CN115505045A

CN115505045A - 靶向lag-3和pd-l1的新型双特异抗体及其应用

Info

Publication number: CN115505045A
Application number: CN202210724139.5A
Authority: CN
Inventors: 张畅; 王荣娟; 焦莎莎; 曾大地; 张姣; 杨莹莹; 王双
Original assignee: Maiwei Shanghai Biotechnology Co ltd
Current assignee: Maiwei Shanghai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-06-23
Filing date: 2022-06-23
Publication date: 2022-12-23
Also published as: WO2022268168A1

Abstract

本发明公开了一种靶向LAG‑3和PD‑L1的双特异性分子及其应用。在人源化抗人LAG‑3抗体的基础上，在抗体重链的C端通过连接子连接抗PD‑L1纳米抗体。将纳米抗体通过上述连接子连接于抗体重链C端的方式不仅减少了Fc的效应子功能、避免了活化T细胞的清除，而且使双特异性抗体的结构更加稳定、重组表达的组装效率更高。并且，该双特异性分子能够同时抑制PD‑1/PD‑L1信号通路和LAG‑3/MHCII、LAG3/信号通路，实现LAG‑3阳性和PD‑L1阳性细胞的桥连，将解除抑制的T细胞聚集在表达PD‑L1的肿瘤细胞周围，具有良好的抑瘤效果。

Description

靶向LAG-3和PD-L1的新型双特异抗体及其应用

优先权信息

本申请请求2021年6月23日向中国国家知识产权局提交的、专利申请号为202110695985.4的专利申请的优先权和权益，并且通过参照将其全文并入此处。

技术领域

本发明属于抗体工程领域，具体而言，本发明涉及新型的经人工设计的双特异抗体分子，特别是同时特异性结合LAG-3和PD-L1的新型抗体和抗体片段以及含有所述抗体或抗体片段的组合物，还涉及结合LAG-3和PD-L1的抗体在肿瘤等疾病治疗中的用途。

背景技术

LAG-3(Lymphocyte-activation-gene-3)是重要的免疫检查点蛋白，属于Ⅰ型跨膜蛋白，由 LAG-3基因编码，主要表达在活化的T细胞、NK细胞、和浆细胞样树突状等细胞表面。LAG-3 通过与其配体作用，调控T细胞功能。到目前为止，已发现的LAG-3配体共有5种：MHC-II，肝窦内皮细胞凝集素(liver sinusoidal endothelial cell lectin，LSECtin)、半乳糖凝集素-3 (galectin3)、α-突触核蛋白原纤维(α-synuclein fibrils)，以及纤维蛋白样蛋白1 (fibrinogen-likeprotein1，FGL1)，其中最主要的配体是MHC II。正常情况下，LAG-3与其配体介导负性信号，调节T细胞增殖和功能，维持机体T细胞的稳态。在肿瘤微环境中， LAG-3和其配体介导的负性信号减弱CD4+T细胞和CD8+T细胞增殖、分化，并促进Treg细胞的分化，最终实现免疫抑制。抑制或敲除LAG-3可以解除T细胞抑制。LAG-3通路的抑制有助于耗竭性T细胞的功能恢复，提高T细胞抗肿瘤活性。

PD-1及其配体PD-L1是肿瘤免疫的重要靶点。PD-1、PD-L1是一对免疫抑制分子，是免疫系统防止自身免疫过激的重要组成部分，其通路的激活具有抑制肿瘤免疫应答、诱导肿瘤特异性T细胞凋亡的作用,与肿瘤发展关系密切。PD-L1全称是程序性死亡配体-1，可以结合T细胞表面的受体PD-1，发挥免疫抑制作用。PD-L1属于抑制型免疫检查点分子，表达于黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、头颈部鳞癌等多种恶性肿瘤细胞表面。PD-L1与 T细胞表面的免疫抑制性受体PD-1结合后，可诱导T细胞凋亡、失能、耗竭，进而抑制肿瘤抗原特异性T细胞的激活、增殖和抗肿瘤功能，实现肿瘤免疫逃逸。PD-1/PD-L1阻断型抗体可以解除PD-L1的免疫抑制作用，增强体内免疫细胞T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤，从而达到杀灭肿瘤的作用。

由于双特异抗体具有多种应用，有必要基于双特异抗体研究多种疾病的治疗方法。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种靶向LAG-3和PD-L1的双特异性抗体及其应用。在人源化抗人LAG-3抗体的基础上，在抗体重链的C端通过连接子连接抗PD-L1纳米抗体。将纳米抗体通过上述连接子连接于抗体重链C端的方式不仅减少了Fc的效应子功能、避免了活化T细胞的清除，而且使双特异性抗体的结构更加稳定、重组表达的组装效率更高。在肿瘤抑制活性方面，本发明制备的靶向LAG-3和PD-L1的双特异性抗体hz7F10-hzF2和hz7F10-hzB6能够同时抑制PD-1/PD-L1 信号通路和LAG-3/MHCII、LAG3/信号通路，实现LAG-3阳性和PD-L1阳性细胞的桥连，将解除抑制的T细胞聚集在表达PD-L1的肿瘤细胞周围，从而有效抑制肿瘤的生长。

具体而言：

第一方面，本发明提供了一种双特异性结合分子。根据本发明的实施例，该双特异性结合分子包括：第一抗原结合部，所述第一抗原结合部包括：第一肽段，所述第一肽段包括第一重链可变区和第一轻链可变区，其中，所述第一重链可变区的互补决定区(CDR)包括H1-CDR1、H1-CDR2和H1-CDR3，所述第一轻链可变区的CDR包括L1-CDR1、L1-CDR2 和L1-CDR3；第二肽段，所述第二肽段包括第二重链可变区和第二轻链可变区，其中，所述第二重链可变区的CDR包括H2-CDR1、H2-CDR2和H2-CDR3，所述第二轻链可变区的 CDR包括L2-CDR1、L2-CDR2和L2-CDR3，且所述第二肽段与所述第一肽段共价连接，具体地，所述第二肽段的N端与所述第一肽段的C端共价连接；第二抗原结合部，所述第二抗原结合部包括:第三肽段，所述第三肽段为纳米抗体，包括第三重链可变区，且与所述第一肽段的C端通过接头相连，所述第三重链可变区的CDR包括H3-CDR1、H3-CDR2和 H3-CDR3。

根据本发明的实施例，所述第一抗原结合部含特异性结合程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)，所述第二抗原结合部特异性结合淋巴细胞活化基因-3(LAG3)。

根据本发明的实施例，所述双特异性结合分子，优选地，第一抗原结合部包含Fc结构域，所述Fc结构域是IgG，特别是IgG1 Fc结构域。

根据本发明的实施例，所述Fc结构域包含L234A和L235A点突变。

根据本发明的实施例，所述H1-CDR1包含SEQ ID NO：17所述的氨基酸序列，所述H1-CDR2包含SEQ ID NO：18所述的氨基酸序列和所述H1-CDR3包含SEQ ID NO：19所述的氨基酸序列，且所述L1-CDR1包含SEQ ID NO：14所述的氨基酸序列、L1-CDR2包含 SEQ ID NO：15所述的氨基酸序列和L1-CDR3包含SEQ ID NO：16所述的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述H2-CDR1、H2-CDR2和H2-CDR3的氨基酸序列分别与所述H1-CDR1、H1-CDR2和H1-CDR3的氨基酸序列相同，且所述L2-CDR1、L2-CDR2和 L2-CDR3的氨基酸序列分别与所述L1-CDR1、L1-CDR2和L1-CDR3的氨基酸序列相同。

