KR100699524B1 - 가용성 수용체 ｂｒ43×2 및 이용 방법 - Google Patents

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Abstract

가용성, 분비 종양 괴사 인자 수용체 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 암호화 폴리펩티드, 및 관련 조성물 및 방법이 개시된다. 폴리펩티드는 트랜스멤브레인 활성제 및 CAML-상호작용제(TACI)와 같은 다른 종양 괴사 인자 수용체에 상동성있는 하나의 시스테인-풍부 반복을 포함한다. 폴리펩티드는 리간드, 아고니스트 및 안타고니스트 검출에 사용될 수 있다.
폴리펩티드는 또한 B 세포 활성 조절 방법에 사용될 수 있다.
Figure 112001016752501-pct00013
BR43X2, TACI.

Description

가용성 수용체 ＢＲ43×2 및 이용방법{SOLUBLE RECEPTOR BR43x2 AND METHODS OF USING}
면역 반응동안 발생하는 세포 상호작용은 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR) 부류를 포함하는 세포 표면 수용체의 몇개 부류의 요소에 의해 조절된다. TNFR 부류는 그들 각각의 리간드와 결합하여, 서로 다른 조혈성 세포 계통간의 상호작용을 조절하는 많은 일체의 막 당단백질 수용체로 구성된다. (Smith et al., The TNF Receptor Superfamily of Cellular 및 Viral Proteins: Activation, Costimulation 및 Death, 76: 959-62,1994; Cosman, Stem Cells 12: 440-55,1994).
하나의 이러한 수용체는 TACI, 트랜스멤브레인 액티베이터 및 CAML-상호작용제이다. (von Bulow 및 Bram, Science 228: 138-41,1997 및 WIPO 공개 WO 98/39361). TACI 는 2 개의 시스테인-풍부 위-반복을 포함하는 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 도메인 및 CAML (칼슘-조절제 및 시클로필린 리간드) 과 상호작용하는 세포질 도메인, Jurkat 세포에서 과발현될 때, NF-AT 활성 공-유발제인 세포내 소포에 위치한 일체의 막 단백질을 가지는 막 결합 수용체이다. TACI 는 B 세포 및 T 세포의 서브셋과 관련된다. von Bulow 및 Bram (상기참조.) 은 TACI 에 대한 리간드는 밝혀지지 않은 것을 보고한다.
본 발명의 폴리펩티드, 단지 1 개의 시스테인-풍부 위-반복(BR43x2), TACI 및 관련 B 세포 단백질, BCMA 를 가지는 TACI 이소형(Gras et al., Int. Immunol. 17: 1093-106,1995) 은 TNF 리간드, ztnf4 (현재 뉴트로킨 α로 알려짐)(WIPO 공개, WO 98/18921), BLyS (Moore et al., Science, 285: 260-3,1999), BAFF (Schneider et al., J. Exp. Med. 189: 1747-56,1999), TALL-1 (Shu et al., J. Leukoc. Biol. 65: 680-3,1999) 또는 THANK (Mukhopadhyay et al.,J. Biol. Chem. 274: 15978-81,1999)에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 그 자체로, BR43x2, TACI, 및 BCMA 는 ztnf4 의 활성화 조절, 특히 B 세포의 활성화의 조절에 유용할 것이다.
이러한 목적을 위해서, 본 발명은 ztnf4 또는 다른 BR43x2 , TACI 또는 BCMA 리간드의 활성을 조절하는 단백질 치료제, 관련 조성물 및 방법뿐만 아니라 본 명세서의 교시로부터 당업자에게 자명한 다른 이용을 제공한다.
본 발명의 한 양태는 a) BR43×2 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드; b) TACI 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드; c) BCMA 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드; d) 서열 SEQ ID NO:10 을 포함하는 폴리펩티드; e) SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편; f) SEQ ID NO:4 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편; g) SEQ ID NO:6 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편; h) SEQ ID NO:8 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편; i) SEQ ID NO:10 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편; k) SEQ ID NO:4 의 폴리펩티드 l) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 1-166 ; 및 m) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 1-150 으 로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물의 양을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 이 포유동물에서 ztnf4 활성을 저해하는 방법을 제공한다.
하나의 구체예에서, 화합물은 펩티드 결합으로 결합된 제 1 의 부분 및 제 2 의 부분으로 구성되는 융합 단백질이고, 이 제 1 의 부분은 a) 서열 SEQ ID NO: 8 을 포함하는 폴리펩티드; b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 25-58 을 포함하는 폴리펩티드; c) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 34-66 을 포함하는 폴리펩티드; d) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 71-104 를 포함하는 폴리펩티드; e) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 25-104 를 포함하는 폴리펩티드; f) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 8-37 을 포함하는 폴리펩티드; g) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 41-88 을 포함하는 폴리펩티드; h) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 8-88 을 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩디드를 포함하고, 상기 제 2 의 부분은 다른 폴리펩티드를 포함한다. 다른 구체예에서, 제 1 의 부분은 a) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 59-120 ; b) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 105-166 ; 및 c) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 89-150 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 더 포함한다. 다른 구체예에서, 제 1 의 부분은 a) BR43×2 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드; b) TACI 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 및 c) BCMA 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택된다. 관련 구체예에서, 제 1 의 부분은 a) SEQ ID NO:4 의 폴리펩티드 b) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 1-154 ; 및 c) SEQ ID NO: 8 의 아미노산 잔기 1-48 로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다른 관련 구체예에서, 제 2 의 부분은 중쇄 항상 부위이다.
다른 구체예에서, 항체 또는 항체 단편은 a) 다클론 항체; b) 뮤린 단일클론 항체; c) b) 로부터 유래된 인간화 항체; 및 d) 인간 단일클론 항체로 구성되는 군으로부터 선택된다. 관련 구체예에서, 항체 단편은 F(ab') , F(ab) , Fab', Fab, Fv, scFv, 및 최소 인지 단위로 구성되는 군으로부터 선택된다. 다른 구체예에서, 포유동물은 영장류이다.
다른 구체예에서, ztnf4 활성은 B 림프구와 관련된다. 다른 관련 구체예에서, ztnf4 활성은 활성화된 B 림프구와 관련된다. 또 다른 구체예에서,ztnf4 활성은 휴지 B 림프구와 관련된다. 다른 구체예에서, ztnf4 활성은 항체생산과 관련된다. 관련 구체예에서, 항체 생산은 자가면역질환과 관련된다. 관련 구체예에서, 상기 자가면역질환은 전신성 홍반성 루푸스, 중증근 무력증, 다발성 경화증, 또는 류마티스양관절염이다. 다른 구체예에서, ztnf4 활성은 천식, 기관지염 또는 기종과 관련된다. 더욱 다른 구체예에서, ztnf4 활성은 말기 신부전과 관련된다. 또 다른 구체예에서, ztnf4 활성은 신질환과 관련된다. 관련 구체예에서, 신질환은 사구체신염, 맥관염, 신장염 또는 신우신염이다. 더욱 다른 구체예에서, 신질환은 신종양, 다발성 골수종, 림프종, 경쇄 신경병증 또는 아밀로이드증과 관련된다. 다른 구체예에서, ztnf4 활성은 효과기 T 세포와 관련된다. 다른 관련 구체예에서 , ztnf4 활성은 면역 반응 조절과 관련된다. 더욱 다른 구체예에서, 활성은 면역 억제와 관련된다. 또 다른 구체예에서, 면역억제는 이식편거부반응, 이식편대숙주질환 또는 염증과 관련된다. 다른 구체예에서, 활성은 자가면역질환과 관련된다. 관련 구체예에서, 자가면역질환은 인슐린 의존 진성당뇨병 또는 크론(Crohn) 질환이 다. 다른 구체예에서, ztnf4 활성은 염증과 관련된다. 다른 구체예에서, 염증은 관절통, 종창, 빈혈 또는 패혈성쇽과 관련된다. 다른 양태에서, 본 발명은 상기에 기술된대로 화합물의 양을 투여하는 단계를 포함하여 BR43×2 ,TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합을 저해하는 방법을 제공한다. 다른 구체예에서, BR43×2, TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 B 림프구와 관련된다. 다른 관련 구체예에서, BR43×2 , TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 활성화된 B 림프구와 관련된다. 더욱 다른 구체예에서, BR43×2, TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 휴지 B 림프구와 관련된다.
다른 구체예에서, BR43×2, TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 항체 생산과 관련된다. 관련 구체예에서, 항체 생산은 자가면역질환과 관련된다. 관련 구체예에서, 상기 자가면역질환은 전신성 홍반성 루푸스, 중증근무력증, 다발성 경화증, 또는 류마티스양관절염이다. 다른 구체예에서, BR43×2, TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 천식, 기관지염 또는 기종과 관련된다. 더욱 다른 구체예에서, BR43×2, TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 말기 신부전과 관련된다. 더욱 다른 구체예에서, BR43×2, TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 신질환과 관련된다. 관련 구체예에서, 신질환은 사구체신염, 맥관염, 신장염 또는 신우신염이다. 더욱 다른 구체예에서, 신질환은 신종양, 다발성 골수종, 림프종, 경쇄 신경병증 또는 아밀로이드증과 관련된다. 다른 구체예에서, BR43×2, TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 효과기 T 세포와 관련된다. 관련 구체예에서, BR43×2, TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 면역 반응 조절과 관련된다. 더욱 다른 구체예에 서, 활성은 면역억제와 관련된다. 더욱 다른 구체예에서, 면역억제는 이식편거부반응, 이식편대숙주질환 또는 염증과 관련된다. 다른 구체예에서, 활성은 자가면역질환과 관련된다. 관련 구체예에서, 자가면역질환은 인슐린 의존 진성당뇨병 또는 크론 질환이다. 다른 구체예에서, BR43×2, TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 염증과 관련된다. 관련된 구체예에서, 염증은 관절통, 종창, 빈혈 또는 패혈성쇽과 관련된다.
다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 또한, SEQ ID NO:1 의 분리된 폴리뉴클레오티드 분자가 제공된다. 관련 구체예에서, 하기의 작동가능하게 연결된 요소인 전사 프로모터; 상기에 개시된 폴리뉴클레오티드 분자, 및 전사 종결자를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. 다른 구체예에서, 발현 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드 분자에 작동가능하게 연결된 분비 수용체-리간드 결합 서열을 더 포함한다. 또한 상기에 개시된 발현벡터에 도입된 배양 세포가 제공되고, 이 배양 세포는 상기 폴리뉴클레오티드 절편에 의해 암호화된 상기 폴리펩티드를 발현한다. 본 발명은 상기에 개시된대로 발현 백터가 도입된 세포를 배양하는 단계; 이에 의해 이 세포가 상기 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 암호화된 상기 폴리펩티드를 발현하는 단계; 및 상기 발현된 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 폴리펩티드 생산 방법을 더 제공한다. 본 발명은 또한 서열 SEQ ID NO:2 을 가지는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 관련 구체예에서, 폴리펩티드는 제약학적으로 허용가능한 운반체와 조합된다.
도 1은 BR43×2 , TACI (von Bulow 및 Bram, 상기참조.) (SEQ ID NO: 6), BCMA (Gras et al., 상기참조.) (SEQ ID NO: 6) 및 BR43xl (SEQ ID NO: 7) 사이의 복합 아미노산 서열 배열을 보여준다. 시스테인-풍부 위-반복 및 트랜스멤브레인 도메인이 표시된다.
도 2는 안정한 BHK 트랜스펙턴트에 의해 발현된 TACI 및 BCMA 에 결합하는 가용성 I125 -ztnf4 의 Scatchard 플롯 분석을 보여준다.
도 3a는 ztnf4 공-작용 인간 B 림프구가 면역글로블린을 증식하고 분비하는 것을 보여준다.
도 3b는 9 일 경과된 배양에서, IL4 또는 IL4 + IL5 의 존재하에서 가용성 ztnf4 로 자극된 B 세포로부터 얻어진 상청액에서 측정된 IgM 및 IgG 의 수준을 보여준다.
도 4는 시험관내에서 5 일 동안 IL-4 의 존재하에서 가용성 ztnf4 또는 대조 단백질(유비퀴틴)로 자극된 인간 말초 혈액 B 세포를 보여준다. 정제된 TACI-Ig, BCMA-Ig 및 대조 Fc 를 ztnf4 특이적 증식의 저해에 관해 시험했다.
도 5a는 SLE 의 특징을 개발시킨 ztnf4 트랜스제닉 동물로부터의 결과를 보여준다.
도 5b는 CD5, CD4 및 CD8 에 대한 항체로 염색된 ztnf4 트랜스제닉 동물의 림프절, 비장 및 흉선 세포를 보여준다.
도 5c는 생후 6 내지 23 주 범위내의 트랜스제닉 ztnf4 동물 혈청내의 총 IgM, IgG 및 IgE 수준을 보여준다.
도 5d는 ztnf4 트랜스제닉 동물의 신장 절개에서 확인된 아밀로이드 침전 및 사구체의 두꺼워진 사구체간질을 보여준다.
도 5e는 ztnf4 트랜스제닉 마우스에서 효과기 T 세포를 보여준다.
도 6a 및 도 6b는 SLE 발생과 관련된 ZNBWF1 마우스 및 MRL/lpr/lpr 마우스로부터 얻어진 혈청에서 증가된 ztnf4 수준을 보여준다.
도 7은 연구 전 과정동안 단백뇨를 발생시키는 NZBWF1 마우스의 비율을 보여준다.
도 8은 ztnf4 트랜스제닉 마우스로부터 ELISA 에 의해 항-dsDNA 수준 및 ZNBWF1 및 MRL/lpr/lpr 마우스로의 혈청과 비교된 대조 리터 짝을 보여준다.
본 발명의 이러한 양태는 하기의 발명의 상세한 설명과 관련되어 분명해질 것이다.
본 발명을 제시하기 전에, 이하 사용될 어떤 용어의 정의를 제시하는 것이 발명의 이해를 위해 도움이 될 것이다.
친화성 표지: 는 본 명세서에서 제 2 의 폴리펩티드의 정제 또는 검출의 제공 또는 기질에 제 2 의 폴리펩티드의 부착 위치를 제공하기 위해 제 2 의 폴리펩티드에 부착될 수 있는 폴리펩티드 절편을 나타내기 위해 사용된다. 원칙적으로, 항체 또는 다른 특이적 결합 약제에 이용가능한 어느 펩티드 또는 단백질도 친화성 표지로서 사용될 수 있다. 친화성 표지는 폴리-히스티딘 트랙, 단백질 A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075,1985; Nilsson et al.,Methods Enzymol. 198: 3,1991), 글루타티온 S 트랜스퍼라제 (Smith 및 Johnson, Gene 67: 31,1988), Glu-Glu 친화성 표지 (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4,1985), 물질 P, FLAG TM 펩티드 (Hopp et al.,Biotechnology 6: 1204-10,1988), 스프렙타비딘 결합 펩티드, 또는 다른 항원성 에피토프 또는 결합 도메인을 포함한다. 일반적으로, Ford et al., Protein Expression Purification 2:95-107, 1991 참조. 친화성 표지를 암호화하는 DNA 는 상업적 제조업자로부터 이용가능하다.(예를 들어, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ ).
대립 변이체 : 같은 염색체 유전자좌를 차지하는 유전자의 어느 둘 이상의 대체형질이다. 대립 변이체는 돌연변이를 통해 자연적으로 발생하고, 개체군내에서 표현형 다형성을 일으킬 수 있다. 유전자 돌연변이는 잠재성일 수 있거나 (즉, 암호화된 폴리펩티드의 무변화), 변형된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 본 명세서에서 용어 " 대립 변이체" 는 또한 유전자의 대립 변이체에 의해 암호화된 단백질을 나타내기 위해 사용된다. 대립 변이로 인해 기준 아미노산 서열과는 다른, 같은 종으로부터 같은 단백질이 또한 포함된다. 대립 변이는 허여된 단백질을 암호화하는 유전자에서 개인간에 자연적으로 발생하는 차이를 말한다.
아미노-말단 및 카르복실-말단: 은 본 명세서에서 폴리펩티드 및 단백질내의 위치를 나타내기 위해 사용된다. 명세서에서 허용하는 경우에, 이러한 용어는 근접 또는 상대적 위치를 나타내기 위해 특정 서열 또는 폴리펩티드 또는 단백질의 부분과 관련되어 사용된다. 예를 들어, 단백질내의 기준 서열의 카르복실-말단에 위치한 어떤 서열은 기준 서열의 카르복실 말단의 근처에 위치하지만, 반드시 완성형 단백질의 카르복실 말단에 위치하는 것은 아니다.
보체/항-보체쌍:은 적당한 조건하에서, 비-공유결합으로 결합된, 안정한 쌍을 형성하는 비-동일 부분을 나타낸다. 예를 들어, 비오티 및 아비딘(또는 스트렙타비딘)은 보체/항-보체쌍의 전형적인 요소이다. 다른 표본적인 보체/항-보체쌍은 수용체/리간드 쌍, 항체/항원(또는 헵텐 또는 에피토프)쌍, 센스/안티센스 폴리뉴클레오티드 쌍등을 포함한다. 보체/항-보체쌍의 연이은 해리가 바람직한 경우에, 보체/항-보체쌍은 바람직하게는 ＜10-9 M 의 결합 친화력 을 가진다.
콘티그: 는 다른 폴리뉴클레오티드에 동일 또는 상보적인 서열의 연속적인 신장을 가지는 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 인접한 서열은 그들 전체 또는 폴리뉴클레오티드의 부분적인 신장을 따라 폴리뉴클레오티드 서열의 허여된 신장에 "오버랩" 된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열 5'-ATGGCTTAGCTT-3' 의 대표적인 콘티그는 5'-TAGCTTgagtct-3' 및 3'-gtcgacTACCGA-5'이다. .
폴리뉴클레오티드 분자의 보체: 는 기준 서열과 비교할 때, 상보적인 염기쌍, 그리고 역 방향을 가지는 폴리뉴클레오티드 분자를 나타낸다. 예를 들어, 서열 5' ATGCACGGG 3' 는 5'CCCGTGCAT 3' 에 상보적이다.
축중 뉴클레오티드 서열 또는 축중 서열 : 은 하나 이상의 축중 코돈(폴리펩 티드를 암호화하는 기준 폴리뉴클레오티드 분자와 비교할 때)을 포함하는 뉴클레오티드의 서열을 나타낸다. 축중 코돈은 뉴클레오티드의 서로 다른 트리플렛을 포함하지만, 같은 아미노산 잔기를 암호화한다. (즉, GAU 및 GAC 트리플렛은 각각 Asp 를 암호화한다).
발현 벡터: 는 전사를 제공하는, 추가적인 절편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 절편을 포함하는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 이러한 추가적인 절편은 프로모터 및 종결자 서열, 및 선택적으로 하나 이상의 복제 기원, 하나 이상의 선택가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 서열등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA 로부터 유래되거나, 양 요소를 포함할 수 있다.
이소형: 은 다른 유전자 또는 교체 스프라이싱에 의해 같은 유전자로부터 생산될 수 있는 다른 형태의 단백질을 말한다. 어떤 경우에, 이소형은 그들의 운반 활성, 발생의 발현 시간, 조직 분배, 세포내 배치 또는 이들의 성질의 조합에서 다르다.
분리 뉴클레오티드: 는 그것의 천연 유전적 환경으로부터 제거된 폴리뉴클레오티드를 나타내므로, 다른 외인성 또는 원하지 않는 암호화서열이 결여되고, 유전적으로 설계된 단백질 생산 시스템에서의 사용에 적당한 형태이다. 이러한 분리 분자는 그들의 천연 환경으로부터 분리된 분자이고 cDNA 및 게놈 클론을 포함한다. 본 발명의 분리 DNA 분자는 그들이 통상 관련되는 다른 유전자가 결여되지만, 프로모터 및 종결자와 같은 자연 발생하는 5' 및 3' 비번역 부위를 포함할 수 있다. 관 련 부위의 확인은 당업계의 통상의 지식을 가진자에게 자명할 것이다. (예를 들어, Dynan 및 Tijan, Nature 316: 774-78,1985 참조).
분리 폴리펩티드 또는 단백질: 은 혈액 및 동물 조직을 제외한 것과 같은 천연 환경을 제외한 조건에서 발현된 폴리펩티드 또는 단백질이다. 바람직한 형태에서, 분리 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드, 구체적으로는 동물기원의 다른 폴리펩티드가 상당히 결여된다. 매우 정제된 형태, 즉, 95 % 순도 이상, 더욱 바람직하게는 99 % 순도 이상으로 폴리펩티드를 제공하는 것이 바람직하다. 본 명세서에서 사용될 때, 용어 "분리" 는 이량체 또는 글리코실화 또는 유도된 형태와 같은 다른 물리적 형태의 폴리펩티드의 존재를 배제하지 않는다.
작동가능한 연결: 뉴클레오티드 절편에 적용될 때, 용어, "작동가능한 연결"은 절편이 예를 들어, 전사가 프로모터에서 개시되고 암호화 절편을 통해 종결자까지 진행하는 그들의 의도된 목적에 관하여 기능하도록 배열되는 것을 나타낸다.
오르토로그: 는 서로 다른 종의 폴리펩티드 또는 단백질의 기능적 상응물인 한 종으로부터 얻은 폴리펩티드 또는 단백질을 나타낸다. 오르토로그 사이의 서열 차이는 종형성의 결과이다.
폴리뉴클레오티드:는 5' 에서 3' 말단으로 해독된 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-가닥 폴리머를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 RNA 및 DNA 를 포함하고, 시험관내에서 합성된 천연원으로부터 분리될 수 있거나, 천연 및 합성 분자의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 크기는 염기쌍 (약어 "bp"), 뉴클레오티드 ("nt"), 또는 킬로베이스 ("kb")로 표현된다. 명세서에서 허용하는 경우에, 후자의 두 용어는 단일-가닥 또는 이중-가닥인 폴리펩티드를 개시할 수 있다. 용어가 이중-가닥 분자에 적용될 때, 전체 길이를 나타내도록 사용되고, 용어 "염기쌍" 과 동일하게 이해될 것이다. 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 2 개의 가닥은 길이면에서 약간 다를 수 있고, 그것의 말단은 효소적 절단의 결과로 서로 엇갈릴 수 있다는 것이 당업자에게 인지될 것이다; 그러므로 이중-가닥 폴리뉴클레오티드내의 모든 뉴클레오티드가 쌍을 형성하는 것은 아니다. 이러한 짝지워지지 않은 말단은 일반적으로 길이면에서 20 nt 를 초과하지 않을 것이다.
폴리펩티드 : 는 천연적 또는 합성적으로 생산되든지 펩티드 결합으로 결합된 아미노산 잔기의 폴리머이다. 일반적으로, 약 10 아미노산 잔기이하의 폴리펩티드를 "펩티드"로 말한다.
프로모터: 는 RNA 폴리머라제의 결합 및 전사의 개시를 제공하는 DNA 서열을 포함하는 유전자의 부분을 나타낸다. 프로머터 서열은 항상 그러한 것은 아니지만, 일반적으로 유전자의 5' 비-암호화 부위에서 발견된다.
단백질: 은 하나이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 거대분자이다. 단백질은 또한 카르보히드레이트기와 같은 비-펩티드 성분을 포함할 수 있다. 카르보히드레이트 및 다른 비-펩티드 치환은 단백질이 생산되는 세포에 의해 단백질에 첨가될 수 있고, 세포의 형태에 따라 다양할 것이다. 단백질은 본 명세서에서 그들의 아미노산 골격 구조의 관점에서 정의되고; 카르보히드레이트기와 같은 치환기는 일반적으로 특정되지는 않지만, 그럼에도 불구하고 존재할 수 있다.
수용체 : 생물학적활성 분자("리간드") 에 결합하고 세포에 대한 리간드의 효과를 매개하는 세포-결합 단백질, 또는 이러한 단백질의 폴리펩티드 서브유닛이다. 수용체와 리간드의 결합은 수용체의 효과기 도메인(들)과 세포내 다른 분자(들) 사이의 상호작용을 일으키는 수용체의 변화를 초래한다. (그리고, 어떤 경우에, 즉, 동일한 또는 다른 수용체 서브유닛의 결합인 수용체 다합화) 차례로, 이러한 상호작용은 세포내 물질대사의 변화를 초래한다. 수용체-리간드 상호작용에 연결된 물질대사 이벤트는 유전자 전사, 인산화, 탈인산화, 세포 증식, 환상 AMP 생산 증가, 세포내 칼슘의 이동, 막지질의 이동, 세포 흡착, 이노시톨 지질의 가수분해 및 인지질의 가수분해를 포함한다. BR43x2 는 본 명세서에 더욱 자세하게 개시된 대로 TNF 수용체의 특징을 가진다.
분비 신호 서열: 더 큰 폴리펩티드의 성분으로서 폴리펩티드("분비 펩티드")를 암호화하는 DNA 서열은 그것이 합성되어지는 세포의 분비 경로를 통해 더 큰 폴리펩티드를 일정방향으로 향하게 한다. 더 큰 폴리펩티드는 일반적으로 분비 경로를 통해 전달되는 동안 분비 펩티드를 제거하도록 절단된다.
가용성 수용체: 세포막에 결합하지 않는 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는 트랜스멤브레인 및 세포질 도메인이 결여된 가장 일반적인 리간드-결합 수용체 폴리펩티드이다. 가용성 수용체는 폴리펩티드의 정제를 제공하거나, 기질에 폴리펩티드의 부착 위치를 제공하는 친화성 표지와 같은 추가적인 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 많은 세포-표면 수용체는 교체적으로 스프라이싱된 mRNA 로부터 단백질가수분해 또는 번역되어 생산된 천연 발생, 가용성 상응물을 가진다. 수용체 폴리펩티드는 그들이 막고정 또는 신호 트랜스덕션 각각을 제공하기 위한 이들 절편의 충분한 부분이 부족한 경우에, 트랜스멤브레인 및 세포내 폴리펩티드가 상당히 결여된 것으로 말해진다.
정확하지 않은 분석 방법(예를 들어, 겔 전기영동)으로 측정된 폴리머의 분자량 및 길이는 대략적인 값으로 이해될 것이다. 이러한 값이 "약" X 또는 " 대략 "X" 로 표현될 때, 언급된 X 의 값은 ±10 % 의 정확성으로 이해될 것이다.
본 명세서에 언급된 참조문헌은 전체로서 참조로 수록된다.
본 발명은 부분적으로 1192 bp DNA 서열(SEQ IC NO:1) 및 수용체 TACI 의 이소형인, 상응하는 폴리펩티드 서열 (SEQ ID NO:2)의 발견에 기초한다. 이소형은 BR43x2 로 나타냈다. BR43x2 의 가용성 형태는 SEQ ID NO:4에 개시되고, 가용성 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3 에 개시된다. 본 명세서에서 더 자세하게 개시될 때, 본 발명의 BR43x2 수용체-암호화 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 인간 RPMI 1788 라이브러리 및 N- 또는 C-말단 FLAG-표지, 비오틴- 또는 FITC-표지 종양 괴사 인자 리간드 ztnf4 (현재는 뉴트로킨 α 로 알려짐) (WIPO W098/18921), BLyS (Moore et al., 상기참조.), BAFF (Schneider et al., 상기참조.), TALL-1 (Shu et al., 상기참조.) 또는 THANK (Mukhopadhyay et al., 상기참조.) 를 사용하여 신호 트랩 클로닝으로 최초로 확인되었다. 양성 풀은 리간드 결합으로 확인되었고, 단일클론으로 분해되고, cDNA 분리되고, 서열결정되었다. 공지된 종양 괴사 인자 수용체와 BR43x2 추론 아미노산 서열(SEQ ID NO:2 로 표시될 때)의 비교는 BR43x2 가 단일의 보존력이 떨어지는, 시스테인-풍부 위-반복을 가지는 TACI 의 이소형이라는 것을 나타냈다.
구조적으로, TNF 수용체 부류는 사실상, "시스테인-풍부 위-반복"으로 명명된 몇 개의 모듈로 구성된 세포외 부분을 특징으로 한다. 전형적인 TNFR 부류 원소는 4 개의 이러한 위-반복을 가지고, 각각은 길이 약 29-43 잔기이고, 각각은 오른쪽으로 배열된다. 전형적인 위-반복은 6 시스테인 잔기를 가진다. 그들은 공통 조상 모듈로부터 기원된 것 같지만, 정확하게 반복하지는 않기 때문에, 위-반복으로 명명된다: 위-반복 #1, #2, #3 및 #4 는 각각을 다른 것과 구별시키는 특징적인 서열 특징을 가진다. p55 TNF 수용체의 결정구조는 하나의 접힌 도메인에 상응하는 각각의 위-반복, 그리고 모든 4 개의 위-반복이 접혀서 이황화결합에 의해 내부적으로 함께 결합된 동일한 4 차 구조로 형성되는 것을 보여주었다.
TACI 는 첫번째는 TNF 수용체 부류의 다른 요소와 구조적으로 보존적이고, 두번째는 덜 보존적인, 두개의 시스테인-풍부 위-반복, (von Bulow 및 Bram, 상기참조.)을 포함한다. 본 발명의 BR43x2 이소형은 덜 보존적 반복인 두번째만 보유하고, 첫번째 TACI 시스테인-풍부 위-반복을 결여한다.
SEQ ID NO:2 로 표시된 BR43x2 의 추론된 아미노산 서열의 서열 분석은 하나의 시스테인-풍부 위-반복 (SEQ ID NO: 2의 잔기 25-58) , 트랜스멤브레인 도메인 (SEQ ID NO: 2의 잔기 121-133) 및 세포질 도메인 (SEQ ID NO: 2 의 잔기 134-247)을 포함하는 세포외 도메인(SEQ ID NO:2 의 잔기 1-120)을 가지는 완성형 단백질의 존재를 나타낸다. BR43x2 의 시스테인-풍부 위-반복은 6 개의 보존된 시스테인 잔기 (SEQ ID NO: 2 의 잔기 25,40,43,47,54 및 58), 보존된 아스파르트산 잔기(SEQ ID NO: 2 의 잔기 34) 및 두개의 보존된 루신 잔기(SEQ ID NO: 2 의 잔기 36 및 37)을 가지고, TACI(SEQ ID NO:6) 의 제 1 의 시스테인-풍부 위-반복과 46% 동일성 및 BCMA(SEQ ID NO:8) 의 시스테인-풍부 위-반복과 35 % 동일성을 공유한다. (도 1) 시스테인-풍부 위 반복은 하기의 모티프로 표시될 수 있다:
CX[QEK][QEKNFDHS][QE]×{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2}C[IMLV]XCX{3}CX{6-8}CX{2}[YF]C (SEQ ID NO:10) ,
여기에서 C 는 아미노산 잔기 시스테인, Q 글루타민, E 글루탐산, K 리신, N 아스파라긴, R 아르기닌, D 아스파라트산, H 히스티딘, S 세린, Y 티로신, F 페닐알라닌, W 트립토판, L 루신, I 이소루신, V 발린을 나타내고, X 는 시스테인을 제외한 어느 천연 발생 아미노산 잔기를 나타낸다. 사각 모난 괄호 "[]" 에서 아미노산 잔기는 그 위치에서 허용된 아미노산 잔기 변이를 나타낸다. 중괄호 "{}" 에서 숫자는 그 위치에서 허용된 아미노산 잔기의 숫자를 나타낸다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:10 에 의해 제공될 때 길이 32 내지 40 아미노산 잔기의 가용성 폴리펩티드를 제공한다.
SEQ ID NO:4 의 잔기 1-120 으로 나타날때, 가용성 BR43x2 수용체는 하나의 시스테인-풍부 위-반복 (SEQ ID NO:4 의 잔기 25-58) 을 포함하고, SEQ ID NO:2 로 개시될때 BR43x2 의 트랜스멤브레인 및 세포질 도메인을 결여한다.
당업자는 이러한 도메인 경계가 대략적이고, 공지된 단백질과의 배열 및 단백질 접힘의 예견에 기초한다는 것을 인지할 것이다. 이러한 특징은 SEQ ID NOs:1 및 3 의 DNA 서열에 의해 암호화된 수용체가 TNF 수용체 부류의 요소이다는 것을 나타낸다.
BR43x2 발현을 검출하도록 예정된 BR43x1 에 대한 뉴클레오티드 프로브에 상응하는 mRNA 의 조직 분배의 노던 블럿 및 도트 블럿 분석은 비장, 림프절, CD19+ 세포에서의 발현, 혼합된 림프구 반응세포, Daudi 및 Raji 세포에서의 약한 발현을 보여주었다. 역전사효소 PCF BR43x1 의 사용은 B 세포에서만 검출되었고, TACI 에 대해 보고된 바와 같이 (von Bulow 및 Bram, 상기참조.)활성화된 T 세포에서는 검출되지 않았다. 상응하는 TACI 서열과 100 % 오버랩하는 BR43x2 프로브의 사용으로, TACI 및 BR43x2 를 비장, 림프절 및 작은 창자, 위, 침샘, 충수, 폐, 골수, 태아 비장, CD 19+ 세포, 및 Raji 세포에서 검출했다.
노던 블럿 분석의 사용으로, BCMA 를 작은 창자, 비장, 위, 결장, 충수, 림프절, 기관, 및 고환에서 검출했다. BCMA 를 또한 선림프종, 비-호즈킨 림프종, 및 이하선 종양에서 검출했고, CD 8+, CD 19+, MLR 세포, Daudi, Raji 및 Hut 78 세포에서 약간 검출했다.
노던 블럿 분석을 또한 쥐의 ztnf4 (SEQ ID NO: 19) 및 유사 인간 TACI , BCMA, 및 BR43x2 를 사용하여 행했고, 쥐의 ztnf4 발현은 비장 및 흉선에서 우세하게 검출되었다. 쥐의 ztnf4 는 또한 폐에서 발현되었고, 피부 및 심장에서 희미한 발현이 검출되었다.
본 발명은 또한 본 명세서에 개시된 BR43x2 를 암호화하는 DNA 및 RNA 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 분자를 제공한다. 당업자는 유전 코드의 축중의 관 점에서, 이러한 폴리뉴클레오티드 분자 사이에서 상당한 서열 변이가 가능할 것이라는 것을 쉽게 인지할 것이다. SEQ ID NO: 11 은 SEQ ID NO:4 의 가용성 BR43x2 폴리펩티드를 암호화하는 모든 DNA 를 포함하는 축중 DNA 서열이다. 유사하게, SEQ ID NO:12 는 SEQ ID NO:2 의 가용성 BR43x2 폴리펩티드를 암호화하는 모든 DNA를 포함하는 축중 DNA 서열이다. 당업자는 SEQ ID NO:12 의 축중 서열이 또한 T 를 U 로 치환함으로서, SEQ ID NO:4 를 암호화하는 모든 RNA 서열을 제공한다는 것을 인지할 것이다. 그러므로, SEQ ID NO:11 의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 360, SEQ ID NO:12 의 뉴클레오티드 1 내지 741 및 그들의 RNA 등가물을 포함하는 BR43x2 폴리펩티드-암호화 폴리뉴클레오티드가 본 발명에 의해 기대된다. 표 1 은 축중 뉴클레오티드 위치를 표시하기 위해 SEQ ID NO:11 및 12 에 사용된 한-문자 코드를 제시한다. "분석" 은 코드 문자에 의해 표시된 뉴클레오티드이다. "보체"는 상보적인 뉴클레오티드(들)에 대한 코드를 나타낸다. 예를 들어, 코드 Y 는 C 또는 T 를 나타내고, 그것의 보체 R 은 A 또는 G , T 에 상보적인 A, 및 C 에 상보적인 G 를 나타낸다.
Figure 112001016752501-pct00001
주어진 아미노산에 대한 모든 가능한 코돈을 포함하는 SEQ ID NO :11 및 12 에 사용된 축중 코돈은 표 2 에 제시된다.
Figure 112001016752501-pct00002
당업계에서 통상의 기술을 가진자는 각각의 아미노산을 암호화하는 모든 가능한 코돈을 나타내는 축중 코돈을 결정할 때 어떤 불명료함이 도입된다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 세린(WSN) 에 대한 축중 코돈은 어떤 경우에, 아르기닌(AGR)을 암호화하고, 아르기닌(MGN)에 대한 축중 코돈은 어떤 경우에, 세린(AGY)를 암호화한다. 페닐알라닌과 루신을 암호화하는 코돈 사이에 유사한 상호관계가 존재한다. 그러므로, 축중 서열로 둘러쌓인 어떤 폴리뉴클레오티드는 변이체 아미노산 서열을 암호화할 수 있으나, 당업계의 통상의 기술을 가진자는 SEQ ID NO:2 및 4 의 아미노산을 기준으로 하여 이러한 변이체 서열을 쉽게 확인할 수 있다. 변이체 서열은 본 명세서에 개시된 대로 기능성에 대해 쉽게 시험될 수 있다.
당업계에서 통상의 기술을 가진자는 또한 다른 종이 "바람직한 코돈 이용" 을 나타낼 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, Grantham, et al., Nuc. Acids Res. 8 : 1893-912,1980; Haas, et al. Curr. Biol. 6: 315-24,1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13: 355-64, 1981; Grosjean 및 Fiers, Gene 18: 199-209,1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87,1986; Ikemura, J. Mol. Biol.158 : 573-97,1982 참조. 본 명세서에 사용될 때, 용어, "바람직한 코돈 이용" 또는 "바람직한 코돈"은 어떤 종의 세포에서 가장 흔하게 사용되는 단백질 번역 코돈을 말하는 당업계의 용어이므로, 각 아미노산을 암호화하는 하나 또는 몇 개의 대표적인 가능한 코돈을 확증하는 용어이다. (도 2 참조) 예를 들어, 아미노산 트레오닌(Thr)은 ACA, ACC, ACG, 또는 ACT 에 의해 암호화될 수 있으나, 포유동물 세포에서 ACC 가 가장 흔하게 사용되는 코돈이고; 곤충 세포, 효모, 바이러스 또는 세균과 같은 다른 종에서, 다른 Thr 코돈이 바람직할 수 있다. 특정 종에 대한 바람직한 코돈은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 도입될 수 있다. 재조합 DNA 로 바람직한 코돈 서열의 도입은 예를 들어, 특정 세포 형태 또는 종에서 더욱 효율적인 단백질 번역을 유발하여 단백질의 생산을 증가시킬 수 있다. 그러므로, SEQ ID NO:11 및 12 로 개시된 축중 코돈 서열은 당업계에서 통상 사용되고 본 명세서에서 개시된, 다양한 세포 형태 및 종에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 최적화하기 위한 주형으로 사용된다. 바람직한 코돈을 포함하는 서열은 다양한 종에서 시험가능하고 발현을 위해 최적화될 수 있고, 본 명세서에 개시된 대로 기능성에 대해 시험될 수 있다.
