WO2023176206A1 - リンカーにより連結されたカプシドタンパク質を含むウイルス様粒子 - Google Patents
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Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/125—Picornaviridae, e.g. calicivirus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
- C07K14/085—Picornaviridae, e.g. coxsackie virus, echovirus, enterovirus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
Definitions
- This application describes capsid protein dimers connected by linkers, virus-like particles containing the dimers, expression vectors and host cells for producing the virus-like particles, and the dimers and/or the viruses.
- the present invention relates to pharmaceutical compositions containing similar particles.
- viruses When viruses infect other living things (animals, plants, bacteria, etc.), they cause various symptoms and diseases. Viral infections can be involved in, for example, colds, influenza, bronchitis, pneumonia, gastroenteritis, hepatitis, meningitis, rubella, cancer, and encephalitis in humans.
- virus infections that were previously limited to a specific area can now spread to other areas. For this reason, even more effective measures against virus infection are required.
- Vaccination is widely used as a means to prevent viral infections. Vaccines increase immunity to viruses and prevent infection by stimulating a subject's immune function. In order to obtain highly effective vaccines, it is necessary to use superior antigens. Therefore, development of antigens for vaccines continues.
- Patent Document 1 describes a protein containing at least part of the S (shell)-domain of VP1 (viral protein 1) of a first norovirus strain and the P (protruding)-domain of VP1 of a second norovirus strain.
- a chimeric VP1 composed of - domains and a virus-like particle (VLP) composed of said VP1 are disclosed.
- VLP virus-like particle
- Patent Document 2 discloses a multivalent VLP composed of antigen proteins derived from two or more norovirus genotypes.
- Patent Document 3 discloses that VP1s derived from different norovirus genotypes are mixed to prepare multivalent VLPs.
- VLPs are formed by random self-assembly of multiple different VP1 monomers, so different VP1s may be present in the VLPs in different proportions.
- the present invention aims to provide VLPs capable of having multivalent antigenicity, in which the two capsid proteins are present in equal proportions.
- the inventor of the present application focused on linking the first capsid protein and the second capsid protein with a linker, and completed the present invention.
- the present invention provides, but is not limited to: (1) A virus-like particle comprising a dimer assembly of a first capsid protein and a second capsid protein, the first capsid protein and the second capsid protein being connected by a linker. (2) The virus particle of (1), wherein the linker is a GS linker. (3) The virus-like particle of (2), wherein the C-terminus of the first capsid protein and the N-terminus of the second capsid protein are linked via a GS linker. (4) The virus-like particle of (2) or (3), wherein the GS linker is a (GGGGS) n linker, where n is an integer of 1 or more.
- the capsid protein dimer of (8) wherein the C-terminus of the first capsid protein and the N-terminus of the second capsid protein are linked via a GS linker.
- a polynucleotide comprising a structure in which a polynucleotide encoding a first capsid protein and a polynucleotide encoding a second capsid protein are linked via a polynucleotide encoding a linker.
- a pharmaceutical composition comprising the virus-like particle of any one of (1) to (6) or the capsid protein dimer of any of (7) to (12).
- the pharmaceutical composition of (20) which is used for inducing protective immunity.
- FIG. 1 shows an example of a conceptual diagram of a capsid protein dimer connected by a linker.
- Figure 2 shows the results of SDS-PAGE.
- Marker molecular weight marker
- Washington0207 control (Washington0207 VP1 without linker) sample
- Aomori2-Washington0207 sample containing a dimer of Aomori2 VP1 and Washington0207 VP1 linked with a linker
- (G 4 S) 4 -6 Linker with 4 to 6 repeating units.
- Upper arrow band around 120 kDa
- lower arrow band around 60 kDa.
- Figure 3 shows the results of Western blotting.
- FIG. 4 shows the analysis results by transmission electron microscopy (TEM).
- Figure 5 shows the results of SDS-PAGE.
- Marker molecular weight marker
- Aomori2 control (VP1 of Aomori2 without linker) sample
- Aomori2-Washington0207 G 4 S 5 : sample containing a dimer of VP1 of Aomori2 and VP1 of Washington0207 linked with a linker
- G 4 S) 5 Linker with 5 repeating units.
- Figure 6 shows the results of Western blotting.
- FIG. 7 shows the analysis results of linker-linked VLPs by transmission electron microscopy (TEM).
- FIG. 8 shows the results of analysis of linker-linked VLPs by size exclusion chromatography (SEC).
- SEC size exclusion chromatography
- FIG. 9 shows the analysis results of a comparative sample (Aomori2 VLP) by size exclusion chromatography (SEC).
- FIG. 10 shows GII.
- BT50 in the figure is the average value of BT50 obtained using 4 lots of mouse immune serum. The results obtained using each lot are indicated by open circles ( ⁇ ).
- FIG. 11 shows GII. 4 The results of the receptor binding inhibitory activity for each VLP are shown when mouse immune serum against the Washington 0207 VLP is used.
- BT50 in the figure is the average value of BT50 obtained using 4 lots of mouse immune serum. The results obtained using each lot are indicated by open circles ( ⁇ ).
- Aomori2 Aomori2 VLP, Washington0207: Washington0207 VLP, Aomori2-Washington0207: Aomori2-Washington0207 linker-connected VLP. *: p ⁇ 0.05 (Whitney U test).
- virus-like particle, capsid protein dimer The present invention provides virus-like particles (hereinafter also referred to as "VLPs"). Virus-like particles have a similar structure to virus particles. On the other hand, virus-like particles differ from virus particles in that they do not contain genetic information (DNA or RNA) and do not have the ability to infect or multiply. Therefore, virus-like particles can be used as antigens for vaccines against viral infections.
- VLPs virus-like particles
- the virus-like particle of the present invention has a first capsid protein and a second capsid protein.
- the assembly of the first and second capsid proteins constitutes a virus-like particle.
- the first capsid protein and the second capsid protein form a dimer
- a virus-like particle is constituted by aggregation of a plurality of the dimers. That is, the virus-like particles of the present invention can be said to be a dimer assembly of the first capsid protein and the second capsid protein. Accordingly, the present invention also provides such dimers.
- the number of dimers constituting the virus-like particle is not limited. It can be seen that any number of dimers can spontaneously assemble to form a structurally more stable virus-like particle.
- a virus-like particle can be an assembly of 90 dimers.
- the dimer of the present invention has a structure in which a first capsid protein and a second capsid protein are connected by a linker.
- the linker may be any linker as long as the purpose of the present invention can be achieved.
- the structure and repeating unit of the linker, the mode of connection with the capsid protein, etc. can also be appropriately set depending on the capsid protein constituting the dimer.
- the repeat unit of the linker may be set to 1 or more, preferably 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10.
- the linker connects the first capsid protein and the second capsid protein at any position such as their amino (N) terminus, carboxyl (C) terminus, side chain amino group, and/or side chain carboxyl group. It can be connected with .
- the arbitrary position may preferably be any position other than a position that may be included in the epitope region or may affect the conformation of the epitope region.
- Exemplary linkers include peptide linkers.
- a peptide linker can include any number of amino acids.
- a peptide linker can be composed of 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, or 15 amino acids.
- the peptide linker is composed of 3, 4, 5, 6, or 7 amino acids.
- a GS linker containing glycine (G) and serine (S) is an example of a preferred peptide linker in the present invention. Linkers with similar flexibility to GS linkers can also be used.
- the method for connecting the first capsid protein and the second capsid protein with a linker is not particularly limited.
- the first capsid protein and the second capsid protein may be linked via a linker at any position by a chemical method.
- a polynucleotide encoding a first capsid protein and a polynucleotide encoding a second capsid protein are linked with a polynucleotide encoding a linker, and an appropriate expression system is used to extract the first capsid protein from the linked polynucleotide.
- a dimer in which a capsid protein and a second capsid protein are connected by a linker can be obtained. Methods for attaching linkers to peptides of proteins are known to those skilled in the art. Therefore, in the present invention, the first capsid protein and the second capsid protein can be linked with a linker using any known method without being limited to the above examples.
- (G 4 S) n or (GGGGS) n can be used as a GS linker to connect a first capsid protein and a second capsid protein.
- n is a repeating unit of the linker and is an integer of 1 or more.
- n is an integer from 2 to 8, more preferably from 4 to 6, and even more preferably 5.
- the GS linker can connect the first capsid protein and the second capsid protein at any position as long as a virus-like particle can be formed.
- the arbitrary position may preferably be any position other than a position that may be included in the epitope region or may affect the conformation of the epitope region.
- the C-terminus of the first capsid protein and the N-terminus of the second capsid protein can be connected with a linker.
- the N-terminus of the first capsid protein and the C-terminus of the second capsid protein can be connected with a linker.
- the first capsid protein and the second capsid protein may be derived from any virus.
- the virus is not particularly limited, and may be, for example, a virus from the same or different family, genus, or species.
- capsid proteins derived from viruses of the same genus can have similar three-dimensional structures, so any capsid protein can be used as long as it is derived from a virus of the same genus.
- the viruses can be of the same or different genogroups, genotypes, or serotypes.
- the virus may infect any host. Examples include bacterial viruses that infect bacteria, plant viruses that infect plants, or animal viruses that infect animals. More specifically, it is a virus of the Caliciviridae family.
- the family Caliciviridae includes the genus Lagovirus, genus Norovirus, genus Hepevirus, genus Sapovirus, and genus Nebovirus.
- information on the amino acid sequence of the viral capsid protein can be obtained from publicly available information sources.
- information sources include databases published on the Internet (including, but not limited to, GenBank, EMBL, DDBJ (Japanese DNA Database), etc.).
- the resulting dimer may be composed of two capsid proteins that are the same or different. Ru.
- the virus-like particles formed by the assembly of such dimers will have monovalent or divalent antigens of viruses of the same family, genus, or species.
- the first capsid protein and the second capsid protein are each selected from capsid proteins derived from viruses of different families, genera, or species, the resulting dimer is composed of two different capsid proteins.
- the virus-like particles formed by the assembly of such dimers will have bivalent antigens of viruses of different families, genera, or species.
- the resulting dimer may be the same or different two capsid proteins. Composed of capsid protein. Therefore, the virus-like particles formed by the assembly of such dimers will have monovalent or divalent antigens of viruses of the same genogroup, genotype, or serotype.
- the first capsid protein and the second capsid protein are selected from capsid proteins derived from viruses of different gene groups, genotypes, or serotypes
- the resulting dimer is composed of two different capsid proteins. It consists of Therefore, the virus-like particles formed by the assembly of such dimers will have bivalent antigens of viruses of different genogroups, genotypes, or serotypes.
- the dimer of the present invention contains the first and second capsid proteins in equal proportions (1:1). It can be understood that the virus-like particles of the present invention formed by the aggregation of the dimers also contain the first and second capsid proteins in an equal ratio (1:1); It may have a regular or uniform structure with bodies as units. This can be difficult to achieve with conventional techniques of mixing capsid protein monomers and forming virus-like particles by spontaneous assembly.
- Prior art VLPs are a mixture of VLPs with different proportions of capsid protein and may not have a uniform structure.
- the first and second capsid proteins constituting the virus particle and dimer of the present invention will be explained in more detail using an example in which these proteins are derived from a norovirus. It should be understood that the present invention is also applicable to capsid proteins derived from other viruses.
- norovirus has 10 gene groups (GI, GII, GIII, GIV, GV, GVI, GVII, GVIII, IX, and GX).