根据本发明的实施例，所述H3-CDR1、H3-CDR2和H3-CDR3选自下列组之一：(a) 所述H3-CDR1包含SEQ ID NO：20所述的氨基酸序列，所述H3-CDR2包含SEQ ID NO： 21所述的氨基酸序列和所述H3-CDR3包含SEQ ID NO：22所述的氨基酸序列；(b)所述 H3-CDR1包含SEQ ID NO：23所述的氨基酸序列，所述H3-CDR2包含SEQ ID NO：24所述的氨基酸序列和所述H3-CDR3包含SEQ ID NO：25所述的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述第一重链可变区包括与SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述第一肽段进一步包括第一轻链恒定区和第一重链恒定区，和所述第二肽段进一步包括第二轻链恒定区和第二重链恒定区。

根据本发明的实施例，所述第一轻链恒定区与所述第二轻链恒定区均包括SEQ IDNO： 2所述的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述第一重链恒定区与所述第二重链恒定区均包括SEQ IDNO： 4所述的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述第三重链可变区包括SEQ ID NO：7或8所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述多肽复合物进一步包括：第四肽段，所述第四肽段包括第四重链可变区，且与所述第二肽段的C端通过所述接头相连。

根据本发明的实施例，所述第四肽段为纳米抗体，且具有与所述第三肽段相同的CDR 序列。

根据本发明的实施例，所述第四重链可变区包括SEQ ID NO：7或8所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述接头的具有(G4S)_2-4或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述双特异性结合分子的重链具有SEQ ID NO:11或12所示的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，所述双特异性结合分子的轻链具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

第二方面，本发明提供一种双特异性结合分子。根据本发明的实施例，该双特异性结合分子包括两条抗体重链和两条抗体轻链，所述两条抗体重链的可变区和两条抗体轻链的可变区相互作用形成两个第一抗原结合部；所述两条抗体重链中的至少一条在C端通过接头连接第二抗原结合部，所述第二抗原结合部包含纳米抗体。

进一步，根据本发明的实施例，所述抗体重链由N端到C端依次包括：第一抗原结合部重链可变区、CH1区、CH2区、CH3区，以及可选的接头+第二抗原结合部。

进一步，根据本发明的实施例，所述两条抗体重链在Fc段包括L234A、L235A点突变，且所述两条抗体重链相同或不同；

当两条抗体重链不同时，其中一条抗体重链具有第二抗原结合部，另一条抗体重链不具有第二抗原结合部；或者两条抗体重链具有序列不同的第二抗原结合部。

进一步，根据本发明的实施例，所述抗体轻链由N端到C端依次包括：第一抗原结合部轻链可变区、VH。

进一步，根据本发明的实施例，所述接头的选自(G4S)2-4、GGGGSPGGGSPGGGS(SEQID NO:10)。

进一步，根据本发明的实施例，所述第一抗原结合部特异性结合LAG-3，第一抗原结合部包含的轻链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列、包含的重链可变区具有SEQID NO:3所示的氨基酸序列。

进一步，根据本发明的实施例，所述第二抗原结合部特异性结合PD-L1，第二抗原结合部的纳米抗体包含的氨基酸序列选自SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8组成的组。

进一步，根据本发明的实施例，所述抗体重链具有选自SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12 组成的组的氨基酸序列。

进一步，根据本发明的实施例，所述抗体轻链具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

第三方面，本发明提供一种组合物，其包含本发明前述任一项的双特异性结合分子以及可选的药学上可接受的辅料。

进一步，根据本发明的实施例，该组合物还包含生物治疗剂、化学治疗剂、天然活性成分等。

进一步，根据本发明的实施例，所述组合物的剂型为水剂、针剂、粉针剂。

第四方面，本发明提供一种多核苷酸。根据本发明的实施例，该多核苷酸编码前述任一项的双特异性结合分子中的抗体重链和/或抗体轻链。

进一步，本发明还提供多核苷酸组合。根据本发明的实施例，该多核苷酸组合包括编码所述抗体重链的多核苷酸和编码所述抗体轻链的多核苷酸。

第五方面，本发明提供一种核酸构建体。根据本发明的实施例，该核酸构建体包含前述的多核苷酸。

进一步，本发明还提供核酸构建体组合。根据本发明的实施例，该核酸构建体组合包括包含编码所述抗体重链的多核苷酸的核酸构建体和编码所述抗体轻链的多核苷酸的核酸构建体。

第六方面，本发明提供一种宿主细胞。根据本发明的实施例，该宿主细胞包含前述的多核苷酸或多核苷酸组合，或包含前述核酸构建体或核酸构建体组合。

第七方面，本发明提供一种制备前述任一项双特异性结合分子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：

(1)在适合表达重组外源蛋白的条件下培养前述宿主细胞；

(2)可选的，从细胞培养物中分离纯化所述双特异性结合分子。

第八方面，本发明提供前述任一项双特异性结合分子、组合物、多核苷酸或多核苷酸组合、核酸构建体、核酸构建体组合、或宿主细胞在结合并抑制LAG3和PD-1功能中的应用，其中所述LAG3和PD-1源自人或食蟹猴。

第九方面，本发明提供了前述任一项双特异性结合分子、组合物、多核苷酸或多核苷酸组合、核酸构建体或核酸构建体组合、或宿主细胞在抑制或阻断LAG-3/MHCII、 LAG-3/FGL1、和/或PD-1/PD-L1信号通路中的应用。

第十方面，本发明提供前述任一项双特异性结合分子、组合物、多核苷酸或多核苷酸组合、核酸构建体或核酸构建体组合、或宿主细胞在桥连LAG-3阳性细胞和PD-L1阳性细胞中的应用。

第十一方面，本发明提供前述任一项双特异性结合分子、组合物、多核苷酸或多核苷酸组合、核酸构建体或核酸构建体组合、或宿主细胞在制备治疗LAG-3和/或PD-L1信号通路异常相关疾病药物中的用途。

进一步，根据本发明的实施例，所述LAG-3和/或PD-L1信号通路异常相关疾病包括异常增生性疾病或免疫相关疾病。

进一步，根据本发明的实施例，异常增殖性疾病包括肿瘤、囊肿、增生等；所述免疫相关疾病包括炎症、免疫缺陷、免疫耐受和过敏等。

根据本发明的实施例，所述肿瘤为结肠癌或肺癌。

为更好理解本发明，首先定义一些术语。其他定义则贯穿具体实施方式部分而列出。

术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。术语“免疫结合”是指发生在抗体分子和抗原(对于该抗原而言抗体为特异性的) 之间的特异性结合反应。免疫结合相互作用的强度或亲和力可以相互作用的平衡解离常数 (KD)表示，其中KD值越小，表示亲和力越高。两分子间的的免疫结合性质可使用本领域中公知的方法定量。一种方法涉及测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速度。指特定抗体-抗原相互作用的“结合速率常数”(Ka或Kon)和“解离速率常数”(Kd或Koff)两者都可通过浓度及缔合和解离的实际速率而计算得出，参见Malmqvist M,1993,Nature,361:186-187。Kd/Ka的比率等于解离常数KD，参见Davies DR等,1990,Annual RevBiochem.,59:439-473。可用任何有效的方法测量KD、Ka和Kd值。在优选的实施方案中，用生物发光干涉测量法来测量解离常数。在其它优选的实施方案中，可用表面等离子共振技术(例如Biacore)或KinExa来测量解离常数。

本文中的术语“抗体”意在包括全长抗体及其任何抗原结合片段(即，抗原结合部分)或单链。全长抗体是包含至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白，重链和轻链由二硫键连接。各重链由重链可变区(简称VH)和重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域构成，即CH1、 CH2和CH3。各轻链由轻链可变区(简称VL)和轻链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域 CL构成。VH和VL区还可以划分为称作互补决定区(CDR)的高变区，其由较为保守的框架区(FR)区分隔开。各VH和VL由三个CDR以及四个FR构成，从氨基端到羧基端以FR1、 CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4的顺序排布。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括多种免疫系统细胞(例如，效应细胞)和传统补体系统的第一组分(C1q)。

