JP2020505001A - 抗ｂｃｍａ重鎖のみ抗体 - Google Patents

Abstract

抗ＢＣＭＡ重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）が、そのような抗体を作製する方法、そのような抗体を含む薬学的組成物を含む組成物、及びＢＣＭＡの発現を特徴とするＢ細胞障害を治療するためのそれらの使用と共に開示されている。一態様では、本発明は、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する重鎖のみ抗体であって、（ａ）配列番号１〜４の配列のうちのいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲ１、及び／または（ｂ）配列番号５〜１８の配列のうちのいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲ２、及び／または（ｃ）配列番号１９と少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含む、重鎖のみ抗体に関する。【選択図】図５

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月２１日出願の米国仮特許出願第６２／４３７，５８８号の出願日の優先権を主張し、この出願の開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１８年１月１７日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、ＴＮＯ−０００２−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、４６，７６８バイトのサイズである。

本発明は抗ＢＣＭＡ重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）に関する。本発明はさらに、そのような抗体を作製する方法、そのような抗体を含む薬学的組成物を含む組成物、及びＢＣＭＡの発現を特徴とするＢ細胞障害を治療するためのそれらの使用に関する。

Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）
腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１７（ＴＮＦＲＳＦ１７）（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ０２２２３）としても知られるＢＣＭＡは、形質細胞及び形質芽細胞上に排他的に発現される細胞表面受容体である。ＢＣＭＡは腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーの２つのリガンド、ＡＰＲＩＬ（増殖誘導リガンド、ＴＮＦＳＦ１３、ＴＡＬＬ−２、及びＴＲＤＬ−１としても知られる、ＢＣＭＡに対する高親和性リガンド）及びＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）（ＢＬｙＳ、ＴＡＬＬ−１、ＴＨＡＮＫ、ｚＴＮＦ４、ＴＮＦＳＦ２０、及びＤ８Ｅｒｔｄ３８７ｅとしても知られる、ＢＣＭＡに対する低親和性リガンド）に対する受容体である。ＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦは、ＢＣＭＡに結合して形質細胞の生存を促進する増殖因子である。ＢＣＭＡはまた、ヒト多発性骨髄腫（ＭＭ）の悪性形質細胞上で高度に発現される。ＢＣＭＡに結合する抗体は、例えば、Ｇｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１０９３−１１０６、ＷＯ２００１２４８１１及びＷＯ２００１２４８１２に記載されている。ＴＡＣＩと交差反応する抗ＢＣＭＡ抗体は、ＷＯ２００２／０６６５１６に記載されている。ＢＣＭＡ及びＣＤ３に対する二重特異性抗体は、例えば、ＵＳ２０１３／０１５６７６９ Ａ１及びＵＳ２０１５／０３７６２８７ Ａ１に記載されている。抗ＢＣＭＡ抗体−ＭＭＡＥまたは−ＭＭＡＦコンジュゲートは、多発性骨髄腫細胞の殺傷を選択的に誘導することが報告されている（Ｔａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１４，１２３（２０）：３１２８−３８）。Ａｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２０１６，１２８（１３）：１６８８−７００は、臨床試験（＃ＮＣＴ０２２１５９６７）で、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞がヒト患者において多発性骨髄腫の寛解をもたらしたことを報告している。

重鎖のみ抗体
従来のＩｇＧ抗体では、重鎖と軽鎖との会合は、軽鎖定常領域と重鎖のＣＨ１定常ドメインとの間の疎水性相互作用に一部起因している。重鎖と軽鎖との間のその疎水性相互作用にも寄与する、重鎖フレームワーク２（ＦＲ２）及びフレームワーク４（ＦＲ４）領域に追加の残基がある。

しかしながら、ラクダ科の血清（ラクダ、ヒトコブラクダ、及びラマを含むラクダ亜目）は、対をなすＨ鎖のみからなる主要な種類の抗体（重鎖のみ抗体またはＨＣＡｂ）を含むことが知られている。ラクダ科（ヒトコブラクダ、フタコブラクダ、ラマ、グアナコ、アルパカ、及びヴィクーニャ）のＨＣＡｂは、単一可変ドメイン（ＶＨＨ）、ヒンジ領域、及び２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）からなる独特の構造を有し、それらは古典的抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインと非常に相同性が高い。これらのＨＣＡｂは、ゲノムに存在する定常領域の最初のドメイン（ＣＨ１）を欠くが、ｍＲＮＡプロセシングの間にスプライスアウトされる。ＣＨ１ドメインの欠損は、このドメインが軽鎖の定常ドメインの固定場所であるので、ＨＣＡｂ中に軽鎖が存在しないことを説明する。そのようなＨＣＡｂは、従来の抗体またはその断片からの３つのＣＤＲによって抗原結合特異性及び高親和性を付与するように自然に進化した（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２００１；Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７４：２７７−３０２、Ｒｅｖｅｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００５；Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ ５：１１１−１２４）。サメなどの軟骨魚は、軽鎖ポリペプチド鎖を欠き、完全に重鎖で構成されている、ＩｇＮＡＲと呼ばれる独自のタイプの免疫グロブリンも進化させてきた。ＩｇＮＡＲ分子は、分子工学により操作され単一重鎖ポリペプチドの可変ドメイン（ｖＮＡＲ）を生成することができる（Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３−３５５４（２００３）、Ｎｕｔｔａｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ５５，１８７−１９７（２００４）、Ｄｏｏｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４０，２５−３３（２００３））。

軽鎖を欠く重鎖のみ抗体が抗原に結合する能力は、１９６０年代に確立された（Ｊａｔｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５−４１９５）。軽鎖から物理的に分離された重鎖免疫グロブリンは、四量体抗体に対して８０％の抗原結合活性を保持していた。Ｓｉｔｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６０，７８１−７９０で、再配列されたマウスμ遺伝子からＣＨ１ドメインを除去すると、哺乳動物細胞培養において、軽鎖を欠く重鎖のみ抗体が産生されることが実証された。産生された抗体は、ＶＨ結合特異性及びエフェクター機能を保持していた。

高い特異性及び親和性を有する重鎖抗体は、免疫感作を通して種々の抗原に対して生成させることができ（ｖａｎ ｄｅｒ Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７−４６（１９９９））、ＶＨＨ部分は容易にクローン化され、酵母中で発現させることができる（Ｆｒｅｎｋｅｎ，Ｌ．Ｇ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１−２１（２０００））。それらの発現レベル、溶解性、及び安定性は、古典的なＦ（ａｂ）またはＦｖ断片のレベルよりも有意に高い（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４，５２１−５２６（１９９７））。

λ（ラムダ）軽（Ｌ）鎖遺伝子座、及び／または、λもしくはκ（カッパ（ｋａｐｐａ））Ｌ鎖遺伝子座が機能的にサイレンシングされているマウス、ならびにそのようなマウスによって産生される抗体は、米国特許第７，５４１，５１３号及び第８，３６７，８８８号に記載されている。マウス及びラットにおける重鎖のみ抗体の組換え産生は、例えば、ＷＯ２００６００８５４８、米国特許出願公開第２０１００１２２３５８号、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１０９（１），９３−１０１、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；２００６，２６（５）：３７７−９０、及びＺｏｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ；２０４（１３）：３２７１−３２８３に報告されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼの胚マイクロインジェクションによるノックアウトラットの生成は、Ｇｅｕｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５（５９３９）：４３３に記載されている。可溶性重鎖のみ抗体及びそのような抗体を産生する異種重鎖遺伝子座を含むトランスジェニックげっ歯類は、米国特許第８，８８３，１５０号及び第９，３６５，６５５号に記載されている。結合（標的化）ドメインとして単一ドメイン抗体を含むＣＡＲ−Ｔ構造は、例えば、Ｉｒｉ−Ｓｏｆｌａ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１７：２６３０−２６４１及びＪａｍｎａｎｉ ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，１８４０：３７８−３８６に記載されている。

国際公開第２００１／０２４８１１号 国際公開第２００１／０２４８１２号

Ｇｒａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：１０９３−１１０６

本発明は抗ＢＣＭＡ抗体に関する。

一態様では、本発明は、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する重鎖のみ抗体であって、
（ａ）配列番号１〜４の配列のうちのいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲ１、及び／または
（ｂ）配列番号５〜１８の配列のうちのいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）配列番号１９と少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含む、重鎖のみ抗体に関する。

