Patents
Search within
Search within the title, abstract, claims, or full patent document: You can restrict your search to a specific field using field names.
Use TI= to search in the title, AB= for the abstract, CL= for the claims, or TAC= for all three. For example, TI=(safety belt).
Search by Cooperative Patent Classifications (CPCs): These are commonly used to represent ideas in place of keywords, and can also be entered in a search term box. If you're searching forseat belts, you could also search for B60R22/00 to retrieve documents that mention safety belts or body harnesses. CPC=B60R22 will match documents with exactly this CPC, CPC=B60R22/low matches documents with this CPC or a child classification of this CPC.
Learn More
Title
Abstract
Claims
Full Document
Find patents
Keywords and boolean syntax (USPTO or EPO format): seat belt searches these two words, or their plurals and close synonyms. "seat belt" searches this exact phrase, in order. -seat -belt searches for documents not containing either word.
For searches using boolean logic, the default operator is AND with left associativity. Note: this means safety OR seat belt is searched as (safety OR seat) AND belt. Each word automatically includes plurals and close synonyms. Adjacent words that are implicitly ANDed together, such as (safety belt), are treated as a phrase when generating synonyms.
Learn More
Search by
Chemistry searches match terms (trade names, IUPAC names, etc. extracted from the entire document, and processed from .MOL files.)
Substructure (use SSS=) and similarity (use ~) searches are limited to one per search at the top-level AND condition. Exact searches can be used multiple times throughout the search query.
Searching by SMILES or InChi key requires no special syntax. To search by SMARTS, use SMARTS=.
To search for multiple molecules, select "Batch" in the "Type" menu. Enter multiple molecules separated by whitespace or by comma.
Learn More
Patent numbers
Search specific patents by importing a CSV or list of patent publication or application numbers.
Zastosowanie białka fuzyjnego
PL209535B1
Poland
- Other languages
English - Inventor
Jane A. Gross Wenfeng Xu Karen L. Madden David P. Yee
Description
translated from
Podstawa wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka fuzyjnego.
Oddziaływania komórkowe, które występują podczas odpowiedzi immunologicznej są regulowane przez członków wielu rodzin powierzchniowych receptorów komórkowych, włączając rodzinę receptora nekrotycznego czynnika nowotworowego (TNFR). Rodzina TNFR składa się z szeregu integralnych receptorów glikoproteinowych, z których wiele, w połączeniu z odpowiadającymi im ligandami, reguluje oddziaływaniami pomiędzy różnymi liniami komórek krwiotwórczych (Smith i wsp., The TNF Receptor Superfamily of Cellular and Viral Proteins: Activation, Costimulation and Death, 76: 959-62, 1994; Cosman, Stem Celles 12: 440-55, 1994).
Jednym z takich receptorów jest TACI, transbłonowy aktywator oraz interaktor CAML (von Bulow i Bram, Science 228: 134-41, 1997 i publikacja WIPO, WO 98/39361). TACI jest receptorem związanym z błoną, posiadającym domenę zewnątrzkomórkową posiadającą dwa pseudo-powtórzenia bogate w cysteinę, domenę transbłonową oraz domenę cytoplazmatyczną, która oddziałuje z CAML (modulator wapniowy i ligand cyklofiliny), integralnym białkiem błonowym zlokalizowanym w wewnątrzkomórkowych pęcherzykach, które jest ko-induktorem aktywacji NF-AT, kiedy jest nadprodukowane w komórkach Jurkat'a. TACI jest związane z limfocytami B i podtypem limfocytów T. Von Bulow i Bram (ibid.) twierdzą , ż e nie jest znany ligand dla TACI.
Wykryto, że polipeptyd opisany w niniejszym wynalazku, będący izoformą TACI posiadającą tylko jedno pseudo-powtórzenie bogate w cysteinę (BR43x2), TACI oraz pokrewne białko z limfocytów B, BCMA (Gras et al., Int. Immunol. 17: 1093-106, 1995) wiążą się z ligandem TNF, ztnf4, znanym jako neurokina α (publikacja WIPO, WO 98/18921), BLyS (Moore et al., Science, 285: 260-3, 1999), BAFF (Schneider et al., J. Exp. Med. 189: 1747-56, 199), TALL-1 (Shu et al., J. Leukoc. Biol. 65: 680-3, 1999) czy THANK (Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem. 274: 15978-81, 1999). Ze względu na to, BR43x2, TACI oraz BCMA będą przydatne w regulowaniu aktywności ztnf4, a w szczególności aktywacji limfocytów B.
Na koniec, opisane też są białkowe substancje terapeutyczne dla modulowania aktywności ztnf4 lub innych ligandów BR43x2, TACI czy BCAM, kompozycje pokrewne oraz sposoby jak również inne zastosowania oczywiste dla specjalistów.
Streszczenie wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie białka fuzyjnego składającego się z pierwszej części i drugiej części połączonych wiązaniem peptydowym, przy czym wspomniana pierwsza część stanowi reszty aminokwasowe 25-104 SEQ ID nr: 6 i wspomniana druga część jest regionem stałym ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, do wytwarzania leku do leczenia astmy, zapalenia oskrzeli, rozedmy płuc, zapalenia nerek, odmiedniczkowego zapalenia nerek, neuropatii lekkiego łańcucha, skrobawicy, kłębuszkowego zapalenia nerek, nefropatii IgA, choroby Berger'a, nefropatii IgM, choroby Goodpasteur'a, postzakaźnego zapalenia kłębuszków nerkowych, błoniastorozplemowego kłebuszkowego zapalenia nerek, zmian minimalnych w zespole nerczycowym lub zapalenia naczyń krwionośnych związanych z toczniem ukł adowym u czł owieka przez hamowanie sprzę gania ztnf4-receptor BR43x2, TACI lub BCMA.
Korzystnie, stały region łańcucha ciężkiego immunoglobuliny jest regionem stałym łańcuch ciężkiego immunoglobuliny ludzkiej, a bardziej korzystnie łańcucha immunoglobuliny ludzkiej IgG1.
Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku, lek zawiera multimer wspomnianego białka fuzyjnego.
Bardziej korzystnie, wspomniany lek zawiera stały region ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, który zawiera dwie domeny stałego regionu a nie zawiera regionu zmiennego.
Metoda hamowania aktywności ztnf4 u ssaka obejmuje podawanie temu ssakowi porcji związku wyselekcjonowanego z grupy składającej się z: a) polipeptydu obejmującego zewnątrzkomórkową domenę z BR43x2; b) polipeptydu obejmującego zewnątrzkomórkową domenę z TACI; c) polipeptydu obejmującego zewnątrzkomórkową domenę z BCMA; d) polipeptydu obejmującego sekwencję SEQ ID NO: 10; e) przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, który swoiście wiąże się z polipeptydem z SEQ ID NO: 2; f) przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, który swoiście wiąże się z polipeptydem z SEQ ID NO: 4; g) przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, który swoiście wiąże się z polipeptydem z SEQ ID NO: 6; h) przeciwciała lub fragmentu przeciwciała, który swoiście wiąże się z polipeptydem z SEQ ID NO: 8; i) przeciwciał a lub fragmentu przeciwciała, który swoiś cie wiąże się z polipeptydem
PL 209 535 B1 z SEQ ID NO: 10; k) polipeptydu z SEQ ID NO: 4; 1) reszt aminokwasowych 1-166 z SEQ ID NO: 6 oraz m) reszt aminokwasowych 1-150 z SEQ ID NO: 8.
Związek opisany w wynalazku jest białkiem fuzyjnym zawierającym pierwszą i drugą część połączone wiązaniem peptydowym, gdzie omawiana część pierwsza obejmuje polipeptyd wyselekcjonowany z grupy składającej się z: a) polipeptydu obejmującego sekwencję SEQ ID NO: 8; b) polipeptydu obejmującego reszty aminokwasowe 25-58 z SEQ ID NO: 2; c) polipeptydu obejmującego reszty aminokwasowe 34-66 z SEQ ID NO: 6; d) polipeptydu obejmującego reszty aminokwasowe 71-104 z SEQ ID NO: 6; e) polipeptydu obejmują cego reszty aminokwasowe 25-104 z SEQ ID NO: 6; f) polipeptydu obejmującego reszty aminokwasowe 8-37 z SEQ ID NO: 8; g) polipeptydu obejmującego reszty aminokwasowe 41-88 z SEQ ID NO: 8; h) polipeptydu obejmującego reszty aminokwasowe 8-88 z SEQ ID NO: 8 a omawiana część druga obejmuje inny polipeptyd. Część pierwsza może obejmować dodatkowo polipeptyd wyselekcjonowany z grupy składającej się z: a) reszt aminokwasowych 59-120 z SEQ ID NO: 2; b) reszt aminokwasowych 105-166 z SEQ ID NO: 6 oraz c) reszt aminokwasowych 89-150 z SEQ ID NO: 8. Część pierwsza może być wyselekcjonowana z grupy składającej się z: a) polipeptydu obejmującego domenę zewnątrzkomórkową z BR43x2; b) polipeptydu obejmującego domenę zewnątrzkomórkową z TACI oraz c) polipeptydu obejmującego domenę zewnątrzkomórkową z BCMA.
Część pierwsza może być także wyselekcjonowana z grupy składającej się z: a) polipeptydu z SEQ ID NO: 4; b) reszt aminokwasowych 1-154 z SEQ ID NO: 6 oraz c) reszt aminokwasowych 1-48 z SEQ ID NO: 8. W innym wykonaniu część druga jest regionem stałym ciężkiego łańcucha immunoglobulinowego.
Przeciwciało lub fragment przeciwciała może być wyselekcjonowany z grupy składającej się z: a) przeciwciała poliklonalnego; b) mysiego przeciwciała monoklonalnego; c) humanizowanego przeciwciała pochodzącego z b) oraz d) ludzkiego przeciwciała monoklonalnego. Fragment przeciwciała może być wyselekcjonowany z grupy składającej się z F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv oraz minimalnej jednostki rozpoznającej. W innym wykonaniu ssak należy do naczelnych.
Aktywność ztnf4 związana jest z limfocytami B, w innym wykonaniu aktywność ztnf4 związana jest z aktywowanymi limfocytami B, w jeszcze innym wykonaniu omawiana aktywność ztnf4 związana jest ze spoczynkowymi limfocytami B, w innym wykonaniu aktywność ztnf4 związana jest z produkcją przeciwciał, w tym z chorobą autoimmunologiczną. Omawiana choroba autoimmunologiczna jest układowym toczeniem rumieniowatym, ciężką miastenią, stwardnieniem rozsianym lub reumatoidalnym zapaleniem stawów. W innym wykonaniu aktywność ztnf4 związana jest z astmą, zapaleniem oskrzeli lub rozedmą płuc. W jeszcze innym wykonaniu aktywność ztnf4 związana jest z końcowym stadium niewydolności nerek. W jeszcze innym wykonaniu aktywność ztnf4 związana jest z chorobą nerek. W pokrewnym wykonaniu choroba nerek jest zapaleniem kłębuszków nerkowych, zapaleniem naczyń, zapaleniem nerek lub odmiedniczkowym zapaleniem nerek. W jeszcze innym wykonaniu jest związana z neuropatią lekkiego łańcucha lub skrobiawicą. W innym wykonaniu aktywność ztnf4 związana jest z efektorowymi limfocytami T. W pokrewnym wykonaniu aktywność ztnf4 związana jest z umiarkowaną odpowiedzią immunologiczną. W jeszcze innym wykonaniu aktywność związana jest z immunosupresją. W jeszcze innym wykonaniu immunosupresja związana jest z odrzuceniem przeszczepu, reakcją przeszczepu przeciw gospodarzowi lub zapaleniem. W innym wykonaniu aktywność związana jest z chorobą autoimmunologiczną. W pokrewnym wykonaniu choroba autoimmunologiczną jest cukrzycą insulinozależną lub chorobą Crohn'a. W innym wykonaniu aktywność ztnf4 związana jest z zapaleniem. W pokrewnym wykonaniu zapalenie zwią zane jest z bólem stawowym, obrz ę kiem, anemią lub wstrząsem septycznym. W innym aspekcie wynalazek dostarcza sposobu hamowania sprzęgania receptora BR43x2, TACI lub BCMA z ligandem obejmującego podawanie porcji związku jak opisano powyżej. W innym wykonaniu sprzęganie receptora BR43x2, TACI lub BCMA z ligandem związane jest z limfocytami B. W innym pokrewnym wykonaniu sprzęganie receptora BR43x2, TACI lub BCMA z ligandem związane jest z aktywowanymi limfocytami B. W jeszcze innym wykonaniu sprzęganie receptora BR43x2, TACI lub BCMA z ligandem związane jest ze spoczynkowymi limfocytami B.
W innym wykonaniu sprzę ganie receptora BR43x2, TACI lub BCMA z ligandem zwią zane jest z produkcją przeciwciał . W pokrewnym wykonaniu produkcja przeciwcia ł związana jest z chorobą autoimmunologiczną. W pokrewnym wykonaniu omawiana choroba autoimmunologiczną jest układowym toczeniem rumieniowatym, ciężką miastenią, stwardnieniem rozsianym lub zapaleniem stawów reumatoidalnym. W innym wykonaniu sprzęganie receptora BR43x2, TACI lub BCMA z ligandem związane jest
PL 209 535 B1 z astmą , zapaleniem oskrzeli lub rozedmą pł uc. W jeszcze innym wykonaniu sprzę ganie receptora BR43x2, TACI lub BCMA z ligandem związane jest z końcowym stadium niewydolności nerek.
W jeszcze innym wykonaniu sprzę ganie receptora BR43x2, TACI lub BCMA z ligandem związane jest z chorobą nerek. W pokrewnym wykonaniu choroba nerek jest zapaleniem kłębuszków nerkowych, zapaleniem naczyń, zapaleniem nerek lub odmiedniczkowym zapaleniem nerek. W jeszcze innym wykonaniu omawiana choroba nerek związana jest z neuropatią lekkiego łańcucha lub skrobiawicą. W innym wykonaniu sprzęganie receptora BR43x2, TACI lub BCMA z ligandem związane jest z efektorowymi limfocytami T. W pokrewnym wykonaniu sprzę ganie receptora BR43x2, TACI lub BCMA z ligandem związane jest z umiarkowaną odpowiedzią immunologiczną. W jeszcze innym wykonaniu aktywność związana jest z immunosupresją. W jeszcze innym wykonaniu immunosupresja związana jest z odrzuceniem przeszczepu, reakcją przeszczepu przeciw gospodarzowi lub zapaleniem. W innym wykonaniu aktywność związana jest z chorobą autoimmunologiczną. W pokrewnym wykonaniu choroba autoimmunologiczna jest cukrzycą insulinozależną lub chorobą Crohn'a. W innym wykonaniu sprzęganie receptora BR43x2, TACI lub BCMA z ligandem związane jest z zapaleniem. W pokrewnym wykonaniu zapalenie związane jest z bólem stawowym, obrzękiem, anemią lub wstrząsem septycznym.
Krótki opis rysunków
Figura 1 przedstawia złożone przyrównanie sekwencji aminokwasowych pomiędzy BR43x2, TACI (von Bulow i Bram, ibid.) (SEQ ID NO: 6), BCMA (Gras et al., ibid.) (SEQ ID NO: 6) oraz BR43x1 (SEQ ID NO: 7). Zaznaczono pseudo-powtórzenia bogate w cysteinę oraz domenę transbłonową.
Figura 2 przedstawia wykres analizy Scatchard wiązania rozpuszczalnego I-125-ztnf4 z TACI i BCMA wytworzonych w stabilnych transfektantach BHK.
Figura 3A przedstawia ztnf4 współaktywujący ludzkie limfocyty B do proliferacji i wydzielania immunoglobulin.
Figura 3B przedstawia poziomy IgM i IgG mierzone w supernatantach uzyskanych z limfocytów B stymulowanych rozpuszczalnym ztnf4 w obecności IL4 lub IL4+IL5 po 9 dniach hodowli.
Figura 4 przedstawia ludzkie limfocyty B z krwi obwodowej stymulowane rozpuszczalnym ztnf4 lub białkiem kontrolnym (ubikwityna) w obecności IL-4 po 5 dniach in vitro. Oczyszczone TACI-Ig, BCMA-Ig oraz kontrolny Fc pod kątem inhibicji specyficznej proliferacji dla ztnf4.
Figura 5A przedstawia wyniki dla zwierząt transgenicznych ztnf4, u których rozwinęły się charakterystyczne SLE.
Figura 5B przedstawia komórki węzła chłonnego, śledziony i grasicy ze zwierząt transgenicznych ztnf4 barwione przeciwciałami dla CD5, CD4 oraz CD8.
Figura 5C przedstawia całkowite poziomy IgM, IgG oraz IgE w surowicy ze zwierząt transgenicznych ztnf4 w granicach wieku od 6 do 23 tygodni.
Figura 5D przedstawia złogi amyloidowe oraz pogrubiałe mezangium kłębuszków nerkowych w skrawkach nerki ze zwierząt transgenicznych ztnf4.
Figura 5E przedstawia efektorowe limfocyty T w transgenicznej myszy ztnf4.
Figury 6A i 6B przedstawiają podwyższone poziomy ztnf4 w surowicy uzyskanej z myszy ZNBWF1 oraz myszy MRL/lpr/lpr, które korelują z rozwojem SLE.
Figura 7 przedstawia procent myszy ZNBWF1, u których rozwinął się białkomocz podczas prowadzenia badań.
