CN114539407B

CN114539407B - 一种全人源抗PD-1的单克隆抗体No.1-10及其应用

Info

Publication number: CN114539407B
Application number: CN202111662737.6A
Authority: CN
Inventors: 梁可莹; 詹金彪; 梅圣圣; 彭珊珊; 陈洁; 高向征
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2023-04-18
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114539407A

Abstract

本发明提供一种全人源抗PD‑1的单克隆抗体No.1‑10及其应用。所述抗体包含重链和轻链可变区的氨基酸序列。本发明从人噬菌体抗体库中筛选出抗PD‑1的单链抗体scFv‑1，通过基因工程技术，将scFv‑1的抗体可变区与恒定区序列拼接，建立表达全长抗体的工程化细胞株，最后筛选和纯化得到全长抗体No.1‑10。其结构包含抗体重链可变区、轻链可变区，以及恒定区；具备高亲和力，K_D值为10^‑12M；能识别细胞表面的PD‑1并有效阻断PD‑1与PD‑L1的结合；在与肿瘤细胞共培养体系中具备较好的逆转T细胞免疫抑制的作用。该抗体免疫原性低，稳定性高，可用于肿瘤免疫治疗。

Description

一种全人源抗PD-1的单克隆抗体No.1-10及其应用

技术领域

本发明抗体工程技术领域，具体涉及一种全人源抗PD-1的单克隆抗体No.1-10及其应用。

背景技术

程序性细胞死亡受体1(PD-1)是由pdcd1基因编码的一种I型跨膜糖蛋白，具有288个氨基酸的蛋白质。结构分为胞外区免疫球蛋白可变区样结构域、跨膜区以及胞内区。其中，PD-1的胞内结构域，包括两个重要的酪氨酸基序，分别是免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸基转换基序(ITSM)。PD-1属于CD28超家族中的一员，主要表达在活化的T细胞表面，以及NK细胞，B细胞，肿瘤相关巨噬细胞等。1992年，Tasuku Honjo教授首先在小鼠体内分离和鉴定了PD-1基因，并认为PD-1分子的活化会导致T细胞的凋亡。但直至1999年，科研人员通过对PD-1缺失的小鼠的研究观察到小鼠的自身免疫疾病发生的现象，才逐步阐明了PD-1的免疫抑制功能。PD-1的配体有PD-L1(又称B7-H1或CD274)和PD-L2(又称B7-DC或CD273)。PD-L1可表达于不同类型的细胞上，包括免疫细胞，上皮细胞，内皮细胞，尤其是肿瘤细胞。PD-L2仅表达于抗原提呈细胞(APCs)。促炎症细胞因子，如I型和II型干扰素、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达可诱导细胞PD-L1和PD-L2的表达。在机体的免疫应答过程中，T细胞的激活，除了需要第一信号，即T细胞受体识别APCs上的组织相容复合体(MHC)提呈的抗原肽，还需要共刺激信号，即共刺激受体CD28结合APCs的B7受体。但若共抑制受体PD-1结合配体PD-L1或PD-L2，则抑制T细胞的增殖。因此，使用PD-1/PD-L1抗体，可以阻断免疫检查点PD-1/PD-L1信号，恢复T细胞的增殖和杀伤能力，从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。

距离1986年FDA批准的第一款单克隆抗体药物，至今已有超过100款抗体药物获批上市。目前，抗体工程技术的出现加速了人源抗体的制备和筛选，通过基因工程技术制备的重组抗体主要包括人鼠嵌合抗体、人源化抗体、全人源化抗体等等。噬菌体展示技术具备筛选周期短、体外高亲和力成熟、无需抗原免疫等优点，成为全人源抗体制备的主要技术平台。