一実施形態では、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列はヒトフレームワーク中に存在する。

別の実施形態では、抗ＢＣＭＡ重鎖のみ抗体は、ＣＨ１配列の非存在下で重鎖定常領域配列をさらに含む。

さらに別の実施形態では、重鎖のみ抗体は、
（ａ）配列番号１〜４からなる群から選択される配列、及び／または
（ｂ）配列番号５〜１８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び／または
（ｃ）配列番号１９のＣＤＲ３を含む。

さらなる実施形態では、抗ＢＣＭＡ重鎖のみ抗体は、
（ａ）配列番号１〜４からなる群から選択されるＣＤＲ１配列と、
（ｂ）配列番号５〜１８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列と、
（ｃ）配列番号１９のＣＤＲ３と、を含む。

なおさらなる実施形態において、重鎖のみ抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号２０〜５３の配列のうちのいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。

別の実施形態では、重鎖のみ抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号２０〜５３の配列からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む。

別の態様では、本発明は、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する重鎖のみ抗体であって、
（ａ）次式のＣＤＲ１配列
Ｇ Ｆ Ｔ Ｆ Ｘ１ Ｘ２ Ｙ Ａ
（式中、
Ｘ１が、ＳまたはＴであり、
Ｘ２が、Ｓ、Ｎ、またはＲである）、及び
（ｂ）次式のＣＤＲ２配列
Ｘ３ Ｘ４ Ｘ５ Ｘ６ Ｇ Ｘ７ Ｘ８ Ｘ９
（式中、
Ｘ３が、ＩまたはＬであり、
Ｘ４が、Ｓ、Ｔ、Ｉ、またはＶであり、
Ｘ５が、ＧまたはＥであり、
Ｘ６が、Ｓ、Ｇ、Ｎ、またはＤであり、
Ｘ７が、Ｇ、Ｄ、またはＡであり、
Ｘ８が、Ｓ、Ｔ、またはＮであり、
Ｘ９が、ＴまたはＳである）、及び
（ｃ）配列番号１９のＣＤＲ３を、
ヒトＶＨフレームワーク中に含む、重鎖可変領域を含む、重鎖のみ抗体に関する。

さらなる態様において、本発明は、ヒトＶＨフレームワーク中にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する重鎖のみ抗体であって、ＣＤＲ配列が、配列番号１〜１９からなる群から選択されるＣＤＲ配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列である、重鎖のみ抗体に関する。

一実施形態では、そのような抗体は、ヒトＶＨフレームワーク中にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲ配列は、配列番号１〜１９からなる群から選択される。

さらなる態様では、本発明は、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する重鎖のみ抗体であって、
（ａ）配列番号１のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、及び配列番号１９のＣＤＲ３、または
（ｂ）配列番号２のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、及び配列番号１９のＣＤＲ３を、
ヒトＶＨフレームワーク中に含む、重鎖可変領域を含む、重鎖のみ抗体に関する。

一実施形態では、重鎖のみ抗体は、二重特異性などの多重特異性である。

別の実施形態では、重鎖のみ抗体は、２つの異なるＢＣＭＡタンパク質に対する結合親和性を有する。

さらに別の実施形態では、重鎖のみ抗体は、同じＢＣＭＡタンパク質上の２つの異なるエピトープに対する結合親和性を有する。

さらなる実施形態では、重鎖のみ抗体は、エフェクター細胞に対する結合親和性を有する。

なおさらなる実施形態では、重鎖のみ抗体は、Ｔ細胞抗原に対する結合親和性を有する。

別の実施形態では、重鎖のみ抗体は、ＣＤ３に対する結合親和性を有する。

異なる態様では、上記の重鎖のみ抗体は、ＣＡＲ−Ｔ形式である。

さらなる態様では、本発明は、本明細書の抗ＢＣＭＡ重鎖のみ抗体を含む薬学的組成物に関する。

なおさらなる態様では、本発明は、ＢＣＭＡの発現を特徴とするＢ細胞障害の治療のための方法に関し、この方法は、そのような障害を有する対象に本明細書の抗ＢＣＭＡ重鎖のみ抗体、またはそのような抗体を含む薬学的組成物を投与することを含む。

様々な実施形態において、Ｂ細胞障害は、例えば、多発性骨髄腫または全身性エリテマトーデスであり得る。

さらなる態様では、本発明は、本明細書の抗ＢＣＭＡ重鎖のみ抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。

なおさらなる態様では、本発明は、本明細書の抗ＢＣＭＡ重鎖のみ抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターに関する。

別の態様では、本発明は、本明細書の抗ＢＣＭＡ重鎖のみ抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞、またはそのようなポリヌクレオチドを含むベクターに関する。

さらに別の態様では、本発明は、抗体の発現を許容する条件下で上記のように細胞を増殖させることと、細胞から抗体を単離することとを含む、本明細書中の抗体を産生する方法に関する。

さらなる態様では、本発明は、ＵｎｉＲａｔ動物をＢＣＭＡで免疫することと、ＢＣＭＡ結合重鎖配列を同定することとを含む、本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ重鎖のみ抗体を作製する方法に関する。

これら及びさらなる態様は、実施例を含め、本開示の残りの部分でさらに説明される。

本発明の３４個の重鎖のみ抗ＢＣＭＡ抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３アミノ酸配列を示す。 本発明の３４個の重鎖のみ抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖可変領域配列を示す。 本発明の３４個の重鎖のみ抗ＢＣＭＡ抗体の重鎖可変領域配列を示す。 ＨＥＫ ２９３細胞で発現した３４個の重鎖のみ抗ＢＣＭＡ抗体の抗体結合活性のヒートマップの概要。赤は強い結合を示し、青は弱いまたは負の結合結果を示す。細胞結合アッセイを３４個全ての抗体について実施し、Ｈ９２９細胞に結合することが示された。ＶＨ配列３０８６０７またはＶＨ配列３０８９１５のどちらかをコードする２つの抗体を、タグなしのヒトＢＣＭＡ ＥＣＤ断片、及びヒトＩｇＧ１とバキュロウイルスタンパク質抽出物（ＢＶＰ）とを含む２つの標的外タンパク質対照、及びＢＣＭＡ＋ＭＭ細胞系ＲＰＭＩ８２２６に対する結合について試験した。２つのＵｎｉＡｂもまた、組換えタンパク質ＥＬＩＳＡスタイルアッセイにおいてＡＰＲＩＬ（リガンド）／ＢＣＭＡ（受容体）の結合をブロックする能力について評価した。 免疫原及び他の標的タンパク質及び標的外タンパク質に対する血清結合活性。動物のサブセットからの単一の１：５００希釈のｄ３５血清を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにおいて一連のタンパク質に対する結合活性についてアッセイした。標的タンパク質には、ヒトＢＣＭＡ Ｆｃ領域（ｈｕＢＣＭＡ−Ｆｃ）、ヒトＦｃ配列に融合したカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＢＣＭＡ ＥＣＤ（ｃｙＢＣＭＡ）、及びＦｃ融合を持たない他の２つの源由来のｈｕＢＣＭＡ（大腸菌及び小麦胚芽）が含まれる。ヒト血清アルブミン及びヒトＩｇＧ１を用いて標的外反応性を評価した。 ＢＣＭＡ＋細胞株（ＮＣＩ−Ｈ９２９）に対する血清結合活性。力価は、ＰＥ結合抗ラットＩｇＧ２ａ抗体を用いたフローサイトメトリーによりＮＣＩ−Ｈ９２９細胞への血清結合を試験することにより評価した。有意な染色を示すＮＣＩ−Ｈ９２９細胞の割合を評価した。 ヒトＶＨ細胞外結合ドメインを含む代表的なＣＡＲ−Ｔ構築物。

本発明の実施は、他に示さない限り、当技術分野の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を使用する。そのような技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ）、“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）、“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ Ｂｅｒｎａｒｄ Ｖ．，１９８８）、“Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）、Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ ａｎｄ Ｈａｒｌｏｗ，Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ Ｎｏ．Ｉ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）、及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）のような文献に十分に説明されている。

値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、及びその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。それらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれ得、また、表示範囲内の任意の具体的な除外限度に従って、本明細書にも包含される。記載範囲がそれらの上限値及び下限値のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含される上限値及び下限値のいずれか一方または両方を除外する範囲も本発明に包含される。

