JP2017534247A - 抗pd−1のモノクローナル抗体およびその獲得方法 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)抗PD−1一本鎖抗体のバイオパニングで、3サイクルの抗体ライブラリの濃縮スクリーニングによって、完全合成のScFvバクテリオファージライブラリから、親和性の高い抗体配列DFPD1−1を獲得しており、その重鎖はDFPD1−H1(SEQ NO.1)であり、軽鎖はDFPD1−L1(SEQ NO.5)である。
(2)DFPD1−1をベースに、コンピュータ三次構造シミュレーションによって、軽鎖の相補性決定領域CDR1、2、3の突然変異ライブラリを構築するとともに該抗体ライブラリに対してバイオパニングと陽性クローンのスクリーニングおよび同定を行い、6種の異なる軽鎖の抗体配列DFPD1−2、DFPD1−3、DFPD1−4、DFPD1−5、DFPD1−6、DFPD1−7を獲得しており、それらが対応する軽鎖配列はそれぞれ、DFPD1−L2(SEQ NO.6)、DFPD−L3(SEQ NO.7)、DFPD1−L4(SEQ NO.8)、DFPD1−L5(SEQ NO.9)、DFPD1−L6(SEQ NO.10)、DFPD1−L7(SEQ NO.11)であり、上記7種の一本鎖抗体についてバクテリオファージレベルで親和性比較を行う。
(3)2株の親和性の高いクローンDFPD1−3およびDFPD1−7を選び出し、重鎖の相補性決定領域CDR1、2、3のライブラリを構築するとともに該ライブラリに対してバイオパニングと陽性クローンのスクリーニングを行い、5種の異なる一本鎖抗体配列DFPD1−9、DFPD1−10、DFPD1−11、DFPD1−12、DFPD1−13を獲得する。そのうちDFPD1−9、DFPD1−11およびDFPD1−12の軽鎖可変領域配列はDFPD1−L3であり、DFPD1−10とDFPD1−13の軽鎖可変領域配列はDFPD1−L7であり、DFPD1−9とDFPD1−10の重鎖可変領域配列はDFPD1−H2(SEQ NO.2)であり、DFPD1−11とDFPD1−13の重鎖可変領域はDFPD1−H3(SEQ NO.3)であり、DFPD1−12の重鎖可変領域はDFPD1−H4(SEQ NO.4)である。上記一本鎖抗体についてバクテリオファージレベルで親和性比較を行う。
(4) (3)に記載のモノクローナル重鎖可変領域遺伝子と軽鎖可変遺伝子および軽重鎖定常領域遺伝子を真核発現ベクタにクローニングし、宿主細胞をトランスフェクトし、モノクローナル抗体の完全抗体を獲得しさらに親和性と他の生物学的機能の比較を行う。
(1)抗PD−1一本鎖抗体のバイオパニングで、3サイクルの抗体ライブラリの濃縮スクリーニングによって、親和性の高い抗体配列DFPD1−1を獲得する。
(2)DFPD1−1をベースに、コンピュータ支援設計によって、軽鎖のCDR1、2、3の突然変異ライブラリを構築するとともに該抗体ライブラリ対してバイオパニングと陽性クローンのスクリーニングおよび同定を行い、6種の異なる軽鎖の抗体配列DFPD1−2、DFPD1−3、DFPD1−4、DFPD1−5、DFPD1−6、DFPD1−7を獲得する。上記7種の一本鎖抗体についてバクテリオファージレベルで親和性比較を行う。
(3)2株の親和性の高いクローンDFPD1−3およびDFPD1−7を選び出し、重鎖のCDR1、2、3のライブラリを構築するとともに該ライブラリに対してバイオパニングと陽性クローンのスクリーニングを行い、5種の異なる配列の一本鎖抗体DFPD1−9、DFPD1−10、DFPD1−11、DFPD1−12、DFPD1−13を獲得する。上記一本鎖抗体についてバクテリオファージレベルで親和性比較を行う。
(4) (3)に記載のモノクローナル重鎖可変領域遺伝子と軽鎖可変遺伝子および軽重鎖定常領域遺伝子を真核発現ベクタにクローニングし、宿主細胞をトランスフェクトし、モノクローナル抗体の完全抗体を獲得し、さらに親和性と他の生物学的機能の比較を行う。
以下、図面と実施例を参照しながら本発明について詳述する。
一連の遺伝子クローンの方法を用いてベクタpCom3のベクタ(中国質粒載体菌株細胞株基因保藏中心から購入)を改造し、それを、バクテリオファージ一本鎖抗体ライブラリの構築と発現に用いさせる。改造後のベクタはpScFvDisb−sと命名され、そのプラスミドプロファイルは図1に示す通りであり、さらに、このベクタをベースに、完全合成バクテリオファージ抗体ライブラリを構築する。
