CN104411719A - 针对fel d1 的人源抗体及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了与猫过敏原Fel d1结合的抗体、包含所述抗体的组合物、编码所述抗体的核酸以及所述抗体的使用方法。根据本发明的某些实施方式，所述抗体是与Fel d1结合的全人源单克隆抗体。本发明的所述抗体可用于在体内结合Fel d1免疫原，从而阻止Fel d1免疫原与在肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面上预先形成的IgE结合。这样做时，所述抗体起到防止从肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞释放组胺和其他炎性介质，从而缓解敏感个体对猫过敏原的不良反应。本发明的所述抗体还可以用于确定患者是否对Fel d1猫过敏原过敏的诊断目的。

Description

针对FEL D1 的人源抗体及其使用方法
发明领域
本发明涉及能够与猫过敏原Fel d1特异性地结合的人源抗体和人源抗体的抗原结合片段，包含所述抗体的治疗组合物和这些抗体的使用方法。
相关技术的声明
Fel d1蛋白是分泌型的猫蛋白，其属于仅在哺乳动物中发现的小二硫化物连接的异源二聚体蛋白的分泌球蛋白家族(Klug,J.et al.(2000),Ann.N.Y.Acad.Sci.923:348-354)。它是在人类中导致猫过敏的主要原因(Platts-Mills,T.A.等，(1997),J.Allergy Clin.Immunol.100:S2-S24)。约90-95％对猫过敏的患者具有针对Fel d1蛋白的IgE应答(van Ree等，(1999),J.Allergy Clin.Immunol.104:1223-1230)。经受对Fel d1产生过敏应答的患者的症状可以从轻微的关节炎和结膜炎到威胁生命的哮喘反应。Fel d1由皮脂腺和鳞状腺和鳞状上皮细胞产生并且通过舔和梳毛转移至毛皮(Bartholome,K.等，(1985),J.Allergy Clin.Immunol.76:503-506；Charpin,C.等，(1991),J.Allergy Clin.Immunol.88:77-82；Dabrowski,A.J.(1990),等，J.Allergy Clin.Immunol.86:462-465)。其还存在于唾液腺、肛门腺和泪腺中(Andersen,M.C.等，(1985),J.Allergy Clin.Immunol.76:563-569；van Milligen,F.J.(1992)，等，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.92(4):375-378)并且似乎其主要储存库为皮肤和毛皮(Mata,P.等，(1992),Ann.Allergy 69(4):321-322)。
天然的Fel d1是约18kDa的异源二聚的糖蛋白。各异源二聚体均包含两条多肽链，其通过三个链间二硫键共价连接并且由两个独立的基因编码(Duffort,OA等，(1991),Mol.Immunol.28:301-309；Morgenstern,JP，等(1991),PNAS 88:9690-9694；Griffith,I.J.等，(1992),Gene 113:263-268；Kristensen,A.K.等，(1997),Biol.Chem.378:899-908)。链1包含70个氨基酸残基和链2包含约90-92个氨基酸残基。两条链在结构上是相似的，但是仅具有10-15％的序列一致性(Kaiser,L.等，(2003),J.Biol.Chem.278(39):37730-37735)。尽管有时将单独的各条链称为Fel d1，但是对于全蛋白过敏原而言需要这两条链。
Fel d1蛋白对动物具有未知的功能，但是导致敏感人群的IgG或IgE反应(称为过敏或哮喘反应)。尽管其他猫过敏原是已知的，包括Fel d2(白蛋白)和Fel d3(胱抑素)，但是60％-90％的抗猫IgE是直接针对Fel d1产生的(Leitermann,K.等，(1984),J Allergy Clin.Immunol.74:147-153；Lowenstein,H.等，(1985),Allergy 40:430-441；van Ree,R.等，(1999),J.Allergy Clin.Immunol.104:1223-1230；Ichikawa,K.等，(2011),Clin.Exp.Allergy,31:1279-1286)。
免疫球蛋白E(IgE)负责I型超敏反应，其表现为过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、花粉热、过敏性哮喘、蜂毒过敏和食物过敏。IgE在血液中循环并且与在嗜碱性和肥大细胞上的对IgE具有高亲和性的FcεR1α受体结合。在大部分的过敏反应中，过敏原通过吸入、摄食或通过皮肤进入机体。然后过敏原与预先已经与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的高亲和性受体结合的IgE结合，导致若干IgE分子交联并且触发导致各种过敏症状的组胺和其他炎性介质的释放。
过敏症的治疗包括用于抑制免疫活性的类固醇和用于减轻哮喘症状的支气管扩张剂。针对严重的过敏患者还使用脱敏疗法。肽疫苗组合已经过测试，用于特定过敏原例如Fel d1的个体脱敏(参见US2010/0239599A1和EP2380591A2)。已建议将抗体用于过敏症的治疗，因为其可能能够阻止过敏原分子进入粘膜组织，或者可以在过敏原有机会与结合于肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面上的高亲和性受体的IgE结合之前先与过敏原结合，从而阻止组胺和其他炎性介质从这些细胞中释放。
美国专利号5,670,626描述了单克隆抗体通过阻止过敏原与粘膜组织结合，用于治疗IgE介导的过敏性疾病如过敏性鼻炎、过敏性哮喘和过敏性结膜炎的用途。美国专利号6,849,259描述了使用过敏原特异性地抗体在过敏症的体内小鼠模型中抑制过敏性炎症。已对基于牛奶和基于蛋类的抗体系统进行了描述。例如，US20030003133A1公开了使用牛奶作为过敏原的载体诱导对猫鳞屑和其他过敏原的口服耐受。在US2010/0143266中描述了组合物和方法，通过使用抑制过敏原与肥大细胞结合能力的分子来降低在动物中对环境中的过敏原的过敏反应。de Groot等(de Groot等，(1988),J.Allergy Clin.Immunol.82:778-786)描述了针对Fel d1的其他抗体。
发明简述
本发明提供了一种与猫过敏原Fel d1特异性地结合的全人源单克隆抗体(mAb)及其抗原结合片段。在致敏的患者暴露于猫过敏原后，此类抗体可以用于在体内结合Fel d1过敏原，并且这样可以发挥促进Fel d1的清除或阻止所述过敏原与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面上预先结合的IgE结合的作用。通过这样的作用，本发明的抗体可以阻止组胺或其他炎性介质从肥大细胞或嗜碱性粒细胞释放，从而阻止或减轻在对所述猫过敏原敏感的患者中观察到的不利作用。在某些实施方式中，所述抗体可能能够在对所述Fel d1猫过敏原敏感的患者中减轻、最小化或阻止至少一种症状，如喷嚏、充血、鼻塞、咳嗽、气喘、支气管痉挛、鼻炎或结膜炎。在某些实施方式中，所述抗体可能能够在敏感个体中阻止甚至更加严重的与暴露于所述猫过敏原相关的体内并发症，如哮喘反应、过敏反应或者甚至死亡。
本发明的抗体可以是全长的(例如IgG1或IgG4抗体)或者可以仅包括抗原结合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，并且可以被修饰以影响其功能性，例如消除残留的效应器功能(Reddy等，(2000),J.Immunol.164:1925-1933)。
本发明的第一个方面提供了一种与Fel d1特异性地结合的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段是不同于IgA同种型的同种型。
在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段具有选自下组的同种型：IgG1、IgG2和IgG4。
在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段以等于或小于10-6M的KD与Fel d1特异性地结合。在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段以等于或小于1.8nM的KD与Fel d1特异性地结合。
在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重链CDR包含在任意一个选自下组的重链可变区(HCVR)序列中：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370和460；和三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述轻链CDR包含在任意一个选自下组的轻链可变区(LCVR)序列中：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378和468。用于鉴定HCVR和LCVR氨基酸序列中的CDR的方法和技术是本领域熟知的并且能够用于鉴定在本申请所公开的特定HCVR和/或LCVR氨基酸序列中的CDR。能够用于标识CDR的边界的示例性约定包括例如Kabat定义、Chothia定义和AbM定义。概括地说，Kabat定义是基于序列的变异性、Chothia定义是基于结构环区的位置而AbM定义是Kabat和Chothia方法之间的折中。参见例如Kabat,"Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学关注的蛋白序列)"National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)；Al-Lazikani等，(1997),J.Mol.Biol.273:927-948和Martin等，(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.USA86:9268-9272。还可以利用公共数据库鉴定抗体中的CDR序列。
在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重链CDR包含在任意一个选自下组的重链可变区(HCVR)序列中：SEQ ID NO：18、66、130、162、242、306、322、370和460；和三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述轻链CDR包含在任意一个选自下组的轻链可变区(LCVR)序列中：SEQ ID NO：26、74、138、170、250、314、330、378和468。
在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含具有选自下组的氨基酸序列的HCVR：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370和460。
在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含具有选自下组的氨基酸序列的HCVR：SEQ ID NO：18、66、130、162、242、306、322、370和460。
在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含具有选自下组的氨基酸序列的LCVR：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378和468。
在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含具有选自下组的氨基酸序列的LCVR：SEQ ID NO：26、74、138、170、250、314、330、378和468。
在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含：(a)HCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370和460；和(b)LCVR，所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378和468。
在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含：(a)HCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：18、66、130、162、242、306、322、370和460；和(b)LCVR，所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：26、74、138、170、250、314、330、378和468。
在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含：
(a)HCDR1结构域，所述HCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356、372和462；
(b)HCDR2结构域，所述HCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358、374和464；
(c)HCDR3结构域，所述HCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360、376和466；
(d)LCDR1结构域，所述LCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364、380和470；
(e)LCDR2结构域，所述LCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366、382和472；以及
(f)LCDR3结构域，所述LCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368、384和474。
在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含：
(a)HCDR1结构域，所述HCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：20、68、132、164、244、308、324、372和462；
(b)HCDR2结构域，所述HCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：22、70、134、166、246、310、326、374和464；
(c)HCDR3结构域，所述HCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：24、72、136、168、248、312、328、376和466；
(d)LCDR1结构域，所述LCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：28、76、140、172、252、316、332、380和470；
(e)LCDR2结构域，所述LCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：30、78、142、174、254、318、334、382和472；和
(f)LCDR3结构域，所述LCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：32、80、144、176、256、320、336、384和474。
在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，所述氨基酸序列对选自下组：SEQ ID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362、370/378和460/468。
在一个实施方式中，所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，所述氨基酸序列对选自下组：SEQ ID NO：18/26、66/74、130/138、162/170、242/250、306/314、322/330、370/378和460/468。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，所述氨基酸序列对选自下组：SEQ ID NO：18/26、66/74、130/138和和162/170。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，所述氨基酸序列对选自下组：SEQ ID NO：18/26和322/330。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，所述氨基酸序列对选自下组：SEQ ID NO：18/26和306/314。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，所述氨基酸序列对选自下组：SEQ ID NO：18/26和370/378。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，所述氨基酸序列对选自下组：SEQ ID NO：242/250和306/314。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，所述氨基酸序列对选自下组：SEQ ID NO：242/250和322/330。
在一个实施方式中，与Fel d1特异性地结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段与至少一个选自下组的氨基酸序列相互作用：SEQ ID NO:396的范围从约位置15至约位置24的氨基酸残基；SEQ ID NO:396的范围从约位置85至约位置103的氨基酸残基；SEQID NO:396的范围从约位置85至约位置104的氨基酸残基；和SEQ ID NO:396的范围从约位置113至约位置116的氨基酸残基。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段与SEQ IDNO:396的范围从约位置15至约位置24的氨基酸残基相互作用。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段与SEQ IDNO:396的范围从约位置85至约位置103的氨基酸残基相互作用。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段与SEQ IDNO:396的范围从约位置85至约位置104的氨基酸残基相互作用。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段与SEQ IDNO:396的范围从约位置113至约位置116的氨基酸残基相互作用。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段与选自下组的至少一个氨基酸序列相互作用：SEQ ID NO：402、403、404和412。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段与SEQ IDNO：402相互作用。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段与SEQ IDNO：403相互作用。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段与SEQ IDNO：404相互作用。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段与SEQ IDNO：426相互作用。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段与SEQ IDNO：412相互作用。
在一个实施方式中，与SEQ ID NO：402、403、404和/或426相互作用的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含包含在SEQ ID NO:18的重链可变区中的三个HCDR和包含在SEQ ID NO:26的轻链可变区中的三个LCDR。
在一个实施方式中，与SEQ ID NO：402、403、404和/或426相互作用的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：20中的HCDR1；SEQ ID NO：22中的HCDR2；SEQ ID NO：24中的HCDR3；SEQ ID NO：28中的LCDR1；SEQ ID NO：30中的LCDR2；和SEQ ID NO：32中的LCDR3。
在一个实施方式中，与SEQ ID NO：412相互作用的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含包含在SEQ ID NO：306的重链可变区中的三个HCDR和包含在SEQ ID NO：314的轻链可变区中的三个LCDR。
在一个实施方式中，与SEQ ID NO：412相互作用的所述分离的人源抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：308中的HCDR1；SEQ ID NO：310中的HCDR2；SEQ ID NO：312中的HCDR3；SEQ ID NO：316中的LCDR1；SEQ ID NO：318中的LCDR2；和SEQID NO：320中的LCDR3。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述人源抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：20、22和24中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列以及SEQ ID NO：28、30和32中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述人源抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：68、70和72中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列以及SEQ ID NO：76、78和80中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述人源抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：132、134和136中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列以及SEQ ID NO：140、142和144中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述人源抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：164、166和168中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列以及SEQ ID NO：172、174和176中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述人源抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：244、246和248中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列以及SEQ ID NO：252、254和256中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述人源抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：308、310和312中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列以及SEQ ID NO：316、318和320中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述人源抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：324、326中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列和328以及SEQ ID NO：332、334和336中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述人源抗体或其抗原结合片段包含SEQ ID NO：372、374和376中的HCDR1、HCDR2和HCDR3的氨基酸序列以及SEQ ID NO：380、382和384中的LCDR1、LCDR2和LCDR3的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明提供了一种与Fel d1结合的全人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段显示出一个或多个下述特性：(i)包含HCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：18、66、130、162、242、306、322、370和460，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；(ii)包含LCVR，所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：26、74、138、170、250、314、330、378和468，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；(iii)包含HCDR3结构域，所述HCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：24、72、136、168、248、312、328、376和466，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；和LCDR3结构域，所述LCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：32、80、144、176、256、320、336、384和474，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；(iv)包含HCDR1结构域，所述HCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：20、68、132、164、244、308、324、372和462，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；HCDR2结构域，所述HCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：22、70、134、166、246、310、326、374和464，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；LCDR1结构域，所述LCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：28、76、140、172、252、316、332、380和470，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；和LCDR2结构域，所述LCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：30、78、142、174、254、318、334、382和472，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；(v)以等于或低于10-6的KD与Fel d1结合，并且优选地等于或低于10-9；(vi)在至少一个过敏或炎症的动物模型中显示有效性；或(vii)与对照抗体竞争与Fel d1的结合。
