CN101141979A - 猫变应原融合蛋白及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医学、公共卫生、免疫学、分子生物学和病毒学领域。本发明提供包含病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒和至少一种抗原的组合物，所述抗原特别是至少一种猫抗原，更特别地是至少一种为人变应原的猫抗原。在特定实施方案中，抗原是与VLP共价连接的Feld1抗原或其片段。本发明也提供制备所述组合物的方法。本发明的组合物在哺乳动物，特别是在人中诱导有效的免疫应答，特别是抗体应答。本发明的组合物和方法可以用于制备疫苗，该疫苗特别用于治疗和/或预防对猫毛皮屑和其他猫抗原和变应原的变态反应。

Description

猫变应原融合蛋白及其用途
发明背景
技术领域
本发明属于医学、公共卫生、免疫学、分子生物学和病毒学领域。本发明提供包含病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒和至少一种抗原的组合物，所述抗原特别是至少一种猫抗原，更特别地是至少一种为人变应原的猫抗原。在特定实施方案中，所述抗原是与VLP共价连接的Fel d1抗原或其片段。本发明也提供制备所述组合物的方法。本发明的组合物在哺乳动物中，特别是在人中诱导有效的免疫应答，特别是抗体应答。本发明的组合物和方法可以用于制备疫苗，该疫苗特别用于治疗和/或预防对猫毛皮屑和其他猫抗原和变应原的变态反应。
背景技术
家猫(Felis domesticus)是室内变应原的一种重要的来源(Lau，S.等人.(2000)Lancet 356，1392-1397)。实际上，在西方国家中有大约25％的家庭养猫，并且在一大部分群体中发现针对猫的变态反应。症状的严重程度从相对较轻的鼻炎和结膜炎到潜在危及生命的哮喘加重不等。
尽管患者偶然对猫毛皮屑和毛皮中的几种不同的分子敏感，但是主要的变应原是Fel d1(即家猫变应原1；以前称为Cat 1，即猫变应原1)。这种变应原的重要性已经在大量研究中被强调。事实上超过80％的猫过敏患者显示出针对该强变应原的IgE抗体(van Ree，R.等人(1999)J.Allergy Clin Immunol 104，1223-1230)。
Fel d1是35-39kDa的酸性糖蛋白，含有10-20％的N-连接的碳水化合物，存在于猫的毛皮、唾液和泪腺中。它是由两个非共价连接的异二聚体形成的。每一个异二聚体由一个70个残基的肽(称为“链1”)和一个78、85、90或92个残基的肽(称为“链2”)组成，这两个肽由单独的基因编码(参见，Duffort，O.A.等(1991)MolImmunol 28，301-309；Morgenstern，J.P.等(1991)Proc Natl AcadSci USA 88，9690-9694和Griffith，I.J.等(1992)Gene 113，263-268)。
当前对猫过敏患者的治疗是通过脱敏疗法，包括重复注射剂量逐渐提高的猫毛皮屑粗提物或由Fel d1衍生的短肽。Lilja等人和Hedlin等人公开了一种脱敏程序，在此过程中给予猫过敏患者猫毛皮屑粗提物(Lilja，Q，等(1989)J Allergy Clin Immunol 83，37-44和Hedlin等(1991)J Allergy Clin Immunol 87，955-964)。该程序至少需要两到三年，而患者在三年治疗后仍然具有全身症状。使用由Fel d1衍生的短肽进行脱敏在肽治疗组和安慰剂组之间没有获得显著性差异(Oldfield，W.L.等(2002)Lancet 360，47-53)。只在给予患者大量(750μg)短肽时才观察到效力(Norman，P.S.等(1996)Am J Respir Crit Care Med 154，1623-1628)。
在猫毛皮屑粗提物治疗和短肽治疗中都曾经报道了变应性副作用，如延迟哮喘反应。因此，由于注射变应原引起的过敏性休克对于任何脱敏程序都是重要的安全性问题。然而，通过减少变应原的注射量来避免这种效应也降低了治疗的效力或延长了治疗。因此，在猫变态反应治疗领域非常需要替代的脱敏方案，特别是能够减少变应性症状而不引发变应性副反应的脱敏方案。
发明内容
现在，我们惊奇地发现，分别包含至少一种本发明的Fel d1抗原或其片段的本发明的组合物和疫苗不仅能够诱导针对Fel d1的免疫应答，特别是抗体应答，而且能够使患有猫变态反应的患者脱敏，从而特别是在短期内分别指示本发明的组合物和疫苗的高效力。另外，我们惊奇地发现，本发明的Fel d1当与本发明的VLP共价连接时，与未与VLP共价连接的本发明的Fel d1相比，具有显著降低的过敏活性，同时保持高度的抗原性和免疫原性。与现有技术的猫变态反应治疗相比，这是非常有利的，因为本发明的组合物和疫苗分别显著减少了在被免疫的动物和人中引起过敏性休克的危险。此外，本发明的组合物和疫苗分别允许给予抗原的剂量大大高于现有技术的猫变态反应治疗，这又可以提高效力和/或缩短整个脱敏程序。因此，本发明的组合物和疫苗分别诱导强抗-Fel d1免疫应答，但是不引发变态反应。
因此，在第一方面，本发明提供一种组合物，其包含：(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒，其中所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒；和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是Fel d1蛋白或Fel d1片段，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点共价连接，优选形成有序且重复的抗原阵列。
在另一个方面，本发明提供一种疫苗组合物。而且，本发明提供一种给对猫、优选对猫Fel d1过敏的人或非人哺乳动物如狗施用该疫苗组合物的方法。在一个优选实施方案中，疫苗组合物还含有至少一种佐剂。然而，本发明的疫苗组合物在不存在至少一种佐剂的情况下能够诱导强免疫应答，特别是抗体应答。因此，在一个优选实施方案中，该疫苗不含佐剂。避免使用佐剂可以减少可能发生的与使用佐剂有关的副作用。
在一个优选实施方案中，组合物和疫苗组合物中包含的VLP分别在宿主中重组产生，并且该VLP基本不含宿主RNA，优选不含宿主核酸。有利的是减少或者优选消除宿主的量，优选不含宿主核酸，以避免不希望的T细胞应答以及其它不希望的副作用，如发热。
在一个优选实施方案中，本发明的组合物还含有至少一种免疫刺激物，优选至少一种免疫刺激性核酸。在一个进一步优选的实施方案中，免疫刺激性核酸包装在本发明的VLP内。使免疫刺激物、优选免疫刺激性核酸包含在本发明的组合物内可以使免疫应答转向Th1应答，由此抑制Th2应答，从而抑制IgE的产生。
一方面，本发明提供一种治疗猫变态反应的方法，该方法包括给猫过敏者，优选人，分别施用本发明的组合物或疫苗。
在另一方面，本发明提供包含本发明的组合物和可接受的药物载体的药物组合物。
再另一方面，本发明提供一种制备本发明的组合物的方法，包括：(a)提供具有至少一个第一附着位点的核心颗粒，其中所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒；(b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述抗原是Fel d1蛋白或Fel d1片段；和(c)将所述核心颗粒与所述至少一种抗原相组合，产生所述组合物，其中所述至少一种抗原和所述核心颗粒通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。
在一个方面，本发明提供一种Fel d1融合蛋白，其包含通过氨基酸间隔区融合的Fel d1的链1和Fel d1的链2，所述间隔区连接一条链的N末端和另一条链的C末端，其中所述氨基酸间隔区由具有10-30个氨基酸残基的氨基酸序列组成，并且其中所述融合蛋白是在大肠杆菌中产生的，或者其中所述融合蛋白是未被糖基化的。
附图说明
图1显示在SDS-PAGE非还原凝胶上考马斯蓝染色的纯化的和复性的Fel d1融合蛋白。泳道1中的样品含有DTT作为还原剂。泳道2中的样品不含DTT。
图2显示了单独的Fel d1融合蛋白或与Qβ偶联的Fel d1融合蛋白引起的嗜碱性粒细胞的脱粒。X轴代表相应的Fel d1蛋白的浓度。Y轴代表已经脱粒的嗜碱性粒细胞的百分比。
图3显示在第0、7、1 4天接受Qβ-FELD1的猫过敏志愿者的皮肤穿刺试验结果，该试验也在第0、14、21天进行。
图4A显示在第0、7、14天接受Qβ-FELD1的猫过敏志愿者的鼻剂量增加得分和鼻总得分(图4B)，该试验也在第0、14、21天进行。
发明详述
除非另有定义，本文使用的所有技术和科技术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的含义。
佐剂：本文使用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激物，或可以在宿主中产生储库(depot)的物质，当分别与本发明的疫苗和药物组合物组合时可以产生更强的免疫应答。有多种佐剂可以使用。例子包括弗氏完全和不完全佐剂、氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。其它佐剂包括无机矿物凝胶如氢氧化铝，表面活性物质如溶血卵磷脂、复合多元醇、聚阴离子、肽、油状乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基酚，以及潜在的可用于人的佐剂如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这些佐剂在本领域中公知。能够与本发明的组合物一起施用的其它佐剂包括但不限于：单磷酰脂质免疫调节剂、AdjuVax 100a、QS-21、QS-18、CRL1005、铝盐(明矾)、MF-59、OM-174、OM-197、OM-294和病毒体佐剂技术。佐剂也可包括这些物质的混合物。VLP通常被描述为佐剂。然而，在本申请中使用的术语“佐剂”是指这样一种佐剂，它不是用于本发明组合物的VLP，而是除所述VLP以外的佐剂。
抗原：本文所用的术语“抗原”指如果被MHC分子呈递，则能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。本文所用的术语“抗原”也包括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别，以及/或者能够诱导体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的活化。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有Th细胞表位或者连接于Th细胞表位上，并且包含于佐剂中。一个抗原可能包含一个或多个表位(B和T表位)。上面提到的特异性反应表示抗原优选地一般以高选择性方式与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的其它许多抗体或TCR反应。本文所用的抗原也可以是几种不同抗原的混合物。
抗原性位点：术语“抗原性位点”和术语“抗原性表位”在本文中可以互换使用，是指多肽的连续或不连续的部分，它可以被抗体或在MHC分子环境内被T细胞受体免疫特异性地结合。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但是不一定排除交叉反应性。抗原性位点在对于该抗原性位点而言独特的空间构象中一般包含5-10个氨基酸。
联接的(associated)：本文所用的术语“联接的”(或其名词：联接)是指所有可能的方式，优选化学相互作用，通过这种方式，两个分子联接在一起。化学相互作用包括共价和非共价的相互作用。非共价相互作用的典型例子是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷键、碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。
第一附着位点：本文所用的短语“第一附着位点”是指VLP中天然存在的或者人工添加到VLP中的一种元件，第二附着位点可与之连接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)、或化学反应基如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基或其组合。作为第一附着位点的化学反应基的一个优选的实施方案是氨基酸如赖氨酸的氨基。第一附着位点一般位于VLP的表面上，优选位于VLP的外表面上。多个第一附着位点一般以重复构型存在于病毒样颗粒的表面上，优选外表面上。在一个优选的实施方案中，第一附着位点与VLP通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键联接。在一个进一步优选的实施方案中，第一附着位点自然存在于VLP中。可替代地，在一个优选的实施方案中，第一附着位点被人工添加到VLP上。
第二附着位点：本文使用的短语“第二附着位点”是指天然存在于或者人工添加到本发明的Fel d1上的一种元件，第一附着位点可以与之连接。本发明的Fel d1的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、氨基酸、糖、多核苷酸、天然或合成的聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)、或化学反应基例如氨基、羧基、巯基、羟基、胍基、组氨酰基、或其组合。作为第二附着位点的化学反应基的一个优选的实施方案是巯基，优选氨基酸半胱氨酸的巯基。因此术语“具有至少一个第二附着位点的本发明的Fel d1”是指包含本发明的Fel d1和至少一个第二附着位点的构建体。但是，特别是对于非天然存在于本发明的Fel d1内的第二附着位点来说，这种构建体典型且优选地还含有“连接体”。在另一个优选的实施方案，第二附着位点与本发明的Fel d1通过至少一个共价键，优选通过至少一个肽键联接。在另一个实施方案中，第二附着位点自然存在于本发明的Feld1内。在另外一个优选的实施方案中，通过连接体将第二附着位点人工添加到本发明的Fel d1上，其中该连接体包含半胱氨酸或者由半胱氨酸组成。优选地，连接体与本发明的Fel d1通过肽键融合。
外壳蛋白：本申请中的术语“外壳蛋白”和可互换使用的术语“衣壳蛋白”是指能够掺入病毒衣壳或VLP内的病毒蛋白质，优选病毒(优选RNA噬菌体)的天然衣壳的亚单位。
本发明的Fel d1：本文使用的术语“本发明的Fel d1”是指至少一种Fel d1蛋白或至少一种Fel d1片段。
Fel d1的链1：本文使用的术语“Fel d1的链1”是指包含SEQ IDNO：22的氨基酸序列或其同源序列或由该序列组成的多肽。本文使用的术语“SEQ ID NO：22的同源序列”是指与SEQ ID NO：22具有大于70％，优选大于80％，更优选大于90％，更优选大于95％的同一性的多肽。本文所用的术语“Fel d1的链1”应当还包括含有至少一个翻译后修饰的多肽，这种修饰包括但不限于本文定义的Fel d1的链1的至少一个糖基化。优选地，本文定义的Fel d1的链1由总共最多130个、更优选最多100个氨基酸组成。
Fel d1的链2：本文使用的术语“Fel d1的链2”是指包含SEQ IDNO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的氨基酸序列或其同源序列或由该序列组成的多肽。本文使用的术语“SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的同源序列”是指与SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26具有大于70％，优选大于80％，更优选大于90％，更优选大于95％的同一性的多肽。本文所用的术语“Fel d1的链2”应当还包括含有至少一个翻译后修饰的多肽，这种修饰包括但不限于本文定义的Fel d1的链2的至少一个糖基化。优选地，本文定义的Fel d1的链2由总共最多150个、更优选最多130个、更优选最多100个氨基酸组成。
Fel d1蛋白：本文使用的术语“Fel d1蛋白”是指包含Fel d1的链1和Fel d1的链2或者由其组成的蛋白质。优选地，Fel d1的链1和Fel d1的链2共价连接。在一个优选实施方案中，Fel d1的链1和Fel d1的链2通过至少一个二硫键连接。在另一个优选实施方案中，链1和链2直接融合或者通过间隔区融合，在后一种情况下，所述Fel d1蛋白还包含或者由间隔区组成。优选地，本文定义的Feld1蛋白由总共最多300个、更优选最多200个氨基酸组成。典型且优选地，本发明的Fel d1蛋白能够在体内诱导产生与天然存在的Fel d1或与按照本发明实施例5制备的重组Fel d1特异性结合的抗体。
Fel d1片段：本文使用的术语“Fel d1片段”是指包含或者由Fel d1的至少一个抗原性位点组成的多肽。典型且优选地，本文使用的术语“Fel d1片段”是指包含或者由Fel d1的至少两个抗原性位点组成的多肽。优选地，这些抗原性位点共价连接，进一步优选地，这些抗原性位点通过至少一个肽键连接，在这种情况下，在抗原性位点之间可能需要间隔区。优选地，该至少两个抗原性位点来源于Feld1的链1和Fel d1的链2两者。优选地，本文定义的Fel d1片段由总共最多130个、更优选最多100个、再更优选60个氨基酸组成。典型且优选地，Fel d1片段能够在体内诱导产生与天然存在的Fel d1或与按照本发明实施例5制备的重组Fel d1特异性结合的抗体。
连接的：本文所用的术语“连接的”(或其名词：连接)是指所有可能的方式，优选化学相互作用，通过这种方式，至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价的相互作用。非共价相互作用的典型例子是离子相互作用、疏水相互作用或氢键，而共价相互作用例如基于共价键如酯、醚、磷酯、酰胺、肽、碳-磷键、碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。在某些优选实施方案中，第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键连接，优选通过至少一个非肽键连接，更优选只通过非肽键连接。然而，本文所用的术语“连接”应当不仅包括至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点的直接连接，而且可替代地并且优选地，包括至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点通过中间分子的间接连接，典型且优选地通过使用至少一个，优选一个异双功能交联剂连接。
连接体：本文所用的“连接体”将第二附着位点与本发明的Feld1联接，或者已经包含第二附着位点、基本由、或者由第二附着位点组成。优选地，本文所用的“连接体”已经包含第二附着位点，典型且优选地-但不是必需地-为一个氨基酸残基，优选半胱氨酸残基。本文所用的“连接体”也被称为“氨基酸连接体”，特别是当本发明的连接体含有至少一个氨基酸残基时。因此，术语“连接体”和“氨基酸连接体”在本文中可以交换使用。然而，这并不意味着这种连接体仅由氨基酸残基组成，即使由氨基酸残基组成的连接体是本发明的优选的实施方案。连接体的氨基酸残基优选由本领域已知的天然氨基酸或非天然氨基酸、其全L型或全D型或混合物组成。本发明的连接体的进一步优选的实施方案是包含巯基或半胱氨酸残基的分子，这些分子因此也包括在本发明中。可用于本发明的其他连接体有包含C1-C6烷基-、环烷基如环戊基或环己基、环烯基、芳基或杂芳基部分的分子。而且，优选包含C1-C6烷基-、环烷基-(C5，C6)、芳基-或杂芳基-部分和另外的氨基酸的连接体也可以用作本发明的连接体，并且包括在本发明的范围内。连接体与本发明的Fel d1优选通过至少一个共价键，更优选通过至少一个肽键联接。
有序且重复的抗原阵列：本文所用的术语“有序且重复的抗原阵列”通常是指抗原的重复模式，或者其特征在于抗原相对于病毒样颗粒的空间排列具有典型且优选地高度的均一性。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可以是几何模式。本发明的某些实施方案，例如与RNA噬菌体的VLP偶联的抗原，是合适的有序且重复的抗原阵列的典型且优选的实例，其具有严格重复的类晶体抗原排列，优选间隔1-30纳米，优选2-15纳米，更优选2-10纳米，更优选2-8纳米，进一步更优选1.6-7纳米。
包装的：本文所用的术语“包装的”是指聚阴离子大分子或免疫刺激物相对于VLP的状态。本文所用的术语“包装”包括结合，该结合可以是共价的，例如化学偶联，也可以是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。该术语也包括聚阴离子大分子的包封或部分包封。因此，聚阴离子大分子或免疫刺激物可以被VLP包封，而不需存在实际上的结合，特别是共价结合。在优选的实施方案中，至少一个聚阴离子大分子或免疫刺激物被包装在VLP内，最优选地以非共价的方式包装。
间隔区：术语“间隔区”以及其等同使用的术语“氨基酸间隔区”是指一段氨基酸序列，它不超过30个氨基酸，并且连接Fel d1的一条链的N末端与另一条链的C末端。
病毒颗粒：本文使用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态学形式。在某些病毒类型中，它包含由蛋白质衣壳围绕的基因组；另外一些具有另外的结构(例如被膜、尾等)。
本文使用的病毒样颗粒(VLP)是指非复制性或非传染性的，优选非复制性且非传染性的病毒颗粒，或者是指非复制性或非传染性的，优选非复制性且非传染性的类似于病毒颗粒优选病毒衣壳的结构。本文使用的术语“非复制性”是指不能复制VLP所含的基因组。本文使用的术语“非传染性”是指不能进入宿主细胞。优选地，本发明的病毒样颗粒是非复制性和/或非传染性的，因为它缺乏全部或部分的病毒基因组或基因组功能。在一个实施方案中，病毒样颗粒是其中病毒基因组已经被物理或化学灭活的病毒颗粒。典型且更优选地，病毒样颗粒缺少病毒基因组的全部或部分复制性和传染性部分。本发明的病毒样颗粒可能含有与其基因组不同的核酸。本发明的病毒样颗粒的一个典型且优选的实施方案是病毒衣壳，如相应病毒、噬菌体，优选RNA噬菌体的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。典型地，有60、120、180、240、300、360个和360个以上的病毒蛋白亚单位。典型且优选地，这些亚单位的相互作用导致形成具有固有的重复组织的病毒衣壳或病毒衣壳样结构，其中所述结构一般是球形或管状。例如，RNA-噬菌体或HBcAg的衣壳具有二十面体对称的球形结构。本文使用的术语“衣壳样结构”是指类似于以上定义的衣壳形态、但是不同于典型的对称装配体、而同时保持充分的有序性和重复性程度的由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。
