CZ303272B6

CZ303272B6 - Farmaceutický prostredek obsahující fúzní protein, izolovaná molekula polynukleotidu, expresní vektor, kultivovaná bunka, zpusob prípravy polypeptidu a izolovaný polypeptid

Info

Publication number: CZ303272B6
Application number: CZ20012465A
Authority: CZ
Inventors: A. Gross@Jane; Xu@Wenfeng; L. Madden@Karen; P. Yee@David
Original assignee: Zymogenetics, Inc.
Priority date: 1999-01-07
Filing date: 2000-01-07
Publication date: 2012-07-11
Also published as: AU2408400A; ZA200105288B; AU780805B2; EP1642973A1; ES2204502T3; PL211033B1; EP2256199A1; IL144029A0; EP1354598A2; BG65603B1; EE201100048A; NO331902B1; DK1642973T3; EA007471B1; NO333915B1; CN101518648A; CZ20012465A3; DE60005135D1; NZ512753A; DK1141274T4

Abstract

Jsou popsány rozpustné, sekretované polypeptidy receptoru pro faktor nádorové nekrózy, polynukleotidy kódující tyto polypeptidy a prostredky a metody je využívající. Polypeptidy (TNF) obsahují jedno opakování bohaté na cystein, které je homologické s jinými receptory pro faktor nádorové nekrózy, jako je transmembránový aktivátor a CAML-interaktor (TACI). Polypeptidy mohou být používány pro detekci ligandu, agonistu a antagonistu. Polypeptidy mohou být také používány v metodách, kterými je tlumena aktivace B bunek.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká buněčných povrchových receptorů, zvláště receptorů faktoru nádorové nekrózy (TNFR), které regulují interakce mezi různými liniemi hemato poetických buněk. Speciálně se zabývá receptorem TACÍ ajeho uměle připravenými, rozpustnými analogy.

Dosavadní stav techniky

Buněčné interakce, ke kterým dochází v průběhu imunitní odpovědi, jsou regulovány členy něko15 iika rodin buněčných povrchových receptorů, včetně rodiny receptorů faktoru nádorové nekrózy (TNFR). Rodina TNFR se skládá zrady glykoproteinových receptorů integrovaných do buněčné membrány, z nichž mnohé ve spojení se svými odpovídajícími ligandy, regulují interakce mezi různými liniemi hematopoetických buněk (Smith a kol., Rodina TNF receptorů pro buněčné a virové proteiny: aktivace, souběžná stimulace a smrt, 76: 959-62, 1994; Cosman, Stem Cells

12:440-55, 1994).

Jedním takovým receptorem je TACÍ, transmembránový aktivátor a CAML-interaktor (von Bůllow a Bram, Science 278: 138-41, 1997 a publikace WIPO WO 98/39 361). TACÍ je receptor vázaný na membránu, který má extracelulámí doménu obsahující dvě nedokonalá opakování, bohatá na cystein, transmembránovou doménu a cytoplazmovou doménu, která interaguje sCAML (modulátor vápníku a cyklofilinový ligand), což je protein, který je součástí buněčné membrány, umístěný na vnitrobuněčných váčcích, který když je v nadbytku exprimován v buňkách Jurkat, se podílí na indukci NF-AT aktivace. TACÍ je spojen s B buňkami a subpopulaci T buněk, von Bůllow a Bram (Science 278: 138-41, 1997), popisují, že ligand pro TACÍ není zná30 mý.

Bylo zjištěno, že polypeptidy předloženého vynálezu, isomemí forma TACÍ, která má pouze jedno nedokonalé opakování, bohaté na cystein (BR43x2), TACÍ a podobný protein B buněk, BCMA (Gras a kol., Int. Immunol. 7: 1093-106, 1995), se vážou k ligandu TNF, ztnf4, nyní známý jako neutrokin a (publikace WIPO WO 98/18, 921), BLyS (Moore a kol., Science, 285: 260-3, 1999), BAFF (Schneider a kol, J. Exp. Med., 189: 1747-56, 1999), TALL-1 (Shu a kol., J. Leukoc. Biol. 65: 680-3, 1999) nebo THANK (Mukbopadhyay a kol., J. Biol. Chem., 274: 15978-81, 1999). Jako takové by byly BR43x2, TACÍ a BCMA vhodné pro regulaci aktivity ztnf4, zvláště při aktivaci B buněk.

Závěrem lze říci, že předložený vynález poskytuje proteinová terapeutika pro modulaci aktivity ztnf4 nebo jiných BR43x2, TACÍ nebo BCMA ligandu, odvozené prostředky a metody, a rovněž další způsoby použití, které by byly ze zde uvedeného popisu zřejmé osobám se zkušeností v oboru.

Podstata vynálezu

Vynález se týká použití fúzního proteinu skládajícího se z první části a druhé části, které jsou spojené peptidovou vazbou, přičemž první část se skládá z aminokyselinových zbytků 25-104 ze SEQ ID NO: 6 a druhá část je konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu, pro výrobu léčiva pro léčbu astmatu, bronchitidy, rozedmy, nefritidy, pyelonefritidy, neuropatie lehkého řetězce, amyloidózy, membránové nefropatie, nefropatie IgA, Bergerovy choroby, nefropatie IgM, Goodpasturovy choroby, poinfekění glomerulonefritidy, mesangioproliferativní choroby, nefrotického

- 1 CZ 303272 B6 syndromu minimální změny nebo sekundární glomerulonefritidy nebo vaskulitidy spojené s lupus, u savců inhibici vazby BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptoru s ztnf4.

Konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu je konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu.

Konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu je pak konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu IgGl.

io Vynález se dále týká použití protilátky nebo fragmentu protilátky, která se specificky váže na polypeptid o sekvenci SEQ ID NO: 18, pro výrobu léčiva pro inhibici produkce protilátky spojené se systémickým lupus erythematodes u savců inhibici vazby BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptoru s ztnť4.

V jednom provedení je popsána protilátka nebo fragment protilátky která je vybrána ze skupiny zahrnující: a) polyklonální protilátku; b) myší monoklonální protilátku; c) zušlechtěnou protilátku odvozenou od b) a c) lidskou monoklonální protilátku. V podobném provedení je fragment protilátky vybrán ze skupiny zahrnující F(ab'), F(ab), Fab', Fv, scFv a minimální rozpoznávací jednotku. V jiném provedení je savcem primát.

Aktivita ztnť4 může být spojena s B lymfocyty. Aktivita ztnf4 může být spojena s aktivovanými B lymfocyty. A aktivita ztnf4 může být spojena s klidovými B lymfocyty. Aktivita ztnf4 může být spojena s produkcí protilátek. Produkce protilátek může být spojena s autoimunitní chorobou. Uvedenou autoimunitní chorobou může být systémický lupus erythematodes, myastenie gravis, roztroušená skleróza nebo zánět kloubů. V jiném provedení je aktivita ztnf4 spojena s astmatem, bronchitidou nebo rozedmou. Dále aktivita ztnf4 může být spojena s konečným stavem selhání ledvin. Aktivita ztnf4 může být spojena s nemocí ledvin. V uvedeném provedení může být nemocí ledvin glomerulonefritida, vaskulitida, nefritida nebo pyelonefritida. Jindy nemoc ledvin může být spojena s novotvary na ledvinách, mnohočetnými myelomy, lymfomy, neuropatii nebo ao amyloidózou. Aktivita ztnf4 může být spojena s efektorovými T buňkami. Aktivita ztnf4 může být spojena s tlumením imunitní odpovědi. Dále aktivita může být spojena s imunosupresí, V ještě jiném provedení je imunosuprese spojena s odmítnutím štěpu, reakci štěpu proti hostiteli nebo zánětem. Aktivita může být spojena s autoimunitní chorobou. A autoimunitní chorobou může být cukrovka závislá na inzulínu nebo Crohnova nemoc. Aktivita ztnf4 může být spojena se zánětem,

V podobném případě zánět může být spojen s bolestí kloubů, otokem, anémií, nebo septickým šokem. Dále je popsán způsob inhibice spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy, spočívající v podání množství sloučeniny, která je popsána výše. Spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svým ligandy může být spojeno s B lymfocyty. V jiném podobném provedení spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy může být spojeno s aktivovanými B lymfocyty. Spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy může býtjinde spojeno s klidovými B lymfocyty.

Spojené BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy může být spojeno s produkcí protilátek. Produkce protilátek může být spojena s autoimunitní chorobou. Autoimunitní choro45 bou může být systemický lupus erythematodes, myastenie gravis, roztroušená skleróza nebo zánět kloubů. Spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy může být spojeno s astmatem, bronchitidou nebo rozedmou. Spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy může být spojeno s konečným stavem selhání ledvin. Spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy může být spojeno s nemocí ledvin. Nemocí ledvin může být glomerulonefritida, vaskulitida, nefritida nebo pyelonefritida. V ještě dalším provedení nemoc ledvin může být spojena s novotvary na ledvinách, mnohočetnými myelomy, lymfomy, neuropatií nebo amyloidózou. Spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy může být spojeno s efektorovými T buňkami. Spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy může být spojeno s tlumením imunitní odpovědi. V ještě jiném provedení je aktivita spo55 jena s imunosupresí. Jindy imunosuprese může být spojeny s odmítnutím štěpu, reakcí štěpu proti

- 2 CZ 303272 B6 hostiteli nebo zánětem. Aktivita může být spojena s auto imunitní chorobou. V podobném provedení může být autoimunitní chorobou cukrovka závislá na inzulínu nebo Crohnova nemoc. Spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy může být spojeno se zánětem. V podobném provedení zánět může být spojen s bolestí kloubů, otokem, anémií, nebo septickým šokem.

Z jiného pohledu předložený vynález poskytuje izolovanou molekulu polynukleotídu, která kóduje polypeptid se sekvencí SEQ ID NO: 2. Je také poskytnuta izolovaná molekula polynukleotídu se sekvencí SEQ ID NO: I. V podobném provedení je poskytnut expresní vektor, který obsahuje ío následující operativně vázané elementy: transkripční promotor; molekulu polynukleotídu popsanou výše a terminátor transkripce. V jiném provedení expresní vektor dále obsahuje sekretorickou sekvenci spojení receptor ligand, operativně vázanou k uvedené molekule polynukleotídu.

Také je poskytnuta kultivovaná buňka, do níž byl vnesen expresní vektor, přičemž tato kultivovaná buňka exprimuje polypeptid kódovaný uvedeným polynukleotidovým segmentem. Předložený vynález dále poskytuje metodu produkce polypeptidů, která spočívá v: kultivaci buňky do které byl vnesen expresní vektor, jak bylo popsáno výše; tato buňka exprimuje polypeptid kódovaný uvedenou polynukleotidovou molekulou; a exprimovaný polypeptid je izolován. Vynález také poskytuje izolovaný polypeptid, který má sekvenci SEQ ID NO: 2. V podobném provedení je polypeptid v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Tyto a ještě jiné aspekty vynálezu se stanou zřetelnější po uvedení následujícího podrobného popisu.

Před vyložením vynálezu může být pro jeho pochopení užitečné vyložit definice určitých termí25 nů, které zde budou dále používány:

Termín „afínitní značka“ je zde používán pro označení polypeptidového segmentu, který může být připojen ke druhému polypeptidů, aby napomohl pri purifikaci nebo detekci druhého polypeptidu, nebo aby poskytl místa pro připojení druhého polypeptidů k substrátu. V principu jaký30 koli peptid nebo protein, pro kteiý je dostupná protilátka nebo jiné specificky se vázající činidlo, může být použit jako afínitní značka. Mezi afínitní značky patří polyhistidinový úsek, protein A (Nilsson a kol., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson a kol., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), glutathion Stransferáza (Smith a Johnson, Gene 67: 31, 1988), afínitní značka Glu~Glu (Grussenmeyer a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985), substance P, peptid Flaf™ (Hopp a kol., Biotechnology 6: 1204-10, 1988), peptid vázající streptavidin nebo jiný antigenní epitop nebo vazebná doména. Obecně viz Ford a kol., Protein Expression and Purifícation 2: 95-107, 1991. DNA kódující afínitní značky jsou dostupné od komerčních dodavatelů (např. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Termínem „alelová varianta“ je zde označována kterákoli ze dvou nebo více alternativních forem genu, kteréjsou umístěny na tomtéž lokusu na chromozómu. Alelové varianty vznikají přirozenou cestou mutacemi a mohou mít za následek fenotypový polymorfizmus uvnitř populací. Mutace v genech mohou být tiché (tj. nezpůsobují žádné změny v jimi kódovaném polypeptidů) nebo mohou kódovat polypeptidy, které mají pozměněnou aminokyselinovou sekvenci. Termín „alelo45 vá varianta“ je zde také používán pro označení proteinu kódovaného alelovou variantou genu. Patří sem také stejné proteiny od jednoho druhu, které se liší od standardní aminokyselinové sekvence alelovou variací. Alelová variabilita označuje přirozeně se vyskytující odchylky mezi jednotlivci v genech kódujících určitý protein.

Termíny „blíže k aminovému konci“ a „blíže ke karboxylovému konci“ jsou zde používány pro označení polohy uvnitř polypeptidů a proteinů. Tam, kde to kontext dovoluje, jsou tyto termíny používány s odkazem na určitou sekvenci nebo část polypeptidů nebo proteinu, pro označení blízkosti nebo relativní polohy. Například určitá sekvence umístěná uvnitř proteinu blíže ke karboxy lovému konci standardní sekvence je umístěna blíže směrem ke karboxy lovému konci standardní sekvence, ale není nezbytně až na karboxylovém konci celého proteinu.

- j CZ 303272 B6

Termínem „pár komplement/antikomplement“ jsou zde označovány neidentické složky, které za vhodných podmínek vytvářejí nekoválentně spojený, stabilní pár. Například biotin a avidin (nebo streptavidin) jsou prototypickými členy takového páru komplement/antikomplement. Jiné příkla5 dy párů komplement/antikomplement zahrnují páry receptor/ligand, páry protilátka/antigen (nebo hapten nebo epitop), páry sense/antisense polynukleotidů, a podobně. Tam kde je žádoucí následná disociace páru komplement/antikomplement, má pár komplement/antikomplement vazebnou afinitu <10 ⁹ M.

io Termínem „kontig“ je zde označován polynukleotid, který obsahuje souvislý úsek totožné nebo komplementární sekvence jiného polynukleotidů. O souvislých sekvencích se uvádí že „pokrývají“ daný úsek póly nukleotidové sekvence buď úplně nebo pokrývají pouze část úseku daného polynukleotidů. Například reprezentativní kontigy pro polynukleotídovou sekvenci 5'ATGGCTTAGCTT-3'jsou 5'-TAGCTTgagtct-3' a 3'-gtcgacTACCGA-5'.

Termínem „komplementy polynukleotidových molekul“ jsou zde označovány polynukleotidy, které mají ve srovnání se standardní sekvencí komplementární sekvenci bází a reverzní orientaci. Například sekvence 5 -ATGCACGGG-3' je komplementární k 5'~CCCGTGCAT-3'.

2() Termínem „degenerovaná nukleotidová sekvence nebo degenerovaná sekvence“ jsou zde označovány sekvence nukleotidů, které zahrnují jeden nebo více degenerovaných kodonů (ve srovnání se standardní polynukleotídovou molekulou, která kóduje polypeptid). Degenerované kodony obsahují odlišné triplety nukleotidů, ale kódují stejný aminokyselinový zbytek (tj. každý z tripletů GAL! a GAC kóduje Asp).

Termínem „expresní vektor“ je zde označována DNA molekula, lineární nebo kruhová, která obsahuje segment kódující polypeptid, o který se jedná, kterýje operativně vázaný k dalším segmentům, zabezpečujícím jeho transkripci. Takové přídatné elementy mohou zahrnovat promotorové a terminátorové sekvence, a případně jeden nebo více počátků replikace, jeden nebo více selektovaných markérů, zesilovač transkripce, polyadenylační signál a podobně. Expresní vektory jsou obecně odvozeny z plazmidové nebo virové DNA, nebo mohou obsahovat elementy z obou.

Termínem „isoforma“ jsou zde označovány různé formy proteinu, které mohou být produkovány z různých genů nebo z téhož genu následkem alternativního sestřihu. V některých případech se isoformy liší svou transportní aktivitou, obdobím kdy jsou ve vývoji exprimovány, tkáňovou distribucí, rozmístěním v buňce nebo kombinací těchto vlastností.

Termínem „izolovaný polynukleotid“ je zde označován polynukleotid, který byl vzat ze svého přirozeného genetického prostředí a je tedy zbaven vnějších nebo nechtěných kódujících sekvencí, a je ve formě vhodné pro použití v rámci produkčních systémů pro geneticky upravené proteiny. Takovými izolovanými molekulami jsou ty, které jsou vyděleny ze svého přirozeného prostředí a zahrnují cDNA a genomové klony. Izolované DNA molekuly které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou zbaveny jiných genů, se kterými jsou obyčejně asociovány, ale mohou obsaho45 vat přirozeně se vyskytující 5' a 3' nepřekládané oblasti, jako jsou promotory a terminátory. Určení asociovaných oblastí bude zřejmé osobám se zkušeností v oboru (viz například Dynan a Tijan, Nátuře 316: 774-78, 1985).

Termínem „izolovaný polypeptid nebo protein“ je zde označován polypeptid nebo protein, který se nalézá v podmínkách jiných než ve svém přirozeném prostředí, jako je například mimo krev nebo mimo živočišnou tkáň. Ve výhodné formě je izolovaný polypeptid v podstatě zbaven jiných polypeptidů, zvláště jiných polypeptidů živočišného původu. Je výhodné poskytnout polypeptidy ve vysoce čisté formě, tj. ve více než 95% čistotě, výhodnější je ve více než 99% čistotě. Pokud je používán v tomto kontextu, termín „izolovaný“ nevylučuje přítomnost téhož polypeptidu

-4CZ 303272 B6 v alternativních fyzikálních formách, jako jsou dimery nebo alternativně glykosylované nebo derivované formy.

„Operativně vázaný“: Pokud je aplikován na nukleotidové segmenty, termín ..operativně vázaný“ označuje že segmenty jsou uspořádány tak, že fungují, pokud se týká jejich zamýšleného účelu, v harmonické součinnosti, například transkripce je započata na promotoru a probíhá podél kódujícího segmentu k terminátoru.

Termínem „ortolog“ je zde označován polypeptid nebo protein, který je získán zjednoho druhu a kteiý je funkčním partnerem polypeptidů nebo proteinu z jiných druhů. Sekvenční rozdíly mezi ortology jsou výsledkem speciace.

Termínem „polynukleotid“ je zde označován jednořetězcový nebo dvouřetězcový polymer deoxyri bon ukleotido vých nebo ribonukleotidových bází, čtený od 5' konce ke 3' konci. Polynukleo15 tidy zahrnují RNA a DNA a mohou být izolované z přírodních zdrojů, syntetizované in vitro, nebo připravené kombinací přírodních a syntetických molekul. Velikosti polynukleotidů jsou vyjádřeny v párech bází (zkráceně „bp“), nukleotidech („nt“) nebo kilobázích („kb“). Tam, kde to kontext umožňuje, poslední dva uvedené termíny mohou označovat polynukleotidy, které jsou jednořetězcové nebo dvouřetězcové. Když je termín použit pro dvouřetězcové molekuly, je použit pro označení celkové délky a bude chápán jako ekvivalent termínu „páry bází“. Osoby se zkušeností v oboru si uvědomují, že dva řetězce dvouřetězcového polynukleotidu se mohou svojí délkou slabě odlišovat a že jejich konce mohou být specificky uspořádány v důsledku enzymatického štěpení; tedy všechny nukleotidy v dvouřetězcové polynukleotidové molekuly nemusí být párovány. Takové nepárované konce obyčejně nebudou přesahovat na délku 20 nukleotidů.

Termínem „polypeptid“ je zde označován polymer aminokyselinových zbytků spojených peptidovými vazbami, ať je produkován přirozeně nebo synteticky. Polypeptidy obsahující méně než 10 aminokyselinových zbytků jsou běžně označovány jako „peptidy“.

Termínem „promotor“ je zde označována ta část genu, která obsahuje DNA sekvence zabezpečující vazbu RNA polymerázy a započetí transkripce. Promotorové sekvence se obyčejně, ale ne vždy, nacházejí v 5' nekódujících oblastech genů.

Termínem „protein“ je zde označována makromolekula obsahující jeden nebo více polypeptido35 vých řetězců. Protein může také obsahovat nebílkovinné složky, jako jsou například sacharidové skupiny. Sacharidy a jiné nebílkovinné substituenty mohou být přidány k proteinu buňkou, v níž je protein vytvořen, a bude se měnit podle typu buňky. Proteiny jsou zde definovány v termínech struktur jejich aminokyselinové kostry; substituenty, jako jsou sacharidové skupiny, nejsou obyčejně specifikovány, nicméně však mohou být přítomny.

Termínem „receptor“ je zde označován s buňkou asociovaný protein nebo polypeptidová jednotka takového proteinu, který se váže k biologicky aktivní molekule („ligand“) a zprostředkuje účinek ligandu na buňku. Vazba ligandu k receptoru má za následek změnu receptoru (a v některých případech multimerizaci receptoru, tj. asociaci totožných nebo odlišných podjednotek receptoru), která způsobí interakci mezi efektorovou doménou (doménami) receptoru a jiné molekuly (molekul) v buňce. Tyto interakce pak vedou ke změnám v metabolizmu buňky. Metabolické jevy, které jsou vázány na interakce receptor-ligand zahrnují transkripci genu, fosforylaci, defosforylaci, buněčné množení, zvýšení produkce cyklického AMP, mobilizací buněčného vápníku, mobilizaci membránových lipidů, buněčnou adhezi, hydrolýzu inoizotolových lipidů a hydrolýzu fosfolipidů. BR43x2 má, jak je zde podrobněji diskutováno, charakteristiky TNF receptorů.

Termínem „sekreční signální sekvence“ je zde označována DNA sekvence, která kóduje polypeptid („sekreční peptid“), který jako součást většího polypeptidů, vede větší polypeptid sekreční dráhou buňky, ve které je syntetizován. Větší polypeptid je obyčejně během průchodu sekreční dráhou štěpen, aby byl sekreční peptid odstraněn.

-5 CZ 303272 B6

Termínem „rozpustný receptor“ je zde označován takový polypeptid receptorů, který není vázán na buněčnou membránu. Rozpustnými receptory jsou nejčastěji takové receptory polypeptidy, které postrádají trans membrán ové a cytoplazmové domény. Rozpustné receptory mohou obsaho5 vat další aminokyselinové zbytky, jako jsou například afinitní značky, které napomáhají purifíkaci polypeptidů nebo poskytují místa pro připojení polypeptidů k substrátu. Mnoho receptorů, vyskytujících se na buněčném povrchu, má přirozeně se vyskytující rozpustné protějšky, které vznikají proteolýzou nebojsou překládány z alternativně sestřižených mRNA. O polypeptidech receptorů je možno říci, že jsou v podstatě zbaveny transmembránových a vnitrobuněčných polyio peptidových segmentů, když postrádají podstatné části těch segmentů, které zabezpečují zakotvení v membráně, respektive přenos signálu.

Molekulární hmotnosti a délky polymerů určené nepřesnými analytickými metodami (např. gelovou elektroforézou), budou chápány jako přibližné hodnoty. Když je taková hodnota vyjádřena is jako „asi“ X nebo „přibližně“ X, uvedená hodnota bude chápána s přesností ±10 %.

Všechny zde uvedené dokumenty jsou tímto odkazem zahrnuty ve své úplnosti.

Předložený vynález je založen částečně na objevu DNA sekvence dlouhé 1192 bp (SEQ ID

NO: 1) a odpovídající polypeptidové sekvence (SEQ ID NO: 2), která je isoformou receptorů TACÍ. Tato isoforma byla označena BR43x2. Rozpustná forma BR43x2 je uvedena v SEQ ID NO: 4 a polynukleotid kódující rozpustný receptor v sekvenci SEQ ID NO: 3. Jak je zde podrobněji popsáno, receptor BR43x2 kódující polynukleotidy a polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, byly původně určeny klonováním spojeným se zachycováním signálu, za použi25 tí lidské knihovny RPMI 1788 a ligandu ztnf4 faktoru nádorové nekrózy, nyní známého jako neutrokin a (WIPO WO 98/18 921), BLyS (Moore a kol., Science, 285: 260-3, 1999), BAFF (Schneider a kol., J. Exp. Med,, 189: 1747-56, 1999), TALL-1 (Shu a kol., J. Leukoc. Biol. 65: 680-3, 1999) nebo THANK (Mukhopadhyay a kol., J. Biol. Chem. 274: 15978-81, 1999), naNkonci nebo na C-konci označených pomocí FLAG, biotinu nebo FITC. Pozitivní soubory byly určovány pomocí vazby ligandu, poté byly rozděleny na jednotlivé klony, z nich byla izolována cDNA a ta sekvenována. Porovnání odvozené aminokyselinové sekvence BR43x2 (uvedené v sekvenci SEQ ID NO: 2) se známými receptory faktoru nádorové nekrózy ukázalo, že BR43x2 je isoformou TACÍ, která obsahuje jedno, špatně zachované nedokonalé opakování, bohaté na cystein.

Strukturálně je rodina TNF receptorů charakterizována extracelulámí částí, složenou z několika modulů, které jsou z historických důvodů nazývány „na cystein bohatá, nedokonalá opakování“. Prototypový člen rodiny TNFR má čtyři tato nedokonalá opakování, každé asi 29 až 43 zbytků dlouhé, uspořádané přímo jedno za druhým. Typické nedokonalé opakování má 6 cysteinovýeh zbytků. Jsou nazývány jako nedokonalá opakování, protože se zdá, že pocházejí ze společného původního modulu, ten vsak není opakován přesně: nedokonalá opakování #1, #2, #3 a #4 mají charakteristické sekvenční rysy, které je odlišují jedno od druhého. Při zkoumání krystalové struktury TNF receptorů p55 bylo zjištěno, že každé nedokonalé opakování odpovídá jedné prostorově uspořádané doméně a že všechna čtyři nedokonalá opakování jsou uspořádána do téže terciární struktury, vnitřně drží pohromadě pomoct disulfidových vazeb.

TACÍ obsahuje dvě nedokonalé opakování bohatá na cystein (von Bii low a Bram, Science 228: 138^11, 1997), z nichž první je konzervováno ve struktuře i jiných členů rodiny TNF receptorů a druhé je konzervováno méně. Isoforma BR43x2, která je předmětem tohoto vynálezu, postrádá první na cystein bohaté nedokonalé opakování TACÍ, obsahuje pouze druhé, méně konzervované nedokonalé opakování.

Sekvenční analýza odvozené aminokyselinové sekvence BR43x2, jak je představena v sekvenci SEQ ID NO: 2 ukazuje přítomnost zralého proteinu, který má extracelulámí doménu (zbytky 1 až

120 v SEQ ID N O: 2), která obsahuje jedno nedokonalé opakování bohaté na cystein (zbytky 25

-6 CZ 303272 B6 až 58 v SEQ ID N O: 2), transmembránovou doménu (zbytky 121 až 133 v SEQ ID NO: 2) a cytoplazmatickou doménu (zbytky 134 až 247 v SEQ ID NO: 2). Nedokonalé opakování bohaté na cystein v BR43x2 obsahuje 6 cysteinových zbytků (zbytky 25, 40, 43, 47, 54 a 58 v SEQ ID NO: 2), konzervovaný zbytek kyseliny asparagové (zbytek 34 v SEQ ID NO: 2) a dva konzervo5 vane leucinové zbytky (zbytky 36 až 37 v SEQ ID NO: 2) a sdílí 46% shodu s prvním nedokonalým opakováním bohatým na cystein v TACÍ (SEQ ID NO: 6) a 35% shodu s prvním nedokonalým opakováním bohatým na cystein v BCMA (SEQ ID NO: 8; obrázek 1). Nedokonalé opakování bohaté na cystein může být představeno následujícím motivem:

io CX[QEK] [QEKNRDHS] [QE] X {0-2} [YFW] [YFW] DXLLX {2} C [IMLV1 XCX {3} CX {6-8} CX {2} [YF] C (SEQ ID NO: 10),

Kde C představuje zbytek aminokyseliny cysteinu, Q představuje zbytek aminokyseliny glutaminu, E představuje zbytek aminokyseliny kyseliny glutamové, K představuje zbytek aminokyseli15 ny lysinu, N představuje zbytek aminokyseliny asparaginu, R představuje zbytek aminokyseliny argininu, D představuje zbytek kyseliny asparagové, H představuje zbytek aminokyseliny histidinu, S představuje zbytek aminokyseliny šeřinu, Y představuje zbytek aminokyseliny tyrosinu, F představuje zbytek aminokyseliny fenyl alaninu, W představuje zbytek aminokyseliny tryptofanu, L představuje zbytek aminokyseliny leucinu, I představuje zbytek aminokyseliny isoleucinu,

V představuje zbytek aminokyseliny valinu a X představuje jakýkoli přirozeně se vyskytující zbytek aminokyseliny, kromě cysteinu. Aminokyselinové zbytky v hranatých závorkách „[ J“ označují povolenou variabilitu aminokyselinových zbytků na této pozici. Číslo ve svorkách „{ }“ označuje počet aminokyselinových zbytků, povolených na této pozici.

Předložený vynález také poskytuje rozpustné polypeptidy dlouhé od 32 do 40 aminokyselinových zbytků, jak jsou uvedeny v SEQ ID NO: 10.

Rozpustný receptor BR43x2, jak je představován zbytky 1 až 120 v sekvenci SEQIDNO: 4, obsahuje jedno nedokonalé opakování bohaté na cystein (zbytky 25 až 58 v sekvenci SEQ ID

NO: 4) a postrádá transmembránovou a cytoplazmatickou doménu z BR43x2, jak je popsáno v sekvenci SEQ ID NO: 2.

Osobám se zkušeností v oboru bude zřejmé, že tato rozhraní mezi doménami jsou přibližná ajsou založena na porovnávání se známými proteiny a na předpovědích prostorového uspořádání pro35 teinů. Tyto rysy ukazují na to, že receptor kódovaný DNA sekvencemi SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 3 je členem roviny TNF receptorů.

Pomocí metod Northem blot a Dot blot byla provedena analýza tkáňové distribuce mRNA, odpovídající nukleotidovým sondám, které byly navrženy pro detekci exprese BR43x2, ukázala expresi ve slezině, lymfatických uzlinách, buňkách CD19+, slabou expresi v buňkách smíšených reagujících lymfocytů, buňkách Daudi a Ráji. Pomocí PCR provedené s reverzní transkriptázou byl BR43x2 detekován pouze v B buňkách a nikoli v aktivovaných T buňkách, jak bylo zjištěno pro TACÍ (von Btilow a Bram, Science 278: 138-41, 1997). Při použití BR43x2 sondy, která se 100% překrývá s odpovídající sekvencí TACÍ, TACÍ a BR43x2 byly detekovány ve slezině, lym45 fatických uzlinách a tenkém střevě, žaludku, stinných žlázách, slepém střevě, plících, kostním morku, slezině plodu, buňkách CD 19⁺ a buňkách Ráji.

Pomocí metody Northem blot byl BCMA detekován v tenkém střevě, slezině, žaludku, tlustém střevě, slepém střevě, lymfatických uzlinách, průdušnici a varlatech. BCMA byl také detekován v adenolymfomu, lymfomu ne-Hodgkinova typu a příušním nádoru, slabě byl detekován v CD 8\ CD 19⁺, buňkách MLR, Daudi, Ráji a buňkách Hut 78.

Byla také provedena analýza Northem blot za použití myšího ztnf4 (SEQ ID NO: 19) a stejně jako u lidských TACÍ, BCMA a BR43x2, exprese myšího ztnf4 byla detekována převážně ve sle- 7 CZ 303272 B6 žíně a brzlíku. Myší ztní'4 byl také exprimován v plících a slabá exprese byla detekována v kůži a srdci.

Předložený vynález také poskytuje polynukleotidové molekuly, počítaje v to DNA a RNA mole5 kuly, které kódují zde popisované BR43x2 polypeptidy. Osoby se zkušeností v oboru snadno rozpoznají, že z důvodu degenerace genetického kóduje mezi těmito polynukleotidovými molekulami možná značná variabilita. SEQ ID NO: 11 je degenerovaná DNA sekvence, která v sobě zahrnuje všechny DNA, které kódují rozpustný polypeptid BR43x2 se sekvencí SEQ ID NO: 4.

Podobně sekvence SEQ ID NO: 12 je degenerovaná DNA sekvence, která v sobě zahrnuje io všechny DNA, které kódují polypeptid BR43x2 se sekvencí SEQ ID NO: 2. Osoby se zkušeností v oboru snadno rozpoznají, že degenerovaná sekvence SEQ ID NO: 12 také poskytuje všechny

RNA sekvence kódující SEQ ID NO: 4, pouze je zaměněno U za T. Tedy za předmět předloženého vynálezu jsou považovány polynukleotídy, které obsahují nukleotidy 1 až 360 ze sekvence SEQ ID NO: 11, nukleotidy 1 až 741 ze sekvence SEQ ID NO: 12 a jejich RNA ekvivalenty, is které kódují polypeptid BR43x2. Tabulka 1 uvádí jednopísmenové kódy používané v sekvencích

SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 12 pro označení degenerovaných pozic nukleotidů. „Rozlišení“ jsou nukleotidy označené kódovým písmenem. „Komplement“ uvádí kód pro komplementární nukleotid (nukleotidy). Například kód Y označuje bud' C nebo T, ajeho komplement R označuje buď A nebo G, přičemž A je komplementární k T a G je komplementární k C.

Tabulka 1

Nukleotid_Rozlišení_Komplement_Rozlišení

A	A	T	T
C	C	G	G
G	G	C	C
T	T	A	A
R	A\|G	Y	C\|T
Y	C\|T	R	A\|G
M	A\|C	K	G\|T
K	G\|T	M	A\|C
S	C\|G	S	C\|G
W	A\|T	W	A\|T
H	A\|C\|T	D	A\|G\|T
B	C\|G\|T	V	A\|C\|G
V	A\|C\|G	B	C\|G\|T
D	A\|G\|T	H	A\|C\|T
N	A\|C\|G\|T	N	A\|C\|G\|T

Degenerované kodony použité v sekvenci SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 12, zahrnující všechny možné kodony pro danou aminokyselinu, jsou uvedeny v tabulce 2.

-8CZ 303272 B6

Tabulka 2

Amino	Jedno	Kodony	Degenerovaný
kyselina	písmenový		kodon
	kód
Cys	C	TGC TGT	TGY
Ser	S	AGC AGT TCA TCC TCG TCT	WSN
Thr	T	ACA ACC ACG ACT	ACN
Pro	P	CCA CCC CCG CCT	CCN
Ala	A	GCA GCC GCG GCT	GCN
Gly	G	GGA GGC GGG GGT	GGN
Asn	N	AAC AAT	AAY
Asp	D	GAC GAT	GAY
Glu	E	GAA GAG	GAR
Gin	Q	CAA CAG	CAR
His	H	CAC CAT	CAY
Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGT	MGN
Lys	K	AAA AAG	AAR
Met	M	ATG	ATG
Ile	1	ATA ATC ATT	ATH
Leu	L	CTA CTC CTG CTT TTA TTG	YTN
Val	V	GTA GTC GTG GTT	GTN
Phe	F	TTC TTT	ΤΤΎ
Tyr	Y	TAC TAT	TAY
Trp	W	TGG	TGG
Ter	•	TAA TAG TGA	TRR
Asn \| Asp	B		RAY
Glu \| Gin	Z		SAR
jakákoli	X		NNN

Osoba s běžnou zkušeností v oboru si bude vědoma, že při určení degenerovaného kodonu, reprezentujícího všechny možné kodony kódující každou aminokyselinu, je vnášena jakási neurčitost. Například degenerovaný kodon pro šeřin (WSN) může za některých okolností kódovat arginin (AGR), a degenerovaný kodon pro arginin (MGN) může za některých okolností kódovat serin (AGY). Podobný vztah existuje mezi kodony kódujícími fenylalanin a leucin. Tedy některé io polynukleotidy zahrnuté v degenerované sekvenci mohou kódovat variantní aminokyselinové sekvence, ale osoba s běžnou zkušeností v oboru může snadno takové variantní sekvence určit

-9 CZ 303272 B6 s odkazem na aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 4. U variantních sekvencí může být, jak je zde popsáno, snadno testována jejich funkčnost.

Osoba s běžnou zkušeností v oboru si také bude vědoma, že různé druhy mohou vykazovat „preferenční užívání kodonů⁴⁴. Obecně viz Grantham a kol., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas a kol., Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson a kol., Gene 13: 355-64, 1981; Grosjean a Eiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; Ikemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982. Zde používané termíny „preferenční užívání kodonů“ nebo „preferované kodony⁴⁴ jsou termíny z oboru, které označují translační kodony proteinu, které jsou nejčastěji io používány v buňkách určitých druhů, které tak dávají přednost jednomu nebo několika reprezentantům zmožných kodonů, kódujících každou aminokyselinu (viz tabulka 2). Například aminokyselina threonin (Thr) může být kódována ACA, ACC, ACG nebo ACT, ale v savčích buňkách je nejběžněji používaným kodonem ACC; v jiných druzích, například v buňkách hmyzu, kvasinkách, vírech nebo bakteriích mohou být přednostně používány odlišné kodony pro Thr. Prefero15 vaně kodony pro určité druhy mohou být vneseny do polynukleotidu předloženého vynálezu pomocí různých metod v oboru známých. Vnesení sekvencí preferovaných kodonů do rekombinantní DNA může například zvýšit produkci proteinu tím, že učiní translaci proteinu v buňce určitého typu, nebo v určitém druhu, účinnější. Proto sekvence degenerovaných kodonů, uvedené v sekvencích SEQ ID NO: 11 a 12, slouží jako matrice pro optimalizaci exprese polynukleotidu v buň20 kách různých typů a druhů, které jsou v oboru obecně používány a zde popisovány. Sekvence obsahující preferované kodony mohou být testovány a optimalizovány pro expresi v různých druzích, a testovány na svoji funkčnost tak, jak je zde popsáno.

Vysoce konzervované aminokyseliny nedokonalých opakování bohatých na cystein v BR43x2, mohou být použity jako nástroj pro identifikaci nových členů rodiny. Například polymerázová řetězová reakce provedená pomocí reverzní trans kriptázy (RT-PCR), může být použita pro namnožení sekvencí kódujících výše popsanou extracelulámí doménu, která váže ligand, z RNA získaných z různých tkáňových zdrojů nebo z buněčných linií. Zvláště užitečné pro tento účel jsou vysoce degenerované primery, navržené podle sekvencí BR43x2.

Ve výhodném provedení vynálezu budou izolované polynukleotidy hybridizovat s podobně velikými oblastmi sekvence SEQ ID NO: 3 nebo sekvence k ní komplementární, za přísných hybridizačních podmínek. Obecně jsou přísné hybridizační podmínky vybírány tak, aby teplota byla asi 5 °C nižší než je teplota tání (T_m) specifické sekvence při definované iontové síle a pH. T_m je tep35 lota (za definované iontové síly a pH) při které 50 % cílové sekvence hybridizuje s přesně se shodující sondou. Typické přísné hybridizační podmínky jsou takové, kdy koncentrace soli je asi 0,03M, pH je 7 a teplota je alespoň 60 °C.

Jak bylo dříve zmíněno, izolované polynukleotidy předloženého vynálezu zahrnují DNA a RNA.

4o Metody pro izolaci DNA a RNA jsou v oboru dobře známé. Obecně je dávána přednost izolaci RNA z buněk RPMI 1788, PBMNC, klidových nebo aktivovaných transfekovaných B buněk nebo z tkáně mandlí, třebaže DNA může být také připravena za použití RNA z jiných tkání nebo izolována jako genomová DNA. Celková RNA může být připravena extrakcí pomocí guanidin HCl, následovanou izolací pomocí centrifugace v gradientu CsCl (Chirgwin a kol,, Biochem i stry

18: 52-94, 1979). Póly (A)⁺ RNA je připravena z celkové RNA pomocí metody Aviva a Ledera (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69: 1408-1, 1972). Komplementární DNA (cDNA) je připravena z póly (A)* RNA pomocí známých metod. Polynukleotidy kódující polypeptidy BR43x2 jsou potom identifikovány a izolovány, například pomocí hybridizace nebo PCR.