- Noroviruses belonging to GI, GII, GIV, GVIII, and GIX infect humans noroviruses belonging to GIII infect cattle, noroviruses belonging to GV infect mice, noroviruses belonging to GVI infect cats, and noroviruses belonging to GVI infect cats.
- Noroviruses belonging to the GX group are known to infect dogs, and noroviruses belonging to the GX group are known to infect bats.
- Each gene group has genotypes that are classified or clustered based on the norovirus gene sequence.
- GI and GII it is known that various genotypes exist. At present, there are nine genotypes of GI (GII.1-9) and 27 genotypes of GII (GII.1-27).
- Noroviruses include, but are not limited to, Norwalk (M87611), Southampton (L07418), DesertShield395 (U04469), Chiba407 (AB042808), Musgrove (AJ277609), BS5 (Hesse ) (AF093797), Winchester (AJ277609 ), Boxer (AF538679), Vancouver730 (HQ637267), Hawaii (U07611), Melksham (X81879), SnowMountain (AY134748), Ibaraki197 (LC213885), MK04 (DQ456824), Hubei027 (MH068811), HuzhouNS17116 (MG763368), 218001 (MK614154 ), TV24 (U02030), NS17-A863 (MG892947
- the first and second capsid proteins can be selected from those derived from any norovirus, and can be combined arbitrarily.
- the first and second capsid proteins can be selected from capsid proteins derived from Norovirus GI and GII. More specifically, both the first and second capsid proteins can be selected from capsid proteins derived from Norovirus GI or GII.
- one of the first and second capsid proteins can be selected from capsid proteins derived from Norovirus GI, and the other can be selected from capsid proteins derived from Norovirus GII.
- norovirus GI is GI. 1 to 9
- norovirus GII is GII. It may be any number from 1 to 27.
- norovirus GII A capsid protein derived from Norovirus GII.
- a capsid protein derived from No. 17 can be selected as the second capsid protein.
- a capsid protein derived from No. 17 can be selected as the first and second capsid proteins.
- the capsid protein can include VP1 capsid protein.
- the capsid protein can consist of VP1 capsid protein.
- Polypeptides (SEQ ID NOs: 10 to 12) in which Aomori2 of norovirus and VP1 capsid protein of Washington 0207 are linked with a linker (repeat units 4 to 6) are a dimer of the capsid protein of the present invention and a virus-like particle of the present invention. This is a specific example of the constituent elements.
- the present invention provides a polynucleotide encoding a dimer of the capsid protein described above. Since the correspondence between amino acid residues and gene codons has already been established, it is easy to mutually convert the amino acid sequence of the dimer and the corresponding polynucleotide sequence.
- the polynucleotide may be either RNA or DNA, but DNA is convenient from the viewpoint of handling and storage.
- the polynucleotide encoding the capsid protein dimer of the present invention can be obtained by biological techniques. For example, by reverse transcribing RNA encoding the viral capsid protein into cDNA and performing a gene amplification reaction (reverse transcription PCR) using the cDNA as a template, polynucleotides encoding the first and second capsid proteins are respectively amplified. can be done. Primers for PCR are designed such that the region containing the nucleic acid sequence encoding the first or second capsid protein is amplified. That is, a primer may be designed that anneals to a nucleic acid sequence located upstream and/or downstream of the nucleic acid sequence encoding the first or second capsid protein.
- Sequence information on polynucleotides encoding viral capsid proteins can also be obtained from published information sources.
- information sources include databases published on the Internet (including, but not limited to, GenBank, EMBL, DDBJ (Japan DNA Database), etc.).
- polynucleotide encoding the capsid protein dimer of the present invention may be obtained by chemical synthesis.
- Polynucleotide synthesis can be performed in-house or outsourced to an external organization.
- Polynucleotides may be synthesized by any known method. For example, solid phase synthesis methods are well known. Those skilled in the art are familiar with the methods and conditions for polynucleotide synthesis.
- the first capsid protein and the second capsid protein are obtained by using an appropriate expression system from the polynucleotide encoding the first capsid protein and the polynucleotide encoding the second capsid protein obtained by the method described above. Capsid proteins can be produced.
- the obtained first capsid protein and second capsid protein are The dimer of the present invention can be obtained by directly linking with a linker.
- a polynucleotide that is obtained by linking a polynucleotide encoding the first capsid protein and a polynucleotide encoding the second capsid protein via a polynucleotide encoding the peptide linker can be prepared.
- the peptide linker those described above can be used.
- An example of a peptide linker is a GS linker, (G 4 S) n or (GGGGS) n linker, where n is as defined above.
- a dimer in which the first capsid protein and the second capsid protein are connected by a linker can be obtained as a product. According to such a method, there is no need to manufacture the first capsid protein and the second capsid protein separately and then chemically connect them with a linker.
- polynucleotide can be subjected to extraction and/or purification operations as necessary at any time regarding its acquisition or utilization.
- Those skilled in the art can appropriately select known methods for polynucleotide extraction and/or purification.
- polynucleotides of SEQ ID NOs: 7 to 9 encode a polypeptide in which Norovirus Aomori2 and Washington 0207 VP1 capsid protein are linked by a linker (repeat units 4 to 6), and are the capsid protein dimer of the present invention. This is a specific example of a polynucleotide encoding.
- a polynucleotide encoding the capsid protein dimer of the present invention can be incorporated into an expression vector. Accordingly, the present invention also provides such expression vectors. Examples of expression vectors include pET for E. coli expression, pAUR for yeast expression, pIEx-1 for insect cell expression, and pBApo-CMV for animal cell expression, but other known vectors can also be used. . In addition, integration of the polynucleotide into the expression vector can be performed by a known method.
- the expression vector of the present invention can be introduced into an appropriate host cell. Therefore, the present invention provides a host cell into which the expression vector has been introduced.
- the host cell is not particularly limited as long as it can produce the capsid protein dimer of the present invention.
- insect-derived cells e.g., Sf9, High Five cells, etc.
- Escherichia coli yeast
- yeast e.g., Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe, Pichia pastori, etc.
- mammalian cells CHO, HEK, etc.
- any other cells CHO, HEK, etc.
- a dimer of the capsid protein of the present invention is produced, and the dimer is assembled to form the virus-like particle of the present invention.
- methods for introducing an expression vector into a host cell, culturing the host cell, and extracting, concentrating, or purifying the product are known. Such known methods can also be applied to the present invention.
- the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the virus-like particle or capsid protein dimer of the present invention described above.
- the pharmaceutical composition of the present invention may contain any additional components as long as the effects of the invention are achieved. Additional components can be appropriately selected from known components. Examples include excipients, diluents, pH adjusters, preservatives, carriers, suspending agents, solubilizers, thickeners, stabilizers, preservatives, penetrants, immunity modifiers, and adjuvants. .
- the pharmaceutical composition of the present invention may be administered either orally or parenterally, and the intended route of administration can be selected as appropriate.
- the pharmaceutical compositions of the present invention can be administered by any route including intravenous, arterial, intramuscular, peritoneal, nasal, transdermal, intradermal, subcutaneous, buccal, sublingual, rectal, oral, ocular, vaginal, pulmonary, and oral. can be administered.
- the form of the pharmaceutical composition of the invention may be, but is not limited to, for example, tablets, capsules, pills, syrups, elixirs, emulsions, aerosols, aqueous or non-aqueous injection solutions, or powders for injection solutions, granules, or It can be made into a tablet (with the addition of liquid excipients, aqueous or non-aqueous, to prepare an injectable solution).
- the pharmaceutical composition of the present invention can treat (prevent, cure, alleviate, or ameliorate) a viral infection, a virus-induced disease, or at least one symptom associated with the infection and/or disease.
- infections, diseases, or symptoms include, for example, acute gastroenteritis and related symptoms (nausea, diarrhea, loose stools, vomiting, nausea, fever, malaise, fatigue, stomach cramps, chills, muscle pain, headache, at least one of the following.
- the above prevention, treatment, mitigation, or amelioration includes neutralizing the infectious agent, inhibiting the entry of the infectious agent into cells, inhibiting the replication of the infectious agent, protecting host cells from infection or destruction, or using antibodies. This may be achieved by, but not limited to, stimulating production.
- the pharmaceutical composition of the present invention is administered in an amount effective to prevent, treat, alleviate, or ameliorate a viral infection, a virus-induced disease, or at least one symptom associated with the infection and/or disease.
- the subject may be any subject that can be infected with a virus, and may be, for example, a mammal (human, pig, cow, rodent, dog, cat, etc.).
- the effective amount can be determined as appropriate, taking into account the subject to whom the composition is applied, the route of administration, the form of administration, and the like.
- the pharmaceutical compositions of the present invention also induce protective immunity against viruses, thereby preventing viral infections, virus-induced diseases, or at least one symptom associated with such infections and/or diseases. , can be used to treat, alleviate, or ameliorate.
- inducing "protective immunity" against a virus means inducing immunity or an immune response against an infectious agent (a virus, a substance derived therefrom, or a substance produced thereby).
- a protective immune response may result from either a humoral immune response or a cell-mediated immune response.
- the antibody titer against the virus may be higher in the subject than before the induction.
- the antibody titer can be measured by a known method. Therefore, the pharmaceutical composition of the present invention can be used as a vaccine composition.
- the pharmaceutical composition of the present invention can be used, for example, to treat infections, diseases, and symptoms associated with norovirus.
- Norovirus is as explained above.
- Norovirus targeted by the pharmaceutical composition of the present invention is not limited, and may belong to any genetic group or genotype. However, it should be understood that the target Norovirus is determined by the origin of the capsid protein constituting the virus-like particle or dimer contained in the pharmaceutical composition of the present invention.
- a virus-like particle or capsid protein dimer included in the pharmaceutical composition - When containing a capsid protein derived from norovirus GI, the target of the pharmaceutical composition is at least norovirus GI, - When containing a capsid protein derived from Norovirus GII, the target of the pharmaceutical composition is at least Norovirus GII, - When containing capsid proteins derived from Norovirus GI and GII, the target of the pharmaceutical composition is at least Norovirus GI and GII.
- virus-like particles of the present invention and dimers of capsid proteins of the present invention have a regular or uniform structure containing the first and second capsid proteins in equal proportions (1:1). may have. This property may be beneficial in aspects of quality control of pharmaceutical compositions.
- the virus-like particle of the present invention or the dimer of the capsid protein of the present invention has bivalent or multivalent antigenicity, it is useful for efficiently producing a pharmaceutical composition having multivalent antigenicity. It can be. It may also be beneficial in that the amount of added protein can be reduced.
- Example 1 Preparation of recombinant baculovirus
- the VP1 gene derived from the following norovirus strain was used: (1) VP1 gene (SEQ ID NO: 2) derived from Norovirus Hu/GII-4/Aomori2/2006/JP (Accession number: AB447433) (hereinafter referred to as "Aomori2"). (2) Norovirus GII isolate Hu/US/2018/GII. P16-GII. 4 VP1 gene (SEQ ID NO: 3) derived from Sydney/Washington0207 (Accession number: MK754446) (hereinafter referred to as "Washington0207").
- a G 4 S linker was used as a linker, and the repeating units were 4 ((G 4 S) 4 ), 5 ((G 4 S) 5 ), and 6 ((G 4 S) 6 ).
