CN108025059B - 抗猫过敏的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及组合物在降低猫过敏原性的方法中的用途。此外,本发明涉及组合物在降低猫对暴露于猫的人的过敏原性的方法中的用途。另外,本发明涉及包含病毒样颗粒(VLP)和至少一种Fel d1蛋白的组合物。本发明的组合物在猫中诱导有效的免疫应答,特别是抗体应答,并且可用于治疗和/或预防猫过敏。
Description
技术领域
本发明涉及组合物在降低猫对人的过敏原性的方法中的用途。此外,本发明涉及组合物在降低猫对暴露于猫的人的过敏原性的方法中的用途。此外,本发明涉及包含病毒样颗粒(VLP)和至少一种Fel d1 蛋白的组合物。本发明的组合物在猫中诱导有效的免疫应答、特别是抗体应答,从而降低由猫脱落的Fel dl的过敏原性,因此可用于治疗和/或预防人的猫过敏。
相关技术
家猫(Felis domesticus)是室内过敏原的重要来源(Lau,S.,et al. (2000)Lancet 356,1392-1397)。事实上,在西方国家约有25%的家庭中发现猫,并在很大一部分人群中发现对猫过敏。症状的严重性从相对轻微的鼻炎和结膜炎到可能危及生命的哮喘恶化而发生变化。虽然患者偶尔会对猫皮屑和毛皮中的几种不同分子敏感,但主要的过敏原是Fel d1。这个过敏原的重要性已经在许多研究中被强调。实际上,超过80%的猫过敏患者对这种强有力的过敏原显示出IgE抗体(van Ree,R.,et al.(1999)J.Allergy ClinImmunol 104,1223-1230)。
Fel d1是含有10-20%的N连接碳水化合物的35-39kDa酸性糖蛋白,并且在猫的毛皮即皮肤和毛中、唾液和泪腺中以及肛周腺中发现。它由两个非共价连接的异二聚体形成。每个异二聚体由一个70 残基的肽(称为“链1”)和一个78、85、90或92残基的肽(称为“链2”)组成,这些肽由分开的基因编码(参见Duffort,O.A.,et al.(1991) Mol Immunol 28,301-309;Morgenstern,J.P.,et al;(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88,9690-9694和Griffith,I.J.,et al.(1992)Gene 113,263-268)。
猫过敏患者的治疗目前通过脱敏治疗来实现,所述脱敏治疗包括反复注射增加剂量的粗制猫皮屑提取物或源自Fel d1的短肽。Lilja 等人和Hedlin等人已经公开了一种脱敏程序,在其过程中将粗制猫皮屑提取物给予猫过敏患者(Lilja,Q,et al.(1989)JAllergy Clin Immunol 83,37-44和Hedlin,et al.(1991)J Allergy Clin Immunol 87,955-964)。该程序至少需要两到三年,治疗三年后的患者仍然有全身症状。使用源自Fel d1的短肽进行脱敏的结果是肽组和安慰剂组之间没有显著性差异(Oldfield,W.L.,et al.(2002)Lancet 360,47-53)。只有在将大量(750μg)短肽给予患者时才能看到功效(Norman,P.S., et al.(1996)Am J Respir Crit Care Med 154,1623-1628)。
过敏的副作用(例如迟发性哮喘反应)已经在粗制猫皮屑提取物治疗和短肽治疗中报道。因此,由于注射过敏原引起的过敏性休克对于任何脱敏程序都是很大的安全问题。然而,通过减少过敏原的注射量来避免这种效应则或降低了治疗效果或延长了治疗。因此,在用于替代脱敏方案的猫过敏治疗领域并且因此特别是能够减少过敏症状但不引起过敏性副反应的脱敏方案中存在巨大需求。还已经描述了用与病毒样颗粒共价连接的Fel d1抗原对人进行主动免疫以解决人的猫过敏问题(WO2006/097530A2)。
替代地,已经提出处理猫本身以减少猫所脱落的Fel d1的量 (WO2007/113633A2)。然而,从其提出起,没有任何数据,更不用说报告成功了。
因此,对显示出有效解决人的猫过敏问题的组合物和治疗的存在需求。具体而言,对显示出在降低猫对人的过敏原性的方法中有效的组合物和治疗的存在需求。
发明内容
我们已经显示本发明的组合物在降低猫过敏原性并且因此特别是猫对人的过敏原性的方法中是有效的。因此,我们已经发现对猫施用本发明组合物导致产生Fel d1特异性IgG抗体以及Fel d1特异性 IgA抗体。此外,在免疫的猫中检测到由内源Fel d1和IgA抗体组成的免疫复合物。此外,与免疫之前与来自所述猫的唾液提取物相比,用所述组合物免疫后获得的猫的唾液提取物显示了猫过敏患者的嗜碱性粒细胞脱颗粒水平降低了至多20%,这相当于Fel d1浓度减少至十三分之一,表明实现了唾液中过敏原性Fel d1的显著降低。
不受此解释的限制,本发明通过在猫中诱导Fel d1特异性IgG 和IgA抗体而在第一个可能的干预点影响人的过敏应答,所述抗体将与Fel d1结合,从而降低或中和Fel d1的过敏原性作用。在施用有效量的本发明组合物后,在猫中诱导针对Fel d1以及针对VLP载体的体液免疫应答。预计诱导的抗体应答主要是IgG同种型,但也会有 IgA。这些抗Fel d1抗体最终介导保护免于过敏反应。Fel d1特异性抗体、免疫复合物即抗体-Fel d1复合物后的免疫和诱导将原位形成并分泌到环境中。因此,人将暴露于复合的Fel d1,并且更少地暴露于猫所脱落的天然非结合(“反应性”)形式。这可能是通过两种作用机制来实现的。第一是通过IgE/FcεRI减少Fel d1的接合(经典中和),第二是通过能够使FcεRI介导的信号传导失活的IgE/FcεRI和 IgG/FcεRIIb的共同接合(负信号传导)。
因此,在第一方面,本发明提供了组合物在降低典型且优选地猫对人的过敏原性的方法中的用途,其中将有效量的所述组合物施用于所述猫,并且其中所述组合物包含(i)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒;(ii)至少一个具有至少一个第二附着位点的Fel d1 蛋白;并且其中所述病毒样颗粒和所述Fel d1蛋白通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。优选地,所述方法是降低所述猫过敏原性的非治疗性方法。在进一步的实施方式中,所述猫没有患有过敏或自身免疫疾病,典型且优选地,其中所述猫没有患有由Fel d1引起的过敏或自身免疫疾病。
在优选的实施方式中,所述降低典型且优选地所述猫对人的过敏原性是通过在所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪中、优选在所述猫的唾液中产生由Fel d1和Fel d1-抗体形成的免疫复合物而实现的,并且其中优选所述组合物的所述施用导致在所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪中、优选在所述猫的唾液中产生所述免疫复合物。
在进一步优选的实施方式中,所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV) 的修饰的VLP,其中所述CMV的修饰的VLP包含至少一种修饰的 CMV多肽、基本上由其组成、或替代地由其组成,其中所述修饰的 CMV多肽包含或优选由以下组成:(a)CMV多肽,和(b)辅助性 T细胞表位;并且其中所述CMV多肽包含或优选由以下组成:(i) CMV的外壳蛋白的氨基酸序列;或(ii)突变的氨基酸序列,其中待突变的氨基酸序列是CMV的外壳蛋白的氨基酸序列,并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV的外壳蛋白显示至少90%、优选至少 95%、进一步优选至少98%、还更优选至少99%的序列同一性。在进一步非常优选的实施方式中,所述CMV多肽包含或优选由以下组成:(a)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含 SEQID NO:1或优选由其组成,或(b)具有SEQ ID NO:1的至少90%的序列同一性的氨基酸序列;并且其中(a)或(b)中所定义的所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:34;或其中所述(a)或(b)中所定义的所述氨基酸序列包含氨基酸序列区,其中所述氨基酸序列区与SEQ ID NO:34具有至少90%的序列同一性。
在进一步非常优选的实施方式中,所述修饰的CMV多肽包含 SEQ ID NO:6或SEQID NO:7的氨基酸序列、优选由其组成。此外,非常优选地,所述Fel d1蛋白是包含Fel d1的链1和Fel d1的链2 的Fel d1融合蛋白,其中Fel d1的链1和Fel d1的链2直接通过一个肽键或通过间隔子融合,其将一个链的N末端与另一个链的C末端连接。非常优选地,所述Feld1蛋白包含选自以下的氨基酸序列: (a)SEQ ID NO:20;(b)SEQ ID NO:25;(c)SEQ ID NO:26;(d) SEQ ID NO:27;或(e)SEQ ID NO:29。
在另一方面,本发明提供了一种降低典型且优选地猫对人的过敏原性的方法,其中所述方法包括将有效量的所述组合物施用于所述猫,其中所述组合物包含(i)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒;(ii)至少一个具有至少一个第二附着位点的Fel d1蛋白;并且其中所述病毒样颗粒和所述Fel d1蛋白通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。优选地,所述方法是降低所述猫过敏原性的非治疗性方法。
在进一步的方面,本发明提供了一种组合物,其包含(i)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP);(ii)至少一个具有至少一个第二附着位点的Fel d1蛋白;并且其中所述病毒样颗粒和所述Fel d1蛋白通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接,并且其中所述Fel d1蛋白包含选自SEQ ID NO:25或 SEQ ID NO:27的氨基酸序列;并且其中所述VLP是黄瓜花叶病毒 (CMV)的修饰的VLP,其中所述CMV的修饰的VLP包含至少一种修饰的CMV多肽、基本上由其组成、或替代地由其组成,其中所述修饰的CMV多肽包含或优选由以下组成:(a)CMV多肽,和(b) 辅助性T细胞表位;并且其中所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列、优选由其组成。
在进一步的方面,本发明提供了一种免疫原性组合物,该组合物被配制成用于施用于猫的组合物,该组合物降低猫脱落的Fel d1的过敏原性。本发明的组合物使得猫对与猫接触或接近猫时易于表现出猫过敏症状的人表现出较低的过敏原性。
在另一方面,本发明提供了组合物在降低猫过敏原性的方法中的用途,其中将有效量的所述组合物施用于所述猫,并且其中所述组合物包含(i)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒;(ii)至少一个具有至少一个第二附着位点的Fel d1蛋白;并且其中所述病毒样颗粒和所述Fel d1蛋白通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接,并且其中所述猫的所述降低的过敏原性是所述猫对人的降低的过敏原性。
在另一方面,本发明提供了用于降低猫过敏原性的方法中的组合物,其中将有效量的所述组合物施用于所述猫,并且其中所述组合物包含(i)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒;(ii)至少一个具有至少一个第二附着位点的Fel d1蛋白;并且其中所述病毒样颗粒和所述Fel d1蛋白通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接,并且其中所述猫的所述降低的过敏原性是所述猫对人的降低的过敏原性。
随着本说明书继续,本发明的其它方面和实施方式将变得明显。
附图说明
图1pET-CMVwt质粒图谱。表示了相关基因和限制酶位点的相对位置。
图2A纯化的CMVwt VLP的动态光散射。通过使用Zetasizer Nano ZS(MalvernInstruments Ltd.,United Kingdom)检测颗粒的大小。
图2B纯化的CMVwt VLP的电子显微镜分析。对于VLP的形态学分析,使用JEM-1230电子显微镜(Jeol Ltd.,Tokyo,Japan)。
图3纯化的CMV衍生的VLP的质谱分析。在Autoflex MS (Bruker Daltonik,Germany)上进行基质辅助激光解吸/电离 (MALDI)-TOF MS分析。蛋白质分子量(MM)校准标准II (22.3-66.5kDa;Bruker Daltonik)用于质量测定。
图3A CMV野生型(“wt”);理论MM=24069;发现MM=24058
图3B CMV-Npadr;理论MM=24161(没有第一个Met);发现 MM=24160
图3C CMV-Ntt830;理论MM=24483(没有第一个Met);发现 MM=24477
图4A纯化的CMV-Ntt830 VLP的动态光散射。通过使用 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd.,United Kingdom)检测颗粒的大小。