Osoby se zkušeností v oboru budou vědomi toho, že sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1 a 3 představují jednu alelu lidského genu, a zeje možno očekávat, že se uplatní alelová variabilita a alternativní sestřih. Alelové varianty DNA sekvencí uvedené v SEQ ID NO: 1 a 3, včetně těch, které obsahují tiché mutace a těch, ve kterých mají mutace za následek změny v aminokyselinové sekvenci, jsou v rámci rozsahu předloženého vynálezu, stejně tak proteiny, které jsou alelovými variantami SEQ ID NO: 2 a 4. Alelové varianty a sestřihové varianty těchto sekvencí mohou být

- 10CZ 303272 B6 klonovány pomocí sondování cDNA nebo genomových knihoven z různých jedinců nebo tkání podle standardních postupů, známých v oboru.

Předložený vynález také poskytuje izolované polypeptidy BR43x2, které jsou v podstatě homolo5 gické s polypeptidy sekvencí SEQ ID NO: 2 a 4 ajejich druhovými ortology. Termín „v podstatě homologický“ je zde použit pro označení polypeptidů, které mají 50%, s výhodou 60% a ještě výhodněji alespoň 80% sekvenční shodu se sekvencemi uvedenými v SEQ ID NO: 2 a 4 nebo jejich ortology. Takové polypeptidy budou s výhodou alespoň z 90 % shodné a nejvýhodnější bude, když budou z 95 % nebo více shodné se sekvencemi uvedenými v SEQ ID NO: 2 a 4 nebo io jejich ortology. Procento sekvenční shody je určováno běžnými metodami. Viz například Atschul a kol.. Bull. Math. Bio. 48: 603-66, 1986 a Henikoff a Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:

10915-9, 1992. Krátce řečeno, dvě aminokyselinové sekvence jsou porovnány a skóre porovnání optimalizováno pomocí penalizace 10 za otevření mezery, penalizace I za rozšíření mezery a hodnotící matrice „blosum 62“ podle Henikoff a Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: is 10915-9, 1992, jak je uvedeno v tabulce 3 (aminokyseliny jsou označovány standardními jednopísmenovými kódy). Procento shody je potom vypočteno jako:

celkový počet shod_x 100 (délka delší sekvence plus počet mezer zavedených 20 do delší sekvence, aby byly obě sekvence srovnány)

Tabulka 3

	A	R	N	D	C	Q	E	G	Η I	L	K	M	F	P	S	T
A	4
R	-1	5
N	-2	0	6
D	-2	-2	1	6
C	0	-3	3	-3	9
Q	-1	1	0	0	-3	5
e	-1	0	0	2	-4	2	5
G	α	-2	0	-1	-3	-2	-2	6
K	-2	0	1	-1	-3	0	0	-2	8
1	-1	-3	-3	-3	-1	-3	-3	-4	-3	4
L	-1	-2	-3	-4	-1	-2	-3	-4	-3	2	4
K	-1	2	0	-1	-3	1	1	-2	-1	-3	-2	5
M	-1	-1	-2	-3	-t	0	-2	-3	-2	1	2	-1	5
F	-2	-3	-3	-3	-2	-3	-3	-3	-1	0	0	-3	0	6
P	-1	-2	-2	-1	-3	-1	-1	-2	-2	-3	-3	-1	-2	-4	7
s	1	-1	t	0	-1	0	0	0	-1	-2	-2	0	-1	-2	-1	4
T	0	-1	0	-1	-1	-1	-1	-2	-2	-1	-1	-1	-1	-2	-1	1	5
w	-3	-3	-4	-4	-2	-2	-3	-2	-2	-3	-2	-3	-1	1	-4	-3	-2
Y	-2	-2	-2	-3	-2	-1	-2	-3	2	-1	-1	-2	-1	3	-3	-2	-2
v	0	-3	-3	-3	-1	-2	-2	-3	-3	3	1	-2	1	-1	-2	-2	0

Sekvenční shoda polynukleotidových molekul je určována podobnými metodami za pomoci zlomku, který byl výše popsán.

V podstatě homo logické proteiny a polypeptidy jsou charakterizovány tím, že mají jednu nebo více aminokyselinových substitucí, delecí nebo adicí. Je výhodné, když jsou tyto změny v pod- 11 CZ 303272 B6 statě malé, tedy když se jedná o konzervativní aminokyselinové substituce (viz tabulka 4) a jiné substituce, které neovlivní významně prostorové uspořádání nebo aktivitu proteinu nebo póly peptidu; malé delece, typicky jedna na asi 30 aminokyselin; a malá prodloužení na aminovém nebo karboxyiové konci, jako je methioninový zbytek na aminovém konci, malý spojovací peptid až asi do 20 až 25 zbytků, nebo afinitní značka. Polypeptidy obsahující afinitní značky mohou dále obsahovat proteolytické štěpné místo mezi polypeptidem BR43x2 a afinitní značkou. Výhodná místa tohoto druhu zahrnují štěpná místa pro thrombin a štěpná místa faktoru Xa.

io Tabulka 4

Konzervativní aminokyselinové substituce

Zásadité: arginin i? lysin histidin

Kyselé: kyselina glutamová kyselina asparagová

Polární: glutamin asparagin

Hydrofobní: leucin isoleucin valin

Aromatické: fenylalanin tryptofan tyrosin

Malé: glycin alanin serin threonin meth i on i n

Vedle 20 standardních aminokyselin, mohou být za aminokyselinové zbytky polypeptidů BR43x2, které jsou předmětem tohoto vynálezu, substituovány nestandardní aminokyseliny (jako jsou 4—hydroxyprolin, 6—N-methyl lysin, kyselina 2-aminoisomáselná, isovalin a a-methylserin).

Omezené množství nekonzervativních aminokyselin, aminokyselin, které nejsou kódovány genetickým kódem a nepřirozených aminokyselin může být substituováno za aminokyselinové zbytky B43x2. Proteiny předloženého vynálezu mohou také obsahovat v přírodě se nevyskytující aminokyselinové zbytky.

Mezi tyto přirozeně se nevyskytující aminokyseliny patří mimo jiné trans-3-methylprolin, 2,4methanoprolin, cis 4-hydroxyprolin, trans-4-hydroxyprolin, N-methyIglycin, allo-threonin, methy lthreonin, hydroxyethylcystein, hydroxyethylhomocystein, nitroglutamin, homoglutamin,

- 12 CZ 303272 B6 kyselina pipekolová, kyselina thiazolídinkarboxylová, dehydroprolin, 3- a 4-mcthvlprolin, 3,3dimethylprolin, terc-leucin, norvalin, 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4—azafenylalanin a 4fluorofenylalanin. V oboru je známo několik metod pro zabudování těchto přirozeně se nevyskytujících aminokyselin do proteinů. Například může být použit in vitro systém, kde jsou nonsense mutace potlačeny pomocí supresorových tRNA, které byly připraveny chemickou aminoacylací. Metody pro syntézu aminokyselin a aminoacylací tRNA jsou v oboru známé. Transkripce a translace plazmidu, obsahujících nonsense mutace se provádí v bezbuněčných systémech, které obsahují extrakt E. coli S30 a komerčně dostupné enzymy a další reagencie. Proteiny jsou purifikovány pomocí chromatografie. Viz například Robertson a kol., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; io EUman a kol., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung a kol., Science 259: 806-9, 1993; a Chung a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 10 145-9, 1993). Ve druhé metodě je translace provedena v oocytech Xenopus a mutovaná mRNA spolu s aminoacylovanými supresorovými tRNA je do nich vpravena pomocí mikroinjekce (Turcatti a kok, J. Biol, Chem. 271: 19 991-8, 1996). Ve třetí metodě jsou buňky E. coli pěstovány v nepřítomnosti přirozené aminokyseliny, is která má být zaměněna (např. fenylalanin) a naopak v přítomnosti požadované, přirozeně se nevyskytující aminokyseliny (aminokyselin) (např. 2-azafenylalanin, 3-azafenylanin, 4-azafenylaianin a 4—fluorofenylalanin). Přirozeně se nevyskytující aminokyselina je zabudována do proteinu na místo svého přirozeného partnera. Viz Koide a kol., Biochem. 33: 7470-7476, 1994. Přirozeně se vyskytující aminokyselinové zbytky mohou být převedeny na přirozeně se nevysky20 tuj ící druhy pomocí chemické modifikace in vitro. Aby se dále rozšířil rozsah substitučních možností, může být chemická modifikace kombinována s místně cílenou mutagenezí (Wynn a Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993).

Omezený počet nekonzervativních aminokyselin, aminokyseliny, které nejsou kódovány genetic25 kým kódem, přirozeně se nevyskytující aminokyseliny a nepřirozené aminokyseliny mohou být substituovány za aminokyselinové zbytky BR43x2.

Podstatné aminokyseliny v polypeptidech BR43x2 předloženého vynálezu je možno zjistit pomocí postupů v oboru známých, jako je místně cílená mutageneze nebo mutageneze pomocí skeno30 vání alaninem (Cunningham a Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Jednotlivé alaninové mutace jsou vneseny na místo každého zbytku v molekule a výsledné mutované molekuly jsou testovány na svou biologickou aktivitu (např. způsobení snížení odpovědi B buněk v průběhu imunitní odpovědi, potlačení nebo snížení produkce autoprotilátek), aby byly určeny aminokyselinové zbytky, které jsou pro aktivitu molekuly kritické. Viz též HÍIton a kol., J. Biol. Chem. 271: 4699—

4708, 1996. Místa kde dochází k biologické interakci, oblasti které vážou ligand, jako jsou nedokonalá opakování bohatá na cystein, mohou být také určována pomocí analýzy fyzikální struktury, jako jsou techniky nukleární magnetická rezonance, krystalografie, elektronová difrakce nebo fotoafinitní značení, ve spojení s mutací aminokyselin na domnělém kontaktním místě. Viz například de Vos a kol., Science 255: 306-312, 1992; Smith a kol., J. Mol. Biol. 224: 899-904,

1 992; Wlodaver a kol., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Totožnost podstatných aminokyselin může být také odvozena z analýzy homologii s příbuznými členy rodiny TNFR, jako jsou TACÍ a BCMA.

Další aminokyselinové substituce mohou být prováděny uvnitř nedokonalých opakování boha45 tých na cystein u BR43x2, pokud konzervované zbytky cysteinu, kyseliny asparagové a leucinu jsou zachovány a struktura vyššího řádu není poškozena. Je výhodné provádět substituce uvnitř nedokonalých opakování bohatých na cystein u BR43x2 stím, že se vezmou v úvahu sekvence jiných na cystein bohatých nedokonalých opakování. Sekvence SEQ ID NO: 10 je zobecněné nedokonalé opakování bohaté na cystein, kde jsou ukázány povolené aminokyselinové substituce, založené na takovém porovnání. Substituce v této doméně podléhají omezením, která jsou zde uvedena.

Mnoho aminokyselinových substitucí může být provedeno a testování pomocí známých metod mutageneze a hromadného prohledávání, jak jsou například popsán v Reidhaar-Olson a Sauer (Science 241: 53-7, 1988) nebo Bowie a Sauer (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989).

- 13 CZ 303272 S6

Krátce řečeno, tito autoři popisují metody pro současné náhodné obsazení dvou nebo více pozic v polypeptidů, selekci funkčního polypeptidů a potom sekvenování mutovaných polypeptidů, pro určení spektra přípustných mutací na každé pozici. Jiné metody, které mohou být použity, zahrnují reprezentaci pomocí fága (např. Lowman a kol., Biochem. 30: 10 832-10 837, 1991; Ladner a kol., Patent US 5 223409; Huse, publikace WIPO 92/06 204) a mutagenezi cílenou do určité oblasti (Derbyshire a kol., Gene 46: 145, 1986; Ner a kol., DNA 7: 127, 1988).

Varianty popsaných BR43x2 DNA a polypeptidových sekvencí mohou být vytvořeny pomocí promíchávání DNA, jak bylo popsáno v Stemmer, Nátuře 370: 389-91, 1994, Stemmer, Proč. io Nati. Acad. Sci. USA 91: 10 747-51, 1994 a publikaci WIPO WO 97/20 078. Krátce řečeno, variantní DNA jsou vytvořeny in vitro homo logickou rekombinací pomocí náhodné fragmentace rodičovské DNA, po které následuje opětné uspořádáni pomocí PCR, což má za následek náhodně vnesené bodové mutace. Tato technika může být modifikována za použití rodiny rodičovských

DNA, jako jsou alelové varianty nebo DNA z různých druhů, aby byla do procesu vnesena další variabilita. Selekce nebo testování na požadovanou aktivitu, následované dalšími opakováními mutageneze a testování, umožňuje rychlou „evoluci“ sekvencí vybíráním požadovaných mutací, přičemž současně dochází k selekci proti nežádoucím změnám.

Metody mutageneze, které jsou zde výše popsány, mohou být spojeny s vysokou průchodností vzorků, automatizací prohledávacích metod při detekci aktivity klonovaných, mutovaných polypeptidů v hostitelských buňkách. Mutované DNA molekuly, které kódují aktivní polypeptidy (tj. takové, které způsobí snížení odpovědi B buněk v průběhu imunitní odpovědi, potlačení nebo snížení produkce autoprotilátek), mohou být z hostitelské buňky získány a rychle sekvenovány pomocí moderních zařízení. Tyto metody umožňují rychlé určení důležitosti jednotlivých amino25 kyselinových zbytků ve sledovaném polypeptidů a mohou být aplikovány na polypeptidy neznámé struktury.

Pomocí výše diskutovaných metod může osoba se zkušeností v oboru identifikovat a/nebo připravit množství rozmanitých polypeptidů, které jsou v podstatě homologické se zbytky 1 až 120 ze

3o sekvence SEQ ID NO: 2 nebo jejich alelové varianty a přitom zachovat supresorické vlastnosti standardního typu proteinu vůči B buňkám. Takové polypeptidy mohou obsahovat další aminokyseliny nebo domény z jiných členů vyšší rodiny receptorů faktoru nádorové nekrózy, afínitní značky nebo podobně. Polypeptidy BR43x2 nebo fúzní konstrukty, obsahující funkční domény jiných členů TNFR vyšší rodiny, tvoří hybridní receptory faktoru nádorové nekrózy, které vyka35 zují pozměněné schopnosti suprimovat B buňky.

Předložený vynález dále poskytuje funkční protějšky receptorů a polynukleotidů z jiných druhů (ortology). Tyto druhy zahrnují mimo jiné savce, ptáky, obojživelníky, plazy, ryby, hmyz a jiné druhy obratlovců a bezobratlých. Zvláště zajímavé jsou receptory BR43x2 z jiných savčích dru40 hů, včetně myších, vepřových, ovčích, hovězích, psích, kočičích, koňských a receptorů jiných primátů. Ortology lidského receptorů BR43x2 mohou být klonovány za použití informace a prostředků poskytnutých předloženým vynálezem ve spojení s běžnými klonovacími technikami. Například cDNA může být klonována za použití mRNA, získané ze tkáně nebo typu buňky, které receptor exprimuje. Vhodné zdroje mRNA mohou být určeny sondováním Northern blotů pomocí sond, navržených podle zde popsaných sekvencí, Z mRNA pozitivní tkáně nebo buněčné linie je potom připravena knihovna. cDNA kódující receptor může být potom izolována různými metodami, jako je sondování kompletní nebo částečné lidské cDNA pomocí jednoho nebo více souborů degenerovaných sond, založených na popsaných sekvencích. cDNA může být také klonována pomocí PCR, za použití primerů navržených podle zde popsaných sekvencí.

V rámci dalších metod může být cDNA knihovna použita pro transformaci nebo transfekci hostitelských buněk a exprese cDNA, o kterou se jedná, může být detekována pomocí protilátek proti receptorů. Podobné techniky mohou být také aplikovány na izolaci genomových klonů.

Polypeptidy receptorů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, včetně receptorových polypeptidů o plné délce, fragmentů polypeptidů a fúzních polypeptidů, mohou být produkovány v geneticky

-14CZ 303272 B6 upravených hostitelských buňkách pomocí běžně užívaných technik. Vhodnými hostitelskými buňkami jsou takové typy buněk, které mohou být transformovány nebo transfekovány exogenní DNA a pěstovány v kultuře a patří mezi ně bakterie, buňky hub a kultivované buňky vyšších eukaryot. Výhodné jsou eukaryotické buňky, zvláště kultivované buňky mnohobuněčných orga5 nizmů. Techniky pro manipulaci s molekulami klonované DNA a vnesení exogenní DNA do rozličných hostitelských buněk jsou popsány v Sambrook a kol., Molekulární klonování: Laboratorní příručka, 2. vyd,, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) a Ausubel a kol., vyd., Současné protokoly v molekulární biologii, John Wiley and Sons, lne., NY, 1987.

io Obecně řečeno, sekvence DNA kódující polypeptid BR43x2 je operačně vázána kjiným genetickým elementům, vyžadovaným pro její expresi v expresním vektoru, obecně se jedná o transkripční promotor a terminátor. Vektor bude také obecně obsahovat jeden nebo více selekčních markérů a jeden nebo více počátků replikace, třebaže osoby se zkušeností v oboru si uvědomí, že v určitých systémech mohou být selekční markéry poskytnuty na oddělených vektorech a replika15 ce vnější DNA může být zabezpečena integrací do genomu hostitelské buňky. Výběr promotorů, terminátorů, selekčních markérů, vektorů a jiných elementů je záležitostí návrhu v rámci běžné zkušenosti v oboru. Mnoho takových elementů je popsáno v literatuře a je dostupných od komerčních dodavatelů.

Pro nasměrování polypeptidů BR43x2 do sekreční dráhy hostitelské buňky je v expresním vektoru poskytnuta sekreční signální sekvence (také známá jako signální sekvence, leader sekvence, preprosekvence nebo presekvence). Sekreční signální sekvence může pocházet z polypeptidů BR43x2, nebo může být odvozena z jiného sekretovaného proteinu (např. t-PA) nebo může být syntetizována de novo. Sekreční signální sekvence je připojena k DNA sekvenci BR43x2 ve správném čtecím rámci a umístěna tak, aby řídila nově syntetizovaný polypeptid do sekreční dráhy hostitelské buňky. Sekreční signální sekvence jsou obecně umístěny ve směru 5' vzhledem k DNA sekvenci, kódující polypeptid, o který se jedná, třebaže určité sekreční signální sekvence mohou být umístěny jinde v DNA sekvenci, o kterou se jedná (viz např. Welch a kol., Patent US 5 037 743; Holland a kol., patent US 5 143 830).

V předloženém vynálezu jsou kultivované savčí buňky vhodnými hostiteli. Metody pro vnesení exogenní DNA do savčí hostitelské buňky zahrnují transfekci zprostředkovanou fosforečnanem vápenatým (Wigler a kol., Cell 14: 725, 1978; Corsaro a Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham a Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), elektroporaci (Neumann a kol., EMBO J.

1: 841-845, 1982), transfekci zprostředkovanou DEAE—dextranem (Ausubel a kol., vyd., Současné protokoly v molekulární biologii, John Wiley and Sons, lne., NY 1987) a transfekci zprostředkovanou liposomy (Hawley-Nelson a kol., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone a kok, Focus 15: 80, 1993). Produkce rekombinantních polypeptidů v kultivovaných savčích buňkách je popsána například v Levinson a kok, patent US 4 713 339; Hagen a kok. Patent US 4 784 950; Palmiter a kok, Patent US 4 579 821 a Ringold a kok, Patent US 4 656 950. Vhodné kultivované savčí buňky zahrnují buněčné linie COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No., CRL 10 314), 293 (ATCC No. CRL 1573); Graham a kok, J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977), Jurkat (ATCC No. CRL-8129), BF3 (prelymfoidní buněčná linie, závislá na interleukinu—3, odvozená z kostního morku myší. Viz Palacíos a Steimetz, Cell 42: 727-34, 1985; Matchey-Prevot a kok, Mok Cell. Biol. 6: 4133-5, 1986) a buněčnou linii odvozenou z vaječníků čínského křečka (např. CHO-K1; (ATCC No. CCL 61).

V oboru jsou známy další vhodné buněčné linie a jsou dostupné ve veřejných sbírkách, jako je americká sbírka typových kultur, Rockville, Maryland. Obecně jsou preferovány silné transkripční promotory, jako jsou promotory z SV40 nebo cytomegaloviru. Viz např. patent US 4 956 288.

Jiné vhodné promotory zahrnují promotory z metallothioneinových genů (patenty US 4 579 821 a 4 601 978) a velký pozdní promotor adenoviru.

Selekce pomocí léků se obecně používá pro selekci těch kultivovaných savčích buněk, do nichž byla vložena cizí DNA. Takové buňky jsou obecně označovány jako „transfekované“. Buňky, které byly kultivovány v přítomnosti selekčního činidla ajsou schopny přenést gen o který se jed- 15 CZ 303272 B6 ná, do svého potomstva, jsou označovány jako „stabilně transfekované“. Výhodným selekčním markérem je gen kódující rezistenci k antibiotiku neomycin. Selekce je provedena v přítomnosti léku neomycínového typu, jako je G—418 nebo podobně. Selekční systémy je možno také použít pro zvýšení expresní hladiny genu o který se jedná, v procesu nazývaném „amplifikace“. Ampli5 llkace je provedena pěstováním transfekovaných buněk v přítomnosti nízkých hladin selekčního činidla a poté zvýšením množství selekčního činidla, aby došlo k selekci buněk, které produkují vysoké úrovně produktů vnesených genů. Výhodným amplifikačním selekčním markérem je reduktáza kyseliny dihydrolistové, která způsobuje rezistenci k methotrexátu. Také mohou být použity jiné geny rezistence k lékům (např. rezistence k hygromycinu, rezistence kviče lékům, ío acetyltransferáza puromycinu). Alternativní markéry, které navozují změněný fenotyp, jako je zelený fluoreskující protein, nebo proteiny buněčného povrchu jako CD4, CD8, MHC třídy 1, alkalická fosfatáza z placenty, mohou být použity pro roztřídění transfekovaných buněk od netransfekovaných, takovými způsoby jako separační technologie FACS nebo pomocí magnetických zrnek.

Jako hostitelské buňky mohou být také použity buňky jiných vyšších eukaiyot, včetně rostlinných buněk, hmyzích buněk a ptačích buněk. Použití Agrobacterium rhizogenes jako vektoru pro expresi genů v rostlinných buňkách bylo přehledně zpracování v Sinkar a kol., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987. Transformace hmyzích buněk a produkce cizích polypeptidů v nich je popsána v Guarino a kol., patent US 5 162 222 a v publikaci WIPO WO 94/06463. Hmyzí buňky mohou být infikovány rekombinantním bakulovirem, obecně odvozeným z viru nukleární polyhedrózy Autographa californica (AcNPV). Viz King a Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Halí; O'Reilly a kol., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; a Richardson, vyd.

Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Druhá metoda přípravy rekombinantního BR43x2 bakuloviru využívá systém založený na transpozonu a popsaný Luckowem (Luckow a kol., J. Virol. 67: 4566-79, 1993). Tento systém, který využívá přenašeči vektory, je prodáván v soupravě Bac-to-Bac™ (Life Technologies, Rockville, MD). Tento systém využívá přenášecí vektor pFastBac 1™ (Life Technologies), obsa30 hující transpozon Tn7, aby přenesl DNA kódující polypeptid BR43x2 do genomu bakuloviru, který je udržován v E. coli jako velký plazmid nazývaný „bacmid“. Viz Hill-Perkins a Possee, J. Gen. Virol. 71: 971-6, 1990; Bonning a kol., J. Gen. Virol. 75:1551-6, 1994; a Chazenbalk a Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543-9, 1995. Přenášecí vektory mohou dále obsahovat na Ckonci nebo N-konci exprimovaného polypeptidů BR43x2 ve čtecím rámci fúzovanou DNA kódující epitopovou značku, například epitopovou značku Glu-Glu (Grussenmeyer a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985). Za použití techniky známé v oboru, je přenášecí vektor, obsahující BR43x2, transformován do E. coli aje provedena selekce na bacmidy, obsahující přerušený gen lacZ, což je známkou přítomnosti rekombinantního bakuloviru. DNA bacmidu, který obsahuje genom rekombinantního bakuloviru je izolována pomocí běžných technik, a použita k transfekci buněk Spodoptera frugiperda, např. buněk Sf9. Následně je produkován rekombinantní virus, který exprimuje BR43x2. Zásobní rekombinantní virus je připraven pomocí v oboru běžně používaných postupů.

Rekombinantní virus je použit k infekci hostitelských buněk, obyčejně buněčné linie odvozené z vojnice podzimní, Spodoptera frugiperda. Obecně viz Glick a Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Application of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Jinou vhodnou buněčnou linií je buněčná linie High FiveO™ (Invitrogen), odvozená zTrichoplusia ni (patent US 5 300 435). Pro růst a udržování buněk jsou používána komerčně dostupná média bez séra. Vhodnými médii pro buňky Sf9 jsou Sf900 II™ (Life Technologies) nebo ESF

921™ (Expression Systems); a pro buňky T. ni Ex-celIO405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) nebo Express Five O™ (Life Technologies). Buňky jsou pěstovány z hustoty naočkování, kteráje přibližně 2 až 5x10’ buněk, na hustotu 1 až 2xl0⁶ buněk, a v této době je přidán stok rekombinantního viru s multiplicitou infekce (MOI) 0,1 až 10, typicky okolo 3. Používané postupy jsou obecně popsány v dostupných laboratorních manuálech (King a Possee, The Baculovirus Expres55 sion System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Halí; O'Reilly a kol., Baculovirus

- 16CZ 303272 B6

Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; a Richardson, vyd. Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995). Následné purifikace polypeptidu BR43x2 ze supematantu může být dosaženo zde popsanými metodami.

Buňky hub, včetně kvasinkových buněk, mohou také být použity v rámci předloženého vynálezu. Druhy kvasinek v tomto ohledu zvláště zajímavé zahrnují Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris a Pichia methanolica. Metody pro transformování buněk S. cerevisiae exogennt DNA a produkování rekombinantních polypeptidů v nich jsou popsány například v Kawasaki, patent US 4 599 311; Kawasaki, patent US 4 931 373; Brake, patent US 4 870 008; Welch a kol., patent US 5 037743;a Murray a kol, patent US4 845 075. Transformované buňky jsou vybrány podle fenotypů určeného selekčním markérem, obyčejně rezistence k léku nebo schopnost růst v nepřítomnosti určité živiny (např. leucin). Výhodný vektorový systém pro použití u Saccharomyces cerevisiae je vektorový systém POTÍ popsaný v Kawasaki a kol., (Patent US 4 931 373), který umožňuje, aby byly transformované buňky selektovány růstem v médiu obsahujícím glukózu. Promotory a terminátory vhodné pro použití u kvasinek zahrnují promotory a terminátory od genů glykolytických enzymů (viz. např. Kawasaki, patent US 4 599 311; Kingsman a kok, Patent US 4 615 974; a Bitter, Patent US 4 977 092) a genů pro alkoholdehydrogenázu. Viz také patenty US 4 990 447; 5 063 154; 5 139 936 a 4 661 454. Transformační systémy pro jiné kvasinky, včetně Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondíi aCandida maltosa jsou v oboru známé. Viz například Gleeson a kok, J. Gen. Microbiok 132; 3459-3465, 1986 a Cregg, patent US 4 882 279. Buňky Aspergillus mohou být použity podle metod McKnight a kok, patent US 4 935 349. Metody pro transformování Acremonium chrysogenum jsou popsány v Sumino a kok, patent US 5 162 228. Metody pro transformování Neurosporajsou popsány v Lambowitz, patent US 4 486 533.

Například použití Pichia methanolica jako hostitele pro produkování rekombinantních proteinů je popsáno v Raymond, patent US 5 716 808, Raymond, patent US 5 736 383, Raymond, Yeast 14: 11-23, 1998 a mezinárodních publikacích WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02526 a WO 98/02565. Molekuly DNA používané při transformování P. methanolica budou běžně připravovány jako dvouřetězcové, kruhové plazmidy, které jsou s výhodou před transformací línearizovány. Pro produkci polypeptidu v P. methanolica je výhodné, když promotor a terminátor v plazmidu bude pocházet z genu P. methanolica, jako je P. methanolica gen pro využívání alkoholu (AUG1 nebo AUG2). Jiné užitečné promotory zahrnují promotory z genů dihydroxyacetonsyntházy (DHAS), dehydrogenázy kyseliny mravenčí (FMD) a katalázy (CAT). Pro usnadnění integrace DNA do hostitelského chromozomu je výhodné, mít úplný expresní segment v plazmid ohraničen na obou koncích sekvencemi hostitelské DNA. Výhodný selekční markér pro použití v Pichia methanolica je P. methanolica gen ADE2, který kóduje karboxyíázu fosforibozyl-5aminoimidazolu (AIRC; EC 4.1.1.21), která umožňuje hostitelským buňkám ade2 růst v nepřítomnosti adeninu. Pro velkoobjemové, průmyslové procesy, kde je žádoucí minimalizovat použití methanolu, je výhodné použít hostitelské buňky, u kterých byly oba geny pro využití methanolu (AUG1 a AUG2) odstraněny. Pro produkci sekretovaných proteinů jsou výhodné hostitelské buňky postrádající geny vakuolámí proteázy (PEP4 a PRB1). Elektroporace se používá pro usnadnění vnášení plazmidu, obsahujícího DNA kódující polypeptid o který se jedná, do buněk

P. methanolica. Je výhodné transformovat buňky P. methanolica elektroporaci pomocí exponenciálně klesajícího, pulzujícího elektrického pole o napětí od 2,5 do 4,5 kV/cm, s výhodou asi

3,75 kV/cm s časovou konstantou (t) od 1 do 40 milisekund, nejvýhodněji asi 20 milisekund.

Prokaryotické hostitelské buňky, včetně kmenů bakterií Escherichia coli, Bacillus a jiných rodů, jsou také vhodnými hostitelskými buňkami v předloženém vynálezu. Techniky pro transformování těchto hostitelů a expresi cizorodých sekvencí DNA v nich klonovaných, jsou v oboru dobře známé (viz např. Sambrook a kok, Molekulární klonování: Laboratorní příručka, 2. vyd., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) a). Když je exprimován polypeptid BR43x2 v bakteriích jako jsou E, coli, polypeptid může být zadržován v cytoplazmě, typicky ve formě

- 17CZ 303272 B6 nerozpustných granulí, nebo může být směrován do periplazmatického prostoru působením bakteriální sekreční sekvence. V prvém případě jsou buňky lyžovány, granule získány a denaturovány pomocí například isothiokyanátu nebo močoviny. Denaturovaný polypeptid potom může být znovu sestaven a dimenzován zředěním denaturačního činidla, třeba dialýzou proti roztoku močoviny a kombinací redukovaného a oxidovaného glutathionu, následovanou dialýzou proti pufrovanému fyziologickému roztoku. Ve druhém případě může být polypeptid získán z periplazmatického prostoru v rozpustné a funkční formě tím, že buňky jsou rozrušeny (například pomocí sonikování nebo osmotickým šokem), aby se uvolnil obsah periplazmatického prostoru a získal protein, tímto je vyloučena potřeba denaturování a opětného sestavování.

Transformované a transfekované hostitelské buňky jsou pěstovány podle běžných postupů v kultivačním médiu, obsahujícím živiny a jiné složky potřebné pro růst vybraných hostitelských buněk. V oboru je znám široký výběr vhodných médií, včetně definovaných a komplexních médií; média běžně zahrnují zdroj uhlíku, zdroj dusíku, základní aminokyseliny, vitamíny a milí nerály. Média mohou také obsahovat, pokud je to vyžadováno, takové složky jako růstové faktory nebo sérum. Růstové médium bude obecně selektovat buňky, obsahující exogenně přidanou

DNA, například pomocí selekce léky nebo nedostatkem základní živiny, která je doplňována selekčním markérem, neseném na expresním vektoru nebo společně transfekovaným do hostitelské buňky. Buňky P. methanolica jsou pěstovány v médiu obsahujícím odpovídající zdroje uhlíku, dusíku a stopové živiny pri teplotě 25 až 35 °C. Tekutým kulturám je poskytováno dostatečné vzduchování běžnými způsoby, jako je třepání v malých lahvích nebo rozstřikováním ve fermentorech. Výhodné kultivační médium pro P. methanolica je YEPD (2% D-glukóza, 2% Bacto Pepton (Difco Laboratories, Detroit, Ml), 1% kvasničný extrakt Bacto™ (Difco Laboratories), 0,004% adenin a 0,006% L-leucin).

Exprimované rekombinantní polypeptidy BR43x2 (nebo chimemí či fúzní polypeptidy BR43x2) mohou být čištěny pomocí frakcionačních a/nebo běžných purifikačních metod a prostředků. Je výhodné poskytnout proteiny nebo polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, ve vysoce purifikované formě, tj. ve více než 95% čistotě, výhodnější je ve více než 99% čistotě.

Pro frakcionaci vzorků může být použito srážení síranem amonným a kyselá nebo chaotropní extrakce. Příklady purifikačních kroků mohou zahrnovat hydroxyl apatit, dělení podle velikosti, FPLC a HPLC reverzní fáze. Vhodné chromatografické prostředky vyměňující anionty zahrnují deriváty dextranů, agarózu, celulózu, polyakrylamid, speciálně upravený oxid křemičitý a podobně. Výhodné jsou PEI, DEAE, QAE a Q deriváty, přičemž zvláště výhodná je DEAE Fast-Flow

Sepharose (Pharmacia, Pistcataway, NJ). Příklady chromatografických prostředků zahrnují ty, které jsou derivovány fenylovou, butylovou nebo oktylovou skupinou, jako je Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) a podobně; nebo polyakrylové pryskyřice, jako je Amberchrom CG 71 (Toso Haas) a podobně. Vhodnými pevnými podpůrnými médii jsou skleněná zrnka, pryskyřice založené na oxidu křemičitém, celulózové pryskyřice, zrna agarózy, sesíťovaná zrna agarózy, polystyrénová zrna, sesíťované polyakrylamidové pryskyřice a podobné, které jsou nerozpustné za podmínek, za kterých budou používány. Tato podpůrná média mohou být modifikována pomocí reaktivních skupin, které umožňují připojení proteinů aminoskupinami, karboxylovými skupinami, sulfhydrylovými skupinami, hydroxylovými skupinami a/nebo cukernými složkami. Příklady chemických postupů, vhodných pro připojení, zahrnují aktivaci bromkyanem, aktivací N-hydroxysukinimidem, epoxidovou aktivaci, sulfhydrylovou aktivaci, aktivaci hydrazidem a karboxylové a aminové deriváty pro karbodiimidový chemický postup připojení. Tato a jiná pevná média jsou dobře známa a v oboru široce používána a jsou dostupná od komerčních dodavatelů. Metody pro vazbu polypeptidových receptorů na podkladová média jsou v oboru dobře známy. Výběr určité metody je záležitostí rutinního návrhu a je určen částečně vlastnostmi vybraného podkladového média. Viz například Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988.

Polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být izolovány za využití jejich íýzi55 kálních vlastností. Například chromatografíe absorpcí na i mobilizovaných iontech kovů (IMAC)

- 18 CZ 303272 B6 může být použita pro čištění proteinů bohatých na histidin, včetně těch, které obsahují polyhistidinové značky. Krátce řečeno, gel je napřed nasycen ionty dvojmocných kovů, aby se vytvořil chelát (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985). Proteiny bohaté histidinem se budou adsorbovat na tuto základní hmotu s různými afinitami, závisejícími na použitém kovovém iontu a budou eluovány kompetitivní elucí, snižováním pH nebo použitím silných chelatačních činidel., Další metody čištění zahrnují čištění glykozylovaných proteinů afinitní chromatografii na lektinech a chromatografii výměny iontů (Methods in Enzymol., sv. 182, „Guide to Protein Purification“, M. Deutscher, (vyd.), Acad. Press, San Diego, 1990, str. 529 až 39). V jiných provedeních vynálezu mohou být, pro usnadnění čištění, konstruovány fúze polypeptidu o který se jedná, io s afínitními značkami (např. s proteinem, který váže maltózu, se značnou FLAG (Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (SEQ ID NO: 13)), Glu-Glu značkou (Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu (SEQ ID NO: 14)), nebo s doménami imunoglobulinu).

S výhodou mohou být použity postupy pro opětné prostorové uspořádání proteinu (popřípadě is reoxidace). Je výhodné čistit proteiny do >80% čistoty, výhodněji do >90% čistoty, ještě výhodněji do >95% čistoty a zvláště výhodný je farmaceuticky čistý stav, tj. vyšší než 99,9% čistota, pokud se týká kontaminujících makromolekul, zvláště jiných proteinů a nukleových kyselin, a zbavený infekčních a pyrogenních činidel. Je výhodné, když je čištěný protein v podstatě zbavený jiných proteinů, zvláště jiných proteinů živočišného původu.

Polypeptidy BR43x2 nebo jejich fragmenty mohou být také připraveny pomocí chemické syntézy. Polypeptid BR43x2 mohou být monomery nebo multimery; glykozylované nebo neglykozylované; pegylované nebo nepegylované; a mohou nebo nemusí obsahovat počáteční methioninový aminokyselinový zbytek. Příklady polypeptidů BR43x2 zahrnují polypeptidy o délce 32 až 40 zbytků, jejichž aminokyselinová sekvence odpovídá motivu: XXCX[QEK] [QEKNRDHSj [QE] X {0-2} [YFW] [YFW] DXLLX {2} C [IMLV] XCX {3} CX {6-8} CX {2} [YF] CXX (SEQ ID NO: 10), a podléhá zde popsaným omezením.

Polypeptidy BR43x2 mohou být syntetizovány výlučně syntézou na pevné fázi, metodami částeč30 ně pevné fáze, kondenzací fragmentů nebo klasickou syntézou v roztoku. Polypeptidy jsou s výhodou připraveny pomocí syntézy peptidů na pevné fázi, popsané například v Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963. Syntéza je prováděna s aminokyselinami, kteréjsou na a-aminoskupině konci chráněny. Aminokyseliny se třemi funkčními skupinami s labilními postranními řetězci jsou také chráněny pomocí vhodných skupin, aby bylo zabráněno probíhání nežádoucích chemických reakcí v průběhu sestavování polypeptidů. Skupina chránící α-aminoskupinu je selektivně odstraněna, aby se mohla uskutečnit na aminovém konci následující reakce. Za podmínek, kdy dochází k odstranění skupiny chránící α-aminoskupinu, nedochází k odstranění chránících skupin na postranním řetězci.

Skupiny chránící α-aminoskupinu jsou ty, o kterých je známo, že jsou vhodné v oboru postupné syntézy polypeptidů. Zahrnuty jsou chránící skupiny typu acylu (např. formyl, trifluoracetyl, acetyl), chránící skupiny typu arylu (např. biotinyl), chránící skupiny typu aromatického uretanu (např. benzy loxy karbonyl (Cbz), substituovaný benzy loxy karbonyl a 9-fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc)), chránící skupiny typu alifatického uretanu (např. t-buty loxy karbo nyl (tBoc), isopropyloxykarbonyl, cyklohexyloxykarbonyl) a chránící skupiny typu alkylu (např. benzyl, trifenylmethyl). Výhodnými chránícími skupinami jsou tBoc a Fmoc.

Vybrané chránící skupiny postranních řetězců musí zůstat v průběhu slučování nedotčené a nesmí být odstraněny v průběhu odstraňování skupiny chránící na aminovém konci nebo za podmínek slučování. Skupiny chránící na postranních řetězcích musí být také odstranitelné po kompletním dokončení syntézy a za použití takových reakčních podmínek, při kterých nedojde ke změně ukončeného polypeptidu. Při procesu používajícím tBoc jsou chránící skupiny postranních řetězců, pro aminokyseliny se třemi funkčními místy, založeny převážně na benzy lu. Při procesu používajícím Fmoc jsou založeny převážně na terc-butylu nebo tritylu.