- the gene encoding (G 4 S) 4 (SEQ ID NO: 4), the gene encoding (G 4 S) 5 (SEQ ID NO: 5), and the gene encoding (G 4 S) 6 (SEQ ID NO: 6) were obtained. .
- DNA in which two different VP1 genes were linked with a linker was obtained by gene synthesis.
- (G 4 S) 6 linker-encoding DNA was obtained.
- Sf9 cells Lipofectamine TM LTX Reagent with PLUS TM Reagent. , Thermo Fisher Scientific, Cat. No. 15338100 ) did. After culturing Sf9 cells at 26-28°C for 7 days, recombinant baculovirus was collected from the culture supernatant and stored at -80°C.
- Example 2 Preparation of linker-linked VLP
- the recombinant baculovirus prepared in Example 1 was inoculated into High Five cells at an appropriate MOI (Multiplicity of Infection).
- High Five cells were cultured at 26-28°C to produce linker-ligated VLPs.
- the culture fluid was collected 4 to 7 days after infection, centrifuged at 10,000 ⁇ g for 60 minutes, and separated into culture supernatant and cell pellet.
- the cell pellet was crushed using an ultrasonic crusher, centrifuged at 15,000 xg for 10 minutes, and the supernatant was collected.
- the culture supernatant and the supernatant after cell pellet disruption were subjected to density gradient centrifugation using cesium chloride to obtain linker-linked VLPs.
- SDS-PAGE analysis was performed as follows. 27 ⁇ l of the sample prepared in Example 2 and 9 ⁇ l of sample buffer (4 ⁇ Laemmli Sample Buffer, Bio-Rad Laboratories, Cat. No. #161-0747) (containing DTT) were mixed and heated at 95° C. for 5 minutes. 12 ⁇ l of the heated solution was applied to one lane of an SDS-PAGE gel, and electrophoresed at 200 V for 30 minutes. The gel after electrophoresis was stained with Coomassie (Bio-Safe Coomassie Stain, Bio-Rad Laboratories, Cat. No. #1610787), and then stained with D. W. Decolorization was performed 3 times for 20 minutes.
- Western blotting analysis was performed as follows. Using a transfer device, the proteins on the gel after SDS-PAGE were transferred to a PVDF membrane (200V, 30 minutes). After immersion treatment with blocking buffer, GII. GII.4 genotype detection antibody (anti-VLP antibody of Norovirus Hu/GII.4/Sydney/NSW0514/2012/AU (JX459908)) was used to detect GII.4 genotype. Four genotypes of VP1 were detected.
- Each gel image was acquired using a gel photography device. Thereafter, the band density of the obtained results was quantified using an analytical method panel, and the purity of the VLP was calculated.
- Example 4 Analysis by transmission electron microscopy (TEM) The structural characteristics of the linker-linked VP1 dimeric protein in the sample prepared in Example 2 were analyzed using TEM.
- TEM analysis was performed as follows. After diluting the sample, it was dropped onto a copper mesh, colored with phosphotungstic acid staining solution, and observed under an electron microscope.
- VLPs the analysis results of a VP1 dimeric protein linked with a (G 4 S) 5 linker are shown (FIG. 4). From this figure, it was confirmed that the VP1 dimers connected by linkers formed particles (VLPs). This result suggested that the VLP was a chimeric VLP having multivalent antigenicity against two norovirus strains (Aomori2 and Washington0207). Even when other linkers are used, it is presumed that two VP1 dimeric proteins connected by a linker form a VLP.
- Example 5 Analysis by size exclusion chromatography (SEC) Analysis of the structural characteristics of the linker-linked VP1 dimeric protein in the sample prepared in Example 2 was performed using SEC.
- Example 6 Repreparation and characterization of linker-linked VLP
- MOI Multiple of Infection
- High Five cells cultured at 26-28°C. Inoculated Four to seven days after inoculation, the culture solution was collected and centrifuged at 10,000 xg for 20 minutes to collect cell pellets. Cell pellets were disrupted using an ultrasonic disruptor, centrifuged at 15,000 ⁇ g for 10 minutes, and the supernatant was collected.
- the collected supernatant was subjected to sucrose cushion centrifugation (40 w/w% sucrose solution), and a pellet containing linker-linked VLP from which low molecular weight impurities had been removed was collected. This pellet was suspended in PBS and subjected to cesium chloride density gradient centrifugation to obtain purified linker-linked VLP.
- Characteristics of the obtained linker-linked VLP were analyzed by SDS-PAGE and Western blotting in the same manner as in Example 3, and by electron microscopy (TEM) and size exclusion chromatography (SEC) in the same manner as in Example 4. Particle formation was confirmed. Furthermore, the particle diameter was evaluated by multi-angle light scattering (MALS).
- MALS multi-angle light scattering
- this band was considered to correspond to the target protein in which two types of VP1 (Aomori2 and Washington0207-derived VP1) were linked with a G 4 S linker.
- linker-linked VLP prepared in this example had higher purity than that prepared in Example 2.
- treatment by the sucrose cushion method was added during the purification operation.
- the structure of the linker-linked VLP prepared in this example was analyzed using TEM. From the obtained electron microscopy image (FIG. 7), it was confirmed that, as in Example 4, the linker-connected VLP formed particles. Then, analysis by SEC revealed that the retention time of the linker-linked VLP (FIG. 8) and that of the comparison control sample (FIG. 9: Aomori2 VLP) were almost the same. Furthermore, the radius of gyration (rw) measured by MALS was 32.9 nm for the linker-linked VLP and 23.6 nm for the comparative sample (VLP of Aomori2). From these results, it was confirmed that the linker-linked VLP has approximately the same particle size as the VLP formed from a single VP1.
- each solution (0.025 ⁇ g/ml) containing three types of VLPs (Aomori2 VLP, Washington0207 VLP, and Aomori2-Washington0207 linker-linked VLP (all prepared according to the method of Example 2)) was mixed with 200 ⁇ l of a mouse immune serum solution serially diluted 2 times from 40 times to 20,480 times, and allowed to stand at 25° C. for 1 hour. This mixture was used as a VLP-mouse immune serum mixture.
- the mouse immune serum was prepared from blood collected after each VLP (Aomori2 VLP and Washington0207 VLP) was administered twice at 100 ⁇ g/head to four mice (4 lots for each VLP).
- the absorbance of the wells to which a mixture of VLPs and PBS containing 0.05% Tween 20 and 5% skim milk (without mouse immune serum) was added was OD [no serum], and no VLP-mouse immune serum mixture was added.
- BT50 blocking titer 50 value.
- BT50 is the value of the maximum serum dilution factor at which the binding inhibition activity exceeds 50%.
- Statistical analysis based on the Mann-Whitney rank sum test was performed on the BT50 values obtained for each of the three types of VLPs (Aomori2 VLP, Washington0207 VLP, and Aomori2-Washington0207 linker-linked VLP). The BT50 values of each VLP were compared, and it was determined whether the linker-linked VLP had two types of antigenicity based on a statistically significant difference.
- Figure 10 shows the results of receptor binding inhibitory activity against each VLP (Aomori2 VLP, Washington0207 VLP, and Aomori2-Washington0207 linker-linked VLP) when mouse immune serum (4 lots) against Aomori2 VLP was used. show.
- FIG. 11 shows the results of the receptor binding inhibitory activity against each VLP when mouse immune serum (4 lots) against the Washington 0207 VLP was used.
- the mouse immune serum against Aomori2 VLP had significantly lower receptor binding inhibitory activity against Washington0207 VLP.
- the mouse immune serum had the same level of receptor binding inhibitory activity as Aomori2 VLP with respect to the linker-linked VLP containing Aomori2 VP1.
- the mouse immune serum against Washington0207 VLP also showed a slight receptor binding inhibitory activity against Aomori2 VLP, but it was significantly lower than that of Washington0207 VLP and linker-linked VLP.
- Washington 0207 VLP and the linker-linked VLP had similar receptor binding inhibitory activity.
- the linker-linked VLP according to the present invention is a chimeric VLP formed from two norovirus VP1s linked via a linker, and the chimeric VLP is a multivalent antigenic particle having the antigenicity of two types of VP1. It was thought that there was.