3サイクルのスクリーニングを経た後、きちんと仕切られたモノクローナルコロニを選び取り、2YTAG液体培地が加えられた96穴のマイクロプレートに接種し、37℃、220rpmで、その対数増殖期まで培養し、穴ごとに約1010の補助バクテリオファージM13KO7を加え、37℃で静止させて30分間感染させ。4000rpmで、15分間遠心し、上澄みを捨て、菌体を2YTAKで再懸濁して沈澱させ、28℃、220rpmで一晩培養する。4000rpm、4℃で15分間遠心し、増幅後のバクテリオファージ上澄みを吸い取ってELISA同定を行う。スクリーニングして、親和性の高い一本鎖抗体DFPD1−1を得、その重鎖可変領域はDFPD1−H1と命名され、そのアミノ酸配列についてはSEQ NO.1を参照のこと。その軽鎖可変領域はDFPD1−L1と命名され、アミノ酸配列についてはSEQ NO.5を参照のこと。
<3.1. DFPD1−1軽鎖CDR1、2、3突然変異ライブラリの構築>
プライマーPVLF1およびPVLR1を設計し、合成された軽鎖突然変異ライブラリ(SEQ NO.12)をテンプレートとし、軽鎖ライブラリ遺伝子をPCR増幅し(図3);プライマPVHF1およびPVHR1を設計し、DFPD1−1プラスミドをテンプレートとしてその重鎖およびリンカ領域を増幅する(図2)。反応条件:95℃ 30s、1cycle;95℃ 15s、60℃ 10s、72℃ 30s、3cycles;95℃ 15s、72℃ 40s、25cycles、72℃ 5分間、4℃で保存する。天根生化科技(北京)有限公司の汎用回収試薬キットでPCR目的断片を回収する。
PVLF1:5’−GATATCCAGATGACCCAGAGC−3’
PVLR1:5’−CTAAGCGGCCGCTTTGATCTCCACTTTGGTGC−3’
PVHF1:5’−CATACCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTG−3’
PVHR1:5’−GCTCTGGGTCATCTGGATATCGGATCCACCACC−3’
実施例1の方法でスクリーニングを行い、親和性の高いクローンを得てシークエンシングし、計6種の異なる一本鎖抗体配列を得、それぞれDFPD1−2、DFPD1−3、DFPD1−4、DFPD1−5、DFPD1−6、DFPD1−7と命名し、対応する軽鎖可変領域はDFPD1−L2、DFPD1−L3、DFPD1−L4、DFPD1−L5、DFPD1−L6、DFPD1−L7と命名され、それらが対応するアミノ酸配列については、SEQ NO.6、SEQ NO.7、SEQ NO.8、SEQ NO.9、SEQ NO.10およびSEQ NO.11をそれぞれ参照のこと。モノクローナルファージELISAでファージ−Absの相対的親和性を同定することについては、図3に示す通りである。
本実施例2で獲得したクローンについてモノクローナルファージのディスプレイおよび精製を行い、ファージ勾配希釈ELISA実験を行いファージ−Absの親和性を同定する。
<4.1 DFPD1−3とDFPD1−7の重鎖CDR1、2、3突然変異ライブラリの構築>
プライマPVHF2とPVHR2を設計し、合成された重鎖突然変異ライブラリ(SEQ NO.13)をテンプレートとし、重鎖ライブラリ遺伝子をPCR増幅し(図8);プライマPVLF2とPVLR2を設計し、DFPD1−3とDFPD1−7のプラスミドをテンプレートとして、軽鎖およびリンカ領域をそれぞれ増幅し(図9)、そのうち、左側はDFPD1−3であり、右側はDFPD1−7である。反応条件:95℃ 30s、1cycle;95℃ 15s、60℃ 10s、72℃ 30s、3cycles;95℃ 15s、72℃ 40s、25cycles;72℃ 5分間、4℃で保存する。天根生化科技(北京)有限公司の汎用回収試薬キットでPCR目的断片を回収する。
PVHF2:‘5−CATACCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTG−3’
PVHR2:‘5−TGAGGAGACGGTGACCAGGGTGCCCTG−3’
PVLF2:‘5−CTGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGTGGTGGTAGC−3’
PVLR2:‘5−CTAAGCGGCCGCTTTGATCTCCACTTTGGTGC−3’