病毒颗粒和病毒样颗粒的一个共同特征是其高度有序且重复的亚单位排列。
RNA噬菌体的病毒样颗粒：本文使用的术语“RNA噬菌体的病毒样颗粒”是指包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段或者优选基本由其组成或者由其组成的病毒样颗粒。另外，RNA噬菌体的病毒样颗粒类似于RNA噬菌体的结构，并且是非复制性或非传染性的，并且至少缺少编码RNA噬菌体的复制机制的基因，一般也缺少编码负责病毒附着或进入宿主的蛋白质的基因。然而，该定义应当也包括上述基因仍然存在但是无活性的RNA噬菌体的病毒样颗粒，这样也可产生非复制性和/或非传染性的RNA噬菌体的病毒样颗粒。来源于RNA-噬菌体的优选的VLP显示二十面体对称，并且由180个亚单位组成。在本申请的公开内容中，术语“亚单位”和“单体”在上下文中可互换并且等同地使用。使RNA噬菌体的病毒样颗粒成为非复制性和/或非传染性的优选方法是通过物理、化学灭活，如紫外线照射、甲醛处理，典型且优选地通过遗传操作。
一种或一个：术语“一种”或“一个”在本申请中使用时，除非另外说明，是指“至少一种(个)”或“一种(个)或一种(个)以上”。
多肽的氨基酸序列同一性可以使用诸如Bestfit程序等已知计算机程序常规确定。当使用Bestfit或其它任何序列比对程序，优选使用Bestfit来确定一种特定序列与参照氨基酸序列是否例如95％相同时，将参数设置为使得在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分比，并且允许最多占参照序列中氨基酸残基总数的5％的同源性缺口。上述测定多肽之间百分同一性的方法适用于本发明公开的所有蛋白质、多肽或其片段。
在本申请中，如果抗体与抗原结合的结合亲和力(Ka)为106M-1或更高，优选107M-1或更高，更优选108M-1或更高，最优选109M-1或更高，则该抗体被定义为特异性结合。本领域技术人员可以容易地测定抗体的亲和力(例如通过Scatchard分析)。
本发明提供本发明的组合物，其包含：(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒，其中所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒；和(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是Fel d1蛋白或Fel d1片段，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点共价连接。优选地，Fel d1蛋白或Fel d1片段与核心颗粒连接，从而形成有序且重复的抗原-VLP阵列。在本发明的优选实施方案中，至少20个，优选至少30个，更优选至少60个，更优选至少120个，进一步更优选至少180个Fel d1蛋白或Fel d1片段与核心颗粒连接。
可以选择本领域公知的任何具有有序且重复的结构的病毒作为本发明的VLP或病毒颗粒。其外壳或衣壳蛋白能够用于制备VLP的示例性的DNA或RNA病毒已经在WO 2004/009124的第25页第10-21行，第26页第11-28行，和第28页第4行到第31页第4行公开。这些公开的内容在此引入作为参考。
病毒或病毒样颗粒可以从病毒感染的细胞培养物中产生和纯化。获得的用于疫苗目的的病毒或病毒样颗粒优选地应当是无复制性或无感染性的，更优选无复制性且无感染性的。紫外线照射、化学处理，例如用甲醛或氯仿处理，是本领域技术人员已知用来灭活病毒的常用方法。
在一个优选实施方案中，核心颗粒是病毒颗粒，并且其中优选地所述病毒颗粒是噬菌体的病毒颗粒，并且其中进一步优选地所述噬菌体是RNA噬菌体，其中更进一步优选地所述RNA噬菌体是选自Qβ、fr、GA或AP205的RNA噬菌体。
在一个优选实施方案中，核心颗粒是VLP。在一个进一步优选的实施方案中，VLP是一种重组VLP。几乎所有公知的病毒都已经被测序，并且可以容易地被公众获得。本领域技术人员可以容易地确定编码外壳蛋白的基因。通过在宿主中重组表达外壳蛋白来制备VLP是本领域技术人员公知的常识。
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或者由选自下组的病毒的重组蛋白、其突变体或片段组成：a)RNA噬菌体；b)噬菌体(bacteriophages)；c)乙型肝炎病毒，优选其衣壳蛋白(Ulrich等人，Virus Res.50：141-182(1998))或其表面蛋白(WO 92/11291)；d)麻疹病毒(Warnes等人，Gene 160：173-178(1995))；e)辛德毕斯病毒；f)轮状病毒(US 5,071,651和US 5,374,426)；g)口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine 13：1603-1610，(1995))；h)诺沃克病毒(Jiang，X.等人，Science 250：1580-1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J.Clin.Invest.87：1456-1461(1991))；i)甲病毒；j)逆转录病毒，优选其GAG蛋白(WO 96/30523)；k)逆转录转座子Ty，优选蛋白p1；l)人乳头瘤病毒(WO 98/15631)；m)多瘤病毒；n)烟草花叶病毒；和o)禽兽棚病毒。
在一个优选实施方案中，VLP包含或者由重组蛋白、其突变体或片段的一种以上的氨基酸序列，优选两种氨基酸序列组成。包含或者由一种以上的氨基酸序列组成的VLP在本申请中被称为嵌合VLP。
本文使用的术语“重组蛋白的片段”或术语“外壳蛋白的片段”被定义为分别为野生型重组蛋白或外壳蛋白长度的至少70％，优选至少80％，更优选至少90％，更优选至少95％，并且优选保留形成VLP的能力的多肽。优选地，该片段通过至少一个内部缺失、至少一个截短或至少一个它们的组合而获得。术语“重组蛋白的片段”或术语“外壳蛋白的片段”还包括与以上定义的“重组蛋白的片段”或“外壳蛋白的片段”分别具有至少80％，优选90％，更优选95％的氨基酸序列同一性并且优选能够装配为病毒样颗粒的多肽。
在本发明中可以交换使用的术语“突变重组蛋白”或术语“重组蛋白突变体”，或者在本发明中可以交换使用的术语“突变外壳蛋白”或术语“外壳蛋白突变体”，分别是指具有来源于野生型重组蛋白或外壳蛋白的氨基酸序列的多肽，其中该氨基酸序列与野生型序列至少80％，优选至少85％、90％、95％、97％或99％相同，并且优选地保留装配为VLP的能力。
在一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒是乙型肝炎病毒的病毒样颗粒。乙型肝炎病毒样颗粒的制备已经在WO 00/32227、WO 01/85208和WO 02/056905中公开，所有这三篇文献在这里都引用以作参考。适合在本发明的实施中使用的HBcAg的其他变体在WO02/056905的第34-39页已经公开。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，将赖氨酸残基导入HBcAg多肽中，来介导本发明的Fel d1与HBcAg的VLP的连接。在优选的实施方案中，利用包含SEQ ID NO：20的氨基酸1-144、或1-149、1-185或者由该序列组成的HBcAg制备本发明的VLP和组合物，其中该氨基酸序列被修饰使得第79和80位的氨基酸被替代为具有Gly-Gly-Lys-Gly-Gly氨基酸序列的肽。这个修饰将SEQ ID NO：20改变为SEQ ID NO：21。在进一步优选的实施方案中，SEQ ID NO：21或其相应片段(优选1-144或1-149)的第48和110位的半胱氨酸残基被突变为丝氨酸。本发明进一步包括包含具有上述相应氨基酸改变的乙型肝炎核心蛋白突变体的组合物。本发明进一步包括分别包含HBcAg多肽的组合物和疫苗，该HBcAg多肽包含与SEQ ID NO：21至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列或者由该序列组成。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒包含、或者基本由、或者由RNA噬菌体的重组外壳蛋白、其突变体或片段组成。优选地，该RNA噬菌体选自：a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；l)噬菌体PP7和m)噬菌体AP205。
在本发明的一个优选实施方案中，所述组合物包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段，其中该外壳蛋白具有选自以下序列的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：1；涉及QβCP；(b)SEQ ID NO：1和SEQID NO：2的混合物(涉及QβA1蛋白)；(c)SEQ ID NO：3；(d)SEQ IDNO：4；(e)SEQ ID NO：5；(f)SEQ ID NO：6；(g)SEQ ID NO：6和SEQID NO：7的混合物；(h)SEQ ID NO：8；(i)SEQ ID NO：9；(j)SEQ IDNO：10；(k)SEQ ID NO：11；(l)SEQ ID NO：12；(m)SEQ ID NO：13；和(n)SEQ ID NO：14。
在本发明的一个优选实施方案中，VLP是嵌合VLP，包含RNA噬菌体的外壳蛋白、其突变体或片段的一种以上的氨基酸序列，优选两种氨基酸序列，或者由该氨基酸序列组成。
在一个非常优选的实施方案中，VLP包含或者由RNA噬菌体的两种不同的外壳蛋白组成，所述两种外壳蛋白具有SEQ ID NO：1和SEQID NO：2，或SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7的氨基酸序列。
在本发明的优选实施方案中，本发明的病毒样颗粒包含或者基本由或者由RNA噬菌体Qβ、fr、AP205或GA的重组外壳蛋白、其突变体或片段组成。在一个优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP，优选RNA噬菌体Qβ、fr、AP205或GA的VLP。
在一个优选实施方案中，本发明的VLP是RNA噬菌体Qβ的VLP。Qβ的衣壳或病毒样颗粒显示为二十面体噬菌体样衣壳结构，直径为25nm，T＝3半对称。该衣壳含有180个拷贝的外壳蛋白，它们通过二硫键连接为共价五聚体和六聚体(Golmohammadi R.等人，Structure4：543-5554(1996))，使Qβ衣壳具有显著的稳定性。然而，由重组Qβ外壳蛋白构成的衣壳或VLP可能含有不通过二硫键与衣壳内的其它亚单位连接的或不完全连接的亚单位。我们惊奇地发现，高达30％的DMSO和乙腈浓度和高达1M的胍盐浓度不影响衣壳的稳定性。Qβ的衣壳或VLP的高稳定性是一个有利的特征，特别是对于根据本发明免疫和接种哺乳动物和人的用途而言。
根据本发明进一步优选的RNA噬菌体、特别是Qβ和fr的病毒样颗粒，已经在WO 02/056905中公开，其公开内容在此引用作为参考。特别地，WO 02/056905的实施例18给出了由Qβ制备VLP颗粒的详细描述。
在另一个优选实施方案中，本发明的VLP是RNA噬菌体AP205的VLP。在本发明的实践中也可以使用AP205VLP的能够装配的突变形式，包括氨基酸5位的脯氨酸被置换为苏氨酸的AP205外壳蛋白，导致本发明的其他优选的实施方案。WO 2004/007538，特别是在实施例1和实施例2中，描述了如何获得包含AP205外壳蛋白的VLP，以及特别是其表达和纯化。WO 2004/007538在此引入作为参考。AP205VLP具有高度免疫原性，可以与本发明的Fel d1连接，典型且优选地产生展示以重复方式定向的本发明的Fel d1的疫苗构建体。产生了针对这样展示的本发明的Fel d1的高抗体效价，这表明连接的本发明的Fel d1容易与抗体分子相互作用，并且具有免疫原性。
在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的VLP包含或者由病毒、优选RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成，其中通过置换和/或通过删除而除去至少一个赖氨酸残基，从而修饰了该突变外壳蛋白。在另一个优选实施方案中，本发明的VLP包含或者由病毒、优选RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成，其中通过置换和/或通过插入而添加至少一个赖氨酸残基，从而修饰了该突变外壳蛋白。至少一个赖氨酸残基的删除、置换或添加可以改变偶联程度，即病毒、优选RNA噬菌体的每个VLP亚单位上本发明的Fel d1的量，特别是，用来满足和适应疫苗的要求。
在一个优选的实施方案中，本发明的组合物和疫苗具有0.5到4.0的抗原密度。本文所用的术语“抗原密度”是指VLP、优选RNA噬菌体的VLP的每个亚单位上、优选每个外壳蛋白上连接的本发明的Fel d1的平均数。因此，该值可以计算为在本发明的组合物或疫苗中VLP、优选RNA噬菌体的VLP的所有亚单位或单体上的平均数。
Qβ外壳蛋白的VLP或衣壳在其表面上展示数量确定的赖氨酸残基，具有3个赖氨酸残基指向衣壳内部并与RNA相互作用，而另外4个赖氨酸残基暴露于衣壳外部的确定的拓扑学。优选地，至少一个第一附着位点是指向或位于VLP外部的赖氨酸残基。
其中暴露的赖氨酸残基被置换为精氨酸的Qβ突变体可以用于本发明。因此，在本发明的另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含突变Qβ外壳蛋白、基本由或由突变Qβ外壳蛋白组成。优选地，这些突变外壳蛋白包含或者由选自下组的氨基酸序列组成：a)Qβ-240(SEQID NO：15，SEQ ID NO：1的Lys13-Arg)；b)Qβ-243(SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：1的Asn10-Lys)；c)Qβ-250(SEQ ID NO：17，SEQ IDNO：1的Lys2-Arg)；d)Qβ-251(SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：1的Lys16-Arg)；和e)Q0-259″(SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：1的Lys2-Arg，Lys16-Arg)。上述Qβ突变外壳蛋白、突变Qβ外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化分别在WO 02/056905中描述。特别参考上述申请的实施例18。
在本发明的另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由Qβ的突变外壳蛋白、或其突变体或片段和相应的A1蛋白组成。在一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或者基本由或者由具有氨基酸序列SEQ ID NO：15、16、17、18或19的突变外壳蛋白和相应的A1蛋白组成。
其它一些RNA噬菌体外壳蛋白在细菌宿主中表达时也显示自装配(Kastelein，RA.等人，Gene 23：245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287：452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology 170：238-242(1989)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249：283-297(1995))。特别是已经公开了GA(Ni，CZ，等人，ProteinSci.5：2485-2493(1996)，Tars，K等人，J.Mol.Biol.271：759-773(1997))和fr(Pushko P.等人，Prot.Eng.6：883-891(1993)，Liljas，L等人.J Mol.Biol.244：279-290，(1994))的生物学和生化性质。几种RNA噬菌体的晶体结构已经确定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4：543-554(1996))。利用这些信息，能够确定表面暴露的残基，从而能够修饰RNA噬菌体的外壳蛋白，以便可以通过插入或置换方式插入一个或多个反应性氨基酸残基。来源于RNA噬菌体的VLP的另一个优点是它们在细菌中的高表达产率，这允许以可承受的成本产生大量的物质。
在一个优选实施方案中，本发明的组合物包含至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是Fel d1蛋白。
在一个优选实施方案中，Fel d1蛋白包含或者由天然存在的Feld1组成。链1的一级结构是SEQ ID NO 22的序列。报道的链1的变体是Lys29-Arg或Asn、Val33-Ser、Val60-Leu。链2的一级结构是SEQ ID NO 23、25或26的序列。报道的链2的变体是SEQ ID NO：23、25或26的Cys7-Phe、Phe15-Thr、Asn19-Ser、Gly20-Leu、Ile55-Val、Arg57-Lys、Val58-Phe。链2的其他变体有SEQ ID NO：25的Glu69-Val、Tyr70-Asp、Met72-Thr、Gln-77-Glu和Asn86-Lys；SEQ ID NO：23的Met74-Thr、Gln79-Glu和Asn88-Lys(Griffith I.J.等人，Gene113：263-268(1992)；Morgenstern J.P.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：9690-9694(1991).Duffort O.A.，等人Mol.Immunol.28：301-309(1991)；Leitermann K.，等人，J.Allergy Clin.Immunol.74：147-153(1984)；Kristensen，A.K，等人.(1997)Biol Chem 378，899-908)。天然存在的Fel d1通过从(例如)猫唾液、猫毛皮屑、猫所生活的房间的屋尘等中纯化获得。
在一个优选实施方案中，本发明的Fel d1是重组Fel d1蛋白或重组Fel d1片段。本文使用的重组Fel d1蛋白或重组Fel d1片段是指通过包括重组DAN技术的至少一个步骤的方法获得的Fel d1蛋白或Fel d1片段。术语“重组Fel d1蛋白或重组Fel d1片段”和“重组产生的Fel d1蛋白或重组产生的Fel d1片段”在本文中可以互换使用，应当具有相同的含意。重组Fel d1蛋白或片段可以在原核表达系统例如大肠杆菌(WO 2004/094639)或真核表达系统如杆状病毒(WO 00/20032)中产生。Seppl等人公开了在杆状病毒中通过双顺反子启动子同时表达Fel d1的链1和链2(J.Biol.Chem.Nov，2004)。重组产生的Fel d1蛋白或片段可以是糖基化或非糖基化的，这取决于用来产生重组蛋白的宿主细胞。
在一个实施方案中，重组Fel d1蛋白包含或者由Fel d1蛋白的链1和Fel d1蛋白的链2组成，其中所述Fel d1的链1和Fel d1的链2仅通过非共价键如疏水相互作用联接。
在一个优选实施方案中，重组Fel d1蛋白包含或者由Fel d1的链1和Fel d1的链2组成，其中所述Fel d1的链1与Fel d1的链2通过至少一个共价键联接。在一个优选实施方案中，至少一个共价键是非肽键，其中所述非肽键是二硫键，或者其中优选地所述非肽键是二硫键。例如，Fel d1的链1和Fel d1的链2可以分开表达，然后在允许正确形成二硫键的条件下组合在一起，例如通过改组(reshuffling)法。可替代地，Fel d1的链1和Fel d1的链2可以在一个宿主中同时表达，例如通过将编码Fel d1的链1和Fel d1的链2的基因分别克隆到一个质粒中处于两个启动子之下。在真核表达系统中，Fel d1的链1和Fel d1的链2可以转录为一个mRNA，并且由内部核糖体进入位点(IRES)分开翻译。
在一个优选实施方案中，Fel d1蛋白包含或者由融合蛋白组成，其中所述融合蛋白包含Fel d1的链1和Fel d1的链2。在一个优选实施方案中，所述Fel d1的链1和所述Fel d1的链2直接融合或者通过一个肽键融合，该肽键连接一条链的N末端和另一链的C末端。在另一个优选实施方案中，所述Fel d1的链1和所述Fel d1的链2通过间隔区融合，该间隔区连接一条链的N末端和另一链的C末端。优选地所述间隔区具有1-30个、优选1-25个、优选1-20个、优选1-15个、优选1-9个、优选1-5个、优选1-3个氨基酸。可替代地，所述间隔区具有10-30个、优选10-25个、更优选10-20个、更优选13-20个、更优选15-20个、更优选13-17个、更优选15-17个氨基酸。优选地，所述间隔区由具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基的氨基酸序列组成。在一个优选实施方案中，所述间隔区具有15个氨基酸。在一个进一步优选的实施方案中，所述间隔区是(GGGGS)3。
在一个优选实施方案中，融合蛋白包含选自下组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：24；(b)SEQ ID NO：54；(c)SEQ ID NO：55；(d)SEQID NO：56；和(e)SEQ ID NO：57。
在一个优选实施方案中，所述Fel d1的链2通过其C末端与所述Fel d1的链1的N末端直接融合或者通过间隔区融合。在一个进一步优选的实施方案中，所述Fel d1蛋白包含或者由SEQ ID NO：24的氨基酸序列组成。
WO 2004/094639公开了分子和生物学性质类似于天然对应物的重组折叠的Fel d1，并且具体公开了编码Fel d1链2的N末端与链1直接融合的融合体的合成基因。大肠杆菌表达产生非共价联接的同型二聚体，其表观分子量根据大小排阻层析确定为30kDa，每个19177Da的亚单位显示与在天然Fel d1中发现的相同的二硫键模式，并且天然和重组Fel d1具有相同的折叠。重组Fel d1与天然Fel d1类似地与来自猫过敏患者的血清的IgE反应。因此，该Fel d1融合蛋白模拟天然Fel d1的抗原性。
在一个优选实施方案中，Fel d1的链1通过其C末端与Fel d1的链2的N末端直接融合或者通过间隔区融合。