在一个实施方式中，“对照抗体”可以包括例如具有选自下组的重链和轻链氨基酸序列对的组合的抗体：18/26、66/74、130/138、162/170、242/250、306/314、322/330、370/378和460/468。
在一个实施方式中，与Fel d1结合的所述全人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCDR1序列，所述序列包含式X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8(SEQ ID NO:386)，其中X1是Gly，X2是Phe、Tyr或Gly，X3是Thr或Ser，X4是Phe或Ile，X5是Ser、Arg、Thr或Asn，X6是Asn、Thr、Asp或Ser，X7是Tyr和X8是Asn、Tyr或Ala；HCDR2序列，所述序列包含式X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8(SEQ ID NO:387)，其中X1是Ile，X2是Tyr、Ser或Asn，X3是Tyr、Ser、Gly、Pro或Asp，X4是Asp、Arg或Ser，X5是Gly、Val或Ser，X6是Ser、Gly、Arg或Tyr，X7是Tyr、Arg、Thr、Ser或Asn，和X8是Ile、Thr、Ala、Ser或无；HCDR3序列，所述HCDR3序列包含式X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8–X9–X10–X11-X12–X13–X14–X15–X16(SEQ ID NO:388)，其中X1是Ala，X2是Lys或Arg，X3是Arg、Gly、His、Ser、Asp、Leu或Thr，X4是Thr、Pro、Arg、Gly或Glu，X5是Leu、Val、Gly、Lys、Tyr或Asn，X6是Ser、Arg、Thr、Ala、Tyr、Phe或Trp，X7是Tyr、Gly、Arg、Ala、Asn、Asp、His或Asn，X8是Tyr、Thr、Ser或His，X9是Val、Ser、Ala、Phe、Pro或无，X10是Met、Gly、Asp、Pro、Val或无，X11是Asp、Tyr、Ser、Gly、Phe或无，X12是Val、Asp、Phe或无，X13是Phe、Asp或无，X14是Phe、Tyr或无，X15是Asp或无，X16是Tyr或无；LCDR1序列，所述LCDR1序列包含式X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8–X9–X10–X11-X12(SEQ ID NO:389)，其中X1是Gln，X2是Gly、Ser或Asp，X3是Ile或Val，X4是Ser、Leu、Asn或Gly，X5是Asn、Tyr、Gly或Ser，X6是Tyr、Ser、Phe或Trp，X7是Ser或无，X8是Asn或无，X9是Asn或无，X10是Lys或无，X11是Gln或无，X12是Tyr或无；LCDR2序列，所述序列包含式X1–X2–X3(SEQ ID NO:390)，其中X1是Ala、Trp、Asp、Tyr、Lys、Gly或Ser，X2是Ala或Thr，和X3是Ser；和LCDR3序列，所述LCDR3序列包含式X1–X2–X3–X4–X5–X6–X7–X8–X9(SEQ ID NO:391)，其中X1是Gln、Leu或His，X2是Lys、Gln或His，X3是Tyr、Ser或Leu，X4是Tyr、Asn、Gly、Asp或Ser，X5是Ser、Asp或Asn，X6是Leu、Ala、Tyr、Thr或Phe，X7是Pro或Arg，X8是Leu、Phe、Tyr或Thr并且X9是Thr或无。
在一个实施方式中，本发明涉及特异性地针对Fel d1的人源抗体或其抗原结合片段，所述人源抗体或其抗原结合片段包含由来源于VH、DH和JH种系序列的核苷酸序列编码的HCVR，和由来源于VK和JK种系序列的核苷酸序列区段编码的LCVR，其组合如表2所示。
本发明包含具有经修饰的糖基化类型的抗体。在一些应用中，修饰以除去不需要的糖基化位点可能是有用的，或者例如除去岩藻糖部分以增加抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参见Shield等，(2002)JBC 277:26733)。在其他应用中，可以进行半乳糖苷化修饰以改变补体依赖性细胞毒性(CDC)。
本申请的第二个方面提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与含有重链可变区(HCVR)的互补性决定区(CDR)和轻链可变区(LCVR)的CDR的抗体或其抗原结合片段竞争与Fel d1的特异性的结合，其中所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370和460，其中所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378和468。
本申请的一个实施方式提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与含有重链可变区(HCVR)的互补性决定区(CDR)和轻链可变区(LCVR)的CDR的抗体或其抗原结合片段竞争与Fel d1的特异性的结合，其中所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：18、66、130、162、242、306、322、370和460，其中所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：26、74、138、170、250、314、330、378和468。
在一个相关的实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与含有包含在选自下组的重链和轻链序列对中的重链和轻链CDR的抗体或抗原结合片段竞争与Fel d1的特异性的结合，其中所述重链和轻链CDR包含在选自下组的重链和轻链序列对中：SEQ ID NO：18/26、66/74、130/138、162/170、242/250、306/314、322/330、370/378和460/468。
本申请的第三个方面提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与含有重链可变区(HCVR)的互补性决定区(CDR)和轻链可变区(LCVR)的CDR的抗体或其抗原结合片段结合Fel d1上的相同表位，其中所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354、370和460，其中所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378和468。
本申请的一个实施方式提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与含有重链可变区(HCVR)的互补性决定区(CDR)和轻链可变区(LCVR)的CDR的抗体或其抗原结合片段结合Fel d1上的相同表位，其中所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：18、66、130、162、242、306、322、370和460，其中所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362、378和468。
在相关的实施方式中，本发明提供了一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与含有包含在选自下组的重链和轻链序列对中的重链和轻链CDR的抗体或抗原结合片段结合Fel d1上的相同表位，其中所述重链和轻链CDR包含在选自下组的重链和轻链序列对中：SEQ ID NO：18/26、66/74、130/138、162/170、242/250、306/314、322/330、370/378和460/468。
本申请的第四个方面提供了一种与Fel d1特异性地结合的双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合结构域(两个臂)，所述抗原结合结构域包含来自任意两个或多个本文所述的抗体的HCVR氨基酸序列和LCVR氨基酸序列。
在一个实施方式中，所述双特异性抗原结合分子包含第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:370所示的HCVR氨基酸序列和如SEQ ID NO:378所示的LCVR氨基酸序列，及第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含如SEQ IDNO:18所示的HCVR氨基酸序列和如SEQ ID NO:378所示的LCVR氨基酸序列。
在一个实施方式中，所述双特异性抗原结合分子包含分别由SEQ ID NO：372、374和376所示的氨基酸序列组成的三个重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，和分别由SEQ ID NO：380、374和376所示的氨基酸序列组成的三个轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)；以及其中所述第二抗原结合结构域包含分别由SEQ ID NO：20、22和24所示的氨基酸序列组成的三个重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，和分别由SEQ ID NO：380、382和384所示的氨基酸序列组成的三个轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
在一个实施方式中，所述双特异性抗原结合分子包含第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:306所示的HCVR氨基酸序列和如SEQ ID NO:314所示的LCVR氨基酸序列，及第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含如SEQ IDNO:18所示的HCVR氨基酸序列和如SEQ ID NO:314所示的LCVR氨基酸序列。
在一个实施方式中，所述双特异性抗原结合分子包含分别由SEQ ID NO：308、310和312所示的氨基酸序列组成的三个重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，和分别由SEQ ID NO：316、318和320所示的氨基酸序列组成的三个轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)；以及其中所述第二抗原结合结构域包含分别由SEQ ID NO：20、22和24所示的氨基酸序列组成的三个重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，和分别由SEQ ID NO：316、318和320所示的氨基酸序列组成的三个轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
在一个实施方式中，本发明提供了一种与Fel d1特异性地结合的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与任意一个本发明的双特异性抗原结合分子竞争与Fel d1的特异性的结合。
在一个实施方式中，本发明提供了一种与Fel d1特异性地结合的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与任意的本发明的双特异性抗原结合分子结合Feld1上的相同表位。
在一个实施方式中，所述双特异性抗原结合分子是与Fel d1特异性地结合的分离的人源单克隆抗体。
在一个实施方式中，所述双特异性抗原结合分子是与Fel d1特异性地结合的分离的人源单克隆抗体，其中所述人源单克隆抗体是单特异性抗体或双特异性抗体。
在一个实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含至少一种本申请所述的双特异性抗原结合分子和药学上可接受的载体或稀释剂。
在一个实施方式中，本发明提供了一种治疗对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者对Feld1蛋白敏感或产生过敏反应的患者的方法，或者治疗与对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者对Fel d1蛋白敏感或产生过敏反应相关的至少一种症状或并发症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予有效量的本发明的一种或多种双特异性抗原结合分子；或者含有有效量的本发明的一种或多种双特异性抗原结合分子的药物组合物，其中在给予所述双特异性抗原结合分子后，或给予含有前述本发明的抗体或双特异性结合分子的组合物后，病人针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感性降低或产生的过敏反应被阻止，或者针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白不发生任何敏感或产生过敏反应，或者针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应相关的至少一种症状或并发症降低，或者针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应的频率和/或持续时间降低。
在一个实施方式中，本发明提供了将有效量的第二治疗剂与至少一种本发明的双特异性抗原结合分子联用，用于减轻针对猫、猫皮屑、猫毛或者针对Fel d1蛋白产生的过敏反应。所述第二治疗剂可以选自下组：皮质类固醇、支气管扩张剂、抗组胺剂、肾上腺素、减充血剂、另一种针对Fel d1的不同抗体和肽疫苗。
在一个实施方式中，单独使用一种或多个本发明的双特异性抗原结合分子的治疗，或与第二治疗剂联用的治疗，可以使得患者在暴露于猫、毛皮屑或Fel dl蛋白后的过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性哮喘或过敏反应减轻。
在第五个方面，本发明提供了编码Fel d1抗体或其片段的核酸分子。在本发明中还包括携带本发明的核酸的重组表达载体，以及引入了此类载体的宿主细胞，以及在能够产生所述抗体的条件下通过培养所述宿主细胞生产所述抗体并且回收所生产的抗体的方法。
在一个实施方式中，本发明提供了抗体或其片段，所述抗体或其片段包含HCVR，所述HCVR由选自下组的核酸序列所编码：SEQ ID NO：1、17、33、49、65、81、97、113、129、145、161、177、193、209、225、241、257、273、289、305、321、337、353、369和459，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性的基本上一致的序列。
在一个实施方式中，所述HCVR由选自下组的核酸序列所编码：SEQ ID NO：17、65、129、161、241、305、321、369和459。
在一个实施方式中，所述抗体或其片段还包含LCVR，所述LCVR由选自下组的核酸序列所编码：SEQ ID NO：9、25、41、57、73、89、105、121、137、153、169、185、201、217、233、249、265、281、297、313、329、345、361、377和467，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性的基本上一致的序列。
在一个实施方式中，所述LCVR由选自下组的核酸序列所编码：SEQ ID NO：25、73、137、169、249、313、329、377和467。
在一个实施方式中，本发明还提供了一种抗体或抗体的抗原结合片段，所述抗体或抗体的抗原结合片段包含HCDR3结构域，所述HCDR3结构域由选自下组的核苷酸序列所编码：SEQ ID NO：7、23、39、55、71、87、103、119、135、151、167、183、199、215、231、247、263、279、295、311、327、343、359、375和465，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性的基本上相似的序列所编码；和LCDR3结构域，所述LCDR3结构域由选自下组的核苷酸序列：SEQ ID NO：15、31、47、63、79、95、111、127、143、159、175、191、207、223、239、255、271、287、303、319、335、351、367、383和473，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性的基本上相似的序列。
在一个实施方式中，本发明提供了一种抗体或其片段，所述抗体或其片段包含HCDR1结构域，所述HCDR1结构域由选自下组的核苷酸序列所编码：SEQ ID NO：3、19、35、51、67、83、99、115、131、147、163、179、195、211、227、243、259、275、291、307、323、339、355、371和461，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性的基本上相似的序列；HCDR2结构域，所述HCDR2结构域由选自下组的核苷酸序列所编码：SEQ ID NO：5、21、37、53、69、85、101、117、133、149、165、181、197、213、229、245、261、277、293、309、325、341、357、373和463，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性的基本上相似的序列；LCDR1结构域，所述LCDR1结构域由选自下组的核苷酸序列所编码：SEQ ID NO：11、27、43、59、75、91、107、123、139、155、171、187、203、219、235、251、267、283、299、315、331、347、363、379和469，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性的基本上相似的序列；以及LCDR2结构域，所述LCDR2结构域由选自下组的核苷酸序列所编码：SEQ ID NO：13、29、45、61、77、93、109、125、141、157、173、189、205、221、237、253、269、285、301、317、333、349、365、381和471，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同源性的基本上相似的序列。
本申请的第六个方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的一种或多种与Fel d1特异性地结合的分离的人源抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方式中，所述药物组合物包含治疗有效量的两种或多种与Fel d1特异性地结合的分离的人源抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的赋形剂。
在一个实施方式中，所述药物组合物包含：
a)与Fel d1特异性地结合的分离的第一全人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的HCVR和具有如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的LCVR；和
b)与Fel d1特异性地结合的分离的第二全人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：66、130、162、306、322、370和460；和LCVR，所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：74、138、170、314、330、378和468。
在一个实施方式中，所述药物组合物包含：
a)与Fel d1特异性地结合的分离的第一全人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ ID NO:242所示的氨基酸序列的HCVR和具有如SEQ ID NO:250所示的氨基酸序列的LCVR；和
b)与Fel d1特异性地结合的分离的第二全人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：306、322和460；和LCVR，所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：314、330和468。
在一个实施方式中，所述药物组合物包含：
与Fel d1特异性地结合的分离的第一全人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含含有SEQ ID NO:18/26的HCVR/LCVR氨基酸序列对；和
与Fel d1特异性地结合的分离的第二全人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：66/74、130/138、162/170、306/314、322/330、370/378和460/468。
在一个实施方式中，所述药物组合物包含：
与Fel d1特异性地结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:18/26组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对；和
与Fel d1特异性地结合的分离的第二全人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:130/138组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在一个实施方式中，所述药物组合物包含：
与Fel d1特异性地结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:18/26组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对；和
与Fel d1特异性地结合的分离的第二全人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:322/330组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在一个实施方式中，所述药物组合物包含：
与Fel d1特异性地结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:18/26组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对；和
