TWI659969B - 一種抗ｐｄ－１的單株抗體及其獲得方法 - Google Patents

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Abstract

一種抗PD-1的單株抗體及其獲得方法，包含編碼所述抗體的可變區和互補決定區的胺基酸序列，獲得方法及單株抗體的用途。本發明從全合成抗體庫中篩選出抗PD-1的單株抗體，然後通過噬菌體庫鏈置換的方法進行親和力成熟，先對初篩獲得的單株抗體的輕鏈CDR1、2、3區突變建庫篩選後，選取親和力較高的單株抗體，再對其重鏈CDR1、2、3區突變建庫進行篩選，最終篩選到了高親和力的抗PD-1的單株抗體。本發明所得到的PD-1全人源抗體對PD-1具有良好的親和力並能夠抑制PD-1與其配體的結合，可用於腫瘤、炎症、自身免疫性疾病的治療。

Description

一種抗PD-1的單株抗體及其獲得方法
本發明涉及抗體工程技術領域，具體涉及全人源的抗PD-1的單株抗體及其獲得方法與應用。
免疫調節在機體免疫應答過程中起著極其重要的作用，而免疫活性細胞的活化對整個免疫應答的調節極其關鍵。研究表明，T細胞活化和增殖依賴於雙重信號途徑。“協同刺激信號”的概念是1970年Bretscher和Cohn在T細胞活化雙信號模型的基礎上提出來的，即T細胞的活化不僅需要通過APC遞呈MHC-抗原肽複合物給抗原特異性T細胞來提供第一信號外，還需要多種協同刺激分子參與提供輔助的第二信號(協同刺激信號)；隨著研究的深入，協同刺激信號逐漸成為免疫學的熱點領域；這些協同信號分子主要包括CD28/B7和TNFR/TNF兩大超家族。PD-1/PD-L1作為CD28/B7超家族的成員，能介導負性協同刺激信號。PD-1/PD-L1信號通路能有效抑制T、B細胞功能，使T細胞增殖受抑，同時減少細胞因數IL-2、IL-10和IFN-γ的分泌，在免疫調節中發揮著重要的作用，並在腫瘤免疫、自身免疫、移植免疫、哮喘、病毒感染等疾病的研究中有著重要的意義。
PD-1屬於免疫球蛋白超家族I型跨膜蛋白，分子量約為50-55KD。最初是在凋亡的T細胞雜交瘤中通過消減雜交技術得到的，因其與 細胞凋亡有關，故命名為程式性細胞死亡因數1(Programmed Cell Death 1)。PD-1的編碼基因是PD-CD1，定位於人染色體2q37.3，和CTLA4基因具有23%的同源性。PD-1由胞內區、跨膜區和胞外區構成，其胞外區包含一個免疫球蛋白可變區IgV樣結構域；其胞內區N端的兩個酪氨酸殘基與其他胺基酸殘基共同組成了一個免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)，ITIM通過酪氨酸的磷酸化發揮拮抗抗原受體刺激信號的功能，從而在免疫應答過程中發揮負性調控功能；PD-1分子可在活化的T細胞、B細胞、NK細胞、單核細胞和樹突狀細胞表面誘導性地表達，並與其配體PD-L1、PD-L2相結合而對淋巴細胞的活化產生抑制作用，從而抑制免疫細胞的免疫應答反應。
PD-L1(CD274或B7H1)和PD-L2(CD273或B7DC)是PD1的兩個配體，這兩個配體基因均定位於人染色體9p24.2，並起始於同一方向，間隔42kb左右；它們同屬B7家族，因而同其他成員一樣，在蛋白結構上PD-L1和PD-L2均由IgV樣結構域、IgC樣結構域、跨膜區和短而保守的胞質區尾巴組成；與PD-L2相比，PD-L1的胞質尾巴在不同種屬間更為保守。PD-L1在活化的T細胞、B細胞、樹突狀細胞、單核細胞和多種類型的腫瘤細胞(如肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌、腎癌、頭頸癌、食道癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌等)上誘導性表達；PD-L2主要表達於活化的巨噬細胞、樹突細胞和個別腫瘤細胞(如霍奇金淋巴瘤)上。腫瘤表面的PD-L1與PD-1相互作用，可導致腫瘤抗原特異性T細胞凋亡，使腫瘤細胞逃脫機體免疫監控。抗PD-1的單抗通過阻斷PD-1/PD-L1信號通路促進腫瘤抗原特異性T細胞增殖，發揮殺傷腫瘤細胞的作用，能有效提高免疫治療效果，具有治療多種類型腫瘤的潛力。
目前多家大型國際製藥公司都在進行針對PD-1或PD-L1的單抗藥物(如表1所示)，其中百事美施貴寶的PD-1抑制劑Opdvio(Nivolumab)於2014年7月獲日本批准上市；默沙東的PD-1抑制劑於2014年9月獲FDA批准上市；這兩個藥物的首個適應症均為黑色素瘤。隨著各公司臨床項目的推進，適應症已擴展到肺癌、乳腺癌、血液癌症等領域。
目前全人源性抗體是治療性抗體發展的主要方向，抗體庫技術的出現為人源抗體的製備篩選提供了良好的技術平臺。抗體庫技術繞過了以往單抗研製過程中必須的雜交瘤過程，甚至不需要經過免疫過程即可獲得各種抗體基因及抗體分子片段。噬菌體抗體庫是最早出現也是目前應用最廣泛的抗體庫。
噬菌體展示技術是由Smith首先建立的一種將編碼外源蛋白或多肽的基因插入噬菌體衣殼蛋白基因，使外源蛋白或多肽與噬菌體衣殼蛋白融合表達於噬菌體表面的技術。噬菌體抗體庫就是利用了上述原理將不同特異性的抗體或其功能性片段(Fab、Fv、ScFv)表達在噬菌體表面，再用抗原進行篩選。噬菌體抗體庫根據抗體基因的來源分為免疫庫和非免疫庫，非免疫庫又包括天然庫、半合成庫和全合成庫。噬菌體抗體庫的篩選模擬了抗體親和力成熟的過程，通常將抗原包被在固相介質上，加入待篩選的噬菌體抗體庫，通過數輪“吸附-洗滌-洗脫-擴增”的過程(即淘選)直至篩選到高親和力特異的抗體。
本發明提供了一種抗PD-1的單株抗體；本發明從全合成抗體庫中篩選出抗PD-1的單株抗體，然後通過電腦輔助設計分析，構建小容量合成噬菌體抗體輕鏈庫的方法，對初篩獲得的抗PD-1單株抗體DFPD1-1輕鏈的互補決定區CDR1、2、3區突變建庫；篩選後，選取親和力較高的單株抗體DFPD1-3和DFPD1-7，再對其重鏈CDR1、2、3區突變建庫進行篩 選，最終篩選到了高親和力的抗PD-1的單株抗體。
為實現上述目的，本發明一種抗PD-1的單株抗體的獲得過程包括：
(1)、抗PD-1單鏈抗體的生物淘選，通過三輪抗體庫的富集篩選，從全合成的ScFv噬菌體庫中獲得了一種親和力較高的抗體序列DFPD1-1，其重鏈為DFPD1-H1(SEQ ID NO：1)，輕鏈為DFPD1-L1(SEQ ID NO：5)。
(2)、以DFPD1-1為基礎，通過電腦三級結構類比，構建輕鏈互補決定區CDR1、2、3突變庫並對該抗體庫進行生物淘選和陽性克隆的篩選及鑒定，獲得了6種不同輕鏈的抗體序列DFPD1-2、DFPD1-3、DFPD1-4、DFPD1-5、DFPD1-6、DFPD1-7，他們對應的輕鏈序列分別為DFPD1-L2(SEQ ID NO：6)、DFPD1-L3(SEQ ID NO：7)、DFPD1-L4(SEQ ID NO：8)、DFPD1-L5(SEQ ID NO：9)、DFPD1-L6(SEQ ID NO：10)、DFPD1-L7(SEQ ID NO：11)；將上述7種單鏈抗體在噬菌體水準進行親和力比較。