在一个优选实施方案中，Fel d1的链1包含SEQ ID NO：22的序列或其同源序列，或由该序列组成，其中所述同源序列与SEQ ID NO：22具有大于80％，优选大于90％，或更优选大于95％的同一性。
在一个优选实施方案中，所述Fel d1的链2包含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的序列或其同源序列，或由该序列组成，其中所述同源序列与SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ IDNO：26具有大于80％，优选大于90％，更优选大于95％的同一性。
在一个优选实施方案中，Fel d1蛋白是重组Fel d1蛋白，其中至少一个二硫键被破坏，优选通过突变、更优选通过保守性置换例如Cys置换为Ser而被破坏。在天然Fel d1中已经鉴定了连接两个肽的三个链间二硫键，即Cys3(1)-Cys73(2)、Cys44(1)-48Cys(2)和Cys70(1)-Cys7(2)，提示Fel d1肽为反平行方向。(Kristensen，A.K.，等人.(1997)Biol Chem 378，899-908)。在一个优选实施方案中，Fel d1蛋白的一个这样的二硫键被破坏。在一个进一步优选的实施方案中，Fel d1蛋白的两个这样的二硫键被破坏。在一个进一步优选的实施方案中，Fel d1蛋白的所有三个这样的二硫键都被破坏。在一个优选实施方案中，链1的Cys70被删除或突变。在另一个优选实施方案中，该链的Cys73被删除或突变。在一个优选实施方案中，所述Fel d1蛋白是包含直接融合或通过间隔区融合的Fel d1蛋白的链1和Fel d1蛋白的链2的融合蛋白，其中所有三个这样的二硫键都被破坏。在一个进一步优选的实施方案中，所述Fel d1蛋白包含或者由SEQ ID NO：24、55或57的氨基酸序列组成，其中至少一个、优选至少三个、更优选至少五个半胱氨酸通过置换或删除而被除去。
在一个优选实施方案中，本发明的抗原包含或者由Fel d1片段组成。众所周知，具有免疫原性通常不需要全长蛋白质，一个蛋白质通常含有一个以上的抗原性表位，即抗原性位点。一个片段或短肽可能足以含有至少一个可被抗体或MHC分子环境内的T细胞受体免疫特异性结合的抗原性位点。抗原性位点可以通过本领域技术人员公知的大量技术来确定。可以通过序列比对和结构预测来进行。例如，人们可以使用诸如Rasmol的程序预测可能的α-螺旋、转角、链间和链内二硫键等。人们可以进一步预测埋藏在分子内的序列或暴露于分子表面的序列。暴露于分子表面的序列更可能含有天然抗原性位点，因此在诱导治疗性抗体中有用。在确定表面肽序列后，例如，通过饱和诱变法(如丙氨酸扫描诱变，Cunningham BC，Wells JA.Science 1989Jun 2；244(4908)：1081-5)，可以进一步确定该序列内的抗原性位点。简要地说，将该序列内的氨基酸一个一个地突变为丙氨酸，其丙氨酸突变分别显示与抗体(抗野生型序列)的结合降低或总体丧失结合的氨基酸可能是抗原性位点的成分。测定抗原性位点的另一种方法是产生覆盖Fel d1全长序列的重叠的肽(Geysen，PNAS Vol 81：3998-4002，(1984)和Slootstra，J.W.等人，(1996)Mol.Divers.1，87-96)。
在一个优选实施方案中，本发明的抗原包含或者由至少一个、优选至少两个Fel d1表位、进一步优选至少一个来源于Fel d1的链1的表位和至少一个来源于Fel d1的链2的表位组成。
Fel d1的T细胞反应性表位已经在整个Fel d1蛋白上作图，并且已经在现有技术中公开，如US 6120769，第14栏第4段，US 6025162的第130和131栏，这些公开内容引入本文作为参考。在一个优选实施方案中，Fel d1的T细胞表位选自SEQ ID NO：27-32。
本发明提供一种制备本发明组合物的方法，包括：(a)提供具有至少一个附着位点的VLP；(b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述抗原是Fel d1蛋白或Fel d1片段；和(c)将所述VLP和所述至少一种抗原相组合，产生所述组合物，其中所述至少一种抗原和所述VLP通过所述第一附着位点和所述第二附着位点连接。在一个优选的实施方案中，提供具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，即Fel d1蛋白或Fel d1片段，是通过表达而实现的，优选通过在细菌系统、优选在大肠杆菌中表达。为了有利于纯化过程，通常添加标签，如His标签、Myc标签。在另一种方法中，特别可以化学合成具有不长于50个氨基酸的Fel d1片段。
在本发明的一个优选实施方案中，具有至少一个第一附着位点的VLP与具有至少一个第二附着位点的本发明的Fel d1通过至少一个肽键连接。编码本发明的Fel d1、优选Fel d1片段、更优选不长于50个氨基酸，更优选不到30个氨基酸的片段的基因，符合读框地连接到编码VLP外壳蛋白的基因的内部或优选N末端或C末端。本发明的抗原用于病毒的外壳蛋白、其突变体或片段的实施方案已经在WO2004/009124的第62页第20行至第68页第17行公开，在此引入作为参考。
在一个优选实施方案中，Fel d1片段与RNA噬菌体AP205的外壳蛋白、其突变体或片段的N末端或C末端融合。在一个进一步优选的实施方案中，所述融合蛋白还包括间隔区，其中所述间隔区与AP205的外壳蛋白、其片段或突变体和本发明的Fel d1融合。
在本发明的一个优选实施方案中，组合物包含或基本由通过至少一个共价键连接的具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒和具有至少一个第二附着位点的至少一个本发明的Fel d1组成，优选地该共价键是非肽键。在本发明的一个优选实施方案中，第一附着位点包含或优选地是氨基，优选赖氨酸残基的氨基。在本发明的另一个优选的实施方案中，第二附着位点包含或优选地是巯基，优选半胱氨酸的巯基。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，至少一个第一附着位点是氨基，优选赖氨酸的氨基，并且至少一个第二附着位点是巯基，优选半胱氨酸的巯基。
在本发明的一个优选实施方案中，通过化学交联，典型且优选地通过使用异双功能交联剂，将本发明的Fel d1与VLP连接。在优选的实施方案中，所述异双功能交联剂含有能够与VLP的优选的第一附着位点、优选氨基、更优选赖氨酸残基的氨基反应的一个官能团，和能够与本发明的Fel d1上固有的或人工添加的优选的第二附着位点、即巯基、优选半胱氨酸残基的巯基反应的另一个官能团，任选地该另一个官能团也可通过还原用于反应。有几种异双功能交联剂在本领域公知。包括优选的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和例如可从Pierce Chemical Company获得的、具有一个氨基反应性官能团和一个巯基反应性官能团的其它交联剂。上述交联剂均导致在与氨基反应后形成酰胺键和与巯基反应后形成硫醚键。适用于实施本发明的另一类交联剂的特征在于偶联时在本发明的Fel d1与VLP之间引入二硫键。属于这一类的优选交联剂包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。
在一个优选实施方案中，本发明的组合物还包含连接体。根据本发明的公开内容，通过连接优选包含至少一个适合作为第二附着位点的氨基酸的连接体，实现向本发明的Fel d1上构建第二附着位点。因此，在本发明的一个优选实施方案中，连接体通过至少一个共价键、优选通过至少一个、通常一个肽键与本发明的Fel d1连接。优选地，连接体包含或者由第二附着位点组成。在一个进一步优选的实施方案中，连接体包含巯基，优选半胱氨酸残基的巯基。在另一个优选的实施方案中，氨基酸连接体是半胱氨酸残基。
连接体的选择取决于本发明的Fel d1的性质，取决于其生化性质，如pI、电荷分布和糖基化。柔性的氨基酸连接体通常是有利的。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，连接体由氨基酸组成，其中进一步优选地，连接体由最多25个，优选最多20个，更优选最多15个氨基酸组成。在本发明的另一优选实施方案中，氨基酸连接体含有不超过10个氨基酸。连接体的优选实施方案选自：(a)CGG；(b)N-端γ1连接体(例如CGDKTHTSPP，SEQ ID NO：58)；(c)N-端γ3连接体(例如CGGPKPSTPPGSSGGAP，SEQ ID NO：69)；(d)Ig铰链区；(e)N-端甘氨酸连接体(例如GCGGGG，SEQ ID NO：59)；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0-12，k＝0-5；(g)N-端甘氨酸-丝氨酸连接体((GGGGS)n，n＝1-3，具有另外一个半胱氨酸(例如SEQ ID NO：60，它相当于其中n＝1的实施方案)；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2(例如SEQ ID NO：61，它相当于其中n＝1、k＝1、l＝1且m＝1的实施方案)；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C端γ1连接体(例如DKTHTSPPCG，SEQ ID NO：62)；(m)C-端γ3连接体(例如PKPSTPPGSSGGAPGGCG，SEQ ID NO：63)；(n)C-端甘氨酸连接体(GGGGCG，SEQ ID NO：64)；(o)(G)nC(G)k，其中n＝0-12，k＝0-5；(p)C-端甘氨酸-丝氨酸连接体((SGGGG)n，n＝1-3，具有另外一个半胱氨酸(例如SEQ ID NO：65，它相当于其中n＝1的实施方案))；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，o＝0-8(例如SEQ ID NO：66，它相当于其中n＝1、k＝1、l＝1、o＝1且m＝1的实施方案)。在一个进一步优选的实施方案中，连接体被添加到本发明的Fel d1的N末端。在本发明的另一个优选实施方案中，接连体被添加到本发明的Fel d1的C末端。
本发明优选的连接体是进一步含有半胱氨酸残基作为第二附着位点的甘氨酸连接体(G)n，如N-末端甘氨酸连接体(GCGGGG)和C-末端甘氨酸连接体(GGGGCG)。进一步优选的实施方案是C-末端甘氨酸-赖氨酸连接体(GGKKGC，SEQ ID NO：67)和N-末端甘氨酸-赖氨酸连接体(CGKKGG，SEQ ID NO：68)，位于肽的C-末端的GGCG、GGC或GGC-NH2(″NH2″代表酰胺化)连接体、或位于其N-末端的CGG。甘氨酸残基通常插入大氨基酸与作为第二附着位点的半胱氨酸之间，以避免偶联反应中较大氨基酸的潜在的空间位阻。
在一个优选实施方案中，连接体与Fel d1蛋白或Fel d1片段的N末端融合。在一个进一步优选的实施方案中，连接体是GCGG。在另一个优选实施方案中，连接体与Fel d1蛋白或Fel d1片段的C末端融合。在一个进一步优选的实施方案中，连接体是GGC。在由两个多肽链组成的Fel d1蛋白或Fel d1片段的情况中，这些Fel d1蛋白或Fel d1片段具有两个N末端或两个C末端。连接体可以与两个N末端或与两个C末端都融合。优选地，连接体只与两个N末端之一或只与两个C末端之一融合。
根据上述优选方法利用异双功能交联剂连接本发明的Fel d1与VLP，使得本发明的Fel d1以定向方式与VLP偶联。连接本发明的Fel d1和VLP的其它方法包括使用碳二亚胺EDC和NHS交联本发明的Fel d1和VLP的方法。本发明的Fel d1也可以首先通过反应，例如与SATA、SATP或亚氨硫醇(iminothiolane)反应而硫醇化。必要时，在脱保护之后，本发明的Fel d1可以和VLP如下所述偶联。在分离过量的硫醇化试剂之后，本发明的Fel d1与预先用含有半胱氨酸反应性部分的异双功能交联剂活化的VLP反应，该活化的VLP展示至少一个或几个对半胱氨酸残基具有反应性的官能团，如上所述的硫醇化的本发明的Fel d1能够与该官能团反应。任选地，在反应混合物中含有少量的还原剂。另外一些方法使用同型双功能交联剂，如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(Pierce)或含有对VLP的胺基或羧基有反应性的官能团的其它已知同型双功能交联剂，将本发明的Fel d1与VLP连接。
在本发明的其他实施方案中，所述组合物包含或者基本由通过化学相互作用连接到本发明的Fel d1上的病毒样颗粒组成，其中这些化学相互作用中的至少一个不是共价键。例如，VLP与本发明的Feld1的连接可以通过将VLP生物素化并将本发明的Fel d1表达为链霉抗生物素-融合蛋白而实现。
一种或几种抗原分子，即本发明的Fel d1，如果空间允许，可以优选通过RNA噬菌体VLP外壳蛋白上暴露的赖氨酸残基附着到VLP、优选RNA噬菌体外壳蛋白的一个亚单元上。因此，RNA噬菌体的VLP，特别是Qβ外壳蛋白VLP的一个具体特征是每个亚单元有偶联数个抗原的可能性。这样就允许产生密集的抗原阵列。
在本发明非常优选的实施方案中，本发明的Fel d1通过已添加到本发明的Fel d1的N末端或C末端上的半胱氨酸残基，或本发明的Feld1内的自然半胱氨酸残基，与RNA噬菌体VLP的外壳蛋白的赖氨酸残基连接，特别是与Qβ的外壳蛋白连接。
如上所述，4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的VLP的表面。典型且优选地，这些残基在与交联剂分子反应时被衍生化。当不是所有的暴露赖氨酸残基都能与抗原偶联时，已与交联剂反应的赖氨酸残基使得交联剂分子在衍生化步骤后附着到ε-氨基上。这就使可能对VLP的溶解性和稳定性不利的一个或几个正电荷消失。通过例如公开的Qβ外壳蛋白突变体中那样用精氨酸取代某些赖氨酸残基，我们防止了正电荷的过度消失，因为精氨酸残基并不能与优选的交联剂反应。此外，用精氨酸残基取代赖氨酸残基会产生更确定的抗原阵列，因为只有较少的位点可与抗原反应。
因此，在下列的Qβ外壳蛋白突变体中，用精氨酸取代暴露的赖氨酸残基：Qβ-240(Lys13-Arg；SEQ ID NO：15)，Qβ-250(Lys 2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO：17)，Qβ-259(Lys 2-Arg，Lys 16-Arg；SEQID NO：19)和Qβ-251；(Lys 16-Arg，SEQ ID NO：18)。在另一实施方案中，我们公开了具有另一个赖氨酸残基的Qβ突变外壳蛋白Qβ-243(Asn 10-Lys；SEQ ID NO：16)，其适合于获得更高密度的抗原阵列。
在本发明的一个优选实施方案中，本发明的VLP由宿主重组产生，并且其中所述VLP基本不含宿主RNA，优选宿主核酸。在一个进一步优选的实施方案中，所述组合物还包含至少一种与VLP结合、优选包装或包封于VLP内部的聚阴离子大分子。在一个进一步优选的实施方案中，聚阴离子大分子是聚谷氨酸和/或聚天冬氨酸。
基本不含宿主RNA、优选宿主核酸：本文所用的术语“基本不含宿主RNA，优选宿主核酸”是指VLP所含的宿主RNA、优选宿主核酸的量，该量典型且优选地为每mg VLP不到30μg，优选不到20μg，更优选不到10μg，甚至更优选不到8μg，甚至更优选不到6μg，甚至更优选不到4μg，最优选不到2μg。在上述内容中使用的宿主是指在其中重组产生VLP的宿主。测定RNA、优选核酸的量的常规方法是本领域技术人员公知的。根据本发明测定RNA、优选核酸的量的典型且优选的方法在同一受让人于2005年10月5日提交的PCT/EP2005/055009的实施例17中描述。对于含有Qβ以外的VLP的本发明的组合物，测定RNA、优选核酸的量典型且优选地使用相同、相似或类似的条件。最终需要的条件的改变是本领域技术人员的常识。确定的量的数值应当典型且优选地被理解为包括指定数值±10％、优选±5％偏差的数值。
聚阴离子大分子：本文所用的术语“聚阴离子大分子”是指包含重复负电荷基团的高相对分子量的分子，其结构基本包括实际上或概念上来源于低相对分子量的分子的多个重复单位。聚阴离子大分子的分子量应当为至少2000道尔顿，更优选至少3000道尔顿，甚至更优选至少5000道尔顿。本文所用的术语“聚阴离子大分子”典型且优选地指不能活化toll-样受体的分子。因此术语“聚阴离子大分子”典型且优选地不包括Toll-样受体配体，甚至更优选地不包括免疫刺激物，如Toll-样受体配体、免疫刺激性核酸和脂多糖(LPS)。更优选地，本文所用的术语“聚阴离子大分子”是指不能诱导细胞因子产生的分子。甚至更优选地，术语“聚阴离子大分子”不包括免疫刺激物。本文所用的术语“免疫刺激物”是指能够诱导和/或增强特别针对本发明中包括的抗原的免疫应答的分子。
宿主RNA、优选宿主核酸：本文使用的术语“宿主RNA、优选宿主核酸”或术语“具有二级结构的宿主RNA、优选宿主核酸”是指最初由宿主合成的RNA或优选核酸。然而，RNA、优选核酸在典型且优选地通过本发明的方法减少或去除RNA、优选核酸的量的过程中可能经受化学和/或物理学改变，例如，RNA、优选核酸的大小可能被缩短，或者其二级结构可能改变。但是，甚至这种得到的RNA或核酸仍然被认为是宿主RNA，或宿主核酸。
2005年10月5日同一受让人提交的PCT/EP2005/055009公开了确定VLP包含的RNA的量以及减少VLP包含的RNA的量的方法，因此整个申请引入本文作为参考。减少或消除宿主RNA、优选宿主核酸的量，最小化或者减少了不希望的T细胞应答，如炎性T细胞应答和细胞毒性T细胞应答，和其他不希望的副作用，如发热，而同时保持特异性针对Fel d1的强抗体应答。
在一个优选实施方案中，本发明提供一种制备本发明的组合物和本发明的RNA噬菌体VLP-Fel d1的方法，其中所述VLP由宿主重组产生，并且其中所述VLP基本不含宿主RNA、优选宿主核酸，该方法包括以下步骤：a)由宿主重组产生具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP)，其中所述VLP包含RNA-噬菌体的外壳蛋白、其变体或片段；b)将所述病毒样颗粒解装配为所述RNA噬菌体的所述外壳蛋白、其变体或片段；c)纯化所述外壳蛋白、其变体或片段；d)将所述纯化的所述RNA噬菌体的外壳蛋白、其变体或片段重装配为病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒基本不含宿主RNA、优选宿主核酸；和e)将具有至少一个第一附着位点的至少一个本发明的抗原与步骤(d)获得的所述VLP连接。在一个进一步优选的实施方案中，所述纯化的外壳蛋白、其变体或片段的重装配在至少一种聚阴离子大分子的存在下实现。
在一个优选实施方案中，本发明的组合物还包含至少一种能够诱导和/或增强免疫应答的免疫刺激物。优选地，免疫刺激物是Toll-样受体配体，优选选自：(a)免疫刺激性核酸；(b)肽聚糖；(c)脂多糖；(d)脂磷壁酸；(e)咪唑并喹啉化合物；(f)鞭毛蛋白；(g)脂蛋白；(h)免疫刺激性有机分子；(i)含非甲基化CpG的寡核苷酸；和(j)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)和(i)的物质的任意混合物。
在一个进一步优选的实施方案中，免疫刺激性核酸选自：(a)细菌来源的核酸；(b)病毒来源的核酸；(c)包含非甲基化CpG基序的核酸；(d)双链RNA；(e)单链RNA；和(g)不含CpG基序的核酸。不含非甲基化CpG基序的免疫刺激性核酸已经在现有技术中公开，例如WO01/22972。本文使用的术语“核酸”是指由线性共价连接的单体(核苷酸)组成的分子。它是指核苷酸分子链，不是指特定长度的产物。因此，寡核苷酸包括在核酸的定义内。核苷酸之间的键典型且优选地是磷酸二酯键。包含键的修饰例如硫代磷酸键的核酸也包括在本发明中。
在一个优选的实施方案中，免疫刺激物与重组VLP混合。在另一个优选的实施方案中，免疫刺激物与本发明的VLP结合，优选包装在本发明的VLP内。
免疫刺激物，特别是免疫刺激性核酸，更特别是包含非甲基化CpG的寡核苷酸的详细描述已经在WO 03/024480、03/024481和PCT/EP/04/003165中公开。混合免疫刺激物和VLP-抗原的方法已经在WO 03/024480中公开。将免疫刺激物包装在VLP内的方法已经在WO 03/024481中公开。WO 03/024480、03/024481和PCT/EP/04/003165的完整申请因此引入本文作为参考。VLP通常可以诱导和/或增强免疫系统。然而，在本申请中使用的术语“免疫刺激物”是指不是用于本发明组合物的VLP的免疫刺激物，而是除所述VLP以外的免疫刺激物。
本发明的组合物内包含免疫刺激物，优选免疫刺激性核酸，可以使免疫应答转为Th1应答，由此抑制Th2应答。
在一个方面，本发明提供一种含有本发明的组合物的疫苗。在一个方面，本发明提供一种含有本发明的组合物和适当的缓冲液的疫苗。在一个优选实施方案中，该疫苗组合物还包含至少一种佐剂。所述至少一种佐剂的施用可以在施用本发明的组合物之前、同时或之后进行。本文使用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激物，或可以在宿主中产生储库(depot)的物质，当分别与本发明的疫苗和药物组合物且合时可以产生更强的免疫应答。
在另一个优选实施方案中，所述疫苗组合物不含佐剂。本发明的一个有利的特征是组合物的高免疫原性，甚至在不含佐剂时依然如此。不使用佐剂可以减少与使用佐剂有关的副作用的可能的发生。因此，优选地给患者施用本发明的疫苗组合物而不需在施用该疫苗之前、同时或之后给同一名患者施用至少一种佐剂。
本发明进一步公开了一种免疫方法，包括给人或非人哺乳动物如狗或猫施用本发明的疫苗。并非意在用理论限制本发明，给猫注射本发明的疫苗组合物可以中和Fel d1，因而减少猫唾液中Fel d1的量。
疫苗可以用本领域所知的各种方法施用，但是通常通过注射、输注、吸入、口服或其他适当的物理方法来施用。或者，偶联物可以肌肉内、静脉内、经粘膜、经皮、鼻内、腹膜内或皮下施用。用于施用的偶联物的组分包括无菌水溶液(例如生理盐水)或非水溶液和悬液。非水溶剂的例子有丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和注射用有机酯如油酸乙酯。可以利用载体或封闭敷料提高皮肤通透性并促进抗原吸收。
如果接受个体能够耐受本发明的疫苗的施用，则认为该疫苗是“药学可接受的”。进而，本发明的疫苗将以“治疗有效量”(即产生希望的生理学效果的量)施用。免疫应答的性质或类型不是本申请公开内容的限制因素。并非意在通过以下机制的解释来限制本发明，本发明的疫苗可以诱导可与Fel d1结合的抗体，推测为IgG亚型，因而阻止了与肥大细胞和嗜碱性粒细胞结合的IgE发现Fel d1。可替代地或者同时，本发明的组合物使免疫应答转为Th1应答，由此抑制了Th2应答的发展和IgE抗体的产生，IgE抗体是变态反应中的一种主要成分。