与Fel d1特异性地结合的分离的第二全人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:306/314组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在一个实施方式中，所述药物组合物包含：
a)与Fel d1特异性地结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:18/26组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对；和
b)与Fel d1特异性地结合的分离的第二人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:370/378组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在一个实施方式中，所述药物组合物包含：
与Fel d1特异性地结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:242/250组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对；和
与Fel d1特异性地结合的分离的第二人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：306/314和322/330。
在一个实施方式中，所述药物组合物包含：
与Fel d1特异性地结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:242/250组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对；和
与Fel d1特异性地结合的分离的第二人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:306/314组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在一个实施方式中，所述药物组合物包含：
a)与Fel d1特异性地结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:242/250组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对；和
b)与Fel d1特异性地结合的分离的第二人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含由SEQ ID NO:322/330组成的HCVR/LCVR氨基酸序列对。
在一个实施方式中，所述药物组合物包含两种或多种与Fel d1特异性地结合的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NOs：18/26、66/74、130/138、162/170、242/250、306/314、322/330、370/378和460/468。
在一个实施方式中，所述药物组合物包含四个与Fel d1特异性地结合的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述人源抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：18/26、66/74、130/138和162/170。
在一个实施方式中，本发明涉及一种组合物，所述组合物是治疗有效量的一种或多种本发明的抗-Fel d1抗体或其抗原结合片段和治疗有效量的第二种治疗剂的组合。
所述第二种治疗剂可以是小分子药物、蛋白/多肽、抗体、核酸分子，如反义分子或siRNA。所述第二种治疗剂可以是合成的或天然来源的。
所述第二种治疗剂可以是与本发明的抗体或其片段有利地联用的任意药剂，例如能够阻断Fel d1与肥大细胞或嗜碱性粒细胞上存在的IgE结合的不同于本发明所述的那些的另一种抗体。第二种治疗剂还可以是用于作为治疗针对任意抗原的过敏反应的标准疗法的任意药剂。此类第二种治疗剂可以是抗组胺剂、肾上腺素、减充血剂、皮质类固醇或肽疫苗。
在某些实施方式中，所述第二种治疗剂可以是有助于消除或减轻与本发明所述的抗体或其抗原结合片段相关的任意可能的副作用的药剂，如果会发生此类副作用的话。
还应理解，本发明的抗体和药学上可接受的组合物可以用于联合疗法中，也就是说，所述抗体和药学上可接受的组合物可以与一种或多种其他所需的治疗剂或医疗程序同时、在其之前或之后施用。在联用方案中使用的特定疗法(治疗剂或程序)的组合将考虑与所需的疗法和/或程序具有相容性并且能够达到所需的治疗效果。还应理解，所使用的疗法针对相同病症可以达到所需的效果(例如，可以将抗体与用于治疗相同病症的另一种药剂同时给予)，或其可以达到不同的效果(例如控制任何不良反应)。如本申请中使用的，在正常情况下给予治疗或预防特定疾病或状况的附加治疗剂适用于待治疗的所述疾病或状况。
当同时施用多种疗法时，根据相关领域的公知常识，可以相应地调整给药剂量。
本发明的第七个方面提供了一种治疗对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者对Fel d1蛋白敏感或产生过敏反应的患者的方法，或者治疗与对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者对Fel d1蛋白敏感或产生过敏反应相关的至少一种症状或并发症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予有效量的与Fel d1特异性结合的一种或多种分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段；或者含有有效量的与Fel d1特异性地结合的一种或多种分离的人源单克隆抗体或其片段的药物组合物；或有效量的一种或多种双特异性抗原结合分子；或者含有有效量的一种或多种双特异性抗原结合分子的药物组合物，其中在给予与Fel d1特异性地结合的一种或多种所述分离的人源单克隆抗体或其片段后，或给予与Fel d1特异性地结合的一种或多种所述双特异性抗原结合分子后，或给予含有任意一种或多种前述抗体或双特异性结合分子的组合物后，针对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应被阻止，或其严重程度和/或持续时间降低，或者与针对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应相关的至少一种症状或并发症被阻止或缓解，或者针对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应的频率和/或持续时间或严重程度降低。
在一个实施方式中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含与Fel d1特异性地结合的一种或多种本发明的抗体，或一种或多种双特异性抗原结合分子，所述药物组合物用于治疗显示出对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者对Fel d1蛋白敏感或产生过敏反应的患者，或者用于治疗与对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者对Fel d1蛋白敏感或产生过敏反应相关的至少一种症状或并发症，其中针对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应被阻止，或其严重程度和/或持续时间降低，或者与针对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应相关的至少一种症状或并发症被阻止或缓解，或者针对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应的频率和/或持续时间或严重程度降低。
在一个实施方式中，本发明提供了使用包含特异性地与Fel d1结合的一种或多种本发明的抗体或一种或多种双特异性抗原结合蛋白分子的药物组合物在制备用于治疗显示出对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者对Fel d1蛋白敏感或产生过敏反应的患者，或者用于治疗与对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者对Fel d1蛋白敏感或产生过敏反应相关的至少一种症状或并发症的药物中的用途，其中针对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应被阻止，或其严重程度和/或持续时间降低，或者与针对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应相关的至少一种症状或并发症被阻止或缓解，或者针对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应的频率和/或持续时间或严重程度降低。
在一个实施方式中，本发明提供了如上文所述的药物组合物的用途，其中将所述组合物与第二种治疗剂联合给予，用于减轻对猫、猫皮屑、猫毛提取物或者对Fel d1蛋白的过敏反应。在一个实施方式中，本发明提供了如上文所述的药物组合物的用途，其中所述第二治疗剂选自皮质类固醇、支气管扩张剂、抗组胺剂、肾上腺素、减充血剂、针对Fel d1的另一种不同抗体和肽疫苗。
在某些实施方式中，与Fel d1特异性地结合的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子可能能够在对Fel d1猫过敏原敏感的患者中减轻、最小化或阻止至少一种症状，如喷嚏、充血、鼻塞、咳嗽、气喘、支气管痉挛、鼻炎或结膜炎。
在一个实施方式中，与Fel d1特异性地结合的本发明的抗体或双特异性抗原结合分子，或者包含与Fel d1特异性地结合的一种或多种本发明的抗体或者一种或多种抗原结合分子的组合物可以用于预防与对Fel d1过敏相关的更严重的体内并发症，包括哮喘反应、过敏性休克或甚至是由过敏反应导致的死亡。
在一个实施方式中，所述药物组合物与第二种治疗剂联合给予患者。
在另一个实施方式中，所述第二种治疗剂选自下组：抗组胺剂、肾上腺素、减充血剂、皮质类固醇、针对Fel d1的另一种不同的抗体、肽疫苗和任意其他的用于减轻过敏反应的严重程度或用于改善与所述过敏反应相关的至少一种症状的姑息疗法。
通过对随后的详细描述的回顾，其他实施方式会更清楚。
详述
在对本发明的方法进行描述以前，应理解本发明不限于所描述的特定方法和实验条件，因为此类方法和条件是可以改变的。应理解本申请中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并非旨在限定，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求进行限定。
除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属技术领域普通技术人员的通常理解相同的含义。在本申请中使用的术语“约”当用于指一个特定列举的数值时意味着该值可以在所列举值的不超过1％的范围内变动。例如，在本申请中使用的表述“约100”包括99和101以及其间的所有值(例如99.1、99.2、99.3、99.4等)。
尽管与本申请中描述的那些类似或等效的任意方法和材料均可以用于实践或测试本发明，但是现在将描述优选的方法和材料。
定义
在本申请中使用的术语“Fel d1”或“FELD1”指至少一种Fel d1蛋白，其是自然/天然形式的，或重组生产的。所述Fel d1蛋白包含或者由Fel d1的链1(也称为链A)(SEQID NO:392)和Fel d1的链2(也称为链B)(SEQ ID NO:393)组成。天然的Fel d1蛋白是约18kDa的异源二聚体糖蛋白，其由来源于两个独立的基因的两条链组成(参见Duffort,O.A.等，(1991),Mol.Immunol.28:301-309；Kristensen,A.K.等，(1997),Biol.Chem.378:899-908；Kaiser L.等，(2003),J.Biol.Chem.278(39):37730-37735)。重组生产的Fel d1蛋白还如SEQ ID NO:396所示，其中该序列含有GenBank登录号为NP_001041619.1的Feld1链B的氨基酸残基18至109(无信号序列)与GenBank登录号为NP_001041618.1的Fel d1链A的氨基酸残基19-88(无信号序列并且具有D27G突变，所述D27G突变对应于SEQ ID NO:396的101位置的甘氨酸)的融合。本发明的其他重组生产的Fel d1构建体举例于SEQ ID NO：385、394、395和397中。
Fel d1的“链1”或“链A”是包含或者由SEQ ID NO:392的氨基酸序列或其同源性序列组成的多肽。在本申请中使用的术语SEQ ID NO:392的同源性序列指与SEQ ID NO:392具有高于70％、优选地高于80％、更优选地高于90％和甚至更优选地高于95％的一致性的多肽。Fel d1链1的氨基酸序列还以登录号P30438或登录号NP_001041618.1提供在GenBank中，其中还包括了在成熟蛋白中被除去的信号肽。
Fel d1的“链2”或“链B”是包含或者替代地由SEQ ID NO:393的氨基酸序列或其同源性序列组成的多肽。在本申请中使用的术语SEQ ID NO:393的同源性序列指与SEQ IDNO:393具有高于70％、优选地高于80％、更优选地高于90％和甚至更优选地高于95％的一致性的多肽。Fel d1链2的氨基酸序列还以登录号P30440或登录号NP_001041619.1提供在GenBank中，其中包括了在成熟蛋白中被除去的信号肽。
在本申请中使用的术语“Fel d1片段”指包含或者由Fel d1的至少一个抗原位点组成的多肽。在一个实施方式中，在本申请中使用的术语“Fel d1片段”指包含或者由Fel d1的至少两个抗原位点组成的多肽。在一个实施方式中，所述抗原位点是共价连接的。在一个实施方式中，所述抗原位点通过至少一个肽键连接。在一个实施方式中，所述两个抗原位点通过至少一个肽键和所述抗原位点之间的间隔区(spacer)连接。在一个实施方式中，所述至少两个抗原位点既来自Fel d1的链1和又来自Fel d1的链2。在一个实施方式中，所述至少两个抗原位点包含GenBank登录号P30438的氨基酸序列23-92和GenBank登录号P30440的氨基酸序列18-109。在一个实施方式中，所述至少两个抗原位点既来自Fel d1的链1和又来自Fel d1的链2。在一个实施方式中，所述至少两个抗原位点包含GenBank登录号NP_001041618.1的氨基酸序列19-88和GenBank登录号NP_001041619.1的氨基酸序列18-109。在一个实施方式中，所述至少两个抗原位点包含在SEQ ID NO：385、394、395、396或397以内的任何一个氨基酸序列。在一个实施方式中，任意的所述Fel d1片段均能够在体内诱导产生与天然存在的Fel d1或者与重组产生的Fel d1特异性地结合的抗体。
在本申请中使用的术语“抗体”指任意抗原结合分子或分子复合物，其包含至少一个与特定抗原(例如Fel d1)特异性地结合或相互作用的互补性决定区(CDR)。在本申请中使用的术语“抗体”旨在指由两条重链(H)和两条轻链(L)之间通过二硫键连接的四条多肽链组成的免疫球蛋白分子(即“全抗体分子”)及其多聚体(例如IgM)或其抗原结合片段。各条重链由重链可变区(“HCVR”或“VH”)和重链恒定区(由结构域CH1、CH2和CH3组成)组成。各条轻链由轻链可变区(“LCVR”或“VL”)和轻链恒定区(CL)组成。所述VH和VL区可以进一步细分为高变区，也称为互补性决定区(CDR)，其分散在称为框架区(FR)的更加保守的区域中。各VH和VL由三个CDR和四个FR组成，其从氨基末端到羧基末端按照下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本发明的某些实施方式中，所述抗体(或其抗原结合片段)的FR可以与人源种系序列相同，或者可以是天然的或经人工修饰的。可以基于对两个或多个CDR的并行(side-by-side)分析定义氨基酸的共有序列。
也可以取代一个或多个CDR残基或去除一个或多个CDR。在科学文献中已经描述了一些抗体，其中的一个或两个CDR对结合而言可以去除。Padlan等(1995FASEB J.9:133-139)基于已发表的晶体结构分析了抗体与其抗原之间的接触区并且得出结论，实际上仅有约五分之一至三分之一的CDR残基与所述抗原接触。Padlan还发现多种抗体，其中的一个或两个CDR中没有氨基酸与抗原接触(亦参见Vajdos等，(2002),J Mol Biol320:415-428)。
不接触抗原的CDR残基可以基于此前的研究(例如在CDRH2中的残基H60-H65通常是不需要的)通过分子建模和/或经验从Chothia CDR以外的Kabat CDR区中鉴定。如果CDR或其残基被省略，则其通常被在另一个人源抗体序列或此类序列中占据相应位置的氨基酸取代。在CDR中的取代位置和取代用的氨基酸也可以根据经验选择。经验取代可以是保守的或非保守的取代。
在本申请中所公开的与Fel d1特异性地结合的全人源单克隆抗体与相应的种系序列相比，可以在重链和轻链可变结构域的框架和/或CDR区中包含一个或多个氨基酸取代、插入和/或缺失。通过将本申请所公开的氨基酸序列与从例如公共抗体序列数据库中获得的种系序列进行比较能够容易地确定此类突变。本发明包括抗体及其抗原结合片段，其来源于任意本申请所公开的氨基酸序列，其中在一个或多个框架和/或CDR区中的一个或多个氨基酸被突变为所述抗体来源的种系序列的相应残基，或另一种人源种系序列的相应的残基。或者所述相应的种系残基的保守的氨基酸取代(在本申请中将此类序列统称为“种系突变”)。本领域的普通技术人员以本申请所公开的重链和轻链可变区序列作为起始能够容易地生产多种抗体和抗原结合片段，所述抗体和抗原结合片段包含一个或多个单独的种系突变或其组合。在某些实施方式中，在所述VH和/或VL结构域中的全部框架和/或CDR残基均突变回在所述抗体源自的原始种系序列中存在的残基。在其他实施方式中，仅某些残基突变回原始种系序列，例如仅在FR1的前8个氨基酸或在FR4的后8个氨基酸中存在突变的残基，或者仅在CDR1、CDR2或CDR3中存在突变的残基。在其他实施方式中，一个或多个框架和/或CDR残基突变为不同种系序列中的相应的残基(即该种系序列不同于所述抗体原始来源的种系序列)。而且，本发明的抗体在框架和/或CDR区中可以包含两种或多种种系突变的任意组合，例如某些个别的残基突变成特定种系序列的相应残基，而不同于原始种系序列的某些其他残基仍保持不变或突变成不同种系序列的相应残基。一旦获得，能够针对一个或多个所需的性质容易地对含有一个或多个种系突变的抗体和抗原结合片段进行检测，如改善的结合特异性、增加的结合亲和性、改善的或增加的拮抗或激动的生物学性质(可视情况而定)、降低的免疫原性等。采用这种一般方法获得的抗体和抗原结合片段包含在本发明中。
本发明还包括全人源单克隆抗体，所述全人源单克隆抗体包含本申请所公开的任意HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列的具有一个或多个保守的取代的变体。例如，本发明包括抗体，所述抗体相对于本申请所公开的任意HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列具有带有例如10个或更少的、8个或更少的、6个或更少的、4个或更少的等等保守的氨基酸取代的HCVR、LCVR和/或CDR氨基酸序列。
在本申请中使用的术语“人源抗体”旨在包括具有来源于人源种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人源mAb例如在CDR中和特别是在CDR3中可以包括不是由人源种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在体外由随机或位点特异性诱变作用或者在体内由体细胞突变引入的突变)。然而，在本申请中使用的术语“人源抗体”并不旨在包括来源于另一个哺乳动物物种(例如小鼠)种系的CDR序列已被移植上人FR序列的mAb。
在本申请中使用的表述“抗原结合分子”指蛋白、多肽或分子复合物，包含或由至少一个互补性决定区(CDR)组成，其独自或与一个或多个其他的CDR和/或框架区(FR)联合后特异性地与特定抗原结合。在某些实施方式中，抗原结合分子是根据本申请其他部分所定义的那些术语的抗体或抗体的片段。
在本申请中使用的表述“双特异性抗原结合分子”指蛋白、多肽或分子复合物，其至少包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域(即两个臂)。在所述双特异性抗原结合分子中的各个抗原结合结构域均包含至少一个CDR，其独自或者与一个或多个其他CDR和/或FR联合后特异性地结合特定抗原。在本发明的上下文中，所述第一抗原结合结构域特异性地结合Fel d1上的第一抗原，以及所述第二抗原结合结构域特异性地结合Fel d1上的第二个不同的抗原。
术语“特异性地结合”或“特异性地与……结合”等类似表达指抗体或其抗原结合片段与抗原在生理条件下形成相对稳定的复合物。特异性地结合可表征为平衡解离常数为至少约1x10-6M或更小(例如KD越小表示结合越紧密)。用于确定两个分子是否特异性地结合的方法是本领域的公知常识，包括例如平衡透析、表面等离子体共振等。如本申请所公开的，已通过表面等离子体共振例如BIACORETM对抗体进行了鉴定，其与Fel dl特异性地结合。而且，如本申请所使用的，将与Fel d1和一种或多种其他抗原结合的多特异性抗体或与Fel d1的两个不同区域(例如Fel d1的链1和/或链2)结合的双特异性抗体也认为是“特异性地结合”的抗体。
术语“高亲和性”抗体指根据表面等离子体共振例如BIACORETM或溶液亲和性ELISA检测，具有至少10-8M；优选地10-9M；更优选地10-10M，甚至更优选地10-11M，甚至更优选地10-12M的与Fel d1的结合亲和性(以KD表示)的mAb。
术语“缓慢解离速率”、“Koff”或“kd”指根据表面等离子体共振例如BIACORETM的检测，以1x 10-3s-1或更低的，优选地1x 10-4s-1或更低的速率常数从Fel d1上解离的抗体。
在本申请中使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等类似表达包括特异性地与抗原结合以形成复合物的任意天然存在的、酶促获得的、合成的或基因工程改造的多肽或糖蛋白。在本申请中使用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗体片段”指一个或多个抗体的片段，所述抗体的片段保持了与Fel d1结合的能力。
在特定的实施方式中，本发明的抗体或抗体的片段可以与治疗性部分缀合(“免疫缀合”)，如皮质类固醇、第二抗-Fel d1抗体、肾上腺素、疫苗、或者任意其他用于治疗针对Fel d1的过敏反应的治疗性部分。
在本申请中使用的“分离的抗体”旨在指一种抗体，其基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体(Ab)(例如特异性地与Fel d1或其片段结合的分离的抗体，基本上不含特异性地与Fel d1以外的其他抗原结合的Ab)。
在本申请中使用的“阻断抗体”或“中和抗体”(或“中和Fel d1活性的抗体”)旨在指与Fel d1结合结果导致Fel d1的至少一种生物活性抑制的抗体或其抗原结合部分。例如，本发明的抗体能够有助于阻止针对Fel d1的原发性过敏反应。或者，本发明的抗体能够显示出阻止针对Fel d1的继发性过敏反应，或针对Fel d1的过敏反应的至少一种症状，包括喷嚏、咳嗽、哮喘状况或由Fel d1导致的过敏性反应的能力。可以通过使用多种标准的体外或体内检测中的一种或多种(如如本申请所述的被动皮肤过敏反应检测)或者本领域公知的其他体内检测(例如，其他动物模型用以观察在给予一种或多种本发明的抗体后对Fel d1攻击的保护)来测定一个或多个Fel d1生物活性的指示指标，进而评估这种Fel d1生物活性的抑制。
在本申请中使用的术语“表面等离子体共振”指，通过检测在生物传感基质中的蛋白浓度变化能够分析实时的生物分子相互作用的光学现象，例如使用BIACORETM系统(Pharmacia Biosensor AB,Uppsala,Sweden and Piscataway,N.J.)。
在本申请中使用的术语“KD”旨在指特定抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。
术语“表位”指抗原决定簇，其与被称为互补位的在抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用。一个抗原可以具有一个以上的表位。因此，不同抗体可以与抗原上的不同区域结合并且可以具有不同的生物效应。术语“表位”还指B和/或T细胞针对其产生应答的抗原上的位置。其还指与抗体结合的抗原上的区域。表位可以是线形的或具有构象的。线形表位是由多肽链中相邻的氨基酸残基产生的。具有构象的表位是由线形多肽链的不同区段在空间上靠近的氨基酸产生的。在某些实施方式中，表位可以包括决定簇，所述决定簇是具有化学活性的表面分子组群，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，和在某些实施方式中，可以具有特异性的三维结构特征和/或特异性的电荷特征。还可以根据结构或功能对表位进行定义。功能性表位通常是结构性表位的一个亚组并且具有与相互作用的亲和性直接相关的那些残基。由相邻的氨基酸形成的表位在暴露于变性溶剂后通常会保留，而由三级结构折叠形成的表位在使用变性溶剂处理后通常会丧失。表位在独特的空间构象中通常包括至少3个，更通常地至少5个或8-10个氨基酸。
