CN107446048B - 一种能够特异性地结合pd-1的抗体及其功能片段 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医学生物技术和人源化抗体改造研究领域，具体而言，涉及一种能够特异性地结合PD‑1的抗体及其功能片段，所述抗体及其功能片段包括PD‑1嵌合抗体及其功能片段及PD‑1人源化抗体及其功能片段。

Description

一种能够特异性地结合PD-1的抗体及其功能片段
技术领域
本发明涉及医学生物技术和人源化抗体改造研究领域，具体而言，涉及一种能够特异性地结合PD-1的抗体及其功能片段。
背景技术
程序性死亡受体-1(programmed death-1，PD-1)是近期炙手可热的免疫检查点(immune checkpoint)，主要参与T细胞的活化调控，可以调节免疫应答的强弱程度和持续时间。在正常情况下，PD-1可以介导和维持机体组织的自身免疫耐受，防止在炎症反应过程中免疫系统过度活化伤害自身组织，对避免自身免疫性疾病的发生具有积极作用；在病理情况下，其参与肿瘤免疫以及多种自身免疫病的发生发展过程(Anticancer Agents MedChem.2015；15(3):307-13.Hematol Oncol Stem Cell Ther.2014Mar；7(1):1-17.TrendsMol Med.2015Jan；21(1):24-33.Immunity.2013Jul 25；39(1):61-73.J ClinOncol.2015Jun 10；33(17):1974-82.)。
PD-1属于CD28家族成员，但不同于CD28家族其它成员如CTLA4能以二硫键形成共价二聚体，PD-1以单体形式存在。PD-1的结构主要包括胞外免疫球蛋白可变区样结构域、疏水的跨膜区和胞内区，其胞内区含有两个独立的磷酸化作用位点，分别为免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和免疫受体酪氨酸转移基序(ITSM)。PD-1主要诱导性表达于活化的T细胞表面，也表达于B细胞，NK细胞，单核细胞，DC细胞。PD-1的配体包括PD-L1(programmeddeath ligand 1)，PD-L2(programmed death ligand 2)，其配体属于B7家族，其中PD-L1诱导性表达于多种免疫细胞表面包括T细胞，B细胞，单核细胞，巨噬细胞，DC细胞，以及内皮细胞，表皮细胞等，而PD-L2仅诱导性表达于一些免疫细胞包括巨噬细胞，DC细胞，B细胞(Autoimmun Rev,2013,12(11):1091-1100.Front Immunol,2013,4:481.Nat Rev Cancer,2012,12(4):252-264.Trends Mol Med.2015Jan；21(1):24-33.)。
在肿瘤研究中发现，PD-L1高表达于多种肿瘤表面，包括黑色素瘤，肺癌，肾癌，乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，膀胱癌，食管癌，胃癌，胰腺癌，肠癌等，PD-L2高表达于B细胞淋巴瘤。肿瘤细胞通过高表达的PD-L1或者PD-L2，与T细胞上的PD-1结合，传递免疫抑制信号，会导致机体对肿瘤细胞免疫耐受，从而有利于肿瘤细胞的生长转移。PD-1配体的高表达与肿瘤患者的不良预后和耐药密切相关(Hematol Oncol Stem Cell Ther.2014Mar；7(1):1-17.)。而且研究还发现，PD-1上调表达于T细胞表面，尤其是浸润在肿瘤细胞中的T细胞表面，与不良预后也是密切相关(Trends Mol Med.2015Jan；21(1):24-33.)。
研发能阻断PD-1/PD-Ls信号通路的抗体来抗肿瘤是近期的一个热点。在临床上，PD-1/PD-Ls阻断抗体具有两个鲜明的特征：一是药效不局限于某一种肿瘤类型，而是在广谱的肿瘤中均有强而持久的抗肿瘤药效，随着越来越多的肿瘤类型进入临床评价之中，这个特点会得到更进一步的验证。二是这些抗体的安全性很好，不会发生一些化疗药和靶向药物常见的副作用譬如疲劳，白细胞降低，秃头，腹泻，皮疹等，而是只具有一些免疫相关的副作用。PD-1抗体nivolumab已上市用于治疗晚期的黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌，pembrolizuamb已上市用于治疗晚期的黑色素瘤、非小细胞肺癌。值得一提的是，目前PD-1/PD-Ls阻断抗体的良好抗肿瘤药效只能让小部分病患受益，多数患者有先天的耐药，或者发生继发性耐药(Oncology(Williston Park).2014Nov；28Suppl 3:15-28.)。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明是基于所获得的一株具有与人PD-1蛋白特异性结合的亲本抗人PD-1鼠单克隆抗体，通过克隆、鉴定与基因结构的分析，确定了其CDR区序列，构建了相应的嵌合抗体及人源化抗体，并建立了相应的真核细胞表达系统，生产纯化出了该嵌合抗体及人源化抗体。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种能够特异性地结合PD-1的抗体及其功能片段，所述抗体及其功能片段包含轻链和重链；
所述轻链具有由CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3组成的轻链CDR；所述重链具有由CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3组成的重链CDR；
所述CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、5和6所示，或者分别如SEQ ID NO:2、5和6所示，或者分别如SEQ ID NO:3、5和6所示，或者分别如SEQ ID NO:4、5和6所示；所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、8和9所示；
优选的，所述抗体及其功能片段包括PD-1嵌合抗体及其功能片段及PD-1人源化抗体及其功能片段。
本领域公知，抗体的结合特异性及亲合力均主要由CDR序列决定，根据成熟、公知的现有各项技术可轻易地将非CDR区域的氨基酸序列改变而获得具有相类似的生物活性的变体。本发明涉及的具有与上述CDR序列完全相同的CDR序列的单克隆抗体变体，因其具有与本发明所述的人源化抗体完全相同的CDR序列，因此具有相类似的生物活性。
优选的，如上所述的抗体及其功能片段，所述抗体包含人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。
优选的，如上所述的抗体及其功能片段，所述功能片段包括F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种或多种。
本发明所述的“功能片段”特别地指对于PD-1具有与母体抗体相同特异性的抗体片段。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。
scFv(sc＝单链)，双特异抗体(diabodies)。
这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断，本发明的抗体片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的功能片段。
抗体片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪，通过肽合成获得。
优选的，如上所述的抗体及其功能片段，所述PD-1嵌合抗体及其功能片段的轻链可变区序列和重链可变区序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:14所示，或者分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14所示，或者分别如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14所示，或者分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；
进一步优选的，如上所述的抗体及其功能片段，所述PD-1嵌合抗体及其功能片段的轻链恒定区序列和重链恒定区序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
优选的，如上所述的抗体及其功能片段，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链骨架区包括FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，重链骨架区包括FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4；
所述FR-L1选自SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，或经过以下取代及其组合所得到的氨基酸序列：
第1个氨基酸D替换为E；
第2个氨基酸V替换为I；
第13个氨基酸L替换为V；
第19个氨基酸A替换为V；
所述FR-L2选自SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，或经过以下取代及其组合所得到的氨基酸序列：
第6个氨基酸P替换为S；
第7个氨基酸G替换为H；
第9个氨基酸A替换为S；
所述FR-L3选自SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，或经过以下取代及其组合所得到的氨基酸序列：
第22个氨基酸L替换为V；
第24个氨基酸P替换为T；
第28个氨基酸A替换为G；
第31个氨基酸F替换为Y；
所述FR-L4选自SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，或经过以下取代所得到的氨基酸序列：
第7个氨基酸V替换为L；
所述FR-H1选自SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