噬菌体展示技术是将外源编码多肽或蛋白质的基因通过基因工程技术插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使其能与噬菌体的衣壳蛋白形成融合蛋白，随子代噬菌体的重新组装呈现在噬菌体表面，可以保持相对的空间结构和生物活性。将抗体片段与噬菌体衣壳蛋白融合表达展示于噬菌体表面，可以得到噬菌体展示抗体库，主要有以下三种类型：scFv库(由VH和VL组成，并由一个小肽(Gly4Ser)₃连接成一个单链多肽)、Fab库(含有VH-CH和VL-CL，并由二硫键连接在一起)和VHH库(只有重链可变区)。噬菌体抗体库的筛选模拟了抗体亲和力成熟的过程。利用靶抗原，采用合适的淘洗方法，洗去未特异性结合的噬菌体。再用酸或者竞争的分子洗脱下结合的噬菌体，中和后的噬菌体感染大肠杆菌扩增，经过3-5轮的富集，逐步提高可以特异性识别靶抗原的噬菌体比例，最终获得识别靶抗原的高亲和力噬菌体抗体。

文献报道DNA链上富含GC位点可以通过反式作用因子(Cys2His2)调控转录过程。由于真核染色质的开放性对基因表达有至关重要的作用，而目的基因附近的GC-rich结构可以通过赋予DNA双链更好的刚性，进而促进染色质的开放。pMH3表达载体则是基于“GCrich”机制的哺乳动物表达载体，含有3个约1000bp长度的，来自鸡βactin基因的富含GC的DNA片段，因此pMH3表达载体具有超高外源蛋白表达能力。此外，pMH3表达载体既含有便于在原核中扩增复制的原核DNA序列(如复制子、抗生素抗性基因、单一的限制性酶切位点等)，也有只能在哺乳动物细胞中应用的表达原件(包括启动子、增强子、5’非编码序列、3’非编码序列、S/MARs元件、内含子、PolyA尾等)，适用于哺乳动物细胞系统的高表达稳定细胞株的构建。

中国仓鼠卵巢细胞(CHO)能不断增殖，能稳定整合外源基因并保持高效的外源蛋白表达水平；作为哺乳动物细胞，可以准确的进行外源基因转录后修饰的功能，使表达的蛋白在功能、结构上接近于天然蛋白分子；可通过悬浮培养的方式在无血清培养环境中进行高密度培养，大规模生产重组蛋白。因此，CHO哺乳动物细胞表达系统是目前基因工程类药物研发和生产最重要的表达系统之一。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种全人源抗PD-1的单克隆抗体No.1-10，是通过基因重组获得的新型全人源抗PD-1全长抗体No.1-10，包含重链可变区和轻链可变区，以及抗体恒定区，所述重链可变区VH的多核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述轻链可变区VL的多核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

所述全长抗体No.1-10的重链可变区和轻链可变区，包含完整的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；所述的重链可变区VH CDR1的氨基酸序列为:HNINTF，重链可变区VH CDR 2的氨基酸序列为：AAS，重链可变区VH CDR3的氨基酸序列为：QQANSFPRT；所述的轻链可变区VLCDR1的氨基酸序列为：GYRFGSYY，轻链可变区VL CDR2的氨基酸序列为：INPTGGYT；轻链可变区VL CDR3的氨基酸序列为：ARDLGGSGYSHFDY。

本发明的另一个目的是提供一种重组抗体表达载体，包含所述的重链可变区的多核苷酸序列SEQ ID No.1或轻链可变区的多核苷酸序列SEQ ID No.3。

本发明还提供一种转染上述重组抗体表达载体的宿主细胞，所述宿主细胞包含原核细胞E.coil DH5α以及哺乳动物细胞CHO-K1。

本发明所述单克隆抗体No.1-10的制备方法，是通过以下步骤实现：

分别构建pMH3-VH(含重链可变区基因和重链恒定区基因)和pMH3-VL(含轻链可变区基因和轻链恒定区基因)重组质粒，然后将重组质粒共转染CHO-K1细胞，通过G418筛选得到稳定转染的细胞株，有限稀释法筛选出抗体产量高的亚克隆，驯化得到无血清培养的悬浮细胞。收集细胞培养上清，采用Protein A亲和层析法纯化得到No.1-10抗PD-1全长抗体。