术语“单克隆抗体”或“单抗”或“单克隆抗体组成”是指单一分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组成呈现出对于特定表位的单一结合特异性和亲和力。

本文中的术语，抗体的“抗原结合片段”(或简称为抗体部分)，是指抗体的保持有特异结合抗原能力的一个或多个片段。已证实，抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段来实施。包含在抗体的“抗原结合部分”中的结合片段的例子包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL 和CH1构成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含铰链区二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂VL和VH构成的Fv片段；(v)由VH构成的dAb片段(Ward et al.，(1989)Nature 341：544-546)；(vi)分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)纳米抗体，一种包含单可变结构域和两个恒定结构域的重链可变区。此外，尽管Fv 片段的两个结构域VL和VH由不同的基因编码，它们可以通过重组法经由使两者成为单蛋白链的合成接头而连接，其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fc(scFv)；参见例如 Bird et al.，(1988)Science 242：423-426；and Huston et al.，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85： 5879-5883)。这些单链抗体也意在包括在术语涵义中。这些抗体片段可以通过本领域技术人员已知的常用技术而得到，且片段可以通过与完整抗体相同的方式进行功能筛选。本发明的抗原结合片段的实例包括例如但不限于Fab、Fab'、F(ab')₂、Fv片段、单链Fv(scFv)片段和单结构域片段。

Fab片段含有轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处的少数残基的添加，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。通过切割在F(ab')2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸处的二硫键产生Fab'片段。抗体片段的另外化学偶联是本领域普通技术人员已知的。Fab和F(ab')2 片段缺乏完整抗体的片段可结晶(Fc)区，从动物的循环中更快速地清除，并且可能具有比完整抗体更少的非特异性组织结合(参见例如，Wahl等人，1983，J.Nucl.Med.24:316)。

术语“Fc区”或“Fc”是指免疫球蛋白重链的C端区，其含有铰链区的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体结合或与经典补体系统的第一组分(例如C1q)结合，包括天然序列Fc区和变异Fc区。通常，人IgG重链Fc区为自其Cys226或Pro230 位置的氨基酸残基至羧基末端的区段，但其边界可能有变化。Fc区的C-末端赖氨酸(残基 447，依照EU编号系统)可以存在或可以不存在。Fc还可以指隔离的这一区域，或在包含 Fc的蛋白多肽的情况下，例如“包含Fc区的结合蛋白”，还称为“Fc融合蛋白”(例如，抗体或免疫粘合素)。本发明的抗体中天然序列Fc区包括人IgG1，IgG2(IgG2A，IgG2B)，IgG3 和IgG4。在IgG、IgA和IgD抗体同种型中，Fc区包含抗体的两条重链的每一条的CH2和 CH3恒定结构域；IgM和IgEFc区包含在每条多肽链中的三个重链恒定结构域(CH结构域 2-4)。。

“Fv”片段是含有完整靶识别和结合位点的抗体的最小片段。该区域由以紧密的非共价结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体(VH-VL二聚体)组成。在该构型中，每个可变结构域的三个CDR相互作用，以限定在VH-VL二聚体的表面上的靶结合位点。通常，六个CDR对抗体赋予靶结合特异性。然而，在一些情况下，甚至单个可变结构域(或仅包含对于靶特异性的三个CDR的Fv的一半)可以具有识别且结合靶的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点。

“单链Fv”或“scFv”抗体结合片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单条多肽链中。一般地，Fv多肽进一步包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其致使scFv能够形成有利于靶结合的结构。

术语“重链”，重链(heavy chain，H链)大小约为轻链的2倍，含450～550个氨基酸残基，分子量约为55或75kD。每条H链含有4～5个链内二硫键所组成的环肽。不同的H 链由于氨基酸组成的排列顺序、二硫键的数目和位置、含的种类和数量不同，其抗原性也不相同，根据H链抗原性的差异可将其分为5类：μ链、γ链、α链、δ链和ε链，不同H链与L链(κ或λ链)组成完整免疫球蛋白的分子分别称之为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。γ、α和δ链上含有4个肽，μ和ε链含有5个环肽。

术语“轻链”，轻链(light chain，L)指在免疫球蛋白单体分子中相对于重链而论，在分子量上较小的多肽链。每条轻链近氨基末端(N端)1/2区域内的氨基酸组成序列多变处为轻链可变区(VL)，是Ig分子与抗原结合部位的一个组成部分。其余1/2区域内的氨基酸组成及排列顺序相对稳定处为轻链恒定区(CL)。由于轻链恒定区内氨基酸序列存在某些差异，故轻链有k和λ两型。

单域抗体(single domain antibody，sdAb)是一类特殊的，只包含一条抗体重链的抗体，也称为纳米抗体。和传统双链抗体类似，它可以选择性的与特定抗原结合。单域抗体最早在骆驼科动物中被发现，之后在护士鲨等软骨鱼纲动物中也被发现。单域抗体单个重链抗体可变区(VHH)是能完整结合抗原的单个功能域，只有12-15kDa。VHH结构简单，在与抗原结合时具有高特异性、高亲和力、免疫原性低、渗透性好以及在进行肿瘤治疗时具有接触到不能被常规抗体接触的较为隐蔽靶点的能力等优点。此外，因为单域抗体只有一条链，所以不会产生双链抗体融合时的错配问题。基于这些优点，利用单域抗体作为双特异性抗体的抗原结合序列具有很大的优势，逐渐成为研发热点(Serge Muyldermans(2013)，Annu.Rev. Biochem.82:775-797)。单可变域抗体是目前最小的抗体分子最初由比利时科学家Hamers， R在骆驼血液中发现，它是工程化抗体产品中备受关注的一类。单可变域抗体除具备单克隆抗体的抗原反应性外，还拥有一些独特的功能特性，如分子质量小，稳定性强、可溶性好、易表达、靶向性强、人源化简单等，尤其是适合进行双/多特异治疗性抗体的开发和 Car-T/M/NK等疗法的开发。目前单可变域抗体和/或基于单可变域抗体的双/多特异性抗体开发已成为研发热点。

对于VHH和纳米抗体的进一步描述，参考Muyldermans 2001(分子生物技术中的综述 (Reviews in Molecular Biotechnology)74:277-302)的综述文章，以及参考作为一般背景技术提及的以下专利申请：VrijeUniversiteit Brussel的WO 94/04678、WO 95/04079和WO 96/34103； Unilever的WO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231和WO 02/48193；VlaamsInstituutvoor Biotechnologie(VIB) 的WO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO03/054016和WO 03/055527；Algonomics N.V.和埃博灵克斯股份有限公司的WO 03/050531；加拿大国立研究委员会(National Research Council of Canada)的WO 01/90190；抗体研究所(Institute of Antibodies)的WO 03/025020；以及埃博灵克斯股份有限公司的WO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO05/044858、WO06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、 WO 06/122787和WO 06/122825和埃博灵克斯股份有限公司的另外的公布的专利申请。还参考在这些申请中提及的另外的现有技术，并且尤其参考在国际申请WO 06/040153的第41-43 页提及的参考文献清单，该清单和参考文献通过引用结合在本文中。如在这些参考文献中描述的，纳米抗体(尤其是VHH序列和部分人源化的纳米抗体)的特征可以尤其在于在一个或多个构架序列中存在一个或多个“标志残基”。可以例如在WO 08/101985和WO 08/142164 中找到纳米抗体的进一步描述，包括纳米抗体的人源化和/或骆驼源化，以及其他修饰、部分或片段、衍生物或“纳米抗体融合体”、多价构建体(包括接头序列的一些非限制性实例) 和增加纳米抗体半衰期的不同修饰和它们的制备。