所述FR-H2选自SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，或经过以下取代及其组合所得到的氨基酸序列：
第5个氨基酸A替换为T；
第14个氨基酸A替换为S；
所述FR-H3选自SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，或经过以下取代及其组合所得到的氨基酸序列：
第12个氨基酸N替换为T；
第14个氨基酸Y替换为H；
第18个氨基酸N替换为S；
所述FR-H4选自SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列；
通常从鼠抗移植CDR到人源框架上，选择序列同源性高的人源框架会有一定的成功率。但是研究表明，许多CDR移植需要做回复突变，才能恢复一定的抗体活性。如何选择合适的人源框架是主要的瓶颈。
CDR是抗原结合的主要相关位点，但多数情况下FR(Framework region)对结合位点构象的影响明显，为获得高亲和力的人源化抗体，本发明选择了合适的FR区，并将相关FR残基需回复为原鼠源氨基酸或其他作用相同的人中可见的氨基酸。
优选的，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：25-36任一项所示；
优选的，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的重链可变区序列如SEQ ID NO：37-42任一项所示；
进一步优选的，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ IDNO：25所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：37所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：25所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：38所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：29所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：38所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：30所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：38所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：31所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：38所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：26所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：38所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：28所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：40所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：25所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：40所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：29所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：40所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：30所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：40所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：31所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：40所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：28所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：38所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：27所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：39所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：32所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：39所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：33所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：39所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：34所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：39所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：35所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：41所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：36所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：42所示；
进一步优选的，如上所述的抗体及其功能片段，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链恒定区序列和重链恒定区序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。
需要说明的是，除本申请上述公开的氨基酸序列外，嵌合抗体和人源化抗体的产生可以由本领域技术人员通过任何已知的方法来实现，比如通过根据鼠抗体经测序的CDR而设计的重组人源化抗体，所述鼠抗体由来自免疫的小鼠或与骨髓瘤细胞相融合的其它物种的脾细胞的骨髓瘤细胞所分泌。所述免疫的动物可以包括转基因小鼠，其具有人类免疫球蛋白基因座，然后直接产生人类抗体。另外一个可能的实施方式可以包括使用噬菌体展示技术筛选文库。
一种分离的核酸分子，所述核酸分子选自如下核酸：
A)、DNA或RNA，其编码如上所述的抗体及其功能片段；
B)、与A)中定义的核酸互补的核酸。
一种载体，其包括如上所述的核酸。
本发明进一步包含至少一种编码如上所述的核酸分子的核构建体，优选载体，进一步优选为表达载体，比如质粒，在本申请的一个实施例中会介绍该载体的构建方法
一种宿主细胞，其被如上所述的载体转化。
所述宿主细胞是真核细胞，比如哺乳动物细胞。
一种生产能够特异性地结合PD-1的抗体及其功能片段的方法，包括如下步骤：
在培养基中和合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞；
从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的抗体及其功能片段。
一种组合物，所述组合物以如上所述的抗体及其功能片段、或它们与其他成分组成的化合物作为活性成分。
优选的，如上所述的组合物，所述抗体及其功能片段与至少一种诊断剂和/或治疗剂偶联以形成免疫偶联物。
优选的，如上所述的组合物，所述诊断剂选自：
放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂中的一种或多种；
优选的，所述所述放射性核素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr中的一种或多种；
优选的，所述顺磁离子包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)中的一种或多种；
优选的，所述荧光标记包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、PacificBlue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的一种或多种。
优选的，如上所述的组合物，所述治疗剂选自：裸抗体、细胞毒素剂、药物、放射性核素、硼原子、免疫调节剂、抗凋亡试剂、光敏性治疗剂、免疫偶联物、寡核苷酸中的一种或多种；
优选的，所述药物选自甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、巯嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、氮芥、环磷酰胺、噻替派、顺铂、丝裂霉素、博莱霉素、喜树碱、鬼臼毒素、放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、长春碱、紫杉醇、三尖杉生物碱、L-门冬酰胺酶；；
优选的，所述寡核苷酸选自shRNA、miRNA和siRNA中的一种或多种；
优选的，所述免疫调节剂选自：细胞因子、趋化因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)和干细胞生长因子中的一种或多种；
其中，所述细胞因子优选选自：人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵胞激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、促血小板生成素(TPO)、NGF-β、血小板-生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应素、内皮抑素、肿瘤坏死因子和LT中的一种或多种。