本发明的再一个目的是提供所述单克隆抗体No.1-10在制备肿瘤免疫治疗抗体药物中的应用。所述应用是指该抗体本身或其轻链可变区序列和重链可变区序列在制备治疗三阴性乳腺癌药物和药物载体中的应用。

通过将上述方法获得的No.1-10抗PD-1全长抗体，与FDA批准上市的Keytruda单克隆抗体进行亲和力、抗原识别能力、对PD-1/PD-L1阻断能力等生物学功能进行比较，显示所述抗体能够有效阻断PD-1与其配体PD-L1的结合，抑制PD-1的生物学活性。

本发明是通过基因工程技术，改造从全人源白血病噬菌体单链抗体库中筛选出的能够特异结合于胞外区PD-1蛋白的单链抗体scFv-1，通过基因工程技术，将scFv-1的抗体可变区与抗体恒定区(Fc端)序列拼接，建立表达全长抗体的工程化细胞株，最后筛选和纯化得到抗PD-1的全长抗体No.1-10。

本发明的有益效果是：(1)采用全人噬菌体抗体库筛选靶向人PD-1的抗体，获得的抗体是全人源的，能最大程度的降低免疫原性，消除人鼠免疫反应，稳定性高；(2)本发明的抗PD-1抗体具备高亲和力，有效识别细胞表面的PD-1，有效阻断PD-1与其配体PD-L1的结合；能够逆转细胞共培养体系中T淋巴细胞的免疫抑制，提高T细胞对肿瘤杀伤性细胞因子IFN-γ的分泌水平。

附图说明

图1、构建pMH3-VH、pMH3-VL重组质粒的实验设计路线图。

图2、ELISA法筛选分泌抗PD-1单克隆抗体表达量高的单克隆细胞株。

图3、No.1-10号抗体的纯化和检测，其中A是Protein A纯化No.1-10号抗体；B是还原性SDS-PAGE检测纯化后的No.1-10号抗体。

图4、抗PD-1单克隆抗体Keytruda和No.1-10号的结合解离曲线。

图5、流式检测抗PD-1单克隆抗体对细胞表面PD-1抗原的结合能力。

图6、流式细胞术检测抗PD-1单克隆抗体对PD-1/PD-L1的阻断作用。

图7、ELISA检测T细胞的IFN-γ释放水平。

具体实施方式

本发明详细的实施方法参见实施例，实施例中所述的实验方法和试剂，若无特殊说明均为常规实验方法和试剂。以下实施例仅用于说明和解释本发明，而不是以任何方式限制本发明。

实施例1重组pMH3-VL和pMH3-VH真核表达载体构建

通过噬菌体抗体库筛选得到的scFv-1,分别将Igκ信号肽序列和scFv-1的VH和VL片段进行PCR扩增，随后通过重叠PCR的方法将信号肽(S)分别连接到VH和VL片段的N端，得到S+VH和S+VL片段，再将扩增的S+VH和S+VL片段分别插入含人IgG重链恒定区pMH3-KH和人κ轻链恒定区的pMH3-KL重组质粒中，得到pMH3-VH、pMH3-VL重组质粒。构建pMH3-VH、pMH3-VL重组质粒的实验设计路线见图1。

实施例2表达人源的抗PD-1全长抗体No.1-10号细胞株的构建和筛选

2.1pMH3-VH和pMH3-VL质粒共转染CHO-K1细胞

将处于生长对数期的CHO-K1细胞接种到细胞培养六孔板中，每孔接种1×10⁵的细胞，至细胞汇合度达到90％的时候，利用脂质体转染方法，将本实施例1中获得的pMH3-VH和pMH3-VL质粒进行共转染。待细胞转染24h后，取少量细胞培养上请，通过ELISA法检测全长抗体的表达。

