NO20111595L - Forbindelse omfattende polypeptid og antistoff, samt fusjonsprotein, farmasoytisk preparat, antistoff og anvendelse av disse - Google Patents

Forbindelse omfattende polypeptid og antistoff, samt fusjonsprotein, farmasoytisk preparat, antistoff og anvendelse av disse

Info

Publication number
NO20111595L
NO20111595L NO20111595A NO20111595A NO20111595L NO 20111595 L NO20111595 L NO 20111595L NO 20111595 A NO20111595 A NO 20111595A NO 20111595 A NO20111595 A NO 20111595A NO 20111595 L NO20111595 L NO 20111595L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
antibody
seq
polypeptide
cells
br43x2
Prior art date
Application number
NO20111595A
Other languages
English (en)
Other versions
NO333915B1 (no
Inventor
Wenfeng Xu
Karen Madden
David P Yee
Jane A Gross
Original Assignee
Zymogenetics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22849300&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO20111595(L) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Publication of NO20111595L publication Critical patent/NO20111595L/no
Application filed by Zymogenetics Inc filed Critical Zymogenetics Inc
Publication of NO333915B1 publication Critical patent/NO333915B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Description

Oppfinnelsens bakgrunn
Cellulære interaksjoner som opptrer under en immunrespons, reguleres av medlemmer av flere familier av celleoverflatereseptorer, innbefattet tumornekrosefaktorreseptor (TNFR)-familien. TNFR-familien består av et antall integrerte membran-glykoproteinreseptorer av hvilke mange sammen med sine tilhørende ligander regulerer interaksjoner mellom forskjellige hematopoietiske celletyper (Smith et al., The TNF Receptor Superfamily of Cellular and Viral Proteins: Activation, Costimulation and Death, 75:959-62,1994, Cosman, Stem Cells 72:440-55, 1994).
En slik reseptor er TACI, transmembranaktivator og CAML-interaktør (von Bulow og Bram, Science 225:138-41,1997 og WIPO patentskrift WO 98/39361). TACI er en membranbundet reseptor med et ekstracellulært domene som inneholder to cysteinrike pseudorepetisjoner, et transmembrandomene og et cytoplasmatisk domene som interagerer med CAML (kalsiummodulator og syklofilinligand), et membranintegrert protein som er lokalisert til intracellulære vesikler og som er en koinduser av NF-AT-aktivering ved overekspresjon i Jurkat-celler. TACI er assosiert med B-celler og en undergruppe av T-celler, von Bulow og Bram ( ibid.) rapporterer at liganden til TACI ikke er kjent.
Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, en TACI-isoform med kun én cysteinrik pseudorepetisjon (BR43x2), TACI og et beslektet B-celleprotein, BCMA (Gras et al., Int. Immunol. 77:1093-106,1995) ble funnet å bindes til TNF-liganden ztnf4 som nå er kjent som neutrokin a (WIPO patentskrift, WO 98/18921), BLyS (Moore et al., Science, 255:260-3, 1999), BAFF (Schneider et al., J. Exp. Med. 189:1141- 56, 1999), TALL-1 (Shu et al., J. Leukoc. Biol. 55:680-3,1999) eller THANK (Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem. 274:15978-81, 1999). Følgelig kan BR43x2, TACI og BCMA være anvendbare for regulering av aktiviteten av ztnf4, nærmere bestemt av aktivering av B-celler.
For dette formål tilveiebringer foreliggende oppfinnelse terapeutiske proteiner for modulering av aktiviteten av ztnf4 eller andre BR43x2-, TACI- eller BCMA-ligander, beslektede sammensetninger og fremgangsmåter, så vel som andre anvendelser som vil være åpenbare for fagfolk ut fra den foreliggende beskrivelse.
O ppsummering av oppfinnelsen
I én utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for inhibering av ztnf4-aktivitet i et pattedyr som omfatter tilførsel av en mengde av en forbindelse utvalgt fra gruppen som består av: omfattende tilførsel til pattedyret av en mengde av en forbindelse utvalgt fra gruppen som består av: et polypeptid som omfatter det ekstracellulære domene fra BR43x2, b) et polypeptid som omfatter det ekstracellulære domene fra TACI, c) et polypeptid som omfatter det ekstracellulære domene fra BCMA, d) et polypeptid som omfatter sekvensen ifølge SEKV.ID NR: 10, e) et antistoff eller et antistoffragment som spesifikt bindes til et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 2, f) et antistoff eller et antistoffragment som spesifikt bindes til et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 4, g) et antistoff eller et antistoffragment som spesifikt bindes til et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 6, h) et antistoff eller et antistoffragment som spesifikt bindes til et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 8, i) et antistoff eller et antistoffragment som spesifikt bindes til et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 10, k) et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 4, 1) aminosyrerestene 1-166 fra SEKV.ID NR: 6, og m) aminosyrerestene 1-150 fra
SEKV.ID NR: 8.
I én utførelse er forbindelsen et fusjonsprotein som består av en første del og en andre, del sammenbundet med en peptidbinding, hvor den første del omfatter et polypeptid utvalgt fra gruppen som består av: a) et polypeptid som omfatter sekvensen ifølge SEKV.ID NR: 8, b) et polypeptid som omfatter aminosyrerestene 25-58 fra SEKV.ID NR: 2, c) et polypeptid som omfatter aminosyrerestene 34-66 fra SEKV.ID NR: 6, d) et polypeptid som omfatter aminosyrerestene 71-104 fra SEKV.ID NR: 6, e) et polypeptid som omfatter aminosyrerestene 25-104 fra SEKV.ID NR: 6, f) et polypeptid som omfatter aminosyrerestene 8-37 fra SEKV.ID NR: 8, g) et polypeptid som omfatter aminosyrerestene 41-88 fra SEKV.ID NR: 8, h) et polypeptid som omfatter aminosyrerestene 8-88 fra SEKV.ID NR: 8, og hvor den andre del omfatter et annet polypeptid. I en annen utførelse omfatter den første del videre et polypeptid utvalgt fra gruppen som består av: a) aminosyrerestene 59-120 fra SEKV.ID NR: 2, b) aminosyrerestene 105-166 fra SEKV.ID NR: 6, og c) aminosyrerestene 89-150 fra SEKV.ID NR: 8.1 en annen utførelse er den første del utvalgt fra gruppen som består av: a) et polypeptid som omfatter det ekstracellulære domene fra BR43x2, b) et polypeptid som omfatter det ekstracellulære domene fra TACI, og c) et polypeptid som omfatter det ekstracellulære domene fra BCMA. I en beslektet utførelse er den første del utvalgt fra gruppen som består av: a) et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 4, b) aminosyrerestene 1-154 fra SEKV.ID NR: 6, og c) aminosyrerestene 1-48 fra SEKV.ID NR: 8.1 en annen, beslektet utførelse er den andre del et konstant område fra en immunglobulin-tungkjede.
I en annen utførelse er antistoffet eller antistofffragmentet utvalgt fra gruppen som består av: a) polyklonalt antistoff, b) monoklonalt antistoff fra mus, c) humanisert antistoff avledet fra b), og d) humant, monoklonalt antistoff. I en beslektet utførelse er antistofrfagmentet utvalgt fra gruppen som består av F(ab'), F(ab), Fab', Fab, F v, scFv og den minimale gjenkjenningsenhet. I en annen utførelse er pattedyret en primat.
I en annen utførelse er ztnf4-aktiviteten forbundet med B-lymfocytter. I en annen, beslektet utførelse er ztnf4-aktiviteten forbundet med aktiverte B-lymfocytter. I ytterligere en annen utførelse er ztnf4-aktiviteten forbundet med hvilende B-lymfocytter. I en annen utførelse er ztnf4-aktiviteten forbundet med antistoffproduksjon. I en beslektet utførelse er antistoffproduksjonen forbundet med en autoimmun sykdom. I en beslektet utførelse er den autoimmune sykdom systemisk lupus erythomatosis, myasthenia gravis, multippel sklerose eller reumatoid artritt. I en annen utførelse er ztnf4-aktiviteten forbundet med astma, bronkitt eller emfysem. I ytterligere en annen utførelse er ztnf4-aktiviteten forbundet med nyresvikt i siste stadium. I ytterligere en annen utførelse er ztnf4-aktiviteten forbundet med nyresykdom. I en beslektet utførelse er nyresykdommen glomerulonefritt, vaskulitt, nefritt eller pyelonefritt. I ytterligere en annen utførelse er nyresykdommen forbundet med nyreneoplasma, multiple myelomer, lymfomer, lettkjedeneuropati eller amyloidose. I en annen utførelse er ztnf4-aktiviteten forbundet med effektor-T-celler. I en beslektet utførelse er ztnf4-aktiviteten forbundet med moderering av en immunrespons. I ytterligere en annen utførelse er aktiviteten forbundet med immunsuppresjon. I ytterligere en annen utførelse er immunsuppresjonen forbundet med transplantatrejeksjon, "graft versus host"-sykdom eller inflammasjon. I en annen utførelse er aktiviteten forbundet med autoimmun sykdom. I en beslektet utførelse er den autoimmune sykdom insulinavhengig diabetes mellitus eller Crohns sykdom. I en annen utførelse er ztnf4-aktiviteten forbundet med inflammasjon. I en beslektet utførelse er inflammasjonen forbundet med leddsmerter, hevelser, anemi eller septisk sjokk. I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for inhibering av BR43x2-, TACI- eller BCMA-reseptor-ligandinteraksjoner som omfatter tilførsel av en mengde av en forbindelse som beskrevet ovenfor. I en annen utførelse er BR43x2-, TACI- eller BCMA-reseptor-ligandinteraksjonen forbundet med B-lymfocytter. I en annen, beslektet utførelse er BR43x2-, TACI- eller BCMA-reseptor-ligandinteraksjonen forbundet med aktiverte B-lymfocytter. I ytterligere en annen utførelse er BR43x2-, TACI- eller BCMA-reseptor-ligandinteraksjonen forbundet med hvilende B-lymfocytter.
I en annen utførelse er BR43x2-, TACI- eller BCMA-reseptor-ligand-interaksjonen forbundet med antistoffproduksjon. I en beslektet utførelse er antistoffproduksjonen forbundet med en autoimmun sykdom. I en beslektet utførelse er den autoimmune sykdom systemisk lupus erythomatosis, myasthenia gravis, multippel sklerose eller reumatoid artritt. I en annen utførelse er BR43x2-, TACI- eller BCMA-reseptor-ligandinteraksjonen forbundet med astma, bronkitt eller emfysem. I ytterligere en annen utførelse er BR43x2-, TACI- eller BCMA-reseptor-ligandinteraksjonen forbundet med nyresvikt i siste stadium. I ytterligere en utførelse er BR43x2-, TACI-eller BCMA-reseptor-ligandinteraksjonen forbundet med nyresykdom. I en beslektet utførelse er nyresykdommen glomerulonefritt, vaskulitt, nefritt eller pyelonefritt. I ytterligere en annen utførelse er nyresykdommen forbundet med nyreneoplasma, multiple myelomer, lymfomer, lettkjedeneuropati eller amyloidose. I en annen utførelse er BR43x2-, TACI- eller BCMA-reseptor-ligand-interaksjonen forbundet med effektor-T-celler. I en beslektet utførelse er BR43x2-, TACI- eller BCMA-reseptor-ligand- interaksjonen forbundet med moderering av en immunrespons. I ytterligere en utførelse er aktiviteten forbundet med immunsuppresjon. I nok en utførelse er immunsuppresjonen forbundet med transplantatrejeksjon, "graft versus host"-sykdom eller inflammasjon. I en annen utførelse er aktiviteten forbundet med autoimmun sykdom. I en beslektet utførelse er den autoimmune sykdom insulinavhengig diabetes mellitus eller Crohns sykdom. I en annen utførelse er BR43x2-, TACI- eller BCMA-reseptor-ligand-interaksjonen forbundet med inflammasjon. I en beslektet utførelse er inflammasjonen forbundet med leddsmerter, hevelser, anemi eller septisk sjokk.
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen er isolert polynukleotidmolekyl som koder for et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 2. Videre tilveiebringes et isolert polynukleotidmolekyl ifølge SEKV.ID NR: 1.1 en beslektet utførelse tilveiebringes en ekspresjonsvektor som omfatter følgende operativt sammenkoblede elementer: en transkripsjonspromoter, et polynukleotidmolekyl som beskrevet ovenfor, og en transkripsjonsterminator. I en annen utførelse omfatter ekspresjonsvektoren videre en sekretorisk reseptor-ligand-interaksjonssekvens operativt koblet til polynukleotidmolekylet. Videre tilveiebringes en dyrket celle i hvilken en ekspresjonsvektor som beskrevet ovenfor, er blitt innført, hvor den dyrkede celle uttrykker polypeptidet som kodes av polynukleotidsegmentet. Oppfinnelsen tilveiebringer videre en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid som omfatter: dyrking av en celle i hvilken en ekspresjonsvektor som beskrevet ovenfor, er blitt innført, hvorved cellen uttrykker polypeptidet som kodes av polynukleotidmolekylet, og gjenvinning av det uttrykte polypeptid. Oppfinnelsen tilveiebringer også et isolert polypeptid med sekvensen ifølge SEKV.ID NR: 2.1 en beslektet utførelse foreligger polypeptidet i kombinasjon med et farmasøytisk aksepterbart bærerstoff.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser en multippel aminosyresekvensoppstilling mellom BR43x2, TACI (von Bulow og Bran, ibid.) (SEKV.ID NR: 6), BCMA (Gras et al., ibid.)
(SEKV.ID NR: 6) og BR43xl (SEKV.ID NR: 7). De cysteinrike pseudorepetisjoner og transmembrandomenet er angitt.
Figur 2 viser en Scatchard-plotanalyse av løselig I<125->ztnf4-binding til TACI og BCMA uttrykt av stabile BHK-transfektanter. Figur 3 A viser koaktivering ved ztnf4 av humane B-lymfocytter til proliferasjon og sekresjon av immunglobulin. Figur 3B viser nivået av IgM og IgG målt i supernatanter erholdt fra B-celler stimulert med løselig ztnf4 i nærvær av IL4 eller IL4+IL5 etter 9 dager i kultur. Figur 4 viser B-celler fra humant, perifert blod stimulert med løselig ztnf4 eller kontrollprotein (ubikvitin) i nærvær av IL-4 i 5 dager in vitro. Renset TACI-Ig, BCMA-Ig og kontroll-Fc ble analysert for inhibering av ztnf4-spesifikk proliferasjon. Figur 5A viser resultater fra ztnf4-transgene dyr som har utviklet egenskaper forbundet med SLE. Figur 5B viser lymfeknute, milt og brisselceller fra ztnf4-transgene dyr farget med antistoffer mot CD5, CD4 og CD8. Figur 5C viser det totale nivå av IgM, IgG og IgE i serum fra 6 til 23 uker gamle ztnf4-transgene dyr. Figur 5D viser amyloid deponering og fortykket mesangium i glomeruli påvist i nyresnitt fra ztnf4-transgene dyr.
Figur 5E viser effektor-T-celler i ztnf4-transgene mus.
Figurene 6A og B viser forhøyet ztnf4-nivå i serum erholdt fra ZNBWF1-mus og MRL/lpr/lpr-mus som korrelerer med utvikling av SLE. Figur 7 viser prosent NZBWFl-mus som utvikler proteinuri i løpet av undersøkelsen. Figur 8 viser nivået av anti-dsDNA målt ved ELISA, fra ztnf4-transgene mus og kontrolldyr fra samme kull, sammenlignet med serum fra ZNBWF1- og MRL/lpr/lpr-mus.
Disse og andre sider ved oppfinnelsen vil være åpenbare ved henvisning til den påfølgende, detaljerte beskrivelse.
Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen
Før oppfinnelsen beskrives kan det være nyttig for en forståelse av denne å fremsette definisjoner av visse begreper som benyttes i det påfølgende: Affinitetsmerkelapp: benyttes heri for å betegne et polypeptidsegment som kan kobles til et annet polypeptid for å bidra til rensing eller påvisning av det andre polypeptid eller tilveiebringe seter for tilkobling av det andre polypeptid til et støtte-medium. I prinsippet kan ethvert peptid eller protein for hvilket et antistoff eller et annet spesifikt bindingsmiddel er tilgjengelig, anvendes som en affinitetsmerkelapp. Affinitetsmerkelapper omfatter en polyhistidintrakt, protein A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985, Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3,1991), glutation S-transferase (Smith og Johnson, Gene 57:31, 1988), Glu-Glu-affinitetsmerkelapp (Grussenmeyer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 52:7952-4, 1985), substans P, "Flag"-peptid (Hopp et al., Biotechnology 5:1204-10,1988), streptavidinbindende peptid, eller andre antigene epitoper eller bindingsdomener. Se generelt Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107,1991. DNA som koder for affinitetsmerkelapper, er tilgjengelig fra kommersielle leverandører (f.eks. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Allelisk variant: Enhver av to eller flere alternative former av et gen som foreligger i samme kromosomale lokus. Allelisk variasjon oppstår naturlig ved mutasjon og kan føre til fenotypisk polymorfi i populasjoner. Genmutasjoner kan være tause (dvs. ingen endring i det kodede polypeptid), eller de kan kode for polypeptider med endret aminosyresekvens. Begrepet "allelisk variant" anvendes også heri for å betegne et protein som kodes av en allelisk variant av et gen. Videre omfattes det samme protein fra samme art som avviker fra en referanseaminosyresekvens grunnet allelisk variasjon. Allelisk variasjon viser til naturlig forekommende forskjeller mellom individer i gener som koder for et gitt protein.
Aminoterminal og karboksylterminal: anvendes heri for å angi posisjoner i polypeptider og proteiner. Dersom sammenhengen tillater dette, anvendes disse begreper med henvisning til en gitt sekvens eller en del av et polypeptid eller protein for å angi nærhet eller relativ posisjon. For eksempel er en gitt sekvens som er plassert karboksyl-terminalt til en referansesekvens i et protein, lokalisert nærmere karboksylenden av referansesekvensen, men er ikke nødvendigvis i karboksylenden av det fullstendige protein.
Komplement/ antikomplementpar: betegner ikke-identiske grupper som danner et ikke-kovalent sammenbundet, stabilt par under egnede betingelser. For eksempel er biotin og avidin (eller streptavidin) prototypiske medlemmer av et komplement/antikomplementpar. Andre eksemplariske komplement/antikomplementpar omfatter reseptor/ligandpar, antistoff/antigen (eller hapten eller epitop)-par, "sense/antisense"-polynukleotidpar og lignende. Dersom påfølgende dissosiasjon av komplement/anti-komplementparet er ønskelig, har komplement/antikomplementparet fortrinnsvis en bindingsaffinitet på <10"<9>M.
Kontig: betegner et polynukleotid som har et kontinuerlig strekk med sekvens som er identisk med eller komplementær til et annet polynukleotid. Kontinuerlige sekvenser sies å "overlappe" et gitt strekk av en polynukleotidsekvens enten i sin helhet eller langs et delstrekk av polynukleotidet. For eksempel er representative kontiger til polynukleotidsekvensen 5'-ATGGCTTAGCTT-3' 5'-TAGCTTgagtct-3' og 3'-gtcgacTACCGA-5'.
Komplementer av polynukleotidmolekvler: betegner polynukleotidmolekyler som har en komplementær basesekvens og revers orientering, sammenlignet med en referansesekvens. For eksempel er sekvensen 5' ATGCACGGG 3' komplementær til 5' CCCGTGCAT 3'.
Degenerert nukleotidsekvens eller degenerert sekvens: betegner en nukleotidsekvens som omfatter ett eller flere degenererte kodoner (sammenlignet med et referansepolynukleotidmolekyl som koder for et polypeptid). Degenererte kodoner inneholder forskjellige tripletter av nukleotider, men koder for samme aminosyrerest (f.eks. koder triplettene GAU og GAC begge for Asp).
Ekspresjonsvektor: Et lineært eller sirkulært DNA-molekyl som omfatter et segment som koder for et polypeptid av interesse, operativt koblet til ytterligere segmenter som tilveiebringer transkripsjon av segmentet. Slike tilleggssegmenter kan omfatte promoter- og terminatorsekvenser og om ønskelig ett eller flere replikasjons origoer, én eller flere seleksjonsmarkører, en enhancer, et polyadenyleringssignal og lignende. Ekspresjonsvektorer er generelt avledet fra plasmid-DNA eller viralt DNA, eller de kan inneholde elementer fra begge disse.
Isoform: viser til forskjellige former av et protein som kan produseres fra forskjellige gener eller fra samme gen ved alternativ spleising. I noen tilfeller er isoformer forskjellige når det gjelder transportaktivitet, tidspunktet for ekspresjon under utviklingen, vevsfordelingen, cellelokaliseringen eller en kombinasjon av disse egenskaper.
Isolert polynukleotid: betegner at polynukleotidet er blitt fjernet fra sitt naturlige genetiske miljø og således er fritt for andre utenforliggende eller uønskede kodende sekvenser, og foreligger i en form som er egnet for anvendelse i produksjons-systemer for genetisk modifisert protein. Slike isolerte molekyler er molekyler som er separert fra sitt naturlige miljø og omfatter cDNA og genomiske kloner. Isolerte DNA-molekyler ifølge foreliggende oppfinnelse er fri for andre gener som de vanligvis er forbundet med, men kan omfatte naturlig forekommende 5'- og 3'-ikke-translaterte områder, f.eks. promotere og terminatorer. Identifisering av assosierte områder vil være åpenbart for en gjennomsnittsfagmann (se f.eks. Dynan og Tijan, Nature 37(5:774-78, 1985).
Isolert polypeptid eller protein: er et polypeptid eller protein som foreligger i en tilstand som er forskjellig fra dets naturlige miljø, f.eks. i fravær av blod og dyrevev. I en foretrukket form er det isolerte polypeptid i det vesentlige fritt for andre polypeptider, fortrinnsvis andre polypeptider med opphav i dyr. Det foretrekkes at polypeptidene tilveiebringes i en svært renset form, dvs. mer enn 95% rene, mer foretrukket mer enn 99% rene. Anvendt i denne sammenheng, utelukker ikke begrepet "isolert" nærvær av det samme polypeptid i alternative fysiske former, f.eks. dimerer eller alternativt glykosylerte eller derivatiserte former.
Operativt sammenkoblet: som anvendt på nukleotidsegmenter viser begrepet "operativt sammenkoblet" til at segmentene er arrangert slik at de fungerer sammen for sine påtenkte formål, f.eks. innledes transkripsjonen i promoteren og forløper gjennom det kodende segment til terminatoren.
Ortolog: betegner et polypeptid eller protein erholdt fra én art som er den funksjonelle motpart til et polypeptid eller protein fra en annen art. Sekvensforskjeller blant ortologer er en følge av artsdannelse.
Pol<y>nukleotid: betegner en enkelt- eller dobbelttrådet polymer av deoksy-ribonukleotid- eller ribonukleotidbaser lest fra 5 - til 3'-enden. Polynukleotider omfatter RNA og DNA og kan være isolert fra naturlige kilder, syntetisert in vitro eller fremstilt fra en kombinasjon av naturlige og syntetiske molekyler. Polynukleotiders størrelse uttrykkes som basepar (forkortet "bp"), nukleotider ("nt") eller kilobaser ("kb"). Dersom sammenhengen tillater dette, kan de siste to begreper beskrive polynukleotider som er enkelttrådede eller dobbelttrådede. Dersom begrepet anvendes på dobbelttrådede molekyler, anvendes det for å angi totallengde og vil forstås å være ekvivalent med begrepet "basepar". Fagfolk vil forstå at de to tråder i et dobbelttrådet polynukleotid kan være noe forskjellige i lengde og at endene av trådene kan være forskjøvet i forhold til hverandre som en følge av enzymatisk kutting, således foreligger ikke nødvendigvis alle nukleotider i et dobbelttrådet polynukleotidmolekyl i basepar. Slike uparede ender vil generelt ikke være mer enn 20 nt lange.
Polypeptid: er en polymer av aminosyrerester sammenbundet med peptid-bindinger, enten produsert naturlig eller syntetisk. Polypeptider med mindre enn tilnærmet 10 aminosyrerester betegnes vanligvis som "peptider".
Promoter: betegner en del av et gen som inneholder DNA-sekvenser som sørger for binding av RNA-polymerase og initiering av transkripsjon. Promotersekvenser foreligger vanligvis, men ikke alltid, i de 5'-ikke-kodende områder av gener.
Protein: er et makromolekyl som omfatter én eller flere polypeptidkjeder. Et protein kan også omfatte ikke-peptidbestanddeler, f.eks. karbohydratgrupper. Karbo-hydrater og andre ikke-peptidbestanddeler kan adderes til et protein av cellen i hvilken proteinet produseres, og vil variere med celletypen. Proteiner defineres heri ut fra strukturen av aminosyreryggraden, substituenter som karbohydratgrupper angis generelt ikke, men kan likevel foreligge.
Reseptor: Et celleassosiert protein eller en polypeptidsubenhet av et slikt protein, som bindes til et bioaktivt molekyl ("liganden") og formidler virkningen av liganden på cellen. Binding av ligand til reseptor fører til en endring i reseptoren (og i noen tilfeller multimerisering av reseptoren, dvs. sammenbinding av identiske eller forskjellige reseptorsubenheter) som forårsaker interaksjoner mellom effektordomenet eller -domenene i reseptoren og ett eller flere andre molekyler i cellen. Disse inter-aksjonene fører i sin tur til endringer i cellens metabolisme. Metabolske begivenheter som er forbundet med reseptor-ligandinteraksjoner, omfatter gentranskripsjon, fosforylering, defosforylering, celleproliferasjon, økt produksjon av syklisk AMP, mobilisering av cellulært kalsium, mobilisering av membranlipider, celleadhesjon, hydrolyse av inositollipider og hydrolyse av fosfolipider. BR43x2 har egenskaper typiske for TNF-reseptorer som diskutert mer detaljert heri.
Sekretorisk si<g>nalsekvens: En DNA-sekvens som koder for et polypeptid (et "sekretorisk peptid"), som som en bestanddel av et større polypeptid styrer det større polypeptid gjennom en sekretorisk reaksjonsvei i en celle i hvilken det syntetiseres. Det større polypeptid kløyves vanligvis for fjerning av det sekretoriske peptid under trans-porten gjennom den sekretoriske reaksjonsvei.
Løselig reseptor: Et reseptorpolypeptid som ikke er bundet til en celle-membran. Løselige reseptorer er vanligvis ligandbindende reseptorpolypeptider som mangler transmembrandomener og cytoplasmatiske domener. Løselige reseptorer kan omfatte ytterligere aminosyrerester, f.eks. affinitetsmerkelapper som anvendes for rensing av polypeptidet eller som tilveiebringer seter for tilkobling av polypeptidet til et støtte-medium. Mange celleoverflatereseptorer har naturlig forekommende, løselige motparter som fremstilles ved proteolyse eller translateres fra alternativt spleiset mRNA. Reseptorpolypeptider sies å være i det vesentlige fri for transmembranpolypeptidsegmenter og intracellulære polypeptidsegmenter dersom de mangler deler av disse segmenter som er nødvendige for å gi membranforankring, hhv. signaloverføring.
Molekylvekter og lengder av polymerer bestemt ved unøyaktige analytiske fremgangsmåter (f.eks. gelelektroforese), vil forstås å være tilnærmede verdier. Dersom en slik verdi angis som "tilnærmet" X eller "omtrent" X, vil det forstås at den angitte verdi av X vil være nøyaktig innenfor ±10%.
Alle referanser som siteres heri, inkorporeres heri i sin helhet ved referanse.
Foreliggende oppfinnelse er delvis basert på oppdagelsen av en DNA-sekvens på 1192 bp (SEKV.ID NR: 1) og den tilsvarende polypeptidsekvens (SEKV.ID NR: 2) som er en isoform av reseptoren TACI. Isoformen er blitt gitt betegnelsen BR43x2. En løselig form av BR43x2 beskrives i SEKV.ID NR: 4 og polynukleotidet som koder for den løselige reseptor i SEKV.ID NR: 3. Som beskrevet mer detaljert heri, ble de BR43x2-reseptorkodende polynukleotider og polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse opprinnelig identifisert ved signalfellekloning ved anvendelse av et humant RPMI 1788-bibliotek og den N- eller C-terminalt "FLAG"-merkede, biotin- eller FITC-merkede tumornekrosefaktorligand ztnf4, nå betegnet neutrokin a (WIPO W098/18921), BLyS (Moore et al., ibid.), BAFF (Schneider et al., ibid.), TALL-1 (Shu et al., ibid.) eller THANK (Mukhopadhyay et al., ibid.). Positive fraksjoner ble identifisert ved ligandbinding, separert i enkeltkloner og cDNA isolert og sekvensert. En sammenligning av den utledede aminosyresekvens for BR43x2 (som vist i SEKV.ID NR: 2) med kjente tumornekrosefaktorreseptorer viste at BR43x2 er en isoform av TACI med en enkelt, dårlig konservert, cysteinrik pseudorepetisjon.
Strukturelt særpreges TNF-reseptorfamilien ved en ekstracellulær del som består av flere moduler som av historiske grunner betegnes "cysteinrike pseudorepetisjoner". Et prototypisk TNFR-familiemedlem har fire av disse pseudorepetisjonene, hver tilnærmet 29-43 aminosyrerester lange, den ene like etter den andre. En typisk pseudorepetisjon har 6 cysteinrester. Disse kalles pseudorepetisjoner da de, selv om de ser ut til å stamme fra en felles utgangssekvens, ikke er nøyaktige repetisjoner: pseudorepetisjonene nr. 1,2,3 og 4 har karakteristiske sekvensegenskaper som skiller dem fra hverandre. Krystallstrukturen av TNF-reseptoren p55 viste at hver pseudorepetisjon tilsvarer et foldingsdomene og at alle de fire pseudorepetisjonene foldes i den samme tertiærstruktur som internt holdes sammen av disulfidbindinger.
TACI inneholder to cysteinrike pseudorepetisjoner (von Bulow og Bram, ibid.), den første er konservert i struktur med andre medlemmer av TNF-reseptorfamilien, mens den andre er mindre konservert. BR43x2-isoformen ifølge foreliggende oppfinnelse mangler den første cysteinrike pseudorepetisjon i TACI og inneholder kun den andre, mindre konserverte repetisjon.
Sekvensanalyse av en utledet aminosyresekvens for BR43x2 som vist i SEKV.ID NR: 2, tyder på nærvær av et modent protein med et ekstracellulært domene (aminosyrerestene 1-120 i SEKV.ID NR: 2) som inneholder én cysteinrik pseudorepetisjon (aminosyrerestene 25-58 i SEKV.ID NR: 2), et transmembrandomene (aminosyrerestene 121-133 i SEKV.ID NR: 2) og et cytoplasmatisk domene (aminosyrerestene 134-247 i SEKV.ID NR: 2). Den cysteinrike pseudorepetisjon i BR43x2 har 6 konserverte cysteinrester (aminosyrerestene 25,40,43,47, 54 og 58 i SEKV.ID NR: 2), en konservert asparaginsyrerest (aminosyrerest 34 i SEKV.ID NR: 2) og to konserverte leucinrester (aminosyrerestene 36 og 37 i SEKV.ID NR: 2) og viser 46% identitet med den første cysteinrike pseudorepetisjon i TACI (SEKV.ID NR: 6) og 35% identitet med den cysteinrike pseudorepetisjon i BCMA (SEKV.ID NR: 8) (figur 1). Den cysteinrike pseudorepetisjon kan representeres ved følgende motiv: CX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2} [YFW][YFW]DXLLX{2}C[IMLV]XCX{3}
CX{6-8}CX{2}[YF]C (SEKV.ID NR: 10),
hvori C står for aminosyreresten cystein, Q glutamin, E glutaminsyre, K lysin, N asparagin, R arginin, D asparaginsyre, H histidin, S serin, Y tyrosin, F fenylalanin, W tryptofan, L leucin, I isoleucin, V valin og X står for enhver naturlig forekommende aminosyrerest bortsett fra cystein. Aminosyrerester i hakeparentes "[]" angir den tillatte aminosyrerestvariasjon i den angitte posisjon. Tallet i klammeparentes "{}" angir antallet tillatte aminosyrerester i den angjeldende posisjon.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også løselige polypeptider med lengde fra 32 til 40 aminosyrerester ifølge SEKV.ID NR: 10.
Den løselige BR43x2-reseptor, representert ved aminosyrerestene 1-120 i SEKV.ID NR: 4, inneholder én cysteinrik pseudorepetisjon (aminosyrerestene 25-58 i SEKV.ID NR: 4) og mangler transmembrandomenet og det cytoplasmatiske domene i BR43x2 som beskrevet i SEKV.ID NR: 2.
Fagfolk vil forstå at disse domenegrensene er tilnærmede og basert på oppstillinger med kjente proteiner og utledet proteinfolding. Disse egenskaper viser at reseptoren som kodes av DNA-sekvensene ifølge SEKV.ID NR: 1 og 3, er et medlem av TNF-reseptorfamilien.
Northern-blot-analyse og Dot-blot-analyse av vevsfordelingen av mRNA som tilsvarer nukleotidprober mot BR43xl, som forventes å påvise BR43x2-ekspresjon, viste ekspresjon i milt, lymfeknute, CD19<+->celler, svak ekspresjon i celler fra en blandet lymfocyttreaksjon, Daudi-celler og Raji-celler. Ved anvendelse av revers transkriptase-PCR ble BR43xl kun påvist i B-celler og ikke i aktiverte T-celler som rapportert for TACI (von Bulow og Bram, ibid.). Ved anvendelse av en BR43x2-probe som overlappet 100% med den tilsvarende TACI-sekvens, ble TACI og BR43x2 påvist i milt, lymfeknute og tynntarm, mage, spyttkjertel, blindtarm, lunge, benmarg, føtal milt, CD19<+->celler og Raji-celler.
Ved anvendelse av Northern-blot-analyse ble BCMA påvist i tynntarm, milt, mage, colon, blindtarm, lymfeknute, luftrør og testis. BCMA ble også påvist i adenolymfom, ikke-Hodgkins lymfom og parotid tumor, og svakt påvist i CD8<+->celler, CD19<+->celler, MLR-celler, Daudi-celler, Raji-celler og Hut 78-celler.
Northern-blot-analyse ble også utført ved anvendelse av ztnf4 fra mus (SEKV.ID NR: 19), og som for humant TACI, BCMA og BR43x2 ble ekspresjon av ztnf4 i mus hovedsakelig påvist i milt og brissel. Ztnf4 fra mus ble også uttrykt i lunge, og en svak ekspresjon ble påvist i hud og hjerte.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også polynukleotidmolekyler, innbefattet DNA- og RNA-molekyler, som koder for BR43x2-polypeptidene som beskrives heri. Fagfolk vil lett innse at i lys av den genetiske kodes degenererthet er betydelig sekvensvariasjon mulig blant disse polynukleotidmolekylene. SEKV.ID NR: 11 er en degenerert DNA-sekvens som omfatter alle DNA som koder for det løselige BR43x2-polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 4. Tilsvarende er SEKV.ID NR: 12 en degenerert DNA-sekvens som omfatter alle DNA som koder for BR43x2-polypeptidet ifølge SEKV.ID NR: 2. Fagfolk vil innse at den degenererte sekvens ifølge SEKV.ID NR: 12 også tilveiebringer alle RNA-sekvenser som koder for SEKV.ID NR: 4 ved å erstatte T med U. Således omfattes BR43x2-polypeptidkodende polynukleotider som omfatter nukleotid 1 til nukleotid 360 i SEKV.ID NR: 11, nukleotid 1 til 741 i SEKV.ID NR: 12 og disses RNA-ekvivalenter av foreliggende oppfinnelse. Tabell 1 angir enbokstavskodene som anvendes i SEKV.ID NR: 11 og 12 for å angi degenererte nukleotidposisjoner. "Betydning" er nukleotidene som angis av en kodebokstav. "Komplement" angir koden for det eller de komplementære nukleotider. For eksempel angir koden Y enten C eller T, og dennes komplement R angir A eller G, hvor A er komplementær til T og G er komplementær til C.
De degenererte kodoner som anvendes i SEKV.ID NR: 11 og 12, som omfatter alle mulige kodoner for en gitt aminosyre, er angitt i tabell 2. En gjennomsnittsfagperson vil innse at en viss tvetydighet innføres ved angivelse av et degenerert kodon som representerer alle mulige kodoner som koder for en gitt aminosyre. For eksempel kan det degenererte kodon for serin (WSN) i noen tilfeller kode for arginin (AGR), og det degenererte kodon for arginin (MGN) kan i noen tilfeller kode for serin (AGY). Et tilsvarende forhold foreligger mellom kodoner som koder for fenylalanin og leucin. Følgelig kan noen polynukleotider som omfattes av den degenererte sekvens, kode for aminosyresekvensvarianter, men en gjennomsnittsfagperson kan lett identifisere slike sekvensvarianter ved henvisning til aminosyresekvensene ifølge SEKV.ID NR: 2 og 4. Sekvensvarianter kan lett analyseres for funksjonalitet som beskrevet heri.
En gjennomsnittsfagperson vil også innse at forskjellige arter kan fremvise "preferensiell kodonbruk". For en generell beskrivelse, se Grantham et al., Nuc. Acids Res. 5:1893-912, 1980, Haas et al., Curr. Biol. 6:315-24, 1996, Wain-Hobson et al., Gene 73:355-64,1981, Grosjean og Fiers, Gene 75:199-209, 1982, Holm, Nuc. Acids Res. 74:3075-87,1986, Ikemura, J. Mol. Biol. 755:573-97, 1982. Som anvendt heri, er begrepet "preferensiell kodonbruk" eller "preferensielle kodoner" et fagbegrep som viser til proteintranslasjonskodoner som hyppigst anvendes i celler fra en viss art, slik at én eller noen få representanter for de mulige kodoner som koder for hver aminosyre, favoriseres (se tabell 2). For eksempel kan aminosyren treonin (Thr) kodes av ACA, ACC, ACG eller ACT, men i pattedyrceller er ACC det hyppigst anvendte kodon, i andre arter, f.eks. insektsceller, gjær, virus eller bakterier, kan andre Thr-kodoner foretrekkes. Preferensielle kodoner for en gitt art kan innføres i polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse ved en rekke fremgangsmåter som er kjent innen faget. Innføring av preferensielle kodonsekvenser i rekombinant DNA kan f.eks. gi økt produksjon av proteinet ved at proteintranslasjonen gjøres mer effektiv i en gitt celletype eller art. Derfor kan de degenererte kodonsekvenser som beskrives i SEKV.ID NR: 11 og 12, fungere som templater for optimalisering av ekspresjonen av polynukleotider i forskjellige celletyper og arter som vanligvis anvendes innen faget og beskrives heri. Sekvenser som inneholder preferensielle kodoner, kan analyseres og optimaliseres for ekspresjon i forskjellige arter og analyseres for funksjonalitet som beskrevet heri.