(3)、選出兩株親和力較高的克隆DFPD1-3和DFPD1-7，構建重鏈互補決定區CDR1、2、3庫並對該庫進行生物淘選和陽性克隆的篩選，獲得了五種不同的單鏈抗體序列DFPD1-9，DFPD1-10、DFPD1-11、DFPD1-12、DFPD1-13。其中DFPD1-9、DFPD1-11和DFPD1-12的輕鏈可變區序列是DFPD1-L3，而DFPD1-10和DFPD1-13的輕鏈可變區序列是DFPD1-L7；DFPD1-9和DFPD1-10的重鏈可變區序列是DFPD1-H2(SEQ ID NO：2)，DFPD1-11和DFPD1-13的重鏈可變區是DFPD1-H3(SEQ ID NO：3)，DFPD1- 12的重鏈可變區是DFPD1-H4(SEQ ID NO：4)。將上述單鏈抗體在噬菌體水準上進行親和力比較。
(4)、將(3)中所述單克隆重鏈可變區基因和輕鏈可變基因及輕重鏈恒定區基因克隆到真核表達載體，轉染宿主細胞，獲得單株抗體的全抗體再進行親和力和其他生物學功能比較。
通過上述方法獲得的抗PD-1的單株抗體，包括：輕鏈和重鏈；所述輕鏈的互補決定區CDR1、CDR2和CDR3分別用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示；所述重鏈的互補決定區CDR1，CDR2和CDR3分別用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示；LCDR1包含SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的任一種；LCDR2包含SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：30中的任一種；LCDR3包含SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：36或SEQ ID NO：37中的任一種；HCDR1包含SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39；HCDR2包含SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：42中的任一種；HCDR3包含SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：44。輕鏈和重鏈具有相對應的五個組別，分別為：第一組：LCDR1、LCDR2和LCDR3分別選自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.33；HCDR1、HCDR2和HCDR3分別選自SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43；第二組：LCDR1、LCDR2和LCDR3分別選自SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.37；HCDR1、HCDR2和HCDR3分別選自SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43；第三組： LCDR1、LCDR2和LCDR3分別選自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.33；HCDR1、HCDR2和HCDR3分別選自SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43；第四組：LCDR1、LCDR2和LCDR3分別選自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.33；HCDR1、HCDR2和HCDR3分別選自SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.43；第五組：LCDR1、LCDR2和LCDR3分別選自SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.37；HCDR1、HCDR2和HCDR3分別選自SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43。
其中，所述輕鏈可變區胺基酸序列包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中的任一種。所述抗體包括輕鏈可變區和重鏈可變區，所述五個組別分別對應為：第一組：所述輕鏈可變區和所述重鏈可變區分別選自序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.2；第二組；所述輕鏈可變區和所述重鏈可變區分別選自序列SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.2；第三組：所述輕鏈可變區和所述重鏈可變區分別選自序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.3；第四組：所述輕鏈可變區和所述重鏈可變區分別選自序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.4；第五組：所述輕鏈可變區和所述重鏈可變區分別選自序列SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.3。
其中，所述重鏈可變區胺基酸序列包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4中的任一種。
其中，本發明還提供了一種包含上述輕鏈和重鏈的抗體、多肽或蛋白質。
其中，本發明還提供了一種包含上述輕鏈和重鏈的抗體，所述抗體能夠阻斷PD-1與其配體PD-L1的結合，抑制PD-1的生物學活性。
其中，本發明還提供了一種包含上述輕鏈和重鏈之多核苷酸序列的重組DNA表達載體。
其中，本發明還提供了一種包含上述多核苷酸序列的重組DNA表達載體；所述載體的DNA序列中包含編碼抗PD1抗體的重鏈可變區及恒定區或輕鏈可變區及恒定區序列的胺基酸序列。
其中，本發明還提供了一種轉染上述重組DNA表達載體的宿主細胞，所述宿主細胞包含大腸桿菌等原核細胞、酵母或哺乳動物細胞。
優選地，所述宿主細胞包含HEK293E細胞、CHO細胞或NS0細胞。
其中，本發明還提供了一種含有上述輕鏈和重鏈的抗體，用於全抗體、單鏈抗體、單域抗體、雙特異抗體、抗體藥物偶聯物或嵌合抗原受體T細胞免疫療法。
其中，本發明還提供了一種含有上述輕鏈和重鏈的單株抗體、人工載體、藥物或藥物組合物。
其中，本發明還提供了一種含有上述輕鏈和重鏈的檢測試劑或試劑盒。
其中，所述抗PD-1的單株抗體包含全長抗體和抗PD-1單株抗體的片段，所述片段包含但不限於Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或ScFv。
其中，所述全長抗體是全人源的。
其中，所述抗PD-1的單株抗體的重鏈恒定區包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；所述輕鏈恒定區包含Cκ或Cλ。
優選地，所述重鏈恒定區為IgG4。
優選地，所述輕鏈恒定區為Cκ。