术语“基本上的一致性”或“基本上一致的”当涉及核酸或其片段时表示，当引入适当的核苷酸插入或缺失以与其他核酸(或其互补链)进行最佳比对时，核苷酸序列的一致性至少约90％，更优选地至少约95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸碱基，由如下文所讨论的任意本领域熟知的序列一致性算法如FASTA、BLAST或GAP对结果进行测定。在某些例子中，与对照核酸分子具有基本上的一致性的核酸分子可以编码一多肽，该多肽与由所述对照核酸分子编码的所述多肽具有相同或基本上相似的氨基酸序列。
在用于多肽时，术语“基本上的相似性”或“基本上相似的”指，当通过使用如GAP或BESTFIT等程序在缺省缺口权重时对两条多肽序列进行最佳比对时，具有至少90％的序列一致性，甚至更优选地至少95％、98％或99％的序列一致性。优选地，不相同的残基位置的差别为保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被带有具相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的另一个氨基酸取代。在通常情况下，保守性氨基酸取代将不会改变蛋白的功能性性质。当两个多个氨基酸序列彼此之间的差别为保守性取代时，可以对相似性的百分比或程度进行上调以校正所述取代的保守性性质。用于进行这种调整的方法是本领域技术人员熟知的。(参见例如Pearson(1994)Methods Mol.Biol.24:307-331)。含有具有相似化学性质的侧链的氨基酸基团的示例包括：1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)羟基脂肪族侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守性氨基酸取代基团是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸、精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守性取代是在Gonnet等((1992)Science 256:144345)所公开的PAM250对数-似然性矩阵中具有正值的任意改变。“适度的保守性”取代是在PAM250对数似然性矩阵中具有非负值的任意改变。
多肽的序列相似性通常使用序列分析软件测定。蛋白分析软件对相似序列进行匹配，针对不同取代、缺失和其他修饰包括保守性氨基酸取代分配相似性的参数。例如，含有程序如GAP和BESTFIT的GCG软件可以使用缺省参数用于确定密切相关的多肽之间的序列同源性或序列一致性，如来自不同物种生物体的或者野生型蛋白与其突变蛋白之间的同源性多肽。参见例如GCG 6.1版。也可以使用采用缺省或推荐参数的FASTA(在GCG 6.1版中的程序)对多肽序列进行比较。FASTA(例如FASTA2和FASTA3)提供了查询和检索序列之间最佳重叠区域的比对和序列一致性百分率(Pearson(2000)，如上所述)。当将本发明的序列与包含来自不同生物体的大量序列的数据库进行比较时，另一种优选的算法是计算机程序BLAST，特别是使用缺省参数的BLASTP或TBLASTN。(参见例如Altschul等，(1990)J.Mol.Biol.215:403410和(1997)Nucleic Acids Res.25:3389402)。
在特定实施方式中，在本发明的方法中使用的抗体或抗体片段可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性抗体可以特异性地针对一个靶多肽的不同表位或者可以含有特异性地针对一个以上靶多肽表位的抗原结合结构域。能够用于本发明的上下文中的一个示例性的双特异性抗体形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中所述第一和第二Ig CH3结构域彼此之间至少存在一个氨基酸的差异，并且其中与不存在氨基酸差异的双特异性抗体相比，至少一个氨基酸的差异降低了所述双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方式中，所述第一Ig CH3结构域结合蛋白A和所述第二Ig CH3结构域含有降低或消除与蛋白A的结合的突变如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。所述第二CH3还可以包含Y96F突变(根据IMGT；根据EU为Y436F)。可以存在于所述第二CH3中的其他修饰包括：在IgG1mAb的情况下为D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT；根据EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2mAb的情况下为N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU为N384S、K392N和V422I)；以及在IgG4mAb的情况下为Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT；根据EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上文所述的双特异性抗体形式的变体均包括在本发明的范围内。
短语“治疗有效量”指给予后产生所需效果的量。精确的量将取决于治疗目的，并且将由本领域技术人员使用公知的技术确定(参见例如Lloyd(1999)The Art,Science andTechnology of Pharmaceutical Compounding)。
本发明的抗体可以用于使对猫敏感的个体“脱敏”。在本申请中将术语“脱敏”定义为在暴露于猫、猫皮屑或其产物例如Fel d1后降低对猫敏感的个体的过敏反应性(使其水平低于猫敏感性个体平时经历的程度)。
一般性描述
家猫是多种室内过敏原的来源并且在已证实对猫过敏原敏感的个体中症状严重程度的范围从相对轻微的鼻炎和结膜炎到可能威胁生命的哮喘状况(Lau,S.等，(2000),Lancet356:1392-1397)。尽管已证实对猫具有此类敏感的患者似乎对在猫皮屑和毛皮中发现的不同分子均会产生反应，但主要的过敏原似乎是Fel d1(家猫属过敏原1)。已发现80％以上对猫过敏的患者具有针对这种过敏原的IgE抗体(van Ree,R.等，(1999),J.Allergy Clin.Immunol 104:1223-1230)。
Fel d1蛋白是约18kDa的异源二聚体酸性糖蛋白，所述蛋白含有约10-20％的N-连接糖类。每个异源二聚体均包含分别由两个独立的基因编码的两条多肽链(Duffort,OA等，(1991),Mol.Immunol.28:301-309；Morgenstern,JP等，(1991),PNAS 88:9690-9694；Griffith,I.J.等，(1992),Gene 113:263-268)。链1包含约70个氨基酸残基而链2包含约90-92个氨基酸残基。有人提出，在天然的Fel d1中由三个链间二硫键连接两条链(Kristensen,A.K.等，(1997),Biol.Chem.378:899-908)，并且这在重组Fel d1的晶体结构中得到了确证(Kaiser,L.等，(2003),J.Biol.Chem.278:37730-37735；Kaiser,L.等，(2007),J.Mol.Biol.370:714-727)。尽管有时单独将各条链称为“Fel d1”，但是作为完整的蛋白过敏原需要兼具这两条链。
Fel d1由皮脂腺、鳞状腺和鳞状上皮细胞产生并且通过舔和梳毛转移至毛皮(Bartholome,K.等，(1985),J.Allergy Clin.Immunol.76:503-506；Charpin,C.等，(1991),J.Allergy Clin.Immunol.88:77-82；Dabrowski,A.J.(1990),等，J.Allergy Clin.Immunol.86:462-465)。其还存在于唾液腺、肛门腺和泪腺中(Andersen,M.C.等，(1985),J.AllergyClin.Immunol.76:563-569；van Milligen,F.J.(1992)，等，Int.Arch.Allergy Appl.Immunol.92(4):375-378)并且似乎主要储存在皮肤和毛皮中(Mata,P.等，(1992),Ann.Allergy69(4):321-322)。
Fel d1蛋白对动物具有未知的功能，但是导致敏感人群的IgG或IgE反应(称为过敏或哮喘反应)。尽管其他猫过敏原是已知的，包括Fel d2(白蛋白)和Fel d3(胱抑素)，但是60％-90％的抗猫IgE是直接针对Fel d1产生的(Leitermann,K.等，(1984),J Allergy Clin.Immunol.74:147-153；Lowenstein,H.等，(1985),Allergy 40:430-441；van Ree,R.等，(1999),J.Allergy Clin.Immunol.104:1223-1230；Ichikawa,K.等，(2011),Clin.Exp.Allergy,31:1279-1286)。
免疫球蛋白E(IgE)负责I型超敏反应，其表现为过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、花粉热、过敏性哮喘、蜂毒过敏和食物过敏。IgE在血液中循环并且与在嗜碱性和肥大细胞上针对IgE的高亲和性FcεR1α受体结合。在大部分的过敏反应中，过敏原通过吸入、摄食或通过皮肤进入机体。然后过敏原与预先已经与肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面上的高亲和性受体结合的IgE结合，导致若干IgE分子交联并且触发导致各种过敏症状的组胺和其他炎性介质的释放。
对于猫过敏症的治疗包括脱敏疗法，所述疗法涉及反复注射增加剂量的猫皮屑粗提物或来源于Fel d1的短肽。使用猫皮屑的粗提物，Lilja等证实了在进行这种治疗三年后，对猫过敏的患者仍显示出全身症状(Lilja,Q.等，(1989),J.Allergy Clin.Immunol.83:37-44和Hedlin等，(1991),J.Allergy Clin.Immunol.87:955-964)。使用来源于Fel d1的短肽脱敏后，在肽组和安慰剂对照组之间未产生具有显著性的差异(Oldfield,W.L.等，(2002),Lancet,360:47-53)。仅当给予患者大量(750ug)短肽时才能观察到有效性(Norman,P.S.等，(1996),Am.J.Respir.Crit.Care Med.154:1623-1628)。而且，在给予猫皮屑粗提物的患者中以及在给予短Fel d1肽治疗的患者中均有哮喘反应的报道。因此，在猫过敏症治疗领域中需要一种用于治疗对猫过敏原特别是Fel d1敏感的患者的替代性策略。
已建议将抗体作为过敏症的一般性治疗策略，因为其可能能够阻止过敏原分子进入粘膜组织，或者可以在过敏原分子有机会与同肥大细胞或嗜碱性粒细胞上的高亲和性受体相结合的IgE结合之前与所述过敏原结合，从而阻止组胺和其他炎性介质从这些细胞中释放。美国专利号5,670,626描述了单克隆抗体通过阻止过敏原与粘膜组织的结合，治疗IgE介导的过敏性疾病如过敏性鼻炎、过敏性哮喘和过敏性结膜炎的用途。美国专利号6,849,259描述了使用过敏原特异性地抗体在过敏症的体内小鼠模型中抑制过敏性炎症。已对基于牛奶和基于蛋类的抗体系统进行了描述。例如，US20030003133A1公开了使用牛奶作为过敏原的载体诱导对猫鳞屑和其他过敏原的口服耐受。在US2010/0143266中描述了通过使用抑制过敏原与肥大细胞结合能力的分子降低在动物中对环境中的过敏原的过敏反应的组合物和方法。de Groot等(de Groot等，(1988),J.Allergy Clin.Immunol.82:778-786)描述了针对Fel d1的其他抗体。
已证实本申请所述的全人源抗体特异性地与Fel d1结合并且可以用于治疗患有猫过敏症的患者，特别是已证实对Fel d1过敏原具有敏感性的患者。此类抗体的该用途可能是治疗患有针对猫皮屑的过敏症的患者的有效方法，或者可以将其用于阻止再次暴露后针对Feld1的加强反应，或阻止与所述过敏症相关的并发症状，或者可以将其用于减轻与首次暴露于猫携带的Fel d1过敏原相关的过敏反应或再次暴露后伴随的症状相关的过敏反应的严重程度和/或持续时间。其可以单独使用或者作为本领域公知的用于治疗此类过敏症的其他治疗性部分或形式的辅助疗法，例如但不限于使用皮质类固醇或肾上腺素的治疗。其可以与第二种或第三种特异性地针对Fel d1的不同抗体联用。其可以用于抗原特异性免疫疗法(SIT)。
在某些实施方式中，本发明的抗体来自使用初始免疫原免疫的小鼠，如天然的Fel d1，其可以从商业上购买获得(参见例如室内生物技术公司,#NA-FD1-2)或者可以通过重组生产获得。在某些实施方式中，所述免疫原可以是顺序或同时给予的Fel d1的链1，或Fel d1的链2，或者可以是链1和链2的组合。链1的全长氨基酸序列(也称为FELD1A)如SEQID NO:392所示。链1的全长氨基酸序列可以在GenBank登录号P30438和NP_001041618.1中找到。链2的全长氨基酸序列(也称为FELD1B)如SEQ ID NO:393所示。链2的全长氨基酸序列可以在GenBank登录号PP30440和NP_001041619.1中找到。
在某些实施方式中，所述重组生产的Fel d1免疫原可以通过直接将Fel d1的两条链融合制备，如Kaiser等所述，以生产与天然Fel d1具有相似再折叠类型的融合产物(Kaiser,L.等，(2003),J.Biol.Chem.278(39):37730-37735)。在某些实施方式中，所述免疫原可以是如在SEQ ID NO：385、394、395、396或397的构建体中所示的融合蛋白，随后再使用第二免疫原免疫，或使用天然或重组生产的Fel d1具有致免疫活性的片段免疫。
所述免疫原可以是天然或重组生产的Fel d1具有生物活性的和/或免疫原性的片段，或编码其活性片段的DNA。所述片段可以来源于链1或链2的N-末端或C-末端，或者来自于链1和链2二者的N-末端或C-末端。用于作为制备针对Fel d1的抗体的免疫原的片段可以来自链1或链2中的任意位点。
在某些实施方式中，所述免疫原可以是包含下述中的任意一个或多个的融合蛋白：i)通过C末端直接与Fel d1链1的氨基酸残基23-92(参见GenBank登录号P30438，亦参见SEQ ID NO:392)的N-末端融合的Fel d1链2的氨基酸残基18-109(参见GenBank登录号P30440，亦参见SEQ ID NO:393)；ii)通过C末端直接与Fel d1链2的氨基酸残基18-109(参见GenBank登录号P30440，亦参见SEQ ID NO:393))的N-末端融合的Fel d1链1的氨基酸残基23-92(参见GenBank登录号P30438，亦参见SEQ ID NO:392)；iii)通过C末端直接与Fel d1链1的氨基酸残基19-88(参见GenBank登录号NP_001041618.1)的N末端融合的Fel d1链2的氨基酸残基18-109(参见Genbank登录号NP_001041619.1)，例如如SEQ ID NO:394or 396所示的构建体；iv)通过C末端与Fel d1链2的氨基酸残基18-109(参见GenBank登录号NP_001041619.1)的N末端融合的Fel d1链1的氨基酸残基19-88(参见GenBank登录号NP_001041618.1)。亦参见SEQ ID NO:395。在某些实施方式中，所述融合蛋白可以在所述构建体的C末端具有标签，如myc-myc-六聚组氨酸标签(对于此类构建体参见SEQ ID NO：385、396或397)。在相关的实施方式中，所述融合蛋白可以具有偶联于所述构建体的C末端的小鼠抗体Fc区(对于此类构建体参见SEQ IDNO：394或395)。在某些实施方式中，链1和2通过本领域技术人员公知的接头偶联，例如(G4S)3(对于此类构建体参见SEQ ID NO：395和397)。
在某些实施方式中，可以使用上文所述区域的片段、或从本申请所述区域的N或C末端之一或两端延伸出指定区域约5至约20个氨基酸残基的肽制备特异性地与Fel d1结合的抗体。某些实施方式中，上文所述区域或其片段的任意组合可以用于制备Fel d1特异性抗体。在某些实施方式中，上文所述Fel d1区域中的任意一个或多个或其片段可以用于制备单特异性、双特异性或多特异性抗体。
抗体的抗原结合片段
除非另有特别指明，本申请中使用的术语“抗体”将被理解为包含两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的抗体分子(即“全抗体分子”)及其抗原结合片段。在本申请中使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等类似表述包括任意天然存在的、酶促获得的、合成的或基因工程改造的多肽或糖蛋白，其特异性地与抗原结合以形成复合物。在本申请中使用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗体片段”指一个或多个抗体的片段，所述抗体的片段保持了与Fel d1的链1和/或链2特异性地结合的能力。抗体的片段可以包括Fab片段、F(ab')2片段、Fv片段、dAb片段、含有CDR的片段或分离的CDR。抗体的抗原结合片段可以来源于例如使用任意适宜的标准技术制备的全抗体分子，如涉及编码抗体可变和(任选地)恒定结构域的DNA操作和表达的蛋白水解消化或重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得，或者能够被合成。所述DNA可以被测序和化学操作或通过使用分子生物学技术例如以便将一个或多个可变和/或恒定结构域排布成适宜的构型，或者引入密码子，形成半胱氨酸残基，修饰、增加或缺失氨基酸等。
抗原结合片段的非限制性示例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)最小识别单位，由模拟抗体的高变区(例如分离的互补性决定区(CDR)如CDR3肽)的氨基酸残基或受束缚的FR3-CDR3-FR4肽组成。其他经工程改造的分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双体、三体、四体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小型模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也均包括在本申请所使用的表述“抗原结合片段”中。
抗体的抗原结合片段将通常包含至少一个可变结构域。所述可变结构域可以是任意尺寸或氨基酸的组合并且通常包含至少一个CDR，其与一个或多个框架序列邻近或在框架中。在具有与VL结构域结合的VH结构域的抗原结合片段中，所述VH和VL结构域所处的位置可以相对于彼此是任意适宜的排布。例如，所述可变区可以是二聚化的并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，所述抗体的抗原结合片段可以含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方式中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可能在本发明抗体的抗原结合片段中发现的可变和恒定结构域的非限制性、示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在包括上文所列出的任意示例性构型的可变和恒定结构域的任意构型中，所述可变和恒定结构域可以直接彼此间连接或者可以通过完全或部分的铰链或接头区连接。铰链区可以含有至少2个(例如5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸，这使得在单一多肽分子中相邻的可变和/或恒定结构域之间是柔性或半柔性的键。而且，本发明抗体的抗原结合片段可以包含如上文所列的任意可变和恒定结构域构型彼此之间和/或与一个或多个单体VH或VL结构域非共价结合(例如通过二硫键)的同型二聚体或异型二聚体(或其他多聚体)。
作为全抗体分子，抗原结合片段可以是单特异性的或多特异性的(例如双特异性的)。抗体的多特异性抗原结合片段将通常包含至少两个不同的可变结构域，其中各可变结构域能够特异性地结合单独的抗原或同一抗原上的不同表位。任何多特异性抗体形式，包括本申请所公开的示例性双特异性抗体形式，可以适用于使用本领域的常规技术获得的本发明抗体的抗原结合片段的背景下。
人源抗体的制备
在转基因小鼠中生成人源抗体的方法是本领域所公知的。任何此类公知的方法均可以用于本发明的背景下以制备特异性地与Fel d1结合的人源抗体。
使用VELOCIMMUNETM技术(参见例如US 6,596,541，瑞恩泽制药公司(RegeneronPharmaceuticals),)或任意其他公知的用于生成单克隆抗体的方法，首先分离具有人源可变区和小鼠恒定区的高亲和性嵌合抗体。所述技术涉及转基因小鼠的产生，所述小鼠具有含有与内源性小鼠恒定区基因座可操作地连接的人源重链和轻链可变区的基因组，以使得所述小鼠针对抗原的刺激产生包含人源可变区和小鼠恒定区的抗体。编码所述抗体的重链和轻链可变区的DNA被分离并且与编码人源重链和轻链恒定区的DNA可操作地连接。然后在能够表达全人源抗体的细胞中表达所述DNA。
在通常情况下，使用目标抗原攻击小鼠，并且从表达抗体的小鼠中回收淋巴细胞(如B细胞)。可以将所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合以制备永生化的杂交瘤细胞系，并且对此类杂交瘤细胞系进行筛选和选择以鉴定产生对目标抗原具有特异性的抗体的杂交瘤细胞系。可以分离编码所述重链和轻链可变区的DNA并且与所述重链和轻链的所需的同种型恒定区连接。可以在细胞如CHO细胞中生产此类抗体蛋白。或者，可以直接从抗原特异性淋巴细胞中分离编码所述抗原特异性嵌合抗体或所述轻链和重链可变结构域的DNA。
首先，分离具有人源可变区和小鼠恒定区的高亲和性嵌合抗体。如在下面的实验章节中，对所述抗体进行表征并对所需的特征进行选择，包括亲和性、选择性、表位等。使用所需的人源恒定区取代所述小鼠的恒定区以生成本发明的全人源抗体，例如野生型或经修饰的IgG1或IgG4。尽管可以根据特定用途改变所选择的恒定区，高亲和性抗原结合和靶特异性特征均保留在可变区中。
在通常情况下，当对与固定在固相上或在溶液相中的抗原的结合进行检测时，本发明的抗体具有非常高的亲和性，通常具有的KD为约10-12至约10-9M。使用所需的人源恒定区取代所述小鼠的恒定区以生成本发明的全人源抗体。尽管可以根据特定用途改变所选择的恒定区，高亲和性抗原结合和靶特异性特征均保留在可变区中。
生物等价物
本发明的抗-Fel d1抗体和抗体片段包含具有不同于本申请所述抗体的那些的氨基酸序列但是仍保持了结合Fel d1的能力的蛋白。此类变体抗体和抗体片段当与母体序列进行比较时包含一个或多个氨基酸插入、缺失或取代，但是显示出基本上与所述抗体等价的生物活性。同样地，本发明的编码抗体的DNA序列与所公开的序列相比包含一个或多个核苷酸插入、缺失或取代，但是其编码的抗体或抗体片段基本上是本发明的抗体或抗体片段的等价物。
如果，例如，两种抗原结合蛋白或抗体是药学等价物或药学替代物，即在类似的实验条件下单剂量或多剂量给予相同摩尔剂量时其吸收速率和程度未显示出显著差异，则认为这两者是生物等价物。如果一些抗体在其吸收程度上而不是吸收速率上是等价的，仍可以将其认为是等价物或药学替代物并且仍可以认为其是生物等价物，因为这种在吸收速率上的差异是有意的并且已经反映在标签中，其对例如长期使用时达到有效的机体药物浓度不是必要的，并且针对所研究的特定药品认为其在医学上是不重要的。
在一个实施方式中，如果两种抗原结合蛋白在安全性、纯度和效能方面不存在具有临床意义的差异，则认为其是生物等价物。
在一个实施方式中，如果患者能够在对照产品和生物产品之间进行一次或多次的转换而在不良反应的风险方面无预期的增加，则认为这两种抗原结合蛋白是生物等价物，所述不良反应包括，与无这种转换的连续疗法相比，免疫原性出现具有临床意义的改变或有效性的降低。
在一个实施方式中，如果两种抗原结合蛋白针对一种或多种病情的使用通过共同的作用机制发挥作用并且此类作用机制在公知的范围内，则认为其是生物等价物。
生物等效性可以通过体内和/或体外方法证明。生物等效性的测定包括，例如(a)在人和其他哺乳动物中的体内检测，测定在血液、血浆、血清或其他生物液体中的抗体或其代谢产物的浓度的时间函数；(b)进行体外检测，与人体内的生物利用度数据关联并合理的预测在人体内的生物利用度数据；(c)在人或其他哺乳动物中进行体内检测，测定抗体(或其靶点)的适当的急性药理学作用的时间函数；和(d)在对照良好的临床试验中确定抗体的安全性、有效性或者生物利用度或生物等效性。
可以通过例如对残基或序列进行各种取代或者缺失生物活性不需要的末端或中间的残基以构建本发明抗体的生物等价物变体。例如，半胱氨酸残基不是生物活性所必须的，可以将其缺失或使用其他氨基酸取代以防止在还原过程中形成不必要的或不正确的分子内二硫键桥。在其他情况下，生物等价物抗体可以包括包含氨基酸改变的抗体变体，其改变了所述抗体的糖基化特征，例如消除或除去糖基化的突变。
抗体的生物学特征
在通常情况下，本发明的抗体可以通过与Fel d1的链1或链2，或与Fel d1的链1和链2两者或者链1或链2的片段结合而发挥功能。
在某些实施方式中，本发明的抗体可以至少结合位于Fel d1链1或链2的C-末端区的表位。在一个实施方式中，所述抗体可以与Fel d1链1或链2的N-末端区中的表位结合。
在某些实施方式中，本发明的抗体可以通过阻断或抑制IgE与对fel d1过敏原敏感的患者中的肥大细胞或嗜碱性粒细胞的结合发挥功能。
在某些实施方式中，本发明的抗体可以通过与天然Fel d1蛋白全长链1或链2的任意其他区域或片段结合而发挥功能，其氨基酸序列如SEQ ID NO:392(链1)和SEQ ID NO:393(链2)所示。