特記しない限り、本明細書中の抗体残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。

以下の説明では、本発明の完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が述べられている。しかしながら、本発明がこれらの具体的な詳細のうちの１つ以上なしに実施され得ることは、当業者には明らかであろう。他の例では、本発明を曖昧にすることを避けるために、当業者に即知である特徴及び手順は説明されていない。

特許出願及び刊行物を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。

Ｉ．定義
「含む」とは、列挙された要素が組成物／方法／キットに必要とされることを意味するが、請求項の範囲内で組成物／方法／キットなどを形成するために他の要素が含まれ得る。

「〜から本質的になる」とは、記載された組成物または方法の範囲を、本発明の基本的及び新規な特徴（複数可）に実質的に影響を与えない特定の材料または工程に限定することを意味する。

「〜からなる」とは、任意の要素の組成、方法、またはキット、請求項で指定されていない工程、または成分の除外を意味する。

「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用されるとき、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団に含まれる個別の抗体は、微量で存在し得る可能性のある自然発生の突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位を対象としている。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。

「重鎖のみ抗体」、「重鎖抗体」及び「ＨＣＡｂ」という用語は互換的に使用され、最も広義では、従来の抗体の軽鎖を欠く抗体を指す。ホモ二量体ＨＣＡｂは軽鎖を欠き、したがってＶＬドメインを欠くので、抗原は１個の単一ドメイン、すなわち重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）によって認識される。この用語は具体的には、限定されないが、ＣＨ１ドメインの非存在下でのＶＨ抗原結合ドメイン及びＣＨ２及びＣＨ３定常ドメイン、そのような抗体の機能的（抗原結合）変異体、可溶性ＶＨ変異体、１個の可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲ）及び５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲ）のホモ二量体を含むＩｇ−ＮＡＲ、ならびにそれらの機能断片、ならびに可溶性単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含むホモ二量体抗体である。一実施形態では、重鎖のみ抗体は、フレームワーク１、ＣＤＲ１、フレームワーク２、ＣＤＲ２、フレームワーク３、ＣＤＲ３、及びフレームワーク４からなる可変領域抗原結合ドメインから構成される。一実施形態では、重鎖のみ抗体は、抗原結合ドメイン、少なくともヒンジ領域のうちの一部、ならびにＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成される。別の実施形態では、重鎖のみ抗体は、抗原結合ドメイン、少なくともヒンジ領域のうちの一部、及びＣＨ２ドメインから構成される。さらなる実施態様では、重鎖のみ抗体は、抗原結合ドメイン、少なくともヒンジ領域のうちの一部、及びＣＨ３ドメインから構成される。ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインが切断されている重鎖のみ抗体もまた本明細書に含まれる。さらなる実施形態では、重鎖は、抗原結合ドメイン、及び少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）ドメインから構成されるが、ヒンジ領域は含まない。重鎖のみ抗体は、２つの重鎖が他の方法では共有結合または非共有結合で互いにジスルフィド結合している二量体の形態であり得る。重鎖のみ抗体はＩｇＧサブクラスに属し得るが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥサブクラスなどの他のサブクラスに属する抗体もまた本明細書に含まれる。特定の実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、特にＩｇＧ１サブタイプである。一実施形態では、本明細書の重鎖のみ抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の結合（標的化）ドメインとして使用される。

抗体に関連して使用される「可変」という用語は、抗体可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で広範に異なるという事実を指し、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性において使用される。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等には分布していない。これは、軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメイン中の超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。本来の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは各々、主にβシート構成を採用する４つのＦＲを含み、それらは、３つの超可変領域により連結され、それら超可変領域はβシート構造を連結し、ある場合にはその一部を形成するループを形成する。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって近接近し一緒に保持されており、他方の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）への関与などの様々なエフェクター機能を呈する。

「超可変領域」という用語は、本明細書に使用されるとき、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、重鎖可変ドメイン中の残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））及び／または、「超可変ループ」由来のそれらの残基、重鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ ＬｅｓｋＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン残基である。

例示的なＣＤＲ名称が本明細書に示されるが、当業者は、Ｋａｂａｔ定義を含むＣＤＲの多数の定義が一般に使用されていることが理解され（“Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ａ ｇｅｒｍｌｉｎｅ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｂａｓｅｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｆｏｒ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；４７：６９４−７００参照）、これは配列の多様性に基づいており、最も一般的に使用されている。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は構造ループ領域の位置に基づく（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｎａｔｕｒｅ．１９８９；３４２：８７７−８８３）。重要な代替のＣＤＲ定義には、限定されないが、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，“Ｙｅｔ ａｎｏｔｈｅｒ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏｏｌ．”Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６５７−６７０、Ｏｆｒａｎ ｅｔ ａｌ．“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲｓ）ｒｅｖｅａｌｓ ｐｅｃｕｌｉａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ＣＤＲｓ ａｎｄ Ｂ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅｓ．”Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８１：６２３０−６２３５、Ａｌｍａｇｒｏ“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｈａｔ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｉｚｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．”Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００４；１７：１３２−１４３、及びＰａｄｌａｎｅｔ ａｌ．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”ＦａｓｅｂＪ．１９９５；９：１３３−１３９によって開示されたものが含まれ、それらのそれぞれは、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。

「単離」抗体とは、その自然環境の成分から、特定及び分離、及び／または回収されたものである。その自然環境の混入成分は、抗体の診断上または治療上の使用を妨げる材料であり、これらには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体は、次の程度まで精製される（１）ローリー法により判定した場合に抗体の９５重量％を上回り、最も好ましくは９９重量％を上回る、（２）スピニングカップシーケネータ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ ｃｕｐ ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使用してＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度、または（３）クーマシーブルー、もしくは好ましくは銀染色を用いて還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、均質になるまで。単離抗体には、抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内でインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製されるであろう。

本発明の抗体は多重特異性抗体を含む。多重特異性抗体は２つ以上の結合特異性を有する。「多重特異性」という用語は、具体的には、「二重特異性」及び「三重特異性」と、高次ポリエピトープ特異性などの高次独立の特異的結合親和性と、四価抗体及び抗体断片とを含む。「多重特異性」抗体は、具体的には、異なる結合実体の組み合わせを含む抗体と、同じ結合実体を複数含む抗体とを含む。「多重特異性抗体」、「多重特異性単鎖のみ抗体」、及び「多重特異性ＨＣＡｂ」という用語は、本明細書では最も広義で使用され、１つより多い結合特異性を有する全ての抗体を包含する。

「価」という用語は、本明細書で使用されるとき、抗体分子中の特定数の結合部位をいう。

「多価」抗体は２つ以上の結合部位を有する。したがって、「二価」、「三価」、及び「四価」という用語は、それぞれ２つの結合部位、３つの結合部位、及び４つの結合部位の存在を指す。したがって、本発明による二重特異性抗体は、少なくとも二価であり、及び三価、四価、またはそうでなければ多価であり得る。

多種多様な方法及びタンパク質の構造が知られており、二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三重特異性抗体などの調製に使用される。

「二重特異性三本鎖抗体様分子」または「ＴＣＡ」という用語は、本明細書では、３つのポリペプチドサブユニットを含む、本質的になる、またはそれらからなる抗体様分子を指すために使用され、そのうちの２つは、抗原結合領域及び少なくとも１つのＣＨドメインを含む、モノクローナル抗体の１つの重鎖及び１つの軽鎖、もしくはそのような抗体鎖の機能的抗原結合断片を含む、本質的になる、またはそれらからなる。この重鎖／軽鎖対は第１の抗原に対する結合特異性を有する。第３のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインの非存在下で、ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分を含む重鎖のみ抗体、ならびに第２の抗原のエピトープまたは第１の抗原の異なるエピトープに結合する抗原結合ドメインを含む、本質的になる、またはそれらからなり、結合ドメインは抗体重鎖または軽鎖の可変領域に由来するか、またはそれと配列同一性を有する。そのような可変領域の一部は、Ｖ_Ｈ及び／またはＶ_Ｌ遺伝子セグメント、Ｄ及びＪ_Ｈ遺伝子セグメント、またはＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされ得る。可変領域は、再構成されたＶ_ＨＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＬＤＪ_Ｈ、Ｖ_ＨＪ_Ｌ、またはＶ_ＬＪ_Ｌ遺伝子セグメントによってコードされ得る。ＴＣＡタンパク質は、上に定義したような重鎖のみ抗体を利用する。