图4B纯化的CMV-Ntt830 VLP的电子显微镜分析。对于VLP 的形态学分析,使用JEM-1230电子显微镜(Jeol Ltd.,Tokyo,Japan)。
图5A纯化的CMV-Npadr VLP的动态光散射。通过使用 Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd.,United Kingdom)检测颗粒的大小。
图5B纯化的CMV-Npadr VLP的电子显微镜分析。对于VLP 的形态学分析,使用JEM-1230电子显微镜(Jeol Ltd.,Tokyo,Japan)。
图6A使用PrepEase试剂盒(USB)对来自大肠杆菌C2566细胞的F12H6GGC蛋白的表达和纯化进行SDS/PAGE分析。M-蛋白质大小标记;S-可溶性蛋白质级分;P-细胞碎片;F-从Ni-IDA 柱流穿(未结合的蛋白质);W1,W2-洗涤级分(2x2ml 1xLEW缓冲液)W3,W4洗涤级分(2x2ml 1xLEW+10mM咪唑);E1,E2- 洗脱级分(2x1.5ml E缓冲液250mM咪唑)。
图6B纯化的F12H6GGC的质谱分析。计算的F12H6GGC的平均质量对应于20089.8Da。20105.3的观测质量对应于具有一个Met 亚砜的F12H6GGC。
图6C纯化FG12GGCG的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析。(A) s-超声处理后的上清液;AmS-在50%(NH4)2SO4后溶解的沉淀物。来自DEAE柱程序的各种级分:FT-流穿,A4-A7-通过增加的NaCl梯度洗脱的级分,(B)通过MonoQ和Butyl HP柱的后续纯化。
图7显示了使用针对天然Fel d1产生的mAb由Indoor Biotechnologies提供的夹心ELISA。mAb同样好地识别F12H6GGC 和天然Fel d1。
图8A 天然Fel d1的嗜碱性粒细胞活化测试(BAT)。
图8B用于F12H6GGC的嗜碱性粒细胞活化测试(BAT)。 F12H6GGC和天然Fel d1诱导通过在CCR3+嗜碱性粒细胞上CD63 的上调所表示的猫过敏患者的血液中嗜碱性粒细胞的相似活化水平。
图9接受10μg的简单地与Fel d1融合蛋白F12H6GGC混合的 Fel d1-CMV VLP(Feld1-CMV-Ntt830-VLP或Fel d1-CMV-Npadr -VLP)或CMV-VLP(CMV-Ntt830-VLP或CMV-Npadr-VLP)的小鼠在第0天和第14天的抗体应答。在第0、14和21天收集血清并通过ELISA分析天然Fel d1特异性IgG抗体。N=3。
图10在有免疫佐剂或没有免疫佐剂的情况下用Fel d1-CMV-Ntt830-VLP免疫的猫的抗Fel d1和CMV的IgG抗体滴度。用ELISA检测免疫猫血清中的Fel d1-(图10A)和CMV-(图10B) 特异性IgG抗体。
图11在猫的唾液提取物中测量抗Fel d1和抗CMV抗体。ELISA 用于检测Fel d1特异性IgG抗体(图11A)、Fel d1特异性IgA抗体 (图11B)、CMV特异性IgG抗体(图11C)和CMV特异性IgA 抗体(图11D)。
图12检测由免疫猫唾液中的内源Fel d1和IgA抗体组成的免疫复合物。
图13来自第0天和第85天的唾液样品的嗜碱性粒细胞活化测试(BAT)显示了用Feld1-CMV-Ntt830-VLP免疫降低6只猫中5只的脱颗粒(图13A和图13B)。
图14使用Fel d1-CMV-Ntt830-VLP免疫前和后获得的猫皮提取物在皮肤点刺试验中的风团大小(面积,mm2)的比较。显示了1:80 和1:243(1:240)稀释的猫毛提取物的数据、平均值+/-平均值的标准误差。成功进行和分析总共16次比较免疫前和免疫后皮提取物的皮肤点刺试验的风团大小。
具体实施方式
除非另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。
病毒样颗粒(VLP):本文使用的术语“病毒样颗粒(VLP)”是指非复制性或非感染性、优选非复制性和非感染性病毒颗粒,或指非复制性或非感染性、优选非复制性和非感染性类似于病毒颗粒的结构,优选病毒衣壳。本文使用的术语“非复制性”是指不能复制VLP所包含的基因组。本文使用的术语“非感染性”是指不能进入宿主细胞。根据本发明的病毒样颗粒是非复制性的并且是非感染性的,因为它缺少全部或部分的病毒基因组或基因组功能。根据本发明的病毒样颗粒可以含有不同于其基因组的核酸。重组产生的病毒样颗粒通常含有宿主细胞衍生的RNA。根据本发明的病毒样颗粒的典型且优选的实施方式是由本发明的多肽组成的病毒衣壳。病毒样颗粒通常是由病毒的外壳蛋白组成的大分子组装体,每个病毒样颗粒通常包含60、 120、180、240、300、360或超过360个蛋白质亚单位。典型且优选地,这些亚单位的相互作用导致具有固有重复性组织的病毒衣壳或病毒衣壳样结构的形成。病毒样颗粒的一个特征是其亚单位的高度有序和重复排列。
CMV的病毒样颗粒:术语“CMV的病毒样颗粒”或CMV VLP是指包含至少一种CMV多肽的病毒样颗粒、或优选地基本上由其组成、或优选由其组成。优选地,CMV的病毒样颗粒包含所述CMV多肽作为衣壳结构的主要的、甚至更优选作为唯一的蛋白质组分。典型且优选地,CMV的病毒样颗粒类似于CMV衣壳的结构。CMV的病毒样颗粒是非复制性和/或非感染性的,并且至少缺少编码CMV复制机制的一个或多个基因,并且典型地还缺少编码负责病毒附着至或进入宿主的一个或多个蛋白质的一个或多个基因。该定义还包括其中前述一个或多个基因仍然存在但无活性的病毒样颗粒。使CMV的病毒样颗粒非复制性和/或非感染性的优选方法是通过物理或化学灭活,例如UV照射、甲醛处理。优选地,CMV的VLP缺少编码CMV复制机制的一个或多个基因,并且缺少编码负责病毒附着或进入宿主的一个或多个蛋白质的一个或多个基因。还更优选地,通过重组基因技术获得非复制性和/或非感染性病毒样颗粒。根据本发明的重组产生的 CMV病毒样颗粒典型且优选不包含病毒基因组。包含多于一个物种的多肽的病毒样颗粒(通常称为嵌合VLP)也包括在本发明中。因此,在一个实施方式中,根据本发明的病毒样颗粒包含至少两种不同物种的多肽,其中至少一种所述物种的多肽是CMV多肽。优选地, CMV的VLP是由每个VLP通常包含180个外壳蛋白亚单位的CMV 外壳蛋白组成的大分子组装体。典型且优选地,本文所用的CMV的 VLP包含至少一种CMV多肽、基本上由其组成、或替代地由其组成,至少一种CMV多肽包含或优选由以下组成:(i)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列;或(ii)突变的氨基酸序列,其中待突变的氨基酸序列是CMV的外壳蛋白的氨基酸序列,并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少90%、优选至少95%、进一步优选至少98%、还更优选至少99%的序列同一性。
多肽:本文使用的术语“多肽”是指由通过肽键(也称为酰胺键) 线性连接的氨基酸单体组成的聚合物。术语多肽是指连续的氨基酸链,并不是指特定长度的产物。因此,肽和蛋白质被包括在多肽的定义中。
黄瓜花叶病毒(CMV)多肽:本文使用的术语“黄瓜花叶病毒 (CMV)多肽”是指包含或优选由以下组成的多肽:(i)黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白的氨基酸序列,或(ii)突变的氨基酸序列,其中待突变的氨基酸序列是CMV外壳蛋白的氨基酸序列,并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列即所述CMV的外壳蛋白显示至少90%、优选至少95%、进一步优选至少98%、还更优选至少99%的序列同一性。典型且优选地,CMV多肽能够在表达后通过自组装形成CMV的病毒样颗粒。
黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP):本文使用的术语“黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)”是指天然存在的黄瓜花叶病毒的外壳蛋白。由于黄瓜花叶病毒的宿主范围非常宽,所以已知许多不同的CMV品系和分离物,并且已经确定了所述品系和分离物的外壳蛋白的序列,并且因此是本领域技术人员已知的。所述CMV的外壳蛋白(CP)的序列描述于已知的数据库如Genbank、www.dpvweb.net或www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/中,并可从中获取。EP申请号 14189897.3中描述了实例。CMV外壳蛋白的其它实例在SEQ ID NO:1-3中提供。值得注意的是,这些品系和分离物在不同的蛋白结构域包括外壳蛋白的N末端具有高度相似的外壳蛋白序列。具体而言,98.1%的所有完全测序的CMV分离物在其外壳蛋白序列的前28 个氨基酸内共享超过85%的序列同一性,并且79.5%的所有完全测序的CMV分离物在其外壳蛋白序列的前28个氨基酸内共享超过 90%的序列同一性。
典型且优选地,用于本发明的CMV的外壳蛋白能够在表达后通过自组装形成CMV的病毒样颗粒。优选地,用于本发明的CMV的外壳蛋白能够在大肠杆菌中在表达后通过自组装形成CMV的病毒样颗粒。
黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的病毒样颗粒(VLP):本文使用的术语“黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰病毒样颗粒(VLP)”是指 CMV的VLP,其是修饰的VLP例如其包含至少一种修饰的CMV多肽、或优选基本上由其组成、或优选由其组成,其中所述修饰的CMV 多肽包含CMV多肽和辅助性T细胞表位或优选由其组成。典型且优选地,所述辅助性T细胞表位(i)与所述CMV多肽的N末端融合, (ii)与所述CMV多肽的C末端融合,(iii)置换所述CMV多肽的连续氨基酸的区域,其中所述CMV多肽的所述连续氨基酸的所述置换区域与所述辅助性T细胞表位之间的序列同一性是至少15%、优选至少20%,或(iv)置换所述CMV多肽的N末端区域,并且其中所述CMV多肽的所述置换的N末端区域由5至15个连续氨基酸组成。优选地,所述辅助性T细胞表位置换所述CMV多肽的N末端区域,并且其中所述CMV多肽的所述置换的N末端区域由5至15个连续氨基酸,优选9至14个连续氨基酸,更优选11至13个连续氨基酸,最优选11、12或13个连续氨基酸组成。优选地,本发明的所述CMV的修饰的VLP是CMV的重组修饰的VLP。
修饰的CMV多肽:本文使用的术语“修饰的CMV多肽”是指如本文所定义的修饰的CMV多肽,所述修饰的CMV多肽包含CMV 多肽和辅助性T细胞表位或优选由其组成。通常,修饰的CMV多肽能够在表达后通过自组装形成CMV的病毒样颗粒。优选地,修饰的 CMV多肽是重组修饰的CMV多肽,并且能够在大肠杆菌中在表达后通过自组装形成CMV的病毒样颗粒。
CMV多肽的N末端区域:本文使用的术语“CMV多肽的N末端区域”是指所述CMV多肽的N末端,并且特别是指CMV的外壳蛋白的N末端区域,或如果所述CMV多肽或所述外壳蛋白包含N末端甲硫氨酸残基,则是从所述CMV多肽或所述CMV的外壳蛋白的 N末端的第二个氨基酸开始的所述CMV多肽或所述CMV的外壳蛋白的N末端区域。优选地,在所述CMV多肽或所述外壳蛋白包含N 末端甲硫氨酸残基的情况下,从实际观点来看,起始密码子编码的甲硫氨酸通常会被缺失并添加到Th细胞表位的N末端。进一步优选地,为了克隆的目的,可以任选地在起始甲硫氨酸和Th细胞表位之间插入一个、两个或三个另外的氨基酸,优选一个氨基酸。本文使用的术语“CMV多肽或CMV外壳蛋白的突变的氨基酸序列的N末端区域”是指所述CMV多肽或所述CMV的外壳蛋白的所述突变的氨基酸序列的N末端,或如果所述突变的氨基酸序列包含N末端甲硫氨酸残基,则是从所述CMV多肽或所述CMV的外壳蛋白的突变的氨基酸序列的N末端的第二个氨基酸开始的所述CMV多肽或所述CMV的外壳蛋白的突变的氨基酸序列的N末端区域。优选地,在所述CMV 多肽或所述外壳蛋白包含N末端甲硫氨酸残基的情况下,从实际观点来看,起始密码子编码的甲硫氨酸通常会被缺失并添加到Th细胞表位的N末端。进一步优选地,为了克隆的目的,可以任选地在起始甲硫氨酸和Th细胞表位之间插入一个、两个或三个另外的氨基酸,优选一个氨基酸。
重组多肽:在本发明上下文中,术语“重组多肽”是指通过包含至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的多肽。典型且优选地,在原核表达系统中产生重组多肽。本领域技术人员显而易见的是,在原核表达系统例如大肠杆菌中表达的重组产生的多肽可以包含N末端甲硫氨酸残基。在重组多肽成熟期间,N末端甲硫氨酸残基通常从表达宿主中的重组多肽上切下。但是,N末端甲硫氨酸的切割可能是不完整的。因此,重组多肽的制备物可以包含具有和不具有N末端甲硫氨酸残基的其它相同多肽的混合物。典型且优选地,重组多肽的制备物包含少于10%、更优选少于5%、还更优选少于1%的具有N末端甲硫氨酸残基的重组多肽。
重组CMV多肽:术语“重组CMV多肽”是指如上定义的CMV 多肽,其通过包含至少一个重组DNA技术步骤的方法获得。典型且优选地,重组CMV多肽的制备物包含少于10%、更优选少于5%、还更优选少于1%的具有N末端甲硫氨酸残基的重组CMV多肽。因此,本发明的重组病毒样颗粒可以包含具有和不具有N末端甲硫氨酸残基的其它相同的重组多肽。