Figura 8 przedstawia poziomy anty-dsDNA przy użyciu ELISA z myszy transgenicznych ztnf4 oraz miotu kontrolnego w porównaniu z surowicą myszy ZNBWF1 i MRL/lpr/lpr.
Szczegółowy opis wynalazku
Definicje stosowanych terminów.
Znacznik powinowactwa: tu stosowany oznacza segment polipeptydowy, który można przyłączyć do drugiego polipeptydu w celu oczyszczania lub wykrywania drugiego peptydu lub w celu dostarczenia miejsc przyłączania drugiego peptydu do substratu. Zasadniczo, dowolny peptyd lub białko, dla którego istnieje przeciwciało lub inny swoisty czynnik wiążący można użyć jako znacznik powinowactwa. Znaczniki powinowactwa obejmują ciągi poli-histydynowe, białko A ( (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), transferaza S glutationu (Smith i Johnson, Gene 67: 31, 1988), znacznik powinowactwa Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985), substancja P, peptyd Flag™ (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-10, 1988), peptyd wiążący streptawidynę lub inny epitop antygenowy czy domenę wiążącą. Patrz, ogólnie, Ford
PL 209 535 B1 et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Cząsteczki DNA kodujące znaczniki powinowactwa są handlowo dostępne (np. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Odmiana alleliczna: dowolna z dwóch lub większej liczby alternatywnych form genu zajmującego ten sam locus w chromosomie. Odmiana alleliczna powstaje naturalnie w wyniku mutacji i może dawać polimorfizm fenotypowy w populacjach. Mutacje w genach mogą być ciche (tzn. nie powodować zmian w kodowanym polipeptydzie) lub mogą dawać polipeptydy o zmienionej sekwencji aminokwasowej. Termin „odmiana alleliczna” jest tu także użyty dla oznaczenia białka kodowanego przez alleliczną odmianę genu. Także obejmuje to samo białko z tego samego gatunku, które różni się od aminokwasowej sekwencji odniesienia zgodnej z odmianą alleliczną. Odmiana alleliczna odnosi się do naturalnie występujących różnic pomiędzy osobnikami w genach kodujących dane białko.
Koniec aminowy i koniec karboksylowy: są tu użyte dla oznaczenia pozycji w polipeptydach i biał kach. Tam gdzie pozwala na to kontekst terminy te są uż yte w odniesieniu do okreś lonej sekwencji lub części polipeptydu lub białka dla określenia bliskości lub względnego położenia. Przykładowo, pewna sekwencja położona w stronę końca karboksylowego w stosunku do sekwencji odniesienia w białku jest usytuowana bliż ej koń ca karboksylowego sekwencji odniesienia, ale niekoniecznie leż y na końcu karboksylowym całego białka.
Para komplementujący/anty-komplementujący: oznacza nie identyczne cząsteczki tworzące nie kowalencyjne połączenie, stabilną parę w odpowiednich warunkach. Przykładowo, biotyna i awidyna (lub streptawidyna) są prototypowymi członkami pary komplementujący/anty-komplementujący. Inne przykłady par komplementujący/anty-komplementujący obejmują pary receptor/ligand, pary przeciwciało/antygen (lub hapten czy epitop), pary sensowny/antysensowny polinukleotyd i im podobne. Kiedy pożądana jest następnie dysocjacja pary komplementujący /anty-komplementujący wówczas powinowactwo wiązania pacy komplementujący /anty-komplementujący korzystnie wynosi <10-9 M.
Kontig: Oznacza polinukleotyd posiadający ciąg identycznej lub komplementarnej sekwencji do innego polinukleotydu. O ciągłych sekwencjach mówi się, że „zachodzą” na dany ciąg sekwencji polinukleotydowej całkowicie lub na część ciągu polinukleotydu. Przykładowo, reprezentatywnymi kontigami do sekwencji polinukleotydowej 5'-ATGGCTTAGCTT-3' są 5'-TAGCTTgagtct-3' i 3'-gtcgacTACCGA-5'.
Komplementarność cząsteczek polinukleotydowych: oznacza cząsteczki polinukleotydowe posiadające komplementarną sekwencję zasad i odwróconą orientację w porównaniu z sekwencją odniesienia. Przykładowo, sekwencja 5'ATGCACGGG3' jest komplementarna do 5'CCCGTGCAT3'.
Zdegenerowana sekwencja nuleotydowa lub sekwencja zdegenerowana: oznacza sekwencję nukleotydów, która zawiera jeden lub większą liczbę kodonów zdegenerowanych (w porównaniu z cząsteczką polinukleotydową, która koduje polipeptyd). Zdegenerowane kodony zawierają różne trójki nukleotydowe, lecz kodują tę sama resztę aminokwasową (tzn. każda z trójek GAU i GAC koduje Asp).
Wektor ekspresyjny: cząsteczka DNA, liniowa lub kolista, obejmująca segment kodujący interesujący polipeptyd funkcjonalnie połączony z dodatkowymi segmentami umożliwiającymi jego transkrypcję. Takie dodatkowe segmenty mogą zawierać sekwencje promotora i terminatora oraz fakultatywnie jedno lub kilka miejsc startu replikacji, jeden lub kilka markerów selekcyjnych, enhancer, sygnał poliadenylacji i temu podobne. Wektory ekspresyjne są zazwyczaj pochodnymi DNA plazmidowego lub wirusowego lub mogą zawierać elementy ich obu.
Izoforma: odnosi się do różnych form białka, które mogą być wytwarzane w oparciu o różne geny lub ten sam gen poprzez alternatywne składanie. W niektórych przypadkach, izoformy różnią się aktywnością transportową, czasem ekspresji podczas rozwoju, rozmieszczeniem w tankach, lokalizacją w komórce lub kombinacją tych właściwości.
Wyizolowany polinukleotyd: oznacza, że polinukleotyd jest wyjęty ze swojego naturalnego otoczenia i jest zatem wolny od innych bocznych i niepożądanych sekwencji kodujących oraz występuje w formie stosownej do uż ycia w systemach do produkcji białka za pomocą metod inżynierii genetycznej. Takie wyizolowane cząsteczki są wyizolowanymi ich naturalnego środowiska i obejmują klony cDNA i genomowe. Wyizolowane cząsteczki DNA w wynalazku są wolne od innych genów, z którymi są one oryginalnie związane, lecz mogą obejmować naturalnie występujące nieulegające translacji regiony 5' i 3', takie jak promotory i terminatory. Identyfikacja regionów przylegających jest jasna dla specjalistów (patrz przykładowo Dynan i Tijan, Nature 316: 774-78, 1985).
Wyizolowany polipeptyd lub białko: jest polipeptydem lub białkiem znalezionym w warunkach innych niż jego natywne środowisko, takie jak krew czy tkanka zwierzęca. W korzystnej formie, wyizolowany polipeptyd jest zasadniczo wolny od innych polipeptydów, w szczególności innych peptydów
PL 209 535 B1 pochodzenia zwierzęcego. Korzystne jest dostarczenie polipeptydów w formie o wysokiej czystości, tzn. powyżej 95% czystości, bardziej korzystnie powyżej 99% czystości. Używany w tym kontekście termin „wyizolowany” nie wyklucza obecności tego samego polipeptydu w alternatywnych formach fizycznych, takich jak dimery lub formy alternatywnie glikozylowane czy pochodne.
Funkcjonalnie połączony: stosowany do segmentów nukleotydowych, termin „funkcjonalnie połączony” oznacza, że segmenty są tak ułożone, że współpracują dla uzyskania zamierzonego celu, np. transkrypcja rozpoczyna się w promotorze przechodzi przez segment kodujący do terminatora.
Ortolog: oznacza polipeptyd lub białko uzyskane z jednego gatunku, które jest funkcjonalnym odpowiednikiem polipeptydu lub białka z innego gatunku. Różnice sekwencji pomiedzy ortologami są wynikiem specjacji.
Polinukleotyd: oznacza jedno- lub dwuniciowy polimer zasad dezoksyrybonukleotydowych lub rybonukleotydowych czytany od końca 5' do końca 3'. Polinukleotydy obejmują RNA i DNA, oraz mogą być wyizolowane z naturalnych źródeł, syntetyzowane in vitro czy wytwarzane z kombinacji cząsteczek naturalnych i syntetycznych. Wielkości polinukleotydów wyraża się w parach zasad (skrót „bp”), nukleotydach („nt”) lub tysiącach par zasad („kb”). O ile pozwala na to kontekst, ostatnie dwa terminy mogą opisywać polinukleotydy jednoniciowe lub dwuniciowe. Kiedy termin stosowany jest do cząsteczek dwuniciowych użyty jest dla oznaczenia pełnej długości i będzie uważany jako równoznaczny z „par zasad”. Zrozumiałe bę dzie dla specjalistów, ż e dwie nici z dwuniciowego polinukleotydu mogą różnić się nieznacznie długością oraz, że ich końce mogą być przesunięte w wyniku cięcia enzymatycznego; zatem nie wszystkie nukleotydy w dwuniciowej cząsteczce polinukleotydowej są sparowane. Takie niesparowane końce zasadniczo nie będą przekraczać długości 20 nt.
Polipeptyd: Polimer reszt aminokwasowych połączonych wiązaniami peptydowymi, wytworzony naturalnie lub syntetycznie. Polipeptydy zbudowane z mniej niż 10 reszt aminokwasowych są powszechnie nazywane „peptydami”.
Promotor: Oznacza część genu zawierającą sekwencje DNA umożliwiające wiązanie polimerazy RNA i inicjację transkrypcji. Sekwencje promotorowe leżą powszechnie, lecz nie zawsze, w 5' niekodujących regionach genów.
Białko: jest makrocząsteczką obejmującą jeden lub kilka łańcuchów polipeptydowych. Białko może także obejmować komponenty niepeptydowe, jak grupy węglowodanowe. Węglowodany i inne niepeptydowe podstawniki mogą być dołączone do białka przez komórkę, w której wytwarzane jest białko i mogą różnić się w zależności od typu komórki. Białka są tu zdefiniowane poprzez określenie struktur ich szkieletu aminokwasowego; podstawniki takie jak grupy węglowodanowe nie są zazwyczaj zaznaczane, niemniej jednak mogą być obecne.
Receptor: Białko związane z komórką lub podjednostka polipeptydowa takiego białka, która wiąże się z aktywną biologicznie cząstką („ligandem”) i pośredniczy w działaniu liganda na komórkę. Związanie liganda z receptorem powoduje zmianę w receptorze (i, w niektórych przypadkach, multimeryzację receptora, tzn. łączenie się identycznych lub różnych podjednostek receptora) w wyniku czego następują interakcje pomiędzy domeną(ami) efektorową receptora i inną cząsteczką(ami) w komórce. Uruchomienie tych interakcji prowadzi do zmian w metabolizmie komórki. Zdarzenia metaboliczne związane z interakcjami receptor-ligand obejmują transkrypcję genu, fosforylację, defosforylację, proliferację komórki, wzrost produkcji cyklicznego AMP, mobilizację wapnia komórkowego, mobilizację lipidów błonowych, adhezję komórkową, hydrolizę lipidów inozytolowych oraz hydrolizę fosfolipidów. BR43x2, jak tu w szczegółach omówiono, ma cechy charakterystyczne dla receptorów TNF.
Sekwencja sygnału wydzielniczego: sekwencja DNA kodująca polipeptyd („peptyd wydzielniczy”), która jako składnik większego polipeptydu, kieruje większy polipeptyd na drogę wydzielniczą komórki, w której jest syntetyzowany. Większy polipeptyd jest na ogół cięty w celu odrzucenia peptydu wydzielniczego podczas przemieszczania się przez drogę wydzielniczą.
Rozpuszczalny receptor: Receptor polipeptydowy, który nie jest związany z błoną komórkową. Rozpuszczalne receptory są na ogół receptorami polipeptydowymi wiążącymi ligand, które nie posiadają domen transbłonowych i cytoplazmatycznych. Rozpuszczalne receptory mogą obejmować dodatkowe reszty aminokwasowe, jak znaczniki powinowactwa umożliwiające oczyszczanie polipeptydu lub dostarczające miejsc dla wiązania polipeptydu z substratem. Wiele receptorów powierzchniowych komórek ma swoje naturalnie występujące, rozpuszczalne odpowiedniki wytwarzane poprzez proteolizę lub dzięki translacji alternatywnie złożonych cząsteczek mRNA. Receptory polipeptydowe zasadniczo nie posiadają polipeptydowych segmentów transbłonowych i wewnątrzkomórkowych wówczas
PL 209 535 B1 gdy utracą wystarczającą część fragmentów umożliwiających odpowiednio zakotwiczenie w błonie lub transdukcję sygnału.
Masy cząsteczkowe i długości polimerów określane na podstawie niedokładnych metod analitycznych (np. elektroforeza w żelu) przyjmowane są jako wartości przybliżone. Kiedy wartość wyraża się jako „około” X lub „w przybliżeniu” X, wartość oznaczona jako X będzie przyjmowana z dokładnością ±10%.
Wszystkie cytowane tu odniesienia są wprowadzane na drodze referencji w całości.
Niniejszy wynalazek w części opiera się na odkryciu 1192 bp sekwencji DNA (SEQ ID NO: 1) i odpowiada sekwencji polipeptydowej (SEQ ID NO: 2), która jest izoformą receptora TACI. Ta izoforma została oznaczona jako BR43x2. Rozpuszczalna forma BR43x2 jest ujawniona jako SEQ ID NO: 3. Jak tu opisano w szczegółach, polinukleotydy kodujące receptor BR43x2 oraz polipeptydy opisane w wynalazku był y pierwotnie zidentyfikowane przez klonowanie poprzez wył apywanie sygnał ów przy użyciu biblioteki ludzkiej RPMI 1788 oraz wyznakowanych FLAG na końcach N lub C, wyznakowanych biotyną lub FITC liganda, ztnf4, nekrotycznego czynnika nowotworowego, znanego jako neurokina α (WIPO W098/18921), BLyS (Moore et al., ibid.), BAFF (Schneider et al., ibid.), TALL-1 (Shu et al., ibid.) lub THANK (Mukhopadhyay et al., ibid.). Pozytywne pule identyfikowano poprzez wiązanie liganda, rozsiewano na pojedyncze kolonie, izolowano cDNA i sekwencjonowano. Porównanie przewidywanej sekwencji aminokwasowej BR43x2 (jak przedstawiona na SEQ ID NO: 2) ze znanymi receptorami nekrotycznego czynnika nowotworowego wykazało, że BR43x2 jest izoformą TACI posiadającą, słabo konserwowane pseudo-powtórzenie bogate w cysteinę.
Strukturalnie, rodzina receptora TNF charakteryzuje się częścią zewnątrzkomórkową złożoną z kilku modułów, historycznie nazwanych, pseudo-powtórzeniami bogatymi w cysteinę. Prototypowy członek rodziny TNFR ma cztery takie pseudo-powtórzenia, każde o długości około 29-43 reszt, jedno za drugim. Typowe pseudo-powtórzenie ma 6 reszt cysteinowych. Są one nazwane pseudo-powtórzeniami ponieważ, pomimo, że wydają się pochodzić od wspólnego modułu przodka, nie powtarzają się dokładnie: pseudo-powtórzenia #1, #2, #3 oraz #4 mają charakterystyczne cechy sekwencji pozwalające rozróżnić jedną od drugiej. Struktura krystaliczna receptora p55 TNF wykazała, że każde pseudo-powtórzenie odpowiada jednej sfałdowanej domenie, oraz, że wszystkie cztery pseudo-powtórzenia fałdują się w tę samą strukturę trzeciorzędową, utrzymywaną wewnętrznie przez mostki dwusiarczkowe.
TACI zawiera dwa pseudo-powtórzenia bogate w cysteinę (von Bulow i Bram, ibid.), struktura pierwszego jest konserwowana u innych członków rodziny receptora TNF, a drugiego jest mniej konserwowana. Izoforma BR43x2 opisana w wynalazku utraciła pierwsze pseudo-powtórzenie TACI bogate w cysteinę, i posiada tylko drugie powtórzenie, słabiej konserwowane.
Analiza sekwencji przewidywanej sekwencji aminokwasowej BR43x2 jak przedstawiono w SEQ ID NO: 2 wykazuje obecność dojrzałego białka posiadającego zewnątrzkomórkową domenę (reszty 1-120 z SEQ ID NO: 2), która zawiera jedno pseudo-powtórzenie bogate w cysteinę (reszty 25-58 z SEQ ID NO: 2), domenę transbł onową (reszty 121-133 z SEQ ID NO: 2) oraz domenę cytoplazmatyczną (reszty 134-247 z SEQ ID NO: 2). Pseudo-powtórzenie bogate w cysteinę z BR43x2 posiada 6 konserwowanych reszt cysteinowych (reszty 25, 40, 43, 47, 54 oraz 58 z SEQ ID NO: 2), konserwowaną resztę kwasu asparaginowego (reszta 34 z SEQ ID NO: 2) oraz dwie konserwowane reszty leucynowe (reszty 36 i 37 z SEQ ID NO: 2) i jest w 4 6% identyczne z pseudo-powtórzeniem bogatym w cysteinę z TACI (SEQ ID NO: 6) oraz w 35% identyczne z pseudo-powtórzeniem bogatym w cysteinę z BCMA (SEQ ID NO: 8) (Figura 1). Pseudo-powtórzenie bogate w cysteinę moż e być reprezentowane przez następujący motyw:
CX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2}C[IMLV]XCX{3}CX{6-8}CX{2}[YF]C (SEQ ID NO: 10), gdzie C oznacza resztę cysteinową, Q glutaminę, E kwas glutaminowy, K lizynę, N asparaginę, R argininę, R kwas asparaginowy, H histydynę, S serynę , Y tyrozynę, F fenyloalaninę, W tryptofan, L leucynę, I izoleucynę, V valinę a X oznacza dowolnie naturalnie występującą resztę aminokwasową z wyjątkiem cysteiny. Reszty aminokwasowe w nawiasach kwadratowych „[]” wskazują na dozwolone warianty reszt aminokwasowych w tej pozycji. Liczby podane w klamrach „{}” wskazują na liczę dozwolonych reszt aminokwasowych w danej pozycji.