BR43x 2 의 시스테인-풍부 위-반복의 매우 보존적인 아미노산은 새로운 부류 요소의 확인을 위한 수단으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 역 전사-폴리머라제 사슬 반응(RT-PCR) 은 다양한 조직 원 또는 세포 라인으로부터 얻어진 RNA 로부터 상기에 개시된 세포외 리간드-결합 도메인을 암호화하는 서열을 증폭시키는 데 사용될 수 있다. 구체적으로는, BR43x2 서열로부터 설계된 고 축중 프라이머가 이러한 목적을 위해 사용된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 분리된 폴리뉴클레오티드는 엄격한 조건하에서, SEQ ID NO:3 의 유사한 크기 부위, 또는 그것에 상보적인 서열에 혼성화할 것이다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH 에서 특정 서열에 대한 열 융점(Tm) 보다 약 5℃ 낮게 선택된다. Tm 은 표적 서열의 50 % 가 대응된 프로브와 완벽하게 혼성화하는 온도(규정된 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 전형적인 엄격한 조건은 염농도가 pH 7 에서 약 0.03 M 이하이고, 온도가 적어도 약 60 ℃ 인 조건이다.
상기에 지적된 대로, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오티드는 DNA 및 RNA 를 포함한다. DNA 및 RNA 의 분리 방법은 당업계에 공지된다. DNA 는 또한 다른 조직으로부터 RNA 를 사용하여 준비되고, 게놈 DNA 로서 분리될 수 있지만, 일반적으로 RPMI 1788 세포, PBMNCs, 휴지 또는 활성화 트렌스펙션된 B 세포 또는 편도선 조직으로부터 RNA 를 분리하는 것이 바람직하다. 총 RNA 는 구아니딘 HC1 추출에 이어 CsCl 구배에서 원심분리에 의한 분리를 사용하여 준비될 수 있다. (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979). 폴리 (A)+ RNA 는 Aviv 및 Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-12,1972)의 방법을 사용하여 총 RNA 로부터 준비된다. 상보적인 DNA (cDNA) 는 공지된 방법을 사용하여 폴리 (A)+ RNA 로부터 준비된다. 그 때, BR43x2 를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 확인되고, 예를 들어, 혼성화 또는 PCR 로 분리된다.
당업자는 SEQ ID NO: 1 및 3 에 개시된 서열이 인간 유전자의 단독 대립유전자를 나타내고, 대립 변이 및 교체 스플라이싱의 발생이 기대된다는 것을 인지할 것이다. 잠재적 돌연변이를 포함하는 대립 변이체 및 돌연변이가 아미노산 서열 변화를 초래하는 대립 변이체를 포함하는, SEQ ID NO:1 및 3 에서 보여진 DNA 서열의 대립 변이체는 단백질이 SEQ ID NO:2 및 4의 대립 변이체인것과 같이, 본 발명의 범위내이다. 대립 변이체 및 이러한 서열의 스플라이스 변이체는 당업계에 알려진 표준 과정에 따라, 서로 다른 개인 또는 조직으로부터 cDNA 또는 게놈 라이브러리를 프로브하여 클론될 수 있다.
본 발명은 또한 SEQ ID NO:2 및 4 의 폴리펩티드에 상당히 상동적인 분리된 BR43x2 폴리펩티드 및 그들의 종 오르토로그를 제공한다. 용어 "상당히 상동적인" 것은 본 명세서에서 SEQ ID NO:2 및 4 또는 그들의 오르토로그에서 보여진 서열과 50 %, 바람직하게는 60 %, 더욱 바람직하게는 적어도 80% 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 나타내는데 사용된다. 이러한 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 또는 그것의 오르토로그에 적어도 90 % 동일성, 및 가장 바람직하게는 95 % 또는 그이상의 동일성일 것이다. % 서열 동일성은 종래의 방법으로 결정된다. 예를 들어, Altschul et al., Bull.Math. Bio.48: 603-66, 1986 및 Henikoff 및 Henikoff, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89:10915-9,1992 참조. 요약하면, 두개의 아미노산 서열은 갭 오프닝 페널티 10 , 갭 신장 페널티 1 , 및 표 3 에서 보여진대로, Henikoff 및 Henikoff(상기참조.)의 "blosum 62" 스코어 매트릭스를 사용하여 배열 스코어를 최적화하기 위해 배열된다. 그 때, % 동일성은 하기와 같이 계산된다.
동일한 매치의 총수 x 100
[ 더긴 서열의 길이 + 두 서열을 배열하기 위해 더 긴
서열에 도입된 갭의 수]
Figure 112001016752501-pct00003
폴리뉴클레오티드 분자의 서열 동일성은 상기에 개시된 대로 비율을 사용하여 유사한 방법으로 결정된다.
상당히 상동성 단백질 및 폴리펩티드는 하나이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가를 가지는 것을 특징으로 한다. 이러한 변화는 바람직하게는 보존적인 아미노산 치환 (표 4 참조)인 마이너 성질이고, 폴리펩티드의 접힘 또는 활성에 중요한 영향을 주지않는 다른 치환, 작은 결실, 전형적으로 하나 내지 30 아미노산; 및 아미노-말단 메티오닌 잔기, 약 20-25 잔기이하의 작은 링커 펩티드와 같은 작은 아미노- 또는 카르복시-말단 신장, 또는 친화성 표지이다. 친화성 표지를 포함하는 폴리펩티드는 BR43x2 폴리펩티드 및 친화성 표지사이의 단백질분해 절단을 더 포함 한다. 바람직한 이러한 위치는 트롬빈 절단 위치 및 인자 Xa 절단 위치를 포함한다.
Figure 112001016752501-pct00027
20 개의 표준 아미노산에 추가하여, 본 발명의 BR43x2 폴리펩티드의 아미노산 잔기가 비-표준 아미노산 (예를 들어, 4-히드록시프로린, 6-N -메틸 리신, 2-아미노이소부틸산, 이소발린 및 a-메틸 세린)으로 치환될 수 있다. BR43x2 폴리펩티드 아미노산 잔기가 한정된 수의 비-보존적 아미노산, 유전 코드에 의해 암호화되지 않는 아미노산, 및 비자연적 아미노산으로 치환될 수 있다. 본 발명의 단백질은 또한 자연 비-발생 아미노산 잔기를 포함한다.
자연 비-발생 아미노산은 트랜스-3-메틸프로린, 2,4-메타노프로린, 시스-4-히드록시프로린, 트랜스-4-히드록시-프로린, N-메틸글리신, 알로-트레오닌, 메틸트레오닌, 히드록시-에틸시스테인, 히드록시에틸-호모시스테인, 니트로-글루타민, 호 모글루타민, 피페콜산, 4 차-루신, 노르발린, 2-아자페닐알라닌, 3-아자-페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 및 4-플루오로-페닐알라닌을 제한없이 포함한다. 비-자연 발생 아미노산 잔기를 단백질에 삽입하기 위한 몇개의 방법이 당업계에 공지된다. 예를 들어, 화학적으로 아마노아실화된 억제 tRNA를 사용하여 넌센스 돌연변이가 억제될 수 있는 시험관 시스템이 사용될 수 있다. 아미노산을 합성하는 방법 및 tRNA 를 아미노아실화하는 방법이 당업계에 공지된다. 넌센스 돌연변이를 포함하는 플라스미드의 전사 및 번역은 E.Coli S30 추출물 및 상업적으로 이용가능한 효소 및 다른 시약을 포함하는 무세포 시스템에서 수행된다. 단백질은 크로마토그래피에 의해 정제된다. 예를 들어, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722,1991; Ellman et al.,Methods Enzymol. 202: 301,1991; Chung et al., Science 259: 806-9,1993; 및 Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci.USA 90: 10145-9,1993 참조. 제 2 의 방법에서, 번역은 돌연변이화된 mRNA 의 미세주입 및 화학적으로 아미노아실화된 억제 tRNAs에 의해 Xenopus 난모세포에서 수행된다. (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-8,1996). 제 3 의 방법에서, E.Coli 세포는 대체가능한 천연 아미노산(예를 들어, 페닐알라닌) 의 부재 및 바람직한 자연 비발생 아미노산(들) (예를 들어, 2-아자페닐알라닌, 3-아자페닐알라닌, 4-아자페닐알라닌, 또는 4-플로오로-페닐알라닌)의 존재하에서 배양된다. 자연 비-발생 아미노산은 그것의 천연 상응물을 대신하여 단백질에 삽입된다. Koide et al., Biochem. 33: 7470-6,1994 참조. 자연적으로 발생하는 아미노산 잔기는 시험관내에서 화학적 변형에 의해 비-자연적으로 발생하는 종으로 전환될 수 있다. 화학적 변형은 부위-특이적 돌연변이화와 결합되어 치환의 범위를 더 확장할 수 있다. (Wynn 및 Richards, Protein Sci. 2: 395-403,1993).
BR43x2 아미노산 잔기가 제한된 수의 비-보존적 아미노산, 유전 코드에 의해 암화화되지 않는 아미노산, 비-자연적으로 발생하는 아미노산, 및 비천연 아미노산으로 치환될 수 있다.
본 발명의 BR43x2 폴리펩티드의 필수 아미노산은 부위-특이적 돌연변이화 또는 알라닌-스캐닝 돌연변이화와 같은 당업계에서 공지된 과정에 따라 확인될 수 있다. (Cunningham 및 Wells, Science 244: 1081-5,1989). 단일 알라닌 돌연변이를 분자의 매 잔기에 도입하고, 결과의 돌연변이 분자를 분자 활성에 필수적인 아미노산 잔기를 확인하기 위해 생물학적 활성(예를 들어, 면역 반응동안 B 세포 반응의 감소, 자가항체 생산에서 저해 또는 감소의 제공)에 대해 시험한다. Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699-708,1996 참조. 생물학적 상호작용 위치, 시스테인-풍부 위-반복과 같은 리간드 결합 부위는 추정상의 접촉 위치 아미노산의 돌연변이와 결합하여, 핵 자기공면, 결정학, 전자 회절 또는 광친화성 표지화와 같은 교시에 의해 결정될 때, 또한 구조의 물리적 분석에 의해 결정된다. 예를 들어, de Vos et al., Science 255: 306-12,1992 ; Smith et al., J.Mol. Biol. 224: 899-904,1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64,1992 참조. 필수 아미노산의 확인은 TACI 및 BCMA 와 같은 관련 TNFR 부류 요소와 상동성 분석으로부터 추론될 수 있다.
추가적인 아미노산 치환은 보존 시스테인, 아스파르트산 및 루신 잔기가 보 유되고 고차 구조가 파괴되지 않는 한, BR43x2 의 시스테인-풍부 위-반복내에서 만들어질 수 있다. 다른 시스테인-풍부 위-반복의 서열을 기준으로 BR43x2 의 시스테인-풍부 위-반복내에서 치환을 하는 것이 바람직하다. SEQ ID NO: 10 은 이러한 배열에 기초하여 허용가능한 아미노산 치환을 보여주는 일반화된 시스테인-풍부 위-반복이다. 이 도메인과의 치환은 본 명세서에 제시된 한계에 놓여진다.
복합 아미노산 치환은 Reidhaar-Olson 및 Sauer (Science 241:53-7,1998) 또는 Bowie 및 Sauer (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86 :2152-6, 1989) 에 개시된 방법과 같은, 공지된 돌연변이화 및 스크리닝 방법을 사용하여 만들어지고 시험될 수 있다. 요약하면, 이들 저자들은 폴리펩티드에서 둘 이상의 위치를 동시에 무작위하는 방법, 기능적 폴리펩티드를 선택하는 방법, 및 그 다음 각 위치에서 허용가능한 치환의 스펙트럼을 결정하기 위해 돌연변이화된 폴리펩티드를 서열결정하는 방법을 개시한다. 사용가능한 다른 방법은 파지 전개(예를 들어, Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7,1991; Ladner et al., U. S. 특허번호 5,223,409; Huse, WIPO 공개번호 WO 92/06204 참조) 및 부위-특이적 돌연변이화 (Derbyshire et al., Gene 46: 145,1986; Ner et al., DNA 7: 127,1988 참조)를 포함한다.
개시된 BR43x2 DNA 및 폴리펩티드 서열의 변이체는 Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10747-51, 1994 및 WIPO 공개 WO 97/20078 에 개시된 대로 DNA 셔플링을 통해 생산될 수 있다. 요약적으로, 변이체 DNA 는 모 DNA 의 무작위 단편화에 이어 PCR 을 사용한 재합성에 의해 시험관내에서 상동 재조합으로 생산되고, 무작위로 도입된 점 돌연변이를 초래한다. 이 기법은 과정에 추가적인 다양성을 도입하기 위해, 대립 변이체 또는 서로 다른 종의 DNA 와 같은 모 DNA 의 부류를 사용하여 변형될 수 있다.바람직한 활성에 관한 선택 또는 스크리닝에 이어서 돌연변이의 추가적인 반복 및 분석은 유해한 변화에 대해 동시 선택동안 바람직한 돌연변이를 선택함으로서 빠른 서열의 "진화"를 제공한다.
상기에 개시된대로 돌연변이화 방법은 숙주 세포에서 클론되고, 돌연변이화된 폴리펩티드의 활성을 검출하기 위해 고-산출량, 자동화 스크리닝 방법과 결합될 수 있다. 활성화 폴리펩티드를 암호화하는 돌연변이화 DNA 분자(예를 들어,면역반응동안 B 세포 반응의 감소, 자가항체 생산에서 질환의 저해 또는 감소를 제공)는 숙주 세포로부터 회수가능하고 현대 장비를 사용하여 빠르게 서열결정된다. 이러한 방법은 관심의 폴리펩티드에서 중요한 개개의 아미노산 잔기의 빠른 결정을 허용하고, 미공지 구조의 폴리펩티드에 적용될 수 있다.
상기에 논의된 방법을 사용하여, 당업계에서 통상의 기술을 가진자는 SEQ ID NO:2 의 잔기 1 내지 120 또는 그것의 대립 변이체에 상당히 상동적이고, 야생형 단백질의 B 세포 억제 특성을 보유하는 다양한 폴리펩티드를 확인 및/또는 제조할 수 있다. 이러한 폴리펩티드는 종양 괴사 인자 수용체 상위부류의 다른 요소로부터의 추가적인 아미노산 또는 도메인, 친화성 표지등을 포함할 수 있다. TNFR 상위부류의 다른 요소의 기능적 도메인을 포함하는 BR43x2 폴리펩티드 또는 융합 구조체는 변형된 B 세포 억제 능력을 나타내는 하이브리드 종양 괴사 인자 수용체를 구성한다.
본 발명은 다른 종(오르토로그)로부터 상응 수용체 및 폴리뉴클레오티드를 더 제공한다. 이러한 종은 포유동물, 조류, 양서류, 파충류, 어류, 곤충 및 다른 척추동물 및 무척추동물 종을 제한없이 포함한다. 구체적인 관심은 쥐의, 돼지, 양, 소, 개, 고양이, 말, 및 다른 영장류 수용체를 포함하는 다른 포유동물 종의 BR43x2 수용체이다. 인간 BR43x2 수용체의 오르토로그는 종래의 클로닝 기법과 결합하여 본 발명에서 제공된 정보 및 조성물을 사용하여 클론될 수 있다. 예를 들어, cDNA 는 수용체를 발현하는 조직 또는 세포 형태로부터 얻어진 mRNA 를 사용하여 클론될 수 있다. mRNA 의 적당한 원은 본 명세서에 개시된 서열로부터 설계된 프로브를 가지고 노던 블럿을 프로브하여 확인될 수 있다. 그 때, 라이브러리는 양성 조직 또는 세포 라인의 mRNA 로부터 제조된다. 그 때, 수용체-암호화 cDNA 는 전체 또는 부분적인 인간 cDNA 로 프로브하거나, 개시된 서열에 기초한 축중 프로브의 하나 이상의 셋트로 프로브하는 것과 같은 다양한 방법에 의해 분리될 수 있다. cDNA 는 또한, 본 명세서에 개시된 서열로부터 설계된 프라이머를 사용하여 PCR 로 클론될 수 있다. 추가적인 방법에서, cDNA 라이브러리는 숙주 세포를 형질전환 또는 트랜스펙트시키는 데 사용가능하고, 관심의 cDNA 의 발현은 수용체에 대한 항체를 가지고 검출될 수 있다. 유사한 기법이 게놈 클론의 분리에 또한 적용될 수 있다.
전-길이 수용체 폴리펩티드, 가용성 수용체 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편, 및 융합 폴리펩티드를 포함하는 본 발명의 수용체 폴리펩티드는 종래의 기법에 따라 유전적으로 설계된 숙주 세포에서 생산될 수 있다. 적당한 숙주 세포는 외인성 DNA 로 형질전환되거나 트랜스펙션될 수 있고, 배양물에서 배양될 수 있는 세포 형태이고, 세균, 균류 세포, 및 배양된 고등 진핵 세포를 포함한다. 진핵 세포, 구체적으로는 다세포 유기물의 배양 세포가 바람직하다. 클론된 DNA 분자를 조작하고 외인성 DNA 를 다양한 숙주 세포에 도입하는 기법은 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, NY, 1989 ; 및 Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley 및 Sons, Inc.,NY, 1987 에 개시된다.
일반적으로, BR43x2 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열은 발현 벡터내에서 일반적으로 전사 프로모터 및 종결자를 포함하며, 그것의 발현에 필요한 다른 유전적 요소에 작동가능하게 연결된다. 당업자는 어떤 시스템내에서 선택가능한 마커는 별개의 벡터상에서 제공될 수 있고, 외인성 DNA 의 복제는 숙주 세포 게놈으로 삽입되어 제공될 수 있다는 것을 인지하겠지만, 벡터는 또한 일반적으로 하나 이상의 선택 마커 및 하나이상의 복제 기점을 포함할 것이다. 프로모터, 종결자, 선택 마커, 벡터 및 다른 요소의 선택은 당업계의 통상의 기술 수준에서 통상의 설계 문제이다. 많은 이러한 요소가 문헌에 개시되고, 상업적 제품공급자를 통해 이용가능하다.
BR43x2 폴리펩티드를 숙주 세포의 분비 경로에 특정하기 위해서, 분비 신호 서열(또한 신호 서열로 공지된, 리더 서열, 프리프로 서열 또는 프리 서열)은 발현 벡터에서 제공된다. 분비 신호 서열은 BR43 x2 폴리펩티드의 서열이거나, 다른 분비 단백질(예를 들어, t-PA)로부터 유래되거나, 새로이 합성될 수 있다. 분비 신호 서열은 올바른 해독 프레임에서 BR43x2 DNA 서열에 연결되고, 숙주 세포의 분비 경로로 새로이 합성된 폴리펩티드를 지정하도록 위치된다. 어떤 신호 서열은 관심의 DNA 의 어디에나 위치할 수 있지만, 분비 신호 서열은 일반적으로 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 5' 에 위치한다.(예를 들어, Welch et al.,U. S. 특허번호 5,037,743; Holland et al., U. S. 특허번호 5,143,830 참조).
배양된 포유동물 세포는 본 발명내에서 적당한 숙주이다. 외인성 DNA 를 포유동물 숙주 세포에 도입하는 방법은 인산칼슘-매개 트랜스펙션 (Wigler et al., Cell 14: 725,1978; Corsaro 및 Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603,1981; Graham 및 Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), 전기천공(Neumann et al., EMBO J. 1: 841-45, 1982), DEAE-덱스트란 매개 트랜스펙션(Ausubel et al., 상기참조.), 및 리포좀-매개 트랜스펙션(Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73,1993; Ciccarone et al., Focus 15: 80, 1993)을 포함한다. 배양 포유동물 세포에서 재조합 폴리펩티드의 생산은 예를 들어, Levinson et al., U. S. 특허번호 4,713,339; Hagen et al.,U. S. 특허번호 4,784,950; Palmiter et al., U. S. 특허번호 4,579,821; 및 Ringold, U. S. 특허번호 4,656,134 에 개시된다. 적당한 배양 포유동물 세포는 COS-1(ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-72,1977), Jurkat (ATCC No. CRL-8129), BaF3 (쥐의 골수로부터 유래된 인터루킨-3 의존 예비-림프 세포)를 포함한다. Palacios 및 Steinmetz, Cell 41: 727-34, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-5, 1986 참조) 및 차이니스 햄스터 난소 (예를 들어, CHO-K1; ATCC No.CCL 61) 세포 라인 참조. 추가적인 적당한 세포 라인은 당업계에 공지되고, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션, Rockville, Maryland 와 같은 공개 수탁자로부터 이용가능하다. 일반적으로, SV-40 또는 사이토메갈로바이러스의 프로모터와 같은 강한 전사 프로모터가 바람직하다. 예를 들어, U. S. 특허번호 4,956,288. 참조. 다른 적당한 프로모터는 메탈로티오닌 유전자의 프로모터 (U. S. 특허번호 4,579,821 및 4,601,978) 및 아데노바이러스 주 늦은 프로모터를 포함한다.
약제 선택은 일반적으로 외래 DNA 가 삽입된 배양 포유동물 세포 선택에 사용된다. 이러한 세포는 통상 " 트랜스펙턴트" 로 말한다. 선택 약제의 존재하에서 배양되고, 관심의 유전자를 그들의 자손에 전달시킬 수 있는 세포는 "적당한 트랜스펙턴트" 로 말한다. 바람직한 선택마커는 항생제 네오마이신 내성을 암호화하는 유전자이다. 선택은 G-418 등과 같은 네오마이신-형 약제로 수행된다. 선택 시스템은 또한 관심의 유전자의 발현 수준을 증가시키는 데 또한 사용될 수 있고, 과정은 "증폭" 이라한다. 증폭은 낮은 수준의 선택 약제의 존재하에서 트랜스펙턴트를 배양하는 단계 및 그 다음, 도입된 유전자의 산물을 높은 수준으로 생산하는 세포를 선택하기 위해 선택약제의 양을 증가시키는 단계에 의해 수행된다. 바람직한 증폭가능한 선택마커는 메토트렉세이트에 내성을 부여하는 디히드로폴레이트 환원제이다. 다른 약제 내성 유전자 (예를 들어, 히그로마이신 내성, 복합-약제 내성, 퓨로마이신 아세틸트랜스퍼라제)가 또한 사용된다. 그린 형광 단백질과 같은 변형된 표현형을 도입하는 대체 마커 , 또는 CD4, CD8, 유형 I MHC ,태반 알칼리 포스파타 제와 같은 세포 표면 단백질이 FACS 분류 또는 자기 비드 분리 기법과 같은 수단에 의해 이러한 트랜스펙션되지 않은 세포에서 트랜스펙션된 세포를 분류하는 데 사용될 수 있다.
식물 세포, 곤충 세포 및 조류 세포를 포함하여 다른 고등 진핵 세포가 숙주로서 사용될 수 있다. 식물 세포에서 유전자를 발현하는 벡터로서 Agrobacterium rhizogenes 의 사용은 Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58,1987 에서 개관되었다. 곤충세포의 형질전환 및 곤충세포에서 외래 폴리펩티드의 생산은 Guarino et al., U. S. 특허번호 5,162,222 및 WIPO 공개 WO 94/06463 에 개시된다. 곤충 세포는 통상 Autographa californica nuclear polyhedrosis 바이러스 (AcNPV) 로부터 유래된, 재조합 바큐로바이러스를 가지고 감염될 수 있다. King 및 Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; 및 Richardson, Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995 참조. 재조합 BR43x2 바큐로바이러스를 만드는 제 2 의 방법은 Luckow 에 개시된 트랜스포존-기초 시스템을 이용한다. (Luckow, et al., J Virol 67: 4566-79, 1993). 전이벡터 전이를 이용하는 이러한 시스템은 Bac-to-BacTM 키트 (Life Technologies, Rockville, MD)에서 판매된다. 이 시스템은 BR43x2 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 를 " 바크미드" 로 명명된 큰 플라스미드로 E.coli 에 유지되 는 바큐로바이러스 게놈에 이동시키는 Tn7 트랜스포존을 포함하는 전이 벡터, pFastBaclTM (Life Technologies) 를 이용한다. Hill Perkins 및 Possee, J. Gen. Virol. 71: 971-6,1990; Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75: 1551-6,1994; 및, Chazenbalk, 및 Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543-9,1995 참조. 게다가, 전이 벡터는 발현된 BR43x2 폴리펩티드의 C-또는 N-말단에서 Glu-Glu 에피토프 표지와 같은 에피토프 표지를 암호화하는 DNA 와 프레임내 융합을 포함할 수 있다. (Grussenmeyer et al., Proc. Natl.Acad. Sci. 82: 7952-4,1985). 당업계에 공지된 기법을 사용하여, BR43x2 를 포함하는 전이 벡터는 E. coli 로 형질전환되고, 재조합 바큐로바이러스를 나타내는 중단된 lacZ 유전자를 포함하는 바크미드가 스크리닝된다. 재조합 바큐로바이러스 게놈을 포함하는 바크미드 DNA 를 통상의 기법으로 분리하고, Sf9 세포와 같은 Spodoptera frugiperda 세포를 트랜스펙션시키는데 사용한다. BR43x2 를 발현하는 재조합 바이러스가 연이어 생산된다. 재조합 바이러스 저장은 당업계에서 사용된 통상의 방법으로 만들어진다.
재조합 바이러스는 전형적으로 가을 거염벌레, Spodoptera frugiperda 로부터 유래된 세포 라인, 숙주 세포를 감염시키는 데 사용된다. 일반적으로, Glick 및 Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D. C., 1994 참조. 다른 적당한 세포 라인은 Trichoplusia ni 로부터 유래된 고 FiveOTM 세포 라인 (Invitrogen)이다. (U. S. 특허 #5, 300, 435). 상업적으로 이용가능한 무-혈청 배지가 세포를 배양하고 유지하기 위해 사용된다. 적당한 배지는 Sf9 세포에 대한 Sf900 IITM (Life Technologies) 또는 ESF 921TM (Expression Systems) ; 및 T. ni 세포에 대한 Ex-cell0405TM (JRH Biosciences, Lenexa, KS) 또는 Express FiveOTM(Life Technologies) 이다.
세포는 재조합 바이러스 스톡이 0.1 내지 10, 더욱 전형적으로는 거의 3으로 매시간마다 첨가될때 접종밀도 2-5 x 105 세포 내지 밀도 1-2 x 106 세포에서 배양된다.
과정은 이용가능한 실험 매뉴얼에 일반적으로 개시된다(King 및 Possee, 상기참조.; O'Reilly, et al., 상기참조.; Richardson, 상기참조.). 상청액으로부터 BR43x2 폴리펩티드의 연이은 정제는 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 획득될 수 있다.
효모 세포를 포함하여 균류 세포는 또한 본 발명에 사용될 수 있다. 이러한 관점에서 특정 관심의 효모 종은 Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, 및 Pichia methanolica 를 포함한다. 외인성 DNA 를 가지고 S. cerevisiae 세포를 형질전환시키는 방법 및 그로부터 재조합 폴리펩티드를 생산하는 방법이 예를 들어, Kawasaki, U. S. 특허번호 4,599,311; Kawasaki et al., U. S. 특허번호 4,931,373; Brake, U. S. 특허번호 4,870,008; Welch et al., U. S. 특허번호 5,037,743; 및 Murray et al., U. S. 특허번호 4,845,075 에 개시된다. 형질전환된 세포는 선택마커, 일반적으로 약제 내성 또는 특정 영양소(예를 들어, 루신)의 부재하에서의 배양능력에 의해 결정된 표현형으로 선택된다. Saccharomyces cerevisiae 에 사용하기 위한 바람직한 벡터 시스템은 Kawasaki et al.에 개시된 POT1 벡터 시스템 (U. S. 특허번호 4,931,373)으로, 이것은 형질전환된 세포가 글루코스-함유 배지에서 배양에 의해 선택되도록 한다. 효모에 사용하기 위한 적당한 프로모터 및 종결자는 해당 효소 유전자의 그것 (예를 들어, Kawasaki, U. S. 특허번호 4,599,311; Kingsman et al., U. S. 특허번호 4,615,974; 및 Bitter, U. S. 특허번호 4,977,092 참조) 및 알콜 디히드로게나제 유전자를 포함한다. 또한 U. S. 특허번호 4,990,446; 5,063,154; 5,139,936 및 4,661,454 참조. Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii 및 Candida maltosa 를 포함하는 다른 효모에 대한 형질전환 시스템이 당업계에 알려진다. 예를 들어, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-65,1986 및 Cregg, U. S. 특허번호 4,882,279 참조. Aspergillus 세포가 McKnight et al., U. S. 특허번호 4,935,349 의 방법에 따라 이용가능하다. Acremonium chrysogenum 를 형질전환시키는 방법은 Sumino et al., U. S. 특허번호 5,162,228 에 개시된다. Neurospora 를 형질전환시키는 방법은 Lambowitz, U. S.특허번호 4,486,533 에 개시된다.
예를 들어, 재조합 단백질의 생산을 위해 숙주로서 Pichia methanolica 의 사용은 Raymond, U. S. 특허번호 5,716,808, Raymond, U. S. 특허번호 5,736,383, Raymond et al., Yeast 14: 11-23, 1998, 및 국제공개번호 WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536, 및 WO 98/02565 에 개시된다. P. methanolica 의 형질전환에 사용되는 DNA 분자는 통상 바람직하게는 형질전환전에 선형화되는, 이중-가닥, 원형 플라스미드로 제조될 것이다. P. methanolica 에서 폴리펩티드 생산을 위해, 플라스미드내의 프로모터 및 종결자는 P. methanolica 알콜 이용 유전자 (AUG1 또는 AUG2)와 같은 P. methanolica 유전자의 그것이 바람직하다. 다른 유용한 프로모터는 디히드로옥시아세톤 합성효소(DHAS), 포르메이트 디히드로게나제 (FMD), 및 카탈라제 (CAT) 유전자의 그것을 포함한다. 숙주 염색체에 DNA 의 삽입을 용이하게하기위해, 숙주 DNA 서열이 양 말단 측면에 인접한 플라스미드의 전체 발현 절편을 가지는 것이 바람직하다. Pichia methanolica 에 사용하기 위한 바람직한 선택가능한 마커는 포스포리보실-5-아미노이미다졸 카르복실라제(AIRC;EC 4.1.1.21)를 암호화하고, adeZ 숙주 세포가 아데노신의 부재하에서 배양되도록 하는 P. methanolica ADE2 유전자이다. 메탄올의 사용을 최소화하는 것이 바람직한 대규모 산업적 과정의 경우에, 메탄올 이용 유전자 (AUG1 및 AUG2) 모두가 제거된 숙주 세포의 사용이 바람직하다. 분비된 단백질의 생산에 있어서, 액포 프로테아제 유전자(PEP4 및 PRB1) 가 결여된 숙주 세포가 바람직하다. 전기천공은 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 를 포함하는 플라스미드를 P. methanolica 세포로 도입하는 과정을 용이하게하기 위해 사용된다. 2.5 내지 4.5 kV/cm ,바람직하게는 약 3.75 kV/cm 필드 강도, 및 1 내지 40 밀리세컨드, 가장 바람직하게는 약 20 밀리세컨드의 시간 상수 (t) 를 가지는 지수 감소, 펄스 전기 필드를 사용한 전기천공에 의해 P. methanolica 세포를 형질전환시키는 것이 바람직하다.
세균 Escherichia coli, Bacillus 및 다른 속의 균주를 포함하는 원핵 숙주 세포가 본 발명의 유용한 숙주 세포이다. 이러한 숙주를 형질전환시키고 그 안에 클론된 외래 DNA 서열을 발현하는 기법은 당업계에 잘 알려진다. (예를 들어, Sambrook et al., 상기참조.). E.coli 와 같은 세균에서, BR43x2 폴리펩티드를 발현하는 경우에, 폴리펩티드는 전형적으로 불용성 과립으로 세포질에 보유될 수 있거나, 세균 분비 서열에 의해 주변 세포질 공간으로 방향지워질 수 있다. 전자의 경우에, 세포는 용균되고, 과립은 구아니딘 이소티오시아네이트 또는 우레아를 사용하여 회수되고 변성된다. 그 다음, 변성된 폴리펩티드는 우레아 용액에 대한 투석 그리고, 환원 및 산화 글루타티온의 조합과 같이 변성체를 희석하고, 이어서 완충 식염수 용액에 대해 투석하여 재폴딩 및 이량화될 수 있다. 후자의 경우에, 폴리펩티드는 세포가 주변 세포질 공간의 내용물을 방출하도록 세포를 파괴하는 단계(예를 들어, 음파처리 및 삼투충격) 및 단백질을 회수하는 단계에 의해 변성 및 재폴딩 요구를 제거하는 단계에 의해 가용성 및 기능성 형태로 주변 세포질 공간으로부터 회수될 수 있다.
형질전환되거나 트랜스펙션된 숙주 세포는 영양소 및 선택된 숙주 세포의 배양에 필요한 다른 성분을 함유하는 배양 배지에서 종래의 과정에 따라 배양된다. 규정 배지 및 복합 배지를 포함하는 다양한 적당한 배지가 당업계에서 공지되고, 일반적으로 탄소원, 질소원, 필수 아미노산, 비타민 및 미네랄을 포함한다. 배지는 또한 필요한 경우, 성장 인자 또는 혈청과 같은 성분을 또한 포함할 수 있다. 성장 배지는 일반적으로 예를 들어, 약제 선택 또는 발현벡터상에 운반되거나 숙주세포로 공-트랜스펙션된 선택마커로 기대되는 필수 영양소의 결여에 의해 외래적으로 첨가된 DNA 를 포함하는 세포를 선택할 것이다. P. methanolica 세포는 약 25 ℃ 내지 35 ℃ 의 온도에서 탄소, 질소 및 소량의 영양소의 적당한 원을 포함하는 배지에서 배양된다. 액체 배양은 작은 훌라스크의 진탕 또는 발효기의 살포와 같은 종래의 수단에 의한 충분한 탄산가스 포화처리로 제공된다. P. methanolica 의 경우에 바람직한 배양 배지는 YEPD (2% D-글루코스, 2% BactoTM 펩톤 (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% BactoTM 효모 추출물(Difco Laboratories), 0.004% 아데닌 및 0.006% L-루신이다.
발현된 재조합 BR43x2 폴리펩티드(키메라 또는 융합 BR43x2 폴리펩티드)는 분획화 및/또는 종래의 정제 방법 및 배지를 사용하여 정제될 수 있다. 고도의 정제된 형태, 즉 95 % 이상의 순도, 더욱 바람직하게는 99 % 이상의 순도로 본 발명의 단백질 또는 폴리펩티드를 제공하는 것이 바람직하다. 황산암모늄 침전 및 산 또는 카오트로프 추출은 샘플의 분획화에 사용될 수 있다. 표본적인 정제 단계는 히드록시아파타이트, 크기 배척, FPLC 및 역-페이즈 고 성능 액체 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 적당한 음이온 교환 배지는 유도된 덱스트란, 아가로스, 셀룰로스, 폴리아그릴아미드, 특수 실리카등을 포함한다. 특히 바람직한 것은 DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway,NJ) 를 가진 PEI, DEAE, QAE 및 Q 유도체가 바람직하다. 표본적인 크로마토그래프 배지는 Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia) Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia)등과 같은 페닐, 부틸, 또는 옥틸기로 유도된 크로마토그래피 배지; 또는 Amberchrom CF 71 (Toso Haas) 등과 같은 폴리아크릴계 수지를 포함한다. 적당한 고형 지지체는 그들이 사용될 조건하에서 불용성인 유리 비드, 실리카-기초 수지, 셀룰로스계 수지, 아가로스 비드, 가교결합 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 가교결합 폴리아크릴아미드 수지등을 포함한다. 이러한 지지체는 아미노기, 카르복실기, 술프히드릴기, 히드록실기 및/또는 카르보하이드레이트 부분에 의해 단백질의 부착을 허용하는 반응기로 변형될 수 있다. 결합 화학의 예는 시아노겐 브로마이드 활성, N-히드록시숙신이미드 활성, 에폭사이드 활성, 술프히드릴 활성, 히드라자이드 활성, 및 카르보디이미드 결합 화학을 위한 카르복실 및 아미노 유도체를 포함한다. 이러한 고형 배지는 당업계에서 잘 알려지고 광범위하게 사용되고, 상업적 제품공급자로부터 이용가능하다. 배지를 지지하기 위해 수용체 폴리펩티드를 결합하는 방법은 당업계에서 잘 알려진다. 특정 방법의 선택은 통상의 설계의 문제이고, 선택된 지지체의 성질에 의해 부분적으로 결정된다. 예를 들어, Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988 참조.
본 발명의 폴리펩티드는 그것의 물리적 성질의 개발에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 고정화 금속 이온 흡착 (IMAC) 크로마토그래피는 폴리히스티딘 표지를 포함하는 것을 포함하는 히스티딘-풍부 단백질을 정제하기 위해 사용될 수 있다. 요약하면, 1 차적으로 겔은 킬레이트를 형성하는 2 가 금속 이온으로 하전된다. (Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1-7, 1985). 히스티딘-풍부 단백질은 사용된 금속 이온에 의존하여 다른 친화성을 가지고 매트릭스에 흡착될 것이고, 경쟁적인 용출, pH 낮춤, 또는 강한 킬레이트제의 사용에 의해 용출될 것이다. 정제의 다른 방법은 렉틴 친화성 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피에 의해 글리코실화된 단백질의 정제를 포함한다. (Methods in Enzymol., Vol.182,"Guide to Protein Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529-39). 본 발명의 추가적인 구체예에서, 관심의 폴리펩티드 및 친화성 표지의 융합 (예를 들어, 말토스-결합 단백질, FLAG-표지 (Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (SEQ ID NO: 13)), Glu-Glu 표지 (Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu (SEQ ID NO: 14)),면역글로블린 도메인) 은 정제를 용이하게 하기 위해 제조될 수 있다.
단백질 재폴딩 (및 선택적으로 재산화) 과정이 유리하게 사용될 수 있다. ＞80 % 순도이하, 더욱 바람직하게는 ＞90 % 순도, 더욱 더 바람직하게는 ＞95% 순도 이하의 단백질을 정제하는 것이 바람직하고, 구체적으로는 거대분자, 특히 다른 단백질 및 핵산을 오염시키는 단계와 관련하여 99.9 % 순도보다 더 크고 무감염제 및 무발열제인, 제약학적 순도 상태가 바람직하다. 바람직하게는, 정제된 단백질은 다른 단백질, 구체적으로는 동물 기원의 다른 단백질이 상당히 결여된다.
BR43x2 폴리펩티드 또는 그것의 단편은 화학 합성을 통해 제조될 수 있다. BR43x2 폴리펩티드는 단량체 도는 복합체; 글리코실화 또는 비-글리코실화; 페그릴화 또는 비-페그릴화일 수 있고; 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 표본적인 BR43x2 폴리펩티드는 모티프에 적합한 아미노산 서 열: XXCX [QEK] [QEKNRDHS] [QE] X {0- 2} [YFW] [YFW] DXLLX {2} C [IMLV] XCX {3} CX{6-8} CX {2} [YF}CXX(SEQ ID NO:10) 을 가지는 길이 32-40 잔기의 폴리펩티드를 포함하고, 대상을 본 명세서에 개시된 제한내로 한다.