「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに対する所望の結合特異性（例えば、モノクローナル抗体または他のリガンドの抗原結合領域）を融合する人工受容体を指すために本明細書では最も広義で使用される。典型的には、受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作製するためにモノクローナル抗体の特異性をＴ細胞上に融合するために使用される。（Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，２０１５；１０８（７）：ｄｖｊ４３９、及びＪａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１６；１３：３７０−３８３．）ヒトＶＨ細胞外結合ドメインを含む代表的なＣＡＲ−Ｔ構築物を図６に示す。

「ヒトイデオタイプ」とは、免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖可変領域においてヒト抗体上に存在するポリペプチド配列エピトープを意味する。「ヒトイデオタイプ」という用語は、本明細書で使用されるとき、ヒト抗体の自然発生配列、ならびに自然発生ヒト抗体に見られるポリペプチドと実質的に同一の合成配列の両方を含む。「実質的に」とは、アミノ酸配列同一性の程度が少なくとも約８５％〜９５％であることを意味する。好ましくは、アミノ酸配列同一性の程度は９０％超、より好ましくは９５％超である。

「キメラ抗体」または「キメラ免疫グロブリン」とは、少なくとも２つの異なるＩｇ遺伝子座からのアミノ酸配列を含む免疫グロブリン分子、例えばヒトＩｇ遺伝子座によってコードされる部分とラットＩｇ遺伝子座によってコードされる部分とを含むトランスジェニック抗体を意味する。キメラ抗体は、非ヒトＦｃ領域または人工Ｆｃ領域を有するトランスジェニック抗体、及びヒトイデオタイプを含む。そのような免疫グロブリンは、そのようなキメラ抗体を産生するように操作された本発明の動物から単離することができる。

抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に帰属する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞毒性、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）などの下方制御が含まれる。

「抗体依存性細胞媒介性細胞毒性」及び「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方で、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。対象となる分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または同第５，８２１，３３７号に記載されるようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、または加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるもの等の動物モデルで評価され得る。

「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、及びエフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを介するヒト白血球の例としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞毒性Ｔ細胞、及び好中球が含まれ、ＰＢＭＣ及びＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、本明細書に記載されるように、その天然源から、例えば、血液またはＰＢＭＣから単離され得る。

「補体依存性細胞毒性」または「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解させる分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分の、同種抗原と複合した分子（例えば、ポリペプチド（例えば、抗体））への結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されるＣＤＣアッセイが実施され得る。

「親和性」とは、分子（例えば、抗体）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一結合部位の間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別途指示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）で表され得る。親和性は、当技術分野において公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は、一般に、抗原に結合するのが遅く、容易に解離する傾向があり、一方、高親和性抗体は、一般に、抗原に結合するのがより速く、結合したままである傾向がある。

本明細書中で使用されるとき、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」とは、速度論様式で、Ｏｃｔｅｔ ＱＫ３８４機器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法によって決定される解離定数を指す。例えば、抗マウスＦｃセンサーにマウス−Ｆｃ融合抗原を負荷し、次いで抗体含有ウェルに浸して濃度依存的会合速度（ｋｏｎ）を測定する。抗体解離速度（ｋｏｆｆ）は最終工程で測定され、センサーは緩衝液のみを含有するウェルに浸される。Ｋｄは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比である。（さらなる詳細については、Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎ，Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｍｂ Ｃｈｅｍ Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎ，１２（８），７９１−８００，２００９を参照）。

「エピトープ」は、単一の抗体分子が結合する抗原分子の表面上の部位である。一般的には、抗原はいくつかのまたは多くの異なるエピトープを有し、そして多くの異なる抗体と反応する。この用語は、具体的には、線状エピトープ及び立体配座エピトープを含む。

「エピトープマッピング」は、それらの標的抗原上の抗体の結合部位またはエピトープを同定する工程である。抗体エピトープは線状エピトープまたは立体配座エピトープであり得る。線状エピトープは、タンパク質中のアミノ酸の連続配列によって形成される。立体配座エピトープは、タンパク質配列において不連続であるが、タンパク質のその三次元構造への折り畳みの際に結合するアミノ酸から形成される。

「ポリエピトープ特異性」とは、同じまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。

２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合、抗体は参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つのエピトープが同一または立体的に重複するエピトープに結合するかを決定するために、最も広く使用されている迅速な方法は競合アッセイであり、それは標識抗原または標識抗体を使用してあらゆる形式で構成できる。通常、抗原は９６ウェルプレートに固定化され、未標識抗体が標識抗体の結合を妨げる能力は放射性または酵素標識を用いて測定される。

「治療」、「治療すること」などの用語は、本明細書では一般に、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。その効果は、その疾患もしくは症状を、完全にもしくは部分的に予防するという観点において予防的であり得、及び／または疾患及び／またはその疾患に起因する副作用の部分的もしくは完全な治癒という観点において治療的であり得る。「治療」は、本明細書で使用されるとき、哺乳動物における疾患の任意の治療を包含し、（ａ）その疾患にかかりやすいが、まだそれを有すると診断されていない対象における発病を予防すること、（ｂ）その疾患を阻害すること、すなわち、その発現を阻止すること、または（ｃ）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患の退行を引き起こすことを含む。治療薬は、疾患または傷害の発症前、発症中または発症後に投与することができる。進行中の病気の治療、治療が患者の望ましくない臨床症状を安定化または軽減する場合、特に興味深い。そのような治療は、罹患組織における機能の完全な喪失の前に行われることが望ましい。本療法は、疾患の兆候段階の間、いくつかの場合には疾患の兆候段階の後に投与することができ得る。

「治療有効量」は、対象に治療上の利益を与えるのに必要な活性剤の量を意味する。例えば、「治療有効量」は、病理学的症状を改善する、またはそうでなければ改善を引き起こす、疾患の進行、または疾患に関連する生理学的状態、もしくは抵抗性を改善することを誘発する量である。

「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、治療のために評価されている及び／または治療されている哺乳動物を指す。一実施形態では、哺乳動物はヒトである。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、がんを有する個体、自己免疫疾患を有する個体、病原体感染を有する個体などを含むがこれらに限定されない。対象はヒトであり得るが、他の哺乳動物、特にヒトの疾患の実験室モデルとして有用なそれらの哺乳動物、例えばマウス、ラットなども含み得る。

ＩＩ．詳細な説明
抗ＢＣＭＡ抗体
本発明は、ヒトＢＣＭＡに結合する密接に関連した重鎖のみ抗体のファミリーを提供する。このファミリーの抗体は、本明細書に定義され、図１に示される一組のＣＤＲ配列を含み、図２に示される配列番号２０〜５３に提供される重鎖可変領域（ＶＨ）配列によって例示される。抗体のファミリーは、臨床的治療薬（複数可）としての有用性に寄与する多くの利点を提供する。抗体は、所望の結合親和性を有する特定の配列の選択を可能にする、ある範囲の結合親和性を有するメンバーを含む。

適切な抗体は、開発及び治療的または他の使用のために本明細書に提供されるものから選択され得、二重特異性抗体もしくは三重特異性抗体、またはＣＡＲ−Ｔ構造の一部としての使用を含むがこれらに限定されない。候補タンパク質に対する親和性の決定は、Ｂｉａｃｏｒｅ測定などの当技術分野において公知の方法を使用して実施することができる。抗体ファミリーのメンバーは、約１０^−６〜約１０^−１１までのＫｄで、ＢＣＭＡに対する親和性を有し得、限定されることなく、約１０^−６〜約１０^−１０まで、約１０^−６〜約１０^−９まで、約１０^−６〜約１０^−８まで、約１０^−８〜約１０^−１１まで、約１０^−８〜約１０^−１０まで、約１０^−８〜約１０^−９まで、約１０^−９〜約１０^−１１まで、約１０^−９〜約１０^−１０まで、またはそれらの範囲内の任意の値を含む。親和性の選択は、調節のための生物学的評価、例えば、阻害、インビトロアッセイ、前臨床モデル、及び臨床試験を含むＢＣＭＡ生物学的活性、ならびに潜在的な毒性の評価によって確認することができ得る。

本明細書における抗体ファミリーのメンバーは、カニクイザルのＢＣＭＡタンパク質と交差反応性ではないが、所望ならば交差反応性を提供するように操作することができる。

本明細書中のＢＣＭＡ特異的抗体のファミリーは、ヒトＶＨフレームワーク中にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含むＶＨドメインを含む。ＣＤＲ配列は、一例として、配列番号２０〜５３に記載の提供された例示的可変領域配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３それぞれについて、アミノ酸残基２６〜３５、５３〜５９、及び９８〜１１７の前後の領域内に位置し得る。一般に配列の順序は同じままであるが、異なるフレームワーク配列が選択される場合、ＣＤＲ配列は異なる位置であり得ることが当業者には理解されるであろう。