Niniejszy wynalazek opisuje także rozpuszczalne polipeptydy o długości od 32 do 40 reszt aminokwasowych dostarczanych przez SEQ ID NO: 10.
PL 209 535 B1
Rozpuszczalny receptor BR43x2, jak reprezentowany przez reszty 1-120 z SEQ ID NO: 4, zawiera jedno pseudo-powtórzenie bogate w cysteinę (reszty 25-58 z SEQ ID NO: 4) oraz nie posiada domeny transbłonowej i cytoplazmatycznej z BR43x2 jak opisano w SEQ ID NO: 2.
Specjaliści w dziedzinie zauważą, że granice tych domen są przybliżone i opierają się na przyrównaniach do znanych białek oraz przewidywanym fałdowaniu białka. Cechy te wskazują na to, że receptor kodowany przez sekwencje DNA z SEQ ID NO: 1 i 3 jest członkiem rodziny receptora TNF.
Analiza typu Northern i dot blot badająca rozmieszczenie w tkankach mRNA odpowiadającego sondom nukleotydowym dla BR43x1, o których przypuszczano, że wykryją ekspresję BR43x2 wykazała ekspresję w śledzionie, węzłach chłonnych, komórkach CD19+, słabą w komórkach reagujących z limfocytami, komórkach Daudi i Raji. Przy uż yciu PCR z odwrotną transkryptazą BR43x1 wykryto tylko w limfocytach B i nie wykryto w aktywowanych limfocytach T, jak donoszono dla TACI (von Bulow i Bram, ibid.). Przy użyciu sondy BR43x2 pokrywającej w 100% sekwencję odpowiadającą TACI, TACI oraz BR43c2 wykryto w śledzionie, węzłach chłonnych, jelicie cienkim, żołądku, śliniankach, wyrostku robaczkowym, płucach, szpiku, śledzionie płodowej, komórkach CD 19' oraz komórkach Raji.
Przy użyciu analizy typu Northern BCAM wykryto w jelicie cienkim, śledzionie, żołądku, okrężnicy, wyrostku robaczkowym, węzłach chłonnych, tchawicy oraz jądrach. BCMA wykryto także w torbielakogruczolaku brodawkowatym, chłoniaku nieziarniczym oraz nowotworze przyusznic i słabo wykryto w komórkach CD 8+, CD 19+, komórkach MRL, Daudi, Raji oraz Hut 78.
Analizę typu Northern przeprowadzono również przy użyciu mysiego ztnf4 (SEQ ID NO: 19) oraz podobnych do ludzkich TACI, BCMA oraz BR43x2, ekspresję mysiego ztnf4 wykryto głównie w ś ledzionie i grasicy. Mysi ztnf4 ulegał także ekspresji w płucach i słabą ekspresję wykryto w skórze i sercu.
Niniejszy wynalazek opisuje także cząsteczki polinukleotydowe, włączając cząsteczki DNA i RNA, które kodują ujawniane tu polipeptydy BR43x2. Specjali ś ci z ł atwoś cią zauważą, ż e ze względu na zdegenerowanie kodu genetycznego możliwe jest znaczne zróżnicowanie sekwencji wśród tych cząsteczek polinukleotydowych. SEQ ID NO: 11 jest zdegenerowaną sekwencją DNA, która obejmuje wszystkie cząsteczki DNA kodujące rozpuszczalny polipeptyd BR43x2 o SEQ ID NO: 4. Podobnie, SEQ ID NO: 12 jest zdegenerowaną sekwencją DNA, która obejmuje wszystkie cząsteczki DNA kodujące polipeptyd BR43x2 o SEQ ID NO: 2. Specjaliści z łatwością zauważą, że zdegenerowaną sekwencja SEQ ID NO: 12 dostarcza także wszystkie sekwencje TNA kodowane przez SEQ ID NO: 4, poprzez podstawienie U zamiast T. Zatem, polinukleotydy kodujące polipeptyd BR43x2 obejmujące nukleotyd 1 do nukleotydu 360 z SEQ ID NO: 11, nukleotyd 1 do 741 z SEQ ID NO: 12 oraz ich odpowiedniki RNA są rozpatrywane przez niniejszy wynalazek. W Tabeli 1 przedstawione są jednoliterowe kody używane w SEQ ID NO: 11 i 12 dla zaznaczenia pozycji zdegenerowanych nukleotydów. „Rozkłady” są nukleotydami oznaczonymi przez literę kodu. „Komplementarny” oznacza kod dla komplementarnego nukleotydu(ów). Przykładowo, kod Y oznacza C lub T, a jego komplementarne R oznacza A lub G, A komplementarne do T a G komplementarne do C.
T a b e l a 1
| Nukleotyd | Rozkład | Komplementarny | Rozkład |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| A | A | T | T |
| C | C | G | G |
| G | G | C | C |
| T | T | A | A |
| R | A/G | Y | C/T |
| Y | C/T | R | A/G |
| M | A/C | K | G/T |
| K | G/T | M | A/C |
| S | C/G | S | C/G |
| W | A/T | W | A/T |
PL 209 535 B1 cd. tabeli 1
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| H | A/C/T | D | A/G/T |
| B | C/G/T | V | A/C/G |
| V | A/C/G | B | C/G/T |
| D | A/G/T | H | A/C/T |
| N | A/C/G/T | N | A/C/G/T |
Zdegenerowane kodony użyte w SEQ ID NO: 11 i 12, obejmują wszystkie możliwe kodony dla danego aminokwasu, jak przedstawiono w Tabeli 2.
T a b e l a 2
| Aminokwas | Kod Jednoliterowy | Kodony | Kodon zdegenerowany |
| Cys | C | TGC TGT | TGY |
| Ser | S | AGC AGT TCA TCC TCG TCT | WSN |
| Thr | T | ACA ACC ACG ACT | ACN |
| Pro | P | CCA CCC CCG CCT | CCN |
| Ala | A | GCA GCC GCG GCT | GCN |
| Gly | G | GGA GGC GGG GGT | GGN |
| Asn | N | AAC AAT | AAY |
| Asp | D | GAC GAT | GAY |
| Glu | E | GAA GAG | GAR |
| Gln | Q | CAA CAG | CAR |
| His | H | CAC CAT | CAY |
| Arg | R | AGA AGG CGA CGC CGG CGT | MGN |
| Lys | K | AAA AAG | AAR |
| Met | M | ATG | ATG |
| Ile | I | ATA ATC ATT | ATH |
| Leu | L | CTA CTC CTG CTT TTA TTG | YTN |
| Val | V | GTA GTC GTG GTT | GTN |
| Phe | F | TTC TTT | TTY |
| Tyr | Y | TAC TAT | TAY |
| Trp | W | TGG | TGG |
| Ter | TAA TAG TGA | TRR | |
| Asn|Asp | B | RAY | |
| Glu|Gln | Z | SAR | |
| dowolny | X | NNN |
Specjalista zdaje sobie sprawę z tego, że w określaniu kodonu zdegenerowanego wprowadzana jest pewna dwuznaczność, dla wszystkich możliwych kodonów kodujących każdy z aminokwasów. Przykładowo, zdegenerowany kodon dla seryny (WSN), w pewnych okolicznościach, może kodować argininę (AGR), a zdegenerowany kodon dla argininy (MGN) może, w pewnych okolicznościach, kodować serynę (AGY). Podobne zależności istnieją pomiędzy kodonami kodującymi fenyloalaninę i leucynę . Zatem, niektóre oligonukleotydy obejmują ce zdegenerowaną sekwencję mog ą kodować
PL 209 535 B1 odmienne sekwencje aminokwasowe, lecz specjalista z łatwością może zidentyfikować takie odmienne sekwencje poprzez porównanie z sekwencją aminokwasową z SEQ ID NO: 2 i 4. Odmienne sekwencje można z łatwością badać pod kątem funkcjonalności jak tu opisano.
Specjalista także zdaje sobie sprawę różne gatunki mogą wykazywać „preferencyjne użycie kodonów”. Ogólnie patrz Grantham et al., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas et al. Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson et al., Gene 13: 355-64, 1981; Grosjean i Fiers, Gene 18; 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; Ikemura J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982. Użyty tu termin „preferencyjne użycie kodonów” jest terminem specjalistycznym odnoszącym się do kodonów dla translacji białka, które są najczęściej używane w komórkach danego gatunku, a zatem są faworyzowane z kilku możliwych kodonów kodujących każdy aminokwas (patrz Tabela 2). Przykładowo, aminokwas treonina (Thr) może być kodowany przez ACA, ACC, ACG lub ACT, lecz w komórkach ssaków najczęściej używanym jest kodon ACC; w innych gatunkach, przykładowo komórkach owadów, drożdżach, wirusach czy bakteriach preferowane mogą być inne kodony dla Thr. Kodony preferencyjne dla poszczególnych gatunków można wprowadzać do polinukleotydów opisanych w wynalazku różnymi sposobami znanymi specjalistom. Wprowadzenie sekwencji kodonów preferencyjnych do zrekombinowanego DNA może, przykładowo, zwiększyć produkcję białka dzięki wydajniejszej translacji białka w określonym typie komórki lub gatunku. Zatem, sekwencje zdegenerowanych kodonów ujawnione na SEQ ID NO: 11 i 12 mogą stanowić matrycę dla zoptymalizowanej ekspresji polinukleotydów w różnych typach komórek i gatunkach powszechnie używanych i tu ujawnionych. Sekwencje zawierające kodony preferencyjne można badać i optymalizować pod kątem ekspresji w różnych gatunkach oraz testować pod katem funkcjonalności jak tu opisano.
Silnie konserwowane aminokwasy pseudo-powtórzenia bogatego w cysteinę z BR43x2 można zastosować jako narzędzie do identyfikowania nowych członków rodziny. Przykładowo, reakcję łańcuchową polimerazy z zastosowaniem odwrotnej transkryptazy (RT-PCR) można użyć do zamplifikowania sekwencji kodujących zewnątrzkomórkową domenę wiążącą ligand, opisaną powyżej, na RNA pochodzącym z tkanek z różnych źródeł lub z linii komórkowych. W szczególności przydatne do tego celu są silnie zdegenerowane startery zaprojektowane do sekwencji BR43x2.
W korzystnym zastosowaniu według wynalazku wyizolowane polinukleotydy będą hybrydyzowały do regionów o podobnej wielkości z SEQ ID NO: 3 lub do sekwencji do niej komplementarnej, w ostrych warunkach. Zasadniczo, ostre warunki są o około 5°C niż sze niż punkt temperatury topnienia (Tm) dla specyficznej sekwencji w określonej sile jonowej i pH. Tm jest temperaturą (w określonej sile jonowej i pH) przy której 50% sekwencji docelowej hybrydyzuje z idealnie pasującą sondą. Typowe ostre warunki to takie w których stężenie soli jest do około 0,03 M w pH 7 a temperatura wynosi co najmniej 60°C.
Jak wcześniej zaznaczono, wyizolowane polinukleotydy opisane w niniejszego wynalazku obejmują DNA i RNA. Metody izolacji DNA I RNA są dobrze znane specjalistom. Zasadniczo korzystne jest izolowanie RNA z komórek RPMI 1788, PBMNC, spoczynkowych lub aktywowanych stransfekowanych limfocytów B lub tkanki migdałka, chociaż DNA można także wytwarzać przy użyciu RNA z innych tkanek lub izolować jako genomowy DNA. Całkowity RNA można wytwarzać przy stosując ekstrakcję roztworem guanidyny HCl a następnie izolacje przez wirowanie w gradiencie CsCl (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979). Poli(A)+ RNA jest wytwarzany z całkowitego RNA przy użyciu metody Aviv i Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 1408-12, 1972). Komplementarny DNA (cDNA) wytwarza się z Poli(A)+ RNA przy użyciu znanych metod. Polinukleotydy kodujące BR43x2 są następnie identyfikowane i izolowane, przykładowo, przez hybrydyzację lub PCR.
Specjaliści zauważą, że sekwencje ujawnione w SEQ ID NO: 1 i 3 reprezentują pojedynczy allel ludzkiego genu i że spodziewane jest pojawianie się odmiany allelicznej i alternatywnego składania. Odmiany alleliczne sekwencji DNA pokazane w SEQ ID NO: 1 i 3, włączając te, które zawierają ciche mutacje oraz te w których mutacje powodują zmiany w sekwencji aminokwasowej objęte są zasięgiem niniejszego wynalazku, tak jak objęte są też białka będące odmianami allelicznymi SEQ ID NO: 2 i 4. Alleliczne odmiany oraz odmiany powstające w wyniku składania tych sekwencji można klonować poprzez przeszukiwanie sondą bibliotek cDNA i genomowych z różnych osobników lub tkanek zgodnie ze standardowymi procedurami znanymi specjalistom.
Niniejszy wynalazek dostarcza także wyizolowane polipeptydy BR43x2, które są zasadniczo homologiczne do polipeptydów z SEQ ID NO: 2 i 4 oraz ich gatunkowych ortologów. Termin „zasadniczo homologiczny” jest tu używany dla oznaczenia polipeptydów posiadających 50%, korzystnie 60%, bardziej korzystnie co najmniej 80%, identyczności z sekwencjami pokazanymi na SEQ ID NO: 2 i 4
PL 209 535 B1 lub z ich ortologami. Peptydy takie bardziej korzystnie będą identyczne w co najmniej 90% i najkorzystniej identyczne w 95% i więcej z SEQ ID NO: 2 lub jej ortologami. Procent identyczności sekwencji jest określany przy użyciu konwencjonalnych metod. Patrz, przykładowo, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-66, 1986 oraz Henikoff i Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-9, 1992. Krótko mówiąc, dwie sekwencje aminokwasowe są zestawiane dla zoptymalizowania przyrównania znaków przy użyciu kary za przerwę 10, kary za wydłużoną przerwę 1 oraz tablicy podobieństwa znaków „blosum 62” według Henikoffer i Henikoffer (ibid.) jak pokazano w Tabeli 3 (aminokwasy podano za pomocą standardowych kodów jednoliterowych). Procent identyczności oblicza się według wzoru:
Całkowita liczba identycznych dopasowań X 100
[długość najdłuższej sekwencji plus liczba przerw wprowadzona do najdłuższej sekwencji w celu przyrównania dwóch sekwencji]
T a b e l a 3
| A | R | N | D | C | Q | E | G | H | I | L | K | M | F | P | S | T | W | Y | V | |
| A | 4 | |||||||||||||||||||
| R | -1 | 5 | ||||||||||||||||||
| N | -2 | 0 | 6 | |||||||||||||||||
| D | -2 | -2 | 1 | 6 | ||||||||||||||||
| C | 0 | -3 | -3 | -3 | 9 | |||||||||||||||
| Q | -1 | 1 | 0 | 0 | -3 | 5 | ||||||||||||||
| E | -1 | 0 | 0 | 2 | -4 | 2 | 5 | |||||||||||||
| G | 0 | -2 | 0 | -1 | -3 | -2 | -2 | 6 | ||||||||||||
| H | -2 | 0 | 1 | -1 | -3 | 0 | 0 | -2 | 8 | |||||||||||
| I | -1 | -3 | -3 | -3 | -1 | -3 | -3 | -4 | -3 | 4 | ||||||||||
| L | -1 | -2 | -3 | -4 | -1 | -2 | -3 | -4 | -3 | 2 | 4 | |||||||||
| K | -1 | 2 | 0 | -1 | -3 | 1 | 1 | -2 | -1 | -3 | -2 | 5 | ||||||||
| M | -1 | -1 | -2 | -3 | -1 | 0 | -2 | -3 | -2 | 1 | 2 | -1 | 5 | |||||||
| F | -2 | -3 | -3 | -3 | -2 | -3 | -3 | -3 | -1 | 0 | 0 | -3 | 0 | 6 | ||||||
| P | -1 | -2 | -2 | -1 | -3 | -1 | -1 | -2 | -2 | -3 | -3 | -1 | -2 | -4 | 7 | |||||
| s | 1 | -1 | 1 | 0 | -1 | 0 | 0 | 0 | -1 | -2 | -2 | 0 | -1 | -2 | -1 | 4 | ||||
| T | 0 | -1 | 0 | -1 | -1 | -1 | -1 | -2 | -2 | -1 | -1 | -1 | -1 | -2 | -1 | 1 | 5 | |||
| w | -3 | -3 | -4 | -4 | -2 | -2 | -3 | -2 | -2 | -3 | -2 | -3 | -1 | 1 | -4 | -3 | -2 | 11 | ||
| Y | -2 | -2 | -2 | -3 | -2 | -1 | -2 | -3 | 2 | -1 | -1 | -2 | -1 | 3 | -3 | -2 | -2 | 2 | 7 | |
| V | 0 | -3 | -3 | -3 | -1 | -2 | -2 | -3 | -3 | 3 | 1 | -2 | 1 | -1 | -2 | -2 | 0 | -3 | -1 | 4 |
Identyczność sekwencji cząsteczek polinukleotydowych określana jest przy użyciu podobnych metod stosujących przedstawiony powyżej stosunek.
