CN112166119A - 从人中分离过敏原特异性抗体的方法及其用途 - Google Patents

从人中分离过敏原特异性抗体的方法及其用途 Download PDF

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Abstract

一方面，提供生成特异性结合过敏原的人单克隆抗体的方法。在一些实施方案中，从序列生成该单克隆抗体，该序列从对该过敏原过敏的人类受试者的分离的单个B细胞中鉴定。

Description

从人中分离过敏原特异性抗体的方法及其用途
背景技术
过敏症是全球范围内日益关注的健康问题，其特征是针对无害蛋白质的适应性免疫应答方向错误。特别是对于食物过敏，个人必须努力避免过敏原暴露，否则有可能导致致命的过敏反应。过敏无法治愈，尽管脱敏疗法(例如免疫疗法)已显示出一定的临床益处，但仍需要一种能够改善过敏者个人的生活质量的快速有效的干预措施。
发明概述
一方面，本公开提供生成与过敏原特异性结合的人单克隆抗体的方法。在一些实施方案中，该方法包括：
(a)从人类受试者的样本中分离单个B细胞，其中该受试者对该过敏原过敏；
(b)从步骤(a)的该单个B细胞生成cDNA，其中cDNA序列包括编码全部或部分免疫球蛋白重链的第一序列和编码全部或部分免疫球蛋白轻链的第二序列；
(c)确定来自步骤(b)中该cDNA的序列；
(d)分析步骤(c)中确定的该序列以鉴定包括第一序列的单个B细胞，该第一序列包括IgE恒定区或IgG4恒定区；
(e)从步骤(d)的该单个B细胞中鉴定(i)包括IgE恒定区或IgG4恒定区的该免疫球蛋白重链中的重链可变区序列，和(ii)在同一单个B细胞中与该免疫球蛋白重链共表达的免疫球蛋白轻链中的轻链可变区序列；
(f)表达包括来自步骤(e)的该重链可变区序列和该轻链可变区序列的抗体；以及
(g)鉴定来自步骤(f)的与该过敏原特异性结合的一种或多种抗体。
在一些实施方案中，步骤(a)包括通过荧光激活细胞分选(FACS)分选该样本中的细胞。在一些实施方案中，步骤(a)包括选择用于表达细胞表面IgE和/或细胞表面IgG4的单个B细胞。在一些实施方案中，步骤(a)包括分离分泌抗体的B细胞和/或记忆B细胞。
在一些实施方案中，该方法包括分离所选择的用于表达细胞表面IgE的单个B细胞以及鉴定编码包括IgE恒定区的免疫球蛋白重链的序列。在一些实施方案中，步骤(a)包括使来自该样本的细胞接触抗人CD19抗体和抗人IgE抗体并选择表达CD19+IgE的B细胞。在一些实施方案中，该方法包括分离表达B细胞标记并对非IgE同种型呈阴性的单个B细胞。在一些实施方案中，步骤(a)包括使来自该样本的细胞接触抗人CD19抗体、抗人IgM抗体、抗人IgG抗体、抗人IgA抗体和抗人IgD抗体并选择CD19+IgM-IgG-IgA-IgD-B细胞。
在一些实施方案中，该方法包括分离所选择的用于表达细胞表面IgG4的单个B细胞以及鉴定编码包括IgG4恒定区的免疫球蛋白重链的序列。在一些实施方案中，步骤(a)包括使来自该样本的细胞接触抗人CD19抗体和抗人IgG4抗体并选择表达的CD19+IgG4 B细胞。在一些实施方案中，该方法包括分离表达B细胞标记以及对非IgG4同种型呈阴性的单个B细胞。在一些实施方案中，步骤(a)包括使来自该样本的细胞接触抗人CD19抗体,抗人IgM抗体、抗人IgE抗体、抗人IgA抗体、抗人IgD抗体、抗人IgG1抗体、抗人IgG2抗体和抗人IgG3抗体并选择CD19+IgM-IgE-IgA-IgD-IgG1-IgG2-IgG3-B细胞。
在一些实施方案中，步骤(b)包括从来自该单个B细胞的RNA中逆转录cDNA以及扩增该cDNA。在一些实施方案中，该RNA是mRNA。在一些实施方案中，该方法包括扩增来自该单个B细胞的免疫球蛋白重链和轻链序列。在一些实施方案中，该方法包括扩增该单个B细胞的转录组。
在一些实施方案中，步骤(f)包括将来自步骤(e)的该重链可变区序列和该轻链可变区序列表达在宿主细胞中以及纯化该抗体。在一些实施方案中，步骤(f)包括表达包括来自步骤(e)的该重链可变区序列和该轻链可变区序列以及IgG4恒定区或IgG1恒定区的抗体。
在一些实施方案中，该方法进一步包括用野生型IgG4恒定区或修饰的IgG4恒定区取代在步骤(g)中所鉴定的抗体的恒定区。
在一些实施方案中，该样本包括外周血。在一些实施方案中，该样本包括组织(例如，扁桃体组织)。
在一些实施方案中，该过敏原是食物过敏原、植物过敏原、真菌过敏原、动物过敏原、药物过敏原、化妆品过敏原或乳胶过敏原。在一些实施方案中，该过敏原是选自以下的食物过敏原：奶过敏原、蛋过敏原、坚果过敏原、鱼过敏原、贝类过敏原、豆类过敏原、豆科过敏原、种子过敏原和小麦过敏原。在一些实施方案中，该食物过敏原是花生过敏原。在一些实施方案中，该食物过敏原是核果过敏原。在一些实施方案中，该食物过敏原是奶过敏原。在一些实施方案中，该过敏原是真菌过敏原。在一些实施方案中，该真菌过敏原是曲霉菌过敏原。
另一方面，提供根据本文公开的方法生产的单克隆抗体。
又一方面，提供包括根据本文公开的方法生产的单克隆抗体的药物组合物。在一些实施方案中，该药物组合物包括多个单克隆抗体，其中每个单克隆抗体根据本文公开的方法生产以及其中该单克隆抗体识别不同的表位或特异性结合不同的抗原(例如，在同一类型或类别的过敏原内或在不同的类型或类别的过敏原中的不同过敏原)。
又一方面，提供特异性结合过敏原的单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区序列，其来源于来自对该过敏原过敏的人类受试者的产IgE-或IgG4的单个B细胞的免疫球蛋白重链；
(b)重链IgG恒定区序列；
(c)轻链可变区序列，其来源于来自人类受试者的产IgE或产IgG4的单个B细胞的免疫球蛋白轻链；以及
(d)轻链恒定区序列，其与(c)的该免疫球蛋白轻链是同一类别。
在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分以小于1nM的结合亲和力(KD)特异性结合过敏原。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分以小于250nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM或小于5nM的结合亲和力(KD)特异性结合过敏原。在一些实施方案中，该抗体以1nM至250nM的结合亲和力(KD)结合该过敏原。在一些实施方案中，该过敏原是食物过敏原、植物过敏原、真菌过敏原、动物过敏原、尘螨过敏原、药物过敏原、化妆品过敏原或乳胶过敏原。在一些实施方案中，该过敏原是选自以下的食物过敏原：奶过敏原、蛋过敏原、坚果过敏原、鱼过敏原、贝类过敏原、豆类过敏原、豆科过敏原、种子过敏原和小麦过敏原。在一些实施方案中，该食物过敏原是花生过敏原或核果过敏原。在一些实施方案中，该食物过敏原是奶过敏原。在一些实施方案中，该过敏原是真菌过敏原。在一些实施方案中，该真菌过敏原是曲霉菌抗原。在一些实施方案中，该抗体与两种不同的抗原交叉反应。在一些实施方案中，该抗体与第一过敏原类型的第一抗原和不同于该第一过敏原类型的第二过敏原类型的第二抗原交叉反应。在一些实施方案中，该抗体与花生过敏原和核果过敏原交叉反应。在一些实施方案中，该抗体与两种或更多种核果抗原交叉反应。
在一些实施方案中，该抗体包括来源于产IgE的人B细胞或产IgG4的人B细胞的重链可变区序列和轻链可变区序列。
又一方面，提供特异性结合花生过敏原的单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该抗体以小于1nM的结合亲和力(KD)结合该花生过敏原。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分以小于250nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM或小于5nM的结合亲和力(KD)特异性结合花生过敏原。在一些实施方案中，该抗体以1nM至250nM的结合亲和力(KD)结合该花生过敏原。
在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分特异性结合花生过敏原Ara h 2、Ara h 3或Ara h 1。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分以小于100pM的KD特异性结合Ara h 2。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分与至少两种花生过敏原交叉反应。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分与Ara h 2和Ara h 3交叉反应。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分以小于1nM的KD特异性结合Ara h 2以及以小于1μM的KD特异性结合Ara h 3。在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分结合包括氨基酸基序DPYSPS(SEQ ID NO:704)的表位。此外，在这些实验中发现了额外的花生特异性抗体。抗体PA12P3E09和PA12P3E11结合花生提取物，几乎不结合天然花生过敏原Ara h 2，而抗体PA12P1D02、PA12P1G11、PA13P1H03、PA12P3C01和PA12P3E04强烈结合花生提取物和天然花生过敏原Ara h 2两者。在一些实施方案中，该花生特异性抗体结合花生提取物，但不结合天然花生过敏原Ara h 2。
在一些实施方案中，该抗体包括：
重链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:2,10,17,25,33,41,47,58,113,129,199,341,348,409,459或593；
重链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:3,11,18,26,34,48,59,130,200,342,349,410,460,539或594；
重链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:4,12,19,27,35,42,49,55,60,131,201,350,411,461,540或595；
轻链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:6,14,21,29,37,44,51,62,133,203,343,352,413,463,542或597；
轻链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:7,15,22,30,38,52,78,86,126,149,196,345,353或598；以及
轻链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:8,23,31,39,45,53,63,134,204,346,354,414,464,543或599。
在一些实施方案中，该抗体包括包含在选自以下的重链可变区和轻链可变区序列对中的重链和轻链CDR序列：SEQ ID NOs:1和5；9和13；16和20；24和28；32和36；40和43；46和50；54和56；57和61；57和5；1和61；64和5；65和5；66和5；67和5；128和132；340和344；347和351；406和407；408和412；458和462；538和541；以及592和596。在一些实施方案中，该抗体包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，其包括以下氨基酸序列：
(a)分别是SEQ ID NOs:2,3,4,6,7和8；或
(b)分别是SEQ ID NOs:10,11,12,14,15和8；或
(c)分别是SEQ ID NOs:17,18,19,21,22和23；或
(d)分别是SEQ ID NOs:25,26,27,29,30和31；或
(e)分别是SEQ ID NOs:33,34,35,37,38和39；或
(f)分别是SEQ ID NOs:41,34,35,37,38和39；或
(g)分别是SEQ ID NOs:47,48,49,51,52和53；或
(h)分别是SEQ ID NOs:47,48,55,51,52和53；或
(i)分别是SEQ ID NOs:58,59,60,62,30和63；或
(j)分别是SEQ ID NOs:58,59,60,6,7和8；或
(k)分别是SEQ ID NOs:2,3,4,62,30和63；或
(l)分别是SEQ ID NOs:58,3,4,6,7和8；或
(m)分别是SEQ ID NOs:2,59,4,6,7和8；或
(n)分别是SEQ ID NOs:2,3,60,6,7和8；或
(o)分别是SEQ ID NOs:129,130,131,133,126和134；或
(p)分别是SEQ ID NOs:341,342,343,345,78和346；或
(q)分别是SEQ ID NOs:348,349,350,352,353和354；或
(r)分别是SEQ ID NOs:199,200,201,203,149和204；或
(s)分别是SEQ ID NOs:409,410,411,413,86和414；或
(t)分别是SEQ ID NOs:459,460,461,463,196和464；或
(u)分别是SEQ ID NOs:113,539,540,542,196和543；或
(v)分别是SEQ ID NOs:593,594,595,597,598和599。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:1,9,16,24,32,40,46,54,57,64,65,66,67,128,340,347,406,408,458,538或592。在一些实施方案中，该抗体包括轻链可变区，该轻链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:5,13,20,28,36,43,50,56,61,132,344,351,407,412,462,541或596。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(b)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:9具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:20具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(d)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:24具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:28具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(e)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:32具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:36具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(f)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:40具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:43具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(g)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:46具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:50具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(h)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:54具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:56具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(i)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:57具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:61具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(j)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:57具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(k)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:61具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(l)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:64具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(m)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:65具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(n)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:66具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(o)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:67具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(p)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:128具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:132具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(q)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:340具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:344具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(r)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:347具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:351具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(s)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:406具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:407具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(t)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:408具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:412具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(u)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:458具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:462具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(v)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:538具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:541具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(w)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:592具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:596具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
又一方面，提供特异性结合核果过敏原的单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该抗体以小于250nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM或小于5nM的结合亲和力(KD)结合该核果过敏原。在一些实施方案中，该抗体以小于1nM的结合亲和力(KD)结合该核果过敏原。在一些实施方案中，该抗体以1nM至250nM的结合亲和力(KD)结合该核果过敏原。在一些实施方案中，该核果过敏原是腰果、开心果、美洲山核桃、核桃、榛子和/或澳洲坚果。
在一些实施方案中，该抗体包括：
重链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:113,167,175,227,311,318,438,466,621,665或692；
重链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:168,176,200,312,319,439,539,666或693；
重链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:169,177,228,313,320,440,467,540,667或694；
轻链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:171,179,230,315,322,442,469,542,623,669或696；
轻链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:30,94,149,172,180,196,323或670；以及
轻链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:173,181,231,316,324,443,470,543,624,671或697。
在一些实施方案中，该抗体包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，其包括以下氨基酸序列：
(a)分别是SEQ ID NOs:692,693,694,696,94和697；或
(b)分别是SEQ ID NOs:318,319,320,322,323和324；或
(c)分别是SEQ ID NOs:227,200,228,230,149和231；或
(d)分别是SEQ ID NOs:113,539,540,542,196和543；或
(e)分别是SEQ ID NOs:311,312,313,315,94和316；或
(f)分别是SEQ ID NOs:665,666,667,669,670和671；或
(g)分别是SEQ ID NOs:466,200,467,469,149和470；或
(h)分别是SEQ ID NOs:167,168,169,171,172和173；或
(i)分别是SEQ ID NOs:621,176,177,623,180和624；或
(j)分别是SEQ ID NOs:175,176,177,179,180和181；或
(k)分别是SEQ ID NOs:438,439,440,442,30和443。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:166,174,226,310,317,437,465,538,620,664或691。在一些实施方案中，该抗体包括轻链可变区，该轻链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:170,178,229,314,321,441,468,541,622,668或695。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:691具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:695具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(b)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:317具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:321具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:226具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:229具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(d)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:538具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:541具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(e)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:310具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:314具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(f)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:664具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:668具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(g)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:465具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:468具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(h)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:166具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:170具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(i)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:620具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:622具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(j)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:174具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:178具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(k)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:437具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:441具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
又一方面，提供特异性结合奶过敏原的单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该抗体以小于250nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM或小于5nM的结合亲和力(KD)结合该奶过敏原。在一些实施方案中，该抗体以小于1nM的结合亲和力(KD)结合该奶过敏原。在一些实施方案中，该抗体以1nM至250nM的结合亲和力(KD)结合该奶过敏原。
在一些实施方案中，该抗体包括：
重链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:121,750,757,765,772,779,785,793,800,807,814,821,833,838,846,853,860,868,874,881,889,895,903,911,918或926；
重链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:378,532,751,758,766,773,786,794,801,808,815,822,826,839,847,854,861,875,882,890,896,904,912,919或927；
重链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:752,759,767,774,780,787,795,802,809,816,827,840,848,855,862,869,876,883,891,897,905,913,920或928；
轻链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:523,754,761,769,776,782,789,797,804,811,818,829,835,842,850,857,864,871,878,885,899,907,915,922或930；
轻链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:22,30,94,110,149,186,196,389,404,509,662,682,762,790,830,843,865,886,900,908,923或931；以及
轻链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:755,763,770,777,783,791,798,805,812,819,824,831,836,844,851,858,866,872,879,887,893,901,909,916,924或932。
在一些实施方案中，该抗体包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，其包括以下氨基酸序列：
(a)分别是SEQ ID NOs:800,801,802,804,110和805；或
(b)分别是SEQ ID NOs:121,826,827,829,830和831；或
(c)分别是SEQ ID NOs:833,826,827,835,149和836；或
(d)分别是SEQ ID NOs:853,854,855,857,662和858；或
(e)分别是SEQ ID NOs:860,861,862,864,865和866；或
(f)分别是SEQ ID NOs:868,378,869,871,682和782。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:749,756,764,771,778,784,792,799,806,813,820,825,832,837,845,852,859,867,873,880,888,894,902,910,917或925。在一些实施方案中，该抗体包括轻链可变区，该轻链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:753,760,768,775,781,788,796,803,810,817,823,828,834,841,849,856,863,870,877,884,892,898,906,914,921或929。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:799具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:803具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(b)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:825具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:828具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:832具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:834具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(d)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:852具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:856具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(e)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:859具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:863具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(f)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:867具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:870具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文公开的单克隆抗体竞争以结合过敏原(例如，以结合食物过敏原，例如花生过敏原、核果过敏原或奶过敏原)的抗体。
