミノ酸配列を、上記の酵母ＵＮＧ１のアミノ酸配列とアラインすることにより、対応する変異部位を同定することができる。例えば、ヒトＵＮＧ１の場合、酵母ＵＮＧ１のＬ３０４に対応するアミノ酸は２７２番目のロイシン（Ｌ２７２）であり、Ｒ３０８に対応するアミノ酸は２７６番目のアルギニン（Ｒ２７６）である。また、大腸菌ｕｎｇの場合、酵母ＵＮＧ１のＬ３０４に対応するアミノ酸は１９１番目のロイシン（Ｌ１９１）であり、Ｒ３０８に対応するアミノ酸は１９５番目のアルギニン（Ｒ１９５）である。ワクシニアウイルスＵＤＧの場合、酵母ＵＮＧ１のＲ３０８に対応するアミノ酸は１８７番目のアルギニン（Ｒ１８７）である。

　酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、大腸菌、ヒト及びポックスウイルス科ウイルスの間におけるＵＮＧ１（ｕｎｇ）の基質特異性及び二重鎖ＤＮＡへの反応性を変化させる変異の位置の対応を表１に示す。変異アミノ酸を一文字表記で示し、数字はＮ末端アミノ酸を１とした変異アミノ酸の位置を示す。

　以上より、本開示の一実施形態において、本開示で使用される「二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼ」として、好ましくは、酵母ＵＮＧ１のＮ２２２Ｄ／Ｌ３０４Ａ二重変異体、Ｎ２２２Ｄ／Ｒ３０８Ｅ二重変異体、Ｎ２２２Ｄ／Ｒ３０８Ｃ二重変異体、Ｙ１６４Ａ／Ｌ３０４Ａ二重変異体、Ｙ１６４Ａ／Ｒ３０８Ｅ二重変異体、Ｙ１６４Ａ／Ｒ３０８Ｃ二重変異体、Ｙ１６４Ｇ／Ｌ３０４Ａ二重変異体、Ｙ１６４Ｇ／Ｒ３０８Ｅ二重変異体、Ｙ１６４Ｇ／Ｒ３０８Ｃ二重変異体、Ｎ２２２Ｄ／Ｙ１６４Ａ／Ｌ３０４Ａ三重変異体、Ｎ２２２Ｄ／Ｙ１６４Ａ／Ｒ３０８Ｅ三重変異体、Ｎ２２２Ｄ／Ｙ１６４Ａ／Ｒ３０８Ｃ三重変異体、Ｎ２２２Ｄ／Ｙ１６４Ｇ／Ｌ３０４Ａ三重変異体、Ｎ２２２Ｄ／Ｙ１６４Ｇ／Ｒ３０８Ｅ三重変異体、Ｎ２２２Ｄ／Ｙ１６４Ｇ／Ｒ３０８Ｃ三重変異体などが挙げられる。他の実施形態において、酵母ＵＮＧ１に代えて別のＵＮＧを用いる場合は、上記各変異体に対応するアミノ酸に、同様の変異が導入された変異体を用いればよい。

　あるいは、他の実施形態において、「二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼ」として、生来的に二重鎖ＤＮＡへの反応性が低く、弛緩二本鎖又は一本鎖ＤＮＡに対する選択性の高いＤＮＡグリコシラーゼを用いることもできる。そのようなＤＮＡグリコシラーゼとしては、例えば、ＵＤＧ活性を有するＳＭＵＧ１（Ｓｉｎｇｌｅ　ｓｔｒａｎｄ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　Ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｕｒａｃｉｌ－ＤＮＡ　Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）を挙げることができる。ＳＭＵＧ１には、ＣＤＧ活性やＴＤＧ活性を付与する変異は知られていないが、シトシンの脱アミノ化によって生じるウラシルの除去に重要であるとの報告がある（Ｎｉｌｓｅｎ，　Ｈ．　ｅｔ　ａｌ．　ＥＭＢＯ　Ｊ．　（２００１）　２０：　４２７８－４２８６）。本発明者らは、シトシンをウラシルに変換し得るシチジンデアミナーゼと、本開示と同様の核酸配列認識モジュールとを組み合わせて、標的化されたヌクレオチド配列及びその近傍に特異的に変異を導入する方法を既に開発しているので（国際公開第２０１５／１３３５５４号）、当該技術と組み合わせることにより、ゲノムＤＮＡ中の標的化された部位において、人為的にシトシンをウラシルに変換した後、さらにＳＭＵＧ１を作用させることで、該ウラシルをＤＮＡから脱離させることもできる。ＳＭＵＧ１の由来は特に制限されないが、例えば、大腸菌、酵母、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）など由来のＳＭＵＧ１を用いることができる。例えば、ヒトＳＭＵＧ１の２つのアイソフォームのアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ　Ｎｏ．Ｑ５３ＨＣ７－１及びＱ５３ＨＶ７－２として参照することができる。また、シチジンデアミナーゼの由来も特に制限されないが、例えば、ヤツメウナギ由来のＰｍＣＤＡ１（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎ　ｍａｒｉｎｕｓ　ｃｙｔｏｓｉｎｅ
　ｄｅａｍｉｎａｓｅ　１）、哺乳動物（例、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）由来のＡＩＤ（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｅｄ　ｃｙｔｉｄｉｎｅ　ｄｅａｍｉｎａｓｅ；　ＡＩＣＤＡ）を用いることができる。例えば、ＰｍＣＤＡ１のｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＥＦ０９４８２２及びＡＢＯ１５１４９を、ヒトＡＩＤのｃＤＮＡの塩基配列及びアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿０２０６６１及びＮＰ＿０６５７１２を、それぞれ参照することができる。

　別の実施態様において、生来的に二重鎖ＤＮＡへの反応性が低いＤＮＡグリコシラーゼとして、ワクシニアウイルス等のポックスウイルス科に属するウイルス由来のＵＤＧを挙げることができる。国際公開２０１６／０７２３９９号に示されるとおり、ワクシニアウイルス由来のＵＤＧ（ｖｖＵＤＧ）は、二重鎖ＤＮＡへの反応性を低下させる変異（例、Ｒ１８７Ｃ）を導入せずとも、非選択培地上で、当該変異が導入された酵母ＵＮＧ１や大腸菌ｕｎｇと同等の生育を示すことから、宿主細胞において毒性を生じない程度に、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いものと考えられる。ＤＮＡグリコシラーゼとしてｖｖＵＤＧ等のポックスウイルス科ウイルス由来ＵＤＧを用いる場合、酵母ＵＮＧ１における二重鎖ＤＮＡへの反応性を低下させる変異に対応する変異（例、Ｒ１８７Ｃ）をさらに導入することもできるが、該ＵＤＧのＣＤＧ活性（Ｎ１２０Ｄ）やＴＤＧ活性（Ｙ７０Ａ、Ｙ７０Ｇ）を低下させる場合には、当該変異を有しないことが望ましい。以上より、本開示で使用されるｖｖＵＤＧ等のポックスウイルス科ウイルス由来ＵＤＧとして、好ましくは、Ｎ１２０Ｄ変異体、Ｙ７０ＧもしくはＹ７０Ａ変異体、Ｎ１２０Ｄ／Ｙ７０Ｇ二重変異体もしくはＮ１２０Ｄ／Ｙ７０Ａ二重変異体などが挙げられる。

　本開示の一実施形態において、ＤＮＡグリコシラーゼとして変異ｖｖＵＤＧ等のポックスウイルス科ウイルス由来ＵＤＧを用いる場合、ＵＤＧと相互作用して、ウイルスＤＮＡポリメラーゼのプロセッシビティ因子として働くヘテロダイマーを形成するＡ２０タンパク質を、ＵＤＧとともに二本鎖ＤＮＡに接触させることが好ましい。Ａ２０タンパク質を併用すると変異ＵＤＧのＣＤＧ活性又はＴＤＧ活性が上昇するので、例えば、ＣＤＧ活性（Ｎ１２０Ｄ）に比べてＴＤＧ活性（Ｙ７０Ｇ）が低い変異ｖｖＵＤＧの場合、Ａ２０タンパク質との併用により、チミンへの変異導入効率を向上させることができる。Ａ２０の由来は特に制限されないが、例えば、ワクシニアウイルス、天然痘ウイルス、サル痘ウイルス、鶏痘ウイルス、豚痘ウイルス、ウサギ線維腫ウイルス等のポックスウイルス科に属するウイルス由来のＡ２０を用いることができる。例えば、ワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）Ａ２０のアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ　Ｎｏ．　Ｐ２０９９５として参照することができる。

　さらに別の実施態様において、核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとを、それぞれ２つの断片に分断し、その一方の断片同士を連結して２つの部分的複合体を形成させ、これらが会合して機能的な核酸配列認識モジュールが再構成され標的ヌクレオチド配列に結合すると、機能的なＤＮＡグリコシラーゼが再構成されるようにデザインされたスプリット酵素を、二重鎖ＤＮＡへの反応性が低いＤＮＡグリコシラーゼとして用いることができる。該スプリット酵素においては、再構成されるＤＮＡグリコシラーゼ自体は二重鎖ＤＮＡへの反応性が低減されていなくとも、標的ヌクレオチド配列と結合した場合にのみ酵素活性を発揮するので、結果的に該標的ヌクレオチド配列及びその近傍の一本鎖ＤＮＡもしくは弛緩した二本鎖ＤＮＡ部分に選択的に作用することとなる。例えば、核酸配列認識モジュール及びＤＮＡグリコシラーゼを、それぞれＮ末側断片とＣ末側断片とに分断し、例えばＮ末側断片同士を連結した部分的複合体と、Ｃ末側断片同士を連結した部分的複合体とを作製し（あるいは、核酸配列認識モジュールのＮ末側断片とＤＮＡグリコシラーゼのＣ末側断片とを連結した部分的複合体と、ＤＮＡグリコシラーゼのＮ末側断片と核酸配列認識モジュールのＣ末側断片とを連結した部分的複合体とを作製し）、これらを会合させることにより機能的な核酸配列認識モジュール及び機能的なＤＮＡグリコシラーゼを再構成させることができる。連結する断片の組み合わせは、２つの部分的複合体が会合した際に、機能的な核酸配列認識モジュールと機能的なＤＮＡグリコシラーゼとの複合体に再構成される限り、特に制限されない。また、２つの部分的複合体は、別個の分子として提供されてもよく、あるいは直接もしくは適当なリンカーを介して連結することにより、１つの融合タンパク質として提供されてもよい。ＤＮＡグリコシラーゼの分断箇所は、分断された２つの断片が機能的なＤＮＡグリコシラーゼに再構成され得る限り特に制限はなく、１か所で分断されてＮ末側断片とＣ末側断片としてもよいし、２か所以上で分断して生じる３以上の断片を適宜連結して２つの断片とすることもできる。種々のＵＤＧタンパク質の３次元構造は公知であり、当業者であれば、当該情報に基づいて適宜分断箇所を選択することができる。例えば、酵母ＵＮＧ１の場合、Ｎ末から２５８番目と２５９番目のアミノ酸の間で、Ｎ末側断片（１－２５８）とＣ末側断片（２５９－３５９）とに分断することができる。

　上述のように、塩基除去修復（ＢＥＲ）機構において、ＤＮＡグリコシラーゼによって塩基が除去されると、ＡＰエンドヌクレアーゼが無塩基部位（ＡＰ部位）にニックを入れ、さらにエキソヌクレアーゼによってＡＰ部位は完全に除去される。ＡＰ部位が除去されると、ＤＮＡポリメラーゼが反対鎖の塩基を鋳型に新しく塩基を作り、最後にＤＮＡリガーゼがニックを埋めて修復が完了する。酵素活性を失っているがＡＰ部位への結合能を保持している変異ＡＰエンドヌクレアーゼは、競合的にＢＥＲを阻害することが知られている。したがって、ＤＮＡグリコシラーゼとともに、該変異ＡＰエンドヌクレアーゼを二本鎖ＤＮＡに接触させることにより、宿主細胞内における内在のＢＥＲ機構によるＡＰ部位の修復が阻害されて、修復エラーの頻度、即ち変異導入効率が向上する。例えば、ＣＤＧ活性（Ｎ２２２Ｄ）に比べてＴＤＧ活性（Ｙ１６４Ｇ）が低い変異酵母ＵＮＧ１の場合、変異ＡＰエンドヌクレアーゼとの併用により、チミンへの変異導入効率を向上させることができる。ＡＰエンドヌクレアーゼの由来は特に制限されないが、例えば、大腸菌、酵母、哺乳動物（例、ヒト、マウス、ブタ、ウシ、ウマ、サル等）など由来のＡＰエンドヌクレアーゼを用いることができる。例えば、ヒトＡｐｅ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ　Ｎｏ．　Ｐ２７６９５として参照することができる。酵素活性を失っているがＡＰ部位への結合能を保持している変異ＡＰエンドヌクレアーゼの例としては、活性サイトや補因子であるＭｇ結合サイトが変異したタンパク質が挙げられる。例えば、ヒトＡｐｅ１の場合、Ｅ９６Ｑ、Ｙ１７１Ａ、Ｙ１７１Ｆ、Ｙ１７１Ｈ、Ｄ２１０Ｎ、Ｄ２１０Ａ、Ｎ２１２Ａ等が挙げられる。

　本開示の一実施形態において、本開示の核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体は、ヌクレアーゼ活性を不活化したＣａｓ９と脱塩基酵素ＵＮＧの変異体からなるものとすることもできる。植物において、ｎＣａｓ９とＵＮＧの組み合わせでは標的周辺の大きな欠損を中心とした様々な変異を誘発することができる。ｄＣａｓ９との組み合わせでは、標的周辺への点変異とともに短い欠損も含まれるような幅広いバリエーションの変異を誘発することができ、また形質転換体の生存率をよりよくすることができる。これらを使い分けることによって植物ゲノムの特定の領域に様々な変異を誘発するような、半合理的な進化学手法として用いることができる。