- 19CZ 303272 B6

Při procesu používajícím tBoc jsou výhodné tyto chránící skupiny postranních řetězců: tosyl pro arginin, cyklohexyl pro kyselinu asparagovou, 4—methyl benzyl (a acetamidomethyl) pro cystein, benzyl pro kyselinu glutamovou, serin a threonin, benzy loxy methyl (a dinitrofenyl) pro histidin,

2-C l-benzy loxy karbonyl pro lysin, formyl pro tryptoťan a 2-brombenzyl pro tyrosin. Pri procesu používajícím Fmoc jsou výhodné tyto chránící skupiny postranních řetězců: 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) nebo 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf) pro arginin, trityl pro asparagin, cystein, glutamin a histidin, terc-butyl pro kyselinu asparagovou, kyselinu glutamovou, serin, threonin a tyrosin, tBoc pro lysin a tryptofan.

io

Pro syntézu fosfory lovaných peptidů se používá zabudování fosfátové skupiny buď přímo při sestavování nebo až po sestavení peptidu. Při použití strategie přímého zabudování mohou být fosfátové skupiny šeřinu, threoninu nebo tyrosinu chráněny pomocí methylu, benzy lu nebo tercbutylu v procesu používajícím Fmoc, nebo pomocí methylu, benzylu nebo fenylu v procesu po15 užívajícím tBoc. V procesu používajícím Fmoc může také být použito přímé zabudování fosfotyrosinu bez chránění fosfátové skupiny. Při použití strategie zabudování fosfátové skupiny až po sestavení peptidu, jsou na pevné fázi vytvořeny deriváty nechráněných hydroxylových skupin šeřinu, threoninu nebo tyrosinu pomocí di-terc-butylfosforamiditu, dibenzylforamiditu nebo dimethyl“N,N'-diisopropylťosforamiditu a potom oxidovány terc-butylhydroperoxidem.

Syntéza na pevné fázi je obyčejně prováděna do karboxylové ho konce připojováním aminokyselin schráněnou α-aminoskupinou (s chráněným postranním řetězcem) ke vhodnému pevnému podkladu. Esterová vazba se vytvoří, když se provede připojení k pryskyřici s chlormethylovými, chlortritylovými nebo hydroxymethylovými skupinami a výsledný polypeptid bude mít volnou karboxylovou skupinu na C-konci. Jinou možností je použití amidové pryskyřice jako je benzhydrylaminová nebo p-methylbenzhydíylaminová pryskyřice (v procesu používajícím tBoc) anebo Rink amid nebo PAL pryskyřice (v procesu používajícím Fmoc), kdy se tvoří amidová vazba a výsledný polypeptid bude mít karboxyamidovou skupinu na C-konci. Tyto pryskyřice, ať založené na polystyrenu, polyamidu nebo polyethylenglykolu, s linkerem nebo bez linkeru, s připojenou první aminokyselinou nebo nikoli, jsou komerčně dostupné a jejich příprava byla popsána Stewardem a kol,, „Syntéza peptidů na pevné fázi“ (2. vydání), (Pierce Chemical Co., Rockfod, IL, 1984) a v Bayer a Rapp, Chem. Pept. Prot, 3: 3, 1986; a v Atherton a kok, Syntéza peptidů na pevné fázi: praktický přístup, IRL Press, Oxford, 1989.

C-koncová aminokyselina, pokud je to nezbytné s chráněným postranním řetězcem, a s chráněnou α-aminoskupinou, je připojena k hydroxymethylované pryskyřici pomocí různých aktivačních činidel, jako jsou dicyklohexylkarbodiimid (DC C), Ν,Ν'-diisopropylkarbodtimid (DIPCDI) a karbonylimidazol (CDI). Může být připojena k chlormethylované nebo chlortritylované pryskyřici přímo ve formě své cesium tetramethylamoniové soli nebo v přítomnosti triethyíaminu (TEA) nebo d i isopropy lethylam inu (DIEA). Připojení první aminokyseliny k amidované pryskyřici je stejné jako tvorba amidové vazby během slučování.

Po připojení k pryskyřici je chránící skupina α-aminoskupinou odstraněna pomocí různých reagencí, v závislosti na používaném chemismu chránících skupin (např. tBoc, Fmoc). Rozsah odstranění Fmoc může být monitorován při 300 až 320 nm nebo pomocí buňky na měření vodivosti. Po odstranění skupiny chránící α-aminoskupinu jsou zbývající chráněné aminokyseliny postupně připojovány v požadovaném pořadí, aby byla získána žádaná sekvence.

Pro připojovací reakce mohou být používána různá aktivační činidla, jako jsou DCC, DIPCDI, hexafluorfosforečnan 2-chlor-l,3-dimethylimidia (CIP), hexafluorfosforečnan benztriazol-1yl-oxy-tris-( dimethy lam i no) fosfonia (BOP) a jeho pyrrolidinový analog (PyBOP), hexafluorfosforečnan brom-tris-pyrrolidinfosfonia (PyBrOP), hexafluorfosforečnan O-(benzotriazol-lyl)-l,l,3,3-tetramethyluronia (HBTU) a jeho tetrafluorborátový analog (TBTU) nebo jeho pyrrolidinový analog (HBPyU), hexafluorfosforečnan O-(azabenztriazol- 1-y 1)-1,1,3,3-tetra-20CZ 303272 B6 methyluronia (HATU) ajeho tetrafluorborátový analog (TÁTU) nebo jeho pyrrol idinový analog (HAPyU). Nejběžnější katalytické přísady používané pro připojovací reakce zahrnují 4-ditnethylaminopyridin (DMAP), 3-hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-l,2.3-benztriazin (HODhbt), Nhydrnxvhenztriazol (HOBt) a l-hydroxy~7-azabenztriazol (HOAt). Každá chráněná amino5 kyše li na je použita v nadbytku (>2,0 ekvivalenty) a sloučení je obyčejně provedeno v N-methylpyrrolidonu (NMP) nebo v DMF, CH₂C1₂ nebojejich směsích. Do jaké míry proběhla připojovací reakce může být v každém stádiu monitorováno, např. pomocí ninhydrinové reakce, jakje popsáno v Kaiser a kol., Anal Biochem. 34: 595, 1970.

io Po úplném sestavení žádaného peptidu je komplex peptid-pryskyřice štěpen reakčním činidlem s vhodnými čisticími přísadami. Fmoc peptidy jsou obvykle štěpeny a zbaveny chránících skupin pomocí TFA s čisticími přísadami (např. H₂O, ethandithiol, fenol a thioanisol). tBoc peptidy jsou obvykle štěpeny a zbaveny chránících skupin pomocí tekutého HF po dobu 1 až 2 hodiny při -5 až 0 °C, který odštěpuje polypeptid od pryskyřice a odstraňuje většinu chránících skupin z post15 ranních řetězců. Čisticí přísady, jako je ani sol, dimethy 1 sulfid a p-thiokresol, jsou obvykle používány spolu s tekutým HF, aby zabránily kationtům vytvářeným v průběhu odštěpování, aby alkylovaly a acylovaly aminokyselinové zbytky přítomné v polypeptidů. Formylová skupina tryptofanu a dinitrofenylová skupina histidinu musí být odstraněny pomocí piperidinu respektive thiofenylu v DMF, před odštěpováním HF. Acetamidomethylová skupina cysteinu může být odstra2o něna octanem rtuťnatým, popřípadě jodem, trifluoroctanem thalitým nebo tetrafluorborátem stříbrným, které současně oxidují cystein na cystin. Jinými silnými kyselinami používanými pro odštěpování peptidů tBoc a odstraňování chránících skupin jsou kyselina trifluormethansulfonová (TFMSA) a trifluoracetát trimethylsilylu (TMSOTf).

Předložený vynález dále poskytuje další rozmanité fúzní polypeptidy a podobné multimerní proteiny, které obsahují jeden nebo více fúzních polypeptidů. Rozpustné polypeptidy BX43x2, TACÍ a BCMA mohou být exprimovány jako fúze s konstantní oblastí těžkého řetězce imunoglobulinu, typicky s Fc fragmentem, který obsahuje dvě konstantní domény a postrádá variabilní oblast. Metody pro přípravu takových fúzí jsou popsány v patentech US 5 155 027 a 5 567 584. Takové fúze jsou typicky sekretovány jako multimerní molekuly, ve kterých jsou Fc části vzájemně vázány disulfidickými vazbami a dva non-Ig polypeptidy jsou uspořádány ve vzájemné těsné blízkosti. Polypeptidové fuze imunoglobulin-BR43x2 (TACÍ nebo BCMA) mohou být exprimovány v buňkách geneticky upravených tak, aby produkovaly rozmanité multimerní analogy BR43x2. K polypeptidům BR43x2 (TACÍ nebo BCMA) mohou být fúzovány pomocné domény, aby je nasměrovaly na specifické buňky, tkáně nebo makromolekuly. Stejným způsobem, jak je zde diskutováno, mohou být také vytvořeny fúze za pomoci toxinů. Tímto způsobem mohou být polypeptidy a proteiny zaměřeny pro terapeutické nebo diagnostické úěely. Polypeptid BR43x2 může být fúzován se dvěma nebo více složkami, jako je afinitní značka pro purifikaci a cílová doména. Fúzní polypeptidy také mohou obsahovat jedno nebo více štěpných míst, zvláště mezi doménami. Viz Tuan a kol., Connect. Tiss. Res. 34: 1-9, 1996. Fúze tohoto typu může být také použita, například, pro afinitní purifikaci příbuzných ligandů z roztoku, jako nástroj v in vitro testu, pro blokování signálů in vitro specifickým titrováním ligandů, pro vazbu ligandů na buněčném povrchu nebo jako antagonisty BR43x2 in vitro, kdy jsou podány aby blokovaly stimulaci ligandů. Pro použití v pokusech mohou být fúzní proteiny vázány k podkladu pomocí F_c oblasti a použity v testu ELISA.

Vynález také poskytuje rozpustné BR43x2 receptory a fragmenty polypeptidů, použité pro vytváření fúzních proteinů s afinitními značkami nebo označeními. Rozpustné BR43x2 fúzní proteiny s afinitními značkami se používají například pro identifikaci BR43x2 ligandů a rovněž ago50 nistů a antagonistů přirozeného ligandu. Při použití značeného, rozpustného BR43x2 je možno identifikovat buňky, které exprimují ligand, agonisty nebo antagonisty, pomocí fluorescenční imunocytometrie nebo imunohistochemie. Rozpustné fúzní proteiny jsou užitečné při studiu distribuce ligandu na tkáních nebo specifických buněčných liniích a pro získání hlubšího pohledu na biologii vztahu receptor/ligand.

-21 CZ 303272 B6

Při purifikaci ligandu, agonistů nebo antagonistů je fúzní protein BR43x2-lg přidán ke vzorku obsahujícímu ligand, agonistů nebo antagonistů, za podmínek které usnadňují vazbu receptorligand (typicky za teploty, pH a iontové síly které jsou blízké fyziologickým hodnotám). Komplex receptor-ligand je potom oddělen ze směsi pomocí proteinu A, který je připevněn k pev5 nému podkladu (např. nerozpustná zrna pryskyřice). Ligand, agonista nebo antagonista jsou potom vymyty za použití běžných chemických technik, jako jsou solný nebo pH gradient. Alternativně může být samotný fúzní protein připevněn k pevnému podkladu a vazba a eluce jsou provedeny, jak bylo výše popsáno. Metody pro připevnění polypeptidů receptorů k pevnému podkladu, jako jsou zrna agarózy, sesíťovaná agaróza, sklo, celulózové pryskyřice, pryskyřice založené io na oxidu křemičitém, polystyrén, sesíťovaný polyakrylamid nebo podobné materiály, které jsou stabilní za podmínek použité, jsou v oboru známé. Metody pro vazbu polypeptidů k pevnému podkladu jsou v oboru známé a zahrnují využití aminů, aktivaci bromkyanem, aktivaci Nhydroxysukcinimidem, epoxidovou aktivaci, sulfhydrylovou aktivaci a aktivaci hydrazidem. Výsledná média budou obecně uspořádána ve formě sloupce, a tekutiny obsahující ligand prochá15 zejí sloupcem jednou nebo vícekrát, aby bylo ligandu umožněno se navázat na polypeptid receptoru. Ligand je potom vymyt pomocí změn v koncentraci soli, chaotropních činidel (MnCb) nebo pH, aby došlo k přerušení vazby ligand-receptor.

Aby byl usměrněn export rozpustného receptorů z hostitelské buňky, je DNA rozpustného receptorů připojena k druhému DNA segmentu, který kóduje sekreční peptid, jako je například tPA sekreční peptid. Aby byla usnadněna purifikace sekreto vaně receptorové domény, může být k polypeptidů receptorů fúzováno prodloužení na N- nebo C-konci, jako je afinitní značka nebo jiný polypeptid nebo protein, pro něž je k dispozici protilátka nebo jiné specificky se vázající činidlo.

Buňky exprimující funkční rozpustné a na membránu vázané receptory, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou používány ve vyhledávacích testech. V oboru jsou známy různé vhodné testy. Tyto testy jsou založeny na detekci biologické odpovědi v cílové buňce. Změny v metabolizmu ve srovnání s kontrolní hodnotou jsou známkou testované sloučeniny, která moduluje metabolizmus zprostředkovaný BR43x2. Jedním takovým testem je test buněčného množení.

Buňky jsou pěstovány v přítomnosti nebo v nepřítomnosti testované sloučeniny a buněčné množení je detekováno například měřením inkorporace thymidinu označeného tritiem, nebo kolorimetrickým testem založeným na metabolickém štěpení bromidu 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-difenyltetrazolia (MTT) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983). Alternativní formát testu používá buňky, které jsou dále geneticky upraveny, aby exprimovaly reportérovy gen. Reportérový gen je vázán k promotorovému elementu, ktefy reaguje na biochemickou dráhu vázanou na receptor, a test tedy detekuje aktivaci transkripce reportérového genu. V oboru je známo množství reportérových genů, které se v buněčných extraktech snadno testují, například

E. coli facZ, chloramfenikol acetyltransferáza (CAT) a element odpovědi na sérum (SRE) (viz např. Shaw a kol., Cell 56: 563-72, 1989). Takovým výhodným reportérovým genem je luciferázový gen (de Wet a kol., Mol. cell. Biol. 7: 725, 1987). Exprese tuciferázového genu je detekována luminiscenčně pomocí metod známých v oboru. (např. Baumgartner a kol., J. Biol. Chem. 269: 29 094-101,1994; Schenborg a Goiffin, Promega Notes 41:11, 1993). Soupravy na testování aktivity luciferázy jsou komerčně dostupné, například od Promega Corp. Madison, WI. Cílové buněčné linie tohoto typu mohou být používány pro prohledávání knihoven chemikálií, buňkami upravených kultivačních médií, bujónů pro kultivaci hub, vzorků půdy, vzorků vody a podobně. Například banka vzorků buňkami upravených kultivačních médií může být testována na cílových buňkách, a určeny tak buňky, které produkují ligand. Pozitivní buňky jsou potom použity pro vytvoření cDNA knihovny v savčím expresním vektoru, který je pak rozdělen na části, transfekován do hostitelských buněk a exprimován. Vzorky média od transfekovaných buněk jsou potom testovány, s následným rozdělením na části, opětnou transfekcí, další kultivací a opětným testováním pozitivních buněk, až je izolována klonovaná DNA kódující ligand.

S výhodou může být použit testovací systém, který používá receptor, který váže ligand (nebo protilátku či jeden člen páru komplement/antikomplement) nebo jeho vazebný fragment a ko-22CZ 303272 B6 merčně dostupný přístroj s biosenzorem (např. BIAcore™, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Takový receptor, protilátka člen páru komplement/antikomplement nebo fragment je imobilizován na povrchu receptorového Čipu. Použití tohoto přístroje je popsáno v Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229-240, 1991 a Cunningham a Wells, J. Mot Biol. 234: 554-63. 1993. Například polypeptid BR43x2, fragment, protilátka nebo člen páru komplement/antikomplement je kovalentně připojen, pomocí aminoskupin nebo sulfhydrylových skupin k vláknům dextranu, jež jsou připojeny ke zlatému filmu, umístěnému v průtokové buňce. Testovaný vzorek prochází buňkou. Pokud je ve vzorku přítomen ligand, epitop nebo opačný člen páru komplement/antikomplement, bude se vázat k imobilizovanému receptoru, protilátce respektive druhému členu páru, a bude způsobovat změny v indexu lomu média, který je detekován jako změna v povrchové plazmonové rezonanci zlatého filmu. Tento systém umožňuje určení rychlostí vazby a uvolňování, z nichž může být spočtena afinita vazby, a stanovena stechiometrie vazby. Polypeptidy receptoru, které vážou ligand, mohou být také použity v rámci jiných, v oboru známých testovacích systémů. Takové systémy zahrnují analýzu podle Scatcharda pro určení afinity vazby (viz Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) a kalorimetrické testy (Cunningham a kol., 253: 545—48. 1991; Cunningham a kol., Science 245: 821-25, 1991).

Analýzu vynesení podle Scatcharda pro rozpustný I¹²⁵-ztnf4, vázající se kTACI a BCMA, je uvedena na obrázku 2 a je porovnána s vazebnými konstantami jiných členů rodiny TNFR v tabulce 7.

Tabulka 7

Ligand	Kd M	Buněčný zdroj	Odkaz
TNFa vysoký	7.14E-11	HL-60	a
TNFa nízký	3.26E-10	HEP-2	a

TNFa vysoký	2.00E-10	HL-60	b

CD27L	3,70E-10	MP-1	c
CD27L	8.30E-09	MP-1	c
CD40L	5.00E-10	EL40.5	d
CD40L	1.00E-09	EBNA	d
(125I-CD40)

4-1BBL	1,16E-09	Biacore	θ
anti 41Bbmab	4,14E-10	Biacore	3

ztnf4 sol.	1,11E-09	TACI-BHK
ztnf4 sol.	1.25E-09	BCMA-BHK

a Hohmann a kol., J. Biol. Chem. 264: 14 927-34, 1989 b Manna a Aggarwal, J. Biol. Chem. 274: 33 333^41, 1998 c Goodwin a kol., Cell 73: 447-56, 1993 d Armitage a kol., Nátuře 357: 80-82, 1992 eShufordakoUJ.Exp. Med. 186: 47-55, 1997

-23 CZ 303272 B6

Protože se jedná o receptor, aktivace polypeptidů BR43x2 může být měřena na křemíku založeným biosenzorovým mikrofyziometrem, který měří rychlost extracelulámího okyselování nebo vylučování protonů, spojená s vazbou receptoru a následujícími fyziologickými buněčnými změnami. Příkladem takového zařízení je Cytosensor™ Microphysíometer vyrobený z Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Touto metodou mohou být měřeny různé buněčné odpovědi, jako je buněčné množení, transport iontů, produkce energie, zánětlivá odpověď, aktivace regulace a aktivace receptoru a podobně. Viz například McConnell a kol., Science 257: 1906-1912, 1992; Pitchford a kol., Meth. Enzymol. 228: 84-108, 1997; Arimilli a kol., J. Immunol. Meth. 212: 4959, 1998; Van Liefde a kol., Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95, 1998. Mikrofyziometr může být používán pro testování přichycených nebo nepřichycených eukaryotických nebo prokaryotických buněk. Při měření změn extracelulámího okyselení v buněčném médiu v průběhu času, mikrofyziometr přímo měří buněčné odpovědi na různé podněty, včetně agonistů, ligandů nebo antagonistů polypeptidů BR43x2. S výhodou je mikrofyziometr používán pro měření odpovědí eukaryotických buněk, které exprimují BR43x2, ve srovnání s kontrolními eukaryotickými buňkami, které polypeptid BR43x2 neexprimují. Eukaryotické buňky exprimující BR43x2 zahrnují buď buňky, do kterých byl BR43x2 transfekován, jakje zde popsáno, Čímž vznikla buňka odpovídající na BR43x2 modulační podněty, nebo buňky, které exprimují BR43x2 přirozeně, jako jsou BR43x2 exprimující buňky odvozené z tkáně sleziny. Rozdíly měřené změnou extracelulámího okyselení, například zesílení nebo zeslabení odpovědi buněk exprimujících BR43x2, vzhledem ke kontrole, jsou přímou mírou buněčných odpovědí modulovaných BR43x2. Kromě toho mohou být takové buněčné odpovědi, modulované BR43x2, testovány pod vlivem rozličných podnětů. Použití mikro fyziometru také poskytuje metodu určování agonistů a antagonistů polypeptidů BR43x2, která sestává z poskytnutí buněk exprimujících polypeptid BR43x2, kultivování první části buněk v nepřítomnosti testované sloučeniny, kultivování druhé části buněk v přítomnosti testované sloučeniny, a detekování změny, například zesílení nebo zeslabení buněčné odpovědi druhé části buněk ve srovnání s částí první. Změny v buněčné odpovědi se projevují jako měřitelné změny rychlosti extracelulámího okyselování. Antagonisti a agonisti polypeptidů BR43x2 mohou být pomocí této metody rychle určeny.

Rozpustný BR43x2 je vhodný při studiu distribuce ligandů na tkáních nebo specifických buněčných liniích a pro získání hlubšího pohledu na biologii vztahu receptor/ligand. Specifitu TNF receptorů pro jejich ligandy lze také využít jako mechanizmu, kterým je možno destruovat cílové buňky nesoucí ligand. Například k rozpustnému receptoru BR43x2 nebo k BR43x2 fúzi je možno připojit toxickou sloučeninu. Příklady toxických sloučenin by zahrnovaly radioaktivně značené farmaceutické přípravky, které inaktivují cílové buňky; chemoterapeutická činidla jako jsou doxorubicin, daunorubicin, methotrexát a cytoxan; toxiny jako jsou ricin, difterický toxin, exotoxin A z Pseudomonas a abrin; a protilátky k povrchovým molekulám cytotoxických T buněk.

Pomocí FACS analýzy (průtoková cytometrie a třídění, Melemed a kol., vyd. Wiley-Liss, 1990 a Imunofluorescence a třídění buněk. Současné protokoly v imunologii, svazek 1, Coligan a kol., vyd. John Wiley a syn, 1997) bylo zjištěno, že ztnf4 (5 ng/ml) se váže k BR43x2 (SEQ ID NO: 2), TACÍ (SEQ ID NO: 6), BCMA (SEQ ID NO: 8) a BR43xl (SEQ ID NO: 9). Pomocí FACS analýzy bylo také zjištěno, že rozpustný ztnf4 označený pomocí F1TC, se specificky váže mimo jiné na B lymfocyty v PBMNC, buňky mandlí, k B buňkám lymfomových buněčných linií (Ráji, lidský Burkittův lymfom, ATCC CCL86), Ramos (buněčná linie z Burkittova lymfomu, ATCC CRL-1596), Daudi (lidský Burkittův lymfom, ATCC CCL213) a RPMI 1788 (buněčná linie z B lymfocytů, ATCC CCL-156). Žádná vazba nebyla pozorována na HL-60 (promyelocytická buněčná linie, ATCC CCL-240). Specifita vazby k B buňkám z PBMNC a buňkám mandlí byla potvrzena společným barvením pomocí protilátek proti specifickým molekulám B buněk, jako jsou CD19, IgD, IgM a CD20, Podobnost ztnf4 sCD40L naznačuje širší tkáňovou distribuci, než byla pozorována. Afinita ztnf4 byla testována na monocytech, dendritických buňkách a purifikovaných T buňkách například pomocí testů cytokinové proliferace T buněk, a nebylo možno detekovat vazbu ztnf4 ani žádný jiný biologický vliv na žádný jiný typ testovaných buněk. Proto specifita ligandu a receptoru pro B buňky naznačuje, že jsou vhodné pro studium a léčení autoimunity, rakovin B buněk, imunomodulaci, IBD a jakýchkoli protilátkami zprostřed-24CZ 303272 B6 kovaných patologických stavů, např. [TCP, myastenie gravis a podobně, nemocí ledvin, nepřímé imunitní odpovědi T buněk, odmítnutí štěpu a reakce štěpu proti hostiteli.

Rylo ukázáno, že ztnf4 aktivuje B buňky, což má za následek množení B buněk, produkci protilátek a aktivování markérů in vitro (viz příklady uvedené dále). Tyto účinky mohou vyžadovat současnou stimulaci z prostředkovanou IL—4 nebo jinými cytokiny nebo stimulaci zprostředkovanou receptorem antigenu B buněk nebo jinými receptory na buněčném povrchu, které aktivují B buňky, tj. CD40. Jiné ligandy faktoru nekrózy nádoru, jako jsou gp39 a TNFp také stimulují množení B buněk. Tedy polypeptidy, kterájsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být zaměřeny na specifické regulování odpovědí B buněk, inhibování aktivovaných B buněk v průběhu imunitní odpovědi, bez toho že by ovlivňovaly jiné buněčné populace, což je výhodné pro léčení nemoci. Dále polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být využity k modulování vývoje B buněk, vývoje jiných buněk, produkce protilátek a produkce cytokinů. Polypeptidy BR43x2 také mohou najít použití při indukování apoptózy v buňkách. Polypeptidy předloženého vynálezu také mohou modulovat komunikaci B buněk a T buněk neutralizováním proliferativních účinků ztnf4. Biologické testy a testy ELISA jsou schopné měřit buněčnou odpověď na ztnf4 v přítomnosti rozpustného BR43x2, TACÍ a/nebo BCMA. Mezi jiné testy patří takové, které měří změny v produkci cytokinů, jakožto míry odpovědi buněk (viz například Současné protokoly v imunologii, vyd. John E. Coligan a kol., NIH, 1996). Testy pro měření dalších buněčných reakcí zahrnují isotyp protilátky, aktivaci monocytů, tvorbu buněk NK, buněčnou funkci prezentace antigenu a apoptózu.

Polypeptidy BR43x2, které jsou předmětem tohoto vynálezu, by byly vhodné pro neutralizování vlivů ztnf4 při léčení leukémií pre-B buněk nebo B buněk, jako jsou leukémie plazmatických buněk, chronické nebo akutní leukémie lymfocytů, myelomy jako je roztroušený myelom, myelom plazmatických buněk, endoteliální myelom a myelom obrovských buněk; a lymfomů jako je lymfom ne-Hodgkinova typu, s nimiž je spojeno zvýšení úrovně ztnf4 polypeptidů. Rozpustný BR43x2 by byl vhodnou složkou v léčebném režimu pro potlačení postupu nádoru a přežití pacienta.

Analýza metodou Northem blot ukázala, že ztnf4 je exprimován v buňkách CD8⁺, monocytech, dendrocytech a aktivovaných monocytech. To znamená, že při některých auto imunitních potížích mohou cytotoxické T buňky stimulovat produkci B buněk nadbytečnou produkcí ztnf4. ímunosuprimující proteiny, které selektivně b lokují působení B lymfocytů, by mohly být použitelné při léčení nemoci. Produkce autoprotilátek je společná několika autoimunitním nemocem a přispívá k destrukci tkáně a zhoršování nemoci. Autoproti látky také mohou vést k objevení se komplikací s usazováním imunního komplexu a vedou k mnoha symptomům systém ického lupus erythematodes, včetně selhání ledvin, neuralgických symptomů a smrti. Modulování produkce protilátek nezávislé na buněčné odpovědi by také bylo užitečné v mnoha chorobných stavech. Bylo také ukázáno, že B buňky hrajou roli při sekreci imunoglobulinů způsobujících artritidu při revmatickém zánětu (Korganow a kok, Immunity 10: 451-61, 1999). Jako taková, inhibice produkce protilátek proti ztnf4 by byla užitečná při léčení auto imunitních nemocí, jako je myastenie gravis a zánět kloubů. Imunosuprimující léčiva, jako je rozpustný BR43x2, který selektivně blokuje nebo neutralizuje působení B lymfocytů, by byl pro takové účely užitečný. Pro ověření takovýchto schopností polypeptidů rozpustného receptoru BR43x2, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou tyto polypeptidy BR43x2 hodnoceny pomocí testů, známých v oboru a zde popsaných.

Dále je popsáno využití polypeptidů BR43x2, TACÍ a BCMA, fúzních polypeptidů, protilátek jak jsou uvedené v nárocích pro přípravu léčiva na léčení stavů spojených s konečným stadiem nemocí ledvin, které mohou nebo nemusí být spojeny s autoimunitním i chorobami, s léčením imunologických nemocí ledvin, s léčením glomerulonefritidy spojené s nemocemi, jako je nefropatie, IgA nefropatie nebo Bergerovy nemoci, s IgM nefropatií, s Goodpasturovou nemocí, s postinfekční glomerulonefritidou, s proliferativní nemocí a nefrotickým syndromem minimální změny a dalším stavů uvedených v patentových nárocích.

-25 CZ 303272 B6

Dále použití podle vynálezu také zahrnuje použití polypeptidů BR43x2, TACÍ a BCMA, fůzních polypeptidů, protilátek, agonistů a antagonistů pro přípravu léčiva pro léčení vysokého tlaku nebo nemocí velkých cév, včetně zúžení nebo uzavření ledvinové tepny a cholesterolové embolie nebo embolie ledviny.

Předložený vynález také poskytuje metody pro zjišťování diagnózy a pro léčení ledvinových a urologických novotvarů, mnohočetných myelomů, lymfomů, neuropatii způsobených lehkým řetězcem nebo amyloidózy.

Vynález také poskytuje metody pro blokování nebo inhibování aktivovaných B buněk pomocí polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA, fůzních polypeptidů, protilátek, agonistů a antagonistů pro léčení astmatu a jiných chronických nemocí dýchacích cest, jako je bronchitida a rozedma.

Také jsou poskytnuty metody pro inhibicí nebo neutralizaci odpovědi efektorových T buněk pomocí polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA, fůzních polypeptidů, protilátek, agonistů a antagonistů pro použití v imunosupresi, a zvláště pro takové terapeutické použití, jako je nemoc reakce štěpu proti hostiteli a odmítnutí štěpu. Další použití by se nalezly v regulaci imunitní odpovědi, zvláště při aktivaci a regulaci lymfocytů. Polypeptidy BR43x2, TACÍ nebo BCMA, fúzní polypeptidy, protilátky, agonisté a antagonisté by byly užitečné v terapeutických postupech při léčení imunitních nedostatečností. Polypeptidy BR43x2, TACÍ nebo BCMA, fúzní polypeptidy, protilátky agonisté a antagonisté by byly užitečné v terapeutických protokolech pro léčení takových auto imunitních chorob, jako je cukrovka závislá na inzulínu (IDDM) nebo Crohnova nemoc. Metody předloženého vynálezu by měly další terapeutickou hodnotu pro léčení chronických zánětlivých stavů, zvláště pro snížení bolesti kloubů, otoku, anémie a jiných souvisících symptomů a rovněž tak léčení septického šoku.

Účinky polypeptidů rozpustného BR43x2, TACÍ nebo BCMA a fůzních proteinů na imunitní odpověď může být měřena pomocí podávání polypeptidů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, živočichům imunizovaným antigenem, po čemž následuje injekce ztnf4 a měření produkce i šoty pu protilátky a odpovědi B a T buněk, včetně opožděné přecitlivělosti a in vitro množení a produkce cytokinů, pomocí metod známých v oboru.

Předložený vynález proto poskytuje metodu inhibice ztnf4 aktivity v savci, která spočívá v podání uvedenému savci množství sloučeniny, vybrané ze skupiny zahrnující: a) polypeptid sekvence SEQ ID NO: 4; b) polypeptid sekvence SEQ ID NO: 8; c) fúzní protein; d) polypeptid sekvence SEQ ID NO: 6 od aminokyselinového zbytku 1 do zbytku 166; e) polypeptid sekvence SEQ ID NO: 8 od aminokyselinového zbytku 1 do zbytku 150; f) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu sekvence SEQ ID NO: 4; a g) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu sekvence SEQ ID NO: 10. Příklady fůzních proteinů zahrnují fúze rozpustného BR43x2 (SEQ ÍD NO: 4), TACÍ (od aminokyselinového zbytku 1 do zbytku 166 sekvence SEQ ID NO: 6) nebo BCMA (od aminokyselinového zbytku 1 do zbytku 150 sekvence SEQ ID NO: 8) s jiným polypeptidem, s výhodou s konstantní oblastí těžkého řetězce F_c fragmentu. Vynález podobně poskytuje metodu pro inhibování vzájemné vazby ligandu a receptorů BR43x2, TACÍ nebo BCMA.

Takové metody by byly zvláště užitečné tam, kde aktivita ztnf4 je spojena s aktivovanými B lymfocyty a pro léčení pre-B buněk a rakoviny B buněk. Takové metody by byly také užitečné tam, kde aktivita ztnf4 je spojena s produkcí protilátky. Zvláště takové produkce protilátky, která souvisí s autoimunitnímí chorobami jako jsou systém ický lupus erythematodes, myastenie gravis nebo zánět kloubů.

Předložený vynález také poskytuje agonísty a antagonisty BR43x2. Sloučeniny určené jako agonisti BR43x2 jsou vhodné pro modifikaci množení a vývoje cílových buněk in vitro a in vivo. Například sloučeniny agonistů jsou vhodné samotné nebo v kombinaci s jinými cytokiny a hormony jako složky definovaných médií pro buněčné kultury. Agonisti jsou tedy užiteční při speci-26CZ 303272 B6 fíckém zprostředkování růstu a/nebo vývoje buněk B lymfocytů nesoucích BR43x2, rostoucích v kultuře. Agonisti a antagonist i se mohou také ukázat užiteční ve studiích efektorové funkce B lymfocytů, zvláště aktivace a diferenciace B lymfocytů. Antagonisty jsou užiteční jako reagencie při zkoumání charakteristik interakce ligand-receptor.

Sloučeniny určené jako antagonisti jsou také užitečné pro zesílení humorální imunitní odpovědi. Odpovědi B buněk jsou důležité pro potírání infekčních onemocnění, včetně infekcí způsobených bakteriemi, viry, prvoky a parazity. Protilátky proti infekčním mikroorganizmům mohou imobilizovat patogen tím, že se k antigenu vážou a po vazbě následuje komplementem zprostředkovaná io lýza nebo buňkou zprostředkovaný útok. Antagonisti BR43x2 by sloužili pro zesílení humorální odpovědi a byli by užitečnými léčivy pro jedince, kteří jsou ohroženi infekční nemocí nebo jako doplněk k očkování.

Vynález také poskytuje antagonisty, kteří se buď vážou na polypeptidy BR43x2 nebo naopak k ligandu, ke kterému se vážou polypeptidy BR43x2, tudíž inhibují nebo ruší funkci BR43x2. Tito antagonisti BR43x2 by zahrnovali protilátky; oligonukleotidy, které se vážou buď k polypeptidů BR43x2 nebo kjeho ligandu; přirozené nebo syntetické analogy ligandu BR43x2, které si podržely schopnost vázat se k receptorů, následkem této vazby však nevydá signál ani ligand ani receptor. Takové analogy mohou být peptidy nebo sloučeniny podobající se peptidům. Přiro20 zené nebo syntetické malé molekuly, které se vážou k polypeptidum BR43x2 a zabraňují vzniku signálu, jsou také počítány mezi antagonisty. Jako taková, antagonisti BR43x2 by byli užiteční jako léčiva pro léčení určitých poruch, kde by bylo prospěšné blokování signálu buď od receptorů BR43x2 nebo ligandu. Antagonisti jsou užiteční jako reagencie při zkoumání charakteristik interakce ligand-receptor. BR43x2 je exprimován v transformovaných liniích B buněk, včetně EBV indukovaného a spontánního Burkittova lymfomu a v několika B buněčných myelomech. Inhibice funkce BR43x2 by byla užitečná pro léčení B buněčných lymfomů nebo mnohočetných myelomů. Antagonisti BR43x2, jako jsou rozpustné receptory BR43x2 nebo protilátky, mohou být použiti terapeuticky pro zprostředkování progrese nádoru.

Aktivita agonistů a antagonistů může být určena testy aktivity, které určují sílu spojení receptor/ligand. Stabilně transfekované linie B buněk, jako jsou Baf3 (linie myších pre-B buněk, Palacios a Steimetz, Cell 42: 727-34, 1985; Matchey-Prevot a kol., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-5, 1986), které souběžně exprimují ve vysokých hladinách konstrukty pro NfKB, NFAT-1 a AP-1 s reportérovým genem, byly upraveny pro expresi BR43x2. Podobným způsobem byly také při35 praveny buněčné linie exprimující TACÍ a BCMA, také byly připraveny v buňkách Jurkat a v jiných buněčných liniích pocházejících z B lymfomů. Bylo zjištěno, že ztnf4 v těchto konstruktech signalizuje prostřednictvím reportérových genů. Pro měření vazby se mohou použít rozpustný BR43x2 a protilátky.

Přístup in vivo pro testování proteinů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, zahrnuje dodávací systémy virového typu. Příklady virů vhodných pro tento účel zahrnují adenovirus, herpesvirus, vakciniavirus a s adenovirem asociovaný virus (AAV). Adenovirus, virus s dvouřetězcovou DNA, je nyní nejlépe prostudovaný vektor pro přenos heterologní nukleové kyseliny (pro přehled viz Becker a kol., Meth. Cell Biol. 43: 161-89, 1994; a Douglas a Curiel, Science & Medicine 4:

44-53, 1997). Adenovirový systém poskytuje několik výhod: (i) adenovirus může pojmout relativně velké DNA inzerty; (ii) může vyrůst do vysokého titru; (iii) infikuje široké spektrum typů savčích buněk; a (iv) může být použit velký počet dostupných vektorů, které obsahují různé promotory. Také, protože adenoviry jsou stabilní v krevním oběhu, mohou být podávány pomocí nitrožilní injekce.

Po odstranění částí adenovirového genomu, mohou být do vektoru zabudovány větší inzerty (až do 7 kb) heterologní DNA. Tyto inzerty mohou být zabudovány do virové DNA pomocí přímé ligace nebo pomocí homologická rekombinace se současně transfekováným plazmidem. V systému, který je uveden jako příklad, byl odstraněn z virového vektoru esenciální gen El, a virus se nebude replikovat, pokud není gen El poskytnut hostitelskou buňkou (příkladem je lidská buněč-27CZ 303272 Β6 ná linie 293). Když je adenovirus podán nitrožilně do nedotčeného živočicha, primárně směřuje do jater. Pokud má dodávací adenovirový systém deleci genu El, virus se nemůže v hostitelské buňce replikovat. Avšak hostitelská tkáň (např. játra) budou exprimovat a zpracovávat (a jestliže je přítomna signální sekvence, i sekretovat) heterologní protein. Sekretované proteiny vstoupí do oběhu ve vysoce krevně zásobených játrech a mohou být určeny účinky na infikovaného živočicha.

Adenovirový systém může být také použit pro produkci proteinu in vitro. Při kultivaci adenovirem infikovaných buněk, jiných než jsou buňky 293, za podmínek, kdy se buňky příliš rychle nedělí, buňky mohou produkovat proteiny po dlouhá časová období. Například buňky BHK jsou vypěstovány do souvislého nárůstu, potom jsou vystaveny adenovirovému vektoru, který kóduje požadovaný sekretovaný protein. Buňky jsou potom pěstovány za podmínek bez séra, které umožní infikovaným buňkám přežívat několik týdnů bez výrazného buněčného dělení. Jinou možností je, že adenovirovým vektorem infikované buňky 293S mohou být pěstovány v suspenzní kultuře při relativně vysoké hustotě buněk, což umožňuje produkovat významná množství proteinu (viz Garnier a kol., Cytotechnol. 15: 145-55, 1994). Podle kteréhokoli postupu, může být exprimovaný, sekretovaný heterologní protein opakovaně izolován ze supematantu buněčné kultury. Při použití protokolu produkce v infikovaných buňkách 293S mohou být také efektivně získávány nesekretované proteiny.

Pro testování in vivo účinnosti rozpustných polypeptidu BR43x2, TACÍ nebo BCMA, které jsou předmětem tohoto vynálezu, pri určitých chorobných stavech, jsou k dispozici dobře zavedené živočišné modely. Zvláště mohou být rozpustné polypeptidy a polypeptidové fragmenty BR43x2, TACÍ nebo BCMA testovány in vivo na radě živočišných modelů autoimunních chorob, jako jsou kongenní myší kmeny BRL-Ipr/Ipr nebo NZBxNZB Fl, které slouží jako modely pro SLE (systemický lupus erythematodes). Takové živočišné modely jsou v oboru známé, viz například Modely autoimunních chorob - příručka, Cohen a Miller, vyd. Academie Press. U potomků křížení mezi kmenem novozélandské černé myši (NZB) a novozélandské bílé myši (NZW) se vyvíjí spontánní forma SLE, která se silně podobá SLE u lidí. Myš tohoto potomstva, známá jako NZBW, počíná ve věku 1 měsíce vyvíjet autoproti látky IgM proti T buňkám, a ve věku 5 až 7 měsíců jsou u ní převládajícími imunoglobul iny Ig anti-DNA autoproti látky. Přecitlivělost polyklonálních B buněk vede k nadprodukci autoprotilátek. Ukládání těchto autoprotilátek, zvláště těch, které jsou zaměřené proti jednořetězcové DNA, je spojeno s vývojem glomerulonefritidy, která se klinicky projevuje jako vylučování proteinů močí, azotemie a smrt ze selhání ledvin. Selhání ledvin je hlavní příčinou smrti u myší se spontánním SLE a u kmene NZBW, tento proces je chronický a ucpává vnitřní dutiny. Průběh nemoci je rychlejší a prudší u samic než u samců, což znamená průměrné přežití pouze 245 dní u samic ve srovnání s 406 dny u samců. Zatímco mnoho samic bude mít příznaky (vylučování proteinů moči) ve stáří 7 až 9 měsíců, některé mohou být v době, kdy vyvinou příznaky, mnohem mladší nebo starší. Smrtelná imunní nefritida, projevující se u myší NZBW, je velmi podobná glomerulonefritidě, pozorované u lidského SLE, což činí tento spontánní myší model velmi atraktivní pro testování potenciálních léčiv SLE (Pitterman a Naparstek, Myší modely spontánního systemického lupus erythematodes, Modely autoimunních chorob - příručka, kap. 14, str. 217 až 234, 1994; Mohan a kok, J. Immunol. 154: 1470-80, 1995; a Daikh a kok, J. Immunol. 159: 3104-08, 1997). Podání rozpustného TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-lg nebo jiných rozpustných a fúzních proteinů těmto myším, aby mohl být zhodnocen vliv TACÍ, BR43x2 nebo BCMA na zmírnění příznaků a změnu průběhu nemoci, je popsáno dále v oddílu příkladů.