又一方面，提供特异性结合真菌过敏原的单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该真菌过敏原是曲霉菌过敏原。在一些实施方案中，该抗体以小于250nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM或小于5nM的结合亲和力(KD)结合该真菌过敏原(例如，曲霉菌过敏原)。在一些实施方案中，该抗体以小于1nM的结合亲和力(KD)结合该真菌过敏原(例如，曲霉菌过敏原)。在一些实施方案中，该抗体以1nM至250nM的结合亲和力(KD)结合该真菌过敏原。
在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分特异性结合过敏原烟曲霉、黑曲霉和/或构巢曲霉。在一些实施方案中，该抗体特异性结合过敏原烟曲霉1(Asp f 1)。
在一些实施方案中，该抗体包括：
重链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:710,718,726,734或742；
重链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:711,719,727,735或743；
重链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:712,720,728,736或744；
轻链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:714,722,730,738或746；
轻链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:715,723,731,739或747；以及
轻链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:716,724,732,740或748。
在一些实施方案中，该抗体包括包含在选自以下的重链可变区和轻链可变区序列对中的重链和轻链CDR序列：SEQ ID NOs:709和713；717和721；725和729；733和737；以及741和745。在一些实施方案中，该抗体包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，其包括以下氨基酸序列：
(a)分别是SEQ ID NOs:710,711,712,714,715和716；或
(b)分别是SEQ ID NOs:718,719,720,722,723和724；或
(c)分别是SEQ ID NOs:726,7272,728,730,731和732；或
(d)分别是SEQ ID NOs:734,735,736,738,739和740；或
(e)分别是SEQ ID NOs:742,743,744,746,747和748。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:709,717,725,733或741。在一些实施方案中，该抗体包括轻链可变区，该轻链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:713,721,729,737或745。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:709具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:713具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(b)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:717具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:721具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:725具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:729具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(d)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:733具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:737具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(e)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:741具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:745具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文公开的单克隆抗体竞争以结合真菌过敏原(例如，以结合曲霉菌过敏原)的抗体。
另一方面，提供药物组合物，其包括如本文公开的单克隆抗体或抗原结合部分。在一些实施方案中，该药物组合物包括多个如本文公开的单克隆抗体，其中该单克隆抗体识别不同的表位或特异性结合不同的抗原(例如，在同一类型或类别的过敏原内或在不同的类型或类别的过敏原中的不同过敏原)。
另一方面，提供抗体-药物偶联物，其包括如本文公开的单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该抗体-药物偶联物包括如本文公开的特异性结合真菌过敏原的单克隆抗体或其抗原结合部分以及进一步包括抗真菌剂。在一些实施方案中，该抗真菌剂是两性霉素B。
又一方面，分离的多核苷酸包括编码如本文公开的单克隆抗体的核苷酸序列。本文还提供包括如本文公开的多核苷酸的载体和宿主细胞。
另一方面，提供治疗方法。在一些实施方案中，该治疗方法是减轻受试者的一个或多个过敏症状的方法。在一些实施方案中，该治疗方法是减轻具有花生过敏症的受试者的一个或多个过敏症状的方法。在一些实施方案中，该治疗方法是减轻具有核果过敏症的受试者的一个或多个过敏症状的方法。在一些实施方案中，该治疗方法是减轻具有真菌过敏症的受试者的一个或多个过敏症状的方法。在一些实施方案中，该治疗方法是减轻具有奶过敏症的受试者的一个或多个过敏症状的方法。在一些实施方案中，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的如本文公开的单克隆抗体或药物组合物。
另一方面，提供试剂盒。在一些实施方案中，该试剂盒包括如本文公开的单克隆抗体或药物组合物。在一些实施方案中，该试剂盒用于实践如本文公开的治疗方法。
附图说明
图1.生成过敏原特异性单克隆抗体的方法的示例性工作流程的流程图。
图2A-2G.从新鲜的人外周血分离的单个B细胞的表征。(A)主成分分析(左)将原初/记忆(黑点)和成浆细胞(PB，灰点)B细胞亚群分开，其通过已建立的转录因子和标记基因的表达进行鉴定(右；对于原初/记忆B细胞用非条纹表示，以及对于成浆细胞(PB)B细胞用条纹表示)。(B)B细胞的同种型，对于IGHE是黑点，而对于其他同种型是灰点。(C)按同种型属于(A)中每个亚型的细胞的数量(对于原初/记忆B细胞，用非条纹表示，以及对于成浆细胞(PB)B细胞，用条纹表示)。(D-G)克隆家族(CF)的分析。(D)每个CF的细胞数量分布。(E)属于多成员CF的每个同种型的细胞的比例(fraction)。(F)多成员CF中每个细胞的同种型、B细胞亚型，突变频率和患者来源(patient of origin)。文中提到的CF已进行标记。(G)(F)中CF的重链(右)和轻链(左)CDR3序列和相似性热图。
图3A-3G.来自单个B细胞的89个IgE抗体的表征。(A)通过IGHV基因(背景模式)，患者来源(节点模式)和突变频率(节点大小)排列的抗体重链的系统发生描述。(B)指示具有给定重链和轻链CDR3长度的细胞数量的热图。(C)每个细胞的重链和轻链突变频率。(D)在重链和轻链中按区划分的沉默(S)和置换(R)突变。(E)IgE PB和其他同种型PB之间的差异基因表达。对数倍数正变化表示富含IgE PB的基因。(F)按同种型的原初/记忆B细胞(顶部)和PB(底部)的重链恒定区覆盖直方图，其中基因座定向为5'至3'的方向。针对所标记的细胞的数量(n)，分别由实线和阴影区域表示平均归一化的读取深度和95％置信区间。膜外显子是每个同种型的两个最3'外显子。(G)对(F)的总结，但描绘了每种同种型的具有任何膜外显子覆盖的细胞比例。
图4A-4C.在两个不相关的个体(PA12&PA13)中高亲和力、交叉反应性IgE抗体融合(convergence)。各小组(panel)之间的抗体模式是保守的。(A)按区的沉默(S)和置换(R)突变的频率。(B)与所有类别转换抗体相比的突变频率百分位。(C)主要过敏原花生蛋白Ara h2和Ara h3针对六种聚合抗体以及PA13P1H08的八种变体的解离常数(KD)。缩写的抗体变体名称表示为“重-轻”，使用以下缩写：N＝天然，R＝返祖(reverted)，FWR＝框架区。“r”前缀表示仅该区域已返祖。
图5A-5E.种系转录揭示了单个B细胞中的类别转换启动。(A)Cε种系转录物剪接供体的同一性以及按同种型表达每一个的细胞的数量。(B)按同种型的表达εGLT的细胞的比例。(C)来自单个PA11的示例，其中在IgE恒定区外显子内鉴定相变体使得能够随后验证来自同一患者的其他B细胞中的双等位基因GLT表达。(D)全局种系转录状态热图，其表示表达给定GLT的给定同种型的细胞的比例。上图：相对于所有GLT同种型的GLT同种型表达频率；排除自身同种型GLT表达。(E)在每个细胞中表达的非自身GLT同种型的数量的直方图。
图6.研究概述。从新鲜血液中提取血浆以测量循环IgE水平，而在FACS之前，富集B细胞的细胞级分。将单个细胞分选到96孔板的各个孔中，并用scRNA-seq处理，生成测序读段，将该测序读段与基因组比对以计算基因表达并评估剪接以及进行组装以便重建重链和轻链序列。生成了重组表达抗体的特异性和亲和力数据。
图7A-7C.血浆IgE水平。(A)过敏原特异性和过敏原成分(榛子、花生)的浓度。(B)总IgE浓度。(C)总血浆IgE水平与确认的IgE+B细胞的数量之间呈正相关。每个点都是一个个体。
图8A-8C.FACS门控和分析。(A)用于分选单个B细胞的门控策略。IgE+B细胞已覆盖为深灰色的点。(B)由重链转录物组装确定的最终IgE门内的同种型同一性。ND＝未确定。(C)作为参考，推定的嗜碱性粒细胞(CD19-IgE+)显示出比IgE+B细胞更高的IgE表面表达。
图9A-9G.单个细胞RNA-seq数据概述和质量控制。(A)在5个文库中对细胞进行测序到每个细胞～1-2百万个读段的深度。(B)每个细胞的基因的直方图。丢弃表达少于950个基因的细胞。(C)解释曲线描绘了基因的数量，该基因的数量被检测为每种B细胞亚型中八个随机选择的细胞的测序深度的函数。实线和阴影区域分别代表基因计数的平均值和95％置信区间。(D)所保留的细胞的读段映射分布。大多数读段是唯一映射的(Ensembl参考注释)，而多重映射的读段主要属于chr21和未放置的骨架上的RNA18S5重复序列(repeats)。(E)跨基因体的读数映射显示最小3'或5'的偏倚。(F)按链的V基因组装长度直方图。(G)在成批校正之前(顶部)和之后(底部)前500个最易变基因的PCA。
图10A-10D.支持B细胞亚型分类的辅助数据。与原初/记忆B细胞亚群(非条纹的)相比，PB(条纹的)具有更强的FACS前向和侧向散射(A)，SmartSeq2预扩增后具有更多的cDNA(B)，并且具有对抗体轻链和重链的更高的基因表达(C)。(D)每个子集的最高差异表达基因。
图11A-11K.同种型之间的B细胞比较。(A-I)按同种型和链的具有给定V和J基因的细胞的数量。(A)IGHM.(B)IGHD.(C)IGHG3.(D)IGHG1.(E)IGHA1.(F)IGHG2.(G)IGHG4.(H)IGHE.(I)IGHA2.(J)按同种型的重链突变频率.(K)按同种型的λ和κ轻链的相对利用率。
图12A-12H.抗体特异性和亲和力表征。(A)融合抗体、对照、PA13P1H08变体和来自其他克隆家族的抗体的半定量间接ELISA。人IgG同种型对照(abcam#ab206195)用作阴性对照，而阳性对照包括购自Indoor Biotechnologies的抗Ara h小鼠单克隆抗体。(B-G)使用生物层干涉术对结合Ara h 2(B-D)和Ara h 3(E-G)的抗体的动力学表征。在本文中命名并描述了抗体。(H)间接ELISA显示来自受试者PA11、PA12、PA13、PA14、PA15和PA16(行)的重组单克隆抗体与过敏原提取物、天然花生过敏原Ara h 2和牛血清白蛋白(BSA)(列)的结合。每种抗体的同种型显示在左侧。较高的值表示较强的结合力。OD＝光密度。所描绘的值代表减去人IgG同种型对照后的值。仅显示任何OD值在0.25以上的被测抗体。
图13A-13E.用于构建PA13P1H08抗体变体的重链和轻链序列。(A)推断的原初重链CDR3和周围氨基酸的推导。(B)除了重链的区域已返祖为推断的原初重排的序列之外，还有自然和返祖的重链序列。带“r”前缀的标签仅表示该区域已返祖。FWR＝框架。(C)推断的原初轻链CDR3和周围氨基酸的推导。(D)自然和返祖的轻链序列。(E)取自另一抗体PA12P4H03的轻链序列，我们通过ELISA证实该另一抗体不结合任何花生过敏原。
图14.所有同种型的GLT剪接。请注意，为清楚起见，每个同种型仅显示前三个恒定区外显子。
图15.ighe恒定区基因座的IGV覆盖直方图和剪接点，其显示了用IL-4、LPS和BAFF刺激的单个鼠B细胞中的εGLT(Wu等人，2017)。箭头指示ighe GLT剪接供体。
图16.来自克隆PA12P3F10、PA12P3D08、PA12P1C07、PA13P1E10、PA13P3G09和PA13P1H08(SEQ ID NOs:19,35,42,12,27,4)的重链CDR3序列和来源于一项单独的花生过敏免疫库测序研究(62)中的多个患者的三个重链CDR3序列的成对CDR3序列同一性。来自该项单独的研究的每个序列与来自本研究的一个或多个序列具有至少70％的同一性。所有序列共享IGHV3-30和IGHJ6基因区段，并且CDR3的长度为17个氨基酸。
图17A.微阵列扫描证实了山羊抗人二抗IgG和对照小鼠单克隆抗HA抗体与抗原衍生的肽之间没有背景相互作用。对照抗体产生了构筑肽微阵列的预期HA对照斑点图案(白点)。
图17B和17C.PA13P1H08至Ara h 2(“Ah2”)和Ara h 3(“Ah3”)肽的微阵列表位映射。(B)微阵列扫描，其显示了抗体与抗原肽的结合(浅灰色)以及预期的HA对照斑点图案(白点)。(C)按抗原肽的微阵列荧光强度。注释了具有高强度的Ara h 2基序。
图18.针对普通食物过敏原以及烟曲霉和黑曲霉的奶过敏受试者PA01和曲霉研究受试者10033201的血浆IgE水平。NP＝未执行。PA01和10033201的总IgE分别为353kU/L和3528kU/L。该测定是由CLIA许可的约翰霍普金斯大学皮肤病学、过敏症和临床免疫学参考实验室(CLIA-licensed Johns Hopkins University Dermatology,Allergy,andClinical Immunology Reference Laboratory)使用ImmunoCAP系统执行的。
图19.间接ELISA，其显示了重组单克隆抗体(列)与抗原(行)的结合。抗原包括烟曲霉、黑曲霉和构巢曲霉的提取物，以及纯化的重组过敏原烟曲霉1(rAsp f 1)。牛血清白蛋白(BSA)用作阴性抗原对照。抗Asp f 1的单克隆抗体(“抗Asp f 1”)用作抗这种过敏原的阳性对照。较高的值表示较强的结合力。OD＝光密度。hIgG＝人IgG同种型对照。
图20.间接ELISA，其显示了来自受试者PA01(行)的重组单克隆抗体与过敏原提取物、天然花生过敏原Ara h 2和BSA(列)的结合。每种抗体的同种型显示在左侧。较高的值表示较强的结合力。OD＝光密度。所描绘的值代表减去人IgG同种型对照后的值。
表1
表1包括本文讨论的蛋白质和核酸序列。使用标准的一字母代码提供多肽序列。提供有氨基酸序列的本领域普通技术人员将理解，氨基酸序列可以由一组确定的核苷酸序列编码，使得读者和发明者拥有编码每个氨基酸序列的核苷酸序列。编码多核苷酸的核酸序列可以是天然存在的人序列。在一些实施方案中，编码多核苷酸的核酸序列不是天然存在的人序列。编码多核苷酸的核酸序列可以是经密码子优化以在人细胞或特定细胞类型、真核细胞、细菌细胞等中表达的序列。可以执行密码子优化以提高宿主产生由核酸编码的多肽的能力，该密码子优化以另一密码子替代一个密码子，该另一密码子编码相同的氨基酸，并且在特定宿主细胞中具有更高的发生频率(参见，例如Mauro,BioDrugs 32(1):69-81,2018和Kato,Int J Mol Sci.20(4),2019)。
在某些实施方案中，考虑到了，变体序列可以用于本文公开的方法和组合物中。例如，一方面，描述了一种具有重链可变区和轻链可变区的抗体，该重链可变区包括与SEQ IDNO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列，以及该轻链可变区包括与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。序列同一性或相似性的程度可以使用本领域已知的方法来确定。在一种方法中，将两个核苷酸或多肽序列或亚序列的同一性计算为在序列已比对后相同或等同的位置的百分比，必要时引入缺口以达到最大的序列同一性百分比。序列比对的方法是本领域已知的方法，并且包含但不限于Needleman-Wunsch全局比对算法(Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48(3):443-453(30))、Smith和Waterman局部同源搜索算法(Smith,Temple F.&Waterman,Michael S.(1981)J.Mol.Biol.147(1):195–197.)、手动比对和检查或这些算法的计算机化的实现，例如“needle”程序，其作为EMBOSS软件包的一部分分发(Rice,P.等人,Trends in Genetics 16(6):276-277(31),版本6.3.1，可从EMBnet以各种来源获得)。
考虑到了，在某些实施方案中，本文所述的方法或组合物与本文提供的多肽序列(例如，在表1中)的区别将在于一种或多种氨基酸取代。在一些实施方案中，序列将与本文所述的序列或序列的组合具有至少90％序列同一性(或下文公开的其他程度的序列同一性)。在一实施方案中，该多肽序列与参考序列(例如，在表1中)的区别在于一种氨基酸取代。在一实施方案中，该多肽序列与参考序列(例如，在表1中)的区别在于两种氨基酸取代。在一实施方案中，该多肽序列与参考序列的区别在于两种氨基酸取代。在一实施方案中，该多肽序列与参考序列的区别在于三种氨基酸取代。在一实施方案中，该多肽序列与参考序列的区别在于四种氨基酸取代。在一实施方案中，该多肽序列与参考序列的区别在于五种氨基酸取代。在一实施方案中，该多肽序列与参考序列的区别在于六种氨基酸取代。在一实施方案中，该多肽序列与参考序列的区别在于七种氨基酸取代。在一实施方案中，该多肽序列与参考序列的区别在于八种氨基酸取代。在一实施方案中，该多肽序列与参考序列的区别在于九种氨基酸取代。在一实施方案中，该多肽序列与参考序列的区别在于十种氨基酸取代。在某些实施方案中，该多肽序列与参考序列的区别在于1至10种氨基酸取代，有时在于1至5种氨基酸取代。在一些情况下，选择不改变相对于参考序列的基本性质(例如，结合特异性)的氨基酸取代。在一些情况下，选择改变结合亲和力，但不改变结合特异性的氨基酸取代。在一些情况下，选择取代以改变如本领域已知的或本文在以下所述的性质(例如，影响效应子功能或半衰期的取代)。在一些实施方案中，该氨基酸取代是保守取代。保守氨基酸取代在本领域中被识别为将一种氨基酸取代为具有相似性质(例如极性、电荷、疏水性和芳香性)的另一氨基酸。也可以基于氨基酸的侧链特征(例如含有硫、羟基或酰胺)进行保守的氨基酸取代。保守氨基酸取代的非限制性示例在下文列出。
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发明详述
I.引言
一方面，本公开提供了人过敏原特异性单克隆抗体和用于从表达单个IgE或IgG4的人B细胞生成人过敏原特异性单克隆抗体的方法。已知IgE抗体，作为人类中抗体含量最低的一类，会引起过敏反应的症状。例如，范围从荨麻疹到潜在的致命过敏性反应的食物过敏症状是由于肥大细胞和嗜碱性粒细胞的脱粒而导致的，该脱粒是由表面结合的IgE抗体识别了过敏性食物蛋白而引起的。尽管在免疫力和过敏性疾病中起着中心作用，但由于其稀缺性，人IgE抗体的表征仍然很差。Fitzsimmons等人,Front Immunol.,2014,5:61。类似地，缺乏关于IgG4同种型的知识，但是人们对它的兴趣正在增长，这是由于它在介导降低的临床过敏原反应性方面有潜在的作用，该临床过敏原反应性伴随免疫疗法和通过抗原封闭(blocking)而进行的早期过敏原暴露。Tordesillas等人,Immunity,2017,47:32–50。
本公开提供了用如本文公开的一种或多种过敏原特异性单克隆抗体或其抗原结合部分来治疗具有过敏症的人类受试者或减轻人类受试者中一种或多种过敏症状的治疗方法。在一些实施方案中，并且无意于受特定机制的束缚，本文公开的过敏原特异性单克隆抗体在治疗上用作封闭抗体，其通常被称为被动免疫疗法。
如本文所述，本公开的方法可用于从具有针对目标抗原的过敏症的人类受试者的样本中生成基因型确认的IgE或IgG4单个B细胞的库，该IgE或IgG4单个B细胞作为候选，用于产生对目的过敏原具有高亲和力的抗体。如以下实施例部分所述，已经发现，分析免疫球蛋白重链恒定区的cDNA序列以鉴定单个B细胞的同种型避免了同种型错误表征的问题，已知该问题在基于通过细胞表面标记(例如，通常在FACS细胞表面染色中进行)对细胞进行分选而确定B细胞同种型时会发生。已知同种型错误表征的这种问题对于IgE B细胞尤其普遍，因为标记CD23是在非IgE B细胞表面捕获IgE的“低亲和力”IgE受体。参见，Berkowska等人,J Allergy Clin Immunol,2014,134:688-697。因此，本公开的方法生成单个B细胞的库，该单个B细胞更可能产生对过敏原具有高亲和力的抗体。此外，已经发现，根据本文公开的方法生成的抗体是迄今为止发现的亲和力最高的自然人抗体，并且表现出与不同抗原的交叉反应性。
II.定义
本文中使用的术语仅是出于描述特定实施方案的目的，而并非旨在进行限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书来限制。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在本说明书和随后的权利要求书中，将提及多个术语，除非明显具有相反的意图，否则这些术语应被定义为具有以下含义。在某些情况下，为了清楚和/或便于提及，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且不应将本文中包括这样的定义解释为表示与本领域中通常理解的术语的定义之间的实质性差异。
所有带数字的名称，例如pH值、温度、时间、浓度和分子量，包含范围在内，都是近似值，其适当地以(+)或(-)通过增量0.1或1.0而变化。应当理解，尽管并非总是明确地指出，所有带数字的名称之前均带有术语“约”。
除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包含复数对象。因此，例如，提及“一化合物”包含多个化合物。
术语“包括”旨在表示化合物、组合物和方法包含所述的要素，但不排除其他要素。当用于定义化合物、组合物和方法时，“基本上由……组成”应表示排除会实质上影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的其他元素。“由……组成”应指排除权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。由这些过渡术语中的每一个限定的实施方案在本发明的范围内。
术语“过敏原”是指在受试者中引起免疫应答的物质，其导致受试者的过敏反应。
如本文所用，术语“抗体”是指由免疫球蛋白基因或其功能片段编码的多肽，其特异性结合并识别抗原。如本文所用，术语“抗体”还包括保留结合特异性的抗体片段，包括但不限于Fab、F(ab’)2、Fv和scFv。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及各种免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，其依次分别定义了免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括两对相同的多肽链，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每条链的N端定义了主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。因此，术语“可变重链”或“VH”是指免疫球蛋白重链的可变区，包含Fv、scFv、dsFv或Fab；而术语“可变轻链”或“VL”是指免疫球蛋白轻链的可变区，包含Fv、scFv、dsFv或Fab。
术语“可变区”是指抗体重链或轻链中的结构域(domain)，其赋予抗体结合抗原的特异性。通常，抗体可变区包括四个保守的“框架”区，其间散布着三个高变的“互补决定区”。
术语“互补决定区”或“CDR”是指每条链中使由轻链和重链可变区建立的四个框架区中断的三个高变区。CDR主要负责与抗原表位的结合。每条链的CDR通常称为CDR1、CDR2和CDR3，其从N端开始依次编号，并且通常也由特定CDR所在的链标识。因此，VH CDR3位于发现它的抗体的重链的可变区中，而VL CDR1是来自发现它的抗体的轻链的可变区的CDR1。
如所指出的，CDR中不包含的可变区的部分称为框架。不同轻链或重链的“框架区”在一物种内相对保守。抗体的框架区，即组成轻链和重链的组合框架区，用于在三维空间中定位和排列CDR。框架序列可以从公共DNA数据库或包含种系抗体基因序列的公开参考文献中获得。例如，可以在用于人和小鼠序列的“VBASE2”种系可变基因序列数据库中找到用于人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列。
CDR和框架区的氨基酸序列可以使用本领域中各种熟知的定义来确定。CDR的位置和长度已由以下精确地定义：Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,美国卫生和公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services),1983,1987，以及其他。参见，例如Johnson和Wu,Nucleic Acids Res.2000Jan 1；28(1):214–218；Johnson等人,Nucleic Acids Res.,29:205-206(2001)；Chothia&Lesk,(1987)J.Mol.Biol.196,901-917；Chothia等人.(1989)Nature 342,877-883；Chothia等人.(1992)J.Mol.Biol.227,799-817；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol 1997,273(4))；以及MacCallum等人,J.Mol.Biol.,262:732-745(1996)。另请参见国际ImMunoGeneTics数据库(IMGT)、AbM和观察到的抗原接触。
术语“抗原结合部分”和“抗原结合片段”在本文可互换使用，并且是指保留特异性结合抗原(例如过敏原，例如Ara h 2或Ara h3)的抗体的一个或多个片段。抗体结合片段的示例包含但不限于Fab片段(由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段)，F(ab')2片段(二价片段，其包括通过铰链区的二硫桥键连接的两个Fab片段)，单链Fv(scFv)，二硫连接的Fv(dsFv)，互补决定区(CDR)，VL(轻链可变区)，VH(重链可变区)，纳米抗体以及能够结合靶抗原的免疫球蛋白肽的那些或任何其他功能部分的任何组合。抗体及其抗原结合部分包含结构域特异性抗体、单结构域抗体、结构域缺失的抗体、嵌合抗体、CDR嫁接的抗体、双抗体、三抗体、四抗体、小抗体、纳米抗体(例如单价纳米抗体、二价纳米抗体等)、小型模块化免疫药物(SMIP)和鲨鱼可变IgNAR结构域。可以在本发明的抗体的抗原结合片段内发现的可变和恒定结构域的示例性构型包括：(a)VH-CHI；(b)VH-CH2；(c)VH-CH3；(d)VH-CH1-CH2；(e)VH-Ch1-Ch2-Ch3；(f)VH-Ch2-Ch3；(g)VH-CL；(h)VL-CH1；(i)VL-Ch2；(X)VL-Ch3；(j)VL-CH1-CH2；(k)VL-CH1-CH2-CH3；(l)VL-CH2-CH3；以及(m)VL-CL(参加例如,FUNDAMENTALIMMUNOLOGY(Paul ed.,4th ed.2001),Gruber等人(1994)J Immunol.152:5368-5374；McCartney,等人,1995Protein Eng.8:301-314；Shukra等人,2014,“Production ofrecombinant antibodies using bacteriophages”Eur J Microbiol Immunol(Bp).4(2):91–98；Todorovska,2001,“Design and application of diabodies,triabodies andtetrabodies for cancer targeting”J Immunol Methods；248(1-2):47-66；Salvador等人,2019,“Nanobody:outstanding features for diagnostic and therapeuticapplications”Anal Bioanal Chem.411(9):1703-1713；Gill等人,2006,“Biopharmaceutical drug discovery using novel protein scaffolds.”Curr OpinBiotechnol.,(6):653-8；以及Ubah等人,2016,“Phage Display Derived IgNAR V RegionBinding Domains for Therapeutic Development”Curr Pharm Des.22(43):6519-6526,其每一个均通过引用并入本文。
术语“表位”是指抗体特异性结合的抗原的区域或区，即与抗体物理接触的区域或区，并且可以包含几个氨基酸或几个氨基酸的部分，例如，5或6个或更多个，例如20个或更多个氨基酸，或那些氨基酸的部分。在一些情况下，表位包含例如来自碳水化合物、核酸或脂质的非蛋白质组分。在某些情况下，表位是三维部分。因此，例如，在靶是蛋白质的情况下，表位可以由连续的氨基酸或来自蛋白质的通过蛋白质折叠而变得接近的不同部分(例如，不连续的表位)的氨基酸组成。
“单克隆抗体”是指由细胞的单个克隆或单个细胞系产生的抗体，该抗体由在其一级氨基酸序列上相同的抗体分子组成或基本上由其组成。在一些实施方案中，除了在单克隆抗体生产期间出现的突变之外，单克隆抗体制剂包含一群相同且结合抗原的相同表位的抗体。除非另有说明或从上下文中清楚看出，否则术语“单克隆抗体”包含合成抗体及其抗原结合片段。
“人抗体”是指具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本公开的人抗体可以包含未由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。术语“人抗体”无意包含嵌合或人源化抗体，其中衍生自非人种(例如小鼠)的种系或免疫细胞的CDR序列已嫁接到人框架序列上。
术语“特异性结合”是指相比其与非靶化合物的结合，分子(例如，抗体或抗体片段)以更大的亲和力、亲合力与样本中的靶进行结合，更容易地和/或更长的持续时间地与该靶进行结合。在一些实施方案中，特异性结合靶(例如，过敏原，例如，Ara h 2或Ara h 3)的抗体或其抗原结合部分是这样的抗体或抗原结合部分，其与靶结合的亲和力是对非靶化合物的亲和力的至少2倍，例如至少3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或更高。例如，在一些实施方案中，特异性结合过敏原靶(如Ara h 2或Ara h 3)的抗体与过敏原靶结合的亲和力通常将是对非过敏原靶的亲和力至少2倍。本领域普通技术人员将理解，特异性地或优先地结合至第一靶的抗体可以特异性地或优先地或可以不特异性地或优先地结合到第二靶。
如本文所用，术语“结合亲和力”是指两个分子，例如抗体(或其抗原结合片段)和抗原之间的非共价相互作用的强度。因此，例如，该术语可以指抗体(或其抗原结合片段)与抗原之间的1∶1相互作用，除非另有说明或从上下文中清楚看出。结合亲和力可以通过测量平衡解离常数(KD)来量化，该平衡解离常数是指解离速率常数(kd，时间-1)除以缔合速率常数(ka，时间-1M-1)。可以通过测量复合物形成和解离的动力学来确定KD，例如使用表面等离激元共振(SPR)方法，例如BiacoreTM系统；动力学排除试验，例如
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和BioLayer干涉测量法(例如使用
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Octet平台)。如本文所用，“结合亲和力”不仅包含形式的结合亲和力，例如反映抗体(或其抗原结合片段)与抗原之间的1：1相互作用的形式的亲和力，还包含可以反映强大结合力的表观亲和力，针对其计算KD。