　本開示の一実施形態において、本開示の複合体における核酸配列認識モジュールにより認識される、二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列は、該モジュールが特異的に結合し得る限り特に制限されず、二本鎖ＤＮＡ中の任意の配列であってよい。標的ヌクレオチド配列の長さは、核酸配列認識モジュールが特異的に結合するのに十分であればよく、例えば、哺乳動物のゲノムＤＮＡ中の特定の部位に変異を導入する場合、そのゲノムサイズに応じて、１２ヌクレオチド以上、好ましくは１５ヌクレオチド以上、より好ましくは１７ヌクレオチド以上である。長さの上限は特に制限されないが、好ましくは２５ヌクレオチド以下、より好ましくは２２ヌクレオチド以下である。

　本開示の一実施形態において、本開示の複合体の核酸配列認識モジュールとしては、例えば、Ｃａｓの少なくとも１つのＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（ＣＲＩＳＰＲ－変異Ｃａｓ）、Ｃａｓの両方のＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（ＣＲＩＳＰＲ－変異Ｃａｓ）、ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター及びＰＰＲモチーフ等の他、制限酵素、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡと特異的に結合し得るタンパク質のＤＮＡ結合ドメインを含み、ＤＮＡ二重鎖切断能を有しないフラグメント等が用いられ得るが、これらに限定されるものではない。好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ－変異Ｃａｓ、ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター、ＰＰＲモチーフ等が挙げられる。

　ジンクフィンガーモチーフは、Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２型の異なるジンクフィンガーユニット（１フィンガーが約３塩基を認識する）を３～６個連結させたものであり、９～１８塩基の標的ヌクレオチド配列を認識することができる。ジンクフィンガーモチーフは、Ｍｏｄｕｌａｒ　ａｓｓｅｍｂｌｙ法（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　（２００２）　２０：
　１３５－１４１）、ＯＰＥＮ法（Ｍｏｌ　Ｃｅｌｌ　（２００８）　３１：　２９４－３０１）、ＣｏＤＡ法（Ｎａｔ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　（２０１１）　８：　６７－６９）、大腸菌ｏｎｅ－ｈｙｂｒｉｄ法（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　（２００８）　２６：
　６９５－７０１）等の公知の手法により作製することができる。ジンクフィンガーモチーフの作製の詳細については、種々の文献を参照することができる。

　ＴＡＬエフェクターは、約３４アミノ酸を単位としたモジュールの繰り返し構造を有しており、１つのモジュールの１２および１３番目のアミノ酸残基（ＲＶＤと呼ばれる）によって、結合安定性と塩基特異性が決定される。各モジュールは独立性が高いので、モジュールを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なＴＡＬエフェクターを作製することが可能である。ＴＡＬエフェクターは、オープンリソースを利用した作製方法（ＲＥＡＬ法（Ｃｕｒｒ　Ｐｒｏｔｏｃ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　（２０１２）　Ｃｈａｐｔｅｒ　１２：　Ｕｎｉｔ　１２．１５）、ＦＬＡＳＨ法（Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
　（２０１２）　３０：　４６０－４６５）、Ｇｏｌｄｅｎ　Ｇａｔｅ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ　（２０１１）　３９：　ｅ８２）等）が確立されており、比較的簡便に標的ヌクレオチド配列に対するＴＡＬエフェクターを設計することができる。ＴＡＬエフェクターの作製の詳細については、種々の文献を参照することができる。

　ＰＰＲモチーフは、３５アミノ酸からなり１つの核酸塩基を認識するＰＰＲモチーフの連続によって、特定のヌクレオチド配列を認識するように構成されており、各モチーフの１、４及びｉｉ（－２）番目のアミノ酸のみで標的塩基を認識する。モチーフ構成に依存性はなく、両脇のモチーフからの干渉はないので、ＴＡＬエフェクター同様、ＰＰＲモチーフを繋ぎ合わせるだけで、標的ヌクレオチド配列に特異的なＰＰＲタンパク質を作製することが可能である。ＰＰＲモチーフの作製の詳細については、種々の文献を参照することができる。

　また、制限酵素、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼ等のフラグメントを用いる場合、これらのタンパク質のＤＮＡ結合ドメインは周知であるので、該ドメインを含み、かつＤＮＡ二重鎖切断能を有しない断片を容易に設計し、構築することができる。

　上述のように、本開示の複合体に用いられるＤＮＡグリコシラーゼは、好ましくはＣＤＧ活性又はＴＤＧ活性が賦与された変異ＵＤＧ、より好ましくはＵＮＧであるが、ＣＤＧ活性又はＴＤＧ活性が標的化された部位の至る所で作用しないように、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いものである必要がある。したがって、該標的化された部位は、ＤＮＡグリコシラーゼとの接触に際して、該ＤＮＡグリコシラーゼが効率よく作用できるように、一本鎖ＤＮＡの状態にあるか、少なくとも強固な二重らせん構造がほどけた、緩んだＤＮＡ構造をとっていることが望ましい。核酸配列認識モジュールとしてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いる場合には、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なガイドＲＮＡが、目的の二本鎖ＤＮＡの配列を認識して標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリッドを形成することにより、該標的化された部位を一本鎖の状態、もしくは二重らせん構造がほどけた（弛緩した二本鎖）状態にするので、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼは、該標的化された部位のシトシンやチミンに選択的に作用して、当該塩基を除去することができる。一方、核酸配列認識モジュールとして、ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター、ＰＰＲモチーフ等を用いる場合には、該モジュール自体に二本鎖ＤＮＡの構造を変化させる（二重らせん構造のひずみを生じさせる）機能はないので、二本鎖ＤＮＡの構造を変化させる因子（例えば、ジャイレース、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ等）と組み合わせて、目的の二本鎖ＤＮＡに、本開示の複合体を接触させることが望ましい。

　上記いずれかの核酸配列認識モジュールは、上記ＤＮＡグリコシラーゼとの融合タンパク質として提供することもできるし、あるいは、ＳＨ３ドメイン、ＰＤＺドメイン、ＧＫドメイン、ＧＢドメイン等のタンパク質結合ドメインとそれらの結合パートナーとを、核酸配列認識モジュールと、ＤＮＡグリコシラーゼとにそれぞれ融合させ、該ドメインとその結合パートナーとの相互作用を介してタンパク質複合体として提供してもよい。あるいは、核酸配列認識モジュールと、ＤＮＡグリコシラーゼとにそれぞれインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）を融合させ、各タンパク質合成後のライゲーションにより、両者を連結することもできる。

　核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとが結合した本開示の複合体（融合タンパク質を含む。）と、二本鎖ＤＮＡとの接触は、目的の二本鎖ＤＮＡ（例、ゲノムＤＮＡ）を有する細胞に、該複合体又はそれをコードする核酸を導入することにより実施される。導入及び発現効率を考慮すると、該複合体自体としてよりも、それをコードする核酸の形態で細胞に導入し、細胞内で該複合体を発現させることが望ましい。変異ＡＰエンドヌクレアーゼやＡ２０タンパク質等を併用する場合にも、それらをコードする核酸の形態で細胞に導入し、該細胞内で発現させることが望ましい。

　したがって、核酸配列認識モジュールと、ＤＮＡグリコシラーゼとは、それらの融合タンパク質をコードする核酸として、あるいは、結合ドメインやインテイン等を利用してタンパク質に翻訳後、宿主細胞内で複合体形成し得るような形態で、それらをそれぞれコードする核酸として調製することが好ましい。ここで核酸は、ＤＮＡであってもＲＮＡであってもよい。ＤＮＡの場合は、好ましくは二本鎖ＤＮＡであり、宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下に配置した発現ベクターの形態で提供される。ＲＮＡの場合は、好ましくは一本鎖ＲＮＡである。

　核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとが、それぞれ２つの断片に分断され、その一方の断片同士が連結された２つの部分的複合体として提供される場合、例えば、核酸配列認識モジュールのＮ末側断片をコードするＤＮＡとＣ末側断片をコードするＤＮＡとを、それぞれ適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により調製し、他方、ＤＮＡグリコシラーゼのＮ末側断片をコードするＤＮＡとＣ末側断片をコードするＤＮＡとを同様にして調製し、例えばＮ末側断片をコードするＤＮＡ同士、並びにＣ末側断片をコードするＤＮＡ同士を、常法を用いて連結して、２つの部分的複合体をコードするＤＮＡを作製することができる。あるいは、核酸配列認識モジュールのＮ末側断片をコードするＤＮＡとＤＮＡグリコシラーゼのＣ末側断片をコードするＤＮＡとを連結し、他方、ＤＮＡグリコシラーゼのＮ末側断片をコードするＤＮＡと核酸配列認識モジュールのＣ末側断片をコードするＤＮＡとを連結することにより、２つの部分的複合体をコードするＤＮＡを作製することもできる。連結する断片の組み合わせは、２つの部分的複合体が会合した際に、機能的な核酸配列認識モジュールと機能的なＤＮＡグリコシラーゼとの複合体に再構成される限り、特に制限されない。また、２つの部分的複合体は、別個の分子として発現させるだけでなく、それらをコードする核酸を直接もしくは適当なリンカーを介して連結することにより、１つの融合タンパク質として発現させ、分子内会合により機能的な核酸配列認識モジュールと機能的なＤＮＡグリコシラーゼとの複合体を形成させるものであってもよい。

　核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとが結合した本開示の複合体は、ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を伴わないため、毒性の低いゲノム編集が可能であり、本開示の遺伝子改変方法は幅広い生物材料に適用することができる。したがって、核酸配列認識モジュール及び／又はＤＮＡグリコシラーゼをコードする核酸が導入される細胞は、原核生物である大腸菌などの細菌や下等真核生物である酵母などの微生物の細胞から、ヒト等の哺乳動物を含む脊椎動物、昆虫、植物など高等真核生物の細胞にいたるまで、あらゆる生物種の細胞をも包含し得る。

　ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター、ＰＰＲモチーフ等の核酸配列認識モジュールをコードするＤＮＡは、各モジュールについて上記したいずれかの方法により取得することができる。制限酵素、転写因子、ＲＮＡポリメラーゼ等の配列認識モジュールをコードするＤＮＡは、例えば、それらのｃＤＮＡ配列情報に基づいて、当該タンパク質の所望の部分（ＤＮＡ結合ドメインを含む部分）をコードする領域をカバーするようにオリゴＤＮＡプライマーを合成し、当該タンパク質を産生する細胞より調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、ＲＴ－ＰＣＲ法によって増幅することにより、クローニングすることができる。

　ＤＮＡグリコシラーゼをコードするＤＮＡも、同様に、使用する酵素のｃＤＮＡ配列情報をもとにオリゴＤＮＡプライマーを合成し、当該酵素を産生する細胞より調製した全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分を鋳型として用い、ＲＴ－ＰＣＲ法によって増幅することにより、クローニングすることができる。例えば、酵母のＵＮＧ１をコードするＤＮＡは、ＮＣＢＩデータベースに登録されているｃＤＮＡ配列（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．　ＮＭ＿００１１８２３７９）をもとに、ＣＤＳの上流及び下流に対して適当なプライマーを設計し、酵母由来ｍＲＮＡからＲＴ－ＰＣＲ法によりクローニングできる。

　得られたｃＤＮＡを鋳型にして、公知の部位特異的変異誘発法を用いて、ＣＤＧ活性、ＴＤＧ活性又は５－ｍＣＤＧ活性を付与する変異と、二重鎖ＤＮＡへの反応性を低下させる変異とを導入することにより、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼをコードする核酸を取得することができる。ｖｖＵＤＧ等のように、生来的に二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼの場合、ＣＤＧ活性、ＴＤＧ活性又は５－ｍＣＤＧ活性を付与する変異のみを導入することができる。

　クローン化されたＤＮＡは、そのまま、または所望により制限酵素で消化するか、適当なリンカー（例、ＧＳリンカー、ＧＧＧＡＲリンカー等）、スペーサー（例、ＦＬＡＧ配列等）及び／又は核移行シグナル（ＮＬＳ）（目的の二本鎖ＤＮＡがミトコンドリアや葉緑体ＤＮＡの場合は、各オルガネラ移行シグナル）を付加した後に、核酸配列認識モジュールをコードするＤＮＡとライゲーションして、融合タンパク質をコードするＤＮＡを調製することができる。ＵＮＧ１及びＵＮＧ２はそれぞれＮ末端にミトコンドリア移行シグナル及び核移行シグナルを有するので、それらをそのまま利用することもできる。あるいは、例えばＵＮＧ１を核ゲノムＤＮＡを標的化したヌクレオチド改変に用いる場合、ミトコンドリア移行シグナルを除去して、別途核移行シグナルを連結することができる。

　あるいは、核酸配列認識モジュールをコードするＤＮＡと、ＤＮＡグリコシラーゼをコードするＤＮＡに、それぞれ結合ドメインもしくはその結合パートナーをコードするＤＮＡを融合させるか、両ＤＮＡに分離インテインをコードするＤＮＡを融合させることにより、核酸配列認識変換モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとが宿主細胞内で翻訳された後に複合体を形成できるようにしてもよい。これらの場合も、所望により一方もしくは両方のＤＮＡの適当な位置に、リンカー及び／又は核移行シグナルを連結することができる。