其中，所述CDR為互補決定區(complementarity-determining region)；所述ScFv為單鏈抗體(single-chain fragment variable)；所述ADCs為抗體藥物偶聯物(antibody-drug conjugates)；所述CAR-T為嵌合抗原受體T細胞免疫療法(Chimeric Antigen Receptor T-Cel lImmunotherapy)；所述HEK293E細胞為人胚腎293E細胞(human embryonic kidney 293E cell)；CHO細胞為中國倉鼠卵巢細胞(chinese hamster ovary cell)；NS0細胞為小鼠NS0胸腺瘤細胞。
本發明相對于現有技術而言，具備的有益效果是：本發明提供的單株抗體可以通過消除、抑制PD-1活性來預防或治療疾病，其中所述疾病選自癌症、感染性疾病或免疫系統疾病。所述癌症包括但不限於肺癌、腎癌、黑色素瘤、乳腺癌、肝癌、頭頸癌、皮膚癌、鱗狀細胞癌、卵巢癌、骨癌、結直腸癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、霍奇金淋巴瘤、濾泡性淋巴瘤、慢性或急性白血病、實體瘤。所述感染性疾病包括不限於HIV病毒感染、肝炎病毒(A型、B型和C型)感染、皰疹病毒感染、流感病毒感染。所述免疫系統疾病包括不限於紅斑狼瘡、類風濕關節炎、強直性脊柱炎、重症肌無力、多發性硬化症、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性肝炎、硬皮病、結節性多動脈炎、Wegener肉芽腫病。
第1圖係本發明之pScFvDisb-s質粒圖譜
第2圖係本發明之輕鏈突變庫構建中以DFPD1-1為範本擴增的重鏈及linker區電泳圖
第3圖係本發明之輕鏈突變庫構建中以合成的輕鏈突變庫為範本擴增的輕鏈庫基因電泳圖
第4圖係本發明之輕鏈突變庫構建中通過擴增獲得的VLCDR123M-DFPD1-1突變庫的電泳圖
第5圖係本發明之輕鏈突變庫構建中通過NcoI-HF和NotI對質粒pScFvDisb-s進行雙酶切的酶切產物的電泳圖
第6圖係本發明之單克隆phage ELISA鑒定輕鏈突變庫中phage-Abs的相對親和力示意圖
第7圖係本發明之梯度稀釋phage ELISA鑒定輕鏈突變庫中phage-Abs的相對親和力示意圖
第8圖係本發明之重鏈突變庫構建中以合成的重鏈突變庫為範本擴增的重鏈庫基因的電泳圖
第9圖係本發明之重鏈突變庫構建中以DFPD1-3和DFPD1-7質粒為範本擴增的輕鏈及linker區的電泳圖
第10圖係本發明之重鏈突變庫構建中通過擴增獲得的VHCDR123M-DFPD1-3突變庫的電泳圖
第11圖係本發明之重鏈突變庫構建中通過擴增獲得的VHCDR123M- DFPD1-7突變庫的電泳圖
第12圖係本發明之單克隆phage ELISA鑒定重鏈突變庫中phage-Abs的相對親和力示意圖
第13圖係本發明之梯度稀釋phage ELISA鑒定重鏈突變庫中phage-Abs的相對親和力示意圖
第14圖係本發明之pTSE質粒載體圖
第15圖係本發明之全抗體與PD-1在分子水準上結合試驗示意圖
第16圖係本發明之全抗體與PD-L1的競爭抑制試驗示意圖
第17圖係本發明之全抗體與細胞表面的PD-1結合試驗示意圖
本發明詳細的實施方法參見實施例，實施例中所述的實驗方法和試劑，若無特殊說明均為常規實驗方法和試劑。以下實施例僅用於說明和解釋本發明，而不是以任何方式限制本發明。
本發明提供了一種特異性結合PD-1的單株抗體，所述重鏈可變區序列包含SEQ ID NO：1、2、3、4，所述輕鏈可變區序列包含SEQ ID NO：5、6、7、8、9、10、11。
優選地，所述特異性結合PD-1的單株抗體的重鏈可變區序列包含SEQ ID NO：2、3、4，所述輕鏈可變區序列選自SEQ ID NO：7、11。
通過輕鏈噬菌體庫篩選，所述抗體輕鏈或其功能性片段的輕鏈互補決定區LCDR1、LCDR2和LCDR3的胺基酸序列選自以下各胺基酸序列中的一組(如表2所示)。
表2、輕鏈各個CDR區的胺基酸序列
通過重鏈噬菌體庫篩選，所述抗體重鏈或其功能性片段重鏈的互補決定區CDR1、CDR2和CDR3分別用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示：HCDR1為SNNGMH(SEQ ID NO.38)或SNYGMH(SEQ ID NO.39)；HCDR2為VIWYDGSKK(SEQ ID NO.40)、VIWYDSSRK(SEQ ID NO.41)或VIWYDSTKK(SEQ ID NO.42)中的任一種；HCDR3為TAVYYCATNNDYW(SEQ ID NO.43)或TAVYYCATNTDYW(SEQ ID NO.44)。
優選地，通過重鏈噬菌體庫篩選，所述特異性結合PD-1的單株抗體包含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重鏈可變區及含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的輕鏈可變區。其中，所述重鏈可變區HCDR1序列為選自SNNGMH(SEQ ID NO.38)、SNYGMH(SEQ ID NO.39)的胺基酸；所述輕鏈可變區LCDR1序列為選自RASQSIHNYLD(SEQ ID NO.20)、RASQSVSNYLD(SEO ID NO.24)的胺基酸；所述重鏈可變區HCDR2序列為選 自VIWYDGSKK(SEQ ID NO.40)、VIWYDSSRK(SEQ ID NO.41)的胺基酸；所述輕鏈可變區LCDR2序列為選自NASTRAT(SEQ ID NO.27)、DASTRAT(SEQ ID NO.30)的胺基酸；所述重鏈可變區HCDR3序列為選自TAVYYCATNNDYW(SEQ ID NO.43)、TAVYYCATNTDYW(SEQ ID NO.44)的胺基酸；所述輕鏈可變區LCDR3序列為選自QQELHLPLT(SEQ ID NO.33)、QQNMQLPLT(SEQ ID NO.37)的胺基酸。
本發明利用全合成ScFv單鏈噬菌抗體庫獲得特異性抗體的方法，所述全人源的特異性結合PD-1的單株抗體是利用噬菌體抗體庫技術篩選而得，其步驟在於：
(1)、抗PD-1單鏈抗體的生物淘選，通過三輪抗體庫的富集篩選，獲得了一種親和力較高的抗體序列DFPD1-1。
(2)、以DFPD1-1為基礎，通過電腦輔助設計，構建輕鏈CDR1、2、3突變庫並對該抗體庫進行生物淘選和陽性克隆的篩選及鑒定，獲得了6種不同輕鏈的抗體序列DFPD1-2、DFPD1-3、DFPD1-4、DFPD1-5、DFPD1-6、DFPD1-7。將上述7種單鏈抗體在噬菌體水準進行親和力比較。
(3)、選出兩株親和力較高的克隆DFPD1-3和DFPD1-7，構建重鏈CDR1、2、3庫並對該庫進行生物淘選和陽性克隆的篩選，獲得了五種不同序列的單鏈抗體DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11，DFPD1-12，DFPD1-13。將上述單鏈抗體在噬菌體水準上進行親和力比較。
(4)、將(3)中所述單克隆重鏈可變區基因和輕鏈可變基因及輕重鏈恒定區基因克隆到真核表達載體，轉染宿主細胞，獲得單株抗體的全抗體，再進行親和力和其他生物學功能比較。
具體實施例：
以下結合附圖和實施例詳述本發明。
實施例1、抗PD-1單鏈抗體的生物淘選
採用一系列基因克隆的方法對pCom3載體(購自中國質粒載體菌株細胞株基因保藏中心)進行改造，使之用於噬菌體單鏈抗體庫的構建和表達。改造後的載體命名為pScFvDisb-s，其質粒圖譜如第1圖所示，並以此載體為基礎，構建全合成噬菌體抗體庫。