Myší modely pro experimentální alergickou encefalomyelitidu (EAE) byly použity jako nástroj pro zkoumání jak mechanizmů této imunitou zprostředkované choroby, tak metod potenciálního terapeutického zásahu. Model připomíná lidskou roztroušenou sklerózu a nastává u ní demyelinizace, která je následkem aktivace T buněk neuroproteiny, jako je myelinový zásaditý protein (MBP) nebo protolipidový protein (PLP). Očkování antigenem vede k indukci CD4+, třídy II MHC omezených T buněk (Th 1). Změny v protokolu pro EAE mohou vyvolat akutní, chronicky se vracející nebo pasivně přenosnou variantu modelu (Weinberg a kok, J. Immunol. 162: 1818-28CZ 303272 B6

26, 1999; Mijaba a kol., Cell. Immunol. 186: 94-102, 1999 a Glabinski, Meth. Enzym. 288: 18290, 1997). Podání rozpustného TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig nebo jiných rozpustných a fúzních proteinů těmto myším, aby mohl být zhodnocen vliv TACÍ, BR43x2 nebo BCMA na zmírnění příznaků a změnu průběhu nemoci je popsáno dále v oddílu příkladů.

V modelu kolagenem indukované artritidy (CIA) se u myší vyvíjí chronická zánět!ivá artritida, která silně připomíná revmatický zánět u lidí (RA). Protože CIA má společné imunologické a patologické příznaky s RA, činí ji to ideálním modelem pro testování lidských prot i zánětlivých sloučenin. Jinou výhodou při použití CIA modelu je, že jsou známy mechanizmy patogeneze. io Na molekule kolagenu typu II byly identifikovány epitopy pro T a B buňky, a byly zjištěny různé imunologické (opožděná přecitlivělost a protilátky proti kolagenu) a zánětlivé (cytokiny, chemokiny a enzymy rozkládající matrix) parametry, které souvisejí s touto imunitou zprostředkovanou artritidou, a mohou být použity pro hodnocení účinnosti testovaných sloučenin na modelech (Wooley, Curr. Opin. Rheu. 3: 407-20, 1999; Williams a kol., Immunol. 89: 9784-788, 1992; ís Meyers a kol., Life Sci, 61: 1861-78, 1997 a Wang a kol., Immunol. 92: 8955-959, 1995 ). Podání rozpustného TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig nebo jiných rozpustných a fúzních proteinů těmto myším, aby mohl být zhodnocen vliv TACÍ, BR43x2 nebo BCMA na zmírnění příznaků a změnu průběhu nemoci je popsáno dále v oddílu příkladů.

Modely pro bronchiální infekce, jako je astma, je možno vytvořit, když je myším injekčně podán ovalbumin a poté jsou opakovaně nazálně stimulovány antigenem, který vyvolá v průduškách astmatickou odpověď, která je podobná astmatu. Podání rozpustného TACI-Ig, BR43x2-Ig, BCMA-lg nebo jiných rozpustných a fúzních proteinů těmto myším, aby mohl být zhodnocen vliv TACÍ, BR43x2 nebo BCMA na zmírnění příznaků a změnu průběhu nemoci je popsáno dále v oddílu příkladů.

Jiným použitím pro modely in vivo je podání provokační injekce antigenů živočichovi tak, že je mu podán rozpustný BR43x2 (TACÍ) nebojeho ligand ztnf4 aje měřena odpověď T a B buněk.

Imunitní odpověď závislá na T buňkách a imunitní odpověď nezávislá na T buňkách mohou být měřeny tak, jak je popsáno v Perez-Melgosa a kol., J. Immunol. 163: 1123-7, 1999.

Může být vyvolána imunitní odpověď živočichů, kteří jsou podrobeni pravidelným dávkám antigenu, (například ovalbumin nebo kolagen), po kterých jsou podávány polypeptidy BR43x2,

TACÍ nebo BCMA nebo jejich rozpustné fúzní konstrukty s Ig, a měřen účinek na odpověď B buněk.

Mohou být provedeny farmakokinetické studie za použití radioaktivně značených rozpustných polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA nebo jejich fúzí, pro určení distribuce a poločasu těchto peptidů in vivo. Další živočišné modely mohou být použity pro zjišťování účinků rozpustných BR43x2, TACÍ nebo BCMA na nádory a vývoj nádorů in vivo.

Polypeptidy BR43x2, TACÍ nebo BCMA je také možno použít jako náhradní markéry pro autoimunní choroby, nemoci ledvin a nemoci B a T buněk. Takovýmto pacientům je možno odebrat krev a rozpustné receptory BR43x2, TACÍ nebo BCMA ajejich ligandy mohou být v krvi detekovány.

Vynález také poskytuje protilátky. Protilátky proti BR43x2 nebo peptidům, které mají aminokyselinovou sekvenci jako SEQ ID NO: 8, mohou být získány, například tak, že je jako antigen použit produkt expresního vektoru, který obsahuje polypeptid o který se jedná, nebo polypeptid izolovaný z přirozeného zdroje. Zvláště užitečné protilátky jsou takové, které se „specificky vážou” k BR43x2 nebo peptidům, které mají aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10. Protilátky jsou považovány za specificky se vázající, jestliže se protilátky vážou k polypeptidů BR43x2 nebo polypeptidů sekvence SEQ ID NO: 8, peptidů nebo epitopu s vazebnou afinitou (K_A) 10⁶ M“¹ nebo větší, výhodněji 10⁷ M¹ nebo větší, ještě výhodněji 10⁸ M'¹ nebo větší a nej-29CZ 303272 B6 výhodněji 10⁹ M ¹ nebo větší. Vazebná afinita protilátky může být snadno určena osobou s běžnou zkušeností v oboru, například pomocí analýzy podle Scatcharda (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660, 1949). Mezi vhodné protilátky patří takové protilátky, které se vážou k BR43x2, zvláště k extracelulámí doméně BR43x2 (aminokyselinové zbytky 1 až 120 ze sekvence SEQ ID NO: 2) a ty, které se vážou k polypeptidúm, které mají aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10.

Protilátky proti BR43x2 mohou být připravovány pomocí peptídů a polypeptidů nesoucích antigenní epitopy BR43x2. Peptidy a polypeptidy nesoucí antigenní epitopy BR43x2, které jsou předmětem tohoto vynález, obsahují sekvence alespoň devíti, výhodně mezi 15 až 30 aminokyselin, obsažených v sekvenci SEQ ID NO: 2. Avšak peptidy nebo polypeptidy, obsahující větší část aminokyselinové sekvence předloženého vynálezu, obsahující od 20 do 50 aminokyselin, nebo jakoukoli větší délku až k zahrnutí celé aminokyselinové sekvence polypeptidů, který je předmětem tohoto vynálezu, jsou také vhodné pro indukování protilátek, které se vážou k BR43x2. Je žádoucí, když je aminokyselinová sekvence peptidu nesoucího epitop vybrána tak, aby zabezpečila dobrou rozpustnost ve vodných roztocích (tj, sekvence obsahuje relativně hydrofilní zbytky, zatímco je výhodné vynechat zbytky hydrofobní). Hydrofilní peptidy může předpovědět osoba se zkušeností v oboru podle vynesení hydrofobnosti, viz například Hopp a Woods., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828, 1981) a Kyte a Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 105-142, 1982). Dále mohou být pro produkci protilátek žádoucí aminokyselinové sekvence, které obsahují prolinové zbytky.

Polyklonální protilátky proti rekombinantnímu BR43x2 proteinu nebo proti BR43x2, izolovanému z přirozených zdrojů, mohou být připraveny pomocí metod, které jsou dobře známé osobám se zkušeností v oboru. Viz například Green a kol., Produkce polyklonálních antisér, v Imunochemické protokoly (Manson, vyd.), str. 1 až 5 (Humana Press 1992), a Williams a kol., Exprese cizorodých proteinů v E. coli pomocí plazmidových vektorů a purifikace specifických polyklonálních protilátek, v Klonování DNA 2: Exprimující systémy, 2. vydání, Glover a kol., (vyd.), str. 15 (Oxford University Press 1995). Imunogenicita polypeptidů BR43x2 může být zvýšena použitím adjuvans, jako je alum (hydroxid hlinitý) nebo kompletní či nekompletní Freundovo adjuvans. Polypeptidy výhodné pro imunizaci také zahrnují fúzní polypeptidy, jako jsou fúzní polypeptidy BR43x2 nebo jeho části s polypeptidem imunoglobulinu nebo s proteinem, který váže maltózu. Polypeptidový imunogen může být molekula o plné délce nebo její část. Pokud část polypeptidů je „podobná haptenu“, taková část může být pro imunizaci s výhodou připojena nebo vázána k makromolekulámímu nosiči (jako je hemokyanin „keyhole limpet“ (KLH), hovězí sérový albumin (BSA) nebo tetanický toxoid).

Třebaže polyklonální protilátky jsou typicky vyvolávány u živočichů jako jsou koně, psi, kuřata, krysy, myši, králíci, křečci, morčata, kozy nebo ovce, protilátky proti BR43x2, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být také odvozeny z protilátek primátů. Obecné techniky pro vyvolání diagnosticky a terapeuticky vhodných protilátek u paviánů je možno nalézt například v Goldenberg a kol., mezinárodní patent WO 91/11465 a v Losman a kok, Int. J. Cancer 46: 310, 1990. Vznik protilátek je možno také vyvolat u transgenních živočichů, jako jsou transgenní ovce, krávy, kozy nebo vepři, nebo mohou být v pozměněných formách exprimovaný v kvasinkách a houbách, a stejně tak v savčích a hmyzích buňkách.

Jinou možností je příprava monoklonálních protilátek. Hlodavci monoklonální protilátky proti specifickým antigenům je možno získat pomocí metod, které jsou známé osobám se zkušeností v oboru (viz například Kohler a kok, Nátuře 256: 495, 1975, Coligan a kok (vyd.), Současné protokoly v imunologii, sv. 1, str. 2.5.1 až 2.6.7 (John Wiley & Sons, 1991), Picksley a kok, Produkce monoklonálních protilátek proti proteinům exprimovaným v E. coli, v Klonování DNA 2: Exprimující systémy, 2. vydání, Glover a kok, (vyd.), str. 93 (Oxford University Press 1995)).

Krátce řečeno, monoklonální protilátky je možno získat tak, že myši je injekčně podán prostředek obsahující produkt genu BR43x2, je ověřena přítomnost produkce protilátek pomocí odebírání

-30CZ 303272 B6 vzorku séra, je odstraněna slezina, aby byly získány B lymfocyty, B lymfocyty jsou fúzovány s myelomovými buňkami ajsou tak vytvořeny hybridomy, hybridomy jsou klonovány, jsou vybrány pozitivní klony, které produkují protilátky proti antigenu, tyto produkující klony jsou pěstovány a jsou izolovány protilátky z hybridomových kultur.

Dále mohou být protilátky proti BR43x2, které jsou předmětem tohoto vynálezu, odvozeny z lidských monoklonálních protilátek. Lidské monoklonální protilátky je možno získat z transgenních myší, které byly přizpůsobeny pro produkování specifických lidských protilátek, jakožto odpověď na antigenní podnět. V této technice jsou elementy lokusu lidského těžkého a lehkého řetězit) ce vneseny do myších kmenů odvozených z linií embryonálních kmenových buněk, které obsahují cílená přerušení v endogenních lokusech těžkého a lehkého řetězce. Transgenní myši mohou syntetizovat lidské protilátky specifické proti lidským antigenům a myši je možno použít pro produkci hybridomů, které sekretují lidské protilátky. Metody pro získání lidských protilátek z transgenních myší jsou popsány například v Green a kol., Nat. Genet. 7: 13, 1994, Lonberg a kol.,

Nátuře 368: 856, 1994 a Taylor a kol., Int. Immun. 6: 579, 1994.

Monoklonální protilátky mohou být izolovány a purifíkovány z hybridomových kultur pomocí řady dobře vypracovaných technik. Takové izolační techniky zahrnují afinitní chromatografii s Protein-A Sepharosou, chromatografii podle velikosti molekul a chromatografii na iontoměni20 čích (viz například Colígan na str, 2.7.1 až 2.7.12 a str. 2.9.1 až 2.9.3; Baines a kol., Purifikace imunoglobulinu G (IgG), v Metody v molekulární biologii, sv. 10, str. 79 až 104 (The Humana Press, lne. 1992)).

Pro zvláštní účely může být žádoucí připravit fragmenty protilátek proti BR43x2. Takové frag25 menty protilátek mohou být získány například proteo lytic kým štěpením protilátky. Fragmenty protilátek mohou být získány například proteolytickým štěpením protilátky. Fragmenty protilátek mohou být získány běžnými metodami štěpením celých protilátek pomocí pepsinu nebo papainu. Pro ilustraci, fragmenty protilátek mohou být připraveny enzymatickým štěpením protilátek pomocí pepsinu, které poskytne 5S fragment označovaný F(ab')₂. Tento fragment může být dále

Štěpen pomocí činidla redukujícího sulfanylové sloučeniny a vzniknou jednomocné fragmenty 3,5S Fab', Popřípadě může být Štěpící reakce provedena za použití blokující skupiny pro sulfanylové skupiny, která vzniká štěpením disulfídických vazeb. Jako alternativa, enzymatické štěpení pomocí papainu produkuje přímo dva jednomocné fragmenty Fab a fragment F_c. Tyto metody jsou popsány například v Goldenberg, patent US 4 331 647, Nisonoff a kol., Arch. Biochem.

Biophys. 89: 230, 1960, Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959, Edelman a kol., Metody v enzymologii, sv. 1, str. 422 (Academie Press 1967) a Coligan a kol. (vyd.), Současné protokoly v imunologii, sv. 1, str. 2.5.1 až 2.6.7 (John Wiley & Sons 1991).

Jiné metody pro štěpení protilátek, jako je oddělení těžkých řetězců, aby byly získány jednomoc40 né fragmenty lehkého a těžkého řetězce, další štěpení fragmentů nebojiné enzymatické, chemické nebo genetické techniky mohou být použity, pokud se fragmenty vážou k tomu antigenu, který je rozpoznáván intaktní protilátkou.

Například fragmenty Fv obsahují spojení řetězců V_H a V_L. Toto spojení může být nekovalentní, jakje popsáno v Inbar a kot, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69: 2659, 1972. Alternativně mohou být variabilní řetězce vázány disulfídickou vazbou nebo mezi sebou spojeny pomocí chemikálií jako je glutaraldehyd (viz například Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437, 1992).

Fv fragment mohou obsahovat řetězce V_H a V_L, které mohou být spojeny peptídovým linkerem.

Tyto jedno řetězcové proteiny vázající se na antigen (scFv) jsou připraveny pomocí konstrukce strukturálního genu obsahujícího DNA sekvence kódující domény V_H a V_L, které jsou vzájemně spojeny pomocí oligonukleotidů. Strukturální gen je vložen do expresního vektoru, který je potom vnesen do hostitelské buňky, jako je například E. coli. Rekombinantní hostitelské buňky syntetizují jeden polypeptidový řetězec s peptidem linkeru, který překlenuje dvě V domény.

Metody pro přípravu scFv jsou popsány například ve Whitlow a kol., Methods: A Companion to

-31 CZ 303272 B6

Methods in Enzymology 2: 97, 1991, také viz Bird a kol., Science 242: 423, 1988, Ladner a kol., patent US 4 946 778, Pack a kok, Bio/Technology 11: 1271, 1993, a Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437, 1992. Pro ilustraci, scFV může být získán tak, že lymfocyty jsou vystaveny in vitro BR43x2 a jsou jimi selektovány knihovny prezentující protilátky na fágu nebo podobných vekto5 rech (například pomocí imobilizovaného nebo značeného proteinu nebo peptidu BR43x2). Geny kódující polypeptidy, které mají potenciální domény, vázající se na polypeptid BR43x2, mohou být získány prohledáváním náhodných peptidových knihoven prezentovaných na fágu (prezentace pomocí fága) nebo na bakterii, jako je například E. coli. Nukleotidová sekvence kódující polypeptidy je možno získat řadou způsobů, jako je pomocí náhodné mutageneze a náhodné synio tézy polynukleotídů. Tyto knihovny prezentující náhodné peptidy mohou být použity pro hledání peptidů, které interagují se známým cílem, což může být protein nebo polypeptid, jako je ligand nebo receptor, makromolekula biologického nebo syntetického původu, nebo organické či anorganické sloučeniny. Techniky pro tvorbu a prohledávání takových knihoven, prezentujících náhodné peptidy, jsou v oboru známé (Ladner a kol., patent US 5 223 409, Ladner a kol., patent

US 4 946 778, Ladner a kol., patent US 5 403 484, Ladner a kok, patent US 5 571 698 a Kay a kok, Phage Display of Peptides and Proteins (Academie Press, lne, 1996)) a knihovny prezentující náhodné peptidy a soupravy pro prohledávání takových knihoven jsou komerčně dostupné, například od Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen lne. (San Diego, CA), New England Biolabs, lne. (Beverly, MA) a Pharmacia KLB Biotechnology lne. (Piscataway, NJ), Knihovny prezen20 tující náhodné peptidy mohou být prohledávány, kvůli identifikaci proteinů, které se vážou na BR43x2, pomocí zde uvedených sekvencí BR43x2.

Jinou formou fragmentu protilátky je peptid kódující jednu oblast, která určuje komplementaritu (CDR). CDR peptidy (tzv. minimální rozpoznávací jednotky) mohou být získány konstruováním genů kódujících CDR protilátky o kterou se jedná. Takové geny jsou připraveny například využitím polymerázové řetězové reakce pro syntézu variabilní oblasti podle RNA buňky produkující protilátku (viz například Larrick a kol., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991, Courtenay-Luck, Genetic Manipulation of Monoclonal, v Monoclonal Antibodies; Production, Engeneering and Clinical Application, Ritter a kol. (vyd.), str. 166 (Cambridge

University Press 1995), a Ward a kol., Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, v Monoclonal Antibodies: Principles and Application, Birch a kok, (vyd.), str. 137 (Wiley-Liss, lne. 1995)).

Jiná možnost je derivovat protilátku proti BR43x2 z humanizované monoklonální protilátky.

Humanizované monoklonální protilátky jsou připraveny přenesením myších oblastí, určujících komplementaritu, z těžkého a lehkého variabilního řetězce myšího imunoglobulinu, do lidské variabilní domény. Typické zbytky lidských protilátek jsou potom v podpůrných oblastech zaměněny za své myší protějšky. Použití proti látkových složek derivovaných z humanizovaných monoklonálních protilátek předchází potenciální problémy spojené s imunogenitou myších kons40 tantních oblastí. Obecné techniky pro klonování variabilních domén myších imunoglobulinů jsou popsány například v Orlandi a kok, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 3833, 1989. Techniky pro přípravu humanizovaných monoklonálních protilátek jsou popsány například v Jones a kok, Nátuře 321: 522, 1986, Carter a kok. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 4285, 1992, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437, 1992, Singer a kok, J. Immun. 150: 2844, 1993, Sudhir (vyd.) Antibody Engi45 neering Protocols (Humana Press, lne. 1995, Kelley, Engineering Therapeutic Antibodies, v Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland a kok, (vyd.) str. 399 až 434 (John Wiley & Sons, lne. 1996), a Queen a kok, patent US 5 693 762 (1997).

Polyklonální protilátky proti idiotypu je možno připravit imunizací živočicha protilátkami proti

BR43x2 nebo jejich fragmenty, za pomoci standardních technik. Viz například Green a kok, Production of Polyclonal Antisera, v Methods in Molecular Biology: Immunochemical Protočíš, Manson (vyd.), str. 1 až 12 (Humana Press 1992). Viz též Coligan a kok (vyd.), Současné protokoly v imunologii, sv. 1, str. 2,4.1 až 2.4.7 (John Wiley & Sons 1991).

-32CZ 303272 B6

Jinou možností je připravit monoklonální protilátky proti idiotypu tím, že jsou za využití výše popsaných technik použity jako imunogeny protilátky proti BR43x2 nebo jejich fragmenty. Jako jiná alternativa mohou být za využití výše popsaných technik připraveny humanizované protilátky proti idiotypu nebo protilátky primátů proti idiotypu. Metody pro přípravu protilátek proti idiotypu jsou popsány například v Irie, patent US 5 208 146, Greene a kol., patent US 5 637 677 a Varthakavi a Minocha, J. Gen. Virol. 77: 1875, 1996.

Zde uvedené protilátky nebo polypeptidy mohou být přímo nebo nepřímo konjugovány s léky, toxiny, radioaktivní izotopy a podobně, a tyto konjugáty pak použity pro in vivo diagnostické io nebo terapeutické aplikace. Například polypeptidy nebo protilátky, kteréjsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být použity pro identifikaci nebo léčení tkání nebo orgánů, které exprimují odpovídající antikomplementární molekulu (například receptor respektive antigen). Přesněji, polypeptidy BR43x2 nebo protilátky proti BR43x2, nebo biologicky aktivní fragmenty nebo jejich části, mohou být připojeny k detekovatelným nebo cytokinovým molekulám a dopraveny k savčím buňkám, tkáním nebo orgánům, které exprimují antikomplementární molekulu.

K polypeptidu nebo protilátce mohou být přímo nebo nepřímo připojeny vhodné detekovatelné molekuly, jedná se mimo jiné o radioaktivní izotopy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční markéry, chemiluminiscenční markéry, magnetické částice a podobně. K polypepti20 du nebo protilátce mohou být přímo nebo nepřímo připojeny vhodné cytotoxické molekuly, jedná se mimo jiné o bakteriální nebo rostlinné toxiny (například difterický toxin, exotoxin Pseudomonas, ricin, abrin a podobně), rovněž terapeutické radioaktivní izotopy, jako je jód—131, rhenium188 nebo yttrium-90 (buďjsou připojeny kpolypeptidu nebo protilátce přímo nebojsou připojeny nepřímo, například pomocí chelatační složky). Polypeptidy nebo protilátky mohou také být konjugovány s cytotoxickými léky, jako je adriamycin. Při nepřímém připojení detekovatelné nebo cytotoxické molekuly může být detekovatelné nebo cytotoxické molekula konjugována se členem páru komplement/antikomplement, přičemž druhý člen je připojen k polypeptidové nebo protilátkové části. Pro tyto účely je příkladem takového páru komplement/antikomplement pár b i otin/strepta v idin.

Rozpustné polypeptidy BR43x2 nebo protilátky proti BR43x2 mohou být přímo nebo nepřímo konjugovány s léky, toxiny, radioaktivními izotopy a podobně, a tyto konjugáty mohou potom být použity pro in vivo diagnostické nebo terapeutické aplikace. Například polypeptidy nebo protilátky, kteréjsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být použity pro identifikaci nebo léčení tkání nebo orgánů, které exprimují odpovídající antikomplementární molekulu (například receptor respektive antigen). Přesněji, polypeptidy BR43x2 nebo protilátky proti BR43x2, nebo biologicky aktivní fragmenty nebo jejich části, mohou být připojeny k detekovatelným nebo cytotoxickým molekulám a dopraveny k savčím buňkám, tkáním nebo orgánům, které exprimují antikomplementámí molekulu.

K polypeptidu nebo protilátce mohou být přímo nebo nepřímo připojeny vhodné detekovatelné molekuly, jedná se mimo jiné o radioaktivní izotopy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční markéry, chemiluminiscenční markéry, magnetické částice a podobně, K. polypeptidu nebo protilátce mohou být přímo nebo nepřímo připojeny vhodné cytotoxické molekuly, jedná se mimo jiné o bakteriální nebo rostlinné toxiny (například difterický toxin, exotoxin Pseudomonas, ricin, abrini a podobně), rovněž terapeutické radioaktivní izotopy, jako je jód-131, ruthenium-188 nebo yttrium-90 (buď jsou připojeny k polypeptidu nebo protilátce přímo nebo jsou připojeny nepřímo, například pomocí chelatační složky). Polypeptidy nebo protilátky mohou také být konjugovány s cytotoxickými léky, jako je adriamycin. Pri nepřímém připojení deteko50 vatelné nebo cytotoxické molekuly může být detekovatelné nebo cytotoxická molekula konjugována se členem páru komplement/antikomplement, přičemž druhý člen je připojen k polypeptidové nebo protilátkové části. Pro tyto účely je příkladem takového páru komplement/antikomplement pár biotin/streptavidin.

-33CZ 303272 B6

Takové fúzní proteiny polypeptiďtoxin nebo fúzní proteiny proti látka/ fragment-toxin mohou být použity pro potlačení nebo odstranění cílové buňky nebo tkáně (například pří léčení nádorových buněk nebo tkání). Jiná možnost je, pokud polypeptid má mnoho funkčních domén (tj. aktivační doménu nebo doménu pro vazbu ligandu, plus cílovou doménu), pak fúzní protein obsahující pouze cílovou doménu může být vhodný pro nasměrování detekovatelné molekuly, cytotoxické molekuly nebo komplementární molekuly na buňku nebo typ tkáně, o který se jedná. V případech, kdy pouze doména fúzního proteinu obsahuje komplementární molekulu, pak antikomplementární molekula může být konjugována k detekovatelné nebo cytotoxické molekule. Takové fúzní proteiny doména-komplementární molekula tedy představují základní cílené prostředky pro io dopravu konjugátů antikomplementárních-detekovatelných/cytotoxických molekul ke specifickým buňkám/tkáním. Zde popisované konjugáty biologicky aktivních polypeptidů nebo protilátek mohou být podávány nitrožilně, do tepny nebo do kanálku, nebo mohou být podávány lokálně, na místo zamýšleného působení.

Mohou být připraveny protilátky proti rozpustným polypeptidům BR43x2, které jsou označeny His nebo FLAG™. Mohou být také připraveny protilátky proti MBP-fúzním proteinům, produkovaným v E. coli. Alternativně mohou takové proteiny obsahovat fúzní protein s lidským Ig. Zvláště antisérum obsahující protilátky proti rozpustným polypeptidům BR43x2 označeným Hisznačkou nebo FLAG značkou, mohou být použity při imunohistochemické analýze tkáňové distribuce BR43x2 na lidských tkáních nebo tkáních z primátů. Rozpustné polypeptidy BR43x2 mohou být také použity k imunizaci myší pro přípravu monoklonálních protilátek k rozpustnému polypeptidů lidského BR43x2. Monoklonální protilátky k rozpustnému polypeptidů lidského BR43x2 mohou také být použity k napodobení spojení ligand/receptor, výsledkem toho je aktivace nebo inaktivace páru ligand/receptor. Například bylo ukázáno, že křížové propojení mono25 klonálních protilátek proti rozpustnému CD40 je stimulačním signálem pro B buňky, které byly suboptimálně aktivovány protilátkami proti IgM nebo LPS, a výsledkem je množení buněk a produkce imunoglobulinu. Tyto samé monoklonální protilátky, když jsou použity v roztoku, působí jako antagonisti tím, že blokují aktivaci receptoru. Monoklonální protilátky proti BR43x2 mohou být použity pro určování distribuce, regulace a biologické interakce páru jo BR43x2/BR43x2-ligand na specifických buněčných liniích, identifikovaných ve studiích tkáňové distribuce.

Vynález také poskytuje izolované a puntíkované polynukleotidové sondy nebo primery pro BR43x2, TACÍ a BCMA. Takovými polynukleotidovými sondami může být RNA nebo DNA.

DNA může být buď cDNA nebo genomová DNA. Polynukleotidové sondy jsou jed nořetězco v á nebo dvouřetězcové DNA nebo RNA, obecně se jedná o syntetické oligonukleotidy, ale mohou být vytvořeny z klonované cDNA nebo genomových sekvencí a budou obecně obsahovat alespoň 16 nukleotidů, častěji od 17 nukleotidů do 25 nebo více nukleotidů, někdy 40 až 60 nukleotidů a některých případech podstatnou část, doménu nebo dokonce celý gen nebo cDNA BR43x2.

4o Sondy a primery jsou obecně syntetické oligonukleotidy, ale mohou být vytvořeny z klonované cDNA nebo genomových sekvencí nebo jejích komplementů. Analytické sondy budou obecně alespoň 20 nukleotidů dlouhé, třebaže se mohou použít i sondy poněkud kratší (14 až 17 nukleotidů). PCR primery jsou alespoň 5 nukleotidů dlouhé, s výhodou 15 nebo více nt, ještě výhodněji 20 až 30 nt. Krátké polynukleotidy je možno použít, když jsou cílem analýzy malé oblasti genu.

Pro druhé analýzy genů může polynukleotidová sonda obsahovat celý exon nebo více. Aby byl signál sond detekovatelný, mohou být pomocí technik, které jsou v oboru dobře známé, označeny enzymem, biotinem, radioaktivním izotopem, fluorescenčně, chem i luminiscenčně, paramagnetickou částicí a podobně, tyto značky jsou komerčně dostupné z mnoha zdrojů, jako jsou Molecular Probes, Inc., Eugene, OR a Amersham Corp., Arlington Heights, IL. Výhodné oblasti, ze kterých je možno konstruovat sondy, jsou oblasti, které vážou ligand, nedokonalá opakování bohatá na cystein, signální sekvence a podobně. Techniky pro vývoj polynukleotidových sond a hybridizační techniky jsou v oboru známé, viz například Ausubel a kok, vyd., Současné protokoly v molekulární biologii, John Wiley and Sons, lne., NY, 1991. Polypeptidy BR43x2, TACÍ a BCMA a protilátky proti nim mohou být použity v diagnostických systémech pro detekování přítomnosti

BR43x2, TACÍ a BCMA a polypeptidů ligandů BR43x2, TACÍ a BCMA, jako je ztnf4. Informa-34CZ 303272 B6 ce odvozená z takových detekčních metod by poskytla hlubší pohled na význam polypeptidů BR43x2 v různých nemocích a na to, jak mohou sloužit jako diagnostické nástroje u nemocí, pro něž jsou významné změněné hladiny BR43x2. Změněné hladiny polypeptidů receptorů BR43x2. TACÍ a BCMA mohou být znakem patologických stavů, včetně rakoviny, autoimunních poruch a infekčních nemocí.

V základním testuje molekula jednořetězcové sondy inkubována s RNA, izolovanou z biologického vzorku, za takových podmínek teploty a iontové síly, které podporují párování bází mezí sondou a cílovým druhy RNA BR43x2, TACÍ a BCMA. Po oddělení nevázané sondy od hybridiio zovaných molekul, je množství hybridů detekováno.

Zavedené hybridizační metody pro detekci RNA zahrnují analýzu typu Northern a dot/slot blot hybridizaci (viz například Ausubel a kol., vyd., Současné protokoly v molekulární biologii, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1991 a Wu a kol., (vyd.) Analýza exprese genů na úrovni RNA, is v Metody genové biotechnologie, str. 225 až 239, (CRC Press, lne. 1997)). Sondy nukleové kyseliny mohou být kvůli detekci značeny radioaktivními izotopy jako je P nebo ³⁵S. Jiná možnost je detekovat BR43x2 RNA pomocí neradioaktivních hybridizačních metod (viz například Isaac (vyd.) Protokoly pro analýzu nukleové kyseliny pomocí neradioaktivních sond, Humana Press, Inc., 1993). V typickém případě je neradioaktivní detekce dosaženo pomocí enzymatické pře20 měny chromogenních nebo chem i luminiscenčních substrátů. Pro ilustraci je možno jako neradioaktivní uvést biotin, fluorescein a digoxigenin.

Oligonukleotidové sondy BR43x2, TACÍ a BCMA jsou také užitečné pro diagnózu in vivo. Pro ilustraci, jedinci mohou být podány oligonukleotidy značené ¹⁸F a poté vizualizovány pomocí emisní pozitronové tomografie (Tavitian a kok, Nátuře Medicine 4: 467, 1998).

Řada diagnostických procedur využívá pro zvýšení citlivosti detekčních metod výhodu polymerázové řetězové reakce (PCR). Standardní techniky provádění PCR jsou dobře zavedeny (obecně viz Mathew (vyd.), Protokoly v lidské molekulární genetice (Humana Press, Inc. 1991), White (vyd.), PCR protokoly: Současné metody a aplikace (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (vyd.),

Molekulární diagnostika rakoviny (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek a Walaszek (vyd.) Protokoly nádorových markérů (Humana Press, Inc. 1998), Lo (vyd.), Klinické aplikace PCR (Humana Press, Inc. 1998) a Meltzer (vyd.) PCR v bioanalýze (Humana Press, Inc. 1998)). Pro PCR mohou být navrženy primery tak, aby byla amplifikována sekvence kódující určitou domé35 nu nebo motiv BR43x2, jako jsou například nedokonalá opakování bohatá na cystein v BR43x2, TACÍ nebo BCMA.

Jednou variantou PCR diagnostických testů je PCR pomocí reverzní transkriptázy (RT-PCR).

V technice RT-PCR je z biologické vzorku izolována RNA, reverzně transkribována na cDNA a cDNA je inkubována s BR43x2 primery (viz například Wu a kol., (vyd.), Rychlá izolace specifických cDNA nebo genů pomocí PCR, v Metody genové biotechnologie, CRC Press, lne., str. 15 až 28, 1997). Potom je provedena PCR a její produkty jsou analyzovány pomocí standardních metod.

Pro ilustraci, RNA je izolována z biologického vzorku například pomocí metody lyžování buněk guanidinium-thiokyanátem, která byla výše popsána. Alternativně je možno pro izolaci mRNA z buněčného lyzátu použít techniku pevné fáze. Jako primery pro reakci reverzní transkripce mohou být u izolované RNA použity náhodné oligonukleotidy, krátké homopolymery dT nebo antisense oligomery BR43x2, TACÍ nebo BCMA. Oligo-dT primery mají tu výhodu, že jsou ampli50 ftkovány různé nukleotidové sekvence mRNA, které mohou sloužit jako kontrola cílových sekvencí. Sekvence BR43x2, TACÍ nebo BCMA jsou amplifikovaný polymerázovou řetězovou reakcí pomocí dvou oligonukleotidových příměrů, sousedících s danou oblastí, které jsou alespoň 5 bází dlouhé.

-35CZ 303272 B6

Produkty PCR amplifikace mohou být detekovány pomocí řady přístupů. Například PCR produkty mohou být ťrakcionovány pomocí gelové elektroforézy a zviditelněny barvením ethidiumbromidem. Jiná možnost je přenést frakcionované produkty na membránu, hybridizovat s označenou BR43x2 sondou a testovat autoradiograflcky. Mezi jiné přístupy patří použití deoxyribo5 nukleotidtrifosfátů značených digoxigeninem a provedení chemiluminiscenční detekce a kolorimetrický test C-TRAK.

Jiným přístupem je kvantitativní PCR v reálném čase (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Ct.). Fluorogenní sonda, která se skládá z oligonukleotidu ke kterému je připojena jak reportérova, tak zhášecí barevná skupina, hybridizuje specificky mezí přímý a reverzní primer. Vlivem 5' endonukleázové aktivity Taq DNA polymerázy je reportérova barevná skupina oddělena od zhášecí barevné skupiny, vytvoří se tak sekvenčně specifický signál, který se zvyšuje stejně, jak se zvyšuje amplifikace. Intenzita fluorescence může být v průběhu PCR reakce kontinuálně sledována a kvantifikována.

Jiným přístupem pro detekci exprese BR43x2, TACÍ nebo BCMA je technologie cyklování sondy (CPT), při níž se jednořetězcová cílová DNA váže s přebytkem chimémí sondy DNARNA-DNA a vytváří komplex, jeho RNA část je štěpena Rnázou H, a je detekována přítomnost štěpené chimérní sondy (viz například Beggs a kol., J. Clin. Microbiol. 34: 2985, 1996 a Bekka20 nou i a kol., Biotechnologíes 20: 240, 1996). Alternativní metody pro detekci sekvencí BR43x2, TACÍ nebo BCMA mohou využívat přístupy jako je amplifikace založená na sekvenci nukleové kyseliny (NASBA), kooperativní amplifikace založená na sekvenci nukleové kyseliny (NASBA), kooperativní amplifikace matric pomocí křížové hybridizace (CATCH) a ligázová řetězové reakce (LCR) (viz například Marshall a kol., patent US 5 686 272 (1997), Dyer a kol., J. Virol.

Methods 60: 161, 1996; Ehricht a kol, Eur. J. Biochem. 243: 358, 1997 a Chadwick a kol, J. Virol Methods 70: 69, 1998). Osobám se zkušeností v oboru jsou známy i jiné standardní metody.

Sondy a primery BR43x2, TACÍ a BCMA mohou být také použity pro detekci a lokalizaci geno30 vé exprese BR43x2, TACÍ a BCMA ve vzorcích tkání. Metody pro takovou in šitu hybridizaci jsou osobám se zkušeností v oboru dobře známy (viz například Choo (vyd.), Protokoly pro hybridizaci in šitu, Humana Press, lne., 1994; Wu a kol. (vyd.), Analýza buněčné DNA nebo nadbytku RNA pomocí radioaktivní Ín sítu hybridizace (RISH), v Metody genové biotechnologie, CRC Press, lne., str. 259 až 278, 1997 a Wu a kol (vyd.), Analýza buněčné DNA nebo nadbytku mRNA pomocí radioaktivní hybridizace in sítu (RISH), v Metody genové biotechnologie, CRC Press, lne., str. 279 až 289, 1997).

Osobám se zkušeností v oboru jsou dobře známy další diagnostické přístupy (viz například Mathew (vyd.), Protokoly v lidské molekulární genetice, Humana Press, lne., 1991; Coleman

4o a Tsongalis, Molekulární diagnostika, Humana Press, lne., 1996 a Elles, Molekulární diagnostika genetických chorob, Humana Press, lne., 1996).

Dále mohou být takové polynukleotidové sondy použity pro hybridizaci s odpovídajícími sekvencemi na jednotlivých chromozomech. Chromozomální identifikace a/nebo mapování genu

BR43x2 může poskytnout užitečnou informaci o funkci genu a jeho spojení s chorobou. Osoby se zkušeností v oboru mají k dispozici mnoho mapovacích technik, například mapování hybridů somatických buněk a fluorescenční hybridizace in šitu (FISH). Výhodnou metodou je radiační hybridní mapování. Radiační hybridní mapování je genetická technika pro somatické buňky, vyvinutá pro konstruování souvislých map lidských chromozomů s vysokým rozlišením (Cox so a kol, Science 250. 245-50, 1990). Částečná nebo úplná znalost sekvence genu umožňuje navržení PCR primerů vhodných pro použití s chromozomálními mapovacími panely radiačních hybridů. Mapovací panely radiačních hybridů, které pokrývají celý lidský genom, jako jsou Stanford G3 RH Panel a GeneBridge 4 RH Panel (Research Genetics, lne., Hunstville, AL), jsou komerčně dostupné. Tyto panely umožňují rychlou, na PCR založenou, chromozomální lokaliza55 ci a zjištění pořadí genů, sekvenčně označených míst (STS) a jiných nepolymorfních a polymorf-36CZ 303272 B6 nich markérů v zájmové oblasti. To zahrnuje stanovení přímo úměrných fyzikálních vzdáleností mezi nově objevenými geny, o které se jedná, a dříve mapovanými markéry. Přesná znalost polohy genů může být užitečná pro různé účely, mimo jiné: 1) určení, zda sekvence je částí existujícího kontigu a získání dalších okolních genetických sekvencí v různých formách, jako jsou YAC,

BAC nebo cDNA klony, 2) poskytnutí možného kandidátního genu pro dědičnou chorobu, která vykazuje vazbu k téže oblasti chromozomu a 3) poskytnutí možného kandidátního genu pro modelové organizmy, jako je myš, které mohou být užitečné a nápomocné pri zjišťování, jakou funkci určitý gen může mít.

io Chromozomální lokalizace může být také provedena za pomoci STS. STS je DNA sekvence, která je jedinečná v lidském genomu a může být použita jako vztažný bod pro určitý chromozom nebo oblast chromozomu. STS může být definována pomocí páru oligonukleotidových primerů, které mohou být použity v polymerázové řetězové reakci pro specifickou detekci tohoto místa, v přítomnosti všech ostatních genomových sekvencí. Protože STS jsou založeny pouze na DNA is sekvenci, mohou být kompletně popsány v databázi, například Databáze sekvenčně značených míst (dbSTS), GenBank, (Národní centrum pro biologické informace, Národní zdravotní instituty, Bethesda, MD http://www.ncbi.nlm.nih.gov), mapová data obsažená uvnitř těchto krátkých význačných orientačních STS sekvencí genomu mohou být vyhledávána spolu s genovou, sekvencí, o kterou se jedná.

