CN110004174B - 长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法 - Google Patents

长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法 Download PDF

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Abstract

长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法，涉及一种长白落叶松瞬时转化体系构建方法。是要解决现有的烟草、白桦、柽柳等树种的瞬时转化体系，无法实现长白落叶松的瞬时转化问题。方法：一、取针叶尚未完全打开的长白落叶松实生苗为瞬时转化材料；二、配置侵染液，并用侵染液重悬含目的基因的农杆菌，得到含农杆菌的侵染液；三、用甘露醇浸泡长白落叶松实生苗，立刻将长白落叶松实生苗置于含农杆菌的侵染液中，抽真空，转移至摇床中侵染；四、将长白落叶松实生苗清洗数次，然后栽于土中。本方法构建的瞬时转化体系转化GUS基因和长白落叶松基因，可获得根、茎、叶被染色和表达量升高、表达量下降的转化植株。本发明用于构建长白落叶松瞬时转化体系。

Description

长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法
技术领域
本发明涉及一种长白落叶松瞬时转化体系构建方法。
背景技术
落叶松(Larix olgensis)是北方地区的主要造林树种之一，长白落叶松是落叶松属中一个非常重要的速生及耐寒树种，具有生长快，生态效益、工艺价值高等特点，对于恶劣气候，病虫害也有很强的抵抗能力。由于长白落叶松生长周期长，采用常规育种技术进行新品种选育时间长、见效慢，同时还存在基因源缺乏和杂交不亲和等制约因素，而长白落叶松稳定遗传转化体系尚未构建成功，这将给长白落叶松基因功能等的研究带来极大的不便。植物的遗传转化技术是指运用分子生物学与基因工程学等技术，通过各种手段将从各种生物(包括动物、植物或微生物)中分离获得的基因片段，即外源基因插入到受体植物的基因组中，通过外源基因的复制、转录和翻译，使受体植物的生理生化性状发生定向改变。
目前，还没有长白落叶松瞬时转化体系被报道，利用已有的烟草、白桦、柽柳等树种的瞬时转化体系，无法实现长白落叶松的瞬时转化，因此需要构建长白落叶松的瞬时转化体系。
发明内容
本发明是要解决现有的烟草、白桦、柽柳等树种的瞬时转化体系，无法实现长白落叶松的瞬时转化问题，提供一种长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法。
本发明长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法，包括以下步骤：
一、取生长1～1.5个月，针叶尚未完全打开的长白落叶松实生苗为瞬时转化材料；
二、配置侵染液，并用侵染液重悬含目的基因的农杆菌，得到含农杆菌的侵染液；
三、用1mol/L甘露醇浸泡长白落叶松实生苗15～18min，然后立刻将长白落叶松实生苗置于含农杆菌的侵染液中，抽真空5～7min，抽完真空将长白落叶松实生苗转移至摇床中，25～27℃，100～120rpm侵染3～4h。
四、将侵染结束之后的长白落叶松实生苗清洗数次，然后栽于土中。
进一步的，步骤二所述含目的基因的农杆菌为转化有含目的基因表达载体的农杆菌，其中目的基因为待研究的长白落叶松。
进一步的，步骤二所述侵染液是由10mM CaCl2、10mM MgCl2、400mM甘露醇、100～150uM乙酰丁香酮、1.5mg/L KT、5mg/L 2,4-D、10mM MES、0.02％～0.03％(v/v)Tween，0.02％(w/v)DTT，4.43g/L 1/2MS和3％蔗糖组成。所述MES为2-(N-吗啡啉)乙磺酸。
进一步的，步骤二中含农杆菌的侵染液的OD600为0.6～0.8。
本发明的有益效果：
本发明构建并优化得到适用于长白落叶松的瞬时转化体系，利用本发明方法可解决长白落叶松基因功能初步分析，启动子活性研究等问题，为长白落叶松的基因工程育种和遗传改良工作奠定基础。本发明以长白落叶松实生幼苗为材料，构建并优化得到适用于长白落叶松的瞬时转化体系，利用此瞬时转化体系转化GUS基因和长白落叶松基因，可获得根、茎、叶被染色和表达量升高、表达量下降(相比于对照)的转化植株。长白落叶松是落叶松属中重要且优质的落叶松，研究其瞬时转化体系对落叶松其他种的遗传转化体系研究具有重要的参考价值，也对于落叶松的基因工程育种研究具有广泛的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中侵染后的长白落叶松实生苗GUS染色结果；
图2为实施例1中用烟草瞬时转化体系进行长白落叶松的瞬时转化后实生苗GUS染色结果；
图3为实施例1中用白桦瞬时转化体系进行长白落叶松的瞬时转化后实生苗GUS染色结果；
图4为实施例1中用柽柳瞬时转化体系进行长白落叶松的瞬时转化后实生苗GUS染色结果；
图5为目的基因Lomyb8瞬时转化长白落叶松后实时荧光定量PCR的数据分析结果；
图6为长白落叶松全株RNA电泳图；
图7为克隆LoMYB8全长基因序列的PCR扩增结果电泳图；
图8为抑制表达载体构建的检测结果。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法，包括以下步骤：
一、取生长1～1.5个月，针叶尚未完全打开的长白落叶松实生苗为瞬时转化材料；
二、配置侵染液，并用侵染液重悬含目的基因的农杆菌，得到含农杆菌的侵染液；
三、用1mol/L甘露醇浸泡长白落叶松实生苗15～18min，然后立刻将长白落叶松实生苗置于含农杆菌的侵染液中，抽真空5～7min，抽完真空将长白落叶松实生苗转移至摇床中，25～27℃，100～120rpm侵染3～4h。