De svært konserverte aminosyrene i den cysteinrike pseudorepetisjon i BR43x2 kan anvendes som et verktøy for identifisering av nye familiemedlemmer. For eksempel kan revers transkripsjon-polymerase-kjedereaksjon (RT-PCR) anvendes for amplifisering av sekvenser som koder for det ekstracellulære, ligandbindende domene beskrevet ovenfor, fra RNA erholdt fra en rekke vevskilder eller cellelinjer. Primere med høy grad av degenerasjon utformet fra BR43x2-sekvensene, er spesielt anvendbare for dette formål.
I foretrukne utførelser av oppfinnelsen vil isolerte polynukleotider hybridisere til områder av tilsvarende størrelse i SEKV.ID NR: 3, eller til en sekvens som er komplementær til denne, under stringente betingelser. Generelt utvelges stringente betingelser slik at temperaturen er tilnærmet 5 °C lavere enn det termale smeltepunkt (Tm) for den spesifikke sekvens ved en definert ionestyrke og pH. Tm er temperaturen (under definert ionestyrke og pH) ved hvilken 50% av målsekvensen hybridiserer til en perfekt tilpasset probe. Typiske stringente betingelser er betingelser hvor saltkonsentrasjonen er opp til tilnærmet 0,03 M ved pH 7, og temperaturen er minst 60 °C.
Som bemerket tidligere, omfatter de isolerte polynukleotidene ifølge foreliggende oppfinnelse DNA og RNA. Fremgangsmåter for isolering av DNA og RNA er velkjente innen faget. Det foretrekkes generelt å isolere RNA fra RPMI 1788-celler, PBMNC, hvilende eller aktiverte, transfekterte B-celler eller tonsillvev, selv om DNA også kan fremstilles ved anvendelse av RNA fra andre vev eller isolert som genomisk DNA. Total-RNA kan fremstilles ved anvendelse av guanidin-HCl-ekstraksjon fulgt av isolering ved sentrifugering i en CsCl-gradient (Chirgwin et al., Biochemistry 75:52-94, 1979). Poly(A)<+->RNA fremstilles fra total-RNA ved anvendelse av fremgangsmåten til Aviv og Leder (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69:1408-12,1972). Komplementært DNA (cDNA) fremstilles fra poly(A)<+->RNA ved anvendelse av kjente fremgangsmåter. Polynukleotider som koder for BR43x2-polypeptider, identifiseres så og isoleres ved f.eks. hybridisering eller PCR.
Fagfolk vil innse at sekvensene beskrevet i SEKV.ID NR: 1 og 3, representerer en enkelt allel av det humane gen, og at allelisk variasjon og alternativ spleising forventes å forekomme. Alleliske varianter av DNA-sekvensene vist i SEKV.ID NR: 1 og 3, innbefattet varianter som inneholder tause mutasjoner og varianter i hvilke mutasjonene fører til aminosyresekvensendringer, ligger innenfor foreliggende oppfin-nelses område, likeså proteiner som er alleliske varianter av SEKV.ID NR: 2 og 4. Alleliske varianter og spleisevarianter av disse sekvenser kan klones ved å gjennomsøke cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker fra forskjellige individer eller ved ifølge standardfremgangsmåter som er kjent innen faget.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også isolerte BR43x2-polypeptider som er i det vesentlige homologe med polypeptidene ifølge SEKV.ID NR: 2 og 4 og disses artsortologer. Begrepet "i det vesentlige homologe" anvendes heri for å betegne polypeptider med 50%, fortrinnsvis 60%, mer foretrukket minst 80%, sekvensidentitet med sekvensene vist i SEKV.ID NR: 2 og 4 eller disses ortologer. Slike polypeptider vil mer foretrukket være minst 90% identiske, og mest foretrukket 95% eller mer identiske med SEKV.ID NR: 2 eller dennes ortologer. Prosent sekvensidentitet bestemmes ved konvensjonelle fremgangsmåter. Se f.eks. Altschul et al, Bull. Math. Bio. 45:603-66, 1986 og Henikoff og Henikoff, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:10915-9, 1992. Kort beskrevet oppstilles to aminosyresekvenser slik at oppstillingspoengene optimaliseres ved anvendelse av en gapåpningsstraff på 10, en gaputvidelsesstraff på 1 og poengtabellen "blosum 62" fra Henikoff og Henikoff ( ibid.) som vist i tabell 3 (aminosyrene er angitt ved standard enbokstavskoder). Prosent identitet beregnes så som:
Sekvensidentitet for polynukleotidmolekyler bestemmes ved tilsvarende fremgangsmåter ved anvendelse av et forhold som beskrevet ovenfor.
I det vesentlige homologe proteiner og polypeptider særpreges ved at de har én eller flere aminosyresubstitusjoner, -delesjoner eller -addisjoner. Disse endringene er fortrinnsvis mindre viktige, det vil si konservative aminosyresubstitusjoner (se tabell 4) og andre substitusjoner som ikke i vesentlig grad påvirker folding eller aktivitet av proteinet eller polypeptidet, små delesjoner, typisk fra 1 til tilnærmet 30 aminosyrer, og små amino- eller karboksylterminale forlengelser, f.eks. en aminoterminal metioninrest, et lite linkerpeptid på opp til tilnærmet 20-25 aminosyrerester eller en affinitetsmerkelapp. Polypeptider som omfatter affinitetsmerkelapper, kan videre omfatte et proteolytisk kløyvingssete mellom BR43x2-polypeptidet og affinitetsmerkelappen. Foretrukne seter av denne type omfatter trombinkløyvingsseter og faktor Xa-kløyvingsseter.
I tillegg til de 20 vanlige aminosyrene kan uvanlige aminosyrer (f.eks. 4-hydroksyprolin, 6-N-metyllysin, 2-aminoisosmørsyre, isovalin og a-metylserin) erstatte aminosyrerester i BR43x2-polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse. Et begrenset antall ikke-konservative aminosyrer, aminosyrer som ikke kodes av den genetiske kode, og unaturlige aminosyrer, kan erstatte aminosyrerester i BR43x2-polypeptidet. Proteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også omfatte ikke-naturlig forekommende aminosyrerester.
Ikke-naturlig forekommende aminosyrer omfatter, men er ikke begrenset til, trans-3-metylprolin, 2,4-metanprolin, cis-4-hydroksyprolin, trans-4-hydroksyprolin, N-metylglysin, allotreonin, metyltreonin, hydroksyetylcystein, hydroksyetylhomocystein, nitroglutamin, homoglutamin, pipekolsyre, tert.-leucin, norvalin, 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenylalanin og 4-fluorfenylalanin. Flere fremgangsmåter er kjente innen faget for innføring av ikke-naturlig forekommende aminosyrerester i proteiner. Det kan f.eks. anvendes et in v/fro-system hvori "nonsense"-mutasjoner undertrykkes ved anvendelse av kjemisk aminoacylerte suppressor-tRNA. Fremgangsmåter for syntese av aminosyrer og aminoacylering av tRNA er kjent innen faget. Transkripsjon og translasjon av plasmider som inneholder "nonsense"-mutasjoner, utføres i et cellefritt system som omfatter et S30-ekstrakt fra E. coli og kommersielt tilgjengelige enzymer og andre reagenser. Proteinene renses ved kromatografi. Se f.eks. Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 7/3:2722, 1991, Ellman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991, Chung et al., Science 259:806-9,1993, og Chung et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 90:10145-9, 1993). I en annen fremgangsmåte utføres translasjonen i Xenopus-oocytter ved mikroinjeksjon av mutert mRNA og kjemisk aminoacylerte suppressor-tRNA (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 277:19991-8,1996). I en tredje fremgangsmåte dyrkes E. cø//-celler i fravær av en naturlig aminosyre som skal erstattes (f.eks. fenylalanin) og i nærvær av den eller de ønskede, ikke-naturlig forekommende aminosyrer (f.eks. 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenylalanin eller 4-fluorfenylalanin). Den ikke-naturlig forekommende aminosyre innføres i proteinet i stedet for dens naturlige motpart. Se Koide et al., Biochem. 33:7470-6,1994. Naturlig forekommende aminosyrerester kan overføres til ikke-naturlig forekommende aminosyrerester ved kjemisk modifisering in vitro. Kjemisk modifisering kan kombineres med setestyrt mutagenese for ytterligere å utvide substitusjonsområdet (Wynn og Richards, Protein Sei. 2:395-403, 1993).
Et begrenset antall ikke-konservative aminosyrer, aminosyrer som ikke kodes av den genetiske kode, ikke-naturlig forekommende aminosyrer og unaturlige aminosyrer kan erstatte aminosyrerester i BR43x2.
Essensielle aminosyrer i BR43x2-polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan identifiseres ifølge fremgangsmåter som er kjent innen faget, f.eks. setestyrt mutagenese eller alanin-skannende mutagenese (Cunningham og Wells, Science 244:1081-5, 1989). Enkeltvise alaninmutasjoner innføres i hver aminosyrerest i mole-kylet, og de resulterende mutante molekyler analyseres for biologisk aktivitet (f.eks. ved at de gir en reduksjon av B-celleresponsen under immunresponsen, inhibering eller reduksjon av autoantistoffproduksjonen) for identifisering av aminosyrerester som er avgjørende for molekylets aktivitet. Se også Hilton et al., J. Biol. Chem. 277:4699-708, 1996. Seter for biologisk interaksjon og ligandbindende deler, f.eks. de cysteinrike pseudorepetisjonene, kan også identifiseres ved fysisk analyse av strukturen, bestemt ved teknikker som kjernemagnetisk resonans, krystallografi, elektrondiffraksjon eller fotoaffinitetsmerking, kombinert med mutasjon av aminosyrer i det mulige kontaktsete. Se f.eks. de Vos et al., Science 255:306-12, 1992, Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992, Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Identiteten av essensielle aminosyrer kan også utledes fra analyse av homologi med beslektede TNFR-familiemedlemmer, f.eks. TACI og BCMA.
Ytterligere aminosyresubstitusjoner kan innføres i den cysteinrike pseudorepetisjon i BR43x2 så lenge som de konserverte cysteinrestene, asparagin-syrerestene og leucinrestene bibeholdes og den høyere ordens struktur ikke forstyrres. Det foretrekkes å innføre substitusjoner i den cysteinrike pseudorepetisjon i BR43x2 ved sammenligning med sekvensene til andre cysteinrike pseudorepetisjoner. SEKV.ID NR: 10 er en generalisert cysteinrik pseudorepetisjon som viser tillatte aminosyresubstitusjoner basert på en slik sekvensoppstilling. Begrensningene beskrevet heri, gjelder for substitusjoner innen dette domene.
Flere aminosyresubstitusjoner kan innføres og analyseres ved anvendelse av kjente fremgangsmåter for mutagenese og analyse, f.eks. fremgangsmåtene beskrevet av Reidhaar-Olson og Sauer (Science 247:53-7, 1988) eller Bowie og Sauer (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 56:2152-6, 1989). Kort fortalt beskriver disse forfattere fremgangsmåter for samtidig randomisering av to eller flere posisjoner i et polypeptid, seleksjon av funksjonelt polypeptid og sekvensering av de mutageniserte polypeptider for å bestemme omfanget av tillatte substitusjoner i hver posisjon. Andre fremgangsmåter som kan anvendes, omfatter bakteriofagrfemvisning (f.eks. Lowman et al., Biochem. 30:10832-7, 1991, Ladner et al., US patentskrift nr. 5 223 409, Huse, WIPO patentskrift WO 92/06204) og områdestyrt mutagenese (Derbyshire et al., Gene 46:145,1986, Ner et al., DNA 7:127, 1988).
Varianter av de beskrevne BR43x2-DNA og polypeptidsekvensene kan fremstilles ved DNA-"stokking" som beskrevet av Stemmer, Nature 370:389-91,1994, Stemmer, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 97:10747-51, 1994 og i WIPO patentskrift WO 97/20078. Kort beskrevet fremstilles DNA-varianter ved homolog rekombinasjon in vitro ved tilfeldig fragmentering av et utgangs-DNA fulgt av gjenoppbygging ved anvendelse av PCR, noe som fører til tilfeldig innførte punktmutasjoner. Denne teknikk kan modifis-eres ved å anvende en familie av utgangs-DNA, f.eks. alleliske varianter eller DNA fra forskjellige arter, for å innføre ytterligere variabilitet i prosessen. Seleksjon eller analyse for den ønskede aktivitet, fulgt av flere gangers gjentakelse av mutagenesen og analysen, gir hurtig "evolusjon" av sekvenser ved seleksjon av ønskede mutasjoner og samtidig seleksjon mot skadelige endringer.
Mutagenesefremgangsmåter som beskrevet ovenfor, kan kombineres med automatiserte analysefremgangsmåter med høy kapasitet for å påvise aktivitet av klonede, mutageniserte polypeptider i vertsceller. Mutageniserte DNA-molekyler som koder for aktive polypeptider (f.eks. polypeptider som gir en reduksjon av B-celleresponsen under immunresponsen, inhibering eller reduksjon av autoantistoffproduksjonen) kan gjenvinnes fra vertscellene og sekvenseres hurtig ved anvendelse av moderne utstyr. Disse fremgangsmåtene tillater hurtig bestemmelse av betydningen av de enkelte aminosyrerester i et polypeptid av interesse og kan anvendes på polypeptider med ukjent struktur.
Ved anvendelse av fremgangsmåtene diskutert ovenfor, kan en gjennomsnittsfagperson identifisere og/eller fremstille en rekke polypeptider som er i det vesentlige homologe med aminosyrerestene 1 til 120 i SEKV.ID NR: 2 eller alleliske varianter av denne og som bibeholder villtype-proteinets B-cellesupprimerende egenskaper. Slike polypeptider kan omfatte ytterligere aminosyrer eller domener fra andre medlemmer av tumornekrosefaktorreseptor-superfamilien, affinitetsmerkelapper eller lignende. BR43x2-polypeptid eller fusjonskonstruksjoner som inneholder funksjonelle domener fra andre medlemmer av TNFR-superfamilien, utgjør hybride tumornekrosefaktorreseptorer som fremviser modifiserte B-cellesupprimerende evner.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre tilsvarende reseptorer og polynukleotider fra andre arter (ortologer). Disse artene omfatter, men er ikke begrenset til, pattedyrarter, fuglearter, amfibiearter, reptilarter, fiskearter, insektsarter og andre vertebratarter og invertebratarter. Av spesiell interesse er BR43x2-reseptorer fra andre pattedyrarter, innbefattet mus, svin, fjærfe, storfe, hund, katt, hest og andre primater. Ortologer av den humane BR43x2-reseptor kan klones ved anvendelse av informasjon og sammensetninger som tilveiebringes av foreliggende oppfinnelse, kombinert med konvensjonelle kloningsteknikker. For eksempel kan et cDNA klones ved anvendelse av mRNA erholdt fra et vev eller en celletype som uttrykker reseptoren. Egnede mRNA-kilder kan identifiseres ved å analysere Northern-blot med prober utformet fra sekvensene beskrevet heri. Et bibliotek fremstilles så fra mRNA fra et positivt vev eller en positiv cellelinje. Et reseptorkodende cDNA kan så isoleres ved en rekke fremgangsmåter, f.eks. ved analyse med et fullstendig humant cDNA eller en del av dette, eller med ett eller flere sett av degenererte prober basert på den beskrevne sekvens. Et cDNA kan også klones ved anvendelse av PCR og primere utformet fra sekvensene beskrevet heri. I ytterligere en fremgangsmåte kan cDNA-biblioteket anvendes for transformasjon eller transfeksjon av vertsceller, og ekspresjon av det angjeldende cDNA kan påvises med et antistoff mot reseptoren. Lignende teknikker kan også anvendes for isolering av genomiske kloner.
Reseptorpolypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, innbefattet fullengde-reseptorpolypeptider, løselige reseptorpolypeptider, polypeptidfragmenter og fusjonspolypeptider, kan fremstilles i genetisk modifiserte vertsceller ifølge konvensjonelle teknikker. Egnede vertsceller er celletyper som kan transformeres eller transfekteres med eksogent DNA og dyrkes i kultur, og omfatter bakterier, soppceller og
I
dyrkede celler fra høyere eukaryoter. Eukaryote celler, spesielt dyrkede celler fra multicellulære organismer, foretrekkes. Teknikker for manipulering av klonede DNA-molekyler og innføring av eksogent DNA i en rekke vertsceller beskrives av Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor, NY, 1989, og Ausubel et al., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.
Generelt er en DNA-sekvens som koder for et BR43x2-polypeptid, operativt koblet til andre genetiske elementer som er nødvendige for ekspresjon av DNA-sekvensen, generelt omfattende en transkripsjonspromoter og -terminator, i en ekspresjonsvektor. Vektoren vil også vanligvis inneholde én eller flere seleksjons-markører og én eller flere replikasjonsorigoer, selv om fagfolk vil innse at i visse systemer kan seleksjonsmarkører foreligge på separate vektorer og replikasjonen av det eksogene DNA oppnås ved integrasjon i vertscellegenomet. Utvelgelse av promotere, terminatorer, seleksjonsmarkører, vektorer og andre elementer er et spørsmål om rutinemessig utforming som ligger innenfor det vanlige kunnskapsnivå innen faget. Mange slike elementer er beskrevet i litteraturen og er tilgjengelige fra kommersielle leverandører.
For å styre et BR43x2-polypeptid inn i en vertscelles sekresjonsreaksjonsvei foreligger en sekretorisk signalsekvens (også betegnet en signalsekvens, en ledersekvens, en prepro-sekvens eller en pre-sekvens) i ekspresjonsvektoren. Den sekretoriske signalsekvens kan være signalsekvensen fra BR43x2-polypeptidet, eller den kan være avledet fra et annet utskilt protein (f.eks. t-PA) eller være syntetisert de novo. Den sekretoriske signalsekvens er koblet til BR43x2-DNA-sekvensen i korrekt leseramme og plassert slik at den styrer det ny syntetiserte polypeptid inn i vertscellens sekresjonsreaksjonsvei. Sekretoriske signalsekvenser ligger vanligvis 5' for DNA-sekvensen som koder for polypeptidet av interesse, selv om visse signalsekvenser kan være plassert andre steder i DNA-sekvensen av interesse (se f.eks. Welch et al., US patentskrift nr. 5 037 743, Holland et al., US patentskrift nr. 5 143 830).
Dyrkede pattedyrceller er egnede verter ifølge foreliggende oppfinnelse. Fremgangsmåter for innføring av eksogent DNA i pattedyrvertsceller omfatter kalsium-fosfatformidlet transfeksjon (Wigler et al., Cell 14:125,1978, Corsaro og Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981, Graham og Van der Eb, Virology 52:456, 1973), elektroporering (Neumann et al., EMBO J. 7:841-45,1982), DEAE-dekstranformidlet transfeksjon (Ausubel et al., ibid.) og liposomformidlet transfeksjon (Hawley-Nelson et al., Focus 75:73, 1993, Ciccarone et al., Focus 75:80, 1993). Produksjonen av rekombinante polypeptider i dyrkede pattedyrceller er f.eks. beskrevet av Levinson et al., US patentskrift nr. 4 713 339, Hagen et al., US patentskrift nr. 4 784 950, Palmiter et al., US patentskrift nr. 4 579 821 og Ringold, US patentskrift nr. 4 656 134. Egnede dyrkede pattedyrceller omfatter cellelinjene COS-1 (ATCC nr. CRL 1650), COS-7 (ATCC nr. CRL 1651), BHK (ATCC nr. CRL 1632), BHK 570 (ATCC nr. CRL 10314), 293 (ATCC nr. CRL 1573, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72,1977), Jurkat (ATCC nr. CRL-8129), BaF3 (en interleukin-3-avhengig pre-lymfoid cellelinje avledet fra benmarg fra mus, se Palacios og Steinmetz, Cell 47:727-34, 1985, Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6:4133-5, 1986) og Kina-hamster-ovarier (f.eks. CHO-K1, ATCC nr. CCL 61). Andre egnede cellelinjer er kjent innen faget og tilgjengelige fra offentlige deponerings-institusjoner som American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Generelt foretrekkes kraftige transkripsjonspromotere, f.eks. promotere fra SV-40 eller cytomegalovirus. Se f.eks. US patentskrift nr. 4 956 288. Andre egnede promotere omfatter promotere fra metallotioneingener (US patentskrifter nr. 4 579 821 og 4 601 978) og den sene hovedpromoter fra adenovirus.
Medikamentseleksjon anvendes generelt for seleksjon av dyrkede pattedyrceller i hvilke fremmed DNA er innsatt. Slike celler betegnes vanligvis som "transfektanter". Celler som er blitt dyrket i nærvær av seleksjonsmidlet og som kan overføre genet av interesse til sitt avkom, betegnes "stabile transfektanter". En foretrukket seleksjonsmarkør er et gen som koder for resistens mot antibiotikumet neomycin. Seleksjonen utføres i nærvær av et medikament av neomycintype, f.eks. G-418 eller lignende. Seleksjonssystemer kan også anvendes for å øke ekspresjonsnivået av genet av interesse, en prosess som betegnes "amplifisering". Amplifisering utføres ved å dyrke transfektanter i nærvær av et lavt nivå av seleksjonsmidlet og så øke mengden av seleksjonsmidlet for seleksjon av celler som produserer store mengder av produktene fra de innførte gener. En foretrukket amplifiserbar seleksjonsmarkør er dihydrofolatreduktase som gir resistens mot metotreksat. Andre medikamentresistensgener (f.eks. gener for hygromycinresistens, flermedikamentresistens, puromycinacetyltransferase) kan også anvendes. Alternative markører som innfører en endret fenotype, f.eks. grønt fluore-scerende protein, eller celleoverflateproteiner som CD4, CD8, klasse IMHC, alkalisk fosfatase fra placenta, kan anvendes for sortering av transfekterte celler fra ikke-transfekterte celler ved hjelp av midler som FACS-sortering eller separasjonsteknologi basert på magnetiske kuler.
Andre celler fra høyere eukaryoter kan også anvendes som verter, innbefattet planteceller, insektsceller og fjærfeceller. En oversikt over anvendelse av Agrobacterium rhizogenes som en vektor for ekspresjon av gener i planteceller gis av Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 77:47-58, 1987. Transformasjon av insektsceller og produksjon av fremmede polypeptider i disse beskrives av Guarino et al., US patentskrift nr. 5 162 222 og WIPO patentskrift WO 94/06463. Insektsceller kan infiseres med rekombinant bakulovirus, vanligvis avledet fra Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). Se King og Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall, 0'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press, 1994, og Richardson, red., Baculovirus Expression Protocols, Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. En annen fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant BR43x2-bakulovirus benytter et transposonbasert system beskrevet av Luckow (Luckow et al., J. Virol. 67:4566-79, 1993). Dette system, som benytter overføringsvektorer, selges i settet "Bac-to-Bac" (Life Technologies, Rockville, MD). Dette system anvender en overføringsvektor, "pFastBacl" (Life Technologies) som inneholder et Tn7-transposon for flytting av DNA som koder for BR43x2-polypeptidet inn i et bakulovirusgenom som opprettholdes i E. coli som et stort plasmid betegnet et "bakmid". Se Hill-Perkins og Possee, J. Gen. Virol. 77:971-6, 1990, Bonning et al., J. Gen. Virol. 75:1551-6, 1994, og Chazenbalk og Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-9, 1995.1 tillegg kan overføringsvektorer omfatte en fusjon med opprettholdt leseramme med DNA som koder for en epitopmerkelapp i C- eller N-enden av det uttrykte BR43x2-polypeptid, f.eks. en Glu-Glu-epitopmerkelapp (Grussenmeyer et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 52:7952-4,1985). Ved anvendelse av en teknikk som er kjent innen faget, transformeres en overføringsvektor som inneholder BR43x2, inn i E. coli, og det analyseres for bakmider som inneholder et oppbrutt lacZ-gen, noe som viser et rekombinant bakulovirus. Bakmid-DNA som inneholder det rekombinante bakulovirusgenom, isoleres ved anvendelse av vanlige teknikker og anvendes for transfeksjon av Spodoptera frugiperda- ceMer, f.eks. Sf9-celler. Rekombinant virus som uttrykker BR43x2, fremstilles så. Lagerløsninger av rekombinant virus fremstilles ved vanlig anvendte fremgangsmåter innen faget.
Det rekombinante virus anvendes for infeksjon av vertsceller, typisk en cellelinje avledet fra hærmygg, Spodoptera rfugiperda. Se generelt Glick og Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. En annen egnet cellelinje er cellelinjen "High FiveO"
(Invitrogen) avledet fra Trichoplusia ni (US patentskrift nr. 5 300 435). Kommersielt tilgjengelig, serumfritt medium anvendes for dyrking og opprettholdelse av cellene. Egnede medier er "Sf900 II" (Life Technologies) og "ESF 921" (Expression Systems) for Sf9-cellene, og "Ex-cellO405" (JRH Biosciences, Lenexa, KS) og "Express FiveO" (Life Technologies) for T. «/-cellene. Cellene dyrkes opp fra en inokulasjonstetthet på tilnærmet 2-5 x IO<5>celler til en tetthet på 1-2 x IO<6>celler, hvoretter en lagerløsning av rekombinant virus tilsettes ved en infeksjonsmultiplisitet (MOI) på 0,1 til 10, mer typisk nær 3. De anvendte fremgangsmåter beskrives generelt i tilgjengelige laboratorie-håndbøker (King og Possee, ibid., 0'Reilly et al., ibid., Richardson, ibid.). Påfølgende rensing av BR43x2-polypeptidet fra supernatanten kan oppnås ved anvendelse av fremgangsmåter som beskrives heri.
Soppceller, innbefattet gjærceller, kan også anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse. Gjærarter av spesiell interesse i denne sammenheng omfatter Saccharomyces cerevisiae, Pichiapastoris og Pichia methanolica. Fremgangsmåter for transformasjon av S. cerevisiae- celler med eksogent DNA og fremstilling av rekombinante polypeptider fra disse beskrives f.eks. av Kawasaki, US patentskrift nr. 4 599 311, Kawasaki et al., US patentskrift nr. 4 931 373, Brake, US patentskrift nr. 4 870 008, Welch et al., US patentskrift nr. 5 037 743 og Murray et al., US patentskrift nr. 4 845 075. Transformerte celler selekteres ut fra fenotypen bestemt av seleksjonsmarkøren, vanligvis medikament-resistens eller evnen til å vokse i fravær av et gitt næringsstoff (f.eks. leucin). Et foretrukket vektorsystem for anvendelse i Saccharomyces cerevisiae er vektorsystemet POT1, beskrevet av Kawasaki et al. (US patentskrift nr. 4 931 373), som tillater seleksjon av transformerte celler ved dyrking i glukoseholdig medium. Egnede promotere og terminatorer for anvendelse i gjær omfatter promotere og terminatorer fra gener for glykolytiske enzymer (se f.eks. Kawasaki, US patentskrift nr. 4 599 311, Kingsman et al., US patentskrift nr. 4 615 974 og Bitter, US patentskrift nr. 4 977 092) og alkohol-dehydrogenasegener. Se også US patentskrifter nr. 4 990 446, 5 063 154, 5 139 936 og 4 661 454. Transformasjonssystemer for andre gjærarter, innbefattet Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii og Candida maltosa, er kjent innen faget. Se f.eks. Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 732:3459-65, 1986 og Cregg, US patentskrift nr. 4 882 279. Aspergillus- céller kan anvendes ifølge fremgangsmåtene til McKnight et al., US patentskrift nr. 4 935 349. Fremgangsmåter for transformasjon av Acremonium chrysogenum beskrives av Sumino et al., US patentskrift nr. 5 162 228. Fremgangsmåter for transformasjon av Neurospora beskrives av Lambowitz, US patentskrift nr. 4 486 533.
For eksempel beskrives anvendelse av Pichia methanolica som vert for produksjon av rekombinante proteiner av Raymond, US patentskrift nr. 5 716 808, Raymond, US patentskrift nr. 5 736 383, Raymond et al., Yeast 74:11-23,1998, og i internasjonale patentskrifter nr. WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 og WO 98/02565. DNA-molekyler for anvendelse for transformering av P. methanolica vil vanligvis være fremstilt som dobbelttrådede, sirkulære plasmider, som fortrinnsvis lineariseres før transformasjonen. For polypeptidproduksjon i P. methanolica foretrekkes det at promoteren og terminatoren i plasmidet er promoteren og terminatoren fra et P. methanolica- gen, f.eks. fra etP. methanolica- gen for alkoholutnyttelse (AUG1 eller AUG2). Andre anvendbare promotere omfatter promotere fra genene for dihydroksy-acetonsyntase (DHAS), formiatdehydrogenase (FMD) og katalase (CAT). For å fremme integrasjon av DNA i vertskromosomet foretrekkes det at hele ekspresjonssegmentet i plasmidet er flankert i begge ender av verts-DNA-sekvenser. En foretrukket seleksjons-markør for anvendelse i Pichia methanolica er et P. methanolica AD2-gen som koder for fosforibosyl-5-aminoimidazolkarboksylase (AIRC, EC 4.1.1.21), som tillater ade2-vertsceller å vokse i fravær av adenin. For industrielle prosesser i stor skala, hvor det er ønskelig å minimalisere anvendelsen av metanol, foretrekkes det å anvende vertsceller i hvilke begge metanolutnyttelsesgenene (AUG1 og AUG2) er delerte. For fremstilling av utskilte proteiner foretrekkes vertsceller som mangler gener for vakuolær protease (PEP4 og PRB1). Elektroporering anvendes for å fremme innføring av et plasmid som inneholder DNA som koder for et polypeptid av interesse i P. methanolica- ceWer. Det foretrekkes å transformere P. methanolica- ceWer ved elektroporering med et eksponen-sielt avtakende, pulserende elektrisk felt med en feltstyrke på fra 2,5 til 4,5 kV/cm, fortrinnsvis tilnærmet 3,75 kV/cm, og en tidskonstant (t) på fra 1 til 40 millisekunder, mest foretrukket tilnærmet 20 millisekunder.
Prokaryote vertsceller, innbefattet stammer av bakteriene Escherichia coli, Bacillus og andre slekter, er også anvendbare vertsceller ifølge foreliggende oppfinnelse. Teknikker for transformasjon av disse vertsceller og ekspresjon av fremmede DNA-sekvenser som er klonet i disse, er velkjente innen faget (se f.eks. Sambrook et al., ibid.). Ved ekspresjon av et BR43x2-polypeptid i en bakterie som E. coli, kan polypeptidet tilbakeholdes i cytoplasma, typisk som uløselige granuler, eller det kan styres til periplasmarommet ved hjelp av en bakteriell sekresjonssekvens. I det første tilfellet lyseres cellene, og granulene gjenvinnes og denatureres ved anvendelse av f.eks. guanidinisotiocyanat eller urea. Det denaturerte polypeptid kan så gjenfoldes og dimeriseres ved å fortynne denatureringsmidlet, f.eks. ved dialyse mot en oppløsning av urea og en kombinasjon av redusert og oksidert glutation, fulgt av dialyse mot en bufret saltløsning. I det siste tilfellet kan polypeptidet gjenvinnes fra periplasmarommet i løselig og funksjonell form ved å bryte opp cellene (f.eks. ved ultralydbehandling eller osmotisk sjokk) for frigivelse av periplasmarominnholdet og gjenvinning av proteinet, hvorved man unngår behovet for denaturering og gjenfolding.
Transformerte eller transfekterte vertsceller dyrkes ifølge konvensjonelle fremgangsmåter i et dyrkningsmedium som inneholder næringsstoffer og andre bestanddeler som er nødvendige for vekst av de valgte vertsceller. En rekke egnede medier, innbefattet definerte medier og komplekse medier, er kjent innen faget og omfatter generelt en karbonkilde, en nitrogenkilde, essensielle aminosyrer, vitaminer og mineraler. Medier kan også inneholde bestanddeler som vekstfaktorer eller serum etter behov. Dyrkningsmediet vil generelt selektere celler som inneholder det eksogent tilsatte DNA ved f.eks. medikamentseleksjon eller mangel på et essensielt næringsstoff som kom-plementeres av seleksjonsmarkøren som foreligger i ekspresjonsvektoren eller som er kotransfektert inn i vertscellen. P. methanolica- ceMer dyrkes i et medium som omfatter tilstrekkelige kilder for karbon, nitrogen og spornæringsstoffer ved en temperatur på fra tilnærmet 25 °C til 35 °C. Flytende kulturer tilføres tilstrekkelig luft ved konvensjonelle midler, f.eks. omristing av små kolber eller gjennombobling av fermentorer. Et foretrukket dyrkningsmedium for P. methanolica er YEPD (2% D-glukose, 2% "Bacto"-pepton (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% "Bacto" gjærekstrakt (Difco Laboratories), 0,004% adenin og 0,006% L-leucin).
Uttrykte, rekombinante BR43x2-polypeptider (eller kimære BR43x2-polypeptider eller fusjons-BR43x2-polypeptider) kan renses ved anvendelse av fraksjonering og/eller konvensjonelle rensingsfremgangsmåter og medier. Det foretrekkes at proteinene eller polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse foreligger i høyt renset form, dvs. mer enn 95% rene, mer foretrukket mer enn 99% rene. Utfelling med ammoniumsulfat og syreekstraksjon eller kaotrop ekstraksjon kan anvendes for fraksjonering av prøver. Eksempler på rensetrinn kan omfatte hydroksyapatitt, størrelseseksklusjon, FPLC og revers fase-høyytelses-væskekromatografi. Egnede anionbyttermedier omfatter derivatiserte dekstraner, agarose, cellulose, polyakrylamid, spesielle kiselgeler og lignende. PEI-, DEAE-, QAE- og Q-derivater foretrekkes, med DEAE "Fast-Flow Sepharose" (Pharmacia, Piscataway, NJ) som spesielt foretrukket. Eksempler på kromatografimedier omfatter de samme medier derivatisert med fenyl-, butyl- eller oktylgrupper, f.eks. "Phenyl-Sepharose FF" (Pharmacia), "Toyopearl butyl 650" (Toso Haas, Montgomeryville, PA), "Octyl-Sepharose" (Pharmacia) og lignende, eller polyakrylsyreresiner som "Amberchrom CG 71" (Toso Haas) og lignende. Egnede faste støttemidler omfatter glasskuler, kiselgelbaserte resiner, celluloseresiner, agarosekuler, kryssbundne agarosekuler, polystyrenkuler, kryssbundne polyakrylamidresiner og lignende, som er uløselige under betingelsene ved hvilke de skal anvendes. Disse støttemidlene kan være modifisert med reaktive grupper som tillater tilkobling av proteiner via aminogrupper, karboksylgrupper, sulfhydrylgrupper, hydroksylgrupper og/eller karbohydratgrupper. Eksempler på kjemisk kobling omfatter cyanogenbromidaktivering, N-hydroksysuccinimidaktivering, epoksidaktivering, sulfhydrylaktivering, hydrazidaktivering og karboksyl- og aminoderivater for kjemisk karbodiimidkobling. Disse og andre faste medier er velkjente og hyppig anvendt innen faget, og er tilgjengelige fra kommersielle leverandører. Fremgangsmåter for binding av reseptorpolypeptider til støttemedier er velkjente innen faget. Utvelgelse av en gitt fremgangsmåte er et spørsmål om rutinemessig utforming og bestemmes delvis av det valgte støttemiddels egenskaper. Se f.eks. Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sverige, 1988.
Polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan isoleres ved å utnytte deres fysiske egenskaper. For eksempel kan immobilisert metallionadsorpsjon (IMAC)-kromatografi anvendes for rensing av histidinrike proteiner, innbefattet proteiner som inneholder polyhistidinmerkelapper. Kort beskrevet lades en gel først med divalente metallioner slik at det dannes et chelat (Sulkowski, Trends in Biochem. 5:1-7, 1985). Histidinrike proteiner vil adsorberes til dette støttemedium med forskjellig affinitet, avhengig av det anvendte metallion, og vil elueres ved kompetitiv eluering, reduksjon av pH eller anvendelse av kraftige chelateringsmidler. Andre fremgangsmåter for rensing omfatter rensing av glykosylerte proteiner ved lektinaffinitetskromatografi og ionebytter-kromatografi (Methods in Enzymol., vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (red.), Acad. Press, San Diego, 1990, s. 529-39). I ytterligere utførelser av oppfinnelsen kan en fusjon mellom polypeptidet av interesse og en affinitetsmerkelapp (f.eks. maltosebindende protein, "FLAG"-merking (Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (SEKV.ID NR: 13)), Glu-Glu-merkelapp (Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu (SEKV.ID NR: 14)), et immunglobulindomene) konstrueres for å lette rensingen.
Fremgangsmåter for proteingjenfolding (og om ønskelig reoksidasjon) kan med fordel anvendes. Det foretrekkes å rense proteinet til >80% renhet, mer foretrukket til >90% renhet, ytterligere mer foretrukket >95% renhet, og spesielt foretrukket er en farmasøytisk ren tilstand, dvs. mer enn 99,9% rent når det gjelder kontaminerende makromolekyler, spesielt andre proteiner og nukleinsyrer, og fritt for infeksiøse og pyrogene midler. Et renset protein er fortrinnsvis i det vesentlige fritt for andre proteiner, særlig andre proteiner med opphav i dyr.
BR43x2-polypeptider eller fragmenter av disse kan også fremstilles ved kjemisk syntese. BR43x2-polypeptider kan være monomerer eller multimerer, glykosylerte eller ikke-glykosylerte, pegylerte eller ikke pegylerte, og de kan ha eller mangle en innledende metionin-aminosyrerest. Eksempler på BR43x2-polypeptider omfatter polypeptider med lengde fra 32-40 aminosyrerester, med en aminosyresekvens som er tilpasset motivet: XXCX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2} C[IMLV]XCX{3}CX{6-8}CX{2}[YF]CXX (SEKV.ID NR: 10) og de begrensninger som er beskrevet heri.