所述趋化因子优选选自RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β和IP-10中的一种或多种。
优选的，所述放射性核素选自111In、111At、177Lu、211Bi、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、133I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、153Sm、161Tb、152Dy、166Dy、161Ho、166Ho、186Re、188Re、189Re、211Pb、212Pb、223Ra、225Ac、77As、89Sr、99Mo、105Rh、149Pm、169Er、194Ir、58Co、80mBr、99mTc、103mRh、109Pt、119Sb、189mOs、192Ir、219Rn、215Po、221Fr、255Fm、11C、13N、15O、75Br、198Au、199Au、224Ac、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、142Pr、143Pr、161Tb、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、76Br和169Yb中的一种或多种。
如上所述组合物在制备用于预防和/或治疗自身免疫性疾病、针对移植物的免疫应答、变态反应、感染、神经退行性疾病和肿瘤的药物中的应用；
优选的，所述自身免疫性疾病包括：关节炎、风湿性关节炎、银屑病、多发性硬化症、溃疡性结肠炎、克罗恩病、系统性红斑狼疮、肾小球肾炎、扩张型心肌病样疾病、斯耶格伦氏综合征、过敏性接触性皮炎、多肌炎、硬皮病、动脉周性多动脉炎、风湿热、白癜风、胰岛素依赖性糖尿病、白塞氏综合征和慢性甲状腺炎；
优选的，所述神经退行性疾病包括：帕金森氏病、亨廷顿氏病、马查多-约瑟夫病、肌萎缩性侧索硬化症、克罗伊茨费尔特-雅各布病；
优选的，所述肿瘤包括：白血病、淋巴瘤、骨髓瘤、脑肿瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鼻咽癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤、前列腺癌、膀胱癌、肾细胞癌、黑色素瘤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中2号克隆分泌的单抗与人PD-1的结合活性；
图2为本发明实施例1中2号克隆分泌的单抗对人PD-1/PD-L1结合的封闭活性；
图3为本发明实施例3中抗人PD-1嵌合抗体与人PD-1的结合活性；
图4为本发明实施例4中抗人PD-1嵌合单抗的种属特异性；
图5为本发明实施例4中抗人PD-1嵌合单抗的结合特异性；
图6为本发明实施例5中抗人PD-1嵌合单抗对PD-1/PD-L1,PD-1/PD-L2结合的封闭活性；
图7为本发明实施例6中抗人PD-1嵌合单抗的T细胞功能调控活性；
图8为本发明实施例7抗人PD-1嵌合单抗单次静脉注射大鼠后的药时曲线；
图9为本发明实施例8抗人PD-1嵌合单抗的体内抗肿瘤药效。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1鼠源的抗人PD-1单抗的制备
1.1、动物免疫
实验动物选用雌性BALB/c小鼠，6至8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。小鼠适应环境一周后，开始免疫。首次免疫使用重组人PD-1-Fc蛋白100μg与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich，货号F5881)，充分混合形成乳液，于小鼠腹腔注射。两周之后，进行加强免疫。加强免疫使用重组人PD-1-Fc蛋白50μg与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich，货号F5806)，充分混合形成乳液，于小鼠腹腔注射。每隔2周以同样的方法加强免疫，共加强免疫3次。末次免疫后第7天，从小鼠眼眶后静脉丛采血并离心分离血清，ELISA测定抗体效价。选择效价高的小鼠用来融合做杂交瘤。融合前三天，腹腔注射重组人PD-1-Fc蛋白50μg，不含佐剂。融合当天，无菌取脾，制成单脾细胞悬液，以待融合。
1.2、杂交瘤细胞的制备
取对数生长的骨髓瘤细胞SP2/0，1000rpm离心5分钟，弃上清，用不完全DMEM培养液(Gibco，cat No.11965)混悬细胞后计数，取所需的细胞数，用不完全培养液洗涤2次。同时制备免疫脾细胞悬液，用不完全培养液洗涤2次。将骨髓瘤细胞与脾细胞按1∶10或1∶5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液洗1次，1200rpm,8分钟。弃上清，用滴管吸净残留液体。在手掌上轻击离心管底，使沉淀细胞松散均匀；置40℃水浴中预热。用1ml吸管在1分钟左右(最佳时间为45秒)加预热至40℃的45％PEG-4000(PH 8.0，Sigma，catNo.P7181)1ml，边加边轻轻搅拌(用吸管搅拌)，肉眼观察应有可见颗粒出现。用10ml吸管在90秒内加20-30ml预热至37℃的不完全培养基以终止PEG作用；20～37℃静置10分钟。1000r/min 5分钟，弃去上清。加入5ml HAT培养基(DMEM+HAT,Sigma,cat No.1 H0262-10VL)，轻轻吹吸沉淀细胞(切记不能用力吹打，以免使融合在一起的细胞散开)，使其悬浮并混匀，然后补加HAT培养基至80-100ml(使脾细胞浓度为1～2×106/ml)。分装96孔细胞培养板，每孔0.1ml；分装24孔板，每孔1.0～1.5ml；然后将培养板置37℃，6％CO2培养箱内培养。一般铺6块96孔板。5天后用HAT培养基换出1/2培养基。再7～10天后用HT培养基(DMEM+HT,Sigma cat No.H0137-10VL)换出HAT培养基。经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。将阳性克隆的细胞扩大培养并冻存。
1.3、克隆筛选与鉴定
ELISA用于筛选杂交瘤培养上清液的抗人PD-1抗体。用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人PD-1(北京义翘神州，货号10377-H08H)，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入培养上清液样品以及阳性血清对照，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。然后加入1:10000稀释在含1％BSA的PBST里的辣根过氧化物酶标记的抗小鼠IgG抗体(Abcam，货号Ab7068)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H2SO4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。根据OD450nm的强弱选取能够分泌抗人PD-1结合抗体的阳性克隆。
ELISA测定阳性克隆分泌的抗人PD-1抗体是否能够阻断PD-1/PD-L1的结合。用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人PD-1-Fc，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入抗人PD-1抗体样品以及阳性对照，每孔加入50μL，并加入生物素标记的PD-L1，浓度为20nM(终浓度10nM)，每孔加入50μL，25℃孵育90分钟。PBST洗涤5次。然后加入1:1000稀释在含1％BSA的PBST里的Streptavidin-HRP(BD Pharmingen，货号554066)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H2SO4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。能够抑制人PD-1-Fc/生物素标记的PD-L1结合的抗人PD-1抗体即具有中和活性。根据封闭能力强弱选取能够分泌抗人PD-1中和抗体的阳性克隆。
结果如图1所示，2号克隆具有强的人PD-1结合活性，根据图2所示，2号克隆同时具有很强的人PD-1/PD-L1结合封闭活性。
1.4、单克隆抗体序列的测定
将筛选得到的同时具有抗原结合活性以及抗原中和活性的克隆，进行抗体DNA序列的测定。首先提取细胞mRNA，使用RNAprep Pure试剂盒(Tiangen，DP430)。步骤如下：悬浮细胞的收集1×107，300×g离心5min，将细胞收集到离心管中，仔细吸除所有培养基上清。立即进行裂解步骤。轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入适量裂解液RL600uL，旋涡震荡。将所有溶液转移至过滤柱CS上(过滤柱CS放在收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，收集滤液。向滤液中加入1倍体积70％乙醇(通常为350μl或600μl)，混匀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中(吸附柱CR3放入收集管中)，12,000rpm(～13,400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。向吸附柱CR3中央加入80μl的DNase I工作液，室温放置15min。向吸附柱CR3中加入350μl去蛋白液RW1，12,000rpm(～13,400×g)离心30～60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW(使用前请先检查是否已加入乙醇)，室温静置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心30-60sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中。12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30～100μl RNase-Free ddH2O室温放置2min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，得到RNA溶液。