Předložený vynález také poskytuje reagencie pro další diagnostické aplikace. Například gen BR43x2, sonda obsahující BR43x2 DNA nebo RNA, nebo jeho sekvence může být použita pro určování, zda je BR43x2 gen přítomen na určitém chromozomu nebo zda nastala mutace. Detekovatelné chromozomální odchylky v lokusu, genu BR43x2 zahrnují mimo jiné aneuploidii, změny počtu genových kopií, inzerce, delece, změny restrikčních míst a změny uspořádání. Tyto odchylky mohou nastat uvnitř kódující sekvence, uvnitř intronů nebo v okolních sekvencích, včetně promotorových a regulačních oblastí, nacházejících se proti směru přepisu, a mohou se projevovat jako fyzické změny uvnitř kódující sekvence nebo změnami v úrovni exprese genu.

ao Obecně tyto diagnostické metody obsahují kroky a) získání genetického vzorku od pacienta; b) inkubace genetického vzorku s polynukleotidovou sondou nebo primerem, jak bylo popsáno výše, za podmínek kdy polynukleotid bude hybridizovat s komplementární polynukleotidovou sekvencí a vytvářet první reakční produkt; a c) porovnání prvního reakčního produktu s kontrolním reakčním produktem. Rozdíly mezi prvním reakčním produktem a kontrolním reakčním pro35 duktem jsou znakem genetické abnormality u pacienta. Genetické vzorky, vhodné pro použití v rámci předloženého vynálezu, zahrnují genomovou DNA, cDNA a RNA. Polynukleotidovou sondou nebo primerem může být RNA nebo DNA a bude obsahovat část SEQ ID NO: 3, sekvenci komplementární k SEQ ID NO: 1 nebo jejich RNA ekvivalent. Mezi vhodné testy v tomto směru patří takové techniky, které jsou známy osobám se zkušeností v oboru, jako jsou analýza polymorfízmu restrikčních fragmentů (RFLP) analýza krátkých tandemových repetic (STR) používající PCR techniky, ligační řetězová reakce (Barany, PCR Methods and Application 1: 516, 1991), testy protekce před ribonukleázou a jiné techniky genetické vazebné analýza, známé v oboru (Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel a kol, vyd., Současné protokoly v molekulární biologii, John Wiley and Sons, lne., NY, 1991; Marian, Chest 108: 255-65, 1995). Testy protekce před ribonukleázou (viz např. Ausubel a kol., vyd.. Současné protokoly v molekulární biologii, John Wiley and Sons, lne., NY, 1991; Marian, Chest 108: 255-65, 1995, kap. 4) obsahují hybridizaci RNA sondy ke vzorku RNA od pacienta a poté je reakční produkt (RNA-RNA hybrid) vystaven RNáze. Hybridizované oblasti RNA jsou před štěpením chráněny. V PCR testech je genetický vzorek od pacienta inkubován s párem polynukleotidových primerů a oblast mezi příměry je amplifikována a izolována. Změny ve velikosti nebo množství získaného produktu jsou znakem mutací u pacienta. Jiná technika založená na PCR, která může být použita, je analýza jednořetězcového konformačního polymorfízmu (SSCP) (Hayashi, PCR metody a aplikace 1:348, 1991).

-37CZ 303272 B6

Aby se dosáhlo potlačení transkripce genů BR43x2, TACÍ nebo BCMA, mohou být použity antisense metody, jako např pro potlačení vývoje B buněk a interakce s jinými buňkami. Jsou navrženy polynukleotidy, které jsou komplementární k úseku polynukleotidů kódujícího BR43x2, TACÍ nebo BCMA (např. polynukleotid uvedený v SEQ ID NO: 3), které se vážou k mRNA kódující BR43x2, TACÍ nebo BCMA, a inhibují translaci této mRNA. Takové antisense polynukleotidy jsou použity pro inhibici exprese genů kódujících polypeptid BR43x2, TACÍ nebo BCMA v buněčné kultuře nebo v jedinci.

Mohou také být připraveny myši geneticky upravené tak, aby exprimovaly BR43x2, TACÍ nebo io BCMA, označované jako „transgenní myši“ a myši, kterým funkce BR43x2, TACÍ nebo BCMA zcela chybí, označované jako „knockoutované myši“ (Snouwaert a kol., Science 257: 1083, 1992;

Lowell a kok, Nátuře 366: 740-42, 1993; Capecchi, Science 244: 1288-92, 1989; Palmiter a kol., Annu. Rev. Genet. 20: 465-99, 1986). Například transgenní myši, které syntetizují nadbytek BR43x2, TACÍ nebo BCMA bud všeobecně nebo specificky v určité tkáni nebo pod promotorem i? omezeným na určitou tkáň, mohou být použity k řešení otázky, zda nadbytečná exprese způsobuje specifický fenotyp. Například nadbytečná exprese standardního typu polypeptidů BR43x2,

TACÍ nebo BCMA, fragmentu polypeptidů nebo jejich mutace, může změnit normální buněčné procesy a mít za následek fenotyp, který vyznačuje tkáň ve které je exprese BR43x2, TACÍ nebo BCMA funkčně významná, a může znamenat léčebný cíl pro BR43x2, TACÍ nebo BCMA nebo pro jejich agonisty nebo antagonisty. Například je výhodné připravit takovou transgenní myš, která v nadbytku produkuje BR43x2, TACÍ nebo BCMA. Dále taková nadbytečná exprese může mít za následek fenotyp, který vykazuje podobnost s lidskými chorobami. Podobně myš s knockoutovaným BR43x2, TACÍ nebo BCMA může být použita pro určení, kde in vivo je BR43x2 absolutně vyžadován. Podle fenotypu knockoutované myši je možno předpovědět in vivo účinky, které mohou mít antagonisti BR43x2, TACÍ nebo BCMA, které jsou předmětem tohoto vynálezu. Lidská BR43x2, TACÍ nebo BCMA cDNA může být použita pro izolaci myší BR43x2, TACÍ nebo BCMA mRNA, cDNA a genomové DNA, které jsou potom použity pro přípravu knockoutované myši. Tyto myši mohou být použity pro studium BR43x2, TACÍ nebo BCMA genu a jím kódovaného proteinu v in vivo systému, a mohou být použity jako in vivo modely pro odpovída30 jící lidské choroby. Dále transgenní exprese BR43x2, TACÍ nebo BCMA antisense polynukleotidů nebo ribozymů, namířených proti BR43x2, TACÍ nebo BCMA, která je zde popsána, může být použita analogicky k transgenním myším, popsaným výše.

Farmaceuticky účinná množství polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být sestavena běžnými metodami s farmaceuticky přijatelnými nosiči pro parenterální, orální, nosní, rektální, místní, dermální podávání nebo podobně. Přípravky mohou dále obsahovat jeden nebo více ředidel, plnidel, emulgátorů, konzervačních činidel, pufrů, excipientu a podobně, a mohou být podávány v takových formách jako jsou například roztoky, prášky, emulze, Čípky, lipozómy, kožní náplasti a tablety. Aby byl zabezpečen kontinuální nebo dlouhodobý zdroj BR43x2 polypeptidů nebo antagonisty, mohou být se zde popsanými prostředky také použity dodávací systémy pro pomalé či zvýšené uvolňování, včetně jakéhokoli z množství biologických polymerů (systémy na biologickém základě), systémy využívající lipozómy a polymerové dodávací systémy. Takové systémy pro pomalé uvolňování jsou použitelné například pro přípravky pro orální, místní a parenterální použití. Termín „farmaceuticky přijatelný nosič“ označuje nosičové médium, které neinterferuje s účinností biologické aktivity aktivních složek a které není pro hostitele nebo pacienta toxické. Osoba se zkušeností v oboru může sestavit sloučeniny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, vhodným způsobem a v souhlase s přijatou praxí, jak je uvedeno v Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, vyd., Mack Publishing Co., Easton PA, 19. vyd. 1995.

Zde použitý termín „farmaceuticky účinné množství“ polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA, agonistů nebo antagonisty, je množství postačující k indukci požadovaného biologického výsledku. Výsledek může být zmírnění příznaků, symptomů nebo příčin nemoci, nebo jakákoli jiná požadovaná změna biologického systému. Například účinné množství polypeptidů BR43x2,

TACÍ nebo BCMA je takové, která poskytne buď subjektivní úlevu od příznaků nebo objektivně

-38CZ 303272 B6 zjistitelné zlepšení, pozorované klinikem nebo jiným kvalifikovaným pozorovatelem. Například účinné množství polypeptidu BR43x2, TACÍ nebo BCMA nebo rozpustného fúzního polypeptidu by poskytlo snížení odpovědi B buněk v průběhu imunitní odpovědi, potlačení nebo snížení produkce autoproti látek, potlačení nebo zmenšení příznaků spojených s SLE, MG nebo RA. Účinná s množství BR43x2, TACÍ nebo BCMA sníží procento B buněk v periferní krvi. Účinná množství polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA mohou široce varírovat v závislosti na nemoci nebo příznaku, který má být léčen. Množství polypeptidu, které bude podáváno a jeho koncentrace v přípravku závisí na vybraném nosiči, způsobu podávání, síle účinku určitého polypeptidu, klinických podmínkách pacienta, vedlejších účincích a stabilitě sloučeniny v přípravku. Klinik tedy použije vhodný prostředek obsahující vhodnou koncentraci v přípravku, rovněž množství podaného přípravku, v závislosti na klinické zkušenosti s pacientem o kterého se jedná nebo s pacienty podobnými. Takové množství bude záviset částečně na určitém léčeném stavu, věku, váze a všeobecném zdravotním stavu pacienta a jiných faktorech, které jsou zřejmé osobám se zkušeností v oboru. V typickém případě bude dávka v rozmezí 0,1 až 100 mg/kg hmotnosti jedince.

Dávky pro specifické sloučeniny mohou být určeny ze studií in vitro nebo ex vivo, v kombinaci se studiemi na pokusných zvířatech. Koncentrace sloučenin, které byly zjištěny jako účinné in vitro nebo ex vivo, poskytují vodítko pro studie na zvířatech, kde dávky jsou spočítány tak, aby zabezpečily v místě působení podobné koncentrace.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje porovnání aminokyselinových sekvencí mezi BR43x2, TACÍ (von Bul low a Bram, Science 278: 138-41, 1997) (SEQ ID NO: 6), BCMA (Gras a kol., tamtéž) (SEQ ID

NO: 6) a BR43xl (SEQ ID NO: 7). Jsou vyznačeny na cystein bohatá nedokonalá opakování a transmembránová doména.

Obrázek 2 ukazuje analýzu vynesení podle Scatcharda pro rozpustný I^l25-ztnf4, vázající se k TACÍ a BMCA, které jsou exprimovány stabilně transfekovanými buňkami BHK.

Obrázek 3A ukazuje jak ztnf4 aktivuje lidské B lymfocyty k proliferací a sekreci imunoglobulinu.

Obrázek 3B ukazuje hladiny IgM a IgG měřené v supematantech získaných z B buněk, stimulo35 váných rozpustným ztnf4 v přítomnosti IL4 nebo IL-4+IL5, po 9 dnech v kultuře.

Obrázek 4 ukazuje B buňky z lidské periferní krve, stimulované rozpustným ztnf4 nebo kontrolním proteinem (ubiquitin) v přítomnosti IL4 po dobu 5 dní in vitro. Vyčištěný TACl-Ig, BMCAIg a kontrolní Fc byly testovány na inhibování proliferace specifické pro ztnf4.

Obrázek 5A ukazuje výsledky ze zvířat transgenních na ztnf4, u kterých se vyvinuly charakteristiky SLE.

Obrázek 5B ukazuje buňky lymfatické uzliny, sleziny a brzlíku ze zvířat transgenních na ztnf4, barvené pomocí protilátek proti CD5, CD4 a CD8.

Obrázek 5C ukazuje celkové hladiny IgM, IgG a IgE v séru zvířat transgenních na ztnf4, starých v rozmezí od 6 do 23 týdnů.

Obrázek 5D ukazuje ukládání amyloidu a ztloustnutí mesangia v ledvinových klubíčkách, zjištěné na řezech ledvin ze zvířat transgenních na ztnf4.

Obrázek 5E ukazuje efektorové T buňky z myších transgenních na ztnf4.

-39CZ 303272 B6

Obrázky 6A a 6B ukazují zvýšené hladiny ztnf4 v séru získaném z ZNBWF 1 a MRL/lpr/Ipr myší, které korelují s vývojem SLE.

Obrázek 7 ukazuje procento NZBWF1 myší, u kterých se v průběhu studie vyvinulo vylučování proteinů močí.

Obrázek 8 ukazuje hladiny anti-dsDNA zjišťované pomocí ELISA u myší transgenních na ztnf4a kontrolních jedinců z téhož vrhu, v porovnání se sérem z ZNBWF1 a MRL/Ipr/lpr myší.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Identifikace BR43x2

IsoformaTACI byla klonována z RPMI knihovny pomocí přístupu se zachycením pomocí sekrece. Knihovna RPMI 1788 (aktivovaná linie B buněk) byla uspořádána pomocí dvaceti 96-jamkových destiček. Každá jamka obsahovala asi 100 kolonií E. coli, přičemž každá kolonie obsahovala 1 cDNA klon. Pomocí zařízení TomTech Quadra 9600 byly připraveny minipreparáty DNA v 96-jamkovém formátu. Izolované DNA byly potom spojeny do 120 směsí, z nichž každá představovala 1600 klonů. Tyto směsi byly transfekovány do buněk Cos-7 a vysety do 12-jamkových destiček. Tři mikrolitry směsné DNA a 5 μί LipofectAMINE byly smíchány v 92 μί média DMEM bez séra (55 mg pyruvátu sodného, 146 mg L-glutaminu, 5 mg transferinu, 2,5 mg inzulínu, 1 pg selenu a 5 mg fetuinu v 500 ml DMEM), inkubovány při teplotě místnosti po dobu 30 minut a potom bylo přidáno 400 μί média DMEM bez séra. Směs DNA-LipofectAMINE byla přidána na 220 000 buněk COS-7/jamku, vysetých v 12-jamkových tkáňových destičkách a inkubovány po dobu 5 hodin při teplotě 37 °C. Po inkubaci bylo ke každé jamce přidáno 500 μΙ 20% FBS DMEM média (100 ml FBS, 55 mg pyruvátu sodného a 146 mg L-glutaminu v 500 ml DMEM) a buňky byly inkubovány přes noc.

Výběr pomocí zachycení sekrece byl proveden biotinylovaným ztnf4, označeným pomocí FLAG. Buňky byly opláchnuty PBS a fixovány po dobu 15 minut s 1,8% formaldehydem v PBS. Buňky byly potom promyty pomocí TNT (0,lM Tris-HCl, 0,15M NaCl a 0,05% Tween-20 v H₂O). U buněk byla učiněna buněčná membrána prostupnou pomocí 0,1% Tritonu-X v PBS po dobu 15 minut a potom následovalo promytí v TNT, Buňky byly blokovány po dobu 1 hodiny s TNB (0,lM Tris-HCl, 0,15M NaCl a 0,5% Blokující činidlo) za použití soupravy NEN Renaissance® TSA-Direct Kit (NEN, Boston, MA) podle návodu výrobce. Buňky byly promyty pomocí TNT a blokovány po dobu 15 minut s avidinem a potom biotinem (Vector Labs Cat # SP-2001), mezi těmito kroky byly buňky promývány TNT. Buňky byly inkubovány po dobu 1 hodiny s 1 μg/ml ztnf4/Flag/biotin v TNB, poté následovalo promytí sTNT. Buňky byly potom inkubovány po dobu 1 hodiny s 1:300 ředěním streptavidin-HRP (NEN) v TNB a promyty s TNT. Hybridizace byla detekována činidlem fluorescein tyramid ředěným 1:50 v ředícím pufru (NEN), inkubovány 4,4 minuty a promyty TNT. Buňky byly uchovány v médiu Vectashield Mounting Medium (Vector Labs, Burlingame, CA), ředěném 1:5 v TNT.

Buňky byly vizualizovány pomocí fluorescenční mikroskopie s použitím filtru FITC. Dvanáct směsí bylo pozitivních na vazbu ztnf4. Směs D8 (představující 1600 klonů) byla rozdělena a byl izolován jeden klon (D8-1), pozitivní na vazbu ztnf4. Sekvenční analýza odhalila, že klon D8-1 obsahoval polypeptidovou sekvenci, která kódovala isoformu TACÍ, v níž první nedokonalé opakování TACÍ bohaté na cystein Phe21 až Arg67, bylo zaměněno jedním aminokyselinovým zbytkem, tryptofanem. Tato isoforma byla označena BR43x2, jejíž polynukleotidové sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 1.

-40CZ 303272 B6

Příklad 2: Lokalizace BR43x2 v lymfocytech a monocytech

Pro lokalizaci exprese BR43x2 v T a B buňkách a monocytech byla použita PCR reakce prováděná pomocí reverzní transkriptázy. Oligonukleotidové primery ZC19 980 (SEQ ID NO: 15) a ZC 19 981 (SEQ ID NO: 16) byly použity pro prohledávání cDNA z CD 19', CD3⁺ a monocytů na BR43, Reakce s reverzní transkriptázou byla provedena při 94 °C po dobu 3 minut, následovalo 30 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 68 °C po dobu 2 minut a 72 °C po dobu 1 minuty, nakonec následovalo 7 minutové prodloužení pri 72 °C. Zóna o očekávané délce 720 bp byla detekována pouze v B buňkách a nikoli v aktivovaných T buňkách, jak bylo po použití protilátek io publikováno pro TACÍ (von Biillow a Bram, Science 278: 138-41, 1997).

Příklad 3: Test množení B buněk za použití BR43 ligandu ztnf4 ís Lahvička obsahující lxl0⁸ zmražených mononukleámích buněk z periferní krve (PBMC) byla rychle rozmražena ve vodní lázni 37 °C a resuspendována v 25 ml média pro B buňky (Dulbeccovo médium modifikované Iscovem, 10% tepelně inaktivované fetální hovězí sérum, 5% Lglutamin, 5% Pen/Strep) v 50ml zkumavce. Životaschopnost buněk byla testována pomocí trypanové modři (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Deset mililitrů Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia

KLB Biotechnology lne., Piscataway, NJ) bylo navrstveno pod buněčnou suspenzi a centrifugováno po dobu 30 minut pri 1800 otáčkách za minutu a ponecháno zastavit bez brždění. Potom byla vrstva mezifáze odebrána a přenesena do čerstvé 50ml zkumavky, doplněna do výsledného objemu 40 ml PBS a centrifugována po dobu 10 minut při 1200 otáčkách za minutu s bržděním. Životaschopnost izolovaných B buněk byla testována pomocí trypanové modři. B buňky byly resuspendovány na konečnou koncentraci lxl0⁶ buněk/ml v médiu pro B buňky a vysety v objemu 180 μΙ/jamku do 96-jamkových destiček se dnem ve tvaru „U“ (Falcon, VWR, Seattle, WA).

K buňkám byl přidán jeden z následujících stimulátorů, kterým byl objem doplněn do 200 μΙ/jamku:

Rozpustný ztntMsCF značený pomocí FLAG nebo ztnf-4sNF, při 10-násobných ředěních od 1 mg do 1 ng/ml buď samotný, s 10 pg/ml anti-IgM (kozí protilidský IgM) ředěný vNaHCCh, pH 9,5, (Southern Biotechnology Associates, lne., Birmingham, AL); nebo s 10 pg/ml anti-lgM a 10 ng/ml rekombinantního lidského IL4 (ředěný v PBS a 0,1% BSA). Dále rovněž byly testo35 vány jiné cytokiny, jako je ÍL-3 a ÍL-6, stejně tak i rozpustná protilátka CD40 (sCD40) (Pharmingen, San Diego, CA). Jako kontrola byly buňky inkubovány s 0,1% hovězím sérovým albuminem (BSA) a PBS, 10 pg/ml anti-lgM nebo 10 pg/ml anti-IgM a 10 ng/ml IL4 (nebo jiné cytokiny). Buňky byly potom inkubovány při 37 °C v inkubátoru s vlhkou atmosférou po dobu 72 hodin. Šestnáct hodin před závěrečným odebíráním buněk bylo ke všem jamkám přidáno

1 pCi ³H-thymidinu. Buňky byly potom odebrány do 96-jamkové filtrační destičky (UniFilter

GF/C, Packard, Meriden, CT) kde byly sesbírány pomocí zařízení na sbírání buněk (Packard) a shromážděny podle návodu výrobce. Destičky byly sušeny při 55 °C po dobu 20 až 30 minut a dno jamek bylo utěsněno pomocí matného těsnění pro tyto destičky. Ke každé jamce bylo přidáno 0,25 ml scintilační tekutiny (Microscint-O, Packard) a destička byla změřena pomocí zařízení pro měření scinti láce TopCount Microplate Scinti llation Counter (Packard).

Pro měření indukování produkce IgG jako odpověď na různé mitogeny B buněk po stimulaci purifikovaných B buněk, byly buňky připraveny podle popsaného postupu a inkubovány po dobu 9 dní. Supematant z buněk byl sbírán pro zajištění produkce IgG.

Pro měření aktivace markérů na buněčném povrchu jako odpověď na různé mitogeny B buněk po stimulaci purifikovaných B buněk, byly buňky připraveny podle výše popsaného postupu, ale inkubovány pouze po dobu 48 hodin. Markéry na buněčném povrchu byly měřeny pomocí FACS analýzy.

-41 CZ 303272 B6

Množení purifikovaných lidských B buněk, stimulovaných různými mitogeny B buněk je souhrnně uvedeno v tabulce 5.

Tabulka 5

Stimul Proliferativní index ztnf4 1,5 io ztnf4 + IL4 9,9 ztnf4 + anti-IgM + 1L4 15,8

Byl vidět synergický efekt ztnf4 s IL4, IL3 (10 pg/ml) a IL6 (10 pg/ml) na množení B buněk. Při použití sCD40 bylo viditelné dvojnásobné zvýšení signální schopnosti B buněk.

Indukce produkce IgG (ng/ml) jako odpověď na různé mitogeny B buněk po stimulaci purifikovaných B buněk je souhrnně uvedena v tabulce 6.

Tabulka 6

Stimul	Kontrola	Ztnf4
anti-IgM	3	7,5
anti-IgM + IL—4	13	32
anti-IgM + IL-4 + IL—5	10	45

Bylo vidět zvýšení aktivace markérů na povrchu buněk po stimulaci purifikovaných B buněk samotným ztnf4 nebo s anti-IgM nebo anti-IgM + IL-4. Neprojevil se žádný vliv na množení PBMNC v přítomností optimálních nebo suboptimálních mitogenů T buněk. Také nebyl zjištěn vliv LPS stimulace na produkci TNFa u purifikovaných monocytů.

Obrázek 3 ukazuje současnou aktivaci lidských B lymfocytů k proliferaci a sekreci imunoglobulinu pomocí rozpustného ztnf4. Obrázek 3 A ukazuje proliferaci purifikovaných lidských B buněk z periferní krve jako odpověď na stimulaci pomocí rozpustného ztnf4 (25 ng/ml) v přítomnosti

IL—4 samotného a IL-4 s anti-IgM, anti-CD40 nebo anti-CD19, po pěti dnech v kultuře. Obrázek 3B ukazuje hladiny IgM a IgG měřené v supematantech získaných z lidských B buněk stimulovaných pomocí rozpustného ztnf4 v přítomnosti IL—4 nebo IL—4 + IL—5, po devíti dnech v kultuře.

Tyto výsledky naznačují, že rozpustný ztnf4 je molekula aktivující B buňky, která působí se spolupráci sjinými stimulátory B buněk a slabě i samotná. Rozpustný ztnf4 podněcuje množení B buněk a produkci Ig. Zvýšení aktivity adhezních molekul, současně stimulujících molekul a aktivace receptorů naznačuje roli pri podporování APC funkce B buněk.

Obrázek 4 ukazuje stimulaci B buněk lidské periferní krve pomocí rozpustného ztnf4 (25 ng/ml) nebo kontrolního proteinu (ubiquitin) v přítomnosti 10 ng/ml IL—4 po pěti dnech in vitro. Purifikované TACI-lg, BCMA-lg nebo kontrolní Fc byly testovány na inhibici proliferace specificky vyvolané rozpustným ztnf4.

-42CZ 303272 B6

Příklad 4: Selekce BHK buněk transformovaných TACÍ a BCMA pomocí vazby ztnf4

BHK buňky exprimující vysoké hladiny proteinu TACÍ byly selektovány pomocí klonování smě5 si transfekovaných buněk. Transfekované buňky (2x1 Oj byly inkubovány na ledu po dobu 30 minut s biotinylovaným ztnf4 v koncentraci 1 pg/ml ve vazebném pufru (PBS, 2% BSA, 0,02% NaNj). Buňky byly 2x promyty vazebným pufrem, potom inkubovány s SA-PE (Caítag) (ředění 1:1000 ve vazebném pufru) na ledu po dobu 30 minut. Buňky byly potom 2x promyty vazebným pufrem a odečítány pomocí metody FACS (FACS Vantage, Becton Dickinson). Byly to vybrány klony s nejvyšší schopností vázat TNF4.

BHK buňky exprimující vysoké hladiny proteinu BCMA byly selektovány pomocí povrchového značení směsi transfekovaných buněk exprimujících BCMA pomocí biotinylovaného ztnf4. Poté následoval streptavidin-Phyco-Erythrin (SA-PE Calteg Burlingame, CA) a sterilní třídění jasně is svítících buněk v FL2 na zařízení FACS Vantage (Becton Dickinson). Jednotlivé kolonie pak byly testovány na vázání ztnf4.

Příklad 5: Distribuce v tkáních

Mnohočetné Northern bloty z lidských tkání (MTN I, MTN II a MTN III; Clontech) byly testovány, aby se zjistila tkáňová distribuce exprese lidského BR43x2 a TACÍ. Sonda dlouhá přibližně 500 bp (SEQ ÍD NO: 21) byla amplifikována za použití BR43x2 (SEQ ID NO: 1) jako matrice a oligonukleotidu ZC 20 061 (SEQ ID NO: 22) a ZC 20 062 (SEQ ID NO: 23) jako primerů. Tato sekvence je totožná s homologickou oblastí TACÍ. Amplifíkace byla provedena následujícím způsobem: 1 cyklus při 94 °C po dobu 1,0 minuty, 30 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 60 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 30 sekund, následováno 1 cyklem pri 72 °C po dobu 10 minut. Produkty PCR reakce byly vizualizovány pomocí elektroforézy v agarózovém gelu a produkt PCR reakce o délce 500 bp byl purifikován pomocí soupravy Gel Extraction Kit (Qiagen, Chats30 worth, CA) podle návodu výrobce. Sonda byla radioaktivně označena pomocí soupravy MU LTI PR1ME DNA íabeling kit (Amersham, Arlington, Heights, IL) podle návodu výrobce. Sonda byla purifikována pomocí NUCLTRAP push column (Stratagene). Pro prehybridizaci byl použit roztok EXPRESSHYB (Clontech) a také jako hybridizační roztok pro Northern bloty. Hybridizace proběhla přes noc při teplotě 65 °C za použití značené sondy o specifické aktivitě 10⁶ cpm/ml.

Bloty byly potom promyty v 2xSSC a 0,1% SDS při teplotě místnosti, poté následovala dvě promytí v 0,lxSSC a 0,1% SDS pri teplotě 50 °C. Produkt transkripce dlouhý přibližně 1500 bp byl detekován ve slezině, lymfatických uzlinách a v tenkém střevě.

Mnohočetné Northern bloty z lidských tkání (MTN I, MTN 11 a MTN III; Clontech) byly testo40 vány, aby se zjistila tkáňová distribuce exprese lidského BCMA. Sonda dlouhá přibližně 257 bp (SEQ ID NO: 24) byla amplifikována pomocí PCR, kdy jako matrice byla použita cDNA z buněk Daudi (SEQ ID NO: 1) a oligonukleotidy ZC 21 065 (SEQ ID NO: 25) a ZC 21 067 (SEQ ID NO: 26) jako primery. Amplifíkace byla provedena následujícím způsobem: 1 cyklus pri 94 °C po dobu 1,0 minuty, 35 cyklů pri 94 °C po dobu 30 sekund, 60 °C po dobu 30 sekund a 72 ^ĎC po dobu 30 sekund, následováno 1 cyklem při 72 °C po dobu 10 minut. Produkty PCR reakce byly vizualizovány pomocí elektroforézy v agarózovém gelu a produkt PCR reakce o délce 257 bp byl purifikován pomocí soupravy Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) podle návodu výrobce. Sonda byla radioaktivně označena pomocí soupravy MULTIPRIME DNA íabeling kit (Amersham, Arlington Heights, IL) podle návodu výrobce. Sonda byla purifikována pomocí NUCL50 TRAP push column (Stratagene). Pro prehybridizaci byl použit roztok EXPRESSHYB (Clontech) a také jako hybridizační roztok pro Northern bloty. Hybridizace proběhla přes noc při teplotě 65 °C za použití značené sondy o specifické aktivitě 10⁶ cpm/ml. Bloty byly potom promyty v 2xSSC a 0,1 % SDS při teplotě místnosti, poté následovala dvě promytí v 0,1 xSSC a 0,1 % SDS při teplotě 50 °C. Produkt transkripce dlouhý přibližně 1,2 kb byl detekován v žaludku, tenkém střevě, lymfatických uzlinách, průdušnici, slezině a ve varlatech.

-43 CZ 303272 B6

RNA Master Dot Bloty (Clontech), které obsahovaly RNA z různých tkání, které byly normalizovány vzhledem k 8 housekeeping genům, byly také sondovány buď sondou TACÍ (SEQ ID NO: 21) nebo sondou BCMA (SEQ ID NO: 24) a hybridizace byla provedena tak, jak bylo popsáno výše. Exprese BR43x2/TACl byla pozorována ve slezině, lymfatických uzlinách, tenkém střevě, žaludku, slinných žlázách, slepém střevě, plicích, kostním morku a ve slezině plodu. Exprese BCMA byla detekována v tenkém střevě, slezině, žaludku, tlustém střevě, lymfatických uzlinách a slepém střevě.

io Lidský nádorový Panel Blot V (Invitrogen lne., San Diego, CA) a lidský lymfomatický blot (Invitrogen) byly sondovány tak, jak bylo výše popsáno buď se sondou BR43x2/TACI (SEQ ID NO: 21) nebo se sondou BCMA (SEQ ID NO: 24). Produkt transkripce dlouhý 1,5 kb, odpovídající TACÍ, byl nalezen v lymfomu ne-Hodgkinova typu a v příušním nádoru. Produkt transkripce dlouhý 1,2 kb, odpovídající BCMA, byl nalezen v adenolymfomu, v lymfomu ne-Hodgkinova typu a v příušním nádoru.

Celková RNA zCD4+, CD8+, CD19+ a směsných lymfocytických buněk (CelIPro, Bothell, WA) byla připravena pomocí guanidinisothiokyanátu (Chirgwin a kol., Biochemistry 18: 52-94, 1979) a poté pomocí centrifugace v CsCl. Poly(A)+ RNA byla izolována pomocí chromatografie zn na oligo(dT) celulóze (Aviv a Leder, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69: 1408-12, 1972). Analýza typu Northem blot byla provedena následujícím způsobem.

Asi 2 mg každé z póly A+ RNA byly denaturovaný ve fosfátovém pufru s 2,2M formaldehydem (50mM Na₂HPO₄, 50mM NaH₂PO₄, 50 mM octan sodný, 1 mM EDTA a 2,2M formaldehyd) 25 a rozdělena pomocí elektroforézy v 1,5% agarózovém minigelu (Stratagene Cloning Systems, La

Jolla, CA) ve fosfátovém pufru s 2,2M formaldehydem. RNA byla blotována přes noc na nytranový filtr (Schleicher & Schueli, Keene, NH) a upevněna na filtr pomocí UV (1 200 mJoulů) v zařízení STRATALINKER³ UV corsslinker (Stratagene Cloning Systems) a potom zapečena při 80 °C po dobu 1 hodiny.

Bloty byly potom sondovány buď sondou TACÍ (SEQ ID NO: 21) nebo BCMA (SEQ ID

NO: 24). Zóna odpovídající 1,5 kb, představující TACÍ byla detekována pouze v buňkách CD

19⁺. Transkript dlouhý 1,2 kb, představující BCMA, byl slabě detekován v buňkách CD8⁺,

CD19⁺aMLR.

Další analýza typu Northem blot byla provedena na biotech připravených z poly/A) RNA z buněk K-562 (erythroidní buňky, ATCC CCL 243), buněk HUT78 (T buňky, ATCC TIB-161), buněk Jurkat (T buňky), DAUDI (lidský Burkittův lymfom, Clontech Palo Alto, CA), RÁJI (lidský Burkittův lymfom, Clontech, Palo Alto) a HL60 (monocyty) tak, jak bylo popsáno výše. Blo40 ty byly sondovány buď se sondou TACÍ (SEQ ID NO: 21) nebo se sondou BCMA (SEQ ID

NO: 24). Produkt transkripce dlouhý 1,5 kb, odpovídající TACÍ, byl detekován v buňkách Ráji.

Produkt transkripce dlouhý 1,2 kb, odpovídající BCMA, byl detekován v buňkách Daudi, Ráji a HUT 78.

Pro identifikaci tkání exprimujících lidský nebo myší TACÍ a lidský BCMA byly použité panely založené na PCR. Lidské a myší panely Rapid-Scan™ Gene Expression (OriGene Technologies, lne., Rockville, MD) byly prohledávány podle návodu výrobce. Oligonukleotidové primery ZC 24 000 (SEQ ID NO: 27) a ZC 24 201 (SEQ ID NO: 28) byly navrženy tak, aby přesahovaly exonové spojení a vytvořily fragment dlouhý 272 bp, odpovídající myšímu TACÍ. Exprese byla dete50 kována ve slezině, brzlíku, plících, prsech, srdci, svalu, kůži, nadledvinkách, žaludku, tenkém střevě, mozku, vaječníků, prostatě a embryu. V mnoha tkáních byly detekovány další zóny dlouhé-500 a 800 bp.

Oligonukleotidové primery ZC 24 198 (SEQ ID NO: 29) a ZC 24 199 (SEQ ID NO: 30) byly navrženy tak, aby přesahovaly exonové spojení a vytvořily fragment dlouhý 204 bp, odpovídající

-44CZ 303272 B6 lidskému TACÍ. Exprese byla detekována ve slezině, mozku, srdci, játrech, tlustém střevě, plících, tenkém střevě, svalu, žaludku, varlatech, placentě slinných žlázách, nedledvinkách, slinivce, prostatě, lymfocytech periferní krve a v kostním morku.

Oligonukleotidové primery ZC 24 271 (SEQ ID NO: 31) a ZC 24 272 (SEQ ID NO: 32) byly navrženy tak, aby přesahovaly exonové spojení a vytvořily fragment dlouhý 329 bp, odpovídající lidskému BCMA. Exprese byla detekována v mozku, slezině, tlustém střevě, plících, tenkém střevě, žaludku, vaječníků, varlatech, slinných žlázách, nadledvinkách, prostatě, lymfocytech periferní krve, kostním morku a v játrech plodu.

Oligonukleotidové primery ZC 24 495 (SEQ ID NO: 33) a ZC 24 496 (SEQ ID NO: 34) byly navrženy tak, aby přesahovaly exonové spojení a vytvořily fragment dlouhý 436 bp, odpovídající myšímu BCMA. Exprese byla detekována v játrech.

Příklad 6: Příprava fúzních vektorů TACI-Ig a BCMA-Ig Konstrukce fragmentu Gammal Fc4

Pro přípravu fůzního proteinu TACI-Ig, byla oblast Fc lidského IgGl (kloubová oblast a domény CH2 a Cl 13) modifikovány tak, že byly odstraněny funkce vázání ke Fc receptoru (FcgRI) a komplementu (Clq). Tato modifikovaná verze IgGl Fc byla nazvána Fc4.

Oblast Fc byla izolována z knihovny připravené z jater lidského plodu (Clontech) pomocí PCR reakce za použití oligonukleotidových příměrů ZC 10 134 (SEQ ID NO: 43) a ZC 10 135 (SEQ ID N O: 44). PCR byla použita pro vnesení mutací do oblasti Fc, aby došlo ke snížení vazby FcgRI. Vazebné místo pro FcgRI (Leu-Leu-gly-Oly) bylo mutováno na Ala-GIu—gly-Ala (aminokyselinové zbytky 38 až 41 ze SEQ ID NO: 45) podle Baum a kol., (EMBO J. 13: 39924001, 1994), aby došlo ke snížení vazby FcRI (Duncan a kol., Nátuře 332: 563-4, 1988). Pro vnesení mutace byly použity oligonukleotidové primery ZC 15 345 (SEQ ID NO: 46) a ZC 15 347 (SEQ ID NO: 47). Do výsledného objemu 50 μΙ bylo přidáno 570 ng matrice IgFc, 5 μΐ lOxPfu reakčního pufru (Stratagene), 8 μϊ l,25mM směsi dNTP, 31 μΐ dH₂O, 2 μΐ 20mM ZC 15 345 (SEQ ID NO: 46) a ZC 15 347 (SEQ ID NO: 47). Byl přidán stejný objem minerálního oleje a reakce byla zahřátá na 94 °C po dobu l minuty. Byla přidána Pfu polymeráza (2,5 jed35 notky, Stratagene) a následovalo 25 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 1 minuty, pak následovalo 7 minut prodlužování při 72 °C. Reakční produkty byly elektroforézovány a byla určena zóna s předpověděnou velikostí fragmentu ~676 bp. Zóna byla z gelu vyříznuta a získána pomocí extrakční soupravy QIAGEN QIAquick TM Gel Extraction Kit (Qiagen) podle návodu výrobce.