BR43x2-polypeptider kan syntetiseres ved utelukkende fast fase-syntese, fremgangsmåter for delvis fast fase-syntese, fragmentkondensering eller klassisk syntese i løsning. Polypeptidene fremstilles fortrinnsvis ved fast fase-peptidsyntese, f.eks. som beskrevet av Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 55:2149,1963. Syntesen utføres med aminosyrer som er beskyttet i alfa-aminoenden. Trifunksjonelle aminosyrer med labile sidekjeder beskyttes også med egnede grupper for å forhindre uønskede kjemiske reaksjoner under oppbyggingen av polypeptidene. Den alfa-aminobeskyttende gruppe fjernes selektivt for å tillate påfølgende reaksjon i aminoenden. Betingelsene for fjerning av den alfa-aminobeskyttende gruppe fjerner ikke de sidekjedebeskyttende grupper.
De alfa-aminobeskyttende grupper er grupper som vites å være anvendbare innen området trinnvis polypeptidsyntese. Her omfattes beskyttelsesgrupper av acyltype (f.eks. formyl, trifluoracetyl, acetyl), beskyttelsesgrupper av aryltype (f.eks. biotinyl), aromatiske beskyttelsesgrupper av uretantype [f.eks. benzyloksykarbonyl (Cbz), substituert benzyloksykarbonyl og 9-fluorenylmetyloksykarbonyl (Fmoc)], alifatiske uretanbeskyttelsesgrupper [f.eks. t-butyloksykarbonyl (tBoc), isopropyloksykarbonyl, sykloheksyloksykarbonyl] og beskyttelsesgrupper av alkyltype (f.eks. benzyl, trifenyl-metyl). De foretrukne beskyttelsesgrupper er tBoc og Fmoc.
De valgte sidekjedebeskyttende grupper må forbli intakte under koblingen og ikke fjernes under avspaltingen av den aminoendebeskyttende gruppe eller under koblingsbetingelsene. De sidekjedebeskyttende grupper må også kunne fjernes etter avsluttet syntese under reaksjonsbetingelser som ikke vil endre det ferdige polypeptid. I tfioc-kjemi er de sidekjedebeskyttende grupper for trifunksjonelle aminosyrer hovedsakelig benzylbaserte. I Fmoc-kjemi er de hovedsakelig tert.-butyl- eller tritylbaserte.
I tBoc-kjemi er de foretrukne sidekjedebeskyttende grupper tosyl for arginin, sykloheksyl for asparaginsyre, 4-metylbenzyl (og acetamidometyl) for cystein, benzyl for glutaminsyre, serin og treonin, benzyloksymetyl (og dinitrofenyl) for histidin, 2-Cl-benzyloksykarbonyl for lysin, formyl for tryptofan og 2-brombenzyl for tyrosin. I Fmoc-kjemi er de foretrukne sidekjedebeskyttende grupper 2,2,5,7,8-pentametylkroman-6-sulfonyl (Pmc) og 2,2,4,6,7-pentametyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf) for arginin, trityl for asparagin, cystein, glutamin og histidin, tert.-butyl for asparaginsyre, glutaminsyre, serin, treonin og tyrosin, tBoc for lysin og tryptofan.
For syntese av fosfopeptider anvendes enten direkte innføring av fosfatgruppen eller innføring etter oppbyggingen. I strategien for direkte inkorporering kan fosfatgruppen på serin, treonin eller tyrosin beskyttes med metyl, benzyl eller tert.-butyl i Fmoc-kjemi eller med metyl, benzyl eller fenyl i tBoc-kjemi. Direkte innføring av fosfotyrosin uten fosfatbeskyttelse kan også anvendes i Fmoc-kjemi. I strategien for innføring etter oppbygging derivatiseres de ubeskyttede hydroksylgrupper i serin, treonin eller tyrosin i fast fase med di-tert.-butyl-, dibenzyl- eller dimetyl-N,N'-diisopropyl-fosforamiditt og oksideres så med tert.-butylhydroperoksid.
Fast fase-syntese utføres vanligvis fra karboksylenden ved kobling av den alfa-aminobeskyttede (sidekjedebeskyttede) aminosyre til et egnet fast støttemiddel. En esterbinding dannes dersom tilkoblingen utføres til et klormetyl-, klortrityl- eller hydroksymetylresin, og det resulterende polypeptid vil ha en fri karboksylgruppe i C-enden. Alternativt dannes en amidbinding dersom det benyttes et amidresin som benzhydrylamin- eller p-metylbenzhydrylaminresin (for tBoc-kjemi) og Rink-amid- eller PAL-resin (for Fmoc-kjemi), og det resulterende polypeptid vil ha en karboksamidgruppe i C-enden. Disse resiner, enten polystyren- eller polyamidbaserte eller polyetylenglykol-tilkoblede, med eller uten "håndtak" eller linker, med eller uten den første aminosyre tilkoblet, er kommersielt tilgjengelige, og fremstilling av disse er blitt beskrevet av Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2. utgave), (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984) og Bayer og Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986, og Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989.
Den C-terminale aminosyre, om nødvendig beskyttet i sidekjeden og i alfa-aminogruppen, kobles til et hydroksymetylresin ved anvendelse av forskjellige aktiveringsmidler, innbefattet disykloheksylkarbodiimid (DCC), N,N'-diisopropyl-karbodiimid (DIPCDI) og karbonyldiimidazol (CDI). Den kan kobles til klormetyl- eller klortritylresin direkte i form av cesiumtetrametylammoniumsaltet, eller i nærvær av trietylamin (TEA) eller diisopropyletylamin (DIEA). Tilkobling av den første aminosyre til et amidresin skjer på samme måte som amidbindingsdannelsen under koblings-reaksj onene.
Etter tilkobling til resinstøttemidlet fjernes den alfa-aminobeskyttende gruppe ved anvendelse av forskjellige reagenser avhengig av den benyttede beskyttelses-kjemi (f.eks. tBoc, Fmoc). Graden av fjerning av Fmoc kan måles ved 300-320 nm eller med en konduktivitetscelle. Etter fjerning av den alfa-aminobeskyttende gruppe tilkobles de gjenværende beskyttede aminosyrer trinnvis i den nødvendige rekkefølge for å oppnå den ønskede sekvens.
Forskjellige aktiveringsmidler kan anvendes for koblingsreaksjonene, innbefattet DCC, DIPCDI, 2-klor-l,3-dimetylimidiumheksafluorfosfat (CIP), benzotriazol-l-yl-oksy-tris-(dimetylamino)-fosfoniumheksafluorfosfat (BOP) og dettes pyrrolidinanalog (PyBOP), brom-tris-pyrrolidinofosfoniumheksafluorfosfat (PyBrOP), 0-(benzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetrametyluroniumheksafluorfosfat (HBTU) og dettes tetrafluorboratanalog (TBTU) eller pyrrolidinanalog (HBPyU), 0-(7-azabenzotriazol-l-yl)-l,l,3,3-tetrametyluroniumheksafluorfosfat (HATU) og dettes tetrafluorboratanalog (TATU) eller pyrrolidinanalog (HAPyU). De vanligste katalytiske tilsetningsstoffer som anvendes i koblingsreaksjonene, omfatter 4-dimetylaminopyridin (DMAP), 3-hydroksy-3,4-dihydro-4-okso-l,2,3-benzotriazin (HODhbt), N-hydroksybenzotriazol (HOBt) og 1-hydroksy-7-azabenzotriazol (HOAt). Hver av de beskyttede aminosyrene anvendes i overskudd (>2,0 ekvivalenter), og koblingene utføres vanligvis i N-metylpyrrolidon (NMP) eller i DMF, CH2C12eller blandinger av disse. Koblingsreaksjonens effektivitet kan måles i hvert trinn, f.eks. ved ninhydrinreaksjonen som beskrevet av Kaiser et al., Anal. Biochem. 34:595, 1970.
Etter fullført oppbygging av det ønskede peptid kløyves bindingen mellom peptid og resin med et reagens sammen med egnede renoveringsmidler. Fmoc-peptidene frakløyves og avbeskyttes vanligvis med TFA og renoveringsmidler (f.eks. H20, etanditiol, fenol og tioanisol). tBoc-peptidene avkløyves og avbeskyttes vanligvis med flytende HF i 1-2 timer ved -5 til 0 °C, noe som kløyver polypeptidet fra resinet og fjerner de fleste av de sidekjedebeskyttende grupper. Renoveringsmidler som anisol, dimetyl-sulfid og p-tiokresol anvendes vanligvis med flytende HF for å forhindre at kationer som dannes under kløyvingen, alkylerer og acylerer aminosyrerestene som foreligger i polypeptidet. Formylgruppen på tryptofan og dinitrofenylgruppen på histidin må fjernes med piperidin, hhv. tiofenyl i DMF før HF-kløyvingen. Acetamidometylgruppen på cystein kan fjernes med kvikksølv(II)acetat eller alternativt med jod, thallium(III)trifluor-acetat eller sølv-tetrafluorborat som samtidig oksiderer cystein til cystin. Andre kraftige syrer som benyttes for tBoc-peptidkløyving og -avbeskyttelse, omfatter trifluormetan-sulfonsyre (TFMSA) og trimetylsilyltrifluoracetat (TMSOTf).
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en rekke andre polypeptidfusjoner og beslektede multimere proteiner som omfatter én eller flere polypeptid fusjoner. Et løselig BR43x2-, TACI eller BCMA-polypeptid kan uttrykkes som en fusjon med et konstant område fra en immunglobulintungkjede, typisk et Fc-fragment, som inneholder to konstante områdedomener og mangler det variable område. Fremgangsmåter for fremstilling av slike fusjoner beskrives i US patentskrifter nr. 5 155 027 og 5 567 584. Slike fusjoner utskilles typisk som multimere proteiner hvori Fc-delene er bundet til hverandre via disulfidbindinger og to ikke-Ig-polypeptider er plassert nær hverandre. Immunglobulin-BR43x2 (TACI eller BCMA)-polypeptidfusjoner kan uttrykkes i genetisk modifiserte celler for fremstilling av en rekke multimere BR43x2-analoger. Ytterligere domener kan fusjoneres til BR43x2 (TACI eller BCMA)-polypeptider for å styre dem til spesifikke celler, vev eller makromolekyler. Fusjoner kan også fremstilles ved anvendelse av toksiner som diskutert heri. På denne måte kan polypeptider og proteiner målstyres for terapeutiske eller diagnostiske formål. Et BR43x2-polypeptid kan fusjoneres til to eller flere grupper, f.eks. en affinitetsmerkelapp for rensing og et målstyrende domene. Polypeptidfusjoner kan også omfatte ett eller flere kløyvingsseter, særlig mellom domener. Se Tuan et al., Connect. Tiss. Res. 54:1-9,1996. Fusjoner av denne type kan f.eks. også anvendes for affinitetsrensing av den tilhørende ligand fra en løsning, som et in vz/ro-analyseverktøy, for blokkering av signaler in vitro ved spesifikk uttitrering av ligand, for binding av ligand til celleoverflaten, eller som BR43x2-antagonister in vivo ved tilførsel av disse for blokkering av ligandstimuleringen. For anvendelse i analyser kan fusjonsproteinene være bundet til et støttemiddel via Fc-området og anvendes i ELISA-format.
Oppfinnelsen tilveiebringer også løselige BR43x2-reseptorer og polypeptidfragmenter anvendt for dannelse av fusjonsproteiner med affinitetsmerkelapper eller andre former for merking. Løselige BR43x2-affinitetsmerkelapp-fusjonsproteiner anvendes f.eks. for identifisering av BR43x2-ligandene, så vel som agonister og antagonister av den naturlige ligand. Ved anvendelse av merket, løselig BR43x2 identifiseres celler som uttrykker liganden, agonistene eller antagonistene ved fluorescensimmuncytometri eller immunhistokjemi. De løselige fusjonsproteinene er anvendbare for å undersøke fordelingen av liganden i vev eller spesifikke cellefamilier, og for å få innsyn i reseptor/ligandbiologien.
For rensing av ligand, agonister eller antagonister tilsettes et BR43x2-Ig-fusjonsprotein til en prøve som inneholder liganden, agonisten eller antagonisten under betingelser som fremmer reseptor-ligandbinding (typisk nær fysiologisk temperatur, pH og ionestyrke). Reseptor-ligandkomplekset separeres så fra blandingen ved anvendelse av protein A immobilisert til et fast støttemiddel (f.eks. uløselige resinkuler). Liganden, agonisten eller antagonisten elueres så ved anvendelse av konvensjonelle kjemiske teknikker, f.eks. med et salt eller en pH-gradient. Alternativt kan fusjonsproteinet selv bindes til et fast støttemiddel hvor binding og eluering utføres som ovenfor. Fremgangsmåter for immobilisering av reseptorpolypeptid til et fast støttemiddel, f.eks. kuler av agarose, kryssbundet agarose, glass, celluloseresiner, kiselgelbaserte resiner, polystyren, kryssbundet polyakrylamid eller lignende materialer som er stabile under anvendelses-betingelsene, er kjent innen faget. Fremgangsmåter for kobling av polypeptider til faste støttemidler er kjent innen faget og omfatter aminkjemi, cyanogenbromidaktivering, N-hydroksysuccinimidaktivering, epoksidaktivering, sulfhydrylaktivering og hydrazidaktivering. Det resulterende medium vil generelt foreligge som en kolonne, og væsker som inneholder ligand, får passere gjennom kolonnen én eller flere ganger slik at liganden kan bindes til reseptorpolypeptidet. Liganden elueres så ved å endre saltkonsentrasjonen eller ved anvendelse av kaotrope midler (MnC^), eller pH for å bryte ligand-reseptorbindingen.
For å styre eksporten av den løselige reseptor fra vertscellen er DNA for den løselige reseptor koblet til et annet DNA-segment som koder for et sekretorisk peptid, f.eks. et t-PA-sekretorisk peptid. For å lette rensing av det utskilte reseptordomene kan en N- eller C-terminal forlengelse, f.eks. en affinitetsmerkelapp eller et annet polypeptid eller protein for hvilket et antistoff eller et annet spesifikt bindingsmiddel er tilgjengelig, fusjoneres til reseptorpolypeptidet.
Celler som uttrykker funksjonelle løselige og membranbundne reseptorer ifølge foreliggende oppfinnelse, anvendes i gjennomsøkingsanalyser. En rekke egnede analysefremgangsmåter er kjent innen faget. Disse analysene er basert på påvisning av en biologisk respons i en målcelle. En endring i metabolisme sammenlignet med en kontrollverdi viser en analyseforbindelse som modulerer den BR43x2-formidlede metabolisme. Én slik analyse er en celleproliferasjonsanalyse. Celler dyrkes i nærvær eller fravær av en analyseforbindelse, og celleproliferasjonen påvises ved f.eks. måling av inkorporert, tritiert tymidin eller ved en kolorimetrisk analyse basert på metabolsk nedbrytning av 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT)
(Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55-63,1983). Et alternativt analyseformat anvender celler som er videre modifisert slik at de uttrykker et rapportørgen. Rapportørgenet er koblet til et promoterelement som responderer på den reseptorkoblede reaksjonsvei, og analysen påviser aktivering av transkripsjon av rapportørgenet. En rekke rapportørgener som lett kan analyseres i celleekstrakter, er kjent innen faget, f.eks. E. coli lacZ, kloramfenikolacetyltransferase (CAT) og serumresponselement (SRE) (se f.eks. Shaw et al., Cell 56:563-72, 1989). Et foretrukket rapportørgen av denne type er et luciferasegen (de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725,1987). Ekspresjon av luciferasegenet påvises ved luminescens og anvendelse av fremgangsmåter som er kjent innen faget (se f.eks. Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269:29094-101,1994, Schenborn og Goiffin, Promega Notes 47:11, 1993). Analysesett for luciferaseaktivitet er kommersielt tilgjengelige fra f.eks. Promega Corp., Madison, WI. Målcellelinjer av denne type kan anvendes for gjennomsøking av biblioteker over kjemikalier, cellekondisjonerte dyrkningsmedier, soppdyrkningsmedier, jordprøver, vannprøver og lignende. For eksempel kan en samling
av prøver på cellekondisjonert medium analyseres med en målcelle for identifisering av celler som produserer ligand. Positive celler anvendes så for fremstilling av et cDNA-bibliotek i en pattedyrekspresjonsvektor, og biblioteket oppdeles i porsjoner, transfekteres inn i vertsceller og uttrykkes. Dyrkningsmediumprøver fra de transfekterte cellene analyseres så, og porsjonene oppdeles så videre, celler transfekteres på ny og dyrkes, og positive celler analyseres for isolering av et klonet cDNA som koder for liganden.
Et analysesystem som anvender en ligandbindende reseptor (eller et antistoff, et medlem av et komplement/antikomplementpar) eller et bindende fragment av denne og et kommersielt tilgjengelig biosensorinstrument ("BIAcore", Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) kan også med fordel anvendes. Reseptoren, antistoffet, medlemmet av komplement/antikomplementparet eller fragmentet immobiliseres til overflaten av en reseptorbrikke. Anvendelse av dette instrument beskrives av Karlsson, J. Immunol. Meth. 745:229-40,1991 og Cunningham og Wells, J. Mol. Biol. 234:554-63, 1993. For eksempel kobles et BR43x2-polypeptid, et fragment, et antistoff eller et medlem av et komplement/antikomplementpar kovalent til dekstranfibre koblet til et gullsjikt i gjennomstrømningscellen ved anvendelse av amin- eller sulfhydrylkjemi. En analyseprøve får passere gjennom cellen. Dersom en ligand, en epitop eller det andre medlem av komplement/antikomplementparet foreligger i prøven, vil dette bindes til den immobiliserte reseptor, antistoffet eller sin parmotpart slik at mediets refraksjonsindeks endres, noe som påvises som en endret overflateplasmonresonans i gullsjiktet. Dette system tillater bestemmelse av på- og av-hastigheter, fra hvilke bindingsaffiniteten kan beregnes, og anslag av bindingsstøkiometrien. Ligandbindende reseptorpolypeptider kan også anvendes i andre analysesystemer som er kjent innen faget. Slike systemer omfatter Scatchard-analyse for bestemmelse av bindingsaffinitet (se Scatchard, Ann. NY Acad. Sei. 57:660-72,1949) og kalorimetriske analyser (Cunningham et al., Science 253:545-48, 1991, Cunningham et al., Science 245:821-25,1991).
Scatchard-plotanalyse for løselig I<125->ztnf4-binding til TACI og BCMA vises i figur 2 og sammenlignes med bindingskonstantene for andre medlemmer av TNFR-familien i tabell 7.
Som for andre reseptorer kan aktiveringen av BR43x2-polypeptid måles i et kiselgelbasert biosensormikrofysiometer som måler den ekstracellulære surgjørings-hastighet eller protonutskillelsen forbundet med reseptorbinding og påfølgende fysio-logiske, cellulære responser. Et eksempel på en slik innretning er "Cytosensor"-mikrofysiometeret fremstilt av Molecular Devices, Sunnyvale, CA. En rekke cellulære responser, f.eks. celleproliferasjon, ionetransport, energiproduksjon, en inflammatorisk respons, regulatorisk aktivering, reseptoraktivering og lignende, kan måles ved denne fremgangsmåten. Se f.eks. McConnell et al., Science 257:1906-12, 1992, Pitchford et al., Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997, Arimilli et al., J. Immunol. Meth. 272:49-59, 1998, Van Liefde et al., Eur. J. Pharmacol. 546:87-95, 1998. Mikrofysiometeret kan anvendes for analyse av adherente eller ikke-adherente, eukaryote eller prokaryote celler. Ved å måle ekstracellulære surhetsendringer i celledyrkningsmediet over tid måler mikrofysiometeret direkte cellulære responser på forskjellige stimuli, innbefattet agonister, ligander eller antagonister av BR43x2-polypeptidet. Mikrofysiometeret anvendes fortrinnsvis for måling av responser fra en BR43x2-uttrykkende eukaryot celle, sammenlignet med en eukaryot kontrollcelle som ikke uttrykker BR43x2-polypeptid. BR43x2-uttrykkende eukaryote celler omfatter celler som er transfektert med BR43x2 som beskrevet heri, noe som gir en celle som responderer på BR43x2-modulerende stimuli, eller celler som naturlig uttrykker BR43x2, f.eks. BR43x2-uttrykkende celler avledet fra miltvev. Forskjeller, målt som endret ekstracellulær surgjøring, f.eks. forhøyet eller redusert respons av celler som uttrykker BR43x2 relativt til en kontrollcelle, er et direkte mål på BR43x2-modulerte, cellulære responser. Videre kan slike BR43x2-modulerte responser analyseres under en rekke forskjellige stimuli. Ved anvendelse av mikrofysiometeret tilveiebringes videre en fremgangsmåte for identifisering av agonister og antagonister av BR43x2-polypeptid som omfatter tilveiebringelse av celler som uttrykker et BR43x2-polypeptid, dyrking av en første del av cellene i fravær av en analyseforbindelse, dyrking av en annen celleporsjon i nærvær av en analyseforbindelse og påvisning av en endring, f.eks. en økning eller en reduksjon, i en cellulær respons i den andre celleporsjon, sammenlignet med den første celleporsjon. Endringen i cellulær respons vises som en målbar endring av den ekstracellulære surgjøringshastighet. Antagonister og agonister mot BR43x2-polypeptidet kan lett identifiseres ved anvendelse av denne fremgangsmåte.
Det løselige BR43x2 er anvendbart for å undersøke fordelingen av ligander i vev og spesifikke cellefamilier og for å gi innsyn i reseptor/ligandbiologien. Man kan også utnytte TNF-reseptorenes spesifisitet for sine ligander som en mekanisme for å ødelegge ligandbærende målceller. For eksempel kan toksiske forbindelser kobles til løselig BR43x2-reseptor eller et BR43x2-fusjonsprotein. Eksempler på toksiske forbindelser kan omfatte radioaktive farmasøytiske forbindelser som inaktiverer målceller, kjemoterapeutiske midler som doksorubicin, daunorubicin, metotreksat og cytoksan, toksiner som ricin, difteritoksin, Pseudomonas eksotoksin A og abrin, og antistoffer mot overflatemolekyler på cytotoksiske T-celler.
Ztnf4 (5 ng/ml) ble funnet å bindes til BR43x2 (SEKV.ID NR: 2), TACI (SEKV.ID NR: 6), BCMA (SEKV.ID NR: 8) og BR43xl (SEKV.ID NR: 9) ved FACS-analyse (Flow Cytometry and Sorting, Melamed et al., red., Wiley-Liss, 1990 og Immunofluorescence and Cell Sorting, Current Protocols in Immunology, bind 1, Coligan et al., red., John Wiley & Son, 1997). FITC-merket, løselig ztnf4 ble også vist å bindes spesifikt til blant annet B-lymfocytter i PBMNC, tonsillceller, B-celle-lymfomcellelinjer (Raji, Burkitts humane lymfom, ATCC CCL86), Ramos (Burkitts lymfomcellelinje, ATCC CRL-1596), Daudi (Burkitts humane lymfom, ATCC CCL213) og RPMI 1788 (en B-lymfocyttcellelinje, ATCC CCL-156) ved anvendelse av FACS-analyse. Ingen binding ble observert med HL-60 (ATCC, en promyelocyttisk cellelinje, ATCC CCL-240). Bindingsspesifisitet for B-celler fra PBMNC og tonsillceller ble bekreftet ved samtidig farging med antistoffer mot B-cellespesifikke molekyler, innbefattet CD 19, IgD, IgM og CD20. Likheten mellom ztnf4 og CD40L tydet på en bredere vevsfordeling enn den som ble observert. Affiniteten av ztnf4 ble analysert på monocytter, dendrittceller og rensede T-celler ved anvendelse av f.eks. analyser for cytokinproliferasjon og T-celleproliferasjon, men binding av ztnf4 eller en annen biologisk virkning kunne ikke påvises for noen andre analyserte celletyper. Liganden og reseptorens spesifisitet for B-celler tyder følgelig på at de er anvendbare for undersøkelser og behandling av autoimmunitet, B-cellecancere, immunmodulering, IBD og alle antistofformidlede sykdomstilstander, f.eks. ITCP, myasthenia gravis og lignende, nyresykdommer, indirekte T-celleimmunrespons, transplantatrejeksjon og "graft versus host"-sykdom.
Ztnf4 er blitt påvist å aktivere B-celler og gi B-celleproliferasjon, antistoffproduksjon og oppregulering av aktiveringsmarkører in vitro (se eksemplene nedenfor). Disse virkningene kan kreve kostimulering via IL-4 eller andre cytokiner eller stimulering via B-celleantigenreseptoren eller andre celleoverflatereseptorer som aktiverer B-celler, dvs. CD40. Andre tumornekrosefaktorligander som gp39 og TNFp\ stimulerer også B-celleproliferasjonen. Således kan polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for spesifikk regulering av B-celleresponser, inhibering av aktiverte B-celler under immunresponsen uten å påvirke andre cellepopulasjoner, noe som er fordelaktig ved behandling av sykdom. I tillegg kan polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for modulering av B-celleutviklingen, utviklingen av andre celler, antistoffproduksjonen og cytokinproduksjonen. BR43x2-polypeptider kan også finne anvendelse for induksjon av apoptose og/eller anergi blant celler. Polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan også modulere T- og B-cellekommunikasjonen ved å nøytralisere de proliferative virkninger av ztnf4. Bioanalyser og ELISA-analyser er tilgjengelige for måling av den cellulære respons på ztnf4 i nærvær av løselig BR43x2, TACI og/eller BCMA. Andre analyser omfatter analyser som måler endringer i cytokinproduksjonen som mål på cellulær respons (se f.eks. Current Protocols in Immunology, red. John E. Coligan et al., NIH, 1996). Analyser for måling av andre cellulære responser omfatter analyse av antistofifsotype, monocyttaktivering, NK-celledannelse, funksjonen av antigenpresenterende celler og apoptose.
BR43x2-polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse vil være anvendbare for nøytralisering av virkningene av ztnf4 for behandling av pre-B- eller B-celle-leukemier, f.eks. plasmacelleleukemi, kronisk eller akutt, lymfocyttisk leukemi, myelomer som multippelmyelom, plasmacellemyelom, endotelmyelom og mega-karyocyttmyelom, og lymfomer som ikke-Hodgkins lymfom, som alle er forbundet med en økt konsentrasjon av ztnf4-polypeptider. Løselig BR43x2 vil være en anvendbar bestanddel i et behandlingsskjema for inhibering av tumorprogresjon og -overlevelse.
Northern-blot-analyse viste at ztnf4 uttrykkes i CD8<+->celler, monocytter, dendrocytter og aktiverte monocytter. Dette tyder på at cytotoksiske T-celler i noen autoimmune forstyrrelser kan stimulere B-celleproduksjonen ved overdreven produksjon av ztnf4. Immunsupprimerende proteiner som selektivt blokkerer virkningen av B-lymfocytter, vil være anvendbare for behandling av sykdom. Autoantistoffproduksjon er felles for flere autoimmune sykdommer og bidrar til vevsdestruksjon og utvikling av sykdom. Autoantistoffer kan også føre til forekomst av komplikasjoner forbundet med immunkompleksdeponering og føre til mange symptomer forbundet med systemisk lupus erythomatosis, innbefattet nyresvikt, neuralgiske symptomer og død. Modulering av antistoffproduksjonen uavhengig av den cellulære respons vil også være fordelaktig i mange sykdomstilstander. B-celler er også blitt vist å spille en rolle i utskillelsen av artritogene immunglobuliner ved reumatoid artritt, (Korganow et al., Immunity 70:451-61,1999). I seg selv vil inhibering av ztnf4-antistoffproduksjonen være fordelaktig ved behandling av autoimmune sykdommer som myasthenia gravis og reumatoid artritt. Immunsupprimerende, terapeutiske midler som løselig BR43x2, som selektivt blokkerer eller nøytraliserer virkningen av B-lymfocytter, vil være anvendbare for slike formål. For å bekrefte disse evnene til løselige BR43x2-reseptorpolypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse analyseres slike BR43x2-polypeptider ved anvendelse av analysefremgangsmåter som er kjent innen faget og beskrives heri.
Oppfinnelsen tilveiebringer fremgangsmåter som anvender BR43x2-, TACI-eller BCMA-polypeptider, fusjonsproteiner, antistoffer, agonister eller antagonister for selektiv blokkering eller nøytralisering av virkningene av B-celler forbundet med nyresykdommer i siste stadium, som enten er eller ikke er forbundet med autoimmune sykdommer. Slike fremgangsmåter vil også være anvendbare for behandling av immunologiske nyresykdommer. Slike fremgangsmåter vil være anvendbare for behandling av glomerulonefritt forbundet med sykdommer som membranøs nefropati, IgA-nefropati eller Bergs sykdom, IgM-nefropati, Goodpastures sykdom, postinfeksiøs glomerulonefritt, mesangioproliferativ sykdom og "minimal-change" nefrotisk syndrom. Slike fremgangsmåter kan også fungere som terapeutiske anvendelser for behandling av sekundær glomerulonefritt eller vaskulitt forbundet med sykdommer som lupus, polyarteritt, Henoch-Schonlein, skleroderm, HIV-forbundne sykdommer, amyloidose eller hemolytisk, uremisk syndrom. Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse vil også være anvendbare som deler av en terapeutisk anvendelse for behandling av interstitiell nefritt eller pyelonefritt forbundet med kronisk pyelonefritt, misbruk av analgetiske midler, nefrokalsinose, nefropati forårsaket av andre midler, nefrolithiasis eller kronisk eller akutt interstitiell nefritt.
Fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptider, fusjonsproteiner, antistoffer, agonister eller antagonister ved behandling av hypertensive sykdommer eller sykdommer i store kar, innbefattet nyrearteriestenose eller -okklusjon og kolesterolemboli eller nyreemboli.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også fremgangsmåter for diagnose og behandling av nyreneoplasma eller urologisk neoplasma, multiple myelomer, lymfomer, lettkjedeneuropati eller amyloidose.
Oppfinnelsen tilveiebringer også fremgangsmåter for blokkering eller inhibering av aktiverte B-celler ved anvendelse av BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptider, fusjonsproteiner, antistoffer, agonister eller antagonister for behandling av astma og andre kroniske luftveissykdommer, f.eks. bronkitt og emfysem.
Videre tilveiebringes fremgangsmåter for inhibering eller nøytralisering av en effektor-T-cellerespons ved anvendelse av BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptider, fusjonsproteiner, antistoffer, agonister eller antagonister for anvendelse ved immunsuppresjon, særlig for terapeutisk anvendelse ved "graft versus host"-sykdom og transplantatrejeksjon. Ytterligere anvendelse kan finnes for regulering av immunresponsen, særlig aktivering og regulering av lymfocytter. BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptider, fusjonsproteiner, antistoffer, agonister eller antagonister vil være anvendbare i behandlingsformer for behandling av immundefisiens. BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptider, fusjonsproteiner, antistoffer, agonister eller antagonister vil være anvendbare i terapeutiske fremgangsmåter for behandling av autoimmune sykdommer som insulinavhengig diabetes mellitus (IDDM) og Crohns sykdom. Fremgangsmåter ifølge foreliggende oppfinnelse vil ha ytterligere terapeutisk verdi for behandling av kroniske, inflammatoriske sykdommer, særlig for å redusere leddsmerter, hevelser, anemi og andre tilhørende symptomer, så vel som for behandling av septisk sjokk.
Virkningen av løselige BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptider og fusjonsproteiner på immunrespons kan måles ved å tilføre polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse til dyr immunisert med antigen, fulgt av injeksjon av ztnf4 og måling av antistoffisotypeproduksjonen og B- og T-celleresponsene, innbefattet hypersensitivitet av forsinket type og in vitro proliferasjon og cytokinproduksjon ifølge fremgangsmåter som er kjent innen faget.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte for inhibering av ztnf4-aktivitet i et pattedyr som omfatter tilførsel til pattedyret av en mengde av en forbindelse utvalgt fra gruppen som består av: a) et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 4, b) et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 8, c) et fusjonsprotein, d) et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 6 fra aminosyrerest 1 til aminosyrerest 166, e) et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 8 fra aminosyrerest 1 til aminosyrerest 150, f) et antistoff eller antistoffragment som spesifikt bindes til et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 4, og g) et antistoff eller antistoffragment som spesifikt bindes til et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 10. Eksempler på fusjonsproteiner omfatter fusjoner mellom løselig BR43x2 (SEKV.ID NR: 4), TACI (fra aminosyrerest 1 til aminosyrerest 166 i SEKV.ID NR: 6) eller BCMA (fra aminosyrerest 1 til aminosyrerest 150 i SEKV.ID NR: 8) og et annet polypeptid, fortrinnsvis et konstant område fra et immunglobulintungkjede Fc- fragment. Oppfinnelsen tilveiebringer på tilsvarende vis en fremgangsmåte for inhibering av BR43x2-, TACI- eller BCMA-reseptor-ligandinteraksjoner.
Slike fremgangsmåter vil være spesielt anvendbare i tilfeller hvor ztnf4-aktivitet er forbundet med aktiverte B-lymfocytter og for behandling av pre-B-celle- eller B-cellecancere. Slike fremgangsmåter vil også være anvendbare dersom ztnf4-aktivitet er forbundet med antistoffproduksjon, særlig antistoffproduksjon forbundet med autoimmune sykdommer som systemisk lupus erythomatosis, myasthenia gravis eller reumatoid artritt.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også BR43x2-agonister og -antagonister. Forbindelser som er identifisert som BR43x2-agonister, er anvendbare for å modifisere proliferasjon og utvikling av målceller in vitro og in vivo. Agonistforbindelser er f.eks. anvendbare alene eller i kombinasjon med andre cytokiner og hormoner som bestanddeler av definerte celledyrkningsmedier. Agonister er således anvendbare for spesifikk formidling av vekst og/eller utvikling av BR43x2-bærende B-lymfocyttceller i kultur. Agonister og antagonister kan også vise seg anvendbare ved undersøkelser av B-lymfocytters effektorfunksjoner, særlig aktivering og differensiering av B-lymfocytter. Antagonister er anvendbare som forskningsreagenser for karakterisering av ligand-reseptorinteraksjon.
Forbindelser identifisert som BR43x2-antagonister, er også anvendbare for å forsterke den humorale immunrespons. B-celleresponser er viktige for bekjempelse av infeksiøse sykdommer, innbefattet bakterieinfeksjoner, virusinfeksjoner, protozo-infeksjoner og parasittinfeksjoner. Antistoffer mot infeksiøse mikroorganismer kan immobilisere den patogene organisme ved å bindes til antigen, fulgt av komplement-formidlet lysering eller celleformidlet angrep. En BR43x2-antagonist kunne bidra til å forsterke den humorale respons og ville være et anvendbart terapeutisk middel for individer utsatt for en infeksiøs sykdom eller som tillegg til vaksinasjon.
Oppfinnelsen tilveiebringer også antagonister som enten bindes til BR43x2-polypeptider eller, alternativt, til en ligand som BR43x2-polypeptider bindes til, hvorved funksjonen av BR43x2 inhiberes eller elimineres. Slike BR43x2-antagonister vil omfatte antistoffer, oligonukleotider som bindes enten til BR43x2-polypeptidet eller dets ligand, naturlige eller syntetiske analoger av BR43x2-ligander som opprettholder evnen til å bindes til reseptoren, men som ikke fører til verken ligand- eller reseptorsignalisering. Slike analoger kunne være peptider eller peptidlignende forbindelser. Naturlige eller syntetiske små molekyler som bindes til BR43x2-polypeptider og forhindrer signalisering, omfattes også som antagonister. Som sådanne ville BR43x2-antagonister være anvendbare som terapeutiske midler for behandling av visse forstyrrelser hvor blokkering av signalet fra enten en BR43x2-reseptor eller en BR43x2-ligand ville være gunstig. Antagonister er anvendbare som forskningsreagenser for karakterisering av ligand-reseptorinteraksjon. BR43x2 uttrykkes på transformerte B-cellelinjer, innbefattet EBV-indusert og spontan Burkitts lymfom og flere B-cellemyelomer. Inhibering av funksjonen av BR43x2 ville være nyttig ved behandling av B-cellelymfomer eller multiple myelomer. BR43x2-antagonister, f.eks. løselige BR43x2-reseptorer eller antistoffer, kunne anvendes terapeutisk for å formidle tumorprogresjon.
Aktiviteten av agonister og antagonister kan bestemmes ved aktivitets-analyser som bestemmer styrken på reseptor-ligandinteraksjonen. Stabilt transfekterte B-cellelinjer, f.eks. Baf3 (en pre-B-cellelinje fra mus, Palacios og Steinmetz, ibid. og Mathey-Prevot et al., ibid.), som samtidig uttrykker høyt nivå av rapportørgen-konstruksjoner for NfKB, NFAT-1 og AP-1, og som uttrykker BR43x2, ble fremstilt. Cellelinjer som uttrykker TACI og BCMA, ble også fremstilt på tilsvarende måte og i Jurkat-celler og andre B-lymfomcellelinjer. Ztnf4 ble funnet å signalisere via rapportør-genene i disse konstruksjonene. Løselig BR43x2 og antistoffer kan anvendes for måling av binding.
En in v/vo-tilnærming for analyse av proteiner ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter virale tilførselssystemer. Eksempler på virus for dette formål omfatter adenovirus, herpesvirus, kukoppevirus og adenoassosiert virus (AAV). Adenovirus, et dobbelttrådet DNA-virus, er i dag den best undersøkte genoverførings-vektor for tilførsel av heterolog nukleinsyre (for en oversikt, se Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161-89, 1994, og Douglas og Curiel, Science & Medicine 4:44-53, 1997). Adenovirussystemet byr på flere fordeler: adenovirus kan (i) motta relativt store DNA-innskudd, (ii) dyrkes til høy titer, (iii) infisere et bredt utvalg av pattedyrcelletyper, og (iv) anvendes med et stort antall tilgjengelige vektorer som inneholder forskjellige promotere. Da adenovirus er stabilt i blodstrømmen, kan slike virus også tilføres ved intravenøs injeksjon.