本発明の抗体は、配列番号１９のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有する。本発明の抗ＢＣＭＡ抗体のＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列は、以下の構造式によって包含され得、ここでＸは可変アミノ酸を示し、それは以下に示されるような特定のアミノ酸であり得る。
ＣＤＲ１
Ｇ Ｆ Ｔ Ｆ Ｘ１ Ｘ２ Ｙ Ａ
（式中、
Ｘ１が、ＳまたはＴであり、
Ｘ２が、Ｓ、Ｎ、またはＲである）、
ＣＤＲ２
Ｘ３ Ｘ４ Ｘ５ Ｘ６ Ｇ Ｘ７ Ｘ８ Ｘ９
（式中、
Ｘ３が、ＩまたはＬであり、
Ｘ４が、Ｓ、Ｔ、Ｉ、またはＶであり、
Ｘ５が、ＧまたはＥであり、
Ｘ６が、Ｓ、Ｇ、Ｎ、またはＤであり、
Ｘ７が、Ｇ、Ｄ、またはＡであり、
Ｘ８が、Ｓ、Ｔ、またはＮであり、
Ｘ９が、ＴまたはＳである）。

代表的なＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を図１に示す。

いくつかの実施形態では、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号１、２、３、または４のＣＤＲ１配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤＲ１配列は配列番号１または配列番号２である。

いくつかの他の実施形態では、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号５〜１８のうちのいずれか１つのＣＤＲ２配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤＲ２配列は配列番号５である。

別の実施形態では、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号１のＣＤＲ１配列、配列番号５のＣＤＲ２配列、及び配列番号１９のＣＤＲ３配列を含む。

さらなる実施態様では、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号５のＣＤＲ２配列、及び配列番号１９のＣＤＲ３配列を含む。

さらなる実施形態では、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号２０〜５３（図２）の重鎖アミノ酸配列のうちのいずれかを含む。

いくつかの実施形態では、本発明のＣＤＲ配列は、配列番号１〜１９のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３配列、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列のセットに対する１、２、３またはそれ以上のアミノ酸置換を含む（図１）。いくつかの実施形態では、該アミノ酸置換（複数可）は、上に提供された式に対して、ＣＤＲ１のアミノ酸位置５もしくは６のうちの１つ以上、及び／またはＣＤＲ２のアミノ酸位置１〜４もしくは６〜８のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、本明細書の抗ＢＣＭＡ抗体のＣＤＲ配列は、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または配列番号１〜１９のうちのいずれか１つの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３配列、もしくはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列のセットに対して少なくとも９９％の同一性を備える配列を有する（図１）。いくつかの他の実施形態では、本明細書の一本鎖のみ抗ＢＣＭＡ抗体は、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または図２に示す重鎖可変領域配列に対して少なくとも９９％の同一性を備える重鎖可変領域配列を含むであろう。

いくつかの実施形態では、二重特異性抗体または多重特異性抗体が提供され、それらは、三鎖二重特異性抗体を含むが、これらに限定されず、本明細書で論じられる構成のいずれかを有し得る。二重特異性抗体は、ＢＣＭＡ以外のタンパク質に特異的な抗体の少なくとも重鎖可変領域を含む。

本発明のタンパク質が二重特異性抗体である場合、一方の結合部分はヒトＢＣＭＡに特異的であり、他方のアームは標的細胞、腫瘍関連抗原、標的抗原、例えばインテグリンなど、病原体抗原、チェックポイントタンパク質などに特異的であり得る。標的細胞は具体的には、血液腫瘍、例えばＢ細胞腫瘍などのがん細胞を含む。

一本鎖ポリペプチド、二本鎖ポリペプチド、三本鎖ポリペプチド、四本鎖ポリペプチド、及びそれら多数を含むがこれらに限定されず、様々な形式の二重特異性抗体が本発明の範囲内である。本明細書における二重特異性抗体は、形質細胞（ＰＣ）及び多発性骨髄腫（ＭＭ）上に選択的に発現されるＢＣＭＡに結合するＴ細胞二重特異性抗体、及びＣＤ３（抗ＢＣＭＡ対抗ＣＤ３抗体）を具体的に含む。そのような抗体は、ＢＣＭＡを運搬する細胞の強力なＴ細胞媒介殺傷を誘導する。

薬学的組成物
本発明の別の態様は、適切な薬学的に許容される担体と混合した本発明の１つ以上の抗体を含む薬学的組成物を提供することである。本明細書で使用される薬学的に許容される担体は、限定されないが、アジュバント、固体担体、水、緩衝剤、または治療成分を保持するために当技術分野で使用される他の担体、またはそれらの組み合わせを例示する。

本発明に従って使用される抗体の薬学的組成物は、所望の純度を有するタンパク質を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態などの、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより貯蔵用に調製される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）を参照）。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、レシピエントに対し、用いられる投与量及び濃度で無毒であり、緩衝液（リン酸、クエン酸、及び他の有機酸など）、アスコルビン酸、及びメチオニンを含む酸化防止剤、保存剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルもしくはプロピルパラベンなど）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールなど）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなど）、単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む）、キレート剤（ＥＤＴＡなど）、糖類（スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど）、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）、及び／または非イオン性界面活性剤（ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）を含む。

抗ＢＣＭＡ抗体製剤は、例えば、米国特許第９，０３４，３２４号に開示されている。同様の製剤を本発明のタンパク質に使用することができる。

使用方法
本明細書の薬学的組成物は、ＢＣＭＡの発現を特徴とするＢ細胞関連障害を治療するために使用することができる。

そのようなＢ細胞関連障害には、Ｂ細胞、及び形質細胞の悪性腫瘍、ならびに自己免疫障害が含まれ、形質細胞腫、ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、非切断型小細胞リンパ腫、風土性バーキットリンパ腫、散発性バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、結節外粘膜関連リンパ組織リンパ腫、結節性単球様Ｂ細胞リンパ腫、脾リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、びまん性混合細胞型リンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、原発性縦隔Ｂ細胞リンパ腫、肺Ｂ細胞血管中心性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、不確定な悪性度のＢ細胞増殖、リンパ腫様肉芽腫症、移植後リンパ増殖性疾患、免疫調節障害、関節リウマチ、重症筋無力症、特発性血小板減少症紫斑病、抗リン脂質抗体症候群、シャーガス病、グレーブス病、ウェゲナー肉芽腫症、結節性多発動脈炎、シェーグレン症候群、尋常性天疱瘡、強皮症、多発性硬化症、抗リン脂質抗体症候群、ＡＮＣＡ関連血管炎、グッドパスチャー病、川崎病、自己免疫性溶血性貧血、及び急速に進行性の糸球体腎炎、重鎖病、原発性もしくは免疫細胞関連アミロイドーシス、またはモノクローナルガンマ症を含むが、限定されない。

ＢＣＭＡの発現を特徴とする形質細胞障害には多発性骨髄腫（ＭＭ）が含まれる。ＭＭは、骨髄区画における異常な形質細胞のモノクローナル増殖及び蓄積を特徴とするＢ細胞悪性腫瘍である。ＭＭに対する現在の治療は、しばしば寛解をもたらすが、ほぼ全ての患者は最終的に再発し死亡する。同種造血幹細胞移植の背景における骨髄腫細胞の免疫介在性除去の実質的な証拠があるが、しかしながら、このアプローチの毒性は高く、そして治癒する患者はほとんどいない。いくつかのモノクローナル抗体は、前臨床試験及び初期の臨床試験においてＭＭを治療するための見込みを示しているが、ＭＭに対する任意のモノクローナル抗体療法の一貫した臨床効果は決定的には証明されていない。そのため、ＭＭの免疫療法を含む新しい療法が非常に必要とされている（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｌｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２０１３，１９（８）：２０４８−２０６０を参照）。