BR43x2 폴리펩티드는 배척 고형 페이즈 합성, 부분적인 고형 페이즈 방법, 단편 축합 또는 고전적인 용액 합성에 의해 합성될 수 있다. 폴리펩티드는 바람직하게는 예를 들어, Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85:2149,1963 에 개시된 고형 페이즈 펩티드 합성으로 제조된다. 합성은 알파-아미노산 말단에서 보호되는 아미노산으로 수행된다. 불안정한 측쇄를 가진 3차 기능적 아미노산은 폴리펩티드의 합성동안 바람직하지 않은 화학반응이 발생하는 것을 방지하기 위해 적당한 기로 또한 보호된다. 알파-아미노 보호기는 선택적으로 제거되어 아미노 말단에서 연이은 반응이 발생하는 것을 허용한다. 알파-아미노 보호기의 제거를 위한 조건은 측쇄 보호기를 제거하지 않는다.
알파-아미노 보호기는 순차진행적인 폴리펩티드 합성에 있어 당업계에서 유용한 것으로 알려진 것이다. 아실형 보호기(예를 들어, 포르밀, 트리플루오로아세틸, 아세틸), 아릴형 보호기 (예를 들어, 비오티닐), 방향족 우레탄형 보호기[예를 들어, 벤질옥시카르보닐(Cbz), 치환 벤질옥시카르보닐 및 9-플루오로에닐메틸오시카르보닐 (Fmoc)] , 알리파트산 우레탄 보호기[예를 들어, t-부틸옥시카르보닐 (tBoc), 이소프로필-옥시카르보닐, 시클로헥실옥시카르보닐] 및 알킬형 보호기 (예를 들어, 벤질, 트리페닐메틸) 가 포함된다. 바람직한 보호기는 tBoc 및 Fmoc 이다.
선택된 측쇄 보호기는 결합동안 본래대로 유지되어야만 하고 아미노-말단 보호기의 탈보호동안 또는 결합 상태동안 제거되지 않아야 된다. 측쇄 보호기는 또한 완성형 폴리펩티드를 변형시키지 않을 반응 조건을 사용하여 합성 완성에 기초하여 제거가능해야만 한다. tBoc 화학에서, 3차기능적 아미노산의 경우 측쇄 보호기는 대부분 벤질에 기초한다. Fmoc 화학에서, 그들은 대부분 4차-부틸 또는 트리틸에 기초한다.
tBoc 화학에서, 바람직한 측쇄 보호기는 아르기닌에 대한 토실, 아스파르트산에 대한 시클로헥실, 시스테인에 대한 4-메틸벤질 (및 아세트아미도메틸), 글루타미산, 세린 및 트레오닌에 대한 벤질, 히스티딘에 대한 벤질옥시메틸(및 디니트로페닐), 리신에 대한 2-Cl-벤질옥시카르보닐, 트립토판에 대한 포르밀 및 티로신에 대한 2-브로모벤질이다. Fmoc 화학에서, 바람직한 측쇄 보호기는 아르기닌에 대한 2,2,5,7,8- 펜타메틸크로만-6-술포닐(Pmc) 또는 2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조퓨란-5-술포닐(Pbf), 아스파라긴, 시스테인, 글루타민 및 히스티딘에 대한 트리틸, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌 및 티로신에 대한 4 차 부틸, 리신 및 트립토판에 대한 tBoc 이다.
포스포펩티드의 합성에서, 포스페이트기의 직접적 또는 합성-후 삽입 중 하나가 사용된다. 적접 삽입 전략에서, 세린, 트레오닌 또는 티로신의 포스페이트기는 Fmoc 화학에서 메틸, 벤질, 또는 4 차-부틸 또는 tBoc 화학에서 메틸, 벤질 또는 페닐로 보호될 수 있다. 포스페이트 보호가 없는 포스포티로신의 직접적 삽입은 Fmoc 화학에서 또한 사용될 수 있다. 합성-후 결합 전략에서, 세린, 트레오닌 또는 티로신의 비보호 히드록실기는 디-4차-부틸-, 디벤질- 또는 디메틸-N,N'-디이소프로필-포스포르아미다이트를 가진 고형 페이즈상에서 유도되고, 그 때 4 차-부틸히드로-과산화물로 산화된다.
고형 페이즈 합성은 일반적으로 알파-아미노 보호 (측쇄 보호) 아미노산을 적당한 고형 지지체에 결합시키는 것에 의해 카르복실-말단으로부터 수행된다. 부착이 클로로메틸, 클로로트리틸 또는 히드록시메틸 수지에 이루어질 때, 에스테르 결합이 형성되고, 결과적인 폴리펩티드는 C-말단에서 자유 카르복실기를 가질 것이다. 대안적으로, 벤즈히드릴아민 또는 p-메틸벤즈히드릴아민 수지 (tBoc 화학의 경우) 와 같은 아미드 수지 및 Rink 아미드 또는 PAL 수지 (Fmoc 화학의 경우) 가 사용될 때, 아미드 결합이 형성되고 결과적인 폴리펩티드는 C-말단에 카르복시아미드기를 가질 것이다. 폴리스티렌- 또는 폴리아미드 기초 또는 폴리에틸렌글리콜-그래프트이거나, 핸들 또는 링커를 가지거나 없거나, 부착된 제 1 의 아미노산이 있거나 없거나, 이러한 수지는 상업적으로 이용가능하고, 그들의 제조는 Stewart et al.,"Solid Phase Peptide Synthesis" (2nd Edition), (Pierce Chemical Co., Rockford,IL, 1984) 및 Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3 : 3,1986; and Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989 에 개시되었다.
필요하다면, 측쇄 및 알파-아미노기가 보호된 C-말단 아미노산은 디시클로헥실카르보디이미드(DCC) , N,N'-디이소프로필카르보디이미드(DIPCDI) 및 카르보닐디이미다졸(CDI) 을 포함하는 다양한 활성제를 사용하여 히드록실메틸 수지에 부착된 다. 그것은 세슘 테트라메틸암모늄 염 형태에서 또는 트리에틸아민(TEA)또는 디이소프로필에틸아민(DIEA) 의 존재하에서 직접적으로 클로로메틸 또는 클로로트리틸 수지에 부착될 수 있다. 아미드 수지에 부착한 제 1 의 아미노산은 결합 반응동안 아미드 결합 형성과 같다.
하기의 수지 지지체에의 부착에 이어서, 알파-아미노 보호기는 보호 화학(예를 들어, tBoc, Fmoc)에 기초하여 다양한 시약을 사용하여 제거된다. Fmoc 제거 범위는 300-320 nm 또는 전도성 세포에 의해 모니터될 수 있다. 알파-아미노 보호기의 제거후에, 잔존 보호 아미노산은 바람직한 서열을 얻기위해 단계적으로 결합된다.
다양한 활성제는 DCC, DIPCDI, 2-클로로-1,3-디메틸이미듐 헥사플로오로포스페이트(CIP), 벤조트리아졸-1-일-옥시-트리스-(디메틸-아미노)-포스포늄 헥사플로오로-포스페이트(BOP) 및 그것의 피롤리딘 유사체 (PyBOP), 브로모-트리스-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBrOP),0-(벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3,-4차메틸우로늄 헥사플로오로포스페이트(HBTU) 및 그것의 4 차-플루오로보레이트 유사체 (TBTU) 또는 그것의 피롤리돈 유사체 (HBPyU) 0-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3,-4차메틸-우로늄 헥사플로오로-포스페이트(HATU) 및 그것의 4 차플루오로보레이트 유사체 (TATU) 또는 그것의 피롤리돈 유사체 (HAPyU)를 포함하는 결합반응에 사용될 수 있다. 결합 반응에 사용된 가장 일반적인 촉매 첨가제는 4-디메틸아미노피리딘(DMAP),3-히드록시-3,4-디히드로-4-옥소-1,2,3-벤조트리아진(HODhbt), N-히드록시벤조트리아졸 (HOBt) 및 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt)을 포함한다. 각각의 보호 아미노산은 과량(＞2.0 등가물)로 사용되고, 결합은 일반적으로 N-메틸피롤리돈(NMP) 또는 DMF, CH2Cl2 또는 그것의 혼합물에서 수행된다. 결합 반응의 완성 정도는 예를 들어, Kaiser et al., Anal. Biochem. 34: 595,1970 에 개시된대로, 닌히드린 반응에 의해 각 단계에서 모니터될 수 있다.
바람직한 펩티드의 완전한 합성 후에, 펩티드-수지는 적당한 스캐빈저를 가진 시약으로 절단된다. Fmoc 펩티드는 일반적으로 절단되고 스캐빈저를 가지고 TFA(예를 들어, H2O, 에탄디티올, 페놀 및 티오아니솔)에 의해 탈보호된다. tBoc 펩티드는 일반적으로 -5 내지 0。 에서 1- 2 시간동안, 수지로부터 폴리펩티드를 절단하고 대부분의 측쇄 보호기를 제거하는 액체 HF 을 가지고 절단되고 탈보호된다. 애니솔, 디메틸술피드 및 p-티오크레솔과 같은 스캐빈저는 절단동안 형성된 양이온이 폴리펩티드내에 존재하는 아미노산 잔기를 알킬화 및 아실화되는 것을 방지하기 위해서 액체 HR 와 함께 사용된다. HF 절단전에, DMF 내의 피페리딘 및 티오페닐에 의해 트립토판의 포르밀기 및 히스티딘의 디니트로페닐기가 각각 제거될 필요가 있다. 시스테인의 아세트아미도메틸기는 시스테인을 동시에 시스틴으로 산화시키는 머큐리(II) 아세테이트 및 대안적으로는 요오드, 탈륨(III), 트리플로오로아세테이트 또는 실버 테트라플로오로보레이트에 의해 제거될 수 있다. tBoc 펩티드 절단 및 탈보호에 사용된 다른 강산은 트리플루오로메탄술폰산(TFMSA) 및 트리메틸실릴-트리플루오로아세테이트(TMSOTf)를 포함한다.
본 발명은 하나이상이 폴리펩티드 융합을 포함하는 다양한 다른 폴리펩티드 융합 및 관련 다합 단백질을 더 제공한다. 가용성 BR43x2, TACI 또는 BCMA 폴리펩티드는 면역글로블린 중쇄 항상 부위, 두개의 항상 부위 도메인을 포함하고 가변 부위가 부족한, 전형적으로 FC 단편을 가진 융합으로 발현된다. 이러한 융합을 제조하는 방법은 U.S. 특허번호 5,155,027 및 5,567,584 에 개시된다. 이러한 융합은 전형적으로 다합 분자로 분비되고, 여기에서 Fc 부분은 서로 이황화결합되고, 두개의 비-Ig 폴리펩티드는 서로 가까운 근처에 배열된다. 면역글로블린-BR43x2 (TACI 또는 BCMA) 폴리펩티드 융합은 다양한 다합 BR43x2 유사체를 생산하도록 유전적으로 설계된 세포로 발현될 수 있다. 보조 도메인은 BR43x2 (TACI 또는 BCMA)폴리펩티드로 융합될 수 있고, 그들을 특정 세포, 조직, 또는 거대분자로 표적화활 수 있다. 융합은 또한 본 명세서에 개시된 독소로서 만들어질 수 있다. 이러한 방법으로, 폴리펩티드 및 단백질은 치료적 또는 진단적 목적을 위해 표적화될 수 있다. BR43x2 폴리펩티드는 정제 및 표적화 도메인에 대한 친화성 표지와 같은 둘 이상의 부분으로 융합될 수 있다. 또한, 폴리펩티드 융합은 특히 도메인 사에에 하나 이상의 절단 부위를 포함할 수 있다. Tuan et al., Connect.Tiss. Res.34:1-9,1996 참조. 이 형태의 융합은 또한, 예를 들어, 시험관내 분석 수단으로서 용액으로부터 동종의 리간드를 친화성 정제하기 위해서, 리간드를 특이적으로 적정함으로써 시험관내에서 신호를 차단하기 위해서, 세포 표면상에 리간드를 결합시키기 위해서 또는, 리간드 자극을 차단하기 위해서 이들을 투여함으로써 생체내에서 BR43x2 안타고니스트로서 사용될 수 있다. 분석에서의 사용을 위해서, 융합 단백질은 FC 영역을 통해 지지체에 결합될 수 있고, ELISA 포멧에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 친화성 표지 또는 라벨을 가지고 융합 단백질 형성에 사용된 가용성 BR43x2 수용체 및 폴리펩티드 단편을 제공한다. 가용성 BR43x2-친화성 표지 융합 단백질은 예를 들어, BR43x2 리간드뿐만 아니라 천연 리간드의 아고니스트 및 안타고니스트를 확인하는 데 사용된다. 표지된, 가용성 BR43x2 를 사용하여, 리간드, 아고니스트 또는 안타고니스트를 발현하는 세포가 형광 면역세포학 또는 면역조직화학에 의해 확인된다. 가용성 융합 단백질은 조직 또는 특정 세포 계통의 리간드 분배 연구에 유용하고, 수용체/리간드 생물학에 대한 통찰력을 제공한다.
리간드를 정제하기 위해서, 아고니스트 또는 안타고니스트, BR43x2-Ig 융합 단백질은 수용체-리간드 결합을 용이하게 하는 조건(전형적으로 생리적 온도, pH, 및 이온강도 근처)하에서 리간드, 아고니스트 또는 안타고니스트를 포함하는 샘플에 첨가된다. 그 때, 수용체-리간드 복합체는 고형 지지체(예를 들어, 불용성 수지 비드)에 고정화된 단백질 A 를 사용하여 혼합물에서 분리된다. 그 때, 리간드, 아고니스트, 안타고니스트는 염 또는 pH 구배와 같은 종래의 화학 기법을 사용하여 용출된다. 대안으로, 융합단백질 그 자체는 상기에서 수행된 결합 및 용출로서 고형 지지체에 결합될 수 있다. 아가로스 비드, 가교결합 아가로스, 유리, 셀룰로스계 수지, 실리카계 수지, 폴리스티렌, 가교결합 폴리아크릴아미드, 또는 사용조건하에서 안정한 유사 물질과 같은 고형 지지체에 수용체 폴리펩티드를 고정화하는 방법은 당업계에 공지된다. 폴리펩티드를 고형 지지체에 연결하는 방법은 당업계에 공지되고, 아민 화학, 시아노겐 브로마이드 활성, N-히드록시숙신이미드 활성, 에폭사이드 활성, 술프히드릴 활성, 및 히드라진 활성을 포함한다. 결과적 배지는 일반적으로 컬럼의 형태로 배치될 것이고, 리간드를 포함하는 유체는 한 번 이상 컬럼을 통과하여 리간드가 수용체 폴리펩티드에 결합하는 것을 허용한다. 그 때, 리간드는 리간드-수용체 결합을 깨기 위한 염농도, 카오트로프제(MnCl2), 또는 pH 의 변화를 사용하여 용출된다.
숙주 세포로부터 가용성 수용체의 배출을 특정하기 위해서, 가용성 수용체 DNA 는 t-PA 분비 펩티드와 같은 분비 펩티드를 암호화하는 제 2 의 DNA 절편에 연결된다. 분비 수용체 도메인의 정제를 용이하게 하기 위해서, 항체 또는 다른 특이적 결합제가 이용가능한 친화성 표지 또는 다른 폴리펩티드 또는 단백질과 같은 N- 또는 C-말단 신장부는 수용체 폴리펩티드에 융합될 수 있다.
본 발명의 기능적 가용성 막 결합 수용체를 발현하는 세포는 스크리닝 분석법에서 사용된다. 적당한 다양한 분석법은 당업계에서 알려진다. 이러한 분석법은 표적 세포에서 생물학적 반응의 검출에 기초한다. 대조값에 대한 물질대사의 변화는 BR43x2 매개 물질대사를 조절하는 시험 화합물을 나타낸다. 이러한 하나의 분석법은 세포 증식 분석법이다. 세포는 시험 화합물의 존재 또는 부재하에서 배양되고, 세포 증식은 예를 들어, 트리티움표지 티미딘의 삽입 측정 또는, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(MTT) 의 물질대사 분해에 기초한 비색분석법에 의해 검출된다. (Mosman, J.Immuno.Meth.65:55-63,1983). 대안적인 분석 포맷은 수용체 유전자를 발현하도록 유전적으로 더 조작된 세포를 사용한다. 수용체 유전자는 수용체-결합 경로에 반응하는 프로모터 요소에 결합되고, 분석은 수용체 유전자의 전사 활성을 검출한다. 세포 추출물에서 쉽게 분석된 많은 수용체 유전자는 당업계에서 공지되고, 예를 들어, E. coli lacZ, 클로로암페니콜 아세틸 트랜스퍼라제(CAT) 및 혈청 반응 요소(SRE) (예를 들어, Shaw et al., Cell 56: 563-72,1989 참조). 바람직한 이러한 수용체 유전자는 루시퍼라제 유전자 이다.(de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7: 725, 1987) 루시퍼라제 유전자의 발현은 당업계에서 알려진 방법을 사용하여 발광에 의해 검출된다. (예를 들어, Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269: 29094-101,1994; Schenborn 및 Goiffin, Promega Notes 41: 11,1993 참조). 루시퍼라제 활성 분석 키트는 예를 들어, Promega Corp., Madison, WI 로부터 상업적으로 이용가능하다. 이러한 형태의 표적 세포 라인은 화학제, 세포-조정 배양 배지, 균류 육즙, 토양 샘플, 물 샘플등의 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포-조정 배지 샘플 은행은 리간드를 생산하는 세포를 확인하기 위한 표적세포상에서 분석될 수 있다. 그 다음 양성 세포는 포유동물 발현 벡터에서 풀로 분열되고, 숙주 세포로 트랜스펙션되고, 발현되는 cDNA 라이브러리를 생산하는 데 사용된다. 그 다음, 리간드를 암호화하는 클론 cDNA 를 분리하기 위해 풀의 연이은 분열, 재-트랜스펙션, 아배양, 및 양성 세포의 재-분석으로 트랜스펙션된 세포로부터 배지 샘플을 분석한다.
리간드-결합 수용체를 사용하는 분석 시스템(또는 항체, 한 요소의 보체/항보체 쌍) 또는 그것의 결합 단편, 및 상업적으로 이용가능한 바이오센서 기구 (BIAcoreTM, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) 가 또한 유리하게 사용될 수 있다. 이러한 수용체, 항체, 보체/항보체 쌍 또는 단편의 요소는 수용체 칩 표면에 고정된다. 이 기구의 이용은 Karlsson, J. Immunol. Meth. 145: 229-40,1991 및 Cunningham 및 Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63,1993 에 개시된다. 예를 들어, BR43x2 폴리펩티드, 단편, 항체 또는 보체/항-보체 쌍의 요소는 아민 또는 술프히드릴 화학을 사용하여 유동 세포내에서 금 필름에 부착된 덱스트란 섬유에 공유결합으로 부착된다. 시험 샘플이 세포를 통해 통과된다. 리간드, 에피토프, 또는 보체/항보체 쌍의 반대 요소가 샘플내에 존재한다면, 그것은 금 필름의 표면 세포질유전자 공명의 변화로 검출되는 배지의 굴절율의 변화를 야기하면서, 고정화된 수용체, 항체 또는 요소, 각각에 결합할 것이다. 이 시스템은 결합 친화력이 계산될 수 있는 온-및 오프-속도의 측정, 및 결합의 화학량론의 측정을 허용한다. 리간드-결합 수용체 폴리펩티드는 또한 당업계에서 알려진 다른 분석 시스템에서 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 결합 친화력의 결정을 위한 Scatchard 분석(Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72,1949 참조) 및 비색분석법 (Cunningham et al., Science 253: 545-48,1991; Cunningham et al., Science 245: 821-25,1991)을 포함한다.
TACI 및 BCMA 와 가용성 I125-ztnf4 결합에 대한 Scatchard 플롯 분석은 표 2 에서 보여지고, 표 7 의 TNFR 부류의 다른 요소의 결합 상수와 비교된다.
Figure 112005000579505-pct00028
수용체로서, BR43x2 폴리펩티드의 활성은 세포외 산성화 속도 또는 수용체 결합 및 연이은 생리적 세포 반응과 관련된 양자 배출을 측정하는 실리콘-기초 바이오센서 미세생리측정기에 의해 측정할 수 있다. 표본적인 장치는 Molecular Devices , Sunnyvale, CA 에 의해 제조된 CytosensorTM 미세생리측정기이다. 세포 증식, 이온 전달, 에너지 생산, 염증 반응, 조절 및 수용체 활성등과 같은 다양한 세포 반응은 이러한 방법으로 측정될 수 있다. 예를 들어, McConnell et al., Science 257: 1906-12,1992; Pitchford et al., Meth. Enzymol. 228: 84-108,1997; Arimilli et al., J. Immunol. Meth. 212: 49-59,1998; Van Liefde et al., Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95,1998 참조. 미세생리측정기는 흡착 또는 비-흡착 진핵 또는 원핵 세포 분석에 사용될 수 있다. 시간경과에 따른 세포 배지에서 세포외 산성화 변화를 측정함으로서, 미세생리측정기는 BR43x2 폴리펩티드의 아고니스트, 리간드, 또는 안타고니스트를 포함하는 다양한 자극에 대한 세포 반응을 직접적으로 측정한다. 바람직하게는, 미세생리측정기는 BR43x2 폴리펩티드를 발현하지 않는 대조 진핵 세포와 비교할 때, R43x2 발현 진핵 세포의 반응 측정에 사용된다. 본 명세서에 개시된 대로, BR43x2-조절 자극에 반응하는 세포; 또는 비장 조직으로부터 유래된 BR43x2-발현 세포와 같은 천연적으로 BR43x2 를 발현하는 세포를 생산하는 BR43x2 발현 진핵생물 세포는 BR43x2 가 트랜스펙션된 세포를 포함한다. 대조군에 비하여 예를 들어, BR43x2 발현 세포 반응의 증가 또는 감소와 같은 세포외 산성화의 변화에 의해 측정된 차이는 BR43x2-조절 세포 반응의 직접적인 측정이다. 더욱이, 이러한 BR43x2 -조절 반응은 다양한 자극하에서 분석될 수 있다. 또한, 미세생리측정기를 사용하여, BR43x2 폴리펩티드를 발현하는 세포를 제공하는 단계, 시험 화합물의 부재하에서 세포의 제 1 의 부분을 배양하는 단계, 시험 화합물의 존재하에서 세포의 제 2 의 부분을 배양하는 단계, 및 예를 들어, 세포의 제 1 의 부분과 비교할 때 세포의 제 2 의 부분의 세포 반응의 증가 또는 감소와 같은 변화를 검출하는 단계를 포함하는 BR43x2 폴리펩티드의 아고니스트 및 안타고니스트를 확인하는 방법을 제공한다. 세포 반응의 변화는 세포외 산성화 속도의 측정가능한 변화로서 보여진다. BR43x2 폴리펩티드에 대한 안타고니스트 및 아고니스트는 이 방법을 사용하여 빠르게 확인될 수 있다.
가용성 BR43x2 는 조직 또는 특정 세포 계통의 리간드의 분배를 연구하는 데 유용하고, 수용체/리간드 생물학에 대한 통찰력 제공에 유용하다. 이용분야는 리간 드-함유 표적 세포를 파괴하는 메카니즘으로 그들의 리간드에 대한 TNF 수용체의 특이성으로 이루어진다. 예를 들어, 독성 화합물은 BR43x2 가용성 수용체 또는 BR43x2 융합에 결합될 수 있다. 독성 화합물의 예는 표적 세포를 불활성화시키는 방사성 약제, 독소루비신, 다우노루비신, 메토트렉세이트, 시토산과 같은 화학요법제; 리신, 디프테리아, 슈도모나스 엑소톡신 A 및 애브린과 같은 독소; 및 세포독성 T-세포 표면 분자에 대한 항체를 포함할 것이다.
FACS 분석에 의해, Ztnf4 (5 ng/ml) 가 BR43x2 (SEQ ID NO: 2), TACI (SEQ ID NO: 6), BCMA (SEQ ID NO: 8) 및 BR43xl (SEQ ID NO: 9) 에 결합하는 것을 밝혔다. (Flow Cytometry 및 Sorting, Melamed et al. eds. Wiley-Liss, 1990 및 Immunofluorescence 및 Cell Sorting, Current Protocols in Immunology, Volume 1, Coligan et al. eds. John Wiley & Son, 1997). FITC-표지, 가용성 ztnf4 는 FACS 분석을 사용하여, 다른 무엇보다도, PBMNC , 편도선 세포의 B 림프구, B 세포 림프종 세포 라인(Raji, Burkitt's human lymphoma, ATCC CCL86), Ramos (Burkitt's lymphoma cell line, ATCC CRL-1596), Daudi (Burkitt's human lymphoma, ATCC CCL213) 및 RPMI 1788 (a B lymphocyte cell line, ATCC CCL-156)에 특이적으로 결합한다는 것을 보여주었다. HL-60 과의 어느 결합도 보이지 않았다. (ATCC a promyelocytic cell line, ATCC CCL-240). PBMNC 및 편도선 세포로부터 B 세포와의 결합 특이성은 CD19, IgD, IgM, 및 CD20 을 포함하는 B 세포 특이적 분자에 대한 항체로 공-염색하여 확인되었다. CD40L 와 ztnf4 의 유사성은 보여진 것보다 더 넓은 조직 분배를 제시했다. ztnf4 의 친화성을 사이토킨 증식 및 T 세 포 증식 분석을 사용하여, 단핵세포, 수지상 세포, 및 정제된 T 세포에서 시험했고, ztnf4 의 결합 또는 시험된 어느 다른 형태의 세포에 대한 다른 생물학적 효과를 검출할 수 없었다. 그러므로, 리간드 및 수용체에 의한 B 세포에 대한 특이성은 그들이 자가면역, B 세포 암, 면역조절, IBD 및 예를 들어, ITCP, 중증근무력증등, 신질환, 간접적 T 세포 면역 반응, 이식편거부, 이식편대숙주질환과 같은 어느 항체-매개 병원학의 연구 및 치료에 유용하다는 것을 제시한다.
Ztnf4 는 B 세포 증식, 항체 생산 및 시험관내에서 활성 마커의 상위-조절을 초래하도록 B 세포를 활성화시키는 것을 보여주었다. (하기 실시예 참조) 이러한 영향은 IL-4 또는 다른 사이토킨에 의한 공-자극 또는 B 세포를 활성화시키는 B 세포 항원 수용체 또는 다른 세포 표면 수용체, 즉 CD40 을 통한 자극을 필요로 할 수 있다. gp39 및 TNFβ 와 같은 다른 종양 괴사 인자 리간드는 또한 B 세포 증식을 자극한다. 그러므로, 본 발명의 폴리펩티드는 다른 세포 군에 영향을 주지않고 질환의 치료에 유리한 면역 반응동안 활성화된 B 세포를 저해하면서, B 세포 반응을 특이적으로 조절하도록 표적화될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 폴리펩티드는 B 세포 발생, 다른 세포의 발생, 항체 생산 및 사이토킨 생산 조절에 사용될 수 있다. BR43x2 폴리펩티드는 또한 세포내에서 아포토시스 및/또는 아네르기 유발에 사용되는 것이 발견될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 또한 ztnf4 의 증식 효과를 중화하여 T 및 B 세포 교류를 조절할 수 있다. 생물학적 분석 및 ELISA 는 가용성 BR43x2 , TACI 및/또는 BCMA 의 존재하에서 ztnf4 에 대한 세포 반응 측정에 유용하다. 다른 분석법은 세포 반응의 측정으로서 사이토킨 생산의 변화를 측정하는 것 을 포함한다. (예를 들어, Current Protocols in Immunology ed. John E. Coligan et al., NIH, 1996 참조). 항체 이소형, 단핵세포 활성, NK 세포 형성, 항원 제시 세포 기능, 아포토시스를 포함하는 다른 세포 반응 측정을 위한 분석이 있다.
본 발명의 BR43x2 폴리펩티드는 ztnf4 폴리펩티드의 증가와 관련된, 형질세포 백혈병, 만성 또는 급성 림프구 백혈병과 같은 예비-B 또는 B-세포 백혈병; 다발성 골수종, 형질세포 골수종, 내피 골수종 및 거대 세포 골수종과 같은 골수종; 및 비-호즈킨 림프종과 같은 림프종 치료에 대한 ztnf4 의 효과를 중화하기에 유용할 것이다 . 가용성 BR43x2 는 종양 진행 및 생존에 대한 치료 기간동안 유용한 성분일 것이다.
노던 블럿 분석은 ztnf4 가 CD8+ 세포, 단핵세포, 수지상 세포, 활성화된 단핵세포에서 발현된다는 것을 보여준다. 이것은 어떤 자가면역 장애에서, 세포독성 T-세포가 ztnf4 의 과잉 생산을 통해 B-세포 생산을 자극하는 것을 제안한다. 선택적으로 B-림프구의 활성을 차단하는 면역억제 단백질은 질환 치료에 유용할 수 있다. 자동항체 생산은 몇개의 자가면역질환에서 흔하고, 조직 파괴 및 질환의 악화에 기여한다. 자동항체는 또한 면역 복합체 침전 악화 발생을 야기할 수 있고, 신장병, 신경성 증후 및 죽음을 포함하는 많은 전신성 홍반성 루프스의 징후를 야기할 수 있다. 세포 반응에 독립적인 항체 생산 조절은 또한 많은 질환 상태에 유리할 것이다. B 세포는 또한 류마티스양관절염에서 관절염발생 면역글로블린 분비를 하는 것을 보였다.(Korganow et al.,Immunity 10: 451-61,1999). 그 자체로, ztnf4 항체 생산의 저해는 중증근무력증 및 류마티스양관절염과 같은 자가면역질환의 치료에 유용할 것이다. B 림프구의 작용을 선택적으로 차단 또는 중화하는 가용성 BR43x2 와 같은 면역억제 치료제는 이러한 목적에 유용할 것이다. 본 발명의 BR43x2 가용성 수용체 폴리펩티드에서 이러한 능력을 증명하기 위해, 이러한 BR43x2 폴리펩티드는 당업계에 공지되고 본 명세서에 개시된 분석법을 사용하여 평가된다.
본 발명은 자가면역질환과 관련되거나 관련되지 않을 수 있는 말기 신질환과 관련된 B-세포의 작용을 선택적으로 차단하거나 중화하는 BR43x2 , TACI 또는 BCMA 폴리펩티드, 융합체, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트를 사용하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 또한 면역성 신질환 치료에 유용하다. 이러한 방법은 막성 신증, IgA 신증 또는 베르거 질환, IgM 신증, 굳페스처(Goodpasture) 질환, 감염후 사구체신염, 맥관막증식성 질환, 최소-변화 신장 증후와 같은 질환과 결합하는 사구체신염 치료에 유용할 것이다. 이러한 방법은 또한 루프스, 다동맥염, 헨노크-쉬온레인 (Henoch-Schonlein), 피부경화증, HIV-관련 질환, 아밀로이드증 또는 용혈성 수뇨관 신드롬과 같은 질환과 관련된 제 2 차 사구체신염 또는 맥관염 치료를 위한 치료적 이용으로 또한 기능할 것이다. 본 발명의 방법은 또한 만성 신우신염, 진통제 오용, 신석회증, 다른 약제에 의해 유발된 신증, 신결석증, 또는 만성 또는 급성 간질성 신염과 관련된 간질성신염 또는 신우신염 치료를 위한 치료적 이용의 일부분으로 유용할 것이다.
본 발명의 방법은 또한 신장동맥협착 또는 폐색 및 콜레스테롤 색전 또는 신장 색전을 포함하는 고혈압 또는 대혈관질환의 치료에서 BR43x2, TACI 또는 BCMA 폴리펩티드, 융합체, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트의 사용을 포함한다.
본 발명은 또한 신장 또는 비뇨기 종양, 복합 골수종, 림프종, 경쇄 신경병증 또는 아밀로이드증의 진단 및 치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 기관지염 및 기종과 같은 천식 및 다른 만성 기도 질환의 치료를 위한 BR43x2, TACI 또는 BCMA 폴리펩티드, 융합체, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트를 사용하여 활성화된 B 세포를 차단 또는 저해하는 방법을 제공한다.
면역억제, 구체적으로는 이식편대숙주질환 및 이식편거부와 같은 치료적 사용을 위해 BR43x2, TACI 또는 BCMA 폴리펩티드, 융합체, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트를 사용하여 효과기 T 세포 반응을 저해 또는 중화하는 방법이 또한 제공된다. 추가적인 사용은 면역반응, 구체적으로는 림프구의 활성 조절에서 발견될 수 있다. BR43x2 , TACI, 또는 BCMA 폴리펩티드, 융합체, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트는 면역결핍 치료에 유용할 것이다. BR43x2, TACI, 또는 BCMA 폴리펩티드, 융합체, 항체, 아고니스트 또는 안타고니스트는 인슐린 의존 진성당뇨병(IDDM) 및 크론 질환과 같은 자가면역 질환 치료를 위한 치료적 프로토콜에 유용할 것이다. 본 발명의 방법은 만성 염증 질환, 구체적으로는 관절통, 종창, 빈혈 및 다른 관련 징후 경감뿐만 아니라 패혈성쇽의 치료에 추가적인 치료적 가치를 가질것이다.
면역반응에 대한 가용성 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 폴리펩티드 및 융합단백질의 효과는 항원으로 면역화되고 이어서, ztnf4 가 주입된 포유동물에 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 단계 및 당업계에서 공지된 방법에 따라 늦추어진 형태 고감 도 및 시험관내 증식 및 사이토킨 생산을 포함하는 항체 이소형 생산 및 B 및 T 세포 반응을 측정하는 단계에 의해 측정될 수 있다.
그러므로, 본 발명은 또한 a) SEQ ID NO:4 의 폴리펩티드; b)SEQ ID NO:8 의 폴리펩티드; c) 융합 단백질; d) 아미노산 잔기 1 내지 잔기 166 의 SEQ ID NO:8 의 폴리펩티드; e) 아미노산 잔기 1 내지 잔기 150 의 SEQ ID NO:8 의 폴리펩티드; f) SEQ ID NO:4 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편; 및 g) SEQ ID NO:10 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편으로 구성되는 군으로부터 선택되는 화합물의 양을 포유동물에 투여하는 단계를 포함하는 포함하는 이 포유동물에서 ztnf4 활성을 저해하는 방법을 제공한다. 융합 단백질의 예는 다른 폴리펩티드, 바람직하게는 면역글로블린 중쇄 항상 부위 Fc 단편을 가지는 가용성 BR43x2 (SEQ ID NO:4), TACI (SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 1 내지 잔기 166 ) 또는 BCMA (SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 1 내지 잔기 150)의 융합을 포함한다. 본 발명은 BR43x2 , TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합을 저해하는 방법을 제공한다.
이러한 방법은 ztnf4 활성이 활성화된 B 림프구와 관련되는 경우에 특히 유용하고, 예비-B 세포 또는 B-세포 암 치료에 유용할 것이다. 이러한 방법은 또한 ztnf4 활성이 항체 생산과 관련되는 경우에 유용할 것이다. 구체적으로는, 전신성 홍반성 루푸스, 중증근무력증 또는 류마티스양관절염과 같은 자가면역질환과 관련된 항체생산이다.
본 발명은 또한 BR43x2 아고니스트 및 안타고니스트를 제공한다. BR43x2 아고니스트로서 확인된 화합물은 시험관내 및 생체내에서 표적 세포의 증식 및 발생을 변형시키는 데 유용하다. 예를 들어, 아고니스트 화합물은 규정 세포 배양 배지의 성분일 때, 단독으로 또는 다른 사이토킨 및 호르몬과 조합하여 유용하다. 그러므로, 아고니스트는 배지에서 BR43x2 함유 B 림프구 세포의 성장 및/또는 발생을 특이적으로 매개하기에 유용한다. 아고니스트 및 안타고니스트는 또한 B 림프구의 효과기 기능의 연구, 구체적으로는 B 림프구 활성 및 분화에 유용한 것으로 증명될 수 있다. 안타고니스트는 리간드-수용체 상호작용을 특징지우는 연구시약으로서 유용하다.
BR43x2 안타고니스트로서 확인된 화합물은 또한 체액성 면역 반응 추가에 유용하다. B 세포 반응은 세균, 바이러스, 원생동물 및 기생충 감염을 포함하는 감염성 질환과 싸우는 데 중요하다. 감염성 미생물에 대해 항체는 항원과의 결합에 이어 보체 매개 용균 또는 세포 매개 공격에 의해 병원균을 고정화할 수 있다. BR43x2 안타고니스트는 체액성 반응을 추가하는 작용을 할 것이고, 감염성 질환에 대한 위험시 개인에 대한 유용한 치료 또는 보충으로 예방접종에 유용할 것이다.
본 발명은 또한 BR43x2 폴리펩티드 또는 교체적으로, BR43x2 폴리펩티드가 결합하는 리간드에 결합하여 BR43x2 의 기능을 저해 또는 제거하는 안타고니스트를 제공한다. 이러한 BR43x2 안타고니스트는 항체; BR43x2 폴리펩티드 또는 그것의 리간드에 결합하는 올리고뉴클레오티드; 수용체에 결합하는 능력을 보유하지만, 리간드 또는 수용체 신호전달을 초래하지는 않는 BR43x2 의 천연 또는 합성 유사체를 포함할 것이다. 이러한 유사체는 펩티드 또는 펩티드-유사 화합물일 수 있다. BR43x2 폴리펩티드에 결합하고 신호전달을 방해하는 천연 또는 합성의 작은 분자는 또한 안타고니스트로 기대된다. 그 자체로, BR43x2 안타고니스트는 BR43x2 수용체 또는 리간드로부터 신호를 차단하는 것이 유리한 어떤 질환을 치료하는 치료제로 유용할 것이다. 안타고니스트는 리간드-수용체 상호작용을 특징지우는 연구 시약으로서 유용하다. BR43x2 는 유발된 EBV 및 자발성 버어킷트 림프종 및 몇개의 B 세포 골수종을 포함하는 형질전환된 B 세포 라인에서 발현된다. BR43x2 의 기능 저해는 B 세포 림프종 또는 다발성 골수종의 치료에 유용할 것이다. BR43x2 가용성 수용체 또는 항체와 같은 BR43x 2 안타고니스트는 종양 진행을 치료적으로 조절하는데 유용할 수 있다.
