ES2424229T3

ES2424229T3 - Proteínas de fusión de alérgenos de gato y utilización de las mismas

Info

Publication number: ES2424229T3
Application number: ES06725140T
Authority: ES
Inventors: Martin Bachmann; Monika Bauer; Klaus Dietmeier; Nicole Schmitz; Stephan Utzinger
Original assignee: Cytos Biotechnology AG
Current assignee: Cytos Biotechnology AG
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2006-03-17
Publication date: 2013-09-30
Anticipated expiration: 2026-03-17
Also published as: JP2008535800A; MX2007011160A; CN101141979A; ZA200707413B; WO2006097530A3; JP5302671B2; CN101141979B; CY1114171T1; DK1868642T3; US20130344098A1; RU2007138265A; WO2006097530A2; IL185103A0; EP1868642A2; NZ561040A; CA2599218A1; CN103203016A; US20110045013A1; CA2599218C; US7767212B2

Abstract

Composición que comprende: (a) una partícula de núcleo con, como mínimo, un primer lugar de unión, en la que dicha partícula de núcleoes una partícula de tipo viral (PTV) (b) como mínimo, un antígeno con, como mínimo, un segundo lugar de unión, en la que dicho, como mínimo, un antígeno es una proteína Fel d1, en la que dicha proteína Fel d1 es una proteínade fusión que comprende la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1, en la que dicha cadena 2 de la Fel d1está fusionada a través de su extremo C-terminal con el extremo N-terminal de dicha cadena 1 de la Fel d1 biendirectamente o bien a través de un espaciador, y en la que (a) y (b) están covalentemente enlazadas a través dedicho, como mínimo, un primer y dicho, como mínimo, un segundo lugar de unión.

Description

Proteínas de fusión de alérgenos de gato y utilización de las mismas

TÉCNICA ANTERIOR

Sector de la presente invención

La presente invención corresponde al sector de la medicina, salud pública, inmunología, biología molecular y virología. La presente invención da a conocer composiciones que comprenden una partícula de tipo viral (PTV) o una partícula viral y, como mínimo, un antígeno, en particular, como mínimo, un antígeno felino, y más particularmente, como mínimo, un antígeno felino que es un alérgeno humano. En ciertas realizaciones, el antígeno es un antígeno Fel d1 o un fragmento del mismo, enlazado covalentemente a la PTV. La presente invención da a conocer además métodos para producir las composiciones. Las composiciones de la presente invención inducen respuestas inmunes eficientes, en particular respuestas de anticuerpos, en mamíferos, particularmente en seres humanos. Las composiciones y métodos de la presente invención son útiles en la producción de vacunas, en particular para el tratamiento y/o la prevención de alergia a la caspa de gato y a otros antígenos y alérgenos de gato.

Técnica relacionada

El gato doméstico (Felis domesticus) es una fuente importante de alérgenos en interiores (Lau, S. y otros (2000) Lancet 356, 1392-1397). De hecho, los gatos se encuentran en aproximadamente el 25% de los hogares en los países occidentales y la alergia a los gatos se encuentra en una gran parte de la población. La gravedad de los síntomas va desde rinitis y conjuntivitis relativamente leves a exacerbación asmática potencialmente mortal.

Aunque los pacientes en ocasiones se sensibilizan a varias moléculas diferentes en la caspa y pieles de gato, el principal alérgeno es Fel d1 (es decir, alérgeno 1 de Felis domesticus, anteriormente Cat 1, es decir, Alérgeno de gato 1). La importancia de este alérgeno se ha enfatizado en numerosos estudios. De hecho, más de 80% de los pacientes alérgicos a los gatos presentan anticuerpos IgE frente a este potente alérgeno (van Ree, R. y otros (1999)

J. Allergy Clin Immunol 104, 1223-1230).

Fel d1 es una glicoproteína ácida de 35-39 KDa que contiene un 10-20% de carbohidratos unidos a N y se encuentra en la piel, la saliva y las glándulas lagrimales de los gatos. Está formada por dos heterodímeros enlazados no covalentemente. Cada heterodímero comprende un péptido de 70 residuos (conocido como "cadena 1") y un péptido 78, 85, 90 ó 92 residuos (conocido como "cadena 2") que son codificados por genes separados (véase Duffort, O. A. y otros (1991) Mol Immunol 28, 301-309; Morgenstern, J. P. y otros, (1991) Proc Natl Acad Sci EE.UU. 88, 96909694 y Griffith, I. J. y otros (1992) Gene 113, 263-268).

Se ha descrito por Kaiser y otros 2.003 (J Biol Chem 278(39):37730-5) que la Fel d1 recombinante, que comprende la cadena 2 y la cadena 1 fusionadas conjuntamente sin ningún conector adicional, tiene propiedades inmunológicas indistinguibles de la proteína natural heterodimérica. Grönlund y otros, 2003 (J Biol Chem 278(41):40144-51) produjeron una Fel d1 recombinante plegada con propiedades moleculares y biológicas similares a las de su correspondiente natural. Se construyó un gen sintético que codifica la fusión directa del extremo N-terminal de la cadena 2 de Fel d1 a la cadena 1 mediante el solapamiento de oligonucleótidos en PCR. (1992 Gene, 113, 263268).

El tratamiento de los pacientes alérgicos a los gatos se lleva a cabo actualmente mediante la terapia de desensibilización, que implica inyecciones repetidas con dosis crecientes de un extracto crudo de caspa de gato o péptidos cortos derivados de Fel d1. Lilja y otros y Hedlin y otros han descrito un programa de desensibilización en el curso del cual extractos crudos de caspa de gato se han suministrado a pacientes alérgicos a los gatos (Lilja, Q y otros (1989) J Allergy Clin Immunol 83, 37-44 y Hedlin y otros (1991) J Allergy Clin Immunol 87, 955-964). Este programa duró como mínimo dos o tres años y los pacientes después de tratamiento de tres años seguían teniendo síntomas sistémicos. La utilización de péptidos cortos derivados de Fel d1 para la desensibilización dio como resultado una diferencia no significativa entre el grupo de péptidos y el grupo de placebo (Oldfield, W. L. y otros (2002) Lancet 360, 47-53). Sólo se observó eficacia cuando se le dio gran cantidad (750 μg) del péptido corto a los pacientes (Norman, P. S. y otros (1996) Am J Respir Crit Care Med 154, 1623-1628).

Efectos secundarios alérgicos, tales como reacciones asmáticas tardías, han sido descritos tanto en el tratamiento con extracto crudo de caspa de gato como en el tratamiento con péptidos cortos. Por lo tanto, el choque anafiláctico debido al alérgeno inyectado es de gran preocupación para la seguridad de cualquier programa de desensibilización. Sin embargo, evitar dicho efecto mediante la reducción de la cantidad inyectada de alérgeno, o bien reduce la eficacia del tratamiento o bien prolonga el tratamiento. Por lo tanto, en el sector del tratamiento de la alergia a los gatos, existe una gran necesidad de regímenes alternativos de desensibilización y, en particular, de regímenes de desensibilización que sean capaces de reducir los síntomas alérgicos, pero que no desencadenen reacciones alérgicas secundarias.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

Ahora, los presentes inventores han descubierto que, sorprendentemente las composiciones y vacunas de la presente invención, respectivamente, que comprenden, como mínimo, un antígeno Fel d1 de la presente invención, no sólo son capaces de inducir respuestas inmunes contra Fel d1 y, en particular, respuestas de anticuerpos, sino que son capaces además de desensibilizar a un paciente que sufre de alergia a los gatos y, en particular, dentro de un período corto de tiempo, lo que indica la elevada eficacia de las composiciones y vacunas de la presente invención, respectivamente. Además, los presentes inventores han descubierto que, sorprendentemente, la Fel d1 de la presente invención, cuando se une covalentemente a la PTV, según la presente invención, reduce drásticamente la actividad anafiláctica en comparación con la Fel d1 de la presente invención no enlazada de forma covalente a PTV, manteniendo un elevado grado de antigenicidad y inmunogenicidad. Esta es una gran ventaja sobre la técnica anterior para el tratamiento de la alergia a los gatos, dado que las composiciones y las vacunas de la presente invención, respectivamente, reducen drásticamente el riesgo de provocar un shock anafiláctico en los animales y seres humanos que van a ser inmunizados. Además, las composiciones y las vacunas de la presente invención, respectivamente, permiten que el antígeno se administre en dosis mucho más elevadas en comparación con los tratamientos para alergias a los gatos de la técnica anterior, lo que puede a su vez mejorar la eficacia y/o acortar la totalidad del programa de desensibilización. Por lo tanto, las composiciones y vacunas de la presente invención, respectivamente, inducen respuestas inmunes anti-Fel d1 potentes pero no desencadenan una reacción alérgica.

De este modo, en un primer aspecto, la presente invención da a conocer una composición que comprende (a) una partícula de núcleo con, como mínimo, un primer lugar de unión, en la que dicha partícula de núcleo es una partícula de tipo viral (PTV), (b), como mínimo, un antígeno con, como mínimo, un segundo lugar de unión, en el que dicho, como mínimo, un antígeno es la proteína Fel d1, en la que dicha proteína Fel d1 es una proteína de fusión que comprende la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1, en la que dicha cadena 2 de la Fel d1 se fusiona a través del extremo C-terminal al extremo N-terminal de dicha cadena 1 de la Fel d1 bien directamente mediante un enlace peptídico o bien mediante un espaciador, y en el que (a) y (b) están enlazados covalentemente a través de dicho, como mínimo, primer y dicho, como mínimo, segundo lugar de unión.

En otro aspecto, la presente invención da a conocer una composición de vacuna. Además, se da a conocer un método para la administración de la composición de vacuna a un ser humano o a un mamífero no humano, tal como un perro, que es alérgico a los gatos, preferentemente a la Fel d1 de gato. En una realización preferente, la composición de vacuna comprende además, como mínimo, un adyuvante. Sin embargo, la composición de vacuna de la presente invención es capaz de inducir una fuerte respuesta inmune, en particular respuesta de anticuerpos, sin la presencia de, como mínimo, un adyuvante. De este modo, en una realización preferente, la vacuna está desprovista de un adyuvante. Evitar la utilización de adyuvantes puede reducir una posible aparición de efectos secundarios relacionados con la utilización de adyuvantes.

En una realización preferente, la PTV compuesta por la composición y la composición de vacuna, respectivamente, se produce de manera recombinante en un huésped y la PTV está esencialmente libre de ARN del huésped, preferentemente libre de ácidos nucleicos del huésped. Es ventajoso reducir o, preferentemente, eliminar, la cantidad de huésped, preferentemente libre de ácidos nucleicos del huésped, para evitar respuestas no deseadas de las células T, así como otros efectos secundarios no deseados, tales como fiebre.

Se da a conocer además una composición que comprende, como mínimo, una sustancia inmunoestimuladora, preferentemente, como mínimo, un ácido nucleico inmunoestimulador. El ácido nucleico inmunoestimulador puede estar empaquetado dentro de la PTV de la presente invención. La inclusión de sustancias inmunoestimuladoras, preferentemente ácidos nucleicos inmunoestimuladores, en la composición de la presente invención puede conducir las respuestas inmunes hacia respuestas Th1 y con ello suprimir las respuestas Th2 y, por lo tanto, suprimir la producción de IgE.

Se da a conocer además en la presente invención un método de tratamiento de alergia a los gatos mediante la administración de la composición o de la vacuna de la presente invención, respectivamente, a un sujeto alérgico a los gatos, preferentemente humano.

En un aspecto adicional, la presente invención da a conocer una composición farmacéutica que comprende la composición de la presente invención y un vehículo aceptable farmacéuticamente.

En otro aspecto adicional, la presente invención da a conocer un método para producir la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende (a) proporcionar una partícula de núcleo con, como mínimo, un primer lugar de unión, en la que dicha partícula de núcleo es una partícula de tipo viral (PTV); (b) proporcionar, como mínimo, un antígeno con, como mínimo, un segundo lugar de unión, en el que dicho antígeno es una proteína Fel d1, en el que dicha proteína Fel d1 es una proteína de fusión que comprende la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1, en la que dicha cadena 2 de la Fel d1 se fusiona a través del extremo C-terminal al extremo N-terminal de dicha cadena 1 de la Fel d1 bien directamente mediante un enlace peptídico o bien mediante un espaciador; y (c) enlazar dicha partícula de núcleo y dicho, como mínimo, un antígeno para producir dicha

composición, en la que dicho, como mínimo, un antígeno y dicha partícula de núcleo están enlazados a través de dicho, como mínimo, primer y dicho, como mínimo, segundo lugar de unión. Se da a conocer además en la presente invención una proteína de fusión de Fel d1 que comprende la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1 fusionadas a través de un conector de aminoácidos, que une el extremo N-terminal de una cadena con el extremo Cterminal de otra cadena, en el que dicho espaciador de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 10-30 residuos de aminoácidos, y en el que dicha proteína de fusión se produce en E. coli o en la que dicha proteína de fusión no está glicosilada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 muestra las proteínas de fusión Fel d1 teñidas con Coomassie purificadas y renaturalizadas sobre gel SDS-PAGE no reductor. Las muestras en la línea 1 tenían DTT como agente reductor, las muestras en la línea 2 no tenían DTT.

La figura 2 muestra la degranulación de basófilos bien mediante las proteínas Fel d1 de fusión solas o bien mediante las proteínas Fel d1 de fusión acopladas a Qβ. El eje X representa la concentración de la proteína Fel d1 correspondiente. El eje Y representa el porcentaje de basófilos que han sido degranulados.

La figura 3 muestra los resultados de la prueba de punción de la piel de un voluntario alérgico a los gatos que recibió Qβ-FELD1 en los días 0, 7 y 14 y además las pruebas se llevaron a cabo en los días 0, 14 y 21.

La figura 4A muestra la puntuación de escalada de dosis nasal y la puntuación nasal global (Fig. 4B) de un voluntario alérgico a los gatos que recibió Qβ-FELD 1 en los días 0, 7 y 14, y las pruebas se llevaron a cabo en los días 0, 14 y 21.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en el presente texto tienen el mismo significado que el entendido comúnmente por un técnico habitual en la materia a la que pertenece la presente invención.

Adyuvante: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "adyuvante", se refiere a estimuladores no específicos de la respuesta inmune o sustancias que permiten la generación de un depósito en el huésped que, cuando se combina con la vacuna y la composición farmacéutica de la presente invención, respectivamente, pueden proporcionar una respuesta inmune aún más aumentada. Se pueden utilizar una variedad de adyuvantes. Entre los ejemplos se incluyen adyuvante de Freund completo e incompleto, hidróxido de aluminio y muramildipéptido modificado. Adyuvantes adicionales son geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias surfactantes tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol, y adyuvantes humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette Guerin) y Corynebacterium parvum. Además, estos adyuvantes son bien conocidos en la técnica. Entre los adyuvantes adicionales que pueden administrarse con las composiciones de la presente invención se incluyen, sin que constituyan limitación, inmunomodulador monofosforil lípido, AdjuVax 100a, QS-21, QS-18, CRL1005, sales de aluminio (alumbre), MF-59, OM-174, OM-197, OM-294, y la tecnología de adyuvante Virosomal. Los adyuvantes pueden comprender además una mezcla de estas sustancias. Las PTV se han descrito generalmente como un adyuvante. Sin embargo, el término "adyuvante", tal como se utiliza en el contexto de la presente solicitud, se refiere a un adyuvante que no es la PTV utilizada para las composiciones de la presente invención, que se añade además de dicha PTV.

Antígeno: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "antígeno" se refiere a una molécula capaz enlazarse a un anticuerpo o a un receptor de células T (TCR) si se presenta mediante moléculas de MHC. El término "antígeno", tal como se utiliza en el presente texto, incluye además epítopos de células T. Un antígeno es capaz además de ser reconocido por el sistema inmune y/o es capaz de inducir una respuesta inmune humoral y/o una respuesta inmune celular que conduce a la activación de linfocitos B y/o linfocitos T. Sin embargo, esto puede requerir que, como mínimo, en ciertos casos, el antígeno contenga un epítopo de célula Th o esté unido al mismo y se administre en adyuvante. Un antígeno puede tener uno o más epítopos (epítopos B y T). La reacción específica mencionada anteriormente pretende indicar que, preferentemente, el antígeno reaccionará, típicamente de una manera altamente selectiva, con su correspondiente anticuerpo o TCR y no con la multitud de otros anticuerpos o TCR que pueden ser inducidos por otros antígenos. Tal como se utiliza en el presente texto, los antígenos pueden ser además mezclas de varios antígenos individuales.

Lugar antigénico: El término "lugar antigénico" y el término "epítopo antigénico", que se utilizan de forma intercambiable en el presente texto, se refieren a partes continuas o discontinuas de un polipéptido, que pueden unirse inmunoespecíficamente a un anticuerpo o a un receptor de célula T en el contexto de una molécula MHC. La unión immunoespecifica excluye la unión no específica, pero no excluye necesariamente la reactividad cruzada. El lugar antigénico comprende típicamente 5-10 aminoácidos en una conformación espacial que es única al lugar antigénico.

Asociado: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "asociado" (o su sustantivo asociación) se refiere a todas las formas posibles, preferentemente las interacciones químicas, por las que dos moléculas se unen entre sí. Las interacciones químicas incluyen interacciones covalentes y no covalentes. Ejemplos típicos de interacciones no covalentes son las interacciones iónicas, interacciones hidrófobas o los enlaces de hidrógeno, mientras que las interacciones covalentes se basan, a modo de ejemplo, en enlaces covalentes tales como éster, éter, fosfoéster, amida, enlace peptídico, enlaces carbono-fósforo, enlaces carbono-azufre tales como tioéter o enlaces imida.

Lugar de unión, primero: Tal como se utiliza en el presente texto, la frase "primer lugar de unión" se refiere a un elemento que se da naturalmente en la PTV o que se añade artificialmente a la PTV, y al que el segundo lugar de unión puede estar enlazado. El primer lugar de unión puede ser una proteína, un polipéptido, un aminoácido, un péptido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo), o un grupo químicamente reactivo tal como un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo hidroxilo, un grupo guanidinilo, grupo histidinilo, o una combinación de los mismos. Una realización preferente de un grupo químicamente reactivo que va a ser el primer lugar de unión es el grupo amino de un aminoácido, tal como lisina. El primer lugar de unión se encuentra, típicamente sobre la superficie, y preferentemente en la superficie externa de la PTV. Múltiples primeros lugares de unión están presentes en la superficie, preferentemente en la superficie exterior de la partícula de tipo viral, típicamente en una configuración repetitiva. En una realización preferente, el primer lugar de unión se asocia con la PTV, a través de, como mínimo, un enlace covalente, preferentemente a través de, como mínimo, un enlace peptídico. En una realización adicionalmente preferente, el primer lugar de unión es de origen natural en la PTV. En una realización preferente alternativa, el primer lugar de unión se añade artificialmente a la PTV.