形質細胞を含む、すなわちＢＣＭＡを発現する別のＢ細胞障害は、狼瘡としても知られる全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。ＳＬＥは全身性の自己免疫疾患であり、身体のあらゆる部分に影響を及ぼし、免疫系が身体自身の細胞及び組織を攻撃し、慢性的な炎症及び組織の損傷を引き起こす。それは、抗体−免疫複合体が、凝結してさらなる免疫応答を引き起こす、タイプＩＩＩ過敏反応である（Ｉｎａｋｉ ＆ Ｌｅｅ， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ ２０１０；６：３２６−３３７）。

本発明の抗体は、ＭＭ、ＳＬＥ、及び上記に列挙したものなどのＢＣＭＡの発現を特徴とする他のＢ細胞障害を治療するための治療薬を開発するために使用することができる。

一実施形態では、本明細書の抗体は、重鎖のみ抗ＢＣＭＡ抗体−ＣＡＲ構造、すなわち、重鎖のみ抗ＢＣＭＡ抗体−ＣＡＲ形質導入Ｔ細胞構造の形態であり得る。

疾患の治療のための本発明の組成物の有効量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び処置が予防的なものであるか治療的なものであるかを含む多くの異なる要因によって変化する。通常、患者はヒトであるが、ヒト以外の哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマなどのコンパニオン動物、ウサギ、マウス、ラットなどの実験動物なども治療することができる。治療投与量は、安全性及び有効性を最適化するために滴定されることが可能である。

投与量レベルは、当業者によって容易に決定されることが可能であり、必要に応じて、例えば、治療への対象の応答を変更するために必要とされる場合、変更されることが可能である。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることが可能である活性成分の量は、治療する宿主及び特定の投与様式に応じて異なる。一般的に単位剤形は、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの間の活性成分を含む。

いくつかの実施形態では、薬剤の治療投与量は、宿主の体重の、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、及びより通常では０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。例えば、投与量は、１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な治療計画は、２週間に１回または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を伴う。本発明の治療実体は、通常、複数の機会に投与される。単回投与の際の間隔は、毎週、毎月または毎年であり得る。また間隔は、患者の治療実体の血中レベルを測定することによって指定される場合、不定期でもあり得る。あるいは、本発明の治療実体は、徐放性製剤として投与されることが可能であり、その場合、あまり頻繁な投与を必要としない。投与量及び頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期によって変化する。

典型的に、組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製され、また、注射前に液体ビヒクル中に溶解または懸濁するのに好適な固体形態も調製することができる。調製物はまた、上記のように、増強されたアジュバント効果のために、リポソームもしくはポリラクチド、ポリグリコリド、またはコポリマーなどのマイクロ粒子中に乳化またはカプセル化され得る。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７，１９９０及びＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ２８：９７−１１９，１９９７。本発明の薬剤は、活性成分の持続放出またはパルス放出を可能にするような方法で処方することができる蓄積注射またはインプラント調製物の形態で投与することができ得る。薬学的組成物は、一般に、無菌であり、実質的に等張性であり、及び米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠して処方される。

本明細書中に記載される抗体及び抗体構造の毒性は、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、ＬＤ_５０（集団の５０％に致命的な用量）またはＬＤ_１００（集団の１００％に致命的な用量）を決定することによって、決定され得る。毒性と治療効果との間の用量比が治療指数である。それらの細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するのに毒性のない投与量範囲を処方するのに使用することができる。本明細書に記載の抗体の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどまたは全くない有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、採用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。正確な処方、投与経路、及び投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る。

投与用組成物は、一般に、薬学的に許容される担体、好ましくは水性担体に溶解した抗体または他の削摩剤を含むであろう。様々な水性担体、例えば緩衝食塩水などを使用することができる。それらの溶液は無菌であり、及び一般的に望ましくない物質を含まない。それらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌することができ得る。本発明の組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされるような製薬学的に許容可能な補助物質（ｐＨ調整剤、緩衝剤及び毒性調整剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム及び乳酸ナトリウムなど）を含むことができ得る。これらの製剤中の活性剤の濃度は広く変動し得、選択される特定の投与様式及び患者の必要性に従って主に体液量、粘度、体重などに基づいて選択されるであろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ ｅｄ．，１９８０）及びＧｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｌｍａｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９６））。

本発明の活性剤及びその製剤、ならびに使用説明書を含むキットも本発明の範囲内である。キットはさらに少なくとも１つの追加の試薬、例えば化学療法薬などを含むことができる。キットは、典型的に、キットの内容物の意図される使用を示すラベルを含む。ラベルという用語には、キット上にもしくはキットと共に供給される、または他の方法でキットに付随する、あらゆる書面または記録物が含まれる。

ここで十分に説明されている本発明は、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、様々な変更及び修正を行うことができることが当業者に明らかとなるであろう。

実施例１
重鎖のみ抗体を発現する遺伝子操作ラット
「ヒト−ラット」のＩｇＨ遺伝子座は、いくつかの部分に分けて構築され、組み立てられた。これは、ヒトＪ_Ｈの下流のラットＣ領域遺伝子の改変及び結合、ヒトＶ_Ｈ６−Ｄ断片領域の上流付加が含まれた。ヒトＶ_Ｈ遺伝子の別々の集団を有する２つのＢＡＣ［ＢＡＣ６及びＢＡＣ３］は、ヒトＶ_Ｈ６、全てのＤ、全てのＪ_Ｈ、及び修飾されたラットＣγ２ａ／１／２ｂ（ΔＣ_Ｈ１）を含む、組み立てられ修飾された領域をコードするＧｅｏｒｇと呼ばれるＢＡＣを同時注入した。

再配置されていない立体配置の人工重鎖免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックラットを作製した。ＩｇＧ２ａ（ΔＣ_Ｈ１）、ｉｇＧ１（ΔＣ_Ｈ１）、ＩｇＧ２ｂ（ΔＣ_Ｈ１）遺伝子はＣ_Ｈ１断片を欠いていた。定常領域遺伝子ＩｇＥ、ＩｇＡ、及び３’エンハンサーが、Ｇｅｏｒｇ ＢＡＣに含まれた。トランスジェニックラットのＲＴ−ＰＣＲ及び血清分析（ＥＬＩＳＡ）は、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座の生産的な再配列及び血清中の様々なアイソタイプの重鎖のみ抗体の発現を明らかにした。トランスジェニックラットを、米国特許公開第２００９／００９８１３４ Ａ１号に以前に記載された変異内因性重鎖及び軽鎖遺伝子座を有するラットと交雑させた。そのような動物の分析は、ラット免疫グロブリン重鎖及び軽鎖発現の不活性化、ならびにヒトＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子によってコードされる可変領域を有する重鎖抗体の高レベル発現を示した。トランスジェニックラットの免疫化は、抗原特異的重鎖抗体の高力価血清応答の生成をもたらした。ヒトＶＤＪ領域を有する重鎖抗体を発現するそれらのトランスジェニックラットは、ＵｎｉＲａｔと呼ばれた。

実施例２
免疫
ＢＣＭＡの組換え細胞外ドメインによる免疫。
１２匹のＵｎｉＲａｔ動物（６匹のＨＣ２７、６匹のＨＣ２８）を組換えヒトＢＣＭＡタンパク質で免疫した。Ｔｉｔｅｒｍａｘ／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントを用いて標準的なプロトコルに従って動物を免疫した。ＢＣＭＡの組換え細胞外ドメインは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入し、滅菌生理食塩水で希釈し、そしてアジュバントと組み合わせた。免疫原をＴｉｔｅｒｍａｘ及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントと組み合わせた。Ｔｉｔｅｒｍａｘ中の免疫原による初回免疫（プライミング）を左右の脚に投与した。その後の追加免疫をＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌの存在下で行い、採取３日前に追加免疫をＰＢＳ中の免疫原で行った。血清は、血清力価を決定するために最終採血時にラットから採取した。

血清力価結果
血清力価概要情報を、図４及び５に示す。動物の半数について、単一の１：５００血清力価希釈に対する結合活性は、真核細胞で産生されたｈｕＢＣＭＡ＋Ｆｃタンパク質及びｃｙｎｏＢＣＭＡ＋Ｆｃタンパク質、ならびにそれぞれの大腸菌及び小麦胚芽由来の２つのヒトＢＣＭＡタンパク質に対してＥＬＩＳＡにより試験した。さらに、血清試料を、２つの標的外タンパク質、ＨＳＡ及びヒトＩｇＧ１に対して試験した。さらに、１２匹全ての動物からの血清をＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＢＣＭＡ＋、ラムダ−）への結合についてアッセイした。