Zasadniczo homologiczne białka i polipeptydy są scharateryzowane jako posiadające jedno lub więcej podstawień, delecji lub insercji. Korzystnie jeśli zmiany te maja niewielkie znaczenie, jak konserwatywne podstawienia aminokwasowe (patrz Tabela 4) oraz inne podstawienia, które nie mają znaczącego wpływu na fałdowanie i aktywność białka czy polipeptydu; małe delecje, zazwyczaj od jednego do około 30 aminokwasów; oraz niewielkie wydłużenia na końcu aminowym i karboksylowym, jak amino-końcowa reszta metioninowa, krótkie linkery peptydowe do około 20-25 reszt czy znaczniki powinowactwa. Polipeptydy obejmujące znaczniki powinowactwa mogą dodatkowo obejmować miejsce cięcia proteolitycznego pomiędzy polipeptydem BR43x2 i znacznikiem powinowactwa. Korzystne miejsca obejmują miejsca cięcia dla trombiny oraz miejsca cięcia dla czynnika Xa.
PL 209 535 B1
T a b e l a 4
| Konserwatywne podstawienia aminokwasowe | |
| Zasadowe: | arginina lizyna histydyna |
| Kwaśne | kwas glutaminowy kwas asparaginowy |
| Polarne: | glutamina asparagina |
| Hydrofobowe: | leucyna izoleucyna walina |
| Aromatyczne | fenyloalanina tryptofan tyrozyna |
| Małe: | glicyna alanina seryna treonina metionina |
Dodatkowo do standardowych 20 aminokwasów, reszty aminokwasowe polipeptydów BR43x2 mogą być podstawione nie standardowymi aminokwasami (takimi jak 4-hydroksyprolina, 6-N-metylolizyna, kwas 2-aminoizomasłowy, izowalina oraz a-metyloseryna). Reszty aminokwasowe peptydu BR43x2 mogą być podstawione przez ograniczoną liczbę niekonserwatywnych aminokwasów, aminokwasów, która nie są kodowane przez kod genetyczny oraz nienaturalnych aminokwasów. Białka mogą także obejmować niewystępujące w naturze reszty aminokwasowe.
Nie występujące w naturze aminokwasy obejmują, lecz nie jedynie, trans-3-metyloprolinę, 2,4-metanoprolinę, cis-4-hydroksyprolinę, trans-4-hydroksyprolinę, N-metyloglicynę, allo-treoninę, metylotreoninę, hydroksy-etylocysteinę, hydroksyetylo-homocysteinę, nitro-glutaminę, homoglutaminę, kwas pipekolinowy, tert-leucynę, norwalinę, 2-azafenyloalaninę, 3-azafenyloalaninę, 4-azafenyloalaninę oraz 4-fluoro-fenyloalaninę. Specjalistom znanych jest szereg metod wprowadzania nie występujących naturalnie reszt aminokwasowych do białek. Przykładowo, można wykorzystać systemy in vitro, gdzie nonsensowne mutacje podlegają supresji przy użyciu chemicznie aminoacylowanych supresorowych cząsteczek tRNA. Metody syntezy aminokwasów i aminoacylowanych tRNA są znane specjalistom. Transkrypcję i translację plazmidów zawierających mutacje nonsensowne przeprowadza się w ukł adzie bezkomórkowym obejmują cym ekstrakt S30 z E.coli oraz handlowo dostę pne enzymy i inne odczynniki. Białka oczyszczane są chromatograficznie. Patrz, przykładowo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman et al., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung et al., Science 259: 806-9, 1993 oraz Chung et al., Proc. Natl. Cad. Sci. USA 90: 10145-9, 1993). W drugiej metodzie, translację przeprowadza się w oocytach Xenopus poprzez mikroinjekcję zmutowanego mRNA oraz chemicznie aminoacylowanych supresorowych cząsteczek tRNA (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 1991-8, 1996). W trzeciej metodzie, komórki E.coli hodowane są przy braku naturalnego aminokwasu, który ma zostać zastąpiony (np. fenyloalaniny) a w obecności pożądanego, nie występującego naturalnie aminokwasu (ów) (np. 2-azafenyloalaniny, 3-azafenyloalaniny, 4-azafenyloalaniny, czy 4-fluoro-fenyloalaniny). Niewystępujący naturalnie aminokwas jest włączany do białka w miejsce jego naturalnego odpowiednika. Patrz, Koide et al., Biochem. 33: 7470-6, 1994. Naturalnie występujące reszty aminokwasowe można przekształcać w nie występujące naturalnie typy poprzez chemiczną, modyfikację in vitro. Chemiczna modyfikacja może być połączona z miejscowo ukierunkowaną mutagenezą dla uzyskania dalszych substytucji (Wynn i Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993).
Reszty aminokwasowe z BR43x2 mogą być podstawione ograniczoną liczbą niekonserwatywnych aminokwasów, aminokwasów, które nie są kodowane przez kod genetyczny, aminokwasów niewystępujących naturalnie oraz nienaturalnych aminokwasów.
Aminokwasy konieczne dla polipeptydów BR43x2 można zidentyfikować stosując procedury znane specjalistom takie jak miejscowo ukierunkowana mutageneza lub mutageneza poprzez skaning
PL 209 535 B1 alaninowy (Cunningham i Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Pojedyncze mutacje alaninowe wprowadzane są w każdej reszcie cząsteczki a uzyskiwane zmutowane cząsteczki są testowane na aktywność biologiczną (np. dostarczenie obniżenia odpowiedzi limfocytów B podczas odpowiedzi immunologicznej, zahamowanie lub obniżenie produkcji autoprzeciwciała) w celu zidentyfikowania reszt aminokwasowych, które są krytyczne dla aktywności cząsteczki. Patrz także Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4 699-7 08, 1996. Można także określać miejsca biologicznego oddziaływania, fragmentów wiążących ligand, jak pseudo-powtórzenia bogate w cysteinę, poprzez fizyczną analizę struktury za pomocą takich technik jak magnetyczny rezonans jądrowy, krystalografia, dyfrakcja elektronowa czy znakowanie dla fotopowinowactwa w powiązaniu z mutacją w przypuszczalnych aminokwasach miejsca kontaktowego. Patrz, przykładowo, de Vos et al., Science 255: 306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Identyczność koniecznych aminokwasów można uzyskać z analizy homologii dla pokrewnych członków rodziny TNFR jak TACI i BCMA.
Dodatkowe substytucje można wytworzyć w pseudo-powtórzeniu bogatym w cysteinę z BR43x2 tak długo jak pozostawione są konserwowane reszty cysteiny, kwasu asparaginowego oraz leucyny i wyższe uporządkowanie struktury nie jest zaburzone. Korzystne jest przeprowadzenie substytucji w pseudo-powtórzeniu bogatym w cysteine z BR43x2 w odniesieniu do sekwencji dla innych pseudo-powtórzeń bogatych w cysteinę. SEQ ID NO: 10 jest uogólnionym pseudo-powtórzeniem bogatym w cysteinę , które pokazuje dopuszczalne substytucje aminokwasowe w oparciu o przyrównanie. Substytucje w tej domenie są poddane ograniczeniom przedstawionym tu.
Mnogie substytucje aminokwasowe można wytwarzać i testować przy użyciu znanych metod mutagenezy i przeszukiwania, jak te ujawnione przez Reidhaar-Olson i Sauer (Science 241: 53-7, 1988) czy Bowie i Sauer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989). Krótko mówiąc, autorzy ci ujawniają metody jednoczesnego losowego zmieniania dwóch lub większej liczby pozycji w polipeptydzie, selekcjonowania funkcjonalnego polipeptydu oraz sekwencjonowania zmutowanych polipeptydów w celu określenia zakresu dopuszczalnego dla substytucji w każdej pozycji. Inne metody, które można użyć obejmują metodę „phage display” (np. Lowman et al., Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladner et al., patent USA nr 5223409; Huse, publikacja WIPO WO 92/06204) oraz mutagenezę ukierunkowaną na cały obszar (Derbyshire et al., Gene 46: 145, 1986; Ner et al., DNA 7: 127, 1988).
Odmiany ujawnianego DNA dla BR43x2 można wytwarzać metoda typu „shuffling” jak opisano w Stemmer, Nature 370: 389-91, 1994 oraz publikacji WIPO 97/20078. Krótko mówiąc, odmiany czą steczek DNA można wytwarzać poprzez homologiczną rekombinację in vitro, dzięki losowej fragmentacji rodzicielskiego DNA a następnie ponowne złożenie poprzez PCR, w wyniku czego uzyskuje się losowo wprowadzone mutacje punktowe. Technikę tę można zmodyfikować poprzez wprowadzenie rodziny rodzicielskich cząsteczek SDNA, takich jak alleliczne odmiany lub cząsteczki DNA pochodzące z różnych gatunków, co wprowadza dodatkowe zmienne do procesu. Selekcja lub poszukiwanie pożądanej aktywności, a następnie przeprowadzenie dodatkowych reakcji mutagenezy oraz testu dostarcza szybkiej „ewolucji” sekwencji dzięki selekcji pożądanych mutacji podczas jednoczesnej selekcji określonych zmian.
Metody mutagenezy jak te ujawnione powyżej można połączyć z wysokowydajnymi, zautomatyzowanymi metodami przesiewowymi dla wykrycia aktywności sklonowanych, zmutagenizowanych polipeptydów w komórkach gospodarza. Zmutagenizowane cząsteczki DNA, kodujące aktywne polipeptydy (np. umożliwiające obniżenie odpowiedzi limfocytów B podczas odpowiedzi immunologicznej, zahamowanie lub obniżenie produkcji autoprzeciwciała) można odzyskiwać z komórek gospodarza i szybko sekwencjonować przy użyciu nowoczesnego sprzętu. Metody te pozwalają na szybkie określenie istotności poszczególnych reszt aminokwasowych w interesującym peptydzie i mają zastosowanie dla polipeptydów o nieznanej strukturze.
Stosując metody omówione powyżej specjalista może identyfikować i/lub wytwarzać odmiany polipeptydów, które są zasadniczo homologiczne do reszt 1 do 120 z SEQ ID NO: 2 lub jej odmian allelicznych i zachowywać właściwości supresyjne limfocytów B białka dzikiego typu. Takie polipeptydy mogą zawierać dodatkowe aminokwasy lub domeny innych członków superrodziny receptora nekrotycznego czynnika nowotworowego, znaczniki powinowactwa i im podobne. Peptyd BR43x2 lub konstrukcje fuzyjne, zawierające funkcjonalne domeny innych członków superrodziny TNFR stanowią hybrydowe receptory nekrotycznego czynnika nowotworowego wykazujące zmodyfikowane zdolności supresji limfocytów B.
PL 209 535 B1
Niniejszy wynalazek pozwala także na dostarczenie odpowiedników receptorów i polinukleotydów z innych gatunków (ortologów). Gatunki te obejmują, lecz nie jedynie, gatunki ssaków, ptaków, płazów, gadów, ryb, owadów i innych kręgowców i bezkręgowców. Przedmiotem szczególnego zainteresowania są receptory BR43x2 z różnych gatunków ssaczych w tym receptory mysie, świńskie, owcze, bydlęce, psie, kocie, końskie oraz z innych naczelnych. Ortologi ludzkiego receptora BR43x2 można klonować stosując informacje i kompozycje dostarczane poprzez niniejszy wynalazek w połączeniu z konwencjonalnymi technikami klonowania. Przykładowo, cDNA moż na klonować przy użyciu mRNA uzyskanego z tkanki lub komórki, która wytwarza receptor. Dogodne źródła mRNA można zidentyfikować za pomocą techniki typu Northern stosując sondy zaprojektowane na podstawie ujawnianych tu sekwencji. Z mRNA pochodzącego z pozytywnych tkanek czy linii komórkowych przygotowywana jest następnie biblioteka. cDNA kodujący receptor można wyizolować różnymi sposobami, takimi jak hybrydyzacja z sondą pochodzącą z całkowitego lub fragmentu ludzkiego cDNA lub z jednego lub kilku zestawów zdegenerowanych sond wytworzonych w oparciu o ujawniona sekwencję. cDNA można także klonować stosując PCR, używając startery zaprojektowane na podstawie ujawnionych tu sekwencji w dodatkowej metodzie bibliotekę cDNA można użyć do transformacji czy transfekcji komórek gospodarza a ekspresja interesującego cDNA może być wykrywana przez przeciwciała dla receptora. Podobne techniki można zastosować do izolacji klonów genomowych.
Polipeptydy receptorowe, włączając receptory polipeptydowe o pełnej długości, rozpuszczalne receptory peptydowe, fragmenty polipeptydowe oraz fuzje peptydowe można wytwarzać w genetycznie skonstruowanych komórkach gospodarza zgodnie z konwencjonalnymi technikami. Dogodnymi komórkami gospodarza są takie typy komórek, które można transformować czy transfekować egzogennym DNA i hodować w hodowlach i obejmują one bakterie, komórki grzybów oraz kultury komórkowe wyższych eukariota. Korzystne są komórki eukariotyczne, w szczególności hodowlane komórki organizmów wielokomórkowych. Techniki manipulacji sklonowanymi cząsteczkami DNA oraz wprowadzania egzogennego DNA do różnych komórek gospodarza opisano w Sambrook et. Al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Wyd. drugie, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et at., wyd. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.
Zasadniczo, sekwencja DNA kodująca polipeptyd BR43x2 jest funkcjonalnie połączony z innymi elementami genetycznymi wymaganymi do jego ekspresji, zasadniczo obejmującymi promotor transkrypcji oraz terminator, w wektorze ekspresyjnym. Wektor także będzie zazwyczaj zawierał jeden lub większą liczbę markerów selekcyjnych oraz jedno lub więcej miejsc startu replikacji, chociaż specjalistom wiadomo jest, że w pewnych systemach markery selekcyjne można dostarczać na oddzielnych wektorach a replikację egzogennego DNA można osiągnąć poprzez jego integrację z genomem komórki gospodarza. Wybór promotorów, terminatorów, markerów selekcyjnych, wektorów oraz innych elementów zależy od specjalisty. Wiele takich elementów opisano w literaturze i są dostępne handlowo.
W celu skierowania peptydu BR43x2 na drogę wydzielniczą komórki gospodarza, w wektorze dostarczana jest wydzielniczą sekwencja sygnałowa (także znana jako sekwencja sygnałowa, sekwencja liderowa, prepro-sekwencja czy pre-sekwencja). Wydzielnicza sekwencja sygnałowa może pochodzić z peptydu BR43x2 lub z innego wydzielanego białka (np. t-PA) lub zsyntetyzowana de novo. Wydzielnicza sekwencja sygnałowa jest połączona z sekwencją DNA dla BR43x2 we właściwej ramce odczytu i tak położona aby kierować nowo syntetyzowane białko na drogę wydzielniczą komórki gospodarza. Wydzielnicze sekwencje sygnałowe są zazwyczaj położone na końcu 5' sekwencji DNA kodującej interesujący polipeptyd, chociaż pewne sekwencje sygnałowe mogą być położone gdzie indziej w interesującej sekwencji DNA (patrz, np. Welch et al., patent USA nr 5037743; Holland et al., patent USA nr 5143830).
Jak stwierdzono, hodowle komórek ssaczych są dogodnymi gospodarzami. Sposoby wprowadzania egzogennego DNA do ssaczych komórek gospodarza obejmują transfekcję za pośrednictwem fosforanu wapnia (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro i Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham i Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), elektroporację (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-45. 1982), transfekcję za pośrednictwem DEAE-dekstranu (Ausubel et al., ibid.) oraz transfekcję za pośrednictwem liposomów (Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone et. al., Focus 15: 80, 1993). Wytwarzanie zrekombinowanych polipeptydów w hodowlach ssaczych komórek ujawniono, przykładowo, w Levinson et al., patent USA nr 4713339; Hagen et al., patent USA nr 4784950; Palmiter et al., patent USA nr 4579821 oraz Ringold, patent USA nr 4656134. Stosowne hodowle komórek ssaczych obejmują COS-1 (ATCC nr CRL 1650), COS-7 (ATCC nr CRL 1651), BHK (ATCC nr CRL 1632), BHK 570 (ATCC nr CRL 10314), 293 (ATCC nr CRL 1573, Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59PL 209 535 B1
72, 1977), Jurkat (ATCC nr CRL-8129), BaF3 (zależna od interleukiny 3 linia komórek pre-limfoidalnych pochodząca z mysiego szpiku kostnego. Patrz, Palacios i Steinmetz, Cell 41: 727-34, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-5, 1986) oraz linie komórkowe jajnika chomika chińskiego (np. CHO-K1; ATCC nr CCL 61). Dodatkowe dogodne linie komórkowe są znane specjalistom i dostępne z publicznych depozytów takich jak American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Zasadniczo, korzystne są silne promotory traskrypcji, takie jak promotor z SV-40 czy cytomegalowirusa. Patrz, np., patent USA nr 4956288. Inne dogodne promotory obejmują pochodzące z genów metalotioneiny (patenty USA nr. 4579821 i 4601978 oraz główny późny promotor adenowirusa).