在一个方面，本发明提供一种包含本发明所述组合物和可接受的药物载体的药物组合物。当给个体施用本发明的疫苗时，它可以是含有盐、缓冲液、佐剂或其他改善偶联物效果所需的物质的形式。适合在制备药物组合物中使用的材料的例子在许多资料中提供，包括REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES(Osol，A，ed，MackPublishing Co，(1990))。
本发明教导了一种制备本发明的组合物的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供具有至少一个附着位点的核心颗粒，其中所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒；(b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述至少一种抗原是Fel d1蛋白或Feld1片段；和(c)将所述核心颗粒和所述至少一种抗原组合，产生组合物，其中所述至少一种抗原和所述核心颗粒通过所述第一附着位点和第二附着位点连接。
在一个进一步优选的实施方案中，提供具有至少一个附着位点的核心颗粒的步骤包括以下另外的步骤：(a)将所述核心颗粒解装配为所述核心颗粒的外壳蛋白、其突变体或片段；(b)纯化所述外壳蛋白、其突变体或片段；(c)重装配所述纯化的所述核心颗粒的外壳蛋白、其突变体或片段，其中所述核心颗粒基本不含宿主RNA、优选宿主核酸。在一个进一步优选的实施方案中，所述纯化的外壳蛋白的重装配在至少一种聚阴离子大分子或至少一种免疫刺激性核酸的存在下实现。
在一个方面，本发明提供一种使用本发明的组合物预防和/或治疗哺乳动物中的猫变态反应的方法，其中优选地所述哺乳动物是人或狗。
在一个方面，本发明教导了本发明的组合物作为药物的用途。在另一方面，本发明提供了本发明的组合物在制备治疗哺乳动物中的猫变态反应的药物中的用途，其中优选地所述哺乳动物是人或狗。
在另一方面，本发明提供了一种Fel d1融合蛋白，该融合蛋白包含通过氨基酸间隔区融合的Fel d1的链1和Fel d1的链2，所述间隔区连接一条链的N末端和另一条链的C末端，其中所述氨基酸间隔区由具有10-30个、优选10-25个、优选10-20个、优选13-20个、优选15-20个、优选13-17个、优选15-17个氨基酸残基的氨基酸序列组成，并且其中所述融合蛋白不是这样的融合蛋白：其包含的SEQID NO：22的链1通过(GGGGS)3与SEQ ID NO：23、25或26的链2的N末端融合，并且其中所述排除的融合蛋白在杆状病毒表达系统中表达。
WO2004094639公开了通过用连接体连接链1和链2形成的Fel d1融合蛋白，该连接体选自碳-氮键和短肽，即具有1-9个、优选1-5个、特别优选1-3个氨基酸。它进一步指出键或短肽不诱导显著的约束或解折叠。然而，WO 2004094639没有公开比9个氨基酸长的连接体。
WO 00/20032公开了杆状病毒表达的重组Fel d1，其含有连续表达并且通过甘氨酸/丝氨酸连接体(GGGGS)3连接在一起的链1和链2。WO 00/20032也报道了与在大肠杆菌中表达的变应原相比，在杆状病毒中表达变应原显著改善了rFel d1对于IgG和IgE抗体的免疫反应性。
本发明的Fel d1融合蛋白可以在原核表达系统中产生，也可以在真核表达系统如杆状病毒系统中产生。在一个优选实施方案中，所述本发明的Fel d1融合蛋白从大肠杆菌中产生。
在一个优选实施方案中，本发明的Fel d1融合蛋白包含的间隔区由具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸残基的氨基酸序列组成。
在一个优选实施方案中，Fel d1融合蛋白包含的间隔区由具有2、3或4次GGGGS重复的氨基酸序列组成。
在一个优选实施方案中，Fel d1的链2位于本发明的融合蛋白的N末端。
在另一个优选实施方案中，Fel d1的链1位于本发明的融合蛋白的N末端。在一个进一步优选的实施方案中，融合蛋白从大肠杆菌中产生。
在一个非常优选的实施方案中，本发明的Fel d1融合蛋白包含选自下组的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：54；(b)SEQ ID NO：55；和(c)SEQ ID NO：57。本发明进一步提供编码本发明的Fel d1融合蛋白的核苷酸序列。在一个优选的实施方案中，本发明提供编码本发明的融合蛋白的核苷酸序列，该融合蛋白的氨基酸序列选自：(a)SEQ IDNO：54；(b)SEQ ID NO：55；和(c)SEQ ID NO：57。在一个进一步优选的实施方案中，本发明的Fel d1融合蛋白在大肠杆菌中产生。在一个进一步优选的实施方案中，本发明的Fel d1融合蛋白包含或者由SEQ ID NO：57的氨基酸序列组成，其中所述本发明的融合蛋白在大肠杆菌中产生。
在一个方面，本发明提供本发明的Fel d1融合蛋白在诊断和治疗猫变态反应中的用途。
实施例
实施例1
在不同聚阴离子大分子的存在下，通过解装配/重装配制备本发明的Qβ VLP，产生重装配的Qβ VLP
(A)现有技术Qβ VLP的解装配
从大肠杆菌裂解液中纯化的溶于PBS(20mM磷酸盐，150mM NaCl，pH 7.5)中的45mg现有技术Qβ VLP(2.5mg/ml，通过Bradford分析测定)在搅拌条件下于室温用10mM DTT还原15分钟。然后加入氯化镁至0.7M的终浓度，继续在搅拌条件下于室温温育15分钟，导致包裹的宿主细胞RNA被沉淀。溶液于4℃下以4000rpm离心10分钟(Eppendorf 5810R，固定角转头A-4-62，在下列所有步骤中均使用)，以从溶液中除去沉淀的RNA。用含有释放的二聚Qβ外壳蛋白的上清液进行层析纯化步骤。
(B)通过阳离子交换层析和大小排阻层析纯化Qβ外壳蛋白
含有二聚体外壳蛋白、宿主细胞蛋白质和残留的宿主细胞RNA的解装配反应上清液用水1∶15稀释，以调节电导率低于10mS/cm，并加样到SP-Sepharose FF柱(xk16/20，6ml，Amersham Bioscience)上。该柱预先用20mM磷酸钠缓冲液pH 7平衡。用达到20mM磷酸钠/500mM氯化钠的分步梯度来完成对结合的外壳蛋白的洗脱，以大约25ml的级分体积收集蛋白质。以5ml/min的流速在室温下进行层析，在260nm和280nm处测量吸光度。
在第二步中，将分离的Qβ外壳蛋白(从阳离子交换柱上洗脱的级分)加样到(分两次进行)用20mM磷酸钠/250mM氯化钠pH 6.5平衡的Sephacryl S-100HR柱(xk26/60，320ml，Amersham Bioscience)上。以2.5ml/min的流速在室温下进行层析，在260nm和280nm处测量吸光度。收集5ml的级分。
(C1)通过透析重装配Qβ VLP
将纯化的Qβ外壳蛋白(2.2mg/ml，在20mM磷酸钠pH 6.5中)、一种聚阴离子大分子(2mg/ml水溶液)、尿素(7.2M水溶液)和DTT(0.5M水溶液)混合至终浓度为1.4mg/ml外壳蛋白、0.14mg/ml各自的聚阴离子大分子、1M尿素和2.5mM DTT。使用3.5kDa阻断值的膜将混合物(各1ml)于5℃下在20mM TrisHCl，150mM NaCl pH8中透析2天。聚阴离子大分子是：聚半乳糖醛酸(25000-50000，Fluka)、硫酸葡聚糖(MW 5000和10000，Sigma)、聚-L-天冬氨酸(MW11000和33400，Sigma)、聚-L-谷氨酸(MW 3000、13600和84600，Sigma)和来自面包酵母和小麦胚的tRNA。
(C2)通过渗滤重装配QβVLP
将33ml纯化的Qβ外壳蛋白(1.5mg/ml，在20mM磷酸钠pH 6.5，250mM NaCl中)与水和尿素(7.2M水溶液)、NaCl(5M水溶液)和聚-L-谷氨酸(2mg/ml水溶液，MW：84600)混合。混合物的体积为50ml，各成分的终浓度为1mg/ml外壳蛋白、300mM NaCl、1.0M尿素和0.2mg/ml聚-L-谷氨酸。然后在使用Pellicon XL膜柱(Biomax 5K，Millipore)的正切流动过滤装置中，应用10ml/min的横流速和2.5ml/min的渗透流速，用500ml的20mM TrisHCl pH 8，50mM NaCl在室温下渗滤该混合物。
实施例2
AP205 VLP的体外装配
(A)AP205外壳蛋白的纯化
解装配：20ml的AP205 VLP溶液(1.6mg/ml，在PBS中，从大肠杆菌提取物中纯化)与0.2ml的0.5M DTT混合，于室温温育30分钟。加入5ml的5M NaCl，然后将该混合物于60℃下温育15分钟，使DTT-还原的外壳蛋白沉淀。将浑浊的混合物离心(转头Sorvall SS34，10000g，10min，20℃)，弃去上清液，将沉淀物分散到20ml的1M尿素/20mM柠檬酸钠pH 3.2中。于室温下搅拌30分钟后，加入1.5M Na2HPO4将分散液调节至pH 6.5，然后离心(转头Sorvall SS34，10000g，10min，20℃)，获得含有二聚体外壳蛋白的上清液。
阳离子交换层析：用20ml水稀释上清液(见上)，以调节电导率约为5mS/cm。将得到的溶液加至预先用20mM磷酸钠pH 6.5缓冲液平衡的6ml SP Sepharose FF柱(Amersham Bioscience)上。加样后，用48ml 20mM磷酸钠pH 6.5缓冲液洗柱，然后以20倍柱体积用达到1M NaCl的线性梯度洗脱结合的外壳蛋白。合并主峰级分，通过SDS-PAGE和UV光谱法进行分析。根据SDS-PAGE，分离的外壳蛋白是基本纯化的，基本不含其他蛋白质杂质。根据UV光谱法，蛋白质浓度为0.6mg/ml(总量12mg)，1个A280单位反映1.01mg/ml AP205外壳蛋白。此外，A280值(0.5999)与A260值(0.291)之比为2，表明该制品基本不含核酸。
(B)AP205 VLP的装配
在不含任何聚阴离子大分子的条件下的装配：将上述洗脱的蛋白质级分渗滤并且通过TFF浓缩，至在20mM磷酸钠pH 6.5中的蛋白质浓度为1mg/ml。将500μl该溶液与50μl的5M NaCl溶液混合，于室温下温育48小时。混合物中重装配的VLP的形成通过非还原SDS-PAGE和大小排阻HPLC显示。使用用20mM磷酸钠，150mMNaCl pH 7.2平衡的TSKgel G5000 PWXL柱(Tosoh Bioscience)进行HPLC分析。
在聚谷氨酸存在下的装配：将375μl纯化的AP205外壳蛋白(1mg/ml，在20mM磷酸钠pH 6.5中)与50μl的NaCl贮存溶液(5M水溶液)、50μl聚谷氨酸贮存溶液(2mg/ml水溶液，MW：86400，Sigma)和25μl水混合。混合物在室温下温育48小时。混合物中重装配的VLP的形成通过非还原SDS-PAGE和大小排阻HPLC显示。混合物中的外壳蛋白几乎完全掺入到VLP中，表明装配效率高于在不含任何聚阴离子大分子情况下装配的AP205外壳蛋白。
实施例3
Fel d1融合蛋白的克隆
使用如下所示的重叠DNA引物，通过PCR扩增制备分别编码Feld1链1和链2的基因。示出了正向(F)和反向(R)引物。将片段连接到pCRII-TOPO载体(Invitrogen)内，并转化XL1-Blue。通过测序证实Fel d1链1和链2的插入。
引物序列1F：SEQ ID NO：34；
引物序列2R：SEQ ID NO：35
引物序列3F：SEQ ID NO：36
引物序列4R：SEQ ID NO：37
引物序列5F：SEQ ID NO：38
引物序列6R：SEQ ID NO：39
引物序列7F：SEQ ID NO：40
引物序列8R：SEQ ID NO：41
引物序列9F：SEQ ID NO：42
引物序列10R：SEQ ID NO：43
Fel d1融合构建体：
FELD1是指链2在N末端与链1直接融合的蛋白质。使用引物11连接体(SEQ ID NO：44)通过剪接重叠延伸(SOE)PCR产生编码FELD1的核苷酸序列。
FD12是指链1在N末端与链2直接融合的蛋白质。使用引物12-1(SEQ ID NO：45)、12-3(SEQ ID NO：46)和12-2-1(SEQ ID NO：47)通过剪接重叠延伸(SOE)PCR产生编码FD12的核苷酸序列。
FELD1-10aa和FELD1-15aa是指链2的N末端分别通过10(GGGGS)2或15(GGGGS)3氨基酸间隔区与链1的C末端融合的蛋白质。使用含有编码FELD1的核苷酸序列的质粒作为模板，通过反向PCR诱变(IPCRM)产生10个氨基酸或15个氨基酸的间隔区。对于1-15间隔区，使用两个引物(引物1-10aa，SEQ ID NO：48和引物2-5aa，SEQ IDNO：49)。对于1-10间隔区，使用两个引物(引物1-5aa，SEQ ID NO：50和引物2-5aa)。得到的PCR片段通过连接环化。它耐受DpnI消化，因为Dpn I只识别含有甲基化腺嘌呤的序列，而质粒模板被Dpn I消化。
FD12-10aa和FD12-15aa是指链1的N末端分别通过10(GGGGS)2或15(GGGGS)3氨基酸间隔区与链2的C末端融合的蛋白质。融合FD12-10aa和FD12-15aa如上所述类似地产生。对于15个氨基酸的间隔区使用引物FD2-10aa(SEQ ID NO：51)和引物FD1-5aa(SEQ IDNO：52)。对于10个氨基酸的间隔区，使用引物FD1-5aa和FD2-5aa(SEQ ID NO：53)。
实施例4
His标记的Fel d1融合蛋白的细菌表达和纯化
将如实施例3所述的编码各种Fel d1融合构建体的核苷酸序列亚克隆到由质粒pET-42a(+)(Novagen)修饰而来的基于T7的表达系统pET-42T(+)中。该融合构建体的C末端与His-标记序列融合，之后是GGC，含有半胱氨酸作为第二附着位点的氨基酸连接体。得到的构建体根据在末端添加“-HC”而相应地命名。
FELD1-HC、FELD1-10aa-HC和FELD1-15aa-HC和FD12-15aa-HC如下表达并纯化：用质粒转化BL21(DE3)。通过向OD600约为1的培养物中加入1mM IPTG诱导表达。培养物在20℃下再生长20小时，收获，并通过在非变性裂解缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，10mM咪唑，pH 8.0)中超声处理而裂解。
澄清后的细菌裂解液添加非变性裂解缓冲液至50ml。加入5ml镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)琼脂糖(Qiagen)，裂解液在4℃下倒置培养1小时。通过用非变性裂解缓冲液洗涤4次除去非特异性结合的蛋白质。通过将Ni-NTA琼脂糖重悬浮在2ml洗脱缓冲液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)中洗脱结合的蛋白质。
实施例5
在纯化的Fel d1融合蛋白中氧化折叠二硫键
Ni2+-亲和纯化的FELD1-HC由15kD至20kD的多种混合二硫键桥接的物质组成。FELD1-HC的天然折叠通过用摩尔比为1∶1的氧化型谷胱甘肽(GSSG，Applichem)和还原型谷胱甘肽(GSH，Applichem)分子内改组二硫键而实现。在用洗脱缓冲液洗脱FELD1后立即加入2.5mM GSSG和2.5mM GSH在室温下反应24小时。重折叠的FELD1-HC在非还原条件下显示分子量为15kD的一条带(图1，第一张图，第2泳道)。使用碘乙酰胺(Sigma)将FELD1-HC的潜在的游离巯基烷基化。在室温下用5mM碘乙酰胺在20mM碳酸氢铵pH 8.0中处理探针15分钟。
通过用PBS平衡的大小排阻层析(SEC)(Superdex 75pg，Amersham Pharmacia Biosciences)将重折叠的FELD1-HC进一步纯化为均质的。
FELD1-10aa-HC和FELD1-15aa-HC通过与以上所述基本相同的方法复性(图1，中间两张图)。
FD12-15aa-HC的天然折叠类似地通过用摩尔比为10∶1的氧化型谷胱苷肽和还原型谷胱苷肽改组二硫键而实现。在洗脱后，FD12-15aa用FD12-15aa重折叠缓冲液(50mM Tris-Cl pH 8.5，240mM NaCl，10mM KC1，1mM EDTA，0.05％ PEG 3，550，1mM GSH，0.1mM GSSH)稀释20倍，并在4℃下温育24小时。重折叠的FD12-15aa显示分子量为20kD的一条带，与之相比，还原型在23kD处(图1，最后一张图)。
实施例6
表位特异性单克隆抗体识别Fel d1融合蛋白
与天然Fel d1(nFel d1)相比较的Fel d1融合蛋白与表位特异性单克隆抗体(mAB)的结合使用来自Indoor biotechnologies(Cardiff，UK)的Fel d1 ELISA试剂盒(6F9/3E4)通过夹心ELISA检测。
简要地说，作为2mg/ml贮存液提供的抗-Fel d1 mAB 6F9用50mM碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液pH 9.6以1∶1000稀释。微量滴定孔用每孔100μl稀释的mAB 6F9在4℃下包被过夜。用PBS-0.05％Tween20(PBS-T)洗板三次，然后用100μl封闭缓冲液(1％BSA(Sigma)，在PBS-T中)封闭。然后微量滴定孔与100μl Fel d1融合蛋白或nFeld1标准(Indoors technologies；UK)温育1小时，使用从80ng/ml到0.16ng/ml的倍比稀释。nFel d1参照由含有13.47U/ml Fel d1(1单位＝4mg蛋白质)的CBER猫毛皮屑参照E10亚标准化。
然后洗板，加入100μl稀释的(1∶1000，用1％BSA/PBS-T)生物素化的抗-Fel d1 mAB 3E4抗体，在室温下温育1小时。用PBS-T洗板三次，使用100μl稀释的(1∶1000，用1％BSA/PBS-T)链霉抗生物素-过氧化物酶(Sigma S5512，0.25mg，在1ml蒸馏水中重建)。在室温下温育30分钟后，用PBS-T洗孔三次。用OPD底物溶液和作为终止溶液的5％H2SO4进行检测。使用ELISA读板器(BioRad)在450nm处测量吸光度，使用EXCEL软件(MS Office；Microsoft)计算算术平均值和平均值的标准差(SEM)。结果显示在表1中。因此，表位特异性mAB对Fel d1融合蛋白和nFel d1的识别反映了两种蛋白质的抗原性的高度相似性。
表1
  检测的蛋白质   FELD1-HC   FELD1-10aa-HC   FELD1-15aa-HC   天然Fel d1
  Fel d1(ng/ml)，OD50％   8.4   6.7   7.9   7.2
实施例7
Fel d1融合蛋白与来源于Qβ的VLP的偶联
143μM Qβ VLP在HEPES缓冲液(20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2)中的溶液与5倍摩尔过量(715μM)的SMPH(Pierce)在25℃和振摇下反应30分钟。SMPH来自溶解在二甲亚砜中的50mM贮存液。使用具有10,000Da分子量阻断值的透析单位(Slide-A-Lyzer，Pierce)用PBS透析反应产物，期间更换两次PBS。在4℃室温下在相对于反应混合物＞1000倍过量的缓冲液中进行透析。
在Fel d1融合蛋白与SMPH-衍生的Qβ VLP偶联之前，实施例5获得的FELD1、FELD1-10aa、FELD1-15aa和FD12-15aa分别与等摩尔量的TCEP(Pierce，Perbio Science)在室温下温育30分钟。
Fel d1融合蛋白以5倍摩尔过量加入到143μM的SMPH-衍生化的Qβ VLP溶液中。反应体积为650μl，平行进行多个反应。反应液在室温振荡下温育4小时。偶联后，将等份以16,000xg在4℃下离心3分钟，以沉淀不可溶的材料。将上清液合并到新的试管中。通过还原SDS-PAGE评价Fel d1融合蛋白与Qβ VLP的偶联。
Fel d1融合蛋白与重装配的Qβ VLP(由实施例1获得)的偶联与以上所述基本相同。
实施例8
FELD1、FELD1-15aa和FD12-15aa与HBcAgl-185-Lys偶联
HBcAgl-185-Lys的构建、表达和纯化基本在WO 03/040164的实施例2-5中描述。120μM HBcAgl-185-Lys VLP在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的溶液与从DMSO中的贮存液稀释得到的25倍摩尔过量的SMPH(Pierce)在25℃摇动振荡器上反应30分钟。反应溶液然后用1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2在4℃下透析两次，2小时。透析后的HBcAgl-185-Lys反应混合物然后与实施例5获得的重组Fel d1反应。在偶联反应中，FELD1、FELD1-15aa和FD12-15aa分别相对于衍生化的HBcAgl-185-Lys VLP为两倍摩尔过量。偶联反应在25℃摇动振荡器上继续4小时。
实施例9
FELD1、FELD1-15aa和FD12-15aa与来源于AP205的VLP的偶联
AP205 VLP的制备在WO 2004/007538的实施例1和2中描述。AP205 VLP的衍生化基本与实施例7对于Qβ VLP所述相同。在Fel d1融合蛋白与SMPH-衍生化的AP205 VLP偶联之前，从实施例5获得的FELD1，FELD1-15aa和FD12-15aa分别与等摩尔量的TCEP(Pierce，Perbio Science)在室温下温育30分钟。
Fel d1融合蛋白以5倍摩尔过量加入到143μM的SMPH-衍生化的AP205 VLP溶液中。反应液在室温振荡下温育4小时。
Fel d1融合蛋白与重装配的AP205 VLP(由实施例2获得)的偶联与以上所述基本相同。
实施例10
基于噬菌体Qβ的本发明的组合物的产生
60 l大肠杆菌AB259培养物(5×107细胞/ml)在强烈通气(1空气体积/培养物体积·分钟)下在37℃下生长2-3小时，获得大约2-4×109细胞/ml的培养物。澄清后的Qβ噬菌体裂解液以5的感染复数接种，并加入CaCl2至终浓度为2.2mM。在5分钟的吸附阶段后，加强通气(1.5空气体积/培养物体积·分钟)。细胞进一步培养3小时，直到OD650nm达到稳定值，在培养物中产生4-6×1012噬菌体颗粒。如下纯化。加入10ml CHCl3/1培养物、0.1mg溶菌酶/l培养物和EDTA至终浓度为20mM，裂解大肠杆菌。在冷却的极限沉降离心机中离心使裂解液澄清，通过硫酸铵沉淀(500g/l，获得大约66％饱和)从裂解液中沉淀噬菌体颗粒。首先倾析悬浮液，通过使用Janetzki K26离心机和W.R.转头6×500ml以6000rpm离心30分钟，或者在BeckmanJ21 C离心机中使用JA-10转头离心30分钟，分离沉淀物。将沉淀物再溶解在NT缓冲液(0.15M NaCl，0.1％Trypton)中，通过离心进行澄清化。用硫酸铵(加入500g/l，大约66％饱和)沉淀上清液。离心分离沉淀物，再溶解在NT缓冲液中，再次通过离心进行澄清化。使用Beckman 35型转头以32000rpm超速离心3.5小时从得到的上清液中分离噬菌体颗粒。将沉淀的噬菌体重悬浮在NT缓冲液中，通过在常规连续CsCl梯度上超速离心而纯化。使用Beckman Ti-70(8×38.5)转头以55000rpm离心20小时。随后噬菌体颗粒用20mMHepes，150mM NaCl，pH 7.4缓冲液透析，以在如实施例7所述的化学交联步骤中使用。