Ved å delere deler av adenovirusgenomet kan større innskudd (opp til 7 kb) med heterologt DNA innføres. Disse innskudd kan innføres i virus-DNA ved direkte ligering eller ved homolog rekombinasjon med et kotransfektert plasmid. I et eksem-plarisk system er det essensielle El-genet blitt delert fra virusvektoren, og viruset vil ikke replikere med mindre El-genet tilveiebringes av vertscellen (et eksempel er den humane 293-cellelinje). Ved intravenøs tilførsel til intakte dyr styres adenovirus hovedsakelig til leveren. Dersom det adenovirale tilførselssystem har en El-gendelesjon, kan viruset ikke replikere i vertscellene. Vertens vev (f.eks. leveren) vil imidlertid uttrykke og prosessere (og, dersom en signalsekvens foreligger, utskille) det heterologe protein. Utskilte proteiner vil gå inn i sirkulasjonssystemet i den svært vaskulariserte lever, og virkningene på det infiserte dyr kan bestemmes.
Adenovirussystemet kan også anvendes for proteinproduksjon in vitro. Ved dyrkning av adenovirusinfiserte ikke-293-celler under betingelser hvor cellene ikke deler seg hurtig, kan cellene produsere proteiner over et lengre tidsrom. BHK-celler dyrkes f.eks. til konfluens i cellefabrikker og behandles så med adenovirusvektoren som koder for det utskilte protein av interesse. Cellene dyrkes så under serumfrie betingelser, noe som tillater overlevelse av infiserte celler i flere uker uten vesentlig celledeling. Alternativt kan adenovirusvektorinfiserte 293S-celler dyrkes i suspensjonskultur ved relativt høy celletetthet for produksjon av signifikante proteinmengder (se Garner et al., Cytotechnol. 75:145-55, 1994). For begge fremgangsmåter kan et uttrykt, utskilt, heterologt protein gjentatte ganger isoleres fra celledyrkningssupernatanten. I produksjonsrfemgangsmåten med infiserte 293S-celler kan ikke-utskilte proteiner også effektivt erholdes.
Veletablerte dyremodeller er tilgjengelige for analyse av in vivo-effektiviteten av løselige BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse i visse sykdomstilstander. Nærmere bestemt kan løselige BR43x2-, TACI-eller BCMA-polypeptider og polypeptidrfagmenter analyseres in vivo i en rekke dyremodeller for autoimmun sykdom, f.eks. de kongeniske musestammene MRL-lpr/lpr eller NZB x NZW Fl, som fungerer som modell for SLE (systemisk lupus erythematosus). Slike dyremodeller er kjent innen faget, se f.eks. Autoimmune Disease Models A Guidebook, Cohen og Miller, red., Academic Press. Avkom fra en krysning mellom New Zealand Black (NZB)- og New Zealand White (NZW)-mus utvikler en spontan form for SLE som viser stor likhet med SLE i mennesker. Avkommet, som betegnes NZB W, begynner å utvikle IgM-autoantistoffer mot T-celler ved en alder på 1 måned, og ved 5-7 måneders alder er Ig-anti-DNA-autoantistoffer det dominerende immunglobulin. Polyklonal B-cellehyperaktivitet fører til overproduksjon av autoantistoffer. Deponering av disse autoantistoffene, særlig antistoffer rettet mot enkelttrådet DNA, er forbundet med utvikling av glomerulonefritt, som manifesteres klinisk som proteinuri, azotemi og død grunnet nyresvikt. Nyresvikt er den viktigste dødsårsak for mus som lider av spontan SLE, og i NZBW-stammen er denne prosess kronisk og dødelig. Sykdommen er hurtigere og mer alvorlig hos hunner enn hos hanner, noe som betyr overlevelse i kun 245 dager, sammenlignet med 406 dager for hanndyrene. Selv om mange hunnmus vil være symptomatiske (proteinuri) ved en alder på 7-9 måneder, kan noen være mye yngre eller eldre ved utvikling av symptomer. Den dødelige immunnefritt som observeres hos NZBW-mus, ligner mye på den glomerulonefritt som observeres ved human SLE, noe som gjør denne spontane musemodell svært attraktiv for analyse av mulige terapeutiske midler mot SLE (Putterman og Naparstek, Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus, Autoimmune Disease Models: A Guidebook, kap. 14, s. 217-34, 1994, Mohan et al., J. Immunol. 754:1470-80, 1995, og Daikh et al., J. Immunol. 759:3104-08, 1997). Tilførsel av løselig TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig eller andre løselige proteiner og fusjonsproteiner til disse mus for evaluering av virkningen av TACI, BR43x2 eller BCMA når det gjelder lindring av symptomer og endringer i sykdoms-forløpet, beskrives nedenfor i eksempelseksjonen.
Musemodeller for eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE) er blitt anvendt som redskap for undersøkelse av både mekanismene for immunformidlet sykdom og fremgangsmåter for mulig terapeutisk inngripen. Modellen ligner human multippel sklerose og gir demyelinering som følge av T-celleaktivering mot neuroproteiner som myelint basisk protein (MBP) eller proteolipidprotein (PLP). Inokulering med antigen fører til induksjon av CD4<+>, klasse II MHC-begrensede T-celler (Thl). Endringer i fremgangsmåten for EAE kan gi akutte, kronisk tilbakevendende eller passive over-føringsvarianter i modellen (Weinberg et al., J. Immunol. 762:1818-26,1999, Mijaba et al., Cell. Immunol. 756:94-102, 1999, og Glabinski, Meth. Enzym. 255:182-90, 1997). Tilførsel av løselig TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig eller andre løselige proteiner og fusjonsproteiner til disse mus for evaluering av virkningen av TACI, BR43x2 eller BCMA for lindring av symptomer og endringer av sykdomsforløpet er beskrevet nedenfor i eksempelseksjonen.
I den kollageninduserte artritt (CIA)-modell utvikler mus kronisk inflammatorisk artritt som i stor grad ligner human reumatoid artritt (RA). Da CIA viser lignende immunologiske og patologiske egenskaper som RA, er dette en ideell modell for analyse av mulige humane antiinflammatoriske forbindelser. En annen fordel ved anvendelse av CIA-modellen er at mekanismene bak patogenesen er kjente. T- og B-celleepitopene på type II-kollagen er blitt identifisert, og forskjellige immunologiske (hypersensitivitet av forsinket type og antikollagenantistoff) og inflammatoriske (cytokiner, kjemokiner og matriksdegraderende enzymer) parametere forbundet med immunformidlet artritt, er blitt bestemt og kan anvendes for å anslå analyseforbindelsers virkning i modellene (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999, Williams et al., Immunol. 59:9784-788,1992, Myers et al., Life Sei. 67:1861-78, 1997 og Wang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995). Tilførsel av løselig TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig eller andre løselige proteiner og fusjonsproteiner til disse mus for evaluering av virkningen av TACI, BR43x2 eller BCMA når det gjelder lindring av symptomer og endringer i sykdomsforløpet, er beskrevet nedenfor i eksempelseksjonen.
Modeller for bronkieinfeksjoner, f.eks. astma, kan frembringes ved injeksjon av mus med ovalbumin og nasal restimulering med antigen, noe som frembringer en astmatisk respons i bronkiene som ligner på astma. Tilførsel av løselig TACI-Ig, BR43x2-Ig, BCMA-Ig eller andre løselige proteiner og fusjonsproteiner til disse mus for evaluering av virkningen av TACI, BR43x2 eller BCMA for lindring av symptomer og endringer i sykdomsforløpet er beskrevet nedenfor i eksempelseksjonen.
En annen anvendelse av in v/vø-modeller omfatter tilførsel av et antigen til dyret, fulgt av tilførsel av løselig BR43x2 (TACI) eller liganden ztnf4 og måling av T- og B-celleresponsen.
T-celleavhengig og T-celleuavhengig immunrespons kan måles som beskrevet i Perez-Melgosa et al., J. Immunol. 763:1123-7,1999.
Immunresponsen i dyr utsatt for en regulær antigentilførsel (f.eks. ovalbumin eller kollagen) fulgt av tilførsel av BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptider eller løselige Ig-fusjoner, kan utføres for å måle virkningen på B-celleresponsen.
Farmakokinetiske undersøkelser kan anvendes i forbindelse med radioaktivt merkede, løselige BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptider eller fusjonsproteiner for å bestemme fordelingen og halveringstiden for slike polypeptider in vivo. I tillegg kan dyremodeller anvendes for å bestemme virkningene av løselig BR43x2, TACI eller BCMA på tumorer og tumorutvikling in vivo.
Videre tilveiebringes anvendelse av BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptider som surrogatmarkører for autoimmune sykdommer, nyresykdommer og B-og T-cellesykdommer. Slike pasienter kan tappes for blod, og løselige BR43x2-, TACI-eller BCMA-reseptorer og deres ligander kan påvises i blodet.
Oppfinnelsen tilveiebringer også antistoffer. Antistoffer mot BR43x2 eller peptider med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID NR: 8 kan f.eks. erholdes ved å anvende som antigen produktet fra en ekspresjonsvektor som inneholder polypeptidet av interesse eller et polypeptid isolert fra en naturlig kilde. Spesielt anvendbare antistoffer "bindes spesifikt" til BR43x2 eller peptider med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID NR: 10. Antistoffer anses å bindes spesifikt dersom antistoffene bindes til et BR43x2-polypeptid eller et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 8, et peptid eller en epitop med en bindingsaffinitet (Ka) på 10<6>M"' eller høyere, fortrinnsvis 10<7>M_<1>eller høyere, mer foretrukket 10<8>M"' eller høyere, og mest foretrukket 10<9>M"' eller høyere. Bindings-affmiteten av et antistoff kan lett bestemmes av en gjennomsnittsfagperson ved f.eks. Scatchard-analyse (Scatchard, Ann. NY Acad. Sei. 57:660, 1949). Egnede antistoffer omfatter antistoffer som bindes til BR43x2, fortrinnsvis det ekstracellulære domene i BR43x2 (aminosyrerestene 1-120 i SEKV.ID NR: 2) og antistoffer som bindes til polypeptider med en aminosyresekvens ifølge SEKV.ID NR: 10.
Anti-BR43x2-antistoffer kan fremstilles ved anvendelse av antigene BR43x2-epitopbærende peptider og polypeptider. Antigene epitopbærende peptider og polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse inneholder en sekvens på minst 9, fortrinnsvis på mellom 15 og tilnærmet 30, aminosyrer som omfattes av SEKV.ID NR: 2. Peptider eller polypeptider som omfatter en større del av en aminosyresekvens ifølge oppfinnelsen, inneholdende fra 30 til 50 aminosyrer, eller enhver lengde opp til og innbefattet den fullstendige aminosyresekvens for et polypeptid ifølge oppfinnelsen, er også anvendbare for indusering av antistoffer som bindes til BR43x2. Det er ønskelig at aminosyresekvensen til det epitopbærende peptid utvelges slik at det oppnås vesentlig løselighet i vandige løsemidler (dvs. at sekvensen omfatter relativt hydrofile aminosyrerester, mens hydrofobe aminosyrerester fortrinnsvis unngås). Hydrofile peptider kan forutsis av en fagperson ut fra et hydrofobisitetsplot, se f.eks. Hopp og Woods (Proe. Nat. Acad. Sei. USA 78:3824-8,1981) og Kyte og Doolittle (J. Mol. Biol. 757:105-142, 1982). Videre kan aminosyresekvenser som inneholder prolinrester, også være ønskelige for antistoffproduksjon.
Polyklonale antistoffer mot rekombinant BR43x2-protein eller mot BR43x2 isolert fra naturlige kilder, kan fremstilles ved anvendelse av fremgangsmåter som er velkjente blant fagfolk. Se f.eks. Green et al., "Production of Polyclonal Antisera" i Immunochemical Protocols (Manson, red.), s. 1-5 (Humana Press 1992), og Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies" i DNA Cloning 2: Expression Systems, 2. utgave, Glover et al. (red.), s. 15 (Oxford University Press 1995). Immunogenisiteten av et BR43x2-polypeptid kan forsterkes ved anvendelse av en adjuvans, f.eks. alun (aluminium-hydroksid) eller Freunds komplette eller ukomplette adjuvans. Polypeptider som er anvendbare for immunisering, omfatter også fusjonspolypeptider, f.eks. fusjoner mellom BR43x2 eller en del av dette og et immunglobulinpolypeptid eller maltosebindende protein. Det immunogene polypeptid kan være et fullengdemolekyl eller en del av dette. Dersom polypeptiddelen er "haptenlignende", kan en slik del med fordel kobles eller bindes til et makromolekylært bærerstoff (f.eks. "keyhole limpet"-hemocyanin (KLH), bovint serumalbumin (BSA) eller tetanustoksoid) for immunisering.
Selv om polyklonale antistoffer typisk frembringes i dyr som hester, kuer, hunder, kylling, rotter, mus, kaniner, hamstere, marsvin, geiter eller sauer, kan et anti-BR43x2-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse også være avledet fra et subhumant primatantistoff. Generelle teknikker for frembringelse av diagnostisk og terapeutisk anvendbare antistoffer i bavianer kan f.eks. finnes i Goldenberg et al., internasjonalt patentskrift nr. WO 91/11465, og i Losman et al., Int. J. Cancer 4(5:310, 1990. Antistoffer kan også frembringes i transgene dyr som transgen sau, ku, geit eller svin, og kan uttrykkes i gjær eller sopp i modifiserte former, så vel som i pattedyrceller og insektsceller.
Alternativt kan monoklonale anti-BR43x2-antistoffer frembringes. Monoklonale antistoffer fra mus mot spesifikke antigener kan erholdes ved fremgangsmåter som er kjent blant fagfolk (se f.eks. Kohler et al., Nature 256:495,1975, Coligan et al.
(red.), Current Protocols in Immunology, bind 1, s. 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991), Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli" i DNA Cloning 2: Expression Systems, 2. utgave, Glover et al. (red.), s. 93 (Oxford University Press 1995)).
Kort beskrevet kan monoklonale antistoffer erholdes ved å injisere mus med et preparat som omfatter et BR43x2-genprodukt, bekrefte nærvær av antistoffproduksjon ved å ta ut en serumprøve, fjerne milten for erholdelse av B-lymfocytter, fusere B-lymfocyttene med myelomceller for fremstilling av hybridomer, klone hybridomene, selektere positive kloner som produserer antistoffer mot antigenet, dyrke klonene som produserer antistoff mot antigenet, og isolere antistoffene fra hybridomkulturene.
I tillegg kan et anti-BR43x2-antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse være avledet fra et humant, monoklonalt antistoff. Humane, monoklonale antistoffer erholdes fra transgene mus som er blitt modifisert slik at de produserer spesifikke, humane antistoffer som respons på antigentilførsel. I denne teknikk innføres elementer fra det humane lokus for tungkjede og lettkjede i musestammer avledet fra embryonale stam-cellelinjer som inneholder målstyrte forstyrrelser i lokus for den endogene tungkjede og lettkjede. De transgene mus kan syntetisere humane antistoffer som er spesifikke for humane antigener, og musene kan anvendes for fremstilling av hybridomer som utskiller humant antistoff. Fremgangsmåter for erholdelse av humane antistoffer fra transgene mus er f.eks. beskrevet av Green et al., Nat. Genet. 7:13, 1994, Lonberg et al., Nature 368:856, 1994, og Taylor et al., Int. Immun. 6:579, 1994.
Monoklonale antistoffer kan isoleres og renses fra hybridomkulturer ved en rekke veletablerte teknikker. Slike isoleringsteknikker omfatter affinitetskromatografi med "Protein-A-Sepharose", størrelseseksklusjonskromatografi og ionebytterkromato-grafi (se f.eks. Coligan, s. 2.7.1-2.7.12 og s. 2.9.1-2.9.3, Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)" i Methods in Molecular Biology, bind 10, s. 79-104 (The Humana Press, Inc., 1992)).
For spesielle formål kan det være ønskelig å fremstille fragmenter av anti-BR43x2-antistoffer. Slike antistofrfagmenter kan f.eks. erholdes ved proteolytisk hydrolyse av antistoffet. Antistoffragmenter kan erholdes ved pepsin- eller papain-kløyving av hele antistoffer ved konvensjonelle fremgangsmåter. Som en illustrasjon kan antistofrfagmenter fremstilles ved enzymatisk kløyving av antistoffer med pepsin for erholdelse av et fragment på 5S betegnet F(ab')2- Dette fragment kan videre kløyves ved anvendelse av et tiolreduserende middel for fremstilling av monovalente 3.5S Fab'-fragmenter. Kløyvingsreaksjonen kan eventuelt utføres ved å anvende en blokkerings-gruppe for sulfhydrylgruppene som oppstår ved kløyving av disulfidbindinger. Alternativt gir en enzymatisk kløyving med pepsin to monovalente Fab-fragmenter og et Fc-fragment direkte. Disse fremgangsmåtene er f.eks. beskrevet av Goldenberg, US patentskrift nr. 4 331 647, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys. 89:230, 1960, Porter, Biochem. J. 73:119, 1959, Edelman et al., i Methods in Enzymology, bind 1, s. 422 (Academic Press 1967), og av Coligan ibid.
Andre fremgangsmåter for kløyving av antistoffer, f.eks. separasjon av tungkjeder for dannelse av monovalente lett-tungkjedefragmenter, videre kløyving av fragmenter eller andre enzymatiske, kjemiske eller genetiske teknikker kan også anvendes, så lenge som fragmentene bindes til det samme antigen som gjenkjennes av det intakte antistoff.
Fv-fragmenter omfatter f.eks. en assosiasjon mellom VH- og VL-kjeder. Denne assosiasjon kan være ikke-kovalent, som beskrevet av Inbar et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69:2659, 1972. Alternativt kan de variable kjeder være sammenkoblet med en intermolekylær disulfidbinding eller kryssbundet med kjemikalier som glutaraldehyd (se f.eks. Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 72:437,1992).
Fv-fragmentene kan omfatte VH- og VL-kjeder som er sammenbundet med en peptidlinker. Disse enkeltkjedede antigenbindende proteiner (scFv) fremstilles ved å konstruere et strukturelt gen som omfatter DNA-sekvenser som koder for VH- og VL-domenene sammenkoblet med et oligonukleotid. Det strukturelle gen innsettes i en ekspresjonsvektor som deretter innføres i en vertscelle, f.eks. E. coli. De rekombinante vertscellene syntetiserer en enkelt polypeptidkjede med et linkerpeptid som binder de to V-domenene sammen. Fremgangsmåter for fremstilling av scFv er f.eks. beskrevet av Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97, 1991, se også Bird et al., Science 242:423,1988, Ladner et al., US patentskrift nr. 4 946 778, Pack et al., Bio/Technology 77:1271, 1993, og Sandhu, ibid.
Som en illustrasjon kan et scFv erholdes ved å behandle lymfocytter med BR43x2-polypeptid in vitro og selektere antistoffremvisningsbiblioteker i bakteriofag eller lignende vektorer (f.eks. ved anvendelse av immobilisert eller merket BR43x2-protein eller -peptid). Gener som koder for polypeptider med mulige BR43x2-polypeptidbindende domener, kan erholdes ved å gjennomsøke tilfeldige peptid-biblioteker fremvist på bakteriofag (bakteriofagfremvisning) eller på bakterier, f.eks. E. coli. Nukleotidsekvenser som koder for polypeptidene, kan erholdes på en rekke måter, f.eks. via tilfeldig mutagenese og tilfeldig polynukleotidsyntese. Disse tilfeldige peptidfremvisningsbibliotekene kan anvendes for å søke etter peptider som interagerer med et kjent mål, som kan være et protein eller et polypeptid, f.eks. en ligand eller reseptor, et biologisk eller syntetisk makromolekyl, eller organiske eller uorganiske forbindelser. Teknikker for fremstilling og gjennomsøking av slike tilfeldige peptidfremvisningsbiblioteker er kjent innen faget (Ladner et al., US patentskrift nr. 5 223 409, Ladner et al., US patentskrift 4 946 778, Ladner et al., US patentskrift nr. 5 403 484, Ladner et al., US patentskrift nr. 5 571 698 og Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)), og tilfeldige peptidfremvisningsbiblioteker og sett for gjennomsøking av slike biblioteker er tilgjengelige kommersielt, f.eks. fra Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA), og Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Tilfeldige peptidfremvisningsbiblioteker kan gjennomsøkes ved anvendelse av BR43x2-sekvensene beskrevet heri for identifisering av proteiner som bindes til BR43x2.
En annen form for antistoffragment er et peptid som koder for et enkelt komplementaritetsbestemmende område (CDR). CDR-peptider ("minimale gjenkjen-ningsenheter") kan erholdes ved å konstruere gener som koder for CDR fra et antistoff av interesse. Slike gener fremstilles f.eks. ved anvendelse av polymerase-kjedereaksjonen for syntese av det variable område fra RNA fra antistoffproduserende celler (se f.eks. Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106,1991), Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies" i Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al. (red.), s. 166 (Cambridge University Press 1995), og Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" i Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., (red.), s. 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).
Alternativt kan et anti-BR43x2-antistoff være avledet fra et "humanisert", monoklonalt antistoff. Humaniserte monoklonale antistoffer fremstilles ved å overføre komplementaritetsbestemmende områder fra lette og tunge variable kjeder fra muse-immunglobulin inn i et humant, variabelt område. Typiske aminosyrerester i humane antistoffer innføres så i rammeverksområdene i motpartene fra mus. Anvendelse av antistoffbestanddeler avledet fra humaniserte, monoklonale antistoffer, fjerner mulige problemer forbundet med immunogenisiteten av konstante områder fra mus. Generelle teknikker for kloning av variable domener fra immunglobulin fra mus beskrives f.eks. av Orlandi et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 86:3833, 1989. Teknikker for fremstilling av humaniserte, monoklonale antistoffer er f.eks. beskrevet av Jones et al., Nature 321:522, 1986, Carter et al., Proe. Nat. Acad. Sei. USA 89:4285, 1992, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 72:437, 1992, Singer et al., J. Immun. 750:2844,1993, Sudhir (red.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies" i Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al. (red.), s. 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), og av Queen et al., US patentskrift nr. 5 693 762
(1997).
Polyklonale anti-idiotype-antistoffer kan fremstilles ved å immunisere dyr med anti-BR43x2-antistoffer eller -antistoffragmenter ved anvendelse av standardteknikker. Se f.eks. Green et al., "Production of Polyclonal Antisera" i Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (red.), s. 1-12 (Humana Press 1992). Se også Coligan, ibid., s. 2.4.1-2.4.7. Alternativt kan monoklonale anti-idiotype antistoffer fremstilles ved anvendelse av anti-BR43x2-antistoffer eller -antistofrfagmenter som immunogener med teknikkene beskrevet ovenfor. Som et annet alternativ kan humaniserte anti-idiotypeantistoffer eller anti-idiotypeantistoffer fra subhumane primater fremstilles ved anvendelse av de ovenfor beskrevne teknikker. Fremgangsmåter for fremstilling av anti-idiotypeantistoffer er f.eks. beskrevet av Irie, US patentskrift nr. 5 208 146, Greene et al., US patentskrift nr. 5 637 677 og Varthakavi og Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875, 1996.
Antistoffer eller polypeptider heri kan også være direkte eller indirekte konjugert til medikamenter, toksiner, radioaktive isotoper og lignende, og disse konjugatene kan brukes i diagnostiske eller terapeutiske anvendelser in vivo. For eksempel kan polypeptider eller antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for identifisering eller behandling av vev eller organer som uttrykker et tilsvarende anti-komplementært molekyl (f.eks. en reseptor, hhv. et antigen). Nærmere bestemt kan BR43x2-polypeptider eller anti-BR43x2-antistoffer eller bioaktive fragmenter eller deler av disse kobles til påvisbare eller cytotoksiske molekyler og tilføres til et pattedyr med celler, vev eller organer som uttrykker det antikomplementære molekyl.
Egnede påvisbare molekyler kan være direkte eller indirekte koblet til polypeptidet eller antistoffet og omfatter radioaktive isotoper, enzymer, substrater, kofaktorer, inhibitorer, fluorescensmarkører, kjemiluminescensmarkører, magnetiske partikler og lignende. Egnede cytotoksiske molekyler kan være direkte eller indirekte koblet til polypeptidet eller antistoffet og omfatter bakterielle toksiner eller plantetoksiner (f.eks. difteritoksin, Pseudomonas- eksotoksm, ricin, abrin og lignende), så vel som terapeutiske, radioaktive isotoper som jod-131, rhenium-188 eller yttrium-90 (enten direkte koblet til polypeptidet eller antistoffet eller indirekte tilkoblet ved hjelp av f.eks. en chelaterende gruppe). Polypeptider eller antistoffer kan også være konjugert til cytotoksiske medikamenter, f.eks. adriamycin. For indirekte tilkobling av et påvisbart eller cytotoksisk molekyl kan det påvisbare eller cytotoksiske molekyl være konjugert til et medlem av et komplementaritets/antikomplementaritetspar, hvor det andre medlem er bundet til polypeptidet eller antistoffdelen. For disse formål er biotin/streptavidin et eksempel på et komplementaritets/antikomplementaritetspar.
Løselige BR43x2-polypeptider eller antistoffer mot BR43x2 kan konjugeres direkte eller indirekte til medikamenter, toksiner, radioaktive isotoper og lignende, og disse konjugatene kan benyttes for diagnostiske eller terapeutiske anvendelser in vivo. For eksempel kan polypeptider eller antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for identifisering eller behandling av organer som uttrykker et tilsvarende antikomple-mentaritetsmolekyl (f.eks. en reseptor, hhv. et antigen). Nærmere bestemt kan BR43x2-polypeptider eller anti-BR43x2-antistoffer, eller bioaktive fragmenter eller deler av disse, kobles til påvisbare eller cytotoksiske molekyler og tilføres til et pattedyr som har celler, vev eller organer som uttrykker antikomplementaritetsmolekylet.
Egnede påvisbare molekyler kan kobles direkte eller indirekte til polypeptidet eller antistoffet og omfatter radioaktive isotoper, enzymer, substrater, kofaktorer, inhibitorer, fluorescensmarkører, kjemiluminescensmarkører, magnetiske partikler og lignende. Egnede cytotoksiske molekyler kan være direkte eller indirekte koblet til polypeptidet eller antistoffet og omfatter bakterielle toksiner eller plantetoksiner (f.eks. difteritoksin, Pseudomonas- éksotoksin, ricin, abrin og lignende), så vel som terapeutiske, radioaktive isotoper som jod-131, rhenium-188 eller yttrium-90 (enten direkte koblet til polypeptidet eller antistoffet eller indirekte tilkoblet ved hjelp av f.eks. en chelaterende gruppe). Polypeptider eller antistoffer kan også være konjugert til cytotoksiske medikamenter, f.eks. adriamycin. For indirekte tilkobling av et påvisbart eller cytotoksisk molekyl kan det påvisbare eller cytotoksiske molekyl være konjugert til et medlem av et komplementaritets/antikomplementaritetspar, hvor det andre medlem er bundet til polypeptidet eller antistoffdelen. For disse formål er biotin/streptavidin et eksempel på et komplementaritets/antikomplementaritetspar.
Slike polypeptid-toksinfusjonsproteiner eller antistoff/fragment-toksinfusjonsproteiner kan anvendes f.eks. målstyrt celle- eller vevsinhibering eller - fjerning (f.eks. for behandling av cancerceller eller -vev). Dersom polypeptidet har flere funksjonelle domener (dvs. et aktiveringsdomene eller et ligandbindende domene pluss et målstyringsdomene), kan alternativt et fusjonsprotein som kun omfatter målstyrings-domenet, være egnet for styring av et påvisbart molekyl, et cytotoksisk molekyl eller et komplementært molekyl til en celle eller vevstype av interesse. I de tilfeller hvor domenefusjonsproteinet omfatter et komplementært molekyl, kan det antikomplementære molekyl være konjugert til et påvisbart eller cytotoksisk molekyl. Slike fusjonsproteiner mellom domener og komplementære molekyler representerer således en generisk målstyrende bærer for celle/vevsspesifikk tilførsel av generiske antikomplementære-påvisbare/cytotoksiske molekylkonjugater. De bioaktive polypeptidkonjugatene eller antistoffkonjugatene som beskrives heri, kan tilføres intravenøst, intraarterielt eller intra-duktalt, eller de kan tilføres lokalt til det påtenkte virkningssted.
Antistoffer kan fremstilles mot løselige BR43x2-polypeptider som er His-eller "FLAG"-merkede. Antistoffer kan også fremstilles mot MBP-fusjonsproteiner fremstilt i E. coli. Alternativt kan slike polypeptider omfatte et fusjonsprotein med humant lg. Nærmere bestemt kan antiserum som inneholder polypeptidantistoffer mot His-merket eller "FLAG"-merket, løselig BR43x2, anvendes ved analyse av vevsfordelingen av BR43x2 ved immunhistokjemi på vev fra menneske eller primat. Disse løselige BR43x2-polypeptider kan også anvendes for immunisering av mus for fremstilling av monoklonale antistoffer mot et løselig humant BR43x2-polypeptid. Monoklonale antistoffer mot et løselig humant BR43x2-polypeptid kan også anvendes for å etterligne ligand/reseptorkobling, noe som fører til aktivering eller inaktivering av ligand/reseptorparet. Det er f.eks. blitt vist at kryssbinding av monoklonale, anti-løselige CD40-antistoffer gir et stimulerende signal til B-celler som er blitt suboptimalt aktivert med anti-IgM eller LPS, og fører til proliferasjon og produksjon av immunglobulin. Disse samme monoklonale antistoffer fungerer som antagonister ved anvendelse i løsning, ved blokkering av reseptorens aktivitet. Monoklonale antistoffer mot BR43x2 kan anvendes for å bestemme fordeling, regulering og biologisk interaksjon av BR43x2/BR43x2-ligandparet på spesifikke cellefamilier identifisert ved vevsfordelingsundersøkelser.
Oppfinnelsen tilveiebringer også isolerte og rensede BR43x2-, TACI- og BCMA-polynukleotidprober eller primere. Slike polynukleotidprober kan være RNA eller DNA. DNA kan være enten cDNA eller genomisk DNA. Polynukleotidprober er enkelt- eller dobbelttrådet DNA eller RNA, generelt syntetiske oligonukleotider, men kan være fremstilt fra klonet cDNA eller genomiske sekvenser, og vil generelt omfatte minst 16 nukleotider, hyppigere fra 17 nukleotider til 25 nukleotider eller mer, noen ganger 40 til 60 nukleotider, og i noen tilfeller en vesentlig del av, et domene fra eller til og med hele BR43x2-genet eller -cDNA. Prober og primere er generelt syntetiske oligonukleotider, men de kan være dannet fra klonet cDNA eller genomiske sekvenser eller komplementer av disse. Analytiske prober vil generelt være minst 20 nukleotider lange, selv om noe kortere prober (14-17 nukleotider) kan anvendes. PCR-primere er minst 5 nukleotider lange, fortrinnsvis 15 eller flere nt, mer foretrukket 20-30 nt. Korte polynukleotider kan anvendes dersom et lite område i genet er målet for analysen. For totalanalyse av gener kan en polynukleotidprobe omfatte et fullstendig ekson eller mer. Prober kan merkes for erholdelse av et påvisbart signal, f.eks. med et enzym, biotin, en radioaktiv isotop, en fluorofor, en kjemiluminescerende gruppe, en paramagnetisk partikkel og lignende, som er kommersielt tilgjengelige fra mange kilder, f.eks. Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, og Amersham Corp., Arlington Heights, IL, ved anvendelse av teknikker som er velkjente innen faget. Foretrukne områder som prober kan konstrueres fra, omfatter det ligandbindende område, de cysteinrike pseudorepetisjoner, signalsekvenser og lignende. Teknikker for utvikling av polynukleotidprober og hybridiseringsteknikker er velkjent innen faget, se f.eks. Ausubel et al., red., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1991.
BR43x2-, TACI- og BCMA-polypeptider og -antistoffer kan anvendes i diagnostiske systemer for å vise nærvær av BR43x2, TACI og BCMA og BR43x2-, TACI- og BCMA-ligandpolypeptider, f.eks. ztnf4. Informasjonen erholdt fra slike påvisningsfremgangsmåter, kan gi innsyn i betydningen av BR43x2-polypeptider i forskjellige sykdommer og kan fungere som diagnostisk verktøy i sykdommer i hvilke endret nivå av BR43x2 er signifikant. Endret nivå av BR43x2-, TACI- og BCMA-reseptorpolypeptider kan indikere patologiske tilstander, innbefattet cancer, autoimmune forstyrrelser og infeksiøse sykdommer.
I en basal analyse inkuberes et enkelttrådet probemolekyl med RNA isolert fra en biologisk prøve under betingelser vedrørende temperatur og ionestyrke som fremmer baseparing mellom proben og mål-RNA-typene BR43x2, TACI eller BCMA. Etter separasjon av ubundet prøve fra hybridiserte molekyler bestemmes hybridmengden.
Veletablerte hybridiseringsfremgangsmåter for RNA-påvisning omfatter Northern-analyse og dot/slot-blot-hybridisering (se f.eks. Ausubel ibid. og Wu et al.
(red.), "Analysis of Gene Expression at the RNA Level" i Methods in Gene Biotechnology, s. 225-239 (CRC Press, Inc. 1997)). Nukleinsyreprober kan merkes påvisbart med
radioaktive isotoper som<32>P eller<35>S. Alternativt kan BR43x2-RNA påvises ved en ikke-radioaktiv hybridiseringsfremgangsmåte (se f.eks. Isaac (red.), Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Humana Press, Inc., 1993). Ikke-radioaktiv påvisning oppnås typisk ved enzymatisk omdanning av kromogene eller kjemiluminescerende
substrater. Illustrative, ikke-radioaktive grupper omfatter biotin, fluorescein og digoksigenin.
BR43x2-, TACI- og BCMA-oligonukleotidprober er også anvendbare for in v/vø-diagnose. Som en illustrasjon kan,<8>F-merkede oligonukleotider tilføres til et individ og synliggjøres ved positronemisjonstomografi (Tavitian et al., Nature Medicine 4:467, 1998).
En rekke diagnostiske fremgangsmåter utnytter polymerase-kjedereaksjonen (PCR) for å øke deteksjonsfremgangsmåtenes sensitivitet. Standardteknikker for utførelse av PCR er velkjente (se generelt Mathew (red.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (red.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (red.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek og Walaszek (red.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (red.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998), og Meltzer (red.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998)). PCR-primere kan utformes for amplifisering av en sekvens som koder for et gitt BR43x2-domene eller
-motiv, f.eks. den cysteinrike pseudorepetisjon fra BR43x2, TACI eller BCMA.
Én variant av PCR for diagnostiske analyser er revers transkriptase-PCR (RT-PCR). I RT-PCR-teknikken isoleres RNA fra en biologisk prøve og revers-transkriberes til cDNA, og cDNA inkuberes med BR43x2-primere (se f.eks. Wu et al.
(red.), "Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR", i Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., s. 15-28, 1997). PCR utføres så, og produktene analyseres ved anvendelse av standardteknikker.
Som en illustrasjon isoleres RNA fra en biologisk prøve ved f.eks. anvendelse av guanidiniumtiocyanat-cellelyseringsfremgangsmåten beskrevet ovenfor. Alternativt kan en fastfaseteknikk anvendes for isolering av mRNA fra et cellelysat. En reverstranskripsjonsreaksjon kan primes med det isolerte RNA ved anvendelse av tilfeldige oligonukleotider, korte homopolymerer av dT eller BR43x2-, TACI- eller BCMA-"antisense"-oligomerer. Oligo-dT-primere byr på den fordel at forskjellige mRNA-nukleotidsekvenser som kan gi kontrollmålsekvenser, amplifiseres. BR43x2-, TACI- eller BCMA-sekvenser amplifiseres ved polymerase-kjedereaksjonen ved anvendelse av to flankerende oligonukleotidprimere som typisk er minst 5 baser lange.
PCR-amplifiseringsprodukter kan påvises ved anvendelse av en rekke tilnærminger. PCR-produkter kan f.eks. fraksjoneres ved gelelektroforese og visualiseres ved etidiumbromidfarging. Alternativt kan fraksjonerte PCR-produkter overføres til en membran, hybridiseres med en påvisbart merket BR43x2-probe og undersøkes ved autoradiografi. Ytterligere alternative tilnærminger omfatter anvendelse av digoksigenin-merkede deoksyribonukleinsyre-trifosfater for å oppnå kjemiluminescenspåvisning, og den kolorimetriske analyse C-TRAK.