上記構築した2種の抗体ライブラリについて、ファージディスプレイ、精製および沈澱を行う。続いて、該ライブラリから抗PD1の一本鎖抗体をパニングする。バクテリオファージ抗体ライブラリのバイオパニング方法は実施例1と同じである。抗PD−1の一本鎖抗体陽性クローンのスクリーニングの方法は実施例2と同じである。その結果、計5種の異なる抗PD−1抗体配列をスクリーニングしたことが分かり、それぞれDFPD1−9、DFPD1−10、DFPD1−11、DFPD1−12、DFPD1−13と命名した。そのうちDFPD1−9、DFPD1−11およびDFPD1−12の軽鎖可変領域配列はDFPD1−L3である一方、DFPD1−10とDFPD1−13の軽鎖可変領域配列はDFPD1−L7であり;DFPD1−9とDFPD1−10の重鎖可変領域配列はDFPD1−H2であり、DFPD1−11とDFPD1−13の重鎖可変領域はDFPD1−H3であり、DFPD1−12の重鎖可変領域はDFPD1−H4である。モノクローナルファージELISAでファージ−Absの相対的親和性を同定することについては、図12に示す通りである。
本実施例4.2で獲得したクローンについてモノクローナルファージのディスプレイおよび精製を行い、ファージ勾配希釈ELISA実験を行いファージ−Absの親和性を同定する方法は、実施例3の3.1と同じである。その結果、スクリーニングされた数株の異なるバクテリオファージ抗体はいずれもPD−1と結合することができ、親和性の差は大きくなく(図13)、そのうちDFPD1−9、DFPD1−10、DFPD1−11、DFPD1−12、DFPD1−13がやや良好であり、これらいくつかの一本鎖抗体を選択し、後の試験を行う。
<5.1 抗PD−1完全抗体の調製>
上記抗体の重鎖VHおよび軽鎖VK遺伝子を、重鎖および軽鎖定常領域遺伝子が組み込まれたベクタpTSE(図14)にそれぞれクローニングし、ヒト定常領域γ4(SEQ NO.14参照)とκ鎖(SEQ NO.15参照)のpTSEベクタ中にエンコードする(pTSEベクタの構造は図14に示す通りであり、調製プロセスについてはCN103525868Aの明細書3ページ段落[0019]を参照のこと)。HEK293E細胞を一過性トランスフェクトし、完全抗体の発現を行う。AKTAの器具、protein Aアフィニティカラムを使用して精製し、完全抗体タンパク質を獲得する。
トラップ法を採用して完全抗体の親和性を測定する。抗ヒトIgGをCM5チップの表面にカップリングし、DFPD1−9、DFPD1−10、DFPD1−11、DFPD1−12およびDFPD1−13をそれぞれ希釈して、約300RU前後の抗体が抗ヒトIgGにトラップされることを保証する。PD−1に一連の濃度勾配(1000nM、500nM、250nM、125nM、62.5nM、31.25nM、15.625nM、7.8125nM、3.9063nM、1.9531nM、0.9766nM)を設定し、固定相表面を流れ、抗体の親和性を測定する。その結果、スクリーニングされた抗体の親和性の差はあまり大きくないことが分かった(表3)。
pH9.6のカーボネート緩衝液でPD−1−Hisを被覆し、60ng/穴/100μlで、4℃で一晩被覆する。300μl/穴のPBSTで5回洗浄し、さらに1%のBSA−PBSを加え、37℃で2時間密閉する。異なる希釈度の完全抗体DFPD1−9、DFPD1−10、DFPD1−11、DFPD1−12およびDFPD1−13を加える。5種の完全抗体の最高濃度は16ug/mlであり、4倍に希釈して11の勾配を設け、最後の穴を陰性対照とし、すなわち、希釈液PBSのみを加え、37℃で1時間インキュベートする。300μl/穴のPBSTで5回洗浄し、1%のBSA−PBSで1:40000に希釈したAnti−Human Fc−HRP二次抗体をさらに加え、37℃で1時間インキュベートする。TMB発色試薬キットで発色させ、100μl/穴であり、室温で8分間発色させ、続いて、2M H2SO4で発色を止め、50μl/穴である。450nm/630nmで示度を読み取る。実験結果は図15に示す通りであり、すべての抗体がPD−1分子としっかりと結合することができる。
pH9.6のカーボネートでPDL1−Fcを被覆し、4℃で一晩被覆する。PBSTで5回洗浄し、1%のBSA−PBSで、37℃で2時間密閉する。4μg/mlのPD1−Hisで、DFPD1−9、DFPD1−10、DFPD1−11、DFPD1−12およびDFPD1−13というこれら5種の完全抗体をそれぞれ希釈し、完全抗体とPD−1のモル比は10:1から開始し、5倍に勾配希釈し、各々の試料に9つの希釈度を設け、37℃で1時間インキュベートする。PBSTで5回洗浄し、1%のBSA−PBSで希釈した、HRP標識されたマウス抗His抗体を加え、37℃で1時間インキュベートする。TMB発色試薬キットで発色させ、100μl/穴であり、室温で8分間発色させる。10%のH2SO4で発色を止め、50μl/穴である。450nm/630nmで示度を読み取る。その結果は図16に示す通りであり、DFPD1−9、DFPD1−10、DFPD1−11、DFPD1−12およびDFPD1−13はいずれもPD−1とPD−L1の結合を抑制することができる(結果については図16参照)。