Lugar de unión, segundo: Tal como se utiliza en el presente texto, la frase "segundo lugar de unión" se refiere a un elemento que se da de forma natural en la Fel d1 de la presente invención o que se añade artificialmente a la misma y al que el primer lugar de unión puede estar enlazado. El segundo lugar de unión de la Fel d1 de la presente invención puede ser una proteína, un polipéptido, un péptido, un aminoácido, un azúcar, un polinucleótido, un polímero natural o sintético, un metabolito o compuesto secundario (biotina, fluoresceína, retinol, digoxigenina, iones metálicos, fluoruro de fenilmetilsulfonilo), o un grupo químicamente reactivo tal como un grupo amino, un grupo carboxilo, un grupo sulfhidrilo, un grupo hidroxilo, un grupo guanidinilo, un grupo histidinilo, o una combinación de los mismos. Una realización preferente de un grupo reactivo químicamente que va a ser el segundo lugar de unión es el grupo sulfhidrilo, preferentemente de un aminoácido cisteína. Por lo tanto, el término "Fel d1 de la presente invención con, como mínimo, un segundo lugar de unión" se refiere, a una construcción que comprende la Fel d1 de la presente invención y, como mínimo, un segundo lugar de unión. Sin embargo, en particular para un segundo lugar de unión que no se da de forma natural dentro de la Fel d1 de la presente invención, de forma típica y, preferentemente, una construcción de este tipo comprende además un "conector". En otra realización preferente, el segundo lugar de unión se asocia con la Fel d1 de la presente invención a través de, como mínimo, un enlace covalente, preferentemente a través de, como mínimo, un enlace peptídico. En una realización adicional, el segundo lugar de unión se da de forma natural dentro de la Fel d1 de la presente invención. En otra realización adicionalmente preferente, el segundo lugar de unión se añade artificialmente a la Fel d1 de la presente invención a través de un conector, en el que dicho conector está compuesto por una cisteína o, alternativamente comprende la misma. Preferentemente, el conector se fusiona a la Fel d1 de la presente invención mediante un enlace peptídico.

Proteína de recubrimiento: El término "proteína de recubrimiento" y el término "proteína de cápside" utilizados de manera intercambiable dentro de la presente solicitud, se refiere a una proteína viral, preferentemente una subunidad de una cápside natural de un virus, preferentemente de un fago de ARN, que es capaz de ser incorporado en una cápside viral o una PTV.

Fel d1 de la presente invención: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "Fel d1 de la presente invención", se refiere a, como mínimo, una proteína Fel d1 o, como mínimo, un fragmento de Fel d1.

Cadena 1 de la Fel d1: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "cadena 1 de la Fel d1", se refiere a un polipéptido que está constituido por una secuencia de aminoácidos tal como la Sec. No. Id.: 22 o una secuencia homóloga a la misma, o alternativamente comprende la misma. El término "secuencia homóloga a la Sec. No. Id.: 22”, tal como se utiliza en el presente texto, se refiere a un polipéptido que tiene una identidad con la Sec. No. Id.: 22 que es mayor que el 70%, preferentemente, mayor que el 80%, más preferentemente, mayor que el 90%, y aún más preferentemente, mayor que el 95%. El término "cadena 1 de la Fel d1", tal como se utiliza en el presente texto, debe referirse además a un polipéptido que comprende, como mínimo, una modificación postraduccional, entre las que se incluyen, pero sin que constituyan limitación, como mínimo, una glicosilación de la cadena 1 de la Fel d1, tal como se define en el presente texto. Preferentemente, tal como se define en el presente texto, la cadena 1 de la Fel d1 comprende un máximo de 130, aún más preferentemente, un máximo 100 de aminoácidos en total.

Cadena 2 de la Fel d1: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "cadena 2 de la Fel d1", se refiere a un polipéptido que está constituido por una secuencia de aminoácidos como la de la Sec. No. Id.: 23, Sec. No. Id. : 25 o Sec. No. Id.: 26, o una secuencia homóloga a las mismas, o alternativamente comprende las mismas. El término "secuencia homóloga a la Sec. No. Id.: 23, Sec. No. Id.: 25 o Sec. No. Id.: 26”, tal como se utiliza en el presente

texto, se refiere a un polipéptido que tiene una identidad con la Sec. No. Id.: 23, Sec. No. Id.: 25 o Sec. No. Id.: 26 mayor que el 70%, preferentemente, mayor que el 80%, más preferentemente, mayor que 90% y, aún más preferentemente, mayor que el 95%. El término "cadena 2 de la Fel d1", tal como se utiliza en el presente texto, debe referirse además a un polipéptido que comprende, como mínimo, una modificación postraduccional, entre las que se incluyen, pero sin que constituyan limitación, como mínimo, una glicosilación de la cadena 2 de la Fel d1, tal como se define en el presente texto. Preferentemente, la cadena 2 de la Fel d1, tal como se define en el presente texto, se compone de un máximo de 150, aún más preferentemente, de un máximo de 130, aún más preferentemente, de un máximo de 100 aminoácidos en total.

Proteína Fel d1: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "proteína Fel d1", se refiere a una proteína que está constituida por la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1 o que, alternativamente, comprende las mismas. Preferentemente, la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1 están enlazadas covalentemente. En una realización preferente, la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1 se enlazan a través de, como mínimo, un enlace disulfuro. En otra realización preferente, la cadena 1 y la cadena 2 se fusionan bien directamente o bien a través de un conector, en cuyo caso dicha proteína Fel d1 está constituida además por un espaciador, o alternativamente comprende el mismo. Preferentemente, la proteína Fel d1, tal como se define en el presente texto, comprende un máximo de 300, aún más preferentemente un máximo de 200 aminoácidos en total. Típicamente y, de forma preferente, la proteína Fel d1, según la presente invención, es capaz de inducir in vivo la producción de anticuerpos que se unen específicamente bien a la Fel d1 de origen natural o bien a la Fel d1 recombinante, tal como se produce según el ejemplo 5 de la presente invención.

Fragmento de la Fel d1: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "fragmento de la Fel d1" se refiere a un polipéptido que está constituido por, como mínimo, un lugar antigénico de Fel d1, o alternativamente comprende el mismo. De forma típica y, preferentemente, el término "fragmento de la Fel d1" tal como se utiliza en el presente texto, se refiere a un polipéptido que está constituido por, como mínimo, dos lugares antigénicos de la Fel d1, o alternativamente comprende los mismos. Preferentemente, los lugares antigénicos se unen covalentemente, aún más preferentemente, los lugares antigénicos están unidos por, como mínimo, un enlace peptídico, en cuyo caso puede ser necesario un espaciador entre los lugares antigénicos. Preferentemente los, como mínimo, dos lugares antigénicos derivan tanto de la cadena 1 de la Fel d1 como de la cadena 2 de la Fel d1. Preferentemente, el fragmento de la Fel d1, tal como se define en el presente texto, se compone de un máximo de 130, aún más preferentemente, de un máximo de 100, aún más preferentemente, 60 aminoácidos en total. De forma típica y, preferentemente, el fragmento de la Fel d1 es capaz de inducir in vivo la producción de anticuerpos que se unen específicamente bien a la Fel d1 de origen natural o bien a la Fel d1 recombinante, tal como se produce según el ejemplo 5 de la presente invención.

Unido: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "unido" (o su sustantivo: unión), se refiere a todas las formas posibles, preferentemente interacciones químicas, mediante las que el, como mínimo, un primer lugar de unión y el, como mínimo, un segundo lugar de unión se unen entre sí. Las interacciones químicas incluyen interacciones covalentes y no covalentes. Ejemplos típicos de las interacciones no covalentes son las interacciones iónicas, interacciones hidrófobas o enlaces de hidrógeno, mientras que las interacciones covalentes se basan, a modo de ejemplo, en enlaces covalentes tales como éster, éter, fosfoéster, amida, péptido, enlaces carbono-fósforo, enlaces carbono-azufre tales como tioéter o enlaces imida. En ciertas realizaciones preferentes, el primer lugar de unión y el segundo lugar de unión están unidos a través de, como mínimo, un enlace covalente, preferentemente a través de, como mínimo, un enlace no peptídico, y aún más preferentemente, exclusivamente a través de un enlace

o enlaces no-peptídicos. Sin embargo, el término "unido" tal como se utiliza en el presente texto, deberá abarcar no sólo un enlace directo del, como mínimo, un primer lugar de unión y el, como mínimo, un segundo lugar de unión, sino además, de forma alternativa y preferentemente, un enlace indirecto del, como mínimo, un primera lugar de unión y el, como mínimo, un segundo lugar de unión a través de una molécula o moléculas intermedias, y de forma típica y preferente, mediante la utilización de, como mínimo, un agente de reticulación heterobifuncional, preferentemente uno.

Conector: Tal como se utiliza en el presente texto, un "conector", o bien asocia el segundo lugar de unión con la Fel d1 de la presente invención o bien ya comprende el segundo lugar de unión, consiste esencialmente en el mismo, o consiste en el mismo. Preferentemente, un "conector", tal como se utiliza en el presente texto, ya comprende el segundo lugar de unión, típicamente, y de forma preferente - pero no necesariamente- un residuo de aminoácido, preferentemente un residuo de cisteína. Tal como se utiliza en el presente texto, un "conector", se denomina además "conector de aminoácidos", en particular, cuando un conector según la presente invención contiene, como mínimo, un residuo de aminoácido. De este modo, los términos "conector" y "conector de aminoácidos" se utilizan indistintamente en el presente texto. Sin embargo, esto no implica que un conector de este tipo se componga exclusivamente de residuos de aminoácidos, incluso si un conector que comprende residuos de aminoácidos es una realización preferente de la presente invención. Los residuos de aminoácidos del conector están, preferentemente, compuestos por aminoácidos de origen natural o aminoácidos no naturales conocidos en la técnica, todos L o todos D o mezclas de los mismos. Otras realizaciones preferentes de un conector según la presente invención son moléculas que comprenden un grupo sulfhidrilo o un residuo de cisteína y estás moléculas, por lo tanto, se engloban además dentro de la presente invención. Otros conectores útiles para la presente invención son moléculas que comprenden un residuo de grupo alquilo C1-C6, un cicloalquilo tal como ciclopentilo o ciclohexilo, un cicloalquenilo,

arilo o heteroarilo. Además, los conectores que comprenden preferentemente un resto de alquilo C1-C6, cicloalquilo (C5, C6), arilo o heteroarilo y un aminoácido o aminoácidos adicionales pueden ser utilizados además como conectores de la presente invención y se incluyen dentro del alcance de la presente invención. Preferentemente, la asociación del conector con la Fel d1 de la presente invención es por medio de, como mínimo, un enlace covalente, más preferentemente por medio de, como mínimo, un enlace peptídico.

Matriz de antígeno ordenada y repetitiva: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "matriz de antígeno ordenada y repetitiva" se refiere generalmente a un patrón de repetición de antígeno, o que está caracterizado típicamente, y de forma preferente, por un elevado orden de uniformidad en la disposición espacial de los antígenos con respecto a las partículas de tipo viral, respectivamente. En una realización de la presente invención, el patrón de repetición puede ser un patrón geométrico. Ciertas realizaciones de la presente invención, tales como antígenos acoplados a la PTV de fagos de ARN, son ejemplos típicos y preferentes de matrices de antígeno ordenadas y repetitivas adecuadas que, además, poseen ordenaciones de antígenos paracristalinas estrictamente repetitivas, preferentemente con separaciones de 1 a 30 nanómetros, preferentemente de 2 a 15 nanómetros, aún más preferentemente de 2 a 10 nanómetros, aún más preferentemente de 2 a 8 nanómetros, y aún más preferentemente 1,6 a 7 nanómetros.

Empaquetado: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "empaquetado", se refiere al estado de una macromolécula polianiónica o sustancias inmunoestimuladoras en relación con la PTV. El término "empaquetado", tal como se utiliza en el presente texto incluye una unión que puede ser covalente, por ejemplo, mediante el acoplamiento químico o, por ejemplo, interacciones no covalentes, iónicas, interacciones hidrofóbicas, enlaces de hidrógeno, etc. El término además incluye la envuelta, o envuelta parcial, de una macromolécula polianiónica. De este modo, las macromoleculares polianiónicas o sustancias inmunoestimuladoras pueden estar envueltas por la PTV sin la existencia de una unión real, en particular de un enlace covalente. En realizaciones preferentes la, como mínimo, una macromolécula polianiónica o sustancia inmunoestimuladora, está envuelta dentro de la PTV, más preferentemente de una manera no covalente.

Espaciador: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "espaciador", así como el término "espaciador de aminoácidos" que se utiliza de forma equivalente, se refiere a un tramo de secuencia de aminoácidos, que no tiene más de 30 aminoácidos, y que une el extremo N-terminal de una cadena con el extremo C-terminal de la otra cadena de la Fel d1.

Partícula viral: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "partícula viral" se refiere a la forma morfológica de un virus. En algunos tipos de virus ésta comprende un genoma rodeado por una cápside proteica, mientras que en otros ésta tiene estructuras adicionales (por ejemplo, cubiertas, colas, etc.)

Partícula de tipo viral (PTV), Tal como se utiliza en el presente texto, se refiere a una partícula viral no replicativa o no infecciosa, preferentemente una no replicativa y no infecciosa, o se refiere a una estructura que se asemeja a una partícula viral no replicativa o no infecciosa, preferentemente una no replicativa y no infecciosa, preferentemente una cápside viral. El término "no replicativo", tal como se utiliza en el presente texto, se refiere a ser incapaz de replicar el genoma contenido por la PTV. El término "no infeccioso", tal como se utiliza en el presente texto, se refiere a ser incapaz de entrar en la célula huésped. Preferentemente, una partícula de tipo viral según la presente invención es no replicativa y/o no infecciosa, ya que carece de todo o parte del genoma viral o la función del genoma. En una realización, una partícula de tipo viral es una partícula viral, en la que el genoma viral ha sido física o químicamente inactivado. Típicamente y, de forma más preferente, una partícula de tipo viral carece de todos o parte de los componentes replicativos e infecciosos del genoma viral. Una partícula de tipo viral según la presente invención puede contener ácido nucleico distinto de su genoma. Una realización típica y preferente de una partícula de tipo viral según la presente invención es una cápside viral tal como la cápside viral del virus correspondiente, bacteriófago, preferentemente un fago de ARN. Los términos "cápside viral" o "cápside", se refieren a una estructura macromolecular compuesta de subunidades de proteínas virales. Típicamente, hay 60, 120, 180, 240, 300, 360 y más de 360 subunidades de proteínas virales. De forma típica y, preferentemente, las interacciones de estas subunidades conducen a la formación de la cápside viral o la estructura de tipo cápside viral con una organización repetitiva inherente, en la que dicha estructura es, típicamente, esférica o tubular. Por ejemplo, las cápsides de los fagos de ARN o HBcAgs tienen una forma esférica de simetría icosaédrica. El término "estructura de tipo cápside", tal como se utiliza en el presente texto, se refiere a un ensamblaje macromolecular compuesto de subunidades de proteínas virales se asemejan a la morfología de la cápside en el sentido definido anteriormente pero se desvían del conjunto simétrico típico mientras se mantiene un grado suficiente de orden y repetitividad.

Una característica común de la partícula viral y la partícula de tipo viral es la disposición altamente ordenada y repetitiva de sus subunidades.

Partículas de tipo viral de un fago de ARN: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "partículas de tipo viral de ARN de fago" se refiere a una partícula de tipo viral que comprende proteínas de recubrimiento, mutantes o fragmentos de las mismas, de un fago de ARN o, preferentemente, que está esencialmente constituida o está constituida por las mismas. Además, partícula de tipo viral de un fago de ARN se asemeja a la estructura de un fago de ARN, siendo no replicativa y/o no infecciosa, y que carece de, como mínimo, el gen o los genes que codifican la

maquinaria de replicación del fago de ARN y, por lo general, carece además del gen o los genes que codifican la proteína o las proteínas responsables de la unión del virus o la entrada en el huésped. Sin embargo, esta definición debe abarcar además partículas de tipo viral de fagos de ARN, en las que el gen o los genes anteriormente mencionados están todavía presentes pero están inactivos, y, por lo tanto, conducen además a partículas de tipo viral de un fago de ARN no replicativas y/o no infecciosas. Las PTV preferentes derivadas de fagos de ARN muestran simetría icosaédrica y constan de 180 subunidades. Dentro de la presente descripción, los términos "subunidad" y "monómero" se utilizan de forma intercambiable y equivalente dentro de este contexto. En la presente solicitud, el término " fago de ARN" y el término " bacteriófago de ARN" se utilizan indistintamente. Los métodos preferentes para convertir una partícula de tipo viral de un fago de ARN en no replicativa y/o no infecciosa son la inactivación física o química, tal como la irradiación de UV, tratamiento con formaldehído, de forma típica y, preferentemente, mediante manipulación genética.

Uno, o un: A menos que se indique lo contrario, cuando los términos "uno" o "un" se utilizan en la presente descripción, se refieren a "como mínimo" o "uno o más".

La identidad de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos se puede determinar convencionalmente utilizando programas informáticos conocidos tales como el programa Bestfit. Cuando se utiliza Bestfit o cualquier otro programa de alineación de secuencias, preferentemente, cuando se utiliza Bestfit para determinar si una secuencia particular es, por ejemplo, 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de referencia, los parámetros se ajustan de tal manera que el porcentaje de identidad se calcula sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia y se permite faltas en homología de hasta el 5% del número total de residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia. Este método anteriormente mencionado en la determinación del porcentaje de identidad entre polipéptidos es aplicable a todas las proteínas, polipéptidos o fragmentos de los mismos descritos en la presente invención.

Dentro de la presente solicitud, se define a los anticuerpos como de unión específica si se unen al antígeno con una afinidad de unión (Ka) de 106 M-1 o mayor, preferentemente 107 M-1 o mayor, más preferentemente 108 M-1 o mayor, y, más preferentemente, 109 M-1 o mayor. La afinidad de un anticuerpo puede ser determinada fácilmente por un técnico habitual en la materia (por ejemplo, mediante análisis de Scatchard).

La presente invención da a conocer composiciones que comprenden: (a) una partícula de núcleo con, como mínimo, un primer lugar de unión, en el que dicha partícula de núcleo es una partícula de tipo viral (PTV) o una partícula viral, y (b), como mínimo, un antígeno con, como mínimo, un segundo lugar de unión, en las que el, como mínimo, un antígeno es una proteína Fel d1 o un fragmento de Fel d1 y en las que (a) y (b) están unidos covalentemente a través del, como mínimo, un primer y el, como mínimo, un segundo lugar de unión. Preferentemente, una proteína Fel d1 o un fragmento de Fel d1 están enlazados a la partícula de núcleo, a efectos de formar una matriz de antígeno-PTV ordenada y repetitiva. En realizaciones preferentes de la presente invención, como mínimo, 20, preferentemente, como mínimo, 30, más preferentemente, como mínimo, 60, aún más preferentemente, como mínimo, 120 y, aún más preferentemente, como mínimo, 180 proteínas Fel d1 o fragmentos de Fel d1 están enlazados a la partícula de núcleo.