아고니스트 및 안타고니스트의 활성은 수용체/리간드 결합의 효능을 결정하는 활성 분석법에 의해 결정될 수 있다. NfKB, NFAT-1 및 AP-1 에 대한 수용체 유전자 구조체를 높은 수준으로 공-발현하는 Baf3 (a murine pre-B cell line Palacios 및 Steinmetz, 상기참조. 및 Mathey-Prevot et al., 상기참조.)와 같은 안정하게 트랜스펙션된 B-세포 라인은 BR43x2 를 발현시키도록 만들어졌다. TACI 및 BCMA 를 발현하는 세포라인은 또한 Jurkat 및 다른 B 림프종 세포라인에서 유사한 방식으로 제조되었다. Ztnf4 는 이러한 구조체에서 수용체 유전자를 통해 신호전달하는 것이 밝혀졌다. 가용성 BR43x2 및 항체는 결합 측정에 사용될 수 있다.
본 발명의 단백질을 분석하는 생체내 접근법은 바이러스 송달 시스템을 포함한다. 이 목적을 위한 표본적인 바이러스는 아데노바이러스, 허프스바이러스, 백시니아 바이러스 및 아데노-관련 바이러스(AVV)를 포함한다. 이중-가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스는 통상 비상동 핵산의 송달을 위한 가장 연구된 유전자 전이 벡터이다. (개관을 위해, Becker et al., Meth. Cell Biol. 43: 161-89,1994; 및 Douglas 및 Curiel, Science & Medicine 4: 44-53,1997 참조). 아데노바이러스 시스템은 (i) 상대적으로 큰 DNA 삽입체를 수용할 수 있고; (ii) 높은-적정량에서 배양될 수 있고 ;(iii) 광범위한 포유동물 세포 형태를 감염시킬 수 있고; (iv) 다른 프로모터를 포함하는 많은 이용가능한 벡터를 가지고 사용될 수 있는 잇점을 제공한다. 또한, 아데노바이러스는 혈액에서 안정하기 때문에, 정맥주사로 투여될 수 있다.
아데노바이러스 게놈의 부분을 제거함으로서, 비상동 DNA 의 큰 삽입체(7kb 이하)가 수용될 수 있다. 이러한 삽입체는 직접적인 연결 또는 공-트랜스펙션된 플라스미드를 가지고 상동 재조합에 의해 바이러스 DNA 에 삽입될 수 있다. 표본적인 시스템에서, 필수 E1 유전자는 바이러스 벡터로부터 제거되었고, 바이러스는 숙주세포(인간 293 세포 라인이 예이다.) 에서 제공되는 E1 유전자 부재시에는 복제할 수 없을 것이다. 완전한 동물에 정맥내로 투여될 때, 아데노바이러스는 1차적으로 간에 표적화된다. 아데노바이러스 송달 시스템이 E1 유전자 결실을 가진다면, 바이러스는 숙주 세포에서 복제할 수 없을 것이다. 그러나, 숙주 조직(예를 들어, 간)은 비상동 단백질을 발현하고 프로세싱(그리고, 신호서열이 존재한다면, 분비)할 것이다. 분비된 단백질은 매우 혈관화된 간에서 순환에 들어갈 것이고, 감염된 동물에 대한 효과가 결정될 수 있다.
아데노바이러스 시스템은 또한 시험관내에서 단백질 생산에 사용될 수 있다. 세포가 빠르게 분열하지 않는 조건하에서 아데노바이러스-감염 비-293 세포를 배양함으로서, 세포는 연장된 시간동안 단백질을 생산할 수 있다. 예를 들어, BHK 세포 는 세포 배양기에서 합류하도록 배양되고, 그 다음 관심의 분비 단백질을 암호화하는 아데노바이러스 벡터에 노출된다. 그 때, 무-혈청 조건에서 세포가 배양되고, 그것은 감염된 세포가 눈에 띄는 세포 분열없이 몇 주 동안 생존 가능하게 한다. 대안적으로, 293S 세포로 감염된 아데노바이러스 벡터는 상당한 양의 단백질을 생산하도록 상대적으로 높은 세포 밀도로 상청액 배양물에서 배양된다. (Garnier et al., Cytotechnol. 15: 145-55,1994 참조). 어느 프로토콜을 가지고, 발현, 분비된 비상동 단백질은 세포 배양물 상청액으로부터 반복적으로 분리될 수 있다. 감염된 293S 세포 생산 프로토콜에서, 비-분비 단백질이 또한 효과적으로 얻어질 수 있다.
잘 확립된 동물 모델은 어떤 질환 상태에서 본 발명의 가용성 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 폴리펩티드의 생체내 효험을 시험하기에 유용하다. 구체적으로는, 가용성 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 폴리펩티드 및 폴리펩티드 단편은 SLE 모델(전신성 홍반성 루프스)로서 작용하는 MRL-lpr/lpr 또는 NZB x NZW Fl 동종의 마우스 균주와 같은 많은 동물모델의 자가면역질환에서 생체내 시험가능하다. 이러한 동물 모델은 당업계에서 공지되고, 예를 들어, Autoimmune Disease Models A Guidebook, Cohen 및 Miller eds. Academic Press 참조. 뉴질랜드 블랙(NZB) 및 뉴질랜드 화이트(NZW) 마우스간의 교배 자손은 인간의 SLE 를 유사하게 닮은 SLE 자발성 형태의 SLE 를 발생시킨다. NZBW 로 알려진 자손 마우스는 생후 1 개월시에 T-세포에 대한 IgM 자가항체를 발생하기 시작하고, 생후 5-7 개월후에는 Ig 항-DNA 자가항체가 우세한 면역글로블린이다. 다클론 B-세포 활동항진은 자가항체의 과생산을 초래한다. 이러한 자가항체의 침전, 구체적으로는 단일 가닥 DNA 에 대해 특이적인 항 체는 단백뇨, 질소혈, 및 신부전에 의한 사멸로서 임상적으로 증명된 사구체신염의 발생과 관련된다. 신장병은 자발성 SLE 로 감염된 마우스 및 NZBW 균주에서 죽음의 결과적인 원인이고, 이 과정은 만성적이고 폐색적이다. 수컷의 경우 406 일 생존하는 것에 비하여 암컷은 단지 245 일 생존을 의미하므로, 질환은 수컷보다 암컷에서 더욱 빠르고 심각하다. 많은 암컷 마우스가 7-9 개월후에 증후(단백뇨)를 나타내는 반면에, 어떤 것은 증후를 발생시키는 시기가 훨씬 빠르거나 더 늦을 수 있다. NZBW 마우스에서 보여진 치명적인 면역 신장염은 인간 SLE 에서 보여진 사구체신염과 매우 유사하여, 이 자발성 쥐의 모델을 잠재적인 SLE 치료제 시험에 매우 매력적으로 만든다.(Putterman 및 Naparstek, Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus, Autoimmune Disease Models: A Guidebook, chapter 14, pp. 217-34,1994; Mohan et al., J. Immunol. 154: 1470-80,1995; 및 Daikh et al., J. Immunol. 159: 3104-08,1997). 징후의 완화 및 질환 코스의 변형에 대한 TACI, BR43x2, 또는 BCMA 의 효험을 평가하기 위해 이러한 마우스에 가용성 TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig 또는 다른 가용성 및 융합 단백질의 투여는 하기의 실시예 단락에 개시된다.
실험 알레르기 뇌척수염(EAE)에 대한 마우스 모델은 면역-매개 질환의 메카니즘, 및 잠재적인 치료성 중재방법 모두를 연구하는 수단으로 사용되었다. 이 모델은 인간 다발성 경화증과 유사하고, 수초 기초 단백질(MBP), 또는 프로테오리피드 단백질(PLP)과 같은 신경단백질에 대한 T-세포 활성화의 결과로서 탈수초를 일으킨다. 항원을 가지고 접종하는 것은 CD4+, 유형 II MHC-제한 T-세포(Th1)의 유발 을 야기한다. EAE 에 대한 프로토콜의 변화는 이 모델의 급성, 만성-재발, 또는 수동-전이 변이체를 생산할 수 있다. (Weinberg et al., J. Immunol. 162: 1818-26,1999; Mijaba et al., Cell. Immunol. 186: 94102,1999; 및 Glabinski, Meth. Enzym. 288: 182-90,1997). 징후의 완화 및 질환 코스의 변형에 대한 TACI, BR43x2, 또는 BCMA 의 효험을 평가하기 위해서 이러한 마우스에 가용성 TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig 또는 다른 가용성 및 융합 단백질의 투여는 하기의 실시예 단락에 개시된다.
콜라겐-유발 관절염(CIA)모델에서, 마우스는 인간 류마티스양 관절염(RA)과 매우 유사한 만성 염증성 관절염을 발생시킨다. CIA 가 RA 와 유사한 면역학적 및 병원학적 특징을 공유하기 때문에, 이것이 마우스를 잠재적인 인간 항-염증성 화합물을 스크리닝하기 위한 이상적인 모델로 만든다. CIA 모델을 사용하는 또다른 잇점은 병원론의 메카니즘이 공지되었다는 것이다. 형태 II 콜라겐상의 T 및 B 세포 에피토프가 확인되었고, 면역-매개 관절염과 관련된 다양한 면역성(연장된-형태 고감도 및 항-콜라겐 항체) 및 염증성 (사이토킨, 케모킨, 및 매트릭스-분해 효소) 매개 변수가 결정되었고, 모델에서 화합물 효험을 시험하기 위해 평가에 사용될 수 있다. (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3: 40720,1999; Williams et al., Immunol. 89: 9784-788,1992; Myers et al., Life Sci. 61: 1861-78,1997; 및 Wang et al.,Immunol. 92: 8955-959,1995). 징후의 완화 및 질환 경로의 변형에 대해 TACI, BR43x2, 또는 BCMA 의 효험을 평가하기 위해 이러한 마우스에 가용성 TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig 또는 다른 가용성 및 융합 단백질의 투여는 하기의 실시예 단락에 개시된다.
천식과 같은 기관지 감염을 위한 모델은 마우스가 오브알부민과 함께 주사될 때, 천식에 유사한 기관지에서 천식성 반응을 일으키는 항원으로 후두로 자극될 때 생성될 수 있다. 징후의 완화 및 질환 코스에 대한 변형에 대한 TACI, BR43x2, 또는 BCMA 의 효험을 평가하기 위해 이러한 마우스에 가용성 TACI-Ig, BR43x2-Ig, BCMA-Ig, 또는 다른 가용성 및 융합 단백질의 투여는 하기의 실시예 단락에 개시된다.
생체 내 모델을 위한 또다른 사용은 동물에 대한 항원 도전의 송달에 연이어 가용성 BR43x2 (TACI) 또는 그것의 리간드 ztnf4 의 투여 및 T 및 B 세포 반응을 측정을 포함한다.
T 세포 의존 및 T 세포 비의존 면역반응이 Perez-Melgosa et al., J. Immunal., 163: 1123-7,1999에 개시된다.
통상의 항원 도전(예를 들어, 오브알부민 또는 콜라겐) 에 놓인 동물에서 면역반응에 이은 BR43x2, TACI 또는 BCMA 폴리펩티드 또는 가용성 Ig-융합의 투여는 B 세포 반응에 대한 효과를 측정하기 위해 행해질 수 있다.
약리역학 연구는 생체내에서 이러한 폴리펩티드의 분배 및 반감기를 결정하기 위해서 방사선표지, 가용성 BR43x2, TACI 또는 BCMA 폴리펩티드와 결합하여 사용될 수 있다. 추가적으로 동물 모델은 종양 및 생체 내 종양 개발상의 가용성 BR43x2, TACI 또는 BCMA 의 효과를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
자가면역질환, 신장 질환, B 및 T 세포 질환에 대한 대용마커로서 BR43x2, TACI 또는 BCMA 폴리펩티드의 사용이 또한 제공된다. 이러한 환자는 출혈될 수 있고, BR43x2, TACI 또는 BCMA 가용성 수용체 및 그들의 리간드는 혈액내에서 검출될 수 있다.
본 발명은 또한 항체를 제공한다. SEQ ID NO:8 의 아미노산 서열을 가지는 BR43X2 또는 펩티드에 대한 항체가 예를 들어, 관심의 폴리펩티드, 또는 천연원으로부터 분리된 폴리펩티드를 포함하는 발현 벡터의 산물을 항원으로 사용하여 얻어질 수 있다. 구체적으로는 유용한 항체는 SEQ ID NO:10 의 아미노산 서열을 가지는 BR43x2 또는 펩티드를 가지고 "특이적으로 결합" 한다. 항체가 결합 친화성 (Ka) 106M-1 이상, 바림직하게는 107M-1 이상, 더욱 바람직하게는 108M-1 이상, 그리고 가장 바람직하게는 109 M-1 을 가지고 BR43x2 폴리펩티드 또는 SEQ ID NO:8 의 폴리펩티드, 펩티드 또는 에피토프에 결합한다면, 항체는 특이적으로 결합하는 것으로 여겨진다. 항체의 결합 친화성은 예를 들어, Scatchard 분석 (Scatchard, Ann. NY Acad.Sci.51:660, 1949)으로 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 적당한 항체는 BR43x2 , 구체적으로는 BR43x2 의 세포외 도메인(SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 1-120)과 결합하는 항체 및 SEQ ID NO:10 의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드와 결합하는 항체를 포함한다.
항-BR43x2 항체는 항원성 BR43x2 에피토프-함유 펩티드 및 폴리펩티드를 사용하여 생산될 수 있다. 본 발명의 항원성 에피토프-함유 펩티드 및 폴립펩티드는 SEQ ID NO:2 에 포함된 적어도 9, 바람직하게는 15 내지 약 30 아미노산의 서열을 포함한다. 그러나, 30 내지 50 아미노산을 포함하거나, 어느 길이 이하 및 본 발명의 폴리펩티드의 전 아미노산 서열을 포함하는, 본 발명의 아미노산 서열의 더 큰 부분을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드는 또한 BR43x2 와 결합하는 항체 유발에 유용한다. 에피토프-함유 펩티드의 아미노산 서열은 수성 용매에서 상당한 가용성을 제공하도록 선택되는 것이 바람직하다. (즉, 서열은 바람직하게는 소수성 잔기는 피하는 반면에 상대적으로 친수성 잔기를 포함한다.) 친수성 잔기는 소수성 플롯으로부터 당업자에 의해 예견될 수 있다. 예를 들어, Hopp 및 Woods (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78: 3824-8,1981) 및 Kyte 및 Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 105-142,1982)참조. 더욱이, 프로린 잔기를 포함하는 아미노산 서열이 또한 항체 생산에 바람직할 수 있다.
재조합 BR43x2 단백질 또는 천연원으로부터 분리된 BR43x2 에 대한 다클론 항체는 당업자에게 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, Green et al.,"Production of Polyclonal Antisera,"in Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1-5 (Humana Press 1992), 및 Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid vectors 및 purification of specific polyclonal antibodies,"in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 15 (Oxford University Press 1995)참조. BR43x2 폴리펩티드의 면역원성은 알룸(수산화 알루미늄)과 같은 애쥬번트 또는 Freund 완전한 또는 불완전한 애쥬번트의 사용을 통해 증가될 수 있다. 면역화에 유용한 폴리펩티드는 또한 면역글로블린 폴리펩티드 또는 말토스 결합 단백질을 가 지고 BR43x2 또는 그것의 부분의 융합과 같은 융합 폴리펩티드를 포함한다. 폴리펩티드 면역원은 완전한-길이 분자이거나 그것의 부분일 수 있다. 폴리펩티드 부분이 "헵텐-유사"라면, 이러한 부분은 면역화를 위해 거대분자 담체(예를 들어, keyhole limpet hemocyanin (KLH), bovine serum albumin (BSA) 또는 tetanus toxoid)에 유리하게 결합 또는 연결될 수 있다.
다클론 항체가 전형적으로 말, 카우, 개, 닭, 래트, 마우스 , 토끼, 햄스터, 기니아 피그, 고우트 또는 양과 같은 동물에서 발생되지만, 본 발명의 항-BR43x2 항체는 또한 인간 이하의 영장류 항체로부터 유도될 수 있다. 비비에서 진단적으로 그리고 치료적으로 유용항 항체를 유발하는 일반적인 기법은 예를 들어, Goldenberg et al., international patent 공개 No. WO 91/11465, 및 in Losman et al., Int. J. Cancer 46: 310,1990 에서 밝혀질 수 있다. 항체는 또한 트랜스제닉 양, 카우, 고우트 또는 피그와 같은 동물에서 유발될 수 있고, 포유동물 및 곤충 세포에서와 마찬가지로 변형된 형태로 효모 및 균류에서 발현될 수 있다.
대안적으로, 단일클론 항-BR43x2 항체가 생성될 수 있다. 특정 항원에 대한 로덴트 단일클론 항체가 당업자들에게 알려진 방법으로 얻어질 수 있다.(예를 들어, Kohler et al., Nature 256: 495,1975, Coligan et al. (eds.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991), Picksley et al.,"Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli,"in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al. (eds.), page 93 (Oxford University Press 1995) 참조).
요약하면, 단일클론 항체는 BR43x2 유전자 산물을 포함하는 조성물을 마우스에 주입하는 단계, 혈청 샘플을 제거하여 항체 생산의 존재를 증명하는 단계, B-림프구를 얻기 위해 비장을 제거하는 단계, 하이브리도마를 생산하기 위해 골수종 세포와 B-림프구를 융합하는 단계, 하이브리도마를 클론하는 단계, 항원에 대한 항체를 생산하는 양성 클론을 선택하는 단계, 항원에 대한 항체를 생산하는 클론을 배양하는 단계, 및 하이브리도마 배양물로부터 항체를 분리하는 단계에 의해 얻어질 수 있다.
게다가, 본 발명의 항-BR43x2 항체는 인간 단일클론 항체로부터 유도될 수 있다. 인간 단일클론 항체를 항원 도전에 반응하여 특정 인간 항체를 생산하도록 조작된 트랜스제닉 마우스로부터 얻었다. 이러한 기법에서, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자화의 요소는 내인성 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 표적화된 파괴를 포함하는 배아 스템 세포 라인으로부터 유래된 마우스의 균주에 도입된다. 트랜스제닉 마우스는 인간 항원에 특이적인 인간 항체를 생산할 수 있고, 마우스는 항체-분비 하이브리도마를 생산하는 데 사용될 수 있다. 트랜스제닉 마우스로부터 인간 항체를 얻는 방법은 예를 들어, Green et al., Nat. Genet. 7: 13,1994, Lonberg et al., Nature 368: 856,1994, 및 Taylor et al., Int. Immun. 6: 579,1994 에 개시된다.
단일클론 항체는 잘 확립된 다양한 기법에 의해 하이브리도마 배양으로부터 분리되고 정제될 수 있다. 이러한 분리 기법은 단백질 A 세파로스에 의한 친화성 크로마토그래피, 크기 배척 크로마토그래피, 및 이온-교환 크로마토그래피를 포함한다.(예를 들어, Coligan at pages 2.7.1-2.7.12 및 pages 2.9.1-2.9.3; Baines et al.,"Purification of Immunoglobulin G (IgG),"in Methods in Molecular Biology, Vol. 10, pages 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992) 참조).
특정 사용을 위해서, 항-BR43x2 항체 단편을 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 항체 단편은 예를 들어, 항체의 단백질분해 가수분해로서 얻어질 수 있다. 항체 단편은 종래의 방법으로 전 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의해 얻어질 수 있다. 예로서, 항체 단편은 5S 단편 표시된 F (ab')2 를 제공하기 위하여 펩신으로 항체의 효소적 절단에 의해 생산될 수 있다. 이 단편은 3.5S Fab' 1 가 단편을 생산하기 위하여 티올 감약제를 사용하여 더 절단될 수 있다. 선택적으로, 절단 반응은 이황화 결합의 절단으로부터 야기된 술프히드릴기에 대한 차단기를 사용하여 수행될 수 있다. 대안적으로 펩신을 사용하는 효소적 절단은 직접적으로 2 개의 1 가 Fab 단편 및 Fc 단편을 생산한다. 이러한 방법은 Goldenberg, U. S. 특허번호 4,331,647, Nisonoff et al.,Arch Biochem. Biophys. 89: 230,1960, Porter, Biochem. J. 73: 119,1959, Edelman et al., in Methods in Enzymology Vol. 1, page 422 (Academic Press 1967), 및 by Coligan, 상기참조 에 개시된다.
1 가 경쇄-중쇄 단편을 형성하기 위한 중쇄의 분리, 단편의 더이상의 절단, 또는 다른 효소적, 화학적 또는 유전적 기법과 같은 항체 절단의 다른 방법이 단편이 완전한 항체에 의해서 인지되는 항원에 결합하는 한 사용될 수 있다.
예를 들어, Fv 단편은 VH 및 VL 사슬의 결합을 포함한다. 이러한 결합은 Inbar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659,1972 에 개시된 대로 비공유 결합일 수 있다. 대안적으로, 가변 사슬은 분자간 이황화 결합 또는 글루테르알데히드와 같은 화학제에 의한 가교결합에 의해 연결될 수 있다.(예를 들어, S및hu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437,1992 참조).
Fv 단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 VH 및 VL 사슬을 포함할 수 있다. 이러한 단일-사슬 항원 결합 단백질(scFv) 는 올리고뉴클레오티드에 의해 연결되는 VH 및 VL 도메인을 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자를 제조함으로서 제조된다. 구조 유전자는 E.coli 와 같은 숙주 세포에 연속적으로 도입되는 발현 벡터에 삽입된다. 재조합 숙주 세포는 두개의 V 도메인을 연결하는 링커 펩티드를 가진 단일 폴리펩티드 사슬을 합성한다. scFvs 를 생산하는 방법은 Whitlow et al.,Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 97,1991, also see, Bird et al., Science 242: 423,1988, Ladner et al., U. S. 특허번호 4,946,778, Pack et al., Bio/Technoloav 11: 1271,1993, 및 Sandhu, 상기참조 에 개시된다.
예로서, scFV 는 림프구를 시험관내에서 BR43x2 폴리펩티드에 노출시키는 단계, 및 파지 또는 유사한 벡터( 예를 들어, 고정화된 또는 표지화된 BR43x2 단백질 또는 펩티드의 사용을 통해)에서 항체전개 라이브러리를 선택하는 단계에 의해 얻어질 수 있다. 잠재적인 BR43x2 폴리펩티드 결합 도메인을 가지는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 파지(파지 전시) 또는 E.coli 와 같은 세균상에서 나타난 무작위 펩티드 라이브러리를 스크리닝하여 얻어질 수 있다. 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 무작위 돌연변이화 및 무작위 폴리뉴클레오티드 합성과 같은 많은 방법으로 얻어질 수 있다. 이러한 무작위 펩티드 전시 라이브러리는 리간드 또는 수용체와 같은 단백질 또는 폴리펩티드, 생물학적 또는 합성 거대분자, 또는 유기 또는 무기 물질일 수 있는 공지된 표적과 상호작용하는 펩티드를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다. 이러한 무작위 펩티드 전시 라이브러리를 생산 및 스크리닝하는 기법은 당업계에서 공지되고(Ladner et al.,U. S. 특허번호 5,223,409, Ladner et al., U. S. 특허번호 4,946,778, Ladner et al., U. S. 특허번호 5,403,484, Ladner et al., U. S. 특허번호 5,571,698, 및 Kay et al., Phaqe Display of Peptides 및 Proteins (Academic Press,Inc. 1996)) , 이러한 라이브러리를 스크리닝하기 위한 무작위 펩티드 전시 라이브러리 및 키트는 예를 들어, Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA), 및 Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ)로부터 상업적으로 이용가능하다. 무작위 펩티드 전시 라이브러리는 BR43x2 에 결합하는 단백질을 확인하기 위하여 본 명세서에 개시된 BR43x2 서열을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
다른 형태의 항체 단편은 단일 상보성-결정 부위(CDR)를 암호화하는 펩티드이다. CDR 펩티드("최소한의 인지 단위") 는 관심의 항체의 CDR 을 암호화하는 유전자를 제조하여 얻어질 수 있다. 이러한 유전자는 항체 생산 세포의 RNA 로부터 가변 부위를 합성하기 위하여 예를 들어, 폴리머라제 사슬 반응을 사용하여 제조된다.(예를 들어, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991), Courtenay-Luck,"Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies,"in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering 및 Clinical Application, Ritter et al. (eds.), page 166 (Cambridge University Press 1995), 및 Ward et al.,"Genetic Manipulation 및 Expression of Antibodies,"in Monoclonal Antibodies: Principles 및 Applications, Birch et al., (eds.), page 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)참조 ).
대안적으로, 항-BR43x2 항체는 "인간화된" 단일클론 항체로부터 유도될 수 있다. 인간화된 단일클론 항체는 마우스 면역글로블린의 중쇄 및 경쇄 가변부위로부터 인간 가변 도메인으로 마우스 상보적인 결정 부위를 전달하는 것에 의해 생산된다. 그 때, 전형적인 인간 항체 잔기는 쥐의 상보물의 프레임워크 부위에 구성된다. 인간화된 단일클론 항체로부터 유도된 항체 성분의 이용은 쥐의 항상 부위의 면역원성과 결합된 잠재적인 문제를 피한다. 쥐의 면역글로블린 가변 도메인을 클로닝하는 일반적인 기법은 예를 들어, Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833,1989 에 개시된다. 인간화된 단일클론 항체를 생산하는 기법은 예를 들어, Jones et al., Nature 321: 522,1986, Carter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89: 4285,1992, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437,1992, Singer et al., J. Immun. 150: 2844,1993, Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley,"Engineering Therapeutic Antibodies,"in Protein Engineering: Principles 및 Practice, Cleland et al. (eds.), pages 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996), 및 by Queen et al., U. S. 특허번호 5,693,762 (1997)에 개시된다.
다클론 항-이디오타입 항체는 항-BR43x2 또는 항체 단편을 가지고 표준 기법을 사용하여 동물을 면역화하여 제조될 수 있다. 예를 들어, , Green et al.,"Production of Polyclonal Antisera,"in Methods In Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), pages 1-12 (Humana Press 1992) 참조. 또한 , Coligan, 상기참조. at pages 2.4.1-2.4.7 참조. 대안적으로, 단일클로 항-이디오타입 항체는 상기에 개시된 기법으로 면역원으로서 항-BR43x2 항체 또는 항체 단편을 사용하여 제조될 수 있다. 다른 대안적인, 인간화된 항-이디오타입 항체 또는 인간이하 영장류 항-이디오타입 항체는 상기-개시된 기법을 사용하여 제조될 수 있다. 항-이디오타입 항체를 생산하는 방법은 예를 들어,Irie, U. S. 특허번호 5,208,146, Greene, et. al., U. S. 특허번호 5,637,677, 및 Varthakavi 및 Minocha, J. Gen. Virol. 77: 1875,1996 에 개시된다.
본 명세서에서 항체 또는 폴리펩티드는 또한 약제, 독소, 방사성뉴클라이드등에 직접 또는 간접으로 결합될 수 있고, 이러한 결합은 생체내 진단 또는 치료 이용에 사용된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체는 상응하는 항-상보성 분자(예를 들어, 각각 수용체 또는 항원)를 발현하는 조직 또는 기관을 확인 또는 치료하는 데 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로는, BR43x2 폴리펩티드 또는 항-BR43x2 항체, 또는 생물학적활성 단편 또는 그것의 부분은 검출가능한 세포독성 분자에 결합될 수 있고 항-상보성 분자를 발현하는 세포,조직 또는 기관을 가지는 포유동물에 송달된다.
적당한 검출가능한 분자는 직접적으로 또는 간접적으로 폴리펩티드 또는 항 체에 부착될 수 있고, 방사성뉴클라이드, 효소, 기질, 공동인자, 저해제, 형광 마커, 화학발광 마커, 자기입자등을 포함한다. 적당한 세포독성 분자는 폴리펩티드 또는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있고, 세균 또는 식물 독소(예를 들어, 디프테리아 독소, Pseudomonas 외독소, 리신, 애브린등) 뿐만아니라 요오드-131 , 레늄-188 또는 이트륨-90 과 같은 치료적 방사성뉴클라이드(폴리뉴클레오티드 또는 항체에 직접적으로 부착되거나 예를 들어, 킬레이팅 부분을 통해 간접적으로 부착)를 포함한다. 폴리펩티드 또는 항체는 또한 아드리아마이신과 같은 세포독성 약제에 결합될 수 있다. 검출가능하거나 세포독성 분자의 간접적인 부착에 대하여, 다른 요소가 폴리펩티드 또는 항체 부분과 결합되는 경우, 검출가능하거나 세포독성 분자는 한 요소의 보체/항보체 쌍과 결합할 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 바이오틴/스트펩타비딘은 표본적인 보체/항보체 쌍이다.
BR43x2 에 대한 가용성 BR43x2 폴리펩티드 또는 항체는 약제, 독소, 방사성뉴클라이드등에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있고, 이러한 결합체는 생체내 진단적 또는 치료적 이용분야에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 또는 항체는 상응하는 항-보체 분자(예를 들어, 수용체 또는 항원 각각)를 발현하는 조직 또는 기관을 확인 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 더욱 구체적으로는, BR43x2 폴리펩티드 또는 항-BR43x2 항체, 또는 그것의 생물학적활성 단편 또는 부분은 검출가능하거나 세포독성 분자에 결합될 수 있고, 항-보체 분자를 발현하는 세포, 조직 또는 기관을 가지는 포유동물에 송달될 수 있다.
적당한 검출가능한 분자는 폴리펩티드 또는 항체에 직접적으로 또는 간접적 으로 부착되고, 방사성뉴클라이드, 효소, 기질, 공동인자, 저해제, 형광 마커, 화학 발광 마커, 자기입자등을 포함한다. 적당한 세포독성 분자는 폴리펩티드 또는 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 부착될 수 있고, 세균 또는 식물 독소(예를 들어, 디프테리아 독소, Pseudomonas 외독소, 리신, 애브린등) 뿐만아니라 요오드-131 , 레늄-188 또는 이트륨-90 과 같은 치료적 방사성뉴클라이드(폴리뉴클레오티드 또는 항체에 직접적으로 부착되거나 예를 들어, 킬레이팅 부분을 통해 간접적으로 부착)를 포함한다. 폴리펩티드 또는 항체는 또한 아드리아마이신과 같은 세포독성 약제에 결합될 수 있다. 검출가능하거나 세포독성 분자의 간접적인 부착에 대하여, 다른 요소가 폴리펩티드 또는 항체 부분과 결합되는 경우, 검출가능하거나 세포독성 분자는 한 요소의 보체/항보체 쌍과 결합할 수 있다. 이러한 목적을 위해서, 바이오틴/스트펩타비딘은 표본적인 보체/항보체 쌍이다.
이러한 폴리펩티드-독소 융합 단백질 또는 항체/단편-독소 융합 단백질은 표적화된 세포 또는 조직 저해 또는 절제(예를 들어, 암 세포 또는 조직을 치료하기 위함)에 사용될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩티드가 복합 기능적 도메인을 가진다면, (즉, 활성 도메인 또는 리간드 결합 도메인, 플러스 표적화 도메인) 단지 표적화 도메인을 포함하는 융합 단백질은 검출가능한 분자, 세포독성 분자 또는 관심의 세포 또는 조직 형태에 상보적인 분자에 특이적으로 적당할 수 있다. 도메인이 단지 융합 단백질인 경우의 예는 보체 분자, 검출가능하거나 세포독성 분자에 결합할 수 있는 항-보체 분자를 포함한다. 그러므로, 이러한 도메인-상보적인 분자 융합 단백질은 항-보체-검출가능한/세포독성 분자 결합체 속성의 세포/조직-특이적 송달 에 관한 속성 표적화 운반체를 나타낸다. 본 명세서에 개시된 생물학적활성 폴리펩티드 또는 항체 결합체는 정맥내, 동맥내로 또는 관내로 송달될 수 있거나, 의도된 작용부위에 국소적으로 도입될 수 있다.
항체는 His 또는 FLAGTM 표지된 가용성, BR43x2 폴리펩티드로 만들어질 수 있다. 항체는 또한 E.coli 생산 MBP-융합 단백질에 대해 제조될 수 있다. 대안적으로, 이러한 폴리펩티드는 인간 Ig 를 가진 융합 단백질을 포함할 수 있다. 구체적으로는, His-표지된, 또는 FLAGTM -표지 가용성 BR43x2 에 대한 폴리펩티드 항체를 함유하는 항혈청이 인간 또는 영장류 조직상의 면역조직화학에 의해 BR43x2 의 조직 분배 분석에 사용될 수 있다. 이러한 가용성 BR43x2 폴리펩티드는 가용성 인간 BR43x2 폴리펩티드에 대한 단일클론 항체를 생산하기 위해 마우스를 면역화하는 데 사용될 수 있다. 가용성 인간 BR43x2 폴리펩티드에 대한 단일클론 항체는 리간드/수용체 결합을 흉내내는 데 사용될 수 있어서, 리간드/수용체 쌍의 활성화 또는 불활성화를 초래한다. 예를 들어, 가교결합 항-가용성 CD40 단일클론항체는 항-IgM 또는 LPS 로 반-적절하게 활성화된 B 세포에 자극적 신호를 제공하고, 증식 및 면역글로블린 생산을 초래한다. 수용체의 활성을 차단함으로서 단일클론 항체는 아고니스트로서 작용한다. BR43x2 에 대한 단일클론 항체는 조직 분배 연구에 의해 확인된 특정 세포계상에서 BR43x2/BR43x2-리간드 쌍의 분배, 조절 및 생물학적 상호작용을 결정하는 데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 분리되고 정제된 BR43x2, TACI 및 BCMA 폴리뉴클레오티드 프 로브 또는 프라이머를 제공한다. 이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 RNA 또는 DNA 일 수 있다. DNA 는 cDNA 또는 게놈 DNA 일 수 있다. 폴리뉴클레오지드 프로브는 단일 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA , 일반적으로는 합성 올리고뉴클레오티드이지만, 클론된 cDNA 또는 게놈 서열로부터 발생될 수 있고, 일반적으로 적어도 16 뉴클레오티드, 더욱 빈번하게는 17 뉴클레오티드 내지 25 또는 그 이상의 뉴클레오티드, 때때로 40 내지 60 뉴클레오티드 , 및 어떤 경우에는 상당한 부분, 도메인 또는 완전한 BR43x2 유전자 또는 cDNA 를 포함할 것이다. 프로브 및 프라이머는 일반적으로 합성 올리고뉴클레오티드이지만, 클론된 cDNA 또는 게놈 서열 또는 그것의 보체일 수 있다. 다소 더 짧은 프로브(14-17 뉴클레오티드) 가 사용될 수도 있지만, 분석 프로브는 일반적으로 적어도 길이면에서 20 뉴클레오티드일 것이다. PCR 프라이머는 길이면에서 적어도 5 뉴클레오티드, 바람직하게는 15 또는 그 이상 nt, 더욱 바람직하게는 20-30 nt 이다. 분석을 위해 유전자의 작은 부분이 표적화될 때, 짧은 폴리뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 유전자의 전 분석을 위해, 폴리뉴클레오티드 프로브는 전체 엑손 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 프로브는 Molecular Probes, Inc.,Eugene , OR, 및 Amersham Corp., Arlington Heights, IL과 같은 많은 원으로부터 상업적으로 이용가능한 효소, 비오틴, 방사성뉴클라이드, 플로로포어, 화학발광제, 상자성 입자등을 가지고 당업계에서 잘 알려진 기법을 사용하여, 검출가능한 신호를 제공하도록 표지될 수 있다. 그로부터 프로브를 제조하기에 바람직한 부위는 리간드 결합 부위, 시스테인-풍부 슈도 반복, 신호 서열등을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 프로브 및 혼성화 기법을 개발시키는 기법은 당업계에 공지 되고, 예를 들어, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology , John Wiley 및 Sons, Inc.,NY, 1991 참조.
BR43x2, TACI 및 BCMA 폴리펩티드 및 항체는 BR43x2, TACI, 및 BCMA 및 BR43x2, TACI, 및 ztnf4 와 같은 BCMA 리간드 폴리펩티드의 존재를 검출하기 위한 진단적 시스템에서 사용될 수 있다. 이러한 검출 방법으로부터 유도된 정보는 다양한 질환에서 BR43x2 폴리펩티드의 중요성에 대한 통찰력을 제공할 수 있고, 질환에 대한 진단적 수단으로서의 잠재적인 작용때문에 BR43x2 의 변형된 수준이 중요하다. 변형된 수준의 BR43x2, TACI 및 BCMA 수용체 폴리펩티드는 암, 자가면역질환 및 감염성 질환을 포함하는 병원성 상태를 나타낼 수 있다.
기초적 접근법에서, 단일-가닥 프로브 분자는 RNA 와 함께 인큐베이션되고, 프로브 및 표적 BR43x2, TACI 또는 BCMA RNA 종 사이의 염기 결합을 촉진하는 온도 및 이온 강도의 조건하에서, 생물학적 샘플로부터 분리된다. 혼성화된 분자로부터 비결합 프로브를 분리시킨 후에, 혼성체의 양을 검출한다.
RNA 검출의 잘 확립된 혼성화 방법은 노던 분석 및 도트/슬랏 블랏 혼성화를 포함한다.(예를 들어, Ausubel 상기참조. 및 Wu et al. (eds.),"Analysis of Gene Expression at the RNA Level,"in Methods in Gene Biotechnology, pages 225-239 (CRC Press, Inc. 1997)참조). 핵산 프로브는 32P 또는 35S 와 같은 방사성동위원소를 가지고 검출가능하게 표지될 수 있다. 대안적으로, BR43x2 RNA 는 비방사성 혼성화 방법으로 검출될 수 있다. (예를 들어, Isaac (ed.), Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Humana Press, Inc., 1993 참조). 전형적으로, 비방사성 검출은 색소생산성 또는 화학발광기질의 효소적 전환에 의해 얻어질 수 있다. 비방사성 부분은 비오틴, 플루오레세인, 및 디그옥시게닌을 포함한다.
BR43x2, TACI, 및 BCMA 올리고뉴클레오티드 프로브는 또한 생체내 진단법에 유용하다. 예로서, 18F -표지 올리고뉴클레오티드는 대상에 투여될 수 있고 양전자 발광 단층장치에 의해 가시화될 수 있다. (Tavitian et al., Nature Medicine 4:467,1998).
많은 진단 과정은 검출 방법의 감도를 증가시키기 위해 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 을 이용한다. PCR 수행의 표준 기법은 잘 알려진다. (일반적으로, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols: Current Methods 및 Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek 및 Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998), 및 Meltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998) 참조). PCR 프라이머는 BR43x2, TACI 또는 BCMA 시스테인 풍부 위 반복와 같은 특정 BR43x2 도메인 또는 모티프를 암호화하는 서열을 증폭시키도록 설계될 수 있다.
진단적 분석을 위한 PCR 의 하나의 변형은 역전사효소-PCR(RT-PCR)이다. RT- PCR 기법에서, RNA 는 생물학적 샘플로부터 분리되고, cDNA 로 역전사되고, cDNA 는 BR43x2 프라이머와 함께 인큐베이션된다. (예를 들어, with BR43x2 primers (see, for example, Wu et al. (eds.), "Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR,"in Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., pages 1528,1997 참조). 그 때, PCR 은 수행되고 산물은 표준 기법을 사용하여 분석된다.