En annen tilnærming er samtids kvantitativ PCR (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Ct.). En fluorogen probe som består av et oligonukleotid tilkoblet både en rapportørgruppe og en quenchergruppe, hybridiseres spesifikt mellom foroverprimeren og reversprimeren. Ved anvendelse av 5'-endonukleaseaktiviteten til Taq DNA-polymerase skilles rapportørgruppen fra quenchergruppen, og et sekvensspesifikt signal dannes og forsterkes etter hvert som amplifiseringen foregår. Fluorescensintensiteten kan måles kontinuerlig og kvantiteres under PCR-reaksjonen.
En annen tilnærming for påvisning av BR43x2-, TACI- eller BCMA-ekspresjon er syklisk probeteknologi (CPT), hvor et enkelttrådet DNA-mål bindes til et overskudd av DNA-RNA-DNA-probe for dannelse av et kompleks, RNA-delen avkløyves med RNase H, og nærvær av kløyvet, kimær probe påvises (se f.eks. Beggs et al., J. Clin. Microbiol. 54:2985,1996 og Bekkaoui et al., Biotechniques 20:240, 1996). Alternative fremgangsmåter for påvisning av BR43x2-, TACI- eller BCMA-sekvenser kan benytte tilnærminger som nukleinsyresekvensbasert amplifisering (NASBA), kooperativ amplifisering av templater ved krysshybridisering (CATCH), og ligase-kjedereaksjonen (LCR) (se f.eks. Marshall et al., US patentskrift nr. 5 686 272 (1997), Dyer et al., J. Virol. Methods 60:161,1996, Ehricht et al., Eur. J. Biochem. 243:358, 1997 og Chadwick et al., J. Virol. Methods 70:59, 1998). Andre standardfremgangsmåter er kjent blant fagfolk.
BR43x2-, TACI- eller BCMA-prober og -primere kan også anvendes for påvisning og lokalisering av BR43x2-, TACI- eller BCMA-genekspresjon i vevsprøver. Fremgangsmåter for slik in s/fø-hybridisering er velkjent blant fagfolk (se f.eks. Choo (red.), In Situ Hybridization Protocols, Humana Press, Inc., 1994, Wu et al. (red.), "Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization (RISH)" i Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., s. 259-278, 1997 og Wu et al. (red.), "Localization of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH)" i Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., s. 279-289, 1997).
Ytterligere diagnostiske tilnærminger er velkjent blant fagfolk (se f.eks. Mathew (red.), Protocols in Human Molecular Genetics, Humana Press, Inc., 1991, Coleman og Tsongalis, Molecular Diagnostics, Humana Press, Inc., 1996 og Elles, Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press, Inc., 1996).
I tillegg kan slike polynukleotidprober anvendes for hybridisering til tilsvarende sekvenser på enkeltkromosomer. Kromosomal identifisering og/eller kartlegging av BR43x2-genet kan gi nyttig informasjon vedrørende genfunksjon og sykdomsassosiasjon. Mange kartleggingsteknikker er tilgjengelige for fagfolk, f.eks. kartlegging av somatiske cellehybrider og fluorescensbasert in s/fw-hybridisering (FISH). En foretrukket fremgangsmåte er strålingshybridkartlegging. Strålingshybridkartlegging er en somatisk cellegenetisk teknikk utviklet for fremstilling av kontinuerlige kart med høy oppløsning over pattedyrkromosomer (Cox et al., Science 250:245-50,1990). Delvis eller fullstendig kjennskap til et gens sekvens tillater utforming av PCR-primere som er anvendbare for anvendelse med kromosomkartleggingssett fra strålingshybrider. Kommersielt tilgjengelige kartleggingssett fra strålingshybrider som omfatter hele det humane genom, f.eks. Stanford G3 RH Panel og GeneBridge 4 RH Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL), er tilgjengelige. Disse settene tillater hurtig PCR-basert kromosomlokalisering og ordning av gener, sekvensmerkede seter (STS) og andre ikke-polymorfe og polymorfe markører i et område av interesse. Dette omfatter direkte etablering av fysiske avstander mellom nyoppdagede gener av interesse og tidligere kartlagte markører. Kjennskap til et gens nøyaktige posisjon kan være nyttig på en rekke måter, innbefattet: 1) bestemmelse av hvorvidt en sekvens er del av et eksisterende kontig og erholdelse av ytterligere omliggende genetiske sekvenser i forskjellige former, f.eks. YAC-, BAC- eller cDNA-kloner, 2) tilveiebringelse av et mulig kandidatgen for en arvelig sykdom som viser kobling til det samme kromosomale område, og 3) for kryssreferanser til modellorganismer, f.eks. mus, noe som kan være nyttig for å fastslå hvilken funksjon et gitt gen kan ha.
Kromosomal lokalisering kan også utføres ved anvendelse av STS. En STS er en DNA-sekvens som er unik i det humane genom og som kan anvendes som referansepunkt for et gitt kromosom eller et kromosomområde. En STS kan være definert ved et par av oligonukleotidprimere som kan anvendes i en polymerase-kjedereaksjon for spesifikk påvisning av dette sete i nærvær av alle andre genomiske sekvenser. Da STS kun er basert på DNA-sekvens, kan de være fullstendig beskrevet i en database, f.eks. Database of Sequence Tagged Sites (dbSTS), GenBank, (National Center for Biological Information, National Institutes of Health, Bethesda, MD http://www.ncbi.nlm.nih.gov), disse kan gjennomsøkes med en gensekvens av interesse for kartleggingsresultatene som foreligger for disse korte, genomiske STS-landemerkesekvenser.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også reagenser for ytterligere diagnostiske anvendelser. For eksempel kan BR43x2-genet, en probe som omfatter
BR43x2-DNA eller -RNA, eller en undersekvens av disse, anvendes for å fastslå hvorvidt BR43x2-genet foreligger på et gitt kromosom eller hvorvidt en mutasjon har forekommet. Påvisbare kromosomale unormaliteter ved lokus for BR43x2-genet omfatter, men er ikke begrenset til, aneuploidi, endret genkopitall, insersjoner, delesjoner, restriksjonssete-endringer og rearrangementer. Disse avvik kan foreligge i den kodende sekvens, i introner eller i flankerende sekvenser, innbefattet oppstrøms promotersekvenser og regulatoriske sekvenser, og de kan vise seg som fysiske endringer i en kodet sekvens eller endret genekspresjonsnivå.
Generelt omfatter disse diagnostiske fremgangsmåtene følgende trinn: (a) erholdelse av en genetisk prøve fra en pasient, (b) inkubering av den genetiske prøve med en polynukleotidprobe eller primer som beskrevet ovenfor, under betingelser hvor polynukleotidet vil hybridisere til den komplementære polynukleotidsekvens for erholdelse av et første reaksjonsprodukt, og (iii) sammenligning av det første reaksjonsprodukt med et kontrollreaksjonsprodukt. En forskjell mellom det første reaksjonsprodukt og kontrollreaksjonsproduktet tyder på en genetisk unormalitet i pasienten. Genetiske prøver for anvendelse i foreliggende oppfinnelse omfatter genomisk DNA, cDNA og RNA. Polynukleotidproben eller primeren kan være RNA eller DNA og vil omfatte en del av SEKV.ID NR: 3, den komplementære sekvens til SEKV.ID NR: 1 eller en RNA-ekvivalent av dette. Egnede analysefremgangsmåter i denne sammenheng omfatter mole-kylærgenetiske teknikker som er kjent blant fagfolk, f.eks. restriksjonsfragmentlengdepolymorfi (RFLP)-analyse, kort tandemrepetisjon (STR)-analyse ved anvendelse av PCR-teknikker, ligase-kjedereaksjon (Barany, PCR Methods and Applications 7:5-16,1991), ribonukleasebeskyttelsesanalyser og andre analyse-teknikker for genetisk kobling som er kjent innen faget (Sambrook et al., ibid., Ausubel et al., ibid., Marian, Chest 708:255-65,1995). Ribonukleasebeskyttelsesanalyser (se f.eks. Ausubel et al., ibid., kap. 4) omfatter hybridisering av en RNA-probe til en RNA-prøve fra en pasient, hvoretter reaksjonsproduktet (RNA-RNA-hybridet) behandles med RNase. Hybridiserte områder i RNA er beskyttet mot kløyving. I PCR-analyser inkuberes en genetisk prøve fra en pasient med et par av polynukleotidprimere, og området mellom primerne amplifiseres og gjenvinnes. Endret størrelse eller mengde av gjenvunnet produkt tyder på mutasjoner i pasienten. En annen PCR-basert teknikk som kan anvendes, er enkelttråd-konformasjonspolymorfi (SSCP)-analyse (Hayashi, PCR Methods and Applications 7:34-8, 1991).
"Antisense"-metodologi kan anvendes for inhibering av BR43x2-, TACI-eller BCMA-gentranskripsjon, f.eks. for inhibering av B-celleutvikling og interaksjon med andre celler. Polynukleotider som er komplementære til et segment i et BR43x2-, TACI- eller BCMA-kodende polynukleotid (f.eks. et polynukleotid som beskrevet i SEKV.ID NR: 3), utformes slik at de bindes til BR43x2-, TACI- eller BCMA-kodende mRNA og inhiberer translasjonen av slik mRNA. Slike "antisense"-polynukleotider anvendes for inhibering av ekspresjonen av BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptidkodende gener i cellekulturer eller i et individ.
Mus som er modifisert slik at de uttrykker BR43x2, TACI eller BCMA, betegnet "transgene mus", og mus som viser fullstendig fravær av BR43x2-, TACI- eller BCMA-funksjonen, betegnet "knockout-mus", kan også frembringes (Snouwaert et al., Science 257:1083,1992, Lowell et al., Nature 366:740-42,1993, Capecchi, Science 244:1288-92, 1989, Palmiter et al., Annu. Rev. Genet. 20:465-99, 1986). Transgene mus som overuttrykker BR43x2, TACI eller BCMA, enten i alle vev eller kontrollert av en vevsspesifikk eller vevsbegrenset promoter, kan f.eks. anvendes for å fastslå hvorvidt overekspresjon gir en fenotype. Overekspresjon av et villtype BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptid, polypeptidfragment eller en mutant av disse kan f.eks. endre normale, cellulære prosesser, noe som fører til en fenotype som identifiserer et vev i hvilket BR43x2-, TACI- eller BCMA-ekspresjon er funksjonelt relevant og som kan peke på et terapeutisk mål for BR43x2, TACI, BCMA eller disses agonister eller antagonister. En foretrukket transgen mus å utforme er f.eks. en mus som overuttrykker løselig BR43x2, TACI eller BCMA. Videre kan slik overekspresjon føre til en fenotype som viser likhet med humane sykdommer. På tilsvarende måte kan "knockout"-BR43x2-, TACI- eller BCMA-mus anvendes for å fastslå hvorvidt BR43x2 er absolutt nødvendig in vivo. Fenotypen til "knockout"-mus kan peke på de in vzvo-virkningene som en BR43x2-, TACI- eller BCMA-antagonist, f.eks. dem beskrevet heri, kan ha. Det humane BR43x2-, TACI- eller BCMA-cDNA kan anvendes for isolering av BR43x2-, TACI- eller BCMA-mRNA, -cDNA og genomisk DNA fra mus, som deretter anvendes for fremstilling av "knockout"-mus. Disse musene kan anvendes for å undersøke BR43x2-, TACI- eller BCMA-genet og proteinet som kodes av disse i et in v/vo-system, og kan anvendes som in v/vø-modeller for tilsvarende humane sykdommer. Videre kan transgen ekspresjon av BR43x2-, TACI- eller BCMA-"antisense"-polynukleotider eller ribozymer rettet mot BR43x2, TACI eller BCMA beskrevet heri, anvendes på tilsvarende måte som transgene mus beskrevet ovenfor.
Farmasøytisk effektive mengder av BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptider ifølge foreliggende oppfinnelse kan utformes med farmasøytisk aksepterbare bærerstoffer for parenteral, oral, nasal, rektal, topisk eller transdermal tilførsel eller lignende, ifølge konvensjonelle fremgangsmåter. Preparater kan videre omfatte ett eller flere fortynningsmidler, fyllstoffer, emulsjonsmidler, konserveringsmidler, buffere, eksipienser og lignende, og kan foreligge i former som væsker, pulvere, emulsjoner, stikkpiller, liposomer, transdermalplastere og tabletter. Tilførselssystemer for langsom eller vedvarende frigivelse, innbefattet en rekke biopolymerer (biologibaserte systemer), systemer som anvender liposomer og polymere tilførselssystemer, kan også anvendes med preparatene som beskrives heri for å oppnå en kontinuerlig eller langvarig kilde for BR43x2-polypeptid eller -antagonist. Slike systemer for langsom frigivelse kan anvendes på preparater for f.eks. oral, topisk og parenteral anvendelse. Begrepet "farmasøytisk aksepterbart bærerstoff' viser til en bærer som ikke interfererer med effektiviteten av den biologiske aktivitet til de aktive bestanddeler, og som ikke er toksisk for verten eller pasienten. En fagperson kan utforme preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse på en egnet måte og i samsvar med akseptert praksis, f.eks. som beskrevet i Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, red., Mack Publishing Co., Easton PA, 19. utgave, 1995.
Som anvendt heri, er en "farmasøytisk effektiv mengde" av et BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptid, en agonist eller antagonist en mengde som er tilstrekkelig til å indusere et ønsket biologisk resultat. Resultatet kan være lindring av tegnene, symptomene eller årsakene til en sykdom, eller enhver annen ønsket endring av et biologisk system. En effektiv mengde av et BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptid er f.eks. den mengde som gir enten subjektiv lindring av symptomer eller en objektivt påvisbar forbedring, bemerket av den behandlende lege eller en annen kvalifisert observatør. En slik effektiv mengde av et BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptid eller et løselig fusjonsprotein vil f.eks. gi en redusert B-cellerespons under immunresponsen, inhibering eller reduksjon av autoantistoffproduksjonen, inhibering eller reduksjon av symptomer forbundet med SLE, MG eller RA. Effektive mengder av BR43x2, TACI eller BCMA vil redusere prosentandelen av B-celler i perifert blod. Effektive mengder av BR43x2-, TACI- eller BCMA-polypeptidene kan variere innen vide grenser avhengig av sykdommen eller symptomet som skal behandles. Mengden polypeptid som skal tilføres og konsentrasjonen av dette i preparatene, avhenger av det valgte bærerstoff, den valgte tilførselsvei, det gitte polypeptids aktivitet, pasientens kliniske tilstand, bivirkningene og forbindelsens stabilitet i preparatet. Den behandlende lege vil således anvende et passende preparat som inneholder en passende konsentrasjon i sammensetningen, så vel som mengden preparat tilført, avhengig av klinisk erfaring med pasienten det gjelder eller med lignende pasienter. Slike mengder vil delvis avhenge av hvilken tilstand som skal behandles, pasientens alder, vekt og generelle helsetilstand, og andre faktorer som er åpenbare for fagfolk. En dose vil typisk være i området fra 0,1-100 mg/kg kroppsvekt. Doser for spesifikke forbindelser kan bestemmes ut fra in vitro- eller ex vzvø-under-søkelser, kombinert med undersøkelser i forsøksdyr. Konsentrasjoner av forbindelser som finnes å være effektive in vitro eller ex vivo, gir ledetråder for dyreforsøk, hvori dosene beregnes slik at de gir tilsvarende konsentrasjoner i virkningssetet.
Oppfinnelsen illustreres videre ved de påfølgende, ikke-begrensende eksempler.
Eksempler
Eksempel 1
Identifisering av BR43x2
TACI-isoformen ble klonet fra et RPMI-arraybibliotek ved anvendelse av en sekresjonsfelletilnærming. Et RPMI 1788 (en aktivert B-cellelinje)-bibliotek ble utsådd i en matrise ved anvendelse av tyve 96-brønners plater. Hver brønn inneholdt tilnærmet 100 E. cø/z-kolonier, hvor hver koloni inneholdt én cDNA-klon. DNA-minipreparater ble fremstilt i 96-brønners format ved anvendelse av "TomTech Quadra 9600". Isolert DNA ble så slått sammen i 120 porsjoner som hver representerte 1 600 kloner. Disse porsjonene ble transfektert inn i Cos-7-celler og utsådd i 12-brønners plater. 3 ul DNA fra én porsjon og 5 ul "LipofectAMINE" ble sammenblandet i 92 ul serumfritt DMEM-medium (55 mg natriumpyruvat, 146 mg L-glutamin, 5 mg transferrin, 2,5 mg insulin, 1 (ig selen og 5 mg fetuin i 500 ml DMEM) og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter, fulgt av tilsetning av 400 ul serumfritt DMEM-medium. DNA-"LipofectAMINE"-blandingen ble tilsatt til 220 000 Cos-7-celler/brønn utsådd i 12-brønners vevs-dyrkningsplater og inkubert i 5 timer ved 37 °C. Etter inkubasjonen ble 500 ul 20% FBS DMEM-medium (100 ml FBS, 55 mg natriumpyruvat og 146 mg L-glutamin i 500 ml DMEM) tilsatt til hver brønn og cellene inkubert over natten.
Sekresjonsfelleanalysen ble utført ved anvendelse av biotinylert, "FLAG"-merket ztnf4. Cellene ble vasket med PBS og fiksert i 15 minutter med 1,8% formaldehyd i PBS. Cellene ble så vasket med TNT (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl og 0,05% "Tween-20" i H20). Cellene ble gjort permeable med 0,1% "Triton-X" i PBS i 15 minutter, fulgt av en vask med TNT. Cellene ble blokkert i 1 time med TNB (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl og 0,5% blokkeringsreagens) ved anvendelse av "NEN Renaissance" TSA-Direct (NEN, Boston, MA) ifølge produsentens instruksjoner. Cellene ble vasket med TNT og blokkert i 15 minutter med avidin, og så med biotin (Vector Labs, kat. nr. SP-2001), med mellomliggende vask med TNT. Cellene ble inkubert i 1 time med 1 ug/ml ztnf4/"Flag"/biotin i TNB, fulgt av en vask med TNT. Cellene ble så inkubert i 1 time med en 1:300 fortynning av streptavidin-HRP (NEN) i TNB og vasket med TNT. Hybridisering ble påvist med fluorescein-tyramidreagens fortynnet 1:50 i fortynnings-buffer (NEN) og inkubert i 4,4 minutter og vasket med TNT. Cellene ble konservert med "Vectashield Mounting Media" (Vector Labs, Burlingame, CA) fortynnet 1:5 i TNT.
Cellene ble synliggjort ved fluorescensmikroskopi med et FITC-filter. 12 porsjoner var positive for ztnf4-binding. Porsjon D8 (som representerte 1 600 kloner), ble oppdelt, og en enkelt klon (D8-1) som var positiv for ztnf4-binding, ble isolert. Sekvensanalyse viste at klon D8-1 inneholdt en polypeptidsekvens som kodet for en isoform av TACI, i hvilken den første cysteinrike pseudorepetisjon i TACI fra Phe21 til Arg67 var erstattet med en enkelt aminosyrerest, tryptofan. Denne isoformen ble betegnet BR43x2, og polynukleotidsekvensen til denne er vist i SEKV.ID NR: 1.
Eksempel 2
Lokalisering av BR43xl i l<y>mfocytter og monocytter
Revers transkriptase-PCR ble anvendt for lokalisering av BR43xl-ekspresjon i T- og B-celler og monocytter. Oligonukleotidprimerne ZC19980 (SEKV.ID NR: 15) og ZC19981 (SEKV.ID NR: 16) ble anvendt for analyse av CD19<+->, CD3<+->og monocytt-cDNA for BR43. Reverstranskripsjonsreaksjonen ble utført ved 94 °C i 3 minutter, fulgt av 30 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 68 °C i 2 minutter og 72 °C i 1 minutt, fulgt av en 7 minutters forlengelsesreaksjon ved 72 °C. Et bånd med forventet størrelse, 720 bp, ble kun påvist i B-celler og ikke i aktiverte T-celler som rapportert for TACI ved anvendelse av antistoffer (von Bulow og Bram, ibid.).
Eksempel 3
B- celleproliferasionsanalvse ved anvendelse av BR43- liganden ztnf4
En ampulle som inneholdt 1 x IO<8>nedfrosne, aferesebehandlede, mononukleære celler fra perifert blod (PBMC), ble hurtig opptint i et vannbad ved 37 °C og resuspendert i 25 ml B-cellemedium (Iscoves modifiserte Dulbeccos medium, 10% varmeinaktivert, føtalt, bovint serum, 5% L-glutamin, 5% Pen/Strep) i et 50 ml rør. Cellene ble analysert for levedyktighet ved anvendelse av "Trypan Blue" (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). 10 ml "Ficoll/Hypaque Plus" (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) ble lagt under cellesuspensjonen, og prøven ble sentrifugert i 30 minutter ved 1 800 rpm og sentrifugen stanset med avskrudd brems. Interfaselaget ble så fjernet og overført til et nytt 50 ml rør, justert til et sluttvolum på 40 ml med PBS og sentrifugert i 10 minutter ved 1 200 rpm med bremsen på. De isolerte B-cellenes levedyktighet ble analysert ved anvendelse av "Trypan Blue". B-cellene ble resuspendert ved en slutt-konsentrasjon på 1 x IO<6>celler/ml i B-cellemedium og utsådd med 180 ul/brønn i en 96-brønners plate med U-bunner (Falcon, VWR, Seattle, WA).
Cellene ble tilsatt én av følgende stimulatorer for justering av sluttvolumet til 200 ml/brønn: Løselig, "FLAG"-merket ztnf-4sCF eller ztnf-4sNF i 10-gangers fortynninger fra 1 mg-1 ng/ml, enten alene, med 10 ug/ml anti-IgM (anti-Human IgM fra geit) fortynnet i NaH2CC>3, pH 9,5 (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL), eller med 10 ug/ml anti-IgM, og 10 ng/ml rekombinant, humant IL4 (fortynnet i PBS og 0,1% BSA). I tillegg ble andre cytokiner, f.eks. IL-3 og IL-6, så vel som løselig CD40 (sCD40)-antistoff (Pharmingen, San Diego, CA) analysert. Som kontroll ble cellene inkubert med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) og PBS, 10 ug/ml anti-IgM eller 10 ug/ml anti-IgM og 10 ng/ml IL4 (eller andre cytokiner). Cellene ble så inkubert ved 37 °C i en fuktgjort inkubator i 72 timer. 16 timer før høsting ble 1 uCi<3>H-tymidin tilsatt til alle brønner. Cellene ble høstet i en 96-brønners filterplate ("UniFilter GF/C", Packard, Meriden, CT), hvor de ble høstet ved anvendelse av en cellehøster (Packard) og oppsamlet ifølge produsentens instruksjoner. Platene ble tørket ved 55 °C i 20-30 minutter, og bunnen av brønnene ble forseglet med en ugjennomsiktig plateforsegler. Hver brønn ble tilsatt 0,25 ml scintillasjonsvæske ("Microscint-O", Packard), og platen ble avlest ved anvendelse av en "TopCount" mikroplate-scintillasjonsteller (Packard).
For å måle induksjon av IgG-produksjon som respons på forskjellige B-cellemitogener etter stimulering av rensede B-celler ble celler fremstilt som beskrevet og inkubert i 9 dager. Cellesupernatanten ble oppsamlet for bestemmelse av IgG-produksjonen.
For å måle celleoverflatemarkøraktivering som respons på forskjellige B-cellemitogener eller stimulering av rensede B-celler, ble celler fremstilt som beskrevet ovenfor, men inkubert i kun 48 timer. Celleoverflatemarkører ble målt ved FACS-analyse.
Proliferasjonen av humane, rensede B-celler stimulert med forskjellige B-cellemitogener, er oppsummert i tabell 5:
En synergistisk virkning av ztnf4 med IL4, IL3 (10 ug/ml) og IL6 (10 ug/ml) ble observert på B-celleproliferasjonen. En to gangers økning av B-cellesignaliseringen ble observert ved anvendelse av sCD40.
Induksjon av IgG-produksjon (ng/ml) som respons på forskjellige B-cellemitogener etter stimulering av rensede B-celler er oppsummert i tabell 6.
En økning i celleoverflateaktiveringsmarkører etter stimulering av rensede B-celler med ztnf4 alene, eller med anti-IgM eller anti-IgM + IL-4, ble observert. Det var ingen virkning på proliferasjonen av PBMNC i nærvær av optimale eller suboptimale T-cellemitogener. Videre ble ingen virkning på TNFa-produksjonen observert i rensede monocytter som respons på LPS-stimulering.
Figur 3 viser koaktivering ved løselig ztnf4 av humane B-lymfocytter til proliferasjon og utskillelse av immunglobulin. Figur 3A viser proliferasjon av rensede B-celler fra humant, perifert blod som respons på stimulering med løselig ztnf4 (25 ng/ml) i nærvær av IL-4 alene, og IL-4 med anti-IgM, anti-CD40 eller anti-CD19, etter 5 dager i
kultur. Figur 3B viser nivået av IgM og IgG målt i supernatantene erholdt fra humane B-celler stimulert med løselig ztnf4 i nærvær av IL-4 eller IL-4 + IL-5 etter 9 dager i kultur.
Disse resultatene tyder på at løselig ztnf4 er et B-celleaktiveringsmolekyl som fungerer sammen med andre B-cellestimuli og i liten grad alene. Løselig ztnf4 fremmer B-celleproliferasjon og Ig-produksjon. Oppregulering av adhesjonsmolekyler, kostimulerende molekyler og aktiveringsreseptorer tyder på en rolle for fremmet APC-funksjon av B-celler.
Figur 4 viser stimulering av humane B-celler fra perifert blod med løselig ztnf4 (25 ng/ml) eller et kontrollprotein (ubikvitin) i nærvær av 10 ng/ml IL-4 i 5 dager in vitro. Renset TACI-Ig, BCMA-Ig eller kontroll-Fc ble analysert for inhibering av løselig ztnf4-spesifikk proliferasjon.
Eksempel 4
Seleksjon av TACI- og BCMA- transformerte BHK- celler ved anvendelse av ztnf4-binding
BHK-celler som uttrykte høyt nivå av TACI-protein, ble selektert ved fortynningskloning av en transfektantporsjon. Transfektante celler (2 x IO<5>) ble inkubert på is i 30 minutter med biotinylert ztnf4 i en konsentrasjon på 1 ug/ml i bindingsbuffer (PBS, 2% BSA, 0,02% NaN3). Cellene ble vasket to ganger med bindingsbuffer og så inkubert med SA-PE (Caltag) (1:1 000 fortynning i bindingsbuffer) på is i 30 minutter. Cellene ble så vasket to ganger med bindingsbuffer, resuspendert i bindingsbuffer og avlest ved FACS (FACS Vantage, Becton Dickinson). Klonene med den høyeste binding av TNF4 selekteres.
BHK-celler som uttrykker høyt nivå av BCMA-protein, ble selektert ved overflatemerking av den BCMA-uttrykkende transfektante porsjon med biotinylert ztnf4. Dette ble fulgt av streptavidin-Phyco-Erythrin (SA-PE Caltag Burlingame, CA) og steril sortering for lyse celler i FL2 i FACS Vantage (Becton Dickinson). Enkeltkoloniene ble så analysert for ztnf4-binding.
Eksempel 5
Vevsfordeling
"Human Multiple Tissue Northern Blots" (MTN I, MTNII og MTN III, Clontech) ble analysert for å bestemme vevsfordelingen av human BR43x2- og TACI-ekspresjon. En PCR-avledet probe på tilnærmet 500 bp (SEKV.ID NR: 21) ble amplifisert ved anvendelse av BR43x2 (SEKV.ID NR: 1) som templat og oligonukleotidene ZC20061 (SEKV.ID NR: 22) og ZC20062 (SEKV.ID NR: 23) som primere. Denne sekvens er identisk med det homologe område i TACI. Amplifiseringen ble utført som følger: 1 syklus bestående av 94 °C i 1,0 minutt, 30 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 60 °C i 30 sekunder og 72 °C i 30 sekunder, fulgt av 1 syklus bestående av 72 °C i 10 minutter. PCR-produktene ble synliggjort ved agarosegelelektroforese, og PCR-produktet på 500 bp ble renset ved anvendelse av et gelekstraksjonssett (Qiagen, Chatsworth, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Proben ble radioaktivt merket ved anvendelse av DNA-merkingssettet "MULTIPRIME" (Amersham, Arlington Heights, IL) ifølge produsentens instruksjoner. Proben ble renset ved anvendelse av en "NUCTRAP" gjennompressingskolonne (Stratagene). "EXPRESSHYB" (Clontech) -løsning ble anvendt for prehybridisering og som hybridiseringsløsning for Northern-blotene. Hybridiseringen fant sted over natten ved 65 °C ved anvendelse av IO<6>cpm/ml merket probe. Blotene ble så vasket med 2X SSC og 0,1% SDS ved romtemperatur, fulgt av to
gangers vask med 0,1X SSC og 0,1% SDS ved 50 °C. Et transkript på tilnærmet 1,5 kb ble påvist i milt, lymfeknute og tynntarm.
"Human Multiple Tissue Northern Blots" (MTN I, MTN II og MTN III, Clontech) ble analysert for å bestemme vevsfordelingen for human BCMA-ekspresjon. En PCR-avledet probe på tilnærmet 257 bp (SEKV.ID NR: 24) ble amplifisert ved anvendelse av Daudi-celle-cDNA som et templat og oligonukleotidene ZC21065 (SEKV.ID NR: 25) og ZC21067 (SEKV.ID NR: 26) som primere. Amplifiseringen ble utført som følger: 1 syklus bestående av 94 °C i 1,0 minutt, 35 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 60 °C i 30 sekunder og 72 °C i 30 sekunder, fulgt av 1 syklus bestående av 72 °C i 10 minutter. PCR-produktene ble synliggjort ved agarosegelelektroforese, og PCR-produktet på 257 bp ble renset ved anvendelse av et gelekstraksjonssett (Qiagen, Chatsworth, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Proben ble radioaktivt merket ved anvendelse av DNA-merkingssettet "MULTIPRIME" (Amersham, Arlington Heights, IL) ifølge produsentens instruksjoner. Proben ble renset ved anvendelse av en "NUCTRAP" gjennompressingskolonne (Stratagene). "EXPRESSHYB" (Clontech) -løsning ble anvendt for prehybridisering og som en hybridiseringsløsning for Northern-blotene. Hybridiseringen fant sted over natten ved 65 °C ved anvendelse av IO<6>cpm/ml merket probe. Blotene ble så vasket med 2X SSC og 0,1% SDS ved romtemperatur, fulgt av to gangers vask med 0,1X SSC og 0,1% SDS ved 50 °C. Et transkript på tilnærmet 1,2 kb ble påvist i mage, tynntarm, lymfeknute, luftrør, milt og testis.
"RNA Master Dot Blots" (Clontech) som inneholdt RNA fra forskjellige vev normalisert relativt til 8 husholdningsgener, ble også analysert med enten TACI-proben (SEKV.ID NR: 21) eller BCMA-proben (SEKV.ID NR: 24) og hybridisert som beskrevet ovenfor. Ekspresjon av BR43x2/TACI ble observert i milt, lymfeknute, tynntarm, mage, spyttkjertel, blindtarm, lunge, benmarg og føtal milt. BCMA-ekspresjon ble påvist i tynntarm, milt, mage, colon, lymfeknute og blindtarm.
"Human Tumor Panel Blot V" (Invitrogen Inc., San Diego, CA) og et humant lymfomblot (Invitrogen) ble analysert som beskrevet ovenfor, enten med en BR43x2/TACI-probe (SEKV.ID NR: 21) eller en BCMA-probe (SEKV.ID NR: 24). Et transkript på 1,5 kb tilsvarende TACI, ble funnet i ikke-Hodgkins lymfom og parotidtumor. Et transkript på 1,2 kb tilsvarende BCMA, ble funnet i adenolymfom, ikke-Hodgkins lymfom og parotidtumor.
Total-RNA fra CD4<+>, CD8<+>, CD19<+>og celler fra en blandet lymfocyttreaksjon ("CellPro", Bothell, WA) ble fremstilt under anvendelse av guanidinisotiocyanat (Chirgwin et al., Biochemistry 78:52-94, 1979), fulgt av et trinn med CsCl-sentrifugering. Poly(A)<+->RNA ble isolert ved anvendelse av oligo d(T)-cellulosekromatografi (Aviv og Leder, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69:1408-12,1972). Northern-blot-analyse ble så utført som følger.
Tilnærmet 2 mg av hvert poly A<+->RNA ble denaturert i 2,2 M formaldehyd/fosfatbuffer (50 mM Na2HP04, 50 mM NaH2P04, 50 mM NaOAc, 1 mM EDTA og 2,2 M formaldehyd) og separert ved elektroforese i 1,5% agarose-minigel (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) i formaldehyd/fosfatbuffer. RNA ble overført over natten til et "Nytran"-filter (Schleicher & Schuell, Keene, NH), og filteret ble UV-kryssbundet (1 200 mJoule) i en "STRATALINKER" UV-kryssbinder (Stratagene Cloning Systems) og så bakt ved 80 °C i 1 time.
Blotene ble analysert med enten en TACI- (SEKV.ID NR: 21) eller BCMA-(SEKV.ID NR: 24) probe. Et bånd på 1,5 kb tilsvarende TACI, ble kun påvist i CD19<+->celler. Et transkript på 1,2 kb tilsvarende BCMA, ble påvist i små mengder i CD8<+->celler, CD19<+->celler og MLR-celler.
Ytterligere Northern-blot-analyser ble utført med blot fremstilt med poly(A)-RNA fra K-562-celler (erytroide, ATCC CCL 243), HUT78-celler (T-celler, ATCC TIB-161), Jurkat-celler (T-celler), DAUDI (Burkitts humane lymfom, Clontech, Palo Alto, CA), RAJI (Burkitts humane lymfom, Clontech) og HL60 (monocytter) som beskrevet ovenfor. Blotene ble analysert med enten en TACI- (SEKV.ID NR: 21) eller BCMA- (SEKV.ID NR: 24) probe. Et transkript på 1,5 kb tilsvarende TACI, ble påvist i Raji-celler. Et transkript på 1,2 kb tilsvarende BCMA, ble påvist i Daudi-celler, Raji-celler og Hut 78-celler.
En PCR-basert analyse ble anvendt for identifisering av vev som uttrykker TACI fra mus eller menneske og BCMA fra menneske. "Human and Murine Rapid-Scan Gene Expression Panels" (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) ble analysert
ifølge produsentens instruksjoner. Oligonukleotidprimerne ZC24200 (SEKV.ID NR: 27) og ZC24201 (SEKV.ID NR: 28) ble utformet for å overspenne en eksonovergang og gi et fragment på 272 bp tilsvarende TACI fra mus. Ekspresjon ble påvist i milt, brissel, lunge, bryst, hjerte, muskel, hud, binyrekjertel, mage, tynntarm, hjerne, ovarier, prostatakjertel og embryo. Ytterligere bånd på tilnærmet 500 og 800 bp ble påvist i mange vev.
Oligonukleotidprimerne ZC24198 (SEKV.ID NR: 29) og ZC24199 (SEKV.ID NR: 30) ble utformet til å overspenne en eksonovergang og gi et fragment på 204 bp tilsvarende humant TACI. Ekspresjon ble påvist i milt, hjerne, hjerte, lever, colon, lunge, tynntarm, muskel, mage, testis, placenta, spyttkjertel, binyrekjertel, bukspyttkjertel, prostata, lymfocytter fra perifert blod og benmarg.
Oligonukleotidprimerne ZC24271 (SEKV.ID NR: 31) og ZC24272 (SEKV.ID NR: 32) ble utformet til å overspenne en eksonovergang og gi et fragment på 329 bp tilsvarende humant BCMA. Ekspresjon ble påvist i hjerne, milt, colon, lunge, tynntarm, mage, ovarier, testis, spyttkjertel, binyrekjertel, prostata, lymfocytter fra perifert blod, benmarg og føtal lever.
Oligonukleotidprimerne ZC24495 (SEKV.ID NR: 33) og ZC24496 (SEKV.ID NR: 34) ble utformet til å overspenne en eksonovergang og gi et fragment på 436 bp tilsvarende BCMA fra mus. Ekspresjon ble påvist i lever.
Eksempel 6
Fremstilling av TACI- Ig- og BCMA- Ig- fusjonsvektorer
lg gammal-Fc4-fragmentkonstruksjon
For fremstilling av TACI-Ig-fusjonsproteinet ble Fc-området fra humant IgGl (hengselsområdet og CH2- og CH3-domenet) modifisert slik at funksjonene som binder Fc-reseptor (FcgRI) og komplement (Clq), var fjernet. Denne modifiserte versjon av humant IgGl-Fe ble betegnet Fc4.
Fc-området ble isolert fra et humant, føtalt leverbibliotek (Clontech) ved PCR med oligonukleotidprimerne ZC10,134 (SEKV.ID NR: 43) og ZC10,135 (SEKV.ID NR: 44). PCR ble anvendt for innføring av mutasjoner i Fc-området for å redusere FcgRI-binding. FcgRI-bindingssetet (Leu-Leu-gly-Gly) ble mutert til Ala-Glu-gly-Ala (aminosyrerestene 38-41 i SEKV.ID NR: 45) ifølge Baum et al. (EMBO J. 73:3992-4001, 1994) for reduksjon av FcRl-binding (Duncan et al., Nature 332:563-4, 1988). Oligonukleotidprimerne ZC 15,345 (SEKV.ID NR: 46) og ZC 15,347 (SEKV.ID NR: 47) ble anvendt for innføring av mutasjonen. Til et sluttvolum på 50 ul ble det tilsatt 570 ng IgFc-templat, 5 ul 10X Pfu reaksjonsbuffer (Stratagene), 8 ul 1,25 mM dNTP, 31 ul dH20, 2 ul 20 mM ZC15,345 (SEKV.ID NR: 46) og ZC15,347 (SEKV.ID NR: 47). Et likt volum mineralolje ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 94 °C i 1 minutt. Pfu-polymerase (2,5 enheter, Stratagene) ble tilsatt, fulgt av 25 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 72 °C i 1 minutt, fulgt av en forlengelsesreaksjon på 7 minutter ved 72 °C. Reaksjonsproduktene ble fraksjonert ved elektroforese, og båndet tilsvarende den forventede størrelse på tilnærmet 676 bp, ble påvist. Bandet ble utkuttet fra gelen og gjenvunnet ved anvendelse av gelekstraksjonssettet QIAGEN "QIAquick" (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner.
PCR ble også anvendt for innføring av en mutasjon fra Ala til Ser (aminosyrerest 134 i SEKV.ID NR: 45) og Pro til Ser (aminosyrerest 135 i SEKV.ID NR: 45) for reduksjon av komplement-Clq-binding og/eller komplementfiksering (Duncan og Winter, Nature 332:788,1988) og stoppkodonet TAA. To førsterundereaksjoner ble utført ved anvendelse av FcyRI-bindingssetemutert IgFc-sekvens som templat. Til et sluttvolum på 50 ul ble det tilsatt 1 (il FcyRI-bindingssetemutert IgFc-templat, 5 ul 10X Rfu reaksjonsbuffer (Stratagene), 8 ul 1,25 mM dNTP, 31 ul dH20, 2 ul 20 mM ZC 15,517 (SEKV.ID NR: 48), en 5'-primer med begynnelse ved nukleotid 26 i SEKV.ID NR: 45, og 2 ul 20 mM ZC15,530 (SEKV.ID NR: 49), en 3'-primer med begynnelse ved den komplementære base til nukleotid 405 i SEKV.ID NR: 45. Den andre reaksjonen inneholdt 2 (il hver av 20 mM lagerløsninger av oligonukleotidprimerne ZC 15,518
(SEKV.ID NR: 50), en 5'-primer, med begynnelse ved nukleotid 388 i SEKV.ID NR: 45, og ZC 15,347 (SEKV.ID NR: 47), en 3'-primer, for innføring av Ala til Ser-mutasjonen, et Xba I-restriksjonssete og et stoppkodon. Et likt volum mineralolje ble tilsatt, og reaksjonsblandingene ble oppvarmet til 94 °C i 1 minutt. Pfu-polymerase (2,5 enheter, Stratagene) ble tilsatt, fulgt av 25 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 72 °C i 2 minutter, fulgt av en forlengelsesreaksjon på 7 minutter ved 72 °C. Reaksjonsproduktene ble fraksjonert ved elektroforese, og bånd tilsvarende de forventede størrelser på tilnærmet 370 og tilnærmet 395 bp ble påvist. Båndene ble utkuttet fra gelen og ekstrahert ved anvendelse av gelekstraksjonssetet QIAGEN "QIAquick" (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. En andre rundes reaksjon ble utført for sammenkobling av fragmentene ovenfor og innføring av det 5' Barn HI-restriksjonssete. Til et sluttvolum på 50 ul ble det tilsatt 30 |xl dH20, 8 ul 1,25 mM dNTP, 5 (il 10X Pfu polymerasere-aksjonsbuffer (Stratagene) og 1 (il av hver av de to første PCR-produktene. Et likt volum mineralolje ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 94 °C i 1 minutt. Pfu-polymerase (2,5 enheter, Stratagene) ble tilsatt, fulgt av 5 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 72 °C i 2 minutter. Temperaturen ble igjen brakt til 94 °C, og 2 (il av hver av 20 mM lagerløsninger av ZC15,516 (SEKV.ID NR: 51), en 5'-primer, med begynnelse ved nukleotid 1 i SEKV.ID NR: 45, og ZC 15,347 (SEKV.ID NR: 47) ble tilsatt, fulgt av 25 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 55 °C i 30 sekunder og 72 °C i 2 minutter, og en avsluttende forlengelsesreaksjon på 7 minutter ved 72 °C. Et uttak av reaksjonsblandingen ble analysert ved gelelektroforese. Et bånd på 789 bp som tilsvarte den forventede størrelse, ble påvist.
