JP2022518519A - 新規二重特異性抗体分子及びｐｄ－ｌ１とｌａｇ－３と同時に結合する二重特異性抗体 - Google Patents

新規二重特異性抗体分子及びｐｄ－ｌ１とｌａｇ－３と同時に結合する二重特異性抗体 Download PDF

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Abstract

本発明は、人工的に設計された新規な抗体分子を提供する。当該抗体分子は、式（Ｉ）のポリペプチド鎖：ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－Ｘ－ＶＨＨ、及び式（ＩＩ）のポリペプチド鎖：ＶＬ－ＣＬ、を含み、ＶＨは重鎖可変領域を示し、ＣＨは重鎖定常領域を示し、ＦｃはＣＨ２、ＣＨ３及び任意のＣＨ４を含み、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４はそれぞれ重鎖定常領域のドメイン１、２、３及び４を示し、Ｘは存在しなくてもよく、又は存在する場合、リンカー、例えば、フレキシブルリンカーを示し、ＶＨＨは単一ドメイン抗原結合部位、例えば、単一ドメイン抗体を示し、ＶＬは軽鎖可変領域を示し、ＣＬは軽鎖定常領域を示し、任意に、ＣＨ１とＦｃとの間にヒンジ領域が存在する。

Description

本発明は、全体的には、免疫学及び抗体工学の分野に関する。具体的には、本発明は人工的に設計された新規な二重特異性抗体分子に関し、特にＰＤ－Ｌ１とＬＡＧ－３と同時に結合する二重特異性抗体、前記抗体分子又はその各鎖をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含むベクター、前記ポリヌクレオチド又はベクターを含む宿主細胞、前記抗体分子を含む免疫複合体及び医薬組成物、並びに疾患の免疫治療、予防及び／又は診断における前記抗体分子の使用に関する。
抗体分子は、対応する抗原と標的特異的に結合することができ、さまざまな疾患（例えば、がん、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患など）の重要な治療剤、予防剤及び／又は診断剤になってきている。しかしながら、臨床利用において、１つの標的だけに対する単一特異性抗体には限界がある。患者が単一特異性抗体による治療を受けた後、薬剤耐性が生じたり、非応答者になったりすることがある。がんや他のさまざまな疾患についての研究により、複数種のシグナル伝達経路が疾患の発生と発展に関与する場合が多く、単一の標的による免疫療法が多くの疾患に対しては一般に治療作用を果たすのに不十分であることが分かった。
多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は異なる抗原と特異的に結合することができるため、２種以上の異なる媒体に同時に作用するシグナル伝達経路として設計されることが可能である。これらの利点により、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）の幅広い応用に将来性が期待できる。
抗体工学により想像力に満ちた数多くの多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）の形態が開発されており、疾患への利用に関するそれらの適用性も研究されている（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ Ｕ．＆Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ Ｒ．Ｅ．，Ｔｈｅ ｍａｋｉｎｇ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｍａｂｓ，２０１７，９（２）：１８２－２１２）。
多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）は、その構成部分及び構築方式によって多くの種類に分けられる。例えば、多重特異性抗体構造の左右対称性によって、対称構造及び非対称構造に分けられ、多重特異性抗体におけるＩｇＧのＦｃ領域の有無によって、Ｆｃ領域を持つ抗体の形態及びＦｃ領域を持たない抗体の形態に分けられ、多重特異性抗体における抗原結合部位の数量によって、二価、三価、四価又はそれ以上の多価抗体などに分けられる。
従来技術による多重特異性抗体の形態はその調製においても利用においてもそれぞれ利点と欠点があり、例えば、Ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を組換えることによって大規模に培養して製造できるが、凝集物が形成されやすく、インビボ半減期が非常に短く、実際に使用する時は連続輸液装置を別途設ける必要があり、Ｃａｔｕｍａｘｏｍａｂは製造プロセスが複雑であり、しかもマウスヘテロ抗体が人体で免疫原性関連の問題を引き起こしやすい。
したがって、本分野では選択可能で特性的に改善されている多重特異性抗体、特に二重特異性抗体が求められる。本発明は、新しい多重特異性抗体の形態を提供し、前記抗体がインビトロの培養細胞で効果的に発現されやすく、複雑な製造プロセスが必要とされない。それと同時に、前記二重特異性抗体は異なる抗原と同時に結合して、各抗原結合部位の対応する異なるエピトープとの結合活性、及びその他の特性を保持できる。さらに、本発明の二重特異性抗体の形態は、物理的・生物学的に安定しており、このため該抗体にはより良好な生産性と将来性が期待できる。
本願は、抗体工学的方法によって構築された新規な二重特異性抗体分子を開示する。
このため、１つの様態において、本発明は、以下に示される１つ又は複数の特性を有する二重特異性抗体分子を提供する。
（ａ）高い親和力で１種又は２種の抗原と特異的に結合する。
（ｂ）インビトロの培養細胞で発現されやすく、かつ抗体分子の各鎖同士が正確にカップリング又はペアリングすることができる。
（ｃ）良好な物理的安定性を有し、特に、良好な長期的熱安定性を有し、かつ長期間にわたって生物学的活性を保持できる。http://en.wikipedia.org/wiki/CD80
（ｄ）１種又は２種の抗原と特異的に結合すると、各抗原が関与するシグナル伝達経路を調節（例えば、抑制又は活性化）することによって生物学的機能を発揮する。
（ｅ）エフェクター機能を発揮する。
（ｆ）より良好な抗腫瘍活性を有する。
１つの実施形態において、本発明の抗体分子は、全抗体部分と単一ドメイン抗体部分とを含み、単一ドメイン抗体部分がリンカーにより全抗体部分の重鎖定常領域のＣ末端に接続される。
１つの実施形態において、本発明の抗体分子は、下記部分を含み、又は下記部分からなる。
式（Ｉ）のポリペプチド鎖（ペプチド鎖＃１）：
ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－Ｘ－ＶＨＨ、及び
式（ＩＩ）のポリペプチド鎖（ペプチド鎖＃２）：
ＶＬ－ＣＬ、
ＶＨは重鎖可変領域を示し、
ＣＨは重鎖定常領域ドメインを示し、
ＦｃはＣＨ２、ＣＨ３及び任意のＣＨ４を含み、
ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４はそれぞれ重鎖定常領域のドメイン１、２、３及び４を示し、
Ｘは存在しなくてもよく、又は存在する場合、リンカー、例えば、フレキシブルリンカーを示し、
ＶＨＨは単一ドメイン抗原結合部位、例えば、単一ドメイン抗体を示し、
ＶＬは軽鎖可変領域を示し、
ＣＬは軽鎖定常領域を示し、
任意に、ＣＨ１とＦｃとの間にヒンジ領域がさらに存在する。
１つの実施形態において、本発明の抗体分子は、少なくとも１本の式（Ｉ）のポリペプチド鎖と、１本の式（ＩＩ）のポリペプチド鎖と、を含む。好ましくは、本発明の抗体分子は、２本の（例えば、同じ）式（Ｉ）のポリペプチド鎖と、２本の（例えば、同じ）式（ＩＩ）のポリペプチド鎖と、を含む。
１つの実施形態において、本発明の抗体分子の構造は、図１（Ａ）に示される。
１つの実施形態において、本発明の抗体分子又はその断片は、２つ又は４つの抗原結合部位を有し、これらの抗原結合部位が２つ、３つ又は４つの異なる抗原、又は同じ抗原と結合する。１つの実施形態において、式（Ｉ）におけるＶＨと式（ＩＩ）におけるＶＬにより１つの抗原結合部位が形成され、式（Ｉ）のＶＨＨにより１つの抗原結合部位（単一ドメイン抗原結合部位）が構成される。
１つの実施形態において、異なる抗原結合部位が同じ抗原における同じエピトープ、又は異なるエピトープと結合する。
１つの実施形態において、本発明の抗体分子における式（Ｉ）のリンカーＸは、フレキシブルリンカーであり、例えば、単独又は組合せのグリシン及び／又はセリン残基を有するリンカーである。１つの実施形態において、前記リンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎは１以上の正の整数であり、例えば、ｎは１～７の正の整数であり、例えば２、３、４、５、６である。１つの実施形態において、ｎは１、２、３又は４である。
１つの実施形態において、式（Ｉ）におけるＶＨと式（ＩＩ）におけるＶＬにより形成される抗原結合部位は、ヒト由来のもの、ヒト化されたもの、又はキメラのものである。
１つの実施形態において、本発明の抗体分子における単一ドメイン抗原結合部位（ＶＨＨ）は、天然の軽鎖欠如抗体の重鎖可変ドメイン（例えば、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）種に天然に存在する重鎖抗体の重鎖可変ドメイン）、新規抗原受容体（ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＮＡＲ）と呼ばれる魚類の免疫グロブリン（例えば、サメの血清に天然に存在するＩｇＮＡＲ）におけるＶＨ様単一ドメイン、又はそれらから誘導される組換え単一ドメイン抗原結合部位（例えば、ラクダ化ヒトＶＨドメイン又はヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメイン）である。１つの好ましい実施形態において、本発明の抗体分子における前記単一ドメイン抗原結合部位は、ラクダ科で天然に存在する重鎖抗体の重鎖可変ドメイン、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、及びヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメインから選択される。
１つの実施形態において、本発明の抗体分子における式（Ｉ）のペプチド鎖のＶＨＨ分子は、ラクダ科の種（例えば、ラクダ、アルパカ、ヒトコブラクダ、リャマ、グアナコ）で産生する抗体から誘導されてもよい。ラクダ科以外の種も天然の軽鎖欠如重鎖抗体を産生でき、このような重鎖抗体のＶＨＨも本発明の範囲内に含まれる。
１つの実施形態において、ＣＨ１とＦｃは、抗体の重鎖、又はその誘導体に由来する。
１つの実施形態において、式（Ｉ）の「ＣＨ１－Ｆｃ」は、ＩｇＧの形態であり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４の形態である。１つの実施形態において、ＩｇＧ１の形態である。抗体を安定させる作用、又はエフェクター機能を増強させる作用を実現するために、定常ドメインにおけるＦｃに対して変異を行ってもよいことが理解すべきである。例えば、１つの特定の実施形態において、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞が介在する細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。１つの実施形態において、前記アミノ酸変異は、ＣＨ２ドメインに存在し、例えば、前記抗体分子は、第２３４位及び第２３５位（ＥＵ番号、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＥＵインデックスに基づいて番号を付ける）のアミノ酸置換を含む。１つの特定の実施形態において、前記アミノ酸置換はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａである。
１つの実施形態において、ＣＨ１とＣＬとの間にジスルフィド結合が存在する。１つの実施形態において、２本の式（Ｉ）ポリペプチド鎖を含む場合、式（Ｉ）ポリペプチド鎖のＣＨ１とＣＨ２との間にある２つのヒンジ領域の間にジスルフィド結合が存在し、ジスルフィド結合の数が抗体定常ドメインの由来ＩｇＧ形態によって変わる。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域の間に２つ又は４つのジスルフィド結合が存在する。
１つの実施形態において、式（ＩＩ）の軽鎖定常ドメインＣＬはκ又はλに由来する。
１つの実施形態において、式（Ｉ）のＶＨと式（ＩＩ）のＶＬにより形成される結合部位は第１抗原に対して特異的である。１つの実施形態において、第１抗原はＬＡＧ－３である。
１つの実施形態において、式（Ｉ）のＶＨＨにより形成される結合部位は第２抗原に対して特異的である。１つの実施形態において、第２抗原はＰＤ－Ｌ１である。
本発明の抗体分子が特異的に結合する抗原のタイプについては特に制限がなく、抗原は、例えば、サイトカイン、成長因子、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、炎症性メディエーター、リガンド、細胞表面受容体又はその断片であってもよい。１つの実施形態において、本発明の抗体分子が特異的に結合する抗原は、腫瘍関連抗原、免疫チェックポイント分子、血管新生因子、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー及び免疫系における共刺激分子、並びにこれら分子のリガンド及び／又は受容体、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ４７、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＶＥＧＦ及びＧＩＴＲから選択される。
１つの実施形態において、式（Ｉ）のＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃにより全抗体部分の重鎖が構成され、式（ＩＩ）のＶＬ－ＣＬにより全抗体部分の軽鎖が構成される。
１つの実施形態において、式（ＩＩ）のＶＨＨにより単一ドメイン抗体が構成される。
１つの実施形態において、本発明の抗体は、その抗原結合断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、単鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）又は（Ｆａｂ’）２、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体（ｄＡｂ）又は線状抗体をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明の抗ＬＡＧ－３抗体又はその断片の重鎖及び／又は軽鎖は、シグナルペプチド配列、例えば、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号２０）をさらに含む。
１つの様態において、本発明は、本発明の抗体分子におけるいずれか１本又は複数本のポリペプチド鎖をコードする核酸、前記核酸を含むベクター、前記核酸又はベクターを含む宿主細胞を提供する。
１つの様態において、本発明は、本発明の抗体分子におけるいずれか１本又は複数本のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクター、例えばｐＴＴ５を提供する。
１つの様態において、本発明は、本発明の抗体分子又はその断片を産生するための方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体を含む免疫複合体、医薬組成物、試薬キット、組合せ製品又は製品を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体、医薬組成物、免疫複合体、組合せ製品、又は試薬キットは、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染、腫瘍などの疾患の予防又は治療に用いられる。例えば、前記疾患は腫瘍（例えばがん）又は感染である。いくつかの実施形態において、腫瘍は腫瘍の免疫回避である。好ましくは、腫瘍は、例えば、結腸がん、結腸直腸がん、又は直腸がんである。別の態様において、本発明は、対象又は個体における疾患の予防又は治療の方法に関する。前記方法は、有効量の本発明に係る任意の抗体又はその断片、医薬組成物、免疫複合体、組合せ製品、又は試薬キットを前記対象に投与することを含む。例えば、前記疾患は腫瘍（例えばがん）又は感染である。いくつかの実施形態において、腫瘍は腫瘍の免疫回避である。１つの実施形態において、腫瘍は、例えば、結腸がん、結腸直腸がん、又は直腸がんである。別の態様において、本発明は、対象における腫瘍（例えば、がん）又は感染の治療用薬物、医薬組成物、試薬キット、又は組合せ製品を製造するための、本発明に係る任意の抗体又はその断片、免疫複合体の用途に関する。いくつかの実施形態において、腫瘍は腫瘍の免疫回避である。１つの実施形態において、腫瘍は、例えば、結腸がん、結腸直腸がん、又は直腸がんである。
本発明はまた、試料中の抗原を検出する方法に関する。
本発明は、本明細書に記載の任意の実施形態の任意の組合せをさらに含む。本発明に係る任意の実施形態又はその任意の組合せは、本発明に係る任意及び全ての抗体又はその断片、免疫複合体、医薬組成物、組合せ製品、又は試薬キット、方法及び用途に適用される。
以下の図面を参照して閲覧すれば、次に詳細に説明される本発明の好ましい実施形態をよりよく理解できる。本発明を説明するために、図面に好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本発明は図面に示される実施形態の特定の配置又は手段に制限されていないことは理解できる。
図１Ａ－１Ｂは、本発明の二重特異性抗体の構造を例示する。 図２は、サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＳＥＣ）により検出された、本発明で調製される抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰの純度を示す。 図３は、ＦＡＣＳにより検出された抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰ、及び対照である抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体とＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞（ＣＨＯＳ－ＰＤ－Ｌ１）との結合を示す。図中、横軸は抗体濃度を示し、縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 図４は、ＦＡＣＳにより検出された抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰ、及び対照である抗ＬＡＧ－３抗体ＡＤＩ－３１８５３とＬＡＧ－３を過剰発現させた２９３細胞（２９３－ＬＡＧ－３）との結合を示す。図中、横軸は抗体濃度を示し、縦軸は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。 図５は、ＬＡＧ－３を過剰発現させた２９３細胞（２９３－ＬＡＧ－３）及びＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞（ＣＨＯＳ－ＰＤ－Ｌ１）に対する抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰの同時結合作用を示す。 図６は、本発明の二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰ、及び対照である抗ＬＡＧ－３抗体ＡＤＩ－３１８５３、抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体、と両者の組合せ、並びに、ＩＬ－２産生濃度（ｐｇ／ｍｌ）によって計量される、インビトロでＴ細胞に対するＩｇＧの活性化作用を示す。 図７は、本発明の二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰ、及び対照である抗ＬＡＧ－３抗体ＡＤＩ－３１８５３、抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体、と両者の組合せ、並びに、インビトロでＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯＫ１－ＰＤ－Ｌ１細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＣＳ１８７１０９）とＬＡＧ－３を過剰発現させたＪｕｒｋａｔＬＡＧ３（Ｐｒｏｍｅｇａ，（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＣＳ１８７１０９））細胞との混合物においてＴＣＲ：Ｐｍｈｃ結合物に対するＩｇＧの促進作用を示す。 図８－１０は、本発明の二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰ、及び対照である抗ＬＡＧ－３抗体ＡＤＩ－３１８５３、抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体、と両者の組合せ、並びに、腫瘍に対するヒトＩｇＧの抑制作用を示す。
特に断らない限り、本願で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明の当業者が理解している通常の意味を有する。本願に言及される全ての刊行物、特許出願、特許又は他の参照文献は引用によりその全体が組み込まれる。また、本願に記載の材料、方法及び例は、説明用のものであり、制限することが意図されない。本発明の他の特徴、目的及び利点は、本明細書と図面、添付された特許請求の範囲から明らかになる。
略号
特に断らない限り、本明細書に出ている略号は以下の意味を有する。
以下の略号を使用する。
ＡＤＣＣ・・・抗体依存性細胞が介在する細胞傷害
ＣＤＣ・・・補体依存性細胞傷害
ＣＤＲ・・・免疫グロブリンの可変領域における相補性決定領域
ＣＨＯ・・・チャイニーズハムスター卵巣
ＥＣ５０・・・５０％効果又は結合を示すときの濃度
ＫＤ・・・平衡解離定数
ＥＬＩＳＡ・・・酵素結合免疫吸着測定
ＦＡＣＳ・・・フローサイトメトリー
ＭＯＡ・・・作用機序
ＭＬＲ・・・混合リンパ球反応
ＦＲ・・・抗体フレームワーク領域
ＩＣ５０・・・５０％抑制を示すときの濃度
Ｉｇ・・・免疫グロブリン
Ｋａｂａｔ・・・Ｅｌｖｉｎ Ａ．Ｋａｂａｔ（（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）により作成された免疫グロブリン比較・番号付けシステム
ｍＡｂ又はＭａｂ又はＭＡｂ・・・モノクローナル抗体
ＰＣＲ・・・ポリメラーゼ連鎖反応
ＩＦＮ・・・インターフェロン
ＶＬ・・・軽鎖可変領域
ＶＨ・・・重鎖可変領域
ＬＣ・・・軽鎖
ＨＣ・・・重鎖
ＨＣＤＲ・・・重鎖相補性決定領域
ＬＣＤＲ・・・軽鎖相補性決定領域
ＩＬ２・・・インターロイキン－２
Ｉ．定義
本明細書で解釈のために以下の定義を使用し、しかも矛盾がなければ、単数形で使用される用語は複数の場合をも含み、逆の場合については同様である。なお、本明細書で使用されている用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、限定を加えるものではない。
用語「約」は数値と共に使用されるとき、下限として記載数値より５％小さく上限として記載数値より５％大きい範囲における数値を含むことを意味する。
本明細書で使用される用語「及び／又は」は選択可能オプションのうちのいずれか１項又は選択可能オプションの２項又は複数項を指す。
本願において、用語「包含する」又は「含む」を用いる場合、特に断らない限り、述べられた要素、整数又はステップからなる場合を含む必要がある。例えば、ある具体的な配列の抗体可変領域を「包含する」ことを言及する場合、当該配列からなる抗体可変領域を含むことを指す。
用語「抗体」は、本願において最も広い意味で使用されており、抗原結合部位を含むタンパク質を意味し、さまざまな構造の天然抗体及び人工抗体を含み、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、単鎖抗体、完全な抗体及び抗体断片を含むが、これらに限定されない。