PCR byla také použita pro vnesení mutace Ala na Ser (aminokyselinový zbytek 134 v SEQ ID NO: 45) a Pro na Ser (aminokyselinový zbytek 135 v SEQ ID NO: 45) pro snížení vazby komplementu Clq a/nebo fixace komplementu (Duncan a Winter, Nátuře 332: 788, 1988) a stop kodonu TAA. V prvním kole byly provedeny dvě reakce a jako matrice byla použita IgFc sek45 vence s mutovaným vazebným místem FcyRI. Do výsledného objemu 50 μΐ byl přidán 1 μϊ IgFc matrice s mutovaným vazebným místem FcyRI, 5 μΐ lOxRfu reakčního pufru (Stratagene), 8 μϊ l,25mM směsi dNTP, 31 μ| dH₂O, 2 μΐ 20mM ZC 15 517 (SEQ ID NO: 48), což je 5' primer začínající na nukleotidu 26 v SEQ ID NO: 45 a 2 μΙ 20mM ZC 15 530 (SEQ ID NO: 49), což je 3' primer začínající na komplementárním nukleotidu k nukleotidu 405 v SEQ ID NO: 45. Druhá reakce obsahovala 2 μΐ každého z 20mM zásobních roztoků primeru ZC 15 518 (SEQ ID NO: 50), což je 5' primer začínající na nukleotidu 388 v SEQ ID NO: 45 a ZC 15 347 (SEQ ID NO: 47), což je 3' primer, aby byla vnesena mutace Ala na Ser, restrikční místo pro Xba 1 a stop kodon. Byl přidán stejný objem minerálního oleje a reakce byla zahřátá na 94 °C po dobu 1 minuty. Byla přidána Pfu polymeráza (2,5 jednotky Stratagene) a následovalo 25 cyklů při 94 °C po dobu

-45CZ 303272 B6 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 1 minuty, pak následovalo 7 minut prodlužování při 72 °C. Reakční produkty byly elektroforézovány a byly určeny zóny s předpověděnou velikostí fragmentů -370 bp respektive -395 bp. Zóny byly z gelu vyříznuty a extrahovány pomocí extrakční soupravy QIAGEN QlAquickTM Gel Extraction Kit (Qiagen) podle návodu výrobce. Reakce druhého kola byla provedena kvůli spojení výše uvedených fragmentů a přidání Bam H1 restrikčního místa. Do výsledného objemu 50 μΐ bylo přidáno 30 μΙ dH₂O, 8 μΙ l,25mM směsi dNTP, 5 μΙ lOxPfu reakčního pufru (Stratagene) a 1 μΙ každého z produktů prvních dvou PCR reakcí. Byl přidán stejný objem minerálního oleje a reakce byla zahřátá na 94 °C po dobu minuty. Byla přidána Pfu polymeráza (2,5 jednotky, Stratagene) a následovalo 5 cyklů pri ío 94 °C po dobu 30 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 2 minut. Pak byla teplota opět zvednuta na 94 °C a byly přidány 2 μΐ každého z 20mM zásobních roztoků primerů ZC 15 516 (SEQ ID NO: 51), což 5' primer začínající na nukleotidu 1 v SEQ ID NO: 45 a ZC 15 347 (SEQ ID NO: 47) a následovalo 25 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 2 minut, pak následovalo 7 minut prodlužování pri 72 °C . Část reakce byla zviditelněna pomocí elektroforézy na gelu. Byla zjištěna zóna 789 bp, odpovídající předpověděné velikosti.

Konstrukce expresního vektoru TACIFc4 a BCMA-Fc4

Expresní plazmidy obsahující fúzní proteiny TACI-Fc4 a BCMA-Fc4 byly konstruovány pomocí homologické rekombinace v kvasinkách. Fragment TACÍ cDNA byl izolován pomocí PCR reakce, která zahrnovala polynukleotidovou sekvenci od nukleotidu 15 k nukleotidu 475 v SEQ ID NO: 5, Dva primery použité pro přípravu fragment TACÍ byly: (1) primer obsahující 40 bp z vektorové sekvence, sousedící s 5' koncem a 17 bp, odpovídajících aminovému konci fragmen25 tu TACÍ (SEQ ID NO: 52); (2) 40 bp ze 3' konce, odpovídající sousedící Fc4 sekvenci a 17 bp, odpovídajících karboxy lovému konci fragmentu TACÍ (SEQ ID NO: 53), Do výsledného objemu 100 μΐ bylo přidáno 10 ng TACÍ matrice, 10 μΐ lOx reakčního pufru pro Taq polymerázu (Perkin Elmer), 8 μΙ 2,5nM směsi dNTP, 78 μΙ dH₂O, 2 μΐ každého z 20mM zásobních roztoků oligonukleotidových primerů SEQ ID NO: 52 a SEQ ID NO: 53 a Taq polymeráza (2,5 jednotky, Life

Technology). Byl přidán stejný objem minerálního oleje a reakce byla zahřátá na 94 °C po dobu minut, poté následovalo 25 cyklů pri 94 °C po dobu 30 sekund, 65 °C po dobu 30 sekund, 65 °C po dobu 30 sekund, 72 °C po dobu 1 minuty a pak následovalo 5 minut prodlužování při 72 °C.

Fragment BCMA cDNA byl izolován pomocí PCR reakce, která zahrnovala polynukleotidovou sekvenci od nukleotidu 219 k nukleotidu 362 v SEQ ID NO: 7. Dva primery použité pro přípravu fragmentu BCMA byly oligonukleotidový primer obsahující 40 bp z vektorové sekvence, sousedící s 5' koncem a 17 bp, odpovídajících aminovému konci fragmentu BCMA (SEQ ID NO: 54); a oligonukleotidový primer obsahující 40 bp ze 3' konce, odpovídající sousedící Fc4 sekvenci a 17 bp, odpovídajících karboxylovému konci fragmentu BCMA (SEQ ID NO: 55). Do výsledného objemu 100 μΐ bylo přidáno 10 ng BCMA matrice, 10 μΙ lOx reakčního pufru pro Taq polymerázu (Perkin Elmer), 8 μΙ 2,5mM směsi dNTP, 78 μΐ dH₂O, 2 μΙ každého z 20mM zásobních roztoků oligonukleotidových primerů SEQ ID NO: 54 a SEQ ID NO: 55. Byl přidán stejný objem minerálního oleje a reakce byla zahřátá na 94 °C po dobu 2 minut, poté následovalo 25 cyklů pri

94 °C po dobu 30 sekund, 65 °C po dobu 30 sekund, 72 °C po dobu 1 minuty a pak následovalo minut prodlužování pri 72 °C.

Fragment obsahující cDNA kódující fragment Fc4 byl konstruován podobným způsobem, vždy jeden pro TACÍ fúzní konstrukt a jeden pro BCMA fuzní konstrukt. Při přípravě Fc4 pro TACÍ fúzní konstrukt byly použity tyto dva oligonukleotidové primery: oligonukleotidový primer obsahující 40 bp ze sekvence, sousedící s 5' koncem TACÍ a 17 bp, odpovídajících aminovému konci fragmentu Fc4 (SEQ ID NO: 56); a oligonukleotidový primer obsahující 40 bp ze 3' konce, odpovídající sousedící vektorové sekvenci a 17 bp, odpovídajících karboxylovému konci fragmentu

Fc4 (SEQ ID N O: 57). Při přípravě Fc4 pro BCMA fúzní konstrukt byl použit oligonukleotidový

-46CZ 303272 B6 primer obsahující 40 bp ze sekvence, sousedící s 5' koncem BCMA a 17 bp, odpovídajících aminovému konci fragmentu Fc4 (SEQ ID NO: 58). Druhým primerem při přípravě Fc4 pro BCMA fúzní konstrukt byl shodný s primerem, popsaným výše po TACI-Fc4 (SEQ ID NO: 57).

Do výsledného objemu 100 μί bylo přidáno 10 ng výše popsané Fc4 matrice, 10 μί lOx reakčního pufru pro Taq polymerázu (Perkin Elmer), 8 μί 2,5 nM směsi dNTP, 78 μί dH₂O, 2 μΙ každého z20mM zásobních roztoků oligonukleotidů SEQ ID NO: 56 a SEQ ID NO: 57 pro TACÍ a oligonukleotidů SEQ ID NO: 58 a SEQ ID NO: 57 pro BCMA a Taq polymeráza (2,5 jednotek, Life Technology). Byl přidán stejný objem minerálního oleje a reakce byla zahřátá na 94 °C po io dobu 2 minut, poté následovalo 25 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 65 °C po dobu 30 sekund, °C po dobu 1 minuty a pak následovalo 5 minut prodlužování při 72 °C.

Deset mikrolitrů každé z výše popsaných 100 μί reakcí bylo pro analytické účely elektroforézováno na 0,8% LMP agarózovém gelu (Seaplaque GTG) v lx TBE pufru. Zbylých 90 μΙ každé

PCR reakce bylo precipitováno po přidání 5 μί ÍM NaCl a 250 μΙ absolutního ethanolu. Plazmid pZMP6 byl štěpen Smál, aby byl linearizován na místě polylinkeru. Plazmid pZMP6 byl odvozen z plazmidu pCZR199 (Americká sbírka typových kultur, Manassas, VA, ATCC# 98 668) a je savčím expresním vektorem, který obsahuje expresní kazetu, která má bezprostředně časný promotor CMV, konsenzuální intron z variabilní oblasti lokusu těžkého řetězce mušího imunoglo20 bul inu, mnohočetná restrikční místa pro vložení kódujících sekvencí, stop kodon a terminátor z lidského růstového hormonu. Plazmid má také počátek replikace z E. coli, savčí expresní jednotku selekčního markéru, která obsahuje promotor SV40, zesilovač transkripce a počátek replikace, gen pro DHFR a SV40 terminátor. Vektor pZMP6 byl konstruován z pCZR199 zaměněním metallothioneinového promotoru za bezprostředně časný promotor CMV a Kozákovy sekvence na 5'' konci otevřeného čtecího rámce.

Sto mikrolitrů kompetentních kvasinkových buněk (S. cerevisiae) bylo smícháno s 10 μΙ, obsahujícími přibližně l pg extracelululámí domény buď TACÍ nebo BCMA, Fc4 fragmenty vhodné pro rekombinaci s nimi a 100 ng vektoru pZMP6, štěpeného Smál, a bylo přeneseno do 0,2 cm elektroporační kyvety. Na směsi kvasinky/DNA bylo působeno elektrickými pulzy pri 0,75 kV (5 kV/cm), oo ohmů, 25 pF. Ke každé kyvetě bylo přidáno 600 μί 1,2M sorbitolu a kvasinky byly vysety ve dvou 300 μΙ alikvotech na URA-D plotny a inkubovány při 30 °C.

Po asi 48 hodinách byly Ura⁺ kvasinkové transformanty z jedné plotny resuspendovány v I ml

H₂O a krátce centrifugovány, aby došlo k usazení kvasinkových buněk. Buněčný sediment byl resuspendován v l ml íyzačního pufru (2% Triton X-100, 1% SDS, lOOmM NaCl, lOmM Tris, pH 8,0, lmM EDTA). Pět set mikrolitrů lyzační směsi bylo přidáno do zkumavky typu eppendorf, obsahující 300 μί skleněných zrnek promytých kyselinou a 200 μ 1 směsi fenol-chloroform, vortexováno 2 až 3x po dobu 1 minuty, následovalo 5 minut centrifugace v centrifuze typu eppendorf pri maximální rychlost. Tri sta mikrolitrů vodní fáze bylo přeneseno do nové zkumavky a DNA byla vysrážená přidáním 600 μί ethanolu (EtOH), následovala centrifugace po dobu 10 minut při teplotě 4 °C. Sediment DNA byl resuspendován v 100 μί H₂O.

Transformace elektrokompetentních buněk E. coli (DH10B, GibcoBRL) byla provedena s prepa45 ráty kvasinkové DNA o objemech 0,5 až 2 ml a se 40 μί buněk DH10B. Na buňky bylo působeno elektrickými pulzy při 2,0 kV, 25 pF a 400 ohmů. Po elektroporaci bylo 1 ml SOC (2% Bacto' Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0,5% kvasničný extrakt (Difco), lOmM NaCl, 2,5mM KC1, lOmM MgCl₂, lOmM MgSO_2í 20mM glukóza) vyseto v 250 μί alikvotech na čtyři plotny LB AMP (LB bujón (Lennox), 1,8% Bacto' Agar (Difco), 100 mg/ml ampicilin).

Jednotlivé klony obsahující správný expresní konstrukt pro TAC-Fc4 nebo BCMA-Fc4 byly určeny pomocí restrikční ho štěpení pro ověření přítomnosti inzertu a potvrzení, že různé DNA sekvence byly správně vzájemně spojeny. Inzert pozitivních klonů byl podroben sekvenční analý-47CZ 303272 B6 ze. Plazmidové DNA byla ve velkém měřítku izolována pomocí soupravy Qiagen Maxi kit (Qiagen) podle návodu výrobce.

Příklad 7: Exprese TAC1-Fc4 a BCMA-Fc4 u savců

Buňky BHK 570 (ATCC #: CRL-10 314) byly vysety do lOcm misek pro tkáňové kultury a ponechány růst do přibližně 50 až 70% souvislého nárůstu přes noc při 37 °C, v 5% CO2, v médiu DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), 5% fetální hovězí sérum (Hyclone, Logan, UT), lmM L-glutamin (JRH Biosciences, Lenexa, KS), lmM pyruvát sodný (Gibco-BRL)). Buňky byly potom transfekovány buď plasmidem TACIFc4/pZMP6 nebo BCMA-Fc4/pZMP6, pomocí Lipofectamine™ (Gibco-BRL), v médiu bez séra (SF) o složení (DMEM, 10 mg/ml transferin, 5 mg/ml inzulín, 2 mg/ml fetuin, 1% L-glutamin a 1% pyruvát sodný). Plazmid obsahující TACI-Fc4/pZMP6 nebo BCMA-Fc4/pZMP6 byl naře15 děn v 15ml zkumavkách do celkového konečného objemu 640 μΐ SF médiem. 35 μΐ Lipofectamine⁴ (Gibco, BRL) bylo smícháno s 605 μΙ SF média. Směs Lipofectamine⁴ byla přidána ke směsi DNA a ponechány inkubovat po dobu přibližně 30 minut při teplotě místnosti. Pět mililitrů SF média bylo přidáno ke směsi DNA:Lipofectamine™. Buňky byly jednou opláchnuty 5 ml SF média, to bylo odsáto a poté byla přidána směs DNA:Lipofectamine™. Buňky byly inkubovány při 37 °C po dobu 5 hodin, potom bylo ke každé plotně přidáno 6,4 ml média DMEM/10% FBS, 1% PSN. Plotny byly inkubovány při 37 °C přes noc a směs DNA:Lipofectamine™ byla příští den nahrazena čerstvým 5% FBS/DMEM médiem. Pět dní po transfekci byly buňky rozděleny do lahví T-162 se selekčním médiem (DMEM/5% FBS, 1% L-GLU, 1% NaPyr). Přibližně 10 dní po transfekci byty z každé transfekce dvě 150mm kultivační misky kolonií rezistentních na methotrexát trypsinizovány, buňky spojeny a vysety do lahví T-162 a převedeny na kultury ve velkém měřítku.

Příklad 9: Transgenní exprese Ztnf4

Transgenní živočichové, kteří exprimují geny ztnf4 byli připraveni pomocí dospělých, plodných samců (B6Cfl), předpubertálních plodných samic (B6Cfl), samců s odňatými chámovody (B6D2fl) a dospělých plodných samic (B6D2fl) (všechny od Taconic farms, Germantown, NY). Predpubertální plodné samice byly uvedeny do stavu nadměrné ovulace pomocí gonadotropinů ze séra březích kobyl ((Sigma, St. Louis, MO) a lidského choriového gonadotropinů (hCG (Sigma)). Samice ve stavu nadměrné ovulace byly poté spářeny s dospělými, plodnými samci a kopulace byla potvrzena přítomností vaginálních zátek.

Oplodněná vajíčka byla odebírána pomocí chirurgického mikroskopu (Leica MZ12 Stereo Micro40 scope, Leica, Wetzlar, Germany). Vajíčka byla potom omyta v hyaluronidáze a Whittenově médiu W640 (tabulka 8; všechny reagencie byly od firmy Sigma Chemical Co.), které bylo inkubováno s 5% CO₂, 5% O2 a 90% N₂ při teplotě 37 °C. Vajíčka byla do provedení mikroinjekce uložena v 5% CO₂ v inkubátoru při 37 °C.

Tabulka 8

Médium 640 podle Whíttena

50		mg/200 ml	mg/500 ml
	NaCl	1280	3200
	KCl	72	180
	KH2PO4	32	80

-48CZ 303272 B6

MgSO₄ - 7 H₂O	60	150
glukóza	200	500
mléčnan vápenatý	106	265
benzylpenicilin	15	37,5
streptomycin SO₄	10	25
NaHCO₃	380	950
pyruvát sodný	5	12,5
H₂O (ml)	200	500
500mM EDTA (μΐ)	100	250
5% fenolová červeň (μΐ)	200	500
BSA	600	1500

Otevřený čtecí rámec 858 bp, kódující celou délku lidského TACÍ ligandu Blys (SEQ ID NO: 35), byl namnožen pomocí PCR tak, že do něho byly pomocí oligonukleotidových primerů SEQ is ID NO: 36 a SEQ ID NO: 37 vneseny optimalizovaný počáteční kodon a na 5' konci sousedící

Pmel restrikční místo a na 3' konci sousedící Ascl restrikční místo. Tento fragment Pmel/Ascl byl klonován do pKF024, což je transgenní vektor pro B a/nebo T buňky, který obsahuje zesilovač transkripce Ig Em (69 bp Notl/Xbal z pEmSR; bodrug a kol., EMBo J. 13: 2124-30, 1994), promotor IG V_h (536 bp Hinclll/Xhol fragment z pJHlX(-); Hu a kok, J. Exp. Med. 177: 168120 90, 1993), polylinker Pmel/Ascl a polyadenylační signál lidského růstového hormonu (627 bp dlouhý fragment Smal/EcoRI; Seeburg, DNA 1: 239-49, 1982), Transgenní inzert byl z plazmidů oddělen štěpením Not!, purifikován na agarózovém gelu a pomocí mikroinjekce vnesen do oplodněných vajíček, pocházejících z páření myší B6C3FlTac, popsaného výše, a vajíčka byla potom implantována do myších samic, u kterých byla vyvolána falešná březost v podstatě tak, jak bylo popsáno výše (Malik a kol., Molec. Cell. Biol. 15: 2349-58, 1995).

Myší samice s takto implantovanými vajíčky byly navráceny v párech do klecí ajejich těhotenství bylo ponecháno probíhat 19 až 21 dní. Po vrhu bylo ponecháno období 19 až 21 dní a poté bylo provedeno zjištění pohlaví, mláďata byla odstavena, a čistými nůžkami byla z ocásku odstri30 žena 0,5 cm biopsie (použita pro zjištění genotypu).

Genomová DNA byla z ústřižků ocásků připravena pomocí komerčně dostupné soupravy (Dneasy 69 Tisue Kit; Qiagen, Valenci a, CA) podle návodu výrobce. Genomová DNA byla analyzována pomocí PCR za použití primerů navržených pro lidský růstový hormon (hGH), který tvoří 3' UTR část transgenního vektoru. Primery ZC 17 251 (SEQ ID NO: 38) a ZC 17 252 (SEQ ID NO: 39) amplifikujt fragment hGH, dlouhý 368 bp. Použití jediné oblasti shodné s lidskou sekvencí (zjištěná pomocí srovnání lidské DNA sekvence a 3' UTR sekvence myšího růstového hormonu) zajistilo, že PCR reakcí nebyla amplifikována myší sekvence. Dále primery ZC 17 156 (SEQ ID NO: 40) a ZC 17 157 (SEQ ID NO: 41), které hybridizují se sekvencemi vektoru a amplifikují inzert cDNA, mohou být použity spolu s primery hGB. V těchto pokusech tvořila DNA ze zvířat pozitivních na transgen dvě zóny, zónu 368 bp odpovídající fragmentu hGH 3’ UTR a zónu variabilní velikosti, odpovídající cDNA inzertu.

Jakmile bylo u zvířat potvrzeno, že je transgenní (TG), byla zpětné křížena s inbredním kmenem tak, že byla TG samice umístěna společně se standardním typem samce nebo TG samec byl umístěn s jednou nebo dvěma samicemi standardního typu. Po vrhu a odstavení potomků byly tito oddělení podle pohlaví a byly jim odstřiženy ocásky při zjištění genotypu.

Pro kontrolu exprese transgenu v živém zvířeti byly provedeny chirurgické odběry biopsie. Ana50 lýza úrovně exprese mRNA každého transgenu byla provedena pomocí testu hybridizace roztoku RNA nebo pomocí měření PCR v reálném čase na přístroji ABI Pri srn 7700 (PE Applied Biosystems, lne., Foster City, CA) podle návodu výrobce.

-49CZ 303272 B6

Příprava buněk a průtoková cytomerrie

Výchozí myši byly analyzovány v různém stáří. Pro analýzu pomocí průtokové cytometrie (FACS) byly ze stehenních a holenních kostí izolovány buňky lymfoidní tkáně, kostního morku (BM), tak, že bylo provedeno opatrné rozrušení ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) pomocí třecí misky s tloukem. Buňky byly resuspendovány, pasivní sedimentací zbaveny kostních fragmentů a sedimentovány při lOOOx g. Splenocyty, thymocyty nebo buňky lymfatických uzlin byly získány rozdrcením intaktních tkání mezi skleněnými destičkami, potom resuslo pendovány v promývacím pufru pro FACS (FACS WB) (balandovaný solný roztok podle Hankse, 1% BSA, lOmM Hepes, pH 7,4) na koncentraci 20 x 10⁶ buněk/ml. Pro barvení bylo 1 x 10^Ďbuněk přeneseno do 5ml zkumavek a promyto 1 ml FACS WB a potom sedimentováno při 1000 x G. Buňky byly potom inkubovány na ledu po dobu 20 minut v přítomnosti dostatečného množství vhodných monoklonálních protilátek, konjugovaných s FITC-, PE- a/nebo TriColor(TC)-, v celkovém objemu 100 ml ve FACS WB. Buňky byly promyty 1,5 ml WB, sedimentovány, potom resuspendovány v 400 ml WB a analyzovány na průtokovém cytometru FACSCalibur za použití CellQuest software (Becken dickinson, Moutain View, CA). Detektory pro přímý (FSC) a boční (SSC) rozptyl světla byly nastaveny na lineární škálu, zatímco pro všechny tři fluorescenční kanály (FL-1, FL-2 a FL-3) byly použity logaritmické detektory.

Kompenzace spektrálního překrývání mezi FL kanály byla provedena pro každý pokus za použití buněčných populací barvených jednou barvou. Všechny buňky byly sebrány na disk a údaje byly analyzovány pomocí CEllQuest software. Červené krvinky a mrtvé buňky byly vyloučeny pomocí elektronických údajů, získaných na základě profilů FSC oproti SSC.

Protilátky

Monoklonální protilátka (mAb) anti-CD8 konjugovaná s fluorescein isothiokyanátem (FITC) (klon 53-6.7) a monoklonální protilátky proti CD4 (klon RM4-5), proti CD5 (klon 53-7,3), proti

CD19 (klon 1D3) a proti syndekanu (klon 281-2), konjugované s fycoerythrinem (PE), byly zakoupeny od Pharm Mingen (San Diego, CA). Monoklonální protilátky proti CD45R/B220 konjugované s TriColor (TC) (klon RA3-6B2) byly zakoupeny od Caltag.

Transgenní myši, které exprimují nadbytek ztnf4 v lymfoidním oddíle, vyvíjejí zvýšené počty periferních B buněk, zvýšené počty plazmatických buněk a zvýšené hladiny sérového imunoglobulinu. Tato transgenní zvířata mají zvýšený počet buněk B200+ ve slezině, lymfatických uzlinách a v brzlíku. Zvýšený počet slezinných B buněk zahrnuje jak běžné B-2 buňky, tak i normálně vzácnou populaci B-l buněk. Obecně jsou buňky B-+ vázány hlavně na pobřišniční a jiné tělní dutiny, produkující autoproti látky se slabou reaktivitou a byly často spojeny s vývojem auto40 imunních chorob, jako je systemický lupus erythematodes SLE.

Starší transgenní zvířata produkující autoproti látky, vyvíjí se u nich vylučování bílkoviny v moči a sklerotická ledvinová klubíčka, což jsou charakteristické znaky systemického lupus eiythematodes.

Obrázek 5A ukazuje suspenze jednotlivých buněk ze sleziny (horní panel) z mezenterické lymfatické uzliny (střední panel) a z kostního morku (dolní panel), připravené výše popsaným postupem, barvené pomocí protilátek proti B220-TC a analyzované pomocí průtokové cytometrie. Počet buněk B220+ v každé tkáni byl vypočítán násobením procenta buněk B220+ celkovým poetem živých buněk (vyjma buněk obarvených trypanovou modří), spočtených pomocí hemocytometru. Každý sloupeček představuje údaje z jednotlivých myší transgenních na ztnf4 (Tg, vyplněné sloupce) nebo netransgenní (non TG, prázdné sloupce) kontrolní myši ze stejného vrhu.

Obrázek 5B ukazuje buňky izolované z ztnf4 TG myši (panely napravo nebo non TG myši ze stejného vrhu (panely nalevo), a to z lymfatické uzliny (horní řada), ze sleziny (prostřední řady)

-50CZ 303272 B6 a z brzlíku (dolní řada), které byly obarveny monoklonálními protilátkami proti vyznačeným molekulám (CD5, CD4 a CD8) a potom analyzovány pomocí průtokové cytometrie. Z údajů byly vyloučeny mrtvé buňky a červené krvinky.

Obrázek 5C ukazuje celkové úrovně IgG, IgM a IgE v séru myší transgenních na ztnf4 ve stáří od 6 do 23 týdnů.

Obrázek 5D ukazuje ukládání amyloidu a zesílené mesangium ledvinových klubíček, zjištěných v řezech ledvin z myší transgenních na ztnf4, kteréjsou barveny podle H&E, ve srovnání s nořit) mální ledvinovými klubíčky kontrolních myší ze stejného vrhu.

Obrázek 5E ukazuje zvýšení počtu efekt ořových T buněk u myší transgenních na ztnf4, podobně jak bylo popsáno v Mackay a kol. (J. Exp. Med. 190: 1697-1710, 1999).

Rozpustné fúzní proteiny TACÍ (BR43x2) nebo BCMA-Ig byly injekčně podány (IP, IM nebo IV) transgenním zvířatům, která exprimují vysoké úrovně ztnf4. Analýza lymfoidních tkání pomocí průtokové cytometrie (FACS) byla použita pro zjištění jakékoli změny v počtu B buněk B220+ ve slezině, lymfatických uzlinách a brzlíku.

Příklad 10: Test ELISA z přímým navázáním

Test ELISA z přímým navázáním byl vyvinut pro charakterizování schopnosti buď rozpustného TACI-Ig nebo rozpustného BCMA-Ig vázat se a inhibovat biologickou aktivitu ztnf4 in vitro.

Destička s 96 jamkami byla potažena kozím protilidským Ig o koncentraci 1 g/ml (Jackson Labs, Bar Harbor, MA), v ELISA A pufru (0,lM NaHCO₃, pH 9,6, 0,02% NaN₃) a inkubovány pres noc při 4 °C. TACÍ BCMA a nepříbuzný TNF receptor, jako je ztnflO (SEQ ID NO: 42) jako kontrola, byly titrovány od 10 pg/ml v 5násobných ředěních do 320 ng/ml plus nula a společně inkubovány s 2,5; 0,5 nebo 0,1 pg/ml biotinylovaného ztnf4 nebo ovalbuminu jako negativní kontrolou, a inkubovány 1 hodinu při teplotě místnosti.

Směs společně inkubovaného receptoru a biotinylovaným ligandem byla potom přidána na 96jamkové destičky, potažené kozím protilidským Ig. Destičky byly potom promyty (ELISA C,

500 pl Tween 20 (Sigma Chemical, St, Louis, MO), 200 mg NaN₃, PBS do konečného objemu litr) a blokovány pomocí Superblock (Pierce, Rockford, IL), Destičky byly potom inkubovány hodiny při teplotě 37 °C.

Destičky byly ještě jednou opláchnuty ELISA C, následovalo přidání 100 pl/jamku neutravidin40 HRP zředěné 1:10 000 v ELISA B (5 nebo 10 pg BSA (Sigma) v případě 1% popřípadě 2% BSA, 250 pg Tween 20 (Sigma), 100 mg NaN₃ fosforečnanem pufrovaný fyziologický roztok pH 7,2 (PBS, Sigma) do konečného objemu 500 ml. Jinou možností je připravit pufr jako 1% nebo 2% BSA v ELISA C pufru). Destičky jsou potom vyvíjeny s OPD po dobu 10 minut při teplotě místnosti a odečítány při 492 pm.

Příklad 11: Test biologické aktivity

Test biologické aktivity byl vyvinut pri měření toho, jak je rozpustný TACI-FC inhibována sti50 mulace lidských B buněk rozpustných ztnf4. B buňky byly izolovány z monoklonámích buněk periferní krve (PBMNC) pomocí CD 19 magnetická zrnka a magnetický separační systém VarioMACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) podle návodu výrobce. Vyčištěné B buňky byly smíchány s rozpustným ztnf4 (25 ng/ml) a rekombinantním lidským IL^4 (10 ng/ml Pharmingen) a byly vysety (ve třech paralelách) do 96jamkových destiček s kulatým dnem v množství lxlO⁶ buněk na jamku.

-51 CZ 303272 B6

Rozpustný TACI-FC byl rozpuštěn od 5 pg/ml do 6 ng/ml a inkubován s B buňkou po dobu 5 dní, přičemž přes noc na 4. den byl do každé jamky přidán pulz 1 pCi ³H thymidinu (Amersham). Jako kontrola byl rozpustný TACI-FC také inkubován s B buňkami a IL-4 bez přítomného ztnf4.

Buňky z destiček byly odebírány pomocí přístroje Packard Plate Harvester a radioaktivita byla měřena pomocí přístroje Packard. TACI-Ig rozpustný receptor inhiboval schopnost rozpustného ztnf4 stimulovat množení B buněk in vitro způsobem, který závisel na dávce. Desetinásobný mo lární nadbytek TACI-IG zcela inhibuje množení lidských B buněk, které je odpovědí na rozlít pustný ztnf4 v přítomnosti 1L-4.

Příklad 12: Test ORIGIn

Hladiny ztnf4 u jedinců s chorobnými stavy (jako je například SLE, zánět kloubů) v porovnání kjedincům normálním, byly zjišťovány pomocí elektrochemiluminiscenčního testu. Standardní křivka rozpustného lidského ztnf4 v koncentracích 10 ng/ml, 1 ng/mg/ml, 0,01 ng/ml a 0 ng/ml byla připravena v pufru ORITGIN (lgen, Gaithersburg, MD). Vzorky sér byly zředěny v pufru ORIGIn. Standardy a vzorky byly inkubovány 2 hodiny při teplotě místnosti s bíotinylovanou

2o králičí protilidskou zntf4NF BV protilátkou, zředěnou na 1 pg/ml v pufru pro test Origin (IGEN) a ruthenylovanou králičí protilidskou zntf4NF BV polyklonální protilátkou, zředěnou na 1 pg/ml v pufru pro test Origin (IGEN), Po inkubaci byly vzorky vortexovány a ke každému ze standardů a vzorků bylo přidáno 0,4 mg/ml streptavidin Dynabeads (Dynal, Oslo, Norway) v množství 50 μΙ/zkumavku a byly inkubovány 30 minut při teplotě místnosti. Vzorky byly potom vortexo25 vány a odečítány na přístroji Origin Analyzer (lgen) podle návodu výrobce. Test Origin je založen na elektrochemiluminiscenci a vytváří odečet jako ECL - to je způsob, jak pracuje a co nám to říká.

Zvýšená úroveň zthf4 byla detekována ve vzorcích séra jak od myší NZBWF1/J, tak myší

MRL/Mpj-Fas^lpr, které dospěly do pokročilých stádií glomerulonefritidy a autoimunní choroby.

Příklad 13: Rozpustný TACI-lg a spontánní model SLE

Myši NZBW se stávají symptomatické pro spontánní SLE ve věku přibližně 7 až 9 měsíců. TACI-Fc byl podáván myši NZBW, aby byla sledován jeho supresivní účinek na B buňky v průběhu 5 týdenního období, protože se má za to, že průměrná produkce autoproti látek k B buňkám má u NZBW myší vysokou úroveň.

Sto osmitýdenních samic myší (NZB x NZW) FI (Jacobson Labs) bylo rozděleno do 6 skupin po 15 myších. Před léčením byl u myší jednou za měsíc kontrolován protein v moči a byla odebírána krev pro uložení CBC a séra. Sérum bylo testováno na přítomnost autoproti látek. Protože vylučování proteinu v moči je charakteristickým příznakem glomerulonefritidy, hladiny proteinu v moči byly kontrolovány pomocí testovacího papírku v pravidelných intervalech v celém průbě45 hu studie. Před léčením byla zvířata zvážena. Dávkování bylo započato, když byly myši přibližně 5 měsíců staré. Myši dostávaly intraperitoneální injekce buď pouze nosiče (PBS) nebo lidského IgG-FC (kontrolní protein) nebo TACI-FC4 (testovaný protein) 3x týdně po dobu 5 týdnů.

- 52CZ 303272 B6

Skupina (5 myší v každé)	Způsob léčení	Dávka
1	neléčené kontroly
2	pouze nosič
3	lidský IgG-FC	20 g
4	lidský IgG-FC	100 pg
5	lidský TACI-FC4	20 pg
6	lidský TAC1-FC4	100 pg

Krev byla odebírána 2x v průběhu dávkování a bude odebrána alespoň 2x po jeho ukončení. Hodnoty zjištěné testovacím papírkem pro vylučování proteinu v moči a tělesné hmotnosti byly zjišťovány každé dva týdny od započetí dávkování. V době usmrcení byla odebrána krev a byla zaznamenána hodnota zjištěná testovacím papírkem a tělesná hmotnost. Byly zjištěny hmotnosti sleziny, brzlíku, jater a žlučníkem, levé ledviny a mozku. Slezina a brzlík byly rozděleny pro FACS analýzu a histologii. Podčelistní slin né žlázy, me zen ter ická lymfatická žláza, jatém í lalok se žlučníkem, tlusté střevo, žaludek, tenké střevo, slinivka, pravá ledvina, nadledvina, jazyk io s průduškou a jícnem, srdce a plíce budou také odebrány pro histologii.

Obrázek 6 ukazuje zvýšené hladiny ztnf4 v séru myší NZBWF1 a MRL/lpr/lpr, které koreluje s vývojem SLE. homí panel na obrázku 6A ukazuje korelaci hladiny ztnf4 v séru s věkem 68 NZBWF1 myší ve stáří v rozmezí od 10 do 40 týdnů a 10 týdnů a 30 týdnů staré kontrolní myši t5 NZB/B. Střední panel ukazuje korelaci s vylučováním proteinu v moči ve třech rozsazích, a to od stopových množství do 0,2 mg/ml (T-30), 1 až 3 mg/ml a 20 mg/ml u NZBWF1 myši ve srovnání s kontrolní myší NZB/B. Dolní panel ukazuje hladiny ztnf4 s různými titry protilátek proti dsDNA u NZBWF1 myší ve srovnání s kontrolními NZB/B.

Obrázek 6B ukazuje stejné korelace zjištěné na 23 myších MRL/lpr/lpr v rozmezí 18 až 24 měsíců starých a u 10 kontrolních MRL/MpJ myší, starých 11 týdnů.

Obrázek 7 ukazuje výsledky analýzy moče. Myši byly považovány za trpící vylučováním proteinu v moči, když testovací papírek ukázal hodnotu >1 mg/ml. (A) PBS, (B) lidský IgG FC, 10 mg, (C) lidský IgG FC, 20 mg, (D) lidský TACI-IgG, 100 mg, a (E) lidský TACI-lgG, 20 mg. Myši léčené fúzním proteinem TACI-lgG vykazovaly snížené vylučování proteinu v moči.

Analýzou periferní krve z léčených zvířat bylo zjištěno, že dva týdny po začátku léčení byly u myší léčených TACI-FC sníženy počty bílých krvinek a lymfocytů (20 a 100 mg) ve srovnání s myšmi léčenými FC (20 a 100 mg), a PBS. Analýza FAC (branka pro lymfocyty) periferní krve odebrané šest týdnů po zahájení léčení (dva týdny po podání poslední dávky) ukázala dramatický pokles procenta B buněk, přítomných ve vzorku. Hladiny B buněk stále klesaly v období pěti týdnů po podání poslední dávky, ale pokles již nebyl tak dramatický. Tabulka 9 uvádí průměrné procento (a standardní odchylku) pro myši v každé léčené skupině (tabulka 9). Pokles procenta B buněk v periferní krvi byl také pozorován 2 týdny v průběhu léčení.

-53CZ 303272 B6

Tabulka 9

Léčení	týden 2	týden 5 % B buněk
% B buněk	% T buněk
PBS	26,05 (6,52)	67,05 (6,80)	20,83 (3,14)
100 mg FC	23,34 (5,77)	68,23 (7,30)	25,04 (8,07)
20 mg FC	24,09 (6,26)	65,27 (7,18)	18,96 (6,42)
100 mg TACI-FC	11,07(5,03)	79,06 (6,71)	14,79 (4,76)
29 ng TACI-FC	16,37 (7,27)	69,72 (8,90)	19,14(5,27)

Příklad 14: Rozpustný TACl-Lg v normální myší (5 TACI-FC byl podáván myším Balb/C, aby byl sledován jeho účinek na normální myši. Šedesát samic myší Balb/C (HSD), starých 8 týdnů, bylo rozděleno do 12 skupin po pěti myších. Před léčením byly myši sváženy a byla jim odebrána krev pro uložení CBC a séra. Skupiny 1 až 9 dostávaly intraperitoneální injekce (IP) bud’ pouze nosiče (PBS) nebo lidského IgG-FC (kontrolní protein) nebo TACI-FC4 (testovaný protein) denně po dobu 12 týdnů a byly 14. den utrace2o ny.

Skupina (5 myší v každé)	Způsob léčení	Dávka
1	lidský TACI-FC4	200 mg
2	lidský TACLFC4	100 mg
3	lidský TACI-FC4	20 pg
4	lidský TACI-FC4	5pg
5	lidský FC4	200 pg
6	lidský FC4	100 mg
7	lidský FC4	20 mg
8	lidský FC4	5 mg
9	pouze nosič	používaný
10	lidský TACI-FC4	100 mg
11	lidský FC4	100 mg
12	neléčené kontroly

Krev byla odebírána 7. a 12. den, V době usmrcení byla odebrána krev a byla zaznamenána hodnota tělesné hmotnosti. Byly zjištěny hmotnosti sleziny, brzlíku a mozku. Slezina a brzlík byly rozděleny pro FACS analýzu a histologii. Kůže, slezina, mezenterická lymfatická žláza, podčelistní slinné žlázy, vaječník, děloha, děložní čípek, močový měchýř, jatemí lalok se žlučníkem, tlusté střevo, žaludek, tenké střevo, slinivka, pravá ledvina, nadledvina, jazyk s průduškou

3o a jícnem, srdce, brzlík, stehenní sval, levá a pravá stehenní kost a mozek budou také odebrány pro histologii.

Jak bylo uvedeno výše v příkladu 13, významné snížení procenta B buněk mezi buňkami periferní krve bylo pozorováno 7. den (pomocí CBS) a 12. den (pomocí FACS) v krvi odebrané od všech jedinců léčených TAGI-FC4, ve srovnání s těmi, kteří byli léčeni samotným FC4 nebo PBS a analyzovaných pomocí CBS nebo FACS. Dále nastalo téměř 50% snížení počtu B buněk

-54CZ 303272 B6 ve slezinách odebraných ze zvířat léčených TACI FC4, ve srovnání se slezinami z myší léčených FC4 čtrnáctý den.

Příklad 15: ELISA test protilátek proti dsDNA

Autoimunita je charakterizována vysokými hladinami protilátek proti dvouřetězcové DNA. Pro měření hladin protilátek proti dsDNA, jak v transgenních myších, které exprimují nadbytek ztnf4, tak v myších NZBW, byl vyvinut ELISA test. 96jamková mikrotitrační destička (Nunc) byla io potažena poly-L-lysinem (Sigma) (20 μΙ/ml v O,1M Tris pufru pH 7,3) v množství 75 μί na jamku a inkubována přes noc při teplotě místnosti. Destičky byly potom promyty dH₂O a potaženy póly dAdT (Sigma) (20 μΙ/ml v 0,1 M Tris pufru pH 7,3) v množství 75 μί na jamku a inkubována po dobu 60 minut při teplotě místnosti. Destičky byly potom promyty dH₂O a blokovány 2%

BSA (Sigma) v Tris pufru po dobu 30 minut při teplotě místnosti, poté následovalo konečné pro15 mytí dH₂O.

Vzorky séra byly odebrány ze ztnf4 transgenních myší, popsaných v příkladě 10 a z myší NZBW, popsaných v příkladě 11. Vzorky séra byly zředěny I : 50 v 1% BSA/2% BGG (Calbiochem) v Tris pufru. Ředěné vzorky byly potom titrovány na potažené destičce při ředěních 1 : 50,

1 : 100, 1 : 200, 1 : 400, 1 : 800, 1 : 1600, 1 : 3200 a 1 : 6400 (50 μΙ/jamku) a inkubovány po dobu 90 minut při teplotě místnosti.

Destičky byly potom promyty DH₂O a bylo přidáno 50 μΙ/jamku kozího protimyšího lgG-FcHRP (Cappel) zředěného 1 : 1000 v 1% BSA/2 % BGG. Destičky byly potom inkubovány po do25 bu 60 minut při teplotě místnosti. Destičky byly potom 5x promyty dH₂O a vyvíjeny s OPD, l tableta/10 ml Novo D a rozplněno po 100 μΙ/jamku. Vývojka byla zastavena pomocí 1M H₂SO₄, 100 μΙ/jamku, a OD byla odečítána při 492 nm.