Selekcja oporności na leki jest zasadniczo stosowana w celu znalezienia hodowli ssaczych komórek z insercją obcego DNA. Komórki takie powszechnie nazywa się „transfektantami”. Komórki, które były hodowane w obecności czynnika selekcyjnego i są zdolne do przekazywania insercji potomnym pokoleniom nazywane są „stabilnymi transfektantami” Korzystnym markerem selekcyjnym jest gen kodujący oporność na antybiotyk-neomycynę. Selekcja jest prowadzona w obecności leku typu neomycyny takiego jak G-418 czy podobnego. Systemy selekcyjne można także zastosować dla podwyższenia poziomu ekspresji interesującego genu, proces zwany „amplifikacją”. Amplifikację prowadzi się poprzez hodowanie transfektantów w obecności niskiego poziomu czynnika selekcyjnego a następnie podwyż szanie iloś ci czynnika selekcyjnego w celu wyselekcjonowania komórek wytwarzających wysokie poziomy produktów wprowadzonych genów. Korzystnym markerem selekcyjnym dla amplifikacji jest reduktaza dihydrofolianowa, która nadaje oporność na metotreksat. Można zastosować także inne geny nadające oporność na leki (np. oporność na higromycynę, oporność na wiele leków, acetylotransferaza puromycyny). Dla sortowania komórek stransfekowanych od niestransfekowanych, metodami typu FACS sorting czy przy użyciu kulek magnetycznych można stosować alternatywne markery nadające zmieniony fenotyp, takie jak białko fluorescencyjne, GFP, lub białka powierzchniowe komórki jak CD4, CD8, MHC klasy I czy fosfataza alkaliczna z łożyska.
Komórki innych wyższych eukariontów można także zastosować jako gospodarzy w tym komórki roślinne, komórki owadzie i komórki ptasie. Donoszono o użyciu Agrobacterium rhizogenes jako wektora dla ekspresji genów w komórkach roślinnych, Sinkar et al., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987. Transformację komórek owadzich do produkcji obcych polipeptydów ujawniono w Guarino et al., patent USA nr 5162222 oraz publikacji WIPO WO 94/06463. Komórki owadzie można infekować zrekombinowanym bakulowirusem pochodzącym z Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). Patrz King i Possee, The Baculovirus Expression System: A Laboratory Guide, Londyn, Chapman & Hall; O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford, University Press., 1994 oraz Richardson, wyd., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Druga metoda uzyskiwania bakulowirusów ze zrekombinowanym BR43x2 wykorzystuje system oparty na transpozonie, opisany przez Lucow (Lucow et al., J. Virol. 67: 4566-79, 1993). System ten, wykorzystujący wektory przenoszące, jest sprzedawany w zestawie Bac-to-Bac™ (Life Technologies, Rockville, MD). System wykorzystujący wektor przenoszący, pFastBac1™ (Life Technologies) zawiera transpozon T7 do przenoszenia DNA kodującego polipeptyd BR43x2 do genomu bakulowirusa utrzymywany w E.coli jako duży plazmid zwany „bacmid”. Patrz, Hill-Perkins i Possee, J. Gen. Virol. 71: 971-6, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75: 1551-6, 1994 oraz Chazenbalk oraz Rapoport J. Biol. Chem. 270: 1543-9, 1995. Dodatkowo, wektory przenoszące mogą obejmować w fuzji z ramką kodującego DNA znacznik epitopowy na końcu c- lub N- wytwarzanego polipeptydu BR43x2, przykładowo, znacznik epitopowy Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985). Przy użyciu technik znanych specjalistom, wektor przenoszący zawierający BR43x2 jest transformowany do E.coli a następnie poszukiwane są bacmidy, które zawierają uszkodzony gen lacZ, co wskazuje na zrekombinowanego wirusa. DNA bacmidu zawierającego zrekombinowany genom bakulowirusa jest izolowany przy użyciu powszechnych technik i używany do transfekcji komórek Spodoptera frugiperda np. komórek Sf9. Wytwarzany jest zrekombinowany wirus, pozwalający na produkcję BR43x2. Stoki zrekombinowanych wirusów są uzyskiwane powszechnie znanymi metodami.
Zrekombinowany wirus używany jest do infekcji komórek gospodarza, zazwyczaj linii komórkowej pochodzącej z pleniówki, Spodoptera frugiperda. Patrz, ogólnie, Glick i Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Waszyngton, D.C., 1994. Inną stosowną linią komórkową jest linia komórek High FiveO™ (Invitrogen) pochodząca z Trichoplusia ni (patent USA #53004345). Do hodowli i utrzymywania komórek stosowane są handlowo do-stępne wolne od surowicy podłoża. Stosownymi podłożami są Sf900 II™ (Life Technologies)
PL 209 535 B1 lub ESF 921™ (Expression Systems) dla komórek Sf9 oraz Ex-cell405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) czy Express FiveO™ (Invitrogen) dla komórek T.ni. Komórki hoduje się od gęstości zaszczepienia około 2-5 x 105 komórek do gęstości 1-2 x 105 komórek, przy której dodawany jest stok zrekombinowanych wirusów przy MOI (multiplicity of infection) do 0,1 do 10, bardziej typowo blisko 3. Stosowane procedury są zasadniczo opisane w dostępnych skryptach laboratoryjnych (King i Possee, ibid.). Polipeptyd BR43x2 można następnie oczyszczać z supernatantu sposobami tu opisanymi.
Komórki grzyba, włączając komórki drożdży także można stosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem. Szczególnie przydatnymi gatunkami drożdży są Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris oraz Pichia methanolica. Sposoby transformowania komórek S. cerevisiae egzogennym DNA oraz wytwarzania w nich zrekombinowanych polipeptydów są ujawnione przez, przykładowo, Kawasaki, patent USA nr 4599311; Kawasaki et al., patent USA nr 4931373; Brake, patent USA nr 4870008; Welch et al., patent USA nr 5037743 oraz Murray et al., patent USA nr 4845075. Stransformowane komórki są selekcjonowane dzięki fenotypowi nadanemu przez marker selekcyjny, zazwyczaj oporność na leki lub zdolność do wzrostu przy braku określonego składnika w pożywce (np. leucyny). Korzystnym systemem wektorowym do użycia w Saccharomyces cerevisiae jest system wektora POT1 ujawniony przez Kawasaki et al. (patent USA nr 4931373), który pozwalana na selekcjonowanie stransformowanych komórek poprzez wzrost na podłożach zawierających glukozę. Dogodnymi promotorami i terminatorami stosowanymi w drożdżach są promotory genów enzymów glikolitycznych (patrz, np. Kawasaki, patent USA nr 4599311; Kingsman et al., patent USA nr 4615974 oraz Bitter, patent USA nr 4977 092) oraz genów dehydrogenazy alkoholowej. Patrz, patenty USA nr 4990446; 5063154; 5139936 oraz 4661454. Systemy transformacji dla innych drożdży, włączając Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii oraz Candida maltosa są znane specjalistom. Patrz, przykładowo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-65, 1986 oraz Cregg, patent USA nr 4882279. Komórki Aspergillus można wykorzystywać zgodnie z metodami McKnight et al., patent USA nr 4935349. Metody transformacji Acremonium chrysogenum są ujawnione przez Sumino et al., patent USA nr 5162228. Metody transformacji Neurospora są ujawnione przez Lambowitz, patent USA nr 4486533.
Dla przykładu, użycie Pichia methanolica jako gospodarza do produkcji zrekombinowanych białek jest ujawnione przez Raymond, patent USA nr 5716808, Raymond, patent USA nr 5736383, Raymond et al., Yeast 14: 11-23, 1998 oraz międzynarodowe publikacje nr WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 oraz WO 98/02565. Cząsteczki DNA do użycia przy transformacji P. methanolica mogą być przygotowane w formie dwuniciowych, kolistych plazmidów, które korzystnie są linearyzowane przed transformacją. Do wytwarzania polipeptydu w P. methanolica korzystne jest aby promotor i terminator znajduj ą ce się w plazmidzie pochodził y z genu P. methanolica, jak gen wykorzystania alkoholu (AUG1 lub AUG2). Inne przydatne promotory obejmują te z genów syntazy dihydroksyacetonowej (DHAS), dehydrogenazy mrówczanowej (FMD) oraz katalazy (CAT). Dla ułatwienia integracji DNA do chromosomu gospodarza korzystne jest posiadanie całego segmentu ekspresyjnego z plazmidu w formie oflankowanej z obu stron przez sekwencje DNA gospodarza. Korzystnym markerem selekcyjnym do użycia w Pichia methanolica jest gen ADE2 z P. methanolica, kodujący karboksylazę fosforybozylo-5-aminoimidazolową (AIRC; EC 4.1.1.21), która pozwala komórkom gospodarza o fenotypie ade2 rosnąc przy braku adeniny. Tam gdzie pożądana jest minimalizacja zużycia metanolu, w procesach przemysłowych na dużą skalę, korzystne jest uż ycie komórek gospodarza z wydeletowanymi obydwoma genami wykorzystania metanolu (AUG1 i AUG2). Dla produkcji wydzielanych białek, korzystne są komórki gospodarza z zaburzonymi genami proteaz wakuolarnych (PEP4 i PRB1). Dla ułatwienia wprowadzenia plazmidu zawierającego DNA kodujący interesujący polipeptyd do komórek P. methanolica stosowana jest elektorporacja. Korzystne jest transformowanie komórek P. methanolica poprzez elektroporację stosując wykładniczo zanikającego pulsowego pola elektrycznego o sile pola od 2,5 do 4,5 kV/cm, korzystnie około 3,75 kV/cm i stałym czasie (t) od 1 do 40 milisek., bardziej korzystnie około 20 milisek.
Komórki gospodarza prokariotycznego, włączając szczepy bakterii jak Escherichia coli, Bacillus i innych rodzajów są także przydatne jako komórki gospodarza. Techniki transformacji tych komórek oraz ekspresji obcych sekwencji DNA w nich sklonowanych są dobrze znane specjalistom (patrz, np. Sambrook et al., ibid.). Kiedy wytwarzany w bakteriach takich jak E. coli polipeptyd BR43x2 może pozostać w cytoplazmie, zazwyczaj jako nierozpuszczalne granule, lub może być skierowany do przestrzeni periplazmatycznej dzięki sekwencjom wydzielniczym bakterii. W pierwszym przypadku, komórki
PL 209 535 B1 są lizowane a granule są odzyskiwane i denaturowane przy użyciu, przykładowo, rodanku guanidyny lub mocznika. Zdenaturowany polipeptyd można ponownie fałdować oraz dimeryzować poprzez rozcieńczenie denaturanta, jak w czasie dializy wobec roztworu mocznika i mieszaniny zredukowanego i utlenionego glutationu, a nastę pnie wobec buforowanej soli fizjologiczej. W drugim przypadku polipeptyd jest odzyskiwany z przestrzeni periplazmatycznej w formie rozpuszczalnej i funkcjonalnej dzięki rozerwaniu komórek (przez przykładowo, sonikację lub szok osmotyczny) w celu uwolnienia zawartości przestrzeni periplazmatycznej i odzyskania białka, co pozwala na ominięcie denaturacji i ponownego fał dowania.
Stransformowane lub stransfekowane komórki gospodarza są hodowane zgodnie z tradycyjnymi procedurami w podłożu hodowlanym zawierającym składniki pokarmowe i inne składniki wymagane do wzrostu wybranych komórek gospodarza. Specjalistom znane są różne odpowiednie podłoża, w tym podł o ż a o zdefiniowanym skł adzie oraz podł o ż a zł o ż one, i zasadniczo zawierają one ź ródł o węgla, źródło azotu, niezbędne aminokwasy, witaminy i sole mineralne. Podłoża mogą także zawierać takie składniki jak czynniki wzrostu czy surowicę, jeśli jest to wymagane. Podłoże wzrostowe będzie zasadniczo selekcjonować komórki zawierające egzogennie dodany DNA poprzez, przykładowo, selekcję na lek lub brak zasadniczego składnika pokarmowego, który jest komplementowany przez marker selekcyjny niesiony przez wektor ekspresyjny lub ko-transfekowany do komórki gospodarza. Komórki P. methanolica są hodowane na podłożu zawierającym odpowiednie źródła węgla, azotu oraz śladowe ilości składników pokarmowych w temp. około 25°C do 35°C. Hodowle płynne są przeprowadzane z wystarczającym napowietrzaniem tradycyjnymi sposobami, takimi jak wytrząsanie małych kolbek czy skraplanie w fermentorach. Korzystnym podłożem hodowlanym dla P. methanolica jest YEPD (2% D-glukoza, 2% Bacto™ Peptone (Difco Laboratories, Detroit, MI), 1% Bacto™ yeast extract (Difco Laboratories), 0,004% adenina oraz 0,006% L-leucyna).
Wytworzone zrekombinowane polipeptydy BR43x2 (lub chmery czy fuzje peptydowe BR43x2) można oczyszczać przy tradycyjnych metod oczyszczania i złóż. Korzystne jest dostarczanie białek czy polipeptydów w formie o wysokiej czystości np. powyżej 95% czystości, bardziej korzystnie powyżej 99% czystości. Do frakcjonowania próbek można użyć wytrącanie siarczanem amonu oraz ekstrakcję kwaśną czy chalotropową. Przykładowe etapy oczyszczania mogą wymagać hydroksyapatytu, wykluczania zależnego od wielkości, FPLC oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej odwróconej fazy. Przydatne podłoża jonowymienne obejmują pochodne dekstranów, agarozy, celulozy, poliakryloamidu, specjalnych krzemionek i temu podobnych. Korzystne są pochodne PEI, DEAE, QAE i Q ze szczególnie korzystną DEAE Flow-Fast Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Przykłady złóż chromatograficznych obejmują pochodne złóż z grupami fenylową, butylową lub oktylową, jak Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) i podobne; lub żywice poliakrylowe, jak Amberchrom CG 71 (Toso HAAS) i podobne. Stosowne stałe nośniki obejmują kulki szklane, żywice oparte na krzemie, żywice celulozowe, żywice agarozowe, kulki z krzyżowo podłączoną agarozą kulki polistyrenowe, kulki z krzyżowo podłączonym poliakryloamidem i podobne, które są nierozpuszczalne w warunkach w jakich są stosowane. Nośniki te można modyfikować za pomocą grup reaktywnych, które umożliwiają przyłączanie białek poprzez grupy aminowe, grupy karboksylowe, grupy sulfhydrylowe, grupy hydroksylowe i/lub cząsteczki węglowodanów. Przykłady chemii sprzęgania obejmują aktywację bromocjankiem, aktywację hydroksybursztynyloimidem, aktywację epoksydową, aktywację sulfhydrylową, aktywację hydrazydową, oraz pochodne karboksylowe i aminowe karboimidowej chemii sprzęgania. Te jak i inne stałe złoża są dobrze znane i powszechnie używane przez specjalistów oraz są handlowo dostępne. Sposoby wiązania receptorów polipeptydowych ze stałymi złożami są dobrze znane specjalistom. Wybór konkretnej metody zależy od projektu i jest w części zdeterminowana przez właściwości wybranego nośnika. Patrz, przykładowo, Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Szwecja, 1988.
Polipeptydy można izolować wykorzystując ich właściwości fizyczne. Przykładowo, chromatografię z unieruchomianiem poprzez absorpcję na metalu (IMAC) można stosować przy oczyszczaniu białek bogatych w histydynę w tym tych, które posiadają znaczniki polihistydynowe. Krótko mówiąc, żel jest najpierw ładowany dwuwartoścowymi jonami metali tak, że powstają chelaty (Sulkowski, Trends in Biochem. 3: 1-7, 1985). Białka bogate w histydynę będą adsorbować na takiej matrycy z różnym powinowactwem, zależnie od użytego jonu metalu i bę dą wymywane za pomocą współzawodniczącego roztworu elucyjnego, obniżonego pH czy dzięki zastosowaniu czynników chelatujących. Inne metody oczyszczania obejmują oczyszczanie białek glikozylowanych za pomocą chromatografii
PL 209 535 B1 z powinowactwem do lektyn i chromatografii jonowymiennej (Methods in Enzymol., Vol. 182, „Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, (wyd.), Acad. Press, San Diego, 1990, str. 529-39). W dodatkowym wykonaniu opisanym w wynalazku można skonstruować fuzję interesującego polipeptydu ze znacznikiem powinowactwa (np. białkiem wiążącym maltozę, FLAG-tag (Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (SEQ ID NO: 13)), znacznikiem Glu-Glu (Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu (SEQ ID NO: 14)), domeną immunoglobulinową dla ułatwienia oczyszczania.
Korzystnie można zastosować procedury ponownego fałdowania białka (i fakultatywnie reoksydacji). Korzystne jest oczyszczenie białka do >80% czystości, bardziej korzystnie do >90% czystości, jeszcze bardziej korzystnie do >95% i szczególnie korzystny jest farmaceutycznie czysty stan, to znaczy powyżej 99,9% czystości w odniesieniu do zanieczyszczających makrocząsteczek, w szczególności innych białek oraz kwasów nukleinowych, wolny od czynników infekcyjnych i pyrogennych. Korzystnie, oczyszczone białko jest zasadniczo wolne od innych białek w szczególności innych białek pochodzenia zwierzęcego.