如本文所用，术语“交叉反应”是指抗体结合两种或更多种抗原的能力。作为非限制性示例，在一些实施方案中，特异性结合第一过敏原靶(例如，第一花生过敏原，例如Arah 2)的抗体可以表现出与第二过敏原靶(例如，第二花生过敏原，如Ara h 3)的交叉反应性。
参照核酸或蛋白质(例如抗体)使用的术语“分离的”是指核酸或蛋白质基本上不含在天然状态下与其缔合的其他细胞成分。优选处于均质状态。纯度和均质性通常使用分析化学技术确定，例如电泳(例如，聚丙烯酰胺凝胶电泳)或色谱法(例如，高效液相色谱法)。在一些实施方案中，分离的核酸或蛋白质(例如抗体)具有至少85％的纯度、至少90％的纯度、至少95％的纯度或至少99％的纯度。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。如本文所用，该术语涵盖任何长度的氨基酸链，包含全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍(methioninemethyl sulfonium)。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。“氨基酸模拟物”是指具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化合物。
氨基酸在本文中可以用它们公知的三个字母符号或IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的一个字母符号来指代。同样，核苷酸可以用它们普遍接受的单字母代码来指代。
如本文所用，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用。术语“多核苷酸”的使用包含寡核苷酸(即，短多核苷酸)。该术语还指脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和天然存在的变体，并且还可以指合成和/或非天然存在的核酸(即，包括核酸类似物或修饰的骨架残基或键合)，例如，非限制性地指：硫代磷酸酯、磷酰胺酯、甲基膦酸酯、手性-甲基膦酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)等。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(例如简并的密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并的密码子取代可以通过生成其中一个或多个选定的(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(参见，例如，Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
如本文所用，术语“样本”是指从人类或非人类哺乳动物受试者获得的生物学样本。在一些实施方案中，样本包括血液、血液成分(blood fraction)或血液制品(例如血清、血浆、血小板、红细胞、外周血单核细胞等)；痰或唾液；粪便、尿液、其他生物体液(例如淋巴液、唾液、前列腺液、胃液、肠液、肾液、肺液、脑脊液等)、组织(例如肾脏、肺、肝、心脏、脑、神经组织、甲状腺、眼睛、骨骼肌、软骨或骨组织)、培养细胞(例如原代培养物、外植体、转化细胞或干细胞)或活检样本。
本文可互换使用的术语“受试者”和“患者”是指哺乳动物，包含但不限于人、非人灵长类、啮齿动物(例如大鼠、小鼠和豚鼠)、兔、牛、猪、马和其他哺乳动物。在一个实施方案中，受试者或患者是人。
术语“治疗”是指成功治疗或减轻损伤、疾病或病症的任何指标，包含任何客观或主观参数，例如消减；缓解；减少症状或使受试者更容易忍受损伤、疾病或病症；退化或衰弱的速度减慢；使最后的退化点较不衰弱；和/或改善受试者的身体或心理健康。症状的治疗或缓解可以基于客观或主观参数。可以将治疗效果与未接受治疗的一个人或一大群人进行比较，或者与治疗前或治疗期间不同时间的同一名患者进行比较。
术语“药物组合物”是指适合于施用给受试者的组合物。通常，药物组合物是无菌的，并且优选不含能够引起受试者不希望的应答的污染物。药物组合物可以设计成经由多种不同的给药途径施用给需要其的受试者，该给药途径包含口服、静脉内、颊、直肠、肠胃外、腹膜内、皮内、气管内、肌内、皮下、吸入等。
术语“药学上可接受的赋形剂”是指与人或动物具有生物学或药理学相容性的非活性药物成分，例如但不限于缓冲液、载体或防腐剂。
如本文所用，药剂(例如本文所公开的单克隆抗体)的“治疗量”或“治疗有效量”是指治疗、减轻、消减、缓解、改善患者生存，增加生存时间或生存率，减少症状，使损伤、疾病或病症(例如过敏症)更可忍受，减慢退化或衰弱的速度，或改善患者的身体或心理健康。例如，对于给定的参数，治疗有效量将显示出至少5％、10％、15％、20％、25％、40％、50％、60％、75％、80％、90％或100％的治疗效果增加或减少。治疗功效也可以表示为“倍数”增加或减少。例如，治疗有效量相对于对照可以具有至少1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或更多的作用。
术语“施用”或“给药”是指将药剂、化合物或组合物递送至所需的生物作用部位的方法。这些方法包含但不限于局部递送、肠胃外递送、静脉内递送、皮内递送、肌内递送、直肠递送或腹膜内递送。任选地与本文所述的药剂和方法一起使用的施用技术包含，例如在Goodman和Gilman,The Pharmacological Basis of Therapeutics,当前版本；Pergamon；以及Remington's,Pharmaceutical Sciences(当前版本),Mack Publishing Co.,Easton,PA中所讨论的技术。
III.生成过敏原特异性抗体的方法
一方面，提供从人样本生成过敏原特异性单克隆抗体的方法。在一些实施方案中，该方法包括：
(a)从人类受试者的样本中分离单个B细胞，其中该受试者对该过敏原过敏；
(b)从步骤(a)的该单个B细胞生成cDNA，其中cDNA序列包括编码全部或部分免疫球蛋白重链的第一序列和编码全部或部分免疫球蛋白轻链的第二序列；
(c)确定来自步骤(b)中该cDNA的序列；
(d)分析步骤(c)中确定的该序列以鉴定包括第一序列的单个B细胞，该第一序列包括IgE恒定区或IgG4恒定区；
(e)从步骤(d)的该单个B细胞中鉴定(i)包括IgE恒定区或IgG4恒定区的该免疫球蛋白重链中的重链可变区序列，和(ii)在同一单个B细胞中与该免疫球蛋白重链共表达的免疫球蛋白轻链中的轻链可变区序列；
(f)表达包括来自步骤(e)的该重链可变区序列和该轻链可变区序列的抗体；以及
(g)鉴定来自步骤(f)的与该过敏原特异性结合的一种或多种抗体。
受试者群体和样本
在一些实施方案中，生成过敏原特异性单克隆抗体的方法包括从来自人类受试者的生物样本分离B细胞。在一些实施方案中，该样本包括全血、外周血或白细胞分离产品。在一些实施方案中，该样本包括外周血单核细胞(PBMCs)。在一些实施方案中，该样本包括来自人类受试者的组织，例如，扁桃体组织、脾或骨髓。本领域中描述了从血液和组织样本分离B细胞的方法。参见，例如，Heine等人,Curr Protoc.Immunol.,2011,94:7.5.1-7.5.14；以及Zuccolo等人,BMC Immunol,2009,10:30,doi:10.1186/1471-2172-10-30。
在一些实施方案中，该过敏原特异性抗体从具有针对该过敏原的过敏症的人类受试者中生成。在一些实施方案中，具有过敏症的该人类受试者是成年人。在一些实施方案中，具有过敏症的该人类受试者是青少年。在一些实施方案中，该人类受试者具有针对食物过敏原、植物过敏原、真菌过敏原、动物过敏原、尘螨过敏原、药物过敏原、化妆品过敏原或乳胶过敏原的过敏症。在一些实施方案中，该人类受试者具有针对两种或更多种过敏原的过敏症，例如，针对食物过敏原、植物过敏原、真菌过敏原、动物过敏原、尘螨过敏原、药物过敏原、化妆品过敏原或乳胶过敏原中的两种或更多种的过敏症。在一些实施方案中，该人类受试者具有针对2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种过敏原的过敏症。在一些实施方案中，该人类受试者具有针对一类别过敏原中两种或更多种不同类型的抗原(过敏原)的过敏症，例如，针对两种或更多种不同的食物过敏原的过敏症[例如，针对两种或更多种不同的花生抗原的过敏症或针对花生过敏原和非花生过敏原(例如核果、蛋或奶过敏原)的过敏症]或针对两种或更多种不同的真菌过敏原的过敏症(例如，针对两个或更多个不同种类的曲霉菌的过敏症)。在一些实施方案中，该人类受试者具有针对两个或更多个不同类别的过敏原的过敏症(例如，针对一种或多种食物过敏原和针对一种或多种植物过敏原的过敏症)。在一些实施方案中，该人类受试者具有仅针对一个类别的过敏原的过敏症(例如，该受试者具有针对一种或多种食物过敏原，但不针对非食物过敏原的过敏症，或该受试者具有针对一种或多种真菌过敏原，但不针对非真菌过敏原的过敏症)。
在一些实施方案中，该人类受试者具有针对食物过敏原的过敏症。在一些实施方案中，该食物过敏原是奶过敏原、蛋过敏原、坚果过敏原、核果过敏原、鱼过敏原、贝类过敏原、豆类过敏原、豆科过敏原、种子过敏原或小麦过敏原。在一些实施方案中，该食物过敏原是花生过敏原。
在一些实施方案中，该人类受试者具有针对植物过敏原或真菌过敏原的过敏症。在一些实施方案中，该过敏原是真菌过敏原(例如曲霉菌，例如烟曲霉、黑曲霉或构巢曲霉)。在一些实施方案中，该过敏原是花粉过敏原(例如，树花粉、青草花粉或杂草花粉)或霉菌过敏原。在一些实施方案中，该人类受试者具有针对动物过敏原的过敏症。在一些实施方案中，该过敏原是皮屑过敏原或昆虫叮咬。
在一些实施方案中，生成过敏原特异性单克隆抗体的方法不包括在从该受试者获取该样本之前，用该过敏原对该人类受试者进行免疫或使该人类受试者接触该过敏原。
B细胞分离和筛选
在一些实施方案中，从具有针对过敏原的过敏症的受试者的样本中分离单个B细胞。在一些实施方案中，将该单个B细胞分离成单独的分区，例如多孔板的单独的孔，封装成液滴，或分散到微孔中。在一些实施方案中，从样本中分离至少10、50、100、500、1,000、5,000或10,000个B细胞或更多，并分离成单独的分区。
在一些实施方案中，分离步骤包括通过荧光激活细胞分选(FACS)来分选样本中的细胞。FACS分选可用于基于细胞表面标记表达、细胞大小和/或粒度来分选细胞，并将细胞分别递送至孔，例如96孔或384孔组织培养物或PCR板。在本领域中描述了通过FACS分离和纯化细胞群体的方法。参见，例如Basu等人,J Vis Exp,2010,41:1546,doi:10.3791/1546。
在一些实施方案中，液滴微流体平台可以用于将单个B细胞分配成单独的液滴。在一些实施方案中，液滴中单个细胞的核酸(例如，mRNA)用液滴唯有的核苷酸序列(例如，唯一分子标识符条形码核苷酸序列)标记，从而实现在单个反应容器中执行的对来自多个B细胞的序列的下游处理步骤。在本领域描述了在液滴中封装单个细胞的方法。参见，例如Macosko等人,Cell,2015,161:1202-1214；Zhang等人,Scientific Reports,2017,7:41192,doi:10.1038/srep41192。
在一些实施方案中，将细胞分散到设计为捕获单个细胞的微孔中。在本领域中描述了单个细胞微孔捕获的方法。参见，例如Han等人,Cell,2018,172:5,doi:10.1016/j.cell.2018.02.001。
在一些实施方案中，对来自样本的细胞进行一种或多种标记的存在、不存在或表达水平的筛选，并且基于一种或多种B细胞标记(例如，一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种标记)的存在或表达水平分离单个B细胞。在一些实施方案中，对细胞进行一种或多种细胞表面B细胞标记(例如但不限于CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72或CD79)的筛选。在一些实施方案中，如果细胞对一种或多种B细胞标记呈阳性，例如对CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72或CD79中的一种或多种呈阳性，则确定该细胞为B细胞。在一些实施方案中，分离单个CD19+B细胞。
在一些实施方案中，对来自样本的细胞进行一种或多种免疫球蛋白同种型(例如但不限于IgE、IgG、IgM、IgA或IgD或其亚类)的存在、不存在或表达水平的筛选。在一些实施方案中，选择所分离的单个B细胞用于细胞表面IgE的表达和/或用于细胞表面IgG4的表达。在一些实施方案中，分离单个B细胞而不选择成用于表达一种或多种免疫球蛋白同种型(例如，不选择成表达细胞表面IgE和/或表达细胞表面IgG4)。
IgE选择
在一些实施方案中，该方法包括分离选择用于表达细胞表面IgE的单个B细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括使样本的细胞与抗人IgE抗体接触，并选择在细胞表面上表达IgE的细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括使样本的细胞与针对B细胞标记的抗体(例如，针对CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72或CD79的抗体)以及抗人IgE抗体接触，并选择表达B细胞标记和在细胞表面上表达IgE的细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括使样本的细胞与抗人CD19抗体和抗人IgE抗体接触，并选择表达CD19+IgE的B细胞。
在一些实施方案中，分离步骤包括使样本的细胞与针对B细胞标记的抗体(例如，针对CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72或CD79的抗体)、抗人IgE抗体和针对一种或多种免疫球蛋白同种型的抗体(例如，抗人IgG抗体、抗人IgM抗体、抗人IgA抗体和/或抗人IgD抗体)或其亚类接触，并选择表达B细胞标记、在细胞表面上表达IgE，以及不表达可检测水平的一种或多种其他正在筛选的免疫球蛋白同种型的细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括使样本的细胞与抗人CD19抗体；抗人IgE抗体；和抗人IgG抗体、抗人IgM抗体、抗人IgA抗体或抗人IgD抗体中的一种或多种接触，并选择对IgG、IgM、IgA或IgD细胞表面表达呈阴性的表达CD19+IgE的B细胞。
在一些实施方案中，分离步骤包括使来自样本的细胞与抗人CD19抗体、抗人IgE抗体、抗人IgM抗体和抗人IgG抗体接触，并选择表达CD19+IgM-IgG-IgE的B细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括使来自样本的细胞与抗人CD19抗体、抗人IgE抗体、抗人IgM抗体、抗人IgG抗体、抗人IgA抗体和抗人IgD抗体接触，并选择表达CD19+IgM-IgG-IgA-IgD-IgE的B细胞。
在一些实施方案中，分离步骤包括使样本的细胞与针对B细胞标记的抗体(例如，针对CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72或CD79的抗体)和针对非IgE同种型(例如，抗人IgG抗体、抗人IgM抗体、抗人IgA抗体和抗人IgD抗体)或其亚类的抗体接触，并选择表达B细胞标记以及不表达可检测水平的非IgE同种型的细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括使来自样本的细胞与抗人CD19抗体、抗人IgM抗体、抗人IgG抗体、抗人IgA抗体和抗人IgD抗体接触，并选择CD19+IgM-IgG-IgA-IgD-B细胞。
在一些实施方案中，该方法包括分离表达IgE的B细胞，其是分泌抗体的B细胞(例如，成浆细胞或浆细胞)。在一些实施方案中，该方法包括分离表达IgE的B细胞，其是记忆B细胞。在一些实施方案中，该方法包括分离表达IgE的分泌抗体的B细胞和表达IgE的记忆性B细胞。
IgG4选择
在一些实施方案中，该方法包括分离选择用于表达细胞表面IgG4的单个B细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括使样本的细胞与抗人IgG4抗体接触，并选择在细胞表面上表达IgG4的细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括使样本的细胞与针对B细胞标记的抗体(例如，针对CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72或CD79的抗体)和抗人IgG4抗体接触，并选择表达B细胞标记以及在细胞表面上表达IgG4的细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括使样本的细胞与抗人CD19抗体和抗人IgG4抗体接触，并选择表达CD19+IgG4的B细胞。
在一些实施方案中，分离步骤包括使样本的细胞与针对B细胞标记的抗体(例如，针对CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72或CD79的抗体)，抗人IgG4抗体和针对一种或多种IgG亚类的抗体(例如，抗人IgG1抗体、抗人IgG2抗体、抗人IgG3抗体)接触，以及选择表达B细胞标记、在细胞表面上表达IgG4以及不表达可检测水平的一种或多种其他正在筛选的IgG亚类的细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括使来自样本的细胞与抗人CD19抗体、抗人IgG1抗体、抗人IgG2抗体、抗人IgG3抗体和抗人IgG4抗体接触，以及选择表达CD19+IgG1-IgG2-IgG3-IgG4的B细胞。
在一些实施方案中，分离步骤包括使样本的细胞与针对B细胞标记的抗体(例如，针对CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72或CD79的抗体)、抗人IgG4抗体和针对一种或多种免疫球蛋白同种型的抗体(例如，抗人IgE抗体、抗人IgM抗体、抗人IgA抗体和/或抗人IgD抗体)或其亚类接触，以及选择表达B细胞标记、在细胞表面上表达IgG4以及不表达可检测水平的一种或多种其他正在筛选的免疫球蛋白同种型的细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括使样本的细胞与抗人CD19抗体；抗人IgG4抗体；和抗人IgE抗体、抗人IgM抗体、抗人IgA抗体或抗人IgD抗体的一种或多种接触，以及选择对IgE、IgM、IgA或IgD细胞表面表达呈阴性的CD19+IgG4表达B细胞。
在一些实施方案中，分离步骤包括使来自样本的细胞与抗人CD19抗体、抗人IgG4抗体、抗人IgM抗体和抗人IgG抗体接触，以及选择表达CD19+IgM-IgE-IgG4的B细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括使来自样本的细胞与抗人CD19抗体、抗人IgG4抗体、抗人IgM抗体、抗人IgE抗体、抗人IgA抗体接触和抗人IgD抗体接触，以及选择表达CD19+IgM-IgE-IgA-IgD-IgG4的细胞。
在一些实施方案中，分离步骤包括使样本的细胞与针对B细胞标记的抗体(例如，针对CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD40、CD72或CD79的抗体)和针对非IgG同种型的抗体(例如，抗人IgE抗体、抗人IgM抗体、抗人IgA抗体和抗人IgD抗体)或其非IgG4同种型接触，以及选择表达B细胞标记和不表达可检测水平的非IgG或非IgG4同种型的细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括使来自该样本的细胞接触抗人CD19抗体、抗人IgM抗体、抗人IgE抗体、抗人IgA抗体和抗人IgD抗体以及选择CD19+IgM-IgE-IgA-IgD-B细胞。在一些实施方案中，分离步骤包括使来自样本的细胞接触抗人CD19抗体、抗人IgM抗体、抗人IgE抗体、抗人IgA抗体、抗人IgD抗体、抗人IgG1抗体、抗人IgG2抗体和抗人IgG3抗体以及选择CD19+IgM-IgE-IgA-IgD-IgG1-IgG2-IgG3-B细胞。
在一些实施方案中，该方法包括分离表达IgG4的B细胞，其是分泌抗体的B细胞。在一些实施方案中，该方法包括分离表达IgG4的B细胞，其是记忆B细胞。在一些实施方案中，该方法包括分离表达IgG4的分泌抗体的B细胞和表达IgG4的记忆B细胞。
生成并测序cDNA
在一些实施方案中，cDNA是从来自样本的分离的单个B细胞[例如，从已经针对免疫球蛋白同种型(如IgE或IgG4)的表达进行筛选的单个B细胞，或者从未针对免疫球蛋白同种型的表达进行筛选的单个B细胞]生成的。在一些实施方案中，从单个B细胞制备cDNA文库。在一些实施方案中，对于针对每个单个B细胞生成的cDNA，cDNA序列包括编码免疫球蛋白重链的序列和编码免疫球蛋白轻链的序列。
在一些实施方案中，通过逆转录来自单个B细胞的RNA的cDNA序列(例如，总RNA或mRNA)并扩增cDNA序列来生成cDNA。为了生成cDNA，在一些实施方案中，将单个B细胞裂解，并从细胞裂解物中存在的mRNA逆转录cDNA序列。在一些实施方案中，从单个B细胞分离RNA，并且从分离的RNA逆转录cDNA。
在一些实施方案中，该方法包括扩增单个B细胞的转录组。例如，在一些实施方案中，该方法包括逆转录RNA(例如，聚腺苷酸化的mRNA)以合成cDNA，然后例如通过PCR扩增cDNA。逆转录聚腺苷酸化的mRNA和扩增单个细胞的转录组的示例性方法被描述于Darmanis等人,Cell Reports,2017,21:1399-1410,以及Picelli等人,Nature Protocols,9,2014,171-181中。
在一些实施方案中，该方法包括从单个B细胞扩增免疫球蛋白重链和轻链序列。例如，在一些实施方案中，该方法包括逆转录RNA(例如，总RNA)以合成cDNA，然后使用用于免疫球蛋白重链可变区和恒定区的引物，例如通过PCR来扩增cDNA。在一些实施方案中，该方法包括使用免疫球蛋白特异性引物(例如恒定区特异性引物)逆转录RNA以合成包括免疫球蛋白序列的cDNA，然后使用用于免疫球蛋白重链可变区和恒定区的引物来扩增cDNA。从单个细胞扩增免疫球蛋白重链和轻链序列的示例性方法被描述于Tiller等人,J.Immunol.Methods,2008,329:112-124中。
在一些实施方案中，在生成cDNA之后，该方法包括确定cDNA的序列。在一些实施方案中，使cDNA经受测序。在一些实施方案中，该方法包括对单个B细胞的转录组测序。在一些实施方案中，该方法包括对靶基因(例如，免疫球蛋白基因，例如，免疫球蛋白重链可变区和恒定区以及免疫球蛋白轻链可变区和恒定区)进行测序。
测序方法，包含用于高通量测序的方法，是本领域已知的。例如，此类测序技术包含但不限于焦磷酸测序、边连接边测序(sequencing-by-ligation)、单分子测序、边合成边测序(SBS)、大规模并行克隆(massive parallel clonal)、大规模并行单分子SBS、大规模并行单分子实时、大规模并行单分子实时纳米孔技术等。Morozova和Marra在Genomics,92:255(2008)中提供了一些这类技术的综述，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，测序包括高通量测序。在高通量测序中，使用多个模板和多个引物的平行测序反应允许对基因组或大部分基因组进行快速测序。高通量测序方法包含通常使用模板扩增的方法和不使用模板扩增的方法。利用扩增的测序方法包含由Roche作为454技术平台(例如GS 20和GS FLX)进行商业化的焦磷酸测序，由Illumina利用诸如NextSeq之类的系统进行商业化的克隆阵列形成和边合成边测序(SBS)化学法，以及由Applied Biosystems商业化的支持的寡核苷酸连接和检测(SOLiD)平台。非扩增方法，也称为单分子测序，以由Helicos BioSciences进行商业化的HeliScope平台，以及分别由VisiGen,Oxford Nanopore Technologies Ltd.,Life Technologies/Ion Torrent以及Pacific Biosciences进行商业化的平台为示范。
在一些实施方案中，使用Illumina测序平台，例如NextSeq。该测序技术利用克隆阵列形成和边合成边测序来大规模产生序列。在这种方法中，将测序模板固定在流通池表面，然后固相扩增以紧密邻位的方式产生每个模板分子的拷贝(多达1,000个相同拷贝)，形成多核苷酸序列的密集“簇”。为了对簇进行测序，使用荧光标记的核苷酸对流通池表面上的簇进行平行测序。对于每个测序循环，将单个标记的与可逆终止子结合的dNTP添加至核酸链。通过检测掺入后的荧光来确定掺入的核苷酸的序列，然后在下一个dNTP添加循环之前去除荧光染料，从而进行逐碱基测序。通常，序列读取长度在约30个核苷酸至超过150个核苷酸的范围内。对于具有较长长度的靶cDNA，可以基于短测序读段之间的重叠以生物信息学方式重新组装该序列以确定全长靶cDNA的序列。
鉴定具有IgE或IgG4同种型的B细胞
在一些实施方案中，在已经确定了单个B细胞的cDNA序列之后，该方法包括分析cDNA的序列以鉴定表达具有IgE同种型和/或IgG4同种型的IgE恒定区的免疫球蛋白重链的单个B细胞，。如本文所述，已经发现基于重链转录物的序列而不是FACS免疫球蛋白表面染色来确定B细胞的同种型，实质上减少了B细胞群体中假阳性IgE细胞的数量，因此产生了更有可能收获抗体的B细胞群体，该抗体与作为B细胞来源的人类受试者对其过敏的过敏原特异性结合。
在一些实施方案中，该方法包括鉴定编码包括IgE恒定区的免疫球蛋白重链的序列。在一些实施方案中，该方法包括鉴定编码包括IgG4恒定区的免疫球蛋白重链的序列。在一些实施方案中，通过将cDNA序列与已知的IgE恒定区序列或已知的IgG4恒定区序列进行比较来分析该cDNA序列。例如，可以通过比对序列将目标cDNA序列(例如，来自B细胞的“测试”序列)与已知的IgE或IgG4恒定区序列(例如，“参考”序列)进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域已知的。用于比较的序列的最佳比对可以例如通过Smith&Waterman,Adv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源比对算法，通过Needleman&Wunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源比对算法，通过Pearson&Lipman,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化实施(威斯康星州遗传学软件包中的GAP,BESTFIT,FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,WI),或通过手动比对和可视化检查来执行。适用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1977)Nucleic Acids Res.25:3389-3402中。可通过国家生物技术信息中心(NCBI)网站公开获得用于执行BLAST分析的软件。
为了将测试序列与IgE或IgG4恒定区参考序列进行比较，在一些实施方案中，参考序列是公开的序列，例如IgE或IgG4恒定区序列，其可在ImMunoGeneTics(IMGT)数据库中公开获得。参见，例如，Camacho等人,BMC Bioinformatics,2009,10:421；Lefranc等人,Nucleic Acids Res,2009,37:D1006-1012。下文表1中还描述了分析测试序列以鉴定包括IgE同种型和/或IgG4同种型的免疫球蛋白重链恒定区的序列的方法。
在一些实施方案中，除了分析序列以鉴定和选择包括包含IgE恒定区或IgG4恒定区的免疫球蛋白重链序列的单个B细胞，所述方法还包括确定单个B细胞中一个或多个其他基因的序列和/或表达水平。例如，在一些实施方案中，该方法包括确定作为特定类型的B细胞的“标签”(signature)的一组基因的序列和/或表达水平。
在一些实施方案中，对于被鉴定为具有包括IgE恒定区或IgG4恒定区的免疫球蛋白重链的B细胞，该方法进一步包括从同一B细胞中鉴定由该细胞表达的重链可变区序列和由该细胞表达的轻链可变区序列。
抗体表达
通常，对于鉴定为具有包含IgE或IgG4恒定区序列的cDNA的单个B细胞，来自单个B细胞的重链可变区和轻链可变区序列是对目标过敏原具有特异性的候选抗体序列。因此，在一些实施方案中，该方法包括表达包括来自单个B细胞的重链可变区和轻链可变区序列的抗体，以及鉴定所表达的抗体是否特异性结合目标过敏原。在本领域中描述了表达和纯化重组抗体的方法。参见，例如Frenzel等人,Front Immunol.,2013,4:217,doi:10.3389/fimmu.2013.00217；Siegemund等人,Methods Mol Biol.,2014,1131:273-295。
在一些实施方案中，来自单个B细胞的重链可变区和轻链可变区序列从单个B细胞扩增并克隆到表达载体中。在一些实施方案中，合成来自单个B细胞的重链可变区和轻链可变区序列。在一些实施方案中，对重链可变区序列和/或轻链可变区序列进行密码子优化，例如以通过表达系统增加抗体表达。参见，例如Ayyar等人,Methods,2017,116:51-62。
来自单个B细胞的重链可变区和轻链可变区序列可以使用任何数量的表达系统(包含原核和真核表达系统)表达。在一些实施方案中，表达系统是哺乳动物细胞表达，例如杂交瘤，或CHO或HEK293细胞表达系统。许多这类系统可从商业供应商处广泛获得。细胞表达系统也在本领域中有描述。参见，例如，Kunert和Reinhart,2016,“Advances inrecombinant antibody manufacturing”Appl Microbiol Biotechnol.100:3451–61；Jager等人,BMC Proc.,2015,9:P40,doi:10.1186/1753-6561-9-S9-P40；以及其中引用的参考文献。在一些实施方案中，重链和轻链使用单一载体表达，例如在双顺反子表达单元中或在不同启动子的控制下表达。在其他实施方案中，重链和轻链使用分开的载体表达。在一些实施方案中，如本文所公开的用于表达重链可变区序列和/或轻链可变区序列的表达载体是包括所需重链同种型或轻链亚类的恒定区的载体。例如，可以将如本文公开的重链可变区序列克隆到包括人IgG(例如IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)重链恒定区的载体中，并且可以将如本文公开的轻链可变区序列克隆到包括人λ或κ轻链恒定区的载体中。
在一些实施方案中，在表达和纯化了如本文公开的来自单个B细胞的包括重链可变区序列和轻链可变区序列的抗体后，该方法包括确定该抗体是否特异性结合过敏原。分析结合亲和力和结合动力学的方法是本领域已知的。参见，例如，Ernst等人,Determination of Equilibrium Dissociation Constants,Therapeutic MonoclonalAntibodies(Wiley&Sons ed.2009)。这些方法包含但不限于固相结合测定(例如ELISA测定)、免疫沉淀、表面等离激元共振(SPR，例如BiacoreTM(GE Healthcare，Piscataway，NJ))、动力学排斥测定(例如
Figure BDA0002783880990000471
)、流式细胞术、荧光激活的细胞分选(FACS)、BioLayer干涉测量法(例如OctetTM(FortéBio,Inc.,Menlo Park,CA))和Western blot分析。SPR技术例如在Hahnfeld等人.Determination of Kinetic Data Using SPR Biosensors,Molecular Diagnosis of Infectious Diseases(2004)中进行了综述。在典型的SPR实验中，在流通池中将一种相互作用剂(靶或靶向药剂)固定在SPR活性、镀金的载玻片上，以及将包含另一种相互作用剂的样本引入以流过整个表面。当给定波长的光照射在表面上时，金的光学反射率的变化表示结合以及结合动力学。在一些实施方案中，动力学排斥测定用于确定亲和力。该技术被描述于例如Darling等人,Assay and Drug DevelopmentTechnologies第2卷,编号6 647-657(2004)中。在一些实施方案中，使用BioLayer干涉测量法来测定亲和力。该技术被描述于例如Wilson等人,Biochemistry and MolecularBiology Education,38:400-407(2010)；Dysinger等人,J.Immunol.Methods,379:30-41(2012)中。
在一些实施方案中，所表达的抗体以高亲和力特异性结合该过敏原。在一些实施方案中，该抗体对该过敏原具有小于250nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM、小于500pM、小于250pM、小于150pM、小于100pM、小于50pM、小于40pM、小于30pM、小于20pM、小于约10pM或小于1pM的结合亲和力(KD)。在一些实施方案中，该抗体以1nM至250nM的结合亲和力(KD)结合该过敏原。
核酸、载体和宿主细胞
在一些实施方案中，本文所述的过敏原特异性单克隆抗体使用重组方法制备。相应地，在一些方面，本发明提供分离的核酸，其包括编码如本文所述的任何过敏原特异性单克隆抗体(例如，本文所述的CDR中的任何一种或多种)的核酸序列；包括这类核酸的载体；以及其中引入了该核酸的宿主细胞，其用来复制编码抗体的核酸和/或表达该抗体。在一些实施方案中，该宿主细胞是真核生物细胞，例如人细胞，例如HEK-293。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)包括编码如本文所述的抗体或其抗原结合部分的核苷酸序列(例如，如下文第IV部分所述)。在一些实施方案中，该多核苷酸包括编码一种或多种氨基酸序列(例如，CDR、重链可变区或轻链可变区)的核苷酸序列，其在下文表1中公开。
在另一方面，提供制造如本文所述的过敏原特异性单克隆抗体的方法。在一些实施方案中，该方法包含在适合于表达该抗体的条件下培养如本文所述的宿主细胞(例如，如本文所述的表达多核苷酸或载体的宿主细胞)。在一些实施方案中，随后从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收该抗体。
含有编码本公开的抗体的多核苷酸或其片段的合适的载体包含克隆载体和表达载体。虽然选择的克隆载体可能根据打算使用的宿主细胞而变化，但有用的克隆载体通常具有自我复制的能力，可具有针对特定限制性核酸内切酶的单一靶，和/或可携带用于标记的基因，该标记可用于选择含有载体的克隆。示例包含质粒和细菌病毒，例如pUC18、pUC19、Bluescript(例如pBS SK+)及其衍生物、mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、ColE1、pCR1、RP4、噬菌体DNA和穿梭载体，例如pSA3和pAT28。克隆载体可从商业供应商(例如BioRad、Stratagene和Invitrogen)获得。