예로서, RNA 는 예를 들어, 상기에 개시된 구아니디움-티오시아네이트 세포 용균 과정을 사용하여 생물학적 샘플로부터 분리된다. 대안적으로, 고형-페이즈 기법은 세포 여액으로부터 mRNA 를 분리하는 데 사용될 수 있다. 역전사반응은 무작위 올리고뉴클레오티드, dT 의 짧은 호모폴리머, 또는 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 항티센스 올리고머를 사용하여 분리된 RNA 를 가지고 프라임될 수 있다. 올리고-dT 프라이머는 다양한 mRNA 뉴클레오티드 서열이 증폭되고, 대조 표적 서열을 제공할 수 있는 잇점을 제공한다. BR43x2, TACI, 또는 BCMA 서열은 길이면에서 적어도 5 염기가 전형적인 두개의 양쪽측면에 위치한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 폴리머라제 사슬 반응으로 증폭된다.
PCR 증폭 산물은 다양한 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 예를 들어, PCR 산물은 겔 전기영동에 의해 분획될 수 있고, 에티듐 브로마이드 염색에 의해 가시화될 수 있다. 대안적으로, 분획된 PCR 산물은 막으로 전이될 수 있고, 검출가능하게-표지된 BR43x2 프로브로 혼성화될 수 있고, 오토라디오그래피에 의해 검사될 수 있다. 추가적인 대안 접근법은 화학발광 검출, 및 C-TRAK 비색분석을 제공하기 위한 디그옥시게닌-표지 디옥시리보핵산 3인산의 이용을 포함한다.
또 다른 접근법은 실제 시간 정량적 PCR 이다 (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Ct.). 수용체 및 부착된 소광 염색 모두를 가진 올리고뉴클레오티드로 구성되는 형광성 프로브는 정 프라이머 및 역 프라이머 사이에 특이적으로 어닐한다. Taq DNA 폴리머라제의 5' 엔도뉴클레아제를 사용하여, 수용체 염색은 소광 염색으로부터 분리되고 서열-특이적 신호가 발생되고 증폭이 증가함에 따라 증가한다. 형광 강도는 연속적으로 모니터될 수 있고, PCR 반응동안에 정량화된다.
BR43x2, TACI 또는 BCMA 발현 검출의 또다른 방법은 사이클링 프로브 기법(CPT)이고, 여기에서 단일-가닥 DNA 표적은 과량의 DNA-RNA-DNA 키메라 프로브와 결합하여 복합체를 형성하고, RNA 부분은 RNaseH 로 절단되고, 절단된 키메라 프로브가 검출된다.(예를 들어, Beggs et al., J. Clin. Microbiol. 34: 2985,1996 및 Bekkaoui et al., Biotechniques 20: 240,1996 참조). BR43x2, TACI 또는 BCMA 서열 검출의 대안적인 방법은 핵산 서열-기초 증폭(NASBA), 교차-혼성화에 의한 주형의 협동적인 증폭(CATCH), 및 리가제 사슬 반응(LCR)과 같은 접근법을 이용한다. (예를 들어, Marshall et al.,U. S. 특허번호 5,686,272 (1997), Dyer et al., J. Virol. Methods 60: 161,1996; Ehricht et al., Eur. J. Biochem.243: 358,1997 및 Chadwick et al., J. Virol. Methods 70: 59,1998 참조). 다른 표준적인 방법이 당업자에게 알려진다.
BR43x2, TACI, 및 BCMA 프로브 및 프라이머는 또한 조직 샘플에서 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 유전자 발현을 검축하고 배치시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 제자리 혼성화 방법은 당업자에게 잘 알려진다. (예를 들어, Choo (ed.), In Situ Hybridization Protocols, Humana Press, Inc., 1994; Wu et al. (eds.),"Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization (RISH),"in Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., pages 259-278,1997 및 Wu et al. (eds.),"Localization of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH),"in Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., pages 279289,1997 참조 ).
다양한 추가적인 진단적 접근은 당업자에게 잘 알려진다. (예를 들어, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics Humana Press, Inc., 1991; Coleman 및 Tsongalis, Molecular Diagnostics, Humana Press, Inc., 1996 및 Elles, Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press, Inc., 1996 참조).
게다가, 이러한 폴리뉴클레오티드 프로브는 개개의 염색체상의 상응하는 서열과의 혼성화에 사용될 수 있다. 염색체 확인 및/또는 BR43x2 유전자의 맵핑은 유전자 기능 및 질환 결합에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있다. 예를 들어, 체세포 혼성체 맵핑, 및 제 자리 형광 혼성화(FISH)와 같은 많은 맵핑 기법은 당업자에게 이용가능하다. 바람직한 방법은 방사선 혼성 맵핑은 포유동물 염색체의 고-해상, 연속적 맵을 제조하기 위해 개발된 체세포 유전 기법이다. (Cox et al.,Science 250:245-50,1990) 유전자 서열의 부분적 또는 완전한 지식은 염색체 방사선 혼성 맵핑 페널과 함께 사용하기에 적합한 PCR 프라이머의 설계를 허용한다. Stanford G3 RH Panel 및 the GeneBridge 4 RH Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL)과 같은 전 인가 게놈을 포함하는 상업적으로 이용가능한 방사선 혼성 맵핑 페널이 이용가능하다. 이러한 페널은 빠른, PCR 기초, 염색체 배치 및 유전자의 순서화, 서열-표지 위치(STSs) , 및 관심 부위내의 다른 비-다형화- 및 다형화 마커를 가능케한다. 이것은 발견된 관심 유전자 및 이미 맵핑된 마커 사이의 비율적인 물리적 거리를 직접적으로 확립하는 것을 포함한다. 유전자 위치의 정확한 지식은 1) 서열이 존재하는 콘티그의 부분인지를 결정하는 단계 및 YAC-,BAC-또는 cDNA 클론과 같은 다양한 형태로 추가적으로 에워쌓는 유전 서열을 얻는 단계, 2) 같은 염색체 부위에 연결을 보여주는 유전가능한 질환에 대한 가능한 잠재 유전자 및 3) 특정 유전자가 어떤 기능을 가질 것인지를 결정하는 것을 돕는데 유리할 수 있는 마우스와 같은 교차 기준 모델에 대한 가능한 잠재 유전자를 제공하는 단계를 포함하는 많은 방법에서 유용할 수 있다.
염색체 배치는 STS 를 사용하여 행해질 수 있다. STS 는 인간 게놈에 특이적인 DNA 서열이고 특정 염색체 또는 염색체 부위에 대한 기준점으로 사용될 수 있다. STS 는 모든 다른 게놈 서열의 존재하에서 이 위치를 특이적으로 검출하기 위한 폴리머라제 사슬 반응세서 사용가능한 한 쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머에 의해 규정될 수 있다. STS 가 예를 들어, Database of Sequence Tagged Sites (dbSTS), GenBank, (National Center for Biological Information, National Institutes of Health, Bethesda, MD http://www. ncbi. nlm. nih. gov)와 같은 데이타베이스내에 완전하게 개시될 수 있는 DNA 서열에만 기초하기 때문에 , 그들은 이러한 짧은 게놈 표지 STS 서열내에 포함된 맵핑 데이타를 위해 관심의 유전자 서 열을 가지고 서치될 수 있다.
본 발명은 또한 추가적인 진단적 이용을 위한 시약을 제공한다. 예를 들어, BR43x2 유전자, BR43x2 DNA 또는 RNA 를 포함하는 프로브, 또는 그것의 아서열은 BR43x2 유전자가 특정 염색체상에 존재하는지 또는 돌연변이가 발생했는지를 결정하기 위해 사용될 수 있다. BR43x2 유전자 위치에서 검출가능한 염색체 이상은 이수성, 유전자 복제 수 변화, 삽입, 결실, 제한 위치 변화 및 재배열을 제한없이 포함한다. 이러한 이상은 암호화 서열내, 인트론내, 또는 양쪽 측면 서열내에서 발생할 수 있고, 암호화 서열내에서의 물리적 변화 또는 유전자 발현 수준에서의 변화로서 증명된다.
일반적으로, 이러한 진단 방법은 (a) 환자로부터 유전 샘플을 얻는 단계; (b) 제 1 의 반응 산물을 생산하기 위해서, 폴리뉴클레오티드가 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열에 혼성화할 조건하에서 본 명세서에 개시된 대로 폴르뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머와 유전 샘플을 인큐베이션하는 단계; 및 (iii) 반응 산물을 조절하기 위해 제 1 의 반응 산물을 비교하는 단계를 포함한다. 제 1 의 반응산물과 조절 반응 산물의 차이는 환자의 유전적 이상의 지표이다. 본 발명내의 사용을 위한 유전 샘플은 게놈 DNA, cDNA, 및 RNA 를 포함한다. 폴리뉴클레오티드 프로브 또는 프라이머는 RNA 또는 DNA 일 수 있고, SEQ ID NO:3 의 부분, SEQ ID NO:1 의 보체, 또는 이의 RNA 등가물을 포함할 것이다. 이러한 관점에서 적당한 분석방법은 제한 효소 길이 다형화 분석법(RFLP), PCR 기법을 사용하는 짧은 종렬 반복(STR) 분석, 연결사슬반응 (Barany, PCR Methods 및 Applications 1: 516,1991), 리보뉴 클레아제 보호 분석법, 및 당업계에서 알려진 다른 유전적 결합 분석과 같은 당업자에게 알려진 분자 유전적 기법을 포함한다. (Sambrook et al., 상기참조.; Ausubel et'. al., 상기참조.; Marian, Chest 108: 255-65,1995). 리보뉴클레아제 보호 분석법은(예를 들어, Ausubel et al., 상기참조., ch. 4참조) 환자 RNA 샘플에 RNA 프로브의 혼성화를 포함하고, 그 후에, 반응산물(RNA-RNA 혼성체)을 RNase에 노출시킨다. RNA 의 혼성화된 부위는 분해로부터 보호된다. PCR 분석의 경우에, 환자의 유전적 샘플은 한 쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머와 함께 인큐베이션되고, 프라이머 사이의 부위는 증폭되고 회수된다. 회수된 산물의 크기 또는 양의 변화는 환자내의 돌연변이의 지표이다. RNA의 혼성화 부분은 소화로부터 보호된다. PCR 분석법 내에서, 환자의 유전 샘플이 한 쌍의 폴리뉴클레오티드 프라이머로 인큐베이션되었고, 프라이머들 사이의 지대가 증폭되고 회수되었다. 회수된 생성물의 크기 또는 양에서의 변화는 환자에서의 돌연변이를 나타낸다. 사용될 수 있는 또 다른 PCR계 기술은 단일 가닥 구조의 이형성 (SSCP) 분석이다(Hayashi, PCR Methods 및 Applications 1:34-8, 1991).
B 세포 개발 및 다른 세포들과의 상호작용을 억제하는 만큼, 안티센스 방법이 사용되어 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 유전자 전사를 억제할 수 있다. BR43x2, TACI, 또는 BCMA 암호화 폴리뉴클레오티드(예컨대, SEQ ID NO:3으로 앞에서 제시된 폴리뉴클레오티드)의 단편에 상보적인 폴리뉴클레오티드는 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 암호화 mRNA에 결합하고, 그러한 mRNA의 번역을 억제하기 위해 유전적으로 설계된다. 그러한 안티센스 폴리뉴클레오티드들이 사용되어 세포 배양액 또는 환자에 서 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 폴리펩티드 암호화 유전자들의 발현을 억제한다.
"트랙스제닉 마우스"로 일컬어지는, BR43x2, TACI, 또는 BCMA를 발현하도록 가공된 마우스와 BR43x2, TACI, 또는 "넉아웃 마우스"로 일컬어 지는, BCMA 기능의 완전한 부재를 보여주는 마우스가 또한 발생될 수 있다(Snouwaert er al., Science 257:1083, 1992;Lowell et al., Nature 366:740-42, 1993; Capecchi, Science 244:1288-92, 1989; Palmiter et al. Annu Rev Genet. 20: 465-99, 1986). 예컨대, 도처에 존재하거나 조직-특이적 또는 조직-제한된 프로모터하에서의 BR43x2, TACI, 또는 BCMA를 과발현하는 트랜스제닉 마우스는 과발현이 표현형의 원인이 되는지를 밝히는데 사용된다. 예컨대, 야생형 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 폴리펩티드, 폴리펩티드 단편 또는 그것들의 돌연변이체의 과발현은 정상 세포 프로세스를 변경하여 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 발현이 기능적으로 관련된 조직을 확인하는 표현형을 가져오고, BR43x2, TACI, 또는 BCMA 또는 그들의 아고니스트 또는 안타고니스트에 대한 치료 부위를 나타낼 수 있다. 예컨대, 가공하기에 바람직한 트랜스제닉 마우스는 가용성 BR43x2, TACI, 또는 BCMA을 과발현하는 마우스이다. 더욱이, 그러한 과발현은 인간 질환과의 유사성을 보여주는 표현형을 가져올 수 있다. 유사하게, 넉아웃 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 마우스를 사용하여 BR43x2가 체내에서 절대적으로 요구되는 경우를 측정할 수 있다. 넉아웃 마우스의 표현형은 본원에서 설명된 것과 같은 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 안타고니스트를 가질 수 있는 체내에서의 영향을 예고한다. 인간 BR43x2, TACI, 또는 BCMA cDNA를 사용하여 쥐의 BR43x2, TACI, 또는 BCMA mRNA, cDNA 및 게놈의 DNA를 단리할 수 있고, 이어서 사용하여 넉아웃 마우스를 발생시킬 수 있다. 이들 마우스를 사용하여 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 유전자 및 체내 시스템에서 그것에 의하여 암호화된 단백질을 연구할 수 있고, 대응하는 인간 질환에 대한 체내의 모델로서 사용할 수 있다. 더욱이, 본원에서 설며왼 BR43x2 특이적 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 안티센스 폴리뉴믈레오티드 또는 리보자임의 트랜스제닉 발현을 상기에서 설명된 트랜스제닉 마우스에 유사하게 사용할 수 있다.
제약학적 유효량의 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 폴리펩티드를 종래의 방법에 따라서 비경구, 경구, 코, 직장, 국소적, 경피적 투여 등을 위한 제약학적으로 허용가능한 담체로 제제화할 수 있다. 더 나아가 제형들은 하나 이상의 희석제, 충진제, 유연화제, 보존제, 완충액, 부형제 등을 포함할 수 있고, 예컨대 액체, 분말, 에멀션, 좌약, 리포좀, 경피 패치 및 정제로서의 그러한 형태로 제공될 수 있다. 또한, 많은 수의 어떤 바이오폴리머를 포함하는 느리거나 연장된 방출 송달 시스템(생물계 시스템), 리포좀을 사용하는 시스템, 및 폴리머 송달 시스템들을 본원에서 설명된 조성물들과 함께 이용하여 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 폴리펩티드 또는 안타고니스트의 계속적이거나 지속성 출처를 제공할 수 있다. 그러한 느린 방출 시스템은 제형들 예컨대 경구, 국소 및 비경구 사용에 적용할 수 있다. "제약학적 허용가능한 담체"란 용어는 활성 성분의 생물학적 활성의 영향으로 방해하지 않고, 숙주나 환자에게 독성이 아닌 담체 배지를 말한다. 당업자는 적당한 방식 및 Remington: The Science 및 Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 19th ed., 1995에서 개시된 대로 허용된 방법에 의해서 본발명의 화합물을 제제화할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 폴리펩티드, 아고니스트 또는 안타고니스트의 "제약학적 유효량"은 원하는 생물학적 결과를 유발하기에 충분한 양이다. 이 결과는 신호, 증상의 경감, 또는 질환의 원인, 또는 생물학적 시스템의 어떤 다른 바라는 변경일 수 있다. 예컨대, BR43x2, TACI, 또는 BCMA 폴리펩티드의 제약학적 유효량은 임상의사 또는 다른 자격있는 관찰자에 의해서 관찰된 병의 자각 증세 또는 객관적으로 확인가능한 개선을 제공하는 것이다. 예컨대, 그러한 BR43x2, TACI, 또는 BCMA 폴리펩티드의 유효량 또는 가용성 퓨젼의 유효량은 면역 반응 동안의 B 세포 반응에서의 감소 또는 자가항체 생성에서의 억제 또는 감소, SLE, MG 또는 RA와 연관된 증상의 감소의 억제를 제공할 것이다. BR43x2, TACI, 또는 BCMA의 유효량은 말초 혈액에서의 B 세포의 백분율을 감소시킬 것이다. BR43x2, TACI, 또는 BCMA 폴리펩티드의 유효량은 치료된 질환이나 증상에 매우 의존하면서 변화할 수 있다. 투여되는 폴리펩티드의 양 및 제제화에서의 그것의 농도는 선택된 비히클, 투여경로, 개개의 폴리펩티드의 효능, 환자의 임상 상태, 부작용, 및 제제화에서의 화합물의 안정성에 의존한다. 따라서, 임상 의사는 문제의 환자 또는 유사한 환자들이 가진 임상 경험에 의존하면서, 투여된 제형의 양 뿐만 아니라, 제형에서의 적당한 농도를 함유하는 적당한 제법을 사용할 수 있다. 그러한 양은 부분적으로 치료되는 개개의 상태, 연령, 체중, 및 환자의 전반적인 건강, 및 당업자에게 명백한 다른 요인들에 의존할 것이다. 통상적으로 용량은 환자의 0.1-100 mg/kg의 범위내일 것이다. 특정 화합물에 대한 용량은 실험실의 동물상의 연구와 조합하여 실험실 내 또는 생체 밖으로 부터 결정될 것이다. 용량이 작용 부위에서의 유사한 농도를 제공하도록 계산되는 경우에 있어서, 실험실 내 또는 생체 밖에서 유효한 것으로 발견된 화합물의 농도는 동물 연구를 위한 길잡이를 제공한다.
본 발명은 다음의 비 제한적 실시예에 의해서 더 잘 설명된다.
(실시예 1)
BR43x2의 확인
TACT 이소형을 분비 트랩 어프로치를 사용하여 RPMI 라이브러리로부터 클로닝하였다. RPMI 1788(활성화된 B-세포 라인)라이브러리를 20개의 96-웰 플레이트를 사용하여 배열하였다. 각 웰은 각 클로니가 하나의 cDNA 클론을 함유하는 약 100개의 대장균 클로니를 함유하였다. DNA 미니프렙스를 TomTech Quadra 9600을 사용하여 96-웰 포맷에서 제조하였다. 그 다음 단리된 DNA를 각 1600 클론을 나타내는 120 풀로 모았다. 이들 풀을 Cos-7으로 트랜스펙션시켰고, 12-웰 플레이트내로 플레이트하였다. 3 마이크로리터의 풀 DNA와 5 마이크로리터 리포펙틴 AMINE를 92 마이크로리터 무-혈청 DMEM 배지(500 ml내의 55 mg 피루브산 나트륨, 146 mg L-글루타민, 5 mg 트랜스페린, 2.5 mg 인슐린, 1 ㎍ 셀레니움 및 5 mg 페투인)에서 혼합하였고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였고, 이어서 400 마이크로리터의 무혈청 DMEM 배지를 첨가하였다. DNA-리포펙틴 AMINE 혼합액을 12-웰 조직 배양 플레이트상에 플레이트된 220,000 Cos-7 셀/웰에 첨가하였고, 5시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션에 이어서 500 마이크로리터의 20% FBS DMEM 배지(500 ml 내의 100 ml FBS, 55 mg 피루브산 나트륨 및 146 mg L-글루타민)을 각 웰에 첨가하였고, 세포를 하룻밤동안 인큐베이션하였다.
분비 트랩 스크리닝을 비오티닐화 FLAG-표지된 ztnf4를 사용하여 실행하였다. 세포를 PBS로 린스하고, 15분 동안 PBS에 1.8% 포름알데히드로 고정하였다. 그 다음 세포를 TNT( H2O 중의 0.1M 트리스-염산, 0.15 M NaCl, 및 0.05% Tween-20)로 세척하였다. 세포를 PBS에서 0.1% 트리톤-x로 15분 동안 삼투하였고, 이어서 TNT에서 세척하였다. 세포를 NEN Renaissance
Figure 112005000579505-pct00006
TSA- Direct Kit (NEN, Boston, MA) 를 사용하여 제조자의 지침에 따라서 TNB(0.0 M 트리스-염산, 0.15 M NaCl 및 0.5% 블로킹제)로 1시간 동안 블로킹하였다. 세포를 TNT로 세척하였고, 아비딘으로 그 다음 비오틴(벡터 랩스 Cat 번호 SP-2001)으로 15분 동안 블로킹하였고, 그 사이에 세척하였다. 세포를 1시간 동안 TNB에서 1 ㎍/ml ztnf4/flag/비오틴으로 인큐베이션하였고, 이어서 TNT로 세척하였다. 그 다음 세포를 TNB에서 1300 희석의 스트렙트아비딘-HRP (NEN)로 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 잡종화를 희석 완충액중의 1:50으로 희석된 형광 티라미드 시약으로 검출하였고, 4.4분 동안 인큐베이션하였고, TNT로 세척하였다. 세포를 TNT 중에서 1:5로 희석된 Vectashield Mounting 배지(Vector Labs, Burlingame, CA)로 보존하였다.
세포를 FITC 필터를 사용하여 형광 현미경으로 가시화하였다. 12 풀은 ztnf4 결합에 대하여 양성이였다. 풀 D8 (1600 클론을 나타내는)은 파괴하고, ztnf4 결합에 대하여 양성인 단일 클론(D8-1)을 단리하였다. 서열 분석은 TACI의 이소형을 암호화한 폴리펩티드 서열을 함유하는 클론 D8-1을 나타내었는데, 여기서 TACI의 Phe 21-Arg 67 제1의 시스테인-풍부 위 반복은 단일 아미노산 잔기, 트립토판으로 치환되었다. 이 이소형을 BR43x2 로 지정하였고, 이의 폴리뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:1에 제시된다.
(실시예 2)
림프구 및 단핵구중의 BR43x2의 위치측정
역전사효소 PCR을 사용하여 T 및 B 세포 및 단핵구에서 BR43x1 발현을 위치측정하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 zc19980 (SEQ ID NO:15) 및 zc19981(SEQ ID NO:16)을 사용하여 BR43에 대하여 CD19+, CD3+ 및 단핵구 cDNA를 스크리닝하였다. 역전사효소 반응을 94℃에서 3분 동안 실행하였고, 이어서 94℃에서 30초 동안, 68℃에서 2분 동안, 및 72℃에서 1분동안 30번 순환하였고, 이어서 72℃에서 7분 연장하였다. 항체(von Bulow 및 Bram, 상기참조.)를 사용하여 TACI에 대하여 보고되어 온 대로 예상된 크기의 밴드, 720 bp를 오직 B 세포에서만 검출하였고, 활성화된 T 세포에서는 검출하지 못했다.
(실시예 3)
BR43 리간드 ztnf4를 사용한 B세포 증식 분석
1×108 냉동, apheresed 말초 혈액 단핵 세포(PBNCs) 함유 바이알을 37℃ 물 욕조에서 해빙시켰고, 25 ml 튜브중의 25 ml B 세포 배지(Isceve's 변형된 Dulbecco's 배지, 10% 열 불활성화된 우레아 혈청, 5% L-글루타민, 5% 펜/스트렙)에서 재현탁시켰다. 세포를 트립판 블루(GIBCO BRL, Gaithersburg, MD)를 사용하여 생존가능성에 대하여 시험하였다. 10 밀리리터의 Ficoll/Hypaque 플러스 (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ)를 세포 현탁하에 층분리하였고, 1800 rpm으로 30분 동안 회전시켰고, 브레이크 오프로 정지시켰다. 그 다음 상간의 층을 제거하고, 맑은 50ml 튜브에 옮겨서 PBS로 최종 부피를 40 ml로 하고, 브레이크 온으로 1200 rpm 에서 10 분 동안 회전시켰다. 단리된 B 세포의 생존가능 성을 트리판 블루를 사용하여 시험하였다. B 세포를 B 세포내 1×106 세포/ml의 최 종 농도로 재현탁시켰고, 96 웰 U 바닥 플레이트(Falcon, VWR, Seattle, WA)내의 180㎕/웰에서 플레이트하였다.
세포에 다음의 자극제의 하나를 첨가하여 최종 부피를 200 ml/웰으로 하였다:
가용성 FLAG-표지된 ztnf-4sCG 또는 ztnf-4sNF, 1 mg-1ng/ml의 10배 희석제에서, NaH2CO3에서 희석된 10 ㎍/ml 항-IgM(염소 항 인간 IgM) 단독으로, ph 9.5,(Southern Biotechnology Assciates, Inc., 버밍햄, 아리조나주); 또는 10 ㎍/ml 항-IgM, 및 10 ng/ml 재조합 인간 IL4(PBS 및 0.1% BSA에서 희석된)과 함께. 또한, 가용성 CD40 (sCD40) 항체 (Pharmingen, 샌디에고, 캘리포니아주) 뿐만 아니라 IL-3 및 IL-6과 같은 다른 시토키닌을 마찬가지로 시험했다. 대조군으로서 세포를 0.1% 우태아 혈청 알부민(BSA) 및 PBS, 10 ㎍/ml 항-IgM 또는 10 ㎍/ml 항-IgM 및 10 ng/ml IL4(또는 다른 시토키닌)로 인큐베이션하였다. 그 다음 세포를 가습한 인큐베이터내에서 37℃로 72시간 동안 인큐베이션하였다. 채취에 앞서 16시간, 1 마이크로 Ci 3H 티미딘을 모든 웰에 첨가하였다. 그들을 세포 harvester(Packard)를 사용하여 채취하고 제조자의 지침에 따라서 모으는 경우, 세포를 96 웰 필터 플레이트( UniFilter GF/C, Packard, Meriden, CT)내로 채취하였다. 플레이트를 55℃에서 20 내지 30 분동안 건조시켰고, 웰의 바닥을 투명한 플레이트 실러로 밀봉하였다. 각 웰에 0.25 ml의 신틸레이션 플루이드(Microscint-O, Packard)를 첨가하였고, 플레이트를 TopCount 마이크로플레이트 신틸레이션 계수기 (Packard)를 사용하여 판독하였다.
정제된 B 세포의 자극에 뒤이은 다양한 B 세포 미토겐의 반응에서 IgG 제조의 인덕션을 측정하기 위하여, 세포를 설명된 대로 제조하였고, 9일 동안 인큐베이션하였다. 세포 상척액을 모아서 IgG 제조를 측정하였다.
정제된 B 세포의 자극에 뒤이은 다양한 B 세포 미토겐의 반응에서 세포 표면 마커 활성화를 측정하기 위하여, 세포를 상기에서 설명한 대로 제조하였으나 단지 48시간 동안만 인큐베이션하였다. 세포 표면 마커를 FACS 분석에 의해 측정하였다.
다양한 B 세포 미토겐으로 자극된 인간 정제된 B 세포의 증식을 표 5에 요약하였다.
Figure 112001016752501-pct00007
IL4, IL3(10 ㎍/ml) 및 IL6(10 ㎍/ml)와 ztnf4의 상승 효과를 B 세포의 증식 에서 보았다. sCD40을 사용할 때 B 세포 시그널링에서의 두 배 증가를 보았다.
정제된 B 세포의 자극에 뒤이은 다양한 B 세포 미토겐의 반응에서의 IgG 제조(ng/ml)의 인덕션을 표 6에 요약하였다.
Figure 112001016752501-pct00008
ztnf4 단독으로 또는 항-IgM 또는 항-IgM + IL-4로 정제된 B 세포의 자극 후에 세포 표면 활성화 마커에서의 증가를 보였다.
적정 또는 차선의 T 세포 미토겐의 존재하에서 PBMNCs의 증식에 대한 효과는 없었다. 또한, LPS 자극에 반응하는 정제된 단핵구에서 TNGα 생산에 대한 작용은 관찰되지 않았다.
도 3은 증식하고 면역글로불린을 분비하는 인간 B 림프구의 가용성 ztnf4 공동-활성화(co-activation)를 나타낸다. 도 3a는 배양액에서 5일 후, IL-4, 단독, 및 항-IgM, 항-CD40, 또는 항-CD19와 IL-4의 존재하에서 가용성 ztnf4(25 ng/ml)와의 자극에 대한 반응에서 정제된 인간 말초 혈액 B 세포 증식을 나타낸다. 도 3b는 배양액에서 9일 후, IL-4 또는 IL-4 + IL-5의 존재하에, 가용성 ztnf4로 자극된 인간 B 세포로 부터 얻어진 상청액에서 측정된 IgM 및 IgG의 수준을 보여준다.
이들 결과들은 가용성 ztnf4이 다른 B 세포 자극과 결합하여 작용하고 그 자체로는 약한 작용을 하는 B 세포 활성화 분자이라는 것을 제시한다. 가용성 ztnf4는 B 세포증식과 Ig 생성을 촉진한다. 부착 분자, 공동자극 분자 및 활성화 수용체의 상향 조정은 B 세포의 APC 기능을 촉진하는 역할을 주장한다.
도 4는 시험관내에서 5일 동안 10 ng/ml IL4의 존재하에서 가용성 ztnf4(25 ng/ml)로 인간 말초 혈액 B 세포의 자극 또는 대조군 단백질(유비퀴틴)을 나타낸다. 정제된 TACI-Ig, BCMA-Ig, 또는 대조군 Fc를 가용성 ztnf4 특정한 증식의 억제에 대해 시험하였다.
(실시예 4)
ztnf4 결합을 사용한 TACI 및 BCMA 형질전환된 BHK 세포의 선택
높은 수준의 TACI 단백질을 발현하는 BHK 세포를 트랜스팩션 풀의 희석물 클로닝으로써 선택하였다. 트랜스팩션 세포(2×105)을 결합 완충액(PBS, 2% BSA, 0.02% NaN3) 중의 1 ㎍/ml에서 비오티닐화 ztnf4로 30분 동안 얼음에서 인큐베이션하였다. 세포를 결합 완충액으로 2회 세척하고, 그 다음 SA-PE (CALTAG)(결합 완충액에서 1:1000 희석)와 얼음에서 30분동안 인큐베이션하였다. 그리고 나서 세포를 결합 완충액에서 2회 세척하고, 결합 완충액에서 재현탁하고, FACS (FACS Vantage, Becton Didkinson)에 의해 판독하였다. TNF4의 최고의 결합을 가진 클론을 선택하였다.
비오티닐화 ztnf4 로 BCMA-발현 트랜스펙턴트 풀을 표면 표지화하여 높은 수준의 BCMA 단백질을 발현하는 BHK 세포를 선택하였다. 스트렙타비딘-피코-에리트린 (SA-PE Caltag Burlingame, CA) 및 FACS Vantage(Becton Dickinson) 상의 FL2 중의 밝은 세포에 대해 무균분류를 했다. 그 때, ztnf4 결합을 하는 단일클론을 스크리닝했다.
(실시예 5)
조직분포
인간 다조직 노던블롯 (MTN I, MTN II 및 MTN III; Clontech)을 프로빙하여 인간 BR43x2과 TACI 발현의 조직분포를 결정하였다. 약 500bp의 PCR 유래 브로브 (SEQ ID NO:21)를 BR43x2 (SEQ ID NO:1)을 주형으로 사용하고 올리고뉴클레오티드 ZC20061 (SEQ ID NO:22) 및 ZC20062 (SEQ ID NO:23)을 프라이머로 사용하여 증폭하였다. 이 서열은 TACI의 상동 영역과 동일하다. 증폭은 하기와 같이 수행하였다: 94 ℃에서 1.0 분 간 1 순환, 94 ℃에서 30 초 간 30 순환, 60 ℃에서 30 초 간 30 순환 및 72 ℃에서 30초 간 처리하고 72℃에서 10분 간 1순환이 이어진다. PCR 산물을 한천 겔 전기영동에 의하여 가시화하였고 500bp PCR 산물을 Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, CA)를 사용하여 정제하였다. 프로브는 MULTIPRIME DNA 표지 키트 (Amersham, Arlington Heights, IL)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 방사성 표지하였다. 프로브는 NUCTRAP 푸시 컬럼 (Stratagene)을 사용하여 정제하였다. EXPRESSHYB (Clontech) 용액은 사전혼성화에 사용하였고 노던블롯에 혼성화 용액으로서 사용하였다. 혼성화는 65 ℃에서 106 cpm/ml의 표지된 프로브를 사용하여 밤새 수행하였다. 블롯을 그 다음 실온에서 2X SSC와 0.1 % SDS에 세척하였고 이어서, 50℃에서 0.1XSSC 및 0.1 % SDS 중에서 2회 세척하였다. 약 1.5 kb의 전사체를 비장, 림프절 및 소장에서 검출하였다.
인간 다조직 노던블롯 (MTN I, MTN II 및 MTN III; Clontech)을 프로빙하여 인간 BCMA 발현의 조직분포를 결정하였다. 약 257bp의 PCR 유래 브로브 (SEQ ID NO:24)를 Daudi 세포 cDNA를 주형으로 사용하고 올리고뉴클레오티드 ZC21065 (SEQ ID NO:25) 및 ZC21067 (SEQ ID NO:26)을 프라이머로 사용하여 증폭하였다. 증폭은 하기와 같이 수행하였다: 94 ℃에서 1.0 분 간 1 순환, 94 ℃에서 30 초 간 30 순환, 60 ℃에서 30 초 간 30 순환 및 72 ℃에서 30 초 간 처리하고 72℃에서 10분 간 1순환이 이어진다. PCR 산물을 한천 겔 전기영동에 의하여 가시화하였고 500bp PCR 산물을 Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, CA)를 사용하여 정제하였다. 프로브는 MULTIPRIME DNA 표지 키트 (Amersham, Arlington Heights, IL)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 방사성 표지하였다. 프로브는 NUCTRAP 푸시 컬럼 (Stratagene)을 사용하여 정제하였다. EXPRESSHYB (Clontech) 용액은 사전혼성화에 사용하였고 노던블롯에 혼성화 용액으로서 사용하였다. 혼성화는 65 ℃에서 106 cpm/ml의 표지된 프로브를 사용하여 밤새 수행하였다. 블롯을 그 다음 실온에서 2X SSC와 0.1 % SDS에 세척하였고 50 ℃에서 0.1X SSC와 0.1% SDS로 두 차례의 세척이 이어졌다. 약 1.2 kb의 전사체를 위, 소장, 림프절, 기관, 비장 및 고환에서 검출하였다.
8 가지 하우스키핑 유전자로 정상화된 다양한 조직 유래 RNA를 함유하는 RNA Master Dot Blot (Clontech)을 또한 TACI 프로브 (SEQ ID NO:21) 또는 BCMA 프로브 (SEQ ID NO:24)로 프로빙하고 상기된 바와 같이 혼성화하였다. BR43x2/TACI 발현은 비장, 림프절, 소장, 위, 침샘, 맹장, 폐, 골수 및 태아 비장에서 나타났다. BCMA 발현은 소장, 비장, 위, 결장, 림프절 및 맹장에서 검출되었다.
인간 Tumor Panel Blot V (Invitrogen Inc., San Diego, CA)와 인간 림프종 블롯 (Invitrogen)을 Br43x2/TACI 프로브 (SEQ ID NO:21) 또는 BCMA 프로브 (SEQ ID NO:24)로 상기된 바와 같이 프로빙하였다. TACI에 대응하는 1.5kb 전사체를 비-Hodgkin's 림프종과 이하선종에서 발견하였다. BCMA에 대응하는 1.2kb 전사체를 아데노림프종, 비-Hodgkin's 림프종과 이하선종에서 발견하였다.
CD4+, CD8+, CD19+ 및 림프구 반응 세포 혼합물 (CellPro, Bothell, WA) 유래 총 RNA를 구아니딘 이소티오시아네이트(Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979) 를 사용하여 준비하였고, CsCl 원심분리 단계로 이어졌다. 폴리(A)+ RNA를 올리고 d(T) 셀룰로스 크로마토그래피 (Aviv와 Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69: 1408-12, 1972)를 사용하여 분리하였다. 그 다음 노던 블롯 분석이 다음과 같이 수행되었다.
약 2 mg의 각 폴리 A+ RNA를 2.2 M 포름알데히드/포스페이트 완충액 (50 mM Na2HPO4, 50 mM NaH2PO4, 50 mM NaOAc, 1 mM EDTA 및 2.2 M 포름알데히드)에서 변성시켰고, 포름알데히드/포스페이트 완충액에서 1.5% 한천 미니 겔 (Stratagen Cloning Systems, La Jolla, CA) 전기영동에 의하여 분리하였다. RNA를 밤새 니트란 여과지 (Schleicher & Schuell, Keene, NH) 상으로 블롯팅 하고, 여과지는 STRATALINKER UV 가교기 (Stratagene Cloning Systems)에서 UV 가교결합하였고 그 다음 80 ℃에서 1 시간 동안 건조하였다.
블롯은 TACI 프로브 (SEQ ID NO:21) 또는 BCMA 프로브 (SEQ ID NO:24)로 프로빙하였다. TACI를 나타내는 1.5 kb 밴드는 오직 CD 19+ 세포에서만 검출되었다. BCMA를 나타내는 1.2kb 전사체는 CD 8+, CD 19+ 및 MLR 세포에서 희미하게 검출되었다.
K-562 세포 (적혈구, ATCC CCL 243), HUT78 세포 (T 세포, ATCC TIB-161), Jurkat 세포 (T 세포), DAUDI (Burkitt's 인간 림프종, Clontech, Palo Alto, CA), RAJI (Burkitt's 인간 림프종, Clontech) 및 HL60 (단핵백혈구) 유래 폴리(A) RNA로 만들어진 블롯에, 상기한 바와 같이 추가적 노던 블롯 분석을 수행하였다. 블롯은 TACI 프로브 (SEQ ID NO:21) 또는 BCMA 프로브 (SEQ ID NO:24)로 프로빙하였다. TACI를 나타내는 1.5 kb 밴드는 Raji 세포에서 검출되었다. BCMA를 나타내는 1.2kb 전사체는 Daudi, Raji 및 Hut 78 세포에서 검출되었다.
PCR-기초 스크리닝을 사용하여 인간 또는 마우스의 TACI와 인간 BCMA를 발현하는 조직을 동정하였다. 인간과 마우스의 Rapid-ScanTM 유전자 발현 패널 (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD)을 제조자의 지시에 따라 스크리닝하였다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 ZC24200 (SEQ ID NO:27) 및 ZC24201 (SEQ ID NO:28)를 고안하여 엑손 연결점에 걸치게 하고 마우스의 TACI에 대응하는 272 bp 단편을 생산하였다. 발현은 비장, 흉선, 폐, 가슴, 심장, 근육, 피부, 부신샘, 위, 소장, 뇌, 난소, 전립선 및 배아에서 검출되었다. 약 500 과 800 bp의 추가적 밴드가 많은 조직에서 검출되었다.