Polipeptydy BR43x2 lub ich fragmenty można także wytwarzać na drodze syntezy chemicznej. Polipeptydy BR43x2 mogą być monomerami lub multimerami; glikozylowane lub nieglikozylowane, pegilowane lub niepegilowane i mogą lecz nie muszą zawierać inicjacyjnej metioninowej reszty aminokwasowej. Przykłady polipeptydów BR43x2 obejmują polipeptydy o długości 32-40 reszt, posiadające sekwencję aminokwasową zgodną z motywem: XXCX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2}C[IMLV]XCX{3}CX{6-8}CX{2}[YF]CXX (SEQ ID NO: 10) poddaną ograniczeniom jak opisano powyżej.
Polipeptydy BR43x2 można syntetyzować ekskluzyjną syntezą fazy stałej, metodami częściowej fazy stałej, poprzez kondensację fragmentów czy klasyczną syntezą w roztworze. Polipeptydy są korzystnie wytwarzane przy użyciu syntezy peptydów w fazie stałej, przykładowo jak opisano w Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963. Synteza prowadzona jest z aminokwasami, które są protegowane na końcach alfa-aminowych. Trójfunkcjonalne aminokwasy z labilnymi łańcuchami bocznymi także są protegowane odpowiednimi grupami dla uniemożliwienia niepożądanych reakcji chemicznych pojawiających się w czasie składania polipeptydów. Grupa protegująca koniec alfa-aminowy jest selektywnie usuwana co umożliwia zajście kolejnej reakcji na końcu aminowym. Warunki usuwania grupy protegującej koniec alfa-aminowy są tak dobrane, że nie powodują usunięcia grup protegujących łańcuch boczny. Grupami protegującymi koniec alfa-aminowy są te, które są przydatne w stopniowej syntezie polipeptydu. Włączone są grupy protegujące typu akrylowego (np. formylowe, trifluoroacetylowe, acetylowe), grupy protegujące typu arylowego (np. biotynylowe), grupy protegujące typu aromatycznych uretanów [np. benzylooksykarbonylowa (Cbz), podstawiona benzylokarbonylowa i 9-fluorenylometyloksykarbonylowa (Fmoc), grupy protegujące typu alifatycznych uretanów [np. t-butylooksykarbonylowa (tBoc), izopropylo-oksykarbonylowa, cykloheksyloksykarbonylowa] oraz grupy protegujące typu alkilowego (np. benzylowa, trifenylometylowa). Korzystnymi grupami protegującymi są tBoc i Fmoc.
Wybrane grupy protegujące łańcuch boczny muszą pozostać nienaruszone w czasie sprzęgania i nie mogą być usunięte podczas usuwania grup protegujących koniec aminowy lub w warunkach sprzęgania. Grupy protegujące łańcuch boczny muszą być usuwalne po zakończeniu syntezy w warunkach reakcji, które nie zmienią wytworzonego polipeptydu. W chemii tBoc, grupy protegują ce łańcuch boczny w trójfunkcjonalnych aminokwasach są przeważnie oparte na benzylu. W chemii Fmoc są one przeważnie oparte na tert-butylu tritylu.
W chemii tBoc korzystnymi grupami protegują cymi są tosylowa dla argininy, cykloheksyl dla kwasu asparaginowego, 4-metylobenzylowa (i acetamidometylowa) dla cysteiny, benzylowa dla kwasu glutaminowego, seryny i treoniny, benzyloksymetylowa (i dinitrofenylowa) dla histydyny, 2-Clbenzyloksykarbonylowa dla lizyny, formylowa dla tryptofanu oraz 2-bromobenzylowa dla tyrozyny. W chemii Fmoc korzystnymi grupami protegującymi są 2,2,4,6,7,-pentametylochromano-6-sulfonylowa (Pmc) lub 2,2,4,6,7-pentametylodihydrobenzofurano-5 sulfonylowa (Pbf) dla argininy, tritylowa dla asparaginy, cysteiny, glutaminy i histydyny, tert-butylowa dla kwasu asparaginowego, kwasu glutaminowego, seryny, treoniny i tyrozyny, tBoc dla lizyny i tryptofanu.
Dla syntezy fosfopeptydów stosowane jest wprowadzanie grupy fosforanowej zarówno bezpośrednio jak i po złożeniu peptydu. W strategii wprowadzania bezpośredniego, fosforanowa grupa w serynie, treoninie czy tyrozynie może być protegowana przez grupę metylową, benzylową czy tertbutylową w chemii Fmoc lub grupę metylową, benzylową czy fenylową w chemii tBoc. W chemii Fmoc można także zastosować bezpośrednie wprowadzenie fosfotyrozyny bez protekcji grupy fosforanowej.
PL 209 535 B1
W strategii wprowadzania grupy fosforanowej po złożeniu peptydu nie protegowane grupy hydroksylowe seryny, treoniny czy tyrozyny są derywatyzowane na fazie stałej z di-tert-butylo, dibenzylo- lub dimetylo-N,N'-diizopropylofosforamiditem, a następnie oksydowane przez wodoronadtlenek tert-butylowy.
Synteza na fazie stałej jest zazwyczaj przeprowadzana od końca karboksylowego poprzez sprzęganie aminokwasu protegowanego na alfa-aminowym końcu (z protekcją łańcucha bocznego) z odpowiednim stałym nośnikiem. W czasie przyłączania do żywicy chlorometylowej, chlorotritylowej czy hydroksymetylowej tworzone jest wiązanie estrowe i powstający polipeptyd będzie miał wolną grupę karboksylową na końcu C. Alternatywnie, kiedy stosowana jest żywica taka jak benzhydryloaminowa czy p-metylobenzhydryloaminowa (dla chemii tBoc) oraz Rink amid lub żywica PAL (dla chemii Fmoc) tworzone jest wiązanie amidowe i powstający polipeptyd będzie miał grupę karboksyamidową na końcu C. Żywice te, zarówno oparte na polistyrenie jak poliamidach czy szczepione z polietylenoglikolem, z lub bez uchwytu czy linkera, z lub bez przyłączonego pierwszego aminokwasu są handlowo dostępne a ich wytwarzanie opisano w Sterward et al., „Solid Phase Peptide Synthesis” (2 wyd.), (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984) oraz Bayer i Rapp, Chem. Pept. Prot. 3: 3, 1986 oraz Atherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989.
C-końcowy aminokwas, z protegowaną grupą boczną jeśli jest to konieczne i protegowaną grupą alfa-aminową przyłączany jest do żywicy hydroksymetylowej przy użyciu różnych czynników aktywujących włączając dicykloheksylokarbodiimid (DCC), N,N'-diizopropylokarboimid (DIPCDI) oraz karbonylodiimidazol (CDI). Będzie on przyłączany do żywicy chlorometylowej lub chlorotritylowej bezpośrednio w formie soli tetrametyloamonowej cezu lub w obecności trietyloaminy (TEA) czy diizopropyloetyloaminy (DIEA). Przyłączenie pierwszego aminokwasu do żywicy amidowej jest takie samo jak tworzenie wiązania amidowego podczas reakcji sprzęgania.
Po przyłączeniu do nośnika z żywicy, grupa protegująca alfa-aminowy koniec jest usuwana przy użyciu różnych odczynników w zależności od zastosowanej chemii protekcji (np. tBoc, Fmoc). Zakres usunięcia Fmoc można monitorować przy 300-320 nm lub w naczynku konduktornetrycznym. Po usunięciu grupy protegującej alfa-aminowy koniec, pozostałe protegowane aminokwasy są stopniowo sprzęgane w porządku wymaganym dla uzyskania pożądanej sekwencji.
Można stosować różne czynniki aktywujące do reakcji sprzęgania włączając DCC, DIPCDI, heksafluorofosforan 2-chloro-1,3-dimetyloimidiowy (CIP), heksafluorofosforan benzotriazolo-1-ylo-oksy-tris-(dimetylo-amino)-fosfoniowy (BOP) i jego analog pirrolidynowy (PyBOP), heksafluorofosforan bromo-tris-pirrolidyno-fosfoniowy (PyBrOP), heksafluorofosforan O-(benzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylo-uroniowy (HBTU) oraz jego tetra-fluoroboranowy analog (TBTU) czy analog pirrolidonowy (HBPyU), heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazolo-1-ylo)-1,1,3,3-tetrametylo-uroniowy (HATU) lub jego tetra-fluoroboranowy analog (TATU) czy analog pirrolidonowy (HAPyU). Najpowszechniej dodawanymi związkami katalitycznymi, używanymi w reakcjach sprzęgania są 4-dimetyloaminopirydyna (DMAP), 3-hydroksy-3,4-dihydro-4-okso-1,2,3-benzotriazyna (HODhbt), N-hydroksybenzaotriazol (HOBt)) oraz 1-hydroksy-7azabenzotrazol (HOAt). Każdy z protegowanych aminokwasów jest stosowany w nadmiarze (>2,0 równoważniki) i sprzęganie jest zazwyczaj prowadzone w N-metylopirrolidonie (NMP) lub DMF, CH2CI2 lub ich mieszaninie. Postępowanie reakcji sprzęgania można monitorować na każdym etapie np. przez reakcję z ninhydryną jak opisano przez Kaiser et al., Anal. Biochem. 34: 595, 1970.
Po całkowitym złożeniu pożądanego peptydu, peptyd jest odcinany od złoża przy użyciu odczynnika o odpowiednich zmiataczach rodnikowych. Peptydy Fmoc są zazwyczaj cięte i deprotegowane przez TFA ze zmiataczami rodnikowymi (np. H2O, etanoditiol, fenol oraz tioanizol). Peptydy tBoc są zazwyczaj cięte i deprotegowane przez płynny HF przez 1-2 godz. w -5 do 0°C, który odcina polipeptyd od żywicy i usuwa większość grup protegujących łańcuchy boczne. Zmiatacze rodnikowe jak anizol, siarczek metylowy p-tiokrezol są zazwyczaj stosowane z ciekłym HF dla ochrony kationów powstających podczas odcinania z alkilowanych i acylowanych reszt aminokwasowych obecnych w polipeptydzie. Grupa formylowa z tryptofanu oraz grupa dinitrofenylowa z histydyny musi by ć usunięta odpowiednio przez piperydynę i tiofenyl w DMF przed cięciem w HF. Grupę acetamidometylową z cysteiny można usunąć octanem rtęci (II) i alternatywnie jodem, trifluorooctanem talu (III) lub tetrafluoroboranem srebra, który jednocześnie utlenia cysteinę do cystyny. Innymi silnymi kwasami stosowanymi do cięcia peptydu z tBoc oraz deprotekcji są kwas trifluorometanesulfonowy (TFMSA) oraz trimetylosilylo-trifluorooctan (TMSOTf).
Niniejszy wynalazek dodatkowo dostarcza różnych fuzji z innymi polipeptydami oraz pokrewnych multimerowych białek obejmujących jedno lub kilka polipeptydów fuzyjnych. Rozpuszczalne
PL 209 535 B1 polipeptydy BR43x2, TACI czy BCMA można wytwarzać jako fuzje z regionem stałym ciężkiego łańcuch immunoglobuliny, zazwyczaj fragmentem Fc, który zawiera dwie domeny regionu stałego i utracił region zmienny. Sposoby wytwarzania takich fuzji są ujawnione w patencie USA nr 515507 i 5567584. Fuzje takie są zazwyczaj wydzielane jako cząsteczki multimeryczne gdzie części Fc są związana ze sobą poprzez mostki dwusiarczkowe a dwa polipeptydy nie-Ig są ułożone w duże bliskości. Fuzje immunoglobulina-polipeptyd BR43x2 (TACI lub BCMA) można wytwarzać w genetycznie skonstruowanych komórkach dla produkcji różnych multimerycznych analogów BR43x2. Domeny pomocnicze można łączyć w fuzje z polipeptydami BR43x2 (TACI lub BCMA) w celu umieszczania ich w docelowych specyficznych komórkach, tkankach czy makrocząsteczkach. Fuzje moż na także wytwarzać przy użyciu toksyn jak tu omówiono. Ta droga polipeptydy lub białka mogą być wprowadzane docelowo w celach terapeutycznych i diagnostycznych. Peptyd BR43x2 może być w fuzji z jedną lub kilkoma cząstkami takimi jak znacznik powinowactwa oraz domena celująca. Fuzje polipeptydowe mogą także obejmować jedno lub więcej miejsc cięcia, w szczególności pomiędzy domenami. Patrz, Tuan et al., Connect. Tiss. Res. 34: 1-9, 1996. Fuzje tego typu można także zastosować do, przykładowo, oczyszczenia przez powinowactwo pokrewnego liganda z roztworu, jako narzędzia w testach in vitro, do blokowania sygnałów in vitro przez swoiste wymiareczkowanie liganda, do wiązania Uganda na powierzchni komórki lub jako antagonistów BR43x2 in vivo poprzez podawanie ich do blokowania stymulacji ligandem. Do użycia w testach, białka fuzyjne można wiązać z nośnikiem poprzez region Fc i uż ywać w testach ELISA.
Wynalazek dostarcza także rozpuszczalne receptory BR43x2 i fragmenty polipeptydowe używane do tworzenia białek fuzyjnych ze znacznikami powinowactwa i wyznakowanych. Rozpuszczalne białka fuzyjne BR43x2 ze znacznikiem powinowactwa stosowane są przykładowo do identyfikacji ligandów BR43x2, jak również agonistów i antagonistów naturalnych ligandów. Stosując wyznakowane, rozpuszczalne BR43x2, można identyfikować komórki wytwarzające ligandy, agonistów czy antagonistów dzięki immunocytometrii i immunohistochemii. Rozpuszczalne białka fuzyjne są przydatne w badaniach rozmieszczenia liganda w tkankach lub specyficznych liniach komórkowych oraz w dostarczaniu informacji na temat działania biologicznego receptora/liganda.
Oczyszczony ligand, agonista czy antagonista białka fuzyjnego BR43x2-Ig dodawany jest do próbki zawierającej ligand, agonistę lub antagonistę w warunkach ułatwiających wiązanie receptorligand (zazwyczaj prawie fizjologiczne temperatura, pH i siła jonowa). Kompleks receptor-ligand jest następnie rozdzielany dzięki mieszaninie z proteina A, która jest unieruchomiona na stałym nośniku (np. kulki nierozpuszczalnej żywicy). Ligand, agonista lub antagonista jest następnie wypłukiwany przy użyciu tradycyjnych technik chemicznych jak gradient soli czy pH. Alternatywnie białko fuzyjne samo jest związane ze stałym nośnikiem a wiązanie i wypłukiwanie są przeprowadzane jak opisano powyżej. Sposoby unieruchamiania receptora polipeptydowego na stałym nośniku jak kulki agarozy, związana krzyżowo agaroza, szkło, żywice celulozowe, żywice oparte na krzemie, polistyren, związany krzyżowo poliakrylamid oraz materiały podobne, które są stabilne w stosowanych warunkach są znane specjalistom. Sposoby wiązania polipeptydów ze stałymi nośnikami są znane specjalistom i obejmują chemię aminową, aktywację bromocjankiem, aktywację N-hydroksybursztynyloimidem, aktywację epoksydową, aktywację sulfhydrylową oraz aktywację hydrazydową. Uzyskiwane złoża są zazwyczaj pakowane w kolumnach a płyny zawierające ligand są przepuszczane przez kolumnę jeden lub kilka razy, co pozwala na związanie się liganda z polipeptydowym receptorem. Ligand jest następnie wymywany przy użyciu zmiennych stężeń soli, czynników chlotropowych (MnCl2) lub pH które rozrywają wiązanie ligand-receptor.
Dla uzyskania bezpośredniego eksportu rozpuszczalnego receptora z komórki gospodarza, DNA rozpuszczalnego receptora jest połączony z drugim segmentem DNA kodującym peptyd wydzielniczy, taki jak peptyd wydzielniczy t-PA. Dla ułatwienia oczyszczania domeny wydzielanego receptora na jej końcu N lub C można dodać znacznik powinowactwa lub inny polipeptyd czy białko dla którego jest dostępne przeciwciało czy inny specyficznie wiążący się czynnik.
Komórki wytwarzające rozpuszczalne oraz związane z błoną receptory mogą być stosowane w testach przesiewowych. Różne dogodne testy są znane specjalistom. Testy te są oparte na wykrywaniu odpowiedzi biologicznej w komórce docelowej. Zmiana w metabolizmie w porównaniu z wartością kontrolną wskazuje na to, że badany związek moduluje metabolizm za pośrednictwem BR43x2. Jednym z takich testów jest test na proliferację komórkową. Komórki hodowane są w obecności i przy braku badanego związku a proliferacja komórkowa jest wykrywana poprzez, przykładowo, pomiar inkorporacji trytowanej tymidyny lub testem kolorymetrycznym opartym na metabolicznym rozkładaniu
PL 209 535 B1 bromku 3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (MTT) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983). Alternatywna forma testu wykorzystuje komórki, które są dodatkowo zmienione tak, że wytwarzają gen reporterowy. Gen reporterowy jest połączony z elementem promotorowym, który jest wrażliwy na drogę związana z receptorem i test wykrywa aktywację transkrypcji genu reporterowego. Specjalistom znany jest szereg genów reporterowych, które można z łatwością testować w ekstraktach komórkowych, przykładowo, lacZ z E.coli, transferaza acetylochloramfenikolowa (CAT) oraz element odpowiedzi na surowicę (SRE) (patrz, Shaw et al., Cell 56: 563-72, 1989). Korzystnym genem reporterowym jest gen lucyferazy (de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7: 725, 1987). Ekspresja genu lucyferazy wykrywana jest poprzez chemiluminescencję przy użyciu metod znanych specjalistom (np. Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269: 29094-101, 1994; Schenborn i Goiffin, Promega Notes 41: 11, 1993). Zestawy do badania aktywności lucyferazy są handlowo dostępne, przykładowo, Promega Corp., Madison, WI. Docelowych linii komórkowych tego typu można użyć do przeszukiwania bibliotek związków, komórkowych podłoży hodowlanych, bulionów grzybowych, próbek ziemi, próbek wody, i podobnych. Przykładowo, komórkowe podłoża hodowlane można badać pod kątem komórek docelowych dla identyfikowania komórek produkujących ligand. Komórki pozytywne są następnie używane do wytworzenia biblioteki cDNA w ssaczym wektorze ekspresyjnym, która jest podzielona na pule, którymi transfekowane są komórki gospodarza, w których zachodzi ekspresja. Próbki podłoża ze stransfekowanych komórek są badane, a następnie dzielone na pule, i ponownie transfekowane, hodowane i ponownie testowane na pozytywne kolonie w celu sklonowania cDNA kodującego ligand.