实施例11
基于GA噬菌体的本发明的组合物的制备
大肠杆菌Q 13 Hfr RNASse I-培养物在含有2％酪蛋白水解物、0.5％酵母提取物、0.2％葡萄糖的M9培养基中的12 l培养物生长至OD540nm为0.6-0.7，相当于2×108细胞/ml，以10-20的感染复数用GA噬菌体感染。培养物在37℃下再生长2.5-3小时，在总培养物中产生大约1011个噬菌体颗粒。加入1-2％v/v的CHCl3并将培养物温育15分钟，从而裂解细胞。使用Janetzki K26转头以5000rpm离心30分钟使裂解液澄清。在4℃下和数天期间，用硫酸铵(60％饱和)从培养基中沉淀噬菌体颗粒。首先倾析悬浮液，使用Janetzki K26转头以6000rpm离心30分钟，分离沉淀物。将沉淀物重悬浮在NET(20mMTris pH 7.8，150mM NaCl，5mM EDTA)缓冲液中，在小部分NET缓冲液中通过几个离心和重悬浮的循环提取颗粒。合并含有衣壳的部分，用60％硫酸铵沉淀。重悬浮在NET缓冲液中的颗粒过Sepharose 4B柱，然后经两个蔗糖梯度纯化三次。简要地说，在离心管中用7ml 50％、7ml 43％、7ml 36％、7ml 29％和7ml 22％w/w蔗糖在NET缓冲液中制备梯度。噬菌体溶液(在NET缓冲液中)在梯度上分层，用BeckmanSW 28转头以25000rpm离心17小时。合并含有衣壳的部分，通过在Sepharose 4B柱上凝胶过滤与蔗糖分离。噬菌体颗粒然后用水透析，冻干供进一步使用。
Fel d1融合蛋白与噬菌体Qβ或GA偶联的条件与实施例7中公开的与Qβ VLP偶联的条件基本相同。
实施例12
Qβ-Fel d1融合蛋白在小鼠中具有高度免疫原性
BALB/c小鼠在第0、14、21天用实施例7获得的50μg Qβ-FELD1或50μg与重组Fel d1(从实施例5获得)混合的Qβ皮下免疫，在第0、21、28天采血。使用FELD1进行包被(10μg/ml)，通过ELISA测定Fel d1特异性抗体。简要地说，使用在4℃下用10μg/ml在0.1M NaHCO3 pH 9.6中的FELD1预包被过夜的96孔F96。用PBS-Tween20洗板四次，通过将平板在37℃下在封闭缓冲液(2％BSA，(Sigma)，在PBS-Tween20中)中温育2小时减少背景。血清用血清稀释缓冲液(2％BSA，1％FCS，在PBS-Tween20中)稀释。进行两倍稀释步骤，在ELISA平板振荡器上在室温下温育2小时。洗板五次，与1∶1000稀释的检测抗体(与HRPO偶联的抗小鼠IgG(Sigma))在室温下温育1小时。用PBS-Tween20洗板五次，使用OPD底物溶液(0.066M Na2HPO4，0.035M柠檬酸，pH5.0，每25ml含有10mg OPD(Fluka)和8μl 30％H2O2(Fluka))，并使用5％H2SO4水溶液作为终止溶液，进行检测。使用ELISA读板器在450nm处测量吸光度，使用EXCEL软件(Microsoft)计算算术平均值和平均值的标准差(SEM)。
Qβ-FELD1免疫的小鼠在第21天和第28天分别显示120,000和75,000的半数最大吸光度。相反，用未交联的Qβ/FELD 1混合物免疫的小鼠在第21天和第28天分别具有7000和6000的低滴度。
实施例13
用明矾作为佐剂免疫小鼠
7-8周大的雌性Balb/c小鼠用50μg现有技术QβVLP-FELD1-HC接种三次(第0、14、28天)。疫苗分别用200μl无菌PBS或100μl PBS和100μl AluGel-S(Serva)稀释，皮下注射到左和右腹股沟区。
在第14、21、28、42、56、84和112天采集血清。通过ELISA测定天然Fel d1、FELD-HC和Qβ VLP的特异性抗体。
微量滴定板分别用1μg/ml天然Fel d1(nFel d1，Indoorsbiotechnologies)、10mg/ml FELD1-HC和10mg/ml Qβ VLP包被过夜。在洗涤(0.05％Tween 20/PBS)和用在PBS中的2％BSA封闭后，以在2％BSA/1％FCS/PBS中的不同稀释度添加血清。
之后通过标准方法进行ELISA。Qβ VLP-FELD1-HC疫苗诱导持久的针对天然FELD1的高Fel d1特异性抗体应答。在明矾存在下的抗体效价高于不含明矾时(表2)。
表2
  含有明矾   不含明矾
  日期   nFel d1   FELD1-HC   nFel d1   FELD1-HC
  第13天   15984   53939   3394   7871
  第20天   100311   203636   38980   77323
  第27天   173190   368716   38177   56836
  第42天   240173   419072   88953   170377
  第56天   228500   492520   65370   163093
  第84天   157009   219834   59603   115049
  第112天   127745   203719   62290   116132
实施例14
与Qβ偶联的FELD1在体外具有大大降低的变应性潜力
为了在体外检测Qβ-FELD1-HC引发变态反应的能力，从三名对猫过敏的供体的血液中分离嗜碱性粒细胞。在-名对猫过敏的个体中，这些嗜碱性粒细胞用Fel d1特异性IgE包被，并且以CD63上调响应变应原刺激。因此，过敏个体的嗜碱性粒细胞用分级的量的Qβ-FELD1-HC或单独的FELD1-HC刺激，并且通过流式细胞术评价CD63的上调。FELD1-HC(由实施例5获得)在检测的最低稀释度(约0.2ng/ml)时引发CD63的强烈上调，Qβ-FELD1-HC(由实施例7获得)显示大大降低的变应性潜力，嗜碱性粒细胞产生响应需要比FELD1-HC高100-1000倍的量(约70ng/ml)。
类似地，对单独或与Qβ偶联的融合蛋白FELD-15aa-HC和FD12-15aa-HC重复该试验。结果显示在图2中。这些Fel d1融合蛋白当与Qβ偶联时全都显示大大降低的变应性潜力。
实施例15
与Qβ偶联的FELD1不能在过敏个体中引发皮肤-穿刺反应
如果通过穿刺过敏个体的皮肤引入变应原，则由于激活皮肤中存在的肥大细胞而在大约20分钟内产生局部水肿。在此，使用皮肤试验来确定Qβ-FELD1-HC(由实施例7获得)的变应性潜力。将分级的量的Qβ-FELD1-HC或相应量的FELD1-HC(由实施例5获得)引入对猫过敏的个体的皮肤内，20分钟后评价皮肤反应。Qβ-FELD1-HC不能引发皮肤反应，而FELD1-HC在100倍的较低浓度以上时具有活性(表3)。
表3：在两种制剂中存在相应量的FELD1-HC
  稀释度   FELD1-HC   Qβ-FELD1-HC
  未稀释   +++   -
  1∶10   ++   -
  1∶100   +   -
  1∶1000   -   -
实施例16
用Qβ-FELD1-HC免疫过敏个体降低皮肤穿刺试验反应性
为了检测Qβ-FELD-HC改善临床症状的能力，一名患有猫变态反应的患者在第0天接种17μg Qβ-FELD1-HC(由实施例7获得)(以2、5、10μg注射三次)，在第7天注射40μg(以10、10、20μg注射三次)，在第14天注射50μg(以10、40μg注射2次)。在第0、14、21天用标准化的猫提取物进行皮肤穿刺试验，对中心肿胀反应的直径进行定量(图3)。在3周内，在皮肤穿刺试验中诱导临床症状所需的变应原浓度比在穿刺试验中足以诱导症状的初始量高1000倍。
实施例17
用Qβ-FELD1-HC免疫过敏个体减少鼻激发试验中的变应性症状
为了检测Qβ-FELD1-HC改善临床症状的能力，一名患有猫变态反应的患者在第0天接种17μg Qβ-FELD1-HC(从实施例7获得)(以2、5、10μg注射三次)，在第7天注射40μg(以10、10、20μg注射三次)，在第14天注射50μg(以10、40μg注射2次)。在第0、14、21天用标准化的猫提取物进行鼻激发试验，评价每一剂量增加水平时的临床症状(图4A)，相应地进行总变应性分级(图4B)。在3周内，诱导临床症状需要高100-1000倍的变应原浓度，并且总变应性分级强烈降低。
实施例18
向Qβ VLP内包装免疫刺激性核酸
解装配并且纯化的Qβ的外壳蛋白如实施例1(A)和(B)所述获得。重装配：向10ml二聚体部分中加入β-巯基乙醇至终浓度为10％，加入300μl含有12.3nmol寡核苷酸的(CpG)20OpA寡脱氧核苷酸溶液。重装配混合物首先用30ml含有10％β-巯基乙醇的NET缓冲液(20mMTris-HCl，pH 7.8，含有5mM EDTA和150mM NaCl)在4℃下透析2小时，然后以8ml/h的NET缓冲液流速，在4℃下以连续模式透析4天。重装配混合物然后通过用水透析脱盐，期间更换6次缓冲液(4×100ml，2×1升)。
Fel d1融合蛋白与内部包装有CpG的Qβ VLP的偶联基本与实施例7所述相同地进行。
实施例19
Fel d1特异性血清在体外抑制Fel d1融合蛋白诱导的嗜碱性粒细胞脱粒
为了检测抗-Fel d1特异性IgG抑制脱粒的能力，将确定量的FELD1-HC或FELD1-15aa-HC与系列稀释的、含量逐渐降低的、从Qβ-FELD1-HC免疫的兔中分离的IgG一起预温育，用其刺激过敏个体的嗜碱性粒细胞。通过流式细胞术评价CD63的上调。抗-Fel d1 IgG在所有检测浓度下都阻断了Fel d1-诱导的脱粒，而对照IgG不显示任何作用(表4)。
表4
  样品   FELD1-HC脱粒百分比   FELD1-15aa-HC脱粒百分比
  无IgG   33   33
  Fel d1特异性IgG(200ng/ml)   1.9   1.6
  Fel d1特异性IgG(100ng/ml)   5.2   2.1
  Fel d1特异性IgG(50ng/ml)   8.2   2.3
  Fel d1特异性IgG(25ng/ml)   10.6   4.2
  非特异性IgG   35   29
  无Fel d1刺激   1.2   1.2
实施例20
用Qβ-FELD1-HC免疫Fel d1变应性小鼠
使用小鼠变应性气管炎症实验哮喘模型评价针对天然变应原Feld1接种对BALB/c小鼠的血清和BAL(支气管肺泡灌洗液)中IgE抗体应答的影响。每组5只小鼠在第0天用在AlumGel-S中的1μg天然Fel d1腹膜致敏。小鼠在第35、49天皮下接种50μg单独的Qβ或50μg Qβ-FELD1-HC，之后在第63天和第70天进行两次鼻内激发。最后一次鼻内激发5天后，将小鼠处死，收集血清和BALF(支气管肺泡灌洗液)，通过ELISA进行体液免疫应答的分析(IgE亚类滴度)。
ELISA板用在碳酸盐(Carbonat)缓冲液中稀释的大鼠抗-IgE mAb(2μg/ml)于4℃包被过夜。将板用PBS/5％BSA封闭2小时后，将板与致敏的、接种的和抗原激发的小鼠的血清(第一个孔预先1∶100稀释，然后经8步1∶3稀释)或BAL(第一个孔为纯BAL，然后经8步1∶3稀释)再温育2小时。在样品温育2小时后，用大鼠抗小鼠IgE-HRP标记的抗体、然后用底物OPD检测血清和BAL-IgE。
表5
  组   血清(d75)   BAL(d75)
  OD50的滴度   ％降低   OD50的滴度   ％降低
  Qβ接种   1036   -   15   -
  Qβ-Fel d1接种   49   95   0   100
序列表
<110>赛托斯生物技术公司
    M.巴克曼
    M.鲍尔
    K.迪特迈尔
    N.施米茨
    S.尤特津格尔
<120>猫变应原融合蛋白及其用途
<130>P1048PC00
<150>60/662,918
<151>2005-03-18
<160>69
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体Q-beta
<400>1
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>2
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体Q-beta
<400>2
Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly
1               5                   10                  15
Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly
    130                 135                 140
Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu
                165                 170                 175
Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala
            180                 185                 190
Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr
    210                 215                 220
Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr
225                 230                 235                 240
Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu
                245                 250                 255
Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu
            260                 265                 270
Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His
        275                 280                 285
Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly
    290                 295                 300
Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile
305                 310                 315                 320
Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala
                325
<210>3
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体R17
<400>3
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1              5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>4
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体fr
<400>4
Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>5
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体GA
<400>5
Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr
       35                   40                  45
Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser
65                  70                  75                  80
Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe
            100                 105                 110
Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe
        115                 120                 125
Tyr Ala
    130
<210>6
<211>132
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>6
Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>7
<211>329
<212>PRT
<213>噬菌体SP
<400>7
Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val
    50                  55                  60
Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp
65                  70                  75                  80
Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr
                85                  90                  95
Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala
            100                 105                 110
Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn
        115                 120                 125
Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp
    130                 135                 140
Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly
                165                 170                 175
Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg
            180                 185                 190
Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly
                245                 250                 255
Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu
            260                 265                 270
Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser
                325
<210>8
<211>130
<212>PRT
<213>噬菌体MS2
<400>8
Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr
1               5                   10                  15
Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu
            20                  25                  30
Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser
        35                  40                  45
Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu
    50                  55                  60
Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val
65                  70                  75                  80
Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe
                85                  90                  95
Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu
            100                 105                 110
Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly
        115                 120                 125