在某些实施方式中，本发明的抗体可以是双特异性抗体。本发明的双特异性抗体可以与链1中的一个表位结合，也可以与链2中的一个表位结合。在某些实施方式中，本发明的双特异性抗体可以结合链1中的两个不同的表位。在某些实施方式中，本发明的双特异性抗体可以结合链2中的两个不同的表位。在某些实施方式中，本发明的抗体可以结合链1或链2之一上相同螺旋中的两个不同的位点，或者可以结合链1和链2二者上的相同螺旋。在Kaiser等的文章中对Fel d1的结构进行了更加详细的描述(Kaiser,L.等，(2003),J.Biol.Chem.278(39):37730-37735)，作者由此指出Fel d1由八个螺旋组成，H1-H4和H5-H8，其分别对应于天然Fel d1中的链1和链2。
在一个实施方式中，本发明提供了与Fel d1的链1和/或链2结合的全人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段显示出一种或多种下述特征：(i)包含HCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354和370，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；(ii)包含LCVR，所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362和378，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；(iii)包含HCDR3结构域，所述HCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360和376，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；和LCDR3结构域，所述LCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368和384，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；(vi)包含HCDR1结构域，所述HCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356和372，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；HCDR2结构域，所述HCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358和374，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；LCDR1结构域，所述LCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364和380，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；和LCDR2结构域，所述LCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366和382，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；(v)以等于或小于10-9的KD与Fel d1的链1和/或链2结合；(vi)不与子宫球蛋白发生交叉反应或与之结合；或者(vii)在使用Fel d1特异性小鼠IgE的被动皮肤过敏反应(PCA)小鼠模型中，在体内阻止染料外渗。
在一个实施方式中，本发明提供了将本发明的两种或多种全人源抗体或其片段组合用于制备组合物的用途，其中所述抗体与Fel d1的链1和/或链2结合，并且其中在所述组合物中包含的各抗体或其片段显示出一种或多种下述特征：(i)包含HCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354和370，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；(ii)包含LCVR，所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362和378，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；(iii)包含HCDR3结构域，所述HCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360和376，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；和LCDR3结构域，所述LCDR3结构域LCDR3具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368和384，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；(iv)包含HCDR1结构域，所述HCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356和372，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；HCDR2结构域，所述HCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358和374，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；LCDR1结构域，所述LCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364和380，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；和LCDR2结构域，所述LCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366和382，或者与其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的基本上相似的序列；(v)以等于或小于10-9的KD与Fel d1的链1和/或链2结合；(vi)不与子宫球蛋白发生交叉反应或与之结合；(vii)在使用Fel d1特异性小鼠IgE的被动皮肤过敏反应(PCA)小鼠模型中，在体内阻止染料外渗；或(viii)当与本发明的第二种抗体或其抗原结合片段组合时，在受Fel d1攻击动物的肺中降低粘液分泌细胞的出现频率。
根据体外或体内检测，本发明的某些Fel d1抗体，当单独或组合使用时，能够结合至或中和Fel d1的至少一种生物学效应。可以采用本领域技术人员公知的任意标准方法测定本发明的抗体结合至以及中和Fel d1的活性的能力，包括如本申请所述的结合试验或活性中和(例如保护其免于出现过敏反应)试验。
用于测定结合活性的非限制性的、示例性体外试验如本申请中的实施例4所示。在实施例4中，通过表面等离子体共振确定人源抗-Fel d1抗体的结合亲和性和动力学常数并且所述检测在T200Biacore仪器上进行。
可以对Fel d1蛋白或肽进行修饰以引入用于标记或用于与载体分子如KLH缀合目的的某些残基的插入或取代。例如，可以在肽的N末端或C末端加入半胱氨酸，或者可以加入接头序列以制备用于缀合至例如KLH以用于免疫的肽。对Fel d1具有特异性的抗体可以不含有其他标签或部分，或者其可以含有N-末端或C-末端标签或部分。在一个实施方式中，所述标签或部分是生物素。在结合试验中，标签(如果有的话)的位置可以确定肽相对于肽所结合的表面的方向。例如，如果表面涂覆了亲和素，则含有N-末端生物素的肽将被定向，以使得所述肽的C-末端部分将远离所述表面。
表位定位和相关技术
在本申请中使用的术语“表位”指与在被称为互补位的抗体分子的可变区中的特异性抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。一个抗原可以具有一个以上的表位。因此，不同抗体可以与抗原上的不同区域结合并且可以具有不同的生物效应。表位可以是线形的或具有构象的。具有构象的表位是由线形多肽链的不同区段在空间上靠近的氨基酸产生的。线形表位是由多肽链中相邻的氨基酸残基产生的。在某些情况下，在抗原上的表位可以包括糖类、磷酰基或磺酰基部分。
本发明包括抗-Fel d1抗体，所述抗体与一个或多个氨基酸相互作用，所述一个或多个氨基酸存在于Fel d1分子的链1或链2包括例如如SEQ ID NO:392所示的链1(链A)或如SEQ ID NO:393所示的链2(链B)的一个或多个区域中，或者在重组产生的Fel d1蛋白的类似区域中，如SEQ ID NO：385、394、395、396或397任一所示。与抗体结合的所述表位可以由在任意上文所述的Fel d1分子的区域或区段中的3个或更多个(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个或更多个)氨基酸的单一连续序列组成(例如在链1或链2中或者在跨链1和链2二者的区域中的线形表位)。或者，所述表位可以由在上文所述的Fel d1分子的区域或区段之一或两者中的多个不连续的氨基酸(或氨基酸序列)组成(例如构象表位)。
本领域的普通技术人员公知的各种技术均可以用于确定是否抗体与多肽或蛋白中的“一个或多个氨基酸相互作用”。示例性的技术包括例如常规的交叉阻断试验，如在Antibodies(抗体),Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NY)中所描述的。其他的方法包括丙氨酸扫描突变分析、肽印迹分析(Reineke(2004)Methods MolBiol 248:443-63)、肽切割分析晶体学研究和NMR分析。此外，可以使用方法如表位切除、表位提取和抗原的化学修饰(Tomer(2000)Protein Science 9:487-496)。能够用于鉴定与抗体相互作用的多肽中的氨基酸的另一种方法是利用质谱进行的氢/氘交换检测。总的来说，所述氢/氘交换方法涉及使用氘标记目标蛋白，随后将所述抗体与所述氘标记的蛋白结合。接下来，将所述蛋白/抗体的复合物转移至水中，在被所述抗体复合物保护的氨基酸中可交换的质子由氘向氢的回交换速率慢于不作为界面一部分的氨基酸中的可交换质子。其结果是，来自蛋白/抗体界面的一部分的氨基酸可以保留氚，并且因此与没有包括在所述界面中的氨基酸相比显示出相对更高的质量。在所述抗体解离后，将所述靶蛋白进行蛋白酶切割并进行质谱分析，以揭示氘标记的残基，所述残基对应于与抗体相互作用的特定氨基酸。参见例如Ehring(1999)Analytical Biochemistry 267(2):252-259；Engen和Smith(2001)Anal.Chem.73:256A-265A。还可以将所述抗原/抗体复合物的X-射线晶体学用于表位定位目的。
修饰辅助分析(MAP)，也称为基于抗原结构的抗体分析(ASAP)，这种方法根据各抗体与经化学或酶促修饰的抗原表面结合性质的相似性，对针对相同抗原的大量单克隆抗体(mAb)进行分类(US 2004/0101920)。各个分类可以反映独特的表位，无论是与另一分类所表示的表位截然不同的还是部分重叠的。这项技术能够快速过滤基因相同的抗体，以使得表征可以集中在基因不同的抗体上。当用于杂交瘤筛选时，MAP可以容易地鉴定产生具有所需特征的mAb的稀有杂交瘤克隆。可以使用MAP将本发明的抗体分选为结合不同表位的抗体组。
在某些实施方式中，所述抗-Fel d1抗体或其抗原结合片段结合在Fel d1的链1或链2中示例的任意一个或多个区域，其可以是天然形式的，如在SEQ ID NO:392(链1)和SEQID NO:393(链2)中所示例的，或重组生产的，如在任意SEQ ID NO：385、394、395、396和397或其片段中所示例的。在某些实施方式中，如表1所示的本发明的抗体与选自下组的至少一个氨基酸序列相互作用：范围从SEQ ID NO:396的约位置15至约位置24的氨基酸残基；范围从SEQ ID NO:396的约位置85至约位置103的氨基酸残基；范围从SEQ ID NO:396的约位置85至约位置104的氨基酸残基；范围从SEQ ID NO:396的约位置113至约位置116的氨基酸残基。这些区域进一步在SEQ ID NO：402、403、404、412和426中示例。
本发明还包括抗-Fel d1抗体，其与表1中的任意本申请所述的具体示例性抗体、或具有表1中所述的任意示例性抗体的CDR序列的抗体，结合相同的表位或结合所述表位的一部分。同样地，本发明还包括抗-Fel d1抗体，其与表1中的任意本申请所述的具体的示例性抗体、或具有表1中所述的任意示例性抗体的CDR序列的抗体竞争性地与Fel d1或Fel d1的片段结合。
通过使用本领域公知的常规方法能够容易地确定是否抗体与对照抗-Fel d1抗体结合相同的表位，或与对照抗-Fel d1抗体竞争结合。例如，为确定是否待测抗体与本发明的对照抗-Fel d1抗体结合相同的表位，将所述对照抗体在饱和条件下与Fel d1蛋白或肽结合。接下来，评估待测抗体与所述Fel d1分子结合的能力。如果在使用所述对照抗-Fel d1抗体饱和后所述待测抗体能够与Fel d1结合，则能够得出结论所述待测抗体与所述对照抗-Fel d1抗体结合不同的表位。另一方面，如果在使用所述对照抗-Fel d1抗体饱和结合后所述待测抗体不能与所述Fel d1分子结合，则所述待测抗体可以与本发明的所述对照抗-Fel d1抗体结合相同的表位。
为了确定是否抗体与对照抗-Fel d1抗体竞争结合，在两个方向上进行上文所述的结合方法：在第一个方向上，将所述对照抗体在饱和状态下与Fel d1分子结合，随后评估所述待测抗体与所述Fel d1分子的结合。在第二个方向上，将所述待测抗体在饱和条件下与Feld1分子结合，随后评估所述对照抗体与所述Fel d1分子的结合。如果在这两个方向上都只有第一(饱和)抗体能够与所述Fel d1分子结合，则结论是所述待测抗体与所述对照抗体竞争与Fel d1的结合。本领域的普通技术人员可以理解的是，与对照抗体竞争结合的抗体可以不是必需地与所述对照抗体结合相同的表位，但是可以通过结合重叠的或邻近的表位在空间上阻断所述对照抗体的结合。
如果两个抗体分别竞争性地抑制(阻断)对方与所述抗原的结合，则其结合相同的或重叠的表位。也就是说，根据在竞争性结合试验中的检测，1-、5-、10-、20-或100-倍过量的一个抗体使对方抗体的结合抑制至少50％，但优选地75％、90％或者甚至99％(参见例如Junghans等，Cancer Res.199050:1495-1502)。或者，在所述抗原中，如果降低或消除一种抗体结合的基本上所有的氨基酸突变都降低或消除对方抗体的结合，则这两种抗体具有相同的表位。如果降低或消除一种抗体结合的一些氨基酸突变降低或消除其他抗体的结合，则两种抗体具有重叠的表位。
然后可以使用其他常规实验(例如肽突变和结合分析)确证是否所观察到的待测抗体结合的缺乏实际上是由于与对照抗体结合相同的表位造成的，或者是否是由于空间位阻(或其他现象)造成了所观察到的结合的缺乏。可以使用ELISA、RIA、表面等离子体共振、流式细胞术或本领域中任意其他的定量或定性的抗体结合试验进行这种类型的实验。
免疫缀合物
本发明包括与治疗性部分缀合的人源抗-Fel d1单克隆抗体(“免疫缀合物”)，例如能够降低针对在猫皮屑或在猫中存在的，或在猫可能居住的环境区域中存在的Fel d1过敏原的过敏反应的严重程度，或改善与暴露于猫、猫皮屑或所述Fel d1过敏原相关的至少一种症状，包括鼻炎、结膜炎或呼吸困难，或其严重程度的药剂。此类药剂可以是皮质类固醇、第二种不同的针对Fel d1的抗体、或疫苗。应考虑所治疗的病情和所要达到的所需的治疗作用，选择可以与所述Fel d1抗体缀合的治疗性部分的类型。或者，如果所需的治疗作用是治疗与暴露于所述Fel d1过敏原相关的后遗症或症状，或者由于这种暴露导致的任意其他状况，例如但不限于鼻炎或结膜炎，则优选与适于治疗所述状况的后遗症或症状，或者减轻本发明抗体的任意副作用的药剂缀合。用于形成免疫缀合物的适宜药剂的示例是本领域公知的，参见例如WO 05/103081。
多特异性抗体
本发明的抗体可以是单特异性的、双特异性的或多特异性的。多特异性抗体可以特异性地针对一个靶多肽的不同表位，或者可以含有特异性地结合针对一个以上靶多肽表位的抗原结构域。参见例如Tutt等，1991,J.Immunol.147:60-69；Kufer等，2004,Trends Biotechnol.22:238-244。本发明的抗体可以连接至或与另一种具有功能的分子共表达，例如另一种肽或蛋白。例如，抗体或其片段可以功能性地与一个或多个其他分子实体如另一种抗体或抗体片段连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)以产生具有另一个结合特异性的双特异性或多特异性抗体。例如，本发明包括双特异性抗体，其中免疫球蛋白的一个臂可以对Fel d1的链1或其片段具有特异性，而所述免疫球蛋白的另一个臂可以对Fel d1的链2，或第二种治疗靶点具有特异性，或者可以与治疗性部分缀合。
本发明的某些示例性的实施方式包括双特异性抗原结合分子，其是双特异性抗体。双特异性抗体的各抗原结合结构域均包括重链可变结构域(HCVR)和轻链可变结构域(LCVR)。所述HCVR还可以被称为VH区，所述LCVR还可以被称为VL区。通常地，各HCVR和LCVR均包含分散在四个FR中的三个CDR，其从氨基末端到羧基末端以下述顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在HCVR中的三个CDR在本申请中可以被称为HCDR1、HCDR2和HCDR3；而在LCVR中的三个CDR在本申请中可以被称为LCDR1、LCDR2和LCDR3。
在本发明的双特异性抗原结合分子中，各抗原结合结构域可以包含或由全抗体分子或抗体的抗原结合片段组成。在本申请中使用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等等包括任意天然存在的、酶促获得的、合成的或基因工程改造的多肽或糖蛋白，其特异性地与抗原结合以形成复合物。抗体的抗原结合片段可以来源于例如使用任意适宜的标准技术制备的全抗体分子，如涉及编码抗体可变和任选地恒定结构域的DNA的操控和表达的蛋白水解消化或重组基因工程技术。此类DNA是已知的和/或易于从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得，或者能够被合成。所述DNA可以被测序和被化学操控，或通过使用分子生物学技术例如以便将一个或多个可变和/或恒定结构域排布成适宜的构型，或者引入密码子，形成半胱氨酸残基，修饰、增加或缺失氨基酸等。
可以包括在本发明的双特异性抗原结合分子中的抗原结合片段的非限制性示例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)最小识别单位，由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成。其他经工程改造的分子，如结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、双体、三体、四体、微抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小型模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域也均包括在本申请所使用的表述“抗原结合片段”中。
抗体的抗原结合片段将通常包含至少一个可变结构域。所述可变结构域可以是任意尺寸或氨基酸的组合并且通常包含至少一个CDR，其与一个或多个框架序列邻近或在框架中。在具有与VL结构域结合的VH结构域的抗原结合片段中，所述VH和VL结构域所处的位置可以是相对于彼此是任意适宜的排布。例如，所述可变区可以是二聚化的并且含有VH-VH、VH-VL或VL-VL二聚体。或者，所述抗体的抗原结合片段可以含有单体VH或VL结构域。
在某些实施方式中，抗体的抗原结合片段可以含有与至少一个恒定结构域共价连接的至少一个可变结构域。可能存在于本发明抗体的抗原结合片段中的可变和恒定结构域的非限制性、示例性构型包括：(i)VH-CH1；(ii)VH-CH2；(iii)VH-CH3；(iv)VH-CH1-CH2；(v)VH-CH1-CH2-CH3；(vi)VH-CH2-CH3；(vii)VH-CL；(viii)VL-CH1；(ix)VL-CH2；(x)VL-CH3；(xi)VL-CH1-CH2；(xii)VL-CH1-CH2-CH3；(xiii)VL-CH2-CH3；和(xiv)VL-CL。在包括上文所列出的任意示例性构型的可变和恒定结构域的任意构型中，所述可变和恒定结构域可以直接彼此间连接或者可以通过完全或部分的铰链或接头区连接。铰链区可以含有至少2个(例如5、10、15、20、40、60个或更多个)氨基酸，这使得在单一多肽分子中相邻的可变和/或恒定结构域之间是柔性或半柔性的键。而且，本发明抗体的抗原结合片段可以包含如上文所列的任意可变和恒定结构域构型彼此之间和/或与一个或多个单体VH或VL结构域非共价结合(例如通过二硫键)的同型二聚体或异二聚体(或其他多聚体)。
所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域可以直接或间接地彼此之间连接以形成双特异性抗原结合分子。或者，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域可以各自与单独的多聚化结构域连接。一个多聚化结构域与另一个多聚化结构域的结合有助于两个抗原结合结构域之间的结合，从而形成双特异性抗原结合分子。在本申请中使用的“多聚化结构域”是任意大分子、蛋白、多肽、肽或氨基酸，其能够与具有相同或相似结构或构造的另一个多聚化结构域结合。例如，多聚化结构域可以是包含免疫球蛋白CH3结构域的多肽。多聚化组分的一个非限制性的示例是免疫球蛋白的Fc部分，例如选自同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及在各同种型组中的任意同种异型的IgG的Fc结构域。在某些实施方式中，所述多聚化结构域可以是Fc片段或含有至少一个半胱氨酸残基、在长度上为1至约200个氨基酸的氨基酸序列。在其他实施方式中，所述多聚化结构域可以是半胱氨酸残基，或含有半胱氨酸的短肽。其他多聚化结构域包括含有或由亮氨酸拉链、螺旋-环基序或卷曲螺旋基序组成的肽或多肽。
任意双特异性抗体形式或技术均可以用于制备本发明的双特异性抗原结合分子。例如，具有第一抗原结合特异性的抗体或其片段能够在功能上与一个或多个其他分子实体如具有第二抗原结合特异性的另一种抗体或抗体片段连接(例如通过化学偶联、基因融合、非共价结合或其他方式)以产生双特异性抗原结合分子。
能够用于本发明背景下的示例性的双特异性抗体形式涉及使用第一免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二Ig CH3结构域，其中所述第一和第二CH3结构域彼此之间的差异为至少一个氨基酸，并且与缺乏所述氨基酸差异的双特异性抗体相比，其中至少一个氨基酸的差异降低了所述双特异性抗体与蛋白A的结合。在一个实施方式中，所述第一Ig CH3结构域结合蛋白A和所述第二Ig CH3结构域含有降低或消除与蛋白A结合的突变如H95R修饰(根据IMGT外显子编号；根据EU编号为H435R)。所述第二CH3还可以包含Y96F修饰(根据IMGT；根据EU为Y436F)。可以存在于所述第二CH3中的修饰还包括：在IgG1抗体的情况下为D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I(根据IMGT；根据EU为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I)；在IgG2抗体的情况下为N44S、K52N和V82I(IMGT；根据EU为N384S、K392N和V422I)；在IgG4抗体的情况下为Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、E79Q和V82I(根据IMGT；根据EU为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I)。上文所述的双特异性抗体形式的变体包括在本发明的范围内。
能够用于本发明背景下的其他示例性的双特异性形式包括，但不限于，例如基于scFv的或双体双特异性的形式、IgG-scFv融合、双可变结构域(DVD)-Ig、四价体杂交瘤、凸起-进入-孔洞(knob-into-hole)、共有轻链(例如具有凸起-进入-孔洞等的共有轻链)、CrossMab、CrossFab、(SEED)体、亮氨酸拉链、Duobody、IgG1/IgG2、双作用Fab(DAF)-IgG和Mab2双特异性形式(参见例如Klein等，2012,mAbs 4:6,1-11，并且作为本申请中引用的参考文献，其对前述的形式进行了综述)。也可以使用肽/核酸缀合构建双特异性抗体，例如其中将具有正交化学反应性的非天然氨基酸用于生成位点特异性抗体-寡核苷酸缀合物，然后将其自组装成具有所定义的组分、价态和几何形状的多聚体复合物(参见例如Kazane等，J.Am.Chem.Soc.[Epub:Dec.4,2012])。
治疗性施用和制剂
本发明提供了包含本发明的抗-Fel d1抗体或其抗原结合片段的治疗性组合物。将通过适宜的途径给予根据本发明的治疗性组合物，包括但不限于静脉内、皮下、肌内、鼻内，使用适宜的载体、赋形剂和其他试剂，所述试剂能够掺入制剂中以提供改善的转移、递送、耐受等。多种适宜的制剂可以见于所有药物化学家公知的处方集中：Remington'sPharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学),Mack Publishing Company,Easton,PA。这些制剂包括例如粉剂、糊剂、软膏、凝胶剂、蜡、油、脂质、含有囊泡的脂质(阳离子的或阴离子的)(如LIPOFECTINTM)、DNA缀合物、无水吸收糊剂、水包油和油包水乳剂、乳剂碳蜡(不同分子量的聚乙二醇)、半固体凝胶和含有碳蜡的半固体混合物。亦参见Powell等，"Compendium of excipients for parenteral formulations(胃肠外制剂用赋形剂纲要)"PDA(1998)J Pharm Sci Technol 52:238-311.