使用QuantScript RT试剂盒(Tiangen，KR103)合成cDNA第一链。步骤如下，将模板RNA在冰上解冻；引物、10×RT mix(其中包含RNasin和DTT)、Super pure dNTP混合液、RNase-Free ddH2O在室温(15～25℃)解冻，解冻后迅速置于冰上。使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，简短离心以收集残留在管壁的液体。按照表1的逆转录体系配制混合液，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5min。简短离心，并置于冰上，最后将模板RNA(50ng～2μg)加入到混合液中，彻底混匀，涡旋振荡时间不超过5sec，简短离心以收集管壁残留的液体。37℃孵育60min。将逆转录的产生的cDNA第一链用于后续PCR反应。
PCR反应使用的引物如表1所示。
表1 PCR引物
Figure BDA0001406713990000141
使用引物时，VH primer中的任一上游引物可与任一下游引物配合使用；同理在VLprimer中的任一上游引物也可与任一下游引物配合使用。将PCR扩增得到的目的条带克隆到pGEM-T载体中。挑取单克隆进行DNA测序。
实施例2嵌合的抗人PD-1单抗的制备
经过PCR扩增得到抗体轻链可变区序列如SEQ ID NO:10所示，抗体重链可变区序列如SEQ ID NO:14所示。根据小鼠可变区序列排除骨架区序列后即可得到其互补决定区序列；其中轻链的三个互补决定区CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、5和6所示；重链的三个互补决定区CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、8和9所示。将上述可变区序列克隆到真核细胞表达载体X0GC中，抗体轻链恒定区序列如SEQ ID NO:15所示，抗体重链恒定区序列如SEQ ID NO:16所示。将抗体轻链(轻链全长序列为将抗体轻链可变区和SEQ ID NO:15连接即得)及重链(重链全长序列为将抗体重链可变区和SEQ ID NO:16连接即得)表达载体转染293F细胞系(FreeStyleTM293-F Cells，货号R79007,invitrogen)。转染前一天接种细胞，转染当天将细胞离心收集细胞，将细胞重悬于新鲜的FreeStyleTM293表达培养基(FreeStyleTM293 Expression Medium，货号12338001，Gibco)中，细胞密度为200×105细胞/mL。按照转染体积加入质粒，终浓度为36.67ug/mL，轻轻混匀；然后加入线性PEI(聚乙烯亚胺，线形，M.W.25000，货号43896，Alfa Aesar)，终浓度为55ug/mL，轻轻混匀。之后放入细胞培养箱，120rpm摇床37℃培养1小时。之后加入19倍转染体积的新鲜培养基。继续120rpm摇床37℃培养。离心收集转染5～6天的细胞培养上清。
实施例3嵌合的抗人PD-1单抗与人PD-1的结合活性及动力学常数
用ELISA测定抗人PD-1嵌合单抗与其抗原人PD-1的结合活性。用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人PD-1，购自义翘神州，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入序列稀释在含1％BSA的PBST里的抗人PD-1嵌合单抗样品以及单抗对照pembrolizumab，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。然后加入1:2000稀释在含1％BSA的PBST里的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Chemicon，货号AP309P)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H2SO4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
结果如图3所示，抗人PD-1嵌合单抗具有良好的人PD-1结合亲和力，跟pembrolizumab的结合活性相似。
用Biacore X100仪器来检测抗人PD-1嵌合单抗与其抗原人PD-1结合的动力学常数。该仪器利用光学的表面等离子体共振技术来检测偶联包被在生物芯片上的分子与待测分子之间的结合和解离。所用的主要试剂为CM5芯片(GE Healthcare，BR-1000-12)。实验过程简要的说，将抗人PD-1嵌合抗体用运行缓冲液(1×HBS-EP+10mM HEPES,150mM NaCl,3mMEDTA,0.05％surfactant P20,pH7.4)稀释到2μg/mL，然后以10μL/min的速度注入固定有抗人IgG的CM5芯片上，持续60秒。在结合阶段，将抗原PD-1用运行缓冲液稀释成多个浓度，分别以30μL/min的速度注入180秒；在解离阶段，解离时间为1200秒。再生条件为甘氨酸盐溶液(GE Healthcare，BR-1003-54)，10μL/min的速度再生30秒。分析对照抗体的实验方法类似，只将解离时间调整为600秒。结合动力学常数和解离动力学常数通过BiacoreX100evaluation software来进行分析计算。抗人PD-1嵌合抗体的结合动力学常数、解离动力学常数和解离平衡常数见表2。数据说明，相比pembrolizumab，抗人PD-1嵌合单抗结合PD-1抗原后能更长时间的维持结合状态，更难解离，这对其生物学功能是很有利的。
表2.抗人PD-1嵌合抗体与人PD-1结合的动力学常数
Figure BDA0001406713990000161
实施例4嵌合的抗人PD-1单抗的种属特异性和结合特异性
用ELISA测定抗人PD-1嵌合单抗的种属特异性。用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人PD-1，猴PD-1，大鼠PD-1和小鼠PD-1，均购自义翘神州，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入序列稀释在含1％BSA的PBST里的抗人PD-1嵌合单抗样品以及对照，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。然后加入1:2000稀释在含1％BSA的PBST里的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Chemicon，货号AP309P)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H2SO4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
用ELISA测定抗人PD-1嵌合单抗的结合特异性。用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人PD-1，CD28，CTLA4，ICOS,BTLA,PD-L1，PD-L2，CD80，CD86，B7-H2，均购自义翘神州，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入序列稀释在含1％BSA的PBST里的抗人PD-1嵌合单抗样品以及对照，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。然后加入1:2000稀释在含1％BSA的PBST里的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Chemicon，货号AP309P)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H2SO4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
结果如图4所示，抗人PD-1嵌合单抗可以结合人PD-1和猴子PD-1，且亲和力相似，但不与大鼠，小鼠PD-1结合，具有种属特异性。同时，如图5所示，抗人PD-1嵌合单抗还具有很强的结合特异性，仅与PD-1结合，不与CD28家族的其他成员结合，也不与B7家族成员结合。
实施例5嵌合的抗人PD-1单抗的封闭PD-1和配体结合的活性
用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液在96孔高吸附酶标板上包被重组人PD-1-Fc，包被浓度为1μg/mL，包被量为100μL每孔，包被在4℃过夜进行。PBST洗涤5次。用含1％BSA的PBST按300μL/孔封闭，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入抗人PD-1抗体样品以及阳性对照，每孔加入50μL，并加入生物素标记的PD-L1，浓度为20nM(终浓度10nM)，或者加入生物素标记的PD-L2，浓度为320nM(终浓度为160nM),每孔加入50μL，25℃孵育90分钟。PBST洗涤5次。然后加入1:1000稀释在含1％BSA的PBST里的Streptavidin-HRP(BD Pharmingen，货号554066)，每孔加入100μL，25℃孵育1小时。PBST洗涤5次。加入比色底物TMB，100μL/孔，室温显色10分钟。加入1M H2SO4，100μL/孔，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
结果如图6所示，抗人PD-1嵌合单抗具有跟pembrolizumab相似的PD-1/PD-L1和PD-1/PD-L2封闭活性。
实施例6嵌合的抗人PD-1单抗的T细胞功能调控活性
实验所用的PBMC购自Lonza，货号为CC-2702。