表达载体通常是包含本公开的核酸的可复制的多核苷酸构建体。表达载体可以作为游离体或作为染色体DNA的组成部分在宿主细胞中复制。合适的表达载体包含但不限于质粒、病毒载体，包含腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒和任何其他载体。
IV.特异性结合过敏原的单克隆抗体
在另一方面，提供了根据本文公开的方法从人样本生成的过敏原特异性单克隆抗体及其抗原结合部分。在一些实施方案中，单克隆抗体是根据以上第III部分中公开的方法生成的抗体。在一些实施方案中，单克隆抗体是从具有针对食物过敏原，植物过敏原，真菌过敏原，动物过敏原，尘螨过敏原，药物过敏原，化妆品过敏原或乳胶过敏原的过敏症的人受试者的样本中生成的抗体，并且单克隆抗体特异性结合食品过敏原、植物过敏原、真菌过敏原、动物过敏原、尘螨过敏原、药物过敏原、化妆品过敏原或乳胶过敏原。
在一些实施方案中，本文所述的抗体是全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fab′-SH、Fv、单链抗体或单链Fv(scFv)抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗体包括IgG4恒定区。在一些实施方案中，本文所述的抗体是单特异性抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗体是多特异性抗体。特别地，本文所述的抗体可以是结合两种不同过敏原的双特异性抗体。例如，在一些实施方案中，本文所述的抗体可以结合花生过敏原和核果过敏原。在一些实施方案中，本文所述的抗体可以结合花生过敏原和奶过敏原。在一些实施方案中，本文所述的抗体可以结合花生过敏原和真菌过敏原。在一些实施方案中，本文所述的抗体可以结合核果过敏原和奶过敏原。在一些实施方案中，本文所述的抗体可以结合核果过敏原和真菌过敏原。在一些实施方案中，本文所述的抗体可以结合奶过敏原和真菌过敏原。
在一些实施方案中，该单克隆抗体或其抗原结合部分是过敏原特异性的抗体，其包括根据包括以下的方法鉴定的重链可变区序列和轻链可变区序列：
(a)从人类受试者的样本中分离单个B细胞，其中该受试者对该过敏原过敏；
(b)从步骤(a)的该单个B细胞生成cDNA，其中cDNA序列包括编码全部或部分免疫球蛋白重链的第一序列和编码全部或部分免疫球蛋白轻链的第二序列；
(c)确定来自步骤(b)中该cDNA的序列；
(d)分析步骤(c)中确定的该序列以鉴定包括第一序列的单个B细胞，该第一序列包括IgE恒定区或IgG4恒定区；
(e)从步骤(d)的该单个B细胞中鉴定(i)包括IgE恒定区或IgG4恒定区的该免疫球蛋白重链中的重链可变区序列，和(ii)在同一单个B细胞中与该免疫球蛋白重链共表达的免疫球蛋白轻链中的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，该重链可变区和该轻链可变区来自包括包含IgE恒定区的免疫球蛋白的B细胞。在一些实施方案中，该重链可变区和该轻链可变区来自包括包含IgG4恒定区的免疫球蛋白的B细胞。
在一些实施方案中，该单克隆抗体或其抗原结合部分是包括以下的过敏原特异性的抗体：
(a)重链可变区序列，其来源于来自对该过敏原过敏的人类受试者的产IgE-或IgG4的单个B细胞的免疫球蛋白重链；
(b)重链IgG恒定区序列；
(c)轻链可变区序列，其来源于来自人类受试者的产IgE-或IgG4的单个B细胞的免疫球蛋白轻链；
(d)轻链恒定区序列，其与(c)的该免疫球蛋白轻链是同一类别。
在一些实施方案中，该单克隆抗体包括来源于产IgE的人B细胞的重链可变区序列和轻链可变区序列。在一些实施方案中，该单克隆抗体包括来源于产IgG4的人B细胞的重链可变区序列和轻链可变区序列。
过敏原特异性单克隆抗体的特性
在一些实施方案中，该单克隆抗体特异性结合食物过敏原、植物过敏原、真菌过敏原、动物过敏原、尘螨过敏原、药物过敏原、化妆品过敏原或乳胶过敏原的抗体。在一些实施方案中，该单克隆抗体是特异性结合食物过敏原(例如奶过敏原，蛋过敏原，坚果过敏原，鱼过敏原，贝类过敏原，豆类过敏原，豆科过敏原，种子过敏原或小麦过敏原)的抗体。在一些实施方案中，该单克隆抗体特异性结合花生过敏原。在一些实施方案中，该单克隆抗体特异性结合奶过敏原。在一些实施方案中，该单克隆抗体特异性结合蛋过敏原。
在一些实施方案中，该单克隆抗体以小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM、小于500pM、小于250pM、小于150pM、小于100pM、小于50pM、小于40pM、小于30pM、小于20pM、小于约10pM或小于1pM的结合亲和力(KD)特异性结合过敏原(例如，食物过敏原、植物过敏原、真菌过敏原、动物过敏原、尘螨过敏原、药物过敏原、化妆品过敏原或乳胶过敏原)。在一些实施方案中，该抗体以1nM至250nM的结合亲和力(KD)结合过敏原。
在一些实施方案中，该单克隆抗体表现出与至少两种不同的抗原(例如，过敏原)的交叉反应性，例如，与至少两种食物过敏原、至少两种植物过敏原、至少两种真菌过敏原、至少两种动物过敏原、至少两种尘螨过敏原、至少两种药物过敏原、至少两种化妆品过敏原或至少两种乳胶过敏原的交叉反应性。在一些实施方案中，该单克隆抗体表现出与至少两种奶过敏原、至少两种蛋过敏原、至少两种坚果过敏原、至少两种鱼过敏原、至少两种贝类过敏原、至少两种大豆过敏原、至少两种豆科过敏原、至少两种种子过敏原或至少两种小麦过敏原的交叉反应性。本领域普通技术人员将认识到，许多不同的过敏原，例如许多植物性食物过敏原，可以被归类为少量的蛋白质家族。例如，所有植物性食物过敏原的一半以上可以归类为以下四个结构蛋白家族之一：醇溶蛋白超家族、cupin超家族、抑制蛋白(profilin)和与Bet v-1相关的蛋白。本领域普通技术人员还将认识到，对于特定类型的过敏原(例如，“花生”过敏原)，可以有超过一种肽或蛋白质是过敏原。作为非限制性示例，有12种已知的花生过敏原。参见Mueller等人,Curr Allergy Asthma Rep,2014,14:429。在一些实施方案中，单克隆抗体表现出与两种或更多种不同抗原(其是不同类型或类别的抗原)的交叉反应性。作为非限制性示例，在一些实施方案中，单克隆抗体表现出与作为花生过敏原的抗原和作为坚果(例如，核果)过敏原的抗原的交叉反应性。
在实施方案中，其中该单克隆抗体表现出与至少两种不同的抗原(例如，过敏原)的交叉反应性，在一些实施方案中，该单克隆抗体以小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM、小于500pM、小于250pM、小于150pM、小于100pM、小于50pM、小于40pM、小于30pM、小于20pM、小于约10pM或小于1pM的KD特异性结合该过敏原中的至少一种。在一些实施方案中，该单克隆抗体以小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM、小于500pM、小于250pM、小于150pM、小于100pM、小于50pM、小于40pM、小于30pM、小于20pM、小于约10pM或小于1pM的KD特异性结合第一抗原(例如，第一过敏原)。在一些实施方案中，该单克隆抗体以小于1μM、小于500nM、小于100nM、小于10nM或小于1nM的KD特异性结合第二抗原(例如，第二过敏原)。
可变区中的工程化变化
在一些实施方案中，单克隆抗体的重链可变区和/或轻链可变区具有与由来自具有针对过敏原的过敏症的人类受试者的产IgE或IgG4的单个B细胞编码的重链可变区和/或轻链可变区相同的序列。在一些实施方案中，单克隆抗体的重链可变区和/或轻链可变区包括一种或多种修饰，例如，氨基酸取代、缺失或插入。
如下文实施例部分所述的，本文所述的抗体(例如，花生过敏原特异性单克隆抗体，例如克隆PA13P1H08、克隆PA13P1E10、克隆PA12P3F10、克隆PA13P3G09、克隆PA12P3D08、克隆PA12P1C07、克隆PA15P1D12、克隆PA15P1D05或克隆PA13P1H08变体)的重链可变区序列和/或轻链可变区序列可以工程化成包括重链可变区序列和/或轻链可变区序列中的一种或多种变化。在一些实施方案中，工程化变化改进了抗体对过敏原的结合亲和力。在一些实施方案中，工程化变化改进了抗体对第二过敏原的交叉反应性。
在一些实施方案中，工程化变化是一种或多种CDR中的变化，例如，如本文所述的重链CDR和/或轻链CDR中的氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化变化是一种或多种框架区中的变化，例如，重链框架区和/或轻链框架区中的氨基酸取代。在一些实施方案中，工程化变化是重链和/或轻链序列区返祖为推断的原初序列。本领域中描述了用于确定推断的原初免疫球蛋白序列的方法。参见，例如，Magnani等人,PLoS Negl Trop Dis,2017,11:e0005655,doi:10.1371/journal.pntd.0005655。
在一些实施方案中，亲和力成熟用于工程化进一步的突变，该突变增强抗体对过敏原的结合亲和力或增强抗体对第二过敏原的交叉反应性。执行亲和力成熟的方法是本领域已知的。参见，例如，Renaut等人,Methods Mol Biol,2012,907:451-461。
恒定区和同种型切换
在一些实施方案中，该单克隆抗体包括来源于产IgE的人B细胞或产IgG4的人B细胞的重链可变区序列和轻链可变区序列，以及进一步包括κ或λ轻链恒定区。在一些实施方案中，该轻链恒定区(κ或λ)来自作为来源于产IgE的人B细胞或产IgG4的人B细胞的轻链可变区的同一类型的轻链(即，κ或λ)；作为非限制性示例，如果产IgE的人B细胞包括κ轻链，则产生的单克隆抗体包括来自产IgE的B细胞的轻链可变区以及进一步包括κ轻链恒定区。
在一些实施方案中，该单克隆抗体包括来源于产IgE的人B细胞或产IgG4的人B细胞的重链可变区序列和轻链可变区序列，以及进一步包括具有IgG同种型(例如，IgG4)、IgA同种型(例如，IgA1)、IgM同种型、IgD同种型或来源于IgG、IgA、IgM或IgD同种型的重链恒定区(例如，是修饰的IgG4恒定区)。本领域普通技术人员将理解，不同的重链同种型(IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)具有由重链恒定区介导的不同效应子功能，并且对于某些用途，可能期望具有具备特定同种型(例如IgG)的效应子功能的抗体。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括自然(即，野生型)人IgG、IgA、IgM或IgD恒定区。在一些实施方案中，单克隆抗体包括自然人IgG1恒定区、自然人IgG2恒定区、自然人IgG3恒定区、自然人IgG4恒定区、自然人IgA1恒定区、自然人IgA2恒定区、自然人IgM恒定区或自然人IgD恒定区。在一些实施方案中，单克隆抗体包括包含一种或多种修饰的重链恒定区。本领域普通技术人员将理解，可以在重链恒定区内调节效应子功能的一个或多个残基处进行修饰，例如氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰降低了效应子功能，例如导致在与介导效应子功能的效应子细胞上表达的Fc受体结合后诱导某些生物学功能的能力降低。在一些实施方案中，修饰(例如氨基酸取代)阻止体内Fab臂交换，这可引入不期望有的作用并降低抗体的治疗功效。参见，例如Silva等人,J Biol Chem,2015,280:5462-5469。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的自然(即，野生型)人IgM恒定区、人IgD恒定区、人IgG恒定区，或来源于IgA1或IgA2的人IgA恒定区，以及包括调节效应子功能的一种或多种修饰。在一些实施方案中，单克隆抗体包括来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人IgM恒定区、人IgD恒定区、人IgG恒定区，或来源于IgA1或IgA2的人IgA恒定区。在一些实施方案中，单克隆抗体包括来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的自然(即，野生型)人IgM恒定区、人IgD恒定区、人IgG恒定区，或来源于IgA1或IgA2的人IgA恒定区，以及包括一、二、三、四、五、六、七、八、九、十种或更多种修饰(例如，氨基酸取代)。在一些实施方案中，恒定区包含降低效应子功能的变化(例如，一、二、三、四、五、六、七、八、九、十种或更多种氨基酸取代)。
在一些实施方案中，单克隆抗体包括来自如本文所述(例如，如下文表1中公开的)的IgE或IgG4 B细胞的抗体的CDR序列、重链可变区和/或轻链可变区，以及进一步包括与来自作为CDR序列和/或可变区序列的来源的IgE或IgG4 B细胞的抗体异源的重链恒定区和/或轻链恒定区。例如，在一些实施方案中，单克隆抗体包括来自IgEB细胞的抗体的CDR序列和/或可变区序列，以及进一步包括与来自IgE B细胞的抗体异源的重链恒定区和轻链恒定区[例如，重链恒定区和/或轻链恒定区是野生型或修饰的IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区，或重链恒定区和/或轻链恒定区包括相对于来自IgE B细胞的抗体的自然恒定区的一种或多种修饰(例如，氨基酸取代)]。
特异性结合花生和/或核果过敏原的抗体
在一些实施方案中，如本文公开的单克隆抗体或其抗原结合部分特异性结合花生过敏原和/或核果过敏原。在一些实施方案中，单克隆抗体特异性结合花生过敏原。在一些实施方案中，单克隆抗体特异性结合花生过敏原，该花生过敏原是Ara h 1、Ara h 2、Ara h3或Ara h 6。
在一些实施方案中，单克隆抗体表现出与至少两种花生过敏原的交叉反应性。在一些实施方案中，单克隆抗体表现出与花生过敏原Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3和Ara h 6中的两种或更多种的交叉反应性。在一些实施方案中，单克隆抗体以小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM、小于500pM、小于250pM、小于150pM、小于100pM、小于50pM、小于40pM、小于30pM、小于20pM、小于约10pM或小于1pM的KD特异性结合至少一种花生过敏原。在一些实施方案中，单克隆抗体以小于100nM(例如，小于50nM、小于10nM、小于5nM或小于1nM)的KD特异性结合第一花生过敏原，以及以小于1μM(例如，小于500nM、小于100nM、小于10nM或小于1nM)的KD特异性结合第二花生过敏原。在一些实施方案中，单克隆抗体以小于100nM(例如，小于50nM、小于10nM、小于5nM或小于1nM)的KD特异性结合Ara h 2，以及以小于1μM(例如，小于500nM、小于100nM、小于10nM或小于1nM)的KD特异性结合Ara h 1、Ara h 3或Ara h 6。
在一些实施方案中，单克隆抗体识别表位，该表位包括氨基酸基序DPYSPS(SEQ IDNO:704)或由其组成。在一些实施方案中，单克隆抗体识别表位，该表位包括氨基酸序列DSYGRDPYSPS(SEQ ID NO:705)、YSPSQDPYSPS(SEQ ID NO:706)或PDRRDPYSPS(SEQ ID NO:707)或由其组成。
在一些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合部分特异性结合核果过敏原。在一些实施方案中，核果过敏原是腰果、开心果、杏仁、松仁、美洲山核桃、核桃、榛子或澳洲坚果过敏原。在一些实施方案中，单克隆抗体表现出与至少两种核果过敏原的交叉反应性。在一些实施方案中，单克隆抗体表现出与腰果和开心果过敏原两者的交叉反应性。在一些实施方案中，单克隆抗体表现出与美洲山核桃和核桃过敏原两者的交叉反应性。在一些实施方案中，单克隆抗体表现出与美洲山核桃、核桃、榛子和澳洲坚果过敏原中的两种或更多种的交叉反应性。在一些实施方案中，单克隆抗体以小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM、小于500pM、小于250pM、小于150pM、小于100pM、小于50pM、小于40pM、小于30pM、小于20pM、小于约10pM或小于1pM的KD特异性结合至少一种核果过敏原。
在一些实施方案中，单克隆抗体或其抗原结合部分特异性结合花生过敏原和核果过敏原。在一些实施方案中，单克隆抗体特异性结合花生过敏原；和腰果、开心果、杏仁、松仁、美洲山核桃、核桃、榛子或澳洲坚果过敏原中的一种或多种(例如，1、2、3、4种或更多种)。
花生特异性的抗体序列
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原(例如，特异性结合Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3或Ara h 6)的单克隆抗体包括下文表1中公开的重链CDR和/或轻链CDR。在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括以下序列：下文表1中公开的轻链可变区序列和/或重链可变区序列。在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括：重链可变区，其包括与表1中公开的重链可变区序列具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括与该重链可变区序列的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3；和轻链可变区，其包括与表1中公开的轻链可变区序列具有至少70％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括与该轻链可变区序列的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原(例如，特异性结合Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3或Ara h 6)的单克隆抗体包括轻链序列或其一部分，和/或重链序列或其一部分，其来源于本文所述的任何下面的抗体：克隆PA13P1H08、克隆PA13P1E10、克隆PA12P3F10、克隆PA13P3G09、克隆PA12P3D08、克隆PA12P1C07、克隆PA15P1D12、克隆PA15P1D05,克隆PA13P1H08的变体(例如，克隆PA13P1H08的R-R变体、R-N变体、N-R变体、rCDR1-N变体、rCDR2-N变体、rCDR3-N变体或者rFWRs-N变体)、克隆PA12P4D02、克隆PA12P3E09、克隆PA12P3E11、克隆PA12P1D02、克隆PA12P1G11、克隆PA13P1H03、克隆PA12P3C01或克隆PA12P3E04。克隆PA13P1H08、克隆PA13P1E10、克隆PA12P3F10、克隆PA13P3G09、克隆PA12P3D08、克隆PA12P1C07、克隆PA15P1D12、克隆PA15P1D05、克隆PA13P1H08变体、克隆PA12P4D02、克隆PA12P3E09、克隆PA12P3E11、克隆PA12P1D02、克隆PA12P1G11、克隆PA13P1H03、克隆PA12P3C01和克隆PA12P3E04的CDR、轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的氨基酸序列在下文表1中列出。
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括以下一种或多种(例如，一、二、三、四、五或全部六种)：
(a)重链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:2,10,17,25,33,41,47,58,113,129,199,341,348,409,459或593；
(b)重链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:3,11,18,26,34,48,59,130,200,342,349,410,460,539或594；
(c)重链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:4,12,19,27,35,42,49,55,60,131,201,350,411,461,540或595；
(d)轻链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:6,14,21,29,37,44,51,62,133,203,343,352,413,463,542或597；
(e)轻链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:7，15，22，30，38，52，78，86，126，149，196，345，353或598；以及
(f)轻链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:8,23,31,39,45,53,63,134,204,346,354,414,464,543或599。
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，其包括以下氨基酸序列：
(a)分别是SEQ ID NOs:2,3,4,6,7和8；或
(b)分别是SEQ ID NOs:10,11,12,14,15和8；或
(c)分别是SEQ ID NOs:17,18,19,21,22和23；或
(d)分别是SEQ ID NOs:25,26,27,29,30和31；或
(e)分别是SEQ ID NOs:33,34,35,37,38和39；或
(f)分别是SEQ ID NOs:41,34,35,37,38和39；或
(g)分别是SEQ ID NOs:47,48,49,51,52和53；或
(h)分别是SEQ ID NOs:47,48,55,51,52和53；或
(i)分别是SEQ ID NOs:58,59,60,62,30和63；或
(j)分别是SEQ ID NOs:58,59,60,6,7和8；或
(k)分别是SEQ ID NOs:2,3,4,62,30和63；或
(l)分别是SEQ ID NOs:58,3,4,6,7和8；或
(m)分别是SEQ ID NOs:2,59,4,6,7和8；或
(n)分别是SEQ ID NOs:2,3,60,6,7和8；或
(o)分别是SEQ ID NOs:129,130,131,133,126和134；或
(p)分别是SEQ ID NOs:341,342,343,345,78和346；或
(q)分别是SEQ ID NOs:348,349,350,352,353和354；或
(r)分别是SEQ ID NOs:199,200,201,203,149和204；或
(s)分别是SEQ ID NOs:409,410,411,413,86和414；或
(t)分别是SEQ ID NOs:459,460,461,463,196和464；或
(u)分别是SEQ ID NOs:113,539,540,542,196和543；或
(v)分别是SEQ ID NOs:593,594,595,597,598和599。
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NOs:1,9,16,24,32,40,46,54,57,64,65,66,67,128,340,347,406,408,458,538或592中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQID NOs:5,13,20,28,36,43,50,56,61,132,344,351,407,412,462,541或596中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NOs:1,9,16,24,32,40,46,54,57,64,65,66,67,128,340,347,406,408,458,538或592中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NOs:5,13,20,28,36,43,50,56,61,132,344,351,407,412,462,541或596中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NOs:1,9,16,24,32,40,46,54,57,64,65,66,67,128,340,347,406,408,458,538或592中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括与该SEQ ID NO的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NOs:5,13,20,28,36,43,50,56,61,132,344,351,407,412,462,541或596中任一项具有至少70％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括与该SEQ ID NO的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NOs:1,9,16,24,32,40,46,54,57,64,65,66,67,128,340,347,406,408,458,538或592中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括与该SEQ ID NO的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NOs:5,13,20,28,36,43,50,56,61,132,344,351,407,412,462,541或596中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括与该SEQ ID NO的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3。
克隆PA13P1H08
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列的重链CDR2，包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的重链CDR3，包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的轻链CDR1，包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:1具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:2,3和4的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:5具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:6,7和8的氨基酸序列的轻链CDR1，CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:2,3,4,6,7和8的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区，以及进一步包括包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA13P1E10
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:9具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:10,11和12的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:13具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:14,15和8的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:9具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体进行结合竞争的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:10,11,12,14,15和8的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的轻链可变区)。
克隆PA12P3F10
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链CDR1，包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:16具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:17,18和19的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:20具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:21,22和23的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:20具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:17,18,19,21,22和23的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA13P3G09
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:24具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:25,26和27的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:28具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:29,30和31的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:24具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:28具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:25,26,27,29,30和31的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA12P3D08
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:32具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:33,34和35的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:36具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:37,38和39的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:32具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:36具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:33,34,35,37,38和39的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA12P1C07
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:44的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ IDNO:30的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:45的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:40具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:41,34和42的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3分别；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:43具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)并包括分别包括SEQ ID NOs:44,30和45的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:40具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:43具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:41,34,42,44,30和45的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA15P1D12
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:46具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:47,48和49的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:50具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:51,52和53的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:46具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:50具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:41,34,42,44,30和45的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体.