　核酸配列認識モジュールをコードするＤＮＡ、ＤＮＡグリコシラーゼをコードするＤＮＡは、化学的にＤＮＡ鎖を合成するか、もしくは合成した一部オーバーラップするオリゴＤＮＡ短鎖を、ＰＣＲ法やＧｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ法を利用して接続することにより、その全長をコードするＤＮＡを構築することも可能である。化学合成又はＰＣＲ法もしくはＧｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ法との組み合わせで全長ＤＮＡを構築することの利点は、該ＤＮＡを導入する宿主に合わせて使用コドンをＣＤＳ全長にわたり設計できる点にある。異種ＤＮＡの発現に際し、そのＤＮＡ配列を宿主生物において使用頻度の高いコドンに変換することで、タンパク質発現量の増大が期待できる。使用する宿主におけるコドン使用頻度のデータは、例えば（公財）かずさＤＮＡ研究所のホームページに公開されている遺伝暗号使用頻度データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いることができ、または各宿主におけるコドン使用頻度を記した文献を参照してもよい。入手したデータと導入しようとするＤＮＡ配列を参照し、該ＤＮＡ配列に用いられているコドンの中で宿主において使用頻度の低いものを、同一のアミノ酸をコードし使用頻度の高いコドンに変換すればよい。

　核酸配列認識モジュール及び／又はＤＮＡグリコシラーゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、例えば、該ＤＮＡを適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。

　発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）；枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）；酵母由来プラスミド（例、ｐＳＨ１９，ｐＳＨ１５）；昆虫細胞発現プラスミド（例：ｐＦａｓｔ－Ｂａｃ）；動物細胞発現プラスミド（例：ｐＡ１－１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏ）；λファージなどのバクテリオファージ；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター（例：ＢｍＮＰＶ、ＡｃＮＰＶ）；レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。

　プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。ＤＳＢを伴う従来法では毒性のために宿主細胞の生存率が著しく低下する場合があるので、誘導プロモーターを使用して誘導開始までに細胞数を増やしておくことが望ましいが、本開示の複合体を発現させても十分な細胞増殖が得られるので、構成プロモーターも制限なく使用することができる。

　本開示の一実施形態において、本開示の方法は、二本鎖ＤＮＡの標的化した部位が改変された植物細胞を生産するものであるため、その宿主として植物細胞を好ましく用いることができる。宿主が植物細胞である場合、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーターなどが好ましい。

　本開示の他の局面について、本開示の方法は、二本鎖ＤＮＡの標的化した部位が改変された細胞を生産するものとすることができ、この場合には、動物細胞などもその宿主として用いることができる。例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）ＬＴＲ、ＨＳＶ－ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）プロモーターなどが用いられる。また宿主が大腸菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。また宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。また宿主が酵母である場合、Ｇａｌ１／１０プロモーター、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。また宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。

　発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ターミネーター、ポリＡ付加シグナル、薬剤耐性遺伝子、栄養要求性相補遺伝子等の選択マーカー、複製起点などを含有しているものを用いることができる。

　核酸配列認識モジュール及び／又はＤＮＡグリコシラーゼをコードするＲＮＡは、例えば、上記した核酸配列認識モジュール及び／又はＤＮＡグリコシラーゼをコードするＤＮＡをコードするベクターを鋳型として、公知のインビトロ転写系にてｍＲＮＡに転写することにより調製することができる。

　核酸配列認識モジュール及び／又はＤＮＡグリコシラーゼをコードするＤＮＡを含む発現ベクターを宿主細胞に導入し、当該宿主細胞を培養することによって、核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとの複合体を細胞内で発現させることができる。

　一実施形態において、宿主細胞としては、例えば、植物細胞、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などを用いることができ、植物細胞としては、種々の植物（例えば、イネ、コムギ、トウモロコシ、豆、綿、麦、麻、ゴマ、ソバ等の穀物、トマト、キュウリ、ナス、バナナ、コーヒー、レタス等の商品作物、カーネーション、トルコギキョウ、ベニバナ、ヒマワリ、バラ、イチイ等の園芸植物、タバコ、シロイヌナズナ等の実験植物など）から調製した懸濁培養細胞、カルス、プロトプラスト、葉切片、根切片などを用いることができる。

　他の実施形態において、エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６０，１６０　（１９６８）〕，エシェリヒア・コリＪＭ１０３〔Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，９，３０９　（１９８１）〕，エシェリヒア・コリＪＡ２２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２０，５１７　（１９７８）〕，エシェリヒア・コリＨＢ１０１〔Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，４１，４５９　（１９６９）〕，エシェリヒア・コリＣ６００〔Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，３９，４４０　（１９５４）〕などが用いられる。またバチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔Ｇｅｎｅ，２４，２５５　（１９８３）〕，バチルス・サブチルス２０７－２１〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９５，８７　（１９８４）〕などが用いられる。また酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ－，ＮＡ８７－１１Ａ，ＤＫＤ－５Ｄ，２０Ｂ－１２、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６，ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。また昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ　ＦｉｖｅＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ　ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞、Ｅｓｔｉｇｍｅｎａ　ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ　Ｎ　細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ
　ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞〔以上、Ｉｎ　Ｖｉｖｏ，　１３，　２１３－２１７
　（１９７７）〕などが用いられる。また昆虫としては、例えば、カイコの幼虫、ショウジョウバエ、コオロギなどが用いられる〔Ｎａｔｕｒｅ，３１５，５９２　（１９８５）〕。また動物細胞としては、例えば、サルＣＯＳ－７細胞、サルＶｅｒｏ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ｄｈｆｒ遺伝子欠損ＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞、マウスＡｔＴ－２０細胞、マウスミエローマ細胞、ラットＧＨ３細胞、ヒトＦＬ細胞などの細胞株、ヒト及び他の哺乳動物のｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞、種々の組織から調製した初代培養細胞が用いられる。さらには、ゼブラフィッシュ胚、アフリカツメガエル卵母細胞なども用いることができる。

　上記いずれの宿主細胞も、半数体（一倍体）であってもよいし、倍数体（例、二倍体、三倍体、四倍体など）であってもよい。従来の変異導入手法では、原則として相同染色体の一本にのみしか変異が導入されず、ヘテロな遺伝子型になるため、優性変異でなければ所望の形質は発現せず、ホモ化するには手間と時間がかかり、不都合が多かった。これに対し、本開示によれば、ゲノム内の相同染色体上の対立遺伝子すべてに変異を導入することができるので、劣性変異であっても当代で所望の形質を発現させることができ、従来法の問題点を克服することができる点で極めて有用である。

　発現ベクターの導入は、宿主の種類に応じ、公知の方法（例えば、リゾチーム法、コンピテント法、ＰＥＧ法、ＣａＣｌ_２共沈殿法、エレクトロポレーション法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リポフェクション法、アグロバクテリウム法、フローラルディップ法など）に従って実施することができる。

　例えば、宿主として植物細胞を用いる場合には、アグロバクテリウムを介する方法および直接細胞に導入する方法などを用いることができる。アグロバクテリウムを介する方法としては、例えば、Ｎａｇｅｌらの方法（Ｎａｇｅｌら（１９９０）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，６７，３２５）が用いられ得る。この方法は、まず、例えば植物に適切な発現ベクターでエレクトロポレーションによってアグロバクテリウムを形質転換し、次いで、形質転換されたアグロバクテリウムをＧｅｌｖｉｎら（Ｇｅｌｖｉｎら編（１９９４）、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｋｌｕｗｅｒ
　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ））に記載の方法で植物細胞に導入する方法である。

　他の実施形態において、大腸菌を用いる場合には、例えば、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９，２１１０　（１９７２）やＧｅｎｅ，１７，１０７　（１９８２）などに記載の方法に従って形質転換することができる。またバチルス属菌は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１　（１９７９）などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。また酵母を用いる場合には、例えば、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９４，１８２－１８７　（１９９１）、Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，７５，１９２９　（１９７８）などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。また昆虫細胞および昆虫を用いる場合には、例えば、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７－５５　（１９８８）などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。また動物細胞を用いる場合は、例えば、細胞工学別冊８　　新細胞工学実験プロトコール，２６３－２６７　（１９９５）（秀潤社発行）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２，４５６　（１９７３）に記載の方法に従ってベクター導入することができる。

　ベクターを導入した細胞の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。

　例えば、植物細胞を培養する培地としては、ＭＳ培地、ＬＳ培地、Ｂ５培地などが用いられる。培地のｐＨは好ましくは約５～約８である。培養は、通常約２０℃～約３０℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。

　他の実施形態において、大腸菌またはバチルス属菌を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは、好ましくは約５～約８である。

　大腸菌を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，　４３１－４３３，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　１９７２〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β－インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。大腸菌の培養は、通常約１５～約４３℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。

　バチルス属菌の培養は、通常約３０～約４０℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。

　酵母を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，７７，４５０５　（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．
　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，８１，５３３０　（１９８４）〕などが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５～約８である。培養は、通常約２０℃～約３５℃で行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。

　昆虫細胞または昆虫を培養する場合の培地としては、例えばＧｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ〔Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８　（１９６２）〕に非働化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６．２～約６．４である。培養は、通常約２７℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。

　動物細胞を培養する場合の培地としては、例えば、約５～約２０％の胎児ウシ血清を含む最小必須培地（ＭＥＭ）〔Ｓｃｉｅｎｃｅ，１２２，５０１　（１９５２）〕，ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）〔Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，８，３９６　（１９５９）〕，ＲＰＭＩ　１６４０培地〔Ｔｈｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，１９９，５１９　（１９６７）〕，１９９培地〔Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，７３，１　（１９５０）〕などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６～約８である。培養は、通常約３０℃～約４０℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。

　以上のようにして、核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとの複合体を細胞内で発現させることができる。

　核酸配列認識モジュール及び／又はＤＮＡグリコシラーゼをコードするＲＮＡの宿主細胞への導入は、マイクロインジェクション法、リポフェクション法等により行うことができる。ＲＮＡ導入は１回もしくは適当な間隔をおいて複数回（例えば、２～５回）繰り返して行うことができる。

　細胞内に導入された発現ベクター又はＲＮＡ分子から、核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとの複合体が発現すると、該核酸配列認識モジュールが目的の二本鎖ＤＮＡ（例、ゲノムＤＮＡ）内の標的ヌクレオチド配列を特異的に認識して結合し、該核酸配列認識モジュールに連結されたＤＮＡグリコシラーゼの作用により、標的化された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部又はそれらの近傍を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる）のセンス鎖もしくはアンチセンス鎖で脱塩基反応が起こり、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖に無塩基部位（ＡＰ部位）が生じる。すると、細胞内の塩基除去修復（ＢＥＲ）系が作動し、まずＡＰエンドヌクレアーゼがＡＰ部位を認識してＤＮＡ片鎖のリン酸結合を切断し、エキソヌクレアーゼが脱塩基されたヌクレオチドを除去する。次にＤＮＡポリメラーゼが反対鎖ＤＮＡを鋳型として新たにヌクレオチドを挿入し、最後にＤＮＡリガーゼが繋ぎ目を修復する。このＢＥＲのいずれかの段階で修復ミスが起こることにより、種々の変異が導入される。上述のように、酵素活性を失っているがＡＰ部位への結合能を保持する変異ＡＰエンドヌクレアーゼを併用することにより、細胞内のＢＥＲ機構が阻害され、修復ミスの頻度、したがって変異導入効率を向上させることができる。

　ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なガイドＲＮＡにより目的の二本鎖ＤＮＡの配列を認識するので、標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成し得るオリゴＤＮＡを合成するだけで、任意の配列を標的化することができ、しかも標的化された部位において、二本鎖ＤＮＡをほどいて一本鎖構造の領域と、それに隣接する緩んだ二本鎖ＤＮＡ構造をとる領域とを生成するため、二本鎖ＤＮＡの構造を変化させる因子を組み合わせることなく、標的化された部位特異的にＤＮＡグリコシラーゼを効率よく作用させることができる。したがって、本開示のより好ましい実施態様においては、核酸配列認識モジュールとして、Ｃａｓの少なくとも１つのＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（ＣＲＩＳＰＲ－変異Ｃａｓ）、またはＣａｓの両方のＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム（ＣＲＩＳＰＲ－変異Ｃａｓ）を好ましく用いることができる。

　ＣＲＩＳＰＲ－変異Ｃａｓを用いた本開示の核酸配列認識モジュールは、標的ヌクレオチド配列と相補的なガイドＲＮＡと、変異Ｃａｓタンパク質のリクルートに必要なｔｒａｃｒＲＮＡとからなるＲＮＡ分子と変異Ｃａｓタンパク質との複合体として提供される。

　本開示で使用されるＣａｓタンパク質は、ＣＲＩＳＰＲシステムに属するものであれば特に制限はないが、好ましくはＣａｓ９である。Ｃａｓ９としては、例えばストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）等が挙げられるが、それらに限定されない。好ましくはＳｐＣａｓ９である。本開示で用いられる変異Ｃａｓとしては、Ｃａｓタンパク質の二本鎖ＤＮＡの両方の鎖の切断能を持たないものと、一方の鎖の切断能のみを持たないニッカーゼ活性を有するものの、いずれも使用可能である。例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基がＡｌａ残基に変換した、ガイドＲＮＡと相補鎖を形成する鎖の反対鎖の切断能を欠くＤ１０Ａ変異体、あるいは、８４０番目のＨｉｓ残基がＡｌａ残基で変換した、ガイドＲＮＡと相補鎖の切断能を欠くＨ８４０Ａ変異体、さらにはその二重変異体を用いることができるが、他の変異Ｃａｓも同様に用いることができる。

　ＤＮＡグリコシラーゼは、上記ジンクフィンガー等との連結様式と同様の手法により、変異Ｃａｓとの複合体として提供される。あるいは、ＤＮＡグリコシラーゼと変異Ｃａｓとを、ＲＮＡ　ａｐｔａｍｅｒであるＭＳ２Ｆ６、ＰＰ７等とそれらとの結合タンパク質によるＲＮＡ　ｓｃａｆｆｏｌｄを利用して結合させることもできる。ガイドＲＮＡが標的ヌクレオチド配列と相補鎖を形成し、これに続くｔｒａｃｒＲＮＡに変異ＣａｓがリクルートされてＤＮＡ切断部位認識配列ＰＡＭ（プロトスペーサー　アジェイセント　モチーフ）（ＳｐＣａｓ９を用いた場合、ＰＡＭはＮＧＧ（Ｎは任意の塩基）３塩基であり、理論上ゲノム上のどこでも標的化することができる）を認識するが、一方あるいは両方のＤＮＡを切断することができず、変異Ｃａｓに連結されたＤＮＡグリコシラーゼの作用により、標的された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる）で脱塩基が起こり、二本鎖ＤＮＡ内にＡＰ部位が生じる。これを修復しようとする細胞のＢＥＲ系のエラーにより、種々の変異が導入される。