以PD-1-His為抗原包被免疫管，抗原包被量為5μg/500μl/管，4℃包被過夜。再用4%脫脂奶粉/PBST分別封閉免疫管和全合成噬菌體抗體庫，室溫封閉1h。封閉後的噬菌體抗體庫加入免疫管中進行抗原抗體結合，噬菌體投入量約為109-1012個，室溫反應1h。PBST-PBS洗去未結合的噬菌體，0.1M PH2.2的Glycine-HCl洗脫，用1.5M PH8.8的Tris-HCl中和洗脫下來的噬菌體抗體溶液至PH7.0左右。
將上述中和後的噬菌體感染10ml生長至對數期的TG1菌液，37℃培養箱中靜置30min，取出部分菌液進行梯度稀釋，塗布於2YTAG平板上，用於計算噬菌體產出量。剩餘的菌液離心棄上清，將菌體沉澱重懸於少量培養基，吸出後塗布於2YTAG大平板，為下一輪篩選做準備。
將上述感染後塗板的菌體從大平板上刮下，接菌至2YTAG液體培養基，搖至對數期後加入M13輔助噬菌體超感染，28℃培養過夜擴增噬菌體，PEG/NaCl沉降純化噬菌體用於下一輪篩選。共進行三輪噬菌體庫富集篩選。
實施例2、抗PD-1噬菌體單鏈抗體陽性克隆的篩選
經過三輪篩選後，挑取分隔良好的單克隆菌落，接種於加有2YTAG液體培養基的96孔深孔板，37℃，220rpm培養至其對數生長期，每孔加入約1010的輔助噬菌體M13KO7，37℃靜止感染30min。4000rpm，離心15min，棄去上清，菌體用2YTAK重懸沉澱，28℃，220rpm培養過夜。4000rpm，4℃離心15min，吸取擴增後的噬菌體上清進行ELISA鑒定。篩選得到親和力較高的單鏈抗體DFPD1-1，其重鏈可變區命名為DFPD1-H1，其胺基酸序列見SEQ ID NO：1：其輕鏈可變區命名為DFPD1-L1，胺基酸序列見SEQ ID NO：5。
實施例3、對篩選出的抗PD-1單鏈抗體DFPD1-1進行體外親和力成熟
3.1. DFPD1-1輕鏈CDR1、2、3突變庫的構建
設計引物PVLF1和PVLR1以合成的輕鏈突變庫(SEQ ID NO：12)為範本，PCR擴增輕鏈庫基因(第3圖)；設計引物PVHF1和PVHR1以DFPD1-1質粒為範本擴增其重鏈及linker區(第2圖)。反應條件：95℃ 30s，1 cycle；95℃ 15s，60℃ 10s，72℃ 30s，3 cycles；95℃ 15s，72℃ 40s，25 cycles，72℃ 5min，4℃保存。天根通用回收試劑盒回收PCR目的片段。
引物如下所示：PVLF1：5’-GATATCCAGATGACCCAGAGC-3’
PVLR1：5’-CTAAGCGGCCGCTTTGATCTCCACTTTGGTGC-3’
PVHF1：5’-CATACCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTG-3’
PVHR1：5’-GCTCTGGGTCATCTGGATATCGGATCCACCACC-3’
將上述兩部分PCR反應產物進行Overlap PCR擴增獲得DFPD1-1的輕鏈突變庫基因。反應條件：95℃ 30s，1 cycle；95℃ 15s，72℃ 30s，4 cycle；(加入引物PVHF1和PVLR1)，95℃ 15s，72℃ 40s，25 cycles；72℃ 5min，4℃保存。天根通用回收試劑盒回收PCR目的片段，對應的PCR產物命名為VLCDR123M-DFPD1-1(第4圖)。
用NcoI-HF和NotI對質粒pScFvDisb-s進行雙酶切，酶切產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳(第5圖)，切膠回收；用NcoI-HF和NotI分別對VLCDR123M-DFPD1-1 PCR產物進行雙酶切。PCR酶切產物採用通用回收試劑盒進行回收。回收後的PCR片段與pScFvDisb-s按摩爾比4：1比例經T4 DNA連接酶16℃連接4h。將連接產物電擊法轉化至TG1感受態中。使用SOC培養基37℃培養1h復蘇。按比例取菌液，塗平板，計算庫容量。其餘菌液4000rpm，室溫下離心15min。棄上清，沉澱塗布於2YTAG大平板上，37℃倒置培養過夜。
構建抗體庫庫容大約為108，從上述抗體庫中分別隨機挑取20個克隆進行序列分析正確率95%，抗體庫庫容遠遠超過抗體庫的多樣性。
3.2. 噬菌體抗體庫的生物淘選和陽性克隆的篩選
在按照實施例1的方法進行篩選，得到親和力較高的克隆測序，共得到6種不同的單鏈抗體序列，分別命名為DFPD1-2、DFPD1-3、DFPD1-4、DFPD1-5、DFPD1-6、DFPD1-7，對應的輕鏈可變區命名為DFPD1-L2、DFPD1-L3、DFPD1-L4、DFPD1-L5、DFPD1-L6、DFPD1-L7，它 們對應的胺基酸序列分別見SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。單克隆phage ELISA鑒定phage-Abs的相對親和力如第6圖所示。
3.3. 梯度稀釋phage ELISA鑒定抗PD1單鏈抗體的親和力
將本實施例2中獲得的克隆進行單克隆phage的展示和純化，進行phage梯度稀釋ELISA實驗鑒定phage-Abs的親和力。
用pH9.6的碳酸鹽緩衝液包被PD1-His，4℃包被過夜。PBST洗滌三次，4%milk-PBST 37℃封閉1h。將純化後的phage用4%milk-PBST三倍稀釋，每孔加入100μl稀釋後的樣品，室溫靜置1h。用PBST洗滌ELISA板，將4%脫脂奶粉稀釋後的anti-M13-HRP單株抗體加入ELISA板中，室溫放置1h。TMB顯色試劑盒顯色，室溫顯色5min。用2M H2SO4終止顯色，50μl/孔。酶標儀450nm單波長測定光密度值。結果顯示篩選出的幾株不同的噬菌體抗體均能與PD-1進行結合，而且DFPD1-3，DFPD1-7的親和力明顯高於其它克隆(第7圖)，選取DFPD1-3和DFPD1-7進行下一步試驗。
實施例4、對篩選出的抗PD-1的單鏈抗體DFPD1-3，DFPD1-7再次進行體外親和力成熟
4.1 DFPD1-3和DFPD1-7重鏈CDR1、2、3突變庫的構建
設計引物PVHF2和PVHR2以合成的重鏈突變庫(SEQ ID NO：13)為範本，PCR擴增重鏈庫基因(第8圖)；設計引物PVLF2和PVLR2以DFPD1-3和DFPD1-7質粒為範本分別擴增其輕鏈及linker區(第9圖)，其中，左側為DFPD1-3，右側為DFPD1-7。反應條件：95℃ 30s，1 cycle；95℃ 15s，60℃ 10s，72℃ 30s，3 cycles；95℃ 15s，72℃ 40s，25 cycles；72℃ 5min，4℃保存。天根通用回收試劑盒回收PCR目的片段。
引物如下所示：PVHF2：‘5CATACCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTG3’
PVHR2：‘5TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCCTG3’
PVLF2：‘5 CTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTAGC3’
PVLR2：‘5 CTAAGCGGCCGCTTTGATCTCCACTTTGGTGC3’