四、将侵染结束之后的长白落叶松实生苗清洗数次，然后栽于土中。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二所述含目的基因的农杆菌为转化有含目的基因表达载体的农杆菌，其中目的基因为待研究的长白落叶松。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二所述侵染液是由10mM CaCl2、10mM MgCl2、400mM甘露醇、100～150uM乙酰丁香酮、1.5mg/L KT、5mg/L2,4-D、10mM MES、0.02％～0.03％(v/v)Tween，0.02％(w/v)DTT，4.43g/L1/2MS和3％蔗糖组成。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中含农杆菌的侵染液的OD600为0.6～0.8。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三中用1mol/L甘露醇浸泡长白落叶松实生苗16～17min。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中抽完真空将长白落叶松实生苗转移至摇床中，26℃，110rpm侵染3h。其它与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤四中长白落叶松实生苗清洗次数为3～5次。其它与具体实施方式一至五之一相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
本实施例长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法，包括以下步骤：本实施例具体是用来转化GUS基因。
一、取生长1个月，针叶尚未完全打开的长白落叶松实生苗为瞬时转化材料；
二、将转化GUS基因的GV3101农杆菌于LB固体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、50mg/L利福平)中，划线，28℃，培养箱中培养48h，挑取单克隆于5mL LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、50mg/L利福平)中，28℃，200rpm，培养24h，检测成功之后取500mL小摇菌液于250mL LB液体培养基中，培养14-16h至OD＝0.6～0.7，再于3000rpm，离心15分钟，得含GUS基因的农杆菌。
配置侵染液，并用侵染液重悬含GUS基因的农杆菌，得到含农杆菌的侵染液；含农杆菌的侵染液的OD600为0.6～0.8。
所述侵染液是由10mM CaCl2、10mM MgCl2、400mM甘露醇、150uM乙酰丁香酮、1.5mg/L KT、5mg/L 2,4-D、10mM MES、0.02％～0.03％(v/v)Tween，0.02％(w/v)DTT，4.43g/L 1/2MS和3％蔗糖组成；
三、用1mol/L甘露醇浸泡长白落叶松实生苗15min，然后立刻将长白落叶松实生苗置于含农杆菌的侵染液中，抽真空5min，抽完真空将长白落叶松实生苗转移至摇床中，25℃，120rpm侵染3h。
四、将侵染结束之后的长白落叶松实生苗清洗5次，然后栽于土中，48h之后取样。
运用GUS染色和基因表达量测定的方法共同验证转化体系。
所述的GUS基因染色中所用的GUS染色液为常用的GUS染色液，基因表达量测定采用的是荧光定量PCR的方法，根据GUS染色面积和颜色深浅以及基因表达量差异优化长白落叶松瞬时转化体系。
本实施例的GUS染色结果可达到根、茎、叶都能着色，如图1所示，图1中对照CK为未经过遗传转化的长白落叶松幼苗。
为了证明本方法构建的长白落叶松瞬时转化实生苗体系有效性，同时以烟草、白桦、柽柳的瞬时转化体系进行长白落叶松的瞬时转化，作为对比实验，其中用烟草瞬时转化体系进行长白落叶松的瞬时转化结果如图2所示，用白桦瞬时转化体系进行长白落叶松的瞬时转化结果如图3所示，用柽柳瞬时转化体系进行长白落叶松的瞬时转化结果如图4所示，由GUS染色结果可知，使用烟草的瞬时转化体系，长白落叶松实生苗没有着色；使用白桦、柽柳的瞬时转化体系，仅在长白落叶松实生苗的茎部有微量的着色。说明现有的烟草、白桦、柽柳的瞬时转化体系均不适用于长白落叶松瞬时转化。而使用本实施例的方法GUS染色结果可达到根、茎、叶都能着色，而且着色较重。此结果进一步证明了本方法得到的长白落叶松实生苗瞬时转化体系的优越性。图2-图4中对照CK为未经过遗传转化的长白落叶松幼苗。
实施例2：
本实施例长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法，包括以下步骤：本实施例具体是用来转化长白落叶松Lomyb8基因。
一、构建长白落叶松Lomyb8基因的过表达载体以及抑制表达载体，并通过液氮冻融法转化GV3101农杆菌；取生长1个月，针叶尚未完全打开的长白落叶松实生苗为瞬时转化材料；
(1)长白落叶松RNA提取
取1.5μL长白落叶松全株RNA，用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。如图6所示，28S和18S条带清晰，5S条带最暗，A260/A280接近2.0～2.1，可用于后续试验。将长白落叶松RNA转化为cDNA。
(2)中间载体构建
以长白落叶松全株cDNA为模板，LoMYB8-F/R为上下游引物，克隆LoMYB8全长基因序列。PCR扩增结果如图7所示。将PCR产物进行胶回收，连接到pEASYTM-Blunt Zero载体中，转化大肠杆菌，选择PCR检测条带正确的阳性克隆送往测序公司进行测序。该测序结果经LALIGN比对，相似度高达99％，PCR产物大小为LoMYB8 1122bp，因此中间载体构建成功，将各载体命名为LoMYB8。长白落叶松Lomyb8基因的全长基因序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
引物LoMYB8-F：GCTCTAGAATGGCGATGAGCAATGGGAGATTATC
引物LoMYB8-R：CGGAATTCTCATTTGTTGAGATGCAGGGCGCCG
(3)过表达载体构建
用限制性内切酶将植物过表达载体ProkII和LoMYB8的目的片段进行双酶切，利用T4DNA连接酶进行连接并转化到大肠杆菌中，挑取单克隆菌落摇菌扩繁，送测序，测序比对成功，成功获得LoMYB8的过表达载体，将过表达载体命名为ProkII-LoMYB8。
(4)抑制表达载体构建
根据抑制表达载体pFGC5941和目的基因LoMYB8的融合特性，分别在LoMYB8-Anti和LoMYB8-Cis的5’、3’端引入核酸内切酶Xba I、BamH I和Nco I、Asc I的酶切位点，再进行载体与目的基因之间的连接，将重组载体转化进大肠杆菌中，检测和测序，检测结果如图8，由图可知，基因获得的对应条带测序后，测序结果均正确，因此成功获得LoMYB8的抑制表达载体，将抑制表达载体命名为pFGC5941-LoMYB8。