この群の動物の中で、我々は、ＮＣＩ−Ｈ９２９細胞（ＢＣＭＡ＋、ラムダ−）に対する血清反応性レベルの有意な広がりを観察した。それらの結果の関連性は、動物のサブセットについて作成されたＥＬＩＳＡ結合データによって確認された。いくつかの一般的なＦｃ特異的反応性が多数の動物について観察されているが、最も有望と思われるものもまた、代替源（大腸菌、小麦胚芽）由来のタグ付けされていないヒトＢＣＭＡに対するアッセイにおいて高い見かけの力価を示し、有意なＢＣＭＡ ＥＣＤ特異的結合活性を示す。ｃｙｎｏＢＣＭＡ＋Ｆｃタンパク質への結合についての陽性シグナルは、ヒト免疫原にも含まれる分子のＥＣＤまたはＦｃ部分のいずれかへの結合を反映し得る。両方のアッセイ種類では、免疫化前にそれらの動物から採取した血清の分析は、免疫原または標的外タンパク質に対する反応性を示さなかった。

実施例３
遺伝子構築、発現及び結合アッセイ
リンパ節細胞において高度に発現される重鎖のみ抗体をコードする３０９個のｃＤＮＡを遺伝子構築のために選択し、発現ベクターにクローニングした。続いて、それらの３０９個の重鎖配列を、ＵｎｉＡｂ重鎖のみ抗体（ＣＨ１欠失、軽鎖なし）としてＨＥＫ細胞に発現させた。試験した３４個のＶＨ領域のアミノ酸配列を含む結合結果は、ＢＣＭＡ＿ＦＡＭ２＿ＤＡＴＡに見出すことができる。

２つの抗体の上清を、標準的なＥＬＩＳＡアッセイにおいてヒトＢＣＭＡへの結合について試験した。組換えＢＣＭＡタンパク質への結合は、Ａｂｃａｍ（ａｂ５００８９）から入手したヒトＢＣＭＡ ＥＣＤを用いてＥＬＩＳＡにより測定した。ＢＣＭＡ ＥＣＤタンパク質を２μｇ／ｍＬの濃度で使用し、５０ｎｇ／ｍＬのＵｎｉＡｂを捕捉した。ＵｎｉＡｂの結合は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ ＨＲＰ共役抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ３１４１３）を用いて検出した。全ての抗体を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０及び１％粉乳を含む１×ＴＢＳで希釈した。

バキュロウイルスタンパク質抽出物（ＢＶＰ）への標的外結合は、希釈剤として１×ＰＢＳ及び１％粉乳を使用するように変更して、上記のようにＥＬＩＳＡによって実施した。ＢＶＰ抽出物はＩＮＳＥＲＭ（Ｎａｎｔｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）から入手した。バキュロウイルス粒子への結合（我々のアッセイにおけるバックグラウンドの＞５倍）は、ヒト及びサルにおける抗体の半減期の減少と相関し、ヒト組織との低親和性相互作用を示すと考えられる（Ｈｏｔｚｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ ４：６，ｐ７５３−７６０，２０１２）。ヒトＩｇＧ１の標的外結合を、ヒトＩｇＧ１ｋａｐｐａを捕捉するためのＵｎｉＡｂを用いたＥＬＩＳＡ、続いてヤギ抗ヒトｋａｐｐａＨＲＰ共役抗体によるｋａｐｐａ鎖の検出によって評価した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０６０−０５）。

全抗体の上清もまた、ＲＰＭＩ−８２２６細胞（ＢＣＭＡ＋、ラムダ＋）及びＨ９２９細胞（ＢＣＭＡ＋、ラムダ−）への結合についてフローサイトメトリーによって試験した。試料をＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製のＧｕａｖａ ｅａｓｙＣｙｔｅ ８ＨＴ装置を用いてフローサイトメトリーにより測定し、ｇｕａｖａＳｏｆｔを用いて分析した。結合抗体をＰＥに結合したヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆ（ａｂ’）_２で検出した（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２０４２−０９）。全ての抗体を、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈した。陽性染色は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照による染色と比較することによって決定した。ＮＣＩ−Ｈ９２９及びＲＰＭＩ−８２２６細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した、ヒトＢＣＭＡを発現するヒト多発性骨髄腫株である。

２つのＵｎｉＡｂもまた、組換えタンパク質ＥＬＩＳＡスタイルアッセイにおいてＡＰＲＩＬ（リガンド）／ＢＣＭＡ（受容体）の結合を遮断する能力について評価した。ＢＣＭＡとＡＰＲＩＬとの間の受容体／リガンド相互作用の遮断を評価するために、組換えヒトＢＣＭＡ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ １０６２０−Ｈ０３Ｈ）をプレート上に直接コーティングし、続いて各ＵｎｉＡｂの希釈系列と共にインキュベートした。ＨＡタグ付き組換えＡＰＲＩＬタンパク質（ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ ５８６０−ＡＰ−０１０）をＢＣＭＡ／抗体複合体と共にインキュベートし、ＨＲＰに結合したニワトリ抗ＨＡ抗体（Ａｂｃａｍ ａｂ１１９０）を用いてＢＣＭＡに対するＡＰＲＩＬの結合を検出した。ＲｎＤシステム抗ＢＣＭＡ抗体（ＡＦ１９３）をＢＣＭＡ／ＡＰＲＩＬ遮断の陽性対照として用いた。

試験したＵｎｉＡｂのいずれも陽性結合を示さなかったが、そのままのバキュロウイルス粒子（ＢＶＰ）に対してさらなる標的外結合アッセイを行った。

本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され、説明されたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは、当業者には明らかであろう。ここで、当業者には、多数の変化形、変更、及び置換を本発明から逸脱することなく想到するであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替手段が、本発明の実施において採用され得ることを理解されたい。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにそれらの等価物を包含することが意図される。

一態様では、本発明は、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する重鎖のみ抗体であって、
（ａ）配列番号１〜４の配列のうちのいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲ１、及び／または
（ｂ）配列番号５〜１８及び５４の配列のうちのいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲ２、及び／または
（ｃ）配列番号１９と少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含む、重鎖のみ抗体に関する。

さらに別の実施形態では、重鎖のみ抗体は、
（ａ）配列番号１〜４からなる群から選択される配列、及び／または
（ｂ）配列番号５〜１８及び５４からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び／または
（ｃ）配列番号１９のＣＤＲ３を含む。

さらなる実施形態では、抗ＢＣＭＡ重鎖のみ抗体は、
（ａ）配列番号１〜４からなる群から選択されるＣＤＲ１配列と、
（ｂ）配列番号５〜１８及び５４からなる群から選択されるＣＤＲ２配列と、
（ｃ）配列番号１９のＣＤＲ３と、を含む。

別の態様では、本発明は、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する重鎖のみ抗体であって、
（ａ）次式のＣＤＲ１配列
Ｇ Ｆ Ｔ Ｆ Ｘ１ Ｘ２ Ｙ Ａ（配列番号５５）
（式中、
Ｘ１が、ＳまたはＴであり、
Ｘ２が、Ｓ、Ｎ、またはＲである）、及び
（ｂ）次式のＣＤＲ２配列
Ｘ３ Ｘ４ Ｘ５ Ｘ６ Ｇ Ｘ７ Ｘ８ Ｘ９（配列番号５６）
（式中、
Ｘ３が、ＩまたはＬであり、
Ｘ４が、Ｓ、Ｔ、Ｉ、またはＶであり、
Ｘ５が、ＧまたはＥであり、
Ｘ６が、Ｓ、Ｇ、Ｎ、またはＤであり、
Ｘ７が、Ｇ、Ｄ、またはＡであり、
Ｘ８が、Ｓ、Ｔ、またはＮであり、
Ｘ９が、ＴまたはＳである）、及び
（ｃ）配列番号１９のＣＤＲ３を、
ヒトＶＨフレームワーク中に含む、重鎖可変領域を含む、重鎖のみ抗体に関する。

さらなる態様において、本発明は、ヒトＶＨフレームワーク中にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する重鎖のみ抗体であって、ＣＤＲ配列が、配列番号１〜１９及び５４からなる群から選択されるＣＤＲ配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列である、重鎖のみ抗体に関する。

一実施形態では、そのような抗体は、ヒトＶＨフレームワーク中にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲ配列は、配列番号１〜１９及び５４からなる群から選択される。