用語「全抗体」、「全長抗体」、「完全抗体」及び「完全な抗体」は、本願において入れ替えて使用され、ジスルフィド結合を介して互いに接続された少なくとも２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）とを含む天然に存在する糖タンパク質を指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）と重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３の３つのドメインからなる。各軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）と軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、さらに分けられると、超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と、その間に挿入されているより保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ））がある。ＶＨ及びＶＬのそれぞれは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなり、アミノ末端からカルボキシル末端までは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列される。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、さまざまなエフェクター機能を示している。
「抗体断片」とは、完全抗体の一部を含みかつ完全抗体によって結合された抗原と結合する、完全抗体とは異なる分子を指す。抗体断片の非限定的な例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重抗体、線状抗体、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、二価抗体もしくは二重特異性抗体もしくはその断片、ラクダ科由来の抗体、抗体断片により形成された二重特異性抗体もしくは多重特異性抗体を含む。
本明細書で使用される用語「エピトープ」とは、抗原（例えば、ヒトＬＡＧ－３又はＰＤ－Ｌ１）における抗体分子と特異的に相互作用する部分を指す。
参照抗体と「同一の又は重複するエピトープと結合する抗体」とは、競合測定において５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上の前記参照抗体とその抗原の結合を阻害する抗体を指す。言い換えれば、参照抗体が競合測定において５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上の当該抗体とその抗原の結合を阻害する。
参照抗体に対してその抗原と競合的に結合する抗体とは、競合測定において５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上の前記参照抗体とその抗原の結合を阻害する抗体を指す。言い換えれば、参照抗体が競合測定において５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上の当該抗体とその抗原の結合を阻害する。１種の抗体が別の抗体と競合関係にあるかどうかを決定するためには様々な競合的結合測定を用いることができる。これらの測定の例としては、固相直接放射免疫測定又は間接放射免疫測定（ＲＩＡ）、固相直接酵素免疫測定又は間接酵素免疫測定（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合測定（例えば、Ｓｔａｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ９：２４２－２５３）が挙げられる。
参照抗体とその抗原の結合を抑制（例えば、競合的抑制）する抗体とは、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上の前記参照抗体とその抗原の結合を抑制する抗体を指す。言い換えれば、参照抗体が５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上の当該抗体とその抗原の結合を抑制する。抗体とその抗原の結合は親和力（例えば、平衡解離定数）として計測できる。親和力の測定方法は、本分野で既知の内容であり、例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ親和力測定である。
参照抗体と同じ又は類似の結合親和力及び／又は特異性を示す抗体とは、参照抗体の少なくとも５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上又は９５％以上の結合親和力及び／又は特異性を有する抗体を指す。これに関しては、本分野の既知の任意の結合親和力及び／又は特異性の測定方法で測定できる。
「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ領域」又は「ＣＤＲ」は、抗体可変ドメインでは、配列において超可変でありかつ構造上に形成された所定のループ（「超可変ループ」）及び／又は抗原接触残基（「抗原接触点」）を含む領域である。ＣＤＲは、主に抗原エピトープに結合する役割を果たす。重鎖と軽鎖のＣＤＲは通常、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２とＣＤＲ３と呼ばれ、Ｎ－末端から順に番号付ける。抗体の重鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３と呼ばれ、抗体の軽鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と呼ばれる。１つの特定の軽鎖可変領域又は重鎖可変領域のアミノ酸配列において、各ＣＤＲにおけるアミノ酸配列の境界は、公知の各種の抗体ＣＤＲ割り当てシステムのいずれか１種又はその組合せにより正確に決定できる。前記割り当てシステムの例は、抗体の三次元的構造とＣＤＲリングのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３，Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２７３，９２７－９４８（１９９７））、抗体配列の可変性に基づくＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））、ＡｂＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈ）、Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）、国際的ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／にて利用可能）、大量の結晶構造が利用されるアフィニティ伝播クラスタリング（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に基づくＮｏｒｔｈ ＣＤＲ定義を含む。
例えば、ＣＤＲの決定方式によって、各ＣＤＲの残基はそれぞれ以下に記載のとおりである。
Figure 2022518519000002
また、参照ＣＤＲ配列（例えば、本発明の例示的なＣＤＲのいずれか）と同じＫａｂａｔ番号位置を有することでＣＤＲを決定することもできる。
特に断らない限り、本発明で用語「ＣＤＲ」又は「ＣＤＲ配列」は、上記のいずれかの方式で決定されるＣＤＲ配列を含む。
特に断らない限り、本発明において、抗体可変領域における残基位置（重鎖可変領域残基と軽鎖可変領域残基を含む）を言及する場合、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））に基づいた番号付け位置を指す。
１つの実施形態において、本発明の抗体のＣＤＲはＫａｂａｔ規則により境界が決定され、又は、ＩＭＧＴ規則、ＡｂＭ規則、もしくはこれらの規則の任意の組合せにより決定される。
本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体分子式（Ｉ）におけるＶＨのＨＣＤＲ１はＫａｂａｔ、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ及び経験などの総合的な要因により境界が決定され、Ｋａｂａｔ番号付けシステムにおける位置がＨ２７－Ｈ３５Ｂであり、ＶＨのＨＣＤＲ２はＫａｂａｔ規則により決定され、ＶＨのＨＣＤＲ３はＩＭＧＴ規則により決定され、式（ＩＩ）におけるＶＬのＬＣＤＲはＫａｂａｔ規則により決定される。本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体分子式（Ｉ）におけるＶＨＨのＨＣＤＲ１はＡｂＭ規則により決定され、ＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３はＫａｂａｔ規則により決定される。
異なる特異性（即ち、異なる抗原に対する異なる結合部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。しかし、抗体と抗体との間にあるＣＤＲが異なるにもかかわらず、ＣＤＲには限られた数のアミノ酸位置のみを抗原との結合に直接参与する。Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭとＣｏｎｔａｃｔ方法のうちの少なくとも２つを使用することにより、最小の重複領域を確定することができ、それによって抗原と結合するための「最小結合単位」を提供する。最小結合単位は、ＣＤＲの１つのサブ部分であることができる。当業者が明らかにしたように、抗体の構造とタンパク質のフォールディングによって、ＣＤＲ配列の残り部分の残基を確定することができる。従って、本発明は、本願に提供される如何なるＣＤＲの変異体も考慮する。例えば、１つのＣＤＲの変異体において、最小結合単位のアミノ酸残基はそのまま保持することができ、Ｋａｂａｔ又はＣｈｏｔｈｉａに基づいて定義された残りのＣＤＲ残基は保守的なアミノ酸残基で置換されることができる。
「ＩｇＧ形態の抗体」とは、抗体の重鎖定常領域がＩｇＧ形態を有することを指す。全ての同一のアイソタイプの抗体はその重鎖定常領域が同じであり、異なるアイソタイプの抗体において、その重鎖定常領域が異なる。例えば、ＩｇＧ４形態の抗体とは、その重鎖定常領域がＩｇＧ４に由来することである。
本発明で使用される用語「単一ドメイン抗体」は一般的に、１つの重鎖可変領域だけからなり、抗原と結合する活性を有し、即ち、Ｃ末端からＮ末端までＦＲ４－ＶＨＨＣＤＲ３－ＦＲ３－ＶＨＨＣＤＲ２－ＦＲ２－ＶＨＨＣＤＲ１－ＦＲ１という１本の鎖だけ含む抗体であり、ラクダ科重鎖抗体の重鎖可変ドメインや魚類ＩｇＮＡＲのＶＨ様単一ドメイン（ｖ－ＮＡＲ）に由来することができ、天然で産生されてもよく、又は遺伝子工学技術により産生されてもよい。単一ドメイン抗体の例は、ラクダ科（アメリカラクダ及びラクダ）及び軟骨魚類（例えばコモリザメ）に由来する単一ドメイン抗体（ＷＯ２００５／０３５５７２）を含む。
用語「ラクダ化ヒトＶＨドメイン」は、ラクダ科ＶＨＨから誘導される主要エレメントをヒトＶＨドメインに導入することによってヒトＶＨドメインが標的抗原を認識するためにＶＬドメインとペアリングする必要がなく、ラクダ化ヒトＶＨドメインは単独でも抗原結合特異性を付与できることを指す。
本発明で使用される用語「結合部位」又は「抗原結合部位」は、抗体分子における抗原と実際に結合する領域を指し、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなるＶＨ／ＶＬ対、ラクダ科の重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン、サメ科動物のＩｇＮＡＲに由来するＶＨ様単一ドメイン（ｖ－ＮＡＲ）、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、ヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメインを含む。本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体分子は、少なくとも４つの抗原結合部位を含み、例えば、２つの単一ドメイン抗原結合部位（例えば、ＶＨＨ）と、２つのＶＨ／ＶＬ対によって形成される抗原結合部位とを含む。
用語「単一ドメイン抗原結合部位」は、単一の可変ドメイン（例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ））をもって抗原と結合する抗体分子の領域を示す。本発明の１つの実施形態において、本発明の単一ドメイン抗原結合部位により単一ドメイン抗体が構成される。１つの実施形態において、本発明の抗体分子は、それぞれ同じ又は異なる抗原と結合する２つの単一ドメイン抗原結合部位を含む。本発明の別の実施形態において、本発明の抗体分子は、それぞれ同じ又は異なる抗原エピトープと結合する２つの単一ドメイン抗原結合部位を含む。
本発明で使用される用語「多重特異性」抗体とは、少なくとも２つの抗原結合部位を有する抗体を指し、前記少なくとも２つの抗原結合部位の各抗原結合部位は、同じ抗原の異なるエピトープ又は異なる抗原の異なるエピトープと結合する。本願に係る抗体は一般に多重特異性抗体であり、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原エピトープに対して結合特異性を有する抗体である。１つの実施形態において、本願は、第１抗原及び第２抗原に対する結合特異性を有する二重特異性抗体を提供する。
用語「免疫グロブリン分子」とは、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧ類免疫グロブリンは、ジスルフィド結合を介して結合された２本の軽鎖と２本の重鎖とからなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各本の免疫グロブリン重鎖は、重鎖可変ドメインとも呼ばれる１つの重鎖可変領域（ＶＨ）を有し、それに続くのは３つの重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）である。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各本の免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインとも呼ばれる１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、それに続くのは１つの軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）である。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と称される５つのクラスのいずれかに分類できる。そのうち、一部のクラスはさらに例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）とα２（ＩｇＡ２）などのサブクラスに分けられる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列によって、κ及びλと呼ばれる２つのタイプのいずれかに分類できる。免疫グロブリンは基本的に、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続された２つのＦａｂ分子と１つのＦｃドメインとからなる。
用語「エフェクター機能」は、免疫グロブリンアイソタイプによって変化する免疫グロブリンＦｃ領域に直結する生物学的活性を指す。免疫グロブリンのエフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合作用、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、免疫複合体介在性抗原提示細胞による抗原の取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレート及びＢ細胞活性化を含む。
用語「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域又はその一部を変化、置換又は交換することによって、抗原結合部位が異なる又は変化したタイプ、エフェクター機能及び／又は生物種の定常領域又はキメラ抗体に新しい性能を付与する完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、医薬品）などに接続され、又は（ｂ）可変領域又はその一部を、異なる又は変化した抗原特異性を有する可変領域によって変化、置換又は交換させた抗体分子を指す。例えば、マウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンに由来する定常領域に変更することによって修飾できる。ヒト定常領域に変更したため、該キメラ抗体は、抗原認識についてのその特異性を保持するとともに、元のマウス抗体と比べて、ヒトにおいて低下した抗原性を有する。
「ヒト化」抗体は、非ヒト抗体（例えばマウスモノクローナル抗体）の抗原特異性反応性を保留するとともに、治療薬としてヒトに投与する場合に免疫原性が低い抗体である。ヒト化抗体は、例えば、非ヒト抗原結合部位を保留するとともに、抗体の残りの部分をこれらに対応するヒト由来の部分（即ち、定常領域及び可変領域における結合に関与しない部分はヒト抗体の対応する部分である）に変更することによって実現できる。例えばＰａｄｌａｎ，Ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９４，３１：１６９－２１７が参照される。ヒト抗体工学技術の他の例は、ＵＳ５，７６６，８８６に開示されているＸｏｍａ技術を含むが、これに限定されない。
「ヒト抗体」とは、ヒト又はヒト細胞より産生された又はヒト以外に由来するものであって、ヒト抗体ライブラリー又はヒト抗体をコードする他の配列を利用する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものを指す。ヒト抗体に対する当該定義において、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が明確に除外されている。
用語「・・・価」抗体とは、抗体分子に存在する抗原結合部位の数を指す。「二価」、「三価」及び「四価」抗体とは、抗体分子にそれぞれ２つの抗原結合部位、３つの抗原結合部位及び４つの抗原結合部位が存在することを意味する。１つの実施形態において、本願で報道された二重特異性抗体は「四価」のものである。
用語「フレキシブルリンカー」又は「リンカー」は、アミノ酸からなる接続ペプチドを指し、例えば、抗体における各可変ドメインを接続するために、単独で又は組合せて使用されるグリシン及び／又はセリン残基である。１つの実施形態において、フレキシブルリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含むＧｌｙ／Ｓｅｒ接続ペプチドであり、ここで、ｎは１以上の正の整数であり、例えば、ｎは１～７の正の整数であり、例えば２、３又は４である。１つの実施形態において、前記フレキシブルリンカーは（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２（配列番号５）である。ＷＯ２０１２／１３８４７５に記載のリンカーも本発明の範囲に含まれており、前記文献は引用により本願に組み込まれる。
本発明で使用される用語「結合」又は「特異性結合」とは、結合作用が抗原に対して選択的であり、かつ好ましくない又は非特異的な相互作用と区別できることを意味する。特定の抗原に対する抗原結合部位の結合能力は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）又は本分野で公知の通常の結合測定法により測定できる。
用語「抗原」は、免疫応答を引き起こす分子を指す。このような免疫応答は、抗体の産生又は特異性免疫細胞の活性化に関係しており、又は両方に関係する可能性がある。当業者が理解できるように、ほぼ全てのタンパク質又はペプチドを含む大分子は、いずれも抗原として利用できる。また、抗原は組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡから誘導されるものであってもよい。本願のいくつかの実施形態において、第１抗原、第２抗原は２種の異なる抗原である。
用語「腫瘍関連抗原」又は「がん抗原」は入れ替えて使用され、正常な細胞よりも、好ましくはがん細胞の表面において完全なもの又は断片（例えば、ＭＨＣ／ペプチド）として発現された分子（一般にタンパク質、炭水化物又は脂質）を意味し、前記分子は、薬剤に用いられると優先的にがん細胞を標的とする。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原は、正常な細胞よりも腫瘍細胞で過剰発現された、例えば、正常な細胞よりも１倍に過剰発現された、２倍に過剰発現された、３倍に過剰発現された又はそれ以上の倍数に過剰発現された細胞表面分子である。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞において合成された問題がある細胞表面分子であり、例えば、正常な細胞において発現された分子に対して欠失、添加又は変異を含む分子である。いくつかの実施形態において、腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面においてのみ完全に発現され又は断片として発現され、しかも正常な細胞の表面には合成又は発現されない。
用語「サイトカイン」は、細胞集団から放出されて、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用するタンパク質の通称である。本発明で使用される用語「サイトカイン」は、天然由来の又は組換え細胞培養物に由来するタンパク質及び天然配列サイトカインの生物学的活性を有する同等物を含み、この同等物は、人工合成により産生された小分子実体、及びその薬学的に許容可能な誘導体と塩を含む。
「免疫複合体」は、１種以上の追加物質（その非限定的な例は細胞傷害剤又は標識を含む）と複合した抗体である。
用語「リンパ球活性化遺伝子－３」又は「ＬＡＧ－３」は、全てのアイソタイプ、哺乳類（例えば、ヒト）ＬＡＧ－３、ヒトＬＡＧ－３の生物種的相同体、ＬＡＧ－３の少なくとも１つの共有するエピトープを含む類似体を含む。ＬＡＧ－３（例えば、ヒトＬＡＧ－３）のアミノ酸配列とヌクレオチド配列は本分野の周知の内容であり、例えば、Ｔｒｉｅｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：１３９３－１４０５を参照できる。いくつかの実施形態において、用語「ヒトＬＡＧ－３」とは、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２２７７のヒトＬＡＧ－３の完全なアミノ酸配列などのヒト配列ＬＡＧ－３を指す。従来技術ではＬＡＧ－３は、例えば、ＣＤ２２３とも呼ばれる。ヒトＬＡＧ－３配列は、例えば、保存的な変異又は非保存的な領域における変異を有することで、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２２７７のヒトＬＡＧ－３とは異なるものであってもよく、当該ＬＡＧ－３はＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＰ＿００２２７７のヒトＬＡＧ－３とほぼ同じ生理機能を有する。例えば、ヒトＬＡＧ－３の生理機能はＬＡＧ－３の細胞外ドメインにエピトープを有し、それが本発明の抗体によって特異的に結合されることであり、又はヒトＬＡＧ－３の生理機能はＭＨＣクラスＩＩ分子と結合することである。
本発明で使用される用語「抗ＬＡＧ－３抗体」、「抗ＬＡＧ－３」、「ＬＡＧ－３抗体」又は「ＬＡＧ－３と結合する抗体的抗体」とは、十分な親和力でＬＡＧ－３タンパク質又はその断片と結合する抗体を指す。１つの実施形態において、抗ＬＡＧ－３抗体の非ＬＡＧ－３タンパク質と結合する程度は、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）又は光干渉による生体測定法又はＭＳＤ測定法により測定された結果、前記抗体のＬＡＧ－３と結合する程度の約１０％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、約５０％未満、約６０％未満、約７０％未満、約８０％未満、又は約９０％以上未満である。