　ＣＲＩＳＰＲ－変異Ｃａｓを核酸配列認識モジュールとして用いる場合でも、ジンクフィンガー等を核酸配列認識モジュールとして用いる場合と同様に、核酸配列認識モジュールとＤＮＡグリコシラーゼとは、それらをコードする核酸の形態で、目的の二本鎖ＤＮＡを有する細胞に導入することが望ましい。

　ＣａｓをコードするＤＮＡは、ＤＮＡグリコシラーゼをコードするＤＮＡについて上記したのと同様の方法により、該酵素を産生する細胞からクローニングすることができる。また、変異Ｃａｓは、クローン化されたＣａｓをコードするＤＮＡに、自体公知の部位特異的変異誘発法を用いて、ＤＮＡ切断活性に重要な部位のアミノ酸残基（例えば、Ｃａｓ９の場合、１０番目のＡｓｐ残基や８４０番目のＨｉｓ残基が挙げられるが、これらに限定されない）を他のアミノ酸で変換するように変異を導入することにより、取得することができる。

　あるいは変異ＣａｓをコードするＤＮＡは、核酸配列認識モジュールをコードするＤＮＡやＤＮＡグリコシラーゼをコードするＤＮＡについて上記したのと同様の方法により、化学合成又はＰＣＲ法もしくはＧｉｂｓｏｎ　Ａｓｓｅｍｂｌｙ法との組み合わせで、用いる宿主細胞での発現に適したコドン使用を有するＤＮＡとして構築することもできる。

　一実施形態において、変異ＣａｓをコードするＤＮＡと、ＤＮＡグリコシラーゼをコードするＤＮＡとは、融合タンパク質として発現するように連結してもよいし、結合ドメインやインテイン等を用いて別々に発現させ、タンパク質間相互作用やタンパク質ライゲーションを介して宿主細胞内で複合体を形成するように設計してもよい。あるいは、変異ＣａｓをコードするＤＮＡと、ＤＮＡグリコシラーゼをコードするＤＮＡとを、それぞれ適当な箇所で２つの断片に分断し、それらの一方の断片同士を直接もしくは適当なリンカーを介して連結することにより、核酸改変酵素複合体を２つの部分的複合体として発現させ、それらが細胞内で会合し、リフォールディングすることによって、特定の核酸配列認識能を有する機能的な変異Ｃａｓを再構成させ、該変異Ｃａｓが標的ヌクレオチド配列と結合した場合に、脱塩基反応触媒活性を有する機能的なＤＮＡグリコシラーゼが再構成されるように設計してもよい。例えば、変異ＣａｓのＮ末側断片をコードするＤＮＡとＣ末側断片をコードするＤＮＡとを、それぞれ適当なプライマーを用いてＰＣＲ法により調製し、他方、ＤＮＡグリコシラーゼのＮ末側断片をコードするＤＮＡとＣ末側断片をコードするＤＮＡとを同様にして調製し、例えばＮ末側断片をコードするＤＮＡ同士、並びにＣ末側断片をコードするＤＮＡ同士を、常法を用いて連結して、２つの部分的複合体をコードするＤＮＡを作製することができる。あるいは、変異ＣａｓのＮ末側断片をコードするＤＮＡとＤＮＡグリコシラーゼのＣ末側断片をコードするＤＮＡとを連結し、他方、ＤＮＡグリコシラーゼのＮ末側断片をコードするＤＮＡと変異ＣａｓのＣ末側断片をコードするＤＮＡとを連結することにより、２つの部分的複合体をコードするＤＮＡを作製することもできる。各部分的複合体は融合タンパク質として発現するように連結してもよいし、結合ドメインやインテイン等を用いて別々に発現させ、タンパク質間相互作用やタンパク質ライゲーションを介して宿主細胞内で複合体を形成するように設計してもよい。また、２つの部分的複合体を１つの融合タンパク質として発現するように連結してもよい。変異Ｃａｓの分断箇所は、分断された２つの断片が標的ヌクレオチド配列を認識して結合するように再構成され得る限り特に制限はなく、１か所で分断されてＮ末側断片とＣ末側断片としてもよいし、２か所以上で分断して生じる３以上の断片を適宜連結して２つの断片とすることもできる。種々のＣａｓ９タンパク質の３次元構造は公知であり、当業者であれば、当該情報に基づいて適宜分断箇所を選択することができる。例えば、ＳｐＣａｓ９の場合、Ｎ末から９４番目から７１８番目のアミノ酸からなる領域が標的ヌクレオチド配列とガイドＲＮＡの認識に関わるドメイン（ＲＥＣ）であり、１０９９番目からＣ末端のアミノ酸からなる領域がＰＡＭとの相互作用に関わるドメイン（ＰＩ）であるので、ＲＥＣドメイン内もしくはＰＩドメイン内の任意の部位、好ましくは構造を持たない領域内（例、Ｎ末から２０４番目と２０５番目のアミノ段の間（２０４．．２０５）、Ｎ末から５３５番目と５３６番目のアミノ酸の間（５３５．．５３６）など）で、Ｎ末側断片とＣ末側断片とに分断することができる（例えば、Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　３３（２）：
　１３９－１４２　（２０１５）参照）。

　得られた変異Ｃａｓ及び／又はＤＮＡグリコシラーゼをコードするＤＮＡは、宿主に応じて、上記と同様の発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することができる。一方、ガイドＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的な配列と既知のｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを連結したオリゴＤＮＡ配列を設計し、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて、化学的に合成することができる。ガイドＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードするＤＮＡも、宿主に応じて、上記と同様の発現ベクターに挿入することができるが、プロモーターとしては、ｐｏｌ　ＩＩＩ系のプロモーター（例、ＳＮＲ６、ＳＮＲ５２、ＳＣＲ１、ＲＰＲ１、Ｕ６、Ｈ１プロモーター等）及びターミネーター（例、Ｔ６配列）を用いることが好ましい。

　変異Ｃａｓ及び／又はＤＮＡグリコシラーゼをコードするＲＮＡは、例えば、上記した変異Ｃａｓ及び／又はＤＮＡグリコシラーゼをコードするＤＮＡをコードするベクターを鋳型として、自体公知のインビトロ転写系にてｍＲＮＡに転写することにより調製することができる。

　ガイドＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的な配列と既知のｔｒａｃｒＲＮＡ配列とを連結したオリゴＲＮＡ配列を設計し、ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機を用いて、化学的に合成することができる。

　変異Ｃａｓ及び／又はＤＮＡグリコシラーゼをコードするＤＮＡあるいはＲＮＡ、ガイドＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡは、宿主に応じて、上記と同様の方法により宿主細胞に導入することができる。

　従来型の人工ヌクレアーゼでは、ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を伴うため、ゲノム内の配列を標的とすると染色体の無秩序な切断（ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ切断）によると思われる増殖阻害と細胞死とが引き起こされる。この影響は多くの微生物・原核生物において特に致命的であり、応用性を阻んでいる。本開示では、変異導入をＤＮＡ切断ではなくＤＮＡ上の脱塩基反応によって行うため、毒性の大幅な軽減が実現できる。

　また本開示の二本鎖ＤＮＡの改変では、標的化された部位（標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる）以外で、該二本鎖ＤＮＡの切断が生じることを妨げない。しかしながら、本開示の利点の１つが、ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ切断による毒性を回避することであり、原則的にいかなる生物種においても適用可能であることを考慮すれば、好ましい一実施態様においては、本開示の二本鎖ＤＮＡの改変は、選択された二本鎖ＤＮＡの標的化された部位のみならず、それ以外の部位でのＤＮＡ鎖切断も伴わない。

　本開示の一実施形態において、近接する複数の標的ヌクレオチド配列に対して配列認識モジュールを作製し、同時に用いることにより、単独のヌクレオチド配列を標的とするよりも、変異導入効率を上昇させ得る。その効果は、両標的ヌクレオチド配列の一部が重複するような場合から、両者が６００ｂｐ程度離れている場合でも同様に変異誘導が実現する。また、標的ヌクレオチド配列が同じ方向（同一鎖上に標的ヌクレオチド配列が存在する）である場合と、対向する（二本鎖ＤＮＡのそれぞれの鎖上に標的ヌクレオチド配列が存在する）場合のどちらでも起こり得る。

　本開示のゲノム配列の改変方法は、適当な標的ヌクレオチド配列を選択すれば、本開示の複合体を発現させたほぼすべての細胞で変異を導入することができる。そのため、従来のゲノム編集では必須であった選択マーカー遺伝子の挿入と選抜が不要である。これは遺伝子操作を劇的に簡便にすると同時に、外来ＤＮＡの組換え生物ではなくなるので、作物育種などの応用性が大きく広がる。

　また、変異導入効率が極めて高く、かつマーカーによる選抜を必要としないことから、本開示のゲノム配列の改変方法においては、全く異なる位置の複数のＤＮＡ領域を標的として改変することが可能である。したがって、本開示の好ましい一実施態様においては、異なる標的ヌクレオチド配列（１つの目的遺伝子内であってもよいし、異なる２以上の目的遺伝子内にあってもよい。これらの目的遺伝子は同一染色体上にあってもよいし、別個の染色体上に位置していてもよい。）とそれぞれ特異的に結合する、２種以上の核酸配列認識モジュールを用いることができる。この場合、これらの核酸配列認識モジュールの各々１つと、ＤＮＡグリコシラーゼとが複合体を形成する。ここでＤＮＡグリコシラーゼは共通のものを使用することができる。例えば、核酸配列認識モジュールとしてＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いる場合、Ｃａｓタンパク質とＤＮＡグリコシラーゼとの複合体（融合タンパク質を含む）は共通のものを用い、ガイドＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡとして、異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ相補鎖を形成する２以上のガイドＲＮＡの各々と、ｔｒａｃｒＲＮＡとのキメラＲＮＡを２種以上作製して用いることができる。一方、核酸配列認識モジュールとしてジンクフィンガーモチーフやＴＡＬエフェクターなどを用いる場合には、例えば、異なる標的ヌクレオチドと特異的に結合する各核酸配列認識モジュールに、ＤＮＡグリコシラーゼを融合させることができる。

　本開示の複合体を宿主細胞内で発現させるためには、上述のように該複合体をコードするＤＮＡを含む発現ベクターや、該複合体をコードするＲＮＡを宿主細胞に導入するが、効率よく変異を導入するためには、一定期間以上、一定レベル以上の核酸改変酵素複合体の発現が維持されるのが望ましい。かかる観点からは、宿主細胞内で自律複製可能な発現ベクター（プラスミド等）を導入することが確実であるが、該プラスミド等は外来ＤＮＡであるため、首尾よく変異導入が達成された後は、速やかに除去されることが好ましい。また、変異ＡＰエンドヌクレアーゼを併用する場合、該変異酵素は宿主細胞内のＢＥＲ機構を阻害するので、標的領域以外での望ましくない自然突然変異を誘発するおそれがあるので、該変異酵素をコードするＤＮＡを含むプラスミドも、所望の変異導入後、速やかに除去されるのが好ましい。従って、宿主細胞の種類等によって変動するが、例えば、発現ベクター導入から６時間～２日間経過後に、当該技術分野で周知の種々のプラスミド除去法を用いて、宿主細胞から導入したプラスミドを除去することが望ましい。

　あるいは、変異導入に十分な核酸改変酵素複合体の発現が得られる限り、宿主細胞内での自律複製能を有しない発現ベクター（例えば、宿主細胞で機能する複製起点及び／又は複製に必要なタンパク質をコードする遺伝子を欠くベクター等）や、ＲＮＡを用いて、一過的発現により目的の二本鎖ＤＮＡに変異を導入することもまた好ましい。

　＜改変植物細胞の生産＞
　本開示の一実施形態において、本開示の方法は、上記のような核酸配列認識モジュールと、ＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体を用いて、該複合体を植物細胞にトランスフェクトさせ、該複合体が発現することにより、該植物細胞において所定の改変が生じる方法である。複合体の導入は、当該複合体をコードする遺伝子が植物に導入される限り特に制限はないが、本明細書の他の箇所に説明されるベクターを用いて、目的の植物に導入することができる。目的の細胞に導入する方法としては、アグロバクテリウム法、フローラルディップ法、パーティクルガン（ボンバートメント）法、ＲＮＡウイルスベクター法、プラズマ処理法、ＰＥＧ法、エレクトロポレーション法等が挙げられる。

　ゲノム編集により標的遺伝子に変異を導入する手法としては、例えば、アグロバクテリウムを利用した形質転換法、およびプロトプラストにゲノム編集用の因子を直接導入する方法等が挙げられる。アグロバクテリウムを利用した形質転換法は、ゲノム編集用の因子を発現するベクターを含むアグロバクテリウム細菌を、植物細胞に感染させることによって、植物細胞にゲノム編集用の因子を導入する手法である。すなわち、目的とする植物（例えばユリ科植物）から単離された植物細胞または植物組織を、ゲノム編集用の因子を発現するベクターを含むアグロバクテリウム細菌とインキュベートし、植物細胞にゲノム編集用の因子を導入する。その後、適切な培養条件において細胞培養または組織培養を行うことにより、ゲノム編集されたカルスを生成する。その後、ゲノム編集されたカルスを分化誘導することによって、ゲノム編集された植物体を再生することにより、植物体全体のゲノムが編集された植物体を得ることができる。プロトプラストにゲノム編集用の因子を直接導入する方法は、アグロバクテリウムおよびベクターを使用せずに、植物細胞にゲノム編集用の因子を直接導入する手法である。すなわち、目的とする植物由来の植物細胞からプロトプラストを調製し、ゲノム編集用の因子を、ＰＥＧ法またはパーティクルガン法などによって直接プロトプラスト内に導入する。その後、プロトプラストを適切な培養条件でインキュベートすることによって、ゲノムが編集された植物体を得ることができる。