Cualquier virus conocido en la técnica que tenga una estructura ordenada y repetitiva puede ser seleccionado como PTV o partícula viral de la presente invención. Se han descrito en el documento WO 2004/009124 en la página 25, línea 10-21, en la página 26, línea 11-28, y en la página 28, línea 4 de la página 31, línea 4, virus de ADN o ARN de ejemplo, cuya proteína de recubrimiento o cápside se puede utilizar para la preparación de las PTV.

Los virus o partículas de tipo viral se pueden producir y purificar a partir de cultivos de células infectadas por virus. Preferentemente, el virus o la partícula de tipo viral resultantes para el propósito de la vacuna deben ser no replicativos o no infecciosos, más preferentemente no replicativos y no infecciosos. La irradiación UV, el tratamiento químico, tal como con formaldehído o cloroformo, son los métodos generales conocidos por el técnico en la materia para inactivar el virus.

En una realización preferente, la partícula de núcleo es una partícula viral, en la que preferentemente dicha partícula viral es una partícula viral de un bacteriófago, en la que más preferentemente dicho bacteriófago es un fago de ARN, y en la que aún más preferentemente dicho fago de ARN es un fago de ARN seleccionado de Qβ, fr, GA o AP205.

En una realización preferente, la partícula de núcleo es una PTV. En una realización adicionalmente preferente, la PTV es una PTV recombinante. Casi todos los virus conocidos de forma común se han secuenciado y están disponibles fácilmente para el público. El gen que codifica la proteína de recubrimiento puede ser fácilmente identificado por un técnico en la materia. La preparación de las PTV por expresión recombinante de la proteína de recubrimiento en un huésped está dentro del conocimiento común de un técnico en la materia.

En una realización preferente, la partícula de tipo viral está constituida por proteínas recombinantes, mutantes o fragmentos de las mismas o, alternativamente, comprende los mismos, de un virus seleccionado del grupo que comprende: a) fagos de ARN; b) bacteriófagos; c) virus de la hepatitis B, preferentemente su proteína de cápside (Ulrich y otros, Virus Res. 50:141-182 (1998)) o su proteína de superficie (documento WO 92/11291); d) virus del

sarampión (Warnes y otros, Gene 160: 173-178 (1995)), e) virus Sindbis; f) rotavirus (Patentes de EE.UU. Nos.

5.071.651 y 5.374.426); g) virus de la fiebre aftosa (Twomey y otros, Vaccine 13:1603 1610, (1995)); h) virus de Norwalk (Jiang, X. y otros, Science 250:1580 1583 (1990); Matsui, S. M. y otros, J. Clin. Invest. 87:1456 1461 (1991)); i) alfavirus; j) retrovirus, preferentemente su proteína GAG (documento WO 96/30523); k) retrotransposón Ty, preferentemente la proteína p1; l) virus del papiloma humano (documento WO 98/15631); m) virus Polioma; n) virus del mosaico del tabaco, y o) virus Flock House.

En una realización preferente, la PTV está constituida por más de una secuencia de aminoácidos, preferentemente dos secuencias de aminoácidos, de las proteínas recombinantes, mutantes o fragmentos de las mismas, o comprende las mismas. En la presente solicitud, la PTV que está constituida por más de una secuencia de aminoácidos o comprende las mismas se denomina PTV de mosaico.

Tal como se utiliza en el presente texto, el término "fragmento de una proteína recombinante" o el término "fragmento de una proteína de recubrimiento" se define como un polipéptido, que tiene, como mínimo, el 70%, preferentemente, como mínimo, el 80%, más preferentemente, como mínimo, el 90%, aún más preferentemente, como mínimo, el 95% de la longitud de la proteína recombinante o la proteína de recubrimiento de tipo salvaje, respectivamente y que, preferentemente, retiene la capacidad de formación de PTV. Preferentemente, el fragmento se obtiene por, como mínimo, una deleción interna, como mínimo, un truncamiento o, como mínimo, una combinación de los mismos. El término "fragmento de una proteína recombinante" o "fragmento de una proteína de recubrimiento" abarcará adicionalmente a un polipéptido, que tiene, como mínimo, el 80%, preferentemente, el 90%, aún más preferentemente, el 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con el "fragmento de una proteína recombinante" o "fragmento de una proteína de recubrimiento", respectivamente, tal como se ha definido anteriormente y que, preferentemente, es capaz de ensamblarse en una partícula de tipo viral.

El término "proteína recombinante mutante" o el término "mutante de una proteína recombinante" tal como se utilizan indistintamente en la presente invención, o el término "proteína de recubrimiento mutante" o el término "mutante de una proteína de recubrimiento", tal como se utilizan indistintamente en la presente invención, se refieren a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos derivada de la proteína recombinante o proteína de recubrimiento de tipo salvaje, respectivamente, en el que la secuencia de aminoácidos es, como mínimo, el 80%, preferentemente, como mínimo, el 85%, 90%, 95%, 97 %, o el 99% idéntica a la secuencia de tipo salvaje y, preferentemente, conserva la capacidad de ensamblarse en una PTV.

En una realización preferente, la partícula de tipo viral de la presente invención es el virus de la hepatitis B. La preparación de partículas de tipo viral de hepatitis B se ha dado a conocer, entre otros, en los documentos WO 00/32227, WO 01/85208 y en el documento WO 02/056905. Otras variantes de HBcAg adecuadas para su utilización en la práctica de la presente invención se han descrito en la página 34-39 del documento WO 02/056905.

En una realización adicionalmente preferente de la presente invención, se introduce un residuo de lisina en el polipéptido HBcAg, para mediar en la unión de la Fel d1 de la presente invención a la PTV de HBcAg. En realizaciones preferentes, las PTV y composiciones de la presente invención se preparan utilizando un HBcAg que está constituido por los aminoácidos 1-144, o 1-149, 1-185 de la Sec. No. Id.: 20, o alternativamente comprende los mismos, que se modifica de modo que los amino ácidos en las posiciones 79 y 80 se sustituyen por un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de Gly-Gly-Lys-Gly-Gly. Esta modificación cambia la Sec. No. Id.: 20 a la Sec. No. Id.: 21. En otras realizaciones preferentes, los residuos de cisteína en las posiciones 48 y 110 de la Sec. No. Id.: 21, o sus correspondientes fragmentos, preferentemente los fragmentos 1-144 o 1-149, se mutan a serina. La presente invención incluye además composiciones que comprenden mutantes de proteína núcleo de la hepatitis B que tienen las correspondientes modificaciones de aminoácidos señaladas anteriormente. La presente invención incluye además composiciones y vacunas, respectivamente, que comprenden polipéptidos de HBcAg que están constituidos por las secuencias de aminoácidos que son, como mínimo, el 80%, 85%, 90%, 95%, 97% o el 99% idénticas a la Sec. No. Id. : 21, o comprenden las mismas.

En una realización preferente de la presente invención, la partícula de tipo viral de la presente invención está constituida por proteínas recombinantes de recubrimiento, mutantes o fragmentos de los mismos, de un fago de ARN, consiste esencialmente en los mismos, o alternativamente comprende los mismos. Preferentemente, el ARN del fago se selecciona del grupo que comprende a) bacteriófago Qβ; b) bacteriófago R17, c) bacteriófago fr; d) bacteriófago GA; e) bacteriófago SP; f) bacteriófago MS2; g) bacteriófago M11, h) bacteriófago MX1; i) bacteriófago NL95, k) bacteriófago f2, 1) bacteriófago PP7 y m) bacteriófago AP205.

En una realización preferente de la presente invención, la composición comprende proteínas de recubrimiento, mutantes o fragmentos de los mismos, de los fagos de ARN, en el que la proteína de recubrimiento tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende: (a) Sec. No. Id.: 1 en referencia a la PR Qβ; (b) una mezcla de la Sec. No. Id.: 1 y Sec. No. Id.: 2 (en referencia a la proteína Qβ A1); (c) la Sec. No. Id.: 3; (d) Sec. No. Id.: 4; (e) Sec. No. Id.: 5; (f) Sec. No. Id.: 6, (g) una mezcla de la Sec. No. Id.: 6 la Sec. No. Id.: 7; (h) Sec. No. Id.: 8; (i) Sec. No. Id.: 9; G) Sec. No. Id.: 10; (k) Sec. No. Id.: 11; (1) Sec. No. Id.: 12; (m) Sec. No. Id.: 13, y (n) Sec. No. Id.: 14.

En una realización preferente de la presente invención, la PTV es una PTV mosaico que está constituida por más de una secuencia de aminoácidos o alternativamente comprende las mismas, preferentemente dos secuencias de aminoácidos, de proteínas de recubrimiento, mutantes o fragmentos de los mismos, de un fago de ARN.

En una realización muy preferente, la PTV está constituida por dos proteínas de recubrimiento diferentes de un fago de ARN o alternativamente comprende las mismas, dichas dos proteínas de recubrimiento tienen la secuencia de aminoácidos de las Sec. No. Id.: 1 y Sec. No. Id.: 2, o de las Sec. No. Id.: 6 y Sec. No. Id.: 7.

En realizaciones preferentes de la presente invención, la partícula de tipo viral de la presente invención está constituida por proteínas recombinantes de recubrimiento, mutantes o fragmentos de los mismos, del bacteriófago de ARN Qβ, fr, AP205 o GA, o alternativamente consiste esencialmente en las mismas, o alternativamente comprende las mismas. En una realización preferente, la PTV es de un bacteriófago de ARN, preferentemente de un bacteriófago de ARN Qβ, fr, AP205 o GA.

En una realización preferente, la PTV de la presente invención es una PTV de Qβ de fago de ARN. La cápside o partícula de tipo viral de Qβ mostró una estructura de cápside icosaédrica de tipo fago con un diámetro de 25 nm y simetría cuasi T=3. La cápside contiene 180 copias de la proteína de recubrimiento, que están enlazadas covalentemente en pentámeros y hexámeros a través de puentes disulfuro (Golmohammadi, R. y otros, Structure 4:543-5554 (1996)), lo que conduce a una notable estabilidad de la cápside Qβ. Las cápsides o PTV realizadas proteína de recubrimiento de Qβ recombinantes pueden contener, sin embargo, subunidades no conectadas a través de enlaces de disulfuro a otras subunidades dentro de la cápside, o incompletamente enlazadas. La cápside o PTV de Qβ muestra una inusual resistencia a disolventes orgánicos y agentes desnaturalizantes. Sorprendentemente, se ha observado que concentraciones de DMSO y acetonitrilo tan elevadas como del 30%, y concentraciones de guanidinio tan elevadas como de 1 M no afectan la estabilidad de la cápside. En particular, la elevada estabilidad de la cápside o PTV de Qβ es una característica ventajosa para su utilización en la inmunización y vacunación de mamíferos y seres humanos según la presente invención.

Se describen en el documento WO 02/056905 partículas de tipo viral de fagos de ARN adicionalmente preferentes, en particular de Qβ y fr, según la presente invención. Particularmente, el ejemplo18 del documento WO 02/056905 da una descripción detallada de la preparación de las partículas PTV a partir de Qβ.

En otra realización preferente, la PTV de la presente invención es una PTV del fago de ARN AP205. Las formas mutantes competentes en ensamblaje de PTV AP205, que incluyen la proteína de recubrimiento de AP205 con la sustitución de prolina en el aminoácido 5 por treonina, se pueden utilizar además en la práctica de la presente invención y conducen a otras realizaciones preferentes de la presente invención. El documento WO2004/007538 describe, en particular, en el ejemplo 1 y el ejemplo 2, la forma de obtener PTV de AP205 que comprende proteínas de recubrimiento, y en particular, la expresión y la purificación de las mismas. Las PTV de AP205 son altamente inmunogénicas, y se pueden enlazar con la Fel d1 de la presente invención para generar de forma típica y, preferentemente, construcciones de vacunas que muestran a la Fel d1 de la presente invención orientada de una manera repetitiva. Se obtiene una titulación elevada de anticuerpos en contra de la Fel d1 de la presente invención mostrada de este modo, lo que demuestra que las Fel d1 enlazadas de la presente invención son accesibles para interactuar con moléculas de anticuerpos y son inmunogénicas.

En una realización preferente, la PTV de la presente invención está constituida por una proteína de recubrimiento mutante de un virus o comprende la misma, preferentemente de un fago de ARN, en la que la proteína de recubrimiento mutante ha sido modificada por la eliminación de, como mínimo, un residuo de lisina por medio de sustitución y/o por medio de deleción. En otra realización preferente, la PTV de la presente invención está constituida por una proteína de recubrimiento de un virus mutante o comprende la misma, preferentemente un fago de ARN, en la que la proteína de recubrimiento mutante se ha modificado mediante la adición de, como mínimo, un residuo de lisina por medio de sustitución y/o por medio de inserción. La deleción, sustitución o adición de, como mínimo, un residuo de lisina permite variar el grado de acoplamiento, es decir, la cantidad de Fel d1 de la presente invención por subunidades de la PTV de un virus, preferentemente de un fago de ARN, en particular, para que coincida con los requisitos de la vacuna y se adapte a los mismos.

En una realización preferente, las composiciones y vacunas de la presente invención tienen una densidad de antígeno de 0,5 a 4,0. Tal como se utiliza en el presente texto, el término "densidad de antígeno", se refiere al número promedio de Fel d1 de la presente invención que está enlazado por subunidad, preferentemente por proteína de recubrimiento, de la PTV, y preferentemente de la PTV de un fago de ARN. De este modo, este valor se calcula como la media de todas las subunidades o monómeros de la PTV, preferentemente de la PTV de fago de ARN, en la composición o las vacunas de la presente invención.

Las PTV o cápsides de proteína de recubrimiento Qβ muestran un número definido de residuos de lisina en su superficie, con una topología definida con tres residuos de lisina que apuntan hacia el interior de la cápside y que interaccionan con el ARN y otros cuatro residuos de lisina expuestos hacia el exterior de la cápside.

Preferentemente el, como mínimo, un primer lugar de unión es un residuo de lisina, que apunta hacia el exterior de la PTV o que está en el mismo.

Las Qβ mutantes, cuyos residuos de lisina expuestos se reemplazan por argininas, se pueden utilizar para la presente invención. De este modo, en otra realización preferente de la presente invención, la partícula de tipo viral está constituida por proteínas de recubrimiento Qβ mutantes, consiste esencialmente en las mismas o alternativamente comprende las mismas. Preferentemente, estas proteínas de recubrimiento mutantes están constituidas por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo de a) Qβ-240 (Sec. No. Id.: 15, Lys13-Arg de la Sec. No. Id.: 1) b) Qβ-243 (Sec. No. Id.: 16, Asn10-Lys de Sec. No. Id.: 1), c) Qβ-250 (Sec. No. Id.: 17, Lys2-Arg de la Sec. No. Id.: 1) d) Qβ-251 (Sec. No. Id.: 18, Lys16-Arg de la Sec. No. Id.: 1), y e) Qβ-259" (Sec. No. Id.: 19, Lys2-Arg, Lys16-Arg de Sec. No. Id.: 1) o alternativamente comprenden las mismas. La construcción, expresión y purificación de las proteínas de recubrimiento Qβ mutantes, las PTV de proteínas de recubrimiento Qβ mutantes y las cápsides que se han indicado anteriormente, respectivamente, se describen en el documento WO 02/056905. En particular, se hace referencia al ejemplo 18 de la solicitud mencionada anteriormente.

En otra realización preferente de la presente invención, la partícula de tipo viral está constituida por la proteína de recubrimiento Qβ mutante, o mutantes o fragmentos de la misma, o alternativamente consiste esencialmente en la misma, o alternativamente comprende la misma, y la correspondiente proteína A1. En una realización adicionalmente preferente, la partícula de tipo viral está constituida por una proteína de recubrimiento mutante con una secuencia de aminoácidos Sec. No. Id.: 15, 16, 17, 18, ó 19 o alternativamente consiste esencialmente en la misma, o alternativamente comprende la misma, y la proteína A1 correspondiente.

Además, se ha demostrado que otras proteínas de recubrimiento de fagos de ARN se autoensamblan tras la expresión en un huésped bacteriano (Kastelein, R. A. Y otros, Gene 23:245-254 (1983), Kozlovskaya, T. M. y otros, Dokl. AKAD. Nauk SSSR 287:452-455 (1986), Adhin, M. R. y otros, Virology 170:238-242 (1989), Priano, C. y otros,

J. Mol. Biol. 249:283-297 (1995)). En particular, se han dado a conocer las propiedades biológicas y bioquímicas de GA (Ni, C. Z. y otros, Protein Sci. 5:2485-2493 (1996), Tars, K. y otros, J. Mol. Biol. 271:759-773 (1997)) y de fr (Pushko P. y otros, Prot. Eng. 6:883-891 (1993), Liljas, L. y otros J Mol. Biol. 244:279-290 (1994)). La estructura cristalina de varios bacteriófagos de ARN ha sido determinada (Golmohammadi, R. y otros, Structure 4:543-554 (1996)). Utilizando esta información, se pueden identificar los residuos expuestos en la superficie y, de este modo, las proteínas de recubrimiento de fago de ARN pueden ser modificadas de tal manera que uno o más residuos de aminoácidos reactivos pueden ser insertados por medio de inserción o sustitución. Otra ventaja de las PTV derivadas de fagos de ARN es su elevado rendimiento de expresión en bacterias, lo que permite la producción de grandes cantidades de material a un costo asequible.

En una realización preferente, la composición de la presente invención comprende, como mínimo, un antígeno, en el que dicho, como mínimo, un antígeno es una proteína Fel d1.

En una realización preferente, la proteína Fel d1 está constituida por una forma natural de Fel d1 o, alternativamente, comprende a la misma. La estructura primaria de la cadena 1 es la secuencia de la Sec. No. Id.

22. Variantes notificadas de la cadena 1 son lys29-Arg o Asn, Ser-Va133, Va160-Leu. La estructura primaria de la cadena 2 es la secuencia de la Sec. No. Id. 23, 25 ó 26. Variantes notificadas de cadena 2 son Cys7-Phe, Phe15-Thr, Asn19-Ser, Leu-Gly20, Ile55-Val, Lys-Arg57, Val58-Phe de la Sec. No. Id.: 23, 25 o 26. Otras variantes de la cadena 2 son Glu69-Val, Tyr70-Asp, Met72-Thr, Gln-77-Glu y Asn86-Lys de la Sec. No. Id: 25; Met74-Thr, Gln79-Glu y Asn88-Lys de Sec. No. Id.: 23. (Griffith I. J. y otros, Gene 113:263-268 (1992); Morgenstern J. P. y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:9690-9694 (1991). Duffort O. A. y otros Mol. Immunol. 28:301-309 (1991); Leitermann K. y otros, J. Allergy Clin. Immunol. 74:147-153 (1984); Kristensen, A. K. y otros (1997) Biol. Chem. 378, 899-908). La Fel d1 de origen natural se obtiene mediante la purificación a partir de, por ejemplo, saliva de gato, caspa de gato, polvo de la casa de una casa donde vive un gato, etc.