可以根据待给药对象的年龄和体型、靶疾病、病情、给药途径等改变抗体的剂量。当使用本发明的抗体治疗在对Fel d1敏感的个体中与暴露于猫或猫皮屑相关的鼻炎或结膜炎，或者用于预防针对猫过敏原的过敏反应，或用于降低所述过敏反应的严重程度时，通常以约0.01至约30mg/kg体重、更优选地约0.02至约7、约0.03至约5或者约0.05至约3mg/kg体重的单一剂量静脉内给予本发明的抗体是有利的。可以根据所述病情的严重程度调整治疗的频率和持续时间。在某些实施方式中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以以至少约0.1mg至约800mg、约1至约500mg、约5至约300mg、或者约10至约200mg、至约100mg或至约50mg的初始剂量给予。在某些实施方式中，在初始剂量给予后，可以给予第二个或多个后续剂量的抗体或其抗原结合片段，其用量可以大致与所述初始剂量相同或低于初始剂量，其中所述后续剂量间隔至少1天至3天；至少1周、至少2周；至少3周；至少4周；至少5周；至少6周；至少7周；至少8周；至少9周；至少10周；至少12周；或者至少14周。
各种递送系统是公知的并且可以用于给予本发明的药物组合物，例如包封在脂质体中、微粒、微囊、能够表达突变型病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参见例如Wu等，(1987)J.Biol.Chem.262:4429-4432)。引入的方法包括但不限于皮内、经皮、肌内、腹腔、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述组合物可以通过任意适宜的途径给予，例如通过输注或推注、通过经上皮或粘膜层(例如口腔粘膜、直肠和小肠粘膜等)的吸收和可以与其他生物活性剂一起给予。施用可以是全身性的或局部的。
所述药物组合物还可以在囊泡中递送，特别是脂质体中(参见例如Langer(1990)Science 249:1527-1533)。
在某些情况下，所述药物组合物可以在控释系统中递送。在一个实施方式中，可以使用泵。在另一个实施方式中，可以使用多聚体材料。在又一个实施方式中，可以将控释系统置于所述组合物的靶点附近，以使得仅需要递送全身剂量的一部分。
可注射制剂可以包括用于静脉内、皮下、皮内和肌内注射，点滴输注等的剂型。这些可注射制剂可以通过公知的方法制备。例如，可以通过例如在常规用于注射剂的无菌水性基质或油性基质中溶解、混悬或乳化上文所述的抗体或其盐制备所述可注射制剂。作为用于注射剂的水性基质，例如有生理盐水、含有葡萄糖和其他助剂的等张溶液等，可以将其与适宜的增溶剂如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非离子表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、氢化蓖麻油的HCO-50(聚氧乙烯(50mol))加合物]等联合使用。作为油性基质，使用例如芝麻油、大豆油等，可以将其与增溶剂如苯甲酸苄酯、苄醇等联合使用。因此，优选地将所制备的注射剂填充至适宜的安瓿中。
可以使用标准针头和注射器皮下或静脉内递送本发明的药物组合物。此外，对于皮下递送，笔递送装置能够容易地用于递送本发明的药物组合物。此类笔递送装置可以是可重复使用的或一次性的。可重复使用的笔递送装置通常使用含有药物组合物的可替换的药筒。一旦药筒中的所有药物组合物已经施用并且所述药筒是空的时，所述空的药筒能够容易地被弃去并且被含有所述药物组合物的新药筒替换。然后可以重新使用所述药物递送装置。在一次性的药物递送装置中，无可替换的药筒。相反地，所述一次性笔递送装置在所述装置中的储液槽中预充了所述药物组合物。一旦所述药物组合物的储液槽变空，则将整个装置弃去。
多种可重复使用的笔和自动注射器递送装置已应用于本发明药物组合物的皮下递送。例如包括但不一定限于AUTOPENTM(欧文芒福德公司，伍德斯托克，UK)、DISETRONICTM笔(Disetronic医疗系统，Burghdorf，瑞士)、HUMALOG MIX 75/25TM笔、HUMALOGTM笔、HUMALIN 70/30TM笔(礼来公司，印第安纳波利斯，IN)、NOVOPENTMI、II和III(诺和诺德，哥本哈根，丹麦)、NOVOPEN JUNIORTM(诺和诺德，哥本哈根，丹麦)、BDTM笔(Becton Dickinson公司，富兰克林湖，NJ)、OPTIPENTM、OPTIPEN PROTM、OPTIPENSTARLETTM和OPTICLIKTM(赛诺菲-安万特，法兰克福，德国)仅列举了其中的几个。应用于本发明的药物组合物皮下递送的一次性笔递送装置的例子包括但不一定限于SOLOSTARTM笔(赛诺菲-安万特)、FLEXPENTM(诺和诺德)和KWIKPENTM(礼来)、SURECLICKTM自动注射器(安进公司，千橡郡，CA)、PENLETTM(Haselmeier，斯图加特，德国)、EPIPEN(Dey,L.P.)和HUMIRATM笔(雅培实验室，雅培公园，IL)仅列举了其中的几个。
有利地，将上文所述的供口服或胃肠外使用的药物组合物制成在适于一剂量活性成分的单位剂量中的剂量。在单位剂量中的此类剂量包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射剂(安瓿)、栓剂等。所含的前述抗体的量通常为约5至约500mg每单位剂量的剂型；特别是在注射剂形式中，优选的所含的前述抗体为约5至约100mg，在其他剂型中为约10至约250mg。
抗体的治疗用途
由于其与Fel d1的相互作用，本发明的抗体对于治疗个体暴露于猫、猫皮屑或含有所述Fel d1蛋白的环境后的原发性反应，或者与所述过敏反应相关的至少一种症状，如眼部发痒、结膜炎、鼻炎、气喘、呼吸困难，或者对于预防针对所述Fel d1过敏原的继发反应，包括更加严重的过敏性反应，或者对于减轻再次暴露于所述猫过敏原后的症状的严重程度、持续时间和/或频率是有用的。因此，可以预计本发明的抗体可以用作预防或治疗。
在又一个实施方式中，本发明的抗体用于制备药物组合物，所述药物组合物用于治疗患有对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物和/或Fel d1蛋白敏感的患者。在又一个实施方式中，本发明的抗体用于制备药物组合物，所述药物组合物用于降低初次暴露于Fel d1的严重程度，或者用于降低针对Fel d1的过敏反应的严重程度、持续时间和/或次数。在又一个实施方式中，本发明的抗体用于作为治疗猫过敏症的任意其他药剂的辅助疗法，所述任意其他药剂包括皮质类固醇、疫苗、过敏原特异性免疫疗法(SIT)或者本领域技术人员公知的任意其他姑息疗法。
联合疗法
联合疗法可以包括本发明的抗-Fel d1抗体和与本发明的抗体或本发明的抗体的生物活性片段联用时可能是有利的任意附加治疗剂。
例如，可以使用第二种治疗剂以辅助降低暴露于猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或Fel d1，或者暴露于猫居住的环境后的过敏症状，如皮质类固醇。抗体也可以用于与其他疗法联用，如特异性针对所述Fel d1过敏原的疫苗。所述附加的治疗性活性组分可以在本发明的抗-Feld1抗体给予之前、同时或之后给予。对于本发明的目的而言，将此类给药方案认为是抗-Feld1抗体与第二种治疗性活性剂“联合”给予。
给药方案
根据本发明的某些实施方式，可以在一个规定的时间段内多剂量给予对象一种或多种抗-Fel d1抗体(抗体的组合)或双特异性抗原结合分子。根据本发明这个方面的方法包括顺序给予对象多剂量的本发明的抗体、抗体的组合或双特异性抗原结合分子。在本申请中使用的“顺序给予”指在不同的时间点给予对象各剂量的抗体、抗体的组合或双特异性抗原结合分子，例如在由预定的间隔(例如小时、天、周或月)分隔的不同天。本发明包括方法，所述方法包括顺序给予所述患者单一初始剂量的抗体、抗体的组合或双特异性抗原结合分子，随后给予一个或多个第二剂量的所述抗体，任选地随后给予一个或多个第三剂量的所述抗体。
术语“初始剂量”、“第二剂量”和“第三剂量”指按照时间顺序给予本发明的抗体、抗体的组合或双特异性抗原集合分子。因此，所述“初始剂量”是在治疗方案开始时给予的剂量(也称为“基线剂量”)；所述“第二剂量”是在初始剂量之后给予的剂量；和所述“第三剂量”时在所述第二剂量之后给予的剂量。所述初始、第二和第三剂量可以均含有相同量的抗体、抗体的组合或双特异性抗原结合分子，但是在给药频率方面其通常可以是彼此不同的。但是，在某些实施方式中，在初始、第二和/或第三剂量中所含的抗体、抗体的组合或双特异性抗原结合分子的量在治疗过程中可以彼此有所不同(例如按需上调或下调)。在某些实施方式中，在治疗方案开始时给予两个或多个(例如2、3、4或5个)剂量作为“负荷剂量”，随后降低频率给予随后的剂量(例如“维持剂量”)。
在本发明的一个示例性实施方式中，在紧邻的上一次剂量给药后的1至26周(例如1、11/2、2、21/2、3、31/2、4、41/2、5、51/2、6、61/2、7、71/2、8、81/2、9、91/2、10、101/2、11、111/2、12、121/2、13、131/2、14、141/2、5、151/2、16、161/2、17、171/2、18、181/2、19、191/2、20、201/2、21、211/2、22、221/223、231/2、24、241/2、25、251/2、26、261/2或更多周)给予各第二和/或第三剂量。在本申请中使用的短语“紧邻的上一次剂量”指，在多次给药的顺序中，在所述顺序中的紧接的下一个剂量给药之前给予患者的抗体、抗体的组合或双特异性抗原结合分子的剂量，在中间没有插入剂量。
根据本发明这一方面的方法可以包括给予患者任意次数的第二和/或第三剂量的特异性地与Fel d1结合的抗体、抗体的组合或双特异性抗原结合分子。例如，在某些实施方式中，仅将单一的第二剂量给予所述患者。在其他实施方式中，将两个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第二剂量给予所述患者。同样地，在某些实施方式中，仅将单一的第三剂量给予所述患者。在其他实施方式中，将两个或多个(例如2、3、4、5、6、7、8或更多个)第三剂量给予所述患者。
在涉及多个第二剂量的实施方式中，各第二剂量可以以与其他第二剂量相同的频率给予。例如，各第二剂量可以在所述紧邻的上一次剂量给予后1至2周给予患者。类似地，在涉及多个第三剂量的实施方式中，各第三剂量可以以与其他第三剂量相同的频率给予。例如，各第三剂量可以在所述紧邻的上一次剂量给予后2至4周给予患者。或者，给予患者的所述第二和/或第三剂量的频率可以在治疗方案的过程中改变。在治疗过程中还可以由医师在临床检查后根据个体患者的需要调整给药频率。
抗体的诊断用途
本发明的抗-Fel d1抗体还可以用于检测和/或测定样品中的Fel d1，例如用于诊断目的。可以预计可通过使用任意一种或多种本发明的抗体通过测定Fel d1的存在情况对认为是由Fel d1导致的过敏反应进行确证。针对Fel d1的示例性的诊断检测可以包括，例如，将来自患者的样品与本发明的抗-Fel d1抗体接触，其中所述抗-Fel d1抗体使用可检测的标记或报告分子标记，或者作为从患者样品中选择性地分离Fel d1蛋白的捕获配体使用。或者，在诊断应用中可以将未经标记的抗-Fel d1抗体与其本身是可检测的标记的第二抗体联用。所述可检测的标记或报告分子可以是放射性同位素，如3H、14C、32P、35S或125I；荧光或化学发光部分如荧光素异硫氰酸酯或罗丹明；或者酶如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根过氧化物酶或荧光素酶。能够用于检测或测定样品中的Fel d1的特异性的示例性检测包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)和荧光活化的细胞分选(FACS)。
能够用于根据本发明的Fel d1诊断检测的样品包括从患者中获得的任意组织或液体样品，在正常或病理条件下其中含有可检测的量的Fel d1蛋白或其片段。通常地，首先检测来自健康的/无过敏性的患者(例如不存在与Fel d1的存在相关的敏感性的患者)的特定样品中的Fel d1的水平以建立Fel d1水平的基线或标准。然后将Fel d1的该基线水平与在来自疑似对猫皮屑中的Fel d1敏感或存在与此状况相关症状的个体的样品中测定的Fel d1水平进行比较。
实施例
阐述下述实施例以便向本领域普通技术人员提供如何制备和使用本发明的方法和组合物的完整公开和描述，并且其并非旨在限制发明人所认为的其发明的范围。已作出努力以确保关于所使用数字的准确性(例如数量、温度等)，但是应对一些实验误差和偏差予以考虑。除非另外指出，份数以重量份计、分子量是平均分子量、温度是摄氏度和压力是处于或接近大气压。
实施例1：针对Fel d1的人源抗体的生成
包含下述中任意一个的免疫原可以用于生成针对Fel d1的抗体。在某些实施方式中，本发明的抗体来自使用初始免疫原免疫的小鼠，如全长天然Fel d1(nFel d1)，其可以商购获得(例如来自室内生物技术公司(Indoor Biotechnologies)，#LTN-FD1-1)，或通过多步柱层析从猫毛或皮屑中分离(参见例如Chapman MD等，(1988),J.Immunol.140:812-818)，或者其可以重组生产(对于Fel d1链1的全长氨基酸序列参见GenBank登录号P30438或NP_001041618.1(也称为链A或FELD1A；亦参见SEQ ID NO:392)和对于Fel d1链2的全长氨基酸序列参见GenBank登录号P30440或NP_001041619.1(也称为链B或FELD B；亦参见SEQ ID NO:393))，或者所述Fel d1蛋白的链1或链2的片段，或链1和链2的片段，随后使用第二免疫原或使用所述天然蛋白具有免疫活性的片段免疫。可以仅使用链1蛋白或仅使用链2蛋白，或者使用链1和链2蛋白两者顺序或同时给予对动物进行免疫。可以使用链1和链2的部分，通过本领域技术人员公知的不同连接或间隔的策略制备不同的构建体。这些构建体可以单独或在各种组合中使用以便在体内激发抗体应答。例如，可以使用重组的Fel d1构建体如SEQ ID NO：385、394、395、396或397中示例的那些或其片段作为免疫原。
在某些实施方式中，本发明的抗体来自使用初始免疫原免疫的小鼠，如天然Fel d1具有生物活性的和/或免疫原性的片段，或编码其活性片段的DNA。所述片段可以来源于Feld1链1和/或链2的N-末端或C-末端结构域。
在某些实施方式中，可以通过直接将Fel d1的两条链融合制备重组生产的Fel d1免疫原，如Kaiser等所述，以生产与天然Fel d1具有相似折叠类型的融合产物(Kaiser,L.等，(2003),J.Biol.Chem.278(39):37730-37735)。在某些实施方式中，所述免疫原可以是融合蛋白，如在SEQ ID NO：385、394、395、396或397所示的构建体中显示的，随后使用第二免疫原或天然的或重组产生的Fel d1的具有免疫活性的片段进行免疫。
在某些实施方式中，在本申请所述的研究中使用的重组Fel d1蛋白构建体包括：i)由Fel d1B链(链2)和Fel d1A链(链1)连接形成的连续的、串联融合(在N-末端具有Fel d1B链)或者ii)在N-末端具有Fel d1A链，后接柔性接头[(Gly4Ser)3]，后接Fel d1B的连续的、串联融合。这些构建体还可以包括如下文所示的C-末端标签(myc-myc-His6或小鼠IgG2a Fc区)。在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达该蛋白。用于促进在CHO细胞中表达的外源性信号序列未包括在序列表中。
在某些实施方式中，所述免疫原可以是包含下述中的任意一个或多个的融合蛋白：i)通过C末端直接与Fel d1链1氨基酸残基23-92(参见GenBank登录号P30438，亦参见SEQ ID NO:392)的N末端融合的Fel d1链2的氨基酸氨基18-108(参见GenBank登录号P30440，亦参见SEQ ID NO:393)；ii)通过C末端直接与Fel d1链2氨基酸残基18-109(参见GenBank登录号P30440，亦参见SEQ ID NO:393)的N末端融合的Fel d1链1的氨基酸氨基23-92(参见GenBank登录号P30438，亦参见SEQ ID NO:392)；iii)通过C末端直接与Fel d1链1的氨基酸残基19-88(参见GenBank登录号NP_001041618.1)的N末端融合的Fel d1链2的氨基酸残基18-109(参见Genbank登录号NP_001041619.1)，例如如SEQ ID NO:394or 396所示的构建体；iv)通过C末端与Fel d1链2的氨基酸残基18-109(参见GenBank登录号NP_001041619.1)的N末端融合的Fel d1链1的氨基酸残基19-88(参见GenBank登录号NP_001041618.1)。亦参见SEQ ID NO:395。在某些实施方式中，所述融合蛋白可以在所述构建体的C末端具有标签，如myc-myc-六聚组氨酸标签(对于此类构建体参见SEQ ID NO：385、396或397)。在相关的实施方式中，所述融合蛋白可以具有偶联于所述构建体的C末端的小鼠抗体Fc区(对于此类构建体参见SEQ IDNO：394或395)。在某些实施方式中，链1和2通过本领域技术人员公知的接头偶联，例如(G4S)3(对于此类构建体参见SEQ ID NO：395和397)。
在某些实施方式中，可以使用上文所述区域的片段、或从本申请所述区域的N或C末端之一或两端延伸出指定区域约5至约20个氨基酸残基的肽制备特异性地与Fel d1结合的抗体。某些实施方式中，上文所述区域或其片段的任意组合可以用于制备Fel d1特异性抗体。在某些实施方式中，上文所述Fel d1区域中的任意一个或多个或其片段可以用于制备单特异性、双特异性或多特异性抗体。
如上文所述的用于作为免疫原的全长蛋白或其片段直接与刺激免疫应答的佐剂一起给予小鼠，所述小鼠包含编码人源免疫球蛋白重链和к轻链可变区的DNA。通过Fel d1特异性免疫测定监测抗体的免疫应答。当达到所需的免疫应答时，收集脾细胞并与小鼠骨髓瘤细胞融合，以保持其活力并形成杂交瘤细胞系。筛选并选择所述杂交瘤细胞系以鉴定产生Fel d1特异性抗体的细胞系。使用这种技术以及上文所述的不同免疫原获得了若干抗-Fel d1的嵌合抗体(即具有人源可变结构域和小鼠恒定结构域的抗体)；将使用这种方法生成的某些示例性抗体命名为H1M1230N、H1M1234N、H1M1241N、H2M1233N、H2M1236N、H2M1237N和H2M1242N。
还直接从未与骨髓瘤细胞融合的抗原阳性B细胞中分离抗-Fel d1抗体，如U.S.2007/0280945A1中所述。使用这种方法，获得了若干全人源抗-Fel d1抗体(即具有人源可变结构域和人源恒定结构域的抗体)；将使用这种方法生成的示例性抗体命名为如下：H4H2574P、H4H2590S、H4H2592B、H4H2594S、H4H2597P、H4H2606B、H4H2607B、H4H2608B、H4H2636P、H4H2645P、H4H2793P、H4H2797P和H4H2864P。
在下述实施例中对根据该实施例的方法生成的示例性抗体的生物学性质进行详细描述。
实施例2：重链和轻链可变区的氨基酸序列
表1中列出了选定的特异性地针对Fel d1的抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列对及其相应的抗体标识。本申请中涉及的抗体通常根据下述命名法：Fc前缀(例如“H4H”、“H1M、“H2M”)，后接数字标识(例如如表1中所示的“1232”)，后接“P”或“N”后缀。因此，根据这种命名法，可以将抗体称为例如“H1M1232N”。在本申请抗体命名中使用的H4H、H1M和H2M前缀标识抗体的特定Fc区。例如，“H2M”抗体具有小鼠IgG2Fc，而“H4H”抗体具有人源IgG4Fc。本领域的普通技术人员将理解，可以将H1M或H2M抗体转化为H4H抗体，反之亦然，但是在任何情况下，以表1中的数字标识表示的所述可变结构域(包括CDR)将仍保持不变。具有相同数字抗体命名但不同字母后缀N、B、S或P的抗体指重链和轻链具有相同的CDR序列但是在所述CDR序列以外的区域中(即在框架区中)具有序列差异的抗体。因此，特定抗体的N、B、S和P变体在其重链和轻链可变区中具有相同的CDR序列但是在其框架区中彼此存在差异。
表1
实施例3：可变基因的利用分析
为分析所生产的抗体的结构，将编码抗体可变区的核酸克隆并测序。从所述抗体的核酸序列和预测的氨基酸序列中，鉴定各重链可变区(HCVR)和轻链可变区(LCVR)的基因使用情况(VH、D、JH、VK或JK)。表2列出了根据本发明的选定抗体的基因使用情况。
表2
实施例4：根据表面等离子体共振测定的抗体与Fel d1的结合
使用实时表面等离子体生物传感器(Biacore T200或Biacore 2000)测定，确定抗原与抗-Fel d1单克隆抗体结合的结合速率常数和解离速率常数(分别为ka和kd)和经计算的平衡解离常数和解离半衰期(分别为KD和t1/2)。使用多克隆的家兔抗小鼠抗体(GE医疗集团，#BR-1008-38)或使用单克隆的小鼠抗人Fc抗体(GE医疗集团，#BR-1008-39)将Biacore传感器表面衍生化以捕获分别表达小鼠Fc(抗体ID前缀H1M、H2M、H2aM、H2bM)或人源IgG4Fc(抗体ID前缀H4H)的抗-Fel d1抗体。为了动力学拟合，在25℃、运行缓冲液(10mM HEPES、150mM NaCl、0.05％P20、3mM MgCl2、3mM CaCl2)流速为50μl/min的条件下，将至少两种不同浓度(范围为从390pM至67nM)的天然Fel d1(室内生物技术公司,#NA-FD1-2)或所述蛋白的重组版本Fel d1(B-A)-mmH(SEQ ID NO:396)注射至抗-Fel d1单克隆抗体捕获表面。Fel d1(B-A)-mmH在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中表达并且其包含与具有C-末端myc-myc-六聚组氨酸标签的Fel d1A的氨基酸23-92(登录号#P30438)串联融合的Fel d1B的氨基酸残基18-109(登录号#P30440)。对抗体-抗原的结合监测3-5分钟，并且对抗原从所述捕获单抗隆抗体上的解离(在25℃下仅在运行缓冲液中)监测10或15分钟。使用Scrubber 2.0曲线拟合软件通过将所述数据处理和拟合至1:1结合模型以确定动力学结合(ka)和解离(kd)速率常数。通过动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：KD＝kd/ka和t1/2＝ln(2)/kd。不同抗-Fel d1单克隆抗体的结合参数列于表3和表4。表3显示了25℃下天然Fel d1与捕获的抗-Fel d1单克隆抗体结合的Biacore亲和性，而表4显示了25℃下重组的Fel d1与捕获的抗-Fel d1单克隆抗体结合的Biacore亲和性。
如表3中所示，已检测的25个抗体中有10个显示出与天然Fel d1结合的KD值低于1nM，其范围为从207pM至982pM。如表4中所示，已检测的25个抗体中有17个显示出与重组Fel d1结合的KD值低于1nM，其范围为从144pM至924pM。其中有两个抗体H4H2574B和H4H2793P在这些实验条件下与重组体结合但不与天然Fel d1结合。
表3
*由于观察到的结合亲和性较低，因而该样品使用了更高注射浓度的天然Fel d1(67nM、200nM、and 600nM)。
表4
*由于观察到的结合亲和性较低，因而该样品使用了更高注射浓度的重组Fel d1(67nM、200nM、and 600nM)。
实施例5：抗-Fel d1抗体与天然(n)Fel d1结合的交叉竞争
使用Octet Red生物传感器系统(Fortebio Inc.)进行结合实验以确定一组8个抗-Fel d1抗体与天然Fel d1(nFel d1；室内生物技术公司，#NA-FD1-2)结合的交叉竞争。该实验在25℃下在含有0.1mg/mL BSA的HBST缓冲液(0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mMEDTA、0.05％v/v表面活性剂P20)中进行。在各结合步骤之间使用HBST缓冲液进行洗涤步骤，在结合和洗涤步骤过程中使用轨道平板振荡器在1000rpm下振荡所述板。将第一抗-Fel d1抗体(mAb-1)从10ug/mL的抗体储备液中捕获至所述抗-hFc生物传感器表面上2分钟(最终的捕获水平～1.5nm响应单位)。然后使用100ug/mL无关抗体溶液阻断已涂覆的传感器尖端5分钟。之后将传感器尖端浸入含500nM nFel d1的孔中5分钟，然后进入含50ug/mL第二抗-Fel d1抗体(mAb-2)溶液的孔中。在mAb-2溶液中加入100ug/mL无关抗体以便将非特异性结合最小化。针对8x8的抗体矩阵测定mAb-2与nFel d1同mAb-1预先形成的复合物的结合应答(表5)。从mAb-2与不同mAb-1/Fel d1捕获表面结合的各结合值(表5中的下面一栏)中减去mAb-1/Fel d1/mAb-2的自身竞争值(其中mAb-1＝mAb-2；横跨表5中的对角线)。低于0.10nm的值表明mAb-1和mAb-2交叉竞争Fel d1上的共同结合位点。