术语“PD-L1”，即PD-L1(programmed death ligand 1)全称程序性死亡受体配体1，也称为表面抗原分化簇274(cluster of differentiation 274，CD274)或B7同源体(B7homolog 1， B7-H1)，由CD274基因编码，是PD-1(programmed cell death 1,程序性死亡受体1)的配体。 PD-L1是大小为40kDa的第一型跨膜蛋白，表达在T细胞、B细胞等免疫细胞以及肿瘤细胞上，正常情形下免疫系统会对聚集在淋巴结或脾脏的外来抗原产生反应，促发具抗原特异性的细胞毒杀性T细胞(CD8+Tcell增生)。当肿瘤细胞膜上的PD-L1与T细胞等免疫细胞上的PD-1结合后，肿瘤细胞发出抑制性信号，减低淋巴结CD8+T细胞的增殖，进而导致T 细胞不能识别肿瘤细胞和对肿瘤细胞产生杀伤作用，机体的免疫功能受到抑制。

术语“LAG-3”，(Lymphocyte-activation-gene-3)是一种由LAG-3基因编码的，主要表达在活化的T细胞、NK细胞、和浆细胞样树突状，具有T细胞功能调节功能的细胞表面分子蛋白。于1990年被发现，2007年第7届国际人类白细胞分化抗原专题会议命名为CD233。LAG-3的主要配体是MHCII，它以CTLA-4和PD-1相似的方式负性调节T细胞的增殖与活化，也有研究表明它在抑制调节性T细胞功能中发挥作用，维持CD8T细胞处于耐受性状态的作用等。临床前研究显示，抑制LAG-3能够让T细胞重新恢复细胞毒性作用，从而限制肿瘤的生长，成为许多制药公司肿瘤免疫疗法的靶点

术语“双特异性抗体”(bispecific antibodies)，一种可与相同或不同抗原上的不同表位结合的抗体结构。因此，双特异性抗体能够桥连两种不同的分子，起到将效应分子、效应细胞、病毒和药物载体系统招募至靶标结构的作用。双特异性抗体这种可同时识别两种不同分子 (受体和/或配体)的特点，提高了抗体的选择性和功能性亲和力。

术语“载体”、“核酸构建体”是指能够运输与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指其中可以连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一种类型的载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接到病毒基因组中。某些载体能够在它们被导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点和游离型哺乳动物载体的细菌载体)。其他载体(例如非附加型哺乳动物载体)可以在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，并由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们有效连接的基因的表达。这种载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA 技术中有用的表达载体通常以质粒的形式存在。然而，也包括其他形式的表达载体，如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒，腺病毒和腺伴随病毒)，其起到等同的功能。

术语“多核苷酸”旨在包括DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，并且可以是cDNA。

术语“宿主细胞”在其中载体可以增殖并且其DNA可以表达的细胞，所述细胞可以是原核细胞或者真核细胞。该术语还包括受试宿主细胞的任何后代。应理解，并不是所有的后代都与亲本细胞相同，因为在复制过程中可能会发生突变，这类后代被包括在内。

术语“免疫相关疾病”指哺乳动物中由哺乳动物免疫系统成分引起、介导、或以其他方式促成发病的免疫相关疾病，还包括刺激或干预免疫应答对该疾病发展具有改善作用的疾病。此术语包括免疫介导的炎性疾病、非免疫介导的炎性疾病、感染性疾病、免疫缺陷病、肿瘤等。

术语“癌症”和“肿瘤”是指或描述哺乳动物的其中细胞群体的特征在于细胞生长不受调控的生理病状。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、良性或恶性肿瘤。所述癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、阴门癌、甲状腺癌、脑癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各种类型的头颈部癌、I型或II型神经纤维瘤病。所述癌症的其它实例包括具有疗法抗性、难治性或转移性的那些。

本发明取得了以下有益的技术效果：

第一、本发明提供一系列抗LAG-3/PD-L1双特异分子。具体地，以人源化抗LAG-3抗体(具体信息参见申请号:202210118342.8的中国申请)与抗PD-L1纳米抗体B6(具体信息参见申请号：202210524220.9的中国申请)或F2(具体信息参见申请号：202110433149.9 的中国申请)组成首尾结构的双特异抗体。该首尾结构设计使双特异性结合分子能够同时有效结合重组及细胞表面的PD-L1和LAG-3，阻断PD-1/PD-L1的结合、MHCII/LAG-3以及 FSTL-1/LAG-3的结合。同时，双特异分子可以有效实现对表达LAG-3和PD-L1的细胞的桥连作用，有利于将解除抑制的T细胞聚集在表达PD-L1的肿瘤细胞周围，发挥抗肿瘤药效。

第二、LAG-3与PD-L1均被证实为导致肿瘤免疫逃逸的重要靶点，LAG-3多个抗体处于不同临床阶段，且PD-L1抗体已有多个获批上市品种。本发明实施例通过构建LAG-3与PD-L1双特异性结合分子，使得双特异抗体在保持各自靶点的抗肿瘤活性同时，以期达到比两株单抗联用更优的抗肿瘤治疗效果。在PD-L1纳米抗体与Fc连接的linker设计上，可以采用传统的(G4S)2-4设计，也可以采用GGGGSPGGGSPGGGS的设计，后者更利于双特异性结合分子的结构稳定性。

第三、LAG-3分子表达于T细胞表面，PD-L1分子表达于肿瘤细胞表面，从而，本发明实施例的双特异性结合分子可以在LAG-3阳性和PD-L1阳性的细胞之间形成桥接的作用，从而在肿瘤为环境内募集T细胞，进而起到更好的T细胞特异杀伤作用。根据本发明实施例的数据，双特异分子hz7F10-hzF2和hz7F10-hzB6均能有效抑制肿瘤的生长，其疗效优于抗PD-L1单抗和LAG-3单抗。实验结果表明，本发明实施例的双特异性结合分子在抗肿瘤治疗上具有良好的应用价值。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1：LAG-3和PD-L1双特异抗体结构模式图；

图2：hz7F10-hzB6的LAG-3结合活性和PD-L1结合活性的相互影响；其中：

图2A：hz7F10-hzB6在结合LAG-3后不影响对PD-L1的结合；

图2B：hz7F10-hzB6在结合PD-L1后不影响对LAG-3的结合；

图3：FACS分析hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2与细胞表面LAG-3的结合；

图4：FACS分析hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2与细胞表面PD-L1的结合；

图5：hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2对不同种属LAG-3/PD-L1结合特异性，其中，图5A：hz7F10-hzB6对人LAG-3、食蟹猴LAG-3、小鼠LAG-3的结合；图5B：hz7F10-hzF2对人 LAG-3、食蟹猴LAG-3、小鼠LAG-3的结合；图5C：BMS-986016对人LAG-3、食蟹猴LAG-3、小鼠LAG-3的结合；图5D：hz7F10-hzB6对人PD-1、食蟹猴PD-1、小鼠PD-L1、大鼠PD-L1 的结合；图5E：hz7F10-hzF2对人PD-1、食蟹猴PD-1、小鼠PD-L1、大鼠PD-L1的结合；

图6：hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2对MHCII与LAG-3结合的阻断活性；

图7：hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2对FGL1与LAG-3结合的阻断活性；

图8：hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2对PD-1/PD-L1的阻断活性；

图9：双特异性抗体对CHO-PD-L1细胞和HEK293-LAG-3细胞的交联；

图10：hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2对人hPD-1/hPD-L1/hLAG-3转基因小鼠皮下移植MC38-hPDL1鼠结肠癌肿瘤生长抑制作用，其中，图10A为体重结果示意图，图10B为肿瘤生长曲线示意图；