En una realización preferente, la Fel d1 de la presente invención es una proteína Fel d1 recombinante o un fragmento de Fel d1 recombinante. Tal como se utiliza en el presente texto, la proteína Fel d1 recombinante o el fragmento de Fel d1 recombinante, se refiere a una proteína Fel d1 o un fragmento Fel d1 que se obtiene mediante un procedimiento que comprende, como mínimo, una etapa de tecnología de ADN recombinante. Los términos "proteína Fel d1 recombinante o fragmento de Fel d1 recombinante" y "proteína Fel d1 producida de forma recombinante o fragmento de Fel d1 producido de forma recombinante" se utilizan de forma intercambiable en el presente texto y deben tener el significado idéntico. La proteína Fel d1 o el fragmento recombinante pueden ser producidos en cualquiera de los sistemas de expresión procariotas, tales como E. coli (documento WO 2004/094639) o en sistemas de expresión eucariotas, tales como baculovirus (documento WO 00/20032). Seppala y otros da a conocer la expresión de la cadena 1 y la cadena 2 de la Fel d1 simultáneamente por el promotor dicistrónico en baculovirus (J. Biol. Chem. noviembre de 2004). La proteína Fel d1 o el fragmento producidos de forma recombinante pueden estar glicosilados o no glicosilados, dependiendo de la célula huésped utilizada para producir la proteína recombinante.

En una realización, la proteína Fel d1 recombinante comprende la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1 o, alternativamente consiste en las mismas, en la que dicha cadena 1 de la Fel d1 se asocia con la cadena 2 de la Fel d1 exclusivamente mediante enlaces no covalentes, tales como interacciones hidrófobas.

En una realización preferente, la proteína Fel d1 recombinante comprende la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1 o, alternativamente consiste en las mismas, en la que dicha cadena 1 de la Fel d1 se asocia con la cadena 2 de la Fel d1 mediante, como mínimo, un enlace covalente. En una realización preferente el, como mínimo, un enlace covalente es un enlace no peptídico, en el que dicho enlace no peptídico es un enlace disulfuro o en el que dicho enlace no peptídico es preferentemente un enlace disulfuro. Por ejemplo, la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1 puede expresarse por separado y luego se combinan en condiciones que permitan la formación de los enlaces disulfuro correctos, tales como un método de reorganización o “reshuffling”. Alternativamente, la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1 se pueden expresar de forma simultánea en un huésped, por ejemplo, mediante la clonación de los genes que codifican la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1, respectivamente, bajo dos promotores en un plásmido. En el sistema de expresión eucariótico, la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1 se pueden transcribir en un ARNm y traducir por separado mediante lugares internos de entrada al ribosoma (IRES).

En una realización preferente, la proteína Fel d1 comprende una proteína de fusión o, alternativamente, consiste en la misma, en la que dicha proteína de fusión comprende la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1. En una realización preferente, dicha cadena 1 de la Fel d1 y dicha cadena 2 de la Fel d1 se fusionan directamente a través de un enlace peptídico, que enlaza el extremo N-terminal de una cadena con el extremo C-terminal de la otra cadena. En otra realización preferente, dicha cadena 1 de la Fel d1 y dicha cadena 2 de la Fel d1 se fusionan a través de un espaciador, que une el extremo N-terminal de una cadena con el extremo C-terminal de la otra cadena. Preferentemente, dicho espaciador tiene 1-30, preferentemente 1-25, preferentemente 1-20, preferentemente 1-15, preferentemente 1-9, preferentemente 1-5, preferentemente 1-3 aminoácidos. Alternativamente, dicho espaciador tiene 10-30, preferentemente 10-25, más preferentemente 10-20, más preferentemente 13-20, más preferentemente 15-20, más preferentemente 13-17, más preferentemente 15-17 aminoácidos. Preferentemente, dicho espaciador se compone de una secuencia de aminoácidos que tiene 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ó 20 residuos de aminoácidos. En una realización preferente, dicho espaciador tiene 15 aminoácidos. En una realización adicionalmente preferente, dicho espaciador es (GGGGS)3.

En una realización preferente, la proteína de fusión está constituida por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende: (a) Sec. No. Id.: 24; (b) la Sec. No. Id.: 54; (c) Sec. No. Id.: 55; (d) Sec. No. Id.: 56, y (e) Sec. No. Id.: 57.

En una realización preferente, dicha cadena 2 de la Fel d1 se fusiona a través de su extremo C-terminal al extremo N-terminal de la cadena 1 de la Fel d1 bien directamente o bien a través de un espaciador. En una realización adicionalmente preferente, dicha proteína Fel d1 está constituida por la secuencia de aminoácidos Sec. No. Id.: 24 o alternativamente comprende la misma.

El documento WO 2004/094639 da a conocer una Fel d1 recombinante plegada con propiedades moleculares y biológicas similares a su contratipo natural y, específicamente, un gen sintético que codifica la fusión directa de la cadena 2 de la Fel d1 a través del extremo N-terminal a la cadena 1. La expresión en E. coli dio como resultado un homodímero asociado no covalentemente con un peso molecular aparente de 30 KDa definido por cromatografía de exclusión por tamaños, y cada subunidad de 19.177 Da mostró un patrón disulfuro idéntico al encontrado en la Fel d1 natural, y que tenía un plegado idéntico de la Fel d1 natural y recombinante. La Fel d1 recombinante reaccionó de manera similar frente a IgE de sueros de pacientes alérgicos a los gatos que la Fel d1 natural. De este modo, esta proteína Fel d1 de fusión imita la antigenicidad de la Fel d1 natural.

En una realización preferente, la cadena 1 de la Fel d1 se fusiona a través de su extremo C-terminal al extremo Nterminal de la cadena 2 de la Fel d1 bien sea directamente o bien a través de un espaciador.

En una realización preferente, la cadena 1 de la Fel d 1 está constituida por la secuencia Sec. No. Id.: 22 o una secuencia homóloga a la misma o, alternativamente, comprende las mismas, en la que dicha secuencia homóloga tiene una identidad con la Sec. No. Id.: 22 mayor que el 80%, preferentemente mayor que el 90%, o aún más preferentemente mayor que el 95%.

En una realización preferente, dicha cadena 2 de la Fel d1 está constituida por la secuencia de la Sec. No. Id.: 23, Sec. No. Id.: 25 o Sec. No. Id.: 26, o una secuencia homóloga a las mismas o, alternativamente, comprende las mismas, en la que dicha secuencia homóloga tiene una identidad con la Sec. No. Id.: 23, Sec. No. Id.: 25 o Sec. No. Id.: 26 mayor que el 80%, preferentemente mayor que el 90%, y aún más preferentemente mayor que el 95%.

En una realización preferente, la proteína Fel d1 es una proteína Fel d1 recombinante en la que, como mínimo, se interrumpe un enlace disulfuro, preferentemente por mutación, más preferentemente por sustitución conservadora, tales como Cys a Ser. Se han identificado tres puentes disulfuro intercatenarios que enlazan los dos péptidos en la Fel d1 nativa, es decir, Cys3(1)-Cys73(2), Cys44(1)-Cys48(2) y Cys70(1)-Cys7(2), lo que sugiere una orientación

anti-paralela de los péptidos Fel d1. (Kristensen, A. K. y otros (1997) Biol. Chem. 378, 899-908). En una realización preferente, se interrumpe uno de estos enlaces disulfuro de la proteína Fel d1. En una realización adicionalmente preferente, se interrumpen dos de estos enlaces disulfuro de la proteína Fel d1. En una realización aún más preferente, se interrumpen los tres enlaces disulfuro de la proteína Fel d1. En una realización preferente, se elimina

o se muta la Cys70 de la cadena 1. En otra realización preferente, se elimina o muta la Cys73 de la cadena. En una realización preferente, dicha proteína Fel d1 es una proteína de fusión que comprende la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1 fusionadas bien directamente o bien a través de un espaciador, en la que los tres enlaces disulfuro se interrumpen. En una realización adicionalmente preferente, dicha proteína Fel d1 está constituida por la secuencia de aminoácidos tal como la Sec. No. Id.: 24, 55 ó 57 o, alternativamente comprende las mismas, en la que se eliminan por sustitución o por deleción, como mínimo, una, preferentemente, como mínimo, tres, aún más preferentemente, como mínimo, cinco cisteínas.

En una realización preferente, el antígeno de la presente invención está constituido por un fragmento de Fel d1, o alternativamente comprende el mismo. Es conocido que la posesión de inmunogenicidad generalmente no requiere de la longitud completa de una proteína y que, por lo general, una proteína contiene más de un epítopo antigénico, es decir, lugar antigénico. Un fragmento o un péptido corto pueden ser suficientes para contener, como mínimo, un lugar antigénico que se puede enlazar inmunoespecíficamente a un anticuerpo o a un receptor de células T en el contexto de una molécula MHC. El lugar o los lugares antigénicos pueden ser determinados por diferentes técnicas conocidas generalmente por la persona experta en la técnica. Se puede realizar mediante la alineación de secuencias y predicción de la estructura. A modo de ejemplo, se puede predecir posibles hélices α, giros, enlaces disulfuro inter e intracatenarios, etc. utilizando un programa tal como Rasmol. Se pueden predecir además secuencias que están ocultas dentro de la molécula o secuencias que están expuestas en la superficie de la molécula. Es más probable que las secuencias expuestas en la superficie de la molécula comprendan lugar o lugares antigénicos naturales y, de este modo, son útiles en la inducción de anticuerpos terapéuticos. Después de que se ha determinado una secuencia peptídica superficial, el lugar antigénico dentro de esta secuencia se puede definir posteriormente mediante, por ejemplo, el método de mutagénesis exhaustiva (tal como mutagénesis de barrido de alanina, Cunningham B. C., Wells J. A. Science 1989 2 de junio, 244 (4908): 1081-5). Brevemente, los aminoácidos dentro de esta secuencia se mutan a alanina uno por uno y los aminoácidos cuyas mutaciones de alanina muestran respectivamente una unión reducida a un anticuerpo (dirigido contra la secuencia de tipo salvaje) o pierden totalmente la unión son componentes probables del lugar antigénico. Otro método para determinar lugar o lugares antigénicos es generar péptidos superpuestos que cubren la secuencia de longitud completa de la Fel d1 (Geysen, PNAS Vol 81: 3. 998-4.002, (1984) y Slootstra, J. W. y otros, (1996) Mol. Divers. 1, 87-96).

En una realización preferente, el antígeno de la presente invención está constituido por como mínimo, uno, preferentemente, como mínimo, dos epítopos de Fel d1, aún más preferentemente, como mínimo, un epítopo deriva de la cadena 1 de la Fel d1 y, como mínimo, un epítopo deriva de cadena de 2 de la Fel d1 o, alternativamente, comprende los mismos.

Los epítopos reactivos a células T de la Fel d1 han sido mapeados para la proteína Fel d1 y se han descrito en la técnica anterior, por ejemplo en la patente de EE.UU. No. 6.120.769, en el cuarto párrafo de la columna 14, en la columna 130 y 131 de la patente de EE.UU. No. 6.025.162. En una realización preferente, el epítopo de células T de la Fel d1 se selecciona de un grupo que comprende: Sec. No. Id.: 27-32.

La presente invención da a conocer un método para producir la composición de la presente invención que comprende (a) proporcionar una PTV con, como mínimo, un primer lugar de unión; (b) proporcionar, como mínimo, un antígeno, en el que dicho antígeno es una proteína Fel d1 o un fragmento de Fel d1, con, como mínimo, un segundo lugar de unión, y (c) combinar dicha PTV y dicho, como mínimo, un antígeno para producir dicha composición, en la que dicho, como mínimo, un antígeno y dicha PTV están enlazados a través del primer y del segundo lugar de unión. En una realización preferente, el suministro del, como mínimo, un antígeno, es decir, una proteína Fel d1 o un fragmento de Fel d1 con el, como mínimo, un segundo lugar de unión se realiza por medio de la expresión, preferentemente mediante la expresión en un sistema bacteriano, preferentemente en E. coli. Por lo general, se añaden etiquetas, tales como etiqueta His, etiqueta Myc para facilitar el proceso de purificación. En otro enfoque, en particular para fragmentos de la Fel d1 con no más de 50 aminoácidos, éstos pueden ser sintetizados químicamente.

En una realización preferente de la presente invención, la PTV con, como mínimo, un primer lugar de unión está enlazada a la Fel d1 de la presente invención con, como mínimo, un segundo lugar de unión a través de, como mínimo, un enlace peptídico. El gen que codifica la Fel d1 de la presente invención, preferentemente el fragmento de Fel d1, más preferentemente un fragmento de no más de 50 aminoácidos, aún más preferentemente de menos de 30 aminoácidos, se liga dentro del marco de lectura (“in-frame”), bien internamente o bien, preferentemente, a los extremos N-o C-terminales del gen que codifica la proteína de recubrimiento de la PTV. Se han descrito realizaciones de la utilización del antígeno de la presente invención para el recubrimiento de la proteína, mutantes o fragmentos de las mismas, a una proteína de recubrimiento de un virus, en el documento WO 2004/009124 de la página 62 línea 20 a la página 68 línea 17.

En una realización preferente, un fragmento de Fel d1 se fusiona con el extremo N- o C-terminal de una proteína de recubrimiento, mutantes o fragmentos de la misma, de un fago de ARN AP205. En una realización adicionalmente preferente, la proteína de fusión comprende además un espaciador, en el que dicho espaciador se fusiona con la proteína de recubrimiento, fragmentos o mutantes de las mismas, de AP205 y un fragmento de Fel d1.

En una realización preferente de la presente invención, la composición está constituida por una partícula de tipo viral o, alternativamente comprende la misma con, como mínimo, un primer lugar de unión unido a, como mínimo, una Fel d1 de la presente invención con, como mínimo, un segundo lugar de unión a través de, como mínimo, un enlace covalente, preferentemente el enlace covalente es un enlace no peptídico. En una realización preferente de la presente invención, el primer lugar de unión comprende, o preferentemente es, un grupo amino, preferentemente el grupo amino de un residuo de lisina. En otra realización preferente de la presente invención, el segundo lugar de unión comprende o, preferentemente es un grupo sulfhidrilo, preferentemente un grupo sulfhidrilo de una cisteína.

En una realización muy preferente de la presente invención, el, como mínimo, un primer lugar de unión es un grupo amino, preferentemente un grupo amino de un residuo de lisina y el, como mínimo, un segundo lugar de unión es un grupo sulfhidrilo, preferentemente un grupo sulfhidrilo de una cisteína.

En una realización preferente de la presente invención, la Fel d1 de la presente invención está relacionada con la PTV a través de reticulación química, de forma típica y, preferentemente, mediante la utilización de un agente de reticulación heterobifuncional. En realizaciones preferentes, el agente de reticulación heterobifuncional contiene un grupo funcional que puede reaccionar con los primeros lugares preferentes de unión, preferentemente con el grupo amino, más preferentemente con los grupos amino del o los residuos de lisina de la PTV, y un grupo funcional adicional que puede reaccionar con el segundo lugar de unión preferente, es decir, con el grupo sulfhidrilo, preferentemente del o los residuos de cisteína inherentes a la Fel d1 de la presente invención o que se añaden artificialmente a la misma, y que opcionalmente además se convierten en disponibles para la reacción por reducción. Son conocidos en la técnica varios agentes de reticulación heterobifuncionales. Entre estos se incluyen los agentes de reticulación preferentes SMPH (Pierce), Sulfo-MBS, Sulfo-EMCS, Sulfo-GMBS, Sulfo-SIAB, Sulfo-SMPB, Sulfo-SMCC, SVSB, SIA y otros agentes de reticulación disponibles, por ejemplo de Pierce Chemical Company, y que tienen un grupo funcional reactivo frente grupos amino y un grupo funcional reactivo frente a grupos sulfhidrilo. Todos los agentes de reticulación mencionados conducen a la formación de un enlace amida después de la reacción con el grupo amino y a un enlace tioéter con los grupos sulfhidrilo. Otra clase de agentes de reticulación adecuados en la práctica de la presente invención se caracterizan por la introducción de un enlace disulfuro entre la Fel d1 de la presente invención y la PTV después del acoplamiento. Entre los agentes de reticulación preferentes que pertenecen a esta clase se incluyen, por ejemplo, SPDP y Sulfo-LC-SPDP (Pierce).

En una realización preferente, la composición de la presente invención comprende además un conector. El diseño de un segundo lugar de unión en la Fel d1 de la presente invención se logra mediante la asociación de un conector, que contiene preferentemente, como mínimo, un aminoácido adecuado como segundo lugar de unión según las divulgaciones de la presente invención. Por lo tanto, en una realización preferente de la presente invención, un conector está asociado a la Fel d1 de la presente invención mediante, como mínimo, un enlace covalente, preferentemente mediante, como mínimo uno, típicamente un enlace peptídico. Preferentemente, el conector está constituido por el segundo lugar de unión, o alternativamente comprende el mismo. En una realización adicionalmente preferente, el conector comprende un grupo sulfhidrilo, preferentemente de un residuo de cisteína. En otra realización preferente, el conector de aminoácidos es un residuo de cisteína.

La selección de un conector será dependiente de la naturaleza de la Fel d1 de la presente invención, de sus propiedades bioquímicas, tales como pI, distribución de carga y glicosilación. En general, están favorecidos conectores de aminoácidos flexibles. En una realización adicionalmente preferente de la presente invención, el conector se compone de aminoácidos, en los que preferentemente además el conector comprende, como máximo, 25, preferentemente, como máximo, 20, más preferentemente, como máximo, 15 aminoácidos. En una realización aún más preferente de la presente invención, el conector de aminoácidos contiene no más de 10 aminoácidos. Las realizaciones preferentes del conector se seleccionan del grupo que comprende: (a) CGG; (b) gamma 1-conector Nterminal (por ejemplo, CGDKTHTSPP, Sec. No. Id.: 58); (c) gamma 3-conector N-terminal (por ejemplo, CGGPKPSTPPGSSGGAP, Sec. No. Id.: 69); (d) regiones bisagra de Ig; (e) conectores de glicina N-terminales (por ejemplo, GCGGGG, Sec. No. Id.: 59); (f) (G)kC(G)n con n=0-12 y k=0-5; (g) conectores glicina-serina N-terminales ((GGGGS)n, n=1-3 con una cisteína adicional, (por ejemplo, Sec. No. Id.: 60, que corresponde a una realización en la que n=1), (h) (G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n con n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2 (por ejemplo, Sec. No. Id.: 61, que corresponde a una realización en la que n=1, k=1, l=1 y m=1); (i) GGC; (k) GGC-NH2; (1) gamma 1-conector Cterminal (por ejemplo, DKTHTSPPCG, Sec. No. Id.: 62); (m) gamma 3-conector C-terminal (por ejemplo, PKPSTPPGSSGGAPGGCG, Sec. No. Id.: 63); (n) conectores de glicina C-terminales (GGGGCG, Sec. No. Id.: 64);

(o) (G)nC(G)k con n=0-12 y k=0-5 ; (p) conectores glicina-serina C-terminales ((SGGGG)n n=1-3 con una cisteína adicional, (por ejemplo, Sec. No. Id.: 65, que corresponde a una realización en la que n=1)); (q) (G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k con n=0-3, k=0-5, m=0-10, l=0-2, y o=0-8 (por ejemplo, Sec. No. Id.: 66, que corresponde a una realización en la que n=1, k=1, l=1, o=1 y m=1). En una realización adicionalmente preferente se añade el conector al extremo N-terminal de la Fel d1 de la presente invención. En otra realización preferente de la presente invención, se añade el conector al extremo C-terminal de la Fel d1 de la presente invención.