本発明で使用される用語「プログラム細胞死１リガンド１」、「ＰＤ－Ｌ１」、「プログラム死リガンド１」、「分化抗原群２７４」、「ＣＤ２７４」又は「Ｂ７同族体１」とは、例えば、霊長類（例えば、ヒト）及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳類を含む任意の脊椎動物源に由来する任意の天然ＰＤ－Ｌ１である。前記用語は、「全長」の未処理ＰＤ－Ｌ１、及び細胞内処理によって産生される任意の形態のＰＤ－Ｌ１を含む。ＰＤ－Ｌ１は膜貫通タンパク質又は可溶性タンパク質として存在してもよい。前記用語はまた、天然に存在するＰＤ－Ｌ１の変異体、例えばスプライシング変異体又は対立遺伝子変異体を含む。ＰＤ－Ｌ１の基本構造は、細胞外Ｉｇ様Ｖ型ドメイン、Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインの４つのドメインを含む。ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ．２９１２６にはヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子（ゲノムＤＮＡ配列）に関する別の情報が記載されている。ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｏ．６０５３３にはマウスＰＤ－Ｌ１遺伝子（ゲノムＤＮＡ配列を含む）に関する別の情報が記載されている。例示的な全長ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿００１２５４６５３又はＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｑ９ＮＺＱ７に記載されており、例示的な全長マウスＰＤ－Ｌ１タンパク質配列は、例えば、ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿０６８６９３又はＵｎｉｐｒｏｔ登録番号Ｑ９ＥＰ７３に記載されている。
本発明で使用される用語「抗ＰＤ－Ｌ１抗体」、「抗ＰＤ－Ｌ１」、「ＰＤ－Ｌ１抗体」又は「ＰＤ－Ｌ１と結合する抗体」とは、十分な親和力でＰＤ－Ｌ１タンパク質又はその断片と結合する抗体を指す。１つの実施形態において、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の非ＰＤ－Ｌ１タンパク質と結合する程度は、例えば、放射免疫測定（ＲＩＡ）又は光干渉による生体測定法又はＭＳＤ測定法により測定された結果、前記抗体のＰＤ－Ｌ１と結合する程度の約１０％未満、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、約５０％未満、約６０％未満、約７０％未満、約８０％未満、又は約９０％以上未満である。
用語「抑制剤」又は「拮抗剤」は、対象分子のいくつかのパラメータ（例えば、活性）を低減させる物質を含む。例えば、当該用語は、対象分子の活性（例えば、ＬＡＧ－３活性又はＰＤ－Ｌ１活性）の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％又は少なくとも４０％以上を抑制する物質を含む。したがって、抑制効果は必ずしも１００％とは限らない。
「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列のＦｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」は、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、貪食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）のダウンレギュレートなどを含む。かかるエフェクター機能には一般に、Ｆｃ領域と結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）の関連が求められ、それに例えば、本発明に開示されている複数種の測定手法を用いて評価できる。
「エフェクター機能」とは、抗体Ｆｃ領域に属し且つ抗体のアイソタイプによって変化する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合と補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞が介在する細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレート、Ｂ細胞活性化を含む。
「ヒトエフェクター細胞」とは、１種以上のＦｃＲを発現しエフェクター機能を行使する白血球を指す。いくつかの実施形態において、当該細胞は少なくともＦｃエフェクターを発現しＡＤＣＣエフェクター機能を行使する。ＡＤＣＣを介在するヒト白血球の例は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単核細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、好中球を含む。エフェクター細胞は、天然由来のものであってもよい。例えば、血液から分離される。
用語「有効量」とは、本発明の抗体もしくは断片又は複合体又は組成物の１回分又は複数回分の量を患者に投与した後、治療又は予防が必要な患者に所望の効果が得られるという量又は投与量を指す。有効量は、当業者である主治医が、例えば、哺乳類の生物種、投与対象の大きさ、年齢、健康状態と、適用される疾患、疾患の程度又は重症度、個体患者における応答、投与される抗体、投与方式、投与製剤の生物学的利用能の特徴、選択される投与計画、併用療法の適用の複数種の要因を考慮して容易に決定することができる。
「治療的有効量」とは、所定の期間に亘って所定の用量で所望の治療結果を達成するために有効な量を指す。抗体もしくは抗体断片又はその複合体又は組成物の治療有効量は、例えば、疾患の状態、個体の年齢、性別、重量、抗体又は抗体の部分が個体に所望の反応を起こす能力の複数種の要因によって変化する可能性がある。また治療有効量は、抗体もしくは抗体断片又はその複合体又は組成物の任意の毒性又は有害作用が有益な治療効果に及ばないという量であってもよい。治療を受けていない対象に比べて、「治療有効量」により計測可能なパラメータ（例えば、腫瘍増殖（成長）速度）の少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約５０％、少なくとも約６０％又は少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％が抑制されることが好ましい。ヒト腫瘍における効能を示す動物モデルシステムにおいて、計測可能なパラメータ（例えば、がん）に対する化合物の抑制能力を評価できる。好ましくは、化合物の抑制能力を検証することによって組成物の当該特性を評価できる。前記抑制は関連技術に熟練した業者が知っている測定手法によりインビトロにおいて測定される。
「予防的有効量」は、所定の期間に亘って所定の用量で所望の予防結果を達成するために有効な量を指す。一般に、予防目的の投与量は対象における疾患の早期段階よりも前に又は疾患の早期段階に適用されるため、予防有効量が治療有効量を下回る。
「Ｆａｂ」断片は、重鎖可変ドメインと、軽鎖可変ドメインとを含み、且つ、軽鎖の定常ドメインと、重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）とをさらに含む。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ基末端にいくつかの残基（抗体ヒンジ領域に由来する１つ以上のシステインを含む）が追加されているため、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が１つの遊離チオール基を携帯しているＦａｂ’に対する呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、最初に１対のＦａｂ’断片として産生され、Ｆａｂ’断片の間にヒンジシステインがある。抗体断片の他の化学的カップリングも、既知の内容である。
本明細書で使用される用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義しており、前記領域は少なくとも一部の定常領域を含む。該用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。一部の実施形態において、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域がＣｙｓ２２６又はＰｒｏ２３０から重鎖のカルボニル基末端に延長している。一方、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は存在してもよいし、又は存在しなくてもよい。特に断らない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号が、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載のＥＵ番号付けシステム（別称ＥＵインデックス）に準じる。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」とは、抗体と抗原の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは一般に、各ドメインが４つの保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含むように、類似の構造を有する。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．ｐ９１（２００７）が参照される）。単一のＶＨドメイン又はＶＬドメインでも、抗原結合特異性を付与することができる。また、特定の抗原と結合する抗体に由来するＶＨドメイン又はＶＬドメインを利用して前記抗原と結合する抗体を分離することによって、相補性のＶＬドメイン又はＶＨドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）が参照される。
用語「宿主細胞」は、既に外因性ポリヌクレオチドが導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、初代より形質転換された細胞及びこれらより誘導された子孫を含むが、継代数を考慮しない。子孫は、変異が含まれる可能性があるため、核酸の内容において親細胞と同じではない。本発明では、初代の形質転換細胞からスクリーニング又は選択された同じ機能又は生物学的活性を有する変異体子孫が含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体分子を産生するために用いられる任意のタイプの細胞株であってもよく、真核細胞、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞と、原核細胞、例えば、大腸菌細胞とを含む。宿主細胞は、培養された細胞を含み、遺伝子組換え動物、遺伝子組換え植物又は培養された植物組織もしくは動物組織の内部の細胞を含む。
用語「抗腫瘍作用」は、さまざまな手段により表示できる生物学的効果であり、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、腫瘍細胞増殖の低減又は生存する腫瘍細胞の減少を含むが、これらに限定されない。
用語「腫瘍」及び「がん」は、本願において、固形腫瘍と液性腫瘍を含むように入れ替えて使用される。
用語「がん」及び「がん性」は、一般に、細胞の成長が調節できないことを特徴とする哺乳動物の生理障害を指し又はこれを説明する。
用語「腫瘍」は、悪性か良性かに関らず、全ての腫瘍性（ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ）の細胞の成長及び増殖、全ての前がん（ｐｒｅ－ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）及びがん性の細胞と組織を含む。用語「がん」、「がん性」及び「腫瘍」は、本願で言及される場合に互いに排他的ではない。
「腫瘍免疫回避」とは、腫瘍が免疫学的認識及び除去を回避する過程である。このように、治療の定義として、上記回避が弱まれば、腫瘍免疫が「治療」されるとともに、腫瘍が免疫系に認識されて攻撃を受ける。腫瘍認識の例として、腫瘍結合、腫瘍収縮、及び腫瘍除去を含む。
本明細書で使用される用語「標識」とは、試薬（例えば、ポリヌクレオチドプローブもしくは抗体）に直接的又は間接的に複合又は融合され、かつ、複合又は融合の対象試薬による検出を促進する化合物又は組成物を指す。前記標識はそれ自体が検出可能（例えば、放射性同位体標識又は蛍光標識）であるか、又は、酵素触媒によって標識されると検出可能な基質化合物又は組成物の化学的改変を触媒できる。当該用語は、検出可能な物質をプローブ又は抗体にカップリング（即ち、物理的連結）させることによってプローブもしくは抗体を直接標識すること、直接標識されている別の試薬との反応によりプローブもしくは抗体を間接的に標識することを含む。間接的な標識の例は、蛍光標識されている二次抗体による一次抗体の検出、蛍光標識されているストレプトアビジンタンパク質で検出可能な、ビオチンを有するＤＮＡプローブの末端標識の使用を含む。
「個体」又は「対象」は、哺乳類を含む。哺乳類の非限定的な例は、家畜（例えば、ウシ、ヤギ（ヒツジ）、ネコ、イヌ、ウマ）、霊長類（例えば、ヒト、サルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）を含む。いくつかの実施形態において、前記個体又は前記対象はヒトである。
「単離された」抗体とは、その存在する自然環境の成分と分離している抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される純度が９５％以上又は９９％以上であるように精製される。抗体純度の評価方法の概要は、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ８４８：７９－８７（２００７）が参照される。
「単離された」核酸とは、その存在する自然環境の成分と分離している核酸分子を指す。単離された核酸は、一般に当該核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子を含む。ただし、当該核酸分子は染色体外又はその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
以下のとおりに配列間の配列同一性を算出する。
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列における同一性パーセンテージを決定するために、前記配列を最適化した上で比較を行ってもよい（例えば、比較の最適化のために第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列又は核酸配列のいずれかもしくは両者にギャップを導入するか、又は比較の便宜上、非相同配列を捨ててもよい）。１つの好ましい実施形態において、比較の便宜上、比較配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％である。次に、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１配列の対象位置は第２配列の対応する位置と同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占有されている場合、当該分子は当該位置において同一である。
数学的アルゴリズムを用いて、２つの配列間において配列比較と同一性パーセンテージの算出を実現できる。１つの好ましい実施形態において、２つのアミノ酸配列間における同一性パーセンテージはＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに統合されているＮｅｅｄｌｅｍａ＆Ｗｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４－４５３）アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて利用可能）に、Ｂｌｏｓｓｕｍ ６２行列もしくはＰＡＭ２５０行列、ギャップ重み１６、１４、１２、１０、８、６もしくは４と長さ重み１、２、３、４、５もしくは６を用いて決定される。別の好ましい実施形態において、２つのヌクレオチド配列間における同一性パーセンテージはＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍにて利用可能）に、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰ行列、ギャップ重み４０、５０、６０、７０もしくは８０、長さ重み１、２、３、４、５もしくは６を用いて決定される。特に好ましくは、パラメータセット（特に断らない限り、１つのパラメータセットを使用する）には、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、フレームシフトギャップペナルティ５のＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリング行列を採用する。
また、２つのアミノ酸配列又はヌクレオチド配列間における同一性パーセンテージは、ＡＬＩＧＮプログラム（２．０版）に統合されているＥ．ＭｅｙｅｒｓとＷ．Ｍｉｌｌｅｒによるアルゴリズム（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，４：１１－１７）によりＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長さペナルティ１２、ギャップペナルティ４を利用して決定されてもよい。
より好ましくは、さらに例えば、本発明に記載の核酸配列とタンパク質配列を「参照配列」としてパブリックデータベースにおいて検索を実行することによって、他のメンバー配列又は関連の配列を同定することもできる。
本明細書で使用される用語「低いストリンジェンシー条件、中等度のストリンジェンシー条件、高いストリンジェンシー条件、又は極めて高いストリンジェンシー条件におけるハイブリダイゼーション」は、ハイブリダイゼーションと洗浄の条件を説明している。ハイブリダイゼーション反応の実行に関する手引きは、援用の形で組み込まれたＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１－６．３．６に記載されている。参考文献には、含水の方法と非含水の方法が説明されており、いずれの方法も利用できる。本明細書で言及される特異性ハイブリダイゼーションの条件は以下のとおりである。１）低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件は約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）において、次に少なくとも５０℃（低いストリンジェンシー条件では、洗浄温度を５５℃に上げることができる）で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて２回洗浄することである。２）中等度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件は約４５℃で６×ＳＳＣにおいて、次に６０℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて複数回洗浄することである。３）高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件は約４５℃で６×ＳＳＣにおいて、次に６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて１回以上洗浄することである。好ましくは、４）極めて高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションの条件であり、それは６５℃で０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳにおいて、次に６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて１回以上洗浄することである。極めて高いストリンジェンシー条件（４）は好ましい条件であり、特に断らない限り、当該条件が適用される。
用語「医薬組成物」とは、それに含まれる活性成分の生物学的活性が有効な形態で存在し、しかも前記組成物が投与される対象に許容されない毒性がある別の成分を含まない組成物を指す。
用語「医薬品添加物」とは、活性物質と共に投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全もしくは不完全））、ベクター、賦形剤又は安定剤などを指す。
本明細書で使用される用語「治療」とは、出現している症状、病的状態、病状又は疾患の進行又は重症度に対する軽減、中断、遅延、寛解、停止、低減、又は逆転を指す。所望の治療效果は、疾病の出現又は再発を防止すること、症状を軽減すること、疾病の如何なる直接的又は間接的病理学結果を減少すること、転移を防止すること、病状進展速度を低減すること、疾病の状態を改善又は緩和させること、及び、予後を緩和又は改善させることを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は、疾患の発展又は疾患の進行を遅延させるために用いられる。
本明細書で使用される用語「予防」は、疾患、病的状態、特定の疾患もしくは病的状態に係る症状の発生又は進行に対する抑制を含む。いくつかの実施形態において、がん家族歴がある対象は、予防性計画対象の候補である。一般に、がんが言及される文脈では、用語「予防」はがんに係る病的状態又は症状が生じる前に、特に、がんに罹患するリスクのある対象にがんが生じる前の薬物投与を指す。
本発明で使用される用語「治療剤」は、化学療法剤、細胞傷害剤、ワクチン、追加の抗体、抗感染症剤、小分子薬物又は免疫調節剤を含む、例えば、腫瘍（例えば、がん）及び感染などの疾患の予防又は治療に有効な任意の物質を含む。
「化学療法剤」は、がんの治療に効果的な化合物を含む。
本明細書で使用される用語「免疫調節剤」とは、免疫応答を抑制又は調節する天然又は合成の活性薬剤又は薬剤を指す。免疫応答は、体液応答又は細胞応答であってもよい。
用語「小分子薬物」とは、生物学的プロセスを調節できる低分子量の有機化合物を指す。
本願で使用される用語「細胞傷害剤」は、細胞機能を抑制又は阻止でき、かつ／又は細胞の死亡又は破壊を引き起こす物質である。
用語「抗感染症剤」は、その投与濃度と投与間隔において、宿主の命に危険を及ぼすことなく微生物の成長を特異的に抑制又は解消する任意の分子を含む。前記微生物は、例えばウイルス、細菌、真菌、又は寄生虫などの原生動物を含む。本明細書で使用される用語「抗感染症剤」は、抗生物質、抗細菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原生動物剤を含む。１つの具体的な態様において、前記抗感染症剤は、その投与濃度と投与間隔において宿主に毒性がない。
抗細菌用の抗感染症剤又は抗細菌剤は、殺菌用（即ち、直接死滅）又は静菌用（即ち、分裂阻止）に大別することができる。抗細菌用の抗感染症剤は狭域抗菌剤（即ち、影響を受けるのはグラム陰性菌など少数の種類の細菌サブタイプだけ）、広域抗菌剤（即ち、幅広い種類に影響を与える）にさらに分類することができる。用語「抗ウイルス剤」は、ウイルスの成長、病原性及び／又はその生存を抑制又は解消する任意の物質を含む。用語「抗真菌剤」は、真菌の成長、病原性及び／又はその生存を抑制又は解消する任意の物質を含む。用語「抗原生動物剤」は、原生動物種（例えば、寄生虫）の成長、病原性及び／又はその生存を抑制又は解消する任意の物質を含む。
用語「組合せ製品」は、２つ以上の治療剤が独立的に同じ時間で同時に投与されてもよく、又は、特に、組合せパートナーが相乗効果を示すことを可能にする時間間隔内で別々に投与されてもよい、投与量単位形態の固定組合せ又は非固定組合せ、或いは組合せて投与される部分のための試薬キットを指す。用語「固定組合せ」は、本発明の抗体及び組合せパートナー（例えば、追加の治療剤）が、単一の実体又は投与量として患者に同時に投与されることを意味する。用語「非固定組合せ」は、本発明の抗体及び組合せパートナー（例えば、追加の治療剤）が、特定の時間的制限なしに、別個の実体として患者に同時に、並行して、又は連続して投与されることを意味し、そのような投与は、患者体内における２つの治療剤の治療上有効的なレベルを提供する。後者はまた、カクテル療法、例えば３つ以上の治療剤の投与にも適している。好ましい実施形態において、薬物の組合せは、非固定組合せである。
用語「組合せ療法」又は「併用療法」は、本開示に記載のがん又は感染を治療するための２つ以上の治療剤の投与を意味する。そのような投与は、活性成分の一定の割合を有する単一のカプセルのような、実質的に同時にこれらの治療剤を同時投与することを含む。或いは、そのような投与は、複数又は別個の容器での各活性成分（例えば、錠剤、カプセル、粉末及び液体）の同時投与、別々の投与、又は連続投与を含む。粉末及び／又は液体は、投与前に所望の投与量に再構成又は希釈することができる。いくつかの実施形態において、投与は、各タイプの治療剤を実質的に同じ時間又は異なる時間に連続的に使用することを含む。いずれの場合においても、治療案は、本明細書に記載の病的状態又は病状の治療における医薬の組合せの有益な効果を提供する。
本明細書で使用される用語「ベクター」とは、それに連結された別の核酸を増殖させる核酸分子を指す。当該用語は、核酸の自己複製が可能な構造としてのベクター、それを導入していた宿主細胞のゲノムに結合されたベクターを含む。一部のベクターは、それに有効的に連結された核酸の発現をガイドすることができる。本明細書で、かかるベクターは「発現ベクター」と呼ばれる。