重组修饰的CMV多肽:术语“重组修饰的CMV多肽”是指如上定义的修饰的CMV多肽,其通过包含至少一个重组DNA技术步骤的方法获得。典型且优选重组修饰的CMV多肽的制备物包含小于 10%、更优选小于5%、还更优选小于1%的具有N末端甲硫氨酸残基的重组修饰的CMV多肽。因此,本发明的重组病毒样颗粒可以包含具有和不具有N末端甲硫氨酸残基的其它相同的重组多肽。
重组病毒样颗粒:在本发明上下文中,术语“重组病毒样颗粒”是指通过包含至少一个重组DNA技术步骤的方法获得的病毒样颗粒 (VLP)。典型且优选地,重组病毒样颗粒包含至少一种重组多肽,优选重组CMV多肽或重组修饰的CMV多肽。最优选地,重组病毒样颗粒由重组CMV多肽或重组修饰的CMV多肽组成。因此,如果在本发明的上下文中,本发明的重组VLP的定义是参照包含N末端甲硫氨酸残基的特定氨基酸序列来实现的,则这些本发明的重组VLP 的范围包括由不具有所述N末端甲硫氨酸残基的所述特定氨基酸形成的VLP,以及即使通常在本文中指出的次要量的由具有所述N末端甲硫氨酸的所述特定氨基酸序列形成的VLP。此外,如果本发明的重组VLP的定义是参照包含N末端甲硫氨酸残基的特定氨基酸序列来实现的,则涵盖包括还包含所述N末端甲硫氨酸残基和缺乏N 末端甲硫氨酸残基的两种氨基酸序列的VLP在本发明的范围内。
突变的氨基酸序列:术语“突变的氨基酸序列”是指通过向待突变的氨基酸序列中引入确定的一组突变而获得的氨基酸序列。在本发明的上下文中,所述待突变的氨基酸序列典型且优选是CMV外壳蛋白的氨基酸序列。因此,突变的氨基酸序列在至少一个氨基酸残基上不同于CMV的外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少90%的序列同一性。典型且优选地,所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性。优选地,所述突变的氨基酸序列和待突变的所述序列在至多 11、10、9、8、7、6、4、3、2或1个氨基酸残基上不同,其中进一步优选所述差异选自插入、缺失和氨基酸交换。优选地,突变的氨基酸序列与CMV的外壳蛋白的氨基酸序列在至少一个氨基酸上不同,其中优选所述不同是氨基酸交换。
对应于残基...的位置:在氨基酸序列上对应于另一个氨基酸序列的给定残基的位置可以通过序列比对来鉴定,典型且优选地通过使用 BLASTP算法,最优选使用标准设置。典型且优选的标准设置是:预期阈值:10;字大小:3;查询范围中的最大匹配:0;矩阵:BLOSUM62;缺口成本:存在11,延伸1;组合调整(compositional adjustment):条件组合得分矩阵调整(conditional compositional score matrix adjustment)。
序列同一性:基于两个序列的比对确定两个给定氨基酸序列的序列同一性。本领域技术人员可以获得用于确定序列同一性的算法。优选地,两个氨基酸序列的序列同一性使用公众可获得的计算机同源性程序如“BLAST”程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi)或“CLUSTALW”(并且由此优选地通过在NCBI主页http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上提供的“BLAST”程序),使用其中提供的默认设置。典型且优选的标准设置是:预期阈值:10;字大小:3;查询范围中的最大匹配:0;矩阵:BLOSUM62;缺口成本:存在11,延伸1;组合调整:条件组合得分矩阵调整。
氨基酸交换:术语氨基酸交换是指氨基酸序列中给定氨基酸残基被具有不同化学结构的任何其它氨基酸残基、优选被另一蛋白氨基酸残基交换。因此,与插入或缺失氨基酸相反,氨基酸交换不会改变所述氨基酸序列的氨基酸总数。在本发明的上下文中非常优选的是交换所述氨基酸序列的氨基酸残基以被赖氨酸残基或半胱氨酸残基突变。
表位:术语表位指抗原、优选多肽的连续或不连续部分,其中所述部分能够在MHC分子的情况下中被抗体或T细胞受体特异性结合。就抗体而言,特异性结合不包括非特异性结合,但不必然不包括交叉反应性。表位通常包含空间构象的5-20个氨基酸,其对于抗原位点是独特的。
辅助性T(Th)细胞表位:本文使用的术语“辅助性T(Th)细胞表位”是指能够被辅助性Th细胞识别的表位。在另一个优选的实施方式中,所述辅助性T细胞表位是通用辅助性T细胞表位。
通用Th细胞表位:本文使用的术语“通用Th细胞表位”是指能够结合至少一个、优选多于一个MHC II类分子的Th细胞表位。确定肽序列是否是通用Th细胞表位的最简单方法是测量肽与个体 MHC II类分子结合的能力。这可以通过肽与已知的Th细胞表位肽竞争与MHC II类分子的结合的能力来测量。HLA-DR分子的代表性选择在例如Alexander J,etal.,Immunity(1994)1:751-761中描述。Th细胞表位对于MHC II类分子的亲和力应至少为10-5M。确定Th细胞表位的“普遍性”的另一种更繁琐但更相关的方式是证明更大比例的人(>30%)在免疫接种后并且一个月后用含有在IFA中配制的Th细胞表位的蛋白质加强免疫产生可测量的T细胞应答。在 Panina-Bordignon P,et al.,Eur J Immunol(1989)19:2237-2242中给出了存在于不同个体中的MHC II类分子的代表性集合。因此,如在 Panina-Bordignon P,et al.,Eur J Immunol(1989)19:2237-2242中所述的,本文使用的术语“通用Th细胞表位”优选是指在免疫和加强(一个月后用含有在IFA中配制的Th细胞表位的蛋白质)的情况下在超过30%的选定个体组中产生可测量的T细胞应答的Th细胞表位。此外,并且再次进一步优选的是,本文使用的术语“通用Th细胞表位”优选是指其能够以至少500nM的亲和力结合选自DR1,DR2w2b, DR3,DR4w4,DR4w14,DR5,DR7,DR52a,DRw53,DR2w2a;并且优选选自DR1,DR2w2b,DR4w4,DR4w14,DR5,DR7,DRw53, DR2w2a的至少一个、优选至少两个、甚至更优选至少三个DR等位基因的Th细胞表位(如Alexander J,et al.,Immunity(1994)1:751-761 和本文引用的参考文献中所述);评估所述亲和力的优选结合测定是由SetteA,et al.,J Immunol(1989)142:35-40描述的测定。以甚至更优选的方式,本文使用的术语“通用Th细胞表位”是指能够以亲和力至少500nM结合选自DR1,DR2w2b,DR4w4,DR4w14,DR5,DR7, DRw53,DR2w2a的至少一个,优选至少两个,甚至更优选结合至少三个DR等位基因的Th细胞表位(如Alexander J,et al.,Immunity (1994)1:751-761和本文引用的参考文献中所述);评估所述亲和力的优选结合测定是由Sette A,et al.,J Immunol(1989)142:35-40描述的测定。
通用Th细胞表位被描述于,并且是本领域技术人员已知的,例如Alexander J,etal.,Immunity(1994)1:751-761,Panina-Bordignon P, et al.,Eur J Immunol(1989)19:2237-2242,Calvo-Calle JM,et al.,J Immunol(1997)159:1362-1373,和Valmori D,etal.,J Immunol(1992) 149:717-721。
佐剂:本文使用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激剂或允许在宿主中产生储库的物质,当分别与本发明的疫苗和药物组合物组合时,可以提供甚至更强的免疫应答。优选的佐剂是完全和不完全弗氏佐剂,含铝佐剂,优选氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。进一步优选的佐剂为矿物凝胶例如氢氧化铝,表面活性物质例如溶血卵磷脂, pluronic多元醇,聚阴离子,肽,油乳剂,匙孔血蓝蛋白,二硝基酚和人佐剂例如BCG(卡介苗)和短小棒状杆菌(Corynebacterium parvum)。这样的佐剂在本领域中也是众所周知的。可与本发明组合物一起施用的其它佐剂包括但不限于单磷酰脂质免疫调节剂, AdjuVax 100a,QS-21,QS-18,CRL1005,铝盐(Alum),MF-59, OM-174,OM-197,OM-294和病毒体佐剂技术。佐剂也可以包含这些物质的混合物。已经一般将病毒样颗粒描述为佐剂。然而,在本申请的上下文中使用的术语“佐剂”是指不是本发明的病毒样颗粒的佐剂。更确切地说,“佐剂”涉及本发明组合物、疫苗或药物组合物的另外的独特组分。
有效量:本文使用的术语“有效量”是指实现期望的生物效应所必需或足够的量。有效量的组合物或药物组合物将是实现该选定结果的量,并且这样的量可以由本领域技术人员按常规确定。优选地,本文使用的术语“有效量”是指典型且优选对于人而言有效降低猫过敏原性所必需或足够的量。优选地,本文使用的术语“有效量”是指必要或足以在猫的唾液、毛、皮肤或眼泪中、优选如本文所述在猫的唾液中有效产生由Fel d1和Fel d1-抗体形成的免疫复合物的量。有效量可以根据施用的特定组合物和受试者的大小而变化。本领域普通技术人员可凭经验确定本发明的特定组合物的有效量,而不需要过度的实验。
治疗:本文使用的术语“治疗”(“treatment”、“treat”、“treated”或“treating”)是指预防和/或治疗。在一个实施方式中,术语“治疗”是指治疗性治疗。在另一个实施方式中,术语“治疗”是指预防性治疗。
Fel d1蛋白:本文使用的术语“Fel d1蛋白”是指包含或替代地由 Fel d1的链1和Fel d1的链2组成的蛋白质。Fel d1的链1和Fel d1 的链2优选共价连接。在一个优选实施方式中,Fel d1的链1和Fel d1 的链2通过至少一个二硫键连接。在另一个优选的实施方式中,链1 和链2直接或通过间隔子融合,在这种情况下,所述Fel d1蛋白进一步包含或替代地由间隔子组成。优选如本文所定义的Fel d1蛋白质由总共至多300个、甚至更优选至多200个氨基酸组成。典型且优选地,根据本发明,Fel d1蛋白能够体内诱导产生与天然存在的Fel d1、内源Fel d1或根据本发明的实施例7-9产生的重组Fel d1融合蛋白特异性结合的抗体。
Fel d1的链1:本文使用的术语“Fel d1的链1”是指包含或替代地由SEQ ID NO:30的氨基酸序列或其同源序列组成的多肽。本文使用的术语“SEQ ID NO:30的同源序列”是指与SEQ ID NO:30具有大于 80%、更优选大于90%、甚至更优选大于比95%的同一性的多肽。本文使用的术语“Fel d1的链1”还应指包括如本文所定义的Fel d1的链1的至少一个翻译后修饰(包括但不限于至少一个糖基化)的多肽。优选地,如本文所定义的Fel d1的链1由总共至多130个、甚至更优选地至多100个氨基酸组成。
Fel d1的链2:本文使用的术语“Fel d1的链2”是指包含或替代地由SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的氨基酸序列或其同源序列组成的多肽。本文使用的术语“SEQ ID NO:31,SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的同源序列”是指与SEQ ID NO:31、SEQID NO:32或SEQ ID NO:33具有大于80%、更优选大于90%、甚至更优选大于95%的同一性的多肽。本文使用的术语“Fel d1的链2”还应指如本文所定义的包含Fel d1的链2的至少一个翻译后修饰(包括但不限于至少一个糖基化)的多肽。优选如本文所定义的Fel d1的链2由总共至多150个、甚至更优选至多130个、还更优选至多100个氨基酸组成。
免疫复合物:本文使用的术语“免疫复合物”是指由抗体与其同源 /特异性抗原的结合形成的复合物。优选地,本文使用的术语“免疫复合物”是指由抗体与其同源/特异性抗原的非共价结合形成的复合物。进一步优选地,本文使用的术语“免疫复合物”是指由Feld1-抗体与 Fel d1的结合、优选非共价结合形成的复合物。
第一附着位点:本文使用的短语“第一附着位点”是指与病毒样颗粒天然存在的或人工添加到病毒样颗粒的元件,并且第二附着位点可以与其连接。第一附着位点优选为蛋白质,多肽,氨基酸,肽,糖,多核苷酸,天然或合成聚合物,次级代谢物或化合物(生物素,荧光素,视黄醇,地高辛,金属离子,苯甲磺酰氟)或化学反应性基团如氨基,羧基,巯基,羟基,胍基,组氨酸基或其组合。作为第一附着位点的化学反应性基团的优选实施方式是氨基酸残基、优选赖氨酸残基的氨基。第一附着位点通常位于VLP的表面上,并且优选位于VLP 的外表面上。多个第一附着位点存在于VLP的表面上,优选在VLP 的外表面上,典型地呈重复构型。在优选的实施方式中,第一附着位点通过至少一个共价键、优选通过至少一个肽键与VLP结合。在进一步优选的实施方式中,第一附着位点与VLP天然存在。替代地,在优选的实施方式中,将第一附着位点人工添加到VLP。在非常优选的实施方式中,所述第一附着位点是所述VLP多肽的氨基酸序列的赖氨酸残基的氨基。