Ile Tyr
    130
<210>9
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体M11
<400>9
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>10
<211>133
<212>PRT
<213>噬菌体MX1
<400>10
Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly
1               5                   10                  15
Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr
65                  70                  75                  80
Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser
                85                  90                  95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu
            100                 105                 110
Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn
        115                 120                 125
Leu Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>11
<211>330
<212>PRT
<213>噬菌体NL95
<400>11
Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly
1               5                   10                  15
Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
            20                  25                  30
Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg
        35                  40                  45
Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys
    50                  55                  60
Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro
145                 150                 155                 160
Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly
                165                 170                 175
Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys
            180                 185                 190
Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu
        195                 200                 205
Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp
    210                 215                 220
Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp
                245                 250                 255
Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr
            260                 265                 270
Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala
        275                 280                 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser
    290                 295                 300
Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro
305                 310                 315                 320
Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu
                325                 330
<210>12
<211>129
<212>PRT
<213>噬菌体f2
<400>12
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly
1               5                   10                  15
Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp
            20                  25                  30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
        35                  40                  45
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
    50                  55                  60
Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala
65                  70                  75                  80
Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala
                85                  90                  95
Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu
            100                 105                 110
Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile
        115                 120                 125
Tyr
<210>13
<211>128
<212>PRT
<213>噬菌体PP7
<400>13
Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu
1               5                   10                  15
Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val
            20                  25                  30
Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn
        35                  40                  45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp
    50                  55                  60
Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg
65                  70                  75                  80
Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr
                85                  90                  95
Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala
            100                 105                 110
Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg
        115                 120                 125
<210>14
<211>131
<212>PRT
<213>噬菌体AP205
<400>14
Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile
1               5                   10                  15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu
            20                  25                  30
Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser
        35                  40                  45
Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly
    50                  55                  60
Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg
65                  70                  75                  80
Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu
                85                  90                  95
Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn
            100                 105                 110
Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp
        115                 120                 125
Thr Thr Ala
    130
<210>15
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Qbeta 240突变体
<400>15
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>16
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Q-beta 243突变体
<400>16
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>17
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Q-beta 250突变体
<400>17
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>18
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Q-beta 251突变体
<400>18
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>19
<211>132
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>噬菌体Q-beta 259突变体
<400>19
Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg
1               5                   10                  15
Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val
            20                  25                  30
Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val
        35                  40                  45
Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
    50                  55                  60
Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys
65                  70                  75                  80
Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe
                85                  90                  95
Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu
            100                 105                 110
Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Asn Pro Ala Tyr
    130
<210>20
<211>185
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>20
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala
65                  70                  75                  80
Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys
                85                  90                  95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
            100                 105                 110
Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr
        115                 120                 125
Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro
    130                 135                 140
Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg
145                 150                 155                 160
Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg
                165                 170                 175
Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>21
<211>188
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>21
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu
1               5                   10                  15
Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
            20                  25                  30
Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys
        35                  40                  45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
    50                  55                  60
Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly
65                  70                  75                  80
Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val
                85                  90                  95
Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr
            100                 105                 110
Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp
        115                 120                 125
Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
    130                 135                 140
Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser
145                 150                 155                 160
Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro
                165                 170                 175
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
            180                 185
<210>22
<211>70
<212>PRT
<213>家猫
<400>22
Glu Ile Cys Pro Ala Val Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly
1               5                   10                  15
Thr Pro Asp Glu Tyr Val Glu Gln Val Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro
            20                  25                  30
Val Val Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys Val Asp Ala Lys
        35                  40                  45
Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile
    50                  55                  60
Tyr Thr Ser Pro Leu Cys
65                  70
<210>23
<211>92
<212>PRT
<213>家猫
<400>23
Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Val Phe Phe Ala
1               5                   10                  15
Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Val
            20                  25                  30
Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gln Asp Cys