四个抗体H4H2636P、H4H1616N、H4H2645P和H4H2864P彼此双向竞争与nFel d1的结合，但是不与任意其他的抗-Fel d1抗体竞争。两个抗体H4H1232N和H4H2597P彼此双向竞争与nFel d1的结合。H4H1232N和H4H2597P均单向与H4H1300N竞争。不能确定H4H1300N的双向竞争，因为H4H1300N没有预先与nFel d1形成复合物。H4H1238N不与任意抗Fel d1抗体竞争与nFel d1的结合。
表5
实施例6：抗-Fel d1抗体在被动皮肤过敏(PCA)体内模型中的作用
使用被动皮肤过敏(PCA)体内模型评估体内的肥大细胞的脱颗粒。该模型涉及将过敏原特异性抗血清皮内注射至皮肤上的局部区域，随后静脉内注射抗原和染料。过敏反应导致致敏部位毛细血管扩张和血管通透性增加，从而导致染料优先累积在这一部位。可以从该组织中提取染料并使用分光光度法进行定量。将外渗进入使用待测抗血清致敏的组织的染料与外渗进入使用无关抗血清致敏的组织的染料进行比较。
通过使用含5μg从猫毛提取物中纯化的天然Fel d1蛋白(室内生物技术公司，LTN-FD1-1)、5μg粗花生过敏原提取物(Greer实验室，#XPF171D3A25)或1250生物当量过敏原单位(BAU)的标准化的猫毛提取物(Greer实验室，#GTE3A01)的1mg/ml alum(Pierce，#77161)的1X磷酸盐缓冲液免疫Balb/c小鼠生成抗血清。两周后(第14天)，使用与初始免疫所使用的那些相同剂量的过敏原对致敏小鼠进行加强免疫。加强免疫两周后(第28天)，处死小鼠并收集血清。通过ELISA测定在分离的血清中的总IgE浓度。将抗血清的终浓度稀释至在1X磷酸盐缓冲液中含2400ng/mL IgE。
为了确定在PCA模型中抗-Fel d1抗体对肥大细胞脱颗粒的作用，在使用根据上文所述产生的抗血清对耳部进行致敏前，将各组的Balb/c小鼠首先皮下注射人源IgG4同种型对照抗体、抗-Fel d1抗体或抗-Fel d1抗体的组合，除非另外指出，在单点实验中的剂量为5mg/kg(总抗体剂量，每个抗体2.5mg/kg)或者在剂量范围实验中浓度范围为0.06mg/kg至2mg/kg。使用抗体预处理3天后，通过将10μl天然Fel d1来源的抗血清或10μl花生来源的抗血清(阴性对照)分别皮下注射至各只小鼠的右耳和左耳，将一组小鼠致敏(“天然Fel d1组”)。通过将20μL猫毛提取物来源的抗血清或20μL花生来源的抗血清(阴性对照)分别皮下注射至各只小鼠的右耳和左耳，将第二组小鼠致敏(“猫提取物组”)。致敏24小时后，通过静脉注射溶液攻击天然Fel d1组的小鼠(100μL每只小鼠)，所述溶液为将0.25μg/mL天然Fel d1(室内生物技术公司，#LTN-FD1-1)溶解在含有0.5％(w/v)伊文思蓝染料(西格玛，#E2129)的1X磷酸盐缓冲液中的溶液。类似地，致敏24小时后，使用溶解在含有0.5％(w/v)伊文思蓝染料(西格玛，#E2129)的1X磷酸盐缓冲液中的250BAU标准化的猫毛提取物[标准化的猫毛提取物(Greer实验室，#GTE3A01)]攻击猫提取物组的小鼠。抗原攻击1小时后，处死小鼠，切下鼠耳并将其置于1mL甲酰胺中在56℃下孵育3天以便从该组织中提取伊文思蓝染料。然后将耳组织从甲酰胺中取出，吸干以除去过量的液体并称重。各甲酰胺提取物均取200微升分装液转移至96孔板中，设置双复孔。在620nm处测定所得到的上清液的吸光度。使用标准曲线将OD值转化成伊文思蓝染料的浓度。计算使用同种型对照抗体处理组伊文思蓝染料外渗进入抗血清致敏耳组织(利用耳组织重量进行归一化)的平均浓度并定义为F(同种型，平均值)。通过使用F(同种型，平均值)减去针对抗体处理组的Fel d1或提取物致敏耳的伊文思蓝染料量(定义为F(mAb，i))计算每只小鼠由抗体预处理导致的伊文思蓝染料外渗的减少。然后用该数量除以F(同种型，平均值)与抗体处理组花生致敏耳的染料量[P(mAb，i)]之差并且再乘以100，得出各只小鼠染料外渗的总体减少百分率(％减少)。
％减少(每只小鼠)＝100*[F(同种型，平均值)–F(mAb,i)]/[F(同种型，平均值)–P(mAb,i)]
然后计算各抗体组染料渗漏的平均减少百分率。以伊文思蓝减少的百分率表示(平均值±SD)的结果如表6所示，表7中为天然Fel d1组和表8中为猫毛提取物组。
如表6中所示，天然Fel d1组的7组小鼠，当使用固定浓度的抗-Fel d1抗体的特定组合处理时，与使用对照抗体的小鼠相比，显示出染料外渗减少的范围为79％至103％。与使用对照抗体的小鼠相比，使用H4H2590S/H4H1238N、H4H2590S/H4H2574P或H4H1232N/H4H1616N配对抗体组合处理的小鼠显示出的染料外渗减少小于3％，这表明不是在这个模型中检测的所有抗-Fel d1抗体均是有效的。
此外，使用天然Fel d1组的小鼠进行了剂量范围实验，如表7所示。在所测试的剂量下，单一抗体在减少染料外渗方面不及抗-Fel d1抗体的组合有效。
多剂量水平的特异性的抗-Fel d1抗体对(H4H2636P和H4H1232N)，以及单一(最高)剂量水平的单独的这些抗-Fel d1抗体均在PCA模型中使用猫毛提取物致敏和攻击的小鼠中进行了进一步的检测，如表8所示。在2mg/kg时，这些单一的抗-Fel d1抗体当单独使用时在减少染料外渗方面不及两种抗体联用有效。在使用猫毛提取物作为免疫原的PCA模型中，在2mg/kg和1mg/kg时H4H2636P与H4H1232N的组合与同种型对照相比均使染料外渗降低超过90％。
通过双因素方差分析(two-way ANOVA)结合Bonferroni事后检验确定的与同种型对照相比具有统计学意义(p<0.05)的所有的减少均以星号(*)表示。各组使用的小鼠数量(n)在表中的括号内显示。
表6
§总抗体浓度为10mg/kg；**总抗体浓度为0.5mg/kg
表7
表8
实施例7：在肺部炎症体内模型中抗-Fel d1抗体的作用
使用肺部炎症体内小鼠模型评估可能与哮喘或鼻结膜炎相关的过敏原诱导的肺部炎症和粘液蓄积。该模型涉及重复鼻内给予此前经过敏原致敏的小鼠过敏原。这种过敏原相关的炎症能够引起肺部粘液蓄积的增加、嗜酸性粒细胞迁移进入肺的增加、血清总IgE的增加和过敏原特异性IgG1水平的增加。
使用在含1mg/mL alum(Pierce,#77161)的1X磷酸盐缓冲液溶液中的1ug从猫毛提取物中纯化的天然Fel d1蛋白(室内生物技术公司，#LTN-FD1-1)，腹腔注射免疫Balb/c小鼠。7天后，使用在含1mg/mL alum的1X磷酸盐缓冲液中的1ug天然Fel d1腹腔注射加强免疫已致敏的小鼠。在第17、21和25天，向各组小鼠(n＝5)皮下注射人IgG4同种型对照抗体或1:1组合的抗-Fel d1抗体H4H1232N和H4H2636P，剂量为20mg/kg(总抗体剂量)。在第20、24和28天，使用稀释于20uL 1X磷酸盐缓冲液中的0.05ug天然Feld1鼻内给药攻击小鼠。在同日，使用20uL 1X磷酸盐缓冲液攻击对照小鼠。在第32天，将所有小鼠处死并收集其肺。各组小鼠的实验剂量和给药方案如表9所示。
为确定在小鼠血清中循环的总IgE和Fel d1特异性IgG1，通过使用配有针头的27G1/21mL TB注射器(BD公司，#309306)通过末端心脏穿刺收集各只小鼠的血清样品。将血液样品置于血清分离管(BD公司，#365956)中，离心，然后将血清转移至新管中贮存直至进行分析。
为确定各只小鼠血清样品中的总IgE浓度，根据生产厂商的说明书使用三明治ELISAOPTEIA试剂盒(BD生物科学，#555248)。稀释血清样品并将其在抗-IgE捕获抗体包被的96孔板中孵育。使用生物素化的抗小鼠IgE二抗检测总的IgE。使用纯化的辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠IgE作为标准品。使用发色团3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)(BDOPTEIA底物试剂组，BD，#555214)检测HRP的活性。然后加入终止液1M的硫酸，在分子装置公司(Molecular Devices)的SpectraMax M5酶标仪上测定450nm的吸光度。使用PrismTM软件进行数据分析。在各实验组中的循环IgE水平的平均量以ng/mL(±SEM)表示，如表10所示。与使用同种型对照抗体的小鼠相比[14080(±1505)ng/mL]，当使用抗-Fel d1抗体的组合治疗鼻内给予Fel d1攻击的小鼠时，显示出循环的IgE量显著降低[6683(±1394)ng/mL]。
为确定各只小鼠的血清样品中Fel d1特异性IgG1的水平，使用了ELISA。使用系列稀释的小鼠血清样品孵育经Fel d 1包被的板，随后使用抗小鼠IgG1-HRP缀合的抗体(BD生物科学，#559626)孵育。使用TMB溶液对所有样品显色并进行如上文所述的分析。血清中循环IgG1的相对水平以滴度单位表示(滴度单位通过将所测定的OD乘以使OD450达到高于本底两倍所需的稀释因子计算得到)。各实验组血清中的平均循环Fel d1特异性IgG1水平均以滴度x 103(±SEM)表示，如表11所示。与使用同种型对照抗体的小鼠相比[滴度为526.1(±144.0)x103]，当使用抗-Fel d1抗体的组合治疗鼻内给予Fel d1攻击小鼠时，其血清中Fel d1特异性IgG1水平的量显示出显著的降低[滴度为105.3(±31.33)x103]。
用于细胞浸润分析的肺收集：
放血后，从各只小鼠中取下右肺并置于含有杜尔贝科改良的伊格尔培养基(DMEM)(Irvine Scientific公司，#9033)的小皮氏培养皿中，并将其切碎成尺寸约2至3mm的小块。然后将小块转移至含有使用汉克氏平衡盐溶液(HBSS)(Gibco，#14025)稀释的20μg/mL DNAse(罗氏，#10104159001)和0.7U/mL Liberase TH(罗氏，05401151001)溶液的试管中并置于37℃的水浴中20分钟，每5分钟涡旋一次。然后通过加入终浓度为10mM的乙二胺四乙酸(EDTA)(Gibco，#15575)终止该反应。将各个肺过筛，过滤通过70μm的滤器，离心，然后将肺球团重悬于4mL的ACK裂解缓冲液中(Gibco，#10492)以除去红细胞。在室温下孵育3分钟后，加入DMEM使ACK缓冲液失活。将该细胞悬液离心，然后将细胞球团重悬于10mL MACS缓冲溶液中[美天旎自动MACS冲洗溶液(美天旎生物技术(Militenyi Biotec)，#130-091-222)和MACS BSA(美天旎生物技术，#130-091-376)的混合物。将混悬样品过滤通过70μm滤器并将1x106个细胞接种于96孔V底培养板上。然后将细胞离心并将球团重悬于使用MACS缓冲液稀释的经纯化的大鼠抗小鼠CD16/CD32Fc Block(BD生物技术克隆：2.4G2，#553142)中，在40℃下放置15分钟。洗涤细胞两次，然后在使用MACS缓冲液稀释的适宜的抗体混合物(如表12中所述)中于4℃下避光孵育30分钟。抗体孵育后，在MACS缓冲液中洗涤细胞两次并重悬于BD cytofix(BD生物科学，#554655)中，在4℃下避光放置15分钟。洗涤细胞，重悬于MACS中，然后转移至BD FACS管(BD生物科学，#352235)中用于通过流式细胞术对嗜酸性粒细胞进行分析。将嗜酸性粒细胞定义为CD45+、GR1-、CD11clo、SiglecFhi的细胞。数据在表13中以在CD45+细胞中嗜酸性粒细胞的出现频率(±SEM)表示。
如表13中所示，与未使用抗体(降低67％)或使用同种型对照抗体的小鼠相比(降低46％)，当使用抗-Fel d1抗体的组合治疗鼻内给予Fel d1攻击的小鼠时，在CD45+细胞群中嗜酸性粒细胞的频率显示出显著的降低。
用于组织学分析的肺收集：
放血后，取下左肺并置于含5mL溶液的试管中，所述溶液是含有4％(w/v)多聚甲醛(波士顿生物制品，#BM-155)的1X磷酸盐缓冲液并在室温条件下贮存了3天。然后将肺样品吸干并转移至含有70％乙醇的试管中用于组织学分析。将所述样品送至Histoserv,Inc(Germantown,MD)进行切片和过碘酸希夫试剂(PAS)染色。
使用配有蔡斯AxioCam MRc照相机的蔡斯Axioplan 2成像光学显微镜对每个PAS染色肺切片的全部区域采集约35张数码图像。然后从较小的图像构建全肺图像并使用配有辅助颜色阈值插件的ImageJ软件进行分析。鉴定在支气管腔中粘液蓄积的区域，并通过用户选择的颜色阈值进行定量并归一化至所述腔的总面积，所述总面积通过独立的颜色阈值设置进行鉴定和定量。各个肺中由粘液蓄积占据的支气管腔的百分率以[(粘液面积/腔面积)x 100]表示，并针对各个治疗组进行计算。以肺阻塞的平均百分率(±SEM)表示的结果如表14所示。
如表14所示，在肺脏炎症模型中，与使用对照抗体的小鼠(粘液蓄积为10.81+/-1.13％)相比，使用抗-Fel d1抗体的组合治疗的小鼠在肺支气管中的粘液蓄积呈现出减少的趋势(粘液蓄积为5.21+/-0.81％)。在各组小鼠之间未观察到支气管腔尺寸或整个肺尺寸存在差异。
表9：各组Balb/c小鼠的实验剂量和给药方案
表10：在小鼠血清中的总循环IgE水平
表11：在小鼠血清中的循环Fel d1特异性IgG1
表12：用于流式细胞术分析的抗体
表13：通过流式细胞术确定的在CD45+细胞中嗜酸性粒细胞的出现频率
表14：肺阻塞(粘液面积/腔面积，％)
实施例8：氢-氘交换表位定位
为了确定被两个抗-Fel d1抗体识别的Fel d1(包含Fel d1链A和FELD1链B的异源二聚体蛋白)的表位，对各抗体与Fel d1的共复合物进行了氢-氘(H/D)交换研究。在H/D交换实验以前，将CHO细胞表达的重组Fel d1在使用PNGase F(新英格兰生物实验室，#0704)的天然条件下于37℃脱糖基化4小时，所述Fel d1包含与FELD1A的氨基酸19-88(GenBank登录号#NP_001041618.1)串联融合的Fel d1链B的氨基酸18-109(GenBank登录号NP_001041619.1)，所述FELD1A的氨基酸19-88具有C-末端myc-myc-六聚组氨酸标签和D27G突变(Fel d1B-A-mmH；SEQ ID:396)。对与这项研究，根据生产厂商的试验方案，将两个抗-FELD1抗体(H4H1232N和H4H2636P)共价附着于N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)琼脂糖小珠(GE生命科学，#17-0906-01)上。
为了定位被H4H1232N识别的Fel d1B-A-mmH结合表位，进行两组H/D交换实验(所有的结合和交换反应均在室温下进行)。第一项实验使用“结合-溶液/解离-小珠”形式(在溶液中结合-交换，随后在小珠上解离-交换)。对于结合-交换而言，将脱糖基化的Feld1B-A-mmH蛋白在使用D2O制备的pH 7.4的PBS缓冲液中氘化5和10分钟(在两项独立的子实验中)，然后在PBS-D中孵育2分钟期间将其与H4H1232N小珠结合。然后使用由H2O制备的pH 7.4的PBS缓冲液(PBS-H)洗涤Fel d1B-A-mmH-结合至H4H1232N小珠的共复合物，并在PBS-H中孵育一半的结合-交换时间(解离-交换)，从而仅允许Feld1B-A-mmH上的表位通过与保持氘化的H4H1232N抗体结合被保护。在解离-交换后，使用冰冷的0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液从小珠上洗脱结合的Fel d1B-A-mmH。然后在4℃下使用固化的胃蛋白酶(赛默飞科技(Thermo Scientific)，#20343)消化洗脱的Feld1B-A-mmH 5分钟。使用ZipTip层析移液吸头(密理博(Millipore)，#ZTC18S096)根据生产厂商的试验方案在4℃下将所得到的肽脱盐，然后立即在UltrafleXtreme基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(MS)上进行分析。
第二项实验被称为“结合-小珠/解离-小珠”(在小珠上结合-交换，然后在小珠上解离-交换)。对于这项实验而言，将脱糖基化的Fel d1B-A-mmH首先结合至H4H1232N小珠，然后在PBS-D中孵育5或10分钟(在两项独立的子实验中)以便进行结合-交换。随后的步骤(解离-交换、胃蛋白酶消化和MS分析)按照上文所述的“结合-溶液/解离-小珠”程序进行。计算所有经检测肽的质心值或平均质核比(m/z)并对结合-溶液/解离-小珠和结合-小珠/解离-小珠实验之间进行比较。
与结合-小珠/解离-小珠程序相比，在经过结合-溶液/解离-小珠程序后，质量增加的肽包含了在Fel d1蛋白中的由于抗体结合而在交换中被保护的氨基酸，由此揭示了结合表位区。
使用与上文针对H4H1232N所述相同的程序，针对Fel d1B-A-mmH与抗-Fel d1抗体H4H2636P的结合进行H/D交换实验，但是使用H4H2636P小珠代替H4H1232N小珠。
对在Fel d1B-A-mmH与H4H1232N的H/D交换实验中检测的所有肽的质心m/z值的比较结果如表15中所示。通过液相色谱-基质辅助激光解吸电离(LC-MALDI)MS对这些肽进行鉴定。针对两个不同的结合-交换和解离-交换时间，大部分的胃蛋白酶消化肽在结合-溶液/解离-小珠和结合-小珠/解离-小珠方案中给出了相似的质心值(差异<0.3单位)。然而，在5分钟和10分钟实验中，氨基酸跨距为Fel d1B-A-mmH(SEQ ID NO:396)的85-103、85-104和113-127的三个肽的m/z质心值差异>0.3。在表15中，在结合-溶液/解离-小珠和结合-小珠/解离-小珠方案中这些质心值之差用粗体显示。由于另一个肽SEQ IDNO:396的氨基酸117-127在解离-交换后未显示出氘保留，因而在113-127肽中的在交换中被保护的区域缩小至SEQ ID NO:396的残基113-116。作为在结合-交换后H4H1232N与Fel d1B-A-mmH结合的结果，两个区域残基85-104(SEQ ID NO:403)和113-116(SEQ IDNO:426)在整个解离-交换中被保护。因此，通过H/D交换法将这两个区段定义为抗体H4H1232N与Fel d1B-A-mmH蛋白结合的不连续的表位。
对在Fel d1B-A-mmH与H4H2636P复合的H/D交换实验中测得的肽的质心m/z值的比较结果如图16中所示。与结合-小珠/解离-小珠条件下相比，在结合-溶液/解离-小珠条件下，仅有一个肽FELD1B-A-mmH的氨基酸15-24显示出质心m/z值增加>0.3m/z，表明该区段在与H4H2636P的全部解离-交换中被保护。质心值之差大于0.3m/z的在表16中加粗表示。因此，基于H/D交换法在该15-24区域(SEQ ID NO:412)中的氨基酸包括了抗体H4H2636P与Fel d1B-A-mmH蛋白结合的表位。
表15：根据胃蛋白酶消化肽的质心m/z值测定的H4H1232N与Fel d1B-A-mmH结合对H/D交换的影响
表16：根据胃蛋白酶消化肽的质心m/z值测定的H4H2636P与Fel d1B-A-mmH结合对H/D交换的影响
实施例9：双特异性抗体的生成
对所生产的Fel d1双特异性抗体的描述
使用标准方法学构建双特异性抗体，所述双特异性抗体包含来自本发明所述的某些抗-Fel d1抗体对的重链和轻链结合的结构域。用于构建本实施例的双特异性抗体的抗-Fel d1抗体来自使用初始免疫原免疫的小鼠，初始免疫原例如全长天然Fel d1，其可以商购获得(例如来自室内生物技术公司，#LTN-FD1-1)，或通过多步柱层析从猫毛或皮屑中分离(参见例如Chapman MD等，(1988),J.Immunol.140:812-818)，或者其可以是重组生产的(对于Fel d1链1的全长氨基酸序列参见GenBank登录号P30438或NP_001041618.1(也称为链A或FELD1A；亦参见SEQ ID NO:392)和对于Fel d1链2的全长氨基酸序列参见GenBank登录号P30440或NP_001041619.1(也称为链B或FELD B；亦参见SEQ ID NO:393))，或者所述Fel d1蛋白的链1或链2的片段，或链1和链2的片段，随后使用第二免疫原或使用所述天然蛋白具有免疫活性的片段免疫。在一个实施方式中，所使用的免疫原如SEQ ID NO:394(Fel d1链2-链1-mFc的串联融合)或SEQ ID NO:395(使用接头的Fel d1链1与链2-mFc的融合)中所示例的。
在根据本发明的实施例中生产的双特异性抗体包含两个抗原结合结构域(即“结合臂1和2”)。
命名为H4H3467D的所述双特异性抗体之一包含来源于抗体H4H2864P(SEQ ID NO:378)的在两个Fab上的共有к轻链。H4H3467D的一个Fab臂利用来自抗体H4H2864P(SEQID NO:370)的重链可变区(VH)，而另一个Fab臂利用来自H4H1232N(SEQ ID NO:18)的VH区。
命名为H4H8751D的本发明的第二个双特异性抗体包含来源于抗体H4H2636P(SEQID NO:314)的在两个Fab上的共有к轻链。H4H8751D的一个Fab臂利用来自抗体H4H2636P(SEQ ID NO:306)的VH区，而另一个Fab臂利用来自H4H1232N(SEQ ID NO:18)的VH区。
下表17提供了根据实施例9制备的两个双特异性抗体的抗原结合结构域的组成部分。来源于母体抗体(用于制备所述双特异性抗体)的不同重链和轻链可变区的氨基酸序列标识也在表17中提供。
表17：所生产的双特异性抗体的两个臂的组成部分
下表18A和18B显示了本申请所述的两个双特异性抗体的不同重链可变区(表18A)和轻链可变区(表18B)及其相应的互补性决定区序列(CDR)的氨基酸序列标识。
表18A：所生产的双特异性抗体的HCVR和HCDR序列标识
表18B：所生产的双特异性抗体的LCVR和LCDR序列标识
双特异性抗体的Biacore分析以确定结合和解离值
采用实时表面等离子体共振生物传感测定，在Biacore 2000仪器上确定天然Fel d1(下文中称为nFel d1)与纯化的抗-Fel d1单特异性和双特异性抗体结合的结合速率常数和解离速率常数(分别为Ka和Kd)、平衡解离常数和解离半衰期(分别为KD和t1/2)。在CM5芯片上，使用EDC-NHS化学，使用单克隆小鼠抗人源Fc抗体(GE,#BR-1008-39)，将Biacore传感器的表面衍生化以捕获抗-Fel d1单特异性和双特异性抗体。在25℃下在HBSP+运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM CaCl2、3mM MgCl2、0.05％v/v表面活性剂P20)中进行所有的Biacore结合研究。以50μL/min的流速将在HBSP+运行缓冲液中制备的不同浓度的nFel d 1(室内生物技术，#NA-FD1-2)(范围为600nM至2.34nM，6倍稀释)注射至捕获了抗-Fel d1抗体的表面。对nFel d1与被捕获的单克隆抗体的结合进行4分钟监测，并监测7分钟nFel d1在HBSP+运行缓冲液中的解离。使用Scrubber 2.0c曲线拟合软件，通过将实时传感图拟合至具有质量转运限的1:1结合模型，确定动力学结合速率常数(Ka)和解离速率常数(Kd)。然后通过动力学速率常数计算结合解离平衡常数(KD)和解离半衰期(t1/2)：KD(M)＝kd/ka和t1/2(min)＝[ln2/(60*kd)]。
在25℃下nFel d1与不同抗-Fel d1单特异性和双特异性抗体结合的结合动力学如表19所示。三个单特异性抗-Fel d1抗体与nFel d1结合的KD值的范围为155pM至1.6nM。两个双特异性抗-Fel d1抗体H4H3467D和H4H8751D与nFel d1结合的KD值分别为250pM和347pM。
表19：在25℃下抗-Fel d1的单特异性和双特异性抗体与nFel d1结合的结合动力学
为确定与其单特异性母体抗体相比，所述抗-Fel d1双特异性抗体的体内效能，在使用天然Fel d1致敏和攻击的PCA体内模型中对这些抗体以及同种型的对照抗体进行检测，在此前已对其进行了描述(参见实施例6)。在这项研究中，抗体以总抗体浓度1mg/kg给予(当同时给予两个抗体时，每个抗体使用0.5mg/kg)，每个实验组使用8只小鼠。各实验组的数据以染料外渗减少％±SD表示，如表20所示。
单特异性抗体H4H1232N和H4H2864P使染料外渗分别减少67(±26)％和81(±26)％。单特异性抗体H4H1232N和H4H2864P的组合使染料外渗减少98(±3.5)％，而由单特异性抗体H4H1232N和H4H2864P组成的双特异性H4H3467D使染料外渗减少93(±11)％。
在另一项实验中，单特异性抗体H4H1232N和H4H2636P使染料外渗分别减少64(±33)％和8.7(±79)％。单特异性抗体H4H1232N和H4H2636P的组合使染料外渗减少90(±15)％，而由单特异性抗体H4H1232N和H4H2636P组成的双特异性抗体H4H8751D使染料外渗减少77(±20)％。
表20：在被动皮肤过敏(PCA)体内模型中抗-Fel d1双特异性抗体及其母体单特异性抗体的作用

Claims (53)

1.一种分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与Fel d1特异性地结合，其中所述抗体或其抗原结合片段是不同于IgA同种型的同种型。
2.根据权利要求1所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段具有选自下组的同种型：IgG1、IgG2和IgG4。