首先用PBMC诱导DC细胞：将PBMC用完全培养基(RPMI 1640+10％FBS)复苏，然后用无血清培养基洗涤一次，再重悬于无血清培养基中，接种于细胞培养瓶置于37℃，5％CO2培养箱中孵育。90分钟之后，移除不贴壁的细胞和培养基；贴壁的单核细胞换用完全培养基培养+100ng/mL GM-CSF及100ng/mL IL-4培养，3天后换一次液，再培养3天，然后将培养基换成完全培养基+100ng/mL GM-CSF，100ng/mL IL-4及20ng/mL TNF-alpha培养1天，即完成DC细胞的诱导。再从另一个个体来源的PBMC中分离T细胞：利用Miltenyi Biotech公司的PanT Cell Isolation Kit(货号5150414820)分离T细胞，具体实验过程参见说明书。将诱导成熟的DC细胞接种于96孔板中，10,000细胞每孔，并加入分离的T细胞，100,000细胞每孔，最后加入待测样品，共同孵育120小时。孵育结束时，取上清，用购自RayBiotech的ELISA试剂盒检测IL-2和IFN-gamma的水平。
结果如图7所示，抗人PD-1嵌合单抗在MLR系统中，能增强IL-2和IFN-gamma的分泌，具有跟pembrolizumab相似的T细胞功能调控活性。
实施例7嵌合的抗人PD-1单抗在大鼠体内的药代动力学研究
实验材料选用雌性SD大鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。大鼠适应环境一周后，随机分组，每组3只。各组分别给予抗人PD-1嵌合单抗，对照单抗pembrolizumab，剂量均为20nmol/kg，静脉注射，单次给药。在0点，给药后5分钟，30分钟，1小时、4小时、8小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、264小时、312小时眼眶采血，不予抗凝，室温放置血样30分钟至1个小时，待凝血后，3000rpm离心10分钟，得到的血清样品冷冻于-80℃保存，待测。
ELISA测定血清中抗人PD-1嵌合单抗，对照单抗pembrolizumab的浓度。简要的说，用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液4℃过夜包被人重组PD-1蛋白于高吸附酶标板上。PBST洗涤。为了防止非特异性结合，用含5％脱脂奶粉的PBST封闭该板，PBST洗涤。然后加入用含10％混合大鼠血清、1％BSA的PBST稀释的待测血清样品孵育，25℃，1小时，PBST洗涤该板。加入稀释于含5％脱脂奶粉的PBST中的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Chemicon，货号AP309P)，25℃，1小时，PBST洗涤该板。最后使用比色底物TMB进行显色，室温显色10分钟。加入1M H2SO4，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。
结果如图8所示，单次静脉注射的剂量为20nmol/kg的抗人PD-1嵌合单抗，对照单抗pembrolizumab，在大鼠体内显示出了相似的药时曲线和药代动力学特征。抗人PD-1嵌合单抗的药代参数如下：半衰期t1/2为212小时；药时曲线下面积AUC0-312hr为33967nM.hr；估算零浓度C0为464nM；表观分布容积Vd为118mL/Kg；清除率CL为0.39mL/hr/kg；平均驻留时间MRTlast为119小时。
实施例8嵌合的抗人PD-1单抗的体内抗肿瘤药效研究
本实施例检测嵌合的抗人PD-1单抗对接种于PBMC人源化小鼠的HCC827异种肿瘤移植物的生长抑制作用。
实验材料选用NCG免疫缺陷小鼠，雌性，6-8周龄，购自南京银河生物医药有限公司。小鼠适应环境一周后，每只小鼠接种1x107个HCC827人非小细胞肺癌细胞(购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心)。待肿瘤体积长至约100mm3时，按肿瘤体积分组，每组6只小鼠，分别设定为溶媒对照组，抗人PD-1嵌合单抗给药组，pembrolizumab给药组。每只小鼠静脉注射5x106个人PBMC细胞对小鼠进行免疫系统人源化，然后按分组给予溶媒或者抗体，给药剂量为70nmol/kg,i.p.，每周给药2次，连续给药3周。自给药之日起，每周测量3次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm3)＝(a x b2)/2。
结果如图9所示，抗人PD-1嵌合单抗具有抗肿瘤活性，抑制了PBMC人源化小鼠体内的HCC827非小细胞肺癌移植物的生长，显示出了与pembrolizumab相当或者稍强的抗肿瘤药效。
实施例9人源化的抗人PD-1单抗的制备
人源化的抗人PD-1单抗是根据Leung等人(1995，Molecule Immunol 32:1413-27)的方法获得的。在Germline数据库中选取与鼠源抗体可变区序列匹配最好的人源化模板，其中轻链可变区的模板为IGKV3-11*01，序列如SEQ ID NO：43所示；重链可变区的模板为IGHV3-23*04，序列如SEQ ID NO：44所示。将鼠源抗体CDR区移植到选择的人源化模板上，替换人模板的CDR区，得到移植的人源化抗体轻链可变区，序列如SEQ ID NO：45所示，移植的人源化抗体重链可变区，序列如SEQ ID NO：46所示。在SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46上选择位点进行回复突变，在SEQ ID NO:45的CDR1区上选择NQS位点进行突变以去除可能的糖基化位点，得到新的CDR-L1序列如SEQ ID NO:2所示，或者如SEQ ID NO:3所示，或者如SEQID NO:4所示，得到轻链可变区序列如SEQ ID NO：25-36所示，得到重链可变区序列如SEQID NO：37-42所示。将轻链可变区与轻链恒定区(序列SEQ ID NO：15)连接，分别得到对应的轻链全长序列，将重链可变区与重链恒定区(序列SEQ ID NO：16)连接，分别得到对应的重链全长序列。通过亲和力和稳定性筛选得到可用的人源化序列。
Figure BDA0001406713990000201
Figure BDA0001406713990000211
Figure BDA0001406713990000212
实施例10人源化的抗人PD-1单抗的体外生物学活性
测定人源化的抗人PD-1单抗的体外生物活性，包括与人PD-1结合的活性和对PD-1/PD-L1结合的封闭活性。测定的人源化序列包括AH00290,AH00291,AH00293,AH00294,AH00295,AH00296,AH00298,BMⅢ,BMⅣ,AH00290-N26Q,AH00291-N26S,AH00291-S28A,AH00294-N26Q,AH00294-N26S,AH00294-S28A,AH00296-N26Q,AH00296-N26S,AH00296-S28A；测定的方法为ELISA，具体实验过程与测定嵌合的抗人PD-1单抗的方法相同。
实验结果见表3。与嵌合的抗人PD-1单抗相比，所测的人源化序列均很好的维持了活性，显示出了很强的PD-1结合活性和PD-1/PD-L1封闭活性。
表3.抗人PD-1人源化抗体结合PD-1、封闭PD-1/PD-L1的活性
Figure BDA0001406713990000213
Figure BDA0001406713990000221
实施例11.分子筛高效液相色谱法(SE-HPLC)检测人源化的抗人PD-1单抗的纯度及其热稳定性
选用的TSKgel SuperSW3000色谱柱(货号：0018675)；流动相为0.1mol/L磷酸盐缓冲液(NaH2PO4-Na2HPO4),0.1mol/L硫酸钠缓冲液,pH 6.7；流速为0.35mL/min；色谱柱温度为25℃；样品池温度:4℃；检测波长280nm；用样品缓冲液稀释样品至1mg/mL,进样体积5μL。用Agilent高效液相分析仪1260系统工作站对实验结果进行数据处理，用面积归一化法计算主峰比例即为纯度。对上述制备的人源化的抗人PD-1单抗进行了SE-HPLC纯度检测。为了确定这些单抗的热稳定性，将上述样品置于40℃高温条件下，在第2周和第4周分别取样进行SE-HPLC检测以观察热稳定性，结果如下表所示。人源化的抗人PD-1抗体,除AH00296-S28A外，均显示出了很好且相当的稳定性。
表4.SE-HPLC检测人源化的抗人PD-1单抗在40℃条件下的热稳定性
Figure BDA0001406713990000222
Figure BDA0001406713990000231
实施例12.人源化的抗人PD-1单抗Tm值的测定
采用差示扫描荧光法(Differential scanning fluorimetry,DSF)测定人源化的抗人PD-1单抗的变性温度(Tm)。DSF是一种利用荧光指示剂的荧光强度改变来检测样品中蛋白热变性过程的方法，实现蛋白变性温度的测定。选用的试剂为SYPRO Orange蛋白质荧光染料(货号：S5692，5000倍浓度，溶剂为DMSO)购自美国Sigma-Aldrich公司。仪器为AB7500 Real Time PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。将蛋白质荧光染料按1:50用样品缓冲液进行稀释，取1μl稀释后染料分别与19μl蛋白溶液混合，荧光染料终稀释度为1:1000,加入96孔板中，每个样品设三个平行孔。用光学封板膜封板，1000rpm离心2min，去除气泡。RT-PCR仪器设置如下：熔解曲线，采用连续模式，扫描温度范围为25～99℃，升温速率为1％(约1℃/min)，25℃平衡2min，在升温过程中采集数据，报告基团选择ROX，淬灭基团选择None，反应体积20μl。样品测定浓度为1mg/ml，参比溶液为样品缓冲液。采用ProteinThermal ShiftTMSoftware v1.3软件绘制荧光曲线及其一阶导数图。DSF试验中，通常以蛋白第1个转变中点温度作为蛋白制剂热稳定性的变性温度。如下表所示，对上述制备的人源化的抗人PD-1单抗进行了Tm值测定。结果如下表所示。人源化的抗人PD-1单抗均有很好的Tm值。
表5.人源化的抗人PD-1单抗的Tm值
人源化的抗人PD-1单抗 Tm值
BMIII 70.7℃
BMIV 65.2℃
AH00290 66.5℃
AH00291 67.7℃
AH00293 69.1℃
AH00294 67.9℃
AH00295 70.5℃
AH00296 70.0℃
AH00298 67.9℃
AH00291-N26Q 68.5℃