图11：hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2对人PBMC免疫重建小鼠皮下移植H1975人肺腺癌细胞肿瘤生长的抑制作用，其中，图11A为体重结果示意图，图11B为肿瘤生长曲线示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1：抗人LAG-3人源化抗体hz7F10及对照抗体

通过用重组人LAG-3蛋白(NCBI登录号：NP_002277.4)抗原免疫小鼠获得鼠源抗体7F10，然后对其进行人源化改造，获得人源化抗体hz7F10。hz7F10的轻链可变区(hz7F10-L)氨基酸序列见序列SEQ ID NO.1；轻链恒定区氨基酸序列见序列SEQ ID NO.2；重链可变区(hz7F10-H)氨基酸序列见序列SEQ ID NO.3；重链恒定区氨基酸序列见序列SEQ ID NO.4，CDR以Kabat定义。

SEQ ID NO.1：人源化抗体hz7F10轻链可变区氨基酸序列(CDRs 1、2和3分别为SEQID NO.14、15和16)

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVGTYVSWFQQKPGKAPKLLIYGASNRYTG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSYPYTFGQGTKLEIK

SEQ ID NO.2：人源化抗体hz7F10轻链恒定区氨基酸序列

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVT EQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO.3：人源化抗体hz7F10重链可变区氨基酸序列(CDRs 1、2和3分别为SEQID NO.17、18和19)

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVNIKDDYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPEDVETKYDPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFYSNYVNYFDQWGQGT LVTVSS

SEQ ID NO.4：人源化抗体hz7F10重链恒定区氨基酸序列

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQ SSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRD ELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

在本实施例中，将hz7F10的重链可变区SEQ ID NO:3的编码基因克隆至含有重链恒定区SEQ ID NO:4编码基因的真核表达载体(PPT5，购自北京华越洋生物，货号VECT6098)上，形成构建hz7F10的重链重组表达载体；另一方面通过将hz7F10的轻链可变区SEQ IDNO:1的编码基因克隆至含有轻链恒定区SEQ ID NO:2编码基因的真核表达载体上，构建hz7F10的轻链重组表达载体。然后双质粒转染真核细胞进行表达和纯化，获得针对LAG-3人源化单克隆抗体hz7F10。

类似地，将对照抗体BMS-986016轻重链序列编码基因进行全合成，采用相同策略克隆至真核瞬时表达载体中，并在真核细胞中进行表达纯化，获得对照抗体BMS-986016重组蛋白。其中，对照抗体BMS-986016氨基酸序列来源于WHO Drug Information (Vol.32,No.2,2018)，重链氨基酸序列见SEQ ID NO.5，轻链氨基酸序列见SEQ ID NO.6。

SEQ ID NO.5：对照抗体BMS-986016重链氨基酸序

QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSDYYWNWIRQPPGKGLEWIGEINHRGST NSNPSLKSRVTLSLDTSKNQFSLKLRSVTAADTAVYYCAFGYSDYEYNWFDPWGQGTLVT VSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO.6：对照抗体BMS-986016轻链氨基酸序列

EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSISSYLAWYQQKPGQAPRLLIYDASNRATGIPA RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQRSNWPLTFGQGTNLEIKRTVAAPSVFIFPPSDE QLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

实施例2：人源化抗PD-L1单域抗体Fc融合蛋白hzB6-Fc和hzF2-Fc

利用人PD-L1重组蛋白抗原(PD-L1序列号：NP_054862.1，19aa-238aa)免疫骆驼，分离外周血单核细胞(PBMC)并提取总RNA进行反转录，以反转录产物为模板构建骆驼免疫库。随后利用PD-L1重组蛋白通过固相筛选的方法对所构建的骆驼免疫库进行筛选，获得特异性噬菌体展示单域抗体VHH-B6和VHH-F2，然后将可变区基因进行人源化改造，获得人源化的hzB6(SEQ ID NO.7)和hzF2(SEQ ID NO.8)的序列，将其分别克隆入含有人Fc(IgG1，hFc，SEQ ID NO.9)编码基因的真核表达载体(PPT5，北京华越洋生物，货号VECT6098)上，构建hzB6-Fc和hzF2-Fc的重组抗体，具体序列如下，其中，CDR以 Kabat定义。

SEQ ID NO.7：人源化单域抗体hzB6可变区氨基酸序列(CDRs 1、2和3分别为SEQID NO.20、21和22)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASEYIGDRYCAGWFRQAPGKEREGVAMIDRHGIVRYKDSVEGRFTISRNHAGNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADRDPTNVIPCRPEYPDMDY WGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.8：人源化单域抗体hzF2可变区氨基酸序列(CDRs 1、2和3分别为SEQID NO.23、24和25)

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASRDSDEGASCMGWFRQAPGKEREGVAIIFNAGERTDYGDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATVWCGSWVARSWGQGTL VTVSS

SEQ ID NO.9：人IgG1 Fc区氨基酸序列

ASEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

实施例3：抗人LAG-3与PD-L1双特异抗体的制备

利用分子克隆的方法在实施例1得到的hz7F10的重链表达载体上进行双特异表达载体的构建，所述双特异抗体结构示意图如图1所示。分别构建hz7F10-hzB6(SEQ IDNO.11) 和hz7F10-hzF2(SEQ ID NO.12)的重链重组表达载体，其中linker的氨基酸序列如SEQ ID NO.10(GGGGSPGGGSPGGGS)所示。

SEQ ID NO.10：linker氨基酸序列

GGGGSPGGGSPGGGS

SEQ ID NO.11：hz7F10-hzB6重链氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVNIKDDYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPED VETKYDPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFYSNYVNYFDQWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSPGGGSPGGGSEVQLVESGGGLVQ PGGSLRLSCAASEYIGDRYCAGWFRQAPGKEREGVAMIDRHGIVRYKDSVEGRFTISRNH AGNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAADRDPTNVIPCRPEYPDMDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.12：hz7F10-hzF2重链氨基酸序列

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVNIKDDYMHWVRQAPGQGLEWIGRIDPED VETKYDPKFQGRVTITADTSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARSFYSNYVNYFDQWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAV LQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEA AGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSPGGGSPGGGSEVQLVESGGGLVQ PGGSLRLSCAASRDSDEGASCMGWFRQAPGKEREGVAIIFNAGERTDYGDSVKGRFTISR DNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCATVWCGSWVARSWGQGTLVTVSS

将hz7F10-hzB6和hz7F10-hzF2的重链重组表达载体与实施例1得到hz7F10的轻链(SEQ ID NO.13)重组表达载体共转染HEK293细胞进行瞬时表达，纯化后获得hz7F10-hzB6和 hz7F10-hzF2的双抗重组蛋白纯品用于后续实验。

SEQ ID NO.13：hz7F10轻链氨基酸序列

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASENVGTYVSWFQQKPGKAPKLLIYGASNRYTG VPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSYPYTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPS DEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

实施例4：抗人LAG-3/PD-L1双特异抗体结合活性分析

4.1SRP测定与重组蛋白的结合活性

使用Reichert公司的4SPR型号仪器，利用Anti-human Fc antibody捕获法对hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2进行亲和力测定。首先通过氨基偶联方法将anti human Fcantibody 固定在芯片表面，随后进行亲和力测定：用HBS-EP将目标抗体稀释至40ug/ml，25uL/min，注射2min；将抗原从200nM 2倍梯度稀释8个浓度，25uL/min，结合2min，解离3min。最后，使用3M MgCl₂对葡聚糖芯片(13206066)再生30ses，以循环检测下一样品。结果显示(表1)，当前实验条件下，hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2与LAG-3结合的亲和力与裸抗体hz7F10相近，与阳性对照抗体BMS-986016也相近；hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2与PD-L1 结合的亲和力与裸抗体hzB6-Fc和hzF2-Fc，与阳性对照抗体BMS-986016也相近。