Los conectores preferentes según la presente invención son conectores de glicina (G)n que contiene además un residuo de cisteína como segundo lugar de unión, tales como el conector de glicina N-terminal (GCGGGG) y el conector glicina C-terminal (GGGGCG). Otras realizaciones preferentes son el conector de glicina-lisina C-terminal (GGKKGC, Sec. No. Id.: 67) y el conector de glicina-lisina N-terminal (CGKKGG, Sec. No. Id.: 68), los conectores GGCG, GGC o GGC-NH2 ("NH2" significa amidación) en el extremo C-terminal del péptido o el CGG en su extremo N-terminal. En general, se insertan residuos de glicina entre los aminoácidos voluminosos y la cisteína que se va a utilizar como segundo lugar de unión, para evitar el impedimento estérico potencial del aminoácido voluminoso en la reacción de acoplamiento.

En una realización preferente, el conector se fusiona con el extremo N-terminal de la proteína Fel d1 o fragmento de la Fel d1. En una realización adicionalmente preferente, el conector es GCGG. En otra realización preferente, el conector se fusiona con el extremo C-terminal de la proteína Fel d1 o fragmento de la Fel d1. En una realización adicionalmente preferente, el conector es GGC. En el caso de que la proteína Fel d1 o el fragmento de la Fel d1 comprenda dos cadenas de polipéptidos, dicha proteína Fel d1 o fragmento de Fel d1 tiene dos extremos Nterminales y dos C-terminales. El conector puede estar fusionado a los dos extremos N-terminales o a ambos extremos C-terminales. Preferentemente, el conector se fusiona sólo a uno de los dos extremos N-terminales o sólo a uno de los dos extremos C-terminales.

El enlace de la Fel d1 de la presente invención a la PTV mediante la utilización de un agente de reticulación heterobifuncional de acuerdo con los métodos preferentes descritos anteriormente, permite el acoplamiento de la Fel d1 de la presente invención a la PTV de una manera orientada. Otros métodos de enlace de la Fel d1 de la presente invención a la PTV incluyen métodos en los que la Fel d1 de la presente invención se reticula con la PTV, utilizando la carbodiimida EDC y NHS. Además, la Fel d1 de la presente invención se puede, en primer lugar, tiolar, a través de la reacción, por ejemplo, con SATA, SATP o iminotiolano. A continuación, la Fel d1 de la presente invención, después de la desprotección si es necesario, se puede acoplar a la PTV de la siguiente manera. Después de la separación del exceso de reactivo de tiolación, la Fel d1 de la presente invención se hace reaccionar con la PTV, previamente activada con un agente de reticulación heterobifuncional que comprende un resto de cisteína reactivo, y que, por lo tanto muestra, como mínimo, uno o varios grupos funcionales reactivos frente a los residuos de cisteína, con los que la Fel d1 tiolada de la presente invención puede reaccionar, tal como se ha descrito anteriormente. Opcionalmente, se incluyen cantidades bajas de un agente reductor en la mezcla de reacción. En otros métodos, la Fel d1 de la presente invención se enlaza a la PTV, utilizando un agente de reticulación homobifuncional, tal como glutaraldehído, DSG, BM[PEO]4, BS3, (Pierce) u otro tipo de agentes de reticulación homobifuncionales conocidos con grupos funcionales reactivos frente a los grupos amina o grupos carboxilo de la PTV.

En otras realizaciones de la presente invención, la composición está constituida por una partícula de tipo viral o, alternativamente comprende esencialmente la misma, enlazada a la Fel d1 de la presente invención a través de interacciones químicas, en las que, como mínimo, una de estas interacciones no es un enlace covalente. Por ejemplo, el enlace de la PTV a la Fel d1 de la presente invención se puede efectuar mediante biotinilación de la PTV y expresión de la Fel d1 de la presente invención como una proteína fusionada con estreptavidina.

Una o varias moléculas de antígeno, es decir, la Fel d1 de la presente invención, se pueden unir a una subunidad de la PTV, preferentemente a las proteínas de recubrimiento de fago de ARN, preferentemente a través de los residuos de lisina expuestos en las proteínas de recubrimiento de fago de ARN de la PTV, si está permitido estéricamente. De este modo, una característica específica de la PTV de fagos de ARN y, en particular, de la PTV de proteína de recubrimiento Qβ, es la posibilidad de acoplar varios antígenos por subunidad. Esto permite la generación de una matriz de antígeno densa.

En realizaciones muy preferentes de la presente invención, la Fel d1 de la presente invención está enlazada a través de un residuo de cisteína, que se ha añadido bien al extremo N-terminal o bien al extremo C-terminal de la Fel d1 de la presente invención, o un residuo natural de cisteína dentro de la Fel d1 de la presente invención, a residuos de lisina de las proteínas de recubrimiento de las PTV de fagos de ARN, y en particular a la proteína de recubrimiento de Qβ.

Tal como se ha descrito anteriormente, cuatro residuos de lisina están expuestos en la superficie de la PTV de la proteína de recubrimiento Qβ. De forma típica y, preferentemente, estos residuos son derivatizados por reacción con una molécula de reticulación. En el caso en el que no todos los residuos de lisina expuestos se puedan acoplar a un antígeno, los residuos de lisina que han reaccionado con el agente de reticulación se dejan con una molécula de agente de reticulación unido al grupo amino en ε después de la etapa de derivación. Esto conduce a la desaparición de una o varias cargas positivas, lo que puede ser perjudicial para la solubilidad y estabilidad de la PTV. Mediante la sustitución de algunos de los residuos de lisina con argininas, tal como en las proteínas de recubrimiento Qβ mutantes dadas a conocer, los presentes inventores evitan la desaparición excesiva de cargas positivas ya que los residuos de arginina no reaccionan con los agentes de reticulación preferentes. Por otra parte, la sustitución de los residuos de lisina por residuos de arginina puede conducir a matrices de antígenos más definidas, dado que un menor número de lugares están disponibles para la reacción con el antígeno.

Por consiguiente, los residuos de lisina expuestos se sustituyeron por argininas en las siguientes de proteínas de recubrimiento Qβ mutantes: Qβ-240 (Lys13-Arg; Sec. No. Id.: 15), Qβ-250 (Lys 2-Arg, Lys13-Arg; Sec. No. Id.: 17), Qβ-259 (Lys 2-Arg, Lys16-Arg; Sec. No. Id.: 19) y Qβ-251; (Lys16-Arg, Sec. No. Id.: 18). En una realización adicional, los presentes inventores dan a conocer proteína de recubrimiento Qβ mutante con un residuo de lisina adicional Qβ-243 (Asn10-Lys; Sec. No. Id.: 16), adecuado para la obtención de matrices de antígenos de densidad aún más elevada.

En una realización preferente de la presente invención, la PTV de la presente invención se produce de manera recombinante por un huésped y en la que dicha PTV está esencialmente libre de ARN del huésped, preferentemente ácidos nucleicos del huésped. En una realización adicionalmente preferente, la composición comprende además, como mínimo, una macromolécula polianiónica unida a la PTV, preferentemente empaquetada dentro o encerrada en la misma. En una realización aún más preferente, la macromolécula polianiónica es ácido poliglutámico y/o ácido poliaspártico.

Esencialmente libre de ARN del huésped, preferentemente de ácidos nucleicos de huésped: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "esencialmente libre de ARN del huésped, preferentemente de ácidos nucleicos de huésped" se refiere a la cantidad de ARN del huésped, preferentemente de ácidos nucleicos del huésped, que comprende la PTV, que es de forma típica y, preferentemente, menor que 30 μg, preferentemente menor de 20 μg, más preferentemente menor de 10 μg, aún más preferentemente menor de 8 μg, aún más preferentemente menor de 6 μg, aún más preferentemente menor de 4 μg, lo más preferente menor de 2 μg, por mg de PTV. Huésped, tal como se utiliza en el contexto mencionado anteriormente, se refiere al huésped en el que se produce la PTV de forma recombinante. Los métodos convencionales de determinación de la cantidad de ARN, preferentemente ácidos nucleicos, son conocidos por la persona técnica en la materia. El método típico y preferente para determinar la cantidad de ARN, preferentemente ácidos nucleicos, según la presente invención se describe en el Ejemplo 17 del documento WO 2006/037787. De forma típica y, preferentemente, se utilizan condiciones idénticas, similares o análogas para la determinación de la cantidad de ARN, preferentemente ácidos nucleicos, para composiciones de la presente invención que comprenden PTV diferentes a Qβ. Las modificaciones de las condiciones finalmente necesarias están dentro del conocimiento de la persona técnica en la materia. De forma típica y, preferentemente, el valor numérico de las cantidades determinadas debe entenderse, como que comprende los valores que tienen una desviación de ± 10%, preferentemente que tienen una desviación de ± 5%, del valor numérico indicado.

Macromolécula polianiónica: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "macromolécula polianiónica", se refiere a una molécula de masa molecular relativamente elevada que comprende grupos repetitivos de carga negativa, la estructura de la cual comprende esencialmente la repetición múltiple de unidades derivadas, real o conceptualmente, de moléculas de masa molecular relativamente baja. Una macromolécula polianiónica debe tener un peso molecular de, como mínimo, 2.000 Dalton, más preferentemente de, como mínimo, 3.000 Dalton y aún más preferentemente de, como mínimo, 5.000 Dalton. El término "macromolécula polianiónica" tal como se utiliza en el presente texto, se refiere de forma típica y, preferentemente, a una molécula que no es capaz de activar los receptores de tipo toll. De este modo, el término "macromolécula polianiónica" excluye de forma típica y, preferentemente, receptores de ligandos de tipo toll y, aún más preferentemente, excluye además las sustancias inmunoestimuladoras, tales como receptores de ligandos tipo toll, ácidos nucleicos inmunoestimuladoras, y lipopolisacáridos (LPS). Más preferentemente, el término "macromolécula polianiónica" tal como se utiliza en el presente texto, se refiere a una molécula que no es capaz de inducir la producción de citoquinas. Aún más preferentemente, el término "macromolécula polianiónica" excluye las sustancias inmunoestimuladoras. Tal como se utiliza en el presente texto, el término "sustancia inmunoestimuladora" se refiere a una molécula que es capaz de inducir y/o mejorar la respuesta inmune específica contra el antígeno comprendido en la presente invención.

ARN del huésped, preferentemente ácidos nucleicos del huésped: Tal como se utiliza en el presente texto, el término "ARN de huésped, preferentemente ácidos nucleicos del huésped" o el término "ARN de huésped, preferentemente ácidos nucleicos del huésped, con estructura secundaria", se refiere al ARN, o preferentemente a ácidos nucleicos, que son sintetizados originalmente por el huésped. Sin embargo, el ARN, preferentemente ácidos nucleicos, se pueden someter a cambios químicos y/o físicos durante el procedimiento de reducción o eliminación de la cantidad de ARN, preferentemente ácidos nucleicos, de forma típica y, preferentemente, por medio de los métodos de la presente invención, por ejemplo, el tamaño de los ARN, preferentemente ácidos nucleicos, puede acortarse o la estructura secundaria de los mismos pueden ser alterada. Sin embargo, incluso estos ARN o ácidos nucleicos resultantes se siguen considerando como ARN del huésped, o ácidos nucleicos del huésped.

Los métodos para determinar la cantidad de ARN y para reducir la cantidad de ARN comprendida por la PTV se han dado a conocer en el documento WO 2006/037787. Reducir o eliminar la cantidad de ARN del huésped, preferentemente ácido nucleico del huésped, minimiza o reduce las respuestas no deseadas de las células T, tales como la respuesta inflamatoria de la células T y la respuesta citotóxica de las células T y otros efectos secundarios no deseados, tales como fiebre, manteniendo al mismo tiempo una fuerte respuesta de anticuerpos específica contra la Fel d1.

En una realización preferente, la presente invención da a conocer un método de preparación de las composiciones de la presente invención y PTV de un bacteriófago de ARN -Fel d1 de la presente invención, en el que dicha PTV se produce de manera recombinante por un huésped y en el que dicha PTV está esencialmente libre de ARN del huésped, preferentemente de ácidos nucleicos del huésped, que comprende las etapas de: a) producir de forma recombinante una partícula de tipo viral (PTV) con, como mínimo, un primer lugar de unión mediante un huésped, en el que dicha PTV comprende proteínas de recubrimiento, variantes o fragmentos de las mismas, de un bacteriófago de ARN; b) desensamblar dicha partícula de tipo viral a dichas proteínas de recubrimiento, variantes o fragmentos de las mismas, de dicho bacteriófago de ARN; c) purificar dichas proteínas de recubrimiento, variantes o fragmentos de las mismas; d) volver a ensamblar dichas proteínas de recubrimiento, variantes o fragmentos de las mismas purificadas, de dicho bacteriófago de ARN en una partícula de tipo viral, en la que dicha partícula de tipo viral está esencialmente libre de ARN del huésped, preferentemente de ácidos nucleicos del huésped y e) enlazar, como mínimo, un antígeno de la presente invención con, como mínimo, un segundo lugar de unión a dicha PTV obtenida en la etapa (d). En una realización adicionalmente preferente, el reensamblaje de dichas proteínas de recubrimiento, variantes o fragmentos purificados de las mismas, se efectúa en presencia de, como mínimo, una macromolécula polianiónica.

En una realización preferente, la composición de la presente invención comprende además, como mínimo, una sustancia inmunoestimuladora capaz de inducir y/o potenciar una respuesta inmune. Preferentemente, la sustancia inmunoestimuladora es un ligando de receptor de tipo Toll, seleccionado preferentemente del grupo que comprende:

(a) ácidos nucleicos inmunoestimuladores; (b) peptidoglicanos; (c) lipopolisacáridos; (d) ácidos lipoteicónicos; (e) compuestos de imidazoquinolina; ( f) flagelinas; (g) lipoproteínas; (h) moléculas orgánicas inmunoestimuladoras; (i) oligonucleótidos no metilados que contienen CpG y (j) cualquiera de las mezclas de sustancias de (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) e (i).

En una realización adicionalmente preferente, el ácido nucleico inmunoestimulador se selecciona preferentemente del grupo que comprende: (a) un ácido nucleico de origen bacteriano; (b) un ácido nucleico de origen viral; (c) un ácido nucleico que comprende un motivo CpG no metilado; (d) un ARN de doble cadena; (e) un ARN de cadena sencilla, y (g) un ácido nucleico libre de motivos CpG no metilados. Ácidos nucleicos inmunoestimuladoras que no contienen el motivo CpG no metilado se han descrito en la técnica anterior, por ejemplo, en el documento WO01/22972. Tal como se utiliza en el presente texto, el término "ácido nucleico", se refiere a una molécula compuesta de monómeros enlazados de forma covalente y lineal (nucleótidos). Indica una cadena molecular de nucleótidos y no se refiere a una longitud específica del producto. De este modo, los oligonucleótidos se incluyen dentro de la definición de ácido nucleico. De forma típica y, preferentemente, el enlace entre los nucleótidos es un enlace fosfodiéster. Los ácidos nucleicos que comprenden modificaciones de enlaces, por ejemplo, enlace fosforotioato, están también abarcados por la presente invención.

En una realización preferente, la sustancia inmunoestimuladora se mezcla con la PTV recombinante. En otra realización adicionalmente preferente, la sustancia inmunoestimuladora se enlaza a la PTV de la presente invención, preferentemente se empaqueta en el interior de la misma.

Las descripciones detalladas de sustancias inmunoestimuladoras, en particular de ácidos nucleicos inmunoestimuladores, más en particular oligonucleótidos que comprenden CpG no metilado se han descrito en los documentos WO 03/024480, 03/024481 y WO 2004/084940. Los métodos de mezcla de las sustancias inmunoestimuladoras con la PTV-antígeno se han dado a conocer en el documento WO 03/024480. Los métodos de empaquetado de las sustancias inmunoestimuladoras dentro de la PTV se han dado a conocer en el documento WO 03/024481.

De modo general, la PTV puede inducir y/o mejorar el sistema inmunológico. Sin embargo, el término "sustancia inmunoestimuladora", tal como se utiliza en el contexto de la presente solicitud, se refiere a una sustancia inmunoestimuladora que no es la PTV que se utiliza para las composiciones de la presente invención, sino que se utiliza además de dicha PTV.

La inclusión de sustancias inmunoestimuladoras, preferentemente de ácidos nucleicos inmunoestimuladores en la composición de la presente invención puede impulsar las respuestas inmunes hacia las respuestas Th1 y con ello la supresión de las respuestas Th2.

En un aspecto, la presente invención da a conocer una vacuna que comprende la composición de la presente invención. En un aspecto, la presente invención da a conocer una vacuna que comprende la composición de la presente invención y un tampón adecuado. En una realización preferente, la composición de vacuna comprende además, como mínimo, un adyuvante. La administración del, como mínimo, un adyuvante de la presente puede tener lugar antes de la administración de la composición de la presente invención, simultáneamente o después de la misma. Tal como se utiliza en el presente texto, el término "adyuvante" se refiere a estimuladores no específicos de la respuesta o sustancias que permiten la generación de un depósito en el huésped que, cuando se combina con la vacuna y la composición farmacéutica de la presente invención, respectivamente, pueden proporcionar una respuesta inmune aún más mejorada.

En otra realización preferente, la composición de vacuna está desprovista de adyuvante. Una característica ventajosa de la presente invención es la elevada inmunogenicidad de la composición, incluso en ausencia de adyuvantes. Evitar la utilización de adyuvante puede reducir una posible aparición de efectos secundarios relacionados con la utilización de adyuvantes. De este modo, la administración de la vacuna de la presente invención a un paciente tendrá lugar preferentemente sin la administración de, como mínimo, un adyuvante al mismo paciente antes de la administración de la vacuna, simultáneamente o después de la misma.

La presente invención da a conocer además un método de inmunización que comprende administrar la vacuna de la presente invención a un ser humano y a un mamífero no humano, tales como perros o gatos. Sin querer limitar la presente invención por ninguna teoría, la inyección de la composición de vacuna de la presente invención a un gato puede neutralizar la Fel d1 y, por lo tanto, reducir la cantidad de Fel d1 en la saliva del gato.

La vacuna puede administrarse por diversos métodos conocidos en la técnica, pero normalmente se administrará por inyección, infusión, inhalación, administración oral, u otros métodos físicos adecuados. Los conjugados se pueden administrar alternativamente por vía intramuscular, por vía intravenosa, transmucosa, transdérmica, intranasal, intraperitoneal o subcutánea. Entre los componentes de los conjugados para la administración se incluyen soluciones y suspensiones acuosas estériles (por ejemplo, solución salina fisiológica) o no acuosas. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo. Los vendajes portadores u oclusivos se pueden utilizar para aumentar la permeabilidad de la piel y mejorar la absorción del antígeno.