克隆PA15P1D05
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:47的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:54具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:47,48和55的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:56具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:51,52和53的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:54具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:56具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:47,48,55,51,52和53的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ ID NO:56的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
变体序列
在一些实施方案中，过敏原特异性单克隆抗体包括如本文公开的一种或多种CDR、重链和/或轻链序列中的一种或多种变化(例如，氨基酸取代)(例如，克隆PA13P1H08，克隆PA13P1E10、克隆PA12P3F10、克隆PA13P3G09、克隆PA12P3D08、克隆PA12P1C07、克隆PA15P1D12、克隆PA15P1D05的一种或多种CDR、重链和/或轻链序列中的一种或多种突变)。在一些实施方案中，一种或多种取代在克隆PA13P1H08的CDR、重链或轻链序列中进行。如下文实施例部分所述，变体由克隆PA13P1H08制得，其中重链和/或轻链中的一种或多种区被返祖为推断的原初重排。发现包括原初轻链或重链序列的抗体序列能够结合花生过敏原Ara h 2。还惊奇地发现，除了对Ara h 2花生过敏原具有亚纳摩尔亲和力之外，包括返祖的CDR-H2序列的克隆PA13P1H08的变体还表现出与第二花生过敏原(Ara h 3)显著改进的交叉反应性。因此，在一些实施方案中，突变是氨基酸取代，其将克隆的序列的至少一部分从其“自然”形式(即，如表1中公开的克隆的CDR、重链可变区或轻链可变区序列)返祖为推断的原初免疫球蛋白序列。
在一些实施方案中，过敏原特异性单克隆抗体包括如本文公开的克隆PA13P1H08变体的一种或多种变体序列。在一些实施方案中，该抗体包括克隆PA13P1H08变体"R-R"的序列之一，其中克隆PA13P1H08的重链可变区和轻链可变区两者被返祖回推断的原初重排。在一些实施方案中，该抗体包括包含SEQ ID NO:57的返祖的重链可变区序列。在一些实施方案中，该抗体包括包含SEQ ID NO:61的返祖的轻链可变区序列。
在一些实施方案中，该抗体包括克隆PA13P1H08变体"R-N"的序列之一，其中克隆PA13P1H08的重链可变区被返祖回推断的原初重排，以及轻链可变区保留克隆PA13P1H08的自然序列(即，SEQ ID NO:5)。在一些实施方案中，该抗体包括克隆PA13P1H08变体"N-R"的序列之一，其中重链可变区保留克隆PA13P1H08的自然序列(即，SEQ ID NO:1)，以及轻链可变区被返祖回克隆PA13P1H08的推断的原初重排。
在一些实施方案中，该抗体包括一种或多种返祖的CDR序列，例如，一种或多种返祖的重链CDR序列和/或一种或多种返祖的轻链CDR序列。在一些实施方案中，该抗体包括包含SEQ ID NO:58的返祖的CDR-H1、包含SEQ ID NO:59的返祖的CDR-H2或包含SEQ ID NO:60的返祖的CDR-H3中的一种或多种。在一些实施方案中，该抗体包括包含SEQ ID NO:62的返祖的CDR-L1、包含SEQ ID NO:30的返祖的CDR-L2或包含SEQ ID NO:63的返祖的CDR-L3中的一种或多种。在一些实施方案中，该抗体包括一种或多种返祖的框架区，例如，包括SEQ IDNO:67的返祖的框架区的重链可变区。
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:58的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:59的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:60的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ IDNO:6或SEQ ID NO:62的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:30的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:63的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:67具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:61具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:57的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:66的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:65具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:2,59和4的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:5具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:6,7和8的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
核果特异性的抗体序列
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原(例如，特异性结合腰果、开心果、杏仁、松仁、美洲山核桃、核桃、榛子或澳洲坚果过敏原)的单克隆抗体包括下文表1中公开的重链CDR和/或轻链CDR。在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括以下序列：下文表1中公开的轻链可变区序列和/或重链可变区序列。在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括包含氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与表1中公开的重链可变区序列具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)并包括与该重链可变区序列的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3；和包含氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与表1中公开的轻链可变区序列具有至少70％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)并包括与该轻链可变区序列的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括轻链序列或其一部分和/或重链序列或其一部分，其来源于本文所述的任何以下抗体：克隆PA14P3H08、克隆PA11P1D11、克隆PA11P1G10、克隆PA12P4D02、克隆PA11P1D12、克隆PA11P1F03、克隆PA11P1C04、克隆PA11P1G04、克隆PA11P1E01、克隆PA11P1C11或克隆PA11P1C03。克隆PA14P3H08、克隆PA11P1D11、克隆PA11P1G10、克隆PA12P4D02、克隆PA11P1D12、克隆PA11P1F03、克隆PA11P1C04、克隆PA11P1G04、克隆PA11P1E01、克隆PA11P1C11和克隆PA11P1C03的CDR、轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的氨基酸序列在下文表1中列出。
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括以下一种或多种(例如，一、二、三、四、五或全部六种)：
(a)重链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:113,167,175,227,311,318,438,466,621,665或692；
(b)重链CDR2,其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:168,176,200,312,319,439,539,666或693；
(c)重链CDR3,其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:169,177,228,313,320,440,467,540,667或694；
(d)轻链CDR1,其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:171,179,230,315,322,442,469,542,623,669或696；
(e)轻链CDR2,其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:30,94,149,172,180,196,323或670；以及
(f)轻链CDR3,其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:173,181,231,316,324,443,470,543,624,671或697。
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括包含氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列包括SEQ ID NOs:166,174,226,310,317,437,465,538,620,664或691的序列，或者与所述SEQ ID NOs中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)。在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括包含氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列包括SEQ ID NOs:170,178,229,314,321,441,468,541,622,668或695的序列，或者与所述SEQ ID NOs中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)。在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括包含氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列包括SEQ ID NOs:166,174,226,310,317,437,465,538,620,664或691的序列或与所述SEQ IDNOs中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，以及包括包含氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列包括SEQ ID NOs:170,178,229,314,321,441,468,541,622,668或695的序列或与所述SEQ ID NOs中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)。
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NOs:166,174,226,310,317,437,465,538,620,664或691中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)并包括与该SEQ ID NO的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NOs:170,178,229,314,321,441,468,541,622,668或695中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)并包括与该SEQ ID NO的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，单克隆抗体特异性结合美洲山核桃、核桃、榛子和/或澳洲坚果过敏原以及包括以下一种或多种(例如，一、二、三、四、五或全部六种)：
(a)重链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:113,227,311,318,665或692；
(b)重链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:200,312,319,539,666或693；
(c)重链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:228,313,320,540,667或694；
(d)轻链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:230,315,322,542,669或696；
(e)轻链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:94,149,196,323或670；以及
(f)轻链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:231,316,324,543,671或697。
在一些实施方案中，特异性结合美洲山核桃、核桃、榛子和/或澳洲坚果过敏原的单克隆抗体包括包含氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列包括SEQ ID NOs:226,310,317,538,664或691的序列或与所述SEQ ID NOs中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)。在一些实施方案中，特异性结合美洲山核桃、核桃、榛子和/或澳洲坚果过敏原的单克隆抗体包括包含氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列包括SEQ ID NOs:229,314,321,541,668或695的序列或与所述SEQ ID NOs中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)。在一些实施方案中，特异性结合美洲山核桃、核桃、榛子和/或澳洲坚果过敏原的单克隆抗体包括包含氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列包括SEQ ID NOs:226,310,317,437,538,664或691的序列或与所述SEQ ID NOs中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，以及包括包含氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列包括SEQ ID NOs:229,314,321,541,668或695的序列或与所述SEQ ID NOs中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)。
在一些实施方案中，单克隆抗体特异性结合腰果和/或开心果过敏原以及包括以下一种或多种(例如，一、二、三、四、五或全部六种)：
(a)重链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:167,175,227,438,466或621；
(b)重链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:168,176,200或439；
(c)重链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:169,177,440或467；
(d)轻链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:171,179,442,469或623；
(e)轻链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:30,149,172或180；以及
(f)轻链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:173,181,443,470或624。
在一些实施方案中，特异性结合腰果和/或开心果过敏原的单克隆抗体包括包含氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列包括SEQ ID NOs:166,174,437,465或620的序列或与所述SEQ ID NOs中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)。在一些实施方案中，特异性结合腰果和/或开心果过敏原的单克隆抗体包括包含氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列包括SEQ ID NOs:170,178,441,468或622的序列或与所述SEQ ID NOs中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)。在一些实施方案中，特异性结合腰果和/或开心果过敏原的单克隆抗体包括包括包含氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列包括SEQ IDNOs:166,174,437,465或620的序列或与所述SEQ ID NOs中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)，以及包括包含氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列包括SEQ ID NOs:170,178,441,468或622的序列或与所述SEQ ID NOs中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)。
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，其包括以下氨基酸序列：
(a)分别是SEQ ID NOs:692,693,694,696,94和697；或
(b)分别是SEQ ID NOs:318,319,320,322,323和324；或
(c)分别是SEQ ID NOs:227,200,228,230,149和231；或
(d)分别是SEQ ID NOs:113,539,540,542,196和543；或
(e)分别是SEQ ID NOs:311,312,313,315,94和316；或
(f)分别是SEQ ID NOs:665,666,667,669,670和671；或
(g)分别是SEQ ID NOs:466,200,467,469,149和470；或
(h)分别是SEQ ID NOs:167,168,169,171,172和173；或
(i)分别是SEQ ID NOs:621,176,177,623,180和624；或
(j)分别是SEQ ID NOs:175,176,177,179,180和181；或
(k)分别是SEQ ID NOs:438,439,440,442,30和443。
克隆PA14P3H08
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:692的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:693的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ IDNO:694的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:696的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQID NO:94的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:697的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合两种或更多种核果过敏原。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合美洲山核桃、核桃、榛子和/或澳洲坚果过敏原。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:691具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:692,693和694的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:695具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:696,94和697的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:691具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:695具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:691的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:695的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:692，693，694，696，95和697的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:691的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:695的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA11P1D11
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:318的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:319的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ IDNO:320的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:322的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQID NO:323的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:324的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合两种或更多种核果过敏原。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合美洲山核桃、核桃、榛子和/或澳洲坚果过敏原。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:317具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:318,319和320的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:321具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:322,323和324的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:317具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:321具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQID NOs:318,319,320,322,323和324的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:317的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ ID NO:321的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA11P1G10
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:227的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ IDNO:228的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:230的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQID NO:149的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:231的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合两种或更多种核果过敏原。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合美洲山核桃、核桃、榛子和/或澳洲坚果过敏原。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:226具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:227,200和228的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:229具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:230,149和231的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:226具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:229具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:226的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:229的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQID NOs:227，200，228，230，149和231的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:226的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ ID NO:229的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA12P4D02
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:113的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:539的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ IDNO:540的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:542的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQID NO:196的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:543的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合两种或更多种核果过敏原。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合美洲山核桃、核桃、榛子和/或澳洲坚果过敏原。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:538具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:113,539和540的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:541具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:542,196和543的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:538具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:541具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:538的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:541的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQID NOs:113,539,540,542,196和543的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:538的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ ID NO:541的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA11P1D12
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:692的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:693的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ IDNO:694的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:696的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQID NO:94的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:697的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合两种或更多种核果过敏原。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合美洲山核桃、核桃、榛子和/或澳洲坚果过敏原。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:310具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:311,312和313的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:314具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:315,94和316的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:310具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:314具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:310的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQID NOs:311,312,313,315,94和316的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:310的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ ID NO:314的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA11P1F03
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:665的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:666的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ IDNO:667的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:669的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQID NO:670的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:671的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合两种或更多种核果过敏原。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合美洲山核桃、核桃、榛子和/或澳洲坚果过敏原。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:664具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:665,666和667的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:668具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:669,670和671的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:664具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:668具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:664的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:668的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQID NOs:665,666,667,669,670和671的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:664的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ ID NO:668的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA11P1C04
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:466的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:200的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ IDNO:467的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:469的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQID NO:149的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:470的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合两种或更多种核果过敏原。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合腰果和/或开心果过敏原。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:465具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:466,200和467的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:468具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:469,149和470的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:465具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:468具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:465的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:468的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQID NOs:466,200,467,469,149和470的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:465的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ ID NO:468的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA11P1G04
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:167的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:168的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ IDNO:169的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:171的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQID NO:172的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:173的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合两种或更多种核果过敏原。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合腰果和/或开心果过敏原。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:166具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:167,168和169的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:170具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:171,172和173的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:166具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:170具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQID NOs:167,168,169,171,172和173的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:166的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA11P1E01
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:621的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ IDNO:177的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:623的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQID NO:180的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:624的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合两种或更多种核果过敏原。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合腰果和/或开心果过敏原。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:620具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:621,176和177的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:622具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:623,180和624的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列620，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列622。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:620的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:622的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:621,176,177,623,180和624的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:620的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:622的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA11P1C11
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:175的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ IDNO:177的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:179的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQID NO:180的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合两种或更多种核果过敏原。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合腰果和/或开心果过敏原。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:174具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:175,176和177的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:178具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:179,180和181的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:174具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:178具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:178的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:175,176,177,179,180和181的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:178的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA11P1C03
在一些实施方案中，特异性结合核果过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:438的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:439的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ IDNO:440的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:442的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQID NO:30的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:443的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合两种或更多种核果过敏原。在一些实施方案中，该单克隆抗体结合腰果和/或开心果过敏原。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:437具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:438,439和440的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:441具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:442,30和443的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:437具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:441具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:437的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:441的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:438，439，440，442，30和443的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:437的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:441的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
特异性结合奶过敏原的抗体
在一些实施方案中，该单克隆抗体或其抗原结合部分特异性结合奶过敏原(例如，牛奶过敏原)。在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括在下文表1中公开的重链CDR和/或轻链CDR。在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括以下序列：下文表1中公开的轻链可变区序列和/或重链可变区。在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括：重链可变区，其包括与表1中公开的重链可变区序列具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列并包括与该重链可变区序列的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3；和轻链可变区，其包括与表1中公开的轻链可变区序列具有至少70％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括与该轻链可变区序列的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括轻链序列或其一部分和/或重链序列或其一部分，其来源于本文所述的任何以下抗体：克隆PA01P2C05、克隆PA01P2B03、克隆PA01P2A12、克隆PA01P2C12、克隆PA01P2E10、克隆PA01P2C09、克隆PA01P2D06、克隆PA01P2E08、克隆PA01P2A05、克隆PA01P2B04、克隆PA01P2E05、克隆PA01P2D04、克隆PA01P2B12、克隆PA01P2D11、克隆PA01P2B10、克隆PA01P2D10、克隆PA01P2D09、克隆PA01P2B05、克隆PA01P4C11、克隆PA01P3E08、克隆PA01P2E06、克隆PA01P2E07、克隆PA01P2G07、克隆PA01P2B09、克隆PA01P2C04或克隆PA01P2H08。克隆PA01P2C05，克隆PA01P2B03，克隆PA01P2A12，克隆PA01P2C12，克隆PA01P2E10，克隆PA01P2C09，克隆PA01P2D06，克隆PA01P2E08，克隆PA01P2A05，克隆PA01P2B04，克隆PA01P2E05，克隆PA01P2D04，克隆PA01P2B12，克隆PA01P2D11，克隆PA01P2B10，克隆PA01P2D10，克隆PA01P2D09，克隆PA01P2B05，克隆PA01P4C11，克隆PA01P3E08，克隆PA01P2E06，克隆PA01P2E07，克隆PA01P2G07，克隆PA01P2B09，克隆PA01P2C04和克隆PA01P2H08的CDR、轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的氨基酸序列在下文表1中列出。
在一些实施方案中，特异性结合花生过敏原的单克隆抗体包括以下一种或多种(例如，一、二、三、四、五或全部六种)：
(a)重链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:121,750,757,765,772,779,785,793,800,807,814,821,833,838,846,853,860,868,874,881,889,895,903,911,918或926；
(b)重链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:378,532,751,758,766,773,786,794,801,808,815,822,826,839,847,854,861,875,882,890,896,904,912,919或927；
(c)重链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:752,759,767,774,780,787,795,802,809,816,827,840,848,855,862,869,876,883,891,897,905,913,920或928；
(d)轻链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:523,754,761,769,776,782,789,797,804,811,818,829,835,842,850,857,864,871,878,885,899,907,915,922或930；
(e)轻链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:22,30,94,110,149,186,196,389,404,509,662,682,762,790,830,843,865,886,900,908,923或931；以及
(f)轻链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:755,763,770,777,783,791,798,805,812,819,824,831,836,844,851,858,866,872,879,887,893,901,909,916,924或932。
在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，其包括以下氨基酸序列：
(a)分别是SEQ ID NOs:750,751,752,754,196和755；或
(b)分别是SEQ ID NOs:757,758,759,761,762和763；或
(c)分别是SEQ ID NOs:765,766,767,769,30和770；或