表1.hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2与人LAG-3/PD-L1重组蛋白亲和力测定

4.2BLI测定LAG-3/PD-L1双特异抗体同时结合LAG-3/PD-L1的情况

利用Fortebio公司的OctetQKesystem仪器，采用抗人抗体Fc段的捕获抗体(AHC)生物探针捕获抗体Fc段的方法测定hz7F10-hzB6同时与LAG-3/PD-L1结合的特性。具体操作如下。

将hz7F10-hzB6抗体用PBS缓冲液稀释至4μg/ml，流经AHC探针(Cat:18-0015，PALL) 表面，时间为120s。使用人LAG-3胞外区融合蛋白(义翘神州，Cat:16498-H08H)60nM作为流动相，结合时间为300s，然后以PD-L1(NCBI序列号：NP_054862.1)60nM作为流动相，结合时间300s，解离时间300s。类似的进行首先PD-L1作为第一流动结合相，LAG-3 作为第二流动结合相。实验结果如图2，结果表明hz7F10-hzB6在结合了一侧的LAG-3/PD-L1 后，对与另一侧PD-L1/LAG-3的结合不产生影响。

4.3FACS分析LAG-3/PD-L1双特异抗体与细胞表面抗原的结合活性

使用LAG-3(NCBI登录号：NP_002277.4)全长质粒瞬转HEK293细胞，48h后离心收集细胞，将细胞分为5×10⁵cells/样品/100μL，加入梯度稀释的待测抗体，加入的抗体终浓度为：最高浓度132nM，3倍连续稀释10个梯度。冰上孵育2h，冰冷PBS洗涤细胞2遍；加入FITC标记的抗人Fc二抗(Cat.:F9512，Sigma)，冰上孵育1h，冰冷PBS(含0.05％吐温)洗涤细胞2遍，重悬于200μL流式缓冲液中，流式细胞仪(型号B49007AD，SNAW31211， BECKMANCOULTER)检测细胞的平均荧光强度(MFI)。检测结果显示(图3)，hz7F10-hzB6、 hz7F10-hzF2与表达在细胞表面的LAG-3结合活性与裸抗体hz7F10相当，EC50值见表2。

与之类似，取肿瘤细胞MBA-MD-231，5×10⁵cells/样品/100μL，方法同HEK293-LAG-3，检测结果同样显示(图4)，hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2与表达在细胞表面的PD-L1的结合活性与裸抗体hzB6-Fc和hzF2-Fc相近，与阳性对照抗体BMS-986016也相近，EC50值见表2。

表2.hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2与细胞表面抗原结合活性(EC50：nM)

实施例5：LAG-3/PD-L1双特异抗体种属交叉分析

将人重组蛋白LAG-3(购自义翘神州，Cat:16498-H08H)、人重组蛋白PD-L1(NCBI序列号：NP_054862.1)，猴重组蛋白LAG-3(Cat:C998，近岸蛋白质科技有限公司)、猴重组蛋白PD-L1(Cat:CC29，近岸蛋白质科技有限公司)，鼠重组蛋白LAG-3(Cat:53069-M08H，北京义翘神州科技股份有限公司)、鼠PD-L1(Cat:50010-M08H，北京义翘神州科技股份有限公司50010-M08H-B)、大鼠PD-L1(Cat:80450-R08H，北京义翘神州科技股份有限公司)，用PBS稀释至1μg/mL，100μL/孔包被酶联板，4℃包被过夜；5％BSA封闭液37℃恒温培养箱封闭60min，PBST洗板3次；加入稀释至1μg/mL的hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2、hz7F10、 BMS-986016，37℃反应60min，PBST洗板4次；加入1:5000稀释的HRP-羊抗人 IgG(Cat:109-035-098，Jackson Immuno Research)反应45min，PBST洗板4次；最后加入TMB 底物显色，37℃恒温培养箱反应15min，2MHCl终止反应，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度。结果如图5、表3所示，hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2与人猴LAG-3/PD-L1均特异性结合，而与鼠LAG-3/PD-L1不结合；抗LAG-3对照抗体BMS-986016与人、猴LAG-3 特异性结合，与小鼠LAG-3不结合。

表3.hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2与人、猴、鼠LAG-3/PD-L1重组蛋白的结合活性(EC50， nM)

实施例6：LAG-3/PD-L1双特异抗体阻断活性分析

6.1FACS鉴定hz7F10-hzB6对LAG-3/MHCII类分子的阻断活性

消化并离心收集A375细胞，计数为3×10⁵cells/样品/100μL；稀释hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2及对照抗体BMS-986016，以40nM起始，1.3倍倍比稀释10个梯度；加入重悬好的A375细胞，冰上孵育1h，冰冷PBS洗涤细胞2遍；稀释LAG-3-mFc至30nM,加入已结合抗体的A375细胞，冰上孵育1h，冰冷PBS洗涤细胞2遍；加入FITC标记的抗鼠Fc 二抗(Cat：F9006，Sigma)，冰上孵育1h，冰冷PBS洗涤细胞2遍，重悬于200μL流式缓冲液中，流式细胞仪检测。检测结果如图6、表4所示，hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2可明显阻断LAG-3与A375细胞表面MHCII类分子的结合活性，其阻断活性与对照抗体 BMS-986016相当。

表4.hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2对A375细胞表面MHCII类分子与LAG-3结合的阻断活性

6.2ELISA鉴定hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2对LAG-3/FGL1的阻断活性

将人重组蛋白FGL1(Cat:13484-H08B，北京义翘神州科技股份有限公司)，用PBS稀释至1μg/mL，100μL/孔包被酶联板，4℃包被过夜；5％BSA封闭液37℃恒温培养箱封闭60min，PBST洗板3次；梯度稀释hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2、hz7F10、BMS-986016，10nM 起始3倍稀释12个梯度，然后加入终浓度0.25ug/ml的LAG-3-mFc,混合后加入酶联板，37℃反应60min，PBST洗板4次；加入1:5000稀释的HRP抗小鼠IgG(Cat：115-035-071，Jackson ImmunoResearch)反应45min，PBST洗板4次；最后加入TMB底物显色，37℃恒温培养箱反应15min，2MHCl终止反应，读取并记录波长450nm下孔板的吸光度。结果如图7、表5 所示，hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2均可特异性阻断LAG-3与FGL1的结合，其阻断活性与对照抗体BMS-986016相当。

表5.hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2对FGL1与LAG-3结合的阻断活性

6.3报告基因系统检测hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2对PD-1/PD-L1通路的阻断活性

程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)是一种在活化T细胞上表达的受体，它与配体PD-L1和PD-L2的结合对免疫应答具有负向调节作用。CHO-K1细胞表面的TCR具有正向调节作用，可激活T细胞内的NFAT通路。当两种细胞共同培养时，PD-1/PD-L1相互作用抑制T 细胞活性，使癌细胞逃避免疫监视。当有抗体阻断该通路时，T细胞内的NFAT通路则可介导底物发光。