將上述兩部分PCR反應產物進行Overlap PCR擴增獲得DFPD1-3和DFPD1-7的重鏈突變庫基因。反應條件：95℃ 30s，1 cycle；95℃ 15s，72℃ 30s，4 cycles；(加入引物PVHF2和PVLR2)，95℃ 15s，72℃ 40s，25 cycles；72℃ 5min，4℃保存。天根通用回收試劑盒回收PCR目的片段，將對應的產物命名為VHCDR123M-DFPD1-3(第10圖)和VHCDR123M-DFPD1-7(第11圖)。
用NcoI-HF和NotI對質粒pScFvDisb-s進行雙酶切，酶切產物經0.8%瓊脂糖凝膠電泳(第5圖)，切膠回收；用NcoI-HF和NotI分別對VHCDR123M-DFPD1-3和VHCDR123M-DFPD1-7 PCR產物進行雙酶切。PCR酶切產物採用天根通用回收試劑盒進行回收。回收後的PCR片段與pScFvDisb-s按摩爾比4：1比例經T4 DNA連接酶16℃連接4h。將連接產物電擊法轉化至TG1感受態中。使用SOC培養基37℃培養1h復蘇。按比例取菌液，塗平板，計算庫容量。其餘菌液4000rpm，室溫下離心15min。棄上清，沉澱塗布於2YTAG大平板上，37℃倒置培養過夜。
構建了2個不同的抗體庫。每個抗體庫庫容大約為107，抗體庫庫容遠遠超過抗體庫的多樣性。從上述抗體庫中分別隨機挑取20個克 隆進行序列分析，正確率為90%。
4.2 噬菌體抗體庫的生物淘選和陽性克隆的篩選
將上述構建的兩種抗體庫，進行phage展示，純化和沉澱。然後從該庫中淘選抗PD1的單鏈抗體。噬菌體抗體庫的生物淘選方法同實施例1。抗PD-1的單鏈抗體陽性克隆的篩選的方法同實施例2。結果發現共篩選到5種不同的抗PD-1抗體序列，分別命名為DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11，DFPD1-12，DFPD1-13。其中DFPD1-9，DFPD1-11和DFPD1-12的輕鏈可變區序列是DFPD1-L3，而DFPD1-10和DFPD1-13的輕鏈可變區序列是DFPD1-L7；DFPD1-9和DFPD1-10的重鏈可變區序列是DFPD1-H2，DFPD1-11和DFPD1-13的重鏈可變區是DFPD1-H3，DFPD1-12的重鏈可變區是DFPD1-H4。單克隆phage ELISA鑒定phage-Abs的相對親和力如第12圖所示。
4.3．梯度稀釋phage ELISA鑒定抗PD1單鏈抗體的親和力
將本實施例4.2中獲得的克隆進行單克隆phage的展示和純化，進行phage梯度稀釋ELISA實驗鑒定phage-abs的親和力，方法同實施例3中3.1。結果顯示篩選出的幾株不同的噬菌體抗體均能與PD1進行結合，親和力相差不是很大(第13圖)，其中DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11，DFPD1-12，DFPD1-13略好，選擇這幾種單鏈抗體進行後面試驗。
實施例5、抗PD-1全抗體DFPD1-9、DFPD1-10、DFPD1-11、DFPD1-12、DFPD1-13親和力鑒定
5.1 抗PD-1全抗體的製備
將上述抗體的重鏈VH和輕鏈VK基因分別克隆至裝有重鏈 和輕鏈恒定區基因的載體pTSE(第14圖)，編碼人恒定區γ4(見SEQ ID NO：14)和κ鏈(見SEQ ID NO：15)的pTSE載體中(pTSE載體結構如第14圖所示，製備過程參見CN103525868A說明書第3頁第[0019]段)。暫態轉染HEK293E細胞，進行全抗體表達。使用AKTA儀器protein A親和柱純化獲得全抗體蛋白。
5.2 BIAcore X100測定全抗體的親和力
採用捕獲法測定全抗體的親和力。將抗人IgG偶聯到CM5晶片表面，分別稀釋DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11，DFPD1-12和DFPD1-13保證大約300RU左右的抗體被抗人IgG捕獲。將PD-1設置一系列的濃度梯度(1000nM，500nM，250nM，125nM，62.5nM，31.25nM，15.625nM，7.8125nM，3.9063nM，1.9531nM，0.9766nM)流經固定相表面，測定抗體的親和力。結果發現篩出的抗體的親和力相差不是太大(表3)。
5.3 全抗體與PD-1的結合實驗
用pH9.6的碳酸鹽緩衝液包被PD-1-His，60ng/孔/100μl，4℃過夜包被。用300μl/孔PBST洗五次，再加入1%BSA-PBS在37℃封閉2h。加入不同稀釋度的全抗體DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11，DFPD1-12和DFPD1-13。五種全抗體最高濃度是16μg/ml，4倍稀釋做11個梯度，最後一 個孔作為陰性對照--即只加稀釋液PBS，37℃孵育1h。用300μl/孔PBST洗五次，再加入用1%BSA-PBS 1：40000稀釋的Anti-Human Fc-HRP二抗37℃孵育1h。TMB顯色試劑盒顯色，100μl/孔，室溫顯色8min，然後用2M H2SO4終止顯色，50μl/孔。450nm/630nm讀數。實驗結果如第15圖所示，所有抗體均能很好的與PD-1分子結合。
5.4全抗體競爭抑制PD-L1與PD-1結合
用pH9.6的碳酸鹽包被PDL1-Fc，4℃包被過夜。PBST洗滌五次，1%BSA-PBS 37℃封閉2h。用4μg/ml的PD1-His分別稀釋DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11，DFPD1-12和DFPD1-13這五種全抗體，全抗體與PD-1的摩爾比從10：1開始，五倍梯度稀釋，每個樣品做9個稀釋度，37℃孵育1h。PBST洗五次，加入用1%BSA-PBS稀釋的HRP標記的小鼠抗His抗體，37℃孵育1h。TMB顯色試劑盒顯色，100μl/孔，室溫顯色8min。用10%H2SO4終止顯色，50μl/孔。450nm/630nm讀數。結果如第16圖所示，DFPD1-9，DFPD1-10，DFPD1-11，DFPD1-12和DFPD1-13均能抑制PD-1與PD-L1的結合。
實例6、抗PD-1抗體與細胞表面PD-1結合試驗
先構建過表達的PD-1的CHO穩定細胞系，將它命名為PD1-CHO。用明膠包被96孔板後，PD1-CHO細胞胰酶消化後中止，離心重懸，稀釋至2×105細胞/ml，每孔100μl鋪于96孔板中，共12孔×6排，即2×104細胞/孔，5%CO2，37℃培養過夜。第二天棄去培養基，用350μl預冷的PBS洗一遍，2%新鮮配製的PFA固定5min，PBS洗2遍。
細胞板中加入倍比稀釋好的抗PD-1全抗體，稀釋液為含 0.5% BSA的PBS。樣品濃度從100μg/ml起，8倍稀釋，共12稀釋度，室溫孵育30min。然後棄去上清，350μlPBS洗3遍後，加入1：5000稀釋的辣根過氧化物酶標記羊抗人二抗，室溫孵育15min。
再用350μlPBS洗3遍，每孔加入100μlTMB顯色液，室溫顯色15-30min。每孔加入50μl 2M H2SO4中止顯色，酶標儀450nm讀數。用Graphpad prism軟體處理結果，計算結合常數(見第17圖)。