(d)分别是SEQ ID NOs:772,773,774,776,389和777；或
(e)分别是SEQ ID NOs:779,532,780,782,404和783；或
(f)分别是SEQ ID NOs:785,786,787,789,790和791；或
(g)分别是SEQ ID NOs:793,794,795,797,30和798；或
(h)分别是SEQ ID NOs:800,801,802,804,110和805；或
(i)分别是SEQ ID NOs:807,808,809,811,509和812；或
(j)分别是SEQ ID NOs:814,815,816,818,94和819；或
(k)分别是SEQ ID NOs:821,822,787,776,790和824；或
(l)分别是SEQ ID NOs:121,826,827,829,830和831；或
(m)分别是SEQ ID NOs:833,826,827,835,149和836；或
(n)分别是SEQ ID NOs:838,839,840,842,843和844；或
(o)分别是SEQ ID NOs:846,847,848,850,196和851；或
(p)分别是SEQ ID NOs:853,854,855,857,662和858；或
(q)分别是SEQ ID NOs:860,861,862,864,865和866；或
(r)分别是SEQ ID NOs:868,378,869,871,682和872；或
(s)分别是SEQ ID NOs:874,875,876,878,22和879；或
(t)分别是SEQ ID NOs:881,882,883,885,886和887；或
(u)分别是SEQ ID NOs:889,890,891,523,762和893；或
(v)分别是SEQ ID NOs:895,896,897,899,900和901；或
(w)分别是SEQ ID NOs:903,904,905,907,908和909；或
(x)分别是SEQ ID NOs:911,912,913,915,149和916；或
(y)分别是SEQ ID NOs:918,919,920,922,923和924；或
(z)分别是SEQ ID NOs:926,927,928,930,931和932。
在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NOs:749,756,764,771,778,784,792,799,806,813,820,825,832,837,845,852,859,867,873,880,888,894,902,910,917或925中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NOs:753,760,768,775,781,788,796,803,810,817,823,828,834,841,849,856,863,870,877,884,892,898,906,914,921或929中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NOs:749,756,764,771,778,784,792,799,806,813,820,825,832,837,845,852,859,867,873,880,888,894,902,910,917或925中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NOs:753,760,768,775,781,788,796,803,810,817,823,828,834,841,849,856,863,870,877,884,892,898,906,914,921或929中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NOs:749,756,764,771,778,784,792,799,806,813,820,825,832,837,845,852,859,867,873,880,888,894,902,910,917或925中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列以及包括与该SEQ ID NO的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQID NOs:753,760,768,775,781,788,796,803,810,817,823,828,834,841,849,856,863,870,877,884,892,898,906,914,921或929中任一项具有至少70％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列以及包括与该SEQ ID NO的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括：
(a)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:749具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:749的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:753具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:753的序列；或
(b)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:756具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:756的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:760具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:760的序列；或
(c)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:764具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:764的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:768具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:768的序列；或
(d)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:771具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:771的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:775具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:775的序列；或
(e)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:778具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:778的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:781具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:781的序列；或
(f)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:784具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:784的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:788具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:788的序列；或
(g)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:792具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:792的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:796具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:796的序列；或
(h)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:799具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:799的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:803具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:803的序列；或
(i)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:806具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:806的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:810具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:810的序列；或
(j)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:813具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:813的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:817具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:817的序列；或
(k)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:820具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:820的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:823具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:823的序列；或
(l)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:825具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:825的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:828具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:828的序列；或
(m)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:832具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:832的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:834具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:834的序列；或
(n)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:837具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:837的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:841具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:841的序列；或
(o)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:845具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:845的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:849具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:849的序列；或
(p)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:852具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:852的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:856具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:856的序列；或
(q)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:859具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:859的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:863具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:863的序列；或
(r)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:867具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:867的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:870具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:870的序列；或
(s)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:873具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:873的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:877具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:877的序列；或
(t)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:880具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:880的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:884具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:884的序列；或
(u)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:888具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:888的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:892具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:892的序列；或
(v)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:894具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:894的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:898具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:898的序列；或
(w)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:902具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:902的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:906具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:906的序列；或
(x)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:910具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:910的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:914具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:914的序列；或
(y)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:917具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:917的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:921具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:921的序列；或
(z)包括氨基酸序列的重链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:925具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:925的序列；和包括氨基酸序列的轻链可变区，该氨基酸序列与SEQ ID NO:929具有至少90％(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性或具有SEQ ID NO:929的序列。
克隆PA01P2D09
在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:860的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:861的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:862的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:864的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ IDNO:865的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:866的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:859具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:860,861和862的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:863具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:864,865和866的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:859具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:863具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:859的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:863的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:860,861,862,864,865和866的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:859的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:863的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA01P2D04
在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:826的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:827的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:829的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ IDNO:830的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:831的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:825具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:121,826和827的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:828具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:829,830和831的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:825具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:828具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:825的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:828的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:121,826,827,829,830和831的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:825的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:828的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA01P2B12
在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:833的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:826的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:827的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:835的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ IDNO:149的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:836的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:832具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:833,826和827的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:834具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:835,149和836的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:832具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:834具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:832的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:834的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:833,826,827,835,149和836的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:832的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:834的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA01P2B05
在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:868的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:378的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:869的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:871的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ IDNO:682的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:872的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:867具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:868,378和869的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:870具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:871,682和872的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:867具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:870具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:867的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:870的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:868,378,869,871,682和872的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:867的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:870的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA01P2D10
在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:853的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:854的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:855的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:857的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ IDNO:662的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:858的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:852具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:853,854和855的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:856具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:857,662和858的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:852具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:856具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:852的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:856的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:853,854,855,857,662和858的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:852的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:856的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆PA01P2E08
在一些实施方案中，特异性结合奶过敏原的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:800的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:801的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:802的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:804的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ IDNO:110的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:805的氨基酸序列的轻链CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:799具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:800,801和802的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:803具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:804,110和805的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:799具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:803具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:799的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:803的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:800,801,802,804,110和805的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:799的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:803的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
特异性结合真菌过敏原的抗体
在一些实施方案中，该单克隆抗体或其抗原结合部分特异性结合真菌过敏原。在一些实施方案中，该单克隆抗体特异性结合真菌过敏原，该真菌过敏原是烟曲霉、黑曲霉或构巢曲霉过敏原(例如，烟曲霉、黑曲霉或构巢曲霉的提取物)。在一些实施方案中，该真菌过敏原是烟曲霉1(Asp f 1)，例如，纯化的重组过敏原烟曲霉1(rAsp f 1)。
在一些实施方案中，该单克隆抗体表现出与至少两种真菌过敏原的交叉反应性。在一些实施方案中，该单克隆抗体表现出与两种或更多种曲霉菌过敏原(例如，两种或更多种曲霉菌属)的交叉反应性。在一些实施方案中，该单克隆抗体表现出与真菌过敏原烟曲霉、黑曲霉和构巢曲霉中的两种或更多种的交叉反应性。在一些实施方案中，该单克隆抗体以小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM、小于500pM、小于250pM、小于150pM、小于100pM、小于50pM、小于40pM、小于30pM、小于20pM、小于约10pM或小于1pM的KD特异性结合该真菌过敏原中的至少一种。
抗体序列
在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原(例如，特异性结合曲霉菌过敏原)的单克隆抗体包括下文表1中公开的重链CDR和/或轻链CDR。在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原(例如，曲霉菌过敏原)的单克隆抗体包括以下序列：下文表1中公开的轻链可变区序列和/或重链可变区序列。在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原(例如，曲霉菌过敏原)的单克隆抗体包括：重链可变区，该重链可变区包括与表1中公开的重链可变区序列具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括与该重链可变区序列的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3；和轻链可变区，该轻链可变区包括与表1中公开的轻链可变区序列具有至少70％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括与该轻链可变区序列的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原(例如，特异性结合曲霉菌过敏原)的单克隆抗体包括轻链序列或其一部分和/或重链序列或其一部分，其来源于本文所述的任何以下抗体：克隆1003320101_D6、克隆1003320105_D6、克隆1003320107_C5、克隆1003320107_F3或克隆1003320107_F8。克隆1003320101_D6、克隆1003320105_D6、克隆1003320107_C5、克隆1003320107_F3以及克隆1003320107_F8的CDR、轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)的氨基酸序列在下文表1中列出。
在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原的单克隆抗体包括以下一种或多种(例如，一、二、三、四、五或全部六种)：
(a)重链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:710,718,726,734或742；
重链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:711,719,727,735或743；
重链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:712,720,728,736或744；
轻链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:714,722,730,738或746；
轻链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:715,723,731,739或747；以及
轻链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:716,724,732,740或748。
在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原的单克隆抗体包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，其包括以下氨基酸序列：
(a)分别是SEQ ID NOs:710,711,712,714,715和716；或
(b)分别是SEQ ID NOs:718,719,720,722,723和724；或
(c)分别是SEQ ID NOs:726,7272,728,730,731和732；或
(d)分别是SEQ ID NOs:734,735,736,738,739和740；或
(e)分别是SEQ ID NOs:742,743,744,746,747和748。
在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原的单克隆抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NOs:709,717,725,733或741中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原的单克隆抗体包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NOs:713,721,729,737或745中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原的单克隆抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NOs:709，717，725，733或741中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NOs:713,721,729,737或745中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原的单克隆抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NOs:709,717,725,733或741中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列以及包括与该SEQ ID NO的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原的单克隆抗体包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ IDNOs:713,721,729,737或745中任一项具有至少70％序列同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列以及包括与该SEQ ID NO的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3。在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原的单克隆抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NOs:709,717,725,733或741中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括与该SEQ ID NO的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NOs:713,721,729,737或745中任一项具有至少75％序列同一性(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括与该SEQ ID NO的CDR相同的CDR1、CDR2和CDR3。
克隆1003320101_D6
在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原(例如，曲霉菌过敏原)的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:710的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:711的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:712的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:714的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ ID NO:715的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:716的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该抗体特异性结合真菌过敏原烟曲霉。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:709具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:710,711和712的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:713具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:714,715和716的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:709具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:713具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:709的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:713的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:710,711,712,714,715和716的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:709的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:713的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆1003320105_D6
在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原(例如，曲霉菌过敏原)的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:718的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:719的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:720的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:722的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ ID NO:723的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:724的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该抗体特异性结合真菌过敏原烟曲霉。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:717具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:718,719和720的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:721具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:722,723和724的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:717具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:721具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:717的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:721的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:718,719,720,722,723和724的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体,其包括包含SEQ ID NO:717的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:721的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆1003320107_C5
在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原(例如，曲霉菌过敏原)的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:726的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:727的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:728的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:730的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ ID NO:731的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:732的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该抗体特异性结合真菌过敏原烟曲霉。在一些实施方案中，该抗体特异性结合真菌过敏原黑曲霉。在一些实施方案中，该抗体特异性结合真菌过敏原构巢曲霉。在一些实施方案中，该抗体特异性结合重组曲霉菌抗原(例如，rAsp f 1)。在一些实施方案中，该抗体交叉反应性地特异性结合烟曲霉、黑曲霉、构巢曲霉或重组曲霉菌抗原(例如，rAsp f 1)中的一种以上。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:725具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:726,727和728的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:729具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:730,731和732的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:725具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:729具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:725的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:729的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:726,727,728,730,731和732的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:725的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:729的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆1003320107_F3
在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原(例如，曲霉菌过敏原)的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:734的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:735的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:736的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:738的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ ID NO:739的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:740的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该抗体特异性结合重组曲霉菌抗原(例如，rAsp f1)。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:733具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:734,735和736的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:737具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:738,739和740的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:733具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:737具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:733的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:737的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:734,735,736,738,739和740的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:733的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:737的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
克隆1003320107_F8
在一些实施方案中，特异性结合真菌过敏原(例如，曲霉菌过敏原)的单克隆抗体包括包含SEQ ID NO:742的氨基酸序列的重链CDR1、包含SEQ ID NO:743的氨基酸序列的重链CDR2、包含SEQ ID NO:744的氨基酸序列的重链CDR3、包含SEQ ID NO:746的氨基酸序列的轻链CDR1、包含SEQ ID NO:747的氨基酸序列的轻链CDR2和包含SEQ ID NO:748的氨基酸序列的轻链CDR3。在一些实施方案中，该抗体特异性结合真菌过敏原烟曲霉。
在一些实施方案中，该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:741具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:74222,743和744的氨基酸序列的重链CDR1、CDR2和CDR3；以及
(b)轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:745具有至少70％序列同一性(例如，至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列并包括分别包括SEQ ID NOs:746,747和748的氨基酸序列的轻链CDR1、CDR2和CDR3。
在一些实施方案中，该抗体包括重链可变区，该重链可变区包括与SEQ ID NO:741具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，以及包括轻链可变区，该轻链可变区包括与SEQ ID NO:745具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体包括包含SEQ ID NO:741的氨基酸序列的重链可变区以及包括包含SEQ ID NO:745的氨基酸序列的轻链可变区。