CHO-PD-L1-CD3L细胞，胰酶消化，用完全培养基终止反应。细胞计数，用完全培养基调整细胞密度为4x10⁵cell/ml,100μl每孔铺到板子上。(4×10⁴cell/孔)，37℃，5％CO₂培养，过夜；用工作培养基稀释抗体至2×起始浓度，再进行1.5倍稀释，共12个点，抗体初始浓度最大稀释倍数为10倍；Jurkat-PD1-NFAT细胞，细胞计数,1000rpm离心5min，用工作培养基重悬，将细胞密度调整至1.2×10⁶cell/ml；弃CHO-PD-L1-CD3L细胞上清，将已梯度稀释的样品加入至96孔白色细胞板，50μl/孔，每个浓度点设置复孔。室温放置1h；将制备好的Jurkat-PD1-NFAT细胞悬液50μl/孔加入至96孔板相应位置(6×104cell/孔)，完成Jurkat-PD1-NFAT细胞的铺板后，将白色96孔板置于37℃、5％CO₂恒温培养箱中孵育6h；提前1～2h取出Bio-Lite Luciferase Assay System底物并融化，室温避光放置至室温。从培养箱取出细胞板，平衡至室温后(约10～15min)，向细胞板50μl/孔加入Bio-Lite底物，避光孵育5min。用酶标仪为Luminescence模式，Intergration选择100，读取RLU。检测结果显示(图8，表6)，hz7F10-hzB6、hz7F10-hzF2可明显阻断PD-1/PD-L1信号通路，且阻断效果与纳米抗体hzB6-Fc、hzF2-Fc相当。

表6.hz7F10-hzB6对PD-1/PD-L1信号系统的的阻断活性(单位nM)

实施例7：LAG-3/PD-L1双特异性抗体对表达LAG-3和PD-L1的细胞交联作用分析

瞬时转染带有OFP红光标签的LAG-3-OFP(NCBI登录号：NP_002277.4)质粒至HEK293 细胞，待2天后收集细胞；消化高表达人PD-L1的CHO细胞并计数，调细胞密度为3×10⁷cells/ml，将CHO-PD-L1-CD3L细胞按照1:500加入CFSE(CFSE Cell Division TrackerKit, Cat:423801)染料，于37°放置30min，在离心机以400g离心5min，去除上清液，用PBS洗一次细胞；稀释不同抗体(hz7F10\hzB6-Fc\hzF2-Fc\hz7F10-hzB6\hz7F10-hzB6\NC-IgG1)， 100nM起始，3倍稀释8个梯度，分别加入U型底96孔板中，加入PBS洗涤后的 CHO-PD-L1-CD3L细胞混合，细胞终密度：1.5×10⁵cells/well，4℃放置30min，于400g离心5min，用PBS洗4次细胞，并用PBS重悬细胞；向U型底96孔板的上述CHO-PD-L1-CD3L 的细胞悬液中加入计数好的HEK-293-LAG3-OFP细胞，该细胞终密度：1×10⁵cells/well，室温放置1h后进行流式细胞仪检测；FITC通道和PC 5.5通道的双阳性细胞的比例可反映出双特异性抗体引起的细胞交联情况。结果显示(图9)，hz7F10-hzB6可剂量依赖地引起 CHO-PD-L1细胞与HEK293-LAG-3细胞发生交联。

实施例8：LAG-3/PD-L1双特异抗体对人PD-1/PD-L1/LAG-3转基因小鼠皮下移植MC38-hPDL1鼠结肠癌肿瘤模型的抗肿瘤药效

将高表达人PD-L1的鼠结肠癌肿瘤细胞MC38-hPDL1接种于雌性 hPD-1/hPD-L1/hLAG-3转基因小鼠(C57来源的PD-1/PD-L1/LAG-3人源化小鼠，百奥赛图江苏基因生物技术有限公司，6-8周)右侧前胁肋部皮下，在肿瘤生长至100mm³左右时分组给药，共4组，每组6只，分别为：hz7F10-hzF2(6mg/kg,ip,Biw×3周)组、hz7F10-hzB6 (6mg/kg,ip,Biw×3周)组、hz7F10(5mg/kg,ip,Biw×3周)组、NC-hIgG1(6mg/kg,ip,Biw ×3周)组。每周测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系。

结果显示(图10)，受试药物hz7F10(TGI:13％)无抑制肿瘤生长的活性，而hz7F10-hzF2 (TGI:58％)及hz7F10-hzB6(TGI:69％)均有效地抑制了肿瘤的生长(图10B)，同时各组间小鼠体重生长无显著性差异(图10A)，表明hz7F10、hz7F10-hzF2和hz7F10-hzB6的毒副作用很小甚至没有。

实施例9：LAG-3/PD-L1双特异抗体对人PBMC免疫重建小鼠皮下移植H1975人肺腺癌细胞肿瘤模型的抗肿瘤药效

将人源肺癌H1975细胞接种于PBMC免疫系统人源化雄性NCG小鼠(江苏集萃药康生物科技有限公司，22-24g)右侧前胁肋部皮下，在肿瘤生长至约60mm3左右时分组给药，共5组，每组6只，分别为：hz7F10-hzF2(20mg/kg,ip,TIW×9次)组、hz7F10-hzB6 (20mg/kg,ip,TIW×9次)组、hz7F10(15mg/kg,ip,TIW×9次)组、hzB6-Fc(12mg/kg,ip,TIW ×9次)组、NC-hIgG1(20mg/kg,ip,TIW×9)组。每周测量肿瘤体积及体重，记录荷瘤鼠体重和肿瘤体积的变化与给药时间的关系。

结果如图11所示，本条件下，抗LAG-3抗体hz7F10(TGI:-1％)与抗PD-L1抗体hzB6-Fc (TGI:14％)均无抑制肿瘤生长的活性，而双特异性抗体hz7F10-hzF2(TGI:52％)及hz7F10-hzB6(TGI:60％)可显著抑制肿瘤生长(图11B)；同时各组间小鼠体重生长无显著性差异(图11A)，表明hz7F10、hz7F10-hzF2和hz7F10-hzB6的毒副作用很小甚至没有。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 迈威（上海）生物科技股份有限公司

<120> 靶向LAG-3和PD-L1的新型双特异抗体及其应用

<150> 202110695985.4

<151> 2021-06-23

<160> 25

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Tyr

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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

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Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

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<210> 3

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

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1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Val Asn Ile Lys Asp Asp

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

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Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Val Glu Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

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Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 329

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

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225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

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Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

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305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

325

<210> 5

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu

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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Asp Tyr

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Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

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Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

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Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

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Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr

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Cys Ala Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

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<400> 8

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Ser Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly

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Val Ala Ile Ile Phe Asn Ala Gly Glu Arg Thr Asp Tyr Gly Asp Ser

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

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<210> 10

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 11

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

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1 5 10 15

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Glu Asp Val Glu Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Phe Tyr Ser Asn Tyr Val Asn Tyr Phe Asp Gln Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly Ser Pro Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

465 470 475 480

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Asp Ser Asp Glu Gly

485 490 495

Ala Ser Cys Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu

500 505 510

Gly Val Ala Ile Ile Phe Asn Ala Gly Glu Arg Thr Asp Tyr Gly Asp

515 520 525

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr

530 535 540

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

545 550 555 560

Tyr Cys Ala Thr Val Trp Cys Gly Ser Trp Val Ala Arg Ser Trp Gly

565 570 575

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

580 585

<210> 13

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Lys Ala Ser Glu Asn Val Gly Thr Tyr Val Ser

1 5 10

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gly Gln Ser Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Asp Asp Tyr Met His

1 5

<210> 18

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Arg Ile Asp Pro Glu Asp Val Glu Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 19

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Ser Phe Tyr Ser Asn Tyr Val Asn Tyr Phe Asp Gln

1 5 10

<210> 20

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Glu Tyr Ile Gly Asp Arg Tyr Cys Ala Gly