AH00291-N26S 67.8℃
AH00291-S28A 68.8℃
AH00294-N26Q 66.6℃
AH00294-N26S 65.9℃
AH00294-S28A 68.4℃
AH00296-N26Q 67.6℃
AH00296-N26S 70.1℃
AH00296-S28A 69.1℃
实施例13.离子交换色谱法(CEX)检测人源化的抗人PD-1单抗的电荷异构体
采用阳离子交换色谱柱MabPac SCX-10,4mm×250mm(货号：78655)，以20mmol/L吗啉乙磺酸(2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid,MES)(pH5.6)和60mmol/L氯化钠为流动相A；以20mmol/L MES(pH5.6)和300mmol/L氯化钠为流动相B；流速为0.5mL/min；柱温为25℃；样品池温度:4℃；检测波长为280nm；样品上样量为50μl(1mg/mL)；洗脱为5～50％线性梯度运行60分钟。用Agilent高效液相分析仪1260系统工作站对实验结果进行数据处理，用面积归一化法计算峰面积百分比。对上述制备的人源化的抗人PD-1单抗进行了CEX检测。为了确定这些单抗的化学稳定性，将上述样品置于40℃高温条件下，在第2周和第4周分别取样进行CEX检测，观察电荷变异体比例的变化，结果如表2所示。人源化的抗人PD-1抗体，除AH00296-S28A外，电荷变异体的比例变化均比较低。
表6.CEX检测人源化的抗人PD-1单抗在40℃条件下电荷变异体的变化
Figure BDA0001406713990000251
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京韩美药品有限公司
<120> 一种能够特异性地结合PD-1的抗体及其功能片段
<160> 46
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Arg Ala Asn Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
1 5 10
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Arg Ala Gln Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
1 5 10
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn Leu His
1 5 10
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Arg Ala Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn Leu His
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser
1 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu Thr
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser
1 5 10
<210> 8
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Glu Tyr Phe Tyr Thr Met Asp Tyr
1 5
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Asn Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 11
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Gln Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 12
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 13
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Ser His Glu Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 14
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Asn Leu His
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Tyr Glu Tyr Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 15
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 16
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 16
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 17
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 17
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys
20
<210> 18
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 18
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Arg
1 5 10 15
<210> 19
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 19
Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
1 5 10 15
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys
20 25 30
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 20
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 21
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 21
Glu Val Asn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser
20 25
<210> 22
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 22
Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
1 5 10
<210> 23
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 23
Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu Tyr Leu Gln
1 5 10 15
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Tyr
20 25 30
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 24
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 25
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Asn Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 26
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 26
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Asn Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 27
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Asn Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 28
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 28
Glu Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Asn Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 29
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gln Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 30
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 31
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 32
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 32
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gln Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 33
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 34
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Asn Gln Ala Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 35