在一些实施方案中，该抗体是与如本文所述的抗体(例如，抗体，其包括分别包括SEQ ID NOs:742,743,744,746,747和748的氨基酸序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3；或抗体，其包括包含SEQ ID NO:741的氨基酸序列的重链可变区以及进一步包括包含SEQ IDNO:745的氨基酸序列的轻链可变区)进行结合竞争的抗体。
抗原结合片段
在一些实施方案中，如本文公开的抗体(例如，第IV部分公开的结合食物过敏原、植物过敏原、真菌过敏原、动物过敏原、尘螨过敏原、药物过敏原、化妆品过敏原或乳胶过敏原的抗体)是抗原结合部分(本文中也称为抗原结合片段)。抗原结合片段的示例包含但不限于Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、二价scFv、单结构域抗体或双抗体。已经开发了用于产生抗原结合片段的各种技术。传统上，这些片段是通过完整抗体的蛋白水解消化而衍生的(参见，例如Morimoto等人,J.Biochem.Biophys.Meth.,24:107-117(1992)；和Brennan等人,Science,229:81(1985))。然而，现在可以使用重组宿主细胞直接生产这些片段。例如，可以从抗体噬菌体文库中分离抗原结合片段。替代地，可以从大肠杆菌细胞中直接回收Fab’-SH片段，并进行化学耦合以形成F(ab’)2片段(参见，例如Carter等人,BioTechnology,10:163-167(1992))。根据另一种方法，可以直接从重组宿主细胞培养物中分离F(ab’)2片段。产生抗原结合片段的其他技术是本领域已知的。
抗体偶联物
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可以与另一分子，例如聚乙二醇(PEG化)或血清白蛋白偶联，以提供延长的体内半衰期。抗原结合片段的聚乙二醇化的示例被提供于Knight等人.Platelets15:409,2004(针对阿昔单抗)；Pedley等人,Br.J.Cancer 70:1126,1994(针对抗CEA抗体)；Chapman等人,Nature Biotech.17:780,1999；andHumphreys,等人,Protein Eng.Des.20:227,2007)中。
在一些实施方案中，提供抗体-药物偶联物，其包括如本文所述的单克隆抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，单克隆抗体或抗原结合片段(例如，特异性结合食物过敏原或真菌过敏原的抗体或抗原结合片段)与细胞毒性药物共价连接。在一些实施方案中，该抗体或抗原结合片段是特异性结合真菌过敏原的抗体，并且该药物是抗真菌药物。合适的抗真菌药包含但不限于两性霉素B、唑类抗真菌药(例如酮康唑、氟康唑、伊伐康唑、伊曲康唑、泊沙康唑或伏立康唑)、棘球白素(例如阿尼芬净、卡泊芬净或米卡芬净)以及氟胞嘧啶。用于制造抗体-药物偶联物的方法被描述于例如Chudasama等人,Nature Chemistry,2016,8:114-119；WO 2013/068874；和US 8,535,678中。
本文描述的某些抗体衍生自从暴露于过敏原的人类受试者分离的B细胞。在某些实施方案中，本发明的抗体、抗体组合物和细胞可在一个或多个方面与天然存在的抗体、组合物和细胞区分开。可区分的抗体、组合物和细胞可以被称为“合成的”，或者可以通过以下条件来鉴定：该抗体或组合物“不是天然存在的”或肯定地是“非天然存在的”。如本文所用，术语“相应的抗体”和“相应于”描述了(1)以六种特异性CDR序列为特征并由下文实施例中所述的研究受试者的免疫细胞产生的抗体与(2)包括相同六种CDR序列的合成抗体之间的关系。
合成抗体
本发明的合成抗体可以与具有相同CDR的天然存在的抗体在结构上不同。即，通过特定的CDR鉴定的合成抗体可以与包括由下文实施例中所述的研究受试者的细胞产生的特定CDR的抗体在结构上不同。可能的不同包含：
与相应的天然存在的抗体不同的可变区序列
在一个方法中，抗体重链包括本文所述的克隆(例如，PA13P1E10)的CDR，条件是该抗体重链不包括与本文所述的克隆相关联的重链可变区序列。为了说明，在一个实施方案中，包括克隆PA13P1E10的CDR的抗体不具有包括SEQ ID NO:9的重链可变区。在另一方法中，抗体轻链包括本文所述的克隆(例如，PA13P1E10)的CDR，条件是该抗体轻链不包括与本文所述的克隆相关联的轻链可变区序列。为了说明，在一个实施方案中，包括克隆PA13P1E10的CDR的抗体不具有包括SEQ ID NO:13的轻链可变区。在一个方法中，本发明的抗体的重链和轻链可变区两者具有不同于本文公开的序列的氨基酸序列。
λ和κ轻链
在一些实施方案中，合成抗体包括λ型轻链。在一些实施方案中，合成抗体包括κ型轻链。
同种型
在一些实施方案中，具有指定CDR的合成抗体是除发现与研究受试者相关联的同种型(具有指定CDR的B细胞从其衍生)以外的同种型。在一些实施方案中，本文公开的抗体是除IgG1以外的同种型。在一些实施方案中，本文公开的抗体是除IgG2以外的同种型。在一些实施方案中，本文公开的抗体是除IgG3以外的同种型。在一些实施方案中，本文公开的抗体是除IgG4以外的同种型。在一些实施方案中，本文公开的抗体是除IgM以外的同种型。在一些实施方案中，本文公开的抗体是除IgA以外的同种型。
同种异型
在一些实施方案中，具有指定CDR的合成抗体是除发现与研究受试者相关联的同种异型(具有指定CDR的B细胞从其衍生)之外的同种异型。在一些实施方案中，本发明的合成抗体包括选自下文表2中列出的那些的同种异型，其不同于来自相应的研究受试者的抗体的同种异型。在一些实施方案中，本发明的合成抗体包括选自表2中列出的那些的任何单个同种异型，条件是该同种异型与来自研究受试者的抗体的相应同种异型不同。
表2：人免疫球蛋白同种异型
Figure BDA0002783880990001201
注意：括号内给出字母符号。出自：Jefferis and Marie-Paule Lefranc,2009,“Humanimmunoglobulin allotypes:Possible implications for immunogenicity”mAbs 1(4):332–338，通过引用并入本文。
恒定结构域变体
本发明的合成抗体可以包括重链恒定区的变化以相对于相应的天然存在的抗体改变合成抗体的性质。示例性的变化包含突变以调节抗体效应子功能(例如，基于补体的效应子功能或基于FcγR的效应子功能)，改变半衰期，调节抗原与FcγR的共接合，引入或去除糖基化基序(糖基-工程化)。参见Fonseca等人,2018,“Boosting half-life andeffector functions of therapeutic antibodies by Fc-engineering:Aninteraction-function review”Int J Biol Macromol.19:306-311；Wang等人,2018,“IgGFc engineering to modulate antibody effector functions”Protein Cell 2018,9(1):63–73；Schlothauer,2016,“Novel human IgG1 and IgG4Fc-engineered antibodieswith completely abolished immune effector functions,”Protein Engineering,Design and Selection 29(10):457–466；Tam等人,2017,“Functional,Biophysical,andStructural Characterization of Human IgG1 and IgG4 Fc Variants with AblatedImmune Functionality”Antibodies 6,12，出于所有目的均通过引用并入本文。
合成抗体组合物
本发明的合成抗体组合物在以下至少一个或多个方面可以与天然存在的组合物不同：(i)组合物包括抗体，该抗体是纯化的，即从在人体中，以及可选地在制造的赋形剂或介质中与其相关联的组织或细胞材料中分离；和/或(ii)本发明的抗体组合物含有单一种类的抗体(其是单克隆的)，使得该组合物中的所有抗体具有相同的结构和特异性；产合成抗体的细胞
本文所述的抗体可以通过在人或非人细胞中的重组表达来产生。产合成抗体的细胞包含表达重链、轻链或重链和轻链两者的非人细胞；不是免疫细胞重链、轻链或重链和轻链两者的人细胞；以及产生重链或轻链，但不产生重链和轻链两者的人B细胞。可以在除人B细胞以外的细胞中，例如除B细胞以外的非人细胞和人细胞中，任选地除免疫细胞之外，以及任选地在除了B细胞谱系中的细胞的细胞中在体外或体内异源地表达本发明的合成抗体。
V.使用方法
在另一方面，本公开提供了用于用本文所公开的一种或多种过敏原特异性单克隆抗体或其抗原结合部分来治疗人类受试者的治疗方法。在一些实施方案中，提供了治疗过敏症的方法。在一些实施方案中，提供了减轻受试者中一种或多种过敏症状的方法。在一些实施方案中，本文公开的过敏原特异性单克隆抗体在治疗上用作封闭抗体，其通常被称为被动免疫疗法。不受特定理论的束缚，假设本文公开的过敏原特异性单克隆抗体阻断过敏原与IgE的结合或在与内源性IgE进行过敏原结合的竞争中胜出，这又阻止或减少了过敏级联反应的启动。在一些实施方案中，无意受限于特定机制，本发明的抗体通过结合肥大细胞和/或嗜碱性粒细胞上的抑制性受体而提供治疗益处。
在一些实施方案中，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的如本文公开的一种或多种过敏原特异性单克隆抗体(例如，如上文第IV部分中公开的一种或多种过敏原特异性单克隆抗体)。在一些实施方案中，该方法包括向该受试者施用包括如本文公开的一种或多种过敏原特异性单克隆抗体的治疗有效量的药物组合物(例如，如下文第VI部分中公开的药物组合物)。
在一些实施方案中，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的过敏原特异性单克隆抗体(其是人IgG同种型，例如人IgG4同种型)或其抗原结合部分(其包括人IgG或IgG4同种型恒定区序列中的至少一部分)。
在一些实施方案中，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的过敏原特异性单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该方法包括向该受试者施用两种或更多种过敏原特异性单克隆抗体(例如，含于包括该两种或更多种过敏原特异性单克隆抗体的药物组合物中)。在一些实施方案中，该方法包括施用特异性结合相同过敏原的两种或更多种抗体。在一些实施方案中，该方法包括施用特异性结合相同过敏原的不同表位的两种或更多种抗体。在一些实施方案中，该方法包括施用特异性结合两种或更多种不同的过敏原的两种或更多种抗体。
在一些实施方案中，治疗性抗体是包含如本文所述(例如，如下表1所示)的CDR序列，重链可变区和/或轻链可变区的抗体，并且还包含自然或修饰的IgM、IgD、IgG3、IgG1、IgA1、IgG2、IgG4或IgA2重链恒定区。
在一些实施方案中，治疗性抗体与例如上文第IV部分中所述的药物偶联。
在一些实施方案中，待治疗的人类受试者是成年人。在一些实施方案中，该人类受试者是青少年。
在一些实施方案中，待治疗的人类受试者具有针对食物过敏原、植物过敏原、真菌过敏原、动物过敏原、尘螨过敏原、药物过敏原、化妆品过敏原或乳胶过敏原的过敏症。在一些实施方案中，该人类受试者具有针对食物过敏原的过敏症。在一些实施方案中，该食物过敏原是奶过敏原、蛋过敏原、坚果过敏原、鱼过敏原、贝类过敏原、豆类过敏原、豆科过敏原、种子过敏原或小麦过敏原。在一些实施方案中，该食物过敏原是花生过敏原。在一些实施方案中，该食物过敏原是奶过敏原。在一些实施方案中，该食物过敏原是蛋过敏原。在一些实施方案中，该人类受试者具有针对植物过敏原或真菌过敏原(例如，曲霉菌过敏原)的过敏症。在一些实施方案中，该过敏原是花粉过敏原(例如，树花粉、青草花粉或杂草花粉)或霉菌过敏原。在一些实施方案中，该人类受试者具有针对动物过敏原的过敏症。在一些实施方案中，该过敏原是皮屑过敏原或昆虫叮咬。
在一些实施方案中，待治疗的人类受试者具有针对两种或更多种过敏原(例如，针对食物过敏原、植物过敏原、真菌过敏原、动物过敏原、尘螨过敏原、药物过敏原、化妆品过敏原或乳胶过敏原的两种或更多种)的过敏症。在一些实施方案中，该人类受试者具有针对2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种过敏原的过敏症。在一些实施方案中，该人类受试者具有针对一个类别的过敏原中两种或更多种不同类型的抗原(过敏原)的过敏症，例如，具有针对两种或更多种不同的食物过敏原的过敏症(例如，针对两种或更多种不同的花生抗原的过敏症，或针对花生过敏原和非花生过敏原，例如蛋或奶过敏原的过敏症)。在一些实施方案中，该人类受试者具有针对两种或更多种不同类别的过敏原的过敏症(例如，针对一种或多种食物过敏原和针对一种或多种植物过敏原的过敏症)。在一些实施方案中，人类受试者具有针对相同类别的过敏原中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种过敏原的过敏症，但是不具有针对其他类别的过敏原中的过敏原的任何已知的过敏症。例如，在一些实施方案中，人类受试者具有针对1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种食物过敏原的过敏症，但是不具有针对非食物过敏原的任何已知的过敏症。在一些实施方案中，人类受试者具有针对1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种真菌过敏原的过敏症，但是不具有针对非真菌过敏原的任何已知的过敏症。
在一些实施方案中，本文公开的治疗方法减轻了受试者的过敏症的一种或多种症状。本领域普通技术人员将理解，与过敏反应相关联的症状可以根据诱导过敏反应的过敏原的类型而变化。过敏反应症状的示例包含但不限于荨麻疹，皮疹，湿疹耀斑，皮肤发红，口腔发痒，眼睛发痒，恶心，呕吐，腹泻，胃痛，鼻充血，流鼻涕，鼻塞，打喷嚏，咳嗽，疲倦，喉咙痛，嘴唇、舌头或喉咙肿胀，头痛，吞咽困难，呼吸急促，喘鸣，血压下降或脉搏微弱。在一些实施方案中，本文公开的治疗方法减轻了过敏症的一种或多种症状的严重性。在本文所述的治疗方法的一些实施方案中，受试者的过敏症状包括以下一种或多种：流鼻涕、皮疹、皮肤发红、皮肤肿胀、口腔和/或喉咙内或周围发痒或刺痛、吞咽困难、流眼泪、腹泻、胃痉挛、恶心、呕吐、喉咙发紧、呼吸急促或喘鸣、呼吸急促和过敏性反应。在一些实施方案中，本文公开的治疗方法减少了过敏症的一种或多种症状的持续时间的长度。
在一些实施方案中，本文公开的治疗方法减轻了对过敏原，例如食物过敏原(例如花生过敏原)的过敏反应的一种或多种症状，例如但不限于荨麻疹，皮疹，湿疹耀斑，皮肤发红，口腔发痒，恶心，呕吐，腹泻，胃痛，鼻充血，流鼻涕，打喷嚏，干咳，嘴唇、舌头或喉咙肿胀，吞咽困难，呼吸急促，喘鸣，血压下降或脉搏微弱。在一些实施方案中，本文公开的一种或多种过敏原特异性单克隆抗体的施用减轻了一种或多种症状的严重性和/或减少了一种或多种症状的持续时间的长度。
在一些实施方案中，以治疗有效量或剂量向人受试者施用本文公开的过敏原特异性单克隆抗体。在一些实施方案中，可以使用约0.01mg/kg至约500mg/kg，或约0.1mg/kg至约200mg/kg，或约1mg/kg至约100mg/kg，或约10mg/kg至约50mg/kg的日剂量范围。然而，剂量可以根据几个因素而变化，包含选择的给药途径、组合物的制剂、患者反应、病症的严重程度、受试者的体重以及处方医生的判断。根据个体患者的需要，剂量可以随时间增加或减少。在某些情况下，首先给患者服用低剂量，然后将其增加到该患者可耐受的有效剂量。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。
如本文所述的抗体或包括抗体的组合物的给药途径可以是皮肤或透皮、吸入、肠、静脉内、肌内、腹膜内、鞘内、病变内、支气管内、鼻、眼或耳的递送、口服、直肠、皮下、局部、透粘膜或本领域已知的任何其他方法。在一些实施方案中，通过输注(例如，静脉内)或通过注射(例如，皮下)来施用该抗体或组合物。在一些实施方案中，以本文所述的任何方法对抗体或包括抗体的组合物的给药途径是皮下、静脉内或鼻内的。
在一些实施方案中，单剂量的本文所述的抗体或包括抗体的组合物的施用可有效治疗过敏症或减轻过敏症的一种或多种症状。在一些实施方案中，施用多剂量的抗体或组合物。在一些实施方案中，在施用第一剂量后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或更长时间，例如至少1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周或更长时间施用第二剂量。在一些实施方案中，约每1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周向受试者施用本文所述的抗体或包括抗体的组合物。在一些实施方案中，在延长的时间段内，例如在至少30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350天或更长时间内向受试者施用本文所述的抗体或包括抗体的组合物。
在一些实施方案中，在本文所述的任何方法中，进一步向受试者施用额外的药剂，例如抗组胺药、肾上腺素、减充血剂，支气管扩张剂或皮质类固醇。在一些实施方案中，单克隆抗体和额外的药剂基本上同时施用，即，含于相同的药物组合物中或含于基本上同时施用(例如，彼此间隔数秒内施用)的分离药物组合物中。在一些实施方案中，单克隆抗体和额外的药剂分开施用。在一些实施方案中，首先施用单克隆抗体，然后施用额外的药剂。在一些实施方案中，首先施用额外的药剂，然后施用单克隆抗体。
在一些实施方案中，在本文所述的任何方法中，该方法可以进一步包括评估受试者中过敏症状(例如，与花生过敏症、核果过敏症、奶过敏症或真菌过敏症相关的过敏症状)的减轻。在某些实施方案中，过敏症状的减轻可以通过总鼻症状评分(TNSS)来测量，该TNSS是根据对四个症状的患者评估而进行：针对充血、瘙痒和鼻漏按0(无)至3(重度)，以及针对打喷嚏，按0(无)至3(5或更多)的标准进行评级。四个症状中的每一个都使用以下标准评估：0＝无，1＝轻度，2＝中度或3＝重度。TNSS的可能分数为0-12。在其他实施方案中，过敏症状的减轻可以通过视觉模拟量表(VAS)的鼻症状评分来测量，该评分通常用于将过敏负担分类为轻度、中度和重度。从0(无鼻症状)到100(最大鼻症状)的VAS鼻症状评分可用于评估合并鼻症状的严重程度。在其他实施方案中，过敏症状的减轻可以通过鼻吸气峰值流量(PNIF)来测量，该PNIF使用鼻肺量计来测量患者的鼻气流(以1/min测量)。又在其他实施方案中，过敏症状的减轻可以通过过敏原皮肤测试，例如皮肤点刺测试(SPT)来测量，其使用皮肤反应性的存在和程度作为靶器官(例如眼睛、鼻子、肺、肠道和皮肤)内敏化的标记。当相关的过敏原(例如，花生过敏原、核果过敏原、奶过敏原或真菌过敏原)被引入皮肤后，皮肤上的过敏反应产生水疱和耀斑响应，其可通过，例如使用水疱的直径进行量化。又在其他实施方案中，过敏症状的减轻可以通过嗜碱性粒细胞激活测试来测量，该测试利用流式细胞术来量化过敏原刺激后嗜碱性粒细胞表面上激活的标记的表达。又在其他实施方案中，过敏症状的减轻可以通过口服食物挑战来测量，其涉及在训练有素的过敏症专家或免疫学家的监督下向过敏个体施用递增剂量的过敏原。可以按照开放，单盲或双盲形式进行口服食物挑战，其中金标准既是双盲又是安慰剂对照的。
在又一方面，本公开提供了使用如本文公开的一种或多种过敏原特异性单克隆抗体或其抗原结合部分的诊断和检测方法。在一些实施方案中，过敏原特异性单克隆抗体或其抗原结合部分用于检测来自受试者的样本是否对过敏原(例如食物过敏原，例如花生过敏原、核果过敏原或奶过敏原；植物过敏原；真菌过敏原；动物过敏原；尘螨过敏原；药物过敏原；化妆品过敏原或乳胶过敏原)具有过敏反应性。在一些实施方案中，过敏原特异性单克隆抗体或其抗原结合部分用于检测来自受试者的样本是否对过敏原的特定表位(例如，使用已知与过敏原的特定表位结合的抗体)具有过敏反应性。在一些实施方案中，该方法包括使来自受试者的样本(例如血液或血浆样本)与如本文公开的过敏原特异性单克隆抗体或抗原结合部分接触。
VI.组合物和试剂盒
另一方面，提供组合物和试剂盒，该组合物和试剂盒包括从人B细胞生成的一种或多种过敏原特异性单克隆抗体或其抗原结合部分。
药物组合物
在一些实施方案中，提供药物组合物，其包括一种或多种过敏原特异性单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该药物组合物包括如本文所述(例如，如上文第IV部分中公开的)的单克隆抗体。在一些实施方案中，该药物组合物用于一种减轻受试者的一种或多种过敏症状(例如，由于针对食物过敏原、植物过敏原、真菌过敏原、动物过敏原、尘螨过敏原、药物过敏原、化妆品过敏原或乳胶过敏原的过敏症而引起的过敏症状)的方法。在一些实施方案中，该药物组合物用于一种减轻具有食物过敏症，例如花生过敏症的受试者的一种或多种过敏症状的方法。在一些实施方案中，该药物组合物用于一种减轻具有针对两种或更多种过敏原(例如，两种或更多种食物过敏原)的过敏症(例如，花生过敏症和核果过敏症)的受试者的一种或多种过敏症状的方法。在一些实施方案中，该药物组合物用于一种减轻具有真菌过敏症的受试者的一种或多种过敏症状的方法。
在一些实施方案中，该药物组合物包括如本文所述的两种或更多种单克隆抗体或其抗原结合部分(例如、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种抗体或其抗原结合部分)。在一些实施方案中，该组合物包括特异性结合相同过敏原的两种或更多种单克隆抗体。在一些实施方案中，该组合物包括特异性结合相同过敏原的不同表位的两种或更多种单克隆抗体。在一些实施方案中，该组合物包括特异性结合两种或更多种不同的过敏原的两种或更多种单克隆抗体。本领域的普通技术人员还将理解的是，对于特定类型或类别的过敏原，例如，一种类型的食物过敏原，例如花生过敏原，在该类型或类别的过敏原内可以有一种以上的诱发过敏反应的物质(例如，肽或蛋白质)。在一些实施方案中，组合物包括特异性结合一种特定类型或类别的过敏原内的不同过敏原的两种或更多种单克隆抗体，该不同过敏原例如作为同一类型或类别的过敏原的两种或更多种不同的肽或蛋白质(例如，作为花生过敏原的两种或更多种不同的蛋白质)。在一些实施方案中，该组合物包括特异性结合相同的第一过敏原的两种或更多种单克隆抗体，以及进一步包括特异性结合第二过敏原的一种或多种单克隆抗体。
用于制备制剂的指南可以在本领域技术人员已知的许多用于药物制备和配制的手册中找到。参见，例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,Philadelphia,PA.Lippincott Williams&Wilkins,2005。
在一些实施方案中，该药物组合物进一步包括适合于该组合物要采用的特定给药途径的一种或多种药学上可接受的载体、佐剂和/或溶媒。在一些实施方案中，载体、佐剂和/或溶媒适合于静脉内、肌内、口服、腹膜内、透皮、局部或皮下施用。在一些实施方案中，该药物组合物被配制用于静脉内或皮下施用。本领域还描述了配制用于注射或输注(例如皮下或肌内注射或通过静脉内输注)的抗体的方法。参见，例如，US 2013/0209465。
药学上可接受的载体是本领域中熟知的。参见，例如Handbook ofPharmaceutical Excipients(第5版,Ed.Rowe等人,Pharmaceutical Press,Washington,D.C.)。药学上可接受的载体的示例包含但不限于水溶液，例如水或生理相容的缓冲液，例如汉克斯氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液。
通常，用于体内施用的药物组合物是无菌的。灭菌可根据本领域已知的方法(例如加热灭菌、蒸汽灭菌、无菌过滤或辐照)完成。
本公开的药物组合物的剂量和期望的药物浓度可以根据设想的特定用途而变化。合适的剂量或给药途径的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。合适的剂量也在上文第V部分中描述。
在一些实施方案中，提供包括本文所公开的一种或多种过敏原特异性单克隆抗体或其抗原结合部分的抗体制剂。在一些实施方案中，该抗体制剂包括抗体或其抗原结合部分；以及缓冲液。
在一些实施方案中，该缓冲液是乙酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、琥珀酸盐、磷酸盐或羟甲基氨基甲烷缓冲液。在一些实施方案中，该抗体制剂进一步包括一种或多种额外的赋形剂，例如盐、表面活性剂、多元醇/二糖/多糖、氨基酸和/或抗氧化剂。在一些实施方案中，该抗体制剂包括表面活性剂，例如聚山梨酸酯80(吐温80)、聚山梨酸酯20(吐温20)或泊洛沙姆188。在一些实施方案中，该抗体制剂包括多元醇/二糖/多糖，例如甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖或右旋糖酐40。在一些实施方案中，该抗体制剂包括盐，例如氯化钠。在一些实施方案中，该抗体制剂包括氨基酸，例如甘氨酸或精氨酸。在一些实施方案中，该抗体制剂包括抗氧化剂，例如抗坏血酸、蛋氨酸或乙二胺四乙酸(EDTA)。在一些实施方案中，该抗体制剂是冻干制剂。在一些实施方案中，该抗体制剂是液体制剂。
试剂盒
在一些实施方案中，提供试剂盒，其包括如本文公开的一种或多种过敏原特异性单克隆抗体或其抗原结合部分；或药物组合物，其包括如本文公开的一种或多种过敏原特异性单克隆抗体或其抗原结合部分。在一些实施方案中，该试剂盒包括如本文所述(例如，如上文第IV部分中公开的)的单克隆抗体。在一些实施方案中，该试剂盒包括如本文所述的两种或更多种单克隆抗体或其抗原结合部分(例如、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种抗体或其抗原结合部分)。在一些实施方案中，该试剂盒用于一种减轻受试者的一种或多种过敏症状(例如，由于针对食物过敏原、植物过敏原、真菌过敏原、动物过敏原、尘螨过敏原、药物过敏原、化妆品过敏原或乳胶过敏原的过敏症引起的过敏症状)的方法。在一些实施方案中，该试剂盒用于一种减轻具有食物过敏症，例如，花生过敏症的受试者的一种或多种过敏症状的方法。在一些实施方案中，该试剂盒用于一种减轻具有真菌过敏症的受试者的一种或多种过敏症状的方法。在一些实施方案中，该试剂盒用于一种减轻具有针对两种或更多种过敏原(例如，两种或更多种食物过敏原，例如，花生过敏原和核果过敏原)的过敏症的受试者的一种或多种过敏症状的方法。
在一些实施方案中，该试剂盒可以进一步包括说明材料，该说明材料包含用于实施本发明的方法的指导(即，方案)(例如，用于使用该试剂盒来治疗过敏症的说明)。尽管说明材料通常包括书面或印刷材料，但它们不限于此。本发明考虑到了能够存储这样的说明并将其传达给最终用户的任何介质。此类介质包含但不限于电子存储介质(例如磁盘、磁带、盒带、芯片)，光学介质(例如CD ROM)等。此类介质可以包含提供此类说明材料的互联网站点的地址。
VII.实施例
提供以下实施例以说明但不限制所要求保护的发明。
实施例1—来自过敏个体的人IgE产生细胞及其抗体的单个细胞转录组学分析
概要
IgE抗体提供对寄生虫感染的免疫力，但是也可以引起威胁生命的过敏反应。尽管它们对人类健康很重要，但由于它们在人类中的稀缺性，这些抗体和产生它们的细胞仍然神秘；我们对它们的特性的很多了解都来自模型生物。本文描述了从患有食物过敏症的个体的血液中分离出产IgE的B细胞，然后通过单个细胞RNA测序(scRNAseq)对它们的特性进行了详细研究。已经发现IgE B细胞缺乏膜免疫球蛋白表达，并且IgE成浆细胞状态比其他产生抗体的细胞更不成熟。通过重组表达源自单个细胞的单克隆抗体，发现并表征了对主要花生过敏原Ara h 2和Ara h 3两者都具有特异性的交叉反应性IgE抗体；这些是迄今为止发现的最高亲和力的自然人类抗体。令人惊讶的是，发现了在无关个体中趋同进化的示例，该个体独立地进化出几乎相同的针对花生过敏原的抗体。最后，发现所有同种型的B细胞内的剪接均揭示了IgE而非IgG4同种型的极化种系转录，以及种系转录物的双等位基因表达的几个示例。这些结果提供了对IgE B细胞转录组学、克隆性和调控的深刻见解，提供了惊人的适应性免疫融合的示例，并提供了一种通过以单细胞分辨率表征使IgE介导的疾病发生的罕见B细胞群体来加速机制疾病理解的方法。
引言
IgE抗体类别在人类所有同种型方面含量最少，并且在针对寄生虫蠕虫感染的宿主防御中起着重要作用(1)，但是它也可能错误地针对其他无害的抗原。食物过敏症是这种错误针对的一个示例，其中范围从荨麻疹到潜在的致命过敏性反应的症状是由于表面结合的IgE抗体识别了过敏性食物蛋白而诱导的肥大细胞和嗜碱性粒细胞的脱粒所致的。尽管在免疫和过敏性疾病中起着中心作用，但由于其稀缺性，人IgE抗体的表征仍然很差(2)。批量抗原表位映射实验揭示，IgE抗体是多克隆的并且抗原表位是异质的(3)；然而，具有相同过敏症的个体倾向于识别一种或几种过敏原性蛋白质的核心集合(4)。最近的应用批量荧光激活细胞分选(FACS)免疫表型(5,6)和免疫库深度测序(7)的研究已经推断出IgE B细胞起源，而进行花生过敏原特异性单个细胞分选(8,9)的研究则描述了IgE抗体所属的克隆家族。然而，没有人成功分离出单个产IgE的细胞或包括单个IgE抗体的成对重链和轻链序列，有关此类抗体的功能特性、这些细胞的转录程序以及这些特征中任一项在个体之间共享的程度都未得到解答。同样，关于IgG4同种型缺乏了解，但兴趣渐长，这是因为IgG4同种型在介导减轻的临床过敏原反应性(其伴随免疫治疗和通过抗原封闭进行的早期过敏原暴露)方面有潜在作用(10)。在这里，我们报道了从人类首次成功分离并转录组学表征单个产IgE和IgG4的B细胞。我们将单个细胞RNA测序(scRNA-seq)与功能性抗体分析相结合，以阐明IgE调控的基础机制，并在无关的个体中发现了高亲和力、交叉反应性花生特异性抗体。
来自外周血的单个B细胞的表征
我们对从食物过敏个体的外周血中分离的B细胞进行了scRNA-seq测序，这使我们能够表征每个细胞的基因表达、剪接变体以及重链和轻链抗体序列(图6)。首先将六个花生过敏个体的新鲜外周血分为血浆和细胞成分；血浆被储存，随后用于过敏原特异性IgE浓度测量(图7A-7C)，而细胞成分在FACS之前富集B细胞(参见Materials and Methods)。排他性地根据免疫球蛋白表面表达对所有同种型的CD19+B细胞进行分选，但重点在于使IgE B细胞捕获最大化(图8A-8C)。因为细胞同一性是通过scRNA-seq而不是复杂的多色门控方案确定的，所以我们能够以高灵敏度分选和捕获细胞。这种方法使许多实验室都可获得IgE B细胞捕获的前景，而对FACS闸门纯度没有严格要求。
将单个细胞分类到96孔板中，使用SmartSeq2协议的改进版本(11)进行处理，并在Illumina NextSeq上测序，具有2x150 bp读段，平均深度为每个细胞1-2百万个读段(图9A-9G)。独立地对测序读段进行比对和组装以产生基因表达计数表，并分别重建抗体重链和轻链(图6，Materials and Methods)。使用STAR(12)进行比对还有助于评估单个细胞内的剪接。严格过滤细胞以去除低质量、假定的嗜碱性粒细胞和缺乏单个生产性重链和轻链的细胞，总共产生973个细胞以用于进一步分析(Materials and Methods)。每个细胞的同种型同一性由其生产性重链组装确定，这避免了基于FACS免疫球蛋白表面染色的同种型错误分类(图8B)，该问题尤其对于IgE B细胞来说比较普遍，这是由于CD23导致，该CD23是在非IgEB细胞表面上的捕获IgE的低-亲和力”IgE受体(6)。
在分批效应校正之后的归一化基因表达的主成分分析(图9A-9G以及Materialsand Methods)将细胞分成两个不同的簇(图2A)，其可鉴定为浆母细胞(PB)和原初/记忆B细胞。PB表达了驱动浆细胞分化(13)的转录因子BLIMP1(PRDM1)、XBP1和IRF4的三联体，以及与抗体分泌相关联的基因，例如J链；而原初和记忆细胞则表达了规范的成熟B细胞表面标记CD20(MS4A1)以及转录因子IRF8，其拮抗PB的命运(fate)并促进生发中心反应(14)。其他数据证实了该细胞亚型的分配；PB具有与其较大的尺寸和增加的粒度一致的较大的FACS前向和侧向散射，在预扩增后PB cDNA浓度较高，并且PB表达了更多的抗体重链和轻链转录物(图10A-10D)。
我们评估了每个B细胞亚型内的同种型分布，并且发现与其他同种型形成鲜明对比的是，IgE B细胞绝大多数都属于PB亚型(图2B-2C)。这一发现与小鼠中IgE B细胞优先分化为PB的观察一致(15)。其他同种型的亚型比例符合预期：主要是原初的IgM B细胞具有最低的PB百分比；而根据其在维持粘膜稳态中的分泌作用，IgA B细胞具有最高的百分比。有趣的是，我们发现每个个体的循环IgE B细胞数量与血浆总IgE水平相关联(图7C)；在高IgE综合征中也发现了类似的现象(16)。
通过将抗体聚类到克隆家族(CF)中，我们能够在我们的数据中观察到经典生发中心现象的元素，例如体细胞超突变、类别转换和命运确定。首先将抗体重链序列除以V和J基因，如果它们的氨基酸CDR3序列具有至少75％的相似性，则将它们聚类。仅49个重链形成具有多个成员的CF，尽管鉴于潜在的免疫球蛋白基因重排的多样性很大，这并不令人惊讶(图2D)。我们发现，与其他同种型相比，IgE和IgG4出人意料地是克隆的，因为超过20％的IgE和IgG4抗体属于此类多成员CF(图2E)。多成员CF多种多样；它们包含两个到六个序列，具有可变的同种型成员(节点模式)，并且具有突变频率的全面分布(节点大小)。CF特定于个体(节点形状)，但包含六个严重突变的IgE PB序列的一个CF(CF1)除外：来自个体PA12和PA13的每个具有三个，如稍后深度讨论的那样。四个CF阐明了生发中心的两种可能的末端分化途径，因为它们包含PB和记忆B细胞两者。其他CF包含属于多个同种型的细胞，其中一个特别感兴趣的(CF3)包含IgE PB和IgG4PB的细胞在稍后讨论。验证CF作为具有相似来源的细胞的集合的前提，我们发现轻链CDR3序列在家族中通常是可比的(图2G)。
IgE抗体在基因使用、CDR3长度和突变频率上广泛变化(图3A-3C)。单个细胞内重链和轻链的突变频率之间存在中等相关性(图3C)，其中具有通过富含相对于框架(FWR)区中不存在的重链CDR1和CDR2中的沉默突变的置换突变来进行选择的证据。轻链类似地富集了CDR1和较小程度的FWR1中的置换突变(图3D)。与其他同种型相比，IgE B细胞具有相似的重链突变频率分布，λ与κ轻链的相对利用率以及重链V和J基因的使用(图11A-11K)。
B细胞内在因子定义IgE细胞状态
为了阐明影响PB激活、存活和分化的B细胞内在因子，我们评估了IgE PB和其他同种型PB之间差异表达的基因(图3E)。在IgE PB中，大量MHC基因被强烈上调，这表明鉴于PB成熟到浆细胞过程中MHC-II的既成损失，这是一种较不成熟的转录程序(17)(18)(19)。FCER2(CD23)，“低亲和力”IgE受体也被上调，尽管尚不清楚其在IgE PB中的确切作用；膜CD23介导的膜IgE(mIgE)和CD21的共连接可导致IgE产生的自动抑制(20)。IgE产生还可以通过由可溶性CD23的拮抗作用而上调(21)，该可溶性CD23(21)被ADAM10切割后产生(22)，我们发现，该ADAM10是一种含有整合素和金属蛋白酶结构域的蛋白质，其在IgE PB的一个亚类中共表达。LAPTM5，作为B细胞活化、BCR表达和抗体产生的负调节剂(23)，被上调，这表明IgE PB的活化和增殖能力受到损害。下调的基因包含LILRB4(24)，支持浆细胞存活的半乳糖凝集素1(LGALS1)(25)，以及S100蛋白S100A4、S100A6和S100A10，这可表明增殖和存活信号传导降低(26,27)。IgE PB中最显著下调的基因之一是与脾相关联的酪氨酸激酶(SYK)，其在BCR信号转导中起着至关重要的作用(28)并且对于原初分化为浆细胞和记忆B细胞的存活是必需的(29)。总之，该基因表达程序显示，相对于其他PB，IgE PB细胞状态不成熟，其激活、增殖和存活能力减弱。它还为过敏症的小鼠模型中描述的假设的短期存活的IgE PB表型提供了潜在的转录组机制(15)。
B细胞内在因子还通过受损的记忆形成来调节鼠模型中的IgE产生(30,31)。确实，我们发现与其他常见同种型相比，属于原初/记忆子集的人IgE B细胞在重链膜免疫球蛋白外显子剪接方面存在缺陷。此外，在非IgE PB中以低水平检测到膜外显子剪接，但在IgE PB中未检测到(图3F和3G)。实际上，由于缺少mIgE剪接，我们无法评估已知具有独特信号传导特征的mIgE的两个剪接变体的相对利用率(32，33)。缺乏成熟的mIgE转录物可以用pre-mRNA的加工不良来解释(34)，这与我们通过FACS测量的低IgE表面蛋白是一致的；实际上，真正的IgE B细胞上的mIgE表面蛋白水平没有超过某些非IgE B细胞的水平，推测是由于CD23介导的捕获而显示出表面IgE(图8B)。总之，这些结果表明体内循环记忆IgE B细胞的稀缺性可能是由于受损的膜IgE表达而导致的，该受损的膜IgE表达损害了IgE B细胞进入记忆隔室和/或记忆B细胞的存活。鼠类研究支持这种假设，已显示通过去除或修饰mIgE结构域降低了IgE反应，但通过将这些结构域交换为IgG1的结构域增强了IgE反应(35)。
花生特异性IgE和IgG4抗体的表征
令人惊讶地，我们的克隆分析产生了属于多个个体的一个细胞CF(CF1，图2F和2G)，其包含来自个体PA12的三个IgE PB和来自个体PA13的三个IgE PB。这六个细胞产生的抗体高度相似，因为它们全部利用了IGHV3-30*18和IGHJ6*02重链基因以及IGKV3-20*01和IGKJ2*01轻链基因，其中成对的CDR3氨基酸序列同一性，对于重链，范围为65％至94％，对于轻链，为70％至100％。这些抗体也高度突变，并且在两条链的互补决定区中富含置换突变(图4A)。实际上，与所有其他类别转换抗体相比，这些是突变程度最高的抗体：重链的突变频率在第76个百分点或以上，而所有轻链在第96个百分点或以上(图4B)。
我们重组表达了属于该融合克隆家族的六个IgE抗体，以评估它们是否结合了主要过敏性花生(花生：Arachis hypogaea)蛋白的天然形式Ara h 1、Ara h 2或Ara h 3。在所有表征的花生过敏原中，Ara h 2是过敏个体最普遍认可的，并且在免疫应答(36)和区分过敏性状态(37,38)方面在临床上最相关。使用间接ELISA作为结合的半定量筛选，我们发现这六个抗体强烈结合Ara h 2，中等结合Ara h 3，而非常弱地结合Ara h 1(图12A-12H)。然后，我们使用生物层干涉术来确定每种抗体对Ara h 2和Ara h 3的解离常数，其中对Arah 2产生17皮摩尔(pM)到亚pM的亲和力，以及对于Ara h 3产生微摩尔到亚纳摩尔的亲和力(图4C和图12A-12G)。这些亲和力可与针对诸如HIV、流感和疟疾等病原体发现的一些最高亲和力的自然人类抗体相媲美(39-43)。此外，如果将此类抗体或其变体在治疗上作为封闭抗体使用，意图在与内源性IgE进行过敏原性蛋白质竞争中胜出(这种方法最近被证明对猫过敏症有效)，则对多种花生过敏原的高亲和力应该是有利的(44)。
为了研究每条链及其中的突变影响结合特性的程度，我们重组表达了抗体PA13P1H08的八个变体，每个变体的重链和/或轻链中的一个或多个区域返祖为推断的原初重排。基于上述重链V和J基因区段以及IGHD4-11*01D基因以及V和D基因之间的推断的非模板核苷酸TYCT，进行了重链CDR3的返祖。基于上述轻链V和J基因进行轻链CDR3的返祖。保留自然重链，同时将轻链与另一个κ轻链交换，消除了与两种过敏原性蛋白质的结合，同时返祖两条链消除了Ara h 3特异性并显著降低了Ara h 2亲和力(图4C)。仅返祖重链或轻链(但不成比例地)降低了对Ara h 2和Ara h 3的亲和力；与重链突变相比，轻链突变对Ara h3亲和力的贡献更大。我们还发现重链突变对亲和力的协同作用，因为CDR1、CDR2，CDR3或框架区的独立返祖各自导致亲和力的轻微降低。有趣的是，重链CDR2的返祖增加了Ara h 3亲和力，而仅略微降低了Ara h 2亲和力。这些结果表明，原初重组的抗体序列能够结合临床上最相关联的花生过敏原Ara h 2，但是突变(特别是在轻链中)对于生成与Ara h 3交叉反应的高亲和力抗体是必需的。更广义地讲，这表明两个不相关联的个体产生了一种相同的重排原初B细胞，该B细胞结合了Ara h 2并经历了类别转换、亲和力成熟、分化和克隆扩增，最终导致存在多个循环的IgE PB的存在，该IgE PB分泌对Ara h 3具有交叉反应性的高亲和力抗体。
我们还表达了来自另外两个CF的抗体。CF2包含来自个体PA16的三个IgE PB(其中两个是相同的)，但是它们的重组表达抗体不结合Ara h 1、2或3，这并不奇怪，因为该个体具有较低的血浆花生特异性IgE水平以及对其他过敏原的IgE特异性(图7A-7C)。另一方面，CF3包含IgE PB(PA15P1D05)和IgG4 PB(PA15P1D12)，即，不结合Ara h 1，但以纳摩尔亲和力结合Ara h 3，而以亚纳摩尔亲和力结合Ara h 2的重组表达的抗体(图12A-12H)。有趣的是，这两种抗体利用与CF1的六种融合抗体相同的轻链V基因和高度相似的重链V基因(IGHV3-30-3*01)，这为这些V基因在Ara h 2结合中的重要性提供了额外的支持。而且，由于IgE和IgG4分别在过敏反应性和可能降低的敏化中的作用，在过敏个体中同一CF中花生特异性IgE和IgG4的存在提供了拮抗细胞命运的独特示例。
极化种系转录和类别转换启动
适应性免疫系统的定制的应答是可能的，部分原因在于活化诱导的胞苷脱氨酶(AID)启动B细胞中的类别转换重组(CSR)的能力，从而导致产生具有特定效应子功能的抗体。CSR之前是细胞因子诱导的种系转录，其中包含I外显子、转换(S)区和重链恒定区外显子的非生产性种系转录物(GLT)将AID引导至S区(45)。重要的是，GLT处理对于CSR是必需的(46,47)，并规范地产生两种：内含子S区套索和由与恒定区外显子剪接的I外显子组成的成熟聚腺苷酸转录物(48)。在我们的scRNA-seq数据中，我们观察到后者的多个剪接同工型，其中近端恒定区外显子充当多个剪接供体的排他剪接受体。我们通过Sanger测序证实，IgE在五处具有最大数量的不同GLT(图5A和图14)；这些在不同同种型的许多细胞中并在所有个体中表达，但是频率不均匀(图5A)。I-外显子是最常见的剪接供体位点(图5A，GLT#1)，并且已知I-外显子可以提供多个剪接供体(49-51)，但在转换区域内也观察到了εGLT剪接供体。
我们在先前公开的scRNA-seq数据集中发现了多个IgE GLT剪接供体的独立证据，该数据集来自模拟类别切换后24小时收获的鼠B细胞(52)(图15)。我们还评估了表达εGLT的同种型的变异。IgG4同种型具有表达εGLT的最高比例的细胞(图5B)，而IgE B细胞本身也通常表达εGLT。其余同种型的εGLT的表达相当低。
GLT产生不限于IgE基因座；我们将我们的分析扩展到所有同种型，从而能够构建全局类别转换启动状态图(图5D)，该图说明了每种同种型的产生其自身(本身)或另一同种型的GLT的细胞所占的比例。我们观察到，与IgE相反，我们在这些过敏个体中几乎没有发现IgG4 GLT表达。我们还观察到升高的IgG2 GLT产量，这可以通过将CH1 IgG2外显子剪接至上游lincRNA来解释。有趣的是，我们观察到由替代等位基因引起的GLT表达是常见的，如IgM GLT以及类别转换同种型上游的其他同种型的GLT的共同表达所证实的(图5D中对角线以下的信号)。反映人类类别转换的情况(53)，我们观察到近端下游同种型而不是远距离下游同种型往往具有较高的GLT产量。与以前的报道不同(54)，我们发现具有GLT表达的细胞往往朝着单个GLT同种型的表达极化，尽管我们没有在大多数细胞中检测到任何非自身GLT产生(图5E)。
在单个细胞分辨率下对B淋巴细胞转录组的研究提供了其他优点；例如，我们发现了通过来自在这些基因座中具有杂合单核苷酸变异体的个体的单个B细胞中的重链恒定区单倍体定相的双等位基因GLT表达的多个实例。证明双等位基因εGLT表达的过程的一个示例在图5C中示出。
核果特异性IgE和IgG4抗体的表征
鉴于一些受试者具有除花生外还针对其他过敏原的血浆IgE(图7A)，我们评估了来自受试者PA11、PA12、PA13、PA14、PA15和PA16的重组单克隆抗体是否结合不仅衍生自花生，而且衍生自其他过敏性物质(包含腰果、开心果、乳胶、BSA、大豆、芝麻、奶、蛋、杏仁、松子、美洲山核桃、核桃、榛子和澳洲坚果)的过敏原提取物。间接ELISA的结果显示在图12H中。总共测试了89种抗体，尽管在图12H中仅显示了那些具有任何高于0.25的OD值的抗体。未描述的抗体包含：PA12P1D04,PA12P1G02,PA16P1B09,PA16P1E11,PA16P1E12,PA11P1C01,PA11P1C12,PA11P1C06,PA11P1C08,PA11P1D07,PA11P1E08,PA11P1F10,PA11P1F02,PA11P1G06,PA11P1G07,PA13P2H10,PA15P1C03,PA15P1E01,PA15P1E02,PA13P1C01,PA13P1C09,PA13P1D02,PA13P1E06,PA14P1C10,PA14P1C12,PA14P1C02,PA14P1C04,PA14P1C06,PA14P1C07,PA14P1C08,PA14P1D10,PA14P1D02,PA14P1D07,PA14P1D09,PA14P1E10,PA14P1E11,PA14P1E12,PA14P1E04,PA14P1E06,PA14P1E08,PA14P1E09,PA14P1F10,PA14P1F11,PA14P1F05,PA14P1F07,PA14P1G01,PA14P1G11,PA14P1G12,PA14P1G03,PA14P1H01,PA14P1H11,PA14P1H12,PA14P1H02,PA14P1H05,PA14P1H09,PA12P3C05,PA12P3C09,PA12P3D11,PA12P3D09,PA12P3E06,PA12P3E07,PA12P3F02,PA12P3F07,PA13P3G04,PA14P3F10,PA14P3F02,PA14P3H10,PA14P3H12,PA12P4G03和PA12P4G06。
如图12H所示，几种抗体表现出对多种核果过敏原的特异性。抗体PA14P3H08与美洲山核桃，核桃，榛子和澳洲坚果过敏原牢固地结合。抗体PA11P1D11与美洲山核桃、核桃和澳洲坚果过敏原结合；抗体PA11P1E01、PA11P1C11和PA11P1C03各自与腰果和开心果过敏原牢固地结合；以及抗体PA11P1C04与腰果和开心果过敏原较弱地结合。一些抗体对花生和核果过敏原两者均显示出特异性。例如，抗体PA11P1G10与美洲山核桃和核桃过敏原两者牢固地结合，并且也与花生过敏原结合(尽管较弱地结合)；而抗体PA12P4D02与花生过敏原牢固地结合，而与核桃过敏原较弱地结合，而不与天然花生过敏原Ara h 2结合。其他抗体对单种核果过敏原表现出特异性。例如，抗体PA11P1G04结合开心果过敏原，PA11P1F03结合美洲山核桃过敏原，以及PA11P1D12结合澳洲坚果过敏原。此外，在这些实验中发现了额外的花生特异性抗体。抗体PA12P3E09和PA12P3E11与花生提取物结合，几乎不与天然花生过敏原Ara h 2结合，而抗体PA12P1D02,PA12P1G11,PA13P1H03,PA12P3C01和PA12P3E04牢固地结合花生提取物和天然花生过敏原Ara h 2两者。
结论
使用scRNA-seq，我们提供了循环人IgE B细胞及它们产生的抗体的第一个转录组学表征。我们的数据表明了人类IgE调控的两种基础机制：膜免疫球蛋白表达不足和IgE PB基因表达程序，其提示激活、增殖和生存能力减弱。这些结果与在过敏症的鼠模型中对mIgE信号传导和IgE记忆的广泛研究在很大程度上相一致，并提供了支持将动物模型用于该疾病的证据.(55-59)。此外，在单个B细胞内捕获GLT剪接变体、极化和双等位基因表达信息的能力为将来的GLT和CSR机理研究提供了令人激动的scRNA-seq应用。
洞察无关个体中高亲和力抗体的趋同进化可以指导疫苗设计并导致群体水平被动免疫的策略；有人认为这也是对诸如流感(60)、HIV(43)和肺炎链球菌(61)之类的许多病原体做出应答的过程。在这里，我们发现了一个惊人的趋同案例，其中两个无关的个体产生了高亲和力、交叉反应性、花生特异性抗体，这些抗体在各自的重链和轻链中由相同的基因重排组成。第三个体具有利用相似的重链V基因和相同的轻链V基因的Arah 2特异性抗体。尽管这是一个很小的样本规模，但是有证据支持这些基因在花生过敏人群中的重要性更为广泛：来自花生过敏个体的一个独立的IgE重链序列数据集(62)包含利用相同V和J基因的IgE重链，并且与我们数据集中的六个融合抗体中的一个或多个共享至少70％的CDR3同一性(图16)；另一个数据集(9)包含Ara h 2特异性抗体，该抗体属于利用相似的IGHV3-30基因的IgG和IgM B细胞。
用纯化的过敏原和血浆IgE的交叉抑制实验表明，IgE抗体的交叉反应性在花生过敏个体中也很常见(63)，而且我们在这里分离出的抗体为这些发现提供了一个清晰的示例。此外，这些高亲和力抗体是由循环中发现的分泌性IgE PB产生的，这一事实有助于了解微量的过敏原如何能够引发严重的过敏反应。我们还期望这些抗体本身或它们的工程化变体可以找到作为治疗法的应用；最近的临床结果已经表明，工程化的过敏原特异性IgG抗体可以施用于人类，并可能通过与自然IgE进行的抗原竞争中胜出，提供对猫须过敏的有效治疗(44)。
方法
研究受试者
所有研究受试者均被同意并通过斯坦福IRB批准的协议进行筛选。如果参与者经口服食品挑战和董事会认证的过敏症专家确认具有花生过敏症，他们就符合参加资格。据报道对花生有反应性的花生过敏个体的年龄范围在8至17岁之间，并且在一些情况下表现出对其他食物过敏原的敏感性(图7A-7C)。
血浆IgE测量和B细胞分离
从收集在K2 EDTA管中的多达45mL的新鲜外周血中提取血浆和细胞成分。对于血浆提取，将血液转移到15mL falcon管中，并以1600g旋转10分钟。提取上层血浆，转移至2mLEppendorf蛋白质LoBind管中，并再次以16000g旋转，以进一步纯化血浆成分。将所得上清液移至新管中，然后置于干冰上，稍后转移至-80℃。过敏原特异性血浆IgE的测量是由CLIA许可的约翰霍普金斯大学皮肤病学、过敏症和临床免疫学(DACI)参考实验室使用ImmunoCAP系统进行的。为了纯化血浆提取后残留的B细胞，在血浆部分用PBS+2％胎牛血清(FBS)代替后，添加了一种阴性选择抗体混合物，即RosetteSep人B细胞富集混合物(Stemcell Technologies)。孵育20分钟后，则将血液用PBS+2％FBS稀释两倍，然后转移至含有15mL Ficoll-Plaque PLUS(GE Healthcare Life Sciences)的Sepmate 50mL管(Stemcell Technologies)中。富集的B细胞在10分钟、1200g旋转并刹车(brake on)后被获得并被转移至新管。然后使用ACK裂解缓冲液(ThermoFisher)去除残留的红细胞，并用染色缓冲液(BD Biosciences)洗涤细胞。根据制造商的说明，使用以下BioLegend抗体在冰上对细胞进行染色：PE抗人IgE克隆MHE-18，Brilliant Violent 421抗人CD19克隆HIB19，APC抗人IgM克隆MHM-88和Alexa Fluor 488抗人IgG克隆M1310G05。在分选之前，将细胞再洗涤两次。
流式细胞术和单个细胞分选
在具有5激光配置(355、405、488、561和640nm激发)的FACSAria II SpecialOrder Research Product(BD Biosciences)上进行单个细胞分类。尽管由于荧光团面板和激光配置而需要的补偿很小，但是在每次分选之前都使用OneComp eBeads(ThermoFisher)进行了荧光团补偿。每种分选使用等效的激光功率设置。使用“单个细胞”纯度模式将细胞分选到含有裂解缓冲液(11)和ERCC合成RNA spike-in混合物(ThermoFisher)的冷却的96孔板(Biorad HSP9641)中。将板旋转并置于干冰上，然后立即将其保存于-80℃。
cDNA生成、文库制备和测序
如先前所述(11)，使用了SmartSeq2协议的修改版本(64)。在Illumina NextSeq上使用2x150 bp Illumina高输出试剂盒，进行了5次运行，总共对1165个细胞进行了测序。
测序读段比对、基因表达和剪接
测序读段与基因组比对，以便确定基因表达，鉴定剪接变体并评估读段覆盖率。为了产生基因表达计数表，首先使用以2-pass模式运行的STAR v2.5.3a(12)将读段与GRCh38人类基因组进行比对。然后使用在交叉非空模式下运行的htseq-count(65)确定基因计数。提供给STAR和htseq-count两者的GTF注释文件是Ensembl 90版本，该版本手动清除了错误的Ig转录物，例如标注为V基因或恒定区，但包含V基因和恒定区外显子两者的那些转录物。在STAR基因组生成过程中，提供了一个额外的剪接连接点文件，其中包含在重链CH1外显子和IGHJ基因的所有组合之间的剪接，以改进这些连接点范围的读段映射。在去除属于ERCC的计数后，使用每百万log2计数对基因表达进行归一化。分析前排除少于950个表达基因的细胞，对通过高FACS IgE鉴定的假定的嗜碱性粒细胞、不存在或质量较差的抗体组装，以及组氨酸脱羧酶(HDC)和Charcot-Leyden晶体蛋白/Galectin-10(CLC)也如此。通过使用PCA在500个最易变基因上进行聚类，在分选之间记录了主要影响原初/记忆B细胞亚群的批次效应；该基因集富含已知受样本处理影响的基因，例如FOS、FOSB、JUN、JUNB、JUND、HSPA8(66)。在排除分选批次之间差异表达的基因(Mann-Whitney检验，Bonferroni校正后p值<0.01)后，PCA获得了原初/记忆和PB细胞簇两者内混合良好的种群，不因分选批次、个体或测序文库而偏倚(图9G)。为了在IgE和非IgE PB之间进行差异表达分析，通过voom-limma(67)结合分选批次对至少10个PB中表达的基因进行了分析，并且测序文库作为技术协变量提供。鉴于恒定区基因，例如IGHE和IGHA1，通过正进行的比较设计进行差异表达，将这些基因排除在外。
包括GLT表达在内的剪接分析依赖于STAR调用的剪接点。如果剪接点包括少于三个唯一的读数，则将其丢弃，仅在至少三个细胞中观察到GLT剪接供体时，才考虑它们。GLTs的双等位基因表达是根据使用bcftools在重链恒定区内发现的变体的杂合表达确定的(68)。
抗体重链和轻链组装