2.2筛选抗PD-1抗体表达量高的稳定转染的单克隆细胞株

在细胞转染48h后，由于pMH3质粒具有新霉素抗性基因，故使用700μg/ml G418抗生素筛选阳性细胞株。每2～3天更换一次培养基，维持该药物浓度筛选一个月的周期时间，以获得稳定转染的阳性细胞株。然后通过有限稀释法对稳定转染的阳性细胞株进行单克隆化，以便筛选得到抗体表达量高的单细胞株。将稳定转染的CHO-K1细胞用胰酶消化，得到单细胞悬液。进行细胞计数，倍比稀释至100cell/ml的细胞密度。将稀释好的细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，100μl/孔，放入细胞培养箱中培养过夜。对只含一个单克隆细胞的孔进行标记。细胞培养约2周的时间，可使汇合度得到90％，收集每孔细胞培养上清进行ELISA检测，通过比较OD₄₅₀，筛选出抗体表达量高的单克隆细胞株，后续进行扩大培养。

2.3 ELISA法检测稳转的单克隆细胞株的抗PD-1全长抗体的表达

将PD-1ECD蛋白加入酶标板中，4℃包被过夜。第二天用PBST洗涤酶标板3次，倒扣酶标板去除洗涤液。每孔加入200μl封闭液，37℃封闭1h。弃去封闭液，然后用洗涤液洗3次。每孔加入200μl的细胞培养上清，37℃孵育2h，PBS作空白对照；阴性对照为对照组细胞培养上清。弃去细胞培养上清，用洗涤液洗涤3次。封闭液以1：1000的比例稀释山羊抗人IgG-HRP二抗，每孔加入200μl二抗，37℃孵育1h。弃去二抗，用洗涤液洗涤5次。每孔加入100μl现配的TMB溶液，37℃显色30min。每孔加50μl终止液(2M H₂SO₄)，酶标仪450nm波长下测OD值。结果显示大部分筛选出的单克隆细胞株均能与PD-1ECD蛋白结合，而No.1-10号的亲和力高于其他单克隆(图2)。后续选取表达No.1-10号抗体的单克隆细胞株进行实验。

实施例3 No.1-10号抗体的表达与纯化

3.1稳定表达No.1-10号抗体的单克隆细胞的悬浮驯化

为提高单克隆后的CHO-K1细胞的抗体表达量，贴壁状态的细胞需要进行悬浮驯化。在细胞汇合度达90％时，细胞传代，并将原来的DMEM培养基替换为EX-CELL 302培养基。每次传代细胞培养基的血清浓度降低至原来的一半，即从10％，5％，依次减半直至血清浓度降为1％。当细胞培养基的血清浓度降为1％后，细胞需要继续传代2～3代，以维持并适应低浓度的血清。后续细胞培养的血清浓度继续依次降低为0.5％以及0％，每个血清浓度需维持细胞稳定传代2～3代。细胞已经以悬浮状态生长时，可将悬浮细胞转移至250mL的细胞摇瓶中，加入10ml的EX-CELL 302培养基，并补加4mM/L的L-谷氨酰胺，37℃，5％的CO₂的培养箱中，120rpm振荡培养。待细胞密度增加，逐步添加EX-CELL 302培养基至总体积达到100ml，并维持4mM/L的谷氨酰胺。每天用台盼蓝染色法检测细胞活力，直到细胞活力降至50％时，3000rpm离心收集细胞培养上清，-20℃冻存。悬浮驯化后的细胞可直接用无血清冻存液冻存。