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Asn Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 36
Asp Val Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Leu Ser Cys Arg Ala Asn Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser His Gln Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Arg Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Thr
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 37
Glu Val Asn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Tyr Glu Tyr Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 38
Glu Val Asn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Tyr Glu Tyr Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 39
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 39
Glu Val Asn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Tyr Glu Tyr Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 40
Glu Val Asn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Tyr Glu Tyr Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 41
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 41
Glu Val Asn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Tyr Glu Tyr Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 42
Glu Val Asn Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Asn Leu His
65 70 75 80
Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Tyr Glu Tyr Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 96
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 43
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Asn Trp Pro Pro
85 90 95
<210> 44
<211> 99
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (99)..(99)
<223> Xaa can be any naturally occurring amino acid
<400> 44
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Xaa
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 45
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Asn Gln Ser Ile Ser Asn Asn
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Phe Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Asn Trp Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 46
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Gly Gly Gly Arg Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Met
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Glu Tyr Phe Tyr Thr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (24)

1.一种能够特异性地结合PD-1的抗体及其功能片段，其特征在于，所述抗体及其功能片段包含轻链和重链；
所述轻链具有由CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3组成的轻链CDR；所述重链具有由CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3组成的重链CDR；
所述CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、5和6所示，或者分别如SEQ ID NO:2、5和6所示，或者分别如SEQ ID NO:3、5和6所示，或者分别如SEQ ID NO:4、5和6所示；所述CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:7、8和9所示。
2.根据权利要求1所述的抗体及其功能片段，其特征在于，所述抗体及其功能片段包括PD-1嵌合抗体及其功能片段及PD-1人源化抗体及其功能片段。
3.根据权利要求1所述的抗体及其功能片段，其特征在于，所述抗体包含人抗体IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。
4.根据权利要求1所述的抗体及其功能片段，其特征在于，所述功能片段包括F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种或多种。
5.根据权利要求2所述的抗体及其功能片段，其特征在于，所述PD-1嵌合抗体及其功能片段的轻链可变区序列和重链可变区序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:10和SEQ IDNO:14所示，或者分别如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:14所示，或者分别如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:14所示，或者分别如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示。
6.根据权利要求2所述的抗体及其功能片段，其特征在于，所述PD-1嵌合抗体及其功能片段的轻链恒定区序列和重链恒定区序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15和SEQ IDNO:16所示。
7.根据权利要求2所述的抗体及其功能片段，其特征在于，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链骨架区包括FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，重链骨架区包括FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4；
所述FR-L1选自SEQ ID NO:17所示的氨基酸序列，或经过以下取代或其组合所得到的氨基酸序列：
第1个氨基酸D替换为E；
第2个氨基酸V替换为I；
第13个氨基酸L替换为V；
第19个氨基酸A替换为V；
所述FR-L2选自SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，或经过以下取代或其组合所得到的氨基酸序列：
第6个氨基酸P替换为S；
第7个氨基酸G替换为H；
第9个氨基酸A替换为S；
所述FR-L3选自SEQ ID NO:19所示的氨基酸序列，或经过以下取代或其组合所得到的氨基酸序列：
第22个氨基酸L替换为V；
第24个氨基酸P替换为T；
第28个氨基酸A替换为G；
第31个氨基酸F替换为Y；
所述FR-L4选自SEQ ID NO:20所示的氨基酸序列，或经过以下取代所得到的氨基酸序列：
第7个氨基酸V替换为L；
所述FR-H1选自SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
所述FR-H2选自SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列，或经过以下取代或其组合所得到的氨基酸序列：
第5个氨基酸A替换为T；
第14个氨基酸A替换为S；
所述FR-H3选自SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列，或经过以下取代或其组合所得到的氨基酸序列：
第12个氨基酸N替换为T；
第14个氨基酸Y替换为H；
第18个氨基酸N替换为S；
所述FR-H4选自SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求2所述的抗体及其功能片段，其特征在于，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：25-36任一项所示。