Abstract
本発明は、２つのカプシドタンパク質が等しい割合で存在する、多価抗原性を有し得るＶＬＰの提供を目的とする。 第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質の二量体の集合体を含み、当該第１のカプシドタンパク質と当該第２のカプシドタンパク質は、リンカーにより連結されている、ウイルス様粒子。
Description
本願は、リンカーにより連結されたカプシドタンパク質の二量体、当該二量体を含むウイルス様粒子、当該ウイルス様粒子を生産するための発現ベクター及び宿主細胞、並びに当該二量体及び／又は当該ウイルス様粒子を含有する医薬組成物に関する。
ウイルスが他の生物（動物、植物、細菌等）に感染すると、様々な症状や疾患引き起こす。ウイルス感染は、例えば、ヒトにおいては、風邪、インフルエンザ、気管支炎、肺炎、胃腸炎、肝炎、髄膜炎、風疹、癌、及び脳炎などに関与し得る。人の往来が活発になっている昨今においては、以前は特定の地域に限られていたウイルス感染が、他の地域に拡散することもある。このことから、ウイルス感染への一層効果的な対策が求められている。
ウイルス感染に対する手段の一つとして、ワクチン接種が広く行われている。ワクチンは、被験体の免疫機能を刺激することによって、ウイルスに対する免疫を高め、感染を予防する。効果の高いワクチンを得るためには、優れた抗原を用いることが必要である。従って、ワクチン用の抗原に関する開発は継続的に行われている。
例えば、特許文献１には、第１のノロウイルス株のＶＰ１（ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ １）のＳ（ｓｈｅｌｌ）－ドメインと第２のノロウイルス株のＶＰ１のＰ（ｐｒｏｔｒｕｄｉｎｇ）－ドメインの少なくとも一部を含有するＰ－ドメインより構成されるキメラＶＰ１、及び当該ＶＰ１より構成されるウイルス様粒子（ＶＬＰ）が開示される。ここでは、複数種類のＶＬＰを混合し、多価ＶＬＰを調製することが開示されている。この技術においては、抗原（標的とするノロウイルス株）毎にＶＬＰを調製する必要があるため、標的とする抗原の数が増える程、多価ＶＬＰの調製に手間が掛かる、品質管理が煩雑になる、抗原量が増加する、又はコストが増加する等の可能性がある。
一方、特許文献２には、２以上のノロウイルス遺伝子型に由来する抗原タンパク質より構成される多価ＶＬＰが開示される。特許文献３には、異なるノロウイルス遺伝子型由来のＶＰ１を混合し、多価ＶＬＰを調製することが開示される。
多価抗原性を有するＶＬＰの作製に関して、先行技術においては、複数の異なるＶＰ１単量体のランダムな自己集合によりＶＬＰを形成するため、異なるＶＰ１が異なる割合でＶＬＰに存在する可能性がある。本発明は、２つのカプシドタンパク質が等しい割合で存在する、多価抗原性を有し得るＶＬＰの提供を目的とする。
以上に鑑み、本願の発明者は、第一のカプシドタンパク質と第二のカプシドタンパク質をリンカーにより連結することに着目し、本発明を完成させた。
本発明は、限定されないが、以下を提供する。
（１）第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質の二量体の集合体を含み、当該第１のカプシドタンパク質と当該第２のカプシドタンパク質は、リンカーにより連結されている、ウイルス様粒子。
（２）リンカーはＧＳリンカーである、（１）のウイルス粒子。
（３）第１のカプシドタンパク質のＣ末端と第２のカプシドタンパク質のＮ末端がＧＳリンカーを介して連結されている、（２）のウイルス様粒子。
（４）ＧＳリンカーが（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーであり、ここでｎは１以上の整数である、（２）又は（３）のウイルス様粒子。
（５）第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質は同じ又は異なるウイルスに由来する、（１）～（４）のいずれかのウイルス様粒子。
（６）第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質はカリシウイルス科のウイルスに由来する、（１）～（５）のいずれかのウイルス様粒子。
（７）第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質がＧＳリンカーにより連結されている、カプシドタンパク質の二量体。
（８）リンカーはＧＳリンカーである、（７）のカプシドタンパク質の二量体。
（９）第１のカプシドタンパク質のＣ末端と第２のカプシドタンパク質のＮ末端がＧＳリンカーを介して連結されている、（８）のカプシドタンパク質の二量体。
（１０）ＧＳリンカーが（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーであり、ここでｎは１以上の整数である、（８）又は（９）のカプシドタンパク質の二量体。
（１１）第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質は同じ又は異なるウイルスに由来する、（７）～（１０）のいずれかのカプシドタンパク質の二量体。
（１２）第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質はカリシウイルス科のウイルスに由来する、（７）～（１１）のいずれかのカプシドタンパク質の二量体。
（１３）第１のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと第２のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、リンカーをコードするポリヌクレオチドを介して連結された構造を含む、ポリヌクレオチド。
（１４）リンカーはＧＳリンカーである、（１３）のポリヌクレオチド。
（１５）ＧＳリンカーが（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーであり、ここでｎは１以上の整数である、（１４）のポリヌクレオチド。
（１６）第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質は同じ又は異なるウイルスに由来する、（１３）～（１５）のいずれかのポリヌクレオチド。
（１７）第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質はカリシウイルス科のウイルスに由来する、（１３）～（１６）のいずれかのポリヌクレオチド。
（１８）（１３）～（１７）のいずれかのポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（１９）（１８）の発現ベクターが導入された宿主細胞。
（２０）（１）～（６）のいずれかのウイルス様粒子又は（７）～（１２）のいずれかのカプシドタンパク質の二量体を含む医薬組成物。
（２１）防御免疫の誘導に用いられる、（２０）の医薬組成物。
（２２）ワクチンである、（２０）又は（２１）の医薬組成物。
（１）第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質の二量体の集合体を含み、当該第１のカプシドタンパク質と当該第２のカプシドタンパク質は、リンカーにより連結されている、ウイルス様粒子。
（２）リンカーはＧＳリンカーである、（１）のウイルス粒子。
（３）第１のカプシドタンパク質のＣ末端と第２のカプシドタンパク質のＮ末端がＧＳリンカーを介して連結されている、（２）のウイルス様粒子。
（４）ＧＳリンカーが（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーであり、ここでｎは１以上の整数である、（２）又は（３）のウイルス様粒子。
（５）第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質は同じ又は異なるウイルスに由来する、（１）～（４）のいずれかのウイルス様粒子。
（６）第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質はカリシウイルス科のウイルスに由来する、（１）～（５）のいずれかのウイルス様粒子。
（７）第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質がＧＳリンカーにより連結されている、カプシドタンパク質の二量体。
（８）リンカーはＧＳリンカーである、（７）のカプシドタンパク質の二量体。
（９）第１のカプシドタンパク質のＣ末端と第２のカプシドタンパク質のＮ末端がＧＳリンカーを介して連結されている、（８）のカプシドタンパク質の二量体。
（１０）ＧＳリンカーが（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーであり、ここでｎは１以上の整数である、（８）又は（９）のカプシドタンパク質の二量体。
（１１）第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質は同じ又は異なるウイルスに由来する、（７）～（１０）のいずれかのカプシドタンパク質の二量体。
（１２）第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質はカリシウイルス科のウイルスに由来する、（７）～（１１）のいずれかのカプシドタンパク質の二量体。
（１３）第１のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと第２のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、リンカーをコードするポリヌクレオチドを介して連結された構造を含む、ポリヌクレオチド。
（１４）リンカーはＧＳリンカーである、（１３）のポリヌクレオチド。
（１５）ＧＳリンカーが（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーであり、ここでｎは１以上の整数である、（１４）のポリヌクレオチド。
（１６）第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質は同じ又は異なるウイルスに由来する、（１３）～（１５）のいずれかのポリヌクレオチド。
（１７）第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質はカリシウイルス科のウイルスに由来する、（１３）～（１６）のいずれかのポリヌクレオチド。
（１８）（１３）～（１７）のいずれかのポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（１９）（１８）の発現ベクターが導入された宿主細胞。
（２０）（１）～（６）のいずれかのウイルス様粒子又は（７）～（１２）のいずれかのカプシドタンパク質の二量体を含む医薬組成物。
（２１）防御免疫の誘導に用いられる、（２０）の医薬組成物。
（２２）ワクチンである、（２０）又は（２１）の医薬組成物。
＜ウイルス様粒子、カプシドタンパク質の二量体＞
本発明は、ウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ、以下「ＶＬＰ」ということもある）を提供する。ウイルス様粒子は、ウイルス粒子と類似の構造を有する。その一方、ウイルス様粒子は、内部に遺伝子情報（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を有さない点でウイルス粒子と異なり、感染や増殖する能力を有さない。このため、ウイルス様粒子は、ウイルス感染に対するワクチンの抗原等として利用することができる。
本発明は、ウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ、以下「ＶＬＰ」ということもある）を提供する。ウイルス様粒子は、ウイルス粒子と類似の構造を有する。その一方、ウイルス様粒子は、内部に遺伝子情報（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を有さない点でウイルス粒子と異なり、感染や増殖する能力を有さない。このため、ウイルス様粒子は、ウイルス感染に対するワクチンの抗原等として利用することができる。
本発明のウイルス様粒子は、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質を有する。第１及び第２のカプシドタンパク質が集合することによって、ウイルス様粒子が構成される。本発明においては、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質が二量体を形成しており、当該二量体の複数が集合することによって、ウイルス様粒子が構成される。即ち、本発明のウイルス様粒子は、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質の二量体の集合体といえる。従って、本発明により、このような二量体も提供される。ウイルス様粒子を構成する二量体の数は制限されない。任意の数の二量体が自発的に集合し、構造的により安定なウイルス様粒子が形成されることが理解できる。例えば、ウイルス様粒子は９０個の二量体の集合体であり得る。
本発明の二量体は、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質がリンカーにより連結された構造を有する。ここで、リンカーは、本発明の目的が達成し得る限りにおいて、任意のものであり得る。そして、リンカーの構造及び繰り返し単位、並びにカプシドタンパク質との連結様式等に関しても、二量体を構成するカプシドタンパク質に応じて適宜設定することが可能である。例えば、リンカーの繰り返し単位は１以上、好ましくは２、３、４、５、６、７、８、９又は１０に設定してもよい。例えば、リンカーは、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質を、それらのアミノ（Ｎ）末端、カルボキシル（Ｃ）末端、側鎖のアミノ基、及び／又は側鎖カルボシキル基等の任意の位置で連結することができる。当該任意の位置は、好ましくは、エピトープ領域に含まれ得る又はエピトープ領域の立体構造に影響し得る位置を除く任意の位置であり得る。
例示的なリンカーとして、ペプチドリンカーが挙げられる。ペプチドリンカーは任意のアミノ酸を任意の数で含み得る。例えば、ペプチドリンカーは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸より構成することができる。好ましくは、ペプチドリンカーは、３、４、５、６、又は７個のアミノ酸より構成される。グリシン（Ｇ）とセリン（Ｓ）を含むＧＳリンカーは、本発明において、好ましいペプチドリンカーの一例である。また、ＧＳリンカーと同様の柔軟性を有するリンカーも利用可能である。