二、将转化Lomyb8基因过表达载体的农杆菌于LB固体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、50mg/L利福平)中，划线，28℃，培养箱中培养48h，挑取单克隆于5mL LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、50mg/L利福平)中，28℃，200rpm，培养24h，检测成功之后取500mL小摇菌液于250mL LB液体培养基中，培养14-16h至OD＝0.6～0.7，再于3000rpm，离心15分钟，得含过表达载体的农杆菌。
将转化Lomyb8基因抑制表达载体的农杆菌于LB固体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、50mg/L利福平)中，划线，28℃，培养箱中培养48h，挑取单克隆于5mL LB液体培养基(含50mg/L卡那霉素、50mg/L庆大霉素、50mg/L利福平)中，28℃，200rpm，培养24h，检测成功之后取500mL小摇菌液于250mL LB液体培养基中，培养14-16h至OD＝0.6～0.7，再于3000rpm，离心15分钟，得含抑制表达载体的农杆菌。
配置侵染液，并用侵染液分别重悬含过表达载体的农杆菌和含抑制表达载体的农杆菌，得到含过表达载体的农杆菌侵染液和含抑制表达载体的农杆菌侵染液；含农杆菌的侵染液的OD600为0.6～0.8。
所述侵染液是由10mM CaCl2、10mM MgCl2、400mM甘露醇、150uM乙酰丁香酮、1.5mg/L KT、5mg/L 2,4-D、10mM MES、0.02％～0.03％(v/v)Tween，0.02％(w/v)DTT，4.43g/L 1/2MS和3％蔗糖组成；
三、用1mol/L甘露醇浸泡长白落叶松实生苗15min，然后立刻将一部分长白落叶松实生苗置于含过表达载体的农杆菌侵染液中，将另一部分长白落叶松实生苗置于含抑制表达载体的农杆菌侵染液中，抽真空5min，抽完真空将长白落叶松实生苗转移至摇床中，25℃，120rpm侵染3h。
四、将侵染结束之后的长白落叶松实生苗清洗5次，然后栽于土中，48h之后取样。
本实施例的基因瞬时转化的RT-PCR结果分析可以发现，构建的长白落叶松瞬时遗传转化体系成功，如图5所示，基因过表达倍数较多对照相比提高，抑制表达倍数在对照之下6倍以上。抑制表达载体导入后，与对照相比，基因表达量下降1.4倍左右。
序 列 表
<110> 东北林业大学
<120> 长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法
<160> 3
<210> 1
<211> 591
<212> DNA
<213> 落叶松属（Larix）
<220>
<223> 长白落叶松Lomyb8基因
<400> 1
atggcgatga gcaatgggag attatcagaa gatttggata gaataaaagg accatggagc 60
cctgaagagg acgcgtcgct gcagaagctt gttcagaaat atgggccgag gaactggacc 120
ctgataagca ggggaatccc agggcgatcc gggaaatcgt gcaggctacg gtggtgcaat 180
cagctgagcc ctcaagttga gcacaggccc ttcaccccgt ccgaggacgc ggccatcctg 240
caggcgcacg ctcagcatgg caacaaatgg gcaacgattg cccgatccct gccgggtcgc 300
accgacaacg cgataaaaaa ccactggaac tccactcttc ggaggcgttg ccgtgactcc 360
gacaagggaa tcgtggtcca ccttgacgac gaaatcagca gcttagacgc cgctcggaag 420
cggagcagcg atggcttctc ccacgatggc agcagcgcac tggaggacaa ctgctgtagc 480
agctgggaag tggactccaa gcggctgaag agattgggcg aattgggggc agagcagggc 540
cccgatgtcg aagtcgaggt cgaggtttcg gaccggagcg attcgaaccc gggacgtgtg 600
ctcttcaggc ccgtgccggt tgcatcattt ttcggttcat ttggaaaaac cgtcgcgaat 660
ctacaggaaa cagcccccgg ctcagtcggc gtcgatccgc cgacatcgtt gagcctgtcg 720
ctgcccggag tcgatcccgc gacgccctct tcgaagccgc cctctctgaa ggattttcat 780
aacactatca cagacaataa caataatcct actccgccgg cggtgggata catgagagca 840
gacgaggcgg tggagcgact cggcaccgcc gtgaaagcca cggtggcaag catgcttgcc 900
cctgttttga gctcatcgcc acgtggcatc aatccaccgg ctgtgagcag cgacctgctg 960
gcgctgatgc gggatatggt tgcaaaggag gtgcacaaat acatgtccag tcatcaccag 1020
cccgccatgt acactccgct ctctccccat cccgagttct tgggtgccgc tggactcgtg 1080
agaaatgttg ttctcggcgg cgccctgcat ctcaacaaat ga 1122
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物LoMYB8-F
<400> 2
gctctagaatggcgatgagcaatgggagattatc 34
<210> 3
<211> 33
<212> DNA
<213>人工序列
<220>
<223> 引物LoMYB8-R
<400> 3
cggaattctcatttgttgagatgcagggcgccg 33