올리고뉴클레오티드 프리이머 ZC24198 (SEQ ID NO:29)와 ZC24199 (SEQ ID NO:30)을 고안하여 엑손 연결점에 걸치게 하고 인간 TACI에 대응하는 204 bp 단편을 생산하였다. 발현은 비장, 뇌, 심장, 간, 결장, 소장, 근육, 위, 고환, 태반, 침샘, 부신샘, 췌장, 전립선, 말초혈 림프구 및 골수에서 검출되었다.
올리고뉴클레오티드 프리이머 ZC24271 (SEQ ID NO:31)와 ZC24272 (SEQ ID NO:32)을 고안하여 엑손 연결점에 걸치게 하고 인간 BCMA에 대응하는 329 bp 단편을 생산하였다. 발현은 뇌, 비장, 결장, 폐, 소장, 위, 난소, 고환, 침샘, 부신샘, 전립선, 말초혈 림프구, 골수 및 태아 간에서 검출되었다.
올리고뉴클레오티드 프리이머 ZC24495 (SEQ ID NO:33)와 ZC24496 (SEQ ID NO:34)을 고안하여 엑손 연결점에 걸치게 하고 마우스의 BCMA에 대응하는 436 bp 단편을 생산하였다. 발현은 간에서 검출되었다.
(실시예 6)
TACI-Ig와 BCMA-Ig 융합 벡터의 제조
Ig 감마 1 Fc4 단편의 제조
TACI-Ig 융합 단백질을 제조하기 위하여, Fc 수용체 (FcgRI)와 보체 (C1q) 결합 기능을 제거하도록 인간 IgG1의 Fc 영역 (경첩 영역 및 CH2와 CH3 도메인)이 변형되었다. 인간 IgG1 Fc의 이 변형형은 Fc4로 불린다.
인간 태아 간 라이브러리 (Clontech)로부터 올리고 프라이머 ZC10,134 (SEQ ID NO:43)와 ZC10,135 (SEQ ID NO:44)를 사용한 PCR에 의하여 Fc 영역을 분리하였다. FcgRI 결합을 감소시키기 위한 Fc 영역 내의 돌연변이 도입에 PCR이 사용되었다. FcR1 결합을 감소시키기 위하여 (Duncan et al., Nature 332: 563-4, 1988) Baum et al. (EMBO J. 13: 3992-4001, 1994)에 따라 FcgRI 결합 부위 (Leu-Leu-Gly-Gly)가 Ala-Glu-Gly-Ala (SEQ ID NO:45의 아미노산 잔기 38 내지 41)로 돌연변이되었다. 올리고뉴클레오티드 프라이머 ZC15,345 (SEQ ID NO:46)과 ZC15,347 (SEQ ID NO:47)이 돌연변이를 도입하는데 사용되었다. 50 ㎕ 최종 부피에, 570 ng IgFc 주형, 5㎕의 10X Pfu 반응 완충액 (Stratagene), 8 ㎕의 1.25mM dNTPs, 31 ㎕ dH2O, 2㎕ 20 mM ZC15,345 (SEQ ID NO:46)과 ZC15,347 (SEQ ID NO:47)를 첨가하였다. 동일 부피의 미네랄 오일을 첨가하고 반응물을 94 ℃에서 1 분 간 가열하였다. Pfu 중합효소 (2.5 단위, Stratagene)을 첨가한 후, 25 순환의 94 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1분을 수행하였고 72 ℃에서 7 분 간 연장하였다. 반응 산물은 전기영동하였고 약 676bp의 예상 크기에 대응하는 밴드가 검출되었다. 밴드를 겔로부터 절단하여, 제조자의 지시에 따라 QIAGEN QIAquickTM 겔 추출 키트 (Qiagen)을 사용하여 회수하였다.
보체 Clq 결합 및/또는 보체 고정 (Duncan과 Winter, Nature 332: 788, 1988) 및 정지 코돈 TAA를 감소시키기 위하여 Ala에서 Ser으로 (SEQ ID NO:45의 아미노산 잔기 134)와 Pro에서 Ser으로 (SEQ ID NO:45의 아미노산 잔기 135)의 돌연변이를 도입하는데 PCR이 또한 사용되었다. FcγRI 결합부위-돌연변이 IgFc 서열은 주형으로 사용하여 두 차례의 제 1순환의 반응을 수행하였다. 최종 부피 50 ㎕에 1㎕ FcγRI 결합 부위 돌연변이 IgFc 주형, 5 ㎕ 10X Rfu 반응 완충액 (Stratagene), 8 ㎕ 1.25 mM dNTPs, 31 ㎕ dH2O, 2 ㎕의 SEQ ID NO:45의 뉴클레오티드 26에서 시작되는 5' 프라이머인 20 mM ZC15,517 (SEQ ID NO:48), 2 ㎕의 SEQ ID NO:45의 뉴클레오티드 405 상보서열에서 시작되는 3' 프라이머인 20 mM ZC15,530 (SEQ ID NO:49)을 첨가하였다. 제 2의 반응은 SEQ ID NO:45의 뉴클레오티드 388에서 시작하는 5' 프라이머인 ZC15,518 (SEQ ID NO:50)와 Ala에서 Ser으로의 돌연변이, Xba I 제한 부위 및 정지 코돈을 도입하기 위한 3'프라이머인 ZC15,347 (SEQ ID NO:47) 올리고뉴클레오티드 프라이머들 각각의 20 mM 원액 2 ㎕씩을 함유하였다. 동일한 부피의 미네랄 오일을 첨가하였고 반응물은 94 ℃에서 1분 간 가열하였다. Pfu 중합효소 (2.5 단위, Stratagene)을 첨가한 후, 25 순환의 94 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 2 분을 수행하였고 72 ℃에서 7 분 간 연장하였다. 반응 산물은 전기영동하였고 각각 약 370과 395bp의 예상 크기에 대응하는 밴드가 검출되었다. 밴드를 겔로부터 절단하여, 제조자의 지시에 따라 QIAGEN QIAquickTM 겔 추출 키트 (Qiagen)을 사용하여 회수하였다. 상기 단편을 연결하고 5' Bam HI 제한 부위를 첨가하기 위하여 제 2 순환 반응이 수행되었다. 최종 부피 50 ㎕에, 30 ㎕ dH2O, 8 ㎕ 1.25 mM dNTPs, 5 ㎕ 10X Rfu 반응 완충액 (Stratagene) 및 제 1의 두가지 PCR 산물 각각 1 ㎕을 첨가하였다. 동일한 부피의 미네랄 오일을 첨가하였고 반응물은 94 ℃에서 1분 간 가열하였다. Pfu 중합효소 (2.5 단위, Stratagene)을 첨가한 후, 5 순환의 94 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 2 분을 수행하였다. 온도를 다시 94 ℃로 올리고, SEQ ID NO:45의 뉴클레오티드 1에 서 시작되는 5' 프라이머인 ZC15,516 (SEQ ID NO:51) 및 ZC15,347 (SEQ ID NO:47)의 20 mM 원액 각 2 ㎕를 첨가하였고, 25 순환의 94 ℃에서 30초, 55 ℃에서 30초, 72 ℃에서 2 분을 수행하였고 72 ℃에서 7 분 간 연장하였다. 반응물의 일부를 겔 전기영동을 사용하여 가시화하였다. 예상되는 크기에 대응하는 789 bp 밴드가 검출되었다.
TACI-Fc4와 BCMA-Fc4 발현 벡터 제조
TACI-Fc4와 BCMA-Fc4 융합 단백질을 함유하는 발현 플라스미드를 효모에서의 상동성 재조합을 통하여 제조하였다. TACI cDNA의 단편을 SEQ ID NO:5의 뉴클레오티드 15 내지 475 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 PCR을 사용하여 분리하였다. TACI 단편의 생산에 사용되는 두 프라이머는: (1) 5' 벡터 인접 서열 40 bp와 TACI 단편의 아미노 말단에 대응하는 17 bp를 함유하는 프라이머 (SEQ ID NO:52) ; (2) 인접 Fc4 서열에 대응하는 3' 말단의 40 bp와 TACI 단편의 카르복시 말단에 대응하는 17 bp를 함유하는 프라이머 (SEQ ID NO:53)였다. 100 ㎕ 최종 부피에, 10 ng TACI 주형, 10 ㎕ 10X Taq 중합효소 반응 완충액 (Perkin Elmer), 8 ㎕ 2.5 nM dNTPs, 78 ㎕ dH2O, 올리고뉴클레오티드 프라이머 SEQ ID NO:52와 SEQ ID NO:53의 20 mM 원액 각각의 2 ㎕, 및 Taq 중합효소 (2.5 단위, Life Technology)를 첨가하였다. 동일 부피의 미네랄 오일을 첨가하고 반응물을 94 ℃에서 2 분 간 가열한 다음 25 순환의 94 ℃에서 30초, 65 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1 분을 수행하였고 72 ℃에서 5 분 간 연장하였다.
BCMA cDNA의 단편을 SEQ ID NO:7의 뉴클레오티드 219 내지 뉴클레오티드 362의 폴리뉴클레오티드 서열을 함유하는 PCR을 사용하여 분리하였다. BCMA 단편의 생산에 사용되는 두 프라이머는 5' 인접서열의 40 bp와 BCMA 단편의 아미노 말단에 대응하는 17 bp를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 (SEQ ID NO:54)); 및 인접 Fc4 서열에 대응하는 3' 말단의 40 bp와 BCMA 단편의 카르복실 말단에 대응하는 17 bp를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 (SEQ ID NO:55)였다. 100 ㎕ 최종 부피에, 10 ng BCMA 주형, 10 ㎕ 10X Taq 중합효소 반응 완충액 (Perkin Elmer), 8 ㎕ 2.5 nM dNTPs, 78 ㎕ dH2O, 올리고뉴클레오티드 프라이머 SEQ ID NO:54와 SEQ ID NO:55의 20 mM 원액 각각의 2 ㎕, 및 Taq 중합효소 (2.5 단위, Life Technology)를 첨가하였다. 동일 부피의 미네랄 오일을 첨가하고 반응물을 94 ℃에서 2 분 간 가열한 다음 25 순환의 94 ℃에서 30초, 65 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1 분을 수행하였고 72 ℃에서 5 분 간 연장하였다.
Fc4 단편을 암호화하는 cDNA를 함유하는 단편을 유사한 방법으로 TACI와 BCMA 융합 구성체의 각각에 대하여 하나씩 제작하였다. TACI에 대하여, Fc4 단편의 생산에 사용되는 두가지 프라이머는 5' TACI 인접 서열의 40 bp와 Fc4 단편의 아미노 말단에 대응하는 17 bp를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 (SEQ ID NO:56)); 및 인접 벡터 서열에 대응하는 3' 말단의 40 bp와 Fc4 단편의 카르복실 말단에 대응하는 17 bp를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 (SEQ ID NO:57)였다. BCMA에 대하여, Fc4 단편의 생산에 사용되는 상류 프라이머는 5' BCMA 인접 서 열의 40 bp와 Fc4 단편의 아미노 말단에 대응하는 17 bp를 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머 (SEQ ID NO:58))였다. BCMA 제조의 Fc4에 대한 하류 프라이머는 상기된 TACI-Fc4에 대한 것과 동일하다 (SEQ ID NO:57).
100 ㎕ 최종 부피에, 상기된 10 ng Fc4 주형, 10 ㎕ 10X Taq 중합효소 반응 완충액 (Perkin Elmer), 8 ㎕ 2.5 nM dNTPs, 78 ㎕ dH2O, TACI에 대하여는 올리고뉴클레오티드 프라이머 SEQ ID NO:56과 SEQ ID NO:57, 그리고 BCMA에 대하여는 올리고뉴클레오티드 프라이머 SEQ ID NO:58과 SEQ ID NO:57의 20 mM 원액 각각의 2 ㎕, 및 Taq 중합효소 (2.5 단위, Life Technology)를 첨가하였다. 동일 부피의 미네랄 오일을 첨가하고 반응물을 94 ℃에서 2 분 간 가열한 다음 25 순환의 94 ℃에서 30초, 65 ℃에서 30초, 72 ℃에서 1 분을 수행하였고 72 ℃에서 5 분 간 연장하였다.
상기된 각 100 ㎕ PCR 반응물의 10 ㎕를 분석용으로 1 x TBE 완충액과 함께 0.8% LMP 한천 겔 (Seaplaque GTG)에서 전개시켰다. 남은 90 ㎕의 각 PCR 반응물은 5 ㎕ 1 M NaCl과 250 ㎕의 순수알콜을 첨가하여 침전하였다. 플라스미드 pZMP6를 SmaI으로 절단하여 폴리링커에서 선형화하였다. 플라스미드 pZMP6는 플라스미드 pCZ199 (아메리칸 타입 컬처 컬렉션, Manassas, VA, ATCC# 98668)에서 유래되었고, CMV 즉시 초기 프로모터, 마우스 면역글로불린 중쇄 위치의 다양한 영역 유래 보존 인트론, 암호화 서열의 삽입을 위한 다제한부위, 정지코돈 및 인간 성장호르몬 터미네이터를 가지는 발현 카세트를 함유하는 포유 동물 발현벡터이다. 플라스미드는 또한 E. coli 복제 기점, SV40 프로모터를 가지는 포유 동물 선택 마커 발현 단위, 인핸서와 복제 시점, DHFR 유전자 및 SV40 터미네이터를 가진다. 메탈로티오네인 프로모터를 CMV 즉시 초기 프로모터로 치환함으로써 pCZR199와 오픈리딩프레임의 5' 말단의 Kozac 서열로부터 벡터 pZMP6를 제조하였다.
100 ㎕의 컴피턴트 효모 세포 (S. cerevisiae)를 약 1 ㎍의 TACI 또는 BCMA 세포외 도메인 중 어느 하나 및 각각과의 재조합에 적당한 Fc4 PCR 단편, 및 SmaI으로 가수분해된 pZMP6 벡터를 함유하는 10 ㎕ 과 배합하여 0.2 cm 일렉트로포레이션 큐벳에 옮긴다. 효모/DNA 혼합물에 0.75 kV (5 kV/cm), ∞오옴, 25 ㎌에서 전기펄스를 가하였다. 각 큐벳에 600 ㎕의 1.2 M 솔비톨을 첨가하였고 효모를 URA-D 평판에 두 개의 300 ㎕ 알리쿼트로 도말하여 30 ℃에서 배양하였다.
약 48 시간 후, 단일 평판 유래 Ura+ 효모 형질전환체를 1 ml H2O에 현탁하여 단기간 회전시켜 효모 세포를 펠릿형성시켰다. 세포 펠릿은 1 ml 용균 완충액 (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA)에 현탁시켰다. 500 ㎕ 용균 혼합물을 300 ㎕ 산세척 비드와 200 ㎕ 페놀-클로로포름을 함유하는 에펜돌프 튜브에 첨가하고, 1 분 간격으로 두 차례 또는 세 차례 와동시키고, 에펜돌프 튜브 원심분리기의 최고속도에서 5 분 간 회전시킨다. 300 ㎕의 수성상을 새 튜브에 옮기고 600 ㎕ 에탄올 (EtOH)로 DNA 침전시킨 다음 4 ℃에서 10분 간 원심분리한다. DNA 펠릿을 100 ㎕ H2O에 현탁한다.
0.5 내지 2 ml 효모 DNA 제제와 40 ㎕ DH10B 세포로 전기 컴피턴트 E. coli 세포의 형질전환이 수행되었다. 세포는 2.0 kV, 25 mF 및 400 오옴에서 전기펄스를 가하였다. 일렉트로포레이션에 이어, 1 ml SOC (2 % 박토 트립톤 (Difco, Detroit, MI), 0.5 % 효모 추출물 (Difco), 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM 포도당)를 250 ㎕ 알리쿼트로 4개의 LB AMP 평판 (LB 육즙 (Lennox), 1.8 % Bacto Agar (Difco), 100 mg/L Ampicillin)에 도말하였다.
TACI-Fc4 또는 BCMA-Fc4에 대한 올바른 발현 구성체를 가지는 개별 클론은 삽입체의 존재를 확증하고 다양한 DNA 서열이 서로 올바르게 연결되었는지 확인하기 위하여 제한 가수분해로 확인하였다. 양성 클론의 삽입체에 대하여 서열 분석을 수행하였다. 대규모 플라스미드 DNA가 제조자의 지시에 따라 Qiagen Maxi 키트를 사용하여 분리된다.
(실시예 7)
TACI-Fc4와 BCMA의 포유 동물 발현
BHK 570 세포 (ATCC NO: CRL-10314)를 10 cm 조직 배양 접시에 도말하였고 37 ℃, 5 % CO2, DMEM/FBS 배지 (DMEM, Gibco/BRL 고포도당, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5 % 태아소 혈청(Hyclone, Logan, UT), 1 mM L-글루타민 (JRH Bioscience, Lenexa, KS), 1 mM 피루브산 나트륨 (Gibco BRL))에서 밤새 약 50 내지 70 % 밀집도로 성장하도록 하였다. 그 다음 LipofectamineTM (Gibco BRL)를 사용하고 무혈청 (SF) 배지 조제물 (DMEM, 10 mg/ml 트렌스페린, 5 mg/ml 인슐린, 2 mg/ml 페튜인, 1% L-글루타민 및 1% 피루브산나트륨) 내에서 세포를 플라스미드 TACI-Fc4/pZMP6 또는 BCMA-Fc4/pZMP6로 트렌스펙션시켰다. TACI-Fc4/pZMP6 또는 BCMA-Fc4/pZMP6는 15 ml 시험관에서 최종 부피 640 ㎕가 되도록 SF 배지로 희석하였다. 35 ㎕ LipofectamineTM (Gibco BRL)을 605 ㎕ SF 배지에 혼합하였다. LipofectamineTM 혼합물을 DNA 혼합물에 첨가하여 실온에서 약 30분 간 배양하였다. 5 ml의 SF 배지를 DNA:LipofectamineTM 혼합물에 첨가하였다. 세포를 5 ml SF 배지로 한차례 헹구고, 흡인하고 DNA:LipofectamineTM 혼합물을 첨가하였다. 세포는 5 시간 동안 37 ℃에서 배양하였고 그 다음 6.4 ml DMEM/10% FBS, 1% PSN 배지를 각 평판에 첨가하였다. 평판은 37 ℃에서 밤새 배양하였고 다음 날 DNA:LipofectamineTM 혼합물을 새로운 5% FBS/DMEM 배지로 교체하였다. 트렌스펙션 후 제 5일에, 세포를 선택 배지 (DMEM/ 5% FBS, 1% L-GLU, 1% NaPyr)의 T-162 프라스크로 분배시켰다. 트렌스펙션 후 약 10일에, 각 트렌스펙션체 유래 메토트렉제이트 내성 콜로니의 150 mm 배양 접시 두 개를 트립신 처리하였고 세포를 합하여 T-162 플라스크에 도말하고 대규모 배양으로 옮긴다.
(실시예 9)
Ztnf4의 트렌스제닉 발현
성체 숫컷 (B6C3f1), 미성숙 가임 암컷 (B6C3f1), 정관절제된 숫컷 (B6D3f1), 및 성체 가임 암컷 (B6D3f1) (모두 Taconic Farms, Germantown, NY 유래)를 사용하여 ztnf4 유전자를 발현하는 트렌스제닉 동물을 제조하였다. 미성숙 가임 암컷를 Pregnant Mare's Serum 성선자극호르몬과 인간 난막 성선자극호르몬 (hCG (Sigma))을 사용하여 배란촉진하였다. 배란촉진된 암컷은 바로 다음에 성체인 가임 수컷과 교배시켰고 질 플러그의 존재에 의하여 교미를 확인하였다.
수정된 난자를 외과용 현미경 (Leica MZ12 Stereo Microscope, Leica, Wetzlar, Germany) 하에서 수집하였다. 그 다음 난자를 히알루로니다제와 Whitten's W640 배지 (표 8; 모든 시약은 Sigma Chemical Co.로부터 구입가능)에서 세척하였고 37 ℃에서 5% CO2, 5% O2, 및 90% N2와 함께 배양하였다. 난자는 37 ℃/ 5% CO2 배양기에서 마이크로주사 전까지 저장하였다.
Figure 112001016752501-pct00009
전 길이의 인간 TACI 리간드 Blys (SEQ ID NO:35)를 암호화하는 858 bp 오픈리딩프레임을 올리고뉴클레오티드 프라이머 SEQ ID NO:36과 SEQ ID NO: 37을 사용하여 PCR로 증폭하여 최적화 개시코돈과 5' PmeI와 3' AscI 인접 부위가 도입되도록 하였다. 이 PmeI/AscI 단편은, Ig Em 인핸서(pEmSR 유래 690 bp NotI/XbaI; Bodrug et al., EMBO J. 13; 2124-30, 1994), Ig Vh 프로모터 (pJH1X(-) 유래 536 bp HincII/XhoI 단편; Hu et al., J. Exp. Med. 177: 1681-90, 1993), SV40 16S 인트론 (pEmSR 유래 171 bp XbaI/HinIII 단편), PmeI/AscI 폴리링커, 및 인간 성장 호르몬 유전자 폴리아데닐화 신호 (672 bp SmaI/EcoRI 단편; Seeburg, DNA 1: 239-49, 1982)를 함유하는 B 및/또는 T-세포-한정 트랜스제닉 벡터인 pKF024로 클로닝시켰다. 트랜스젠 삽입체를 NotI 가수분해에 의하여 플라스미드 골격으로부터 분리하였고 한천 겔 정제하였고, 상기 B6CF1Tac 마우스의 교배로부터 수정된 난자를 마이크로주사 하고 본질적으로 이전에 기술된 바와 같이 가상임신된 암컷에 이식하였다 (Malik et al., Molec. Cell. Biol. 15:2349-58, 1995).
수여자를 쌍으로 우리로 돌려보내 19 내지 21 일의 임신기간을 허용하였다. 출생 후, 암수구별과 이유전에 19 내지 21 일의 산후기간을 허용하였고, (유전자형 결정에 사용될) 0.5 cm 생검체를 청정 가위로 꼬리로부터 절단하였다.
게놈 DNA를 시중 구입가능한 키트 (DNeasy 96 Tissue Kit; Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 제조자 지시에 따라 꼬리절편으로부터 준비하였다. 트랜스제닉 벡터의 인간 성장 호르몬 (hGH) 3' UTR 부분에 대하여 고안된 프라이머를 사용한 PCR에 의하여 게놈 DNA를 분석하였다. 프라이머 ZC17251 (SEQ ID NO:38)과 ZC17252 (SEQ ID NO:39)로 hGH 368-염기쌍 단편을 증폭하였다. (인간과 마우스 성장 호르몬 3' UTR DNA 서열의 정렬로 부터 확인한) 인간 서열 고유의 영역의 사용은 PCR 반응이 마우스 서열을 증폭시키지 않았음을 확실하게 하였다. 또한, 벡터 서열에 혼성화되고 cDNA 삽입체를 증폭시키는 프라이머 ZC17156 (SEQ ID NO:40) 및 ZC17157 (SEQ ID NO:41)는 hGH 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 이 실험에서, 트 랜스젠에 대하여 양성인 동물 유래 DNA는, hGH 3' UTR 단편에 대응하는 368 염기쌍 밴드와 cDNA 삽입체에 대응하는 다양한 크기의 밴드, 두 밴드를 생성한다.
일단 동물이 트랜스젠 (TG)인 것으로 확인되면, TG 암컷과 야생종 숫컷 배열, 또는 TG 숫컷과 야생종 암컷 한 마리나 두 마리 배열에 의하여 역-교배시켜 근친종이 되게 하였다. 새끼가 태어나고 이유하면, 성감별하여 분리시키고 유전형 결정을 위하여 꼬리를 절단한다.
생존동물에서 트랜스젠의 발현을 점검하기 위하여, 생존 생검이 수행되었다. 각 트랜스젠의 mRNA 발현 수준의 분석은 RNA 용액 혼성화 분석이나 제조자의 지시에 따라 ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) 상에서 실시간 PCR을 사용하여 수행하였다.
세포 준비와 유동세포계측법
기부(founder) 마우스를 다양한 나이에서 분석하였다. 림프 조직의 유동세포계측 (FACS) 분석용으로, 막자와 막자사발을 사용하여 포스페이트 완충액 식염수 (PBS)에서의 주의깊은 파괴에 의하여 골수 (BM)세포를 대퇴골과 경골로부터 분리였다. 세포를 재현탁하고, 수동 침전에 의하여 뼈 단편을 사혈시키고, 그리고 1000 x g에서 펠렛형성시켰다. 비장혈구, 흉선 혈구, 또는 림프절 세포를 유리 슬라이드 사이의 온전한 조직을 분쇄시켜 얻고, 그 다음 재현탁하여 세포를 BM으로서 펠릿형성시켰다. 세포를 염색 전에 20 x 106 세포/ml에서 FACS 세척 완충액 (FACS WB) (Hank's 균형 염 용액, 1% BSA, 10mM Hepes, pH 7.4)으로 재현탁하였다. 염색하기 위하여, 1 x 106 세포를 5 ml 시험관으로 옮겼고 1 ml FACS WB로 세척하였다. 그 다음 세포를 포화 양의 적당한 FITC-, PE- 및/또는 TrisColor (TC)- 융합 mAb의 존재하에서, FACS WB 내 총 부피 100 ml로 20 분 간 빙상에서 항온처리하였다. 세포를 1.5 ml WB로 세척하였고, 펠릿형성하고, 그 다음 400 ml WB에 재현탁하여 CellQuest 소프트웨어 (Becton Dickinson, Mountain View, CA)를 사용하여 FACSCalibur 유동세포계측법 상에서 분석하였다. 전면 (FSC)과 측면 (SSC) 광 분산에 대한 검출기를 선형 비율로 세팅하였으나 모든 세 형광 채널 (FL-1, FL-2, 및 FL-3)에 대하여 로그 검출기를 사용하였다.
단일색 염색 세포 집단을 사용한 각 실험에 대하여 FL 채널 간의 스펙트럼 중복에 대한 보상을 수행하였다. 모든 세포를 수집하여 디스크로 언게이트하였고 CellQuest 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. FSC vs SSC 프로필을 기반으로 데이터를 전기적으로 게이트하여 RBS와 죽은 세포를 배제하였다.
항체
프루오레신 이소티오시아네이트 (FITC)-융합 항-CD8 모노클로날 항체 (mAb) (크론 53-6.7)과 피코에르티린 (PE)-융합 항-CD4 (클론RM4-5), 항-CD5 (클론 53-7.3), 항-CD19 (클론 1D3), 및 항-신데칸 (클론 281-2) mAb를 PharMingen (San Diego, CA)로부터 구입하였다. TriColor (TC)-융합 항-CD45R/B220 mAb (클론 RA3-6B2)를 Caltag로부터 구입하였다.
림프계 구획 발생에서 ztnf4를 과발현하는 트랜스제닉 마우스는 말초 B 세포 의 수가 감소되었고 형질세포가 증가하였고 혈장 면역글로불린의 수준이 증가하였다. 이들 트랜스제닉 동물은 비장, 림프절 및 흉선에서 증가된 수의 B200+ 세포를 가진다. 증가된 수의 비장 B 세포는 전통적 B-2 세포와 정상적으로는 드문 B-1세포를 모두 함유한다. 일반적으로, B-1 세포는 복강과 다른 체강에 넓게 분포되고, 저친화도 자가-반응성 항체를 생산하며, 종종 전신 홍반성 낭창 SLE 같은 자가면역질환의 진행과 관련되었다. 더 나이든 트랜스제닉 동물은 자가항체를 생산하고, 단백뇨와 사구체 경화를 진행하고, 전신 홍반성 낭창의 특징을 나타낸다.
도 5a는, 상기와 같이 준비되고, 항-B220-TC로 염색되고 유동세포계측에 의하여 분석된 비장 (상측 패널), 장간막 림프절 (중간 패널), 및 골수 (하측 패널)의 단일 세포 현탁을 도시한다. 각 조직 내 B220+ 세포의 수를 B220+ 세포 비율에 헤모사이토메터 상에서 측정한 총 (트리판 블루 배제) 생존 세포수를 곱하여 계산하였다. 각 막대는 개별 ztnf4 트랜스제닉 (Tg, 음영 막대) 또는 비TG 동복자 (열린막대) 대조군 마우스로부터의 데이터를 나타낸다.
도 5b는 ztnf4 TG (우측 패널) 또는 비TG 동복자 (좌측 패널)에서 분리된 세포를 도시한다. 림프절 (상측열), 비장 (중간열), 및 흉선 (하측 열)를 지시된 분자 (CD5, CD4, 및 CD8)에 대한 mAb로 염색한 다음 유동세포계측에 의하여 분석하였다. 나타난 세포를 게이트하여 죽은 세포와 RBC를 배제하였다.
도 5c는 나이가 6주 내지 23주의 범위인 ztnf4 트랜스제닉 마우스 유래 혈청의 총 IgG, IgM, 및 IgE 수준을 도시한다.
도 5d는 대조군 동복자 유래 정상 신사구체에 비교한 ztnf4 트랜스제닉 마우 스 유래 H & E 염색 신장 절편에서 확인되는 아밀로이드 침착과 신사구체의 비후맥관막을 도시한다.
도 5e는 Mackay et al. (J. Exp. Med. 190:1697-1710, 1999)에 의하여 보고된 바와 유사한 ztnf4 트랜스제닉 마우스의 에펙터 T 세포의 증가를 도시한다.
용해성 TACI(BR43x2) 또는 BCMA-Ig 융합체를 ztnf4 과발현 트랜스제닉 마우스에 주사한다 (IP, IM 또는 IV). 림프계 조직의 유동세포계측 (FACS) 분석이 비장, 림프절, 및 흉선에서 B220+ B 세포수의 어떤 변화를 확인하는데에 사용될 것이다.
(실시예 10)
직접 결합 ELISA
용해성 TACI-Ig 또는 용해성 BCMA-Ig의 결합 능력과 시험관 내 ztnfr4의 생체활성 저해능력의 특성결정을 위하여 직접 결합 ELISA가 개발되었다.
96 웰 평판을 ELISA A 완충액 (0.1 M Na2HCO3, pH 9.6, 0.02% NaN3)의 1 ㎍/ml 염소-항-인간 Ig (Jackson Labs, Bar Horbor, MA)로 코팅하였고 밤새 4 ℃에서 항온처리하였다. TACI, BCMA, 및 대조군으로 ztnfr10 (SEQ ID NO:42) 같은 비관련 TNF 수용체를 10 ㎍/ml 내지 5배 희석 320 ng/ml 더하기 0으로 적정하였고 2.5, 0.5, 또는 0.1 ㎍/ml 비오틴결합된 ztnf4, 또는 대조군으로서 오보알부민과 함께 항온처리하고, 실온에서 1시간동안 항온처리하였다.
함께 항온처리된 수용체-비오틴결합 리간드 혼합물을 그 다음 염소-항-인간 Ig 코팅 96 웰 평판에 첨가하였다. 평판을 그 다음 세척하였고(ELISA C, 500 ㎕ Tween 20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO.), 200 mg NaN3, 최종 부피 1 리터가 되도록 PBS) Superblock (Pierce Rockford, IL)로 차단하였다. 평판은 그 다음 37℃에서 2시간 항온처리하였다.
평판을 다시 한차례 ELISA C로 세척한 다음 100 ㎕/웰의 중성-아비딘-HRP 를 ELISA B (1% 또는 2% BSA에 대하여 각각 5 또는 10 ㎍ BSA (Sigma), 250 ㎕ Tween 20 (Sigma), 100 mg NaN3, 포스페이트-완충 식염수 pH 7.3 (PBS, Sigma)에서 500ml 의 최종부피로 하였다. 대안으로, 본 완충액은 ELISA C 완충액에 1% 또는 2% BSA로 만든다)중에 1:10,000으로 첨가하였다. 그 다음 평판을 OPD로 10분 간 실온에서 전개시키고 492에서 판독한다.
(실시예 11)
생체활성 분석
인간 B 세포의 용해성 TACI-FC 저해와 용해성 ztnf4에 의한 촉진을 측정하기 위하여 생체활성 분석법이 개발되었다. B 세포를 CD19 자성 비드와 VarioMacs 자성 분리 시스템 (Miltenyi Biotec Auburn, CA)을 사용하여 제조자의 지시에 따라 말초혈 단핵세포 (PBMNC)로부터 분리하였다. 정제된 B 세포를 용해성 ztnf4 (25 ng/ml)와 재조합 인간 IL-4 (10 ng/ml Pharmingen)에 혼합하였고 원형 바닥 96 웰 평판 상에 웰 당 1 x 105 세포로 세 벌씩 도말하였다.
용해성 TACI-FC는 5 ㎍/ml 내지 6 ng/ml로 희석하였고 B 세포와 5 일간 항온 처리하였는데 제 4일에는 웰 당 1 μCi 3H 티미딘 (Amersham)으로 밤새 펄스처리하였다. 대조군으로서 TACI-FC 또한 B 세포와 IL-4와 함께, ztnf4 없이 항온처리하였다.
평판을 Packard 평판 채취기를 사용하여 채취하였고 Packard 판독기를 사용하여 측정하였다. TACI-Ig 용해성 수용체는 용해성 ztnf4의 시험관 내 B 세포 증식 촉진 능력을 투여량-의존 방식으로 저해하였다. 10 배 몰 과량의 TACI-Ig는, IL-4 존재에서 용해성 stnf4에 반응하여 인간 B 세포 증식을 완전히 저해하였다.
(실시예 12)
ORIGIN 분석
질환환경에 있는 개체 내 ztnf4의 수준을 전기화학냉광 분석법을 사용하여 정상 개체에 상대적으로 결정하였다. 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0.1 ng/ml, 0.01ng/ml 및 0 ng/mg의 용해성 인간 ztnf4로부터 준비된 표준 곡선을 ORIGIN 완충액에서 준비하였다. 혈청 샘플을 ORIGIN 완충액에 희석하였다. 표준과 샘플을, Origin 분석 완충액 (IGEN)에 1 ㎍/ml로 희석되고 바이오틴결합된 토끼 항-인간 ztnf4-NF BV 항체 및 Origin 분석 완충액 (IGEN)에 1 ㎍/ml로 희석되고 루테닐결합된 토끼 항-인간 ztnf4-NF BV 폴리클로날 항체와 함께 실온에서 2 시간 항온처리하였다. 항온처리에 이어, 샘플을 와동시켰고 0.4 mg/ml 스트렙타비딘 Dynabead (Dynal, Oslo, Norway)을 각 표준과 샘플에 50 ㎕/시험관으로 첨가하였고 30분 간 실온에서 항온처리하였다. 샘플을 그 다음 와동시켰고 샘플을 Origin 분석기 (Igen) 상에서 제조자의 지 시에 따라 판독하였다. Origin 분석은 전기화학냉광에 기초하고 ECL-what is this, how does it work and what does this tell you에서 판독 결과를 산출한다.
사구체신염과 자가면역질환의 진행악화기로 진행된 NZBWF1/J와 MRL/Mpj-Fas1pr 마우스 모두에서 유래한 혈청 샘플에서 높은 수준의 ztnf4가 검출되었다.
(실시예 13)
SLE 자발성 모델의 용해성 TACI-Ig
NZBW 마우스는 약 7 내지 9달 나이에서 자발성 SLE의 증상을 나타낸다. TACI-Fc를 NZBW에 투여하여 B 세포 자가항체 생성이 평균적으로 NZBW 마우스에서 고수준인 것으로 생각될 때인 5주 기간에 걸쳐 그것의 B-세포에 대한 억제효과를 점검하였다.
8주 나이의 100 마리 암컷 (NZB x NZW) F1 마우스 (Jackson Labs)를 15 마리씩 6 군으로 나누었다. 처리 전에 마우스를 소변 단백질에 대하여 한 달에 한 차례씩 점검하였고 혈액을 CBC와 혈장 저장용으로 채취하였다. 자가항체의 존재에 대하여 혈장이 스크리닝될 것이다. 단백뇨증은 사구체신염의 전형적 신호이므로, 전 연구 진행에 걸쳐 일정 간격으로 딥스틱에 의하여 소변 단백질의 수준을 점검하였다. 처리에 앞서 동물의 중량을 측정하였다. 투여는 마우스가 약 5 개월 나이일 때 시작되었다. 마우스를 용제 (PBS) 단독 또는 인간 IgG-FC (대조군 단백질) 또는 TACI-FC4 (시험 단백질)로 5 주 동안 세 차례 복강 내 주사하였다.
Figure 112001016752501-pct00010
투여기간 동안 두 차례 혈액을 채취하였고 투여에 이어 적어도 두 차례 채취될 것이다. 투여 개시 후, 단백뇨에 대한 소변 딥스틱 값과 체중이 매 두 주 마다 측정되었다. 혈액, 소변 딥스틱 값과 체중이 안락사 시점에서 수집되었다. 비장, 흉선, 담낭을 포함하는 간, 좌측 신장 및 뇌의 중량을 취하였다. 비장과 흉선을 FACS 분석과 조직학용으로 나누었다. 턱밑침샘, 장간막 림프절 사슬, 담낭을 포함하는 간엽, 맹장과 대장, 위, 소장, 췌장, 우측 신장, 부신샘, 기관과 식도를 포함하는 혀, 심장 및 허파 또한 조직학용으로 채취하였다.
도 6은 SLE 진행과 연관되는 NZBWF1과 MRL/lpr/lpr 마우스 유래 혈장 내 고수준의 ztnf4를 도시한다. 도 6a 상측 패널은 68 마리의 10 내지 40 주 범위 나이의 NZBWF1 마우스와 30주 나이의 NZB/B 대조군 마우스에서 나이와 ztnf4 혈청 수준의 관계를 도시한다. 중간 패널은 극소량 내지 20 mg/dl (T-30), 100 내지 300 ng/dl 및 2000 mg/dl의 세 가지 범위에서, NZBWF1 마우스의 대조군 NZB/B 마우스와 비교한 단백뇨증과의 관계를 도시한다. 하측 패널은 대조군 NZB/B 마우스와 비교한 NZBWF1 마우스에서 항-ds DNA 항체의 다양한 역가를 가지는 ztnf4 수준을 도시한 다.
도 6b는 18 내지 24 주 나이의 23 마리의 MRL/lpr/lpr 마우스와 10 마리의 대조군 11주 나이의 MRL/MpJ 마우스 상에서 만들어진 동일한 관계를 도시한다.
도 7은 요검사 결과를 도시한다. 딥스틱 판독이 ≥100 mg/dl이면 마우스는 단백뇨증을 가지는 것으로 간주되었다. (A) PBS, (B) 인간 IgG, FC, 100 mg, (C) 인간 IgG FC, 20 mg, (D) 인간 TACI-IgG, 100 mg, 및 (E) 인간 TACI-IgG, 20mg. 용해성 TACI-IgG 융합으로 처리된 마우스는 단백뇨의 감소를 나타냈다.