Obrázek 8 ukazuje hladiny protilátek proti dsDNA ve dvou ztnf4 transgenních myších (staré 23 týdnů), dvou netransgenních jedinců ze stejného vrhu a porovnání s hladinami zjištěnými v séru myši NZBWF (stará 32 týdnů) a myší MRL/lpr/Ipr (stará 19 týdnů).

Příklad 16: Rozpustný TACI-lg ve spontánním modelu ELE

Dvacet pět myších samic PLxSJL Fl (staré 12 týdnů, Jackson Labs) dostalo podkožní injekci 125 pg/myš antigenů (protein myelinového proteolipidu, PLP, zbytky 139 až 151), připraveného v kompletním Freundově adjuvans. Myši jsou rozděleny do pěti skupin po pěti. V den 0 a 2 jim jsou podány intraperitoneální injekce toxinu černého kašle (400 ng). Skupiny dostanou lnásob40 nou, lOnásobnou nebo lOOnásobnou dávku TACÍ, BCMA nebo BR43x2, jedna skupina dostane pouze nosič a jedna skupina léčena nebude. Preventivní léčba započne v den 0, léčba jako zásah započne v den 7 nebo při objevení se klinických příznaků. Příznaky nemoci, ztráta hmotnosti a paralýza, se projevují přibližně 10. až 14. den a trvají asi po dobu 1 týdne. Zvířata jsou hodnocena denně zaznamenáváním tělesné hmotnosti a hodnocením klinického skóre, které odpovídá rozsahu jejich příznaků. Klinické příznaky EAE se objevují mezi 10. a 14. dnem po očkování a přetrvávají přibližně 1 týden. Na konci studie byla všechna zvířata utracena vysokou dávkou plynu a poté pitvána. Mozek a páteř byly odebrány pro histologii nebo zmraženy pro analýzu mRNA. Údaje o tělesné hmotnosti a klinickém skóre jsou vyneseny jak pro jednotlivé jedince, tak pro skupiny.

Klinické skóre

Normální

0,5 Slabý, napětí ocasu může být sníženo, ale nechybí

-55CZ 303272 B6

Ochablý ocas (když je myš zatahána za kořen ocasu, není schopna jej pozvednout)

Ochablý ocas, slabost v nohou (není schopna pozvednout ocas, může stát vzpřímeně na zadních nohách, ale nohy se třesou)

Paréza (nemůže sedět s nohami pod tělem, při chůzi se potácí)

4 Paralýza (nemůže hýbat zadními nohami, při pokusu o chůzi je vleče za sebou)

Ochrnutí čtyř končetin (paralýza předních končetin nebo chození v kruhu, může mít sklopenou hlavu)

Umírá (kompletně paralyzována, nemůže dosáhnout potravy nebo vody) io

Příklad 17: TACI-FC a CIA modely revmatického zánětu

Osm týdnů staří samci myšího kmene DBA/1J (Jackson Labs) byli rozděleni do skupin po pěti a v třítýdenním intervalu dostali dvě podkožní injekce 50 až 100 μΐ roztoku kolagenu 1 mg/ml υ kuřecího nebo hovězího původu. Jedna kontrola kolagenové injekce nedostala. První injekce byla připravena v kompletním Freundově adjuvans a druhá injekce byla připravena v nekompletním

Freundově adjuvans. TACI-FC byl podán preventivně při druhé injekci nebo před ní, nebo po tom, až se u zvířete vyvinulo klinické skóre 2 nebo více, které přetrvalo alespoň 24 hodin. Zvířata začala vykazovat příznaky revmatického zánětu po druhé injekci kolagenu, obvykle během 2 až

3 týdnů. Rozsah nemoci byl hodnocen na každé tlapce pomocí kapiperu, kterým byla měřena tloušťka tlapky a hodnoceno klinické skóre (0 až 3) u každé tlapky. Klinické skóre, 0 normální, 1 prst (prsty) zanícen, 2 slabý zánět tlapky, 3 mírný zánět tlapky a 4 prudký zánět tlapky. Zvířata byla utracena poté, co se nemoc vyvíjela stanovené časové období, obvykle 7 dní. Tlapky byly sbírány pro histologii nebo analýzu mRNA a sérum bylo odebíráno pro testy imunoglobulinů a cytokinů.

Příklad 18: Neutralizační TACÍ protilátky

Polyklonální protilátky proti peptidu byly připraveny imunizací dvou samic novozélandských bílých králíků peptidem, huzntf4-l SAGIAKLEEGPELQLAIPRE (SEQ ID NO: 59) nebo huzntf4-2 SFKRGSALEEKENKELVKET (SEQ ID NO: 60) Peptidy byly syntetizovány pomocí syntetizátoru peptidů Applied Biosystems model 431A (Applied Biosystems, INC., Foster City, CA) podle návodu výrobce. Peptidy byly konjugovány k proteinu keyhole limpet hemocyanin (KLH) jako nosiči, pomocí aktivace maleinimidem. Každý králík dostal počáteční intraperitoneální (íp) injekci 200 pg peptidu v kompletním Freundově adjuvans, poté následovaly posilující ip injekce 100 pg peptidu v nekompletním Freundově adjuvans každé tri týdny. Sedm až deset dní po podání druhé posilující injekce (celkem třetí injekce) byla zvířatům odebrána krev a z něho odebráno sérum. Zvířatům potom byla podávána posilující injekce a byla jim odebírána krev každé tři týdny.

Králičí séra specifická pro peptid ztnf4 byla charakterizována zjištěním ELISA titru, přičemž jako cíl pro protilátku byl použit v koncentraci 1 pg/ml ten peptid, pomocí kterého byla připravena protilátka (SEQ ID NO: 59 a SEQ ID NO: 60). Dvě králičí séra proti peptidu huztnf4-l (SEQ

ID NO: 59) měla titr proti jejich specifickému peptidu pri ředění 1:1 E5 (1:100 000). Dvě králičí séra proti peptidu huztnf4-2 (SEQ ID NO: 60) měla titr proti jejich specifickému peptidu 1:5E6 a proti rekombinantním proteinům o plné délce (N-koncový ztnf4 označený FLAG, vytvořený v buňkách BHK) 1:5E6.

Polyklonální protilátky specifické proti peptidu ztnf4 byly purifikovány afinitní chromatografii z králičího séra pomocí sloupců CNBR-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LBK), které byly připraveny pomocí 10 mg specifických peptidů (SEQ ID NO: 59 nebo SEQ ID NO: 60) na gram

-56CZ 303272 B6

CNBr-SEPHAROSE, následováno 20x dialýzou v PBS přes noc. Protilátky specifické proti peptidu zntt4 byly charakterizovány zjištěním ELISA titru, přičemž jako cíl pro protilátky byl použit v koncentraci 1 pg/ml vhodný peptidový antigen nebo rekombinantní protein v plné délce (huztnf4s-NF-Bv). Spodní hranice detekce (LLD) králičích protilátek proti huztnf4-l, purifiko5 váných afinitní chromatografii, při použití jejich specifického antigenů (peptid huztnť4-l, SEQ ID NO:59) je při ředění 5 ng/ml Spodní hraníce detekce (LLD) králičích protilátek proti huztnf42, purifikovaných afinitní chromatografii, při použití jejich specifického antigenů (peptid huztnf4-2, SEQ ID NO: 60) je pri ředění 0,5 ng/ml. Spodní hranice detekce (LLD) králičích protilátek proti huztnf4-2, purifikovaných afinitní chromatografii, při použití k rekombinantního io proteinu huztnf4s-NF-Bv je pri ředění 5 ng/ml.

Monoklonální protilátky byly vytvořeny a selektovány pro inhibici inhibice biotinem značeného rozpustného ztnf4. Žádná z monoklonálních protilátek proti TACÍ (248.14, 248.23, 238,24 nebo 246.3) neblokuje vazbu ztnf4 k BCMA. Monoklonální protilátka 248.23 snižuje vazbu 10 mg/ml biotinem značeného ztnf4 asi na 50 %, když jsou upravená média zředěna 1 : 243 a snižuje vazbu asi 2x v naředěných médiích. Monoklonální protilátka 246.3 snižuje vazbu 10 ng/ml biotinem značeného ztnf4 asi na 50%, když jsou upravená média ředěna v rozmezí 1:243 až 1:181 a snižuje vazbu asi 5x v neředěných médiích.

zo Z výše uvedeného vyplývá, že třebaže zde byla při účelu ilustrace popsána specifická provedení vynálezu, mohou být provedeny různé modifikace bez toho, že by došlo k odchýlení od smyslu a rozsahu vynálezu. Proto tedy tím není vynález omezen, omezen je pouze připojenými patentovými nároky.

₂₅ SEZNAM SEKVENCÍ <110> zYMOgENETICS, INC.

<120> Rozpustný receptor BR43x2 a způsobyjeho použití <130> 98-75 <150> 09/226, 53, <151> 1999-01-07 <160> 60 < 170> FastSEQ pro Windows, verze 3,0 <210> 1 <211> 1192 <212>DNA <213> Homo sapiens <220>

<221>CDS <222> (6)...(746)

-57CZ 303272 B6 <400> 1 gagta atg agt ggc ctg ggc cgg agc agg ega ggt ggc cgg agc cgt gtg 50

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val 15 10 15

gac cag

gag

ege

tgg

tea

ctc

agc

tgc

ege

aag

gag

caa

ggc

aag

Asp Gin

Glu

Arg

Trp

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly

Lys

20

25

30

ttc tat

gac

cat

ctc

ctg

agg

gac

tgc

atc

agc

tgt

gcc

tcc

atc

tgt

Phe Tyr

Asp

His

Leu

Arg

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Ala

Ser

Ile

Cys

35

40

45

gga cag

cac

cct

aag

caa

tgt

gca

tac

ttc

tgt

gag

aac

aag

ctc

agg

Gly Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

Arg

50

55

60

agc cca

gtg

aac

ctt

cca

gag

ctc

agg

aga

cag

cgg

agt

gga

gaa

Ser Pro

Val

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

Glu

65

70

75

gtt gaa

aac

aat

tea

gac

aac

tcg

gga

agg

tac

caa

gga

ttg

gag

cac

Val Glu

Asn

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin

Gly

Leu

Glu

His

80

85

90

95

aga ggc

tea

gaa

gca

agt

cca

get

ctc

ccg

ggg

ctg

aag

ctg

agt

gca

Arg Gly

Ser

Glu

Ala

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

Ala

100

105

110

gat cag

gtg

gcc

ctg

gtc

tac

agc

acg

ctg

ggg

ctc

tgc

ctg

tgt

gcc

Asp Gin

Val

Ala

Leu

Val

Tyr

Ser

Thr

Leu

Gly

Leu

Cys

Leu

Cys

Ala

115

120

125

gtc ctc

tgc

ttc

ctg

gtg

gcg

gtg

gcc

tgc

ttc

ctc

aag

agg

Val Leu

Cys

Phe

Leu

Val

Ala

Val

Ala

Cys

Phe

Leu

Lys

Arg

130

135

140

ggg gat

ccc

tgc

tcc

tgc

cag

ccc

ege

tea

agg

ccc

cgt

caa

agt

ccg

Gly Asp

Pro

Cys

Ser

Cys

Gin

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Arg

Gin

Ser

Pro

145

150

155

gcc aag

tet

tcc

cag

gat

cac

gcg

atg

gaa

gcc

ggc

agc

cct

gtg

agc

Ala Lys

Ser

Gin

Asp

His

Ala

Met

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Val

Ser

160

165

170

175

aca tcc

ccc

gag

cca

gtg

gag

acc

tgc

agc

ttc

tgc

ttc

cct

gag

tgc

Thr Ser

Pro

Glu

Pro

Val

Glu

Thr

Cys

Ser

Phe

Cys

Phe

Pro

Glu

Cys

180 185 190

146

194

242

290

338

386

434

482

530

578

-58CZ 303272 B6

626

agg

gcg

ccc

acg

cag

gag

age

gca

gtc acg

cct ggg

acc

ccc

gac

ccc

Arg

Ala

Pro

Thr

Gin

Glu

Ser

Ala

Val Thr

Pro Gly

Thr

Pro

Asp

Pro

195

200

205

act

tgt

gct

gga

agg

tgg

ggg

tgc

cac acc

agg acc

aca

gtc

ctg

cag

Thr

Cys

Ala

Gly

Arg

Trp

Gly

Cys

His Thr

Arg Thr

Thr

Val

Leu

Gin

210

215

220

cct

tgc

cca

cac

atc

cca

gac

agt

ggc ctt

ggc att

gtg

tgt

gtg

cct

Pro

Cys

Pro

His

Ile

Pro

Asp

Ser

Gly Leu

Gly Ile

Val

Cys

Val

Pro

225

230

235

gcc

cag

gag

ggg

ggc

cca

ggt

gca

taaatggggg tcagggaggg a;

aagg;

agga<

Ala

Gin

Glu

Gly

Pro

Gly

Ala

674

722

776

240 245 ggagagagat ggagaggagg ggagagagaa agagaggtgg ggagagggga gagagatatg aggagagaga gacagaggag gcagagaggg agagaaacag aggagacaga gagggagaga gagacagagg gagagagaga cagaggggaa gagaggcaga gagggaaaga ggcagagaag gaaagaggca gagagggaga gaggcagaga gggagagagg cagagagaca gagagggaga gagggacaga gagagataga gcaggaggtc ggggcactct gagtcccagt tcccagtgca gctgtaggtc gtcatcacct aaccacacgt gcaataaagt cctcgtgcct gctgctcaca gcccccgaga gcccctcctc ctggagaata aaacctttgg cagctgccct tcctca <210> 2 <211>247 <212> PRT <213> Homo sapiens

836

896

956

1016

1076

1136

1192 <400>2

Met

Ser

Gly

Leu

Gly

Arg

Ser

Arg

Gly

Arg

Ser

Arg

Val

Asp

1

5

10

15

Gin

Glu

Arg

Trp

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly

Lys

Phe

20

25

30

Tyr

Asp

His

Leu

Arg

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Ala

Ser

Ile

Cys

Gly

35

40

45

Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

Arg

Ser

50

55

60

Pro

Val

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

Glu

Val

65

70

75

80

Glu

Asn

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin

Gly

Leu

Glu

His

Arg

85

90

95

Gly

Ser

Glu

Ala

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

Ala

Asp

100

105

110

Gin

Val

Ala

Leu

Val

Tyr

Ser

Thr

Leu

Gly

Leu

Cys

Leu

Cys

Ala

Val

115

120

125

Leu

Cys

Phe

Leu

Val

Ala

Val

Ala

Cys

Phe

Leu

Lys

Arg

Gly

130

135

140

Asp

Pro

Cys

Ser

Cys

Gin

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Arg

Gin

Ser

Pro

Ala

145

150

155

160

-59CZ 303272 B6

Lys

Ser

Gin

Asp

His

Ala

Met

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Val

Ser

Thr

165

170

175

Ser

Pro

Glu

Pro

Val

Glu

Thr

Cys

Ser

Phe

Cys

Phe

Pro

Glu

Cys

Arg

180

185

190

Ala

Pro

Thr

Gin

Glu

Ser

Ala

Val

Thr

Pro

Gly

Thr

Pro

Asp

Pro

Thr

195

200

205

Cys

Ala

Gly

Arg

Trp

Gly

Cys

His

Thr

Arg

Thr

Val

Leu

Gin

Pro

210

215

220

Cys

Pro

His

Ile

Pro

Asp

Ser

Gly

Leu

Gly

Ile

Val

Cys

Val

Pro

Ala

225

230

235

240

Gin

Glu

Gly

Pro

Gly

Ala

245 <210>3 5 <2tl>360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

io <221>CDS <222>(1).„ (360) <400> 3 atg agt ggc ctg ggc cgg age agg ega ggt ggc cgg age cgt gtg gac 48

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg. Ser Arg Val Asp

10 15

cag

gag

ege

tgg

tea

ctc

age

tgc

ege

aag

gag

caa

ggc

aag

ttc

96

Gin

Glu

Arg

Trp

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly

Lys

Phe

20

25

30

tat

gac

cat

ctc

ctg

agg

gac

tgc

atc

age

tgt

gcc

tcc

atc

tgt

gga

144

Tyr

Asp

His

Leu

Arg

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Ala

Ser

Ile

Cys

Gly

35

40

45

cag

cac

cct

aag

caa

tgt

gca

tac

ttc

tgt

gag

aac

aag

ctc

agg

age

192

Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

Arg

Ser

50

55

60

cca

gtg

aac

ctt

cca

gag

ctc

agg

aga

cag

cgg

agt

gga

gaa

gtt

240

Pro

Val

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

Glu

Val

65

70

75

80

gaa

aac

aat

tea

gac

aac

tcg

gga

agg

tac

caa

gga

ttg

gag

cac

aga

288

Glu

Asn

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin

Gly

Leu

Glu

His

Arg

90 95

-60CZ 303272 B6

ggc

tca

gaa

gca

agt

cca

gct

ctc

ccg

ggg

ctg

aag

ctg

agt

gca

gat

Gly

Ser

Glu

Ala

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

Ala

Asp

100

105

110

cag

gtg

gcc

ctg

gtc

tac

agc

acg

Gin

Val

Ala

Leu

Val

Tyr

Ser

Thr

115

120

<210>4 <211> 129 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met

Ser

Gly

Leu

Gly

Arg

Ser

Arg

Gly

Arg

Ser

Arg

Val

Asp

1

5

10

15

Gin

Glu

Arg

Trp

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly

Lys

Phe

20

25

30

Tyr

Asp

His

Leu

Arg

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Ala

Ser

Ile

Cys

Gly

35

40

45

Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

Arg

Ser

50

55

60

Pro

Val

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

Glu

Val

65

70

75

80

Glu

Asn

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin

Gly

Leu

Glu

His

Arg

85

90

95

Gly

Ser

Glu

Ala

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

Ala

Asp

100

105

110

Gin

Val

Ala

Leu

Val

Tyr

Ser

Thr

115

120

<210> 5 <211> 1377 <212>DNA <213> Homo sapiens <220>

<221>CDS <222> (1)...(895) <400> 5 agcatcctga gta atg agt ggc ctg ggc cgg agc agg ega ggt ggc cgg 49

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg

5 10

agc

cgt

gtg

gac

cag

gag

ege

ttt

cca

cag

ggc

ctg

tgg

acg

ggg

97

Ser

Arg

Val

Asp

Gin

Glu

Arg

Phe

Pro

Gin

Gly

Leu

Trp

Thr

Gly

15

20

25

gtg

gct

atg

aga

tcc

tgc

ccc

gaa

gag

cag

tac

tgg

gat

cct

ctg

145

Val

Ala

Met

Arg

Ser

Cys

Pro

Glu

Gin

Tyr

Trp

Asp

Pro

Leu

30

35

40

-61 CZ 303272 B6

193

ggt

acc

tgc

atg

tcc

tgc

aaa

acc att

tgc

aac

cat

cag

agc

cag

cgc

Gly

Thr

Cys

Met

Ser

Cys

Lys

Thr Ile

Cys

Asn

His

Gin

Ser

Gin

Arg

45

50

55

60

acc

tgt

gca

gcc

ttc

tgc

agg

tca ctc

agc

tgc

cgc

aag

gag

caa

ggc

Thr

Cys

Ala

Phe

Cys

Arg

Ser Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly

65

70

75

aag

ttc

tat

gac

cat

ctc

ctg

agg gac

tgc

atc

agc

tgt

gcc

tcc

atc

Lys

Phe

Tyr

Asp

His

Leu

Arg Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Ala

Ser

Ile

80

85

90

tgt

gga

cag

cac

cct

aag

caa

tgt gca

tac

ttc

tgt

gag

aac

aag

ctc

Cys

Gly

Gin

His

Pro

Lys

Gin

Cys Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

95

100

105

agg

agc

cca

gtg

aac

ctt

cca

cca gag

ctc

agg

aga

cag

cgg

agt

gga

Arg

Ser

Pro

Val

Asn

Leu

Pro

Pro Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

110

115

120

gaa

gtt

gaa

aac

aat

tca

gac

aac tcg

gga

agg

tac

caa

gga

ttg

gag

Glu

Val

Glu

Asn

Ser

Asp

Asn Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin

Gly

Leu

Glu

125

130

135

140

cac

aga

ggc

tca

gaa

gca

agt

cca get

ctc

ccg

ggg

ctg

aag

ctg

agt

HiS

Arg

Gly

Ser

Glu

Ala

Ser

Pro Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

145

150

155

gca

gat

cag

gtg

gcc

ctg

gtc

tac agc

acg

ctg

ggg

ctc

tgc

ctg

tgt

Ala

Asp

Gin

Val

Ala

Leu

Val

Tyr Ser

Thr

Leu

Gly

Leu

Cys

Leu

Cys

160

165

170

gcc

gtc

ctc

tgc

ttc

ctg

gtg gcg

gtg

gcc

tgc

ttc

ctc

aag

Ala

Val

Leu

Cys

Phe

Leu

Val Ala

Val

Ala

Cys

Phe

Leu

Lys

175

180

185

agg

ggg

gat

ccc

tgc

tcc

tgc

cag ccc

cgc

tca

agg

ccc

cgt

caa

agt

Arg

Gly

Asp

Pro

Cys

Ser

Cys

Gin Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Arg

Gin

Ser

190

195

200

ccg

gcc

aag

tet

tcc

cag

gat

cac gcg

atg

gaa

gcc

ggc

agc

cct

gtg

Pro

Ala

Lys

Ser

Gin

Asp

His Ala

Met

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Val

205

210

215

220

agc <

aca

tcc

ccc

gag

cca

gtg

gag acc

tgc

agc

ttc

tgc

ttc

cct

gag

Ser '

íhr :

Ser

Pro ¹

Glu

Pro

Val

Glu Thr

Cys

Ser

Phe

cys

Phe

Pro

Glu

225

230

235

241

289

337

385

433

481

529

577

625

673

721

-62CZ 303272 B6

769

tgc	agg	gcg	ccc	a cg	cag	gag age
Cys	Arg	Ala	Pro	Thr	Gin	Glu Ser
			240
CCC	act	tgt	gct	gga	agg	tgg ggg
Pro	Thr	Cys	Ala	Gly	Arg	Trp Gly
		255				260
cag	cct	tgc	cca	cac	atc	cca gac
Gin	Pro	Cys	Pro	His	Ile	Pro Asp
	270					275
cct	gcc	cag	gag	ggg	ggc	cca ggt
Pro	Ala	Gin	Glu	Gly	Gly	Pro Gly
285					290

gca	gtc	acg	cct	ggg	acc	ccc	gac
Ala	Val	Thr	Pro	Gly	Thr	Pro	Asp
245					250
tgc	cac	acc	agg	acc	aca	gtc	ctg
Cys	His	Thr	Arg	Thr	Thr	Val	Leu
				265
agt	ggc	ctt	ggc	att	gtg	tgt	gtg
Ser	Gly	Leu	Gly	Ile	Val	Cys	Val
			280
gca	ta a	atgggggtca <	jggaggga.	3a
Ala	*

817

865

915 ggaggaggga gagagatgga gaggagggga agatatgagg agagagagac agaggaggca ggagagagag acagagggag agagagacag agagaaggaa agagacaggc agagaaggag agagaggcag agagacagag agggagagag gcactctgag tcccagttcc cagtgcagct ataaagtcct cgtgcctgct gctcacagcc cctttggcag ctgcccttcc tcaaaaaaaa gagagaaaga gaggtgggga gaggggagag gaaagggaga gaaacagagg agacagagag aggggaagag aggcagagag ggaaagaggc agaggcagag agggagagag gcagagaggg ggacagagag agatagagca ggaggtcggg gtaggtcgtc atcacctaac cacacgtgca cccgagagcc cctcctcctg gagaataaaa aaaaaaaaaa aa

975

1035

1095

1155

1215

1275

1335

1377 <210>6 <211> 293 <212>PRT <213> Homo sapiens <400> 3

Met

Ser

Gly

Leu

Gly

Arg

Ser

Arg

Gly

Arg

Ser

Arg

Val

Asp

1

5

10

15

Gin

Glu

Arg

Phe

Pro

Gin

Gly

Leu

Trp

Thr

Gly

Val

Ala

Met

Arg

20

25

30

Ser

Cys

Pro

Glu

Gin

Tyr

Trp

Asp

Pro

Leu

Gly

Thr

Cys

Met

35

40

45

Ser

Cys

Lys

Thr

Ile

Cys

Asn

His

Gin

Ser

Gin

Arg

Thr

Cys

Ala

50

55

60

Phe

Cys

Arg

Ser

Leu

Ser

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly

Lys

Phe

Tyr

Asp

65

70

75

80

His

Leu

Arg

Asp

Cys

Ile

Ser

Cys

Ala

Ser

Ile

Cys

Gly

Gin

His

85

90

95

Pro

Lys

Gin

Cys

Ala

Tyr

Phe

Cys

Glu

Asn

Lys

Leu

Arg

Ser

Pro

Val

100

105

110

Asn

Leu

Pro

Glu

Leu

Arg

Gin

Arg

Ser

Gly

Glu

Val

Glu

Asn

115

120

125

Asn

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin

Gly

Leu

Glu

His

Arg

Gly

Ser

130

135

140

'63 CZ 303272 B6

Glu

Ala

Ser

Pro

Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

Ala

Asp

Gin

Val

145

150

155

160

Ala

Leu

Val

Tyr

Ser

Thr

Leu

Gly

Leu

Cys

Leu

Cys

Ala

Val

Leu

Cys

165

170

175

Cys

Phe

Leu

Val

Ala

Val

Ala

Cys

Phe

Leu

Lys

Arg

Gly

Asp

Pro

180

185

190

Cys

Ser

Cys

Gin

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Arg

Gin

Ser

Pro

Ala

Lys

Ser

195

200

205

Ser

Gin

Asp

His

Ala

Met

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Val

Ser

Thr

Ser

Pro

210

215

220

Glu

Pro

Val

Glu

Thr

Cys

Ser

Phe

Cys

Phe

Pro

Glu

Cys

Arg

Ala

Pro

225

230

235

240

Thr

Gin

Glu

Ser

Ala

Val

Thr

Pro

Gly

Thr

Pro

Asp

Pro

Thr

Cys

Ala

245

250

255

Gly

Arg

Trp

Gly

Cys

His

Thr

Arg

Thr

Val

Leu

Gin

Pro

Cys

Pro

260

265

270

His

Ile

Pro

Asp

Ser

Gly

Leu

Gly

Ile

Val

Cys

Val

Pro

Ala

Gin

Glu

275

280

285

Gly

Pro

Gly

Ala

290 <210> 7 <211> 995 <212>DNA <213> Homo sapiens <220>

<221>CDS <222> (1)... (773) <400> 7 aagactcaaa cttagaaact tgaattagat gtggtattca aatccttacg tgccgcgaag 60 acacagacag cccccgtaag aacccacgaa gcaggcgaag ttcattgttc tcaacattct 120 agctgctctt gctgcatttg ctctggaatt cttgtagaga tattacttgt ccttccaggc 180 tgttctttct gtagctccct tgttttcttt ttgtgatc atg ttg cag atg get ggg 236

Met Leu Gin Met Ala Gly 1 5

cag

tgc

tcc

caa

aat

gaa

tat

ttt

gac

agt

ttg

cat

get

tgc

ata

284

Gin

Cys

Ser

Gin

Asn

Glu

Tyr

Phe

Asp

Ser

Leu

His

Ala

Cys

Ile

10

15

20

cct

tgt

caa

ctt

ega

tgt

tet

aat

act

cct

cta

aca

tgt

cag

332

Pro

Cys

Gin

Leu

Arg

Cys

Ser

Asn

Thr

Pro

Leu

Thr

Cys

Gin

25

30

35

cgt

tat

tgt

aat

gca

agt

gtg

acc

aat

tea

gtg

aaa

gga

acg

aat

gcg

380

Arg

Tyr

Cys

Asn

Ala

Ser

Val

Thr

Asn

Ser

Val

Lys

Gly

Thr

Asn

Ala

45 50

-64CZ 303272 B6

att

ctc

tgg

acc

tgt

ttg

gga

ctg

agc

tta

ata

att

tet

ttg

gca

gtt

428

Ile

Leu

Trp

Thr

Cys

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

Ile

Ser

Leu

Ala

Val

55

60

65

70

ttc

gtg

cta

atg

ttt

ttg

cta

agg

aag

ata

agc

tet

gaa

cca

tta

aag

476

Phe

Val

Leu

Met

Phe

Leu

Arg

Lys

Ile

Ser

Glu

Pro

Leu

Lys

75

80

85

gac

gag

ttt

aaa

aac

aca

gga

tea

ggt

ctc

ctg

ggc

atg

get

aac

att

524

Asp

Glu

Phe

Lys

Asn

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

Gly

Met

Ala

Asn

Ile

90

95

100

gac

ctg

gaa

aag

agc

agg

act

ggt

gat

gaa

att

ctt

ccg

aga

ggc

572

Asp

Leu

Glu

Lys

Ser

Arg

Thr

Gly

Asp

Glu

Ile

Leu

Pro

Arg

Gly

105

110

115

ctc

gag

tac

acg

gtg

gaa

tgc

acc

tgt

gaa

gac

tgc

atc

aag

agc

620

Leu

Glu

Tyr

Thr

Val

Glu

Cys

Thr

Cys

Glu

Asp

Cys

Ile

Lys

Ser

120

125

130

aaa

ccg

aag

gtc

gac

tet

gac

cat

tgc

ttt

cca

ctc

cca

get

atg

gag

668

Lys

Pro

Lys

Val

Asp

Ser

Asp

His

Cys

Phe

Pro

Leu

Pro

Ala

Met

Glu

135

140

145

150

gaa

ggc

gca

acc

att

ctt

gtc

acc

acg

aaa

acg

aat

gac

tat

tgc

aag

716

Glu

Gly

Ala

Thr

Ile

Leu

Val

Thr

Lys

Thr

Asn

Asp

Tyr

Cys

Lys

155

160

165

agc

ctg

cca

get

ttg

agt

get

acg

gag

ata

gag

aaa

tea

att

tet

764

Ser

Leu

Pro

Ala

Leu

Ser

Ala

Thr

Glu

Ile

Glu

Lys

Ser

Ile

Ser

170

175

180

get agg taa ttaaccattt cgactcgagc agtgccactt taaaaatctt 813

Ala Arg * ttgtcagaat agatgatgtg teagatetet ttaggatgac tgtatttttc agttgccgat 873 acagcttttt gtcctctaac tgtggaaact ctttatgtta gatatatttc tctaggttac 933 tgttgggagc ttaatggtag aaacttcctt ggtttcatga ttaaagtctt tttttttcct 993 ga 995 <210> 8 5 <21l>184 <212> PRT <213> Homo sapiens

-65CZ 303272 B6 <400> 8

Met

Leu

Gin

Met

Ala

Gly

Gin

Cys

Ser

Gin

Asn

Glu

Tyr

Phe

Asp

Ser

1

5

10

15

Leu

His

Ala

Cys

Ile

Pro

Cys

Gin

Leu

Arg

cys

Ser

Asn

Thr

20

25

30

Pro

Leu

Thr

Cys

Gin

Arg

Tyr

Cys

Asn

Ala

Ser

Val

Thr

Asn

Ser

35

40

45

Val

Lys

Gly

Thr

Asn

Ala

Ile

Leu

Trp

Thr

Cys

Leu

Gly

Leu

Ser

Leu

50

55

60

Ile

Ser

Leu

Ala

Val

Phe

Val

Leu

Met

Phe

Leu

Arg

Lys

Ile

65

70

75

80

Ser

Glu

Pro

Leu

Lys

Asp

Glu

Phe

Lys

Asn

Thr

Gly

Ser

Gly

Leu

85

90

95

Leu

Gly

Met

Ala

Asn

Ile

Asp

Leu

Glu

Lys

Ser

Arg

Thr

Gly

Asp

Glu

100

105

110

Ile

Leu

Pro

Arg

Gly

Leu

Glu

Tyr

Thr

Val

Glu

Cys

Thr

Cys

115

120

125

Glu

Asp

Cys

Ile

Lys

Ser

Lys

Pro

Lys

Val

Asp

Ser

Asp

His

Cys

Phe

130

135

140

Pro

Leu

Pro

Ala

Met

Glu

Gly

Ala

Thr

Ile

Leu

Val

Thr

Lys

145

150

155

160

Thr

Asn

Asp

Tyr

Cys

Lys

Ser

Leu

Pro

Ala

Leu

Ser

Ala

Thr

Glu

165

170

175

Ile

Glu

Lys

Ser

Ile

Ser

Ala

Arg

180 <210>9 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens io <400>9

Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp Gin Glu Glu Arg 15 10 15

Phe Pro Gin Gly Leu Trp Thr Gly Val Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu 20 25 30

Glu Gin Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr 35 40 45

Ile Cys Asn His Gin Ser Gin Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser 50 55 60

Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg 65 70 75 80

Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys	Gly	Gin	His	Pro	Lys	Gin	Cys
85	90					95
Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg	Ser	Pro	Val	Asn	Leu	Pro	Pro
100 105					110
Glu Leu Arg Arg Gin Arg Ser Gly Glu	Val	Glu	Asn	Asn	Ser	Asp	Asn
115 120				125

Ser

Gly

Arg

Tyr

Gin

Gly

Leu

Glu

His

Arg

Gly

Ser

Glu

Ala

Ser

Pro

130

135

140

Ala

Leu

Pro

Gly

Leu

Lys

Leu

Ser

Ala

Asp

Gin

Val

Ala

Leu

Val

Tyr

145

150

155

160

Ser

Thr

Leu

Gly

Leu

Cys

Leu

Cys

Ala

Val

Leu

Cys

Phe

Leu

Val

165

170

175

Ala

Val

Ala

Cys

Phe

Leu

Lys

Arg

Gly

Asp

Pro

Cys

Ser

Cys

Gin

180

185

190

Pro

Arg

Ser

Arg

Pro

Arg

Gin

Ser

Pro

Ala

Lys

Ser

Gin

Asp

His

195

200

205

Ala

Met

Glu

Ala

Gly

Ser

Pro

Val

Ser

Thr

Ser

Pro

Glu

Pro

Val

Glu

210

215

220

Thr

Cys

Ser

Phe

Cys

Phe

Pro

Glu

Cys

Arg

Ala

Pro

Thr

Gin

Glu

Ser

225

230

235

240

Ala

Val

Thr

Pro

Gly

245

<210> 10 <211> 40 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Motiv popisující doménu nedokonalého opakování bohatého na cystein, io <221> VARIANTA <222> (1)...(2) <223> Každé Xaaje nezávisle jakýkoli aminokyselinový zbytek kromě cysteinu, nebo chybí.

is <221> VARIANTA <222> (4)... (4) <223> Xaaje jakýkoli aminokyselinový zbytek kromě cysteinu.

<221> VARIANTA 20 <222> (5)... (5) <223> Xaaje glutamin, kyselina glutamová nebo lyzin.

<221> VARIANTA <222> (6)... (6) <223> Xaaje glutamin, kyselina glutamová nebo lyzin, asparagin, arginin, kyselina asparagová, histidin nebo serin.

<221> VARIANTA <222> (7)... (7) <223> Xaaje glutamin nebo kyselina glutamová.

<221> VARIANTA <222> (8)... (9) <223> Každé Xaaje nezávisle jakýkoli aminokyselinový zbytek kromě cysteinu, nebo chybí.

-67CZ 303272 B6 <22l> VARIANTA <222> (10) ...(ll) <223> Xaa je tyrozin, fenylalanin nebo tryptofan.

<221> VARIANTA <222> (13)... (13) <223> Xaa je jakýkoli aminokyselinový zbytek kromě cysteinu.

io <221> VARIANTA <222> (16)... (17) <223> Každé Xaa je nezávisle jakýkoli aminokyselinový zbytek kromě cysteinu.

<221> VARIANTA 15 <222> (19)... (19) <223> Xaa je ízoleucin, methionin, leucin nebo valin, <221> VARIANTA <222> (20)...(20) zo <223> Xaa je jakýkoli aminokyselinový zbytek kromě cysteinu.

<221> VARIANTA <222> (22)...(24) <223> Každé Xaa je nezávisle jakýkoli aminokyselinový zbytek kromě cysteinu.

<221> VARIANTA <222> (26)...(31) <223> Každé Xaa je nezávisle jakýkoli aminokyselinový zbytek kromě cysteinu.

<221> VARIANTA <222> (32)...(33) <223> Každé Xaa je nezávisle jakýkoli aminokyselinový zbytek kromě cysteinu, nebo chybí.

<221> VARIANTA 35 <222> (35) ... (36) <223> Každé Xaaje nezávisle jakýkoli aminokyselinový zbytek kromě cysteinu, <221> VARIANTA <222> (37)... (37) <223> Xaaje tyrozin nebo fenylalanin.

<221> VARIANTA <222> (39)... (40) <223> Každé Xaaje nezávisle jakýkoli aminokyselinový zbytek kromě cysteinu, nebo chybí.

<400

> 10

Xaa

Cys

Xaa

Asp

Xaa

Leu

Xaa

1

5

10

15

Xaa

Cys

Xaa

Cys

Xaa

Cys

Xaa

20

25

30

Xaa

Cys

Xaa

Cys

Xaa

35

40

-68CZ 303272 B6 <210> 11 <211> 360 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Degenerovaná oligonukleotídová sekvence kódující polypeptid SEQ ID NO: 4:

<221> variace io <222> (1)... (360) <223> Každé N je nezávisle A, T, G nebo C.