さらなる態様では、本発明は、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する重鎖のみ抗体であって、
（ａ）配列番号１のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、及び配列番号１９のＣＤＲ３、または
（ｂ）配列番号２のＣＤＲ１、配列番号５４のＣＤＲ２、及び配列番号１９のＣＤＲ３を、
ヒトＶＨフレームワーク中に含む、重鎖可変領域を含む、重鎖のみ抗体に関する。

本発明の抗体は、配列番号１９のＣＤＲ３アミノ酸配列を共有する。本発明の抗ＢＣＭＡ抗体のＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列は、以下の構造式によって包含され得、ここでＸは可変アミノ酸を示し、それは以下に示されるような特定のアミノ酸であり得る。
ＣＤＲ１
Ｇ Ｆ Ｔ Ｆ Ｘ１ Ｘ２ Ｙ Ａ（配列番号５５）
（式中、
Ｘ１が、ＳまたはＴであり、
Ｘ２が、Ｓ、Ｎ、またはＲである）、
ＣＤＲ２
Ｘ３ Ｘ４ Ｘ５ Ｘ６ Ｇ Ｘ７ Ｘ８ Ｘ９（配列番号５６）
（式中、
Ｘ３が、ＩまたはＬであり、
Ｘ４が、Ｓ、Ｔ、Ｉ、またはＶであり、
Ｘ５が、ＧまたはＥであり、
Ｘ６が、Ｓ、Ｇ、Ｎ、またはＤであり、
Ｘ７が、Ｇ、Ｄ、またはＡであり、
Ｘ８が、Ｓ、Ｔ、またはＮであり、
Ｘ９が、ＴまたはＳである）。

いくつかの他の実施形態では、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号５〜１８及び５４のうちのいずれか１つのＣＤＲ２配列を含む。特定の実施形態では、ＣＤＲ２配列は配列番号５または配列番号５４である。

さらなる実施態様では、本発明の抗ＢＣＭＡ抗体は、配列番号２のＣＤＲ１配列、配列番号５４のＣＤＲ２配列、及び配列番号１９のＣＤＲ３配列を含む。

いくつかの実施形態では、本発明のＣＤＲ配列は、配列番号１〜１９及び５４のうちのいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３配列、またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列のセットに対する１、２、３またはそれ以上のアミノ酸置換を含む（図１）。いくつかの実施形態では、該アミノ酸置換（複数可）は、上に提供された式に対して、ＣＤＲ１のアミノ酸位置５もしくは６のうちの１つ以上、及び／またはＣＤＲ２のアミノ酸位置１〜４もしくは６〜８のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、本明細書の抗ＢＣＭＡ抗体のＣＤＲ配列は、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または配列番号１〜１９及び５４のうちのいずれか１つの、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３配列、もしくはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列のセットに対して少なくとも９９％の同一性を備える配列を有する（図１）。いくつかの他の実施形態では、本明細書の一本鎖のみ抗ＢＣＭＡ抗体は、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、または図２に示す重鎖可変領域配列に対して少なくとも９９％の同一性を備える重鎖可変領域配列を含むであろう。

Claims (28)

1. ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する重鎖のみ抗体であって、
   （ａ）配列番号１〜４の配列のうちのいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲ１、及び／または
   （ｂ）配列番号５〜１８の配列のうちのいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲ２、及び／または
   （ｃ）配列番号１９と少なくとも９５％の配列同一性を有するＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域を含む、前記重鎖のみ抗体。
2. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列がヒトフレームワーク中に存在する、請求項１に記載の重鎖のみ抗体。
3. ＣＨ１配列の非存在下で重鎖定常領域配列をさらに含む、請求項１に記載の重鎖のみ抗体。
4. （ａ）配列番号１〜４からなる群から選択されるＣＤＲ１配列、及び／または
   （ｂ）配列番号５〜１８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列、及び／または
   （ｃ）配列番号１９のＣＤＲ３を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の重鎖のみ抗体。
5. （ａ）配列番号１〜４からなる群から選択されるＣＤＲ１配列と、
   （ｂ）配列番号５〜１８からなる群から選択されるＣＤＲ２配列と、
   （ｃ）配列番号１９のＣＤＲ３とを含む、請求項４に記載の重鎖のみ抗体。
6. 配列番号２０〜５３の配列のうちのいずれかと少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の重鎖のみ抗体。
7. 配列番号２０〜５３からなる群から選択される重鎖可変領域配列を含む、請求項６に記載の重鎖のみ抗体。
8. ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する重鎖のみ抗体であって、
   （ａ）次式のＣＤＲ１配列
   Ｇ Ｆ Ｔ Ｆ Ｘ１ Ｘ２ Ｙ Ａ
   （式中、
   Ｘ１が、ＳまたはＴであり、
   Ｘ２が、Ｓ、Ｎ、またはＲである）、及び
   （ｂ）次式のＣＤＲ２配列
   Ｘ３ Ｘ４ Ｘ５ Ｘ６ Ｇ Ｘ７ Ｘ８ Ｘ９
   （式中、
   Ｘ３が、ＩまたはＬであり、
   Ｘ４が、Ｓ、Ｔ、Ｉ、またはＶであり、
   Ｘ５が、ＧまたはＥであり、
   Ｘ６が、Ｓ、Ｇ、Ｎ、またはＤであり、
   Ｘ７が、Ｇ、Ｄ、またはＡであり、
   Ｘ８が、Ｓ、Ｔ、またはＮであり、
   Ｘ９が、ＴまたはＳである）、及び
   （ｃ）配列番号１９のＣＤＲ３を、
   ヒトＶＨフレームワーク中に含む、重鎖可変領域を含む、前記重鎖のみ抗体。
9. ヒトＶＨフレームワーク中にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含む、ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する重鎖のみ抗体であって、前記ＣＤＲ配列が、配列番号１〜１９からなる群から選択されるＣＤＲ配列と少なくとも９５％の同一性を有する配列である、前記重鎖のみ抗体。
10. ヒトＶＨフレームワーク中にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域を含み、前記ＣＤＲ配列が、配列番号１〜１９からなる群から選択される、請求項９に記載の重鎖のみ抗体。
11. ヒトＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に結合する重鎖のみ抗体であって、
    （ａ）配列番号１のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、及び配列番号１９のＣＤＲ３、または、
    （ｂ）配列番号２のＣＤＲ１、配列番号５のＣＤＲ２、及び配列番号１９のＣＤＲ３を、ヒトＶＨフレームワーク中に含む、重鎖可変領域を含む、前記重鎖のみ抗体。
12. 多重特異性である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の重鎖のみ抗体。
13. 二重特異性である、請求項１２に記載の重鎖のみ抗体。
14. ２つの異なるＢＣＭＡタンパク質に対する結合親和性を有する、請求項１３に記載の重鎖のみ抗体。
15. 同じＢＣＭＡタンパク質上の２つの異なるエピトープに対する結合親和性を有する、請求項１３に記載の重鎖のみ抗体。
16. エフェクター細胞に対する結合親和性を有する、請求項１２に記載の重鎖のみ抗体。
17. Ｔ細胞抗原に対する結合親和性を有する、請求項１２に記載の重鎖のみ抗体。
18. ＣＤ３に対する結合親和性を有する、請求項１７に記載の重鎖のみ抗体。
19. ＣＡＲ−Ｔ形式である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の重鎖のみ抗体。
20. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の重鎖のみ抗体を含む、薬学的組成物。
21. ＢＣＭＡの発現を特徴とするＢ細胞障害の治療のための方法であって、前記障害を有する対象に請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体または請求項２０に記載の薬学的組成物を投与することを含む、前記方法。
22. 前記Ｂ細胞障害が多発性骨髄腫である、請求項２１に記載の方法。
23. 前記Ｂ細胞障害が全身性エリテマトーデスである、請求項２１に記載の方法。
24. 請求項１〜１９のいずれかに記載の抗体をコードする、ポリヌクレオチド。
25. 請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
26. 請求項２５に記載のベクターを含む、細胞。
27. 請求項１〜１９のいずれかに記載の抗体を産生する方法であって、前記タンパク質の発現を許容する条件下で請求項２６に記載の細胞を増殖させることと、前記細胞から前記抗体を単離することとを含む、前記方法。
28. 請求項１〜１９のいずれか１項に記載の抗体を作製する方法であって、ＵｎｉＲａｔ動物をＢＣＭＡで免疫することと、ＢＣＭＡ結合重鎖配列を同定することとを含む、前記方法。