Se dice que las vacunas de la presente invención son "farmacológicamente aceptables" si su administración puede ser tolerada por un individuo receptor. Además, las vacunas de la presente invención se pueden administrar en una "cantidad terapéuticamente eficaz" (es decir, una cantidad que produce un efecto fisiológico deseado). La naturaleza

o el tipo de respuesta inmune no es un factor limitante de la presente divulgación. Sin intención de limitar la presente invención por la siguiente explicación del mecanismo, la vacuna de la presente invención puede inducir anticuerpos, presumiblemente subtipos de IgG, que se unen a la Fel d1 evitando de este modo que la Fel d1 sea vista por las IgE unidas a los mastocitos y basófilos. Alternativa o simultáneamente, la composición de la presente invención dirige las respuestas inmunes hacia las respuestas Th1, suprimiendo el desarrollo de respuestas Th2 y, por lo tanto, la producción de anticuerpos IgE, un componente importante en las reacciones alérgicas.

En un aspecto, la presente invención da a conocer una composición farmacéutica que comprende la composición tal como la que se ha dado a conocer en la presente invención y un vehículo farmacéutico aceptable. Cuando la vacuna de la presente invención se administra a un individuo, puede estar en una forma que contenga sales, tampones, adyuvantes, u otras sustancias que son deseables para mejorar la eficacia del conjugado. Ejemplos de materiales adecuados para su utilización en la preparación de composiciones farmacéuticas se dan a conocer en numerosasfuentes entre las que se incluye CIECIAS FARMACÉUTICAS DE REMINGTON (Editor A. Osol, Mack Publishing Co., (1990)).

La presente invención da a conocer un procedimiento para producir la composición de la presente invención que comprende las etapas de: (a) proporcionar una partícula de núcleo con, como mínimo, un primer lugar de unión, en el que dicha partícula de núcleo es una partícula de tipo viral o una partícula viral; (b) proporcionar, como mínimo, un antígeno con, como mínimo, un segundo lugar de unión, en el que dicho, como mínimo, antígeno es una proteína Fel d1 o un fragmento de Fel d1, y (c) combinar dicha partícula de núcleo y dicho, como mínimo, un antígeno para producir una composición, en el que dichos, como mínimo, un antígeno y dicha partícula de núcleo están enlazados a través del primer y segundo lugar de unión.

En una realización adicionalmente preferente, la etapa de proporcionar una partícula de núcleo con, como mínimo, un primer lugar de unión comprende además las etapas de: (a) desensamblar dicha partícula de núcleo en proteínas de recubrimiento, mutantes o fragmentos de las mismas, de dicha partícula de núcleo; (b) purificar dichas proteínas de recubrimiento, mutantes o fragmentos de las mismas, (c) volver ensamblar dichas proteínas de recubrimiento purificadas, mutantes o fragmentos de las mismas, de dicha partícula de núcleo, en la que dicha partícula de núcleo está esencialmente libre de ARN del huésped, preferentemente de ácidos nucleicos del huésped. En una realización aún más preferente, el reensamblaje de dichas proteínas de recubrimiento purificadas se lleva a cabo en presencia de, como mínimo, una macromolécula polianiónica o, como mínimo, un ácido nucleico inmunoestimulatorio.

En un aspecto, la presente invención da a conocer un método de utilización de las composiciones de la presente invención para prevenir y/o tratar la alergia a los gatos en un mamífero, en el que dicho mamífero es preferentemente un ser humano o un perro.

En un aspecto, la presente invención describe la utilización de la composición de la presente invención como un medicamento. En otro aspecto, la presente invención da a conocer la utilización de la composición de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la alergia a los gatos en un mamífero, en el que dicho mamífero es preferentemente un ser humano o un perro.

En un aspecto, la presente invención da a conocer una proteína Fel d1 de fusión que comprende la cadena 1 de la de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1 fusionadas a través de un espaciador de aminoácidos, que une el extremo Nterminal de una cadena con el C-terminal de la otra cadena, en el que dicho espaciador de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 10-30, preferentemente 10-25, preferentemente 10-20, preferentemente 13-20, preferentemente 15-20, preferentemente 13-17, preferentemente 15-17 residuos de aminoácidos, y en el que dicha proteína de fusión no es una proteína de fusión que comprende la cadena 1 de la Sec. No. Id.: 22 fusionada a través de (GGGGS)3 al extremo N-terminal de la cadena 2 de la Sec. No. Id.: 23, 25 o 26 y en el que dicha proteína de fusión divulgada se expresa en el sistema de expresión de baculovirus.

El documento WO2004094639 da a conocer proteína de fusión Fel d1 mediante el enlace de la cadena 1 y la cadena 2 con un conector seleccionado de un enlace carbono-nitrógeno y un péptido corto, es decir, que tiene de 1 a 9, preferentemente de 1 a 5, preferentemente en particular de 1 a 3 aminoácidos. Afirma, además, que sorprendentemente un enlace o un péptido corto no inducen restricciones significativas o el despliegue. Sin embargo, el documento WO2004094639 no da a conocer conectores con longitud mayor de 9 aminoácidos.

El documento WO 00/20032 da a conocer una Fel d1 recombinante expresada en baculovirus que comprende la cadena 1 y la cadena 2 expresadas en serie y enlazadas entre sí por un conector de glicina/serina (GGGGS)3. El documento WO00/20032 da a conocer además información de que la inmunoreactividad de rFel d1 frente a anticuerpos IgG e IgE se mejora dramáticamente expresando el alérgeno en baculovirus, en comparación con el alérgeno expresado en E. coli.

La proteína de fusión Fel d1 de la presente invención se puede producir bien en un sistema de expresión procariota

o bien en un sistema de expresión eucariótico, tal como un sistema de baculovirus. En una realización preferente, dicha proteína de fusión Fel d1 de la presente invención se produce a partir de E. coli.

En una realización preferente, el espaciador comprendido por la proteína de fusión Fel d1 de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 residuos de aminoácidos.

En una realización preferente, el espaciador comprendido por la proteína de fusión Fel d1 comprende una secuencia de aminoácidos que tiene 2, 3 o 4 veces la repetición de GGGGS.

En una realización preferente, la cadena 2 de la Fel d1 está en el extremo N-terminal de la proteína de fusión de la presente invención.

En otra realización preferente, la cadena 1 de la Fel d1 está en el extremo N-terminal de la proteína de fusión de la presente invención. En una realización adicionalmente preferente, la proteína de fusión se produce a partir de E. coli.

En una realización muy preferente, la proteína de fusión Fel d1 de la presente invención comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende: (a) la Sec. No. Id.: 54; (b) la Sec. No. Id.: 55; y (c) la Sec. No. Id.: 57. La presente invención da a conocer además la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de fusión Fel d1 de la presente invención. En una realización preferente, la presente invención da a conocer la secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de fusión de la presente invención seleccionado de entre el grupo que comprende: (a) la Sec. No. Id.: 54; (b) la Sec. No. Id.: 55, y (c) la Sec. No. Id.: 57. En una realización adicionalmente preferente, la proteína de fusión Fel d1 de la presente invención se produce en E. coli. En una realización adicionalmente preferente, la proteína de fusión Fel d1 de la presente invención está constituida por una secuencia de aminoácidos de Sec. No. Id.: 57, o alternativamente comprende la misma, en la que dicha proteína de fusión de la presente invención se produce en E. coli.

Además, la presente invención da a conocer un utilización de la proteína de fusión Fel d1 de la presente invención para el diagnóstico y tratamiento de la alergia a los gatos.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Preparación de PTV de Qβ de la presente invención mediante desensamblaje/reensamblaje en presencia de diferentes macromoléculas polianiónicas lo que da como resultado PTV de Qβ reensambladas

(A) Desensamblaje de la PTV de Qβ de la técnica anterior

Se redujeron 45 mg de la PTV de Qβ de la técnica anterior (2,5 mg/ml, tal como se determinó por análisis de Bradford) en PBS (fosfato 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) purificada a partir de lisado de E. coli con DTT 10 mM durante 15 min a temperatura ambiente en condiciones de agitación. A continuación, se añadió cloruro de magnesio a una concentración final de 0,7 M y se continuó la incubación durante 15 min a temperatura ambiente en condiciones de agitación, lo que condujo a la precipitación del ARN encapsulado de las células huésped. La solución

se centrifugó durante 10 min a 4000 rpm a 4oC (Eppendorf 5810 R, en rotor de ángulo fijo A-4-62 utilizado en todas las etapas siguientes) a fin de eliminar el ARN precipitado de la solución. El sobrenadante, que contiene las proteína de recubrimiento Qβ dimérica liberada, se utilizó para las etapas de purificación cromatográfica.

(B) Purificación de la proteína de recubrimiento Qβ mediante cromatografía de intercambio catiónico y cromatografía de exclusión

El sobrenadante de la reacción de desensamblaje, que contiene la proteína de recubrimiento dimérica, las proteínas de la célula huésped y el ARN residual de la célula huésped, se diluyó 1:15 en agua para ajustar la conductividad por debajo de 10 mS/cm y se cargó en una columna de SP-Sefarosa FF (xk16/20, 6 ml, Amersham Bioscience). La columna se había equilibrado previamente con tampón de fosfato sódico 20 mM de pH 7. La elución de la proteína de recubrimiento unida se logró mediante un gradiente de paso de fosfato sódico 20 mM / cloruro sódico 500 mM y la proteína se recogió en una fracción de volumen de aproximadamente 25 ml. La cromatografía se llevó a cabo a temperatura ambiente con una velocidad de flujo de 5 ml/min y la absorbancia se monitorizó a 260 nm y 280 nm.

En la segundo etapa, se cargó la proteína de recubrimiento Qβ aislada (la fracción eluída de la columna de intercambio catiónico) (en dos ciclos) en una columna Sephacryl S-HR 100 (xk26/60, 320 ml, Amersham Bioscience), equilibrada con 20 mM de fosfato sódico/cloruro sódico 250 mM, pH 6,5. La cromatografía se llevó a cabo a temperatura ambiente con un caudal de 2,5 ml/min y la absorbancia se monitorizó a 260 nm y 280 nm. Se recogieron fracciones de 5 ml.

(C1) Ensamblaje de la PTV de Qβ por diálisis

Se mezclaron la proteína de recubrimiento Qβ purificada (2,2 mg/ml en fosfato sódico 20 mM, pH 6,5), una macromolécula polianiónica (2 mg/ml en agua), urea (7,2 M en agua) y DTT (0,5 M en agua) a las concentraciones finales de 1,4 mg/ml de proteína de recubrimiento, 0,14 mg/ml de macromolécula polianiónica respectiva, 1 M de urea y 2,5 mM de DTT. Las mezclas (1 ml cada una) se dializaron durante 2 días a 5oC en Tris HCl 20 mM, NaCl 150 mM pH 8, utilizando membranas de 3,5 KDa de corte. Las macromoléculas polianiónicas fueron: ácido poligalacturónico (25000 a 50000, Fluka), sulfato de dextrano (PM 5.000 y 10.000, Sigma), ácido poli-L-aspártico (PM 11.000 y 33.400, Sigma), ácido poli-L-glutámico (PM 3000, 13600 y 84600, Sigma) y ARNt de levadura de panadero y germen de trigo.

(C2) Ensamblaje de PTV de Qβ por diafiltración

Se mezclaron 33 ml de proteína de recubrimiento Qβ purificada (1,5 mg/ml en fosfato sódico 20 mM pH 6,5, NaCl 250 mM) con agua y urea (7,2 M en agua), NaCl (5 M en agua) y ácido poli-L-glutámico (2 mg/ml en agua, PM: 84.600). El volumen de la mezcla fue de 50 ml y las concentraciones finales de los componentes fueron proteína de recubrimiento 1 mg/ml, NaCl 300 mM, urea 1,0 M y ácido poli-L-glutámico 0,2 mg/ml. A continuación, la mezcla se sometió a diafiltración a temperatura ambiente, contra 500 ml de Tris HCl 20 mM, pH 8, NaCl 50 mM, aplicando un caudal transversal de 10 ml/min y un caudal de permeado de 2,5 ml/min, en un aparato de filtración de flujo tangencial utilizando un cartucho de membrana Pellicon XL (Biomax 5K, Millipore).

EJEMPLO 2

Ensamblaje in vitro de AP205 PTV

(a) Purificación de la proteína de recubrimiento AP205

Desensamblaje: se mezclaron 20 ml de solución de PTV de AP205 (1,6 mg/ml en PBS, purificada a partir de extracto de E. coli) con 0,2 ml de DTT 0,5 M y se incubaron durante 30 min a temperatura ambiente. Se añadieron 5 ml de NaCl 5 M y, a continuación, la mezcla se incubó durante 15 min a 60oC, provocando la precipitación de las proteínas de recubrimiento reducidas por DTT. La mezcla turbia se centrifugó (rotor Sorvall SS34, 10.000 g, 10 min, 20oC) y el sobrenadante se desechó y el sedimento se dispersó en 20 ml de urea 1 M/citrato de Na 20 mM pH 3,2. Después de agitar durante 30 min a temperatura ambiente, la dispersión se ajustó a pH 6,5 mediante la adición de Na2HPO41,5 M y posteriormente se centrifugó (rotor Sorvall SS34, 10.000 g, 10 min, 20oC) obteniendo el sobrenadante que contiene la proteína de recubrimiento dimérica.

Cromatografía de intercambio de cationes: El sobrenadante (véase lo anterior) se diluyó con 20 ml de agua para ajustar a una conductividad de aproximadamente 5 mS/cm. La solución resultante se cargó en una columna de 6 ml de SP Sefarosa FF (Amersham Bioscience) que se había equilibrado previamente con tampón de fosfato sódico 20 mM pH 6,5. Después de la carga, la columna se lavó con 48 ml tampón de fosfato sódico 20 mM pH 6,5 seguido de la elución de la proteína de recubrimiento unida mediante un gradiente lineal hasta NaCl 1 M en 20 volúmenes de columna. Las fracciones del pico principal se combinaron y se analizaron por SDS-PAGE y espectroscopia UV. De acuerdo con la SDS-PAGE, la proteína de recubrimiento aislada estaba esencialmente pura de otras contaminaciones de proteínas. Según la espectroscopia UV, la concentración de proteína fue de 0,6 mg/ml (cantidad

total 12 mg), teniendo en cuenta que 1 unidad de A280 refleja 1,01 mg/ml de proteína de recubrimiento AP205. Por otra parte, el valor de A280 (0,5999) sobre el valor de A260 (0,291) es 2, lo que indica que la preparación está esencialmente libre de ácidos nucleicos.

(B) Ensamblaje de PTV AP205

Ensamblaje en ausencia de cualquier macromolécula polianiónica: La fracción de proteína eluída desde arriba se sometió a diafiltración y se concentró mediante TFF a una concentración de proteína de 1 mg/ml en fosfato sódico 20 mM pH 6,5. Se mezclaron 500 μl de esta solución con 50 μl de solución de NaCl 5 M y se incubaron durante 48 h a temperatura ambiente. La formación de PTV reensambladas en la mezcla se observa mediante SDS-PAGE no reductor y HPLC de exclusión por tamaño. Se utilizó para el análisis por HPLC una columna TSKgel G5000 PWXL (Tosoh Bioscience), equilibrada con fosfato sódico 20 mM, NaCl 150 mM pH 7,2.

Ensamblaje en presencia de ácido poliglutámico: Se mezclaron 375 μl de proteína de recubrimiento AP205 purificada (1 mg/ml en fosfato sódico 20 mM pH 6,5) con 50 μl de solución madre de NaCl (solución 5 M en agua), 50 μl de solución madre de ácido poliglutámico (2 mg/ml en agua, PM: 86.400, Sigma) y 25 μl de agua. La mezcla se incubó durante 48 h a temperatura ambiente. La formación de PTV reensambladas en la mezcla se observa mediante SDS-PAGE no reductor de y HPLC de exclusión por tamaño. La proteína de recubrimiento en la mezcla fue casi completamente incorporada en las PTV, lo que muestra una eficiencia de ensamblaje más elevada que la proteína de recubrimiento AP205 ensamblada en la ausencia de cualquier macromolécula polianiónica.

EJEMPLO 3

Clonación de las proteínas de fusión Fel d1

Se produjeron los genes que codifican la cadena 1 y la cadena 2 de la Fel d1, respectivamente, mediante amplificación por PCR utilizando cebadores de ADN superpuestos, tal como se muestra a continuación. Se indican los cebadores directo (F) y reverso (R). Los fragmentos se ligaron en el vector pCRII-TOPO (Invitrogen) y se transformaron en XL1-Blue. La secuencia de los insertos de la cadena 1 y la cadena 2 de Fel d1 se verificó.

Secuencia del cebador 1F: Sec. No. Id.: 34; Secuencia del cebador 2R: Sec. No. Id.: 35 Secuencia del cebador 3F: Sec. No. Id.: 36 Secuencia del cebador 4R: Sec. No. Id: 37 Secuencia del cebador 5F: Sec. No. Id.: 38 Secuencia del cebador 6R: Sec. No. Id.: 39 Secuencia del cebador 7F: Sec. No. Id.: 40 Secuencia del cebador 8R: Sec. No. Id: 41 Secuencia del cebador 9F: Sec. No. Id.: 42 Secuencia del cebador 10R: Sec. No. Id.: 43

Construcciones de Fel d1 de fusión:

FELD1 se refiere a la proteína con la cadena 2 en el extremo N-terminal fusionada directamente con la cadena 1. Las secuencias de nucleótidos que codifican FELD 1 se han creado mediante PCR de extensión de corte y empalme superpuesto (SOE) utilizando el conector cebador 11 (Sec. No. Id.: 44).

FD 12 se refiere a la proteína con la cadena 1 en el extremo N-terminal fusionada directamente con la cadena 2. La secuencia de nucleótidos que codifica la FD 12 se ha creado mediante PCR de extensión de corte y empalme de solapamiento (SOE) utilizando cebadores 12-1 (Sec. No. Id.: 45), 12-3 (Sec. No. Id.: 46) y 12-2-1 (Sec. No. Id.: 47).

FELD1-10aa y FELD1-15aa se refieren a las proteínas con la cadena 2 en el extremo N-terminal fusionada a través de un espaciador de 10 aminoácidos (GGGGS)2 o 15 aminoácidos (GGGGS)3, respectivamente, con la cadena 1 en el extremo C-terminal. El plásmido que contiene la secuencia de nucleótidos que codifica FELD1 se utilizó como plantilla para crear los espaciadores de 10 aminoácidos o 15 aminoácidos mediante mutagénesis por PCR inversa (IPCRM). Para el espaciador 1-15 dos se utilizaron cebadores (cebador 1-10aa, Sec. No. Id.:48 y el cebador 2-5aa, Sec. No. Id.: 49). Para el espaciador 1-10, se utilizaron dos cebadores (cebador de 1-5aa, Sec. No. Id: 50 y el cebador 2-5aa). El fragmento de PCR resultante se circularizó por ligación. Es resistente a la digestión con Dpn I, que sólo reconoce secuencia que contiene adenina metilada, mientras que la plantilla de plásmido se digirió con Dpn

I.