對於本領域的普通技術人員而言，具體實施例只是對本發明進行了示例性描述，顯然本發明具體實現並不受上述方式的限制，只要採用了本發明的方法構思和技術方案進行的各種非實質性的改進，或未經改進將本發明的構思和技術方案直接應用於其它場合的，均在本發明的保護範圍之內。
<110> 北京東方百泰生物科技有限公司；北京精益泰翔技術發展有限公司
<120> 一種抗PD-1的單株抗體及其獲得方法
<130> 160202-083WT
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 1
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 2
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 3
<210> 4
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 4
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
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<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 5
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<212> PRT
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<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 6
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<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 7
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<211> 107
<212> PRT
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<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 8
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 9
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 10
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 11
<210> 12
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<220>
<221> misc_feature
<222> (82)..(83)
<223> r代表a或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (85)..(85)
<223> r代表a或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (88)..(88)
<223> v代表a,c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (89)..(89)
<223> r代表a或g
<220>
<221> misc_feature
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<223> v代表a,c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (94)..(94)
<223> n代表a,c,g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (95)..(95)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (96)..(96)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (166)..(166)
<223> w代表a或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (271)..(272)
<223> n代表a,c,g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (273)..(273)
<223> s代表c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (274)..(275)
<223> n代表a,c,g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (276)..(276)
<223> s代表c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (277)..(277)
<223> v代表a,c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (278)..(278)
<223> r代表a或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (279)..(279)
<223> b代表c,g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (280)..(281)
<223> n代表a,c,g或t
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (286)..(287)
<223> n代表a,c,g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (288)..(288)
<223> s代表c或g
<400> 12
<210> 13
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<220>
<221> misc_feature
<222> (91)..(91)
<223> r代表a或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (92)..(92)
<223> v代表a,c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (93)..(93)
<223> y代表c或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (97)..(97)
<223> k代表g或t
<220>
<221> misc_feature
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<223> s代表c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (103)..(103)