Konstruksjon av ekspresjonsvektor for TACI-Fc4 og BCMA-Fc4
Ekspresjonsplasmider som inneholdt TACI-Fc4- og BCMA-Fc4-fusjonsproteiner, ble konstruert ved homolog rekombinasjon i gjær. Et fragment av TACI-cDNA som omfattet polynukleotidsekvensen fra nukleotid 15 til nukleotid 475 i SEKV.ID NR: 5, ble isolert ved anvendelse av PCR. De to primerne som ble anvendt for fremstilling av TACI-fragmentet, var: (1) en primer som inneholdt 40 bp av den 5-flankerende vektorsekvens og 17 bp tilsvarende aminoenden av TACI-fragmentet (SEKV.ID NR: 52), (2) 40 bp av den 3' ende tilsvarende den flankerende Fc4-sekvens og 17 bp tilsvarende karboksylenden av TACI-fragmentet (SEKV.ID NR: 53). Til et sluttvolum på 100 ul ble det tilsatt 10 ng TACI-templat, 10 ul 10X Taq-polymerase-reaksjonsbuffer (Perkin Eimer), 8 (il 2,5 nM dNTP, 78 (il dH20, 2 ul av hver av 20 mM lagerløsninger av oligonukleotidprimerne SEKV.ID NR: 52 og SEKV.ID NR: 53, og Taq-polymerase (2,5 enheter, Life Technology). Et likt volum mineralolje ble tilsatt, og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 94 °C i 2 minutter, fulgt av 25 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 65 °C i 30 sekunder, 65 °C i 30 sekunder og 72 °C i 1 minutt, fulgt av en forlengelsesreaksjon på 5 minutter ved 72 °C.
Et fragment av BCMA-cDNA som omfatter polynukleotidsekvensen fra nukleotid 219 til nukleotid 362 i SEKV.ID NR: 7, ble isolert ved anvendelse av PCR. De to primere som ble anvendt for fremstilling av BCMA-fragmentet, var en oligonukleotidprimer som inneholdt 40 bp av den 5-flankerende vektorsekvens og 17 bp tilsvarende aminoenden av BCMA-fragmentet (SEKV.ID NR: 54), og en oligonukleotidprimer som inneholdt 40 bp av den 3' ende tilsvarende den flankerende Fc4-sekvens og 17 bp tilsvarende karboksylenden av BCMA-fragmentet (SEKV.ID NR: 55). Til et sluttvolum på 100 ul ble det tilsatt 10 ng BCMA-templat, 10 ul 10X Taq-polymerase-reaksjonsbuffer (Perkin Eimer), 8 ul 2,5 mM dNTP, 78 ul H20, 2 ul av hver av 20 mM lagerløsninger av oligonukleotidprimerne SEKV.ID NR: 54 og SEKV.ID NR: 55. Et likt volum mineralolje ble tilsatt og reaksjonsblandingen oppvarmet til 94 °C i 2 minutter, fulgt av 25 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 65 °C i 30 sekunder og 72 °C i 1 minutt, fulgt av en forlengelsesreaksjon på 5 minutter ved 72 °C.
Fragmentet som inneholdt cDNA som kodet for Fc4-fragmentet, ble konstruert på tilsvarende måte, ett for hver av TACI- og BCMA-fusjonskonstruksjonene. For TACI var de to primerne som ble anvendt for fremstilling av Fc4-fragmentet (oppstrøms og nedstrøms), en oligonukleotidprimer som inneholdt 40 bp av den 5'-flankerende TACI-sekvens og 17 bp tilsvarende aminoenden av Fc4-fragmentet (SEKV.ID NR: 56) og en oligonukleotidprimer som inneholdt 40 bp av den 3' ende tilsvarende den flankerende vektorsekvens og 17 bp tilsvarende karboksylenden av Fc4-fragmentet (SEKV.ID NR: 57). For BCMA var oppstrømsprimeren for fremstilling av Fc4-fragmentet en oligonukleotidprimer som inneholdt 40 bp av den 5-flankerende BCMA-sekvens og 17 bp tilsvarende aminoenden av Fc4-fragmentet (SEKV.ID NR: 58). Nedstrømsprimeren for Fc4 fra BCMA-konstruksjonen var den samme som beskrevet ovenfor for TACI-Fc4 (SEKV.ID NR: 57).
Til et sluttvolum på 100 (il ble det tilsatt 10 ng Fc4-templat beskrevet ovenfor, 10 ul 10X Taq-polymerase-reaksjonsbuffer (Perkin-Elmer), 8 (il 2,5 nM dNTP, 78 (il dH20,2 (il av hver av 20 mM lagerløsninger av oligonukleotidene SEKV.ID NR: 56 og SEKV.ID NR: 57 for TACI og oligonukleotidene SEKV.ID NR: 58 og SEKV.ID NR: 57 for BCMA, og Taq-polymerase (2,5 enheter, Life Technology). Et likt volum mineralolje ble tilsatt og reaksjonsblandingen oppvarmet til 94 °C i 2 minutter, fulgt av 25 sykluser bestående av 94 °C i 30 sekunder, 65 °C i 30 sekunder og 72 °C i 1 minutt, fulgt av en forlengelsesreaksjon på 5 minutter ved 72 °C. 10 (il av hver av PCR-reaksj onene på 100 (il beskrevet ovenfor, ble fraksjonert i en 0,8% LMP agarosegel ("Seaplaque GTG") med 1 x TBE-buffer for analyse. De gjenværende 90 (il av hver PCR-reaksjon ble utfelt ved tilsetning av 5 (il 1 M NaCl og 250 ul absolutt etanol. Plasmid pZMP6 ble kuttet med Smal for linearisering i polylinkeren. Plasmid pZMP6 var avledet fra plasmidet pCZR199 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, ATCC nr. 98668) og er en pattedyrekspresjonsvektor som inneholder en ekspresjonsvektor med den umiddelbart tidlige promoter fra CMV, et konsensusintron fra det variable område fra lokus for immunglobulintungkjede i mus, flere restriksjonsseter for innsetting av kodende sekvenser, et stoppkodon og en terminator fra humant veksthormon. Plasmidet har også et replikasjonsorigo fra E. coli, en ekspresjonsenhet for en pattedyrseleksjonsmarkør med en SV40-promoter, -enhancer og replikasjonsorigo, et DHFR-gen og SV40-terminatoren. Vektor pZMP6 ble konstruert fra pCZR199 ved å erstatte metallotioneinpromoteren med den umiddelbart tidlige promoter fra CMV og Kozac-sekvensene i den 5' ende av den åpne leseramme. 100 (il kompetente gjærceller (5. cerevisiae) ble blandet med 10 (il inneholdende tilnærmet 1 ug av hver av PCR-fragmentene fra det ekstracellulære domene i TACI eller BCMA og Fc4, egnede for rekombinasjon, og 100 ng Smal-kuttet pZMP6-vektor og overført til en 0,2 cm elektroporeringskyvette. Gjær/DNA-blandingene ble elektroporert ved 0,75 kV (5 kV/cm), oo ohm, 25 uF. Hver kyvette ble tilsatt 600 ul 1,2 M sorbitol, og gjærcellene ble utsådd i to porsjoner på 300 ul på URA-D-skåler og inkubert ved 30 °C. Etter tilnærmet 48 timer ble Ura<+->gjærtransformantene fra en enkeltskål resuspendert i 1 ml H20 og sentrifugert i kort tid for nedsentrifugering av gjærcellene. Nedsentrifugerte celler ble resuspendert i 1 ml lyseringsbuffer (2% "Triton X-100", 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). 500 [il lyseringsblanding ble overført til et Eppendorf-rør inneholdende 300 ul syrevaskede glasskuler og 200 ul fenol-kloroform, vorteksristet to eller tre ganger med 1 minutts mellomrom og så sentrifugert i 5 minutter i en Eppendorf-sentrifuge ved maksimal hastighet. 300 ul av vannfasen ble overført til et nytt rør og DNA utfelt med 600 ul etanol (EtOH), fulgt av sentrifugering i 10 minutter ved 4 °C. Nedsentrifugert DNA ble resuspendert i 100 (il H20.
Transformasjon av elektrokompetente E. co/z-celler (DH10B, GibcoBRL) ble utført med 0,5-2 ml gjær-DNA-preparat og 40 (il DHlOB-celler. Cellene ble
elektroporert ved 2,0 kV, 25 mF og 400 ohm. Etter elektroporeringen ble 1 ml SOC (2% baktotrypton (Difco, Detroit, MI), 0,5% gjærekstrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10 mM MgCl2,10 mM MgS04,20 mM glukose) utsådd i porsjoner på 250 ul på fire LB-AMP-skåler (LB-medium (Lennox), 1,8% baktoagar (Difco), 100 mg/l ampicillin).
Enkeltkloner som inneholdt den korrekte ekspresjonskonstruksjon for TACI-Fc4 eller BCMA-Fc4, ble identifisert ved restriksjonskutting for å bekrefte nærvær av innskuddet og bekrefte at de forskjellige DNA-sekvensene var korrekt sammenkoblet. Innskuddet i positive kloner ble sekvensert. Plasmid-DNA i større skala isoleres ved anvendelse av settet "Qiagen Maxi" (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner.
Eksempel 7
Ekspresjon i pattedyr av TACI- Fc4 og BCMA- Fc4
BHK 570-celler (ATCC nr. CRL-10314) ble utsådd i 10 cm vevs-dyrkningsskåler og dyrket til tilnærmet 50 til 70% konfluens over natten ved 37 °C, 5% C02, i DMEM/FBS-medium (DMEM, Gibco/BRL High Glucose (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% føtalt, bovint serum (Hyclone, Logan, UT), 1 mM L-glutamin (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM natriumpyruvat (Gibco BRL)). Cellene ble så transfektert med enten plasmidet TACI-Fc4/pZMP6 eller BCMA-Fc4/pZMP6 ved anvendelse av "Lipofectamine" (Gibco BRL), i serumfritt (SF) mediumpreparat (DMEM, 10 mg/ml transferrin, 5 mg/ml insulin, 2 mg/ml fetuin, 1% L-glutamin og 1% natriumpyruvat). TACI-Fc4/pZMP6 eller BCMA-Fc4/pZMP6 ble fortynnet i 15 ml rør til et sluttvolum på 640 ul med SF-medium. 35 ul "Lipofectamine" (Gibco BRL) ble blandet med 605 ul SF-medium. "Lipofectamine"-blanding ble tilsatt til DNA-blandingen og inkubert i tilnærmet 30 minutter ved romtemperatur. 5 ml SF-medium ble tilsatt til DNA:"Lipofectamine"-blandingen. Cellene ble vasket én gang med 5 ml SF-medium, mediet ble avsugd, og DNA:"Lipofectamine"-blandingen tilsettes. Cellene ble inkubert ved 37 °C i 5 timer, hvoretter 6,4 ml DMEM/10% FBS, 1% PSN-medium ble tilsatt til hver skål. Skålene ble inkubert ved 37 °C over natten, og DNA:"Lipofectamine"-blandingen ble erstattet med friskt 5% FBS/DMEM-medium neste dag. På dag 5 etter transfeksjonen ble cellene splittet i T-162-flasker i seleksjonsmedium (DMEM/5% FBS, 1% L-GLU, 1% NaPyr). Tilnærmet 10 dager etter transfeksjonen ble to 150 mm dyrkningsskåler med metotreksatresistente kolonier fra hver transfeksjon trypsin-behandlet, og cellene slås sammen og utsås i en T-162-flaske og overføres til dyrking i stor skala.
Eksempel 9
Transgen ekspresjon av ztnf4
Transgene dyr som uttrykker ztnf4-gener, ble fremstilt ved anvendelse av voksne, fruktbare hanner (B6C3fl), fruktbare hunner som ikke hadde nådd pubertetsalderen (B6C3fl), vasektomiserte hanner (B6D2fl) og voksne fertile hunner (B6D2fl)
(alle fra Taconic Farms, Germantown, NY). De fertile hunnene som ikke hadde nådd pubertetsalderen, ble superovulert ved anvendelse av gonadotropin fra drektig hoppe (Sigma, St. Louis, MO) og humant korion-gonadotropin (hCG (Sigma)). De super-ovulerte hunnene ble deretter paret med voksne, fertile hanner, og kopulasjon ble bekreftet ved nærvær av vaginalpropper.
Befruktede egg ble oppsamlet under et kirurgisk mikroskop (Leica MZ12 stereomikroskop, Leica, Wetzlar, Tyskland). Eggene ble så vasket med hyaluronidase og Whittens W640-medium (tabell 8, alle reagenser tilgjengelige fra Sigma Chemical Co.) som på forhånd var inkubert med 5% C02, 5% 02og 90% N2ved 37 °C. Eggene ble lagret i en 37 °C/5% C02-inkubator inntil mikroinjeksjonen ble utført.
Den åpne leseramme på 858 bp som koder for fullengde, human TACI-ligand Blys (SEKV.ID NR: 35), ble amplifisert ved PCR slik at det ble innført et optimalisert initieringskodon og flankerende 5' Pmel- og 3' Ascl-seter ved anvendelse av oligonukleotidprimerne ifølge SEKV.ID NR: 36 og SEKV.ID NR: 37. Dette Pmel/Ascl-fragment ble subklonet i pKF024, en B- og/eller T-cellebegrenset, transgen vektor som inneholder lg Em-enhanceren (690 bp Notl/Xbal fra pEmSR, (Bodrug et al., EMBO J. 73:2124-30,1994), lg Vh-promoteren (536 bp HincII/XhoI-fragment fra pJHlX(-), Hu et al., J. Exp. Med. 777:1681-90,1993), SV40 16S-intronet (171 bp XhoI/Hindlll-fragment fra pEmSR), en Pmel/AscI-polylinker, og polyadenyleringssignalet fra humant vekst-hormongen (627 bp Smal/EcoRI-fragment, Seeburg, DNA 7:239-49, 1982). Det transgene innskudd ble separert fra plastmidryggraden ved Notl-kutting og agarosegel-rensing, og fertiliserte egg fra paringer av B6C3FlTac-mus beskrevet ovenfor, ble mikroinjisert og implantert i pseudodrektige hunner, i det vesentlige som beskrevet tidligere (Malik et al., Molec. Cell. Biol. 75:2349-58,1995).
Mottakerne ble tilbakeført til bur parvis og gitt 19-21 dagers drektighetstid. Etter fødselen lot man det gå 19-21 dager postpartum før kjønnsbestemmelse og avvenning, og en biopsi på 0,5 cm (anvendt for genotyping) ble kuttet av halen med rene sakser.
Genomisk DNA ble fremstilt fra halestumpene ved anvendelse av et kommersielt tilgjengelig sett ("DNeasy 96 Tissue Kit", Qiagen, Valencia, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Genomisk DNA ble analysert ved PCR med primere utformet for den humane veksthormon (hGH)-3'-UTR-delen av den transgene vektor. Primerne ZC17251 (SEKV.ID NR: 38) og ZC17252 (SEKV.ID NR: 39) amplifiserer et fragment på 368 basepar fra hGH. Anvendelse av et område som er unikt for den humane sekvens (identifisert fra en oppstilling av 3'-UTR-DNA-sekvenser fra veksthormon fra menneske og mus), sikret at PCR-reaksjonen ikke amplifiserte musesekvensen. I tillegg kan primerne ZC17156 (SEKV.ID NR: 40) og ZC17157 (SEKV.ID NR: 41) som hybridiserer til vektorsekvenser og amplifiserer cDNA-innskuddet, anvendes sammen med hGH-primerne. I disse eksperimenter ga DNA fra dyr som var positive for transgenet, to bånd, et bånd på 368 bp som tilsvarer 3'-UTR-rfagmentet fra hGH, og et bånd med variabel størrelse som tilsvarer cDNA-innskuddet.
Etter at dyrene ble bekreftet å være transgene (TG), tilbakekrysses de til en innavlet stamme ved å plassere en TG-hunn sammen med en villtypehann eller en TG-hann sammen med én eller to villtypehunner. Etter hvert som unger ble født og avvendt, ble kjønnene separert og halen avkuttet for genotyping.
For å kontrollere for ekspresjon av et transgen i et levende dyr utføres en overlevelsesbiopsi. Analyse av mRNA-ekspresjonsnivået for hvert transgen ble utført ved anvendelse av en RNA-hybridiseringsanalyse i løsning eller samtids-PCR i en "ABI Prism 7700" (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) ifølge produsentens instruksjoner.
Cellefremstilling og "flow"-cytometri
Utgangsmusene ble analysert på forskjellige alderstrinn. For "flow"-cytometrisk (FACS) analyse av lymfevev ble benmarg (BM)-celler isolert fra femur og tibia ved forsiktig oppbrytning i fosfatbufret saltvann (PBS) med en morter og pestill. Cellene ble resuspendert, befridd for benfragmenter ved passiv sedimentering og nedsentrifugert ved 1 000 x g. Splenocytter, tymocytter eller lymfeknuteceller ble erholdt ved å knuse intakte vev mellom objektglass og resuspendering og nedsentrifugering av cellene som for BM. Cellene ble resuspendert i FACS-vaskebuffer (FACS WB) (Hanks balanserte saltløsning, 1% BSA, 10 mM Hepes, pH 7,4) ved en konsentrasjon på 20 x IO<6>celler/ml før farging. For fargingen ble 1 x IO<6>celler overført til 5 ml rør og vasket med 1 ml FACS WB, og så nedsentrifugert ved 1 000 x g. Cellene ble så inkubert på is i 20 minutter i nærvær av mettende mengder av egnede FITC-, PE- og/eller TriColor(TC)-konjugerte mAb i et totalvolum på 100 ml i FACS WB. Cellene ble vasket med 1,5 ml WB og nedsentrifugert, og så resuspendert i 400 ml WB og analysert i et "FACSCalibur" "flow"-cytometer ved anvendelse av programvaren "CellQuest" (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Detektorer for lysspredning forover (FSC) og sidelengs (SSC) ble justert til lineær skala, mens logaritmiske detektorer ble benyttet for de tre fluores-censkanalene (FL-1, FL-2 og FL-3).
Kompensering for spektrumoverlapp mellom FL-kanalene ble utført for hvert eksperiment ved anvendelse av cellepopulasjoner farget med en enkelt farge. Alle celler ble oppsamlet uten sortering til skåler, og resultatene ble analysert ved anvendelse av programvaren "CellQuest". RBC og døde celler ble ekskludert fra elektronisk sorterte verdier basert på FSC- relativt til SSC-profilene.
Antistoffer
Fluoresceinisotiocyanat (FITC)-konjugert, monoklonalt anti-CD8-antistoff (mAb) (klon 53-6.7) og fykoerytrin (PE)-konjugert anti-CD4 (klon RM4-5), anti-CD5 (klon 53-7.3), anti-CD19 (klon 1D3) og antisyndekan (klon 281-2) mAb ble erholdt fra PharMingen (San Diego, CA). TriColor(TC)-konjugert anti-CD45Px/B220 mAb (klon RA3-6B2) ble erholdt fra Caltag.
Transgene mus som overuttrykker ztnf4 i lymfevevene, utvikler forhøyet
antall perifere B-celler, forhøyet antall plasmaceller og forhøyet nivå av immunglobulin i serum. Disse transgene dyrene har et økt antall B200<+->celler i milt, lymfeknute og brissel. Det økte antall B-celler i milten omfatter både konvensjonelle B-2-celler og den normalt sjeldne populasjon av B-l-celler. Generelt er B-l-celler hovedsakelig begrenset til
bukhule og andre hulrom i kroppen, de produserer selvreaktive antistoffer med lav affinitet og er ofte blitt assosiert med utvikling av autoimmune sykdommer som systemisk lupus erythematosus, SLE.
Eldre transgene dyr produserer autoantistoffer og utvikler proteinuri og sklerotiske glomeruli som er typiske for systemisk lupus erythematosus.
Figur 5 A viser enkeltcellesuspensjoner fra milt (toppfeltet), mesenterisk
lymfeknute (midtre felt) og benmarg (nedre felt) fremstilt som beskrevet nedenfor, farget med anti-B220-TC og analysert ved "flow"-cytometri. Antall B220<+->celler i hvert vev ble beregnet ved å multiplisere prosentantallet av B220<+->celler med det totale antall levende (trypan blue-ekskluderende) celler tellet i et hemocytometer. Hver søyle representerer verdier fra ztnf4-transgene (Tg, skraverte søyler) eller ikke-TG (åpne søyler) kontrollmus fra samme kull.
Figur 5B viser celler isolert fra ztnf4-TG (høyre felter) eller ikke-TG-mus fra samme kull (venstre felter), lymfeknute (øvre rad), milt (midtre rad) og brissel (nedre rad) ble farget med mAb mot de angitte molekyler (DC5, CD4 og CD8) og så analysert ved "flow"-cytometri. De viste resultater ble sortert for å ekskludere døde celler og RBC. Figur 5C viser det totale nivå av IgG, IgM og IgE i serum fra ztnf4-transgene mus i aldersområdet fra 6 til 23 uker. Figur 5D viser amyloid deponering og fortykket mesangium i glomeruli påvist i H&E-fargede nyresnitt fra ztnf4-transgene mus, sammenlignet med normale glomeruli fra kontrolldyr fra samme kull. Figur 5E viser økt antall effektor-T-celler i ztnf4-transgene mus tilsvarende det rapportert av Mackay et al. (J. Exp. Med. 790:1697-1710, 1999).
Løselige TACI(BR43x2)- eller BCMA-Ig-fusjoner injiseres (IP, IM eller IV) i ztnf4-overuttrykkende transgene dyr. "Flow"-cytometrisk (FACS) analyse av lymfevev vil anvendes for påvisning av eventuelle endringer av antall B220<+->B-celler i milt, lymfeknute og brissel.
Eksempel 10
Pirektebindende ELISA
En direktebindende ELISA ble utviklet for å karakterisere evnen til enten løselig TACI-Ig eller løselig BCMA-Ig til å bindes til og inhibere den biologiske aktivitet av ztnfr4 in vitro.
En 96-brønners plate ble belagt med 1 ug/ml geit-anti-human lg (Jackson Labs, Bar Harbor, MA) i ELISA A-buffer (0,1 M Na2HC03, pH 9,6, 0,02% NaN3) og inkubert over natten ved 4 °C. TACI, BCMA og en ubeslektet TNF-reseptor, f.eks. ztnfrlO (SEKV.ID NR: 42) som kontroll ble titrert fra 10 ug/ml via 5 gangers fortynninger til 320 ng/ml pluss en nullprøve og ko-inkubert med 2,5, 0,5 eller 0,1 |ig/ml biotinylert ztnf4 eller ovalbumin som negativ kontroll og inkubert 1 time ved romtemperatur.
Den ko-inkuberte, reseptor-biotinylerte ligandblanding ble så tilsatt til 96-brønnersplatene belagt med anti-humant lg fra geit. Platene ble så vasket (ELISA C, 500 (il "Tween 20" (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 200 mg NaN3, PBS til et sluttvolum på 1 liter) og blokkert med "Superblock" (Pierce, Rockford, IL). Platene ble så inkubert ved 37 °C i 2 timer.
Platene vaskes igjen med ELISA C, fulgt av tilsetning av 100 ul/brønn av neutr-avidin-HRP fort. 1:10 000 i ELISA B (5 eller 10 ug BSA (Sigma) for 1% hhv. 2% BSA, 250 (il "Tween 20" (Sigma), 100 mg NaN3, fosfatbufret saltvann pH 7,2 (PBS, Sigma) til et sluttvolum på 500 ml. Alternativt kan bufferen fremstilles som 1% eller 2% BSA i ELISA C-buffer). Platene fremkalles så med OPD i 10 minutter ved romtemperatur og avleses ved 492 nm.
Eksempel 11
Analyse av biologisk aktivitet
En biologisk aktivitetsanalyse ble utviklet for å måle inhibering ved løselig TACI-FC av stimulering av humane B-celler med løselig ztnf4. B-celler ble isolert fra mononukleære celler fra perifert blod (PBMNC) ved anvendelse av CD19-magnetiske kuler og det magnetiske separasjonssystem "VarioMacs" (Miltenyi Biotec Auburn, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Rensede B-celler ble blandet med løselig ztnf4 (25 ng/ml) og rekombinant, humant IL-4 (10 ng/ml Pharmingen) og utsådd (in triplo) i 96-brønners plater med rund bunn med 1 x IO<5>celler pr. brønn.
Løselig TACI-FC ble fortynnet fra 5 ug/ml til 6 ng/ml og inkubert med B-cellene i 5 dager, fulgt av pulsmerking over natten på dag 4 med 1 uCi<3>H-tymidin (Amersham) pr. brønn. Som kontroll ble løselig TACI-FC også inkubert med B-celler og IL-4 uten nærvær av ztnf4.
Platene ble høstet ved anvendelse av en Packard platehøster og analysert ved anvendelse av Packard-leseren. Den løselige TACI-Ig-reseptor inhiberte evnen til løselig ztnf4 til å stimulere B-celleproliferasjon in vitro på en doseavhengig måte. Et 10 gangers molart overskudd av TACI-Ig inhiberte fullstendig proliferasjonen av humane B-celler som respons på løselig ztnf4 i nærvær av IL-4.
Eksempel 12
" ORIGIN"- analvse
Nivået av ztnf4 i individer med en sykdomstilstand (f.eks. SLE eller reumatoid artritt) relativt til normale individer ble bestemt ved anvendelse av en elektrokjemiluminescensanalyse. En standardkurve fremstilt fra løselig, humant ztnf4 ved 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml og 0 ng/ml, ble fremstilt i "ORIGIN"-buffer (Igen, Gaithersburg, MD). Serumprøver ble fortynnet i "ORIGIN"-buffer. Standarder og prøver ble inkubert ved romtemperatur i 2 timer med biotinylert anti-humant ztnf4-NF BV-antistoff fra kanin, fortynnet til 1 ug/ml i "Origin Assay Buffer" (IGEN) og rutenylert polyklonalt anti-humant ztnf4-NF BV-antistoff fra kanin, fortynnet til 1 ug/ml i "Origin Assay Buffer" (IGEN). Etter inkubasjonen ble prøvene omristet, og 0,4 mg/ml streptavidin-"Dynabeads" (Dynal, Oslo, Norge) ble tilsatt til både standarder og prøver med 50 ul/rør og inkubert i 30 minutter ved romtemperatur. Prøvene ble så vorteksert og avlest i en "Origin Analyzer" (Igen) ifølge produsentens instruksjoner. "Origin"-analysen er basert på elektrokjemiluminescens og gir en avlesning i ECL - hva er dette, hvordan virker det og hva forteller det deg.
Et forhøyet nivå av zthf4 ble påvist i serumprøver fra både NZBWF1/J- og MRL/Mpj-Fas<lpr->mus som har nådd svært utviklede stadier av glomerulonefritt, og autoimmun sykdom.
Eksempel 13
Løselig TACI- Ig i en spontan modell for SLE
NZBW-mus får symptomer på spontan SLE ved en alder på tilnærmet 7-9 måneder. TACI-Fc ble tilført til NZBW-mus for å måle den supprimerende virkning på
B-celler over det tidsrom på 5 uker hvor den gjennomsnittlige B-celle-autoantistoffproduksjon antas å være på et høyt nivå i NZBW-mus.
Ett hundre 8 uker gamle (NZB x NZW)Frhunnmus (Jackson Labs) ble oppdelt i 6 grupper på 15 mus. Før behandlingen ble musene undersøkt én gang i måneden for protein i urinen, og blod ble tappet for CBC og serumlagring. Serum vil analyseres for nærvær av autoantistoffer. Da proteinuri er et typisk tegn på glomerulonefritt, ble proteinnivået i urinen målt med "dipsticks" ved jevne mellomrom over undersøkelsens varighet. Før behandlingen ble dyrene veid. Doseringen ble innledet da musene var tilnærmet 5 måneder gamle. Musene ble gitt intraperitoneale injeksjoner av bærerstoff alene (PBS), humant IgG-FC (kontrollprotein) eller TACI-FC4 (analyseprotein) tre ganger i uken i 5 uker.
Blod ble oppsamlet to ganger under doseringen og vil oppsamles minst to ganger etter doseringen. "Dipstick"-urinverdier for proteinuri og kroppsvekt ble målt annenhver uke etter innledet dosering. Blod, "dipstick"-urinverdier og kroppsvekt ble målt på avlivningstidspunktet. Vekten av milt, brissel, lever med galleblære, venstre nyre og hjerne ble målt. Milt og brissel ble oppdelt for FACS-analyse og histologisk analyse. Submandibulære spyttkjertler, den mesenteriske lymfeknutekjede, leverlapper med galleblære, cecum og tykktarm, mage, tynntarm, bukspyttkjertel, høyre nyre, binyrekjertelen, tunge med luftrør og spiserør, hjerte og lunger vil også oppsamles for histologisk analyse.
Figur 6 viser et forhøyet nivå av ztnf4 i serum fra NZBWF1- og MRL/lpr/lpr-mus som korrelerer med utviklingen av SLE. Figur 6A, øvre felt, viser korrelasjonen mellom serumnivå av ztnf4 og alder, 68 NZBWFl-mus i aldersområdet fra 10 til 40 uker og 10 uker og 30 uker gamle NZB/B-kontrollmus. Midtre felt viser korrelasjonen med proteinuri i tre områder, spormengder til 20 mg/dl (T-30), 100-300 ng/dl og 2 000 mg/dl i NZBWFl-mus sammenlignet med NZB/B-kontrollmus. Nedre felt viser ztnf4-nivåer ved forskjellige titere av anti-ds-DNA-antistoff i NZBWFl-mus, sammenlignet med NZB/B-kontrollmus. Figur 6B viser de samme korrelasjoner utført på 23 MRL/lpr/lpr-mus i aldersområdet fra 18 til 24 uker og ti 11 uker gamle MRL/MpJ-kontrollmus. Figur 7 viser urinanalyseresultater. Mus ble ansett å ha proteinuri dersom "dipstick"-avlesningen var >100 mg/dl. (A) PBS, (B) humant IgG FC, 100 mg, (C) humant IgG FC, 20 mg, (D) humant TACI-IgG, 100 mg, og (E) humant TACI-IgG, 20 mg. Mus behandlet med den løselige TACI-IgG-fusjon viste redusert proteinuri.
Analyse av perifert blod fra behandlede dyr viste at antall hvite blodceller og lymfocytter var redusert i TACI-FC-behandlede mus (20 og 100 mg), sammenlignet med FC (20 og 100 mg)- og PBS-behandlede mus to uker etter innledet behandling. FAC-analyse (lymfocyttporten) av perifert blod tappet seks uker etter innledet behandling (to uker etter tilførsel av siste behandling) viste en dramatisk reduksjon i prosent B-celler som forelå i prøvene. B-cellenivåene var fortsatt nedgående fem uker etter tilførsel av siste behandling, men ikke like dramatisk. Tabell 9 gir gjennomsnittsverdier (og standardavvik) for musene i hver behandlingsgruppe (tabell 9). Redusert prosentantall B-celler i perifert blod ble også observert to uker inn i behandlingen.
Eksempel 14
Løselig TACI- Ig i normale mus
TACI-FC ble tilført til Balb/C-mus for å undersøke virkningen på normale mus. Seksti 8 uker gamle Balb/C-hunnmus (HSD) ble inndelt i 12 grupper på 5 mus. Før behandlingen ble musene veid, og blod ble tappet for CBC og serumlagring. Gruppene 1-9 ble gitt intraperitoneale injeksjoner (IP) av bærerstoff alene (PBS), humant IgG-FC
(kontrollprotein) eller TACI-FC4 (analyseprotein) daglig i 12 dager og ble avlivet på dag
14. Gruppene 10 og 11 ble gitt IP-injeksjoner tre ganger i uken i to uker og ble avlivet på dag 14.
Blod ble oppsamlet på dagene 7 og 12. Blod og kroppsvekt ble oppsamlet på avlivningstidspunktet. Vekten av milt, brissel og hjerne ble målt. Milt og brissel ble oppdelt for FACS-analyse og histologisk undersøkelse. Hud, milt, den mesenteriske LN-kjede, submandibulære spyttkjertler, ovarier, uterus, cervix, urinblære, den mesenteriske lymfeknutekjede, leverlapper med galleblære, cecum og tykktarm, mage, tynntarm, bukspyttkjertel, høyre nyre, binyrekjertelen, tunge med luftrør og spiserør, hjerte, brissel, lårmuskel, venstre og høyre femur og hjerne vil også oppsamles for histologisk undersøkelse.
Som beskrevet ovenfor i eksempel 13, ble en signifikant reduksjon av prosent B-celler observert på dagene 7 (ved CBC) og 12 (ved anvendelse av FACS) i celler fra perifert blod tappet fra alle TACI-FC4-behandlede prøver, sammenlignet med dyrene behandlet med FC4 eller PBS alene og analysert ved CBC eller FACS. I tillegg var det en nesten 50% reduksjon av B-celler i milt fra dyrene behandlet med TACI-FC4, sammenlignet med milt fra FC4-behandlede mus på dag 14.
Eksempel 15
Anti- dsDNA- ELISA
Autoimmunitet særpreges ved høyt nivå av antistoffer rettet mot dobbelttrådet DNA. For å måle nivået av anti-dsDNA-antistoffer både i ztnf4-overuttrykkende transgene mus og i NZBW-mus ble en ELISA-analyse utviklet. En 96-brønners mikro-titerplate (Nunc) ble belagt med poly-L-lysin (Sigma) (20 ul/ml i 0,1 M Tris-buffer, pH 7,3), 75 ul/brønn, og inkubert over natten ved romtemperatur. Platene ble så vasket med destillert vann og belagt med poly-dAdT (Sigma) (20 ul/ml i 0,1 M Tris-buffer, pH 7,3), 75 ul/brønn, og inkubert ved romtemperatur i 60 minutter. Platene ble så vasket med destillert vann og blokkert med 2% BSA (Sigma) i Tris-buffer i 30 minutter ved romtemperatur, fulgt av en avsluttende vask med destillert vann.
Serumprøver ble tatt fra de ztnf4-transgene mus beskrevet i eksempel 10 og NZBW-musene beskrevet i eksempel 11. Serumprøvene ble fortynnet 1:50 i 1% BSA/2% BGG (Calbiochem) i Tris-buffer. De fortynnede prøver ble så titrert inn i den belagte plate ved fortynninger på 1:50,1:100,1:200,1:400,1:800,1:1 600,1:3 200 og 1:6 400 (50 ul/brønn) og inkubert i 90 minutter ved romtemperatur.
Platene ble så vasket med destillert vann, og anti-muse-IgG-Fc-HRP fra geit (Cappel) fortynnet 1:1 000 i 1% BSA/2% BGG ble tilsatt med 50 ul/brønn. Platene ble inkubert i 60 minutter ved romtemperatur. Platene ble vasket 5 ganger med destillert vann, fremkalt med OPD, 1 tablett/10 ml Novo D og overført til plater med 100 ul/brønn. Fargeutviklingen ble stoppet med 1 N H2S04, 100 ul/brønn, og OD avlest ved 492 nm.
Figur 8 viser nivået av anti-ds-DNA i to ztnf4-transgene mus (23 uker gamle) og to ikke-transgene mus fra samme kull, sammenlignet med nivået påvist i serum fra NZBWFl-mus (32 uker gamle) og MRL/lpr/lpr-mus (19 uker gamle).
Eksempel 16
Løseli<g>TACI- Ig i en spontan modell for ELE
25 PLxSJL Fl-hunnmus (12 uker gamle, Jackson Labs) gis en subkutan injeksjon på 125 ug/mus med antigen (myelint proteolipidprotein, PLP, aminosyrerestene 139-151), utformet i komplett Freunds adjuvans. Musene inndeles i 5 grupper på 5 mus. Intraperitoneale injeksjoner med pertussistoksin (400 ng) gis på dagene 0 og 2. Gruppene vil bli gitt en lx, 10x eller 100x dose av TACI, BCMA eller BR43x2, én gruppe vil gis bærerstoff alene, og én gruppe vil ikke behandles. Forebyggende behandling vil begynne på dag 0, intervensjonsbehandling vil begynne på dag 7 eller når kliniske tegn viser seg. Tegn på sykdom, vekttap og paralyse viser seg i løpet av tilnærmet 10-14 dager og varer i tilnærmet 1 uke. Dyrene vurderes daglig ved å måle kroppsvekten og gi dem en klinisk poengsum som tilsvarer omfanget av symptomene. Kliniske tegn på EAE opptrer i løpet av 10-14 dagers inokulasjon og vedvarer i tilnærmet 1 uke. Etter avsluttet undersøkelse avlives alle dyr ved en overdose av gass, og autopsi utføres. Hjerne og ryggmarg oppsamles for histologisk undersøkelse, eller nedfryses for mRNA-analyse. Kroppsvekt og klinisk poengsum fremstilles grafisk for hvert individ og for gruppene.
Eksempel 17
TACI- FC og CIA- modellen for reumatoid artritt
8 uker gamle DBA/1 J-hannmus (Jackson Labs) oppdeles i grupper på 5 mus/gruppe og gis to subkutane injeksjoner med 50-100 ul 1 mg/ml kollagen (med opphav i kylling eller storfe), med 3 ukers mellomrom. Én kontrollgruppe gis ingen kollageninjeksjoner. Den første injeksjon er utformet i komplett Freunds adjuvans, mens den andre injeksjonen er utformet i ukomplett Freunds adjuvans. TACI-FC vil tilføres profylaktisk samtidig med eller før den andre injeksjonen, eller etter at dyrene utvikler en klinisk poengsum på 2 eller mer som vedvarer i minst 24 timer. Dyrene begynner å vise symptomer på artritt etter den andre kollageninjeksjonen, vanligvis i løpet av 2-3 uker. Sykdomsomfanget evalueres i hver pote ved anvendelse av en målepasser for å måle potetykkelsen og ved å gi en klinisk poengsum (0-3) til hver pote. Kliniske poeng: 0 Normal, 1 Én eller flere tær inflammert, 2 Mild poteinflammasjon, 3 Moderat poteinflammasjon og 4 Alvorlig poteinflammasjon. Dyrene vil avlives etter å ha hatt etablert sykdom over et gitt tidsrom, vanligvis 7 dager. Potene oppsamles for histologisk undersøkelse eller mRNA-analyse, og serum oppsamles for immunglobulin- og cytokinanalyser.
Eksempel 18
Nøytraliserende TACI- antistoffer
Polyklonale anti-peptidantistoffer ble fremstilt ved immunisering av 2 New Zealand white-hunnkaniner med peptidet huztnf4-l SAGIAKLEEGPELQLAIPRE (SEKV.ID NR: 59) eller huztnf4-2 SFKRGSALEEKENKELVKET (SEKV.ID NR: 60). Peptidene ble syntetisert ved anvendelse av et "Applied Biosystems Model 43 IA" peptidsynteseinstrument (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Peptidene ble så konjugert til bærerproteinet "keyhole limpef-hemocyanin (KLH) med maleimidaktivering. Begge kaniner ble gitt en innledende intraperitoneal (ip) injeksjon med 200 ug peptid i komplett Freunds adjuvans, fulgt av forsterkende ip-injeksjoner med 100 ug peptid i ukomplett Freunds adjuvans hver tredje uke. 7 til 10 dager etter tilførsel av den andre forsterkerinjeksjonen (3 injeksjoner i alt) ble dyrene tappet for blod og serum oppsamlet. Dyrene ble så gitt forsterkerinjeksjoner og tappet for blod hver tredje uke.
De ztnf4-peptidspesifikke kaninsera blekarakterisert veden ELIS A-titeranalyse ved anvendelse av 1 ug/ml av peptidene anvendt for fremstilling av antistoffet (SEKV.ID NR: 59 og 60) som antistoffmål. De to kaninseraene mot huztnf4-l-peptidet (SEKV.ID NR: 59) har titere for sitt spesifikke peptid ved en fortynning på
1:1E5 (1:100 000). De to kaninseraene mot huztnf4-2-peptidet (SEKV.ID NR: 60) hadde titere for sitt spesifikke peptid ved en fortynning på 1:5E6 og for rekombinante fullengde-proteiner (N-terminalt "FLAG"-merket ztnf4 fremstilt i bakulovirus (huztnf4s-NF-Bv) og C-terminalt "FLAG"-merket ztnf4 fremstilt i BHK-celler) ved en fortynning på 1:5E6.
De ztnf4-peptidspesifikke, polyklonale antistoffene ble affinitetsrenset fra kaninserumet ved anvendelse av "CNBR-SEPHAROSE 4B"-proteinkolonner (Pharmacia LKB) som ble fremstilt ved anvendelse av 10 mg av de spesifikke peptidene (SEKV.ID NR: 59 og 60) pr. g "CNBr-SEPHAROSE", fulgt av 20X dialyse i PBS over natten. Ztnf4-spesifikke antistoffer blekarakterisert veden ELISA-titeranalyse med 1 ug/ml av det tilhørende peptidantigen eller rekombinant fullengdeprotein (huztnf4s-NF-Bv) som antistoffmål. Den nedre deteksjonsgrense (LLD) for det affinitetsrensede anti-huztnf4-l-antistoff fra kanin overfor sitt spesifikke antigen (huztnf4-l-peptidet, SEKV.ID NR: 59) er en fortynning på 5 ng/ml. Den nedre deteksjonsgrense (LLD) for det affinitetsrensede anti-huztnf4-2-antistoff fra kanin overfor sitt spesifikke antigen (huztnf4-2-peptidet, SEKV.ID NR: 60) er en fortynning på 0,5 ng/ml. Den nedre deteksjonsgrense for affinitetsrenset anti-huztnf4-2-antistoff fra kanin for det rekombinante protein huztnf4s-NF-Bv er en fortynning på 5 ng/ml.
Monoklonale antistoffer fra mus ble også fremstilt og selektert for inhibering av biotinmerket, løselig ztnf4. Ingen av de monoklonale TACI-antistoffer (248.14, 248.23,248,24 eller 246.3) blokkerer ztnf4-binding til BCMA. Det monoklonale antistoff 248.23 reduserer bindingen av 10 ng/ml ztnf4-biotin til tilnærmet 50% dersom kondisjonert medium fortynnes til 1:243 og reduserer bindingen til tilnærmet 2X i ufortynnet medium. Det monoklonale antistoff 246.3 reduserer bindingen av 10 ng/ml ztnf4-biotin til tilnærmet 50% mellom en fortynning på 1:243 og 1:181 av kondisjonert medium og reduserer bindingen 5X i ufortynnet medium.
Fra det ovenstående vil det forstås at selv om spesifikke utførelser av oppfinnelsen er blitt beskrevet heri for å illustrere den, kan forskjellige modifikasjoner innføres uten å avvike fra oppfinnelsens ånd og område. Følgelig er oppfinnelsen kun begrenset av de vedlagte krav.