「対象／患者試料」とは、患者又は対象より得た細胞又は液体の集まりである。組織又は細胞試料の由来としては、新鮮な、冷凍された及び／又は保存された器官、組織試料、生検試料もしくは穿刺試料などの固形組織、血液もしくは任意の血液成分、脳脊髄液、羊膜液（羊水）、腹腔内液（腹水）もしくは間質液などの体液、対象における妊娠もしくは発育の任意の段階に由来する細胞が挙げられる。組織試料は、防腐剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養素、抗生物質などの自然界に存在する組織に溶けない化合物を含んでもよい。本明細書に言及される腫瘍試料の非限定的な例は、腫瘍生検試料、吸引物、気管支肺胞洗浄液、胸膜腔内液（胸水）、痰、尿、手術標本、遊走する腫瘍細胞、血清、血漿、遊走する血漿タンパク質、腹水、腫瘍から誘導されたもしくは腫瘍様の特性を示す初代細胞培養物又は細胞株、又はホルマリンで固定されたもしくはパラフィンで包埋された腫瘍試料もしくは冷凍された腫瘍試料などの保存された腫瘍試料を含む。
用語「包装付加頁」とは、一般に治療用途の商品の包装とともに提供された、特定の治療製品の用途に適する適応症、用法、投与量、投与、併用療法、禁忌症及び／又は注意事項などの情報を含む取扱説明書。
ＩＩ．本発明の抗体分子
本発明は、さまざまな疾患の免疫治療、予防及び／又は診断に用いられる新規な抗体分子を提供する。本発明の抗体分子は、少なくとも２つ、３つ又は４つの抗原結合部位を含み、単一特異性抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体として機能でき、好ましくは、二重特異性抗体として機能できる。
１つの実施形態において、本発明の抗体分子における式（Ｉ）の単一ドメイン抗原結合部位（ＶＨＨ）は、高い親和力で標的抗原のエピトープと特異的に結合できる単一の重鎖可変ドメイン、例えば、ラクダ科の重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン、サメ科動物のＩｇＮＡＲに由来するｖ－ＮＡＲ、ラクダ化ヒトＶＨドメイン、ヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメイン、及びこれらの組換え単一ドメインである。１つの実施形態において、本発明の抗体分子における単一ドメイン抗原結合部位は、ラクダ科の重鎖抗体から誘導される重鎖可変ドメイン、ラクダ化ヒトＶＨドメイン及び／又はヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメインである。従来技術において、ラクダ科の種（例えばラクダ、アルパカ、ヒトコブラクダ、リャマ、グアナコ）から得られた抗体タンパク質の大きさ、構造及びヒト対象に対する抗原性のキャラクタリゼーションがすでに完成されている。自然界でラクダ科哺乳動物ファミリーに由来する一部のＩｇＧ抗体は、軽鎖が欠如しており、そのため構造的には他の動物に由来する２本の重鎖と２本の軽鎖とを有する一般的な四鎖抗体の構造とは異なる。ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２２１４（１９９４年３月３日に開示されたＷＯ９４／０４６７８）が参照される。
標的抗原に対する高い親和力を有するラクダ科の重鎖抗体の重鎖可変ドメインＶＨＨは遺伝子工学的方法により得られる。例えば１９９８年６月２日に登録された米国特許第５，７５９，８０８号を参照する。他の非ヒト抗体断片と同様に、ラクダ科ＶＨＨのアミノ酸配列は、組換えにより変化させることによってヒト配列により類似する配列とすることができ、これは即ち「ヒト化」であり、それによってヒトに対するラクダ科ＶＨＨの抗原性が低減する。また、ラクダ科ＶＨＨから誘導される主要エレメントをヒトＶＨドメインに移すことによって、ラクダ化ヒトＶＨドメインを得ることもできる。ＶＨＨは、ヒトＩｇＧ分子に対して分子量がその十分の一であり、しかも物理的直径はわずか数ナノメートルである。ＶＨＨ自体は優れた熱安定性を有し、極端なｐＨ及びタンパク質の酵素分解消化に対して安定的でかつ抗原性が低いため、本発明の抗体分子の１つの実施形態において、式（Ｉ）におけるＶＨＨが構築モジュールとして本発明の抗体分子の安定性にも、ヒト対象における低抗原性にも寄与する。
１つの実施形態において、本発明の抗体分子の式（Ｉ）におけるＶＨＨがＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１）と特異的に結合する。
１つの実施形態において、本発明の抗体分子の式（Ｉ）におけるＰＤ－Ｌ１と特異的に結合するＶＨＨは、
（ｉ）配列番号６の３つの相補性決定領域（ＶＨＨ ＣＤＲ）を含む、又は
（ｉｉ）（ｉ）の配列に対して、前記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下もしくは１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的な置換）が含まれる配列、を含む。
好ましい実施形態において、本発明の抗体分子の式（Ｉ）におけるＰＤ－Ｌ１と特異的に結合するＶＨＨは、相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＶＨＨ ＣＤＲ１、ＶＨＨ ＣＤＲ２及びＶＨＨ ＣＤＲ３であって、配列番号１０のアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列からなり、或いは、配列番号１０のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＶＨＨ ＣＤＲ１と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列からなり、或いは、配列番号１１のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＶＨＨ ＣＤＲ２と、配列番号１２のアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列からなり、或いは、配列番号１２のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＶＨＨ ＣＤＲ３と、を含む。
好ましい実施形態において、本発明の抗体分子の式（Ｉ）におけるＰＤ－Ｌ１と特異的に結合するＶＨＨは、
（ｉ）配列番号６で示される配列、
（ｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列、或いは
（ｉｉｉ）配列番号６のアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下又は１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列、を含むか又はそれらからなり、好ましくは、前記アミノ酸変異はＣＤＲ領域に生じない。
１つの実施形態において、式（Ｉ）のＶＨと式（ＩＩ）のＶＬにより構成される抗原結合部位はＬＡＧ－３、例えばヒトＬＡＧ－３と特異的に結合する。
いくつかの具体的な実施形態において、本発明の抗体分子では、式（Ｉ）におけるＶＨは、
（ｉ）配列番号２で示される重鎖可変領域ＶＨの３つの相補性決定領域ＨＣＤＲ、又は
（ｉｉ）（ｉ）の配列に対して、前記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下もしくは１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的な置換）が含まれる配列を含み、且つ／又は
式（ＩＩ）におけるＶＬは、
（ｉ）配列番号８で示される軽鎖可変領域ＶＬの３つの相補性決定領域ＬＣＤＲ、又は
（ｉｉ）（ｉ）の配列に対して、前記３つのＣＤＲ領域に合計で少なくとも１個であり、かつ、５個以下、４個以下、３個以下、２個以下もしくは１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的な置換）が含まれる配列を含む。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子では、式（Ｉ）におけるＶＨは、
相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＨＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３であって、配列番号１３のアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列からなり、或いは、配列番号１３のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列からなり、或いは、配列番号１４のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、配列番号１５のアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列からなり、或いは、配列番号１５のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含み、
且つ／又は
式（ＩＩ）におけるＶＬは、
相補性決定領域（ＣＤＲ）であるＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３であって、配列番号１６のアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列からなり、或いは、配列番号１６のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ１と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列からなり、或いは、配列番号１７のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むか又は前記アミノ酸配列からなり、或いは、配列番号１８のアミノ酸配列に対して１個、２個もしくは３個の変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的な置換）を有するアミノ酸配列を含むＬＣＤＲ３と、を含む。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子では、
（ａ）式（Ｉ）におけるＶＨは、
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、又は
（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、又は
（ｉｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下又は１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、好ましくは、前記アミノ酸変異はＣＤＲ領域に生じない、
且つ／又は
（ｂ）式（ＩＩ）におけるＶＬは、
（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、又は
（ｉｉｉ）配列番号８のアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下又は１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、好ましくは、前記アミノ酸変異はＣＤＲ領域に生じない。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子の式（Ｉ）のＦｃは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４に由来する。いくつかの実施形態において、前記Ｆｃは、ＩｇＧ１に由来する。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、
（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、又は
（ｉｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下又は１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子の式（Ｉ）のＣＨ１は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４に由来する。いくつかの実施形態において、ＣＨ１は、ＩｇＧ１に由来する。いくつかの実施形態において、ＣＨ１は、
（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、又は
（ｉｉｉ）配列番号３のアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下又は１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子の式（Ｉ）のＣＬは、
（ｉ）配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、又は
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下又は１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子の式（Ｉ）のＸは、フレキシブルリンカーであり、例えば、単独又は組合せのグリシン及び／又はセリン残基を有するリンカーである。１つの実施形態において、前記リンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎは１以上の正の整数であり、例えば、ｎは１～７の正の整数であり、例えば２、３、４、５、６である。１つの実施形態において、ｎは１、２、３又は４である。１つの実施形態において、Ｘは配列番号５で示される配列を有する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子では、
（ａ）式（Ｉ）におけるＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃは、
（ｉ）配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、又は
（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは２０個以下もしくは１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下、１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記アミノ酸変異は重鎖のＣＤＲ領域に生じず、より好ましくは、前記アミノ酸変異は重鎖可変領域に生じない、
且つ／又は
（ｂ）式（ＩＩ）のＶＬ－ＣＬは、
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、又は
（ｉｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列に対して１個以上（好ましくは２０個以下又は１０個以下、より好ましくは５個以下、４個以下、３個以下、２個以下又は１個以下）のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、より好ましくは保存的なアミノ酸置換）を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、前記アミノ酸変異は軽鎖のＣＤＲ領域に生じず、より好ましくは、前記アミノ酸変異は軽鎖可変領域に生じない。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子の式（Ｉ）のＶＨ又は式（ＩＩ）のＶＬのＮ末端は、シグナルペプチド配列、例えば、ＭＥＴＤＴＬＬＬＷＶＬＬＬＷＶＰＧＳＴＧ（配列番号２０）をさらに含む。
本発明の好ましい実施形態において、本発明は、式（Ｉ）のポリペプチド鎖が配列番号１で示される配列、又はその配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、且つ／又は、式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が配列番号７で示される配列、又はその配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、抗体分子に関する。
１つの実施形態において、本発明の抗体は、その一部として全抗体部分を含む。いくつかの実施形態において、本発明の全抗体部分は、式（Ｉ）鎖のＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ、及び式（ＩＩ）鎖のＶＬ－ＣＬを含む。なお、ＶＨにより全抗体部分の重鎖可変領域が構成され、ＣＨ１－Ｆｃにより全抗体部分の重鎖定常領域が構成され、両者により全抗体部分の重鎖が構成される。ＶＬにより全抗体部分の軽鎖可変領域が構成され、ＣＬにより全抗体部分の軽鎖定常領域が構成され、両者により全抗体部分の軽鎖が構成される。
いくつかの実施形態において、全抗体部分はヒト抗体である。いくつかの実施形態において、全抗体部分はＩｇＧ１形態の抗体、ＩｇＧ２形態の抗体又はＩｇＧ４形態の抗体である。いくつかの実施形態において、全抗体部分により独立的にモノクローナル抗体が構成される。いくつかの実施形態において、全抗体部分はヒト化されたものである。いくつかの実施形態において、全抗体部分はキメラ抗体である。いくつかの実施形態において、全抗体部分のフレームワーク配列の少なくとも一部は、ヒトに共有するフレームワーク配列である。
１つの具体的な実施形態において、全抗体部分は抗ＬＡＧ－３抗体である。
本発明の１つの実施形態において、本明細書に記載のアミノ酸変異は、アミノ酸の置換、挿入又は欠失を含む。好ましくは、本発明において前記アミノ酸変異はアミノ酸置換であり、保存的な置換であることが好ましい。
好ましい実施形態において、本発明において前記アミノ酸変異はＣＤＲ外の領域（例えば、ＦＲ）に生じる。より好ましくは、本発明において前記アミノ酸変異は重鎖可変領域外及び／又は軽鎖可変領域外の領域に生じる。
いくつかの実施形態において、置換は保存的な置換である。前記保存的な置換とは、１つのアミノ酸が同種の別のアミノ酸によって置換されたことを指す。例えば、１つの酸性アミノ酸が別の酸性アミノ酸によって置換されたこと、１つの塩基性アミノ酸が別の塩基性アミノ酸によって置換されたこと、又は１つの中性アミノ酸が別の中性アミノ酸によって置換されたことを指す。例示的な置換は下記表Ａに示されるとおりである。
Figure 2022518519000003
一部の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、抗体のグリコシル化の程度が増大又は低減するように改変される。抗体のグリコシル化部位の追加又は欠失は、アミノ酸配列を改変させて１つ以上のグリコシル化部位を産生又は除去することによって容易に実現できる。
例えば、１種以上のアミノ酸置換を行って１つ以上の可変領域フレームワークのグリコシル化部位を解消することによって、当該部位のグリコシル化を解消することができる。このような脱グリコシル化により抗原に対する抗体の親和力を増加させることができる。これに関しては例えば、米国特許第５，７１４，３５０号、第６，３５０，８６１号が参照される。改変を加えたグリコシル化抗体、例えば、フコシル残基の量を減少した低フコシル化抗体又はバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を追加した抗体を製造することができる。このような変えたグリコシル化モデルは既に抗体のＡＤＣＣ能力の向上が示されている。例えば、改変を加えたグリコシル化系の宿主細胞において、抗体を発現させることによって当該糖鎖修飾を実現できる。好ましくは、フコシダーゼを利用して抗体のフコシル残基を切除してもよい。例えば、フコシダーゼα－Ｌ－フコシダーゼを利用して抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６－２３）。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸修飾を導入してＦｃ領域の変異体を産生することによって、がん又は細胞増殖性疾患の治療における抗体の有効性などを増強させることができる。Ｆｃ領域に対する修飾は、アミノ酸変異（置換、欠失、挿入）、グリコシル化と脱グリコシル化、複数のＦｃの追加を含む。Ｆｃに対する修飾により治療抗体における抗体の半減期を改変させることもでき、これによってより低い頻度の投与、利便性の向上と材料使用の低減を実現できる。これに関しては、Ｐｒｅｓｔａ（２００５）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１６：７３１，ｐ７３４－７３５が参照される。
１つの実施形態において、抗体のシステイン残基の数量を改変させて抗体の特性を修飾することができる。例えば、ＣＨ１のヒンジ領域に修飾を行って、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数量を変更（例えば、増加又は減少）させる。当該手法に関する詳細な説明は、米国特許第５，６７７，４２５号に記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数量を変更することによって、軽鎖及び重鎖の組み立てを促進し又は抗体の安定性を向上もしくは低減させることができる。
任意に、本発明の抗体は抗体鎖に対する翻訳後修飾を含む。例示的な翻訳後修飾としては、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は標識成分複合による任意の他の操作が挙げられる。
本発明の１つの実施形態において、本発明の抗体又は断片が人工改変を経た酵母Ｎ－を連結したプロテオグリカン又はＣＨＯ Ｎ－を連結したプロテオグリカンによりグリコシル化される。
一部の実施形態において、本明細書で提供される抗体は、本分野で既知の事項として容易に得られる他の非タンパク質の部分を含有するようにさらに修飾されてもよい。抗体の誘導作用に適した部分の非限定的な例は、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキサン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）、デキストラン又はポリ（ｎ－ビニルピロリドン）、ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセリン）、ポリビニルアルコール、これらの混合物を含む。
本発明は、本発明の抗体又はその断片に対する別種の修飾としてペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）を含む。抗体にペグ化を行って、例えば、生体内（例えば、血清）の抗体の半減期を延長することができる。本明細書で使用される用語「ポリエチレングリコール」には、他のタンパク質への誘導に使用されるＰＥＧ的のいずれかの形態、例えば、モノ（Ｃ１－Ｃ１０）アルコキシ－もしくはアリールオキシポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール－マレイミドを含むことが意図される。いくつかの実施形態において、ペグ化される抗体は非グリコシル化抗体である。本分野で、タンパク質のペグ化の方法が既知の内容であり、例えば、欧州特許ＥＰ０１５４３１６、ＥＰ０４０１３８４に記載のとおり、それを本発明の抗体に用いることができる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子はヒト化されたものである。抗体のヒト化のための各種の方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ＆Ｆｒａｎｓｓｏｎに記載の当該方法の概要は当業者が知っている内容であり、当該内容の全体が引用によって本明細書に組み込まれる（Ａｌｍａｇｒｏ ＪＣ＆Ｆｒａｎｓｓｏｎ Ｊ（２００８）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ１３：１６１９－１６３３）。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子はヒト抗体又はヒト化抗体である。本分野で既知の様々な技術を利用してヒト抗体又はヒト化抗体を製造できる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子はキメラ抗体である。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子のフレームワーク配列の少なくとも一部は、ヒトに共有するフレームワーク配列である。
１つの実施形態において、本発明の抗体分子は、その抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆｖ、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）もしくは（Ｆａｂ’）２、又は線状抗体などの抗体断片をさらに含む。