第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質をリンカーで連結する方法は特に限定されない。例えば、化学的な手法により、第1のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質を、任意の位置でリンカーを介して連結させてもよい。或いは、遺伝子工学的な手法を用いることも可能である。第１のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと第２のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、リンカーをコードするポリヌクレオチドで連結し、適切な発現系を用いて当該連結したポリヌクレオチドから、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質がリンカーで連結された二量体を得ることができる。タンパク質のペプチドにリンカーを連結する方法は、当業者に公知である。従って、本発明においても、上記の例に制限されることなく、公知のいずれの方法を用いて、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質をリンカーで連結することができる。
例えば、ＧＳリンカーとして（Ｇ４Ｓ）ｎ又は（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１）を用いて、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質を連結することができる。ここでｎは、リンカーの繰り返し単位であり、１以上の整数である。好ましくは、ｎは２～８の整数であり、より好ましくは４～６の整数であり、さらに好ましくは５である。ＧＳリンカーは、ウイルス様粒子が形成できる限り、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質を任意の位置で連結することができる。当該任意の位置は、好ましくは、エピトープ領域に含まれ得る又はエピトープ領域の立体構造に影響し得る位置を除く任意の位置であり得る。例えば、第１のカプシドタンパク質のＣ末端と第２のカプシドタンパク質のＮ末端をリンカーで連結することができる。例えば、第１のカプシドタンパク質のＮ末端と第２のカプシドタンパク質のＣ末端をリンカーで連結することができる。
第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質は、いずれのウイルスに由来するものであってもよい。ここで、ウイルスは特に制限されないが、例えば、同じ又は異なる科（ｆａｍｉｌｙ）、属（ｇｅｎｅｒａ）、或いは種（ｓｐｅｃｉｅｓ）のウイルスであることができる。一般的に、同じ属のウイルス由来のカプシドタンパク質は立体構造が類似し得るため、同じ属のウイルスに由来するものであれば、任意のカプシドタンパク質を用いることができる。或いは、ウイルスは、同じ又は異なる遺伝子群（ｇｅｎｏｇｒｏｕｐ）、遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）、又は血清型（ｓｅｒｏｔｙｐｅ）のウイルスであることができる。また、ウイルスは、いずれの宿主に感染するものであってもよい。例えば、細菌に感染する細菌ウイルス、植物に感染する植物ウイルス、又は動物に感染する動物ウイルスが挙げられる。より具体的には、カリシウイルス科のウイルスである。カリシウイルス科には、ラゴウイルス（Ｌａｇｏｖｉｒｕｓ）属、ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）属、ヘペウイルス（Ｈｅｐｅｖｉｒｕｓ）属、サポウイルス（Ｓａｐｏｖｉｒｕｓ）属、ネボウイルス（Ｎｅｂｏｖｉｒｕｓ）属が含まれる。なお、ウイルスのカプシドタンパク質のアミノ酸配列の情報は、公開された情報源から入手可能である。例えば、そのような情報源として、インターネット等で公開されているデータベース（限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータベース）など）が挙げられる。
第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質を、共に、同じ科、属、又は種のウイルスに由来するカプシドタンパク質から選択した場合、得られる二量体は同じ又は異なる２つのカプシドタンパク質より構成される。従って、そのような二量体が集合して形成されるウイルス様粒子は、同じ科、属、又は種のウイルスの、１価又は２価抗原を有するものとなる。そして、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質を、それぞれ、異なる科、属、又は種のウイルスに由来するカプシドタンパク質から選択した場合、得られる二量体は異なる２つのカプシドタンパク質より構成される。従って、そのような二量体が集合して形成されるウイルス様粒子は、異なる科、属、又は種のウイルスの、２価抗原を有するものとなる。
また、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質を、共に、同じ遺伝子群、遺伝子型、又は血清型のウイルスに由来するカプシドタンパク質から選択した場合、得られる二量体は同じ又は異なる２つのカプシドタンパク質より構成される。従って、そのような二量体が集合して形成されるウイルス様粒子は、同じ遺伝子群、遺伝子型、又は血清型のウイルスの、１価又は２価抗原を有するものとなる。そして、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質を、それぞれ、異なる遺伝子群、遺伝子型、又は血清型のウイルスに由来するカプシドタンパク質から選択した場合、得られる二量体は異なる２つのカプシドタンパク質より構成される。従って、そのような二量体が集合して形成されるウイルス様粒子は、異なる遺伝子群、遺伝子型、又は血清型のウイルスの、２価抗原を有するものとなる。
上記の説明から、本発明の二量体は、第１及び第２のカプシドタンパク質を等しい割合（１：１）で含むことが理解できる。そして、当該二量体が集合することによって形成される本発明のウイルス様粒子も、第１及び第２のカプシドタンパク質を等しい割合（１：１）で含むことが理解でき、更に、当該二量体を単位とする規則的又は均一な構造を有し得る。このような事項は、カプシドタンパク質の単量体を混合し、自発的な集合によってウイルス様粒子を形成させる、従来の技術では達成が困難となり得る。従来技術のＶＬＰは、カプシドタンパク質の割合が異なるＶＬＰの混合物となり、均一な構造を有さないことがあり得る。
本発明のウイルス粒子及び二量体を構成する第１及び第２のカプシドタンパク質について、これらのタンパク質がノロウイルスに由来する場合を例にして、より具体的に説明する。他のウイルスに由来するカプシドタンパク質に対しても、本発明が適用できることは理解されるべきである。
ノロウイルスには、１０の遺伝子群（ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶ、ＧＶＩ、ＧＶＩＩ、ＧＶＩＩＩ、ＩＸ、ＧＸ）が存在することが知られている。ＧＩ、ＧＩＩ、ＧＩＶ、ＧＶＩＩＩ、及びＧＩＸに属するノロウイルスはヒトに感染し、ＧＩＩＩに属するノロウイルスはウシに感染し、ＧＶに属するノロウイルスはマウスに感染し、ＧＶＩに属するノロウイルスはネコに感染し、ＧＶＩＩに属するノロウイルスはイヌに感染し、ＧＸに属するノロウイルスはコウモリに感染することが知られている。各遺伝子群には、ノロウイルスの遺伝子配列に基づいて分類又はクラスタリングされた、遺伝子型が存在する。例えば、ＧＩ及びＧＩＩに関していえば、様々な遺伝子型が存在することが知られている。現時点では、ＧＩは９つの遺伝子型（ＧＩ．１～９）、そしてＧＩＩは２７の遺伝子型（ＧＩＩ．１～２７）が存在する。限定されるものではないが、ノロウイルスには、例えば、Ｎｏｒｗａｌｋ（Ｍ８７６１１）、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ（Ｌ０７４１８）、ＤｅｓｅｒｔＳｈｉｅｌｄ３９５（Ｕ０４４６９）、Ｃｈｉｂａ４０７（ＡＢ０４２８０８）、Ｍｕｓｇｒｏｖｅ（ＡＪ２７７６０９）、ＢＳ５（Ｈｅｓｓｅ）（ＡＦ０９３７９７）、Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ（ＡＪ２７７６０９）、Ｂｏｘｅｒ（ＡＦ５３８６７９）、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ７３０（ＨＱ６３７２６７）、Ｈａｗａｉｉ（Ｕ０７６１１）、Ｍｅｌｋｓｈａｍ（Ｘ８１８７９）、ＳｎｏｗＭｏｕｎｔａｉｎ（ＡＹ１３４７４８）、Ｉｂａｒａｋｉ１９７（ＬＣ２１３８８５）、ＭＫ０４（ＤＱ４５６８２４）、Ｈｕｂｅｉ０２７（ＭＨ０６８８１１）、ＨｕｚｈｏｕＮＳ１７１１６（ＭＧ７６３３６８）、２１８００１（ＭＫ６１４１５４）、ＴＶ２４（Ｕ０２０３０）、ＮＳ１７－Ａ８６３（ＭＧ８９２９４７）、ＮＳ１７－Ａ９２８（ＭＧ８９２９５０）、ＮＳ１７－Ａ１３３５（ＭＧ８９２９５６）、Ｂｒｉｓｔｏｌ（Ｘ７６７１６）、Ｈｉｌｌｉｎｇｄｏｎ（ＡＪ２７７６０７）、Ｓｅａｃｒｏｆｔ（ＡＪ２７７６２０）、ＤｉｎｇＨａｉ３０（ＭＨ０６８８１１）、ＧＺ２０１０－Ｌ９６（ＪＸ９８９０７５）、ＮＯＲＯ＿１７３（ＭＨ２１８６４２）、ＰＡ２２６（ＭＨ１１４０１４）、１５－ＢＡ１１（ＭＨ２７９８３８）、０１６Ｑ０１（ＫＹ４０７２１３）、Ｌｅｅｄｓ（ＡＪ２７７６０８）、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（ＡＦ１９５８４８）、ＶＡ９７２０７（ＡＹ０３８５９９）、Ｅｒｆｕｒｔ５４６（ＡＦ４２７１１８）、Ｓｗ９１８（ＡＢ０７４８９３）、Ｗｏｒｔｌｅｙ（ＡＪ２７７６１８）、Ｍ７（ＡＹ１３０７６１）、Ｔｉｆｆｉｎ（ＡＹ５０２０１０）、ＣＳ－Ｅ１（ＡＹ５０２００９）、Ｋａｗａｓａｋｉ３０８（ＬＣ０３７４１５）、ＯＨ－ＱＷ１０１（ＡＹ８２３３０４）、ＯＨ－ＱＷ１７０（ＡＹ８２３３０６）、Ｌｕｃｋｅｎｗａｌｄｅ５９１（ＥＵ３７３８１５）、ＩＦ１９９８（ＡＹ６７５５５４）、Ｙｕｒｉ（ＡＢ０８３７８０）、Ｌｏｒｅｔｏ１８４７（ＫＴ２９０８８９）、Ｌｏｒｅｔｏ１９７２（ＫＹ２２５９８９）、Ｂｅｉｊｉｎ５３９３１（ＧＱ８５６４６９）、Ｌｅｏｎ４５０９（ＫＵ３０６７３８）、Ｌｏｒｅｔｏ０９５９（ＭＧ４９５０７７）、Ｌｏｒｅｔｏ１２５７（ＭＧ４９５０７９）、ＰＮＶ０６９２９（ＭＧ７０６４４８）、ＣＨＤＣ５１９１（ＡＣＴ７６１３９）、Ｃａｍｂｅｒｗｅｌｌ（ＡＦ１４５８９６）、Ｌｏｒｄｓｄａｌｅ（Ｘ８６５５７）、Ｇｒｉｍｓｂｙ（ＡＪ００４８６４）、Ｍｉａｍｉ Ｂｅａｃｈ（ＡＦ４１４４２４）、Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ Ｈｉｌｌｓ（ＡＹ５０２０２３）、Ｈｏｕｓｔｏｎ（ＥＵ３１０９２７）、Ｃｈｉｂａ０４－１０５０（ＡＢ２２０９２１）、Ｈｕｎｔｅｒ５０４Ｄ（ＤＱ０７８８１４）、ＤｅｎＨａａｇ８９（ＥＦ１２６９６5）、Ｓａｇａ１（ＡＢ４４７４５６）、Ａｏｍｏｒｉ２（ＡＢ４４７４３３） 、Ｙｅｒｓｅｋｅ３８（ＥＦ１２６９６３）、Ａｐｅｌｄｏｏｒｎ３１７（ＡＢ４４５３９５）、Ｏｓａｋａ１（ＡＢ５４１３１９）、ＯＣ０７１３８（ＡＢ４３４７７０）、ＮｅｗＯｒｌｅｎｓ１８０５（ＧＵ４４５３２５）、Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４（ＪＸ４５９９０８）、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７（ＭＫ７５４４４６）、及びＣＵＨＫ－ＮＳ－２２００（ＭＮ４００３５５）等（括弧内はゲノムアクセッション番号）が含まれる。
本発明において、第１及び第２のカプシドタンパク質は、それぞれ、いずれのノロウイルスに由来するものから選択し、任意に組み合わせることができる。これに限定されないが、例えば、第１及び第２のカプシドタンパク質は、ノロウイルスＧＩ及びＧＩＩに由来するカプシドタンパク質から選択することができる。より詳細には、第１及び第２のカプシドタンパク質は、いずれも、ノロウイルスＧＩ又はＧＩＩに由来するカプシドタンパク質から選択することができる。或いは、第１及び第２のカプシドタンパク質のいずれか一方をノロウイルスＧＩに由来するカプシドタンパク質から選択し、他方をノロウイルスＧＩＩに由来するカプシドタンパク質から選択することができる。ここで、ノロウイルスＧＩはＧＩ．１～９のいずれであってもよく、そしてノロウイルスＧＩＩはＧＩＩ．１～２７のいずれであってもよい。更なる例として、ノロウイルスＧＩＩ．４に由来するカプシドタンパク質を第１のカプシドタンパク質として選択し、そしてノロウイルスＧＩＩ．１７に由来するカプシドタンパク質を第２のカプシドタンパク質として選択することができる。そして、ノロウイルスＧＩＩ．４又はＧＩＩ．１７に由来するカプシドタンパク質を第１及び第２のカプシドタンパク質として選択することができる。もちろん、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質を入れ替えることも可能である。ノロウイルス由来のカプシドタンパク質は、遺伝子群、遺伝子型、又は株間で、立体構造が類似し得るため、上記に例示した第１及び第２のカプシドタンパク質の組み合わせに限らず、任意の組み合わせが採用し得る。ここで、カプシドタンパク質は、ＶＰ１カプシドタンパク質を含むことができる。或いは、カプシドタンパク質は、ＶＰ１カプシドタンパク質からなることができる。ノロウイルスのＡｏｍｏｒｉ２とＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のＶＰ１カプシドタンパク質がリンカー（繰り返し単位４～６）で連結されたポリペプチド（配列番号１０～１２）は、本発明のカプシドタンパク質の二量体及び本発明のウイルス様粒子の構成要素の具体例である。
＜ポリヌクレオチド、発現ベクター、宿主細胞＞
本発明は、上記したカプシドタンパク質の二量体をコードするポリヌクレオチドを提供する。アミノ酸残基と遺伝子コドンの対応関係は既に確立されているため、当該二量体のアミノ酸配列と対応するポリヌクレオチド配列を相互に変換することは容易である。当該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれであってもよいが、取り扱いや保存の側面から見れば、ＤＮＡが便利である。