第二附着位点:本文使用的短语“第二附着位点”是指与Fel d1蛋白天然存在或人工添加到Fel d1蛋白的元件,并且第一附着位点可以与其连接。Fel d1蛋白的第二附着位点优选为蛋白质,多肽,肽,氨基酸,糖,多核苷酸,天然或合成聚合物,次级代谢物或化合物(生物素,荧光素,视黄醇,地高辛,金属离子,苯甲磺酰氟)或化学反应性基团如氨基,羧基,巯基,羟基,胍基,组氨酸基或其组合。作为第二附着位点的化学反应性基团的优选实施方式是巯基,优选氨基酸半胱氨酸的巯基,最优选半胱氨酸残基的巯基。术语“具有至少一个第二附着位点的抗原”或“具有至少一个第二附着位点的Fel d1蛋白”因此是指包含Fel d1蛋白和至少一个第二附着位点的构建体。然而,特别是对于Fel d1蛋白内不天然存在的第二附着位点,这种构建体典型且优选进一步包含“连接子”。在另一个优选实施方式中,第二附着位点通过至少一个共价键、优选通过至少一个肽键与Fel d1蛋白结合。在另一个实施方式中,第二附着位点天然存在于Fel d1蛋白内。在另一个进一步优选的实施方式中,第二附着位点通过连接子人工添加到Fel d1蛋白,其中所述连接子包含或替代地由半胱氨酸组成。优选地,连接子通过肽键与Fel d1蛋白融合。
连接:本文使用的术语“连接”(“linked”或“linkage”)是指所有可能的方式、优选化学相互作用,通过所述方式,至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点连接在一起。化学相互作用包括共价和非共价相互作用。非共价相互作用的典型实例是离子相互作用、疏水相互作用或氢键,而共价相互作用例如基于共价键,如酯,醚,磷酸酯,碳-磷键,碳-硫键如硫醚或酰亚胺键。在某些优选的实施方式中,第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键、优选通过至少一个非肽键、甚至更优选仅通过非肽键连接。然而,如本文所使用的术语“连接”不仅应该指代至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点的直接连接,而且另外并且优选地是指至少一个第一附着位点和至少一个第二附着位点通过中间分子,并且因此典型且优选通过使用至少一个、优选一个异双功能交联剂的间接连接。在其它优选的实施方式中,第一附着位点和第二附着位点通过至少一个共价键、优选通过至少一个肽键、甚至更优选仅通过肽键连接。
连接子:本文使用的“连接子”将第二附着位点与Fel d1蛋白结合或已经包含第二附着位点、基本上由第二附着位点组成,或由第二附着位点组成。优选地,本文使用的“连接子”已经包含第二附着位点,典型且优选地(但不一定)作为一个氨基酸残基,优选作为半胱氨酸残基。优选的连接子是氨基酸连接子,即含有至少一个氨基酸残基的连接子。术语氨基酸连接子并不意味着这种连接子仅由氨基酸残基组成。然而,仅由氨基酸残基组成的连接子是本发明的优选实施方式。连接子的氨基酸残基优选由本领域已知的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸、全-L或全-D或其混合物组成。根据本发明的连接子的进一步优选的实施方式是包含巯基或半胱氨酸残基的分子,因此这样的分子也包括在本发明内。连接子与Feld1蛋白的结合优选通过至少一个共价键、更优选通过至少一个肽键的方式。
因此,在第一方面,本发明提供组合物在降低猫过敏原性的方法中的用途,其中将有效量的所述组合物施用于所述猫,并且其中所述组合物包含(i)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒;(ii)至少一个具有至少一个第二附着位点的Fel d1蛋白;并且其中所述病毒样颗粒和所述Fel d1蛋白通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。优选地,所述方法是降低所述猫过敏原性的非治疗性方法。在进一步优选的实施方式中,所述猫没有患有过敏或自身免疫疾病,优选其中所述猫没有患有由Fel d1引起的过敏或自身免疫疾病。
在优选的实施方式中,所述降低典型且优选所述猫对人的过敏原性是通过在所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪中、优选在所述猫的唾液中产生由Fel d1和Fel d1-抗体形成的免疫复合物,并且其中优选所述组合物的所述施用导致在所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪中、优选在所述猫的唾液中所述免疫复合物的所述产生。
如实施例中所述,通过将本发明组合物施用于所述猫引起的所述猫对人的过敏原性的降低可以进一步通过使来自猫过敏患者的嗜碱性粒细胞脱颗粒来确定。因此,在优选的实施方式中,所述降低所述猫对人的过敏原性是降低所述猫脱落的Fel d1的过敏原性,并且其中优选降低所述猫脱落的Fel d1的过敏原性是降低所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪中、优选在所述猫的唾液中的Fel d1的过敏原性。
在优选的实施方式中,向猫的所述有效量的组合物的所述施用包括向猫重复施用所述有效量的组合物,并且其中所述重复施用以2、 3、4、8、12周的间隔实施,并且其中优选所述重复施用包括2、3、 4或5次将所述有效量的组合物施用于猫。
在进一步优选的实施方式中,所述重复施用是以3或4周的间隔实施的三次施用。典型且优选地,向猫的所述有效量的组合物的所述施用进一步包括向猫单次施用所述有效量的组合物,其中所述单次施用在所述重复施用的最后一次之后6、9、12、15或18个月,优选12个月实施。
典型地,所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪中、优选在所述猫的唾液中的所述过敏活性Fel d1的所述降低存在于所述重复施用的最后一次之后至少一个月至三个月之间。
在进一步非常优选的实施方式中,所述降低所述猫的过敏原性降低了所述猫对暴露于所述猫的人的过敏原性。在另一个非常优选的实施方式中,所述降低所述猫对暴露于猫的人的过敏原性是(i)降低由所述人产生的过敏应答的水平或严重性,或(ii)减少所述人的至少一种过敏症状;并且其中所述人对所述猫的所述暴露优选是所述人暴露于所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪,优选所述猫的唾液。
在进一步非常优选的实施方式中,所述降低所述猫过敏原性是降低所述猫对暴露于所述猫的人的过敏原性,其中所述降低所述猫对所述猫的过敏原性是(i)减少所述人的至少一种过敏症状,或(ii)降低所述人的至少一种过敏症状的水平或严重性;并且其中所述人对所述猫的所述暴露优选是所述人暴露于所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪,优选所述猫的唾液。优选地,(i)由所述人产生的过敏应答的水平或严重性的所述降低,或(ii)所述人的所述至少一种过敏症状的所述减少,由较少阳性的皮肤点刺试验、鼻激发试验或结膜激发试验、优选由较少阳性的皮肤点刺试验表示,其中优选将所述施用之前和之后来自所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪,更优选将所述施用之前和之后来自所述猫的唾液,用于所述皮肤点刺试验、鼻激发试验或结膜激发试验,优选所述皮肤点刺试验。本领域技术人员已知,可以使用症状评分试验、皮肤点刺试验、鼻激发试验或结膜激发试验或支气管激发试验来评估过敏和过敏症状。这些程序、问卷调查和试验对于本领域技术人员来说是众所周知的。在本文中和在症状评分试验、皮肤点刺试验、鼻激发试验、结膜激发试验的情况下,特别是在症状评分试验或皮肤点刺试验中使用的术语“较少阳性”是指(i)所述人在暴露于所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪、优选所述猫的唾液后所产生的过敏的水平或严重性较低或降低,或(ii)当暴露于所述猫后,优选暴露于所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪、优选暴露于所述猫的唾液后,更优选暴露于所述猫的唾液后,所述人的至少一种过敏症状的降低或减少。
在一个实施方式中,所述病毒样颗粒衍生自对所述猫是非病原性的病毒。在优选的实施方式中,所述病毒样颗粒(VLP)衍生自植物病毒或噬菌体,并且其中优选所述噬菌体衍生自RNA噬菌体,并且其中进一步优选所述VLP衍生自RNA噬菌体或植物病毒,并且再进一步优选其中所述VLP衍生自植物病毒。在另一个优选的实施方式中,所述VLP是重组VLP,并且其中优选所述重组VLP衍生自植物病毒。在另一个优选的实施方式中,所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV) 的VLP。在另一个优选的实施方式中,所述VLP是RNA噬菌体的 VLP,优选所述VLP是RNA噬菌体的重组VLP。在另一个优选的实施方式中,所述病毒样颗粒是RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒。在另一个优选的实施方式中,所述VLP不是RNA噬菌体的VLP,优选所述VLP不是RNA噬菌体的重组VLP。在另一个优选的实施方式中,所述病毒样颗粒不是RNA噬菌体Qβ的病毒样颗粒。
在优选的实施方式中,所述VLP是包含至少一种修饰的VLP多肽、基本上由其组成、或替代地由其组成的修饰的VLP,其中所述修饰的VLP多肽包含或优选由以下组成:(a)VLP多肽,和(b) 辅助性T细胞表位,其中所述VLP多肽包含或优选由以下组成:(i) 病毒的外壳蛋白的氨基酸序列,优选植物病毒的外壳蛋白的氨基酸序列;或(ii)突变的氨基酸序列,其中待突变的氨基酸序列是所述病毒的外壳蛋白的氨基酸序列,并且其中所述突变的氨基酸序列和所述病毒的外壳蛋白显示至少90%、优选至少95%、进一步优选至少 98%、还更优选至少99%的序列同一性。
在优选的实施方式中,所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP,其中所述CMV的修饰的VLP包含至少一种修饰的CMV 多肽、基本上由其组成、或替代地由其组成,其中所述修饰的CMV 多肽包含或优选由以下组成:(a)CMV多肽,和(b)辅助性T细胞表位组成;并且其中所述CMV多肽包含或优选由以下组成:(i) CMV的外壳蛋白的氨基酸序列;或(ii)突变的氨基酸序列,其中待突变的氨基酸序列是CMV的外壳蛋白的氨基酸序列,并且其中所述突变的氨基酸序列和CMV的外壳蛋白显示至少90%、优选至少 95%、进一步优选至少98%、还更优选至少99%的序列同一性。
在优选的实施方式中,所述CMV多肽包含CMV的外壳蛋白的氨基酸序列、优选由其组成。在另一个优选的实施方式中,所述CMV 多肽包含突变的氨基酸序列、优选由其组成,其中待突变的氨基酸序列是CMV的外壳蛋白的氨基酸序列,并且其中所述突变的氨基酸序列和所述CMV的外壳蛋白显示至少90%、优选至少95%、进一步优选至少98%、还更优选至少99%的序列同一性。典型且优选地,所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列在至少一个和至多11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个氨基酸残基上不同,其中优选这些不同选自(i)插入,(ii)缺失,(iii)氨基酸交换,和(iv) (i)至(iii)的任何组合。
在另一个优选的实施方式中,所述CMV多肽包含或优选由以下组成:(i)(a)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1、或优选由其组成,或(b)具有SEQ ID NO:1 的至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、还进一步优选至少 90%、还更优选至少95%、又进一步优选至少98%、又还进一步更优选为至少99%的序列同一性的氨基酸序列;或(ii)突变的氨基酸序列,其中所述待突变的氨基酸序列是如(i)中所定义的所述氨基酸序列,并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少95%、优选至少98%、更优选至少99%的序列同一性。
在另一个优选的实施方式中,所述CMV多肽包含或优选由以下组成:(a)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1、或优选由其组成,或(b)具有SEQ ID NO:1的至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、还进一步优选至少90%、还更优选至少95%、又进一步优选至少98%、又还进一步更优选为至少99%的序列同一性的氨基酸序列。
在另一个优选的实施方式中,所述CMV多肽包含或优选由以下组成:(i)(a)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:34,或(b)包含氨基酸序列区的CMV外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列区与SEQ ID NO:34具有至少 75%、优选至少80%、更优选至少85%、还进一步优选至少90%、还更优选至少95%、又进一步优选至少98%、又还进一步更优选为至少99%的序列同一性的氨基酸序列;或(ii)突变的氨基酸序列,其中所述待突变的氨基酸序列是如(i)中所定义的所述氨基酸序列,并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少95%、优选至少98%、更优选至少99%的序列同一性。
在进一步优选的实施方式中,所述CMV多肽包含或优选由以下组成:(a)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:34,或(b)包含氨基酸序列区的CMV的外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列区与SEQ ID NO:34具有至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、还进一步优选至少90%、还更优选至少95%、又进一步优选至少98%、又还进一步更优选为至少99%的序列同一性。