いくつかの実施形態において、本発明の二重特異性抗体は下記の１種以上の特性を有する。
（１）本発明の二重特異性抗体又はその断片は、２種の抗原と高い親和力で同時に結合し、例えば、約１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ又は２ｎＭ以下、最も好ましくは、約１．９ｎＭ又は１．８ｎＭ以下、いくつかの実施形態において、約１ｎＭ、１．１ｎＭ、１．２ｎＭ、１．３ｎＭ、１．４ｎＭ、１．５ｎＭ、１．６ｎＭ又は１．７ｎＭ以上の平衡解離定数（ＫＤ）でＬＡＧ－３（例えば、ヒトＬＡＧ－３）と結合すると同時に、約１００ｎＭ、９０ｎＭ、８０ｎＭ、７０ｎＭ、６０ｎＭ、５０ｎＭ、４０ｎＭ、３０ｎＭ又は２０ｎＭ以下、最も好ましくは、約１９ｎＭ、１８ｎＭ又は１７ｎＭ以下、いくつかの実施形態において、約１０ｎＭ、１１ｎＭ、１２ｎＭ、１３ｎＭ、１４ｎＭ、１５ｎＭ又は１６ｎＭ以上の平衡解離定数（ＫＤ）でＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１）と結合するが、いくつかの実施形態において、抗体の結合親和力が光干渉による生体測定法（例えば、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ親和力計測）により測定される。
（２）本発明の抗体又はその断片は、例えば、約３ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、１．４ｎＭ、１．３ｎＭ、１．２ｎＭ又は１．１ｎＭ以下のＥＣ５０（いくつかの実施形態において、前記ＥＣ５０が約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、又は１．０ｎＭ以上である）でヒトＰＤ－Ｌ１を発現させた細胞と結合すると同時に、例えば、約３ｎＭ、２ｎＭ、１．５ｎＭ、１．４ｎＭ、１．３ｎＭ、１．２ｎＭ、１．１ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ又は０．５ｎＭ以下のＥＣ５０（いくつかの実施形態において、前記ＥＣ５０が約０．３又は０．４ｎＭ以上である）でヒトＬＡＧ－３を発現させた細胞と結合する。いくつかの実施形態において、前記結合がフローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）により測定される。いくつかの実施形態において、ヒトＬＡＧ－３を発現させた細胞はヒトＬＡＧ－３を発現させた２９３細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）であり、且つ／又は、ヒトＰＤ－Ｌ１を発現させた細胞はヒトＰＤ－Ｌ１を発現させたＣＨＯ細胞（例えば、ＣＨＯＳ細胞）である。
（３）本発明の抗体又はその断片は、良好な熱安定性を有する。いくつかの実施形態において、示差走査蛍光測定法により測定される前記抗体又はその断片のＴｍは約６０℃、６１℃、６２℃又は６３℃以上である。
（４）本発明の抗体又はその断片は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（例えば、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞）を活性化させ、例えば、そのＩＬ－２の発現を促進する。
（５）本発明の抗体又はその断片は、例えば、ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の結合又はＰＤ－Ｌ２とＰＤ－１の結合の阻害、ＣＤ４＋Ｔリンパ球の抗原依存性刺激の増加、Ｔ細胞の増殖増加、活性化抗原（例えば、ＣＤ２５）の発現増加、サイトカイン（例えば、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）又はインターロイキン－４（ＩＬ－４））の発現増加、ケモカイン（例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４又はＣＣＬ５）の発現増加、Ｔｒｅｇ細胞の阻害活性低減、Ｔ細胞ホメオスタシスの向上、腫瘍浸潤リンパ球の増加、又はがん細胞の免疫回避低減などの１種以上が生じるように、ＬＡＧ－３及びＰＤ－Ｌ１の１種以上の活性を抑制する。
（６）本発明の抗体又はその断片は、抗体依存性細胞が介在する細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘発できる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、以下の１つ以上の特性を有する。
（ｉ）ＬＡＧ－３及びＰＤ－Ｌ１に対して、本発明の抗体（例えば、式（Ｉ）のペプチド鎖として配列番号１を含むとともに、式（ＩＩ）のペプチド鎖として配列番号７を含む）と同一又は類似の結合親和力及び／又は特異性を示す。
（ｉｉ）本発明の抗体（例えば、式（Ｉ）のペプチド鎖として配列番号１を含むとともに、式（ＩＩ）のペプチド鎖として配列番号７を含む）とＬＡＧ－３及びＰＤ－Ｌ１の結合を抑制（例えば、競合的に抑制）する。
（ｉｉｉ）本発明の抗体（例えば、式（Ｉ）のペプチド鎖として配列番号１を含むとともに、式（ＩＩ）のペプチド鎖として配列番号７を含む）と同一の又は重複するエピトープと結合する。
（ｉｖ）本発明の抗体（例えば、式（Ｉ）のペプチド鎖として配列番号１を含むとともに、式（ＩＩ）のペプチド鎖として配列番号７を含む）に対して競合的にＬＡＧ－３及びＰＤ－Ｌ１と結合する。
（ｖ）本発明の抗体（例えば、式（Ｉ）のペプチド鎖として配列番号１を含むとともに、式（ＩＩ）のペプチド鎖として配列番号７を含む）の１つ以上の生物学的特性を有する。
ＩＩＩ．免疫複合体
いくつかの実施形態において、本発明は、他の物質と複合した抗体（「免疫複合体」）をさらに含む。いくつかの実施形態において、他の物質は、例えば、細胞傷害剤、免疫抑制剤又は化学療法剤などの治療剤もしくは標識である。細胞傷害剤は、細胞に対して傷害性を有する任意の薬剤を含む。免疫複合体の生成に適した細胞傷害剤（例えば、化学療法剤）の例は、本分野で既知の内容である。
また、本発明の抗体分子は、標識された配列（例えば、ペプチド）と複合することによって精製しやすくなる。好ましい実施形態において、標識されたアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、例えばｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．，９２５９ Ｅｔｏｎ Ａｖｅｎｕｅ，Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，ＣＡ，９１３１１）などにおいて提供された標識であり、そのほとんどは市販品として得ることができる。Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１－８２４に記載のとおり、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質を精製しやすくできる。他の精製用ペプチド標識は、ヘマグルチニン（「ＨＡ」）標識を含むが、これに限定されない。それはインフルエンザウイルスヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３７：７６７）及び「ｆｌａｇ」標識に対応する。
他の実施形態において、本発明の抗体分子は診断剤又は検出可能な試薬と複合する。このような抗体は、臨床検査方法の一部（例えば、特定の療法の効果を確認するため）として、疾患又は病的状態の発生、成立、進行及び／又はその重症度を監視又は予測することができる。このような診断及び検査は、抗体と検出可能な物質をカップリングさせることによって実現でき、前記検出可能な物質は、さまざまな酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、各種の陽電子放出断層撮影法で使用される陽電子放出性金属及び非放射性の常磁性金属イオンを含むが、これらに限定されない。
また、本発明の抗体分子は所定の生物学的反応を調節する治療用部分又は薬物部分と複合できる。治療用部分又は薬物部分は、古典的な化学療法薬に制限されると解釈できない。例えば、薬物部分は、所望の生物学的活性を有するタンパク質、ペプチド又はポリペプチドであってもよい。このようなタンパク質は、例えば、毒素、タンパク質、又は生物学的応答調節物質を含んでもよい。
また、本発明の抗体分子は、例えば、放射性金属イオンなどの治療用部分と複合でき、又は放射金属イオンをポリペプチドと複合させる大環状キレート剤として用いることができる。治療用部分と抗体を複合させる技術は公知の内容であり、例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｏｆ Ｄｒｕｇｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．（編集），ｐ２４３－２５６（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ， Ｉｎｃ．１９８５）より一部抜粋）が参照される。
抗体は、固相支持物に接続されてもよく、前記支持物は特に免疫測定法又は標的抗原の精製に用いられる。このような固相支持物は、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンを含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、前記免疫複合体は、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染、腫瘍などの疾患の予防又は治療に用いられる。例えば、前記疾患は腫瘍（例えばがん）又は感染である。いくつかの実施形態において、腫瘍は腫瘍の免疫回避である。好ましくは、腫瘍は、例えば、結腸がん、結腸直腸がん、又は直腸がんである。
ＩＶ．本発明の核酸とそれを含む宿主細胞
１つの態様において、本発明は、上記任意の抗体、その断片又はそのいずれか１本の鎖をコードする核酸を提供する。１つの実施形態において、前記核酸を含むベクターを提供する。１つの実施形態において、ベクターは発現ベクターである。１つの実施形態において、前記核酸又は前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。１つの実施形態において、宿主細胞は真核細胞である。別の実施形態において、前記宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞もしくは２９３細胞）又は抗体もしくはその抗原結合断片の製造に適した他の細胞から選択される。別の実施形態において、宿主細胞は原核細胞である。
例えば、本発明の核酸は、配列番号１－９のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードする核酸、又は配列番号１－９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸を含む。
本発明は、配列番号１－９のいずれかで示されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸、又は配列番号１－９のいずれかで示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸と、ストリンジェンシー条件においてハイブリダイゼーションされた、又は前記核酸に対して１つ以上の置換（例えば、保存的な置換）、欠失もしくは挿入を有する核酸をさらに含む。
１つの実施形態において、前記核酸を含む１つ以上のベクターを提供する。１つの実施形態において、ベクターは発現ベクターで、例えば、真核発現ベクターである。ベクターの非限定的な例は、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージ又は酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含む。いくつかの実施形態において、ベクターはｐＴＴ５ベクターである。
発現用の発現ベクター又はＤＮＡ配列の用意が完了すると、適切な宿主細胞に発現ベクターをトランスフェクション又は導入することができる。上記の目的を達成するためには、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、レトロウイルス形質導入、ウイルストランスフェクション、パーティクルガン、脂質ベースのトランスフェクション又は他の通常技術など様々な技術を利用できる。プロトプラスト融合を利用する場合、培地において細胞を培養し適切な活性に対してスクリーニングする。産生されたトランスフェクション細胞の培養と産生された抗体分子の単離のための方法と条件は、当業者が知っている内容であり、本明細書に記載の方法と既存の技術により、使用された特定の発現ベクターと哺乳類宿主細胞によって改変又は最適化を行うことができる。
また、トランスフェクションされた宿主細胞に対する選択が可能な１つ以上のマーカーを導入することによって、染色体にＤＮＡが安定的に導入された細胞を選択することができる。前記マーカーは、栄養要求性宿主に原栄養性、殺生物剤（例えば、抗生物質）耐性又は重金属（例えば、銅）耐性などを付与することができる。選択可能な標識遺伝子は発現されるＤＮＡ配列と直接連結することによって、又は同時形質転換により同一の細胞に導入することができる。ｍＲＮＡ合成の最適化のために、他にエレメントを必要とする場合がある。これらのエレメントは、スプライシングシグナル、転写プロモーター、エンハンサー、終結シグナルを含んでもよい。
１つの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含む１種又は複数種の宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、酵母細胞、哺乳動物細胞又は抗体もしくはその抗原結合断片の製造に適した他の細胞から選択される。
適切な宿主細胞は、大腸菌などの原核微生物を含む。宿主細胞は、糸状真菌もしくは酵母などの真核微生物、又は昆虫細胞などのさまざまな真核細胞であってもよい。脊椎動物の細胞も宿主として用いることができる。例えば、懸濁化成長に適したように改変された哺乳類由来の細胞株を使用できる。使用可能な哺乳動物宿主細胞株の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）；ヒト胎児腎臓株（ＨＥＫ ２９３又は２９３Ｆ細胞）、２９３細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ）、犬腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＣＨＯＳ細胞、ＮＳＯ細胞、ＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が挙げられる。タンパク質の産生に適する哺乳動物宿主細胞株に関する概要は、例えば、Ｙａｚａｋｉ＆Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編集，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐ２５５－２６８（２００３）が参照される。１つの好ましい実施形態において、前記宿主細胞はＣＨＯ細胞であり、例えば、ＣＨＯＳ細胞又は２９３細胞であり、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である。
Ｖ．本発明の抗体分子の製造及び精製
１つの実施形態において、本発明は、本発明の抗体分子又はその断片（好ましくは、抗原結合断片）の製造方法を提供する。前記方法は、本発明の抗体分子又はその断片（好ましくは、抗原結合断片）をコードする核酸の発現に適した条件において前記宿主細胞を培養すること、及び任意に前記抗体又はその断片（好ましくは、抗原結合断片）を分離することを含む。ある実施形態において、前記方法は、宿主細胞から本発明の抗体分子又はその断片（好ましくは、抗原結合断片）を単離することをさらに含む。
１つの実施形態において、本発明の抗体分子の製造方法を提供する。前記方法は、抗体の発現に適した条件において、前述したように、前記抗体（例えば、いずれか１本のポリペプチド鎖、及び／又は複数本のポリペプチド鎖）をコードする核酸又は前記核酸の発現ベクターを含む宿主細胞を培養すること、及び任意に前記宿主細胞（又は宿主細胞培地）から前記抗体を単離することを含む。
組換えにより本発明の抗体分子を産生するために、抗体（例えば、上記の抗体、例えば、いずれか１本のポリペプチド鎖、及び／又は複数本のポリペプチド鎖）をコードする核酸を分離し、宿主細胞におけるさらなるクローニング及び／又は発現のために、それを１つ以上のベクターに挿入する。かかる核酸は、通常のプロセスにより分離しシークエンシングすることが容易である（例えば、抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって行う）。
本願に記載のとおり調製された抗体分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなど、既知の従来技術により精製できる。特定のタンパク質を精製するための実際の条件は、正味電荷、疎水性、親水性などの因素にも依存し、これは当業者にとって公知する内容である。本発明の抗体分子の純度は、さまざまな公知する分析方法のいずれかにより決定でき、前記公知する分析方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどを含む。
ＶＩ．測定手法
本分野において既知の様々な測定手法を利用して、本願の抗体分子に対して同定、スクリーニング、又はその物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性の特性評価を行うことができる。１つの態様において、本発明の抗体に対する抗原結合活性の測定は、例えば、ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎブロッティングなどの既知の方法により行われる。本分野において既知の方法を利用して結合対象となる抗原の結合を測定でき、本明細書には、例えば、バイオレイヤー干渉法などの方法が例示的に開示されている。
本発明は、生物学的活性を有する抗体を同定するための測定手法をさらに提供する。生物学的活性は、例えば、抗原結合、細胞表面抗原に対する結合、抗原に対する抑制作用などを含んでもよい。インビボ及び／又はインビトロにおいて、上記の生物学的活性を有する抗体をさらに提供する。
一部の実施形態において、本発明の抗体に対してかかる生物学的活性を測定する。
本発明は、抗体の特性、例えば、薬剤形成性関連特性を同定するための方法をさらに提供する。前記薬剤形成性関連特性は、例えば、熱安定性を含む。
任意の上記インビトロ測定手法に使用される細胞は、天然的に抗原を発現するか、もしくは抗原を発現するように改変された細胞株を含む。かかかる細胞は、抗原を発現する細胞株、及び、通常の状態において抗原が発現されないが、抗原をコードするＤＮＡによりトランスフェクションされた細胞株をさらに含む。
なお、本発明の免疫複合体を利用して本発明の抗体分子を置換え又はそれを補足して、任意の上記の測定手法を実現できる。
なお、本発明の抗体分子と他の活性剤を利用して、任意の上記の測定手法を実現できる。
いくつかの実施形態において、前記抗原は、ＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１）及び／又はＬＡＧ－３（例えば、ヒトＬＡＧ－３）である。
ＶＩＩ．医薬組成物と薬物製剤
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書に記載の任意の抗体分子又はその断片（好ましくは、その抗原結合断片）又はその免疫複合体を含む組成物を提供する。好ましくは、前記組成物は医薬組成物である。１つの実施形態において、前記組成物は、医薬品添加物をさらに含む。１つの実施形態において、組成物、例えば、医薬組成物は、本発明の抗体分子又はその断片もしくはその免疫複合体と、１種以上の追加の治療剤（例えば、化学療法剤、細胞傷害剤、ワクチン、追加の抗体、抗感染症剤、小分子薬物又は免疫調節剤）の組合せとを含む。
いくつかの実施形態において、前記組成物は、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染、腫瘍などの疾患の予防又は治療に用いられる。例えば、前記疾患は腫瘍（例えばがん）又は感染である。いくつかの実施形態において、腫瘍は腫瘍の免疫回避である。好ましくは、腫瘍は、例えば、結腸がん、結腸直腸がん、又は直腸がんである。
本発明は、本発明の抗体又はその免疫複合体を含む組成物（医薬組成物又は薬物製剤を含む）、及び／又は本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む組成物（医薬組成物又は薬物製剤を含む）をさらに含む。いくつかの実施形態において、組成物は、１種以上の本発明の抗体又はその断片、又は１種以上の本発明の抗体又はその断片をコードする１種以上のポリヌクレオチドを含む。
これらの組成物はまた、本分野で既知の薬用ベクター、緩衝剤を含む薬用賦形剤などの適切な医薬品添加物を含んでもよい。
本願で使用される「薬用ベクター」は、生理学的に適合性がある溶剤、分散媒体、等張剤、吸収遅延剤などのいずれか又はその全てを含む。本発明に適する薬用ベクターは、石油、動物もしくは植物に由来する又は合成された、ピーナッツオイル、大豆油、鉱油、ごま油など、水、油などの滅菌液体であってもよい。医薬組成物を静脉内に投与する場合、水はベクターとして好ましい。さらに、生理塩水溶液、水性デキストロースとグリセリン溶液を液体ベクターとして、特に注射溶液に用いることができる。
適切な賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセリン、プロピレン、ジオール、水、エタノールなどを含む。賦形剤の使用及びその用途に関しては、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」，５ｔｈ ｅｄｉｔｏｎ，Ｒ．Ｃ．Ｒｏｗｅ，Ｐ．Ｊ．Ｓｅｓｋｅｙ、Ｓ．Ｃ．Ｏｗｅｎ，ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＰｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｃｈｉｃａｇｏが参照される。
必要があれば、前記組成物は湿潤剤、乳化剤、又はｐＨ緩衝剤をさらに少量に含有してもよい。これらの組成物は、溶液、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、持続性放出製剤などの形態を採用できる。経口製剤は、薬用マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンなどの標準的な薬用ベクター及び／又は賦形剤を含んでもよい。
本発明の組成物は、さまざまな形態で存在することができる。これらの形態は、液体、半固体及び固体の剤型、例えば、液体溶液剤（例えば、注射用溶液剤、輸注用溶液剤）、分散体剤もしくは懸濁剤、リポソーム剤及び坐剤を含む。好ましい形態は、所望の投与モードと治療用途によって決定する。一般的に好ましくは、組成物が注射用溶液剤、輸注用溶液剤の形態である。好ましい投与モードは、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内）注射である。１つの好ましい実施形態において、抗体分子は静脈内輸注又は注射により投与される。別の好ましい実施形態において、抗体分子は筋肉内、腹腔内又は皮下注射により投与される。
所定の純度を有する本発明の抗体を１種以上の任意の医薬品添加物（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｏｓｏｌ，Ａ．（１９８０））と混合することによって、本明細書に記載の抗体を含む薬物製剤、好ましくは凍結乾燥製剤又は水性製剤を製造できる。
例示的な凍結乾燥抗体製剤に関する説明は、米国特許第６，２６７，９５８号が参照される。水性抗体製剤に関しては、米国特許第６，１７１，５８６号、世界特許ＷＯ２００６／０４４９０８が参照され、後者の製剤はヒスチジン－アセテート緩衝剤を含む。
本発明の医薬組成物又は製剤は、１種以上の活性成分をさらに含んでもよい。前記活性成分は、特定の適応症の治療に必要であり、好ましくは互いにマイナスの影響を与えない活性的に相補な活性成分を含む。例えば、好ましくは、例えば、化学療法剤、細胞傷害剤、ワクチン、追加の抗体、抗感染症剤、小分子薬物又は免疫調節剤などの追加の治療剤をさらに提供する。前記活性成分は、目的用途において有効な量で適切に組合せた形で存在する。
いくつかの実施形態において、治療剤は、以下のカテゴリ（ｉ）～（ｉｉｉ）の１つ、２つ又は全てから選択される。（ｉ）抗原提示（例えば、腫瘍抗原提示）を強化させる薬物、（ｉｉ）エフェクター細胞反応（例えば、Ｂ細胞及び／又はＴ細胞活性化及び／又は動員）を強化させる薬物、又は（ｉｉｉ）免疫抑制を低減させる薬物。