　アグロバクテリウム法は、土壌細菌であるリゾビウム属のアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、リゾビウム・ラジオバクター（Ｒｉｚｏｂｉｕｍ　ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、またはリゾビウム・リゾゲネス（Ｒｉｚｏｂｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）などを用いる方法であり、この菌
が有するＴｉ又はＲｉプラスミドのＴ－ＤＮＡ領域が、相同組換えにより、植物ゲノム内に挿入されることを利用することができる。すなわち、目的遺伝子をＴ－ＤＮＡ領域内に挿入しておけば、アグロバクテリウムが植物に感染した際に、目的遺伝子を植物ゲノム内に導入することができる。

　フローラルディップ法は、花きの蕾にアグロバクテリウムを感染させることで雄しべとなる細胞および雌しべとなる細胞の両方に目的の遺伝子を導入し、その後受粉させることで、目的遺伝子を植物ゲノム内に導入する方法である。

　パーティクルガン法は、金やタングステンなどの金属の微粒子にＤＮＡをコーティングしたものを、弾丸として高速で射出し、植物細胞内にＤＮＡを導入する方法である。金属粒子の射出には、ヘリウムなどの高圧ガスが主に用いられる。

　アグロバクテリウム法では、例えば、上記複合体をコードする遺伝子を含むベクターを含むアグロバクテリウムを、植物の子葉又はカルスに感染させ、アグロバクテリウムを除菌するための抗生物質及び、遺伝子導入細胞の選抜のための抗生物質を培地に添加し、除菌及び選抜を繰り返して行うことで、該遺伝子を当該植物に導入させることができる。

　この場合のベクターとしては、植物体内で上記遺伝子を発現させることができる限り特に制限はなく、種々のプラスミドベクターを用いることができ、例えば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＣａＭＶ１９Ｓプロモーター、ＮＯＳプロモーター、ｐＲＩ２０１－ＡＮベクター（タカラバイオ社）、ｐＢＩベクター（タカラバイオ社）、ｐＲＩベクター（タカラバイオ社）、ｐＦＡＳＴベクター（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、ｐＳｕｐｅｒＡｇｒｏベクター（インプランタイノベーションズ社）などを用いることができる。

　また、ベクターの特殊な例として、アグロバクテリウムを介した遺伝子導入法を用いて植物細胞を形質転換する場合は、大腸菌とアグロバクテリウム双方の複製開始点、および植物に導入され得る境界領域を示すＴ－ＤＮＡ由来の境界配列（Ｌｅｆｔ　ｂｏｒｄｅｒおよびＲｉｇｈｔ　Ｂｏｒｄｅｒ）に相当するヌクレオチド配列を有する「バイナリーベクター」と呼ばれるプラスミドを用いる必要がある。例えばｐＢＩ１０１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社より市販）、ｐＢＩＮ（Ｂｅｖａｎ，Ｎ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　１２，８７１１－８７２１，１９８４）、ｐＢＩＮＰｌｕｓ（ｖａｎ　Ｅｎｇｅｌｅｎ，ＦＡ　ｅｔ　ａｌ．，Ｔｒａｎｅｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　４，２８８－２９０、１９９５）、ｐＴＮまたはｐＴＨ（Ｆｕｋｕｏｋａ　Ｈ　ｅｔ．ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　１９，２０００）、ｐＰＺＰ（Ｈａｊｄｕｋｉｅｗｉｃｚ　Ｐ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　２５，９８９－９９４，１９９４）などが挙げられるがそれらに限定されない。このほか、植物に利用され得るベクターとしては、タバコモザイクウイルスベクターも例示されるが、このタイプのベクターは目的遺伝子を植物染色体に導入するわけではないので、遺伝子導入した植物を種子を介して増殖させること必要がない場合に用途が限定されるが、本開示に使用し得る。

＜形質転換植物の生成＞
　本開示の一実施形態において、本開示の方法によれば、上記複合体をコードする遺伝子を導入した植物からカルスを形成させ、該カルスから根及びシュートを分化させて、形質転換植物を得ることができる。遺伝子が導入された植物からカルスを形成させる方法及び／又はカルスから根とシュート（ｓｈｏｏｔ）を分化させる方法としては、遺伝子が導入された植物又はカルス（特に該遺伝子を含むベクターを有するアグロバクテリウムに感染させた植物又はカルス）を、カルス誘導用培地で培養することによって行うことができる。この際、カルス誘導用培地には、さらに除菌用抗生物質や形質転換細胞選抜用抗生物質を添加することができる。除菌用抗生物質としては、セフォタキシム、モキサラクタム、メロペネム等を挙げることができ、これらの作用により、カルスから根とシュート（ｓｈｏｏｔ）の分化を効率よく行うことができる。

　培地としては、例えば、2N6培地 (N6培地用混合塩 (Sigma-Aldrich社) 4.0g/L,　Casamino　acid　300mg/L,　Myo-inocitol　100mg/L,　Nicotinic　acid　0.5mg/L,　Pyridoxine　HCl　0.5mg/L,　Thiamine　HCl　0.5mg/L,　L-Proline　2878mg/L,　Sucrose30.0g/L,　2,4-D　(2,4-dichlorophenoxyacetic　acid)　2mg/L,　Gelrite　4.0g/L,　pH5.8)を
用いることができる。アグロバクテリウムに感染させた植物片を、この培地に置床し、約２５℃暗所で３日間共存培養し、その後、共存培養後のカルスからアグロバクテリウム菌を除菌して、除菌後のカルスを2N6NU培地　(N6培地用混合塩[Sigma社製]　4.0g/L,　Casamino　acid　300mg/L,　Myo-inocitol　100mg/L,　Nicotinic　acid　0.5mg/L,　Pyridoxine　HCl　0.5mg/L,　Thiamine　HCl　0.5mg/L,　L-Proline　2878mg/L,　Sucrose30.0g/L,　2,4-D　2mg/L,　Gelrite　4.0g/L,　Vancomycin　100mg/L,　Meropenem　25mg/L,　pH5.8)で５日間養生培養することができる。その後、後述するように、形質転換に用いた任意の薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含む培地で植物を培養することで、カルスを選抜することができる。

＜遺伝子導入細胞の選別＞
　本開示の複合体が導入された細胞および／または該複合体による改変が導入された細胞の選抜方法としては、導入遺伝子とともに任意の薬剤耐性遺伝子を含むベクターを植物に導入後、当該任意の薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を含む培地で植物を培養する方法が挙げられる。薬剤耐性遺伝子としては、カナマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ビアラフォス耐性遺伝子などが挙げられる。また、これらの耐性遺伝子に対応する薬剤としては、カナマイシン、ハイグロマイシン、ビアラフォスが挙げられる。例えば、ベクターのＴ－ＤＮＡ領域にネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を挿入した場合は、抗生物質のカナマイシンを含む培地で選抜を行い、ハイグロマイシン耐性遺伝子（ＨＰＴ）やビアラフォス耐性遺伝子（ｂａｒ）遺伝子を挿入した場合は、それぞれハイグロマイシンまたはビアラフォスを培地に添加し、アグロバクテリウムを感染させた植物を、これらの薬剤耐性遺伝子に対応する薬剤を添加した培地で培養することにより、当該遺伝子が導入された植物細胞を選抜することができる。

　植物発現ベクターを導入された細胞は、上記のとおりハイグロマイシン耐性、カナマイシン耐性などの薬剤耐性で選択される。次いで、当該分野で周知の方法により、植物組織、植物器官および／または植物体に再分化され得る。さらに、植物体から種子が取得され得る。導入した遺伝子の発現は、ノーザンブロット法またはＰＣＲ法により、検出し得る。必要に応じて、遺伝子産物たるタンパク質の発現を、例えば、ウェスタンブロット法により確認し得る。

　本開示の一実施形態において、上記複合体が導入された細胞および／または上記改変が導入された細胞から所望の特性を有する細胞を選択する場合には、細胞が上記のようにトランスフェクトされた結果、上記複合体が導入された細胞、または該複合体の作用によって、二本鎖ＤＮＡの標的化した部位の１以上のヌクレオチドに置換、欠失、または１以上のヌクレオチドの挿入が生じた細胞のうち、収量、日持ち性、育成の容易さ、高品質など、植物体として有用な特性を備えた細胞を選択することができる。

　本開示は、植物において特に有用であることが示されているが、他の生物においても利用することができる。本開示において使用される分子生物学技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ　Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ　Ｅｄ．およびその第３版，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。

　形質転換を行う方法において、物理的手法には、ポリエチレングリコール法（ＰＥＧ法）、電子穿孔（エレクトロポレーション）法、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法がある。これらの方法は、単子葉、双子葉の両植物体に適用できる点で有用性が高い。しかし、ポリエチレングリコール法とエレクトロポレーション法では、細胞壁が障害となるため、プロトプラストを用いなければならない上、導入された遺伝子の植物細胞の染色体ＤＮＡへの組込み頻度が低いことが問題である。また、プロトプラストを用いずに、カルスや組織を用いたマイクロインジェクション法では、針の太さや組織の固定等に関して困難が多い。組織を用いたパーティクルガン法でも、変異がキメラの形で出現してくる等の問題がある。また、これら物理的手法では、一般に、導入された外来遺伝子が核ゲノムに不完全な状態で多コピーの遺伝子として組込まれやすい。外来遺伝子が多コピー導入されると、その遺伝子が不活化されやすいことが知られている。

　他方、生物を利用して単離遺伝子を導入する方法には、アグロバクテリウム法、ウイルスベクター法、および花粉をベクターとして用いる方法等がある。これらの方法は、プロトプラストを用いず植物のカルス、組織または植物体を用いて遺伝子導入を行うため、培養が長期間に及ぶことがなく、またソマクローナル変異等の障害を受けにくいという長所を有している。これらのうち花粉をベクターとして用いる方法は、まだ実験例も少なく、植物の形質転換法としては未知数の部分が多い。ウイルスベクター法は、ウイルスに感染した植物体全体に導入すべき遺伝子が広がるという利点はあるものの、各細胞内で増幅されて発現されるだけで、次世代に伝えられるという保証がないという点、および長いＤＮＡ断片を導入できないという点に問題がある。アグロバクテリウム法は、約２０ｋｂｐ以上のＤＮＡを大きな再編成なしに染色体に導入できること、導入される遺伝子のコピー数が、数コピーと少ないこと、および再現性が高いこと等、多くの利点がある。イネ科植物等の単子葉植物にとってアグロバクテリウムは宿主範囲外であるため、イネ科植物への外来遺伝子導入は、従来は、先に述べたような物理的手法により行われてきた。しかしながら、近年、単子葉植物でもイネ等、培養系が確立されている植物においては、アグロバクテリウム法が適用されるようになっており、むしろ現在ではアグロバクテリウム法が好んで用いられている。

　アグロバクテリウム法による外来遺伝子の導入では、ＴｉプラスミドＶｉｒ領域に植物が合成するアセトシリンゴン等の低分子フェノール化合物が作用すると、ＴｉプラスミドからＴ－ＤＮＡ領域が切り出され、幾つかの過程を経て植物細胞の核染色体ＤＮＡに組み込まれる。双子葉植物では、植物自身がそのようなフェノール化合物の合成機構を備えているため、リーフディスク法等により容易に外来遺伝子を導入することができ、再現性も高い。これに対し、単子葉植物では、そのようなフェノール化合物を植物自身が合成しないため、アグロバクテリウムによる形質転換植物の作出は困難であった。しかし、アグロバクテリウムの感染時にアセトシリンゴンを添加することで、単子葉植物への外来遺伝子導入も現在では可能となっている。

　本開示において、形質転換体では、目的とする核酸分子（導入遺伝子）は、染色体に導入されていても導入されていなくてもよい。好ましくは、目的とする核酸分子（導入遺伝子）は、染色体に導入されており、より好ましくは、２つの染色体の両方に導入されている。

　植物細胞、植物組織および植物体の培養、脱分化、分化および再生のためには、当該分野で公知の手法および培地が用いられる。このような培地には、例えば、Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ－Ｓｋｏｏｇ（ＭＳ）培地、ＧａＭｂｏｒｇ　Ｂ５（Ｂ）培地、Ｗｈｉｔｅ培地、Ｎｉｔｓｃｈ＆Ｎｉｔｓｃｈ（Ｎｉｔｓｃｈ）培地などが含まれるが、これらに限定されるわけではない。これらの培地は、通常、植物生長調節物質（植物ホルモン）などが適当量添加されて用いられる。

　本明細書において、植物の場合、「再分化」するとは、未分化の状態の細胞が機能を有する細胞、組織または個体全体等、より分化した実体へと分化する現象を意味する。例えば、カルスの再分化により、細胞（葉、根など）のような組織片を形成させることができ、またこれらの組織片を成長させることにより、器官または植物体を形成させることができる。

　形質転換体を植物体へと再分化する方法は当該分野において周知である。そのような方法としては、Ｒｏｇｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１１８：６２７－６４０（１９８６）；Ｔａｂａｔａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２８：７３－８２（１９８７）；Ｓｈａｗ，Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ　ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ｓｈｉｍａｍｏｔｏ　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　３３８：２７４（１９８９）；Ｍａｌｉｇａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｃｏｕｒｓｅ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などに記載されるものが挙げられるがそれらに限定されない。したがって、当業者は、上記周知方法を目的とするトランスジェニック植物に応じて適宜使用して、再分化させることができる。このようにして得られたトランスジェニック植物には、目的の遺伝子が導入されており、そのような遺伝子の導入は、ノーザンブロット、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。