<400> 11 atgwsnggny tnggnmgnws tggwsnytnw sntgymgnaa athwsntgyg cnwsnathtg aarytnmgnw snccngtnaa garaayaayw sngayaayws wsnccngcny tnccnggnyt nmgnmgnggn ggnmgnwsnm rgarcarggn aarttytayg yggncarcay ccnaarcart yytnccnccn garytnmgnm nggnmgntay carggnytng naarytnwsn gcngaycarg gngtngayca rgargarmgn aycayytnyt nmgngaytgy gygcntaytt ytgygaraay gncarmgnws nggngargtn arcaymgngg nwsngargcn tngcnytngt ntaywsnacn

120

180

240

300

360 <210> 12 <211> 741 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Degenerovaná oligonukleotídová sekvence kódující polypeptid SEQ IDNO: 2 <221> variace <222> (1) ... (741) <223> Každé N je nezávisle A, T, G nebo C <400> 12 atgwsnggny tnggnmgnws nmgnmgnggn ggnmgnwsnm gngtngayca rgargarmgn tggwsnytnw sntgymgnaa rgarcarggn aarttytayg aycayytnyt nmgngaytgy athwsntgyg cnwsnathtg yggncarcay ccnaarcart gygcntaytt ytgygaraay aarytnmgnw snccngtnaa yytnccnccn garytnmgnm gncarmgnws nggngargtn garaayaayw sngayaayws nggnmgntay carggnytng arcaymgngg nwsngargcn wsnccngcny tnccnggnyt naarytnwsn gcngaycarg tngcnytngt ntaywsnacn ytnggnytnt gyytntgygc ngtnytntgy tgyttyytng tngcngtngc ntgyttyytn aaraarmgng gngayccntg ywsntgycar ccnmgnwsnm gnccnmgnca rwsnccngcn aarwsnwsnc argaycaygc natggargcn ggnwsnccng tnwsnacnws nccngarccn gtngaracnt gywsnttytg yttyccngar tgymgngcnc cnacncarga rwsngcngtn acnccnggna cnccngaycc nacntgygcn ggnmgntggg gntgycayac nmgnacnacn gtnytncarc cntgyccnca yathccngay wsnggnytng gnathgtntg ygtnccngcn cargarggng gnccnggngc n <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Umělá sekvence

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

741

-69CZ 303272 B6 <220>

<223> FLAG značka <400> 13

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys <210> 14 <211>7 <212> PRT io <213> Umělá sekvence <220 <223> GIu-Glu tag <400 14

Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC199980 <400> 15 cgaagagcag tactgggatc ctct 24 <210> 16 <211>23 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC 19981 <400> 16 gccaaggcca ctgtctggga tgt 23 <2lO> 17 <211> 1149 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<22I>CDS <222> (236)...(1027)

-70CZ 303272 B6 <400> 17 gaattcggca cgaggcagaa aggagaaaat tcaggataac tctcctgagg ggtgagccaa 60 gccctgccat gtagtgcacg caggacatca acaaacacag ataacagaaa atgatccatt 120 ccctgtggtc acttattcta aaggccccaa ccťtcaaagt tcaagtagtg atatggatga 180 ctccacagaa agggagcagt cacgccttac ttcttgcctt aagaaaagag aagaa atg 238

Met

aaa Lys

ctg aag gag

tgt gtt

tcc Ser

atc ctc cca cgg aag gaa age ccc

tet Ser

286

Leu

Lys Glu 5

Cys

Val

Ile Leu Pro 10

Arg Lys

Glu

Ser 15

Pro

gtc

ega

tcc

aaa

gac

gga

aag

ctg

ctg get gca

acc

ttg ctg

ctg

334

Val

Arg

Ser

Lys Asp Gly Lys

Leu

Leu Ala Ala

Thr Leu

Leu

20

25

30

gca

ctg ctg

tet

tgc tgc ctc acg gtg gtg

tet ttc

tac

cag

gtg

gcc

382

Ala

Leu Leu

Ser

Cys

Leu Thr

Val

Ser Phe

Tyr

Gin

Val

Ala

35

40

45

gcc

ctg caa

ggg

gac

ctg

gcc

age

ctc

cgg

gca

gag

ctg

cag

ggc

cac

430

Al a

Leu Gin

Gly Asp

Leu

Ala

Ser

Leu Arg Ala Glu

Leu

Gin

Gly

His

50

55

60

65

cac

gcg

gag

aag

ctg

cca

gca

gga

gca gga

gcc

ccc

aag

gcc

ggc

ctg

478

His

Ala

Glu

Lys

Leu

Pro

Ala

Gly Ala Gly

Ala

Pro

Lys

Ala

Gly

Leu

70

75

80

gag

gaa

get

cca

get gtc

acc

gcg

gga

ctg

aaa

atc

ttt

gaa

cca

526

Glu

Glu Ala

Pro

Ala

Val

Thr

Ala

Gly

Leu

Lys

Ile

Phe Glu

Pro

85

90

95

get

cca gga

gaa

ggc

aac

tcc

agt

cag

aac

age

aga

aat

aag

cgt

gcc

574

Ala

Pro Gly

Glu Gly

Asn

Ser

Gin

Asn

Ser

Arg

Asn

Lys Arg

Ala

100

105

110

gtt

cag

ggt

cca

gaa

aca

gtc

act

caa

gac

tgc ttg

caa

ctg

att

622

Val

Gin

Gly

Pro

Glu

Thr

Val

Thr Gin Asp

Cys Leu Gin

Leu

Ile

115

120

125

gca

gac

agt

gaa

aca

cca

act

ata

caa

aaa gga

tet tac aca

ttt

gtt

670

Ala

Asp

Ser

Glu Thr

Pro Thr

Ile Gin

Lys Gly Ser Tyr Thr

Phe

Val

130

135

140

145

cca

tgg

ctt

ctc

age

ttt

aaa

agg gga

agt gcc cta gaa gaa

aaa

gag

718

Pro Trp

Leu

Leu Ser

Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys

Glu

150 155 160

-71 CZ 303272 B6

aat

aaa

ata

ttg

gtc

aaa

gaa

act

ggt

tac

ttt

ata

tat

ggt

cag

766

Asn

Lys

Ile

Leu

Val

Lys

Glu

Thr

Gly

Tyr

Phe

Ile

Tyr

Gly

Gin

165

170

175

gtt

tta

tat

act

gat

aag

acc

tac

gcc

atg

gga

cat

cta

att

cag

agg

814

Val

Leu

Tyr

Thr

Asp

Lys

Thr

Tyr

Ala

Met

Gly

His

Leu

Ile

Gin

Arg

180

185

190

aag

gtc

cat

gtc

ttt

ggg

gat

gaa

ttg

agt

ctg

gtg

act

ttg

ttt

862

Lys

Val

His

Val

Phe

Gly

Asp

Glu

Leu

Ser

Leu

Val

Thr

Leu

Phe

195

200

205

ega

tgt

att

caa

aat

atg

cct

gaa

aca

cta

CCC

aat

tcc

tgc

tat

910

Arg

Cys

Ile

Gin

Asn

Met

Pro

Glu

Thr

Leu

Pro

Asn

Ser

Cys

Tyr

210

215

220

225

tea

get

ggc

att

gca

aaa

ctg

gaa

gga

gat

gaa

ctc

caa

ctt

gca

958

Ser

Ala

Gly

Ile

Ala

Lys

Leu

Glu

Gly

Asp

Glu

Leu

Gin

Leu

Ala

230

235

240

ata

cca

aga

gaa

aat

gca

caa

ata

tea

ctg

gat

gga

gat

gtc

aca

ttt

1006

Ile

Pro

Arg

Glu

Asn

Ala

Gin

Ile

Ser

Leu

Asp

Gly

Asp

Val

Thr

Phe

245 250 255 ttt ggt gca ttg aaa ctg ctg tgacctactt acaccatgtc tgtagctatt 1057

Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu

260 ttcctccctt tctctgtacc tctaagaaga aagaatctaa ctgaaaatac caaaaaaaaa 1117 aaaaaaaaaa aaaaaaccct cgagcggccg cc 1149 <210> 18 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18

Met

Lys

Leu

Lys

Glu

Cys

Val

Ser

Ile

Leu

Pro

Arg

Lys

Glu

Ser

Pro

1

5

10

15

Ser

Val

Arg

Ser

Lys

Asp

Gly

Lys

Leu

Ala

Thr

Leu

20

25

30

Leu

Ala

Leu

Ser

Cys

Leu

Thr

Val

Ser

Phe

Tyr

Gin

Val

35

40

45

Ala

Leu

Gin

Gly

Asp

Leu

Ala

Ser

Leu

Arg

Ala

Glu

Leu

Gin

Gly

50

55

60

His

Ala

Glu

Lys

Leu

Pro

Ala

Gly

Ala

Gly

Ala

Pro

Lys

Ala

Gly

65

70

75

80

Leu

Glu

Ala

Pro

Ala

Val

Thr

Ala

Gly

Leu

Lys

Ile

Phe

Glu

Pro

85

90

95

-72CZ 303272 B6

Pro

Ala

Pro

Gly

Glu

Gly

Asn

Ser

Gin

Asn

Ser

Arg

Asn

Lys

Arg

100

105

110

Ala

Val

Gin

Gly

Pro

Glu

Thr

Val

Thr

Gin

Asp

Cys

Leu

Gin

Leu

115

i nn ičU

125

Ile

Ala

Asp

Ser

Glu

Thr

Pro

Thr

Ile

Gin

Lys

Gly

Ser

Tyr

Thr

Phe

130

135

140

Val

Pro

Trp

Leu

Ser

Phe

Lys

Arg

Gly

Ser

Ala

Leu

Glu

Lys

145

150

155

160

Glu

Asn

Lys

Ile

Leu

Val

Lys

Glu

Thr

Gly

Tyr

Phe

Ile

Tyr

Gly

165

170

175

Gin

Val

Leu

Tyr

Thr

Asp

Lys

Thr

Tyr

Ala

Met

Gly

His

Leu

Ile

Gin

180

185

190

Arg

Lys

Val

His

Val

Phe

Gly

Asp

Glu

Leu

Ser

Leu

Val

Thr

Leu

195

200

205

Phe

Arg

Cys

Ile

Gin

Asn

Met

Pro

Glu

Thr

Leu

Pro

Asn

Ser

Cys

210

215

220

Tyr

Ser

Ala

Gly

Ile

Ala

Lys

Leu

Glu

Gly

Asp

Glu

Leu

Gin

Leu

225

230

235

240

Ala

Ile

Pro

Arg

Glu

Asn

Ala

Gin

Ile

Ser

Leu

Asp

Gly

Asp

Val

Thr

245

250

255

Phe

Gly

Ala

Leu

Lys

Leu

260

<210> 19 <211> 1430 <212>DNA <213> Mus musculus <220>

<221>CDS io <222> (102) ... (848) <400> 19 ttggcgcagg agcgtgcgta ggattgctcg ctcacaacag gcacctgact ggtattgaaa 60 gccgagtctt cccttcctct ttaaaggatt ggtgaccagg c atg gct atg gca ttc 116

Met Ala Met Ala Phe 1 5

tgc

ccc

aaa

gat

cag

tac

tgg

gac

tcc

tca

agg aaa

tcc

tgt

gtc

tcc

164

Cys

Pro

Lys

Asp

Gin

Tyr

Trp.

Asp

Ser

Arg Lys

Ser

Cys

Val

Ser

10

15

20

tgt

gca

ctg

acc

tgc

agc

cag

agg

agc

cag

cgc acc

tgt

aca

gac

ttc

212

Cys

Ala

Leu

Thr

Cys

Ser

Gin

Arg

Ser

Gin

Arg Thr

Cys

Thr

Asp

Phe

25

30

35

tgc

aaa

ttc

atc

aat

tgc

ega

aaa

gag

caa

ggc agg

tac

gac

cat

260

Cys

Lys

Phe

Ile

Asn

Cys

Arg

Lys

Glu

Gin

Gly Arg

Tyr

Asp

His

40

45

50

-73 CZ 303272 B6

308

ctc

ctg

ggg

gcc

tgc

gtc

age

tgt

gac

tcc

acc

tgc

aca

cag

cac

cct

Leu

Gly

Ala

Cys

Val

Ser

Cys

Asp

Ser

Thr

Cys

Thr

Gin

His

Pro

55

60

65

cag

tgt

gcc

cac

ttc

tgt

gag

aaa

agg

ccc

aga

age

cag

gcg

aac

Gin

Cys

Ala

His

Phe

Cys

Glu

Lys

Arg

Pro

Arg

Ser

Gin

Ala

Asn

70

75

80

85

ctc

cag

ccc

gag

ctc

ggg

aga

cca

cag

gcc

ggg

gag

gtg

gaa

gtc

agg

Leu

Gin

Pro

Glu

Leu

Gly

Arg

Pro

Gin

Ala

Gly

Glu

Val

Glu

Val

Arg

90

95

100

tca

gac

aac

tca

gga

agg

cac

cag

gga

tet

gag

cat

ggt

cca

gga

ttg

Ser

Asp

Asn

Ser

Gly

Arg

His

Gin

Gly

Ser

Glu

His

Gly

Pro

Gly

Leu

105

110

115

agg

cta

agt

age

gac

cag

ctg

act

ctc

tac

tgc

aca

ctg

ggg

gtc

tgc

Arg

Leu

Ser

Asp

Gin

Leu

Thr

Leu

Tyr

Cys

Thr

Leu

Gly

Val

Cys

120

125

130

ctc

tgc

gcc

atc

ttc

tgc

tgt

ttc

ttg

gtg

gcc

ttg

gcc

tcc

ttc

ctc

Leu

Cys

Ala

Ile

Phe

Cys

Phe

Leu

Val

Ala

Leu

Ala

Ser

Phe

Leu

135

140

145

agg

cgt

aga

gga

gag

cca

cta

ccc

age

cag

cct

gcc

ggg

cca

cgt

ggg

Arg

Gly

Glu

Pro

Leu

Pro

Ser

Gin

Pro

Ala

Gly

Pro

Arg

Gly

150

155

160

165

tca

caa

gca

aac

tet

ccc

cac

gcc

cac

cgc

ccc

gtg

aca

gag

gct

tgc

Ser

Gin

Ala

Asn

Ser

Pro

His

Ala

His

Arg

Pro

Val

Thr

Glu

Ala

Cys

170

175

180

gac

gag

gtg

acc

gcg

tca

ccc

cag

cct

gtg

gaa

acg

tgt

age

ttc

tgc

356

404

452

500

548

596

644

692

Asp Glu Val Thr Ala Ser Pro Gin Pro Val Glu Thr Cys Ser Phe Cys 185 190 195 ttc ccg gag cgc agt tet ccc act cag gag age gcg ccg cgt tcg ctc Phe Pro Glu Arg Ser Ser Pro Thr Gin Glu Ser Ala Pro Arg Ser Leu

200 205 210 ggg ata cac ggc ttc gcg ggc act gcc gcc ccg cag ccc tgt atg cgt

Gly Ile His Gly Phe Ala Gly Thr Ala Ala Pro Gin Pro Cys Met Arg

215 220 225 gca aca gta ggc ggc ctg ggt gtc ctg cgc gca tcc act ggg gac gct

Ala Thr Val Gly Gly Leu Gly Val Leu Arg Ala Ser Thr Gly Asp Ala

230 235 240 245 cgt ccg gca act tgacagcccg aaaaataaaa aagacaattt agaggatgga Arg Pro Ala Thr

740

788

836

888

- 74 CZ 303272 B6 gtgacagagg gggaaaggga tggagaagag acagatgaag acacgataaa ggaagcccgg ctgcacccac gcagagcaac aaagcaacca cctgcagcgc ccacgttccc agcaccgcct gtgcctgccg ctgtgtccta tactttccag agcagtcaac ctgtgccttt tttctttagt cgagaaagat ggagaatgac cggcacctag cattaccctt acaattctta caaacaagtg gtctttccta tggccttagg cagatagctg agtgcagtgt ggatgtattt gtgatttaag taacttgtat gtgtatgtgc agattcgggg ttatgtcata tgtgcatgta tacgtgagtt gtgtgtctgt atgagttgtg tgtatatgtg cgcctataaa tatgtgtgtg aattctgtgc atgcagatgt gtgtgtacat atgtgtctgg ctgatgtggt atagccagaa agatgagggc ccttctaggt gaaggccaaa catctaaaaa ccatctaggt gatgggtgct cgtgccgaat tc <210 20 <211> 249 <212> PRT <213> Mus musculus <400 20

Met Ala Met Ala Phe Cys Pro Lys Asp Gin Tyr Trp Asp Ser Ser Arg 15 10 15

Lys Ser Cys Val Ser Cys Ala Leu Thr Cys Ser Gin Arg Ser Gin Arg

25 30

Thr Cys Thr Asp Phe Cys Lys Phe Ile Asn Cys Arg Lys Glu Gin Gly 35 40 45

Arg Tyr Tyr Asp His Leu Leu Gly Ala Cys Val Ser Cys Asp Ser Thr 50 55 60

948

1008

1068

1128

1188

1248

1308

1368

1428

1430

cys

Thr

Gin

His

Pro Gin

Gin

Cys

Ala

H1s Phe

Cys

Glu

Lys

Arg

Pro

65

70

75

80

Arg

Ser

Gin

Ala

Asn Leu

Gin

Pro

Glu

Leu Gly

Arg

Pro

Gin

Ala

Gly

85

90

95

Glu

Val

Glu

Val

Arg Ser

Asp

Asn

Ser

Gly Arg

His

Gin

Gly

Ser

Glu

100

105

110

His

Gly

Pro

Gly

Leu Arg

Leu

Ser

Asp Gin

Leu

Thr

Leu

Tyr

Cys

115

120

125

Thr

Leu

Gly

Val

Cys Leu

Cys

Ala

Ile

Phe Cys

Cys

Phe

Leu

Val

Ala

130

135

140

Leu

Ala

Ser

Phe

Leu Arg

Arg

Gly

Glu Pro

Leu

Pro

Ser

Gin

Pro

145

150

155

160

Ala

Gly

Pro

Arg

Gly Ser

Gin

Ala

Asn

Ser Pro

His

Ala

His

Arg

Pro

165

170

175

Val

Thr

Glu

Ala

Cys Asp

Glu

Val

Thr

Ala Ser

Pro

Gin

Pro

Val

Glu

180

185

190

Thr

Cys

Ser

Phe

Cys Phe

Pro

Glu

Arg

Ser Ser

Pro

Thr

Gin

Glu

Ser

195

200

205

Ala

Pro

Arg

Ser

Leu Gly

Ile

His

Gly

Phe Ala

Gly

Thr

Ala

Pro

210

215

220

Gin

Pro

Cys

Met

Arg Ala

Thr

Val

Gly

Gly Leu

Gly

Val

Leu

Arg

Ala

225

230

235

240

Ser

Thr

Gly

Asp

Ala Arg

Pro

Ala

Thr

245

-75CZ 303272 B6 <210>21 <211> 473 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220 <223> northem Blot sonda io <400 21 ctgtggacgg gggtggctat gagatcctgc cccgaagagc agtactggga tcctctgctg 60 ggtacctgca tgtcctgcaa aaccatttgc aaccatcaga gccagcgcac ctgtgcagcc 120 ttctgcaggt cactcagctg ccgcaaggag caaggcaagt tctatgacca tctcctgagg 180 gactgcatca gctgtgcctc catctgtgga cagcacccta agcaatgtgc atacttctgt 240 gagaacaagc tcaggagccc agtgaacctt ccaccagagc tcaggagaca gcggagtgga 300 gaagttgaaa acaattcaga caactcggga aggtaccaag gattggagca cagaggctca 360 gaagcaagtc cagctctccc ggggctgaag ctgagtgcag atcaggtggc cctggtctac 420 agcacgctgg ggctctgcct gtgtgccgtc ctctgctgct tcctggtggc ggt 473 <210>22 <211>25 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220 <223>ZC20061 <400 22 ctgtggacag gggtggctat gagat 25 <210>23 <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC20062 <400> 23 accgccacca ggaagcacag aggac 25 <210> 24 <211> 256 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Northem Blot sonda

-76CZ 303272 B6 <400> 24 tgcgattctc tggacctgtt tgggactgag cttaataatt tctttggcag ttttcgtgct 60 aatgtttttg ctaaggaaga taagctctga accattaaag gacgagttta aaaacacagg 120 atcaggtctc ctgggcatgg ctaacattga cctggaaaag agcaggactg gtgatgaaat 180 tattcttccg agaggcctcg agtacacggt ggaagaatgc acctgtgaag actgcatcaa 240 gagcaaaccg aaggtc 256 <210>25 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence ío <220>

<223> Olígonukleotid ZC21065 <400> 25 tgcgattctc tggacctgtt tg 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Olígonukleotid ZC21067 <400> 26 gaccttcggt ttgctcttga tg 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Olígonukleotid ZC24200 <400> 27 acactggggg tctgcctctg 20 <210> 28 <211> 17 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Olígonukleotid ZC24201 45 <400> 28 gcgaagccgt gtatccc 17

-77CZ 303272 B6 <210> 29 <21 I> 17 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC24198 <400> 29 tctacagcac gctgggg <2 IO> 30 <211> 16 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC24199 <400> 30 gcacaagtgg ggtcgg <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC24271 <400> 31 ttattgtaat gcaagtgtg <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC24272 <400> 32 tagctgggag tggaaag <2I0> 33 <211> 20 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC24495

- 78 CZ 303272 B6 <400> 33 tccaagcgtg accagttcag 20 <210> 34 <211>18 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

io <223> Oligonukleotid ZC24496 <400> 34 agttggcttc tccatccc 18 <210>35 <211> 1090 <212>DNA <213> Homo sapiens

2o <400> 35 taactctcct gaggggtgag ccaagccctg ccatgtagtg cacgcaggac atcaacaaac 60 acagataaca ggaaatgatc cattccctgt ggtcacttat tctaaaggcc ccaaccttca 120 aagttcaagt agtgatatgg atgactccac agaaagggag cagtcacgcc ttacttcttg 180 ccttaagaaa agagaagaaa tgaaactgaa ggagtgtgtt tccatcctcc cacggaagga 240 aagcccctct gtccgatcct ccaaagacgg aaagctgctg gctgcaacct tgctgctggc 300 actgctgtct tgctgcctca cggtggtgtc tttctaccag gtggccgccc tgcaagggga 360 cctggccagc ctccgggcag agctgcaggg ccaccacgcg gagaagctgc cagcaggagc 420 aggagccccc aaggccggcc tggaggaagc tccagctgtc accgcgggac tgaaaatctt 480 tgaaccacca gctccaggag aaggcaactc cagtcagaac agcagaaata agcgtgccgt 540 tcagggtcca gaagaaacag tcactcaaga ctgcttgcaa ctgattgcag acagtgaaac 600 accaactata caaaaaggat cttacacatt tgttccatgg cttctcagct ttaaaagggg 660 aagtgcccta gaagaaaaag agaataaaat attggtcaaa gaaactggtt acttttttat 720 atatggtcag gttttatata ctgataagac ctacgccatg ggacatctaa ttcagaggaa 780 gaaggtccat gtctttgggg atgaattgag tctggtgact ttgtttcgat gtattcaaaa 840 tatgcctgaa acactaccca ataattcctg ctattcagct ggcattgcaa aactggaaga 900 aggagatgaa ctccaacttg caataccaag agaaaatgca caaatatcac tggatggaga 960 tgtcacattt tttggtgcat tgaaactgct gtgacctact tacaccatgt ctgtagctat 1020 tttcctccct ttctctgtac ctctaagaag aaagaatcta actgaaaata ccaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa 1090 <21O>36 <211> 35 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid 30 <400> 36 cgcgcggttt aaacgccacc atggatgact ccaca 35

-79CZ 303272 B6 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid <400> 37 _|θ gtatacggcg cgcctcacag cagtttcaat gc 32 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC 17251 <400> 38 tctggacgtc ctcctgctgg tatag 25 <2I0> 39 <211> 25 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC 17252 30 <400> 39 ggtatggagc aaggggcaag ttggg 25 <21o> 40 35 <211>27 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC 17156 <400> 40 gagtggcaac ttccagggcc aggagag 27 <210>41 <2U>27 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC17157

-80CZ 303272 B6 <400 41 cttttgctag cctcaaccct gactatc 27 <210> 42 5 <211>813 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 ggcacagcac ggggcgatgg gcgcgtttcg ggccctgtgc ggcctggcgc tgctgtgcgc 60 gctcagcctg ggtcagcgcc ccaccggggg tcccgggtgc ggccctgggc gcctcctgct 120 tgggac.ggga acggacgcgc gctgctgccg ggttcacacg acgcgctgct gccgcgatta 180 cccgggcgag gagtgctgtt ccgagtggga ctgcatgtgt gtccagcctg aattccactg 240 cggagaccct tgctgcacga cctgccggca ccacccttgt cccccaggcc agggggtaca 300 gtcccagggg aaattcagtt ttggcttcca gtgtatcgac tgtgcctcgg ggaccttctc 360 cgggggccac gaaggccact gcaaaccttg gacagactgc acccagttcg ggtttctcac 420 tgtgttccct gggaacaaga cccacaacgc tgtgtgcgtc ccagggtccc cgccggcaga 480 gccgcttggg tggctgaccg tcgtcctcct ggccgtggcc gcctgcgtcc tcctcctgac 540 ctcggcccag cttggactgc acatctggca gctgaggagt cagtgcatgt ggccccgaga 600 gacccagctg ctgctggagg tgccgccgtc gaccgaagac gccagaagct gccagttccc 660 cgaggaagag cggggcgagc gatcggcaga ggagaagggg cggctgggag acctgtgggt 720 gtgagcctgg ctgtcctccg gggccaccga ccgcagccag cccctcccca ggagctcccc 780 aggccgcagg gctctgcgtt ctgctctggg ccg 813 <210> 43 <211> 44 <212>DNA is <213> Umělá sekvence <220 <223> Oligonukleotid ZC 10.134 <400> 43 atcagcggaa ttcagatctt cagacaaaac tcacacatgc ccac 44 <210> 44 <211> 35 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220 <223> Oligonukleotid ZC 10135 <400> 44 ggcagtctct agatcattta cccggagaca gggag 35 <210> 45 35 <211>768 <212> DNA <213> Homo sapiens

-81 CZ 303272 B6 <220>

<221>CDS 5 <222> (7)... (759) <223> Ig Fc sekvence <400> 45 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg get ccc 48

Met Lys His Leu Trp Phě Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro

5 io

aga

tgg

gtc

ctg tcc

gag

ccc

aga

tet

tea

gac

aaa

act

cac

aca

tgc

96

Arg

Trp

Val

Leu Ser

Glu

Pro

Arg

Ser

Asp

Lys

Thr

His

Thr

Cys

15

20

25

30

cca

ccg

tgc

cca gca

cct

gaa

gcc

gag

ggg

gca

ccg

tea

gtc

ttc

ctc

144

Pro

Cys

Pro Ala

Pro

Glu

Ala

Glu

Gly

Ala

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

35

40

45

ttc

ccc

cca

aaa ccc

aag

gac

acc

ctc

atg

atc

tcc

cgg

acc

cct

gag

192

Phe

Pro

Lys Pro

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

Ile

Ser

Arg

Thr

Pro

Glu

55 60

gtc

aca

tgc

gtg

gac

gtg

age

cac

gaa

gac

cct

gag

gtc

aag

240

Val

Thr

Cys

Val

Asp

Val

Ser

His

Glu

Asp

Pro

Glu

Val

Lys

65

70

75

ttc

aac

tgg

tac

gtg

gac

ggc

gtg

gag

gtg

cat

aat

gcc

aag

aca

aag

288

Phe

Asn

Trp

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

Glu

Val

His

Asn

Ala

Lys

Thr

Lys

80

85

90

ccg

cgg

gag

cag

tac

aac

age

acg

tac

cgt

gtg

gtc

age

gtc

ctc

336

Pro

Arg

Glu

Gin

Tyr

Asn

Ser

Thr

Tyr

Arg

Val

Ser

Val

Leu

95

100

105

110

acc

gtc

ctg

cac

cag

gac

tgg

ctg

aat

ggc

aag

gag

tac

aag

tgc

aag

384

Thr

Val

Leu

His

Gin

Asp

Trp

Leu

Asn

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Cys

115

120

125

gtc

tcc

aac

aaa

gcc

ctc

cca

tcc

atc

gag

aaa

acc

atc

tcc

aaa

432

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

Leu

Pro

Ser

Ile

Glu

Lys

Thr

Ile

Ser

Lys

130

135

140

gcc

aaa

ggg

cag

ccc

ega

gaa

cca

cag

gtg

tac

acc

ctg

ccc

cca

tcc

480

Ala

Lys

Gly

Gin

Pro

Arg

Glu

Pro

Gin

Val

Tyr

Thr

Leu

Pro

Ser

145

150

155

cgg

gat

gag

ctg

acc

aag

aac

cag

gtc

age

ctg

acc

tgc

ctg

gtc

aaa

528

Arg

Asp

Glu

Leu

Thr

Lys

Asn

Gin

Val

Ser

Leu

Thr

Cys

Leu

Val

Lys

160 165 170

-82CZ 303272 B6

ggc

ttc

tat

CCC

agc

gac

atc

gcc

gtg

gag

tgg

gag

agc

aat

ggg

cag

576

Gly

Phe

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

Ala

Val

Glu

Trp

Glu

Ser

Asn

Gly

Gin

175

180

185

190

ccg

gag

aac

tac

aag

acc

acg

cct

ccc

gtg

ctg

gac

tcc

gac

ggc

624

Pro

Glu

Asn

Tyr

Lys

Thr

Pro

Val

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly

195

200

205

tcc

ttc

ctc

tac

agc

aag

ctc

acc

gtg

gac

aag

agc

agg

tgg

cag

672

Ser

Phe

Leu

Tyr

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

Asp

Lys

Ser

Arg

Trp

Gin

210

215

220

cag

ggg

aac

gtc

ttc

tca

tgc

tcc

gtg

atg

cat

gag

get

ctg

cac

aac

720

Gin

Gly

Asn

Val

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

Met

His

Glu

Ala

Leu

His

Asn

225

230

235

cac

tac

acg

cag

aag

agc

ctc

tcc

ctg

! tCt

. ccg

i ggt

aaa

taa

itcte

iga

768

His

Tyr

Thr

Gin

Lys

Ser

Leu

Ser

Leu

i Ser

• Prc

1 Gb

' Lys

240 245 250 <210> 46 <211>52 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

io <223> Oligonukleotid ZC15345 <400> 46 ccgtgcccag cacctgaagc cgagggggca ccgtcagtct tcctcttccc cc 52 <210>47 <211> 31 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC 15347 <400> 47 ggattctaga ttttataccc ggagacaggg a 31 <210> 48 <211> 55 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC15517

-83CZ 303272 B6 <400> 48 ggtggcggct cccagatggg tcctgtccga gcccagatct tcagacaaaa ctcac 55 <210>49 <211> 18 <212> DNA <213> Umělá sekvence io <220>

<223> Oligonukleotid ZC 15530 <400> 49 tgggagggct ttgttgga <2IO> 50 <211> 42 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC 15518 <400> 50 tccaacaaag ccctcccatc ctccatcgag aaaaccatct cc <210> 51 <211> 57 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid ZC 15516 <4OO>51 ggatggatcc atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatg <21O> 52 <211> 59 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotidový primer 45 <400> 52 ctcagccagg aaatccatgc cgagttgaga cgcttccgta gaatgagtgg cctgggccg 59

- 84CZ 303272 B6 <210> 53 <211> 48 <212> DNA <213> Uměla sekvence <220>

<223> Oligonukleotidový primer io <400> 53 gcatgtgtga gttttgtctg aagatctggg ctccttcagc cccgggag 48 <210> 54 <211> 59 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotidový primer <400> 54 ctcagccagg aaatccatgc cgagttgaga cgcttccgta gaatgagtgg cctgggccg 59 <210> 55 <211>59 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotidový primer <400> 55 gcacggtggg catgtgtgag ttttgtctga agatctgggc tccttcagcc ccgggagag 59 <210>56 <211> 60 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotid primer <400> 56 gcacagaggc tcagaagcaa gtccagctct cccggggctg aaggagccca gatcttcaga 60 <210> 57 <211> 56 <212>DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotidový primer

-85CZ 303272 B6 <400> 57 ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa tctagattat ttacccggag acaggg 56 <210> 58 <211> 59 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Oligonukleotidový primer <400> 58 ctaacatgtc agcgttattg taatgcaagt gtgaccaatt cagagcccag atcttcaga 59 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Peptid protilátky <400> 59

Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Pro Glu Leu Gin Leu Ala 15 10 15

Ile Pro Arg Glu 20 <210> 60 <211> 20 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Peptid protilátky <400> 60

Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu

5 10 15

Val Lys Glu Thr

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

CZ 303272 Bó s 1. Použití fúzního proteinu skládajícího se z první části a druhé části, které jsou spojené peptidovou vazbou, přičemž první část se skládá z aminokyselinových zbytků 25-104 ze SEQ ID NO: 6 a druhá část je konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu, pro výrobu léčiva pro léčbu astmatu, bronchitidy, rozedmy, nefritidy, pyelonefritidy, neuropatie lehkého řetězce, amyloidózy, membránové nefropatie, nefropatie IgA, Bergerovy choroby, nefropatie IgM, Goodpasturovy io choroby, po infekční glomerulonefritidy, mesangioproliferativní choroby, nefrotického syndromu minimální změny nebo sekundární glomerulonefritidy nebo vaskulitidy spojené s lupus, u savců inhibicí vazby BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů s ztnf4.
2. Použití podle nároku 1, kde konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu je konstantní

15 oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu.
3. Použití podle nároku 2, kde konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu je konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu IgGl.

20
4. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 3, kde léčivo zahrnuje multimer fůzních proteinů.
5. Použití podle nároku 4, kde léčivo zahrnuje konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu, která obsahuje dvě domény konstantní oblasti a postrádá variabilní oblast

25
6. Použití protilátky nebo fragmentu protilátky, která se specificky váže na polypeptid o sekvenci SEQ ÍD NO: 18, pro výrobu léčiva pro inhibicí produkce protilátky spojené se systemickým lupus erythematodes u savců inhibicí vazby BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů s ztnf4.
7. Izolovaná molekula polynukleotidu kódující polypeptid o sekvenci SEQ ID NO: 2.
8. Izolovaná molekula polynukleotidu podle nároku 7 o sekvenci SEQ ID NO: 1.
9. Expresní vektor zahrnující následující operativně vázané prvky:

35 transkripční promotor;

molekulu polynukleotidu podle nároku 7; a terminátor transkripce.
10. Kultivovaná buňka, do které byl zaveden expresní vektor podle nároku 9, přičemž tato buň40 ka exprimuje polypeptid kódovaný molekulou polynukleotidu.
11. Způsob výroby polypeptidu o sekvenci SEQ ID NO: 2, v y z n a č u j í c í se tím, že se kultivuje buňka, do které byl zaveden expresní vektor podle nároku 9, přičemž buňka exprimuje polypeptid kódovaný molekulou polynukleotidu, a získá se exprimovaný polypeptid,
12. Izolovaný polypeptid o sekvenci SEQ ID NO: 2.
13. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 12 a farmaceuticky přijatelný nosič.

-87CZ 303272 B6
14. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje:

protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu o sekvenci SEQ ID

5 NO: 2;

protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu o sekvenci SEQ ID NO: 4;

i o a farmaceuticky přijatelný nosič.
15. Prostředek podle nároku 14, vyznačující se tím, že protilátka nebo fragment protilátky je vybrán ze skupiny skládající se z:

15 a) polyklonální protilátky;

b) myší protilátky;

c) humanizované protilátky odvozené z b); a

d) lidské monoklonální protilátky.

20
16. Prostředek podle nároku 14 nebo 15, vyznačující se tím, že fragment protilátky je vybrán ze skupiny skládající se z F(ab'), Fab, Fv a scFv.
17. Použití sloučeniny vybrané ze skupiny skládající se z

25 a) polypeptidu zahrnujícího extracelulámí doménu BR43x2 (SEQ ID NO: 2); a b) polypeptidu o sekvenci SEQ ID NO: 4;

pro výrobu léčiva pro léčbu astmatu, bronchitidy, rozedmy, konečného stadia ledvinového selhání, neuropatie lehkého řetězce, amyloidózy, zánětu, membránové nefropatie, nefropatie IgA, Ber30 gerovy choroby, nefropatie IgM, Goodpasturovy choroby, poinfekční glomerulonefritidy, mesangioproliferativní choroby, nefrotického syndromu minimální změny nebo sekundární glomemlonefritidy nebo vaskulitidy spojené s lupus, nebo pro inhibici produkce protilátky spojené s autoimunitní chorobou, u savců inhibici vazby BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptoru s ztnf4.

35
18. Použití podle nároku 17, kde sloučeninaje fúzní protein skládající se z první části a druhé části, které jsou spojené peptidovou vazbou, přičemž první část zahrnuje polypeptid zahrnující aminokyselinové zbytky 25-58 ze sekvence SEQ ID NO: 2 a druhá část zahrnuje jiný polypeptid.
19. Použití podle nároku 18, kde první Část dále zahrnuje polypeptid skládající se z aminokyseli40 nových zbytků 59-120 ze sekvence SEQ ID NO:2.
20. Použití podle nároku 18, kde první část je polypeptid zahrnující extracelulámí doménu BR43x2 (SEQ ID NO: 2).

45
21, Použití podle nároku 18, kde první část je polypeptid o sekvenci SEQ ID NO: 4.
22. Použití fůzního proteinu skládajícího se z první části a druhé části, které jsou spojené peptidovou vazbou, přičemž první část je ztnf4 vázající fragment TACÍ extracelulámí části sestávající se z aminokyselinových zbytků 71-104 sekvence SEQ ID č. 6 a druhá část je konstantní část těž50 kého řetězce imunoglobulinu, pro přípravu léčiva pro léčbu astmatu, bronchitidy, rozedmy, konečného stadia ledvinového selhání, neuropatie lehkého řetězce, amyloidózy, zánětu, membránové nefropatie, nefropatie IgA, Bergerovy choroby, nefropatie IgM, Goodpasturovy choroby, poinfekční glomerulonefritidy, mesangioproliferativní choroby, nefrotického syndromu minimální změny nebo sekundární glomerulonefritidy nebo vaskulitidy spojené s lupus, nebo pro inhibici

-88CZ 303272 B6 produkce protilátky spojené s autoimunitní chorobou, u savců inhibici vazby BR43x2. TACÍ nebo BCMA receptorů s ztnf4.
23. Použití podle kteréhokoliv z nároků 18 až 22, kde druhá část je konstantní oblast těžkého 5 řetězce imunoglobulinu.
24. Použití podle nároku 23, kde konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu je konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu, ío
25. Použití podle nároku 24, kde konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu je konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu IgG 1.
26. Použití podle kteréhokoli z nároků 23 až 25, kde léčivo zahrnuje multimer fúzních proteinů.

i s
27. Použití podle nároku 26, kde léčivo zahrnuje konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu, která obsahuje dvě domény konstantní oblasti a postrádá variabilní oblast.
28. Použití sloučeniny vybrané ze skupiny skládající se z

20 a) protilátky nebo fragmentu protilátky, která se specificky váže k polypeptidů o sekvenci SEQ ÍD NO: 2;

b) protilátky nebo fragmentu protilátky, která se specificky váže k polypeptidů o sekvenci SEQ ID NO: 4;

pro výrobu léčiva pro léčbu astmatu, bronchitidy, rozedmy, konečného stadia ledvinového selhání, neuropatie lehkého řetězce, amyloidózy, zánětu, membránové nefropatie, nefropatie IgA, Bergerovy choroby, nefropatie IgM, Goodpasturovy choroby, poinfekční glomerulonefritidy, mesangioproliferativní choroby, nefrotického syndromu minimální změny nebo sekundární glomerulo30 nefritidy nebo vaskulitidy spojené s lupus, nebo pro inhibici produkce protilátky spojené s autoimunitní chorobou, u savců inhibici vazby BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů s ztnf4.
29. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 28, kde produkce protilátek je spojená s autoimunitní chorobou vybranou ze systematické lupus erythematosus, myastenie gravis, roztroušené

35 sklerózy nebo revmatické artritidy.
30. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 28, kde produkce protilátek je spojená s autoimunitní chorobou vybranou z cukrovky závislé na inzulínu nebo Crohnovy choroby.

40
31. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 28, kde produkce protilátky je spojená s autoimunitní chorobou vybranou z glomerulonefritidy, vaskulitidy, nefritidy nebo pyelonefrttÍdy.
32. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 28, kde zánět je spojený s bolestí kloubů, otokem nebo septickým šokem.
33. Použití protilátky nebo fragmentu protilátky, která se specificky váže na polypeptid o sekvenci SEQ ID NO: 6, pro výrobu léčiva pro léčbu astmatu, bronchitidy nebo rozedmy u savců, inhibici vazby TACÍ receptorů s ztnf4.

50
34. Fúzní protein obsahující první část a druhou část napojenou peptidovou vazbou, přičemž první část se skládá z aminokyselinové sekvence vybrané ze skupiny skládající se z

a) aminokyselinových zbytků 1—48 ze sekvence SEQ ID NO: 8;

b) aminokyselinových zbytků 8-88 ze sekvence SEQ ID NO: 8; nebo

-89CZ 303272 B6

c) aminokyselinových zbytků 1-150 ze sekvence SEQ ID NO; 8, přičemž druhá část se skládá z konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu nebo Fc fragmentu konstantní oblasti těžkého řetězce imunoglobulinu, který obsahuje dvě domény konstantní oblasti a postrádá variabilní oblast.
35. Fúzní protein podle nároku 34, kde konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu je konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu.
36. Fúzní protein podle nároku 35, kde konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu je konstantní oblast těžkého řetězce lidského imunoglobulinu IgGl.
37. Fúzní protein podle nároku 34, kde Fc fragment je odvozený z lidského IgGl.
38. Fúzní protein podle nároku 34 nebo 37, kde Fc fragment je modifikovaný, aby se odstranila vazebná funkce Fc receptorů a vazebná funkce komplementu (Clq).
39. Fúzní protein podle kteréhokoliv z nároků 37 a 38 ve formě multimeru fúzních proteinů.
40. Použití fúzního proteinu podle kteréhokoliv z nároků 34, 37 až 39 pro výrobu léčiva pro savce pro léčbu astmatu, bronchitidy, rozedmy ledvinové choroby, konečného stadia ledvinového selhání, ledvinových novotvarů, mnohočetných myelomů, lymfomů, neuropatie lehkého řetězce, amyloidózy nebo zánětu, nebo pro inhibici produkce protilátek spojené s autoimunitní chorobou, nebo pro inhibici efektorových T buněk, kde inhibice dále zahrnuje imunosupresi spojenou s odmítnutím štěpu, reakcí štěpu proti hostiteli, autoimunitní chorobou nebo zánětem.
41. Použití podle nároku 40, kde produkce protilátek je spojená s autoimunitní chorobou vybranou ze systemické lupus erythematosus, myastenie gravis, roztroušené sklerózy nebo revmatické artritidy.
42. Použití podle nároku 40, kde produkce protilátek je spojená s autoimunitní chorobou vybranou ze cukrovky závislé na inzulínu nebo Crohnovy choroby.
43. Použití podle nároku 40, kde ledvinová nemoc je glomerulonefritida, vaskulitida, nefritida nebo pyelonefritida.
44. Použití podle nároku 40, kde zánět je spojený s bolestí kloubů, otokem nebo septickým šokem.