持続性放出製剤として製造できる。持続性放出製剤の適切な例は、抗体を含有する疎水性固体ポリマーによる半透性マトリックスを含み、前記マトリックスは、フィルム又はマイクロカプセルなどのように一定の形態を有する。
本発明の医薬組成物は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、直腸投与、脊髄投与又は表皮投与（例えば、注射又は輸注）に適する。
治療用組成物は一般に、滅菌されたものであり、しかもその製造・保管条件において安定している。組成物は溶液、マイクロエマルション、分散体、リポソーム又は凍結乾燥物の形態として調製することができる。活性化合物（即ち抗体分子）を所定の量で適切な溶剤に加え、次に濾過・消毒することによって、滅菌された注射用溶液剤を調製することができる。一般には、前記活性化合物を滅菌溶媒に混入することによって分散体を調製し、前記滅菌溶媒は基礎となる分散媒体と他の成分を含む。レシチンなどのコーティング剤を用いることができる。分散体である場合は、界面活性剤を用いて溶液剤に適切な流動性を維持できる。吸収を遅延させる物質、例えばモノステアレート、ゼラチンを組成物に含有させることによって注射用組成物の吸収を引き伸ばすことができる。
本願に記載の抗体分子を含む試薬キットも本発明の範囲内である。試薬キットは、１つ又は複数の他の要素を含んでもよく、例えば、包装付加頁、マーカー又はカップリング用試薬などの他の試薬、薬学的に許容可能なベクター、対象への投与のための装置もしくは他の材料を含む。
ＶＩＩＩ．組合せ製品又は試薬キット
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体、その抗原結合断片、又はその免疫複合体、及び１種以上の追加の治療剤（例えば、化学療法剤、追加の抗体、細胞傷害剤、ワクチン、抗感染症剤、小分子薬物又は免疫調節剤など）を含む組合せ製品をさらに提供する。いくつかの実施形態において、前記組合せ製品は、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染、腫瘍などの疾患の予防又は治療に用いられる。例えば、前記疾患は腫瘍（例えばがん）又は感染である。いくつかの実施形態において、腫瘍は腫瘍の免疫回避である。好ましくは、腫瘍は、例えば、結腸がん、結腸直腸がん、又は直腸がんである。いくつかの形態において、前記組合せ製品における２種以上の成分は、対象に対して連続投与、別々投与、又は同時併用投与してもよい。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体、医薬組成物、免疫複合体又は組合せ製品を含む試薬キット、及び任意の投与指導用包装付加頁をさらに提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体、医薬組成物、免疫複合体、組合せ製品を含む薬物製品をさらに提供する。任意に前記薬物製品は、投与指導用包装付加頁をさらに含む。
ＩＸ．本発明の抗体分子の用途
１つの様態において、本発明は、本発明の抗体分子を利用して、免疫応答の調節が必要な対象の疾患をインビボで治療又は予防することで、がん性腫瘍、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染性疾患などの関連疾患の発生又は再発を抑制又は減少する。本発明の抗体分子は単独で使用できる。必要に応じて、抗体分子は、他の療法（例えば、治療剤／予防剤／治療法）と組合せて投与されてもよい。本発明の抗体分子が１種又は複数種の他の医薬品と組合せて投与される場合は、この組合せが任意の順番で連続投与、別々投与、又は同時投与されてもよい。
したがって、１つの実施形態において、本発明は、対象における免疫応答を調節する方法を提供し、前記方法は、本願に記載の抗体分子を治療的有効量で対象に投与することを含む。別の実施形態において、本発明は、対象における疾患の発生又は再発を防止する方法を提供し、前記方法は本願に記載の抗体分子を予防的有効量で対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態において、前記疾患は、患者に（例えば、上昇レベルの、例えば、タンパク質又は核酸レベルの）ＬＡＧ－３を有する疾患である。いくつかの実施形態において、前記疾患は、患者に（例えば、上昇レベルの、例えば、タンパク質又は核酸レベルの）ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ２を有する疾患である。いくつかの実施形態において、前記疾患は、患者に（例えば、上昇レベルの、例えば、タンパク質又は核酸レベルの）ＬＡＧ－３及びＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ２を有する疾患、例えば、がんである。いくつかの実施形態において、前記疾患は、核酸又はタンパク質レベルのＬＡＧ－３及び／又はＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ２の抑制から利益を受ける疾患である。いくつかの実施形態において、前記疾患は、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合の阻害、又はＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２の結合の阻害から利益を受ける。
いくつかの実施形態において、本発明は、個体における抗原作用の抑制方法に関する。当該方法は、有効量の本発明の抗体分子（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１／ＬＡＧ３抗体）、医薬組成物、免疫複合体、組合せ製品又は試薬キットを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記抗原は、ＬＡＧ－３（例えば、ヒトＬＡＧ－３）及び／又はＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１）である。いくつかの実施形態において、抗原作用の抑制とは、ＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合の阻害、又はＰＤ－１とＰＤ－Ｌ２の結合の阻害、及び／又はＬＡＧ－３作用の抑制である。
別の態様において、本発明は、対象における腫瘍（例えば、がん）の予防又は治療の方法に関する。前記方法は、有効量の本発明の抗体分子、医薬組成物、免疫複合体、組合せ製品又は試薬キットを前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、腫瘍は腫瘍の免疫回避である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍はがんである。
別の態様において、本発明は、対象における感染性疾患の予防又は治療の方法に関する。前記方法は、有効量の本発明の抗体分子、医薬組成物、免疫複合体、組合せ製品又は試薬キットを前記対象に投与することを含む。別の態様において、本発明は、対象における自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患の予防又は治療の方法に関する。前記方法は、有効量の本発明の抗体分子、医薬組成物、免疫複合体、組合せ製品又は試薬キットを前記対象に投与することを含む。
前記対象は、霊長類などの哺乳類であってもよい。好ましくは、人間（例えば、本明細書に記載の疾患に罹患しているか又は本明細書に記載の疾患に罹患するリスクのある患者）などの高等霊長類である。１つの実施形態において、前記対象は本明細書に記載の疾患（例えば、本明細書に記載の腫瘍、感染又は自己免疫疾患）に罹患しており、又は本明細書に記載の疾患に罹患するリスクがある。いくつかの実施形態において、対象は、例えば、化学療法治療及び／又は放射線治療などの他の治療を受けるか、又は既に前記治療を受けている。好ましくは、前記対象には感染により免疫不全が生じ、又は感染により免疫不全になるリスクがある。
いくつかの実施形態において、抗体分子を用いて治療及び／又は予防するがんは、固形腫瘍、血液がん及び転移性病巣を含むが、これらに限定されない。１つの実施形態において、前記がんは固形腫瘍である。固形腫瘍の例は、悪性腫瘍を含む。がんは、早期、中期又は末期にあるがん又は転移性がんであってもよい。
本発明の方法と組成物は、前記がんに関連する転移性病巣の治療に用いることができる。
いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、（例えば、上昇レベルの）ＬＡＧ－３を発現する腫瘍、例えば、がんである。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、（例えば、上昇レベルの）ＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍、例えば、がんである。いくつかの実施形態において、前記腫瘍は、（例えば、上昇レベルの）ＬＡＧ－３及びＰＤ－Ｌ１を発現する腫瘍、例えば、がんである。
いくつかの実施形態において、抗体分子を用いて治療及び／又は予防する感染性疾患は、効果的なワクチンがない病原体、又は一般的なワクチンでは十分な効果が得られないような病原体を含む。本発明で例示される抗体分子によるＰＤ－Ｌ１阻害作用は、感染が発展するに伴い、変異抗原が生じる病原体が引き起す感染には特に利用できる。これらの変異抗原は、本発明の抗体が投与されると、外来抗原とみなされ、それによって、本発明で例示される抗体分子は、負のシグナルにより抑制されない強烈なＴ細胞反応をＰＤ－Ｌ１を介して活性化させることができる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子を用いて炎症性・自己免疫疾患及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）を治療及び／又は予防し、免疫系をダウンレギュレートする。
他の態様において、本発明は、薬物を生産又は製造するための、抗体分子、その断片、その免疫複合体、組成物、組合せ製品又は試薬キットの用途を提供する。前記薬物は、本明細書で言及される関連疾患又は病的状態の治療に用いられる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体、抗体断片、免疫複合体、組成物、組合せ製品又は試薬キットは、病的状態及び／又は病的状態に関連する症状の出現を遅延することができる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体、医薬組成物、免疫複合体、組合せ製品又は試薬キットは、本発明に係る予防及び／又は治療のために、１種以上の他の療法、例えば、治療法及び／又は追加の治療剤と組合せて投与することができる。
いくつかの実施形態において、治療法は、外科手術、放射線治療、局所照射又は集中的照射などを含む。いくつかの実施形態において、治療剤は、化学療法剤、細胞傷害剤、ワクチン、追加の抗体、抗感染症剤又は免疫調節剤から選択される。
ワクチンの非限定的な例はがんワクチンを含む。前記ワクチンとしては、ＤＮＡによるワクチン、ＲＮＡによるワクチン又はウイルス形質導入によるワクチンが挙げられる。前記がんワクチンは、予防用であってもよいし、又は治療用であってもよい。
抗感染症剤の非限定的な例は、抗ウイルス剤、抗真菌剤、抗原生動物剤、抗細菌剤を含むが、これらに限定されない。
さらに、いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその断片は、チロシンキナーゼ抑制剤と組合せて投与されてもよい。
本発明の任意の方法に係るいくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその断片の投与と、腫瘍抗原の投与とを組み合せる。抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌由来抗原、又は病原体由来抗原である。いくつかの実施形態において、前記腫瘍抗原はタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、前記腫瘍抗原は核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記腫瘍抗原は腫瘍細胞である。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその断片は、抗腫瘍剤と併用して投与されてもよい。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその断片は、サイトカインと併用して投与されてもよい。サイトカインは本発明の抗体分子との融合分子として投与されてもよく、又は単独の組成物として投与されてもよい。１つの実施形態において、本発明の抗体は、１種、２種、又は３種以上のサイトカイン（例えば、融合分子として、又は単独の組成物として）と組合せて投与される。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその断片は、本分野の通常の抗がん療法と組合せることができる。通常の抗がん療法は、（ｉ）放射線治療又は電離放射線によるがん細胞の死滅と腫瘍の縮小であって、放射線治療は外部照射療法（ＥＢＲＴ）又は内部近接照射療法により行われる抗がん療法、（ｉｉ）化学療法、又は細胞毒性薬の使用であって、一般的に迅速に分裂する細胞に影響を与える抗がん療法、（ｉｉｉ）標的療法、又はがん細胞タンパク質が脱調節するように特異的な影響を与える薬剤、（ｉｖ）免疫療法、又は宿主免疫応答の増強（例えば、ワクチン）、（ｖ）ホルモン療法、又はホルモン系阻害剤（例えば、ホルモン感受性の腫瘍に対して）、（ｖｉ）血管新生抑制剤、又は血管の形成と成長の阻害、及び（ｖｉｉ）緩和ケア、又はより強烈な治療計画が実施できるように、ケアの質の改善により、痛み、悪心、嘔吐、下痢、出血を軽減する治療、を含むが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本発明の抗体又はその断片は、宿主の免疫機能を増強するための通常の方法と組合せることができる。
上記の各種の療法の組合せは、治療に際しさらに組合せることができる。
このような療法の組合せは、併用投与（２種以上の治療剤が同一の製剤に含まれ、又は別々の製剤に含まれる）、別々の投与を含む。後者の場合は、本発明の抗体の投与は、別の療法、例えば、治療法及び／又は治療剤の前に、それと同時に、及び／又はその後に行われる。抗体分子の投与及び／又は他の療法、例えば、治療剤の投与又は治療法は、活動性疾患の活動期、寛解期、又は活動性が低い非活動期のいずれかにおいて行われる。抗体分子は、他の治療の前に、他の治療と同時に、他の治療後に、又は疾患の寛解期に投与されてもよい。
１つの実施形態において、本発明の抗体の投与と他の療法（例えば、治療法又は治療剤の投与）は約１か月間以内、又は約１週間以内、２週間以内もしくは３週間以内、又は約１日間以内、２日間以内、３日間以内、４日間以内、５日間以内、もしくは６日間以内に行われる。
なお、本発明の免疫複合体、組成物、組合せ製品又は試薬キットを利用して本発明の抗体を置換え又はそれを補足して、任意の治療を実現できる。
本発明の抗体（及びそれを含む医薬組成物又は免疫複合体、任意の追加の治療剤）は、非経口投与、肺内投与、鼻腔内投与を含む任意の適切な方法により投与されてもよく、且つ、局所治療の場合は、病巣内に投与されてもよい。非経口注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与又は皮下投与を含む。なお、投与期間の長さによって、例えば、静脈内注射投与又は皮下注射投与などの注射を含む任意の適切な経路にすることができる。本発明において、非限定的であるが、単回投与又は複数の時刻での複数回投与、ボーラス投与、パルス療法などの様々な頻度の投与が含まれる。
本発明の抗体は、疾患の予防又は治療に用いられる場合、その適切な投与量（単独で投与される場合又は１種以上の追加の治療剤と組合せて投与される場合）が、治療対象疾患の種類、抗体のタイプ、疾患の重症度とその経過、前記抗体の投与が予防目的であるか治療目的であるか、これまでの治療歴、患者の臨床病歴、前記抗体に対する応答、主治医の判断によって決定される。前記抗体は、単回の治療として、又は一連の治療において患者に適切に投与される。
本発明の抗体分子の投与量と投与計画は、当業者が決定してもよい。いくつかの実施形態において、所望の反応（例えば、治療反応）が得られるように、投与計画を調整する。例えば、ボーラス投与してもよいし、治療の段階によって異なる投与量で投与されてもよいし、又は疾患の重症度によって、投与量を適宜減少又は増加してもよい。特に、投与量と投与の一様性が保証しやすいように、１回投与量分の形態で非経口組成物として製造されることが好ましい。本明細書で使用される「１回投与量分の形態」とは、治療対象に対する１回の投与量分として適する物理的に分離しているユニットを指す。各ユニットは、所定の量の活性化合物を含有し、前記所定の量は、所定の薬用ベクターと結合すると所望の治療効果が得られるように算出される。本発明における１回投与量分の形態は、その仕様が（ａ）活性化合物の特性と達成したい特定の治療効果、（ｂ）感受性の個体における当該活性化合物の混合による治療に関する特定の制限によって決定される。
Ｘ．診断と検出のための方法と組成物
いくつかの実施形態において、本発明の任意の抗体又はその抗原結合断片は、生体試料におけるそれと結合される抗原の存在を検出するために用いることができる。本明細書で使用される用語「検出」は、定量的検出又は定性的検出を含み、例示的な検出方法としては、免疫組織化学、免疫細胞化学、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）、抗体分子複合磁気ビーズ、ＥＬＩＳＡ測定手法、ＰＣＲ－技術（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）が挙げられる。一部の実施形態において、生体試料は、血、血清又は生物に由来するその他の液体試料である。一部の実施形態において、生体試料は細胞又は組織を含む。いくつかの実施形態において、生体試料は過剰増殖性の病巣又はがん性病巣に由来する。
１つの態様において、本発明は、血清、精液、尿又は組織生検試料（例えば、過剰増殖性又はがん性の病巣に由来する）などの生体試料中の関連抗原の存在をインビトロ又はインビボで検出する診断方法を提供する。該診断方法は、（ｉ）相互作用が生じることが認められる条件において、試料（必要に応じて、対照試料）を本願に記載の抗体分子と接触させ、又は対象に前記抗体を投与することと、（ｉｉ）前記抗体と試料（必要に応じて、対照試料）による複合物の形成を検出することとを含む。複合物が形成される場合、関連抗原が存在することを示し、本願に記載の治療及び／又は予防の適合性又はその必要性も示唆される。
１つの実施形態において、本発明の抗体を利用して疾患の診断を行い、例えば、対象における本明細書に記載の疾患（例えば、腫瘍又は感染）の治療又は進行、その診断及び／又は病期の評価（例えば、監視）を行うことができる。いくつかの実施形態において、標識された本発明の抗体を提供する。標識の非限定的な例は、直接的に検出される標識又は部分（例えば、蛍光標識、発色団標識、高電子密度標識、化学発光標識、放射性標識）と、酵素触媒反応又は分子間の相互作用などにより間接的に検出される部分（例えば、酵素又はリガンド）とを含む。標識の非限定的な例は、放射性同位体、例えば、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉなど、フルオロフォア、例えば、希土類キレートもしくはフルオレセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル（ｄａｎｓｙｌ）、ウンベリフェロン（ｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃｅｒｉｆｅｒａｓｅ）、例えば、ホタル由来ルシフェラーゼ、細菌由来ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、フルオレセイン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、炭水化物オキシダーゼ、例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、グルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、複素環オキシダーゼ、例えば、尿酸オキシダーゼ、キサンチンオキシダーゼ、過酸化水素染料前駆体からなる酵素、例えば、ＨＲ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼ（ｍｉｃｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）、ビオチン／アビジン、スピン標識、ファージ標識、安定的なフリーラジカルなどを含む。
本明細書に記載の任意の発明のいくつかの実施形態において、試料が本発明の抗体による治療前に取得される。いくつかの実施形態において、前記試料はがんの転移後に取得される。いくつかの実施形態において、試料はホルマリンで固定され、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）されている。いくつかの実施形態において、前記試料は生検（例えば、コア生検）検体、手術標本（例えば、手術切除による標本）、又は吸引物である。
いくつかの実施形態において、治療前、例えば、治療を開始する前、又は治療間隔がある場合は、治療を再開する前に関連抗原を検出する。
いくつかの実施形態において、関連抗原のレベル及び／又は分布をインビボで決定し、例えば、検出可能な物質で標識された本発明の抗体分子を、非侵襲的方式（例えば、適切なイメージング技術（例えば、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）による走査）により検出する。１つの実施形態において、例えば、ＰＥＴ試薬（例えば、１８Ｆ－フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ））を用いて検出可能な方式で標識された本発明の抗体分子を検出することによって、関連抗原のレベル及び／又は分布をインビボで測定する。
１つの実施形態において、本発明は、本願に記載の抗体分子と、取扱説明書とを含む診断キットを提供する。
いくつかの実施形態において、疾患の治療方法を提供する。前記方法は、対象（例えば、試料）（例えば、がん細胞を含む対象の試料）に関連抗原の存在を検出することによって、関連抗原の値を決定することと、関連抗原の値を対照値（例えば、健康個体における関連抗原の値）と比較し、関連抗原の値が対照値を上回る場合、対象に対し、任意の１種以上の他の療法と組合せて、治療有効量の本発明の抗体を投与することによって、疾患を治療することとを含む。
いくつかの実施形態において、抗原は、ＰＤ－Ｌ１（例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１）及び／又はＬＡＧ－３（例えば、ヒトＬＡＧ－３）である。
なお、例えば、疾患、治療剤、治療法及び投与などの、本発明の各部分に記載の各実施形態は、本発明の他の部分の実施形態にも適し、或いは他の部分の実施形態と組合せることができる。本発明の各部分に記載の抗体分子に適する特性、用途、及び方法などの実施形態は、抗体を含む組成物、複合体、組合せ製品及び試薬キットなどにも適する。
以下の実施例を本発明の理解を補助するように説明する。如何なる形式で実施例を、本発明の保護範囲を制限するものと解釈すべきではない。
実施例１．抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の構築
本実施例において、図１に示される構造の抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体が構築された。なお、抗原ＡはＬＡＧ－３であり、抗原ＢはＰＤ－Ｌ１である。
二重特異性抗体の具体的な配列は下記の通りである。
ＶＬ： 配列番号８
ＶＬ－ＣＬ、即ちペプチド鎖＃２：配列番号７
リンカー： 配列番号５
ＶＨ： 配列番号２
ＣＨ１： 配列番号３
Ｆｃ、即ちＣＨ２－ＣＨ３：配列番号４
ＶＨＨ： 配列番号６
ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－ＶＨＨ、即ちペプチド鎖＃１：配列番号１
実施例２．抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の発現、精製及び分析
本実施例において、実施例１で構築された抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のペプチド鎖＃１、ペプチド鎖＃２をコードするヌクレオチド配列をそれぞれポリクローナルサイトによって真核発現ベクターｐＴＴ５の市販品に組み入れ、真核細胞において発現させて精製することによって、抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰを得た。操作は具体的に以下のとおりである。