        35                  40                  45
Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu Asp Gly Leu Val Met
    50                  55                  60
Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Val Gln Asn
65                  70                  75                  80
Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg
                85                  90
<210>24
<211>162
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>链2+链1融合蛋白
<400>24
Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Val Phe Phe Ala
1               5                   10                  15
Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Val
            20                  25                  30
Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gln Asp Cys
        35                  40                  45
Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu Asp Gly Leu Val Met
    50                  55                  60
Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Val Gln Asn
65                  70                  75                  80
Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg Glu Ile Cys Pro
                85                  90                  95
Ala Val Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu
            100                 105                 110
Tyr Val Glu Gln Val Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro Val Val Leu Glu
        115                 120                 125
Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys Val Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu
    130                 135                 140
Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr Ser Pro
145                 150                 155                 160
Leu Cys
<210>25
<211>90
<212>PRT
<213>家猫
<400>25
Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Val Phe Phe Ala
1               5                   10                  15
Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Val
            20                  25                  30
Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gln Asp Cys
        35                  40                  45
Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu Asp Gly Leu Val Met
    50                  55                  60
Ile Ala Ile Asn Glu Tyr Cys Met Gly Glu Ala Val Gln Asn Thr Val
65                  70                  75                  80
Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg
                85                  90
<210>26
<211>78
<212>PRT
<213>家猫
<400>26
Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Val Phe Phe Ala
1               5                   10                  15
Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys Val
            20                  25                  30
Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gln Asp Cys
        35                  40                  45
Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu Asp Gly Leu Val Met
    50                  55                  60
Pro Ser Thr Asn Ile Ala Trp Val Lys Gln Phe Arg Thr Pro
65                  70                  75
<210>27
<211>27
<212>PRT
<213>家猫
<400>27
Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Val
1               5                   10                  15
Glu Gln Val Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro Val
            20                  25
<210>28
<211>27
<212>PRT
<213>家猫
<400>28
Lys Ala Leu Pro Val Val Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys
1               5                   10                  15
Val Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu
            20                  25
<210>29
<211>26
<212>PRT
<213>家猫
<400>29
Phe Phe Ala Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu
1               5                   10                  15
Thr Lys Val Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg
            20                  25
<210>30
<211>19
<212>PRT
<213>家猫
<400>30
Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr
1               5                   10                  15
Ser Pro Leu
<210>31
<211>19
<212>PRT
<213>家猫
<400>31
Met Gly Glu Ala Val Gln Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr
1               5                   10                  15
Leu Gly Arg
<210>32
<211>16
<212>PRT
<213>家猫
<400>32
Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr
1               5                   10                  15
<210>33
<211>174
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>与his标记和GGC的融合
<400>33
Met Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Val Phe Phe
1               5                   10                  15
Ala Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys
            20                  25                  30
Val Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gln Asp
        35                  40                  45
Cys Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu Asp Gly Leu Val
    50                  55                  60
Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Val Gln
65                  70                  75                  80
Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg Glu Ile Cys
                85                  90                  95
Pro Ala Val Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp
            100                 105                 110
Glu Tyr Val Glu Gln Val Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro Val Val Leu
        115                 120                 125
Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys Val Asp Ala Lys Met Thr Glu
    130                 135                 140
Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr Ser
145                 150                 155                 160
Pro Leu Cys Leu Glu His His His His His His Gly Gly Cys
                165                 170
<210>34
<211>85
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1F
<400>34
gtacatatgg aaatctgccc ggctgttaaa cgtgacgttg acctgttcct gaccggtacc  60
ccggacgaat acgttgaaca ggttg                                        85
<210>35
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物2R
<400>35
ggcagagctt tgtactgagc aacctgttca acgtattc                          38
<210>36
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物3F
<400>36
gctcagtaca aagctctgcc ggttgttctg gaaaacgctc gtatcctgaa aaactgcgtt    60
gacgctaaaa tgacc                                                     75
<210>37
<211>89
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物4R
<400>37
cctctcgagg cacagcgggg aggtgtagat tttgtccagc agggacagag cgttttcttt    60
gtcttcttcg gtcattttag cgtcaacgc                                      89
<210>38
<211>76
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物5F
<400>38
gtacatatgg ttaaaatggc tgaaacctgc ccgatcttct acgacgtttt cttcgctgtt    60
gctaacggta acgaac                                                    76
<210>39
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物6R
<400>39
ggtacgttcc ggttcggtag cgttaacttt ggtcagggac aggtccagca gcagttcgtt    60
accgttagca acagc                                                     75
<210>40
<211>80
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物7F
<400>40
ctaccgaacc ggaacgtacc gctatgaaaa aaatccagga ctgctacgtt gaaaacggtc    60
tgatctcccg tgttctggac                                                80
<210>41
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物8R
<400>41
gcttcaccca tgcagtcttt ggaggaggag atggtggtca taaccagacc gtccagaaca    60
cgggagatca g                                                         71
<210>42
<211>75
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物9F
<400>42
caaagactgc atgggtgaag ctgttcagaa caccgttgaa gacctgaaac tgaacaccct    60
gggtcgctcg agagg                                                     75
<210>43
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物10R
<400>43
cctctcgagc gacccagggt g                                              21
<210>44
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物连接体
<400>44
cgtttaacag ccgggcagat ttcacgaccc agggtgttca gtttc                    45
<210>45
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物12-1
<400>45
gtacatatgg aaatctgccc ggctgtta                                       28
<210>46
<211>48
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物12-3
<400>46
gcaggtttca gccattttaa cgcacagcgg ggaggtgtag attttgtc                 48
<210>47
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物12-2-1
<400>47
cctctcgaga cgacccaggg tgttcagttt caggtcttc                           39
<210>48
<211>58
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1-10aa
<400>48
ggtggaggag gtagcggtgg aggaggtagc gaaatctgcc cggctgttaa acgtgacg    58
<210>49
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物2-5aa
<400>49
gctacctcct ccaccacgac ccagggtgtt cagtttcagg t                      41
<210>50
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1-5aa
<400>50
ggtggaggag gtagcgaaat ctgcccggct gttaaacgtg acg                    43
<210>51
<211>59
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物2-10aa
<400>51
ggtggaggag gtagcggtgg aggaggtagc gttaaaatgg ctgaaacctg cccgatctt   59
<210>52
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物1-5aa
<400>52
gctacctcct ccaccgcaca gcggggaggt gtagattttg tc                     42
<210>53
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物2-5aa
<400>53
ggtggaggag gtagcgttaa aatggctgaa acctgcccga tctt                   44
<210>54
<211>175
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>FELD1-10aa
<400>54
Met Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Val Phe Phe
1               5                   10                  15
Ala Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys
            20                  25                  30
Val Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gln Asp
        35                  40                  45
Cys Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu Asp Gly Leu Val
    50                  55                  60
Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Val Gln
65                  70                  75                  80
Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg Gly Gly Gly
                85                  90                  95
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Cys Pro Ala Val Lys Arg Asp
            100                 105                 110
Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Val Glu Gln Val
        115                 120                 125
Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro Val Val Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu
    130                 135                 140
Lys Asn Cys Val Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala
145                 150                 155                 160
Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr Ser Pro Leu Cys Leu Glu
                165                 170                 175
<210>55
<211>180
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>FELD1-15aa
<400>55
Met Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe Tyr Asp Val Phe Phe
1               5                   10                  15
Ala Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp Leu Ser Leu Thr Lys
            20                  25                  30
Val Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met Lys Lys Ile Gln Asp
        35                  40                  45
Cys Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val Leu Asp Gly Leu Val
    50                  55                  60
Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met Gly Glu Ala Val Gln
65                  70                  75                  80
Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu Gly Arg Gly Gly Gly
                85                  90                  95
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Cys Pro
            100                 105                 110
Ala Val Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr Gly Thr Pro Asp Glu
        115                 120                 125
Tyr Val Glu Gln Val Ala Gln Tyr Lys Ala Leu Pro Val Val Leu Glu
    130                 135                 140
Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys Val Asp Ala Lys Met Thr Glu Glu
145                 150                 155                 160
Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys Ile Tyr Thr Ser Pro
                165                 170                 175
Leu Cys Leu Glu
            180
<210>56
<211>165
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>FD12
<400>56
Met Glu Ile Cys Pro Ala Val Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Val Glu Gln Val Ala Gln Tyr Lys Ala Leu
            20                  25                  30
Pro Val Val Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys Val Asp Ala
        35                  40                  45
Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys
    50                  55                  60
Ile Tyr Thr Ser Pro Leu Cys Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile
65                  70                  75                  80
Phe Tyr Asp Val Phe Phe Ala Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu
                85                  90                  95
Asp Leu Ser Leu Thr Lys Val Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala
            100                 105                 110
Met Lys Lys Ile Gln Asp Cys Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg
        115                 120                 125
Val Leu Asp Gly Leu Val Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys
    130                 135                 140
Met Gly Glu Ala Val Gln Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr
145                 150                 155                 160
Leu Gly Arg Leu Glu
                165
<210>57
<211>180
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>FD12-15aa
<400>57
Met Glu Ile Cys Pro Ala Val Lys Arg Asp Val Asp Leu Phe Leu Thr
1               5                   10                  15
Gly Thr Pro Asp Glu Tyr Val Glu Gln Val Ala Gln Tyr Lys Ala Leu
            20                  25                  30
Pro Val Val Leu Glu Asn Ala Arg Ile Leu Lys Asn Cys Val Asp Ala
        35                  40                  45
Lys Met Thr Glu Glu Asp Lys Glu Asn Ala Leu Ser Leu Leu Asp Lys
    50                  55                  60
Ile Tyr Thr Ser Pro Leu Cys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
65                  70                  75                  80
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Lys Met Ala Glu Thr Cys Pro Ile Phe
                85                  90                  95
Tyr Asp Val Phe Phe Ala Val Ala Asn Gly Asn Glu Leu Leu Leu Asp
            100                 105                 110
Leu Ser Leu Thr Lys Val Asn Ala Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ala Met
        115                 120                 125
Lys Lys Ile Gln Asp Cys Tyr Val Glu Asn Gly Leu Ile Ser Arg Val
    130                 135                 140
Leu Asp Gly Leu Val Met Thr Thr Ile Ser Ser Ser Lys Asp Cys Met
145                 150                 155                 160
Gly Glu Ala Val Gln Asn Thr Val Glu Asp Leu Lys Leu Asn Thr Leu
                165                 170                 175
Gly Arg Leu Glu
            180
<210>58
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>gamma连接体1
<400>58
Cys Gly Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro
1               5                   10
<210>59
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N末端甘氨酸连接体
<400>59
Gly Cys Gly Gly Gly Gly
1               5
<210>60
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>N-末端甘氨酸丝氨酸连接体
<400>60
Cys Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>61
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>GCGSGGGGS连接体
<400>61
Gly Cys Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1               5
<210>62
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C-末端gamma 1连接体
<400>62
Asp Lys Thr His Thr Ser Pro Pro Cys Gly
1               5                   10
<210>63
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C末端gamma连接体3
<400>63
Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala Pro Gly Gly
1               5                   10                  15
Cys Gly
<210>64
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C末端甘氨酸连接体
<400>64
Gly Gly Gly Gly Cys Gly
1               5
<210>65
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>C末端甘氨酸丝氨酸连接体
<400>65
Ser Gly Gly Gly Gly Cys
1               5
<210>66
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>GSGGGGSGCG连接体
<400>66
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Cys Gly
1               5                   10
<210>67
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甘氨酸赖氨酸连接体
<400>67
Gly Gly Lys Lys Gly Cys
1               5
<210>68
<211>6
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>甘氨酸赖氨酸连接体2
<400>68
Cys Gly Lys Lys Gly Gly
1               5
<210>69
<211>17
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>CGGPKPSTPPGSSGGAP
<400>69
Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser Ser Gly Gly Ala
1               5                   10                  15
Pro

Claims (30)

1.一种组合物，其包含：
(a)具有至少一个第一附着位点的核心颗粒，其中所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒，
(b)具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，
其中所述至少一种抗原是Fel d1蛋白或Fel d1片段，并且其中(a)和(b)通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点共价连接。
2.权利要求1的组合物，其中所述Fel d1蛋白包含Fel d1的链1和Fel d1的链2，其中所述Fel d1的链1与Fel d1的链2通过至少一个共价键联接。
3.权利要求1或2的组合物，其中所述Fel d1蛋白是包含Fel d1的链1和Fel d1的链2的融合蛋白，其中所述Fel d1的链1与Fel d1的链2通过一个肽键直接融合或者通过间隔区融合，该间隔区连接一条链的N末端和另一条链的C末端。
4.权利要求3的组合物，其中所述Fel d1蛋白的链2通过其C末端与所述Fel d1的链1的N末端直接融合或者通过间隔区融合。
5.权利要求3的组合物，其中所述Fel d1蛋白的链1通过其C末端与所述Fel d1的链2的N末端直接融合或者通过间隔区融合。
6.权利要求3-5中任意一项的组合物，其中所述间隔区由具有1-20个氨基酸残基的氨基酸序列组成。
7.权利要求3-6中任意一项的组合物，其中所述融合蛋白包含选自下组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：24；
(b)SEQ ID NO：54；
(c)SEQ ID NO：55；
(d)SEQ ID NO：56；和
(e)SEQ ID NO：57。
8.权利要求3-6中任意一项的组合物，其中所述Fel d1蛋白的链1包含SEQ ID NO：22的序列或其同源序列，其中所述同源序列与SEQ ID NO：22具有大于80％，优选大于90％，或更优选大于95％的同一性。
9.权利要求3-6中任意一项的组合物，其中所述Fel d1蛋白的链2包含SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26的序列或其同源序列，其中所述同源序列与SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26具有大于80％，优选大于90％，更优选大于95％的同一性。
10.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述核心颗粒是病毒颗粒，并且其中优选地所述病毒颗粒是RNA噬菌体的病毒颗粒。
11.权利要求1-9中任一项的组合物，其中所述核心颗粒是病毒样颗粒，并且其中优选地所述病毒样颗粒是RNA噬菌体的病毒样颗粒。
12.权利要求10或11的组合物，其中所述RNA噬菌体选自Qβ、fr、GA或AP205。
13.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述第一附着位点包含或者优选是氨基，优选赖氨酸的氨基。
14.前述权利要求中任一项的组合物，其中所述第二附着位点包含或者优选是巯基，优选半胱氨酸的巯基。
15.前述权利要求中任一项的组合物，其还包含连接体。
16.权利要求15的组合物，其中所述连接体与所述Fel d1蛋白的C末端融合或者与所述Fel d1片段的C末端融合。
17.一种疫苗，其包含权利要求1-16中任一项的组合物。
18.权利要求17的疫苗，其还包含至少一种佐剂。
19.一种药物组合物，其包含：
(a)权利要求1-16中任一项的组合物；和
(b)可接受的药物载体。
20.一种制备权利要求1-16中任一项的组合物的方法，包括：
(a)提供具有至少一个第一附着位点的核心颗粒，其中所述核心颗粒是病毒样颗粒(VLP)或病毒颗粒；
(b)提供具有至少一个第二附着位点的至少一种抗原，其中所述抗原是Fel d1蛋白或Fel d1片段；和
(c)将所述核心颗粒与所述至少一种抗原连接，产生所述组合物，其中所述至少一种抗原和所述核心颗粒通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。
21.权利要求1-16中任一项的组合物在制备治疗猫变态反应的药物中的用途。
22.一种治疗猫变态反应的方法，包括给人或非人哺乳动物施用权利要求1-16中任一项的组合物或权利要求17-18中任一项的疫苗，其中优选地所述非人哺乳动物是狗或猫。
23.在治疗猫变态反应的方法中使用的权利要求1-16中任一项的组合物或权利要求17-18中任一项的疫苗，所述方法包括给人或非人哺乳动物施用所述组合物或所述疫苗，其中优选地所述非人哺乳动物是狗或猫。
24.一种Fel d1融合蛋白，其包含通过氨基酸间隔区融合的Fel d1的链1和Fel d1的链2，所述间隔区连接一条链的N末端和另一条链的C末端，其中所述氨基酸间隔区由具有10-30个氨基酸残基的氨基酸序列组成，并且其中所述融合蛋白不是包含SEQ ID NO：22链1通过(GGGGS)3与SEQ ID NO：23、25或26链2的N末端融合的融合蛋白，并且其中所述排除的融合蛋白在杆状病毒表达系统中表达。
25.权利要求24的Fel d1融合蛋白，其中所述间隔区由具有2、3或4次GGGGS重复的氨基酸序列组成。
26.权利要求24或25的Fel d1融合蛋白，其中所述Fel d1融合蛋白在大肠杆菌中产生。
27.权利要求24-26中任一项的Fel d1融合蛋白，其中Fel d1的链2位于融合蛋白的N末端。
28.权利要求24-26中任一项的Fel d1融合蛋白，其中Fel d1的链1位于融合蛋白的N末端。
29.权利要求24-28中任一项的Fel d1融合蛋白，其包含选自下组的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：5
(b)SEQ ID NO：55；和
(c)SEQ ID NO：57。
30.一种包含SEQ ID NO：57的氨基酸序列的Fel d1融合蛋白，其中所述Fel d1蛋白在大肠杆菌中产生。
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