　（一般技術）
　本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９８９）．　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，　Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ　Ｅｄ．（２００１）；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９８９）．　Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．　（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｇｒｅｅｎｅ　Ｐｕｂ．　Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；　Ｉｎｎｉｓ，　Ｍ．Ａ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ　Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｕｓｕｂｅｌ，　Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ：　Ａ　Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｒｏｍ　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｗｉｌｅｙ，　ａｎｄ　ａｎｎｕａｌ　ｕｐｄａｔｅｓ；　Ｓｎｉｎｓｋｙ，　Ｊ．Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９９）．
　ＰＣＲ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｆｏｒ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。

　人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えばＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ　ＤＮＡ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）などの遺伝子合成やフラグメント合成サービスを用いることもでき、その他、例えば、Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９８５）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｇａｉｔ，　Ｍ．Ｊ．（１９９０）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ
　Ｐｒｅｓｓ；　Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，　Ｆ．（１９９１）．　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：　Ａ　Ｐｒａｃｔｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ，　ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ；　Ａｄａｍｓ，　Ｒ．Ｌ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９２）．　Ｔｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｃｈａｐｍａｎ　＆　Ｈａｌｌ；　Ｓｈａｂａｒｏｖａ，　Ｚ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ，　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；　Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，　Ｇ．Ｍ．　ｅｔ　ａｌ．（１９９６）．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　ｉｎ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，　Ｏｘｆｏｒｄ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｐｒｅｓｓ；　Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，　Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．　Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。

　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも１つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「２つの値」の「範囲内」と明記した場合、その範囲には２つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。

　以上、本開示を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本開示を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本開示を限定する目的で提供したのではない。従って、本開示の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。

（実施例１：Ｔａｒｇｅｔ－Ｇによる変異の導入）
１－１．　Ｔａｒｇｅｔ－Ｇ発現ユニットの構築
単子葉植物における恒常発現型プロモーターとして、トウモロコシのユビキチン遺伝子プロモーター（配列番号１）を用いた。プロモーター下流には、改変型Ｃａｓ９遺伝子とＤＮＡウラシルグリコシラーゼ遺伝子を融合した人工遺伝子を連結した。主要な構成要素を以下に記す。Streptococcus　pyogenesに由来したＣａｓ９をヌクレアーゼ完全失活型（
ｄＣａｓ９）（配列番号２）に改変し、両端に核移行シグナル（ATG GCT CCT AAG AAG AAG CGG AAG GTT GGT ATT CACGGG GTG CCT GCG GCT;配列番号３（MAPKKKRKVGIHGVPAAをコ
ードする）、CCCAAG AAG AAG AGG AAG GTG;配列番号４（PKKKRVをコードする））を付加
した。また、改変型Ｃａｓ９遺伝子としては、ヌクレアーゼ部分失活型（ｎＣａｓ９）（配列番号５）も構築し、Ｃ末端側に核移行シグナル（配列番号４）を付与した。さらに、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９のＣ末端側にはリンカー配列を介して酵母のミトコンドリアに由来した改変型ＵＮＧ１遺伝子が１コピーあるいは２コピー連結されている。ＵＮＧ１においては、野生型遺伝子からミトコンドリア移行シグナルをコードする領域（塩基番号１～６０）を除外し、Ｎ２２２Ｄ変異（塩基番号６６４のａがｇに置換されたもの（ａ６６４ｇ）およびＲ３０８Ｃ変異（塩基番号９２２～９２４のａｇａがｔｇｔに置換されたもの（ａｇａ９２２ｔｇｔ））を導入した改変型を用いた（配列番号６）。上記構成要素を組み合わせ、４種類のＴａｒｇｅｔ－Ｇユニットを構築した。各ユニットの具体的な構造は、ｄＣａｓ９に１コピーのＵＮＧ１を連結した「ｄ１」（配列番号７）、ｄＣａｓ９に２コピーのＵＮＧ１を連結した「ｄ２」（配列番号８）、ｎＣａｓ９に１コピーのＵＮＧ１を連結した「ｎ１」（配列番号９）、ｎＣａｓ９に２コピーのＵＮＧ１を連結した「ｎ２」（配列番号１０）とした。

１－２．ガイドＲＮＡ発現ユニットの構築
　単子葉植物においてガイドＲＮＡを発現させるためのプロモーターは、イネのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存型Ｕ６プロモーター（以下ＯｓＵ６）（配列番号１１）を用いた。本実験では、イネゲノム中の６箇所の標的配列を改変することとし、各標的に対応するガイドＲＮＡを設計した。その配列を以下に示す。
1. ALS A96：CATGGACGCGCCGCCCGGGT（配列番号１２）
2. OsFTIP1eQ590：CAGCTGTGGAAACCACCAAT（配列番号１３）
3. DL-3：GACCTTGCACTGACTGCAGG（配列番号１４）
4. OsClpP5：GCCATGGCCGCGGCTCGTGG（配列番号１５）
5. EGFP Mut1：GAGCTGGACGGCGACGTAAA（配列番号１６）
6. EGFP Mut2：CATGTGATCGCGCTTCTCGT（配列番号１７）
7. mGFP switch：TCTAGAGGATCCGGCCCAGT（配列番号１８）
8. ALSP171-R173：CAGGTCCCCCGCCGCATGAT（配列番号１９）

　本実験では、複数のガイドＲＮＡを組み合わせた４種類のユニットを使用した。一つ目のユニットは、上記ガイドＲＮＡ１～４を組み合わせた「ｘ４」（配列番号２０）、二つ目は１～６を組み合わせた「ｘ６」（配列番号２１）、三つ目は１～４と７を組み合わせた「ｘ５」（配列番号２２）、四つ目は上記ガイドＲＮＡ１と８を組み合わせた「ｘ２」とした（配列番号２３）。

１－３．恒常発現型Ｔａｒｇｅｔ－Ｇベクターの構築
　Ｔａｒｇｅｔ－Ｇシステムを植物細胞へ導入するため、上記のトウモロコシのユビキチン遺伝子プロモーターと組み合わせたＴａｒｇｅｔ－Ｇ発現ユニット、およびｇＲＮＡ発現ユニットを一般的なＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ法用バイナリーベクター（ｐＶＳ１系）に組み込んだ。また、Ｔａｒｇｅｔ－Ｇシステムがゲノムに組み込まれた植物細胞を選抜するためのポジティブマーカーとしては、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーターに連結したｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｈｐｔ）発現ユニット（配列番号２４）を用いた。本実験では、変異型Ｃａｓ９の種類とＵＮＧ１のコピー数により、下記４種類の恒常発現型Ｔａｒｇｅｔ－Ｇベクターを構築した（図１）。
・ｐＯＳＧｄ１１（ｄＣａｓ９に１コピーのＵＮＧ１を連結）
・ｐＯＳＧｄ２１（ｄＣａｓ９に２コピーのＵＮＧ１を連結）
・ｐＯＳＧｎ１１（ｎＣａｓ９に１コピーのＵＮＧ１を連結）
・ｐＯＳＧｎ２１（ｎＣａｓ９に２コピーのＵＮＧ１を連結）

　ｐＯＳＧｄ１１、ｐＯＳＧｄ２１にはイネゲノム上の４遺伝子を標的とするｇＲＮＡ発現ユニット（配列番号２０）を組み込み、「ｐＯＳＧｄ１１ｘ４」「ｐＯＳＧｄ２１ｘ４」を作製した。また、ｐＯＳＧｎ２１にイネＡＬＳ遺伝子領域内の２ヶ所を標的とするｇＲＮＡ発現ユニット「ｘ２」（配列番号２３）を組み込み「ｐＯＳＧｎ２１ｘ２」を作製した。

１－４．ヒートショック誘導型Ｔａｒｇｅｔ－Ｇベクターの構築
　ヒートショック誘導型Ｔａｒｇｅｔ－Ｇシステムを構築するため、恒常発現型Ｔａｒｇｅｔ－Ｇベクター「ｐＯＳＧｄ１１」および「ｐＯＳＧｄ２１」のトウモロコシのユビキチン遺伝子プロモーターをイネヒートショックタンパク質１７．９Ｃ　遺伝子プロモーター（配列番号２５）に置き換えて「ｐＯＳＧｄ１３」と「ｐＯＳＧｄ２３」を構築した。その後、イネゲノム上の４遺伝子を標的とするｇＲＮＡ発現ユニット（配列番号２０）を組み込み、「ｐＯＳＧｄ１３ｘ４」「ｐＯＳＧｄ２３ｘ４」を作製した。さらに、「ｐＯＳＧｄ１３」および「ｐＯＳＧｄ２３」の植物細胞選抜用ポジティブマーカーをイネアクチン遺伝子プロモーターに連結したｎｅｏｍｙｃｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＩＩ　（ｎｐｔＩＩ）発現ユニット（配列番号２６）に置換し、「ｐＯＳＧｄ１３－ｎｐｔＩＩ」「ｐＯＳＧｄ２３－ｎｐｔＩＩ」を構築した。これらにイネゲノム上の６箇所を標的とするガイドＲＮＡ発現ユニット（配列番号２１）を組み込み、「ｐＯＳＧｄ１３－ｎｐｔＩＩｘ６」「ｐＯＳＧｄ２３－ｎｐｔＩＩｘ６」とした。

１－５．ＰＥＧ－Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ解析用Ｔａｒｇｅｔ－Ｇベクターの構築
　Ｔａｒｇｅｔ－Ｇベクターの構成要素の違いが塩基編集効率に及ぼす影響を評価するため、ＰＥＧ－Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ法用のベクターを構築した。トウモロコシのユビキチン遺伝子プロモーター（配列番号１）に４種類のＴａｒｇｅｔ－Ｇユニット「ｄ１１」（配列番号７）、「ｄ２１」（配列番号８）、「ｎ１１」（配列番号９）、「ｎ２１」（配列番号１０）を連結し、クローニングベクターｐＤＯＮＲ／Ｚｅｏ　（＃１２５３５０３５，　ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に組み込んだ。これらにガイドＲＮＡ発現ユニット「ｘ５」（配列番号２２）を組み込み、以下の４種類のベクターを構築した。
・ｐＯＳＧｄ１１ｘ５－Ｚｅｏ
・ｐＯＳＧｄ２１ｘ５－Ｚｅｏ
・ｐＯＳＧｎ１１ｘ５－Ｚｅｏ
・ｐＯＳＧｎ２１ｘ５－Ｚｅｏ

１－７．　Ｔａｒｇｅｔ－Ｇの活性評価用レポーターシステムの構築
　Ｔａｒｇｅｔ－Ｇによる標的ＤＮＡ配列の編集効率を目視で検出するため、２種類のＧＦＰレポーターシステムを構築した。１種類目は、ＧＦＰシグナルの消失をもって標的配列における経時的な変異の蓄積状況を可視化するもので、カリフラワーモザイクウイルスｐ３５Ｓプロモーターに連結したＥｎｈａｎｃｅｄ　Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　（ＥＧＦＰ）発現ユニット（配列番号２７）を利用した。このＥＧＦＰ発現ユニットは、イネアクチン遺伝子プロモーターに連結したｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ
　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｈｐｔ）発現ユニット（配列番号２８）とともに植物形質転換用バイナリーベクター（ｐＶＳ１）に組み込んだ。このプラスミドの名称は「ｐＲＩＴ４－ＥＧＦＰ」とした。２種類目は、ＧＦＰシグナルの出現頻度をもってＴａｒｇｅｔ－Ｇによる標的ＤＮＡ配列の編集効率を可視化するものである。開始コドンを削り、ガイドＲＮＡ「ｍＧＦＰ　ｓｗｉｔｃｈ（配列番号１８）」が結合するＤＮＡ配列を連結したmutated　Green　Fluorescent　Protein（ｍＧＦＰ）（配列番号２９）を構築し、カリフラワーモザイクウイルスｐ３５Ｓプロモーターの下流に連結した。これをイネアクチン遺伝子プロモーターに連結したｎｅｏｍｙｃｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＩＩ（ｎｐｔＩＩ）発現ユニット（配列番号２６）とともに植物形質転換用バイナリーベクター（ｐＶＳ１）に組み込んだ。このプラスミドの名称は「ｐＲＩＴ３－ｍＧＦＰ」とした。

２．　Ｔａｒｇｅｔ－Ｇおよび評価用ベクターのアグロバクテリウム菌への導入
　上記のとおり作製したバイナリーベクター「ｐＯＳＧｄ１１ｘ４」「ｐＯＳＧｄ２１ｘ４」「ｐＯＳＧｎ２１ｘ２」「ｐＯＳＧｄ１３ｘ４」「ｐＯＳＧｄ２３ｘ４」「ｐＯＳＧｄ１３－ｎｐｔＩＩｘ６」「ｐＯＳＧｄ２３－ｎｐｔＩＩｘ６」「ｐＲＩＴ４－ＥＧＦＰ」「ｐＲＩＴ３－ｍＧＦＰ」は、エレクトロポレーション（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社ＭｉｃｒｏＰｕｌｓｅｒエレクトロポレーションシステム）によりアグロバクテリウム菌(Agrobacterium　tumefaciens　EHA101株)へ導入した。