Claims (5)

1.长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
一、取生长1～1.5个月，针叶尚未完全打开的长白落叶松实生苗为瞬时转化材料；
二、配置侵染液，并用侵染液重悬含目的基因的农杆菌，得到含农杆菌的侵染液；
三、用1mol/L甘露醇浸泡长白落叶松实生苗15～18min，然后立刻将长白落叶松实生苗置于含农杆菌的侵染液中，抽真空5～7min，抽完真空将长白落叶松实生苗转移至摇床中，25～27℃，100～120rpm侵染3～4h；
四、将侵染结束之后的长白落叶松实生苗清洗数次，然后栽于土中；
步骤二所述含目的基因的农杆菌为转化有含目的基因表达载体的农杆菌，其中目的基因为待研究的长白落叶松；
步骤二所述侵染液是由10mM CaCl2、10mM MgCl2、400mM甘露醇、100～150uM乙酰丁香酮、1.5mg/L KT、5mg/L 2,4-D、10mM MES、0.02％～0.03％(v/v)Tween，0.02％(w/v)DTT，4.43g/L 1/2MS和3％蔗糖组成。
2.根据权利要求1所述的长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法，其特征在于步骤二中含农杆菌的侵染液的OD600为0.6～0.8。
3.根据权利要求2所述的长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法，其特征在于步骤三中用1mol/L甘露醇浸泡长白落叶松实生苗16～17min。
4.根据权利要求3所述的长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法，其特征在于步骤三中抽完真空将长白落叶松实生苗转移至摇床中，26℃，110rpm侵染3h。
5.根据权利要求4所述的长白落叶松瞬时转化实生苗体系构建方法，其特征在于步骤四中长白落叶松实生苗清洗次数为3～5次。
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