在另一个优选的实施方式中,所述CMV多肽包含或优选由以下组成,(i)(a)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1、或优选由其组成,或(b)具有SEQ ID NO:1 的至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、还进一步优选至少 90%、还更优选至少95%、又进一步优选至少98%、又还进一步更优选为至少99%的序列同一性的氨基酸序列;并且其中(a)或(b) 中所定义的所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:34;或其中(a)或(b) 中所定义的所述氨基酸序列包含氨基酸序列区,其中所述氨基酸序列区与SEQID NO:34具有至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、还进一步优选至少90%、还更优选至少95%、又进一步优选至少 98%、又还进一步更优选为至少99%的序列同一性的氨基酸序列;或(ii)突变的氨基酸序列,其中所述待突变的氨基酸序列是如(i) 中所定义的所述氨基酸序列,并且其中所述突变的氨基酸序列和所述待突变的氨基酸序列显示至少98%、优选至少99%的序列同一性。
在另一个优选的实施方式中,所述CMV多肽包含或优选由以下组成:(a)CMV的外壳蛋白的氨基酸序列,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1、或优选由其组成,或(b)具有SEQ ID NO:1的至少90%的序列同一性的氨基酸序列;并且其中(a)或(b)中定义的所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:34;或其中(a)或(b)中所定义的所述氨基酸序列包含氨基酸序列区,其中所述氨基酸序列区与 SEQ ID NO:34具有至少90%的序列同一性。
在另一个优选的实施方式中,所述辅助性T细胞表位置换所述CMV多肽的N末端区域。在另一个优选的实施方式中,置换的所述 N末端区域的氨基酸数目等于或低于由所述辅助性T细胞表位组成的氨基酸数目。
在进一步非常优选的实施方式中,所述辅助性T细胞表位置换所述CMV多肽的N末端区域,并且其中置换的所述N末端区域的氨基酸数目等于或低于由所述辅助性T细胞表位组成的氨基酸数目。典型且优选地,所述CMV多肽的所述置换的N末端区域由5至15 个连续氨基酸、优选9至14个连续氨基酸、更优选11至13个连续氨基酸组成。
在进一步非常优选的实施方式中,所述CMV多肽的所述N末端区域对应于SEQ IDNO:1的氨基酸2-12。
在另一个非常优选的实施方式中,所述辅助性T细胞表位是通用辅助性T细胞表位。在另一个优选的实施方式中,所述辅助性T 细胞表位由至多20个氨基酸组成。
在非常优选的实施方式中,所述Th细胞表位是PADRE序列。在进一步非常优选的实施方式中,所述Th细胞表位包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、优选由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述Th细胞表位是PADRE序列,并且其中所述Th细胞表位包含SEQ IDNO:5的氨基酸序列、优选由其组成。
在另一个优选的实施方式中,所述辅助性T细胞表位衍生自人疫苗。在非常优选的实施方式中,所述Th细胞表位衍生自破伤风毒素。在另一个非常优选的实施方式中,所述Th细胞表位具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列、优选由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述Th细胞表位衍生自破伤风毒素,并且其中所述Th细胞表位具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列、优选由其组成。
在非常优选的实施方式中,所述Th细胞表位是PADRE序列,并且其中所述Th细胞表位包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、优选由其组成;或其中所述Th细胞表位衍生自破伤风毒素,并且其中所述 Th细胞表位具有SEQ ID NO:4的氨基酸序列、优选由其组成。
在非常优选的实施方式中,所述CMV多肽包含或优选由CMV 的外壳蛋白的氨基酸序列组成,其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:1或具有SEQ ID NO:1的至少95%的序列同一性的氨基酸序列、或优选由其组成;并且其中所述氨基酸序列包含SEQ ID NO:34,并且其中所述辅助性T细胞表位置换所述CMV多肽的N末端区域,并且其中所述CMV多肽的所述置换的N末端区域由11至13个连续氨基酸、优选11个连续氨基酸组成,并且其中所述CMV多肽的所述N 末端区域进一步优选对应于SEQ ID NO:1的氨基酸2-12。
在另一个非常优选的实施方式中,所述修饰的CMV多肽包含 SEQ ID NO:6的氨基酸序列、优选由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述修饰的CMV多肽包含SEQ IDNO:7的氨基酸序列、优选由其组成。组合物的用途,其中所述修饰的CMV多肽包含SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:7的氨基酸序列、优选由其组成。
在非常优选的实施方式中,所述第一附着位点和所述第二附着位点通过至少一个共价非肽键连接。在另一个非常优选的实施方式中,所述第一附着位点包含或优选为氨基,优选赖氨酸的氨基。在进一步非常优选的实施方式中,所述第二附着位点包含或优选为巯基,优选半胱氨酸的巯基。
在非常优选的实施方式中,所述至少一个第一附着位点是氨基,优选赖氨酸残基的氨基,并且所述至少一个第二附着位点是巯基,优选半胱氨酸残基的巯基或已经化学附着到Fel d1蛋白的巯基。在进一步优选的实施方式中,只有一个所述第二附着位点通过至少一个非肽共价键与所述第一附着位点结合,导致所述Fel d1蛋白与所述修饰的病毒样颗粒的单一且均一类型的结合,其中所述与所述第一附着位点结合的只有一个第二附着位点是巯基,并且其中所述Fel d1蛋白和所述修饰的病毒样颗粒通过所述结合相互作用形成有序和重复的抗原阵列,即有序和重复的Fel d1蛋白阵列。
在本发明的一个优选实施方式中,Fel d1蛋白通过化学交联方式连接于修饰的VLP,典型并优选地通过使用异双功能交联剂。在优选的实施方式中,异双功能交联剂含有能够与优选的第一附着位点、优选与氨基、更优选与修饰的VLP的赖氨酸残基的氨基反应的官能团,和能够与优选的第二附着位点(即巯基,优选与固有或人工添加到Fel d1蛋白质的半胱氨酸残基的巯基)反应的进一步的官能团,并且任选还可用于还原反应。几种异双功能交联剂是本领域已知的。这些包括优选的交联剂SMPH(Pierce),Sulfo-MBS,Sulfo-EMCS,Sulfo-GMBS,Sulfo-SIAB,Sulfo-SMPB,Sulfo-SMCC,Sulfo-KMUS SVSB,SIA以及例如可获得自Pierce Chemical Company的其它交联剂,并具有对氨基具有反应性的一个官能团和对巯基具有反应性的一个官能团。上述交联剂全部导致在与氨基反应和与巯基基团形成硫醚键后形成酰胺键。适用于本发明实践的另一类交联剂的特征在于在偶联后在Fel d1蛋白和修饰的VLP之间引入二硫键。属于这一类的优选的交联剂包括例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。
根据上述优选的方法,通过使用异双功能交联剂将Fel d1蛋白与修饰的VLP连接,允许Fel d1蛋白以定向方式与修饰的VLP偶联。将Fel d1蛋白连接到修饰的VLP的其它方法包括其中使用碳化二亚胺EDC和NHS将Fel d1蛋白交联到修饰的VLP的方法。Fel d1蛋白也可以通过反应例如用SATA、SATP或亚氨基硫烷首先进行硫醇化。如果需要的话,在脱保护之后,Fel d1蛋白可以如下与修饰的 VLP偶联。分离过量的硫醇化试剂后,Fel d1蛋白与预先用包含半胱氨酸反应性部分的异双功能交联剂活化的修饰的VLP反应,因此显示如上所述的至少一个或几个对半胱氨酸残基有反应性的官能团,硫醇化的Fel d1蛋白可以与之反应。任选地,反应混合物中包含少量的还原剂。在另外的方法中,使用同双功能交联剂例如戊二醛,DSG, BM[PEO]4,BS3,(Pierce)或其它已知的同双功能交联剂用对改性的VLP的胺基或羧基具有反应性的官能团将Fel d1蛋白与修饰的 VLP连接。
在本发明非常优选的实施方式中,Fel d1蛋白通过已经添加到 Fel d1蛋白的N末端或C末端的半胱氨酸残基或Fel d1蛋白中的天然半胱氨酸残基与修饰的病毒样颗粒的赖氨酸残基连接。在优选的实施方式中,本发明的组合物进一步包含连接子,其中所述连接子将所述Fel d1蛋白与所述第二附着位点结合,并且其中优选所述连接子包含或替代地由所述第二附着位点组成。
在另一个非常优选的实施方式中,所述组合物还包含连接子,所述连接子与所述Fel d1蛋白的C末端融合。在非常优选的实施方式中,所述Fel d1蛋白包含Fel d1的链1和Fel d1的链2,其中Fel d1 的链1通过至少一个共价键与Fel d1的链2结合。
在非常优选的实施方式中,所述Fel d1蛋白是Fel d1融合蛋白,其包含Fel d1的链1和Fel d1的链2,其中Fel d1的链1和Fel d1的链2直接通过一个肽键融合或通过连接一条链的N末端和另一条链的C末端的间隔子融合。已经描述了Fel d1的几种重组融合蛋白(Vailes LD,et al.,J Allergy Clin Immunol(2002)110:757-762;H,et al.,JBiol Chem(2003)278:40144–40151;Schmitz N,et al.,J Exp Med(2009)206:1941-1955;WO2006/097530)。在进一步优选的实施方式中,所述Fel d1蛋白是Fel d1融合蛋白,其包含Fel d1的链1和Fel d1的链2,其中Fel d1的所述链2经由其C末端融合至Fel d1的所述链1的N末端,直接经由一个肽键或经由间隔子,其中所述间隔子由具有1-20个氨基酸残基的氨基酸序列组成,其中优选地,所述间隔子由具有10-20个氨基酸残基的氨基酸序列。在另一个非常优选的实施方式中,所述间隔子由15个氨基酸残基的氨基酸序列组成,并且其中优选所述间隔子具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在进一步非常优选的实施方式中,所述Fel d1蛋白是Fel d1融合蛋白,其包含Feld1的链1和Fel d1的链2,其中Fel d1的所述链 1经由其C末端融合至Fel d1的所述链2的N末端,直接通过一个肽键或经由间隔子,其中所述间隔子由具有1-20个氨基酸残基的氨基酸序列组成,其中优选所述间隔子由具有10-20个氨基酸的氨基酸序列残留物。在另一个非常优选的实施方式中,所述间隔子由15个氨基酸残基的氨基酸序列组成,并且其中优选所述间隔子具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列。
在另一个非常优选的实施方式中,Fel d1的所述链1包含SEQ ID NO:30的序列或其同源序列,其中所述同源序列与SEQ ID NO:30具有大于80%、优选大于90%、甚至更优选大于95%的同一性。优选地,Fel d1的所述链1包含SEQ ID NO:30的序列或其同源序列,其中所述同源序列与SEQ ID NO:30具有大于90%或甚至更优选大于 95%的同一性。
在另一个非常优选的实施方式中,Fel d1的所述链2包含SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32或SEQ ID NO:33的序列或其同源序列,其中所述同源序列与SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33具有大于80%、优选大于90%、甚至更优选大于95%的同一性。进一步优选地,Fel d1的所述链2包含SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33的序列或其同源序列,其中所述同源序列与SEQ ID NO:31、 SEQ ID NO:32或SEQ ID NO:33具有大于90%、甚至更优选大于95%的同一性。