Claims (45)

1. Forbindelse, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen som består av; a) et polypeptid som omfatter aminosyrerestene 1-48 i SEKV.ID NR: 8, b) et polypeptid som omfatter aminosyrerestene 8-37 i SEKV.ID NR: 8, c) et polypeptid som omfatter aminosyrerestene 8-88 i SEKV.ID NR: 8, d) et polypeptid ifølge (a)-(c) som videre omfatter aminosyrerestene 89-150 iSEKV.IDNR:8, e) et polypeptid som omfatter aminosyrerestene 1-150 i SEKV.ID NR: 8, f) et polypeptid som omfatter sekvensen ifølge SEKV.ID NR: 10, g) et antistoff eller antistoffragment som spesifikt bindes til et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 8, og h) et antistoff eller antistoffragment som spesifikt bindes til et polypeptid ifølge SEKV.ID NR: 10.
2. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament for behandling av astma, bronkitt, emfysem, nyresvikt i siste stadium og/eller nyresykdom, nyreneoplasma, multiple myelomer, lymfomer, lettkjedenevropati, amyloidose, eller inflammasjon, eller for inhibering av effektor-T-celler eller for inhibering av antistoffproduksjon eller for inhibering av proliferasjonen av B-lymfocytter hos et pattedyr ved inhibering av ztnf4-aktivitet hos pattedyret.
3. Fusjonsprotein, karakterisert ved at det består av en første del og en andre del sammenbundet med en peptidbinding, hvori den første del omfatter et polypeptid ifølge krav 1, og den andre del omfatter et konstant område fra en immunglobulin-tungkjede, eller et Fc-fragment fra et konstant område fra en immunglobulin-tungkjede, som omfatter to konstant område-domener og mangler det variable område.
4. Fusjonsprotein ifølge krav 3, karakterisert ved at det konstante område fra immunglobulin-tungkjeden er et humant konstant område fra immunglobulin-tungkjede.
5. Fusj onsprotein ifølge krav 4, karakterisert ved at det humane konstant område fra immunglobulin-tungkjeden er en human konstant område fra immunglobulin-tungkjede fra IgGl.
6. Fusjonsprotein ifølge krav 3, karakterisert ved at Fc-fragmentet er avledet fra human IgGl.
7. Fusjonsprotein ifølge krav 3 eller krav 5, karakterisert ved at Fc-fragmentet er modifisert ved at Fc reseptorbindingsfunksjonen og komplement (Clq)-bindingsfunksjonen er fjernet
8. Fusjonsprotein ifølge hvilke som helst av kravene 3-7, karakterisert ved at det er i form av en multimer av nevnte fusjonsproteiner.
9. Fusjonsprotein ifølge hvilke som helst av kravene 3-8, karakterisert ved at den første del omfatter et polypeptid omfattende sekvensen ifølge i SEKV.ID NR: 10.
10. Fusjonsprotein ifølge krav 9, karakterisert ved at det omfatter aminosyrene 71-104 i SEKV.ID NR: 6.
11. Fusjonsprotein ifølge krav 9, karakterisert ved at det videre omfatter aminosyrene 34-66 i SEKV.ID NR: 6.
12. Anvendelse av et fusjonsprotein ifølge hvilke som helst av kravene 3-11, for fremstilling av et medikament for behandling av astma, bronkitt, emfysem, nyresvikt i siste stadium og/eller nyresykdom, nyreneoplasma, multiple myelomer, lymfomer, lettkjedenevropati, amyloidose, eller inflammasjon, eller for inhibering av effektor-T-celler eller for inhibering av antistoffproduksjon eller for inhibering av proliferasjonen av B-lymfocytter hos et pattedyr ved inhibering av ztnf4-aktivitet hos pattedyret.
13. Anvendelse ifølge kravene 2 eller 12, hvori medikamentet er for inhibering av proliferasjon av B-lymfocytter.
14. Anvendelse ifølge krav 13, hvori B-lymfocyttene er aktiverte B-lymfocytter.
15. Anvendelse ifølge krav 13, hvori B-lymfocyttene er hvilende B-lymfocytter.
16. Anvendelse ifølge hvilke som helst av kravene 2, 12 og 13-15, hvori medikamentet er for inhibering av antistoffproduksjon.
17. Anvendelse ifølge krav 16, hvori antistoffproduksjonen er forbundet med en autoimmun sykdom.
18. Anvendelse ifølge krav 17, hvori autoimmun sykdommen er systemisk lupus erythematosus, myasthenia gravis, multippel sklerose eller reumatoid artritt.
19. Anvendelse ifølge hvilke som helst av kravene 2, 12 og 13-18, for behandling av astma, bronkitt, emfysem, nyresvikt i siste stadium og/eller nyresykdom.
20. Anvendelse ifølge krav 19, hvori nyresykdommen er glomerulonefritt, vaskulitt, nefritt eller pyelonefritt.
21. Anvendelse ifølge hvilke som helst av kravene 2,12 og 13-18, for behandling av nyreneoplasma, multiple myelomer, lymfomer, lettkjedenevropati eller amyloidose.
22. Anvendelse ifølge hvilke som helst av kravene 2, 12 og 13-21, for inhibering av effektor T-celler.
23. Anvendelse ifølge krav 22, for moderering av immunrespons.
24. Anvendelse ifølge krav 22, hvori inhiberingen videre omfatter immunsuppresjon.
25. Anvendelse ifølge krav 24, hvori immunsuppresjonen er forbundet med transplantatrejeksjon, "graft versus host"-sykdom, autoimmun sykdom eller inflammasjon.
26. Anvendelse ifølge krav 25, hvori den autoimmune sykdom er insulinavhengig diabetes mellitus eller Crohns sykdom.
27. Anvendelse ifølge hvilke som helst av kravene 2,12 og 13-26, for behandling av inflammasjon.
28. Anvendelse ifølge krav 27, hvori inflammasjonen er forbundet med leddsmerter, hevelser, anemi eller septisk sjokk.
29. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det omfatter en forbindelse ifølge krav 1 og en farmasøytisk akseptabel bærer.
30. Farmasøytisk preparat ifølge krav 29, karakterisert ved at nevnte forbindelse er et antistoff eller antistoff-fragment som spesifikt binder til et polypeptid ifølge SEQ ID NO: 10.
31. Farmasøytisk preparat ifølge krav 29, karakterisert ved at nevnte forbindelse er et antistoff eller antistoff-fragment som spesifikt binder til et polypeptid ifølge SEQ ID NO: 8.
32. Farmasøytisk preparat ifølge krav 30 eller krav 31, karakterisert ved at antistoffet eller antistofrfagmentet er utvalgt fra gruppen som består av; a) polyklonalt antistoff, b) murint, monoklonalt antistoff, c) humanisert antistoff avledet fra b), og d) humant, monoklonalt antistoff.
33. Farmasøytisk preparat ifølge hvilke som helst av kravene 30-32, karakterisert ved at antistoffragmentet er utvalgt fra gruppen som består av F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv og den minimale gjenkjenningsenhet.
34. Anvendelse av et antistoff eller antistoff-fragment som spesifikt binder til et ztnf4-polypeptid, for fremstilling av et medikament for behandling av en sykdom valgt fra gruppen bestående av; (i) systemisk lupus erythematosus (ii) multippel sklerose (iii) multippelt myelom (iv) myasthenia gravis (v) IBD (inflammatorisk tarmsykdom) (vi) ITCP (idiopatisk trombocytopen purpura) hos et pattedyr ved inhibering av ztnf4-aktivitet hos pattedyret.
35. Anvendelse ifølge krav 34, hvori antistoffet eller antistofrfagmentet spesifikt binder til et polypeptid ifølge SEQ ID NO: 18.
36. Anvendelse ifølge krav 34 eller 35, hvori antistoffet eller antistoffragmentet inhiberer autoantistoffproduksjon hos pattedyret.
37. Anvendelse ifølge hvilke som helst av kravene 34-36, hvori antistoffet er valgt fra gruppen bestående av; a) polyklonalt antistoff, b) murint, monoklonalt antistoff, c) humanisert antistoff avledet fra b), og d) humant, monoklonalt antistoff.
38. Anvendelse ifølge hvilke som helst av kravene 34-37, hvori antistofffragmentet er valgt fra gruppen som består av F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv og den minimale gjenkjenningsenhet.
39. Anti-human ztnf4 antistoff eller antistofrfagment, karakterisert ved at det binder spesifikt til aminosyresekvensen valgt fra SEQ ID NO: 59 eller SEQ ID NO: 60.
40. Antistoff ifølge krav 39, karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av; a) polyklonalt antistoff, b) murint, monoklonalt antistoff, c) humanisert antistoff avledet fra b), og d) humant, monoklonalt antistoff.
41. Antistoff ifølge krav 40 , karakterisert ved at det er valgt fra gruppen bestående av F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv og den minimale gjenkjenningsenhet.
42. Anvendelse av et antistoff eller antistoffragment ifølge hvilke som helst av kravene 39-41 for fremstilling av et medikament for behandling av systemisk lupus erythematosus hos pattedyr.
43. Anvendelse ifølge krav 42, hvori behandlingen av systemisk lupus erythematosus hos pattedyret omfatter inhibering av antistoffproduksjon forbundet med systemisk lupus erythematosus.
44. Anvendelse ifølge hvilke som helst av kravene 2,12-28, 34-38 og 42-43, hvori pattedyret er en primat.
45. Anvendelse ifølge krav 44, hvori primaten er et menneske.
NO20111595A 1999-01-07 2011-11-21 ¿ Forbindelse omfattende polypeptid og antistoff, samt fusjonsprotein, farmasøytisk preparat, og anvendelse av disse til fremstilling av et medikament¿ NO333915B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22653399A 1999-01-07 1999-01-07
PCT/US2000/000396 WO2000040716A2 (en) 1999-01-07 2000-01-07 Soluble receptor br43x2 and methods of using them for therapy