FD 12-10aa y FD 12-15aa se refieren a las proteínas con la cadena 1 en el extremo N-terminal fusionadas a través de un espaciador de 10 aminoácidos (GGGGS)2 o 15 aminoácidos (GGGGS)3, respectivamente, con la cadena 2 en el extremo C-terminal. Las FD12-10aa y FD12-15aa de fusión se producen de manera similar a como se describe anteriormente. Para el espaciador de 15 aminoácidos se utilizó el cebador FD2-10aa (Sec. No. Id: 51) y el cebador

FD1-5aa (Sec. No. Id.: 52). Para el espaciador de 10 aminoácidos se utilizaron los cebadores FD1-5aa y FD2-5aa (Sec. No. Id.: 53).

EJEMPLO 4

Expresión bacteriana y purificación de proteínas de fusión Fel d1 etiquetadas con His

Las secuencias de nucleótidos que codifican las diferente construcciones de Fel d1 de fusión, tal como las que se describen en el ejemplo 3, se subclonaron en un sistema de expresión pET-42T(+) basado en T7, modificado a partir del plásmido pET-42a(+) (Novagen). El extremo C-terminal de las construcciones de fusión se fusiona a una secuencia etiquetada con His seguida por GGC, un conector de aminoácidos que contiene cisteína como el segundo lugar de unión. Por consiguiente, los construcciones resultantes se denominan añadiendo "-HC" al final.

FELD1-HC, FELD1-10aa-HC y FELD1-15aa-HC y FD12-15aa-HC se expresaron y purificaron tal como se describe a continuación: El plásmido se transformó en BL21 (DE3). La expresión se indujo mediante la adición de IPTG 1 mM al cultivo en el OD600 de la aplicación 1. El cultivo se desarrolló durante un período adicional de 20 horas a 20oC, se recogió y se lisó por sonicación en tampón de lisis nativo (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM pH 8,0).

El lisado bacteriano clarificado se diluyó a 50 ml con tampón de lisis nativo. Se añadieron 5 ml de agarosa níquelácido nitrilotriacético(Ni-NTA) (Qiagen) y el lisado se incubó por inversión durante una hora a 4oC. Las proteínas unidas inespecíficamente se eliminaron por lavado 4 veces en tampón de lisis nativo. La proteína unida se eluyó por resuspensión de la agarosa Ni-NTA en 2 ml de tampón de elución (NaH2PO4 50 mM, NaCl 300 mM, imidazol 250 mM pH 8,0).

EJEMPLO 5

Enlaces disulfuro de plegado oxidativo en proteínas Fel d1 de fusión purificadas

Las FELD1-HC purificadas por afinidad hacia el Ni2+ comprenden una variedad de especies enlazadas por puentes disulfuro mixtos de 15 KDa a 20 KDa. El plegamiento nativo de FELD1-HC se logró mediante la reorganización intramolecular de los enlaces disulfuro con glutatión oxidado (GSSG, Applichem) y glutatión reducido (GSH, Applichem) en una relación molar de 1:1. La reacción se llevó a cabo durante 24 horas inmediatamente después de la elución de FELD1 en el tampón de elución mediante la adición de GSSG 2,5 mM y GSH 2,5 mM a temperatura ambiente. La FELD1-HC plegada de nuevo mostró una sola banda a un peso molecular de 15 KDa en condiciones no reductoras (Figura 1, el primer panel, línea 2). Los potenciales grupos sulfhidrilo libres de FELD1-HC se alquilaron utilizando yodoacetamida (Sigma). Las pruebas se trataron con yodoacetamida 5 mM en bicarbonato de amonio 20 mM a pH 8,0 durante 15 minutos a temperatura ambiente.

La FELD1-HC plegada de nuevo se purificó adicionalmente hasta homogeneidad mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) (Superdex 75 pg, Amersham Pharmacia Biosciences) equilibrada en PBS.

FELD1-10aa-HC y FELD1-15aa-HC se renaturalizaron sustancialmente mediante el mismo método que se ha descrito anteriormente (figura 1, los dos carriles centrales).

El plegamiento nativo de FD12-15aa-HC se logró de manera similar mediante la reorganización de los enlaces disulfuro con glutatión oxidado y glutatión reducido y en una relación molar de 10:1. Después de la elución FD1215aa se diluyó veinte veces en tampón de replegamiento de FD12-15aa (Tris-Cl 50 mM, pH 8,5, NaCl 240 mM, KCl 10 mM, EDTA 1 mM, 0,05% de PEG 3550, GSH 1 mM, GSSH 0,1 mM) y se incubó a 4oC durante 24 horas. La FD12-15aa replegada mostró una sola banda a un peso molecular de 20 KDa en comparación con la forma reducida que corría a 23 KDa (Figura 1, último carril).

EJEMPLO 6

Proteínas Fel d1 de fusión son reconocidas por los anticuerpos monoclonales específicos para el epítopo

La unión de proteínas de fusión Fel d1 en comparación con la Fel d1 natural (nFel d1) a los anticuerpos monoclonales específicos de epítopo (MAB) se midió mediante un ELISA de tipo sándwich utilizando el kit de ELISA de Fel d1 (6F9/3E4) de Indoor Biotechnologies (Cardiff, Reino Unido).

En resumen, el mAb anti-Fel d1 6F9, suministrado como una solución madre 2 mg/ml, se diluyó 1:1000 en tampón carbonato-bicarbonato 50 mM, pH 9,6. Los pocillos de microtitulación se recubrieron con 100 μl por pocillo del mAb 6F9 diluido a 4oC durante la noche. Las placas se lavaron tres veces con PBS-Tween 20 al 0,05% (PBS-T) y, a continuación, se bloquearon con 100 μl de tampón de bloqueo (1% de BSA (Sigma) en PBS-T). A continuación, los pocillos de microtitulación se incubaron durante una hora con 100 μl de proteínas Fel d1 de fusión o nFel d1 estándar (Indoor Biotechnologies; Reino Unido) utilizando diluciones dobles de 80 a 0,16 ng/ml. La nFel d1 de referencia se subestandarizó a partir de la referencia E10 de caspa de gato CBER, que contiene 13,47 U/ml de Fel d1 (1 unidad=4 mg de proteína).

A continuación, las placas se lavaron y se añadieron 100 μl de anticuerpo mAb 3E4 anti-Fel d1 biotinilado diluido

5 (1:1000 en 1% BSA/PBS-T) y se incubaron durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron tres veces con PBS-T utilizando 100 μl de estreptavidina-peroxidasa (Sigma S5512, 0,25 mg de reconstituidos en 1 ml de agua destilada) diluidas (1:1000 en 1% BSA/PBS-T). Después de 30 minutos de incubación a temperatura ambiente los pocillos se lavaron tres veces con PBS-T. La detección se realizó con una solución de sustrato OPD y 5% de H2SO4 como solución de detención. La absorbancia se midió utilizando un lector de ELISA (BioRad) a 450 nm y para el

10 cálculo de medias aritméticas y el error estándar de la media se utilizó software (SEM) EXCEL (MS Office, Microsoft). Los resultados se muestran en la Tabla 1. De este modo, el reconocimiento de las proteínas Fel d1 de fusión y nFel d1 por los mABs específicos de epítopo refleja la elevada similitud de la antigenicidad de ambas proteínas.

15 TABLA 1

Proteínas evaluadas: FELD1-HC FELD1-10aa-HC FELD1-15aa-HC Fel d1 Natural

Fel d1 (ng/ml) en OD 50%: 8,4 6,7 7,9 7,2

EJEMPLO 7

Acoplamiento de proteínas Fel d1 de fusión a PTV derivadas de Qβ

20 Una solución 143 μM de PTV de Qβ en tampón HEPES (HEPES 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2) se hizo reaccionar con un exceso molar de 5 veces (715 μM) de SMPH (Pierce) durante 30 minutos a 25oC con agitación. El SMPH fue tomado de una solución madre 50 mM disuelto en dimetilsulfóxido. Los productos de reacción se sometieron a diálisis frente a dos cambios de PBS utilizando una unidad de diálisis con un corte de peso molecular de 10000Da

25 (Slide-A-Lyzer, Pierce). La diálisis se realizó a 4oC a temperatura ambiente en un exceso de más de 1000 veces de tampón a mezcla de reacción.

Antes de acoplar las proteínas de fusión Fel d1 a las PTV de Qβ derivatizadas con SMPH, se incubaron FELD1, FELD1-10aa, FELD1-15aa, y FD12-15aa, respectivamente, tal como se obtienen a partir del Ejemplo 5, con TCEP 30 (Pierce, Perbio Science) en cantidades equimolares durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Las proteínas Fel d1 de fusión se añadieron en un exceso molar de 5 veces a una solución de PTV de Qβ derivatizadas con SMPH 143 μM. El volumen de reacción fue 650 μl y se llevaron a cabo múltiples reacciones en paralelo. Las reacciones se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente con agitación. Después del

35 acoplamiento, se centrifugaron alícuotas a 16.000 x g durante 3 minutos a 4oC para sedimentar el material insoluble. Los sobrenadantes se combinaron en tubos nuevos. El acoplamiento de proteínas Fel d1 de fusión a las PTV de Qβ se evaluó por SDS-PAGE reductora.

El acoplamiento de las proteínas Fel d1 de fusión con las PTV de Qβ reensambladas (obtenidas a partir del Ejemplo 40 1) es sustancialmente el mismo que el descrito anteriormente.

EJEMPLO 8

Acoplamiento de FELD1, FELD1-15aa y FD12-15aa a HBcAg1-185-Lys

45 La construcción de HBcAg1-185-Lys, su expresión y purificación se han descrito sustancialmente en los ejemplos 25 del documento WO 03/040164. Una solución 120 μM de HBcAg1-185-Lys PTV en Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 se hace reaccionar durante 30 minutos con un exceso molar de 25 veces de SMPH (Pierce), diluido a partir de una solución madre en DMSO, a 25oC en un agitador oscilante. La solución de reacción se dializa posteriormente

50 dos veces durante 2 horas frente a la 1 l de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,2 a 4oC. A continuación, la mezcla de reacción de HBcAg1-185-Lys dializada se hace reaccionar con la Fel d1 recombinante obtenida en el Ejemplo 5. En la reacción de acoplamiento, la FELD1, FELD1-15aa y 15aa-FD12, respectivamente, están en exceso molar del doble sobre la PTV de HBcAg1-185-Lys derivatizada. La reacción de acoplamiento tiene lugar durante cuatro horas a 25oC en un agitador oscilante.

55 EJEMPLO 9

Acoplamiento de FELD1, FELD1-15aa y 15aa-FD12 a PTV derivadas de AP205

60 La preparación de PTV de AP205 se describe en los Ejemplos 1 y 2 en el documento WO 2004/007538. La derivatización de AP205 PTV es sustancialmente la misma que la descrita en el ejemplo 7 para la PTV de Qβ. Antes de acoplar las proteínas Fel d1 de fusión a PTV AP205 derivatizadas con SMPH, se incuban con TCEP (Pierce,

Perbio Science) FELD1, FELD1-15aa y FD12-15aa obtenidas del ejemplo 5, respectivamente, en cantidades equimolares durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Se añaden las proteínas Fel d1 de fusión en un exceso molar de 5 veces a la solución 143 μM de PTV de AP205 derivatizadas con SMPH. Las reacciones se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente con agitación.

El acoplamiento de las proteínas Fel d1 de fusión a las PTV AP205 reensambladas (obtenidas a partir del ejemplo 2) es sustancialmente el mismo que el descrito anteriormente.

EJEMPLO 10

Producción de la composición de la presente invención basada en bacteriófago Qβ

Un cultivo 601 de E. coli AB259 (5x107 células/ml) se hizo crecer durante 2-3 horas a 37oC con aireación intensiva (1 volumen de aire/volumen de cultivo · minuto) para obtener un cultivo de alrededor de 2-4x109 células/ml. Se inoculó el lisado de fago Qβ clarificado a una multiplicidad de infección de 5, y se añadió CaCl2 a una concentración final de 2,2 mM. Después de una fase de adsorción de 5 minutos, se intensificó la aireación (1,5 volúmenes de aire/volumen de cultivo · minuto) Las células se cultivaron adicionalmente durante 3 horas, hasta que el OD650 nm alcanzó un valor estable, produciendo 4-6x1012 en partículas de fago en el cultivo. Estos se purificaron de la siguiente manera.

E. coli se lisó mediante la adición de 10 ml de CHCl3/l cultivo, 0,1 mg lisozima/1 cultivo y EDTA a una concentración final de 20 mM. El lisado se clarificó por centrifugación en una centrífuga con enfriamiento por flujo transversal, las partículas de fago sedimentadas a partir del lisado mediante precipitación con sulfato de amonio (500 g/l, produciendo una saturación de aproximadamente el 66%). En primer lugar, la suspensión se decantó y el precipitado se aisló mediante centrifugación durante 30 minutos utilizando una centrifugadora K26 Janetzki con un rotor W.R. de 6x500ml a 6000 rpm, o en una centrífuga Beckman J21 C utilizando un rotor JA-10. El sedimento se resolubilizó en tampón NT (NaCl 0,15 M, Trypton 0,1%) y se clarificó mediante centrifugación. El sobrenadante se precipitó con sulfato de amonio (500 g/l añadido, saturación aproximadamente del 66%). El precipitado se aisló por centrifugación, se resolubilizó en tampón NT y se aclaró de nuevo mediante centrifugación. Las partículas de fago se aislaron a partir del sobrenadante resultante mediante ultracentrifugación durante 3,5 h, utilizando un rotor Beckman de tipo 35 a 32.000 rpm. Los fagos sedimentados se resuspendieron en tampón NT y se purificaron por ultracentrifugación en un gradiente de CsCl continuo convencional. La centrifugación se realizó utilizando un rotor Beckman Ti-70 (8x38.5), a 55000 rpm durante 20 horas. Posteriormente, las partículas de fago se dializaron frente a tampón de Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 para ser utilizadas en las etapas de reticulación química tal como se describe en el ejemplo 7.

EJEMPLO 11

Preparación de la composición de la presente invención basada en fago GA

Un cultivo de 12 l de E. coli Q 13 Hfr RNASse I-en medio M9 que contiene 2% de hidrolizado de caseína, 0,5% de extracto de levadura, 0,2% de glucosa se hizo crecer a una OD540 nm de 0,6-0,7, lo que corresponde a aproximadamente a 2x108 células/ml, y se infectaron con fago GA a una multiplicidad de infección de 10-20. El cultivo se desarrolló durante 2,5 - 3 horas adicionales a 37oC produciendo aproximadamente 1011 partículas de fagos en el cultivo total. Las células se lisaron mediante la adición de 1-2% v/v de CHCl3 e incubación del cultivo durante 15 minutos. El lisado se clarificó por centrifugación durante 30 minutos a 5000 rpm en un rotor Janetzi K26. Las partículas de fago se precipitaron con sulfato de amonio (saturación del 60%) a partir del medio de cultivo durante varios días a 4oC. En primer lugar se decantó la suspensión, y el precipitado se aisló por centrifugación durante 30 minutos a 6000 rpm en un rotor de Janetzki K26. El sedimento se resuspendió en NET (Tris 20 mM pH 7,8, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM), y las partículas se extrajeron durante varios ciclos de centrifugación y resuspensión en pequeñas porciones de tampón NET. Se agruparon las porciones que contienen cápsides, y se precipitaron con sulfato amónico al 60%. Las partículas resuspendidas en tampón NET se purificaron tres veces sobre una columna de Sefarosa 4B y posteriormente sobre dos gradientes de sacarosa. Brevemente, se preparó un gradiente con 7 ml del 50%, 7 ml del 43%, 7 ml del 36%, 7 ml del 29% y 7 ml del 22% p/p de sacarosa en tampón NET en tubos de centrífuga. Se depositó la solución de fago (en tampón NET) en el gradiente, y se centrifuga durante 17 horas en un rotor Beckman SW 28 a 25000 rpm. Las fracciones que contienen cápsides se agruparon, y se separaron de la sacarosa por filtración en gel sobre una columna de Sefarosa 4B. Posteriormente, las partículas de fago se dializaron contra agua y se liofilizaron para su utilización posterior.

Las condiciones de acoplamiento de las proteínas Fel d1 de fusión para los bacteriófagos Qβ o GA son sustancialmente las mismas que las condiciones de acoplamiento a las PTV de Qβ, tal como se describe en el ejemplo 7.

EJEMPLO 12

Las Qβ-proteínas de fusión Fel d1 son altamente inmunogénicas en ratones

5 Se inmunizaron sc ratones BALB/c con 50 μg de Qβ-FELD1 obtenidas del ejemplo 7 o 50 μg de Qβ mezclados con Fel d1 recombinante (obtenidas del ejemplo 5) en los días 0, 14 y 21 y se extrajo sangre en los días 0, 21 y 28. Se midieron los anticuerpos específicos Fel d1 mediante ELISA utilizando FELD1 para el recubrimiento (10 μg/ml). De forma breve, se utilizaron F96 de 96 pocillos que habían sido pre-recubierto a 4oC durante la noche con 10 μg/ml de FELD1 en NaHCO3 0,1 M pH 9,6. Las placas se lavaron cuatro veces con PBS-Tween 20 y la línea de base se

10 redujo mediante la incubación de las placas 2 horas a 37oC en tampón de bloqueo (BSA al 2%, (Sigma) en PBS-Tween 20). El suero se diluyó en tampón de dilución de suero (2% de BSA, 1% de FCS en PBS-Tween 20). Se realizaron etapas de dilución en dos veces y se incubaron durante 2 h a temperatura ambiente en un agitador de placas de ELISA. Las placas se lavaron cinco veces y se incubó anticuerpo de detección (anti-IgG de ratón acoplado con HRPO (Sigma)) diluido 1:1000 durante 1 h a temperatura ambiente. Las placas se lavaron cinco veces con PBS

15 Tween 20 y la detección se llevó a cabo utilizando una solución de sustrato OPD (Na2HPO4 0,066 M, ácido cítrico 0,035 M pH 5,0 que contiene 10 mg de OPD (Fluka) y 8 μl de H2O2 al 30% (Fluka) por 25 ml) y H2SO4 al 5% en H2O como solución de parada. La absorbancia se midió utilizando un lector de ELISA a 450 nm y para el cálculo de medias aritméticas y el error estándar de la media se utilizó software (SEM) EXCEL (Microsoft).

20 Los ratones inmunizados con Qβ-FELD1 mostraron una absorción en la mitad del máximo de 120.000 y 75.000 en el día 21 y el día 28, respectivamente. En contraste, los ratones inmunizados con una mezcla no-reticulada de Qβ/FELD 1 tenían una titulación baja de 7000 y 6000 en el día 21 y el día 28, respectivamente.