9.根据权利要求2所述的抗体及其功能片段，其特征在于，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的重链可变区序列如SEQ ID NO：37-42任一项所示。
10.根据权利要求2所述的抗体及其功能片段，其特征在于，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：25所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：37所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：25所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：38所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：29所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：38所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：30所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：38所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：31所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：38所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：26所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：38所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：28所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：40所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：25所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：40所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：29所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：40所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：30所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：40所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：31所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：40所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：28所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：38所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：27所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：39所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：32所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：39所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：33所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：39所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：34所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：39所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：35所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：41所示；
或，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链可变区序列如SEQ ID NO：36所示；其对应的重链可变区序列如SEQ ID NO：42所示。
11.根据权利要求2所述的抗体及其功能片段，其特征在于，所述PD-1人源化抗体及其功能片段的轻链恒定区序列和重链恒定区序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:15和SEQID NO:16所示。
12.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子选自如下核酸：
A）、DNA或RNA，其编码权利要求1~11任一项所述的抗体及其功能片段；
B）、与A）中定义的核酸互补的核酸。
13.一种载体，其包括权利要求12所述的核酸。
14.一种宿主细胞，其被权利要求13所述的载体转化。
15.一种生产能够特异性地结合PD-1的抗体及其功能片段的方法，其特征在于，包括如下步骤：
在培养基中和合适的培养条件下培养权利要求14所述的宿主细胞；
从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的抗体及其功能片段。
16.一种组合物，其特征在于，所述组合物以权利要求1~11任一项所述的抗体及其功能片段、或它们与其他成分组成的化合物作为活性成分。
17.根据权利要求16所述的组合物，其特征在于，所述抗体及其功能片段与至少一种诊断剂和/或治疗剂偶联以形成免疫偶联物。
18.根据权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述诊断剂选自：
放射性核素、放射性造影剂、顺磁离子、金属、荧光标记、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂中的一种或多种。
19.根据权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述所述放射性核素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu、67Cu、67Ga、68Ga、86Y、90Y、89Zr、94mTc、94Tc、99mTc、120I、123I、124I、125I、131I、154-158Gd、32P、11C、13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb 和83Sr中的一种或多种。
20.根据权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述顺磁离子包括铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)和铒(III)中的一种或多种。
21.根据权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述荧光标记包括Alexa 350、Alexa405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6- 羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、OregonGreen 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyaninB、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的一种或多种。
22.根据权利要求17所述的组合物，其特征在于，所述治疗剂选自：裸抗体、细胞毒素剂、药物、放射性核素、硼原子、免疫偶联物、寡核苷酸中的一种或多种。
23.根据权利要求22所述的组合物，其特征在于，所述药物选自甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、巯嘌呤、羟基脲、阿糖胞苷、氮芥、环磷酰胺、噻替派、顺铂、丝裂霉素、博莱霉素、喜树碱、鬼臼毒素、放线菌素D、多柔比星、柔红霉素、长春碱、紫杉醇、三尖杉生物碱、L-门冬酰胺酶；
所述寡核苷酸选自shRNA、miRNA和siRNA中的一种或多种；
所述放射性核素选自111In、111At、177Lu、211Bi、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131I、133I、32P、33P、47Sc、111Ag、67Ga、153Sm、161Tb、152Dy、166Dy、161Ho、166Ho、186Re、188Re、189Re、211Pb、212Pb、223Ra、225Ac、77As、89Sr、99Mo、105Rh、149Pm、169Er、194Ir、58Co、80mBr、99mTc、103mRh、109Pt、119Sb、189mOs、192Ir、219Rn、215Po、221Fr、255Fm、11C、13N、15O、75Br、198Au、199Au、224Ac、77Br、113mIn、95Ru、97Ru、103Ru、105Ru、107Hg、203Hg、121mTe、122mTe、125mTe、165Tm、167Tm、168Tm、197Pt、109Pd、142Pr、143Pr、161Tb、57Co、58Co、51Cr、59Fe、75Se、201Tl、76Br和169Yb中的一种或多种。
24.权利要求16~23任一项所述的组合物在制备用于预防和/或治疗感染疾病和肿瘤的药物中的应用。
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