在非常优选的实施方式中,所述Fel d1蛋白包含选自以下的氨基酸序列:(a)SEQID NO:20;(b)SEQ ID NO:25;(c)SEQ ID NO:26;(d)SEQ ID NO:27;或(e)SEQ ID NO:29。在另一个非常优选的实施方式中,所述Fel d1蛋白包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列、优选由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述Fel d1蛋白包含 SEQ ID NO:20的氨基酸序列、优选由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述Fel d1蛋白包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列、优选由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述Fel d1蛋白包含 SEQID NO:26的氨基酸序列、优选由其组成。在另一个非常优选的实施方式中,所述Fel d1蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列、优选由其组成。
另一方面,本发明提供了降低猫过敏原性的方法,其中所述方法包括将有效量的所述组合物施用于所述猫,其中所述组合物包含(i) 具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒;(ii)至少一个具有至少一个第二附着位点的Fel d1蛋白;并且其中所述病毒样颗粒和所述 Fel d1蛋白通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接。优选地,所述方法是降低所述猫过敏原性的非治疗性方法;其中优选所述方法或所述组合物如本文所述进一步定义。
另一方面,本发明提供了一种组合物,其包含(i)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP);(ii)至少一个具有至少一个第二附着位点的Fel d1蛋白;并且其中所述病毒样颗粒和所述Fel d1蛋白通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接,并且其中所述Fel d1蛋白包含选自SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的氨基酸序列;并且其中所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV) 的修饰的VLP,其中所述CMV的修饰的VLP包含至少一种修饰的 CMV多肽、基本上由其组成、或替代地由其组成,其中所述修饰的 CMV多肽包含或优选由以下组成:(a)CMV多肽,和(b)辅助性 T细胞表位;并且其中所述修饰的CMV多肽包含SEQ ID NO:6或 SEQ ID NO:7的氨基酸序列、优选由其组成。
实施例
实施例1
黄瓜花叶病毒(CMV)的外壳蛋白(CP)的分离与克隆
根据制造商的说明,使用TRI试剂(Sigma,Saint Louis,USA) 从CMV感染的百合叶中分离总RNA。对于cDNA合成,使用OneStep RT-PCR试剂盒(Qiagen,Venlo,Netherlands)。对于扩增CMV CP 基因,在分析来自GenBank的CMV序列之后选择引物序列:CMcpF (CACCAT GGACAAATCTGAATCAACCAGTGCTGGT)(SEQ ID NO:8)和CMcpR (CAAAGCTTATCAAACTGGGAGCACCCCAGATGTGGGA)(SEQ ID NO:9),NcoI和HindIII位点加下划线。将相应的PCR产物克隆到pTZ57R/T载体(Fermentas,Vilnius,Lithuania)中。使用大肠杆菌XL1-Blue细胞作为宿主用于克隆和质粒扩增。为了避免选择含有 PCR错误的克隆,使用BigDye循环测序试剂盒和ABI Prism 3100基因分析仪(Applied Biosystems,Carlsbad,USA)对含有CP基因的几个pTZ57质粒克隆进行测序。测序后,将编码SEQ ID NO:1的CMV 外壳蛋白的无序列错误的CMVCP基因(SEQ ID NO:10)的cDNA 亚克隆到pET28a(+)表达载体(Novagen,San Diego,USA)的NcoI/HindIII位点,产生表达质粒pET-CMVwt(图1)。
实施例2
SEQ ID NO:1的CP在大肠杆菌中的表达得到CMV的VLP
为了获得CMV VLP,用含有CMV CP基因的质粒pET-CMVwt 转化大肠杆菌C2566细胞(New England Biolabs,Ipswich,USA)。在选择具有最高表达水平的靶蛋白的克隆后,将大肠杆菌培养物在旋转振荡器(200rev/min;Infors,Bottmingen,Switzerland)上在含有卡那霉素(25mg/l)的2xTY培养基中于30℃生长至OD600为0.8-1.0。然后,用0.2mM IPTG诱导细胞,并向培养基补充5mM MgCl2。在旋转振荡器上于20℃继续温育18小时。通过低速离心收集得到的生物质,并在-20℃冷冻。在冰上解冻后,将细胞悬浮于含有50mM柠檬酸钠,5mM硼酸钠,5mM EDTA,5mM巯基乙醇(pH9.0,缓冲液A)的缓冲液中,并通过超声波处理破碎。通过离心(13000rpm, 5℃30分钟)去除不溶性蛋白质和细胞碎片。使用饱和硫酸铵(1:1,体积/体积)在+4℃过夜以将澄清的裂解物中的可溶性CMV CP蛋白质沉淀。沉淀的蛋白质在+4℃在相同的缓冲液A(不含巯基乙醇)中溶解4小时。通过低速离心(13000rpm,4℃15分钟)除去不溶性蛋白质。通过超速离心(SW28转子,Beckman,Palo Alto,USA;在 25000rpm,6小时,5℃)在蔗糖梯度(缓冲液A中的20-60%蔗糖,不含巯基乙醇,补充有0.5%Triton X-100)中将含有可溶性CMVCP 的蛋白质溶液与细胞蛋白质分离。从梯度的底部开始将梯度分成六个级分,通过SDS-PAGE分析级分(数据未显示)。将含有重组CMV CP的级分2号和级分3号合并,并对200体积的缓冲液(5mM硼酸钠,2mM EDTA,pH9.0)透析以除去蔗糖和Triton X-100。透析后,通过0.2μ过滤器过滤灭菌CMV CP溶液。接下来,使用Type70转子 (Beckman,PaloAlto,USA)在无菌条件下(50000rpm,4小时, +5℃)通过20%蔗糖“缓冲垫(cushion)”超速离心浓缩CMV CP。使用QuBit荧光计根据制造商的建议(Invitrogen,Eugene,USA) 估算纯化的CMVwt的浓度。将浓缩的VLP溶液(约3mg/ml)在+4℃储存在5mM硼酸钠、2mM EDTA缓冲液(pH9.0)中。涉及VLP表达和纯化的所有步骤通过使用12.5%凝胶的SDS-PAGE监测。
CMV外壳蛋白可以在大肠杆菌中成功表达,获得的重要部分可在可溶性级分中。此外,如通过蔗糖梯度分析(图2A)、动态光散射和电子显微镜分析(图2B)所证明的,这些蛋白直接以等长VLP 形式存在于大肠杆菌细胞提取物中。
实施例3
含有破伤风类毒素表位的CMV的修饰的外壳蛋白的克隆 (CMV-Ntt830)
为了用破伤风类毒素表位编码序列置换SEQ ID NO:1的CMV CP的N末端的原始氨基酸,将pET-CMVwt质粒用于PCR扩增和诱变。位于CMVwt基因内的SalI位点(图1)用于克隆相应的PCR产物。
为了将破伤风类毒素表位编码序列引入CMVwt基因,使用两步 PCR诱变。对于第一步扩增,使用下列引物:pET-220 (AGCACCGCCGCCGCAAGGAA(SEQ ID NO:11)-来自多连接子的上游,扩增区包括BglII位点)和CMV-tt83-1R (ATTTGGAGTTGGCCTTAATATACTGGCCCATGGTATATCTCCT TCTTAAAGT)(SEQ ID NO:12)。对于第二轮,将来自第一扩增的PCR产物以1:50稀释并用引物pET-220(SEQ ID NO:11)和 CMV-tt83Sal-R2 (GACGTCGACGCTCGGTAATCCCGATAAATTTGGAGTTGGCCT TAATATACTG)(SEQ ID NO:13)再扩增。将得到的PCR产物(编码SEQ IDNO:6的CMV-Ntt830的SEQ ID NO:14的cDNA)亚克隆到pET-CMVwt的BglII/SalI位点中。通过测序鉴定正确的克隆并命名为pET-CMV-Ntt830。
实施例4
CMV-Ntt830在大肠杆菌中表达得到CMV的修饰的VLP
为获得CMV-Ntt830 VLP,用含有CMV-Ntt830基因的质粒 pET-CMV-Ntt830转化大肠杆菌C2566细胞(New England Biolabs, Ipswich,USA)。在选择具有最高表达水平的靶蛋白的克隆后,将大肠杆菌培养物在旋转振荡器(200rev/min;Infors,Bottmingen,Switzerland)中在30℃下在含有卡那霉素(25mg/l)的2xTY培养基中生长至OD600为0.8-1.0。然后用0.2mM IPTG和补充有5mM MgCl2的培养基诱导细胞。在20℃的旋转振荡器上继续温育18小时。通过低速离心收集所得的生物质并在-20℃下冷冻。在冰上解冻后,将细胞悬浮于含有50mM柠檬酸钠,5mM硼酸钠,5mM EDTA,5mM巯基乙醇(pH9.0,缓冲液A)的缓冲液中并通过超声破碎。通过离心 (13000rpm,5℃30分钟)去除不溶性蛋白质和细胞碎片。使用饱和硫酸铵(1:1,体积/体积)在+4℃过夜以将澄清的裂解物中的可溶性 CMV-Ntt830蛋白质沉淀。沉淀的蛋白质在+4℃下在缓冲液A(不含巯基乙醇)中溶解4小时。通过低速离心(13000rpm,4℃15分钟) 除去不溶性蛋白质。通过超速离心(SW28转子,Beckman,PaloAlto, USA;在25000rpm,6小时,5℃)在蔗糖梯度(缓冲液A中的20-60%蔗糖,不含巯基乙醇,补充有0.5%Triton X-100)中将含有可溶性 CMV-Ntt830的蛋白质溶液与细胞蛋白质分离。从梯度的底部开始将梯度分成六个级分。将含有重组CMV-Ntt830的级分合并,并对200 体积的5mM硼酸钠,2mM EDTA(pH9.0)透析以除去蔗糖和Triton X-100。透析后,通过0.2μ过滤器过滤灭菌CMV-Ntt830溶液。接下来,使用Type70转子(Beckman,Palo Alto,USA)在无菌条件下 (50000rpm,4小时,+5℃)通过20%蔗糖“缓冲垫”超速离心浓缩 CMV-Ntt830。使用QuBit荧光计根据制造商的建议(Invitrogen, Eugene,USA)估算纯化的CMV-Ntt830的浓度。将浓缩的VLP溶液(约3mg/ml)在+4℃储存在5mM硼酸钠、2mM EDTA缓冲液(pH9.0)中。涉及VLP表达和纯化的所有步骤通过使用12.5%凝胶的SDS-PAGE监测。为了证明CMV VLP中破伤风类毒素表位的存在,使用纯化的CMV-Ntt830 VLP的质谱分析。如图3C所示,如果在大肠杆菌细胞中蛋白质合成期间发生的第一个甲硫氨酸被去除,则获得的主峰对应于蛋白质的理论分子量。动态光散射和电子显微镜证实与CMVwt VLP相似的等长颗粒形态学(图4A和4B)。
实施例5
含有PADRE表位的CMV的修饰的外壳蛋白的克隆 (CMV-Npadr)
为了在CMVwt基因中引入PADRE表位编码序列,使用扩增和亚克隆pET-CMVwt质粒(也参见实施例2和3)作为模板进行PCR 诱变。对于扩增,使用下列引物:pET-220(SEQ IDNO:11)和 CMV-padrSal-R(GACGTCGACGCGCGGCCGCCTTGAGGGTCCACGCGGCCACAAATTTCGCCATGGT)(SEQ ID NO:15)。将得到的PCR产物(编码SEQ ID NO:7的CMV-Npadr的SEQ ID NO:16的 cDNA)再次亚克隆到pET-CMVwt的BglII/SalI位点中。通过测序鉴定正确的克隆并命名为pET-CMV-Npadr。
实施例6
CMV-Npadr在大肠杆菌中的表达得到CMV的修饰的VLP
CMV-Npadr的表达和纯化程序基本上与CMV-Ntt830并在实施例4中描述的相同。为了证明CMV VLP中PADRE表位的存在,使用纯化的CMV-Npadr VLP的质谱分析。如图3B所示,如果在大肠杆菌细胞中蛋白质合成期间发生的第一个甲硫氨酸被去除,则获得的主峰对应于蛋白质的理论分子量。动态光散射和电子显微镜分析证实了等长颗粒形态(图5A和图5B)。
实施例7
Fel d 1融合蛋白的克隆
通过寡核苷酸定向基因合成产生由经由15个氨基酸的序列 (GGGGS)3(SEQ IDNO:17)融合至Fel d1的链2的N末端的Fel d1的链1组成并且包括融合至Fel d1的链2的C末端的HHHHHHGGC序列(SEQ ID NO:18)的Fel d1融合蛋白(命名为 F12H6GGC)。相应的寡核苷酸序列具有SEQ ID NO:19的序列,其中F12H6GGC的蛋白质序列具有SEQ ID NO:20的序列:MEICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPVVLENARILKNCV DAKMTEEDKENALSVLDKIYTSPLCGGGGSGGGGSGGGGSVKMAE TCPIFYDVFFAVANGNELLLDLSLTKVNATEPERTAMKKIQDCYVEN GLISRVLDGLVMTTISSSKDCMGEAVQNTVEDLKLNTLGRHHHHHH GGC。
合成基因后,将其从其辅助质粒中切下,并亚克隆到质粒 pET42a(+)(Novagen,USA)的NdeI/XhoI位点,得到表达载体 pET42-F12H6GGC。
Fel d1融合蛋白在C末端具有额外的甘氨酸残基(命名为 F12H6GGCG)或不具有六组氨酸序列(命名为F12GGC)或在C末端不具有六组氨酸但具有额外的甘氨酸残基(命名为F12GGCG)通过使用质粒pET42-F12H6GGC作为模板的PCR诱变产生。用于PCR 产生这些融合蛋白的寡核苷酸引物是:
对于F12H6GGCG,正向引物是Fel BglF(SEQ ID NO:21),反向引物是Fel6H-cgR(SEQ ID NO:22)。
对于F12GGC,正向引物是Fel_BglF(SEQ ID NO:21),反向引物是Feld-dHR(SEQ IDNO:23)。
对于F12GGCG,正向引物是Fel_BglF(SEQ ID NO:21),反向引物是Feld-dH-cgR(SEQ ID NO:24)。
所有PCR产物用限制酶BglII/XhoI切割并在相同的切除位点亚克隆回到载体pET42-F126HGGC中。分离质粒DNA后,使用BigDye 循环测序试剂盒和ABI Prism 3100基因分析仪(Applied Biosystems, Carlsbad,USA)确认引入的变化。得到的表达载体命名为pET42-F12H6GGCG、pET42-F12GGC和pET42-F12GGCG。它们相应地编码Fel d1融合蛋白F12H6GGCG(SEQ ID NO:25)、F12GGC (SEQ ID NO:26)和F12GGCG(SEQ ID NO:27)。
MEICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPVVLENARILK NCVDAKMTEEDKENALSVLDKIYTSPLCGGGGSGGGGSGGGGSVK MAETCPIFYDVFFAVANGNELLLDLSLTKVNATEPERTAMKKIQDC YVENGLISRVLDGLVMTTISSSKDCMGEAVQNTVEDLKLNTLGRHH HHHHGGCG(SEQ ID NO:25);
MEICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPVVLENARILK NCVDAKMTEEDKENALSVLDKIYTSPLCGGGGSGGGGSGGGGSVK MAETCPIFYDVFFAVANGNELLLDLSLTKVNATEPERTAMKKIQDC YVENGLISRVLDGLVMTTISSSKDCMGEAVQNTVEDLKLNTLGRGG C(SEQ ID NO:26);
MEICPAVKRDVDLFLTGTPDEYVEQVAQYKALPVVLENARILK NCVDAKMTEEDKENALSVLDKIYTSPLCGGGGSGGGGSGGGGSVK MAETCPIFYDVFFAVANGNELLLDLSLTKVNATEPERTAMKKIQDC YVENGLISRVLDGLVMTTISSSKDCMGEAVQNTVEDLKLNTLGRGG CG(SEQ ID NO:27)。
六组氨酸序列使得能够通过金属螯合物亲和色谱进行纯化,并且包含GGC或GGCG(SEQ ID NO:28)的C末端序列能够使Fel d1 融合蛋白与CMV-Ntt830和CMV-Npadr偶联。
实施例8
Fel d 1融合蛋白的表达和纯化。
Fel d1融合蛋白在大肠杆菌中的表达。将Fel d1表达载体 pET42-F12H6GGC、pET42-F12H6GGCG、pET42-F12GGC和 pET42-F12GGCG转化到大肠杆菌C2566细胞(NewEngland Biolabs, Ipswich,USA)中。选择表达最高水平的靶蛋白的克隆并用于进一步的实验。以下列方式进行各种重组Fel d1融合蛋白的表达。携带表达质粒的大肠杆菌培养物在旋转振荡器(200rev/min;Infors, Bottmingen,Switzerland)上在含有卡那霉素(25mg/l)的2xTY培养基中于30℃生长至OD600为0.8-1.0。然后通过加入0.2mM IPTG 诱导Fel d1融合蛋白基因的表达。培养基补充有5mM MgCl2。在旋转振荡器上于20℃继续温育18小时。通过低速离心收集得到的生物质,并在-20℃冷冻直至纯化。
纯化六组氨酸标签的Fel d1融合蛋白。为了纯化F12H6GGC和 F12H6GGCG融合蛋白,根据制造商的说明使用USB PrepEase试剂盒(Affymetrix,High Wycombe,UK)。在冰上解冻后,将来自100ml 培养物的大肠杆菌细胞(约0.75g)悬浮在含有5mM DTT的1×LEW 缓冲液中,然后通过超声破碎。通过离心(13000rpm,5℃30分钟) 去除不溶性蛋白质和细胞碎片。将澄清的裂解物施加到Ni-IDA柱上,用同样的缓冲液(无DTT)洗涤两次,用2×1.5ml含有1×E缓冲液的咪唑洗脱。通过SDS/PAGE(图6A)鉴定含有Fel d1的级分,并对200体积的缓冲液(20mM磷酸钠,2mM EDTA,pH7.0)进行两次透析。透析后,使用QuBit荧光计根据制造商的说明书(Invitrogen, Eugene,USA)或通过在280nm处的UV分光光度测量来估算蛋白质浓度。通过质谱分析(图6B)和使用抗His标签抗体(Novagen,目录号71840-3;数据未显示)的蛋白质印迹证实纯化的蛋白质的同一性。
纯化无六组氨酸标签的Fel d1融合蛋白。为了纯化F12GGC和 FG12GGCG融合蛋白,使用阴离子交换和疏水相互作用色谱。通过在20ml裂解缓冲液LB(20mM Tris/HCl pH 8.0,50mM NaCl,5mM DTT)中超声处理破碎3g IPTG诱导的大肠杆菌。超声处理后,将溶液以15000g离心15分钟,收集上清液。在持续搅拌下加入硫酸铵直至达到30%饱和,然后在RT下温育5分钟。离心后,将固体硫酸铵加入到回收的上清液中直到50%饱和。离心后,收集蛋白质沉淀并溶解在2ml LB中,并用5ml用LB平衡的HiTrapTM脱盐柱(GE Healthcare LifeSciences)除去过量的盐。将脱盐的蛋白质洗脱液上样到用LB平衡的1ml HiTrapTMCaptoTMDEAE柱上。结合的F12GGC 或FG12GGCG用递增梯度的NaCl洗脱。收集含有Fel d1融合蛋白的级分并合并。所得溶液用4体积的20mM Tris/HCl(pH8.0),5mM DTT稀释并上样到LB中的MonoQ 5/50GL柱上,用递增的NaCl梯度洗脱。收集含有Fel d1融合蛋白的级分并合并。加入5M NaCl直至达到2.5M的浓度,并向溶液中加入DTT以保持5mM的浓度。然后将含有Fel d1的溶液上样到1ml在2.5M NaCl,5mM DTT中的 HiTrapTM Butyl HP柱中,并用连续递减的NaCl浓度洗脱。收集含有 Fel d1融合蛋白的级分并合并。通过考马斯染色的SDS/PAGE凝胶监测所有的纯化步骤(图6C)。通过使用针对重组Feld1的多克隆抗体的蛋白质印迹来证实纯化的蛋白质的同一性(数据未显示)。
实施例9
重组Fel d1融合蛋白的真实性
Fel d1融合蛋白类似地被Fel d1特异性单克隆抗体识别。使用来自Indoorbiotechnologies(Cardiff,UK)的夹心ELISA Fel dl ELISA 试剂盒(6F9/3E4)比较Fel d1融合蛋白F12H6GGC和天然Fel d1(nFel d1)与Fel d1特异性单克隆抗体(mAb)的结合。为此,用抗Fel d1 mAb 6F9(1μg/ml)包被Nunc ELISA板在4℃过夜。用含有0.05% Tween 20的PBS(PBST)洗涤板并用Superblock(Invitrogen)在室温(RT)下封闭2小时。将天然Fel d1以及F12H6GGC(1μg/ml) 以1:3系列稀释并在RT下温育2小时。用PBST洗涤板,加入生物素化的抗Fel d1 mAb 3E4(1μg/ml)并在RT下温育1小时。利用与辣根过氧化物酶(HRPO)偶联的链霉抗生物素蛋白进行检测。为此,将板用PBST洗涤,然后加入链霉抗生物素蛋白-过氧化物酶(Sigma, 1:1000稀释)并在RT下30分钟。用OPD底物溶液和作为终止溶液的5%H2SO4进行检测。使用ELISA酶标仪(BioRad)在450nm 处测量吸光度。
天然Fel d1和F12H6GGC在ELISA中给出相似滴度,证明它们类似地被Fel d1特异性mAb识别,从而证实了重组Fel d1 F12H6GGC 的真实性(图7)。
重组Fel d1融合蛋白活化猫过敏患者全血中的嗜碱性粒细胞。猫过敏患者的血液含有在其表面上携带Fel d1特异性IgE抗体的嗜碱性粒细胞,其在过敏原暴露后交联FcεRI并引起脱颗粒。为了检查重组 Fel d1引起脱颗粒的能力,收集来自Fel d1-过敏患者的全血,并将其与重组Fel d1融合蛋白F12H6GGC在Bühlmann Laboratories的嗜碱性粒细胞活化实验试剂盒(FlowFK CCR)组合使用。该测定测量CCR3+嗜碱性粒细胞上专门的脱颗粒标记CD63的上调。简而言之,将100μl刺激缓冲液与50μl EDTA处理的全血混合。另外,加入50μl天然Fel d1或重组Fel d1融合蛋白F12H6GGC的各种稀释液。在测定中也测试了包括针对FcεRI的mAb以及非特异性细胞活化剂(fMLP)的阳性对照溶液。加入含有标记至PE的抗CCR3抗体和标记至FITC的抗CD63抗体的染色染料(每个样品20μl),并在 37℃温育25分钟。随后加入裂解缓冲液将红细胞裂解。温育10分钟后,将样品以500xg离心5分钟,并用洗涤缓冲液(含有2%FCS的 PBS)洗涤。第二次离心步骤后,将细胞沉淀悬浮于200μl洗涤缓冲液中,并使用流式细胞仪(FACS Calibur)获取。用Cell Quest Pro 软件分析样品。分析CCR3+嗜碱性粒细胞上CD63表达的百分数。
发现重组Fel d1融合蛋白很容易触发猫过敏患者的嗜碱性粒细胞脱颗粒。此外,当与天然Fel d1相比时,获得相似水平的脱颗粒,从而证明重组产生的Fel d1融合蛋白的真实性。(图8A/图8B)。
实施例10
Fel d1融合蛋白与CMV-Ntt830和CMV-VLP的偶联
使用异双功能化学交联剂琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺丙酸酰胺基)己酸酯](SMPH)以下列方式将Fel d1融合蛋白F12H6GGC 共价连接至CMV-Ntt830和CMV-Npadr VLP。
保存在5mM硼酸钠,2mM EDTA缓冲液,pH9.0中的 CMV-Ntt830和CMV-Npadr病毒样颗粒用含有30%蔗糖和2mM EDTA的20mM磷酸钠使用PD10柱(GE Healthcare)进行缓冲液交换。CMV-Npadr或CMV-Ntt830 VLP的溶液与7.5倍摩尔过量的异双功能交联剂SMPH在RT下反应60分钟。未反应的SMPH用含有 30%蔗糖和2mM EDTA的20mM磷酸钠中的PD10柱除去。
用10倍摩尔过量的TCEP(Thermo Fisher)处理Fel d1融合蛋白F12H6GGC。衍生化的CMV-Ntt830和CMV-Npadr-VLP与1倍或 2倍摩尔过量的重组Fel d1融合蛋白F12H6GGC在23℃下反应3小时。通过还原用考马斯蓝染色的SDS-PAGE(NuP-12%Bis-Tris 凝胶)分析偶联反应。在化学缀合反应之后,具有大约44.5kDa和 69kDa的质量的蛋白质条带是明显的(数据未显示)。这些条带分别对应于与Fel d1融合蛋白F12H6GGC(20kDa)共价连接的CMV外壳蛋白(24.5kDa)和与一个Fel d1融合蛋白F12H6GGC共价连接的两个CMV外壳蛋白分子(49kDa),表明形成Fel d1-CMV VLP。类似地,进一步的Fel d1融合蛋白例如SEQ IDNO:25的融合蛋白与 CMV-Ntt830 VLP共价连接。
实施例11
小鼠中对Fel d1-CMV VLP的免疫应答
用如实施例10中所述制备的Fel d1-CMV-Ntt830-VLP或简单地与Fel d1融合蛋白F12H6GGC混合的CMV-Ntt830-VLP免疫三组雌性Balb/c小鼠。两种组合物都含有相同量的Fel d1融合蛋白。在 150mM PBS,pH 7.4中制备10μg的每种组合物,并在第0天和第14 天静脉内注射150μl的体积。第0天(免疫前)、第14天和第21天给小鼠放血,通过ELISA分析血清的天然Fel d1特异性IgG抗体。
用在PBS中1μg/ml浓度的天然Fel d1(Indoor Biotechnologies) 包被NUNCELISA板在4℃过夜。用Superblock(Invitrogen)封闭板。进行血清系列稀释以检测OD50。OD50描述达到最大OD值的一半的稀释度的倒数。用直接标记辣根过氧化物酶(HRPO)(Jackson) 的抗小鼠IgG抗体检测对Fel d1特异的IgG抗体。通过HRPO测量邻苯二胺二盐酸盐(OPD)的转化,在450nm处显色反应,温育7 分钟后加入5%硫酸(H2SO4)终止反应。
仅仅单次免疫后,在小鼠中检测到Fel d1特异性IgG抗体(第 14天)。第二次注射加强了应答。与混合组合物相比,Fel d1-CMV VLP 显著增加Fel d1特异性IgG抗体的诱导,表明Fel d1融合蛋白与VLP 的化学缀合的免疫增强作用(图9)。
实施例12
猫中对Fel d1-CMV VLP的免疫应答
为了研究Fel d1-CMV-Ntt830 VLP在靶物种中的免疫原性和功效,通过肌内途径(后肢)用100μg配制在PBS中的有佐剂(15μg 皂苷基质M;n=3)或无佐剂(n=3)的Fel d1-CMV-Ntt830 VLP免疫雌性欧洲短毛猫免疫3次(以21天的间隔)。
在免疫前和第22、43、58、71和85天收集血液。凝结和离心后,将血清样品冷冻保存直至测定。通过将无菌拭子插入嘴巴中以从动物收集唾液样品。这是在免疫前和第64和85天进行的。
A.在免疫的猫中测量针对(i)Fel d1和(ii)CMV载体的IgG 抗体。使用ELISA测定来检测来自免疫猫的血清中的(i)Fel d1和 (ii)CMV特异性IgG抗体。简述如下:
i)将在PBS中的1μg/ml天然Fel d1(Indoor Biotechnologies) 施加于NUNCELISA板过夜,然后将其用含2%BSA的PBS吐温20 (0.05%)洗涤并封闭。洗涤后,将系列稀释的猫血清施加到板上。进一步洗涤后,将用辣根过氧化物酶(HRPO)标记的山羊抗猫IgG抗体施加到板上。在最后的洗涤步骤之后,加入O-苯二胺二盐酸盐(OPD),7分钟后,用5%硫酸终止反应。在450nm处测量HRPO 的OPD转化。滴度报告为OD50,其是达到最大OD值的一半的稀释度的倒数。
在免疫之前,没有显著的抗Fel d1 IgG。在单次免疫后第22天检测到Fel d1特异性IgG。在第22天第二次免疫后,应答进一步增加,在第43天第三次注射施用后维持在高水平。此后抗体滴度缓慢下降。已经接受了与佐剂组合的Fel d1-CMV-Ntt830 VLP的猫获得了类似的结果(图10A)。
ii)在0.1M碳酸氢钠(pH9.6)中的1μg/ml黄瓜花叶病毒样颗粒 (CMVwt)施加于NUNCELISA板过夜。洗涤后,用2%BSA的PBS 吐温20(0.05%)封闭板。洗涤后,将系列稀释的猫血清施加到板上。进一步洗涤后,将用HRPO标记的山羊抗猫IgG抗体施加到板上。在最后的洗涤步骤之后,加入OPD,7分钟后,用5%硫酸终止反应。在450nm处测量HRPO的OPD转化。滴度报告为OD 50,其是达到最大OD值的一半的稀释度的倒数。
在免疫之前,没有显著的抗CMV IgG。单次免疫后第22天检测到CMV特异性IgG。第22天第二次免疫后,反应进一步增加,在第 43天第三次注射施加后维持在高水平。此后抗体滴度缓慢下降。已经接受具有佐剂的Fel d1-CMV-Ntt830 VLP的猫获得了类似的结果(图10B)。
B.在从免疫的猫收集的唾液中测定Fel d1和CMV-VLP特异性抗体。将1ml的PBST移液到棉拭子(用于收集唾液)上,在旋转混合器上以50rpm在RT下温育30分钟。通过在50mlFalcon管中使用筛(细胞过滤器,BD#352350)在4000rpm下离心10分钟来从拭子分离液体。收集流穿物并用于ELISA。
为了检测抗Fel d1 IgG和IgA抗体,使用间接ELISA方法。简而言之,将PBS中的1μg/ml天然Fel d1在4℃下施加于NUNC ELISA 板过夜,然后将其用2%BSA的PBS吐温20(0.05%)洗涤并封闭。洗涤后,将系列稀释(1:3)的唾液提取物施加到板上,随后洗涤板。为了检测IgG抗体,施加用HRPO标记的山羊抗猫IgG抗体。替代地,为了检测IgA抗体,将用HRPO标记的山羊抗猫IgA抗体加入板。在最后的洗涤步骤之后,加入OPD,7分钟后,用5%硫酸终止反应。在450nm处测量HRPO的OPD转化。
使用重组表达的CMVwtVLP包被的ELISA板类似地测量唾液 CMV特异性抗体。
在免疫后,在第64天从五只猫和第85天从所有六只猫测量高于个体免疫前基线水平的Fel d1特异性IgG抗体(图11A)。在第64 天从五只猫和第85天从五只猫测量高于个体免疫前基线水平的Fel d1特异性IgA抗体(图11B)。在第64天从五只猫和第85天从五只猫测量高于免疫前基线水平的CMV特异性IgG抗体(图11C)。在第64天从所有六只猫和第85天从所有六只猫测量CMV特异性 IgA抗体(图11D)。
C.在从免疫的猫收集的唾液中测定由内源Fel d1和抗Fel d1 IgA抗体组成的免疫复合物。将三种不同mAb(5μg/ml,在PBS中) 的混合物(特异性针对三种非重叠的Fel d1表位)包被在NUNC ELISA板上在4℃过夜。将板在室温下洗涤并封闭(2%BSA/PBST) 2小时。将纯的且系列稀释(1:3)的唾液提取物施加到板上。用来自AbD Serotec的山羊抗猫IgAAb-HRPO检测包含内源Fel d1和IgA 抗体的免疫复合物。在最后的洗涤步骤之后,加入OPD,7分钟后,用5%硫酸终止反应。在450nm处测量HRPO的OPD转化。
在所有的猫中,在第64天或第85天检测到高于免疫前基线水平的由内源Fel d1和IgA抗体组成的免疫复合物(图12)。
实施例13
来自Fel d1-CMV-Ntt830 VLP免疫的猫的唾液样品显示来自猫过敏患者的嗜碱性粒细胞脱颗粒减少
使用如实施例9所述的嗜碱性粒细胞活化测试测定Fel d1-CMV-Ntt830 VLP免疫接种抑制唾液Fel d1介导的嗜碱性粒细胞脱颗粒的能力。为此,如实施例12所述,收集并提取来自猫免疫前和后的唾液样品。使用50μl抗-FcεRImAb作为阳性对照或50μl来自猫免疫前和后的唾液样品进行嗜碱性粒细胞活化测试。
简而言之,将100μl刺激缓冲液与50μl EDTA处理的全血混合。另外,加入50μl来自免疫前和后(第85天)的猫的唾液样品或作为阳性对照的针对FcεRI的mAb。加入含有标记至PE的抗CCR3抗体和标记至FITC的抗CD63抗体的染色染料(每个样品20μl),并在 37℃温育25分钟。随后加入裂解缓冲液将红细胞裂解。温育10分钟后,将样品以500xg离心5分钟,并用洗涤缓冲液(含有2%FCS的 PBS)洗涤。第二次离心步骤后,将细胞沉淀悬浮于200μl洗涤缓冲液中,并使用流式细胞仪(FACS Calibur)获取。用Cell Quest Pro 软件分析样品。分析CCR3+嗜碱性粒细胞上CD63表达的百分数。
与免疫前的唾液提取物相比,来自免疫后第85天6只猫中的5 只的唾液提取物显示降低至多20%的脱颗粒水平(图13)。当外推至在所述嗜碱性粒细胞活化测试和所述猫过敏患者中用天然Fel d1 构建的滴定曲线时,脱颗粒降低20%相当于Fel d1浓度减少至十三分之一。这表明实现了唾液中致敏性Fel d1的显著降低。
实施例14
通过猫过敏性受试者的临床试验评估的猫免疫的效果
使用猫过敏性人受试者的滴定皮肤点刺试验来比较用Fel d1-CMV-Ntt830 VLP免疫猫前和后获得的猫毛提取物的过敏原性。
猫毛提取物的制备
在第1、22、43和256天,用100μg Fel d1-CMV-Ntt830 VLP(如实施例10所述制备,包含SEQ ID NO:25)皮下免疫三只雌性欧洲短毛猫。来自猫的毛样品在第1天免疫之前和第312天第四次免疫之后通过刷猫获得。收集的毛样品被冷冻储存直至制备。
为了制备毛提取物,将0.03g毛转移到提取小瓶(1.5ml管)中,并向小瓶中加入1ml含有0.05%吐温20的磷酸盐缓冲盐水。将提取管放入设定温度为23℃的恒温器中,以550rpm的转速温育1.5小时。温育后,将提取管转移至台式Eppendorf离心机并在RT下以16000xg 离心10分钟。将上清液转移至干净的1.5ml管中并冷冻保存直至分析。
皮肤点刺试验
在使用前不久解冻冷冻猫毛提取物(0.5ml Eppendorf管中的75μl 溶液),并用PBS-Tween 20稀释成三倍系列稀释液。
用猫毛提取物在左手臂前臂外侧使用常规的皮肤点刺试验来确认猫过敏性受试者的阳性过敏状态。
简要描述用于患者筛选和猫毛提取物评估的皮肤点刺试验。在前臂掌侧面上选择合适的皮肤区域进行测试。使用由市区药店提供的摩擦酒精使皮肤干净,干燥,免于脂肪、乳霜或化妆品。避免皮肤湿疹或炎症部位。刺点用皮肤标记笔标记和编号。避免肘部和手腕。两种过敏原提取物之间的垂直和水平距离至少为2厘米以避免交叉污染。使用20μlGilson移液器将猫毛溶液的液滴(10μl)置于皮肤的合适位置上。然后将皮肤点刺针压穿过小滴,将过敏原点刺入真皮内。施加压力大约一秒钟,并寻求所有应用的压力强度都是相同的。15分钟后,使用皮肤标记笔围绕每个风团的轮廓画圆圈。这些线是在风团周围的红色皮肤上绘制的,没有交叉或覆盖它的任何部分。确保没有围绕风团的红色皮肤部分出现在圆圈部分内。圆圈标记的副本是通过将透明的自粘胶带粘贴到风团上,然后将其粘贴在纸上以保持永久记录而获得的。计算了风团大小(mm2)的面积。
在每次患者就诊时,测试来自一只猫的稀释毛提取物。在免疫接种前采集的猫毛提取物在右臂上进行测试,在左臂上测试免疫接种后采集毛的猫毛溶液。
结果
单中心非盲临床研究中包括七个猫过敏患者(年龄18-65岁,男性和女性)。成功获得比较免疫接种前和免疫接种后毛提取物的(可能的21次中的)16次皮肤点刺试验的风团大小的比较。
对来自这16次皮肤点刺试验的平均风团大小的分析显示,从免疫的猫获得的毛提取物诱导的风团大小比免疫前收集的更小(图 14)。该数据表明猫毛提取物在用Fel d1-CMV-Ntt830 VLP免疫后较不具有过敏原性。
Claims (14)
1.一种组合物在降低猫过敏原性的方法中的用途,其中,将有效量的所述组合物施用于所述猫,并且其中,所述组合物包含:
(i)具有至少一个第一附着位点的黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的病毒样颗粒(VLP);
(ii)至少一个具有至少一个第二附着位点的Feld1蛋白;
其中,所述修饰的VLP包含至少一种修饰的CMV多肽,所述修饰的CMV多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示;
其中所述Fel d1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、或SEQ ID NO:29所示;
其中,所述病毒样颗粒和所述Feld1蛋白通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点共价连接。
2.根据权利要求1所述的组合物的用途,其中,所述降低所述猫过敏原性是通过在所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪中产生由Fel d1和Fel d1-抗体形成的免疫复合物来实现的,并且其中所述组合物的所述施用导致在所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪中所述免疫复合物的所述产生。
3.根据权利要求1所述的组合物的用途,其中所述降低所述猫的过敏原性是通过在所述猫的唾液中产生由Fel d1和Fel d1-抗体形成的免疫复合物来实现的,并且其中所述组合物的所述施用导致在所述猫的唾液中所述免疫复合物的所述产生。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物的用途,其中,所述修饰的CMV多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
5.一种组合物在制造用于降低猫过敏原性的组合物中的用途,所述组合物包含:
(i)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒;
(ii)至少一个具有至少一个第二附着位点的Feld1蛋白;并且
其中,所述病毒样颗粒和所述Feld1蛋白通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点连接;
其中,所述组合物如权利要求1至4中任一项所定义。
6.根据权利要求5所述的用途,其中,所述降低所述猫过敏原性是降低所述猫对暴露于所述猫的人的过敏原性,其中,所述降低所述猫对暴露于猫的人的过敏原性是(i)降低由所述人产生的过敏应答的水平或严重性,或(ii)减少所述人的至少一种过敏症状。
7.根据权利要求6所述的用途,其中所述人暴露于所述猫是所述人暴露于所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪。
8.根据权利要求6所述的用途,其中所述人暴露于所述猫是所述人暴露于所述猫的唾液。
9.根据权利要求6至8中所述任一项所述的用途,其中,(i)由所述人产生的过敏应答的水平或严重性的所述降低,或(ii)所述人的所述至少一种过敏症状的所述减少,由较少阳性的皮肤点刺试验、鼻激发试验或结膜激发试验表示,其中将所述施用之前和之后来自所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪用于所述皮肤点刺试验、鼻激发试验或结膜激发试验。
10.根据权利要求9所述的用途,其中将所述施用之前和之后来自所述猫的唾液用于所述皮肤点刺试验、鼻激发试验或结膜激发试验。
11.根据权利要求6至8中所述任一项所述的用途,其中,(i)由所述人产生的过敏应答的水平或严重性的所述降低,或(ii)所述人的所述至少一种过敏症状的所述减少由较少阳性的皮肤点刺试验表示,其中将所述施用之前和之后来自所述猫的唾液、毛、皮肤或眼泪用于所述皮肤点刺试验。
12.根据权利要求11所述的用途,其中将所述施用之前和之后来自所述猫的唾液用于所述皮肤点刺试验。
13.一种组合物,其包含:
(i)具有至少一个第一附着位点的病毒样颗粒(VLP);
(ii)至少一个具有至少一个第二附着位点的Feld1蛋白;
其中,所述病毒样颗粒和所述Feld1蛋白通过所述至少一个第一附着位点和所述至少一个第二附着位点共价连接,
其中,具有所述第二附着位点的所述Fel d1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:25或SEQID NO:27所示;
其中,所述VLP是黄瓜花叶病毒(CMV)的修饰的VLP,所述CMV的修饰的VLP包含至少一种修饰的CMV多肽,
其中,所述修饰的CMV多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示。
14.根据权利要求13所述的组合物,其中所述修饰的CMV多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示。
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