本発明は、上記したカプシドタンパク質の二量体をコードするポリヌクレオチドを提供する。アミノ酸残基と遺伝子コドンの対応関係は既に確立されているため、当該二量体のアミノ酸配列と対応するポリヌクレオチド配列を相互に変換することは容易である。当該ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ及びＤＮＡのいずれであってもよいが、取り扱いや保存の側面から見れば、ＤＮＡが便利である。
本発明のカプシドタンパク質の二量体をコードするポリヌクレオチドは、生物学的な手法によって得ることができる。例えば、ウイルスのカプシドタンパク質をコードするＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、当該ｃＤＮＡを鋳型として遺伝子増幅反応（逆転写ＰＣＲ）を行うことによって、第１及び第２のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ増幅させることができる。ＰＣＲのためのプライマーは、第１又は第２のカプシドタンパク質をコードする核酸配列を含む領域が増幅されるように設計する。即ち、第１又は第２のカプシドタンパク質をコードする核酸配列の上流及び／又は下流に存在する核酸配列にアニールするプライマーを設計すればよい。
そして、ウイルスのカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドの配列情報は、公開された情報源から取得することもできる。例えば、そのような情報源としては、インターネット等で公開されているデータベース（限定されないが、ＧｅｎＢａｎｋ、ＥＭＢＬ、ＤＤＢＪ（日本ＤＮＡデータベース）など）が挙げられる。
或いは、本発明のカプシドタンパク質の二量体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成することによって得てもよい。ポリヌクレオチドの合成は、インハウスで行うことが可能であり、また外部機関に委託することも可能である。ポリヌクレオチドは、公知のいずれの方法で合成してもよい。例えば、固相合成法がよく知られている。当業者は、ポリヌクレオチドの合成に関し、方法及びその条件を熟知している。
上記のような方法によって取得した、第１のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド及び第２のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドから、適切な発現系を用いることによって、第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質を製造することができる。
ここで、第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質を、それぞれ別々の発現系で製造する場合、得られた第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質を、上記で説明したように、化学的にリンカーで連結することによって、本発明の二量体を得ることができる。
或いは、リンカーとして、ペプチドリンカーを用いる場合、第１のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと第２のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、当該ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドを介して連結したポリヌクレオチドを調製することができる。ペプチドリンカーとして、上記で説明するようなものが利用できる。ペプチドリンカーの一例は、ＧＳリンカー、（Ｇ４Ｓ）ｎ又は（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカー（ここで、ｎは上記で定義したとおりである）である。このようなポリヌクレオチドを用いると、生産物として、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質がリンカーで連結された二量体を得ることができる。このような手法によれば、第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質を、別々に製造した後に、これらを化学的にリンカーで連結する必要がない。
上記のポリヌクレオチドは、その取得又は利用に関するいずれの時期において、必要に応じて抽出及び／又は精製の操作に付することができる。当業者は、ポリヌクレオチドの抽出及び／又は精製に関し、公知の方法を適宜選択することができる。
配列番号７～９のポリヌクレオチドは、ノロウイルスのＡｏｍｏｒｉ２とＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のＶＰ１カプシドタンパク質がリンカー（繰り返し単位４～６）で連結されたポリペプチドをコードするものであり、本発明のカプシドタンパク質の二量体をコードするポリヌクレオチドの具体例である。
本発明のカプシドタンパク質の二量体をコードするポリヌクレオチドは、発現ベクターに組み込むことができる。従って、本発明は、そのような発現ベクターも提供する。発現ベクターとしては、例えば大腸菌発現用のｐＥＴ、酵母発現用のｐＡＵＲ、昆虫細胞発現用のｐＩＥｘ－１、動物細胞発現用のｐＢＡｐｏ－ＣＭＶが挙げられるが、その他の公知のものも利用可能である。なお、ポリヌクレオチドの発現ベクターへの組み込みは公知の方法によって行うことができる。
本発明の発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入することができる。従って、本発明は、当該発現ベクターが導入された宿主細胞を提供する。宿主細胞は、本発明のカプシドタンパク質の二量体が生産できるものであれば特に制限されない。例えば、昆虫由来（例えば、Ｓｆ９、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞など）、大腸菌、酵母（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・ポンベ、ピキア・パストリなど）、哺乳類細胞（ＣＨＯ、ＨＥＫなど）、及びその他任意の細胞を宿主細胞とすることができる。本発明の宿主細胞を培養することによって、本発明のカプシドタンパク質の二量体が生産され、当該二量体が集合して本発明のウイルス様粒子が形成される。なお、発現ベクターの宿主細胞への導入、宿主細胞の培養、及び生産物の抽出、濃縮、若しくは精製のための方法は公知である。本発明においてもこのような公知の方法が適用できる。
＜医薬組成物＞
本発明は、上記した本発明のウイルス様粒子又はカプシドタンパク質の二量体を含んでなる医薬組成物を提供する。
本発明は、上記した本発明のウイルス様粒子又はカプシドタンパク質の二量体を含んでなる医薬組成物を提供する。
本発明の医薬組成物は、発明の効果が奏される限り、任意の追加の成分を含んでいてもよい。追加の成分は、公知のものを適宜選択することができる。例えば、賦形剤、希釈剤、ｐＨ調整剤、保存剤、担体、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、防腐剤、浸透剤、免役調整剤、及びアジュバント等が挙げられる。
本発明の医薬組成物は、経口用及び非経口用のいずれであってもよく、そして、意図する投与経路を適宜選択することができる。本発明の医薬組成物は、静脈、動脈、筋肉、腹膜、鼻腔、経皮、皮内、皮下、頬側、舌下、直腸、口腔、眼、膣、肺、及び経口など、任意の経路で投与することができる。
本発明の医薬組成物の形状は、限定されないが、例えば、錠剤、カプセル、丸薬、シロップ、エリキシル剤、エマルジョン、エアロゾル、水性又は非水性の注射溶液、或いは、注射溶液用の粉末、顆粒、又は錠剤（水性又は非水性のような液体賦形剤を添加し、注射溶液を調製するものであってもよい）にすることができる。
本発明の医薬組成物は、ウイルス感染症、ウイルスにより誘導された疾患、又は当該感染症及び／又は疾患に関連する少なくとも１つの症状を、処置（予防、治療、軽減、又は改善）し得る。ここでいうウイルスについては、上記の説明が当てはまる。そして、これらの感染症、疾患、又は症状は、例えば、急性胃腸炎、及び関連する症状（悪心、下痢、軟便、嘔吐、吐き気、発熱、倦怠感、疲労、胃痙攣、悪寒、筋肉痛、頭痛、の少なくとも１つ）が挙げられる。但し、ここで挙げたものに限定されない場合があることは理解されるべきである。上記の予防、治療、軽減、又は改善は、感染因子を中和する、感染因子の細胞への侵入を阻害する、感染因子の複製を阻害する、宿主細胞を感染又は破壊から防御する、又は抗体産生を刺激することによって達成されてもよいが、これに限定されない。
本発明の医薬組成物は、ウイルス感染症、ウイルスにより誘導された疾患、又は当該感染症及び／又は疾患に関連する少なくとも１つの症状を、予防、治療、軽減、又は改善するために有効な量で、対象に投与することができる。当該対象は、ウイルスに感染し得る対象であればよく、例えば、哺乳類（ヒト、ブタ、ウシ、げっ歯類、イヌ、ネコ等）であり得る。当該有効な量は、組成物を適用する対象、投与経路、投与形態などを考慮して、適宜設定可能である。
また、本発明の医薬組成物は、ウイルスに対する防御免疫を誘導し、これによって、ウイルス感染症、ウイルスにより誘導された疾患、又は当該感染症及び／又は疾患に関連する少なくとも１つの症状を、予防、治療、軽減、又は改善するために用いることが可能である。ここで、ウイルスに対する「防御免疫」の誘導とは、感染因子（ウイルス、それ由来の物質、又はそれにより生産される物質）に対する免疫又は免疫応答を誘発することを意味する。防御免疫応答は、体液性免疫応答と細胞媒介性免疫応答のいずれに起因するものであってもよい。ウイルスに対する防御免疫が誘導されると、当該誘導がされる前に比べて、対象においてウイルスに対する抗体価が高くなり得る。抗体価の測定は、公知の方法により行うことができる。従って、本発明の医薬組成物は、ワクチン用組成物とすることが可能である。
本発明の医薬組成物は、例えば、ノロウイルスが関与する感染症、疾患、症状の処置に利用し得る。ノロウイルスについては上記で説明した通りである。本発明の医薬組成物が標的とするノロウイルスは制限されず、いずれの遺伝子群又は遺伝子型に属するものであってもよい。但し、本発明の医薬組成物に含まれる、ウイルス様粒子又は二量体を構成するカプシドタンパク質の由来によって、標的になるノロウイルスが定まることは理解されるべきである。限定されないが、例えば、医薬組成物に含まれる、ウイルス様粒子又はカプシドタンパク質の二量体が：
・ノロウイルスＧＩに由来するカプシドタンパク質を含む場合には、医薬組成物の標的は少なくともノロウイルスＧＩになり、
・ノロウイルスＧＩＩに由来するカプシドタンパク質を含む場合には、医薬組成物の標的は少なくともノロウイルスＧＩＩになり、
・ノロウイルスＧＩ及びＧＩＩに由来するカプシドタンパク質を含む場合には、医薬組成物の標的は少なくともノロウイルスＧＩ及びＧＩＩになる。
・ノロウイルスＧＩに由来するカプシドタンパク質を含む場合には、医薬組成物の標的は少なくともノロウイルスＧＩになり、
・ノロウイルスＧＩＩに由来するカプシドタンパク質を含む場合には、医薬組成物の標的は少なくともノロウイルスＧＩＩになり、
・ノロウイルスＧＩ及びＧＩＩに由来するカプシドタンパク質を含む場合には、医薬組成物の標的は少なくともノロウイルスＧＩ及びＧＩＩになる。
本発明のウイルス様粒子及び本発明のカプシドタンパク質の二量体は、上記で説明したように、第１及び第２のカプシドタンパク質を等しい割合（１：１）で含む、規則的又は均一な構造を有し得る。この特性は、医薬組成物の品質管理の側面で有益であり得る。そして、本発明のウイルス様粒子又は本発明のカプシドタンパク質の二量体が２価又は多価の抗原性を有する場合、多価の抗原性を有する医薬組成物を効率的に製造する上で有益になり得る。また、タンパク質としての添加量を低減できることにおいても有益であり得る。
以下の実施例により、発明をより詳細に説明する。当該実施例は、発明をより理解する目的で提供されたものであり、発明の範囲を限定することを意図するものではない。
［実施例１］組み換えバキュロウイルスの調製
下記のノロウイルス株に由来するＶＰ１遺伝子を用いた：
（１）Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ Ｈｕ／ＧＩＩ－４／Ａｏｍｏｒｉ２／２００６／ＪＰ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢ４４７４３３）（以下、”Ａｏｍｏｒｉ２”とする）に由来するＶＰ１遺伝子（配列番号２）。
（２）Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩＩ ｉｓｏｌａｔｅ Ｈｕ／ＵＳ／２０１８／ＧＩＩ．Ｐ１６－ＧＩＩ．４ Ｓｙｄｎｅｙ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＭＫ７５４４４６）（以下、”Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７”とする）に由来するＶＰ１遺伝子（配列番号３）。
下記のノロウイルス株に由来するＶＰ１遺伝子を用いた：
（１）Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ Ｈｕ／ＧＩＩ－４／Ａｏｍｏｒｉ２／２００６／ＪＰ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＡＢ４４７４３３）（以下、”Ａｏｍｏｒｉ２”とする）に由来するＶＰ１遺伝子（配列番号２）。
（２）Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ ＧＩＩ ｉｓｏｌａｔｅ Ｈｕ／ＵＳ／２０１８／ＧＩＩ．Ｐ１６－ＧＩＩ．４ Ｓｙｄｎｅｙ／Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＭＫ７５４４４６）（以下、”Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７”とする）に由来するＶＰ１遺伝子（配列番号３）。
リンカーとしてＧ４Ｓリンカーを使用し、繰り返し単位を４（（Ｇ４Ｓ）４）、５（（Ｇ４Ｓ）５）及び６（（Ｇ４Ｓ）６）とした。（Ｇ４Ｓ）４をコードする遺伝子（配列番号４）、（Ｇ４Ｓ）５をコードする遺伝子（配列番号５）及び（Ｇ４Ｓ）６をコードする遺伝子（配列番号６）を取得した。