처리된 동물 유래 말초혈의 분석은, 처리 시작 2주 후 백혈구와 림프구 측정치가 FC (20 및 100 mg)나 PBS 처리 마우스와 비교할 때 TACI-FC처리 마우스 (20 및 100 mg)에서 감소하였음을 드러냈다. 처리 시작 후 6 주 (마지막 처리가 투여된 후 2주)에 채취된 말초혈의 FAC 분석 (림프구 게이트)은 샘플에서 B 세포 존재가 매우 감소하는 것를 나타내었다. 마지막 처리가 투여된 후 5주에도 B 세포 수준은 여전히 감소되고 있었다. 표 9는 각 처리군에서 마우스에 대한 평균 (및 표준 편차)을 제공한다 (표 9). 말초혈에서 B세포의 감소는 또한 처리 2 주 후에도 관찰되었다.
Figure 112001016752501-pct00011
(실시예 14)
정상 마우스에서 용해성 TACI-Ig
TACI-FC를 Blab/C 마우스에 투여하여 정상마우스에 미치는 효과를 조사하였다. 6 마리의 8 주 나이의 암컷 Blab/C 마우스 (HSD)를 5 마리의 12 군으로 나누었다. 처리 전에 마우스를 중량을 재고 혈액을 CBC와 혈장 저장용으로 채취하였다. 군 1 내지 9에는 용제 (PBS) 단독 또는 인간 IgG-FC (대조군 단백질) 또는 TACI-FC4 (시험 단백질)의 복강내 주사 (IP)를 12일간 매일 투여하였고 제 14일에 희생시켰다. 군 10과 11에는 IP 주사를 1주에 세 차례로 두 주 동안 투여하였고 제 14일에 희생시켰다.
Figure 112001016752501-pct00012
제 7일과 제 12일에 혈액을 채취하였다. 혈액과 체중이 안락사 시점에 수집되었다. 비장, 흉선, 및 뇌 중량을 취하였다. 비장과 흉선을 FACS 분석과 조직학용으로 나누었다. 피부, 비장, 장간막 림프절 사슬, 턱밑침샘, 난소, 자궁, 경관, 방 광, 장간막 림프절 사슬, 담낭을 포함하는 간엽, 맹장과 대장, 위, 소장, 췌장, 우측 신장, 부신샘, 기관과 식도를 포함하는 혀, 심장, 흉선, 대퇴근, 우측 대퇴골, 뇌 또한 조직학용으로 수집될 것이다.
상기 실시예 13에 고안된 바와 같이, FC4 또는 PBS 처리 세포와 비교하여 모든 TACI-FC4 처리 샘플로부터 취하여진 말초혈 세포에서 제 7일 (CBC에 의한)과 제 12일 (FACS에 의한)에 B세포 백분율의 유의한 감소가 나타났고 이는 CBC 또는 FACS로 분석하였다. 또한, 제 14일에 FC4로 처리된 마우스와 비교하여, TACI-FC4로 처리된 동물에서 취하여진 비장에서 B세포의 거의 50% 감소가 있었다.
(실시예 15)
항-dsDNA ELISA
자가면역성은 고수준의 항-이중가닥 DNA 항체를 특징으로 한다. ztnf4 고발현 트랜스제닉 마우스와 NZBW 마우스 모두에서 항-dsDNA 항체의 수준을 측정하기 위하여, ELISA 분석이 개발되었다. 96 웰 마이크로적정 평판 (Nunc)을 폴리-L-리신 (Sigma) (0.1 M Tris 완충액 pH 7.3 내의 20 ㎕/m)으로 75 ㎕/웰로 코팅하였고 실온에서 밤새 항온처리하였다. 그 다음 평판을 dH2O로 세척하였고 폴리 dAdT (Sigma) (0.1 M Tris 완충액 pH 7.3 내의 20 ㎕/m)으로 75 ㎕/웰로 코팅하였고 실온에서 60분 간 항온처리하였다. 그 다음 평판을 dH2O로 세척하였고 Tris 완충액 내 2% BSA (Sigma)로 30 분 간 실온에서 차단하고 최종적으로 dH2O로 세척하였다.
혈청 샘플은 실시예 10에 기술된 ztnf4 트랜스제닉 마우스 및 실시예 11에 기술된 NZBW 트랜스제닉 마우스로부터 취하였다. 혈청 샘플을 Tris 완충액 내 1% BSA/ 2% BGG (Calbiochem)를 사용하여 1:50으로 희석하였다. 그 다음 희석된 샘플을 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200 및 1:6400 (50 ㎕/웰)에서 코팅된 평판 내로 적정하였고 90 분 간 실온에서 항온처리하였다.
그 다음 평판을 dH2O로 세척하였고, 1% BSA/ 2% BGG로 1: 1000 희석된 염소 항-마우스 IgG-Fc-HRP (Cappel)를 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 평판을 60 분 간 실온에서 항온처리하였다. 평판을 다섯 차례 dH2O로 세척하고 OPD, 1 정제/10 ml Novo D로 현상하였고 100 ㎕/웰로 도말하였다. 현상은 1N H2SO4, 100 ㎕/웰로 정지되었고 OD를 492 nm에서 판독한다.
도 8은 두 마리의 ztnf4 트랜스제닉 마우스 (23 주 나이), 두 마리의 비-트랜스제닉 동복자에서 NZBWF1 (32 주 나이) 및 MR/lpr/lpr (19 주 나이) 유래 혈청에서 검출된 수준에 비교한 항-ds DNA 수준을 도시한다.
(실시예 16)
ELE의 자발성 모델의 용해성 TACI-Ig
25 마리의 암컷 PLxSJL F1 마우스 (12 주 나이, Jackson Labs)에 125 ㎍/마우스로 완전 Freund's 아쥬반트에 조제된 항원 (myelin Proteolipid Protein, PLP, 잔기 139 내지 151)을 피하주사하였다. 마우스는 5 마리의 5 군으로 나누었다. 백일해 독소 (400 ng)으로 복강 내 주사가 제 0일 및 제 2일에 수행되었다. 군들은 1x, 10x, 또는 100x 투여량의 TACI, BCMA 또는 BR43x2가 주어질 것이고, 한 군은 용제 단독이 주어지고, 한 군은 아무런 처리를 하지 않을 것이다. 예방 치료가 제 0일에 시작될 것이고 개입 치료가 제 7일 또는 임상적 징후가 있으면 시작될 것이다. 질환의 징후, 체중손실, 및 마비가 대략 제 10일 내지 제 12일에 나타나고 약 1주간 계속된다. 동물을 체중을 수집하고 증상의 범위에 대응하는 임상적 스코어를 배정하여 매일 평가한다. EAE의 임상 징후는 접종 제 10 내지 14일 이내에 나타나고 약 1 주간 지속된다. 연구 마지막에 모든 동물을 가스 과투여로 안락사시키고 부검한다. 뇌와 척주를 조직학용으로 수집하거나 mRNA 분석용으로 동결한다. 체중과 임상 스코어 데이터가 개별적 및 군으로 플롯된다.
임상 스코어
0 정상
0.5 약함, 꼬리움직임이 감소하지만 없지는 않음
1 Limp 꼬리 (꼬리 기부로 마우스를 들었을때 꼬리를 옮기지 못함)
2 Limp 꼬리, 약한 다리 (꼬리를 옮기지 못함, 뒷다리로 곧게 유지할 수 있으나 다리가 떨림)
3 부전마비 (몸을 다리로 지탱하고 앉지 못함, 다리를 뒤로하고 아장아장 걸음)
4 마비 (뒷다리를 움직이지 못함, 뒤다리를 끌음)
5 사지마비 (앞다리 마비 또는 순환적 형태로 걸음, 머리가 기울어짐)
6 빈사 (완전히 바비됨, 취식 불가능, 동물 희생)
(실시예 17)
TACI-FC와 류마티스양 관절염에 대한 CIA 모델
8 주 나이의 숫컷 DBA/1J 마우스 (Jackson Labs)를 5 마리/군으로 나누고 50 내지 100 ㎕의 1 mg/ml 콜라겐 (닭 또는 소 기원)을 3주 간격으로 피하주사한다. 대조군 하나는 콜라겐 주사를 하지 않는다. 제 1회 주사는 완전 Freund's 아쥬반트에 조제하고 제 2회 주사는 불완전 Freund's 아쥬반트에 조제한다. TACI-FC는 제 2회 주사 전 또는 동물이 임상 스코어 2 이상을 진행하고 적어도 24시간 지속될 때에 예방으로 투여될 것이다. 동물은 제 2회 콜라겐 주사에 이어, 주로 2 내지 3주 이내에, 관절염의 증상을 나타내기 시작한다. 질환의 정도는 각 발에서 발두께를 측정하는 칼리퍼를 사용하고 임상 스코어 (0 내지 3)를 배정하여 평가된다. 임상 스코어, 0 정상, 1 발가락 염증, 2 온화한 발 염증, 3 중간정도의 발 염증, 4 심한 발 염증. 동물은 일정 시간 경과 후, 보통 7일, 질환이 확립된 다음에 안락사될 것이다. 조직학 또는 mRNA 분석용으로 발을 수집하고, 혈청을 면역글로불린과 시토카인 분석용으로 수집한다.
(실시예 18)
중화된 TACI 항체
2 마리의 암컷 뉴질랜드 백색 토끼를 펩티드 huztnf4-1 SAGIAKLEEGPELQLAIPRE (SEQ ID NO:59) 또는 huztnf4-2 SFKRGSALEEKENKELVKET (SEQ ID NO:60)로 면역화하여 폴리클로날 항-펩티드 항체를 제조하였다. 펩티드를 Applied Biosystems Model 431A 펩티드 합성기 (Applied Biosystems, Inc., Foster City CA)를 사용하여 제조자의 지시에 따라 합성하였다. 그 다음 펩티드를 말레미 드-활성화와 함께 담체 단백질 키홀 림펫 헤모시아닌 (KLH)에 융합하였다. 토끼를 각각 처음에 완전 Freund's 아쥬반트 내 200 ㎍ 펩티드를 복강내 주사하고 이어서 불완전 Freund's 아쥬반트 내 100 ㎍ 펩티드를 3 주 마다 ip 주사하였다. 제 2회 추가 주사 7 내지 10일 후 (총 3회 주사), 동물에서 혈액채취하여 혈청을 수집하였다. 그 다음 동물을 매 3 주 마다 추가 주사하였다.
ztnf4 펩티드-특이적 토끼 혈청은 항체를 생산하는데 사용된 1 ㎍/ml 펩티드 (SEQ ID NO:59 및 60)를 항체 표적으로서 사용한 ELISA 역가를 특징으로 하였다. huztnf4-1 펩티드 (SEQ ID no;59)에 대한 두 마리의 토끼 혈청은 1:1E5 (1:100000) 희석에서 그것의 특이적 펩티드에 대한 역가를 가진다. huztnf4- 펩티드 (SEQ ID no;60)에 대한 두 마리의 토끼 혈청은 1:5E6 희석에서 그것의 특이적 펩티드에 대한 역가를 가졌고, 1:5E6 희석에서 재조합 전 길이 펩티드 (배큘로바이러스에서 생산된 (huztnf4s-NF-Bv) N-말단 FLAG-태그된 ztnf4와 BHK 세포에서 생산된 C-말단 FLAG-태그된 ztnf4)에 대한 역가를 가졌다.
그램 CNBr-SEPHAROSE 당 10 mg 특이 펩티드 (SEQ ID NO:59 또는 60)를 사용하여 준비된 CNBR-SEPHAROSE 4B 단백질 컬럼 (Pharmacia LKB)를 사용하여, ztnf4 펩티드-특이적 폴리클로날 항체를 친화성에 기초하여 토끼 혈청으로부터 정제하였고 밤새 20X 투석하였다. ztnf4-특이적 항체는 항체를 생산하는데 사용된 1 ㎍/ml 적당한 펩티드 항원 또는 재조합 전 길이 단백질 (huztnf4s-NF-Bv)를 항체 표적으로 사용하는 1 ELISA 역가를 특징으로 한다. 토끼 항-huztnf4-1 친화성 정제된 항체의 그것의 특이 항원 (huztnf4-1 펩티드, SEQ ID NO:59)에 대한 검출의 하한값 (LLD)은 5 ng/ml 희석이다. 토끼 항-huztnf4-2 친화성 정제된 항체의 그것의 특이 항원 (huztnf4-2 펩티드, SEQ ID NO:60)에 대한 검출의 하한값 (LLD)은 0.5 ng/ml 희석이다. 토끼 항-huztnf4-2 친화성 정제된 항체의 재조합 단백질 huztnf4s-NF-Bv에 대한 검출의 하한값 (LLD)은 5 ng/ml 희석이다.
마우스 모노클로날 항체 또한 생산되고 비오틴-표지된 용해성 ztnf4의 저해에 대하여 선택되었다. TACI 모노클로날 항체 (248.14, 248.23, 248.24, 또는 246.3) 중 어느 것도 ztnf4의 BCMA 상 결합을 차단하지 않는다. 모노클로날 항체 248.23은 조건배지가 1:243으로 희석될 때 10 ng/ml ztnf4-비오틴의 결합을 약 50%로 감소시키고 희석되지 않은 배지에서 결합을 약 두배 감소시킨다. 모노클로날 항체 246.3은 조건배지 1:243 내지 1:181로 희석에서 10 ng/ml ztnf4-비오틴의 결합을 약 50%로 감소시키고 희석되지 않은 배지에서 결합을 약 5배 감소시킨다.
상기된 것으로 보아, 비록 본 발명의 특정 구체예가 여기에 설명의 목적으로 기술되었지만, 본 발명의 요지와 범위에서 벗어남 없이 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의하여만 한정된다.
<110> ZYMOGENETICS, INC. <120> SOLUBLE RECEPTOR BR43x2 AND METHODS OF USING <130> 3 <150> US 09/226,533 <151> 1999-01-07 <160> 60 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1192 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (6)..(746) <400> 1 gagta atg agt ggc ctg ggc cgg agc agg cga ggt ggc cgg agc cgt 47 Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg 1 5 10 gtg gac cag gag gag cgc tgg tca ctc agc tgc cgc aag gag caa ggc 95 Val Asp Gln Glu Glu Arg Trp Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly 15 20 25 30 aag ttc tat gac cat ctc ctg agg gac tgc atc agc tgt gcc tcc atc 143 Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile 35 40 45 tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac ttc tgt gag aac aag ctc 191 Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu 50 55 60 agg agc cca gtg aac ctt cca cca gag ctc agg aga cag cgg agt gga 239 Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg Ser Gly 65 70 75 gaa gtt gaa aac aat tca gac aac tcg gga agg tac caa gga ttg gag 287 Glu Val Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly Leu Glu 80 85 90 cac aga ggc tca gaa gca agt cca gct ctc ccg ggg ctg aag ctg agt 335 His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser 95 100 105 110 gca gat cag gtg gcc ctg gtc tac agc acg ctg ggg ctc tgc ctg tgt 383 Ala Asp Gln Val Ala Leu Val Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys 115 120 125 gcc gtc ctc tgc tgc ttc ctg gtg gcg gtg gcc tgc ttc ctc aag aag 431 Ala Val Leu Cys Cys Phe Leu Val Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys 130 135 140 agg ggg gat ccc tgc tcc tgc cag ccc cgc tca agg ccc cgt caa agt 479 Arg Gly Asp Pro Cys Ser Cys Gln Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gln Ser 145 150 155 ccg gcc aag tct tcc cag gat cac gcg atg gaa gcc ggc agc cct gtg 527 Pro Ala Lys Ser Ser Gln Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val 160 165 170 agc aca tcc ccc gag cca gtg gag acc tgc agc ttc tgc ttc cct gag 575 Ser Thr Ser Pro Glu Pro Val Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu 175 180 185 190 tgc agg gcg ccc acg cag gag agc gca gtc acg cct ggg acc ccc gac 623 Cys Arg Ala Pro Thr Gln Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro Asp 195 200 205 ccc act tgt gct gga agg tgg ggg tgc cac acc agg acc aca gtc ctg 671 Pro Thr Cys Ala Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val Leu 210 215 220 cag cct tgc cca cac atc cca gac agt ggc ctt ggc att gtg tgt gtg 719 Gln Pro Cys Pro His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Val Cys Val 225 230 235 cct gcc cag gag ggg ggc cca ggt gca taaa tgggggtcag ggagggaaag 770 Pro Ala Gln Glu Gly Gly Pro Gly Ala 240 245 gaggagggag agagatggag aggaggggag agagaaagag aggtggggag aggggagaga 830 gatatgagga gagagagaca gaggaggcag agagggagag aaacagagga gacagagagg 890 gagagagaga cagagggaga gagagacaga ggggaagaga ggcagagagg gaaagaggca 950 gagaaggaaa gaggcagaga gggagagagg cagagaggga gagaggcaga gagacagaga 1010 gggagagagg gacagagaga gatagagcag gaggtcgggg cactctgagt cccagttccc 1070 agtgcagctg taggtcgtca tcacctaacc acacgtgcaa taaagtcctc gtgcctgctg 1130 ctcacagccc ccgagagccc ctcctcctgg agaataaaac ctttggcagc tgcccttcct 1190 ca 1192 <210> 2 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp 1 5 10 15 Gln Glu Glu Arg Trp Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe 20 25 30 Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly 35 40 45 Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser 50 55 60 Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg Ser Gly Glu Val 65 70 75 80 Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly Leu Glu His Arg 85 90 95 Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp 100 105 110 Gln Val Ala Leu Val Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Val 115 120 125 Leu Cys Cys Phe Leu Val Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly 130 135 140 Asp Pro Cys Ser Cys Gln Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gln Ser Pro Ala 145 150 155 160 Lys Ser Ser Gln Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val Ser Thr 165 170 175 Ser Pro Glu Pro Val Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg 180 185 190 Ala Pro Thr Gln Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro Thr 195 200 205 Cys Ala Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val Leu Gln Pro 210 215 220 Cys Pro His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Val Cys Val Pro Ala 225 230 235 240 Gln Glu Gly Gly Pro Gly Ala 245 <210> 3 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(360) <400> 3 atg agt ggc ctg ggc cgg agc agg cga ggt ggc cgg agc cgt gtg gac 48 Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp 1 5 10 15 cag gag gag cgc tgg tca ctc agc tgc cgc aag gag caa ggc aag ttc 96 Gln Glu Glu Arg Trp Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe 20 25 30 tat gac cat ctc ctg agg gac tgc atc agc tgt gcc tcc atc tgt gga 144 Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly 35 40 45 cag cac cct aag caa tgt gca tac ttc tgt gag aac aag ctc agg agc 192 Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser 50 55 60 cca gtg aac ctt cca cca gag ctc agg aga cag cgg agt gga gaa gtt 240 Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg Ser Gly Glu Val 65 70 75 80 gaa aac aat tca gac aac tcg gga agg tac caa gga ttg gag cac aga 288 Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly Leu Glu His Arg 85 90 95 ggc tca gaa gca agt cca gct ctc ccg ggg ctg aag ctg agt gca gat 336 Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp 100 105 110 cag gtg gcc ctg gtc tac agc acg 360 Gln Val Ala Leu Val Tyr Ser Thr 115 120 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp 1 5 10 15 Gln Glu Glu Arg Trp Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe 20 25 30 Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly 35 40 45 Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser 50 55 60 Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg Ser Gly Glu Val 65 70 75 80 Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly Leu Glu His Arg 85 90 95 Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp 100 105 110 Gln Val Ala Leu Val Tyr Ser Thr 115 120 <210> 5 <211> 1377 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (14)..(892) <400> 5 agcatcctga gta atg agt ggc ctg ggc cgg agc agg cga ggt ggc 46 Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly 1 5 10 cgg agc cgt gtg gac cag gag gag cgc ttt cca cag ggc ctg tgg acg 94 Arg Ser Arg Val Asp Gln Glu Glu Arg Phe Pro Gln Gly Leu Trp Thr 15 20 25 ggg gtg gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag tac tgg gat cct ctg 142 Gly Val Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro Leu 30 35 40 ctg ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc aac cat cag agc cag 190 Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser Gln 45 50 55 cgc acc tgt gca gcc ttc tgc agg tca ctc agc tgc cgc aag gag caa 238 Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln 60 65 70 75 ggc aag ttc tat gac cat ctc ctg agg gac tgc atc agc tgt gcc tcc 286 Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser 80 85 90 atc tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac ttc tgt gag aac aag 334 Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys 95 100 105 ctc agg agc cca gtg aac ctt cca cca gag ctc agg aga cag cgg agt 382 Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg Ser 110 115 120 gga gaa gtt gaa aac aat tca gac aac tcg gga agg tac caa gga ttg 430 Gly Glu Val Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly Leu 125 130 135 gag cac aga ggc tca gaa gca agt cca gct ctc ccg ggg ctg aag ctg 478 Glu His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu 140 145 150 155 agt gca gat cag gtg gcc ctg gtc tac agc acg ctg ggg ctc tgc ctg 526 Ser Ala Asp Gln Val Ala Leu Val Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu 160 165 170 tgt gcc gtc ctc tgc tgc ttc ctg gtg gcg gtg gcc tgc ttc ctc aag 574 Cys Ala Val Leu Cys Cys Phe Leu Val Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys 175 180 185 aag agg ggg gat ccc tgc tcc tgc cag ccc cgc tca agg ccc cgt caa 622 Lys Arg Gly Asp Pro Cys Ser Cys Gln Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gln 190 195 200 agt ccg gcc aag tct tcc cag gat cac gcg atg gaa gcc ggc agc cct 670 Ser Pro Ala Lys Ser Ser Gln Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro 205 210 215 gtg agc aca tcc ccc gag cca gtg gag acc tgc agc ttc tgc ttc cct 718 Val Ser Thr Ser Pro Glu Pro Val Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro 220 225 230 235 gag tgc agg gcg ccc acg cag gag agc gca gtc acg cct ggg acc ccc 766 Glu Cys Arg Ala Pro Thr Gln Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro 240 245 250 gac ccc act tgt gct gga agg tgg ggg tgc cac acc agg acc aca gtc 814 Asp Pro Thr Cys Ala Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val 255 260 265 ctg cag cct tgc cca cac atc cca gac agt ggc ctt ggc att gtg tgt 862 Leu Gln Pro Cys Pro His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Val Cys 270 275 280 gtg cct gcc cag gag ggg ggc cca ggt gca taaatggg ggtcagggag 910 Val Pro Ala Gln Glu Gly Gly Pro Gly Ala 285 290 ggaaaggagg agggagagag atggagagga ggggagagag aaagagaggt ggggagaggg 970 gagagagata tgaggagaga gagacagagg aggcagaaag ggagagaaac agaggagaca 1030 gagagggaga gagagacaga gggagagaga gacagagggg aagagaggca gagagggaaa 1090 gaggcagaga aggaaagaga caggcagaga aggagagagg cagagaggga gagaggcaga 1150 gagggagaga ggcagagaga cagagaggga gagagggaca gagagagata gagcaggagg 1210 tcggggcact ctgagtccca gttcccagtg cagctgtagg tcgtcatcac ctaaccacac 1270 gtgcaataaa gtcctcgtgc ctgctgctca cagcccccga gagcccctcc tcctggagaa 1330 taaaaccttt ggcagctgcc cttcctcaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1377 <210> 6 <211> 293 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp 1 5 10 15 Gln Glu Glu Arg Phe Pro Gln Gly Leu Trp Thr Gly Val Ala Met Arg 20 25 30 Ser Cys Pro Glu Glu Gln Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met 35 40 45 Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala 50 55 60 Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp 65 70 75 80 His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His 85 90 95 Pro Lys Gln Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val 100 105 110 Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gln Arg Ser Gly Glu Val Glu Asn 115 120 125 Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gln Gly Leu Glu His Arg Gly Ser 130 135 140 Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp Gln Val 145 150 155 160 Ala Leu Val Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Val Leu Cys 165 170 175 Cys Phe Leu Val Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly Asp Pro 180 185 190 Cys Ser Cys Gln Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gln Ser Pro Ala Lys Ser 195 200 205 Ser Gln Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val Ser Thr Ser Pro 210 215 220 Glu Pro Val Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg Ala Pro 225 230 235 240 Thr Gln Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro Thr Cys Ala 245 250 255 Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val Leu Gln Pro Cys Pro 260 265 270 His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Val Cys Val Pro Ala Gln Glu 275 280 285 Gly Gly Pro Gly Ala 290 <210> 7 <211> 995 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (219)..(770) <400> 7 aagactcaaa cttagaaact tgaattagat gtggtattca aatccttacg tgccgcgaag 60 acacagacag cccccgtaag aacccacgaa gcaggcgaag ttcattgttc tcaacattct 120 agctgctctt gctgcatttg ctctggaatt cttgtagaga tattacttgt ccttccaggc 180 tgttctttct gtagctccct tgttttcttt ttgtgatc atg ttg cag atg gct 233 Met Leu Gln Met Ala 1 5 ggg cag tgc tcc caa aat gaa tat ttt gac agt ttg ttg cat gct tgc 281 Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu His Ala Cys 10 15 20 ata cct tgt caa ctt cga tgt tct tct aat act cct cct cta aca tgt 329 Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr Pro Pro Leu Thr Cys 25 30 35 cag cgt tat tgt aat gca agt gtg acc aat tca gtg aaa gga acg aat 377 Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser Val Lys Gly Thr Asn 40 45 50 gcg att ctc tgg acc tgt ttg gga ctg agc tta ata att tct ttg gca 425 Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu Ile Ile Ser Leu Ala 55 60 65 gtt ttc gtg cta atg ttt ttg cta agg aag ata agc tct gaa cca tta 473 Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile Ser Ser Glu Pro Leu 70 75 80 85 aag gac gag ttt aaa aac aca gga tca ggt ctc ctg ggc atg gct aac 521 Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu Leu Gly Met Ala Asn 90 95 100 att gac ctg gaa aag agc agg act ggt gat gaa att att ctt ccg aga 569 Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu Ile Ile Leu Pro Arg 105 110 115 ggc ctc gag tac acg gtg gaa gaa tgc acc tgt gaa gac tgc atc aag 617 Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys Glu Asp Cys Ile Lys 120 125 130 agc aaa ccg aag gtc gac tct gac cat tgc ttt cca ctc cca gct atg 665 Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe Pro Leu Pro Ala Met 135 140 145 gag gaa ggc gca acc att ctt gtc acc acg aaa acg aat gac tat tgc 713 Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys Thr Asn Asp Tyr Cys 150 155 160 165 aag agc ctg cca gct gct ttg agt gct acg gag ata gag aaa tca att 761 Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu Ile Glu Lys Ser Ile 170 175 180 tct gct agg taattaacca tttcgactcg agcagtgcca ctttaaaaat 810 Ser Ala Arg cttttgtcag aatagatgat gtgtcagatc tctttaggat gactgtattt ttcagttgcc 870 gatacagctt tttgtcctct aactgtggaa actctttatg ttagatatat ttctctaggt 930 tactgttggg agcttaatgg tagaaacttc cttggtttca tgattaaagt cttttttttt 990 cctga 995 <210> 8 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Leu Gln Met Ala Gly Gln Cys Ser Gln Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15 Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gln Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 20 25 30 Pro Pro Leu Thr Cys Gln Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Val Thr Asn Ser 35 40 45 Val Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu 50 55 60 Ile Ile Ser Leu Ala Val Phe Val Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile 65 70 75 80 Ser Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu 85 90 95 Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu 100 105 110 Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Val Glu Glu Cys Thr Cys 115 120 125 Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Val Asp Ser Asp His Cys Phe 130 135 140 Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Val Thr Thr Lys 145 150 155 160 Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu 165 170 175 Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg 180 <210> 9 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp Gln Glu Glu Arg 1 5 10 15 Phe Pro Gln Gly Leu Trp Thr Gly Val Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu 20 25 30 Glu Gln Tyr Trp Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr 35 40 45 Ile Cys Asn His Gln Ser Gln Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser 50 55 60 Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gln Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg 65 70 75 80 Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gln His Pro Lys Gln Cys 85 90 95 Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro 100 105 110 Glu Leu Arg Arg Gln Arg Ser Gly Glu Val Glu Asn Asn Ser Asp Asn 115 120 125 Ser Gly Arg Tyr Gln Gly Leu Glu His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro 130 135 140 Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp Gln Val Ala Leu Val Tyr 145 150 155 160 Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Val Leu Cys Cys Phe Leu Val 165 170 175 Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly Asp Pro Cys Ser Cys Gln 180 185 190 Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gln Ser Pro Ala Lys Ser Ser Gln Asp His 195 200 205 Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val Ser Thr Ser Pro Glu Pro Val Glu 210 215 220 Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg Ala Pro Thr Gln Glu Ser 225 230 235 240 Ala Val Thr Pro Gly 245 <210> 10 <211> 40 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif describing the cysteine-rich pseudo-repeat domain <220> <221> VARIANT <222> (1)..(2) <223> Each Xaa is independently any amino acid residue except cysteine, or absent. <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Xaa is any amino acid residue except cysteine. <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> Xaa is slutamine, glutamic acid. or lysine. <220> <221> VARIANT <222> (6) <223> Xaa is glutamine, glutamic acid, lysine, asparagine, arginine, aspartic acid, histidine, or serine. <220> <221> VARIANT <222> (7) <223> Xaa is glutamine or glutamic acid. <220> <221> VARIANT <222> (8)..(9) <223> Each Xaa is independently any amino acid residue except cysteine, or absent. <220> <221> VARIANT <222> (10)..(11) <223> Xaa is tyrosine, phenylalanine. or tryptophan. <220> <221> VARIANT <222> (13) <223> Xaa is any amino acid residue except cysteine. <220> <221> VARIANT <222> (16)..(17) <223> Each Xaa is independently any amino acid residue except cysteine. <220> <221> VARIANT <222> (19) <223> Xaa is isoleucine, methionine, leucine, or valine. <220> <221> VARIANT <222> (20) <223> Xaa is any amino acid residue except cysteine. <220> <221> VARIANT <222> (22)..(24) <223> Each Xaa is independently any amino acid residue except cysteine. <220> <221> VARIANT <222> (26)..(31) <223> Each Xaa is independently any amino acid residue except cysteine. <220> <221> VARIANT <222> (32)..(33) <223> Each Xaa is independently any amino acid residue except cysteine, or absent. <220> <221> VARIANT <222> (35)..(36) <223> Each Xaa is independently any amino acid residue except cysteine. <220> <221> VARIANT <222> (37) <223> Xaa is tyrosine or phenylalanine. <220> <221> VARIANT <222> (39)..(40) <223> Each Xaa is independently any amino acid residue except cysteine, or absent. <400> 10 Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Leu Leu Xaa 1 5 10 15 Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 35 40 <210> 11 <211> 360 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Degenerate oligonucleotide sequence encoding the polypeptide of SEQ ID NO:4 <220> <221> variation <222> (1)..(360) <223> Each N is independently A, T, G, or C. <400> 11 atgwsnggny tnggnmgnws nmgnmgnggn ggnmgnwsnm gngtngayca rgargarmgn 60 tggwsnytnw sntgymgnaa rgarcarggn aarttytayg aycayytnyt nmgngaytgy 120 athwsntgyg cnwsnathtg yggncarcay ccnaarcart gygcntaytt ytgygaraay 180 aarytnmgnw snccngtnaa yytnccnccn garytnmgnm gncarmgnws nggngargtn 240 garaayaayw sngayaayws nggnmgntay carggnytng arcaymgngg nwsngargcn 300 wsnccngcny tnccnggnyt naarytnwsn gcngaycarg tngcnytngt ntaywsnacn 360 360 <210> 12 <211> 741 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Degenerate oligonucleotide sequence encoding a polypeptide of SEQ ID NO:2 <220> <221> variation <222> (1)..(741) <223> Each N is independently A, T, G, or C. <400> 12 atgwsnggny tnggnmgnws nmgnmgnggn ggnmgnwsnm gngtngayca rgargarmgn 60 tggwsnytnw sntgymgnaa rgarcarggn aarttytayg aycayytnyt nmgngaytgy 120 athwsntgyg cnwsnathtg yggncarcay ccnaarcart gygcntaytt ytgygaraay 180 aarytnmgnw snccngtnaa yytnccnccn garytnmgnm gncarmgnws nggngargtn 240 garaayaayw sngayaayws nggnmgntay carggnytng arcaymgngg nwsngargcn 300 wsnccngcny tnccnggnyt naarytnwsn gcngaycarg tngcnytngt ntaywsnacn 360 ytnggnytnt gyytntgygc ngtnytntgy tgyttyytng tngcngtngc ntgyttyytn 420 aaraarmgng gngayccntg ywsntgycar ccnmgnwsnm gnccnmgnca rwsnccngcn 480 aarwsnwsnc argaycaygc natggargcn ggnwsnccng tnwsnacnws nccngarccn 540 gtngaracnt gywsnttytg yttyccngar tgymgngcnc cnacncarga rwsngcngtn 600 acnccnggna cnccngaycc nacntgygcn ggnmgntggg gntgycayac nmgnacnacn 660 gtnytncarc cntgyccnca yathccngay wsnggnytng gnathgtntg ygtnccngcn 720 cargarggng gnccnggngc n 741 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FLAG tag <400> 13 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu-Glu tag <400> 14 Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC19980 <400> 15 cgaagagcag tactgggatc ctct 24 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC19981 <400> 16 gccaaggcca ctgtctggga tgt 23 <210> 17 <211> 1149 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (236)..(1027) <400> 17 gaattcggca cgaggcagaa aggagaaaat tcaggataac tctcctgagg ggtgagccaa 60 gccctgccat gtagtgcacg caggacatca acaaacacag ataacaggaa atgatccatt 120 ccctgtggtc acttattcta aaggccccaa ccttcaaagt tcaagtagtg atatggatga 180 ctccacagaa agggagcagt cacgccttac ttcttgcctt aagaaaagag aagaa 235 atg aaa ctg aag gag tgt gtt tcc atc ctc cca cgg aag gaa agc ccc 283 Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro Arg Lys Glu Ser Pro 1 5 10 15 tct gtc cga tcc tcc aaa gac gga aag ctg ctg gct gca acc ttg ctg 331 Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu Ala Ala Thr Leu Leu 20 25 30 ctg gca ctg ctg tct tgc tgc ctc acg gtg gtg tct ttc tac cag gtg 379 Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val Ser Phe Tyr Gln Val 35 40 45 gcc gcc ctg caa ggg gac ctg gcc agc ctc cgg gca gag ctg cag ggc 427 Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ala Glu Leu Gln Gly 50 55 60 cac cac gcg gag aag ctg cca gca gga gca gga gcc ccc aag gcc ggc 475 His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly Ala Pro Lys Ala Gly 65 70 75 80 ctg gag gaa gct cca gct gtc acc gcg gga ctg aaa atc ttt gaa cca 523 Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu Lys Ile Phe Glu Pro 85 90 95 cca gct cca gga gaa ggc aac tcc agt cag aac agc aga aat aag cgt 571 Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn Ser Arg Asn Lys Arg 100 105 110 gcc gtt cag ggt cca gaa gaa aca gtc act caa gac tgc ttg caa ctg 619 Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys Leu Gln Leu 115 120 125 att gca gac agt gaa aca cca act ata caa aaa gga tct tac aca ttt 667 Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Thr Phe 130 135 140 gtt cca tgg ctt ctc agc ttt aaa agg gga agt gcc cta gaa gaa aaa 715 Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys 145 150 155 160 gag aat aaa ata ttg gtc aaa gaa act ggt tac ttt ttt ata tat ggt 763 Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Gly 165 170 175 cag gtt tta tat act gat aag acc tac gcc atg gga cat cta att cag 811 Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu Ile Gln 180 185 190 agg aag aag gtc cat gtc ttt ggg gat gaa ttg agt ctg gtg act ttg 859 Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu 195 200 205 ttt cga tgt att caa aat atg cct gaa aca cta ccc aat aat tcc tgc 907 Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys 210 215 220 tat tca gct ggc att gca aaa ctg gaa gaa gga gat gaa ctc caa ctt 955 Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gln Leu 225 230 235 240 gca ata cca aga gaa aat gca caa ata tca ctg gat gga gat gtc aca 1003 Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly Asp Val Thr 245 250 255 ttt ttt ggt gca ttg aaa ctg ctg tga cctacttaca ccatgtctgt 1050 Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu 260 agctattttc ctccctttct ctgtacctct aagaagaaag aatctaactg aaaataccaa 1110 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaccctcga gcggccgcc 1149 <210> 18 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro Arg Lys Glu Ser Pro 1 5 10 15 Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu Ala Ala Thr Leu Leu 20 25 30 Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val Ser Phe Tyr Gln Val 35 40 45 Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ala Glu Leu Gln Gly 50 55 60 His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly Ala Pro Lys Ala Gly 65 70 75 80 Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu Lys Ile Phe Glu Pro 85 90 95 Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn Ser Arg Asn Lys Arg 100 105 110 Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln Asp Cys Leu Gln Leu 115 120 125 Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys Gly Ser Tyr Thr Phe 130 135 140 Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys 145 150 155 160 Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Gly 165 170 175 Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu Ile Gln 180 185 190 Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu 195 200 205 Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys 210 215 220 Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gln Leu 225 230 235 240 Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu Asp Gly Asp Val Thr 245 250 255 Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu 260 <210> 19 <211> 1430 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (102)..