　まず、以下の手順にてアグロバクテリウム菌のコンピテントセル作製を行った。アグロバクテリウム菌株をＬＢ寒天培地（Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ　１０ｇ／Ｌ，　Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　５ｇ／Ｌ，　ＮａＣｌ　１０ｇ／Ｌ，　Ｂａｃｔｏ　Ａｇａｒ
　１５ｇ（１．５％））に塗布し、２８℃・暗所で２日間培養した。得られたシングルコロニーを２ｘＹＴ液体培地（Ｂａｃｔｏ　Ｔｒｙｐｔｏｎｅ　１６ｇ／Ｌ，　Ｙｅａｓｔ
　Ｅｘｔｒａｃｔ　１０ｇ／Ｌ，　ＮａＣｌ　５ｇ／Ｌ）　５ｍＬに植菌後、２８℃・暗所で１２時間振とう培養し、懸濁液２００μＬを２００ｍＬの２ｘＹＴ液体培地に加え２８℃・暗所で振とう培養し、ＯＤ６００＝０．２～０．４に増殖させた。次いで菌体を遠心して（３０００ｒｐｍ、４℃・１０分間）集菌し、２０ｍＬの１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ８．０）に懸濁、遠心を２～３回繰り返した。遠心により回収した菌体を滅菌１０％グリセロール水溶液２ｍＬに懸濁し、コンピテントセルとした。

　次に、以下に記す手順にて各ベクターをアグロバクテリウムへ導入した。各ベクターを１μｇ／μＬ濃度で滅菌水に溶解し、上記のアグロバクテリウム菌懸濁液５０μＬに混合し、マイクロパルサーキュベット（０．１ｃｍギャップ，ＢｉｏＲａｄ社）に移し、エレクトロポレーション（２．２ｋＶ，　５．８ｍｓ）を行った。次いで、この液に８００μＬの２ｘＹＴ液体培地を加えて２８℃・暗所で２時間振とう培養し、１００ｍｇ／Ｌ　スペクチノマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布し２８℃・暗所で３６～４８時間培養した。得られた菌コロニーを１００ｍｇ／Ｌ　スペクチノマイシンを含む２ｘＹＴ液体培地５ｍＬで増殖させグリセロール（最終濃度３５％）ストックとして微小遠沈管に分注し、－８０℃で保存した。

３．　イネ培養細胞へのＴａｒｇｅｔ－ＡＩＤ評価用ベクターの導入
　イネの形質転換は、基本的にＴｅｒａｄａ　ｅｔ　ａｌ（２００２，　ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｂｔ７３７）の手法に従って行った。詳細を以下に記す。

３－１．　形質転換用のイネカルスの準備
イネ　（Ｏｒｙｚａ　ｓａｔｉｖａ．Ｌ　Ｊａｐｏｎｉｃａ品種；日本晴）の種子約１００粒の籾を取り除き、７０％エタノール中にて１分間振とうした後、２．５％次亜塩素酸ナトリウム水溶液に２０～３０分間浸漬して滅菌した。その後、滅菌水ですすぎ２Ｎ６培地（Ｎ６培地用混合塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）　４．０ｇ／Ｌ，　Ｃａｓａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　３００ｍｇ／Ｌ，　Ｍｙｏ－ｉｎｏｃｉｔｏｌ　１００ｍｇ／Ｌ，　Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ　ａｃｉｄ　０．５ｍｇ／Ｌ，　Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ　ＨＣｌ　０．５ｍｇ／Ｌ，　Ｔｈｉａｍｉｎｅ　ＨＣｌ　０．５ｍｇ／Ｌ，　Ｌ－Ｐｒｏｌｉｎｅ　２８７８ｍｇ／Ｌ，　Ｓｕｃｒｏｓｅ３０．０ｇ／Ｌ，　２，４－Ｄ（２，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｐｈｅｎｏｘｙａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ）　２ｍｇ／Ｌ，　Ｇｅｌｒｉｔｅ　４．０ｇ／Ｌ，　ｐＨ５．８）の上に置床し、暗所・３１．５℃にて３週間培養し、胚盤細胞由来の脱分化細胞塊（カルス）を誘導した。その後、細胞分裂活性の高いカルスを選抜して形質転換に用いた。

３－２．　形質転換用のアグロバクテリウム菌の準備
　各バイナリーベクターを導入した各アグロバクテリウム菌液を氷上で溶解し、うち３００μＬを１００ｍｇ／Ｌ　スペクチノマイシンを加えたＡＢ培地　（ＮＨ_４Ｃｌ　１ｇ／Ｌ，　ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２０．３ｇ／Ｌ，　ＫＣｌ　０．１５ｇ／Ｌ，　ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ　０．０１２ｇ／Ｌ，　ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ　０．００２５ｇ／Ｌ，　Ｋ_２ＨＰＯ_４　３ｇ／Ｌ，　ＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏ　１．１５ｇ／Ｌ，　Ｓｕｃｒｏｓｅ５．５ｇ／Ｌ，　Ａｇａｒｏｓｅ　６．０ｇ／Ｌ，　ｐＨ７．２）に塗布し、２８℃・暗所で３日間培養した。その後、増殖したアグロバクテリウム菌を４０ｍｇ／ＬのＡｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ（３’，５’－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－４’－ｈｙｄｒｏｘｙ－ａｃｅｔｏｐｈｅｎｏｎｅ）を加えたＡＡＩ液体培地　（ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ　５ｇ／Ｌ，　ＣａＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ　１．５ｇ／Ｌ，　ＮａＨ_２ＰＯ_４・Ｈ_２Ｏ　１．５ｇ／Ｌ，　ＫＣｌ　２９．５ｇ／Ｌ，　ＭｎＳＯ_４・４Ｈ_２Ｏ　１０ｇ／Ｌ，　ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ　２ｇ／Ｌ，　Ｈ_３ＢＯ_３　３ｇ／Ｌ，　ＫＩ　０．７５ｇ／Ｌ，　Ｎａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ　０．２５ｇ／Ｌ，　ＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ　２５ｍｇ／Ｌ，　ＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ　２５ｍｇ／Ｌ，　ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ　１３．９ｇ／Ｌ，　Ｎａ_２　ＥＤＴＡ　１８．７ｇ／Ｌ，　Ｍｙｏ－ｉｎｏｃｉｔｏｌ　１００ｍｇ／Ｌ，　Ｔｈｉａｍｉｎｅ　ＨＣｌ　０．０１ｇ／Ｌ，　Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ　ａｃｉｄ　１ｍｇ／Ｌ，　Ｐｙｒｉｄｏｘｉｎｅ　ＨＣｌ　１ｍｇ／Ｌ）に懸濁して２５℃で２時間振とう培養した。この懸濁液を４０ｍｇ／ＬのＡｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅを含むＡＡＩ液体培地で希釈しＯＤ６００＝０．００８とした懸濁液１２０ｍｌを調整した。

３－３．　イネカルスへのＴａｒｇｅｔ－Ｇベクター導入（アグロバクテリウム菌接種、共存培養、除菌、イネ組み換え体カルス選抜）
　３－１で得たイネカルス約１５ｇを滅菌したガラスビーカーに集め、各ベクターを導入したアグロバクテリウム菌懸濁液（先述）を加え、３～５分間振とうしながら接種を行った。その後、懸濁液をステンレスメッシュ（目地開き１．５ｍｍ）で濾過し、余分なアグロバクテリウム菌を除去した。次いで、２Ｎ６共存培地（上記２Ｎ６培地にＡｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ　４０ｍｇ／Ｌを添加，　ｐＨ５．２）の上に滅菌濾紙を敷き、その上にカルスをピンセットで等間隔に並べ、２５℃暗所で３日間共存培養した。その後、共存培養後のカルスからアグロバクテリウム菌を除菌するため、カルスを５００ｍｌのビーカーに集めて、除菌液１（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ　２００ｍｇ／Ｌ，　Ｔｗｅｅｎ２０　２０μｌ／Ｌを含む滅菌水）　３００ｍｌを用いて攪拌しながら３０分間洗浄した。その後、カルスをステンレスメッシュに集め、ペーパータオルでカルス周辺の水分を取り除いた後、除菌液２（Ｖａｎｃｏｍｙｃｉｎ　２００ｍｇ／Ｌを含む滅菌水）３００ｍｌを用いて同様の除菌操作を４回繰り返した。次いで除菌後のカルスを２Ｎ６ＮＵ培地（２Ｎ６培地にＶａｎｃｏｍｙｃｉｎ　１００ｍｇ／Ｌ，　Ｍｅｒｏｐｅｎｅｍ　２５ｍｇ／Ｌを添加，　ｐＨ５．８）で５日間養生培養した。その後、選抜培地　２Ｎ６ＳＥ　Ｈ４０（２Ｎ６ＮＵ培地にＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　４０ｍｇ／Ｌを添加）、または２Ｎ６ＳＥ　Ｐａ５０（２Ｎ６ＮＵ培地に　Ｐａｒｏｍｏｍｙｃｉｎ　５０ｍｇ／Ｌを添加）の上に等間隔に並べ、３１．５℃の暗所で約４～６週間培養した。

３－４．　変異導入の確認
　自動核酸抽出装置（クラボウ株式会社ＰＸ－８０）を用いてＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性カルスからゲノムＤＮＡを抽出した。各カルスの標的遺伝子領域をＰＣＲ法により増幅した後ダイレクトシークエンス解析を行い、Ｔａｒｇｅｔ－Ｇによる変異の導入を確認した。さらに一部のカルスから得られたＰＣＲ産物についてはクローニングシークエンス解析を実施し、変異の導入状況を詳細に確認した。

３－５．　イネ培養細胞を用いた一過的発現解析
　液体培地で振とう培養したイネ培養細胞から液体培地を取り除き、酵素溶液（Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ　１．６ｇ，　Ｍａｃｅｒｏｚｙｍｅ　０．４ｇ，　Ｓｕｃｒｏｓｅ　６．８６ｇ，　ＣａＣｌ_２　２Ｈ_２Ｏ　５８．８ｍｇ／Ｌ，　ＭＥＳ　４０ｍｇ，　ＢＳＡ　４０ｍｇ，　滅菌水で４０ｍｌまでメスアップ）を加えて３０℃で６時間程度処理する。その後洗浄バッファー（ＫＣｌ　３７３ｍｇ，　ＮａＣｌ　９ｇ，　ＣａＣｌ_２　２Ｈ_２Ｏ
　１８．４ｍｇ，　ＭＥＳ　４２７ｍｇ，　滅菌水で４０ｍｌまでメスアップ）を加え、遠心分離によりプロトプラストを分離し、ピペットで吸い出し新しい容器に移す。その後洗浄バッファーに懸濁して遠心、上清を捨てる工程を繰り返して洗浄する。微小遠沈管内で導入するプラスミドＤＮＡとプロトプラストを混合した後、ＰＥＧ溶液（ＰＥＧ４０００　２ｇ，　０．８Ｍ　Ｍａｎｎｉｔｏｌ　１．２５ｍｌ，　１Ｍ　ＣａＣｌ_２　０．５ｍｌ，　滅菌水で５ｍｌまでメスアップ）を加える。その後３０℃で２４～７２時間インキュベートしたプロトプラストをプレパラートにし、蛍光顕微鏡を用いて解析した。

（実施例２：ｎＣａｓ９を用いたＴａｒｇｅｔ－Ｇシステムによる標的変異導入）
　ｎＣａｓ９を用いたＴａｒｇｅｔ－Ｇシステムによる単子葉植物の標的遺伝子改変を評価するため、イネカルスへアグロバクテリウム法により「ｐＯＳＧｎ２１ｘ２」を導入した。その結果、Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性を示したカルスは３２３系統のうち３系統にとどまり、形質転換効率は１．２８％であった。それらのカルスからゲノムＤＮＡを抽出し、標的領域（ＡＬＳ遺伝子中の２箇所）における変異の導入状況を確認した結果、塩基置換変異よりも大規模な欠失の発生頻度が高かった（図２）。その理由として、Ｔａｒｇｅｔ－ＧシステムにｎＣａｓ９を用いた場合、ＵＮＧにより誘導される脱塩基箇所の修復過程とｎＣａｓ９によるＤＮＡ一重鎖切断が同時に進行する状況になり、高頻度でＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）が生じたと推測した。

（実施例３：ｄＣａｓ９を用いたＴａｒｇｅｔ－Ｇシステムによる標的変異導入）
　上記の問題を解決するため、ｄＣａｓ９を用いたＴａｒｇｅｔ－Ｇシステムによる標的遺伝子改変を試みた。「ｐＯＳＧｄ１１ｘ４」「ｐＯＳＧｄ２１ｘ４」をイネカルスへ同時形質転換した結果、１３６４系統のカルスのうち５４系統がＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性を示し、形質転換効率は３．９６％であった。ダイレクトシークエンス解析の結果、複数のＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎ耐性カルス系統において４つの標的遺伝子（ＡＬＳ，　ＯｓＦＴＩＰ１ｅ，　ＤＬ，　ＯｓＣｌｐＰ５）への変異導入が確認された（図３～６）。また、１つのカルス内で複数の標的遺伝子が改変されており、Ｔａｒｇｅｔ－Ｇによる多点同時編集も実証された。続いて、一部カルス系統についてクローニングシークエンス解析を行った結果、標的配列を中心にややランダムに点変異や欠失・挿入変異が生じていた（図７～１０）。本技術の基本特許（ＷＯ２０１６０７２３９９）にて出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を用いて示された通り、主な変異はＣないしＧからの点変異であった。これにより、本発明のゲノム編集技術が、植物ゲノム中の標的ヌクレオチド配列及びその周辺にランダムに変異を導入し、局所的進化を促す用途に適していることが示唆された。

（実施例４：Ｔ０植物体の再分化と変異の伝達（カルスからＴ０植物））
　標的遺伝子への変異導入が確認された複数系統のカルスからＴ０植物体を再分化し、変異の伝達状況を調査した。ダイレクトシークエンス解析の結果、カルスで確認された変異がＴ０植物に伝達することを確認した（図１１～１３）。また、同一のカルスに由来したＴ０植物体は同一の変異を共有する一方、各植物体に固有の変異も確認された（図１２，１３）。さらにＢｉａｌｌｅｌｉｃ変異の導入も確認された（図１１）。