異なる２つのＶＰ１遺伝子をリンカーで連結させたＤＮＡを遺伝子合成により取得した。２つのＶＰ１遺伝子を、（Ｇ４Ｓ）４リンカーをコードする遺伝子で連結させたＤＮＡ（配列番号７）、（Ｇ４Ｓ）５リンカーをコードする遺伝子で連結させたＤＮＡ（配列番号８）、及び（Ｇ４Ｓ）６リンカーをコードする遺伝子で連結させたＤＮＡ（配列番号９）を取得した。
これらのＤＮＡを、それぞれ、トランスファーベクター（ｐＦａｓｔＢａｃＴＭ １ ｖｅｃｔｏｒ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１０３６００１４）へ組み込んだ。次に、このトランスファーベクターを、バキュロウイルスゲノムＤＮＡを保持する大腸菌（ＭＡＸ ＥｆｆｉｃｉｅｎｃｙＴＭ ＤＨ１０Ｂａｃ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１０３６１０１２）に導入し、相同性組換えにより、目的ＤＮＡをバキュロウイルスゲノムＤＮＡに組み込んだ。大腸菌より、バキュロウイルスゲノムＤＮＡを抽出・精製（ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ，ＱＩＡＧＥＮ，Ｃａｔ．Ｎｏ．２７１０６）し、Ｓｆ９細胞に導入（ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ ＬＴＸ Ｒｅａｇｅｎｔ ｗｉｔｈ ＰＬＵＳＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１５３３８１００）した。Ｓｆ９細胞を２６～２８℃で７日間培養した後、培養上清から組換えバキュロウイルスを回収し、－８０℃で保存した。
［実施例２］リンカー連結型ＶＬＰの調製
実施例１で調製した組み換えバキュロウイルスを、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞に適切なＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：感染多重度）で接種した。Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞を２６～２８℃で培養し、リンカー連結型ＶＬＰを産生させた。感染後４～７日後に培養液を回収し、１０，０００×ｇで６０分間遠心分離し、培養上清と細胞ペレットに分けた。細胞ペレットを超音波破砕装置を用いて破砕し、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。培養上清と細胞ペレット破砕後の上清を、塩化セシウムを用いる密度勾配遠心分離に供し、リンカー連結型ＶＬＰを得た。
実施例１で調製した組み換えバキュロウイルスを、Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞に適切なＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：感染多重度）で接種した。Ｈｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞を２６～２８℃で培養し、リンカー連結型ＶＬＰを産生させた。感染後４～７日後に培養液を回収し、１０，０００×ｇで６０分間遠心分離し、培養上清と細胞ペレットに分けた。細胞ペレットを超音波破砕装置を用いて破砕し、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。培養上清と細胞ペレット破砕後の上清を、塩化セシウムを用いる密度勾配遠心分離に供し、リンカー連結型ＶＬＰを得た。
［実施例３］ＶＬＰの特徴付け
リンカー連結型ＶＬＰの構成要素である、リンカーで連結されたＶＰ１タンパク質の２量体が発現されていることを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を用いて確認した。
リンカー連結型ＶＬＰの構成要素である、リンカーで連結されたＶＰ１タンパク質の２量体が発現されていることを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ）を用いて確認した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析は次のように行った。実施例２で調製したサンプル２７μｌとサンプルバッファー（４×Ｌａｅｍｍｌｉ Ｓａｍｐｌｅ Ｂｕｆｆｅｒ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．＃１６１－０７４７）９μｌ（ＤＴＴ含む）を混合し、９５℃で５分間加熱した。加熱後の溶液１２μｌをＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルの１レーンにアプライし、２００Ｖで３０分間電気泳動した。泳動後のゲルを、クマシーで染色（Ｂｉｏ－Ｓａｆｅ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｓｔａｉｎ，Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．＃１６１０７８７）した後、Ｄ．Ｗ．で２０分×３回脱色した。
ウエスタンブロッティング分析は次のように行った。転写装置を使用して、上記ＳＤＳ－ＰＡＧＥ後のゲル上のタンパク質をＰＶＤＦ膜へ転写した（２００Ｖ、３０分間）。ブロッキングバッファーにより浸水化処理を行った後、１０，０００倍に希釈したＧＩＩ．４遺伝子型検出用抗体（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ Ｈｕ／ＧＩＩ．４／Ｓｙｄｎｅｙ／ＮＳＷ０５１４／２０１２／ＡＵ（ＪＸ４５９９０８）の抗ＶＬＰ抗体）を使用して、ＧＩＩ．４遺伝子型のＶＰ１を検出した。
各ゲル画像はゲル撮影装置を用いて取得した。その後、分析法パネルにより、得られた結果のバンドの濃さを定量化し、ＶＬＰの純度を算出した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥの分析結果を図２に示す。実施例１で調製した組み換えバキュロウイルスを用いて得られたサンプルでは、１２０ｋＤａ付近にバンドが検出された（図２中、”Ａｏｍｏｒｉ２－Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７”のレーン）。比較対照のサンプル（図２中、”Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７”のレーン）では、１２０ｋＤａ付近にバンドは検出されなかった。ＶＰ１単量体タンパク質に相当すると思われるバンドが６０ｋＤａ付近で検出されたことから、当該１２０ｋＤａのバンドは、２つのＶＰ１（Ａｏｍｏｒｉ２由来のＶＰ１、及びＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７由来のＶＰ１）がリンカーで連結されたタンパク質であることが示唆された。また、いずれの長さのリンカーを用いた場合においても、１２０ｋＤａ付近のバンドが確認された。
ウエスタンブロッティングの分析結果を図３に示す。６０ｋＤａ付近で検出されたバンドは、ＶＰ１単量体に相当することが確認された。ＶＰ１がＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７及びＡｏｍｏｒｉ２のいずれに由来する場合であっても、同じ位置でバンドが検出された。１２０ｋＤａ付近で検出されたバンドは、２つのＶＰ１がリンカーで連結されたタンパク質であることが確認された（図３中、”Ａｏｍｏｒｉ２－Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７”のレーン）。比較対照のサンプル（図３中、”Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７”のレーン）では、１２０ｋＤａ付近にバンドは検出されなかった。また、いずれの長さのリンカーを用いた場合においても、２つのＶＰ１がリンカーで連結されたタンパク質の発現が確認されたことから、当該連結タンパク質の発現はリンカーの長さに依存しないことが分かった。
［実施例４］透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）による解析
実施例２で調製されたサンプル中のリンカーで連結されたＶＰ１二量体タンパク質の構造的特徴を、ＴＥＭを用いて分析した。
実施例２で調製されたサンプル中のリンカーで連結されたＶＰ１二量体タンパク質の構造的特徴を、ＴＥＭを用いて分析した。
ＴＥＭ分析は次のように行った。サンプルを希釈した後、銅メッシュ上に滴下し、リンタングステン酸染色液で着色し、電子顕微鏡で観察した。
代表例として、（Ｇ４Ｓ）５リンカーで連結されたＶＰ１二量体タンパク質の解析結果を示す（図４）。この図から、リンカーで連結されたＶＰ１二量体は、粒子（ＶＬＰ）を形成していることが確認できた。この結果から、当該ＶＬＰは、２つのノロウイルス株（Ａｏｍｏｒｉ２及びＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７）に対する多価抗原性を有するキメラＶＬＰであることが示唆された。他のリンカーを用いた場合にも同様に、リンカーで連結された２つのＶＰ１二量体タンパク質はＶＬＰを形成すると推察される。
［実施例５］サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による分析
実施例２で調製されたサンプル中のリンカーで連結されたＶＰ１二量体タンパク質の構造的特徴の分析を、ＳＥＣを用いて行った。
実施例２で調製されたサンプル中のリンカーで連結されたＶＰ１二量体タンパク質の構造的特徴の分析を、ＳＥＣを用いて行った。
ＳＥＣの条件は次の通りである。精製したリンカーで連結されたＶＰ１二量体タンパク質のサンプル５０μｌをインジェクションした。流速を０．８ｍｌ／ｍｉｎとし、カラムはＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．０００８０２４）を用いた。サンプルの希釈及び移動相として、リン酸緩衝液（ｐＨ＝７．４）を用いた。
ＳＥＣ分析によっても、リンカーで連結されたＶＰ１二量体タンパク質は、粒子を形成していることが確認できた。
［実施例６］リンカー連結型ＶＬＰの再調製及び特性解析
実施例１で調製した組み換えバキュロウイルスを、２６～２８℃で培養したＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞に適切なＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：感染多重度）で接種した。接種４～７日後に培養液を回収して、１０，０００×ｇで２０分間 遠心分離し、細胞ペレットを回収した。細胞ペレットを、超音波破砕装置を用いて破砕し、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清をスクロースクッション法（ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｕｓｈｉｏｎ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）（４０ｗ／ｗ％スクロース溶液）に供し、低分子量の不純物が除去されたリンカー連結型ＶＬＰを含むペレットを回収した。このペレットをＰＢＳで懸濁し、塩化セシウム密度勾配遠心分離に供し、精製リンカー連結型ＶＬＰを得た。
実施例１で調製した組み換えバキュロウイルスを、２６～２８℃で培養したＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ細胞に適切なＭＯＩ（Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：感染多重度）で接種した。接種４～７日後に培養液を回収して、１０，０００×ｇで２０分間 遠心分離し、細胞ペレットを回収した。細胞ペレットを、超音波破砕装置を用いて破砕し、１５，０００×ｇで１０分間遠心分離し、上清を回収した。回収した上清をスクロースクッション法（ｓｕｃｒｏｓｅ ｃｕｓｈｉｏｎ ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）（４０ｗ／ｗ％スクロース溶液）に供し、低分子量の不純物が除去されたリンカー連結型ＶＬＰを含むペレットを回収した。このペレットをＰＢＳで懸濁し、塩化セシウム密度勾配遠心分離に供し、精製リンカー連結型ＶＬＰを得た。
得られたリンカー連結型ＶＬＰの特性解析として、実施例３と同様の方法でＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティング、実施例４と同様の方法で電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により粒子形成確認を行った。さらに、多角度光散乱法（ＭＡＬＳ）により粒子径の評価を行った。
ＳＥＣは、サンプル２０μｌをインジェクションすること以外は、実施例５の条件に従った。ＳＥＣにより分離され、検出されたピークのフラクションをＭＡＬＳに供し、ｄｎ／ｄｃ＝０．１８５で粒子径を測定した。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥの分析結果を図５に示す。今回新たに調製したリンカー連結型ＶＬＰは、約１２０ｋＤａ付近に単一バンドが検出された（図５、”Ａｏｍｏｒｉ２－Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７（Ｇ４Ｓ）５”のレーン）。一方、比較対照のサンプル（図５、”Ａｏｍｏｒｉ２”のレーン）では、約１２０ｋＤａ付近にバンドは検出されず、ＶＰ１単量体タンパク質に相当すると思われるバンドが約６０ｋＤａ付近で検出された。そして、ウエスタンブロッティングの結果（図６）より、リンカー連結型ＶＬＰの１２０ｋＤａ付近のバンドは、ＧＩＩ．４のＶＰ１に特異的な抗体によって検出された。従って、このバンドが、２種類のＶＰ１（Ａｏｍｏｒｉ２及びＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７由来のＶＰ１）がＧ４Ｓリンカーで連結された目的のタンパク質に相当すると考えられた。これらの結果より、リンカー連結型ＶＬＰの調製は再現可能なことが確認された。
また、本実施例で調製したリンカー連結型ＶＬＰは、実施例２で調製したものに比べて、純度が高かった。これは、本実施例においては、精製操作中に、スクロースクッション法による処理を追加したことが一因と考えられた。