3.2 No.1-10号抗体的亲和层析纯化

利用Protein A特异性结合IgG分子恒定区Fc结构域的原理，使用Bio-Rad的NGC蛋白纯化层析系统和Protein A纯化柱纯化细胞培养上清。上柱的液体皆需用0.22μM的滤膜过滤。先用3～5个柱体积(column volumn，CV)的洗柱缓冲液，以1mL/min的流速平衡Protein A纯化柱。每次细胞培养上清可上样100mL，上样完毕后，继续用10CV的洗柱缓冲液洗去杂蛋白，至UV 280曲线回复基线水平。用5CV的洗脱缓冲液洗脱抗体，并用1.5mL的EP管收集洗脱液，1ml/管的体积。迅速用1M的Tris-HCl中和洗脱产物。No.1-10号抗体的纯化图见图3A。洗脱结束后，用10CV的洗柱缓冲液清洗柱子，最后用20％的乙醇保存Protein A纯化柱。将位于洗脱峰范围内的收集管中的抗体浓缩。使用30kDa分子截留量的超滤管浓缩抗体，10,000xg离心5min。最后加入PBS，离心3遍，将缓冲液置换为PBS。BCA法测定蛋白浓度后，SDS-PAGE电泳检测抗体的结构完整性和纯度(图3B)。

实施例4 No.1-10号抗体亲和力的测定

利用Fortibio Octet生物大分子相互作用分析仪分析测定No.1-10号抗体与PD-1抗原的结合动力学。分析结果见图4。结果发现No.1-10抗体的亲和力要高于Keytruda(表1)。

表1抗PD-1抗体亲和力常数测定数值

Sample	Ka(1/Ms)	Kd(1/s)	<![CDATA[K<sub>D</sub>(M)]]>
				Keytruda	<![CDATA[9.97×10<sup>5</sup>]]>	<![CDATA[2.13×10<sup>-3</sup>]]>	<![CDATA[2.14×10<sup>-9</sup>]]>
No.1-10	<![CDATA[7.99×10<sup>3</sup>]]>	<![CDATA[<10<sup>-7</sup>]]>	<![CDATA[<10<sup>-12</sup>]]>

实施例5流式细胞术检测抗PD-1抗体对细胞表面的PD-1的结合能力

选用PD-1阳性的人急性白血病单核细胞THP-1，1,000rpm，离心5min收集细胞沉淀。加入500μL的FACS buffer重悬细胞，洗涤2遍。每组细胞处理设置2～3个重复，空白对照组不做任何处理。加入FACS buffer稀释的抗PD-1抗体，冰上孵育1h。加入500μL的FACSbuffer重悬细胞，洗涤2遍。加入FACS buffer稀释的FITC标记的anti-human荧光二抗(1：500稀释比)，冰上避光孵育1h，FACS buffer洗涤2遍。最后用500μL PBS重悬细胞，300目细胞筛过滤后，流式细胞仪上检测细胞的平均荧光强度和阳性细胞的百分比。结果见图5，发现No.1-10号抗体和Keytruda皆可结合细胞表面PD-1。

实施例6流式细胞术检测抗PD-1抗体对PD-1/PD-L1的阻断作用

选用PD-1阳性的THP-1和U937细胞，1,000rpm，离心5min收集细胞沉淀；加入500μL的FACS buffer重悬细胞，洗涤2遍。每组细胞加入2μg的PD-L1-his重组蛋白和不同浓度的抗PD-1抗体混合液，充分混匀后，4℃孵育2h。每组设置2个重复，其中一组只加PD-L1-his重组蛋白进行孵育，空白对照组不做任何处理。加入FACS buffer稀释的anti-mouse His单克隆抗体(1：400稀释比)，4℃孵育1h。加入500μL的FACS buffer重悬细胞，洗涤2遍。加入FACSbuffer稀释的Alexa Flior 647标记的anti-mouse荧光二抗(1：500稀释比)，4℃避光孵育1h，FACS buffer洗涤2遍。最后用500μL PBS重悬细胞，300目细胞筛过滤后，流式细胞仪上检测细胞的平均荧光强度。用FlowJo和Excel软件处理流式结果，计算抗PD-1抗体的竞争抑制率，结果见图6，发现No.1-10号抗体和Keytruda皆可抑制PD-L1与PD-1的结合，而且同种抗体浓度下，No.1-10号抗体的抑制效果要优于Keytruda。