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<220>
<221> misc_feature
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<223> r代表a或g
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (148)..(149)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (150)..(150)
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<223> v代表a,c或g
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (166)..(167)
<223> r代表a或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (168)..(168)
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<220>
<221> misc_feature
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<223> w代表a或t
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<223> r代表a或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (277)..(278)
<223> v代表a,c或g
<220>
<221> misc_feature
<222> (279)..(279)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (280)..(281)
<223> n代表a,c,g或t
<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (286)..(287)
<223> n代表a,c,g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (288)..(288)
<223> s代表c或g
<220>
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<223> n代表a,c,g或t
<220>
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<222> (298)..(298)
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<220>
<221> misc_feature
<222> (300)..(300)
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<400> 13
<210> 14
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<212> DNA
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<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 14
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 16
<210> 17
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 17
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<211> 11
<212> PRT
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<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
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<212> PRT
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<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 19
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<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 20
<210> 21
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 21
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 22
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 23
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 24
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 25
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 26
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<211> 7
<212> PRT
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<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 27
<210> 28
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 28
<210> 29
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 29
<210> 30
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 30
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 31
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 32
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 33
<210> 34
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 34
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 35
<210> 36
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 36
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 37
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 38
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 39
<210> 40
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 40
<210> 41
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 41
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 42
<210> 43
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 43
<210> 44
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 44
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 45
<210> 46
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 46
<210> 47
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 47
<210> 48
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 48
<210> 49
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 49
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 50
<210> 51
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 51
<210> 52
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 該序列係經由合成而獲得
<400> 52

Claims (10)

  1. 一種抗PD-1的單株抗體，至少包括：輕鏈和重鏈；所述輕鏈的互補決定區CDR1、CDR2和CDR3分別用LCDR1、LCDR2和LCDR3表示；所述重鏈的互補決定區CDR1，CDR2和CDR3分別用HCDR1、HCDR2和HCDR3表示；輕鏈和重鏈具有相對應的五個組別，分別為：第一組：LCDR1、LCDR2和LCDR3分別選自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.27和SEQ ID NQ.33；HCDR1、HCDR2和HCDR3分別選自SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43；第二組：LCDR1、LCDR2和LCDR3分別選自SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.37；HCDR1、HCDR2和HCDR3分別選自SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43；第三組：LCDR1、LCDR2和LCDR3分別選自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.33；HCDR1、HCDR2和HCDR3分別選自SEQ ID NO.38、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43；第四組：LCDR1、LCDR2和LCDR3分別選自SEQ ID NO.20、SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.33；HCDR1、HCDR2和HCDR3分別選自SEQ ID NO.39、SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.43；第五組：LCDR1、LCDR2和LCDR3分別選自SEQ ID NO.24、SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.37；HCDR1、HCDR2和HCDR3分別選自SEO ID NO.38、SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.43。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之抗PD-1的單株抗體，其中，所述抗體包括輕鏈可變區和重鏈可變區，所述五個組別分別對應為：第一組：所述輕鏈可變區和所述重鏈可變區分別選自序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.2；第二組：所述輕鏈可變區和所述重鏈可變區分別選自序列SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.2；第三組：所述輕鏈可變區和所述重鏈可變區分別選自序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.3；第四組：所述輕鏈可變區和所述重鏈可變區分別選自序列SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.4；第五組：所述輕鏈可變區和所述重鏈可變區分別選自序列SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.3。
  3. 如申請專利範圍第1項或2項所述之抗PD-1的單株抗體，其中，所述抗體為全人源抗體；所述抗體的重鏈恒定區包含IgG1、IgG2、IgG3或IgG4；所述抗體的輕鏈恒定區包含Cκ或Cλ。
  4. 一種抗體、多肽或蛋白，至少包括：如申請專利範圍第1項或第2項所述之輕鏈和重鏈。
  5. 一種多核苷酸序列，至少包括編碼如申請專利範圍第1項或第2項所述之輕鏈和重鏈的多核苷酸序列或組合。
  6. 一種重組DNA表達載體，至少包括：如申請專利範圍第5項所述之多核苷酸序列。
  7. 一種宿主細胞，至少包括：如申請專利範圍第6項所述之重組DNA表達載體所轉染，其中所述宿主細胞包含原核細胞、酵母或哺乳動物細胞。
  8. 一種全抗體、單鏈抗體、單域抗體、雙特異抗體或抗體藥物偶聯物，使用如申請專利範圍第1項或第2項所述的輕鏈和重鏈。
  9. 一種單株抗體、人工載體、藥物或藥物組合物，包括：所述單株抗體、人工載體、藥物或藥物組合物包含如申請專利範圍第1項或第2項所述的輕鏈和重鏈。
  10. 一種檢測試劑或試劑盒，包括：所述檢測試劑或試劑盒包含如申請專利範圍第1項或第2項所述的輕鏈和重鏈。
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