System testu wykorzystujący wiązanie liganda z receptorem (czy przeciwciałem, jeden z członków pary komplement/antykomplement) lub jego fragment wiążący oraz handlowo dostępne narzędzia biosensorowe (BIAcore™, PharmaciaBiosensor, Piscatway, NJ) można także korzystnie stosować. Receptor, przeciwciało, członek pary komplement/antykomplement lub fragment jest unieruchamiany na powierzchni czipa receptorowego. Użycie takiego narzędzia ujawniono w Karlsson, J. Immunol. Meth. 145: 229-40, 1991 oraz Cunningham i Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993. Przykładowo, polipeptyd BR43x2, fragment, przeciwciało, czy członek pary komplement/antykomplement jest kowalencyjnie przyłączony, za pomocą chemii aminowej lub sulfhydrylowej do włókien dekstranowych, które są przyłączone do złotego filmu w przepływającej komórce. Testowana próbka przechodzi przez komórkę. Jeżeli ligand, epitop, czy przeciwny członek pary komplement/antykomplement jest obecny w próbce, bę dzie się wią zał odpowiednio z unieruchomionym receptorem, przeciwciał em czy czł onkiem pary komplement/antykomplement wywołując zmianę w reagującym wskaźniku występującym w podło żu, który jest wykrywany jako zmiana na powierzchni rezonansu plazmonowego złotego filmu. System taki pozwala na określenie gromadzenia i braku, z czego można obliczyć współczynnik powinowactwa wiązania i ocenić stechiometrię wiązania. Wiązanie ligand-receptor polipeptydowy można także wykorzystać w innych systemach znanych specjalistom. Systemy takie obejmują analizę Scatchard dla określania powinowactwa wiązania (patrz, Scatchard Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) oraz testy kolorymetryczne (Cunningham et al., Science 253: 545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245: 821-25, 1991).
Wykres analizy Scachard wiązania rozpuszczalnego I125-ztnf4 z TACI oraz BCMA przedstawiono na Fig. 2 i porównano ze stałymi wiązania dla innych członków rodziny TNFR w Tabeli 7.
T a b e l a 7
| Ligand | Kd M | Źródło komórek | Referencje |
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| TNFa wysoki | 7,14E-11 | HL-60 | a |
| TNFa niski | 3,26E-10 | HEP-2 | a |
| TNFa wysoki | 2,00E-10 | HL-60 | b |
| CD27L | 3,70E-10 | MP-1 | c |
| CD27L | 8,30E-09 | MP-1 | c |
| CD40L | 5,00E-10 | EL40,5 | d |
| CD40L | 1,00E-09 | EBNA | d |
| (125I-CD40) |
PL 209 535 B1 cd. Tabeli 7
| 1 | 2 | 3 | 4 |
| 4-1BBL | 1,16E-09 | Biocare | e |
| Anty 41BBmab | 4,14E-10 | Biocare | e |
| Zntf4 sol. | 1.11E-09 | TACI-BHK | |
| Zntf4 sol. | 1,25E-09 | BCMA-BHK |
a Hohmann et al., J. Biol. Chem. 264: 14 927-34, 1989 a Manna i Aggarwal, J. Biol. Chem. 273: 33333-41, 1998 a Goodwin et al., Cell 73: 447-56, 1993 d Armitage et al., Nature 357: 80-82, 1992 e Shuford et al., J. Exp. Med. 186: 47-55, 1997
Jako receptora, aktywację polipeptydu BR43x2 można mierzyć w oparciu o krzemowy mikrofizjometr biosensorowy, który mierzy poziom zewnąrzkomórkowego zakwaszenia lub wydzielanie protonów związane z wiązaniem receptora i następującą zmianę odpowiedzi komórkowej. Przykładowym urządzeniem jest Cytosensor™ Microphysiometr wytwarzany przez Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Metodą tą można mierzyć różne odpowiedzi komórkowe, takie jak proliferacja komórkowa, transport jonów, produkcja energii, odpowiedź zapalna, aktywacja regulatorowa i receptorowa i podobne. Patrz, przykładowo, McConnell et al., Science 257: 1906-12, 1992; Pitchford et al., Meth. Enzymol. 228: 84-108, 1997; Arimilli et al., J. Immunol. Meth. 212: 49-59, 1998; Van Liefde et al., Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95, 1998. Mikrofizjometr można zastosować do badania adherentnych i nieadherentnych komórek eukariotycznych i prokariotycznych. Mierząc zmiany zewnątrzkomórkowego zakwaszenia w podłożu komórkowym przez określony czas, mikrofizjometr mierzy bezpośrednio odpowiedzi komórkowe na różne bodźce w tym na działanie agonistów, ligandów czy antagonistów polipeptydu BR43x2. Korzystnie mikrofizjometr jest stosowany do mierzenia odpowiedzi eukariotycznych komórek wytwarzających BR43x2, w porównaniu z kontrolnymi komórkami eukariotycznymi, które nie wytwarzają polipeptydu BR43x2. Komórki eukariotyczne wytwarzające BR43x2 obejmują komórki do których BR43x2 został wprowadzony poprzez transfekcję, jak opisano powyżej, co stwarza komórki odpowiadające na bodźce modulujące BR43x2 lub komórki naturalnie wytwarzające BR43x2, takie jak komórki wytwarzające BR43x2 pochodzące z tkanki śledziony. Różnice mierzone na podstawie zmiany w zakwaszeniu zewnątrzkomórkowym, przykładowo, wzrost czy zmniejszenie odpowiedzi komórek wytwarzających BR43x2, w porównaniu z kontrolą, są bezpośrednimi miarami odpowiedzi komórkowych modulowanych przez BR43x2. Ponadto, takie odpowiedzi modulowane przez BR43x2 można testować wobec różnych bodźców. Także, dzięki użyciu mikrofizjometra, dostarczana jest metoda identyfikowania agonistów i antagonistów polipeptydu BR43x2, obejmująca dostarczenie komórek wytwarzających polipeptyd BR43x2, hodowanie pierwszej porcji komórek przy braku testowanego związku, hodowanie drugiej porcji komórek w obecności badanego związku oraz wykrywanie zmian, przykładowo, w zwiększeniu lub zmniejszeniu odpowiedzi komórkowej dla drugiej porcji komórek w porównaniu z pierwszą porcją komórek. Zmiany w odpowiedzi komórkowej pokazywane są jako mierzony poziom zmiany zewnątrzkomórkowego zakwaszenia. Przy użyciu tej metody można szybko identyfikować agonistów i antagonistów polipeptydu BR43x2.
Rozpuszczalny BR43x2 jest przydatny w badaniu rozmieszczenia ligandów w tkankach lub specyficznych ligandów komórkowych, w celu zbadania biologicznego działania receptora/liganda. Można także zastosować do badania specyficzności receptorów TNF pod względem ligandów jako mechanizmu poprzez który niszczony jest cel komórkowy dla liganda. Przykładowo, związek toksyczny można sprzęgać z rozpuszczalnym receptorem BR43x2 lub fuzją BR43x2, Przykłady związków toksycznych będą obejmowały radiofarmaceutyki, które inaktywują docelowe komórki; czynniki chemoterapeutyczne jak doksorubicyna, daunorubicyna, metotreksat oraz cytoksan; toksyny takie jak rycyna, dyfteria, egzotoksyna A z Pseudomonas oraz abrina a także przeciwciała przeciwko cząsteczkom cytotoksycznych limfocytów T.
Wykazano, za pomocą analizy FACS (Flow Cytometry and Sorting, Melamed et al., wyd. Wiley-Liss, 1990 oraz Immunofluorescence and Cell Sorting, Current Protocols in Immunology, Vol. 1, Coligan et al., wyd John Wiley & Son, 1997), że ztnf4 (5 ng/ml) wiąże się z BR43x2 (SEQ ID NO: 2), TACI (SEQ ID NO: 6), BCMA (SEQ ID NO: 8) oraz BR43x1 (SEQ ID NO: 9). Przy użyciu analizy FACS
PL 209 535 B1 wykazano, że wyznakowany FITC, rozpuszczalny ztnf4 także wiąże swoiście, pośród innych rzeczy, limfocyty B w PBMNC, komórki migdałkowe, komórki linii chłoniaka z limfocytów B (Raji, Burkitt's human lymphoma ATCC CCL86), Ramos (Burkitt's lymphoma cell line ATCC CRL-1596), Daudi (Burkitt's human lymphoma ATCC CCL-156) oraz RPMI 1788 (B lymphocyte cell line ATCC CCL-156). Nie wykazano wiązania z HL-60 (ATCC protomyelocytic cell line, ATCC CCL-240). Swoistość wiązania do komórek B z PBMNC i komórek migdałkowych potwierdzono poprzez współbarwienie przeciwciałami dla cząsteczek swoistych dla limfocytów B w tym CD19, IgD, IgM oraz CD20. Podobieństwo ztnf4 do CD40L sugeruje szersze rozmieszczenie w tkankach niż to obserwowano. Badano powinowactwo ztnf4 do monocytów, komórek dendrytycznych oraz oczyszczonych limfocytów T przy użyciu testów z proliferacją cytokininową oraz proliferacja limfocytów T, przykładowo, i nie wykryto wiązania ztnf4 ani innego biologicznego wpływu na inne typy testowanych komórek. Zatem, swoistość limfocytów B dla Uganda i receptora sugeruje, że są one przydatne do badania i leczenia chorób autoimmunologicznych, nowotworów limfocytów B, immunomodulacyjnych, IBD oraz innych zaburzeń związanych z przeciwciał ami, np. ITCP, miastenia ciężka i podobnych, chorób nerek, niebezpoś redniej odpowiedzi immunologicznej limfocytów T, odrzucaniu przeszczepu, reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi.
Wykazano, że ztnf4 aktywuje limfocyty B w wyniku czego następuje proliferacja limfocytów B, produkcja przeciwciał i podniesienie regulacji aktywującej markery in vitro (patrz przykłady poniżej). Zmiany te mogą wymagać ko-stymulacji poprzez IL-4 lub inne cytokininy czy stymulacji poprzez receptor antygenowy limfocytów B lub innych receptorów powierzchniowych komórki, które aktywują limfocyty B tzn. CD40. Inne ligandy nekrotycznego czynnika nowotworowego, takie jak gp39 i TNFe także mogą stymulować proliferację limfocytów B. Zatem polipeptydy te mogą być celami dla swoiście regulowanych odpowiedzi limfocytów B, hamując aktywowane limfocyty B, podczas odpowiedzi immunologicznej, bez zaburzania populacji innych komórek co jest korzystne w leczeniu. Dodatkowo, polipeptydy można stosować do modulowania rozwoju limfocytów B, rozwoju innych komórek, produkcji przeciwciał oraz produkcji cytokinin. Polipeptydy BR43x2 można także z powodzeniem zastosować w indukowaniu apoptozy i/lub anergii komórek. Polipeptydy takie mogą także modulować komunikację limfocytów B i T poprzez neutralizowanie skutków proliferacji wywołanych przez ztnf4. Testy biologiczne oraz ELISA są przydatne w mierzeniu odpowiedzi komórkowej na ztn4 w obecności rozpuszczalnego BR43x2, TACI i/lub BCMA. Inne testy obejmują te, które mierzą zmiany produkcji cytokin jako miarę odpowiedzi komórkowej (patrz przykładowo, Current Protocols in Immunology, wyd. John E. Coilgan et al., NIH, 1996). Testy mierzące inne odpowiedzi komórkowe obejmują izotypowanie przeciwciał, aktywację monocytów, tworzenie komórek NK, komórkową prezentacje antygenu, apotozę.
Polipeptydy BR43x2 opisane w niniejszego wynalazku będą przydatne w neutralizowaniu efektów ztn4 w leczeniu białaczek limfatycznych z komórkami pre-B lub B, takich jak białaczka plazmocytowa, białaczka limfatyczna przewlekła i ostra, szpiczaków jak szpiczak mnogi, szpiczak plazmocytowy, mięsak Ewinga, guz olbrzymiokomórkowy kości oraz chłoniaków takich jak chłoniak nieziarniczy, z którymi jest związany wzrost ilości polipeptydów ztnf4. Rozpuszczalny BR43x2 będzie przydatnym składnikiem w stosowaniu terapii hamującej rozwój nowotworu oraz i pozwalającej na przeżycie. Analiza typu Northern wykazała, że ztnf4 jest wytwarzany w komórkach CD8+, monocytach, dendrocytach, aktywowanych monocytach. Sugeruje to, że w niektórych chorobach autoimmunologicznych limfocyty cytotoksyczne T mogą stymulować produkcję limfocytów B poprzez nadmierną produkcję ztnf4. Białka immunosupresorowe, które selektywnie blokują działanie limfocytów B będą przydatne w leczeniu. Produkcja autoprzeciwciał jest powszechna w wielu chorobach autoimmunologicznych i przyczynia się do rozmieszczenia tkankowego oraz zaostrzenia choroby. Autoprzeciwciała mogą także prowadzić do wystąpienia komplikacji związanych z odkładaniem kompleksu immunologicznego i prowadzić do wielu objawów układowego toczenia rumieniowatego, włączając niewydolność nerek, objawy neuralgiczne i śmierć. Modulowanie produkcji przeciwciał niezależnie od odpowiedzi komórkowej będzie także korzystne w innych stanach chorobowych. Wykazano także, że limfocyty B odgrywają rolę w wydzielaniu immunoglobulin w zapaleniu reumatoidalnym stawów (Korganow et al., Immunity 10: 451-61, 1999). Zatem zahamowanie produkcji przeciwciał wywołanej przez ztnf4 będzie korzystne w leczeniu chorób autoimmunologicznych takich jak ciężka miastenia i zapalenie reumatoidalne stawów. Będą w tym celu przydatne terapeutyki immunosupresyjne takie jak rozpuszczalny BR43x2, które selektywnie blokują lub neutralizują działanie limfocytów B. Dla zweryfikowania tych zdolności rozpuszczalnego receptora polipeptydowego BR43x2 peptydy BR43x2 są badane przy użyciu testów znanych specjalistom i tu opisanych.
PL 209 535 B1
Wynalazek dostarcza sposobów zatrudniania polipeptydów BR43x2, TACI czy BCMA, ich fuzji, przeciwciał agonistów oraz antagonistów w selektywnym blokowaniu lub neutralizowaniu działania limfocytów B związanych z końcowym stadium niewydolności nerek, które mogą lecz nie muszą być związane z chorobami autoimmunologicznymi. Sposoby takie będą także przydatne w leczeniu immunologicznych niewydolności nerek. Metody takie będą przydatne w leczeniu zapalenia kłębuszków nerkowych związanego z chorobami takimi jak nefropatia membranowa, nefropatia IgA czy choroba Berger'a, nefropatia IgM, choroba Goodpasture'a, poinfekcyjne zapalenie kłębuszków nerkowych, nefropatia z rozrostem mezangium, nefropatia z minimalnymi zmianami. Metody takie można także zastosować w leczeniu wtórnego zapalenia kłębuszków nerkowych czy zapaleniu naczyń związanych z toczeniem, zapaleniu wielu tętnic, choroby Henoch-Schonlein'a, twardziny skóry, chorób pokrewnych HIV, skrobiawicy czy zespołu hemolityczno-mocznicowego. Zastosowanie według wynalazku może być także przydatne do wytworzenia leku jako część stosowanej terapii przy leczeniu zapalenia nerek śródmiąższowego czy zapalenia miedniczek nerkowych związanych z przewlekłą chorobą miedniczek nerkowych, nadużywaniem leków przeciwbólowych, wapnicą nerek, zapalenia nerek wywołanego innymi czynnikami, kamicy nerkowej czy przewlekłej lub ostrego zapalenia śródmiąższowego miedniczek nerkowych.
Metody leczenia przy zastosowaniu takiego leku obejmują także użycie polipeptydów BR43x2, TACI czy BCMA, fuzji, przeciwciał, agonistów czy antagonistów w leczeniu chorób naczyń nadwrażliwych i rozległych, włączając zwężenie tętnicy nerkowej czy złogowe czy cholesterolowe czopy zatorowe czy nerkowe czopy zatorowe.
Niniejszy wynalazek dostarcza także sposobów diagnozowania i leczenia nowotworów nerkowych i urologicznych, szpiczaków mnogich, chłoniaków, neuropatii lekkiego łańcucha lub skrobiawicy.