（実施例５：導入された変異のＴ１世代への遺伝と分離、さらなる変異の拡充）
　Ｔ０植物体の自殖により得られたＴ１世代の植物体を展開した結果、一部にアルビノの表現型を示す植物体が分離した（図１４）。これらのゲノム配列を解析した結果、ＯｓＣｌｐＰ５における変異が確認された。また同様に、「しだれ葉」の表現型を示す植物体も分離し、これらではＤＬ遺伝子おける変異が確認された。また、同一のＴ０植物体に由来したＴ１植物についてＰＣＲ解析を行い、Ｔａｒｇｅｔ－Ｇ発現ユニットを保持する植物体と持たない植物体に分類した。それらの植物体における４つの標的遺伝子（ＡＬＳ，　ＯｓＦＴＩＰ１ｅ，　ＤＬ，　ＯｓＣｌｐＰ５）の配列を確認した結果、ベクターを保持する植物体ではより多様な変異が生じていた。これにより、Ｔａｒｇｅｔ－Ｇが時間の経過とともにゲノム上の標的領域に変異を蓄積することが確認された。

（実施例６：Ｔａｒｇｅｔ－Ｇシステムの最適構成の検討）
　実施例２において、恒常発現型Ｔａｒｇｅｔ－Ｇをイネカルスに導入した場合の形質転換効率が３．９６％と低い値を示したことから、致死性が低く編集効率が高いＴａｒｇｅｔ－Ｇシステムの構成を検討した。まず標的領域における塩基置換を検出するレポーター系「ｐＲＩＴ３－ｍＧＦＰ」を導入したイネカルスを作成して液体培養細胞化し、次にＰＥＧ－Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎにより４種類のベクター「ｐＯＳＧｄ１１ｘ５－Ｚｅｏ」「ｐＯＳＧｄ２１ｘ５－Ｚｅｏ」「ｐＯＳＧｎ１１ｘ５－Ｚｅｏ」「ｐＯＳＧｎ２１ｘ５－Ｚｅｏ」を導入した。２４～７２時間後のプロトプラストを蛍光顕微鏡で観察した結果、ＧＦＰシグナルが確認されたのは「ｐＯＳＧｄ１１ｘ５－Ｚｅｏ」のみであり、標的領域におけるＤＳＢを低減しつつ塩基置換を導入するにはｄＣａｓ９にＵＮＧを１コピー連結したユニットが適することが示唆された。続いて、各ベクターを導入したプラスミドからゲノムＤＮＡを抽出し、ディープシークエンス解析により５つの標的領域（ＡＬＳ，
　ＯｓＦＴＩＰ１ｅ，　ＤＬ，　ＯｓＣｌｐＰ５，　ｍＧＦＰ）における変異導入状況を解析した。その結果、ｎＣａｓ９を用いた場合、Ｔａｒｇｅｔ－Ｇシステムでは標的領域に高い頻度で欠失・挿入が確認され、ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）の発生が示唆された。ｄＣａｓ９を用いた場合では、欠失・挿入の頻度が抑えられた一方、様々な塩基置換変異が確認された。また、ＵＮＧが２コピーの場合に比べて１コピーの場合の方が欠失・挿入の頻度が明確に低下していた。以上より、Ｔａｒｇｅｔ－Ｇシステムの最適な構成はｄＣａｓ９にＵＮＧを１コピー連結したものである、と判断した。

（実施例７：誘導型Ｔａｒｇｅｔ－Ｇシステムの評価）
　Ｔａｒｇｅｔ－Ｇによる致死性を回避するため、ヒートショック誘導型Ｔａｒｇｅｔ－Ｇシステムを構築し、その制御性と標的配列編集効率を評価した。まず、イネカルスにレポーター系である「ｐＲＩＴ４－ＥＧＦＰ」をアグロバクテリウム法により導入し、編集効率評価用のイネカルスを作成した。次に、恒常的にＥＧＦＰを発現するカルスに「ｐＯＳＧｄ１３－ｎｐｔＩＩｘ６」または「ｐＯＳＧｄ２３－ｎｐｔＩＩｘ６」を導入し、ＨｙｇｒｏｍｙｃｉｎとＰａｒｏｍｏｍｙｃｉｎに耐性を持つ二重形質転換カルスを得た。各カルスはそれぞれ隔離し、独立系統化して増殖した後、５等分した。その後５日間ごとにヒートショック処理（４２℃，９０分間）を行い、処理回数による変異の蓄積状況を調査した。１～４回のヒートショック処理を行った後、３週間養生培養し、各カルスからゲノムＤＮＡを抽出してディープシークエンス解析を行った。６つの標的領域（ＡＬＳ，　ＯｓＦＴＩＰ１ｅ，　ＤＬ，　ＯｓＣｌｐＰ５，　ＥＧＦＰ－１，　ＥＧＦＰ－２）における変異を解析した結果、通常の培養温度（３１．５℃）ではＴａｒｇｅｔ－Ｇの活性が抑えられた一方、ヒートショック処理の回数に伴い各標的領域における変異の蓄積量が増加することを確認できた。

（実施例８：誘導型Ｔａｒｇｅｔ－Ｇシステムによる標的変異導入）
　実施例７での成果を元に、誘導型Ｔａｒｇｅｔ－Ｇシステムを用いてイネの標的遺伝子植物体を作成した。アグロバクテリウム法によりイネカルスに「ｐＯＳＧｄ１３ｘ４」あるいは「ｐＯＳＧｄ２３ｘ４」導入した結果、恒常発現型Ｔａｒｇｅｔ－Ｇを導入した場合に比べて形質転換効率に改善が認められ、さらに各形質転換カルスの褐変壊死も回避できた。これにより、誘導型プロモーター用いることでＴａｒｇｅｔ－Ｇの致死性を低減できることが示唆された。次に、得られた各形質転換カルス系統に５日ごとのヒートショック処理（４２℃，９０分間）を計４回繰り返し、２週間養生培養した後、Ｔ０植物体を再分化した。各Ｔ０植物体からゲノムＤＮＡを抽出し、ディープシークエンス解析により４つの標的領域（ＡＬＳ，　ＯｓＦＴＩＰ１ｅ，　ＤＬ，　ＯｓＣｌｐＰ５）における変異導入状況を解析した結果、変異の蓄積が確認できた。さらに、恒常発現型よりも多彩な変異が確認できた。その理由として、生存細胞数が増えた結果、それらのゲノムにおける変異も検出できるようになったためと推定する。また、種子稔性の改善が認められ、これはＤＬ遺伝子の過剰なＫＯ変異が回避できたため、と推測する。

　（注記）
　以上のように、本開示の好ましい実施形態を用いて本開示を例示してきたが、本開示は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願及び他の文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。

　本開示の方法によって、動物、植物、微生物などあらゆる生物において遺伝子機能の人工的な操作が可能になるため、医療応用や農作物の開発、産業微生物の改変など幅広い応用が期待できる。

配列番号１：トウモロコシのユビキチン遺伝子プロモーター
配列番号２：ヌクレアーゼ完全失活型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）遺伝子
配列番号３：ｄＣａｓ９　Ｎ末端側核移行シグナル
配列番号４：ｄＣａｓ９　Ｃ末端側核移行シグナル
配列番号５：ヌクレアーゼ部分失活型Ｃａｓ９（ｎＣａｓ９）遺伝子
配列番号６：改変型ＵＮＧ１遺伝子
配列番号７：ｄＣａｓ９－ＵＮＧ１発現ユニット（ｄ１）
配列番号８：ｄＣａｓ９－ＵＮＧ１発現ユニット（ｄ２）
配列番号９：ｎＣａｓ９－ＵＮＧ１発現ユニット（ｎ１）
配列番号１０：ｎＣａｓ９－ＵＮＧ１発現ユニット（ｎ２）
配列番号１１：イネのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ依存型Ｕ６プロモーター
配列番号１２：ガイドＲＮＡ：ＡＬＳ　Ａ９６
配列番号１３：ガイドＲＮＡ：ＯｓＦＴＩＰ１ｅ　Ｑ５９０
配列番号１４：ガイドＲＮＡ：ＤＬ－３
配列番号１５：ガイドＲＮＡ：ＯｓＣｌｐＰ５
配列番号１６：ガイドＲＮＡ：ＥＧＦＰ　Ｍｕｔ１
配列番号１７：ガイドＲＮＡ：ＥＧＦＰ　Ｍｕｔ２
配列番号１８：ガイドＲＮＡ：ｍＧＦＰ　ｓｗｉｔｃｈ
配列番号１９：ガイドＲＮＡ：ＡＬＳ　Ｐ１７１－Ｒ１７３
配列番号２０：ガイドＲＮＡユニットｘ４
配列番号２１：ガイドＲＮＡユニットｘ６
配列番号２２：ガイドＲＮＡユニットｘ５
配列番号２３：ガイドＲＮＡユニットｘ２
配列番号２４：ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｈｐｔ）発現ユニット
配列番号２５：イネヒートショックタンパク質１７．９Ｃ遺伝子プロモーター
配列番号２６：ｎｅｏｍｙｃｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅＩＩ（ｎｐｔＩＩ）発現ユニット
配列番号２７：Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＥＧＦＰ）発現ユニット
配列番号２８：ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ　ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ（ｈｐｔ）発現ユニット
配列番号２９：ｍｕｔａｔｅｄ　Ｇｒｅｅｎ　Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｍＧＦＰ）遺伝子

Claims

　二本鎖ＤＮＡの標的化した部位が改変された植物細胞を生産するための方法であって、（ｉ）目的の二本鎖ＤＮＡを含む植物細胞を提供する工程と、
（ｉｉ）該二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体を提供する工程と、
（ｉｉｉ）該複合体を、該植物細胞がトランスフェクトされる条件に配置する工程と、
（ｉｖ）該トランスフェクトされた植物細胞を、該標的化された部位において該二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の改変を誘導する条件に配置する工程と、
（ｖ）該複合体が導入された細胞および／または該改変が導入された細胞を選択する工程と
　を含む、方法。
　前記核酸配列認識モジュールが、Ｃａｓの少なくとも１つのＤＮＡ切断能が失活したＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、ジンクフィンガーモチーフ、ＴＡＬエフェクター、およびＰＰＲモチーフからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
　前記核酸配列認識モジュールが、Ｃａｓの少なくとも１つのＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである、請求項１または２に記載の方法。
　前記核酸配列認識モジュールが、Ｃａｓの両方のＤＮＡ切断能を持たないＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムである、請求項１または２に記載の方法。
　前記改変が、前記標的化した部位の１以上のヌクレオチドの置換、欠失、または前記標的化した部位への１以上のヌクレオチドの挿入を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
　前記改変が、前記標的化された部位のＰＡＭ配列側に優位に生じる、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
　前記ＤＮＡグリコシラーゼが、野生型に比べて二重鎖ＤＮＡへの反応性が減弱された変異体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
　前記ＤＮＡグリコシラーゼが、シトシン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＣＤＧ）活性またはチミン－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＴＤＧ）活性を有するものである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
　前記ＣＤＧ活性またはＴＤＧ活性を有するＤＮＡグリコシラーゼが、ウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）の変異体である、請求項８に記載の方法。
　前記ＤＮＡグリコシラーゼが、ＣＤＧ活性またはＴＤＧ活性を有する、酵母由来のウラシル－ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）の変異体である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
　前記植物細胞は、イネ、シロイヌナズナ、豆、トウモロコシ、綿、ベニバナ、ヒマワリ、タバコ、小麦、麦、麻、バラ、イチイ、バナナ、コーヒー、ゴマ、ソバ、またはレタス由来である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
　前記植物細胞は、イネまたはシロイヌナズナ由来である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
　前記トランスフェクトは、前記複合体の、分離された植物カルスへの送達を通して、またはフローラルディップ法によって行われる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
　前記送達は、アグロバクテリウム法によって行われる、請求項１３に記載の方法。
　さらに、前記細胞から植物体を作出する工程を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
　さらに、得られた前記細胞をクローン分離する工程を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
　請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法によって取得可能な形質転換された植物細胞。
　請求項１７に記載の植物細胞を含む、形質転換された植物。
　請求項１８に記載の植物から得られた種子。
　前記形質転換された形質が当代世代のみに発現される、請求項１８に記載の植物。
　前記形質転換された形質の発現が世代を超えて継承される、請求項１８に記載の植物。
　二本鎖ＤＮＡの標的化した部位が改変された細胞を生産するための方法であって、
（ｉ）目的の二本鎖ＤＮＡを含む細胞を提供する工程と、
（ｉｉ）該二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体を提供する工程と、
（ｉｉｉ）該複合体を、該細胞がトランスフェクトされる条件に配置する工程と、
（ｉｖ）該トランスフェクトされた細胞を、該標的化された部位において該二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の改変を誘導する条件に配置する工程と、
（ｖ）該複合体が導入された細胞および／または該改変が導入された細胞を選択する工程と
　を含み、該細胞における改変が少なくとも当代において維持される、方法。
　所望の特性を有する植物細胞を生産するための方法であって、
（ｉ）所望の特性に関連する二本鎖ＤＮＡを含む植物細胞を提供する工程と、
（ｉｉ）該二本鎖ＤＮＡ中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、二重鎖ＤＮＡへの反応性が十分に低いＤＮＡグリコシラーゼとが結合した複合体を提供する工程と、
（ｉｉｉ）該複合体を、該植物細胞がトランスフェクトされる条件に配置する工程と、
（ｉｖ）該トランスフェクトされた植物細胞を、該標的化された部位において該二本鎖ＤＮＡの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の改変を誘導する条件に配置する工程と、
（ｖ）該複合体が導入された細胞および／または該改変が導入された細胞を選択する工程と、
（ｖｉ）該導入された細胞から、所望の特性を有する細胞を選択する工程を含む、方法。