3.根据要求1或2所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中通过表面等离子体共振测得所述人源抗体或其抗原结合片段与Fel d1特异性结合的KD等于或小于10-6M。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含三个重链CDR(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，所述重链CDR包含在任意一个选自下组的重链可变区(HCVR)序列中：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354和370；和三个轻链CDR(LCDR1、LCDR2和LCDR3)，所述轻链CDR包含在任意一个选自下组的轻链可变区(LCVR)序列中：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362和378。
5.根据权利要求1-4中任意一项所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含具有选自下组的氨基酸序列的HCVR：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354和370。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含具有选自下组的氨基酸序列的LCVR：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362和378。
7.根据权利要求1-6中任意一项所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：(a)HCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354和370；和(b)LCVR，所述具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362和378。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
(a)HCDR1结构域，所述HCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：4、20、36、52、68、84、100、116、132、148、164、180、196、212、228、244、260、276、292、308、324、340、356和372；
(b)HCDR2结构域，所述HCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：6、22、38、54、70、86、102、118、134、150、166、182、198、214、230、246、262、278、294、310、326、342、358和374；
(c)HCDR3结构域，所述HCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：8、24、40、56、72、88、104、120、136、152、168、184、200、216、232、248、264、280、296、312、328、344、360和376；
(d)LCDR1结构域，所述LCDR1结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：12、28、44、60、76、92、108、124、140、156、172、188、204、220、236、252、268、284、300、316、332、348、364和380；
(e)LCDR2结构域，所述LCDR2结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：14、30、46、62、78、94、110、126、142、158、174、190、206、222、238、254、270、286、302、318、334、350、366和382；以及
(f)LCDR3结构域，所述LCDR3结构域具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：16、32、48、64、80、96、112、128、144、160、176、192、208、224、240、256、272、288、304、320、336、352、368和384。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对，所述氨基酸序列对选自下组：SEQID NO：2/10、18/26、34/42、50/58、66/74、82/90、98/106、114/122、130/138、146/154、162/170、178/186、194/202、210/218、226/234、242/250、258/266、274/282、290/298、306/314、322/330、338/346、354/362和370/378。
10.根据权利要求1至9中任意一项所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与选自下组的至少一个氨基酸序列相互作用：SEQ ID NO:396的范围从约位置15至约位置24的氨基酸残基；SEQ ID NO:396的范围从约位置85至约位置103的氨基酸残基；SEQ ID NO:396的范围从约位置85至约位置104的氨基酸残基；和SEQ ID NO:396的范围从约位置113至约位置127的氨基酸残基。
11.根据权利要求10所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与SEQ ID NO:396的范围从约位置15至约位置24的氨基酸残基相互作用。
12.根据权利要求10所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与SEQ ID NO:396的范围从约位置85至约位置103的氨基酸残基相互作用。
13.根据权利要求10所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与SEQ ID NO:396的范围从约位置85至约位置104的氨基酸残基相互作用。
14.根据权利要求10所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与SEQ ID NO:396的范围从约位置113至约位置127的氨基酸残基相互作用。
15.根据权利要求1至10中任意一项所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与选自下组的至少一个氨基酸序列相互作用：SEQ ID NO：402、403、404和412。
16.根据权利要求15所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与SEQ ID NO:402相互作用。
17.根据权利要求15所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与SEQ ID NO:403相互作用。
18.根据权利要求15所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与SEQ ID NO:404相互作用。
19.根据权利要求15所述的分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段与SEQ ID NO:412相互作用。
20.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的根据权利要求1-19中任意一项所述的一种或多种分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段特异性地与Fel d1结合，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
21.一种药物组合物，所述药物组合物包含治疗有效量的根据权利要求1-19中任意一项所述的特异性地与Fel d1结合的第一分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，和特异性地与Fel d1结合的第二分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
22.根据权利要求21所述的药物组合物，其中：
(a)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列的HCVR和具有如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列的LCVR；并且
(b)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第二人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：66、130、162、306、322和370；和LCVR，所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：74、138、170、314、330和378。
23.根据权利要求21所述的药物组合物，其中：
(a)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含具有如SEQ ID NO:242所示的氨基酸序列的HCVR和具有如SEQ ID NO:250所示的氨基酸序列的LCVR；并且
(b)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第二人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR，所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：306和322；和LCVR，所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：314和330。
24.根据权利要求21所述的药物组合物，其中：
(a)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：18/26；并且
(b)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第二人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：66/74、130/138、162/170、306/314、322/330和370/378。
25.根据权利要求21所述的药物组合物，其中：
(a)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：18/26；和
(b)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第二人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：130/138。
26.根据权利要求21所述的药物组合物，其中：
(a)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：18/26；和
(b)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第二人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：322/330。
27.根据权利要求21所述的药物组合物，其中：
(a)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：18/26；和
(b)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第二人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：306/314。
28.根据权利要求21所述的药物组合物，其中：
(a)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：18/26；和
(b)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第二人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：370/378。
29.根据权利要求21所述的药物组合物，其中：
(a)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：242/250；和
(b)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第二人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含选自下组的HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：306/314和322/330。
30.根据权利要求21所述的药物组合物，其中：
(a)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：242/250；和
(b)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第二人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：306/314。
31.根据权利要求21所述的药物组合物，其中：
(a)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第一人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：242/250；和
(b)所述特异性地与Fel d1结合的分离的第二人源单克隆抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对：SEQ ID NO：322/330。
32.根据权利要求20所述的药物组合物，所述组合物包含特异性地与Fel d1结合的四种分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述人源抗体或其抗原结合片段包含HCVR/LCVR氨基酸序列对SEQ ID NO：18/26、66/74、130/138和162/170。
33.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与含有重链可变区(HCVR)的互补性决定区(CDR)和轻链可变区(LCVR)的CDR的抗体或其抗原结合片段竞争与Fel d1的特异性的结合，其中所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ IDNO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354和370，其中所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362和378。
34.一种分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与含有重链可变区(HCVR)的互补性决定区(CDR)和轻链可变区(LCVR)的CDR的抗体或其抗原结合片段结合Fel d1上的相同表位，其中所述HCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO：2、18、34、50、66、82、98、114、130、146、162、178、194、210、226、242、258、274、290、306、322、338、354和370，其中所述LCVR具有选自下组的氨基酸序列：SEQID NO：10、26、42、58、74、90、106、122、138、154、170、186、202、218、234、250、266、282、298、314、330、346、362和378。
35.一种核酸分子，所述核酸分子编码与Fel d1特异性地结合的根据权利要求1-19中或权利要求33-34中任意一项所述的人源单克隆抗体或其片段。
36.一种表达载体，所述表达载体包含根据权利要求35所述的编码与Fel d1特异性地结合的人源单克隆抗体或其片段的核酸分子。
37.一种宿主细胞，所述宿主细胞含有根据权利要求36所述的表达载体。
38.一种与Fel d1特异性地结合的双特异性抗原结合分子，，所述双特异性抗原结合分子包含第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:370所示的HCVR氨基酸序列和如SEQ ID NO:378所示的LCVR氨基酸序列，以及第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:18所示的HCVR氨基酸序列和如SEQID NO:378所示的LCVR氨基酸序列。
39.根据权利要求38所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域包含分别由SEQ ID NOs：372、374和376所示的氨基酸序列组成的三个重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，和分别由SEQ ID NO：380、382和384所示的氨基酸序列组成的三个轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)；以及其中所述第二抗原结合结构域包含分别由SEQ ID NO：20、22和24所示的氨基酸序列组成的三个重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，和分别由SEQ ID NO：380、382和384所示的氨基酸序列组成的三个轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
40.一种与Fel d1特异性地结合的双特异性抗原结合分子，所述双特异性抗原结合分子包含第一抗原结合结构域，所述第一抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:306所示的HCVR氨基酸序列和如SEQ ID NO:314所示的LCVR氨基酸序列，及第二抗原结合结构域，所述第二抗原结合结构域包含如SEQ ID NO:18所示的HCVR氨基酸序列和如SEQ ID NO:314所示的LCVR氨基酸序列。
41.根据权利要求40所述的双特异性抗原结合分子，其中所述第一抗原结合结构域包含分别由SEQ ID NO：308、310和312所示的氨基酸序列组成的三个重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，和分别由SEQ ID NO：316、318和320所示的氨基酸序列组成的三个轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)；以及其中所述第二抗原结合结构域包含分别由SEQ ID NO：20、22和24所示的氨基酸序列组成的三个重链互补性决定区(HCDR1、HCDR2和HCDR3)，和分别由SEQ ID NO：316、318和320所示的氨基酸序列组成的三个轻链互补性决定区(LCDR1、LCDR2和LCDR3)。
42.一种特异性针对Fel d1的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段与权利要求38至41中任意一项所述的双特异性抗原结合分子竞争与Fel d1的结合。
43.一种特异性针对Fel d1的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段与权利要求38至41中任意一项所述的双特异性抗原结合分子结合Fel d1上的相同表位。
44.根据权利要求42或43所述的分离的抗体，其中所述抗体是单特异性抗体或双特异性抗体。
45.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求38至41中任意一项所述的双特异性抗原结合分子和药学上可接受的载体或稀释剂。
46.一种治疗对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者对Fel d1蛋白敏感或产生过敏反应的患者的方法，或者治疗与对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者对Fel d1蛋白敏感或产生过敏反应相关的至少一种症状或并发症的方法，所述方法包括向有需要的患者给予有效量的与Fel d1特异性结合的根据权利要求1-19或33-34中任意一项所述的一种或多种分离的人源单克隆抗体或其抗原结合片段；或者根据权利要求20-32中任意一项所述的含有有效量的与Fel d1特异性地结合的一种或多种分离的人源单克隆抗体或其片段的药物组合物；或有效量的根据权利要求38-41中任意一项所述的一种或多种双特异性抗原结合分子；或者含有有效量的根据权利要求38-41中任意一项所述的一种或多种双特异性抗原结合分子的药物组合物，其中在给予与Fel d1特异性地结合的一种或多种所述分离的人源单克隆抗体或其片段后，或给予与Fel d1特异性地结合的一种或多种所述双特异性抗原结合分子后，或给予含有任意一种或多种前述抗体或双特异性结合分子的组合物后，针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应被阻止，或其严重程度和/或持续时间降低，或者与针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应相关的至少一种症状或并发症被阻止或缓解，或者针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应的频率和/或持续时间或严重程度降低。
47.根据权利要求46所述的方法，所述方法还包括给予有效量的第二治疗剂用于减轻针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白产生的过敏反应。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述第二治疗剂选自下组：皮质类固醇、支气管扩张剂、抗组胺剂、肾上腺素、减充血剂、另一种针对Fel d1的不同抗体和肽疫苗。
49.根据权利要求46至48中任意一项所述的方法，其中所述治疗使得患者在与猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者Fel d1蛋白接触后产生的过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、过敏性哮喘或过敏性反应减轻。
50.根据权利要求20-32或45中任意一项所述的药物组合物用于治疗针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白敏感或产生过敏反应的患者，或者用于治疗与针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应相关的至少一种症状或并发症的用途，其中所述针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应被阻止，或其严重程度和/或持续时间降低，或者与针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应相关的至少一种症状或并发症被阻止或缓解，或者针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白敏感或产生过敏反应的频率和/或持续时间或严重程度降低。
51.根据权利要求20-32或45中任意一项所述的药物组合物用于制备用于治疗针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白敏感或产生过敏反应的患者，或者用于治疗与针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应相关的至少一种症状或并发症的药物的用途，其中所述针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生过敏的反应被阻止，或其严重程度和/或持续时间降低，或者与针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应相关的至少一种症状或并发症被阻止或缓解，或者针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白的敏感或产生的过敏反应的频率和/或持续时间或严重程度降低。
52.根据权利要求20-32或45中任意一项所述的药物组合物的用途，其中所述药物组合物与第二治疗剂联用用于减轻针对猫、猫皮屑、猫毛或其提取物或者针对Fel d1蛋白产生的过敏反应。
53.根据权利要求52所述的药物组合物的用途，其中所述第二治疗剂选自皮质类固醇、支气管扩张剂、抗组胺剂、肾上腺素、减充血剂、另一种针对Fel d1的不同抗体和肽疫苗。
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