除了比对，测序读段也被独立地组装以便重建全长的重链和轻链转录物。鉴于BASIC(69)打算用于抗体重建，则将其用作主要组装体，而当BASIC没有组装功能性重链和/或轻链时，将整个转录组组装体Bridger(70)用作替代方案。使用由IMGT序列(72)构建的重链和轻链恒定区的BLAST(71)数据库确定重链同种型或轻链类型(λ或κ)。在此重要的是要注意利用重链转录物存在而不是FACS免疫球蛋白表面染色来确定同种型的必要性：实际上，IgE B细胞分选门中仅30％的B细胞产生IgE转录物(图8B)。这可能是由于CD23在非IgEB细胞上捕获的表面结合的IgE的存在所致，虽然酸洗可以去除CD23所结合的IgE(73)，但为了使转录组对细胞的干扰最小化，我们避免了这种苛刻的处理。免疫球蛋白可变结构域基因片段分配是使用IgBLAST(74)v1.8.0，使用来自IMGT的人种系基因片段的数据库进行的。IgBLAST输出用Change-O解析，以及突变频率用SHazaM调用(75)。不具有单个生产性重链和单个生产性轻链的细胞(其均为原初/记忆细胞簇的成员)被排除在外，最终共有973个细胞。工作流引擎Snakemake(76)用于执行这些分析管线。
重组抗体表达
重组表达所选择的抗体以进行特异性和亲和力测定。所有重链均表示为人IgG1，而轻链视情况表示为λ或κ。重链和轻链序列在密码子优化后通过Genscript合成，并在HEK293-6E细胞中瞬时转染。用RoboColumn
Figure BDA0002783880990001451
A柱(EMD Millipore)纯化抗体，并在还原和非还原条件下通过SDS-PAGE以及视情况通过利用山羊抗人IgG-HRP和山羊抗人κ-HRP或山羊抗人λ-HRP的蛋白质印迹法进行确认。
功能抗体表征
ELISA以两种方式之一进行。对于衍生自CF1、CF2或CF3的抗体，纯化的花生过敏原用于半定量评估花生过敏原结合。使用浓度为2ng/μL的50μL将购自IndoorBiotechnologies的纯天然Ara h 1(NA-AH1-1)、Ara h 2(NA-AH2-1)和Ara h 3(NA-AH3-1)于4℃固定过夜。洗涤3次后，将孔用100μL PBST(ThermoFisher)+2％BSA封闭2小时。两次洗涤后，将100μL一抗在封闭缓冲液中以2ng/μL的浓度孵育2小时。洗涤4次后，将100μL兔抗人HRP(abcam#ab6759)或兔抗小鼠HRP(abcam#ab6728)二抗在封闭液中以1/1000的稀释度孵育2小时。洗涤5次后，将150μL的1-Step ABTS底物溶液(ThermoFisher)添加到孔中。8-20分钟后，在酶标仪(plate reader)上于405nm处测量了显色性，报告的OD值是减去无抗体孔的信号后得到的。阴性对照包含固定化的BSA作为抗原，以及人同种型对照一抗(abcam#ab206195)。我们重组表达的一种随机IgM/IgK抗体(PA12P4H3)也没有表现出任何结合。阳性对照由分别对Ara h 1、Ara h 2和Ara h 3具特异性的单克隆小鼠抗体2C12、1C4和1E8(Indoor Biotechnologies)组成。
对于用于测试针对广泛的一组过敏原提取物的重组抗体的ELISA，进行以下操作。首先，获得了过敏原。未加工的坚果过敏原、芝麻、花生、脱脂奶粉和大豆粉是在当地杂货店购买的，而喷雾干燥的全蛋则是从National Institute of Standards and Technology(RM 8445)购买的，以及含有天然橡胶的离心乳胶和水的液态乳胶是从亚马逊获得的。如有必要，可使用研钵和研杵研磨固体过敏原，然后将100mg以及5mm不锈钢珠和1.7mL PBS加入到2mL Eppendorf蛋白质LoBind管中。使用TissueLyser系统(Qiagen)将样本在30Hz匀浆10分钟。随后，将样本在20000g和4℃下旋转20分钟。然后将水层转移至新管中。然后，按照制造商的说明，使用Pierce 660nm蛋白质测定试剂盒(ThermoFisher)以微孔板形式测定这些过敏原提取物的蛋白质浓度。ELISA按照以下步骤以384孔形式进行。首先，将20μL的15种过敏原和BSA在4℃分别以2ng/μL的浓度孵育过夜。然后使用Integra VIAFLO以每次洗涤每孔62.5μL的1X PBST将板洗涤3次。然后使用由1X PBST和2％BSA组成的50μL封闭缓冲液封闭孔2小时。接下来，将20μL重组抗体以2ng/μL的浓度在封闭缓冲液中进行孵育。洗涤4次后，将在封闭缓冲液中以1/1000稀释的20μL兔抗人HRP(abcam#ab6759)孵育2小时。洗涤5次后，加入40μL ABTS，并使用BioTek Neo2测量405nm平板吸光度。
抗体与天然纯化的过敏原花生蛋白相互作用的动力学表征是通过在ForteBioOctet 96上使用抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器，以1X PBST作为测定缓冲液，通过生物层干涉术实现的。该测定使用以下方案进行：长达600s的基线，120-150s的抗体负载，120-300s的基线，长达300s的关联以及对于高亲和力抗体-抗原相互作用持续长达30分钟的可变长度解离。每次实验后，通过在缓冲液和pH 1.5甘氨酸之间循环来再生成生物传感器。抗体以10-25nM的浓度加载，而最佳花生蛋白浓度通过实验确定(图12A-12H)。使用ForteBio软件使用1：1结合模型处理数据，在减去参考传感器(配体，但没有分析物)之后进行全局拟合。
实施例2-单克隆抗体PA13P1H08的共有Ara h 2结合基序
方法
重组IgG1 PA13P1H08抗体的线性表位映射针对Ara h 2和Ara h 3序列进行，该Ara h 2和Ara h 3序列在N-和C-末端用中性GSGSGSG接头连接和延长，以避免截断的肽。连接的抗原序列被翻译成线性的15个氨基酸的肽，其中肽-肽重叠有14个氨基酸。所得的Arah 2和Ara h 3肽微阵列包含668个以一式两份打印的不同肽(1,336个肽斑点)以及构建该微阵列的流感病毒血凝素(HA)肽YPYDVPDYAG的90个斑点，将其作为内部质量对照。
首先使微阵列在洗涤缓冲液(PBS，pH 7.4，0.05％吐温20)中进行15分钟预溶胀，然后在封闭缓冲液(Rockland封闭缓冲液MB-070)中进行30分钟预溶胀。将微阵列与浓度为1μg/ml的PA13P1H08 IgG1抗体在孵育缓冲液(含10％封闭缓冲液的洗涤缓冲液)中于4℃以140rpm振荡孵育16h。然后将微阵列在室温下的孵育缓冲液中用二抗山羊抗人IgG(H+L)DyLight680抗体(1：5000)和对照小鼠单克隆抗HA(12CA5)DyLight800抗体(1：2000)染色45分钟。使用LI-COR Odyssey成像系统使用以下参数进行读取：扫描偏移量为0.65mm，分辨率为21μm，扫描强度为7/7(红＝700nm/绿＝800nm)。使用
Figure BDA0002783880990001481
Analyzer进行斑点强度定量和肽注释。
将相同拷贝的肽微阵列进行上述程序，而不孵育PA13P1H08抗体。这用作分析二抗和对照抗体与两种抗原的668种不同肽的背景相互作用的对照。
结果
为了评估PA13P1H08抗体以及与PA13P1H08类似的延伸抗体是否可以结合线性花生过敏原表位，我们从花生过敏原Ara h 2和Ara h 3合成了包含15个氨基酸肽的微阵列。我们发现，Ara h 2和Ara h 3肽微阵列的二抗和对照抗体染色未突出显示任何可能干扰主要测定的背景相互作用(图17A)。相反，我们观察到以高信噪比对Ara h 2的非常相似的共有基序DSYGRDPYSPS、YSPSQDPYSPS和PDRRDPYSPS的强PA13P1H08抗体响应。在具有含共有DPYSPS基序的多个重复单元的区域中发现了相似的响应(图17B和17C)。该基序在Ara h 2同工型Ara h 2.0201(SEQ ID NO:708；WHO/IUIS过敏原命名法；Uniprot ID:Q6PSU2-1)中出现3次。
实施例3-从人IgE B细胞衍生的曲霉特异性抗体
该实施例描述了衍生自人IgE B细胞的曲霉菌特异性抗体的生成和表征。实施例1的方法用于获得曲霉菌特异性抗体，其具有以下不同：从中分离出B细胞的血液源自对曲霉菌具有过敏反应性而不是具有食物过敏症的受试者(受试者编号10033201)。因此，测试受试者的血浆中曲霉菌特异性IgE以及常见的食物过敏原，以及如图18所示，血浆IgE水平表明曲霉菌致敏，但没有混淆的食物致敏。
如实施例1中所述进行功能测定(ELISA)以半定量评估获得的抗体对购自Stallergenes Greer的静态培育、脱脂、粉状和干燥的曲霉菌物种以及购自IndoorBiotechnologies的重组烟曲霉抗原Asp f 1的特异性。如图19所示，单克隆抗体克隆1003320101_D6、1003320105_D6和1003320107_F8各自表现出与烟曲霉的特异性结合。克隆1003320107_F3表现出与纯化的重组过敏原烟曲霉1(rAsp f 1)的特异性结合。此外，克隆1003320107_C5特异性结合烟曲霉、黑曲霉和构巢曲霉的每种过敏原和rAsp F1。这些结果证明本文公开的用于从表达单个IgE或IgG4的人B细胞产生抗体的方法能够可靠地分离与过敏反应疾病类型无关的过敏原特异性抗体。
实施例4–源自人IgE B细胞的牛奶过敏原特异性抗体
该实施例描述了源自人IgE B细胞的乳特异性抗体的产生和表征。实施例1的方法用于获得乳特异性抗体，其具有以下差异：分离出B细胞的血液来源于对牛奶具有过敏反应性但对其他食物过敏原无反应性的受试者(PA01)。测试对象的血浆中常见的食物过敏原，包括牛奶。如图1所示。参照图18，来自受试者的血浆IgE水平表明牛奶过敏，但没有其他混淆的食物过敏。
如实施例1中所述进行功能测定(ELISA)以半定量评估获得的IgE和IgG4抗体的特异性。如图20所示，单克隆抗体克隆PA01P2D09，PA01P2D04，PA01P2B12，PA01P2B05和PA01P2D10均与牛奶提取物牢固结合，而抗体PA01P2E08则适度结合。这些结果证明本文公开的用于从表达单个IgE或IgG4的人B细胞产生抗体的方法能够牢固地分离与过敏反应疾病的类型无关的过敏原特异性抗体。
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Figure BDA0002783880990002141
尽管为了清楚理解的目的，已经通过图示和示例的方式详细地描述了前述发明，但是本领域的技术人员将理解，可以在所附权利要求的范围内进行某些改变和修改。另外，本文提供的每个参考文献通过引用整体并入本文，其程度与每个参考文献通过引用单独并入的程度相同。

Claims (83)

1.一种生成特异性结合过敏原的人单克隆抗体的方法，该方法包括：
(a)从人类受试者的样本中分离单个B细胞，其中该受试者对该过敏原过敏；
(b)从步骤(a)的该单个B细胞生成cDNA，其中cDNA序列包括编码全部或部分免疫球蛋白重链的第一序列和编码全部或部分免疫球蛋白轻链的第二序列；
(c)确定来自步骤(b)中该cDNA的序列；
(d)分析步骤(c)中确定的该序列以鉴定包括第一序列的单个B细胞，该第一序列包括IgE恒定区或IgG4恒定区；
(e)从步骤(d)的该单个B细胞中鉴定(i)包括IgE恒定区或IgG4恒定区的该免疫球蛋白重链中的重链可变区序列，和(ii)在同一单个B细胞中与该免疫球蛋白重链共表达的免疫球蛋白轻链中的轻链可变区序列；
(f)表达包括来自步骤(e)的该重链可变区序列和该轻链可变区序列的抗体；以及
(g)鉴定来自步骤(f)的与该过敏原特异性结合的一种或多种抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括通过荧光激活细胞分选(FACS)分选该样本中的细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括选择用于表达细胞表面IgE和/或细胞表面IgG4的单个B细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中该方法包括分离所选择的用于表达细胞表面IgE的单个B细胞以及鉴定编码包括IgE恒定区的免疫球蛋白重链的序列。
5.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(a)包括使来自该样本的细胞接触抗人CD19抗体和抗人IgE抗体并选择表达CD19+IgE的B细胞。
6.根据权利要求4所述的方法，其中步骤(a)包括使来自该样本的细胞接触抗人CD19抗体、抗人IgE抗体、抗人IgM抗体和抗人IgG抗体并选择CD19+IgM-IgG-IgE表达B细胞。
7.根据权利要求1所述的方法，其中该方法包括分离表达B细胞标记且对非IgE同种型呈阴性的单个B细胞。
8.根据权利要求7所述的方法，其中步骤(a)包括使来自该样本的细胞接触抗人CD19抗体、抗人IgM抗体、抗人IgG抗体、抗人IgA抗体和抗人IgD抗体并选择CD19+IgM-IgG-IgA-IgD-B细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中该方法包括分离所选择的用于表达细胞表面IgG4的单个B细胞以及鉴定编码包括IgG4恒定区的免疫球蛋白重链的序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(a)包括使来自该样本的细胞接触抗人CD19抗体和抗人IgG4抗体并选择表达CD19+IgG4的B细胞。
11.根据权利要求1所述的方法，其中该方法包括分离表达B细胞标记且对非IgG4同种型呈阴性的单个B细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤(a)包括使来自该样本的细胞接触抗人CD19抗体、抗人IgM抗体、抗人IgE抗体、抗人IgA抗体、抗人IgD抗体、抗人IgG1抗体、抗人IgG2抗体和抗人IgG3抗体并选择CD19+IgM-IgE-IgA-IgD-IgG1-IgG2-IgG3-B细胞。
13.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(a)包括分离分泌抗体的B细胞和/或记忆B细胞。
14.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(b)包括从来自该单个B细胞的RNA中逆转录cDNA以及扩增该cDNA。
15.根据权利要求14所述的方法，其中该RNA是mRNA。
16.根据权利要求14所述的方法，其包括扩增来自该单个B细胞的免疫球蛋白重链和轻链序列。
17.根据权利要求14所述的方法，其包括扩增该单个B细胞的转录组。
18.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(f)包括将来自步骤(e)的该重链可变区序列和该轻链可变区序列在宿主细胞中表达以及纯化该抗体。
19.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(f)包括表达包括来自步骤(e)的该重链可变区序列和该轻链可变区序列以及IgG1恒定区的抗体。
20.根据权利要求1所述的方法，其中该方法进一步包括用野生型IgG4恒定区或修饰的IgG4恒定区取代在步骤(g)中所鉴定的抗体的恒定区。
21.根据权利要求1所述的方法，其中该样本包括外周血。
22.根据权利要求1所述的方法，其中该过敏原是食物过敏原、植物过敏原、真菌过敏原、动物过敏原、药物过敏原、化妆品过敏原或乳胶过敏原。
23.根据权利要求22所述的方法，其中该过敏原是选自以下的食物过敏原：奶过敏原、蛋过敏原、坚果过敏原、鱼过敏原、贝类过敏原、豆类过敏原、豆科过敏原、种子过敏原和小麦过敏原。
24.根据权利要求23所述的方法，其中该食物过敏原是花生过敏原。
25.根据权利要求23所述的方法，其中该食物过敏原是核果过敏原。
26.根据权利要求23所述的方法，其中该食物过敏原是奶过敏原。
27.根据权利要求22所述的方法，其中该过敏原是真菌过敏原。
28.根据权利要求27所述的方法，其中该真菌过敏原是曲霉菌过敏原。
29.一种单克隆抗体或其抗原结合部分，其以小于100nM的结合亲和力(KD)特异性结合花生过敏原和/或核果过敏原，其中该抗体包括：
重链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:2,10,17,25,33,41,47,58,113,129,199,341,348,409,459或593；
重链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:3,11,18,26,34,48,59,130,200,342,349,410,460,539或594；
重链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:4,12,19,27,35,42,49,55,60,131,201,350,411,461,540或595；
轻链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:6,14,21,29,37,44,51,62,133,203,343,352,413,463,542或597；
轻链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:7,15,22,30,38,52,78,86,126,149,196,345,353或598；以及
轻链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:8,23,31,39, 45,53,63,134,204,346,354,414,464,543或599。
30.根据权利要求29所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括包含在选自以下的重链可变区和轻链可变区序列对中的重链和轻链CDR序列：SEQ ID NOs:1和5；9和13；16和20；24和28；32和36；40和43；46和50；54和56；57和61；57和5；1和61；64和5；65和5；66和5；67和5；128和132；340和344；347和351；406和407；408和412；458和462；538和541；以及592和596。
31.根据权利要求29所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，该重链CDR1-3和轻链CDR1-3包括以下氨基酸序列：
(a)分别是SEQ ID NOs:2,3,4,6,7和8；或
(b)分别是SEQ ID NOs:10,11,12,14,15和8；或
(c)分别是SEQ ID NOs:17,18,19,21,22和23；或
(d)分别是SEQ ID NOs:25,26,27,29,30和31；或
(e)分别是SEQ ID NOs:33,34,35,37,38和39；或
(f)分别是SEQ ID NOs:41,34,35,37,38和39；或
(g)分别是SEQ ID NOs:47,48,49,51,52和53；或
(h)分别是SEQ ID NOs:47,48,55,51,52和53；或
(i)分别是SEQ ID NOs:58,59,60,62,30和63；或
(j)分别是SEQ ID NOs:58,59,60,6,7和8；或
(k)分别是SEQ ID NOs:2,3,4,62,30和63；或
(l)分别是SEQ ID NOs:58,3,4,6,7和8；或
(m)分别是SEQ ID NOs:2,59,4,6,7和8；或
(n)分别是SEQ ID NOs:2,3,60,6,7和8；或
(o)分别是SEQ ID NOs:129,130,131,133,126和134；或
(p)分别是SEQ ID NOs:341,342,343,345,78和346；或
(q)分别是SEQ ID NOs:348,349,350,352,353和354；或
(r)分别是SEQ ID NOs:199,200,201,203,149和204；或
(s)分别是SEQ ID NOs:409,410,411,413,86和414；或
(t)分别是SEQ ID NOs:459,460,461,463,196和464；或
(u)分别是SEQ ID NOs:113,539,540,542,196和543；或
(v)分别是SEQ ID NOs:593,594,595,597,598和599。
32.根据权利要求29所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，该重链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:1,9,16,24,32,40,46,54,57,64,65,66,67,128,340,347,406,408,458,538或592。
33.根据权利要求29所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括轻链可变区，该轻链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:5,13,20,28,36,43,50,56,61,132,344,351,407,412,462,541或596。
34.根据权利要求29所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(b)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:9具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:13具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:16具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:20具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(d)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:24具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:28具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(e)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:32具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:36具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(f)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:40具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:43具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(g)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:46具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:50具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(h)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:54具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:56具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(i)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:57具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:61具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(j)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:57具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(k)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:61具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(l)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:64具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(m)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:65具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(n)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:66具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(o)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:67具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:5具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(p)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:128具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:132具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(q)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:340具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:344具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(r)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:347具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:351具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(s)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:406具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:407具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(t)重链可变区，其包括SEQ ID NO:408与具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括SEQ ID NO:412与具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(u)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:458具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:462具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(v)重链可变区包括与SEQ ID NO:538具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:541具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(w)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:592具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:596具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
35.根据权利要求29至34中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗原结合部分是Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、二价scFv、单结构域抗体或双抗体。
36.一种药物组合物，其包括根据权利要求29至35中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
37.一种药物组合物，其包括多个根据权利要求29至35中任一项所述的单克隆抗体，其中该单克隆抗体识别不同的表位或特异性结合不同的过敏原。
38.一种单克隆抗体或其抗原结合部分，其以小于100nM的结合亲和力(KD)特异性结合核果过敏原，其中该抗体包括：
重链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:113,167,175,227,311,318,438,466,621,665或692；
重链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:168,176,200,312,319,439,539,666或693；
重链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:169,177,228,313,320,440,467,540,667或694；
轻链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:171,179,230,315,322,442,469,542,623,669或696；
轻链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:30,94,149,172,180,196,323或670；以及
轻链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:173,181,231,316,324,443,470,543,624,671或697。
39.根据权利要求38所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括包含在选自以下的重链可变区和轻链可变区序列对中的重链和轻链CDR序列：SEQ ID NOs:166和170；174和178；226和229；310和314；317和321；437和441；465和468；538和541；620和622；664和668；以及691和695。
40.根据权利要求38所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，该重链CDR1-3和轻链CDR1-3包括以下氨基酸序列：
(a)分别是SEQ ID NOs:692,693,694,696,94和697；或
(b)分别是SEQ ID NOs:318,319,320,322,323和324；或
(c)分别是SEQ ID NOs:227,200,228,230,149和231；或
(d)分别是SEQ ID NOs:113,539,540,542,196和543；或
(e)分别是SEQ ID NOs:311,312,313,315,94和316；或
(f)分别是SEQ ID NOs:665,666,667,669,670和671；或
(g)分别是SEQ ID NOs:466,200,467,469,149和470；或
(h)分别是SEQ ID NOs:167,168,169,171,172和173；或
(i)分别是SEQ ID NOs:621,176,177,623,180和624；或
(j)分别是SEQ ID NOs:175,176,177,179,180和181；或
(k)分别是SEQ ID NOs:438,439,440,442,30和443。
41.根据权利要求38所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，该重链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:166,174,226,310,317,437,465,538,620,664或691。
42.根据权利要求38所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括轻链可变区，该轻链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:170,178,229,314,321,441,468,541,622,668或695。
43.根据权利要求38所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:691具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:695具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(b)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:317具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:321具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:226具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:229具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(d)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:538具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:541具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(e)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:310具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:314具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(f)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:664具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:668具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(g)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:465具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:468具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(h)重链可变区，其包括与具有至少90％序列同一性的氨基酸序列SEQ ID NO:166；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:170具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(i)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:620具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:622具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(j)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:174具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:178具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(k)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:437具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:441具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
44.根据权利要求38至43中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗原结合部分是Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、二价scFv、单结构域抗体或双抗体。
45.一种药物组合物，其包括根据权利要求38至44中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
46.一种单克隆抗体或其抗原结合部分，其以小于100nM的结合亲和力(KD)特异性结合曲霉菌过敏原，其中该抗体包括：
重链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:710,718,726,734或742；
重链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:711,719,727,735或743；
重链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:712,720,728,736或744；
轻链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:714,722,730,738或746；
轻链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:715,723,731,739或747；以及
轻链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:716,724,732,740或748。
47.根据权利要求46所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括包含在选自以下的重链可变区和轻链可变区序列对中的重链和轻链CDR序列：SEQ ID NOs:709和713；717和721；725和729；733和737；以及741和745。
48.根据权利要求46所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，该重链CDR1-3和轻链CDR1-3包括以下氨基酸序列：
(a)分别是SEQ ID NOs:710,711,712,714,715和716；或
(b)分别是SEQ ID NOs:718,719,720,722,723和724；或
(c)分别是SEQ ID NOs:726,7272,728,730,731和732；或
(d)分别是SEQ ID NOs:734,735,736,738,739和740；或
(e)分别是SEQ ID NOs:742,743,744,746,747和748。
49.根据权利要求46所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，该重链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:709,717,725,733或741。
50.根据权利要求46所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，包括轻链可变区，该轻链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:713,721,729,737或745。
51.根据权利要求46所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:709具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:713具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(b)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:717具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:721具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:725具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:729具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(d)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:733具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:737具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(e)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:741具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:745具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
52.根据权利要求46至51中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗原结合部分是Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、二价scFv、单结构域抗体或双抗体。
53.一种药物组合物，其包括根据权利要求46至52中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
54.一种药物组合物，其包括多个根据权利要求46至52中任一项所述的单克隆抗体，其中该单克隆抗体识别不同的表位或特异性结合不同的过敏原。
55.一种单克隆抗体或其抗原结合部分，其以小于100nM的结合亲和力(KD)特异性结合奶过敏原，其中该抗体包括：
重链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:121,750,757,765,772,779,785,793,800,807,814,821,833,838,846,853,860,868,874,881,889,895,903,911,918或926；
重链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:378,532,751,758,766,773,786,794,801,808,815,822,826,839,847,854,861,875,882, 890,896,904,912,919或927；
重链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:752,759,767,774,780,787,795,802,809,816,827,840,848,855,862,869,876,883,891,897,905,913,920或928；
轻链CDR1，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:523,754,761,769,776,782,789,797,804,811,818,829,835,842,850,857,864,871,878,885,899,907,915,922或930；
轻链CDR2，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:22,30,94,110,149,186,196,389,404,509,662,682,762,790,830,843,865,886,900,908,923或931；以及
轻链CDR3，其包括以下任一项的氨基酸序列：SEQ ID NOs:755,763,770,777,783,791,798,805,812,819,824,831,836,844,851,858,866,872,879,887,893,901,909,916,924或932。
56.根据权利要求55所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链CDR1-3和轻链CDR1-3，该重链CDR1-3和轻链CDR1-3包括以下氨基酸序列：
(a)分别是SEQ ID NOs:800,801,802,804,110和805；或
(b)分别是SEQ ID NOs:121,826,827,829,830和831；或
(c)分别是SEQ ID NOs:833,826,827,835,149和836；或
(d)分别是SEQ ID NOs:853,854,855,857,662和858；或
(e)分别是SEQ ID NOs:860,861,862,864,865和866；或
(f)分别是SEQ ID NOs:868,378,869,871,682和782。
57.根据权利要求55所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括重链可变区，该重链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:749,756,764,771,778,784,792,799,806,813,820,825,832,837,845,852,859,867,873,880,888,894,902,910,917或925。
58.根据权利要求55所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包括轻链可变区，该轻链可变区包括与以下任一项具有至少90％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NOs:753,760,768,775,781,788,796,803,810,817,823,828, 834,841,849,856,863,870,877,884,892,898,906,914,921或929。
59.根据权利要求55所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体包括：
(a)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:799具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:803具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(b)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:825具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:828具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(c)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:832具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:834具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(d)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:852具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:856具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(e)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:859具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:863具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；或
(f)重链可变区，其包括与SEQ ID NO:867具有至少90％序列同一性的氨基酸序列；和轻链可变区，其包括与SEQ ID NO:870具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。
60.根据权利要求55至59中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗原结合部分是Fab,a F(ab’)2、Fv、scFv、二价scFv、单结构域抗体或双抗体。
61.一种药物组合物，其包括根据权利要求55至60中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分和药学上可接受的载体。
62.一种抗体-药物偶联物，其包括根据权利要求29至35、38至44、46至52或55至60中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。
63.根据权利要求62所述的抗体-药物偶联物，其包括根据权利要求46至52中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该药物是抗真菌剂。
64.根据权利要求63所述的抗体-药物偶联物，其中该抗真菌剂是两性霉素B。
65.一种分离的多核苷酸，其包括编码根据权利要求29至35、38至44、46至52或55至60中任一项所述的单克隆抗体的核苷酸序列。
66.一种载体，其包括根据权利要求65所述的多核苷酸。
67.一种宿主细胞，其包括根据权利要求65所述的多核苷酸或根据权利要求66所述的载体。
68.一种试剂盒，其包括根据权利要求29至35、38至44、46至52或55至60中任一项所述的单克隆抗体，根据权利要求36、37、45、53、54或61中任一项所述的药物组合物或根据权利要求62至64中任一项所述的抗体-药物偶联物。
69.一种减轻受试者的一个或多个过敏症状的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求29至35、38至44、46至52或55至60中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，根据权利要求36、37、45、53、54或61中任一项所述的药物组合物或根据权利要求62至64中任一项所述的抗体-药物偶联物。
70.一种减轻具有花生过敏症的受试者的一个或多个过敏症状的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求29至35中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分或根据权利要求36或37所述的药物组合物。
71.一种减轻具有核果过敏症的受试者的一个或多个过敏症状的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求38至44中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分或根据权利要求45所述的药物组合物。
72.一种减轻具有真菌过敏症的受试者的一个或多个过敏症状的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求46至52中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，根据权利要求53或54所述的药物组合物或根据权利要求62至64中任一项所述的抗体-药物偶联物。
73.一种减轻具有奶过敏症的受试者的一个或多个过敏症状的方法，该方法包括向该受试者施用治疗有效量的根据权利要求55至60中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，根据权利要求61所述的药物组合物或根据权利要求62至64中任一项所述的抗体-药物偶联物。
74.根据权利要求69至73中任一项所述的方法，其中该单克隆抗体或其抗原结合部分通过皮下、静脉或鼻内施用。
75.根据权利要求69至74中任一项所述的方法，其中该过敏症状包括以下一种或多种：流鼻涕、皮疹、皮肤发红、皮肤肿胀、口腔和/或喉咙内或周围发痒或刺痛、吞咽困难、流眼泪、腹泻、胃痉挛、恶心、呕吐、喉咙发紧、呼吸急促或喘鸣、呼吸急促和过敏性反应。
76.根据权利要求69至75中任一项所述的方法，其中进一步向该受试者施用额外的药剂。
77.根据权利要求76所述的方法，其中该额外的药剂是抗组胺药、肾上腺素、减充血剂、支气管扩张剂或皮质类固醇。
78.根据权利要求76或77所述的方法，其中该单克隆抗体或其抗原结合部分和该额外的药剂基本上同时或分开施用。
79.根据权利要求69至78中任一项所述的方法，其进一步包括评估该受试者中该过敏症状的减轻。
80.根据权利要求79所述的方法，其中该评估包括通过使用总鼻症状评分(TNSS)、视觉模拟量表(VAS)鼻症状评分、鼻吸气峰值流量(PNIF)的改善、过敏原皮肤测试、嗜碱性粒细胞激活测试或口服食物挑战来测量过敏症状的减轻。
81.根据权利要求29-35、38-44、46-52和55-60中任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，或根据权利要求36、37、45、54或61中任一项所述的药物组合物，或根据权利要求69-80中任一项所述的方法，其中该单克隆抗体是IgM、IgD、IgA或IgG同种型。
82.根据权利要求81所述的单克隆抗体、抗原结合部分、药物组合物或方法，其中该抗体是IgG4。
83.根据权利要求81所述的单克隆抗体、抗原结合部分、药物组合物或方法，其中该抗体包括修饰的IgM、IgD、IgG3、IgG1、IgA1、IgG2、IgG4或IgA2重链恒定区。
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