二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰの上記の各ペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列の合成を蘇州金唯智生物科技有限公司（Ｇｅｎｅｗｉｚ）に依頼した。適切な制限酵素とリガーゼを用いて、合成されたペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列をそれぞれベクターｐＴＴ５に接続させることによって、それぞれペプチド鎖をコードする前記ヌクレオチド配列を含む組換えベクターを得た。
前記組換えベクターは、シーケンシングしてその正確性が確認され、後続の発現に用いる。
ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）をＥｘｐｉ２９３細胞培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社から購入）において継代培養した。トランスフェクションの前日に細胞培養物を遠心分離させて、細胞沈殿物を得た。新鮮なＥｘｐｉ２９３細胞培養液で細胞を懸濁させて、細胞密度を１×１０６個の細胞／ｍｌに調整する。引き続きＨＥＫ２９３細胞を培養し、トランスフェクション当日に培養物中の細胞密度を約２×１０６個の細胞／ｍｌにさせる。
ＨＥＫ２９３細胞懸濁液の最終体積の１／１０に相当するＦ１７培地（Ｇｉｂｃｏ社から購入、製品カタログ番号はＡ１３８３５－０１）をトランスフェクション緩衝液とする。１ｍＬのトランスフェクション緩衝液当たり、上記のとおりに調製された、それぞれペプチド鎖＃１又はペプチド鎖＃２をコードするヌクレオチド配列を含むモル比１：１の組換えプラスミド２００μｇを加え、均一に混合し、次にポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ（ＰＥＩ））（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号：２３９６６）３０μｇを加えて、均一に混合し、室温で１０分間インキュベートした後、ＰＥＩ／ＤＮＡ混合物をＨＥＫ２９３細胞懸濁液に徐々にデカントした。軽く混合させて均一になると、８％ＣＯ２、３６．５℃において一晩培養した。
一晩培養した後、培養フラスコに、トランスフェクション後の培養物の体積の１／５０で濃度が２００ｇ／ＬのＦＥＥＤ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号：Ｈ６７８４－１００Ｇ）と、トランスフェクション後の培養物の体積の１／５０で濃度が２００ｇ／Ｌのグルコース溶液を追加し、軽く混合させて均一になると、８％ＣＯ２、３６．５℃において引き続き培養した。２０時間後に、最終濃度が２ｍＭ／ＬになるようＶＰＡ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：１１１４０－０５０）を加えた。７日目まで又は細胞活性≦６０％となるまで連続的に培養すると、培養物を収集して、７５００回転／分で３０分間遠心分離し、細胞の上清を取り分けて、ＳＡＲＴＯＰＯＲＥ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号：５４４１３０７Ｈ４）で濾過した後、ＡＫＴＡｐｕｒｅシステム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）においてアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
アフィニティークロマトグラフィーによる精製の操作ステップは具体的に下記の通りである。
１）アフィニティ精製：
ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号：１７－５４３８－０３）アフィニティークロマトグラフィーカラムを使用し、ＡＫＴＡｐｕｒｅシステムに配置した。０．１Ｍ ＮａＯＨを用いてＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅアフィニティークロマトグラフィーカラムが装備されたＡＫＴＡｐｕｒｅシステムから、一晩かけてエンドトキシンを除去した。試料単離の当日に細胞を７５００ｒｐｍ／ｍｉｎで３０ｍｉｎ遠心分離させて、ＳＡＲＴＯＰＯＲＥ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、５４４１３０７Ｈ４）により濾過した。
その後、カラムの体積の５倍の結合緩衝液（Ｔｒｉｓ ２０ｍＭ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、ｐＨ７．２）でシステムを洗浄してカラムを平衡化した。上記のように濾過後の細胞上清はカラムに通した。カラムの体積の５～１０倍の結合緩衝液で再度平衡化し、ＡＫＴＡｐｕｒｅシステムに装備された紫外線検出装置を用いてＵＶ基線が直線となるまで監視した。
次に、溶出緩衝液（クエン酸＋クエン酸ナトリウム１００ｍＭ、ｐＨ３．５）を用いて抗体を溶出し、紫外線吸収値に基づいて試料を収集した。収集液は１ｍｌ当たりに中和緩衝液（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ２Ｍ）８０μｌを加えて中和させておいた。
２）緩衝液交換：
サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ；ＳＥＣ）を利用して、収集された各レベルのサブチューブ中の試料の純度を検出した。
精製後の二重特異性抗体溶液に対して、１５ｍｌ限外濾過遠心分離管において４５００回転／分で３０分間遠心分離した。ＰＢＳでタンパク質を希釈して、次に４５００回転／分で３０分間遠心し、該操作を２回繰り返すことによって、緩衝液を交換した。緩衝液が交換された抗体を合わせて、抗体濃度を測定した。ＳＥＣ結果はそれぞれ図２に示されるように、ＩＧＮ－ＬＰ純度が比較的に高く、その単一メインピーク純度が９８．９９％である。
後続の実験では、得られた抗体を選択してさらに研究した。
実施例３．抗ＬＡＧ－３抗体ＡＤＩ－３１８５３の生産及び精製
本分野の通常の方法を利用して、抗ＬＡＧ－３抗体ＡＤＩ－３１８５３の軽鎖アミノ酸配列と重鎖アミノ酸配列（配列番号７と配列番号１９）をコードするｃＤＮＡをそれぞれ発現ベクターｐＴＴ５にクローニングする。
メーカーが提供する方法に従って、目的抗体遺伝子を含有する上記発現ベクターとトランスフェクション試薬ＰＥＩ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を培養されたヒト胎児腎２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性トランスフェクションし、トランスフェクション完了後、培地を捨て、新鮮なＥＸＰＩ２９３培地（Ｇｉｂｃｏ）で４×１０６の細胞を／ｍｌに希釈する。３７℃、５％ＣＯ２の条件において、細胞を７日間培養し、４８時間ごとに新鮮な培地を流加する。７日後に、１３００ｒｐｍで２０ｍｉｎ遠心分離する。上清液を採取し、抗体の純度が９５％を上回るように、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａで上清液を精製した。
ＺＬ２０１７１０６５７６６５．３の方法により抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体を得た。
実施例４．二重特異性抗体及び抗原の結合活性の検出
Ｏｃｔｅｔシステム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ社製）を用いて動力学的結合測定法により本発明で調製される例示的な抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰがＬＡＧ－３及びＰＤ－Ｌ１と結合する時の平衡解離定数（ＫＤ）を測定した。関連の文献で報告された方法（Ｅｓｔｅｐ，Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ａｎｔｉｇｅｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｄ ｅｐｉｔｏｐｅ ｂｉｎｎｉｎｇ．ＭＡｂｓ，２０１３、５（２）：ｐ２７０－２７８）に基づいてＦｏｒｔｅＢｉｏ親和力測定を行った。簡単に言えば、
１）センサ準備：実験開始の３０分間前に、ＡＨＱセンサ（Ｐａｌｌ、カタログ番号：１５０６０９１）をＳＤ緩衝液（ＰＢＳ １×、ＢＳＡ ０．１％、ポリソルベート２０ ０．０５％）に浸漬して室温で平衡化した。
２）黒色ポリスチレン製のハーフボリューム９６ウェルマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）のウェルにそれぞれ空白対照（背景除去用）としてＳＤ緩衝液１００μｌと、１００ｎＭの精製された二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰ １００μｌ及び対照として抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体（ＺＬ２０１７１０６５７６６５．３）と、抗ＬＡＧ－３抗体ＡＤＩ－３１８５３（実施例３に示される調製）と、抗原としてＳＤ緩衝液によって希釈されたヒトＰＤ－Ｌ１－ｈｉｓ（１００ｎＭ）及びヒトＬＡＧ－３－ｈｉｓ（１００ｎＭ）（いずれも義翹神州製）の溶液１００μｌと、を加えた。抗ヒトＩｇＧ ＦｃバイオセンサＡＨＱを、それぞれ前記抗体溶液を含むウェルに室温で６００秒間浸漬した後、ローディングした。次に、センサをＳＤ緩衝液において基線となるまで洗浄し、次に１００ｕｌの抗原溶液を含むウェルに没入し、抗体と抗原の結合を監視した。次にセンサを、ＳＤ緩衝液１００ｕｌを含むウェルに移して、抗体の解離を監視した（運転ステップ及び時間の設定：Ｂａｓｅｌｉｎｅ、Ｌｏａｄｉｎｇ～１ｎｍ、Ｂａｓｅｌｉｎｅ、ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎとＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ時間が試料の結合、解離速度に決められる）。回転数は４００回転／分であり、温度は３０℃である。Ｏｃｔｅｔ分析ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて、背景修正後の結合曲線と解離曲線を当てはめして、結合（ｋｏｎ）及び解離（ｋｄｉｓ）の速度定数を生成し、後に平衡解離定数（ＫＤ）の算出するにこれらを用いる。表１及び表２には、抗原ＬＡＧ－３又はＰＤ－Ｌ１に対する二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰのｋｏｎ、ｋｄｉｓとＫＤデータが示されている。
Figure 2022518519000004
Figure 2022518519000005
上記表に示されるように、ＩＧＮ－ＬＰは、ＰＤ－Ｌ１及びＬＡＧ－３タンパク質と同時に結合でき、且つ親抗体の親和力定数を維持している。
実施例５．本発明の抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体と、ＬＡＧ－３又はＰＤ－Ｌ１を過剰発現させた細胞との結合の分析
本発明の抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰと、ＬＡＧ－３又はＰＤ－Ｌ１を過剰発現させた細胞との結合をＦＡＣＳにより計測した。
簡単に言えば、ＥｘｐｉＣＨＯＴＭ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ Ｋｉt（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号：Ａ２９１３３）を用いて、メーカーが提供する取扱説明書に従って下記の通りに操作した。
ポリクローナルサイトＭＣＳにクローニングされたヒトＬＡＧ－３又はヒトＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）を持つｐＣＨＯ１．０ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をそれぞれＨＥＫ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）細胞及びチャイニーズハムスター卵巣がん細胞（ＣＨＯＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にトランスフェクションすることによって、ヒトＬＡＧ－３を過剰発現させた２９３細胞（２９３－ＬＡＧ－３）及びＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯＳ細胞（ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１）を産生した。
二重特異性抗体が細胞の表面に発現される抗原と結合できるかどうかを検証するために、本研究ではフローサイトメトリーを用いて、二重特異性抗体と２９３－ＬＡＧ－３又はＣＨＯＳ－ＰＤ－Ｌ１細胞との結合について検出した。実験手順は下記の通りである。
１）２９３－ＬＡＧ－３／ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞を計数して、細胞培地を用いて１×１０６個の細胞／ｍｌとなるまで希釈し、１００μｌ／ウェルでＵ底９６ウェルプレートに加えた。
２）検出ステップ：遠心分離機において４００ｇで５分間遠心分離して、細胞培地を除去した。階段希釈された本発明の二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰ １００μｌ、対照としてヒト化Ｎｂ－Ｆｃ、抗ＬＡＧ－３抗体ＡＤＩ３１８５３をそれぞれＵ底プレートに加えて細胞を再懸濁させ、氷上に３０分間静置した。４００ｇで５分間遠心分離して、上清を除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄して、未結合の抗体を取り除いた。４００ｇで５分間遠心分離して、ＰＢＳを除去した。１：２００で希釈したＰＥに複合した抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）１００μｌを各ウェルに加えて、遮光下、氷上に３０分間インキュベートした。４００ｇで５分間遠心分離して、上清を除去した。ＰＢＳで細胞を１回洗浄して、未結合のＰＥと複合した抗ヒトＦｃ抗体を取り除いた。ＰＢＳ １００μｌで細胞を再懸濁させ、ＦＡＣＳにより抗体と細胞の結合を検出した。
検出結果は図３に示されるように、ＩＧＮ－ＬＰが細胞表面のＰＤ－Ｌ１と結合でき、結合ＥＣ５０がそれぞれ１．０３３ｎＭであり、親抗ＰＤ－Ｌ１抗体と結合する能力とほぼ同じである（ＥＣ５０が１．１９９ｎＭである）。図４に示されるように、ＩＧＮ－ＬＰが細胞表面のＬＡＧ－３と結合でき、結合ＥＣ５０が０．４３４５ｎＭであり、親抗ＬＡＧ－３抗体ＡＤＩ－３１８５３と結合する能力とほぼ同じである（ＥＣ５０が０．５０３９ｎＭである）。
実施例６．本発明の抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体と、ＬＡＧ－３を過剰発現させた２９３細胞及びＰＤ－Ｌ１を過剰発現させたＣＨＯ細胞との同時結合の分析
二重特異性抗体が異なる細胞に由来する標的抗原と同時に結合できるかどうかを検証するために、本実施例ではフローサイトメトリーを用いて、二重特異性抗体によって誘導される異なる細胞のカップリングについて検出した。実験手順は具体的に以下のとおりである。
１）実施例５に記載の通りＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞及び２９３－ＬＡＧ－３細胞を得て、培養した。遠心分離機においてＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞を含む培養物及び２９３－ＬＡＧ－３細胞を含む培養物をそれぞれ４００ｇで５分間遠心分離して、細胞培地を除去した。ＰＢＳで洗浄して、ＰＢＳで細胞を再懸濁させた。細胞を計数して、細胞密度を２×１０６個の細胞／ｍｌに調整した。ＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞及び２９３－ＬＡＧ－３細胞にそれぞれ１：５０００でＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒＴＭ Ｄｅｅｐ Ｒｅｄ（Ｔｈｅｒｍｏ）及びＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）染料を加え、３７℃で３０分間静置した。遠心分離機において４００ｇで５分間遠心分離して、上清を除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄した。
２）階段希釈された本発明の二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰ、対照としてヒト化Ｎｂ－Ｆｃ（１０００ｎＭ）、抗ＬＡＧ－３抗体ＡＤＩ３１８５３（１０００ｎＭ）をそれぞれ９６ウェルＵ底プレートに加えた。前記１）の染色後のＣＨＯ－ＰＤ－Ｌ１細胞を加え、混合させた（最終細胞密度は１．５×１０６個／ｍｌ）。９６ウェルＵ底プレートを４℃で３０分間静置してプレートを取り出し、４００ｇで５分間遠心分離し、次にＰＢＳで４回洗浄し、ＰＢＳで細胞を再懸濁させた。
３）９６ウェルＵ底プレート中の前記２）の細胞懸濁液に前記１）の染色後の２９３－ＬＡＧ－３細胞を加えて、２９３－ＬＡＧ－３細胞の最終細胞密度が１×１０６個／ｍｌになると、室温で１時間静置してフローサイトメーター（ＢＤ、ＡＣＣＵＲＩＣ６）検出を行った。チャンネル２及びチャンネル４の二重陽性細胞の比率は二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰが引き起こす細胞カップリングの状況を反映している。
検出結果は図５に示されるように、ＩＧＮ－ＬＰがＣＨＯＳ－ＰＤ－Ｌ１細胞及び２９３－ＬＡＧ－３細胞のカップリングを誘導できることから、本発明の二重特異性抗体が異なる細胞表面に由来する標的抗原と同時に結合できることを示している。
本実施例で使用されるＩｇＧ１陰性対照の重鎖（ＨＣ）アミノ酸配列は下記の通りである。
ＥＶＲＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＡＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＴＳＲＤＤＳＫＮＡＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＧＰＧＷＹＡＡＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＡＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２１）
ＩｇＧ１陰性対照の軽鎖（ＬＣ）アミノ酸配列は下記の通りである。
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＡＤＬＰＡＦＡＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号２２）
実施例７．本発明の抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の熱安定性検出
示差走査蛍光測定法（ＤＳＦ）は、マップにおける蛍光の変化過程に基づいて構造安定性に関する情報を提供し、タンパク質の立体配置の変化を検出できる。蛍光曲線の絶対値が最大である場合に対応する温度は該タンパク質のＴｍであった。本研究ではＤＳＦ法により本発明の二重特異性抗体のＴｍ値を測定した。実験手順は下記の通りである。
１）ＰＢＳで抗体試料を１ｍｇ／ｍｌに希釈した。ＰＢＳでＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅタンパク質ゲル染色（Ｇｉｂｃｏ、Ｓ６６５０）を５０倍希釈し、即ち、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅタンパク質ゲル染色母液４μｌにＰＢＳ １９６μｌを加えた。
２）９６ウェルＰＣＲプレートに希釈後抗体試料５０μｌ、ＳＹＰＲＯ Ｏｒａｎｇｅタンパク質ゲル染色希釈液１０μｌ、及び水４０μｌを加えた。７５００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムに入れて検出した。
実験結果は表３に示されるように、二重特異性抗体のＴｍ＞６３℃であり、良好な熱安定性を有する。
Figure 2022518519000006
実施例８．本発明の抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体のＴ細胞に対する活性化効果の検出
本研究では、混合リンパ球実験によって二重特異性抗体のヒトＴ細胞に対する活性化作用を検出した。具体的な実験過程は下記の通りである。
１）ＰＢＭＣの分離：ドナーの新鮮な血液５０ｍｌに２．５倍のＰＢＳを加え、ＦｉＣｏｌｌ（Ｔｈｅｒｍｏ）に添加し、４つの管に分け、１管あたり１２．５ｍｌとして、遠心分離機において４００ｇで３０ｍｉｎ遠心分離し、速度が０に低減すると停止する。中間の白色の部分を吸い取りＰＢＳに移し、ＰＢＳで２回洗浄する。
２）ＤＣ細胞分離：単離されたＰＢＭＣ細胞にＴ細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ １５（ＬＯＮＺＡ））５ｍｌを加え、３７℃、６％ ＣＯ２で２ｈ接着培養し、懸濁細胞液を吸い取り、ＣＤ４＋細胞分離を行い、残った細胞にＤＣ培地３ｍｌを加えて、２日間培養後、ＤＣ培地（Ｘ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ） ９９％、ヒトＡＢ血清（Ａｃｃｅｓｓ） １％、ＨＥＰＥＳ １０ｍＭ、β－Ｍｅ ５０μＭ、ＩＬ－４（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１０００Ｕ／ｍｌ、ＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）１０００Ｕ／ｍｌ）３ｍｌを加えて、さらに５日目まで培養した後に、ｒＴＮＦa（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１０００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ－１ｂ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ－６（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）（１０ｎｇ／ｍｌ）及び１μＭ ＰＧＥ２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加えて２日間培養し、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）のＤＣ細胞とした。
３）Ｃｄ４＋細胞分離：１）で得たＰＢＭＣを２ｈ静置して培養し、細胞懸濁液を吸い取り２０ｍｌ遠心分離管に加え、２００ｇで１０ｍｉｎ遠心分離し、沈殿物に分離液５００μｌ、ＡＢ型血清１００μｌ、精製抗体１００μｌを加えて再懸濁し、４℃で２０ｍｉｎインキュベートし、分離液（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ（２０１４４））で１回洗浄して、さらにＢｅａｄ Ｂｕｆｆｅｒ ５００μｌを加えて１５ｍｉｎインキュベートし、磁場によってＢｅａｄを除去し、Ｔ細胞培地（Ｘ－ＶＩＶＯ １５（ＬＯＮＺＡ））で１回洗浄し、Ｔ細胞培地８ｍｌで再懸濁して、３７℃、６％ ＣＯ２で培養した。（‘Ｈｕｍａｎ ＣＤ４＋ Ｔ ｃｅｌｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ Ｋｉｔ’（１９０５２、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）取扱説明書に基づいて操作し、例えば、当該試薬キットを操作する。使用される試薬が全て当該試薬キットに提供されるものである）。
４）ＣＤ４＋ Ｂｅａｄｓ刺激：３）で得たＣＤ４＋ Ｃｅｌｌｓ（１×１０７個）を培地４ｍｌにおいて再懸濁させ、１：１でＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて、３日間培養した。
５）ＭＬＲ：成熟したＤＣ細胞を刺激されたＣＤ４＋細胞と混合し、１ウェルあたり体積２００μｌ、ＤＣ細胞１００００個、ＣＤ４＋細胞１０００００個として、階段希釈された抗体、１ｎＭ ＳＥＥ（Ｔｏｘｉｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＩｇＧ（ヒトＩｇＧ（ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ））を陰性対照として加え、混合して３日間培養した。