まず、過剰発現したPD−1のCHO安定細胞株を構築し、それをPD1−CHOと命名する。ゼラチンで96穴のマイクロプレートを被覆した後、PD1−CHO細胞がパンクレアチン消化されてから中止し、遠心して再懸濁し、2×105細胞/mlまで希釈し、1穴につき100ulを96穴のマイクロプレートに行き渡らせ、計12穴×6列であり、すなわち2×104細胞/穴であり、5%のCO2で、37℃で一晩培養する。2日目に培地を捨て、350ulの予冷したPBSで1回洗浄し、2%の新たに調製したPFAで5分間固定し、PBSで2回洗浄する。
Claims (12)
- 軽鎖と重鎖を備え、
前記軽鎖の相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれLCDR1、LCDR2およびLCDR3で表され、
LCDR1は、RASQNIHSYLD、RASQNVSNWLD、RASQSIHNYLD、RASQDINNWLD RASQDVRTYLD、RASQGINSWLD、またはRASQSVSNYLDのいずれか一種を含み、
LCDR2は、EASTRAS、DASNRAT、NASTRAT、DASTLAT、GASTRATまたはDASTRATのいずれか一種を含み、
LCDR3は、QQALKLPIT、QQSRHIPLT、QQELHLPLT、QQNVNLPLT、QQDIDLPLT、QQSYRLPLTまたはQQNMQLPLTのいずれか一種を含む、
ことを特徴とする抗PD−1のモノクローナル抗体。 - 前記軽鎖の可変領域アミノ酸配列は、SEQ NO.5、SEQ NO.6、SEQ NO.7、SEQ NO.8、SEQ NO.9、SEQ NO.10、またはSEQ NO.11のいずれか一種を含むことを特徴とする請求項1に記載の抗PD−1のモノクローナル抗体。
- 軽鎖と重鎖を備え、
前記重鎖の相補性決定領域CDR1、CDR2およびCDR3はそれぞれHCDR1、HCDR2およびHCDR3で表され、
HCDR1は、SNNGMHまたはSNYGMHを含み、
HCDR2は、VIWYDGSKK、VIWYDSSRK、またはVIWYDSTKKのいずれか一種を含み、
HCDR3は、TAVYYCATNNDYWまたはTAVYYCATNTDYWを含む、
ことを特徴とする抗PD−1のモノクローナル抗体。 - 前記重鎖の可変領域アミノ酸配列は、SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、またはSEQ NO.4のいずれか一種を含むことを特徴とする請求項3に記載の抗PD−1のモノクローナル抗体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の軽鎖または重鎖を含むことを特徴とする抗体、ペプチド、またはタンパク質。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の軽鎖または重鎖をエンコードすることを特徴とするポリヌクレオチドの配列または組み合わせ。
- 請求項6に記載のポリヌクレオチドの配列または組み合わせを含むことを特徴とする組み換えDNA発現ベクタ。
- 原核細胞、酵母、または哺乳動物細胞を含む、請求項7に記載の前記組み換えDNA発現ベクタをトランスフェクトする宿主細胞。
- 前記抗体は完全ヒト由来抗体であり、
前記抗体の重鎖定常領域は、IgG1、IgG2、IgG3、またはIgG4を含み、
前記抗体の軽鎖定常領域はCκまたはCλを含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか一項に記載の抗PD−1のモノクローナル抗体。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の軽鎖または重鎖を用いる、完全抗体、一本鎖抗体、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体、または抗体薬物複合体。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の軽鎖または重鎖を含むことを特徴とするモノクローナル抗体、人工ベクタ、薬物または薬物組成物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の軽鎖または重鎖を含むことを特徴とする検査試薬または試薬キット。
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