1 5 10

<210> 21

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

Met Ile Asp Arg His Gly Ile Val Arg Tyr Lys Asp Ser Val Glu Gly

1 5 10 15

<210> 22

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

Asp Arg Asp Pro Thr Asn Val Ile Pro Cys Arg Pro Glu Tyr Pro Asp

1 5 10 15

Met Asp Tyr

<210> 23

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

Arg Asp Ser Asp Glu Gly Ala Ser Cys Met Gly

1 5 10

<210> 24

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Ile Ile Phe Asn Ala Gly Glu Arg Thr Asp Tyr Gly Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 25

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Thr Val Trp Cys Gly Ser Trp Val Ala Arg Ser

1 5 10

Claims

1.一种双特异性结合分子，其特征在于，包括：

第一抗原结合部，所述第一抗原结合部包括：

第一肽段，所述第一肽段包括第一重链可变区和第一轻链可变区，其中，所述第一重链可变区的互补决定区(CDR)包括H1-CDR1、H1-CDR2和H1-CDR3，所述第一轻链可变区的CDR包括L1-CDR1、L1-CDR2和L1-CDR3；

第二肽段，所述第二肽段包括第二重链可变区和第二轻链可变区，其中，所述第二重链可变区的CDR包括H2-CDR1、H2-CDR2和H2-CDR3，所述第二轻链可变区的CDR包括L2-CDR1、L2-CDR2和L2-CDR3，且所述第二肽段与所述第一肽段共价连接；

第二抗原结合部，所述第二抗原结合部包括:

第三肽段，所述第三肽段为纳米抗体，包括第三重链可变区，且与所述第一肽段的C端通过接头相连，所述第三重链可变区的CDR包括H3-CDR1、H3-CDR2和H3-CDR3。

2.根据权利要求1所述的双特异性结合分子，其特征在于，所述第一抗原结合部含特异性结合程序性细胞死亡-配体1(PD-L1)，所述第二抗原结合部特异性结合淋巴细胞活化基因-3(LAG3)。

3.根据权利要求2所述的双特异性结合分子，其特征在于，所述双特异性结合分子包含Fc结构域，所述Fc结构域是IgG，特别是IgG1 Fc结构域，

任选地，所述Fc结构域包含L234A和L235A点突变。

4.根据权利要求2所述的双特异性结合分子，其特征在于，所述H1-CDR1包含SEQ IDNO：17所述的氨基酸序列，所述H1-CDR2包含SEQ ID NO：18所述的氨基酸序列和所述H1-CDR3包含SEQ ID NO：19所述的氨基酸序列，且所述L1-CDR1包含SEQ ID NO：14所述的氨基酸序列、L1-CDR2包含SEQ ID NO：15所述的氨基酸序列和L1-CDR3包含SEQ ID NO：16所述的氨基酸序列，

任选地，所述H2-CDR1、H2-CDR2和H2-CDR3的氨基酸序列分别与所述H1-CDR1、H1-CDR2和H1-CDR3的氨基酸序列相同，且所述L2-CDR1、L2-CDR2和L2-CDR3的氨基酸序列分别与所述L1-CDR1、L1-CDR2和L1-CDR3的氨基酸序列相同。

5.根据权利要求2所述的双特异性结合分子，其特征在于，所述H3-CDR1、H3-CDR2和H3-CDR3选自下列组之一：

(a)所述H3-CDR1包含SEQ ID NO：20所述的氨基酸序列，所述H3-CDR2包含SEQ ID NO：21所述的氨基酸序列和所述H3-CDR3包含SEQ ID NO：22所述的氨基酸序列；

(b)所述H3-CDR1包含SEQ ID NO：23所述的氨基酸序列，所述H3-CDR2包含SEQ ID NO：24所述的氨基酸序列和所述H3-CDR3包含SEQ ID NO：25所述的氨基酸序列。

6.根据权利要求2所述的双特异性结合分子，其特征在于，所述第一重链可变区包括SEQ ID NO：3所述的氨基酸序列，所述第一轻链可变区包括SEQ ID NO：1所述的氨基酸序列。

7.根据权利要求2所述的双特异性结合分子，其特征在于，所述第一肽段进一步包括第一轻链恒定区和第一重链恒定区，且所述第二肽段进一步包括第二轻链恒定区和第二重链恒定区，

任选地，所述第一轻链恒定区与所述第二轻链恒定区均包括SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列，

任选地，所述第一重链恒定区与所述第二重链恒定区均包括SEQ ID NO：4所述的氨基酸序列。

8.根据权利要求2所述的双特异性结合分子，其特征在于，所述第三重链可变区包括SEQ ID NO：7或8所示的氨基酸序列。

9.根据权利要求2所述的多肽复合物，其特征在于，所述多肽复合物进一步包括：

第四肽段，所述第四肽段包括第四重链可变区，且与所述第二肽段的C端通过所述接头相连。

10.根据权利要求9所述的双特异性结合分子，其特征在于，所述第四肽段为纳米抗体，且具有与所述第三肽段相同的CDR序列。

11.根据权利要求10所述的双特异性结合分子，其特征在于，所述第四重链可变区包括SEQ ID NO：7或8所示的氨基酸序列。

12.根据权利要求1所述的双特异性结合分子，其特征在于，所述接头具有(G4S)_2-4或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

13.根据权利要求2所述的双特异性结合分子，其特征在于，所述双特异性结合分子的重链具有SEQ ID NO:11或12所示的氨基酸序列，

任选地，所述双特异性结合分子的轻链具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

14.一种组合物，其特征在于，包含：

权利要求1-13中任一项所述的双特异性结合分子；以及

可选的药学上可接受的辅料。

15.根据权利要求14所述组合物，其特征在于，还包含生物治疗剂、化学治疗剂和天然活性成分中的至少一种。

16.根据权利要求15所述组合物，其特征在于，所述组合物的剂型为水剂、针剂或粉针剂。

17.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1-13中任一项所述双特异性结合分子中的抗体重链和/或抗体轻链。

18.一种核酸构建体，其特征在于，包含权利要求17所述的多核苷酸。

19.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求17所述的多核苷酸或权利要求18所述的核酸构建体。

20.一种制备权利要求1-13中任一项所述双特异性结合分子的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在适合表达重组外源蛋白的条件下培养权利要求19所述宿主细胞；

21.权利要求1-13中任一项所述双特异性结合分子、权利要求14-16中任一项所述组合物、权利要求17所述多核苷酸、权利要求18所述核酸构建体、或权利要求19所述宿主细胞在结合并抑制LAG3和PD-1功能中的应用，其中，所述LAG3和PD-1源自人或食蟹猴。

22.权利要求1-13中任一项所述双特异性结合分子、权利要求14-16中任一项所述组合物、权利要求17所述多核苷酸、权利要求18所述核酸构建体、或权利要求19所述宿主细胞在抑制或阻断LAG-3/MHCII、LAG-3/FGL1、和/或PD-1/PD-L1信号通路中的应用。

23.权利要求1-13中任一项所述双特异性结合分子、权利要求14-16中任一项所述组合物、权利要求17所述多核苷酸、权利要求18所述核酸构建体、或权利要求19所述宿主细胞在桥连LAG-3阳性细胞和PD-L1阳性细胞中的应用。

24.权利要求1-13中任一项所述双特异性结合分子、权利要求14-16中任一项所述组合物、权利要求17所述多核苷酸、权利要求18所述核酸构建体、或权利要求19所述宿主细胞在制备治疗LAG-3和/或PD-L1信号通路异常相关疾病药物中的用途。

25.如权利要求24所述的用途，其特征在于，所述LAG-3和/或PD-L1信号通路异常相关疾病包括异常增生性疾病或免疫相关疾病。

26.根据权利要求25所述用途，其特征在于，所述异常增殖性疾病包括肿瘤、囊肿和增生；所述免疫相关疾病包括炎症、免疫缺陷、免疫耐受和过敏，

任选地，所述肿瘤为结肠癌或肺癌。