６）使用される抗体及びその開始濃度は下記の通りである。
ＩｇＧ：１０ｍｇ／ｍｌ
ＩＧＮ－ＬＰ：１１．３ｍｇ／ｍｌ
抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体：１．２７ｍｇ／ｍｌ
抗ＬＡＧ－３抗体ＡＤＩ－３１８５３：１０．５ｍｇ／ｍｌ
７）Ｃｉｓｂｉｏ Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ ｋｉｔで培地に対しＩＬ－２の濃度を検出する。
検出液の調製（試薬はいずれもＣｉｓｂｉｏ Ｈｕｍａｎ ＩＬ２ １０００ ｔｅｓｔｓ試薬キットより）
Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ ｄ２ ａｎｔｉｂｏｄｙ ３０μｌ（由来）を検出緩衝液 ５７０μｌ（由来）に、Ｈｕｍａｎ ＩＬ－２ ｃｒｙｐｔａｔｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ３０μｌ（由来）を検出緩衝液５７０μｌにそれぞれ加えて、１：１で混合する。
実験結果は図６に示されるように、二重特異性抗体がＴ細胞をインビトロで活性化させることができ、その活性化効果が抗ＰＤ－Ｌ１又は抗ＬＡＧ－３抗体の単独使用よりも良好であり、抗ＰＤ－Ｌ１及び抗ＬＡＧ－３抗体の併用投与とほぼ同じである。
実施例９．二重特異性抗体のＴＣＲ：ｐＭＨＣ結合に対する促進能力の検出
前日に、４×１０５個／ウェル、１ウェルあたりＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ、２２４００－０７１）１００ｕｌで、９６ウェルプレートにＣＨＯＫ１－ＰＤ－Ｌ１（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＳ１８７１０９）をプレーティングした。実験当日に、Ｊｕｒｋａｔ －ＬＡＧ３（Ｐｒｏｍｅｇａ、（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＣＳ１８７１０９））を計数し、培地を利用して細胞密度を２．５×１０６個／ｍｌに調整した。
陰性対照とするＩｇＧ（ヒトＩｇＧ（ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ））、本発明の二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰ、抗ＰＤ－Ｌ１ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体ＡＤＩ－３１８５３、及びＮｂ－Ｆｃ＋ＡＤＩ－３１８５３を試料として、ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ、２２４００－０７１）培地を利用して、開始濃度２００ ｎＭ、計１０個の濃度勾配で３倍階段希釈を行った。
９６ウェルプレートにおけるＣＨＯＫ１－ＰＤ－Ｌ１の上清を除去して、上記Ｊｕｒｋａｔ－ＬＡＧ３細胞を４０ｕｌ／ウェルで加えた。上記希釈された各試料をそれぞれ４０ｕｌ／ウェルで加えて、３７℃で１６時間インキュベートした。
１６時間後、多機能マイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｍａｘ Ｉ３）で数値を読み取り、ＴＣＲ：ｐＭＨＣの生物発光（ＲＵ）（蛍光シグナル）を得た。ＧｒａｐｈＰａｄで濃度依存性曲線を当てはめする。検出結果は図７に示されるように、各単一の抗ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体及び抗ＬＡＧ－３抗体ＡＤＩ－３１８５３、さらにその併用（ヒト化Ｎｂ－Ｆｃ抗体＋抗ＬＡＧ－３抗体ＡＤＩ－３１８５３）と比較すれば、二重特異性抗体ＩＧＮ－ＬＰがＴＣＲ：ｐＭＨＣ結合をさらに促進でき、下流シグナル経路を活性化させる。
実施例１０．本発明の抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１二重特異性抗体の抗腫瘍活性
本研究では、ＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＫＩ（ＭＪ－１）結腸がん細胞が接種されているＰＤ－Ｌ１遺伝子組換えマウス（ＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＫＩ担腫瘍マウスモデル、略称ＭＣ３８／ＰＤ－Ｌ１モデル）を利用して、本発明の抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体ＩＧＮＬＰ（即ち、実施例２で調製されたＩＧＮ－ＬＰ）の抗腫瘍作用を測定した。
皮下接種の方式でＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＫＩ担腫瘍マウスモデルを構築した。腫瘍が出現すると群分けをし、異なる抗体を投与して治療し、投与期間に各群マウスの腫瘍体積と体重の変化を監視した。投与頻度は週に２回で、２週間にわたり、合計で５回投与した。監視頻度はいずれも週に２回であり、４週間にわたり連続的に監視した。投与量と投与方式は下記の通りである。投与終了後に、相対腫瘍抑制率（ＴＧＩ％）を算出し、計算式は、下記の通りである。ＴＧＩ％＝１００％×（ｈ－ＩｇＧ対照群の腫瘍体積－治療群の腫瘍体積）／（ｈ－ＩｇＧ対照群の腫瘍体積－ｈ－ＩｇＧ対照群の投与前の腫瘍体積）。但し、ｈ－ＩｇＧ対照群の投与前の腫瘍体積の平均値は８０ｍｍ３である。
マウス：ＰＤ－Ｌ１遺伝子組換えマウス、雌性、７～８週齢（腫瘍細胞接種時のマウス週齢）、体重１８～２０ｇ、上海南方模式生物科技股ふん有限公司より購入。マウスを受け入れた後、実験開始前に７日間飼育して順応させる。
細胞：上海和元生物より購入されたマウス結腸がん細胞ＭＣ３８（上海和元生物、ＨＹＣ０１１６）にヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子（南京銀河生物医薬有限公司）を組み込み、ヒトＰＤ－Ｌ１を含むＭＣ３８細胞を得て、ＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ、２２４００－０７１）で培養し、後続のインビボ実験に備えるために、ＭＣ３８培養要求を厳格に遵守して通常の継代培養を行った。遠心分離（４００ｇ／分間、５分間）により細胞を収集し、滅菌ＲＰＭＩ １６４０基本培地において細胞を再懸濁し、細胞密度を５×１０６個／ｍｌに調整した。ＰＤ－Ｌ１遺伝子組換えマウスの右背部を剃毛し、０．２ｍｌ／匹でＭＣ３８－ｈｕＰＤ－Ｌ１ ＫＩ細胞を皮下注射した。腫瘍細胞接種後から５日目に、各マウスの腫瘍体積を検出し、腫瘍の平均体積が７６～８０ｍｍ３の範囲にあるマウスを選択し、腫瘍体積によってランダムに群分けした。下記の投与方式により、抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体を単独で使用する場合の抗腫瘍活性を検出した。
投与：マウスを１１群に分け（１群あたり６匹マウス）、各群に対し下記の投与量でそれぞれ抗体を皮下注射した。
（１）ヒトＩｇＧ（ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ）、１５ｍｇ／ｋｇ、
（２）抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、１．２５ｍｇ／ｋｇ、
（３）抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、２．５ｍｇ／ｋｇ、
（４）抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、５ｍｇ／ｋｇ、
（５）ＬＡＧ－３（ＡＤＩ－３１８５３）、１０ｍｇ／ｋｇ、
（６）ＬＡＧ－３（ＡＤＩ－３１８５３）、１０ｍｇ／ｋｇ＋抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、１．２５ｍｇ／ｋｇ、
（７）ＬＡＧ－３（ＡＤＩ－３１８５３）、１０ｍｇ／ｋｇ＋抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、２．５ｍｇ／ｋｇ、
（８）ＬＡＧ－３（ＡＤＩ－３１８５３）、１０ｍｇ／ｋｇ＋抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ヒト化抗ＰＤ－Ｌ１抗体Ｎｂ－Ｆｃ）、５ｍｇ／ｋｇ、
（９）抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体（ＩＧＮＬＰ）、３ｍｇ／ｋｇ、
（１０）抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体（ＩＧＮＬＰ）、６ｍｇ／ｋｇ、
（１１）抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体（ＩＧＮＬＰ）、１２ｍｇ／ｋｇ。
ヒトＩｇＧはＥｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏにより得られたヒトＩｇＧ調製物である。
腫瘍細胞接種後から５日目、９日目、１２日目、１５日目及び１８日目に、各群のマウスにそれぞれ上記の投与量で上記の抗体を投与した。
分析：実験期間にわたり、週に２回腫瘍、体重を計測した。腫瘍が端点まで成長すると（腫瘍体積が３０００ｍｍ３を上回る）、又はマウスに２０％以上の体重減少が認められると、マウスに安楽死を実施する。ノギスを用いて腫瘍の長径（Ｌ）と短径（Ｗ）を測定し、Ｖ＝Ｌ×Ｗ２／２により腫瘍体積を算出する。各群のマウスに対し腫瘍サイズと時間のグラフを作成する。分散分析（ＡＮＯＶＡ）により統計的有意性を判定する。Ｐ値＜０．０５である場合は、分析に統計的有意性がある。
実験結果は下記表及び図８－１０に示されるように、ＩｇＧ対照（ｅｑｕｉｔｅｃｈ－Ｂｉｏ）、抗ＬＡＧ－３又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体の単独又は組合せ投与と比較すれば、本願の抗ＬＡＧ－３／ＰＤ－Ｌ１抗体ＩＧＮＬＰの単独投与は、腫瘍の成長が明らかに抑制されることが示されている。
Figure 2022518519000007
Figure 2022518519000008
Figure 2022518519000009
Figure 2022518519000010

Claims (25)

  1. （ｉ）式（Ｉ）のポリペプチド鎖：
    ＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃ－Ｘ－ＶＨＨ、
    及び
    （ｉｉ）式（ＩＩ）のポリペプチド鎖：
    ＶＬ－ＣＬ、
    を含むか、又はそれらからなる抗体分子又はその抗原結合断片であって、
    ＶＨは重鎖可変領域を示し、
    ＣＨは重鎖定常領域を示し、
    ＦｃはＣＨ２、ＣＨ３及び任意のＣＨ４を含み、
    ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４はそれぞれ重鎖定常領域のドメイン１、２、３及び４を示し、
    Ｘは存在しなくてもよく、又は存在する場合、リンカーを示し、
    ＶＨＨは単一ドメイン抗原結合部位を示し、
    ＶＬは軽鎖可変領域を示し、
    ＣＬは軽鎖定常領域を示し、
    任意に、ＣＨ１とＦｃとの間にヒンジ領域が存在する、
    前記抗体分子又はその抗原結合断片。
  2. １又は２つの式（Ｉ）のポリペプチド鎖、及び１又は２つの式（ＩＩ）のポリペプチド鎖を含むか、又はそれらからなる、請求項１に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
  3. 前記リンカーがフレキシブルリンカーであり、好ましくは、前記リンカーがアミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、ｎは１以上の正の整数であり、例えば、ｎは１～７の正の整数であり、例えば１、２、３、４、５又は６である、請求項１又は２に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
  4. 前記抗体又はその断片がヒト抗体、ヒト化抗体又はキメラ抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
  5. 前記単一ドメイン抗原結合部位（ＶＨＨ）が天然の軽鎖欠如抗体の重鎖可変ドメインであり、例えば、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）の種に天然に存在する重鎖抗体の重鎖可変ドメイン、若しくは新規抗原受容体と呼ばれる魚類の免疫グロブリン（例えば、サメの血清に天然に存在するＩｇＮＡＲ）におけるＶＨ様単一ドメイン、又はそれらから誘導される組換え単一ドメイン抗原結合部位（例えば、ラクダ化ヒトＶＨドメイン又はヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメイン）であり、好ましくは、前記単一ドメイン抗原結合部位がラクダ科の種に天然に存在する重鎖抗体の重鎖可変ドメイン、ラクダ化ヒトＶＨドメイン及びヒト化ラクダ科抗体の重鎖可変ドメインから選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
  6. 前記式（Ｉ）の「ＣＨ１－Ｆｃ」がＩｇＧの形態であり、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２又はＩｇＧ４の形態であり、且つ／又は前記式（ＩＩ）のＣＬがκ又はλに由来する、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
  7. 前記ＶＨ及びＶＬにより形成される抗原結合部位が第１抗原に対して特異的であり、前記ＶＨＨにより形成される抗原結合部位が第２抗原に対して特異的であり、好ましくは、前記第１抗原が前記第２抗原と同じであるか又は異なるものである、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
  8. 前記第１抗原及び第２抗原が、サイトカイン、成長因子、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、炎症性メディエーター、リガンド、細胞表面受容体又はその断片、腫瘍関連抗原、免疫チェックポイント分子、血管新生因子、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー、免疫系における共刺激分子、並びにそれらのリガンド及び／又は受容体、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ４７、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＶＥＧＦ及びＧＩＴＲから選択される、請求項７に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
  9. 前記第１抗原がＬＡＧ－３であり、例えば、ヒトＬＡＧ－３であり、且つ／又は、前記第２抗原がＰＤ－Ｌ１であり、例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１である、請求項７に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
  10. 前記式（Ｉ）におけるＶＨＨが、
    （ｉ）配列番号６の３つの相補性決定領域（ＶＨＨ ＣＤＲ）を含む、又は
    （ｉｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＶＨＨ ＣＤＲ１、ＶＨＨ ＣＤＲ２およびＶＨＨ ＣＤＲ３を含み、前記ＶＨＨ ＣＤＲ１が配列番号１０で示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、前記ＶＨＨ ＣＤＲ２が配列番号１１で示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、且つ前記ＶＨＨ ＣＤＲ３が配列番号１２で示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、又は
    （ｉｉｉ）配列番号６で示される配列を含むか又はそれからなる、又は
    （ｉｖ）配列番号６で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、
    請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
  11. 前記式（Ｉ）におけるＶＨが、
    （ｉ）配列番号２で示される重鎖可変領域ＶＨの３つの相補性決定領域ＨＣＤＲを含む、又は
    （ｉｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、前記ＨＣＤＲ２が配列番号１４で示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、且つ前記ＨＣＤＲ３が配列番号１５で示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、又は
    （ｉｉｉ）配列番号２で示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、又は
    （ｉｖ）配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、
    且つ／又は
    ＶＬが、
    （ｉ）配列番号８で示される軽鎖可変領域ＶＬの３つの相補性決定領域ＬＣＤＲを含む、又は
    （ｉｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１が配列番号１６で示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、前記ＬＣＤＲ２が配列番号１７で示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、且つ前記ＬＣＤＲ３が配列番号１８で示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、又は
    （ｉｉｉ）配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、又は
    （ｉｖ）配列番号８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、
    請求項１～１０のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
  12. （ａ）前記式（Ｉ）におけるＶＨ－ＣＨ１－Ｆｃが、
    （ｉ）配列番号１９で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、又は
    （ｉｉ）配列番号１９で示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、
    且つ／又は
    （ｂ）前記式（ＩＩ）のＶＬ－ＣＬが、
    （ｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、又は
    （ｉｉ）配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、
    請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
  13. 前記式（Ｉ）のポリペプチド鎖が、配列番号１で示される配列、又はそれに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなり、且つ／又は、前記式（ＩＩ）のポリペプチド鎖が、配列番号７で示される配列、又はそれに対して少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか又はそれからなる、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片。
  14. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片の１本以上のポリペプチド鎖をコードする、単離された核酸。
  15. 請求項１４に記載の核酸を含み、且つ、好ましくはｐＴＴ５ベクターのような発現ベクターである、ベクター。
  16. 請求項１４に記載の核酸又は請求項１５に記載のベクターを含む宿主細胞であって、好ましくは原核細胞又は真核細胞であり、より好ましくは大腸菌細胞、酵母細胞、哺乳類細胞、及び抗体又はその抗原結合断片の製造に適する他の細胞から選択され、最も好ましくは２９３細胞又はＣＨＯ細胞である、宿主細胞。
  17. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片の製造方法であって、請求項１４に記載の核酸の発現に適する条件において、請求項１６に記載の宿主細胞を培養すること、及び任意に前記抗体又はその抗原結合断片を単離することを含み、任意に前記宿主細胞から前記抗体又はその抗原結合断片を単離することをさらに含む、製造方法。
  18. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片と、追加の物質、例えば、細胞傷害剤などの治療剤又は標識とを含む、免疫複合体。
  19. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片、又は請求項１８に記載の免疫複合体と、任意に医薬品添加物とを含む、医薬組成物。
  20. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片、又は請求項１７に記載の免疫複合体と、追加の治療剤と、任意に医薬品添加物とを含む医薬組成物であって、好ましくは、前記追加の治療剤が化学療法剤、追加の抗体、細胞傷害剤、ワクチン、抗感染症剤、小分子薬物及び免疫調節剤から選択される、医薬組成物。
  21. 請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片、又は請求項１８に記載の免疫複合体と、化学療法剤、細胞傷害剤、ワクチン、追加の抗体、抗感染症剤、小分子薬物又は免疫調節剤などの１種以上の追加の治療剤とを含む、組合せ製品。
  22. 対象における疾患の予防又は治療方法であって、有効量の請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体分子又はその抗原結合断片、請求項１８に記載の免疫複合体、請求項１９又は２０に記載の医薬組成物、又は請求項２１に記載の組合せ製品を前記対象に投与することを含み、前記疾患が、例えば、自己免疫疾患、炎症性疾患、感染又は腫瘍であり、例えば、前記腫瘍ががんであり、例えば、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２及び／又はＬＡＧ－３の上昇発現レベルを有するがんであり、例えば、結腸がん、結腸直腸がん又は直腸がんである、方法。
  23. 前記対象に１種以上の追加の療法を併用することをさらに含み、前記両方が、例えば、治療法及び／又は追加の治療剤を含み、好ましくは、前記治療法が手術治療及び／又は放射線治療を含み、又は、前記治療剤が化学療法剤、細胞傷害剤、ワクチン、追加の抗体、抗感染症剤、小分子薬物及び免疫調節剤から選択される、請求項２２に記載の方法。
  24. 試料中の抗原の検出方法であって、
    （ａ）前記試料と請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片とを接触させること、及び
    （ｂ）前記抗体又はその抗原結合断片と抗原によって形成される複合物を検出すること
    を含み、任意に前記抗体が検出可能に標識される、方法。
  25. 前記抗原が、サイトカイン、成長因子、ホルモン、シグナル伝達タンパク質、炎症性メディエーター、リガンド、細胞表面受容体又はその断片、腫瘍関連抗原、免疫チェックポイント分子、血管新生因子、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー、免疫系における共刺激分子、並びにそれらのリガンド及び／又は受容体、例えば、ＯＸ４０、ＣＤ４７、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＬＡＧ－３、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＶＥＧＦ及びＧＩＴＲから選択され、好ましくは、前記抗原が、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＬＡＧ－３であり、例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１及び／又はヒトＬＡＧ－３である、請求項２４に記載の方法。
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