本実施例で調製したリンカー連結型ＶＬＰの構造を、ＴＥＭを用いて分析した。得られた電子顕微鏡観察像（図７）から、実施例４と同様、当該リンカー連結型ＶＬＰは、粒子を形成していることが確認された。そして、ＳＥＣによる解析を行ったところ、リンカー連結型ＶＬＰの保持時間（図８）と、比較対照サンプル（図９：Ａｏｍｏｒｉ２のＶＬＰ）の保持時間はほとんど同じであった。また、ＭＡＬＳで測定した回転半径（ｒｗ）は、リンカー連結型ＶＬＰが３２．９ｎｍ、比較対照のサンプル（Ａｏｍｏｒｉ２のＶＬＰ）が２３．６ｎｍであった。これらのことから、リンカー連結型ＶＬＰは、単独のＶＰ１から形成されるＶＬＰと、概ね同じ大きさの粒子径を有することが確認された。
［実施例７］リンカー連結型ＶＬＰの抗原性の確認
リンカー連結型ＶＬＰの抗原性を、ブタ胃ムチン（ＰＧＭ）を使用した、レセプター結合阻害試験を用いて評価した。Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１９；１１（５）：３９２を参考にして、以下のように試験を行った。
リンカー連結型ＶＬＰの抗原性を、ブタ胃ムチン（ＰＧＭ）を使用した、レセプター結合阻害試験を用いて評価した。Ｈａｙｎｅｓ，Ｊ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１９；１１（５）：３９２を参考にして、以下のように試験を行った。
市販品のＰＧＭ（カタログＮｏ．Ｍ１７７８、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて調製したＰＧＭ溶液（１．０μｇ/ｍＬ、ＰＢＳ）を、ウェルプレートの各ウェルに１００μｌずつ添加し、２５℃で２時間静置した。その後、液を取り除き、Ｗａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を３００μｌ添加し、各ウェルを洗浄した（この洗浄操作を３回繰り返した）。５％スキムミルク－ＰＢＳ溶液を各ウェルに２００μｌずつ添加し、４℃で一晩静置した。
３種類のＶＬＰ（Ａｏｍｏｒｉ２のＶＬＰ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のＶＬＰ、及びＡｏｍｏｒｉ２－Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のリンカー連結型ＶＬＰ（いずれも実施例２の方法に準じて調製））を含有する溶液（０．０２５μｇ／ｍｌ）それぞれの２００μｌを、４０倍から２０４８０倍まで連続して２倍ずつ段階的に希釈したマウス免疫血清溶液２００μｌと混合し、２５℃で一時間静置した。この混合液を、ＶＬＰ－マウス免疫血清混合液とした。なお、マウス免疫血清は、各ＶＬＰ（Ａｏｍｏｒｉ２のＶＬＰ及びＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のＶＬＰ）をマウス４個体に１００μｇ／ｈｅａｄで２回投与した後に採取した血液より調製した（各ＶＬＰについて４ロット）。
４℃で一晩静置したウェルプレートの各ウェルをＷａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄（３回）した後、ＶＬＰ－マウス免疫血清混合液の１００μｌを各ウェルに添加し、２５℃で一時間静置した。その後、プレートをＷａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄（３回）し、一次抗体溶液（自社調製）（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳに溶解）の１００μｌを各ウェルに添加して、２５℃で一時間静置した。なお、一次抗体溶液は、各ＶＬＰ（Ａｏｍｏｒｉ２のＶＬＰ及びＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のＶＬＰ）をウサギに１ｍｇ／ｈｅａｄで２回投与した後に採取した血液より調製した。プレートをＷａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄（３回）し、二次抗体溶液（Ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ Ａｎｔｉｂｏｄｙ，ＨＲＰ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ（カタログ＃６５－６１２０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））（０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳに溶解）の１００μｌを各ウェルに加し、２５℃で一時間静置した。プレートをＷａｓｈｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで洗浄（３回）し、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）溶液の１００μｌを各ウェルに添加し、遮光して２５℃で３０分静置した。Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを１００μｌ添加して反応を停止させた。反応停止後の溶液の波長４５０ｎｍでの吸光度（ＯＤ）を測定した。
ＶＬＰと０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０及び５％スキムミルクを含むＰＢＳの混合液（マウス免疫血清を有さない）を添加したウェルの吸光度をＯＤ［血清無］、ＶＬＰ－マウス免疫血清混合液を添加しなかったウェルの吸光度をｂｌａｎｋ、そしてＶＬＰ－マウス免疫血清混合液を添加したウェルの吸光度をＯＤ［血清有］として、結合阻害活性を以下の式を用いて算出した。
結合阻害活性（％）＝１００－〔（ＯＤ［血清有］－ｂｌａｎｋ）／（ＯＤ［血清無］－ｂｌａｎｋ）〕×１００
結合阻害活性（％）＝１００－〔（ＯＤ［血清有］－ｂｌａｎｋ）／（ＯＤ［血清無］－ｂｌａｎｋ）〕×１００
レセプター結合阻害活性の有無は、ブロッキングタイター（Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｔｉｔｅｒ（ＢＴ））５０値に基づく。ＢＴ５０とは、結合阻害活性が５０％を上回る最大血清希釈倍率の値である。３種類のＶＬＰ（Ａｏｍｏｒｉ２のＶＬＰ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のＶＬＰ、及びＡｏｍｏｒｉ２－Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のリンカー連結型ＶＬＰ）それぞれについて得られたＢＴ５０値に対して、マン・ホイットニー順位和検定に基づく統計分析を行った。各ＶＬＰ間でＢＴ５０値を比較し、統計学的有意差を基準として、リンカー連結型ＶＬＰが２種類の抗原性を有するかを判断した。
レセプター結合阻害試験の結果を、図１０及び１１に示す。図１０は、Ａｏｍｏｒｉ２のＶＬＰに対するマウス免疫血清（４ロット）を使用した際の、各ＶＬＰ（Ａｏｍｏｒｉ２のＶＬＰ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のＶＬＰ、及びＡｏｍｏｒｉ２－Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のリンカー連結型ＶＬＰ）に対するレセプター結合阻害活性の結果を示す。図１１は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のＶＬＰに対するマウス免疫血清（４ロット）を使用した際の、各ＶＬＰに対するレセプター結合阻害活性の結果を示す。
図１０に示すように、Ａｏｍｏｒｉ２のＶＬＰに対するマウス免疫血清は、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のＶＬＰに対してレセプター結合阻害活性が有意に低い値となった。一方、当該マウス免疫血清は、Ａｏｍｏｒｉ２のＶＰ１を含んでいるリンカー連結型ＶＬＰに対して、Ａｏｍｏｒｉ２のＶＬＰと同程度のレセプター結合阻害活性を有することが確認された。
また、図１１に示すように、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のＶＬＰに対するマウス免疫血清は、Ａｏｍｏｒｉ２のＶＬＰに対しても僅かにレセプター結合阻害活性を示したが、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のＶＬＰやリンカー連結型ＶＬＰに比べると有意に低く、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ０２０７のＶＬＰとリンカー連結型ＶＬＰではレセプター結合阻害活性が同程度であった。
したがって、本発明に係るリンカー連結型ＶＬＰは、リンカーを介して連結した２つのノロウイルスＶＰ１より形成されたキメラＶＬＰであり、当該キメラＶＬＰは２種類のＶＰ１の抗原性を有する多価抗原性粒子であると考えられた。
Claims (22)
- 第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質の二量体の集合体を含み、
当該第１のカプシドタンパク質と当該第２のカプシドタンパク質は、リンカーにより連結されている、
ウイルス様粒子。 - リンカーはＧＳリンカーである、請求項１に記載のウイルス粒子。
- 第１のカプシドタンパク質のＣ末端と第２のカプシドタンパク質のＮ末端がＧＳリンカーを介して連結されている、請求項２に記載のウイルス様粒子。
- ＧＳリンカーが（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーであり、ここでｎは１以上の整数である、請求項２又は３に記載のウイルス様粒子。
- 第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質は同じ又は異なるウイルスに由来する、請求項１～４のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
- 第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質はカリシウイルス科のウイルスに由来する、請求項１～５のいずれか１項に記載のウイルス様粒子。
- 第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質がリンカーにより連結されている、カプシドタンパク質の二量体。
- リンカーはＧＳリンカーである、請求項７に記載のカプシドタンパク質の二量体。
- 第１のカプシドタンパク質のＣ末端と第２のカプシドタンパク質のＮ末端がＧＳリンカーを介して連結されている、請求項８に記載のカプシドタンパク質の二量体。
- ＧＳリンカーが（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーであり、ここでｎは１以上の整数である、請求項８又は９に記載のカプシドタンパク質の二量体。
- 第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質は同じ又は異なるウイルスに由来する、請求項７～１０のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質の二量体。
- 第１のカプシドタンパク質と第２のカプシドタンパク質はカリシウイルス科のウイルスに由来する、請求項７～１１のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質の二量体。
- 第１のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと第２のカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、リンカーをコードするポリヌクレオチドを介して連結された構造を含む、ポリヌクレオチド。
- リンカーはＧＳリンカーである、請求項１３に記載のポリヌクレオチド。
- ＧＳリンカーが（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーであり、ここでｎは１以上の整数である、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
- 第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質は同じ又は異なるウイルスに由来する、請求項１３～１５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 第１のカプシドタンパク質及び第２のカプシドタンパク質はカリシウイルス科のウイルスに由来する、請求項１３～１６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項１３～１７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項１８に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。
- 請求項１～６のいずれか１項に記載のウイルス様粒子又は請求項７～１２のいずれか１項に記載のカプシドタンパク質の二量体を含む医薬組成物。
- 防御免疫の誘導に用いられる、請求項２０に記載の医薬組成物。
- ワクチンである、請求項２０又は２１に記載の医薬組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022-043609 | 2022-03-18 | ||
| JP2022043609 | 2022-03-18 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2023/004126 WO2023176206A1 (ja) | 2022-03-18 | 2023-02-08 | リンカーにより連結されたカプシドタンパク質を含むウイルス様粒子 |
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|---|---|
| WO (1) | WO2023176206A1 (ja) |
Citations (4)
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2023
- 2023-02-08 WO PCT/JP2023/004126 patent/WO2023176206A1/ja unknown
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