(848) <400> 19 ttggcgcagg agcgtgcgta ggattgctcg ctcacaacag gcacctgact ggtattgaaa 60 gccgagtctt cccttcctct ttaaaggatt ggtgaccagg c atg gct atg 110 Met Ala Met 1 gca ttc tgc ccc aaa gat cag tac tgg gac tcc tca agg aaa tcc tgt 158 Ala Phe Cys Pro Lys Asp Gln Tyr Trp Asp Ser Ser Arg Lys Ser Cys 5 10 15 gtc tcc tgt gca ctg acc tgc agc cag agg agc cag cgc acc tgt aca 206 Val Ser Cys Ala Leu Thr Cys Ser Gln Arg Ser Gln Arg Thr Cys Thr 20 25 30 35 gac ttc tgc aaa ttc atc aat tgc cga aaa gag caa ggc agg tac tac 254 Asp Phe Cys Lys Phe Ile Asn Cys Arg Lys Glu Gln Gly Arg Tyr Tyr 40 45 50 gac cat ctc ctg ggg gcc tgc gtc agc tgt gac tcc acc tgc aca cag 302 Asp His Leu Leu Gly Ala Cys Val Ser Cys Asp Ser Thr Cys Thr Gln 55 60 65 cac cct cag cag tgt gcc cac ttc tgt gag aaa agg ccc aga agc cag 350 His Pro Gln Gln Cys Ala His Phe Cys Glu Lys Arg Pro Arg Ser Gln 70 75 80 gcg aac ctc cag ccc gag ctc ggg aga cca cag gcc ggg gag gtg gaa 398 Ala Asn Leu Gln Pro Glu Leu Gly Arg Pro Gln Ala Gly Glu Val Glu 85 90 95 gtc agg tca gac aac tca gga agg cac cag gga tct gag cat ggt cca 446 Val Arg Ser Asp Asn Ser Gly Arg His Gln Gly Ser Glu His Gly Pro 100 105 110 115 gga ttg agg cta agt agc gac cag ctg act ctc tac tgc aca ctg ggg 494 Gly Leu Arg Leu Ser Ser Asp Gln Leu Thr Leu Tyr Cys Thr Leu Gly 120 125 130 gtc tgc ctc tgc gcc atc ttc tgc tgt ttc ttg gtg gcc ttg gcc tcc 542 Val Cys Leu Cys Ala Ile Phe Cys Cys Phe Leu Val Ala Leu Ala Ser 135 140 145 ttc ctc agg cgt aga gga gag cca cta ccc agc cag cct gcc ggg cca 590 Phe Leu Arg Arg Arg Gly Glu Pro Leu Pro Ser Gln Pro Ala Gly Pro 150 155 160 cgt ggg tca caa gca aac tct ccc cac gcc cac cgc ccc gtg aca gag 638 Arg Gly Ser Gln Ala Asn Ser Pro His Ala His Arg Pro Val Thr Glu 165 170 175 gct tgc gac gag gtg acc gcg tca ccc cag cct gtg gaa acg tgt agc 686 Ala Cys Asp Glu Val Thr Ala Ser Pro Gln Pro Val Glu Thr Cys Ser 180 185 190 195 ttc tgc ttc ccg gag cgc agt tct ccc act cag gag agc gcg ccg cgt 734 Phe Cys Phe Pro Glu Arg Ser Ser Pro Thr Gln Glu Ser Ala Pro Arg 200 205 210 tcg ctc ggg ata cac ggc ttc gcg ggc act gcc gcc ccg cag ccc tgt 782 Ser Leu Gly Ile His Gly Phe Ala Gly Thr Ala Ala Pro Gln Pro Cys 215 220 225 atg cgt gca aca gta ggc ggc ctg ggt gtc ctg cgc gca tcc act ggg 830 Met Arg Ala Thr Val Gly Gly Leu Gly Val Leu Arg Ala Ser Thr Gly 230 235 240 gac gct cgt ccg gca act tg acagcccgaa aaataaaaaa gacaatttag 880 Asp Ala Arg Pro Ala Thr 245 aggatggagt gacagagggg gaaagggatg gagaagagac agatgaagac acgataaagg 940 aagcccggct gcacccacgc agagcaacaa agcaaccacc tgcagcgccc acgttcccag 1000 caccgcctgt gcctgccgct gtgtcctata ctttccagag cagtcaacct gtgccttttt 1060 tctttagtcg agaaagatgg agaatgaccg gcacctagca ttacccttac aattcttaca 1120 aacaagtggt ctttcctatg gccttaggca gatagctgag tgcagtgtgg atgtatttgt 1180 gatttaagta acttgtatgt gtatgtgcag attcggggtt atgtcatatg tgcatgtata 1240 cgtgagttgt gtgtctgtat gagttgtgtg tatatgtgcg cctataaata tgtgtgtgaa 1300 ttctgtgcat gcagatgtgt gtgtacatat gtgtctggct gatgtggtat agccagaaag 1360 atgagggccc ttctaggtga aggccaaaca tctaaaaacc atctaggtga tgggtgctcg 1420 tgccgaattc 1430 <210> 20 <211> 249 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20 Met Ala Met Ala Phe Cys Pro Lys Asp Gln Tyr Trp Asp Ser Ser Arg 1 5 10 15 Lys Ser Cys Val Ser Cys Ala Leu Thr Cys Ser Gln Arg Ser Gln Arg 20 25 30 Thr Cys Thr Asp Phe Cys Lys Phe Ile Asn Cys Arg Lys Glu Gln Gly 35 40 45 Arg Tyr Tyr Asp His Leu Leu Gly Ala Cys Val Ser Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Cys Thr Gln His Pro Gln Gln Cys Ala His Phe Cys Glu Lys Arg Pro 65 70 75 80 Arg Ser Gln Ala Asn Leu Gln Pro Glu Leu Gly Arg Pro Gln Ala Gly 85 90 95 Glu Val Glu Val Arg Ser Asp Asn Ser Gly Arg His Gln Gly Ser Glu 100 105 110 His Gly Pro Gly Leu Arg Leu Ser Ser Asp Gln Leu Thr Leu Tyr Cys 115 120 125 Thr Leu Gly Val Cys Leu Cys Ala Ile Phe Cys Cys Phe Leu Val Ala 130 135 140 Leu Ala Ser Phe Leu Arg Arg Arg Gly Glu Pro Leu Pro Ser Gln Pro 145 150 155 160 Ala Gly Pro Arg Gly Ser Gln Ala Asn Ser Pro His Ala His Arg Pro 165 170 175 Val Thr Glu Ala Cys Asp Glu Val Thr Ala Ser Pro Gln Pro Val Glu 180 185 190 Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Arg Ser Ser Pro Thr Gln Glu Ser 195 200 205 Ala Pro Arg Ser Leu Gly Ile His Gly Phe Ala Gly Thr Ala Ala Pro 210 215 220 Gln Pro Cys Met Arg Ala Thr Val Gly Gly Leu Gly Val Leu Arg Ala 225 230 235 240 Ser Thr Gly Asp Ala Arg Pro Ala Thr 245 <210> 21 <211> 473 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Northern Blot Probe <400> 21 ctgtggacgg gggtggctat gagatcctgc cccgaagagc agtactggga tcctctgctg 60 ggtacctgca tgtcctgcaa aaccatttgc aaccatcaga gccagcgcac ctgtgcagcc 120 ttctgcaggt cactcagctg ccgcaaggag caaggcaagt tctatgacca tctcctgagg 180 gactgcatca gctgtgcctc catctgtgga cagcacccta agcaatgtgc atacttctgt 240 gagaacaagc tcaggagccc agtgaacctt ccaccagagc tcaggagaca gcggagtgga 300 gaagttgaaa acaattcaga caactcggga aggtaccaag gattggagca cagaggctca 360 gaagcaagtc cagctctccc ggggctgaag ctgagtgcag atcaggtggc cctggtctac 420 agcacgctgg ggctctgcct gtgtgccgtc ctctgctgct tcctggtggc ggt 473 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZC20061 <400> 22 ctgtggacag gggtggctat gagat 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC20062 <400> 23 accgccacca ggaagcacag aggac 25 <210> 24 <211> 256 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Northern Blot probe <400> 24 tgcgattctc tggacctgtt tgggactgag cttaataatt tctttggcag ttttcgtgct 60 aatgtttttg ctaaggaaga taagctctga accattaaag gacgagttta aaaacacagg 120 atcaggtctc ctgggcatgg ctaacattga cctggaaaag agcaggactg gtgatgaaat 180 tattcttccg agaggcctcg agtacacggt ggaagaatgc acctgtgaag actgcatcaa 240 gagcaaaccg aaggtc 256 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC21065 <400> 25 tgcgattctc tggacctgtt tg 22 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC21067 <400> 26 gaccttcggt ttgctcttga tg 22 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC24200 <400> 27 acactggggg tctgcctctg 20 <210> 28 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC24201 <400> 28 gcgaagccgt gtatccc 17 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC24198 <400> 29 tctacagcac gctgggg 17 <210> 30 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC24199 <400> 30 gcacaagtgg ggtcgg 16 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC24271 <400> 31 ttattgtaat gcaagtgtg 19 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC24272 <400> 32 tagctgggag tggaaag 17 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC24495 <400> 33 tccaagcgtg accagttcag 20 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC24496 <400> 34 agttggcttc tccatccc 18 <210> 35 <211> 1090 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 taactctcct gaggggtgag ccaagccctg ccatgtagtg cacgcaggac atcaacaaac 60 acagataaca ggaaatgatc cattccctgt ggtcacttat tctaaaggcc ccaaccttca 120 aagttcaagt agtgatatgg atgactccac agaaagggag cagtcacgcc ttacttcttg 180 ccttaagaaa agagaagaaa tgaaactgaa ggagtgtgtt tccatcctcc cacggaagga 240 aagcccctct gtccgatcct ccaaagacgg aaagctgctg gctgcaacct tgctgctggc 300 actgctgtct tgctgcctca cggtggtgtc tttctaccag gtggccgccc tgcaagggga 360 cctggccagc ctccgggcag agctgcaggg ccaccacgcg gagaagctgc cagcaggagc 420 aggagccccc aaggccggcc tggaggaagc tccagctgtc accgcgggac tgaaaatctt 480 tgaaccacca gctccaggag aaggcaactc cagtcagaac agcagaaata agcgtgccgt 540 tcagggtcca gaagaaacag tcactcaaga ctgcttgcaa ctgattgcag acagtgaaac 600 accaactata caaaaaggat cttacacatt tgttccatgg cttctcagct ttaaaagggg 660 aagtgcccta gaagaaaaag agaataaaat attggtcaaa gaaactggtt acttttttat 720 atatggtcag gttttatata ctgataagac ctacgccatg ggacatctaa ttcagaggaa 780 gaaggtccat gtctttgggg atgaattgag tctggtgact ttgtttcgat gtattcaaaa 840 tatgcctgaa acactaccca ataattcctg ctattcagct ggcattgcaa aactggaaga 900 aggagatgaa ctccaacttg caataccaag agaaaatgca caaatatcac tggatggaga 960 tgtcacattt tttggtgcat tgaaactgct gtgacctact tacaccatgt ctgtagctat 1020 tttcctccct ttctctgtac ctctaagaag aaagaatcta actgaaaata ccaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa 1090 <210> 36 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 36 cgcgcggttt aaacgccacc atggatgact ccaca 35 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 37 gtatacggcg cgcctcacag cagtttcaat gc 32 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC17251 <400> 38 tctggacgtc ctcctgctgg tatag 25 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC17252 <400> 39 ggtatggagc aaggggcaag ttggg 25 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC17156 <400> 40 gagtggcaac ttccagggcc aggagag 27 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC17157 <400> 41 cttttgctag cctcaaccct gactatc 27 <210> 42 <211> 813 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 ggcacagcac ggggcgatgg gcgcgtttcg ggccctgtgc ggcctggcgc tgctgtgcgc 60 gctcagcctg ggtcagcgcc ccaccggggg tcccgggtgc ggccctgggc gcctcctgct 120 tgggacggga acggacgcgc gctgctgccg ggttcacacg acgcgctgct gccgcgatta 180 cccgggcgag gagtgctgtt ccgagtggga ctgcatgtgt gtccagcctg aattccactg 240 cggagaccct tgctgcacga cctgccggca ccacccttgt cccccaggcc agggggtaca 300 gtcccagggg aaattcagtt ttggcttcca gtgtatcgac tgtgcctcgg ggaccttctc 360 cgggggccac gaaggccact gcaaaccttg gacagactgc acccagttcg ggtttctcac 420 tgtgttccct gggaacaaga cccacaacgc tgtgtgcgtc ccagggtccc cgccggcaga 480 gccgcttggg tggctgaccg tcgtcctcct ggccgtggcc gcctgcgtcc tcctcctgac 540 ctcggcccag cttggactgc acatctggca gctgaggagt cagtgcatgt ggccccgaga 600 gacccagctg ctgctggagg tgccgccgtc gaccgaagac gccagaagct gccagttccc 660 cgaggaagag cggggcgagc gatcggcaga ggagaagggg cggctgggag acctgtgggt 720 gtgagcctgg ctgtcctccg gggccaccga ccgcagccag cccctcccca ggagctcccc 780 aggccgcagg gctctgcgtt ctgctctggg ccg 813 <210> 43 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC10.134 <400> 43 atcagcggaa ttcagatctt cagacaaaac tcacacatgc ccac 44 <210> 44 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide ZC10135 <400> 44 ggcagtctct agatcattta cccggagaca gggag 35 <210> 45 <211> 768 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (7)..(759) <223> Ig Fc sequence <400> 45 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro 1 5 10 aga tgg gtc ctg tcc gag ccc aga tct tca gac aaa act cac aca tgc 96 Arg Trp Val Leu Ser Glu Pro Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 15 20 25 30 cca ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tca gtc ttc ctc 144 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu 35 40 45 ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg atc tcc cgg acc cct gag 192 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 50 55 60 gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc cac gaa gac cct gag gtc aag 240 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 65 70 75 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 288 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 80 85 90 ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg tac cgt gtg gtc agc gtc ctc 336 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 95 100 105 110 acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 384 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 115 120 125 gtc tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc atc gag aaa acc atc tcc aaa 432 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 130 135 140 gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 480 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 145 150 155 cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc agc ctg acc tgc ctg gtc aaa 528 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 160 165 170 ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aat ggg cag 576 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 175 180 185 190 ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 624 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 195 200 205 tcc ttc ttc ctc tac agc aag ctc acc gtg gac aag agc agg tgg cag 672 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 210 215 220 cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac acc 720 Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Thr 225 230 235 cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa t aatctaga 768 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 240 245 250 <210> 46 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucletide ZC15345 <400> 46 ccgtgcccag cacctgaagc cgagggggca ccgtcagtct tcctcttccc cc 52 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucletide ZC15347 <400> 47 ggattctaga ttttataccc ggagacaggg a 31 <210> 48 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucletide ZC15517 <400> 48 ggtggcggct cccagatggg tcctgtccga gcccagatct tcagacaaaa ctcac 55 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucletide ZC15530 <400> 49 tgggagggct ttgttgga 18 <210> 50 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucletide ZC15518 <400> 50 tccaacaaag ccctcccatc ctccatcgag aaaaccatct cc 42 <210> 51 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucletide ZC15516 <400> 51 ggatggatcc atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatg 57 <210> 52 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucletide primer <400> 52 ctcagccagg aaatccatgc cgagttgaga cgcttccgta gaatgagtgg cctgggccg 59 <210> 53 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucletide primer <400> 53 gcatgtgtga gttttgtctg aagatctggg ctccttcagc cccgggag 48 <210> 54 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucletide primer <400> 54 ctcagccagg aaatccatgc cgagttgaga cgcttccgta gaatgagtgg cctgggccg 59 <210> 55 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucletide primer <400> 55 gcacggtggg catgtgtgag ttttgtctga agatctgggc tccttcagcc ccgggagag 59 <210> 56 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucletide primer <400> 56 gcacagaggc tcagaagcaa gtccagctct cccggggctg aaggagccca gatcttcaga 60 60 <210> 57 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucletide primer <400> 57 ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa tctagattat ttacccggag acaggg 56 <210> 58 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucletide primer <400> 58 ctaacatgtc agcgttattg taatgcaagt gtgaccaatt cagagcccag atcttcaga 59 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody peptide <400> 59 Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Pro Glu Leu Gln Leu Ala 1 5 10 15 Ile Pro Arg Glu 20 <210> 60 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Antibody peptide <400> 60 Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu 1 5 10 15 Val Lys Glu Thr 20

Claims (63)

  1. a) BR43x2 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드;
    b) TACI 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드;
    c) BCMA 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드;
    d) 서열 SEQ ID NO:10 을 포함하는 폴리펩티드;
    e) SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편;
    f) SEQ ID NO:4 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편;
    g) SEQ ID NO:6 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편;
    h) SEQ ID NO:8 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편;
    i) SEQ ID NO:10 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편;
    k) SEQ ID NO:4 의 폴리펩티드
    l) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 1-166 ; 및
    m) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 1-150 으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 포유동물에서 znf4 활성을 저해하는 화합물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 펩티드 결합으로 결합된 제 1 의 부분 및 제 2 의 부분으로 구성되는 융합 단백질이고, 상기 제 1 의 부분은
    a) 서열 SEQ ID NO: 8 을 포함하는 폴리펩티드;
    b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 25-58 을 포함하는 폴리펩티드;
    c) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 34-66 을 포함하는 폴리펩티드;
    d) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 71-104 를 포함하는 폴리펩티드;
    e) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 25-104 를 포함하는 폴리펩티드;
    f) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 8-37 을 포함하는 폴리펩티드;
    g) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 41-88 을 포함하는 폴리펩티드;
    h) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 8-88 을 포함하는 폴리펩티드;
    로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하고, 상기 제 2 의 부분은 다른 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 제 1 의 부분은
    a) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 59-120 ;
    b) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 105-166 ; 및
    c) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 89-150 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  4. 제 2 항에 있어서, 상기 제 1 의 부분은
    a) BR43×2 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드;
    b) TACI 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 및
    c) BCMA 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 제 1 의 부분은
    a) SEQ ID NO:4 의 폴리펩티드
    b) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 1-154 ; 및
    c) SEQ ID NO: 8 의 아미노산 잔기 1-48 로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 제 2 의 부분은 면역글로블린 중쇄 항상 부위인 것을 특징으로 하는 화합물.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은
    a) 다클론 항체;
    b) 뮤린 단일클론 항체;
    c) b) 로부터 유래된 인간화 항체; 및
    d) 인간 단일클론 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 항체 단편은 F(ab') , F(ab) , Fab', Fab, Fv, scFv, 및 최소한의 인지 단위로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 포유동물은 영장류인 것을 특징으로 하는 화합물.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 ztnf4 활성은 B 림프구와 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 ztnf4 활성은 활성화된 B 림프구와 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 ztnf4 활성은 휴지 B 림프구와 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 ztnf4 활성은 항체 생산과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 항체 생산은 자가면역질환과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 자가면역질환은 전신성 홍반성 루프스, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 또는 류마티스양관절염인 것을 특징으로 하는 화합물.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 ztnf4 활성은 천식, 기관지염 또는 기종과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 ztnf4 활성은 말기 신부전과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 ztnf4 활성은 신질환과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 신질환은 사구체신염, 맥관염, 또는 신장염 또는 신우신염인 것을 특징으로 하는 화합물.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기는 신종양, 다발성 골수종, 림프종, 경쇄 신경병증 또는 아밀로이드증과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  21. 제 1 항에 있어서, 상기 ztnf4 활성은 효과기 T 세포와 관련되는 것을 특징으로하는 화합물.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 ztnf4 활성은 면역반응 조절과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  23. 제 21 항에 있어서, 상기 활성은 면역억제와 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  24. 제 21 항에 있어서, 상기 면역억제는 이식편거부, 이식편대숙주질환 또는 염증과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 활성은 자가면역질환과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 자가면역질환은 인슐린 의존 진성당뇨병 또는 크론질환인 것을 특징으로 하는 화합물.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 ztnf4 활성은 염증과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 염증은 관절통, 종창, 빈혈, 또는 패혈성쇽과 관련되어있는 것을 특징으로 하는 화합물.
  29. a)BR43x2 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드;
    b)TACI 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드;
    c)BCMA 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드;
    d)서열 SEQ ID NO:10 을 포함하는 폴리펩티드;
    e)SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편;
    f)SEQ ID NO:4 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편;
    g)SEQ ID NO:6 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편;
    h)SEQ ID NO:8 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편;
    i)SEQ ID NO:10 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편;
    j)SEQ ID NO:18 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편;
    k)SEQ ID NO:20 의 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항체 단편;
    l)SEQ ID NO:4 의 폴리펩티드;
    m)SEQ ID NO: 6 의 아미노산 잔기 1-166; 및;
    n)SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 1-150 으로 구성되는 군으로부터 선택되는, BR43x2, TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합을 저해하는 화합물.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 화합물은 펩티드 결합으로 결합된 제 1 의 부분 및 제 2 의 부분으로 구성되는 융합 단백질이고, 상기 제 1 의 부분은
    a) 서열 SEQ ID NO:8 을 포함하는 폴리펩티드;
    b) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 25-58 을 포함하는 폴리펩티드;
    c) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 34-66 을 포함하는 폴리펩티드;
    d) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 71-104 를 포함하는 폴리펩티드;
    e) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 25-104 를 포함하는 폴리펩티드;
    f) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 8-37 을 포함하는 폴리펩티드;
    g) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 41-88 을 포함하는 폴리펩티드;
    h) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 8-88 을 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 포함하고; 상기 제 2 의 부분은 다른 폴리펩티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 제 1 의 부분은
    a) SEQ ID NO:2 의 아미노산 잔기 59-120 ;
    b) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 105-166 ; 및
    c) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 89-150 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 화합물.
  32. 제 30 항에 있어서, 상기 제 1 의 부분은
    a) BR43x2 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드;
    b) TACI 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드;
    c) BCMA 의 세포외 도메인을 포함하는 폴리펩티드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  33. 제 30 항에 있어서, 상기 제 1 의 부분은
    a) SEQ ID NO:4 의 폴리펩티드;
    b) SEQ ID NO:6 의 아미노산 잔기 1-154; 및
    c) SEQ ID NO:8 의 아미노산 잔기 1-48 로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  34. 제 30 항에 있어서, 상기 제 2 의 부분은 면역글로블린 중쇄 항상 부위인 것을 특징으로 하는 화합물.
  35. 제 29 항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은
    a) 다클론 항체;
    b) 뮤린 단일클론 항체;
    c) b)로부터 유래된 인간화 항체; 및
    d) 인간 단일클론 항체로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 항체 단편은 F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv, 및 최소 인지 단위로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  37. 제 29 항에 있어서, 상기 BR43x2 , TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 B 림프구와 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  38. 제 29 항에 있어서, 상기 BR43x2, TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 활성화된 B 림프구와 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  39. 제 29 항에 있어서, 상기 BR43x2 , TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 휴지 B 림프구와 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  40. 제 29 항에 있어서, 상기 BR43x2 , TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 항체 생산과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  41. 제 29 항에 있어서, 상기 항체 생산은 자가면역질환과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  42. 제 41 항에 있어서, 상기 자가면역질환은 전신성 홍반성 루프스, 중증 근무력증, 다발성 경화증, 또는 류마티스양관절염인 것을 특징으로 하는 화합물.
  43. 제 29 항에 있어서, 상기 BR43x2 , TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 천식, 기관지염 또는 기종인 것을 특징으로 하는 화합물.
  44. 제 29 항에 있어서, 상기 BR43x2 , TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 말기 신부전과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  45. 제 29 항에 있어서, 상기 BR43x2 , TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 신질환과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 신질환은 사구체신염, 맥관염, 신장염 또는 신우신염인 것을 특징으로 하는 화합물.
  47. 제 29 항에 있어서, 상기 수용체-리간드 결합은 신종양, 다발성 골수종, 림프종, 경쇄 신경병증 또는 아밀로이드증과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  48. 제 29 항에 있어서, 상기 BR43x2 , TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 효과기 T 세포와 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  49. 제 48 항에 있어서, 상기 BR43x2 , TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 면역반응의 조절과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 수용체-리간드 결합은 면역억제와 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  51. 제 50 항에 있어서, 상기 면역억제는 이식편거부, 이식편대숙주질환 또는 염증과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  52. 제 50 항에 있어서, 상기 수용체-리간드 결합은 자가면역질환과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  53. 제 52 항에 있어서, 상기 자가면역질환은 인슐린 의존 진성당뇨병 또는 크론 질환인 것을 특징으로 하는 화합물.
  54. 제 50 항에 있어서, 상기 BR43x2 , TACI 또는 BCMA 수용체-리간드 결합은 염증과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 염증은 관절통, 종창, 빈혈, 또는 패혈성쇽과 관련되는 것을 특징으로 하는 화합물.
  56. SEQ ID NO:2 의 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  57. SEQ ID NO:1 의 분리된 폴리뉴클레오티드 분자.
  58. 다음의 작동가능하게 연결된 요소들:
    전사 프로모터;
    제 56 항에 따른 폴리뉴클레오티드 분자; 및
    전사 종결자를 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터.
  59. 제 58 항에 따른 발현 벡터가 도입된 배양세포로서, 이 배양 세포는 상기 폴리뉴클레오티드 절편에 의해 암호화된 상기 폴리펩티드를 발현하는 것을 특징으로 하는 세포.
  60. 폴리펩티드를 생산하는 방법으로서,
    세포가 상기 폴리뉴클레오티드 분자에 의해 암호화된 상기 폴리펩티드를 발현하도록 제 58 항에 따른 발현 벡터가 도입된 세포를 배양하는 단계; 및
    상기 발현 폴리펩티드를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 서열 SEQ ID NO:2 를 가지는 것을 특징으로 하는 분리된 폴리펩티드.
  62. 제 62 항에 있어서, 제약학적으로 허용가능한 운반체와 조합되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드.
  63. 삭제
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Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6689579B1 (en) 1996-10-25 2004-02-10 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding neutrokine-α
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
US6689607B2 (en) 1997-10-21 2004-02-10 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor, necrosis factor receptor-like proteins TR11, TR11SV1 and TR11SV2
US6503184B1 (en) 1997-10-21 2003-01-07 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor-like proteins TR11, TR11SV1 and TR11SV2
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
NZ512753A (en) * 1999-01-07 2003-10-31 Zymogenetics Inc Soluble receptor BR43x2 related proteins useful for inhibiting ztnf4
NZ513284A (en) 1999-01-25 2003-10-31 Biogen Inc BAFF blocking agents and their use in the stimulation and inhibition of B-cells and immunoglobulins in immune responses
US20030095967A1 (en) 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
US20030022233A1 (en) 1999-04-30 2003-01-30 Raymond G. Goodwin Methods of use of the taci/taci-l interaction
AU4986700A (en) 1999-05-06 2000-11-21 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
MXPA02001665A (es) 1999-08-17 2003-07-14 Biogen Inc Receptor de baff (bcma) como agente inmunorregulador.
UA74798C2 (uk) * 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
AU3695801A (en) * 2000-02-11 2001-11-20 Amgen, Inc. Receptor from tnf family
US20040002068A1 (en) * 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US6969519B2 (en) 2000-03-10 2005-11-29 Human Genome Sciences, Inc. Methods of using an agonistic antibody human tumor necrosis factor receptor (TR17)
SI1297013T1 (sl) * 2000-04-27 2007-06-30 Biogen Idec Inc Uporaba TACI kot protitumorskega sredstva
EP1746106A3 (en) * 2000-04-27 2007-03-14 Biogen Idec MA Inc. Use of TACI as an anti-tumor agent
US7371388B1 (en) 2000-05-04 2008-05-13 Human Genome Sciences, Inc. Treatment of Sjogren's syndrome by administration of TR18 polypeptides
JP2003533218A (ja) 2000-05-12 2003-11-11 アムジエン・インコーポレーテツド Ａｐｒｉｌ／ｇ７０、ｂｃｍａ、ｂｌｙｓ／ａｇｐ−３及びｔａｃｉに関する物質の組成物及び使用方法
AU2001268427B2 (en) 2000-06-16 2007-03-29 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to blys
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
US7220840B2 (en) 2000-06-16 2007-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator protein
US20030091565A1 (en) 2000-08-18 2003-05-15 Beltzer James P. Binding polypeptides and methods based thereon
EP2267018A3 (en) * 2000-08-18 2011-04-20 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides for B lymphocyte stimulator protein (BLyS)
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
AU2002215753A1 (en) * 2000-12-07 2002-06-18 The University Of British Columbia Caml-binding peptides
JP2004533997A (ja) * 2001-02-20 2004-11-11 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド Ｂｃｍａ及びｔａｃｉの両者を結合する抗体
IL158719A0 (en) 2001-05-11 2004-05-12 Amgen Inc Peptides and related molecules that bind to tall-1
EP2116259B1 (en) 2001-05-24 2012-01-25 ZymoGenetics, Inc. TACI-immunoglobulin fusion proteins
CN1636067A (zh) * 2001-08-03 2005-07-06 杰南技术公司 TACls和BR3多肽及其用途
WO2003013582A1 (en) * 2001-08-06 2003-02-20 Genset S.A. Genoxit agonists and antagonists for use in the treatment of metabolic disorders
WO2003045421A1 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Genset S.A. Agonists and antagonists of ryzn for the treatment of metabolic disorders
WO2004094620A2 (en) 2003-03-28 2004-11-04 Biogen Idec Ma Inc. Truncated baff receptors
US20050095243A1 (en) 2003-06-05 2005-05-05 Genentech, Inc. Combination therapy for B cell disorders
EP1709072A1 (en) 2004-01-29 2006-10-11 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of bcma and uses thereof
WO2006001023A2 (en) * 2004-06-28 2006-01-05 Yeda Research And Development Co. Ltd Chimeric proteins and uses thereof
EP1836224A1 (en) 2004-12-23 2007-09-26 Laboratoires Serono S.A. Bcma polypeptides and uses thereof
UA93516C2 (ru) 2005-08-09 2011-02-25 Займоджинетикс, Инк. Способы лечения b-клеточных злокачественных образований c помощью слитой молекулы taci-ig
AU2006278227B2 (en) * 2005-08-09 2011-10-20 Ares Trading S.A. Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using TACI-fusion molecules
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
CA2626082C (en) * 2005-10-13 2017-04-11 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
CA2629306A1 (en) 2005-11-23 2007-05-31 Genentech, Inc. Methods and compositions related to b cell assays
US8211649B2 (en) 2006-03-31 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Methods of diagnosing and prognosing hodgkin's lymphoma
NZ572373A (en) 2006-05-15 2012-02-24 Ares Trading Sa Methods for treating rheumatoid arthritis using a taci-ig fusion molecule
PL2061803T5 (pl) 2006-08-28 2023-03-27 Ares Trading S.A. Proces oczyszczania białek zawierających fc
ES2366593T3 (es) 2007-01-26 2011-10-21 Merck Serono S.A. Purificación de proteínas de fusión taci-fc empleando la tecnología de cuerpos grasos.
PL2233149T3 (pl) 2007-10-16 2016-08-31 Zymogenetics Inc Kombinacja przezbłonowego aktywatora i ligandu cyklofiliny (taci) oraz przeciwciała anty-cd20 do leczenia chorób autoimmunologicznych
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
CN102421801B (zh) 2009-03-10 2016-03-16 比奥根Ma公司 抗-bcma抗体
CN107385034B (zh) 2009-09-03 2021-08-17 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 用于治疗、诊断和监控类风湿性关节炎的方法
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
WO2012066058A1 (en) 2010-11-16 2012-05-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
CN103502472B (zh) 2011-02-28 2017-06-06 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 生物标记物和用于预测对b‑细胞拮抗剂的响应的方法
UA112434C2 (uk) 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
AU2013215332A1 (en) 2012-01-31 2014-09-04 Genentech, Inc. Anti-Ig-E M1' antibodies and methods using same
TW201425336A (zh) * 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
EP2953974B1 (en) 2013-02-05 2017-12-20 EngMab Sàrl Bispecific antibodies against cd3epsilon and bcma
US9458246B2 (en) 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
JOP20140087B1 (ar) 2013-03-13 2021-08-17 Amgen Inc بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها
PT3126383T (pt) 2014-04-03 2019-03-22 Igm Biosciences Inc Cadeia j modificada
AU2016209324B2 (en) 2015-01-20 2020-02-27 Igm Biosciences, Inc. Tumor necrosis factor (TNF) superfamily receptor binding molecules and uses thereof
CN108463472A (zh) 2015-09-30 2018-08-28 Igm生物科学有限公司 具有修饰的j-链的结合分子
CA2999284C (en) 2015-09-30 2023-06-13 Igm Biosciences A/S Binding molecules with modified j-chain
CA3029209A1 (en) 2016-06-21 2017-12-28 Teneobio, Inc. Cd3 binding antibodies
CR20220408A (es) 2016-09-14 2022-10-20 Teneobio Inc ANTICUERPOS DE UNIÓN A CD3(Divisional del Expediente 2019-198)
BR112019008426A2 (pt) 2016-11-02 2019-09-03 Engmab Sarl anticorpo biespecífico contra bcma e cd3 e um fármaco imunológico para uso combinado no tratamento de mieloma múltiplo
CN116284402A (zh) 2016-12-21 2023-06-23 特尼奥生物股份有限公司 仅有重链的抗bcma抗体
WO2018170325A1 (en) * 2017-03-15 2018-09-20 Juneau Biosciences, L.L.C. Methods of using genetic markers associated with endometriosis
CA3067584A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 Teneobio, Inc. Anti-bcma heavy chain-only antibodies
KR20210016390A (ko) 2018-06-01 2021-02-15 노파르티스 아게 Bcma에 대한 결합 분자 및 이의 용도
CN111944047B (zh) * 2019-05-15 2022-04-08 重庆精准生物技术有限公司 抗bcma的人源化单链抗体及应用
EA202290054A1 (ru) 2019-06-14 2022-03-25 Тенеобио, Инк. Полиспецифические антитела, содержащие только тяжелые цепи, которые связываются с cd22 и cd3
JP2023526774A (ja) 2020-04-29 2023-06-23 テネオバイオ， インコーポレイテッド 重鎖定常領域が修飾された多重特異性重鎖抗体
CN115812077A (zh) 2020-05-08 2023-03-17 高山免疫科学股份有限公司 April和baff抑制性免疫调节蛋白及其使用方法
JP2023540705A (ja) 2020-08-28 2023-09-26 サナ バイオテクノロジー，インコーポレイテッド 修飾された抗ウイルス結合剤
PE20240641A1 (es) 2021-05-07 2024-04-04 Alpine Immune Sciences Inc Metodos de dosificacion y tratamiento con una proteina inmunomoduladora de fusion taci-fc
WO2024077018A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4615974A (en) 1981-08-25 1986-10-07 Celltech Limited Yeast expression vectors
US4579821A (en) 1981-11-23 1986-04-01 University Patents, Inc. Control of DNA sequence transcription
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US4486533A (en) 1982-09-02 1984-12-04 St. Louis University Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element
US4599311A (en) 1982-08-13 1986-07-08 Kawasaki Glenn H Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor
US4977092A (en) 1985-06-26 1990-12-11 Amgen Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
US4661454A (en) 1983-02-28 1987-04-28 Collaborative Research, Inc. GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
US5139936A (en) 1983-02-28 1992-08-18 Collaborative Research, Inc. Use of the GAL1 yeast promoter
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
ATE54167T1 (de) 1984-12-06 1990-07-15 Fina Research Promotoren fuer die expression von fremden genen in hefe, plasmide, die diese promotoren enthalten, sowie deren verwendung zur herstellung von polypeptiden.
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4882279A (en) 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
GB8611832D0 (en) 1986-05-15 1986-06-25 Holland I B Polypeptide
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5063154A (en) 1987-06-24 1991-11-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Pheromone - inducible yeast promoter
US5637677A (en) 1987-07-16 1997-06-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Biologically active compounds and methods of constructing and using the same
DE721983T1 (de) 1988-01-22 2002-07-04 Zymogenetics, Inc. Verfahren zur herstellung von biologisch-aktive Dimerpeptiden
US5567584A (en) 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5037743A (en) 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5162228A (en) 1988-12-28 1992-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Gylceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and promoter
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5162222A (en) 1989-07-07 1992-11-10 Guarino Linda A Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses
SG46445A1 (en) 1990-01-26 1998-02-20 Immunomedics Inc Vaccines against cancer and infectious diseases
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
US5208146A (en) 1990-11-05 1993-05-04 The Regents Of The University Of California Murine monoclonal anti-idiotype antibodies
AU4387193A (en) 1992-05-29 1993-12-30 Abbott Laboratories Ligase chain reaction starting with rna sequences
EP0749319A1 (en) 1992-09-14 1996-12-27 Pfizer Inc. Immortalized cells and uses therefor
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
JP2000500014A (ja) 1995-11-09 2000-01-11 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド ピヒア・メタノリカ中で異種ポリペプチドを生産するための組成物と方法
US5716808A (en) 1995-11-09 1998-02-10 Zymogenetics, Inc. Genetic engineering of pichia methanolica
US5736383A (en) 1996-08-26 1998-04-07 Zymogenetics, Inc. Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants
CA2261151C (en) 1996-07-17 2003-09-16 Zymogenetics, Inc. Transformation of pichia methanolica
JP2002514049A (ja) 1996-07-17 2002-05-14 ザイモジェネティクス，インコーポレイティド ピヒア・メタノリカの栄養要求性突然変異体の製造
WO1998018921A1 (en) 1996-10-25 1998-05-07 Human Genome Sciences, Inc. NEUTROKINE $g(a)
US5969102A (en) * 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) * 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
AU743490B2 (en) * 1997-06-06 2002-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. NTN-2 member of TNF ligand family
JP2002517977A (ja) * 1997-06-06 2002-06-18 リジェネロン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド Ｔｎｆリガンドファミリーのｎｔｎ−２メンバー
NZ512753A (en) * 1999-01-07 2003-10-31 Zymogenetics Inc Soluble receptor BR43x2 related proteins useful for inhibiting ztnf4

Also Published As

Publication number Publication date
BG65603B1 (bg) 2009-02-27
HU230024B1 (hu) 2015-05-28
IL144029A0 (en) 2002-04-21
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EP2256199A1 (en) 2010-12-01
CN1342202A (zh) 2002-03-27
EP1141274A2 (en) 2001-10-10
AU780805B2 (en) 2005-04-21
EP1642973A1 (en) 2006-04-05
EA007471B1 (ru) 2006-10-27
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UA74330C2 (uk) 2005-12-15
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CA2753331A1 (en) 2000-07-13
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ES2204502T3 (es) 2004-05-01
AU2408400A (en) 2000-07-24
EA200100621A1 (ru) 2002-04-25
CA2358520A1 (en) 2000-07-13
HK1041497B (zh) 2004-06-18
JP2012001550A (ja) 2012-01-05
DE60005135D1 (de) 2003-10-16
ATE453712T1 (de) 2010-01-15
NO331902B1 (no) 2012-04-30
EP1354598A3 (en) 2003-11-19
PL364817A1 (en) 2004-12-13
DE60043626D1 (de) 2010-02-11
ATE249517T1 (de) 2003-09-15
DE60005135T3 (de) 2015-04-09
KR20010105322A (ko) 2001-11-28
DE60005135T2 (de) 2004-07-15
CN101518648A (zh) 2009-09-02
ATE437227T1 (de) 2009-08-15
PT1141274E (pt) 2004-02-27
DE60042617D1 (de) 2009-09-03
EP1141274B1 (en) 2003-09-10
ES2204502T5 (es) 2015-01-21
CZ303272B6 (cs) 2012-07-11
HUP0200429A2 (en) 2002-06-29
IL144029A (en) 2009-11-18
EE05539B1 (et) 2012-04-16
EP1642972A1 (en) 2006-04-05
EP1354598A2 (en) 2003-10-22
TR200101998T2 (tr) 2002-06-21
NO333915B1 (no) 2013-10-21
EP1141274B2 (en) 2014-11-12
CA2358520C (en) 2011-12-13
DK1141274T3 (da) 2003-12-29
SK9712001A3 (en) 2002-02-05
PL211033B1 (pl) 2012-04-30
EP1642973B1 (en) 2009-07-22

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