EJEMPLO 13

25 Inmunización de ratones con alumbre como adyuvante

Se vacunaron ratones Balb/c hembra con 7-8 semanas de edad tres veces (días 0, 14 y 28) con 50 μg de PTV de Qβ-FELD1-HC de la técnica anterior. Las vacunas se diluyeron en 200 μl de PBS estéril o 100 μl de PBS y 100 μl

30 AIuGeI-S (Serva), respectivamente, y se inyectaron por vía subcutánea en la región inguinal izquierda y derecha.

Los sueros se recogieron en los días 14, 21, 28, 42, 56, 84 y 112. Se determinaron por ELISA los anticuerpos específicos contra la Fel d1 natural, FELD-HC y PTV de Qβ.

35 Las placas de microtitulación se recubrieron durante la noche con 1 μg/ml de Fel d1 natural (nFel d1, Indoor Biotechnologies), 10 mg/ml de FELD1-HC y 10 mg/ml de PTV de Qβ, respectivamente. Después del lavado (0,05% de Tween 20/PBS) y el bloqueo con BSA al 2% en PBS, se añadieron los sueros a diferentes diluciones en 2% BSA/1% de FCS/PBS.

40 A partir de aquí el ELISA se llevó a cabo por el método estándar. Las vacunas de PTV de Qβ-FELD1-HC inducen una respuesta frente a anticuerpos específicos de Feld1 que es elevada y de larga duración frente a la natural y FELD1. La titulación de anticuerpos fue mayor en la presencia de alumbre que sin alumbre (tabla 2).

TABLA 2

Con alumbre: Sin alumbre

Fechas: nFel d1 FELD1-HC nFel d1 FELD1-HC

Día 13: 15984 53939 3394 7871

Día 20: 100311 203636 38980 77323

Día 27: 173190 368716 38177 56836

Día 42: 240173 419072 88953 170377

Día 56: 228500 492520 65370 163093

Día 84: 157009 219834 59603 115049

Día 112: 127745 203719 62290 116132

45 EJEMPLO 14

FELD1 acoplada a Qβ tiene un potencial alérgico in vitro reducido drásticamente

50 Para evaluar la capacidad de Qβ-FELD1-HC para desencadenar una reacción alérgica in vitro, se aislaron basófilos de la sangre de tres donantes alérgicos a los gatos. En un individuo alérgico a los gatos, estos basófilos están recubiertos con IgE específica de Fel d1 y responden con regulación ascendente de CD63 a la estimulación alergénica. De este modo, los basófilos de la persona alérgica se estimularon con cantidades graduadas de Qβ-FELD1-HC o solamente con FELD1-HC y la regulación ascendente de CD63 se evaluó mediante citometría de flujo.

55 Mientras que la FELD1-HC (obtenida del ejemplo 5) provocó una fuerte regulación ascendente de CD63 en la

dilución más baja ensayada (aproximadamente 0,2 ng/ml), la Qβ-FELD1-HC (obtenida del ejemplo 7) exhibió un potencial alérgico drásticamente reducido y se requirieron cantidades 100-1000 veces más elevadas (aproximadamente 70 ng/ml) de FELD1-HC para que los basófilos respondieran.

Del mismo modo, esta prueba se repitió para las proteínas de fusión FELD-15aa-HC y FD12-15aa-HC bien solas o bien junto a Qβ. Los resultados se muestran en la figura 2. Estas proteínas Fel d1 de fusión, cuando se acoplan a Qβ, mostraron todas un potencial alérgico drásticamente reducido.

EJEMPLO 15

FELD1 junto a Qβ es incapaz de provocar una reacción de punción cutánea en un individuo alérgico

Si los alérgenos se introducen mediante punción en la piel de un individuo alérgico, se genera un edema local en, aproximadamente, 20 minutos debido a la activación de los mastocitos residentes en la piel. En este caso, la prueba cutánea se utilizó para determinar el potencial alérgico de Qβ-FELD1-HC (obtenida del ejemplo 7). Cantidades graduadas de Qβ-FELD1-HC o las cantidades correspondientes de FELD1-HC (obtenida a partir del ejemplo 5) se introdujeron en la piel de un individuo alérgico a los gatos y se evaluó la reacción de la piel 20 minutos más tarde. Qβ-FELD1-HC no fue capaz de desencadenar una reacción de la piel, mientras que la FELD1-HC fue activa en concentraciones más de 100 veces más bajas (Tabla 3).

Tabla 3: Cantidades correspondientes de FELD1-HC estaban presentes en ambas preparaciones.

Dilución: FELD1-HC Qβ-FELD1-HC

Sin dilución: +++ -

1:10: ++ -

1:100: + -

1:1000: - -

EJEMPLO 16

La inmunización de una persona alérgica con Qβ-FELD1-HC reduce la reactividad a la prueba de punción cutánea

Con el fin de evaluar la capacidad de Qβ-FELD1-HC para mejorar los síntomas clínicos, un paciente que sufre de alergia a los gatos se vacunó con 17 μg de Qβ-FELD1-HC (obtenida a partir del ejemplo 7) en el día 0 (3 inyecciones de 2, 5 y 10 μg), 40 μg en el día 7 (3 inyecciones de 10, 10 y 20 μg) y 50 μg en el día 14 (2 inyecciones de 10 y 40 μg). Los ensayos de punción en la piel se realizaron con un extracto de gato estandarizado en los días 0, 14 y 21 y se cuantificó los diámetros de la reacción de hinchamiento central (figura 3). En 3 semanas, se requieren concentraciones de alérgenos 1000 veces más elevadas para inducir síntomas clínicos en el ensayo de punción cutánea que la cantidad inicial suficiente para inducir los síntomas en la prueba de punción.

EJEMPLO 17

La inmunización de un individuo alérgico con Qβ-FELD1-HC reduce los síntomas alérgicos en los ensayos de provocación nasal

Con el fin de evaluar la capacidad de Qβ-FELD1-HC para mejorar los síntomas clínicos, un paciente que sufre de alergia a los gatos se vacunó con 17 μg de Qβ-FELD1-HC (obtenida a partir del ejemplo 7) en el día 0 (3 inyecciones de 2, 5 y 10 μg), 40 μg en el día 7 (3 inyecciones de 10, 10 y 20 μg) y 50 μg en el día 14 (2 inyecciones de 10 y 40 μg). Los ensayos de provocación nasal se realizaron con un extracto de gato estandarizado en los días 0, 14 y 21 y los síntomas clínicos se evaluaron en cada nivel de aumento de la dosis (figura 4A) y se realizó una calificación global alérgica según (figura 4B). En 3 semanas, fueron necesarias concentraciones de alérgenos 100-1000 veces mayores para producir los síntomas clínicos y la calificación global alérgica se redujo fuertemente.

EJEMPLO 18

Empaquetamiento de ácidos nucleicos inmunoestimulatorios en PTV de Qβ

Se obtuvo proteína de recubrimiento Qβ desensamblada y purificada tal como se describe en el ejemplo 1 (A) y (B). Reensamblaje: Se añadió β-mercaptoetanol a la fracción de dímero de 10 ml a una concentración final del 10%, y se añadieron 300 μl de una solución de oligodesoxinucleótido (CpG)20OpA, que contiene 12,3 nmol de oligonucleótido. La mezcla de reensamblaje se dializó en primer lugar contra 30 ml de tampón NET (Tris-HCl 20 mM, pH 7,8 con EDTA 5 mM y NaCl 150 mM) que contenía 10% de beta-mercaptoetanol durante 2 horas a 4oC y, a continuación, se dializó en un modo continuo, con un flujo de tampón NET de 8 ml/h durante 4 días a 4oC. A continuación, la mezcla de reensamblaje se desaló por diálisis contra agua, con 6 intercambios de tampón (4 x 100 ml, 2 x 1 litro).

El acoplamiento de las proteínas Fel d1de fusión a las PTV de Qβ con CpG empaquetado en el interior se lleva a cabo sustancialmente de la misma manera que la descrita en el Ejemplo 7.

5 EJEMPLO 19

El suero específico de Fel d1 inhibe in vitro la degranulación de basófilos inducida por las proteínas Fel d1 de fusión

Para evaluar la capacidad de anticuerpos IgG específicos anti-Fel d1 para inhibir la degranulación, se estimularon

10 los basófilos de un individuo alérgico con una cantidad definida de FELD1-HC o FELD1-15aa-HC pre-incubadas con una serie de diluciones de cantidades decrecientes de IgG aisladas a partir de conejos inmunizados con Qβ-FELD1-HC. La regulación ascendente de CD63 se evaluó mediante citometría de flujo. Las IgG Anti-Fel d1 bloquearon la degranulación inducida por Fel d1 en todas las concentraciones probadas, mientras que el control de IgG no mostró ningún efecto (Tabla 4).

15 TABLA 4

Muestras: Porcentaje de degranulación por FELD1-HC Porcentaje de degranulación por FELD1-15aa-HC

Sin IgG: 33 33

IgG específica de Fel d1 (200 ng/ml): 1,9 1,6

IgG específica de Fel d1 (100 ng/ml): 5,2 2,1

IgG específica de Fel d1 (50 ng/ml): 8,2 2,3

IgG específica de Fel d1 (25 ng/ml): 10,6 4,2

IgG no específica: 35 29

Sin estimulación por Fel d1: 1,2 1,2

EJEMPLO 20

20 Inmunización de ratones alérgicos a Fel d1 con Qβ-FELD1-HC

Se utilizó un modelo experimental de asma de inflamación alérgica de las vías respiratorias en ratones para evaluar los efectos de la vacunación contra el alérgeno natural Fel d1 sobre la respuesta de anticuerpos IgE en el suero y BAL (lavado broncoalveolar) de ratones BALB/c. Se sensibilizaron peritonealmente 5 ratones por grupo con 1 μg de

25 Fel d1 natural en AlumGel-S en el día 0. Los ratones se vacunaron por vía subcutánea en el día 35 y 49, bien con 50 μg de Qβ solas o bien con 50 μg de Qβ-FELD1-HC antes de dos estímulos intranasales posteriores en el día 63 y el día 70. 5 días después del último estímulo intranasal, los ratones se sacrificaron para recoger el suero y el BALF (Líquido de lavado broncoalveolar) para el análisis de la respuesta inmune humoral (titulaciones de la subclase de IgE) mediante ELISA.

30 Las placas de ELISA se recubrieron con un mAb de rata anti-IgE (2 μg/ml) diluido en tampón de carbonato durante toda la noche a 4oC. Después del bloqueo de las placas con PBS/BSA al 5% durante 2 horas, las placas se incubaron durante dos horas adicionales, bien con suero (primer pocillo dilución previa 1:100, a continuación, dilución 1:3 en 8 etapas) o BAL (primer pocillo BAL puro, a continuación dilución 1:3 en 8 etapas) de ratones

35 sensibilizados, vacunados y estimulados con antígeno. Después de 2 horas de incubación de la muestra, se detectó IgE-suero y IgE-BAL con un anticuerpo de rata antiratón IgE HRP marcado antes de la detección con el sustrato OPD.

TABLA 5

Grupo: Suero (d75) BAL (d75)

Titulación en OD50: % de reducción Titulación en OD50 % de reducción

Vacunados con Qβ: 1036 - 15 --

Vacunados con Qβ-FELD1-HC: 49 95 0 100

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Cytos Biotechnology AG Bachman, Martin F

5 Monika, BAUER F Dietmeier, Klaus Schmitz, Nicole Uzinger, Stefan

10 <120> Conjugados de alérgenos de gato y utilizaciones de los mismos

<130> P1048PC00

<150> 60/662.918 15 <151> 2005-03-18

<160> 69

<170> PatentIn version 3.2 20

<210> 1

<211> 132

<212>: PRT 25 <213> Bacteriófago Q-beta

<400> 1

<210> 2

<211> 329

<212> PRT

<213> Bacteriófago Q-beta

<400> 2

<210> 3

<211> 129

<212> PRT

<213> Bacteriófago R17

<400> 3

<210> 4

<211> 130

<212> PRT

<213> Bacteriófago fr

<400> 4

<210> 5

<211> 130

<212>: PRT 15 <213> Bacteriófago GA

<400> 5

<210> 6

<211> 132

<212> PRT

<213> Bacteriófago SP

<400> 6

<210> 7

<211> 329

<212> PRT

<213> Bacteriófago SP

<400> 7

<210> 8

<211> 130

<212> PRT

<213> Bacteriófago MS2

<400> 8

<210> 9

<211> 133

<212> PRT

<213> Bacteriófago M11

<400>9

<210> 10

<211> 133

<212> PRT

<213> Bacteriófago MX1

<400> 10

<210> 11

<211> 330 10 <212> PRT

<213> Bacteriófago NL95

<400> 11

<212> PRT

<213> Bacteriófago f2

<400> 12 10

<210> 13

<211>: 128 15 <212> PRT

<213> Bacteriófago PP7

<400> 13

<210> 14

<211> 131

<212> PRT

<213> Bacteriófago AP205

<400> 14

<210> 15

<211>: 132 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Bacteriófago Q-beta 240 mutante 10

<400 > 15

15 <210> 16

<211> 132

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

20 <220>

<223> Bacteriófago Q-beta 243 mutante

<400 > 16

<210> 17

<211> 132 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Bacteriófago Q-beta 250 mutante 10

<400 > 17

<210> 18

<211> 132 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Bacteriófago Q-beta 251 mutante 10

<400 > 18 <210> 19

<211> 132 5 <212> PRT

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Bacteriófago Q-beta 259 mutante 10

<400 > 19

<210> 20 <211>185

<212> PRT

<213> Virus de la Hepatitis B

<400> 20

<210> 21 <211>188

<212> PRT

<213> Virus de la Hepatitis B

<400> 21

<210> 22 <211>70

<212> PRT

<213> Felis domesticus

<400> 22

<210> 23 <211>92

<212> PRT 15 <213> Felis domesticus

<400> 23

5

<210> 24

<211>162

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

10

<220>

<223> fusión de la cadena 2 + cadena 1

<400> 24

15

<210> 25

<211> 90

<212> PRT

<213> Felis domesticus

<400> 25

<211> 78

<212> PRT

<213> Felis domesticus

<400> 26

<210> 27

<211> 27

<212> PRT

<213> Felis domesticus

<400> 27

10 <210> 28

<211> 27

<212> PRT

<213> Felis domesticus

15 <400> 28

<210> 29

<211> 26 20 <212> PRT

<213> Felis domesticus

<400> 29

<210> 30

<211> 19

<212> PRT 30 <213> Felis domesticus

<400> 30

Claims

REIVINDICACIONES

1. Composición que comprende:

(a)

una partícula de núcleo con, como mínimo, un primer lugar de unión, en la que dicha partícula de núcleo es una partícula de tipo viral (PTV)

(b)

como mínimo, un antígeno con, como mínimo, un segundo lugar de unión,

en la que dicho, como mínimo, un antígeno es una proteína Fel d1, en la que dicha proteína Fel d1 es una proteína de fusión que comprende la cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1, en la que dicha cadena 2 de la Fel d1 está fusionada a través de su extremo C-terminal con el extremo N-terminal de dicha cadena 1 de la Fel d1 bien directamente o bien a través de un espaciador, y en la que (a) y (b) están covalentemente enlazadas a través de dicho, como mínimo, un primer y dicho, como mínimo, un segundo lugar de unión.
2.

Composición, según la reivindicación 1, en la que dicha cadena 2 de la Fel d1 está fusionada a través de su extremo N-terminal con el extremo C-terminal de dicha cadena 1 de la Fel d1 a través de un espaciador, en el que dicho espaciador está compuesto preferentemente por una secuencia de aminoácidos que tiene 1-20 residuos de aminoácidos, en la que preferentemente dicho espaciador consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene 1-20 residuos de aminoácidos.
3.

Composición, según la reivindicación 2, en la que dicho espaciador es (GGGGS)3.
4.

Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en la que dicha proteína de fusión comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que comprende:

(a)

Sec. No. Id.: 24;

(b)

Sec. No. Id.: 54; y

(C)

Sec. No. Id.: 55;
5.

Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha cadena 1 de la Fel d 1 comprende una secuencia de Sec. No. Id.: 22 o una secuencia homóloga a la misma, en la que dicha secuencia homóloga tiene una identidad con la Sec. No. Id.: 22 mayor del 80%, preferentemente mayor del 90%, o aún más preferentemente mayor del 95%.
6.

Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha cadena 2 de la Fel d 1 comprende una secuencia de Sec. No. Id.: 23, Sec. No. Id.: 25 o Sec. No. Id.: 26, o una secuencia homóloga a las mismas, en la que dicha secuencia homóloga tiene una identidad con las Sec. No. Id.: 23, Sec. No. Id.: 25 o la Sec. No. Id.: 26 mayor del 80%, preferentemente mayor del 90%, y aún más preferentemente mayor del 95%.
7.

Composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicha partícula de tipo viral es una partícula de tipo viral de un bacteriófago de ARN, en la que dicho bacteriófago de ARN se selecciona de Qβ, fr, GA o AP205.
8.

Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho primer lugar de unión comprende, o preferentemente es, un grupo amino, preferentemente un grupo amino de una lisina.
9.

Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho segundo lugar de unión comprende, o preferentemente es, un grupo sulfhidrilo, preferentemente un grupo sulfhidrilo de una cisteína.
10.

Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha partícula de tipo viral con dicho, como mínimo, un primer lugar de unión, se enlaza con dicha, como mínimo, una proteína Fel d1 con dicho, como mínimo, un segundo lugar de unión a través de un enlace covalente no peptídico.
11.

Composición, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un conector, en la que dicho conector se fusiona con el extremo C-terminal de dicha proteína Fel d1, y en la que preferentemente dicho conector comprende dicho segundo lugar de unión.
12.

Vacuna que comprende la composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que dicha vacuna comprende además, como mínimo, un adyuvante.
13.

Composición farmacéutica que comprende:

(a)

la composición según cualquiera de las reivindicaciones 1-9; y

(b)

un portador aceptable farmacéuticamente.
14.

Método de producción de la composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende:

(a)

proporcionar una partícula de núcleo con, como mínimo, un primer lugar de unión, en el que dicha partícula de núcleo es una partícula de tipo viral (PTV);

(b)

proporcionar, como mínimo, un antígeno con, como mínimo, un segundo lugar de unión, en el que dicho antígeno es una proteína Fel d1, en el que dicha proteína Fel d1 es una proteína de fusión que comprende la

5 cadena 1 de la Fel d1 y la cadena 2 de la Fel d1, en el que dicha cadena 2 de la Fel d1 se fusiona a través de su extremo C-terminal con el extremo N-terminal de dicha cadena 1 de la Fel d1 bien directamente o bien a través de un espaciador; y

(c) enlazar dicha partícula de núcleo y dicho, como mínimo, un antígeno para producir dicha composición, en

la que dicho, como mínimo, un antígeno y dicha partícula de núcleo están enlazados a través de dicho, como 10 mínimo, un primer y dicho, como mínimo, un segundo lugar de unión.
15. Utilización de la composición, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la alergia a los gatos.