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20111595L true NO20111595L (no) 2001-09-06
NO333915B1 NO333915B1 (no) 2013-10-21

Family

ID=22849300

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20013316A NO331902B1 (no) 1999-01-07 2001-07-04 Anvendelse av en forbindelse for fremstilling av medikament for behandling av ulike sykdommer ved inhibering av ztnf4-aktivitet, isolert polynukleotid, ekspresjonsvektor, dyrket celle og fremgangsmate for fremstilling av polypepitd, samt isolert polypeptid og farmasoytisk preparat.
NO20111595A NO333915B1 (no) 1999-01-07 2011-11-21 ¿ Forbindelse omfattende polypeptid og antistoff, samt fusjonsprotein, farmasøytisk preparat, og anvendelse av disse til fremstilling av et medikament¿

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20013316A NO331902B1 (no) 1999-01-07 2001-07-04 Anvendelse av en forbindelse for fremstilling av medikament for behandling av ulike sykdommer ved inhibering av ztnf4-aktivitet, isolert polynukleotid, ekspresjonsvektor, dyrket celle og fremgangsmate for fremstilling av polypepitd, samt isolert polypeptid og farmasoytisk preparat.

Country Status (29)

Country Link
EP (5) EP1141274B2 (no)
JP (2) JP5021117B2 (no)
KR (1) KR100699524B1 (no)
CN (2) CN1342202A (no)
AT (3) ATE437227T1 (no)
AU (1) AU780805B2 (no)
BG (1) BG65603B1 (no)
BR (1) BR0007423A (no)
CA (2) CA2753331A1 (no)
CY (1) CY1109977T1 (no)
CZ (1) CZ303272B6 (no)
DE (3) DE60042617D1 (no)
DK (3) DK1642972T3 (no)
EA (1) EA007471B1 (no)
EE (2) EE05460B1 (no)
ES (3) ES2204502T5 (no)
HK (1) HK1041497B (no)
HU (1) HU230024B1 (no)
IL (2) IL144029A0 (no)
NO (2) NO331902B1 (no)
NZ (1) NZ512753A (no)
PL (3) PL211033B1 (no)
PT (2) PT1642972E (no)
SI (1) SI1642972T1 (no)
SK (1) SK288176B6 (no)
TR (1) TR200101998T2 (no)
UA (1) UA74330C2 (no)
WO (1) WO2000040716A2 (no)
ZA (1) ZA200105288B (no)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
US6689579B1 (en) 1996-10-25 2004-02-10 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding neutrokine-α
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US6503184B1 (en) 1997-10-21 2003-01-07 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor-like proteins TR11, TR11SV1 and TR11SV2
US6689607B2 (en) 1997-10-21 2004-02-10 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor, necrosis factor receptor-like proteins TR11, TR11SV1 and TR11SV2
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
ATE437227T1 (de) * 1999-01-07 2009-08-15 Zymogenetics Inc Verfahren zur therapeutischen verwendung von löslichen rezeptoren br43x2
US20030095967A1 (en) 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
CZ299819B6 (cs) 1999-01-25 2008-12-03 Biogen Idec Ma Inc. Farmaceutické kompozice obsahující protilátky specifické pro rozpustný BAFF
US20030022233A1 (en) 1999-04-30 2003-01-30 Raymond G. Goodwin Methods of use of the taci/taci-l interaction
AU4986700A (en) 1999-05-06 2000-11-21 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
EE05673B1 (et) * 1999-08-17 2013-08-15 Biogen, Inc. BAFF-retseptor (BCMA), immunoregulatoorne agens
UA74798C2 (uk) * 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
AU3695801A (en) * 2000-02-11 2001-11-20 Amgen, Inc. Receptor from tnf family
US20040002068A1 (en) * 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US6969519B2 (en) 2000-03-10 2005-11-29 Human Genome Sciences, Inc. Methods of using an agonistic antibody human tumor necrosis factor receptor (TR17)
CA2404945C (en) * 2000-04-27 2010-02-09 Biogen, Inc. Taci as an anti-tumor agent
EP1746106A3 (en) * 2000-04-27 2007-03-14 Biogen Idec MA Inc. Use of TACI as an anti-tumor agent
US7371388B1 (en) 2000-05-04 2008-05-13 Human Genome Sciences, Inc. Treatment of Sjogren's syndrome by administration of TR18 polypeptides
MXPA02011130A (es) * 2000-05-12 2003-03-10 Amgen Inc Metodos y composiciones de materia que se refieren a april/g70, bcma, blys/agp-3, y taci.
US7220840B2 (en) 2000-06-16 2007-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator protein
NZ522700A (en) * 2000-06-16 2006-02-24 Human Genome Sciences Inc Antibodies that immunospecifically bind to blys
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
WO2002016411A2 (en) 2000-08-18 2002-02-28 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides and methods based thereon
DE60140773D1 (de) * 2000-08-18 2010-01-21 Dyax Corp Polypeptide zur Bindung an das B-Lymphozyten-stimulatorische Protein (BLyS)
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
AU2002215753A1 (en) * 2000-12-07 2002-06-18 The University Of British Columbia Caml-binding peptides
EP2301971A1 (en) * 2001-02-20 2011-03-30 ZymoGenetics, L.L.C. Antibodies that bind both BCMA and TACI
CA2446189C (en) 2001-05-11 2011-10-18 Amgen, Inc. Peptides and related molecules that bind to tall-1
RS20120253A1 (en) 2001-05-24 2013-02-28 Zymogenetics Inc. TACI-IMUNOGLOBULINSKI PROTEIN FUNCTIONS
CN1636067A (zh) * 2001-08-03 2005-07-06 杰南技术公司 TACls和BR3多肽及其用途
WO2003013582A1 (en) * 2001-08-06 2003-02-20 Genset S.A. Genoxit agonists and antagonists for use in the treatment of metabolic disorders
WO2003045421A1 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Genset S.A. Agonists and antagonists of ryzn for the treatment of metabolic disorders
AU2004233164B2 (en) 2003-03-28 2009-10-08 Biogen Ma Inc. Truncated BAFF receptors
PT2272868E (pt) 2003-06-05 2015-07-07 Genentech Inc Terapêutica de combinação para distúrbios de células b
CA2554526A1 (en) 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of bcma and uses thereof
JP4940136B2 (ja) * 2004-06-28 2012-05-30 イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド キメラタンパク質およびその使用
WO2006067210A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Laboratoires Serono S.A. Bcma polypeptides and uses thereof
CA2618763A1 (en) 2005-08-09 2007-02-15 Zymogenetics, Inc. Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using taci-fusion molecules
EA016083B1 (ru) 2005-08-09 2012-02-28 Займоджинетикс, Инк. СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ НЕХОДЖКИНСКОЙ ЛИМФОМЫ С ПОМОЩЬЮ СЛИТОЙ МОЛЕКУЛЫ TACI-Ig
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
WO2007142667A2 (en) * 2005-10-13 2007-12-13 Human Genome Sciences, Inc. Treatment of patients with autoantibody positive disease
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
WO2007062090A2 (en) 2005-11-23 2007-05-31 Genentech, Inc. Methods and compositions related to b cell assays
WO2007123765A2 (en) 2006-03-31 2007-11-01 Human Genome Sciences Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
MX2008014365A (es) 2006-05-15 2008-11-27 Ares Trading Sa Metodos para tratar enfermedades autoinmunitarias utilizando una molecula de fusion del activador de transmembrana-inmunoglobulina.
PT2061803T (pt) 2006-08-28 2019-11-21 Ares Trading Sa Processo de purificação de proteinas contendo fc
ATE509107T1 (de) 2007-01-26 2011-05-15 Merck Serono Sa Aufreinigung von fc-tact-fusionsproteinen unter verwendung der ölkörper-technik
WO2009052293A1 (en) 2007-10-16 2009-04-23 Zymogenetics, Inc. Combination of blys inhibition and anti-cd 20 agents for treatment of autoimmune disease
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
JP6061469B2 (ja) 2009-03-10 2017-01-25 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 抗ｂｃｍａ抗体
IN2012DN02485A (no) 2009-09-03 2015-08-28 Hoffmann La Roche
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
EP3974453A3 (en) 2010-11-16 2022-08-03 Amgen Inc. Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
JP6271254B2 (ja) 2011-02-28 2018-01-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｂ細胞アンタゴニストに対する生物学的マーカー及び応答を予測するための方法
UA112434C2 (uk) 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
MX2014009043A (es) 2012-01-31 2014-10-14 Genentech Inc Anticuerpos anti-ige y sus metodos de uso.
TW201425336A (zh) * 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
PL2953972T3 (pl) 2013-02-05 2021-03-08 Engmab Sàrl Metoda wyboru przeciwciał przeciwko bcma
JOP20140087B1 (ar) 2013-03-13 2021-08-17 Amgen Inc بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها
US9458246B2 (en) 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
DK3126383T3 (en) 2014-04-03 2019-04-01 Igm Biosciences Inc MODIFIED J-CHAIN
JP7179464B2 (ja) 2015-01-20 2022-11-29 アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 腫瘍壊死因子 （ｔｎｆ） スーパーファミリー受容体結合分子およびその使用
AU2016329197B2 (en) 2015-09-30 2021-01-21 Igm Biosciences, Inc. Binding molecules with modified J-chain
DK3356401T3 (da) 2015-09-30 2020-09-07 Igm Biosciences Inc Bindingsmolekyler med modificeret j-kæde
KR20190053835A (ko) 2016-06-21 2019-05-20 테네오바이오, 인코포레이티드 Cd3 결합 항체
WO2018052503A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Teneobio, Inc. Cd3 binding antibodies
MX2019004621A (es) 2016-11-02 2019-11-28 Engmab Sarl Anticuerpo biespecifico contra bcma y cd3 y un farmaco inmunologico para uso combinado en el tratamiento del mieloma multiple.
JP7254699B2 (ja) 2016-12-21 2023-04-10 テネオバイオ， インコーポレイテッド 抗ｂｃｍａ重鎖のみ抗体
EP3596100A4 (en) * 2017-03-15 2021-01-13 Juneau Biosciences, L.L.C. METHODS OF USING GENETIC MARKERS ASSOCIATED WITH ENDOMETRIOSIS
KR20200018498A (ko) 2017-06-20 2020-02-19 테네오바이오, 인코포레이티드 항-bcma 중쇄-단독 항체
CA3098420A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Novartis Ag Binding molecules against bcma and uses thereof
CN111944047B (zh) * 2019-05-15 2022-04-08 重庆精准生物技术有限公司 抗bcma的人源化单链抗体及应用
AR119746A1 (es) 2019-06-14 2022-01-05 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecíficos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3
CN115894703A (zh) 2020-04-29 2023-04-04 特尼奥生物股份有限公司 具有经修饰重链恒定区的多特异性重链抗体
CN116903727A (zh) 2020-05-08 2023-10-20 高山免疫科学股份有限公司 具有和不具有t细胞抑制蛋白的april和baff抑制性免疫调节蛋白及其使用方法
US20230303665A1 (en) 2020-08-28 2023-09-28 Sana Biotechnology, Inc. Modified anti-viral binding agents
KR20240019124A (ko) 2021-05-07 2024-02-14 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Taci-fc 융합 면역조절 단백질의 투여 및 치료 방법
WO2024077018A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4615974A (en) 1981-08-25 1986-10-07 Celltech Limited Yeast expression vectors
US4579821A (en) 1981-11-23 1986-04-01 University Patents, Inc. Control of DNA sequence transcription
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US4486533A (en) 1982-09-02 1984-12-04 St. Louis University Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element
US4599311A (en) 1982-08-13 1986-07-08 Kawasaki Glenn H Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor
US4977092A (en) 1985-06-26 1990-12-11 Amgen Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
US4661454A (en) 1983-02-28 1987-04-28 Collaborative Research, Inc. GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
US5139936A (en) 1983-02-28 1992-08-18 Collaborative Research, Inc. Use of the GAL1 yeast promoter
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
ATE54167T1 (de) 1984-12-06 1990-07-15 Fina Research Promotoren fuer die expression von fremden genen in hefe, plasmide, die diese promotoren enthalten, sowie deren verwendung zur herstellung von polypeptiden.
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4882279A (en) 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
GB8611832D0 (en) 1986-05-15 1986-06-25 Holland I B Polypeptide
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5063154A (en) 1987-06-24 1991-11-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Pheromone - inducible yeast promoter
US5637677A (en) 1987-07-16 1997-06-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Biologically active compounds and methods of constructing and using the same
EP0325224B1 (en) 1988-01-22 1996-07-31 ZymoGenetics, Inc. Methods of producing secreted receptor analogs
US5567584A (en) 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5037743A (en) 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5162228A (en) 1988-12-28 1992-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Gylceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and promoter
US5162222A (en) 1989-07-07 1992-11-10 Guarino Linda A Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses
ATE149841T1 (de) 1990-01-26 1997-03-15 Immunomedics Inc Impfstoffe gegen krebs und infektionskrankheiten
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
US5208146A (en) 1990-11-05 1993-05-04 The Regents Of The University Of California Murine monoclonal anti-idiotype antibodies
US5686272A (en) 1992-05-29 1997-11-11 Abbott Laboratories Amplification of RNA sequences using the ligase chain reaction
CA2144651A1 (en) 1992-09-14 1994-03-31 Timothy J. Miller Immortalized cells and uses therefor
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
EP0862640A2 (en) 1995-11-09 1998-09-09 ZymoGenetics, Inc. Production of gad65 in methylotrophic yeast
US5716808A (en) 1995-11-09 1998-02-10 Zymogenetics, Inc. Genetic engineering of pichia methanolica
WO1998002536A2 (en) 1996-07-17 1998-01-22 Zymogenetics, Inc. Preparation of pichia methanolica auxotrophic mutants
US5736383A (en) 1996-08-26 1998-04-07 Zymogenetics, Inc. Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants
IL128073A0 (en) 1996-07-17 1999-11-30 Zymogenetics Inc Transformation of pichia methanolica
ATE302272T1 (de) * 1996-10-25 2005-09-15 Human Genome Sciences Inc Neutrokin alpha
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) * 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
JP2002504818A (ja) * 1997-06-06 2002-02-12 リジェネロン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド リガンドファミリーのｎｔｎ−２メンバー
IL133316A0 (en) * 1997-06-06 2001-04-30 Regeneron Pharma Ntn-2 member of tnf ligand family
ATE437227T1 (de) * 1999-01-07 2009-08-15 Zymogenetics Inc Verfahren zur therapeutischen verwendung von löslichen rezeptoren br43x2

Also Published As

Publication number Publication date
KR100699524B1 (ko) 2007-03-23
SK9712001A3 (en) 2002-02-05
DE60005135D1 (de) 2003-10-16
DE60005135T3 (de) 2015-04-09
HU230024B1 (hu) 2015-05-28
UA74330C2 (uk) 2005-12-15
ATE249517T1 (de) 2003-09-15
WO2000040716A2 (en) 2000-07-13
PT1642972E (pt) 2010-04-07
JP2003525861A (ja) 2003-09-02
DK1141274T4 (en) 2015-01-19
ES2204502T3 (es) 2004-05-01
SK288176B6 (sk) 2014-04-02
EA200100621A1 (ru) 2002-04-25
KR20010105322A (ko) 2001-11-28
JP5021117B2 (ja) 2012-09-05
EP1141274B1 (en) 2003-09-10
CN101518648A (zh) 2009-09-02
ES2329254T3 (es) 2009-11-24
IL144029A (en) 2009-11-18
NZ512753A (en) 2003-10-31
SI1642972T1 (sl) 2010-05-31
EP1642972A1 (en) 2006-04-05
JP2012001550A (ja) 2012-01-05
EE05539B1 (et) 2012-04-16
BR0007423A (pt) 2002-01-22
DE60043626D1 (de) 2010-02-11
EA007471B1 (ru) 2006-10-27
CN1342202A (zh) 2002-03-27
EE200100360A (et) 2002-12-16
ATE437227T1 (de) 2009-08-15
CA2753331A1 (en) 2000-07-13
DK1642972T3 (da) 2010-05-10
DK1141274T3 (da) 2003-12-29
BG105674A (bg) 2002-03-29
ATE453712T1 (de) 2010-01-15
PL364817A1 (en) 2004-12-13
DK1642973T3 (da) 2009-11-02
HK1041497B (zh) 2004-06-18
PT1141274E (pt) 2004-02-27
WO2000040716A3 (en) 2000-09-21
NO20013316L (no) 2001-09-06
EP1141274B2 (en) 2014-11-12
NO20013316D0 (no) 2001-07-04
BG65603B1 (bg) 2009-02-27
TR200101998T2 (tr) 2002-06-21
EE201100048A (et) 2011-10-17
EP1642973A1 (en) 2006-04-05
IL144029A0 (en) 2002-04-21
ES2338661T3 (es) 2010-05-11
EP2256199A1 (en) 2010-12-01
DE60005135T2 (de) 2004-07-15
AU2408400A (en) 2000-07-24
PL211033B1 (pl) 2012-04-30
HUP0200429A2 (en) 2002-06-29
EP1642973B1 (en) 2009-07-22
CY1109977T1 (el) 2014-09-10
DE60042617D1 (de) 2009-09-03
NO331902B1 (no) 2012-04-30
HK1041497A1 (en) 2002-07-12
EP1141274A2 (en) 2001-10-10
EE05460B1 (et) 2011-08-15
PL393286A1 (pl) 2011-06-06
ZA200105288B (en) 2002-06-26
CA2358520C (en) 2011-12-13
CA2358520A1 (en) 2000-07-13
ES2204502T5 (es) 2015-01-21
CZ20012465A3 (cs) 2002-03-13
PL209535B1 (pl) 2011-09-30
EP1354598A3 (en) 2003-11-19
EP1642972B1 (en) 2009-12-30
EP1354598A2 (en) 2003-10-22
CZ303272B6 (cs) 2012-07-11
NO333915B1 (no) 2013-10-21
AU780805B2 (en) 2005-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1642973B1 (en) Therapeutic uses of BR43X2 soluble receptors
US7772365B2 (en) Soluble receptor BR43x2
US20060067933A1 (en) Soluble receptor BR43x2 and methods of using
AU2005200008B2 (en) Soluble receptor BR43x2 and methods of using
US20050255496A1 (en) Ztnf12, a tumor necrosis factor
MXPA01006938A (en) SOLUBLE RECEPTOR BR43x2 AND METHODS OF USING

Legal Events

Date Code Title Description
CHAD Change of the owner's name or address (par. 44 patent law, par. patentforskriften)

Owner name: ARES TRADING S.A., CH

MK1K Patent expired