实施例7 ELISA检测T细胞的IFN-γ的释放水平

用300U/mL的IL-2和1μg/mL的抗CD28抗体刺激复苏的人外周血淋巴细胞(PBMC)，刺激48h后可提高激活的T淋巴细胞的比例。将三阴性乳腺癌MDA-MB 231细胞和刺激后的PBMC按照1：2的靶效比接种于96孔板中，并加入100μL的抗PD-1抗体(终浓度为1μg/mL或10μg/mL)，共培育48h。离心收集细胞上清，用ELISA试剂盒检测释放到细胞上清的IFN-γ的浓度。向抗体预包被酶标板中每孔加入100μL不同浓度的IFN-γ标准品或待测样品，37℃孵育2h。用洗涤液洗板3次后，加入100μL生物素化抗体(100×)工作液37℃孵育1h。洗板3次后，加入100μL链霉素-HRP(100×)工作液37℃孵育30min。洗板3次后，加入100μL TMB底物，37℃孵育15min，随后加入50μL终止液，并立即用酶标仪检测450nm的OD值。统计结果如图7所示，在细胞共培养体系中，No.1-10抗体和Keytruda皆可有效刺激T淋巴细胞分泌IFN-γ，即促进T细胞的激活，从而杀伤肿瘤细胞。而且在10μg/mL的浓度下，No.1-10号抗体比Keytruda具有更强的恢复T细胞激活效果。

对于本领域的普通技术人员而言，具体实施例只是对本发明进行了示例性描述，显然本发明具体实现并不受上述方式的限制，只要采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进，或未经改进将本发明的构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种全人源抗PD-1的单克隆抗体No.1-10及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 321

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gacatccggg tgacccagtc tccttcttcc gtgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcgcttgtc gggcgagtca caacattaac acattcttag cctggtatca acacaaaccg 120

gggcaagccc ctaaactcct gatccatgct gcttccactt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagcg gcagcggatc tgggacagat ttcgttctca ccattaataa cctgcagcct 240

gaagattttg caacttacta ttgtcaacag gctaacagtt tccctcggac tttcggccct 300

gggaccaagc tggagatcaa a 321

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Asp Ile Arg Val Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ala Cys Arg Ala Ser His Asn Ile Asn Thr Phe

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

His Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Val Leu Thr Ile Asn Asn Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 363

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

caggtgcagc tggtgcagtc tgggcctgag gtgaagaagc ctggggcctc ggtgaaggtg 60

tcctgcaaga catctggata tagattcggc agctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgaatg gatgggatta atcaacccta ctggtggtta cacaacctcc 180

gcacagaagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtgtac 240

atggagttga ggagcctgag atctgaggac acggccgtgt attattgtgc gagagatctc 300

gggggcagtg gttattccca ctttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tca 363

<210> 4

<211> 121

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Arg Phe Gly Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Thr Gly Gly Tyr Thr Thr Ser Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Gly Gly Ser Gly Tyr Ser His Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

Claims

1.一种全人源抗PD-1的单克隆抗体No.1-10，其特征在于，包含重链可变区和轻链可变区，以及抗体恒定区，编码所述重链可变区VH的多核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述重链可变区VH的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码所述轻链可变区VL的多核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述轻链可变区VL的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

2.权利要求1所述的一种全人源抗PD-1的单克隆抗体No.1-10，其特征在于，所述抗体No.1-10包含完整的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3；所述的重链可变区VH CDR1的氨基酸序列为: HNINTF，重链可变区VH CDR 2的氨基酸序列为：AAS，重链可变区VH CDR3的氨基酸序列为：QQANSFPRT；所述的轻链可变区VL CDR1的氨基酸序列为：GYRFGSYY，轻链可变区VLCDR2的氨基酸序列为：INPTGGYT；轻链可变区VL CDR3的氨基酸序列为：ARDLGGSGYSHFDY。

3.一种重组DNA表达载体，其特征在于，包含权利要求1中编码所述的重链可变区的多核苷酸序列SEQ ID No.1和编码所述的轻链可变区的多核苷酸序列SEQ ID No.3。

4.权利要求1所述全人源抗PD-1的单克隆抗体No.1-10在制备肿瘤免疫治疗抗体药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为三阴性乳腺癌。