Niniejszy wynalazek dostarcza metod blokowania i hamowania aktywowanych limfocytów B przy użyciu polipeptydów BR43x2, TACI czy BCMA, fuzji, przeciwciał, agonistów i antagonistów w leczeniu astmy i innych przewlekłych chorób dróg oddechowych jak zapalenie oskrzeli i rozedma płuc.
Dostarczane są także sposoby hamowania lub neutralizowania odpowiedzi efektorowych limfocytów T przy użyciu polipeptydów BR43x2, TACI czy BCMA, fuzji, przeciwciał, agonistów i antagonistów w zastosowaniu immunosupresji, w szczególności w leczeniu reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi i przy odrzucaniu przeszczepu. Dodatkowe zastosowanie można znaleźć przy regulacji odpowiedzi immunologicznej w szczególności w aktywacji i regulacji limfocytów. Polipeptydy BR43x2, TACI czy BCMA, fuzje, przeciwciała, agoniści i antagoniści będą przydatni w leczeniu niedoborów immunologicznych. Polipeptydy BR43x2, TACI czy BCMA, fuzje, przeciwciała, agoniści i antagoniści będą przydatni w leczeniu takich chorób autoimmunologicznych jak cukrzyca insulinozależna (IDDM) lub choroba Crohn'a. Sposoby te będą miały dodatkową wartość treapeutyczną w leczeniu przewlekłych chorób zapalnych, w szczególności związanych z bólem stawowym, obrzękiem, anemią jak również wstrząsem septycznym.
Wpływ rozpuszczalnych polipeptydów BR43x2, TACI czy BCMA oraz białek fuzyjnych na odpowiedź immunologiczną można mierzyć przez podanie opisanych polipeptydów zwierzętom immunizowanym antygenem po podaniu ztnf4 oraz mierzenie produkcji izotypowej przeciwciał oraz odpowiedzi limfocytów B i T włączając reakcję opóźnionej nadwrażliwości i proliferację in vitro oraz produkcję cytokinin według sposobów znanych specjalistom.
Niniejszy wynalazek dostarcza zatem sposobu hamowania aktywności ztnf4 w ssakach obejmującego podawanie omawianym ssakom porcji związku wyselekcjonowanego z grupy składającej się z a) polipeptydu z SEQ ID NO: 4; b) polipeptydu z SEQ ID NO: 8; c) biał ka fuzyjnego; d) polipeptydu z SEQ ID NO: 6 od reszty aminokwasowej 1 do reszty 166; e) polipeptydu z SEQ ID NO: 8 od reszty aminokwasowej 1 do reszty 150; f) przeciwciała lub fragmentu przeciwciała swoiście wiążącego się z polipeptydem o SEQ ID NO: 4 oraz g) przeciwciał a lub fragmentu przeciwciał a swoiście wiążącego się z polipeptydem o SEQ ID NO: 10. Przykłady białek fuzyjnych obejmują fuzje rozpuszczalnego BR43x2 (SEQ ID NO: 4), TACI (od reszty aminokwasowej 1 do reszty 166 z SEQ ID NO: 6) lub BCMA (od reszty aminokwasowej 1 do reszty 150 z SEQ ID NO: 8) z innym polipeptydem, korzystnie fragmentem Fc regionu stałego ciężkiego łańcucha immunoglobuliny. Wynalazek dostarcza podobnie sposobu hamowania kompleksów receptor BR43x2, TACI czy BCMA - ligand.
Metody takie będą szczególnie korzystne tam, gdzie aktywność ztnf4 jest związana z aktywowanymi limfocytami B oraz w leczeniu nowotworów limfocytów pre-B i B. Metody takie będą też przydatne tam, gdzie aktywność ztnf4 jest związana z produkcją przeciwciał. W szczególności przy
PL 209 535 B1 produkcji przeciwciał związanej z chorobami autoimmunologicznymi jak układowy toczeń rumieniowaty, ciężka miastenia czy zapalenie reumatoidalne stawów.
Niniejszy wynalazek dostarcza także agonistów i antagonistów BR43x2. Związki zidentyfikowane jako antagoniści BR43x2 są przydatne w modyfikowaniu proliferacji i rozwoju komórek docelowych in vitro i in vivo. Przykładowo, związki agonistyczne są przydatne same lub w kombinacji z innymi cytokininami i hormonami jako składniki zdefiniowanych podłoży hodowlanych dla komórek. Agoniści są zatem przydatni w specyficznym pośredniczeniu we wzroście i/lub rozwoju w hodowli limfocytów B niosących BR43x2. Agoniści i antagoniści mogą także okazać się przydatni w badaniach wpływu na funkcjonowanie limfocytów B, w szczególności aktywacji i różnicowania limfocytów B. Antagoniści są również przydatni jako czynniki w charakteryzowaniu interakcji ligand-receptor.
Składniki zidentyfikowane jako antagoniści BR43x2 są także przydatne w zwiększaniu humoralnej odpowiedzi immunologicznej. Odpowiedzi limfocytów B są ważne w walce z chorobami zakaźnymi włączając zakażenia bakteryjne, wirusowe, wywołane protozoa czy pasożytami. Przeciwciała przeciwko mikroorganizmom zakaźnym mogą unieruchamiać patogen poprzez wiązanie z antygenem a następnie jest on lizowany za pośrednictwem dopełniacza lub ataku komórek pośredniczących. Antagonista BR43x2 może dawać zwiększona odpowiedź humoralną i może być przydatnym lekarstwem u osobników z podwyższonym ryzykiem zachorowania na chorobę zakaźną lub może służyć jako uzupełnienie szczepionki.
Niniejszy wynalazek dostarcza także antagonistów, którzy albo wiążą się z polipeptydami BR43x2 albo, alternatywnie, z ligandami z którymi wiążą się polipeptydy BR43x2, powodując tym samym hamowanie lub eliminowanie funkcji BR43x2. Do wymienionych antagonistów BR43x2 należą: przeciwciała; oligonukleotydy, które wiążą się zarówno do polipeptydu BR43x2 jak i jego ligandów, naturalne lub sztuczne analogi ligandów BR43x2, które mają zdolność wiązania się z receptorem, ale nie zachowują zdolności do przekazywania sygnału za pomocą ligandu i receptora. Takimi analogami mogą być polipeptydy lub związki peptydo-podobne. Naturalne lub sztuczne związki mające zdolność wiązania polipeptydów BR43x2 i uniemożliwiania przekazywania sygnału nazywa się antagonistami. Takie związki antagonistyczne mogą być użyteczne jako leki przy leczeniu chorób, w których zarówno blokowanie receptora jak i ligandu będzie miało znaczenie. Antagoniści mogą być użyteczni jako związki używane przy charakteryzowaniu oddziaływań ligand-receptor. BR43x2 jest wyrażany przez transformowane linie komórek B, włączając te indukowane EBV jak, spontaniczne chłoniaki Burkitta oraz kilka nowotworów komórek B. Blokowanie funkcji BR43x2 może być użyteczne w leczeniu chłoniaków i nowotworów komórek B. Antagoniści BR43x2, tacy jak rozpuszczalne receptory BR43x2 lub przeciwciała mogą być używane w leczeniu progresji nowotworowej.
Aktywność antagonistów i agonistów może być wyznaczana w testach badających aktywność, które wykrywają możliwości wiązania receptor/ligand. Wytworzono stabilnie transfekowane linie komórek B wyrażające BR43x2, takie jak Baf3 (mysia linia komórek pre-B Palacios i Steinmetz, i Mathey-Prevot i wsp.), które jednocześnie wyrażają na wysokim poziomie konstrukt z genem reporterowym NfKB, NFAT-1 i AP-1. W podobny sposób w komórkach Jurkat i innych liniach chłoniaków komórek B wytworzono linie wyrażającej TACI i BCMA. Wykazano, że ztnf4 brał udział w przekazywaniu sygnału w przypadku wymienionych konstruktów z genem reporterowym. Rozpuszczalny BR43x2 i przeciwciała mogą być używane przy badaniu wiązania.
Podejście do badania białek niniejszego wynalazku in vivo wykorzystuje wirusowe systemy dostarczania genów. Przykładowe wirusy wykorzystywane do tego celu to: adenowirusy, wirusy typu herpes, wirusy ospy i wirusy związane z adenowirusami (AAV). Adenowirusy, zawierające dwuniciowe DNA, są obecnie najintensywniej badanymi wektorami do przenoszenia heterologicznych kwasów nukleinowych (patrz Becker i wsp., Meth. Cell Biol. 43: 161-89, 1994 i Douglas i Curiel, Science & Medicine 4; 44-53, 1997). Systemy adenowirusowe mają wiele zalet, adenowirusy są zdolne do: (i) włączania stosunkowo dużych fragmentów DNA, (ii) wzrostu do wysokich mian, (iii) infekowania różnych typów komórek ssaczych, (iv) mogą być wykorzystywane z dużą liczbą dostępnych wektorów, zawierających różne promotory. Jednocześnie, zaletą jest ich stabilność w układzie krążenia - mogą być podawane poprzez wstrzyknięcie dożylne.
Poprzez usunięcie fragmentu genomu adenowirusowego, mogą być wstawiane duże fragmenty (do 7 kb) heterologicznego DNA. Te fragmenty mogą być włączane do DNA wirusowego, poprzez ligację lub rekombinację homologiczną z kotransfekowanym plazmidem. W przykładowym systemie, z wektora wirusowego usunięto gen E1, zatem wirus nie jest zdolny do replikacji, gdy gen E1 nie jest dostarczony przez komórkę gospodarza (przykładowo, ludzka linia komórkowa 293). Przy dostarczaniu
PL 209 535 B1 adenowirusów do żywych zwierząt, pierwotnie kierują się one do wątroby. W adenowirusowym systemie dostarczania genów, w którym brak jest genu E1, wirus nie może się namnażać w komórkach gospodarza. Jednakże, tkanka gospodarza (np. wątroba) będzie wyrażać i obrabiać (przy obecności odpowiedniej sekwencji sygnałowej - wydzielać) białko heterologiczne. Wydzielane białka mogą dostawać się do krwioobiegu w unaczynionej wątrobie, zatem jego wpływ na infekowane zwierze może być badany.
Systemy adenowirusowe mogą być również wykorzystywane do produkcji białek in vitro. Poprzez hodowle komórek zinfekowanych adenowirusem (nie 293) w warunkach uniemożliwiających szybkie podziały, komórki produkują białko przez wydłużony okres czasu. Przykładowo, komórki BHK mogą być hodowane do osiągnięcia stanu zlewania się, a później eksponowane na wektor adenowirusowy kodujący odpowiednie białko. Następnie komórki są hodowane przy braku surowicy, co pozwala zainfekowanym komórkom przeżycie kilku tygodni bez znaczących podziałów komórkowych. Jednocześnie, infekowane wektorem adenowirusowym komórki 293S mogą rosnąć w hodowli zawiesionowej, przy wysokiej gęstości, tak aby produkować znaczące ilości białka (patrz Garnier i wsp., Cytotechnol. 15: 145-55, 1994). Wyrażane, wydzielane białko heterologiczne może być w sposób powtarzalny izolowane z supernatantu takiej hodowli. W ramach tego samego protokołu (z komórkami 293S) białka, które nie są wydzielane również mogą być wydajnie otrzymywane.
Dobrze znane modele zwierzęce mogą być wykorzystywane w celu badania in vivo skuteczności rozpuszczalnych polipeptydów BR43x2, TACI i BCMA opisywanego wynalazku w określonych stanach chorobowych. W szczególności, rozpuszczalne polipetydy i fragmenty polipeptydów BR43x2, TACI i BCMA mogą być badane in vivo w wielu modelach zwierzęcych chorób autoimmunologicznych takich, jak MRL-1pr/1pr lub NZB x NZW F1 szczepach myszy, które służą jako model SLE. Takie modele zwierzęce są znane w dziedzinie, dla przykładu Autoimmune Disease Models A Gudebook, Cohen i Miller wyd. Academic Press. W potomstwie krzyżówki pomiędzy myszami New Zealand Black (NZB) i New Zealand White (NZW) można zaobserwować rozwój spontanicznej formy SLE, która przypomina SLE u ludzi. W potomstwie tych myszy, nazywanym NZBW, wytwarzane są autoprzeciwciała IgM przeciw komórkom T w wieku 1 miesiąca, anty-DNA przeciwciała Ig w wieku 5-7 miesięcy są dominującymi immunoglobulinami. Nadaktywność poliklonalnych komórek T powoduje nadprodukcję autoprzeciwciał. Odkładanie się tych przeciwciał, w szczególności tych skierowanych przeciw jednoniciowemu DNA, jest związane z rozwojem glumerulonephritis, które klinicznie objawia się jako białkomocz, azotemia i śmierć w wyniku niewydolności nerek. Niewydolność nerek jest bezpośrednią przyczyną śmierci myszy ze spontanicznym SLE i, w przypadku szczepów NZBW, proces ten jest chroniczny i cechuje się niedrożnością. Ta choroba jest szybciej postępująca i cięższa u samic, w porównaniu z samcami. W przypadku samic, średnia długość życia to tylko 245 dni, podczas gdy u samców wynosi ona 406 dni. Wiele samic myszy wykazuje symptomy choroby (białkomocz) w wieku 7-9 miesięcy, jednocześnie niektóre z nich mogą być o wiele młodsze lub starsze w momencie pojawienia się symptomów. Płodowe immunologiczne zapalenie nerek u myszy NZBW jest bardzo podobne do glomerulonephritis obserwowanego w przypadku ludzkiego SLE, przez to spontaniczny mysi model może być niezwykle użyteczny w badaniu potencjalnych leków na SLE (Putterman i Naparstek, Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus, Autoimmune Disease Models: A Guidebook, rozdz. 14, str. 217-34, 1994, Mohan i wsp., J. Immunol. 159: 3104-08, 1997). Podanie tym myszom rozpuszczalnego TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig lub innych rozpuszczalnych lub fuzyjnych białek w celu zbadania zdolności TACI, BR43x2 i BCMA do poprawy symptomów lub zmiany przebiegu choroby, jest opisane w przykładach.
Mysie modele eksperymentalnego EAE użyto jako narzędzia przy badania zarówno mechanizmów chorób immunologicznych, jak i metod leczenia. Model przypomina ludzkie stwardnienie rozsiane, powoduje demielinizację, jako wynik aktywacji komórek T przeciw neuroproteinom takim, jak MBP lub PLP. Inokulacja z antygenem prowadzi do indukcji CD4+, komórek T MHC klasy II. Zmiany w protokole mogą powodować ostre, chroniczne-powracające, lub bierne warianty modelu (Weinberg i wsp., J. Immunol. 162: 1818-26, 1999; Mijaba i wsp., Cell. Immunol. 186: 94-102, 1999; i Glabinski, Meth. Enzym, 288: 182-90, 1997). Podanie rozpuszczalnego TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig lub innych rozpuszczalnych lub fuzyjnych białek w celu zbadania zdolności TACI, BR43x2 i BCMA do poprawy symptomów lub zmiany przebiegu choroby, jest opisane w przykładach.
W modelu CIA, u myszy występuje chroniczne zapalenie stawów, które przypomina ludzkie reumatyczne zapalenie stawów (RA). Z uwagi na fakt, że CIA ma podobne do RA cechy immunologiczne i patologiczne, taki model jest dobry przy wyszukiwaniu ludzkich związków przeciwzapaleniowych.
PL 209 535 B1
Inną zaletą użycia modelu CIA jest fakt, że mechanizm patogenezy jest znany. Zidentyfikowano epitopy komórek T i B na kolagenie typu II oraz różne immunologiczne (opóźniona nadwrażliwość i przeciwciała anty-kolagen) i zapaleniowe (cytokiny, chemokiny i enzymy) parametry związane z zapaleniem stawów, które mogą być używane w badaniu skuteczności związku w danym modelu (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3: 407-20, 1999; Williams i wsp., Immunol. 89: 9784-788, 1992; Myers i wsp, life Sci. 61: 1861-78, 1997; i Wang i wsp., Immunol. 92: 895-959, 1995). Podanie tym myszom rozpuszczalnego TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig lub innych rozpuszczalnych lub fuzyjnych białek w celu zbadania zdolności TACI, BR43x2 i BCMA do poprawy symptomów lub zmiany przebiegu choroby, jest opisane w przykładach.
Modele infekcji oskrzelowych, takich jak astma, mogą być wytwarzane poprzez iniekcję myszy owalbuminą oraz stymulację nosową antygenem powodującym odpowiedź astmatyczną w oskrzelach, podobną do astmy. Podanie tym myszom rozpuszczalnego TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig lub innych rozpuszczalnych lub fuzyjnych białek w celu zbadania zdolności TACI, BR43x2 i BCMA do poprawy symptomów lub zmiany przebiegu choroby, jest opisane w przykładach.
Innym zastosowaniem modeli in vivo jest prowokacja antygenem zwierząt, po której następuje podanie rozpuszczalnego BR43x2 (TACI) lub jego ligandu ztnf4 oraz mierzenie odpowiedzi komórek T i B.
Odpowiedź zależna i niezależna od komórek T może być mierzona tak jak opisano w Perez-Melgosa i wsp., J. Immunol. 163: 1123-7, 1999.
Odpowiedź immunologiczna u zwierząt poddanych prowokacji antygenem (przykładowo owalbumina lub kolagen), po której podawano polipeptydy BR43x2, TACI i BCMA, lub rozpuszczalne fuzje z Ig może być wykorzystywana w celu zmierzenia wpływu na odpowiedź komórek B.
Badania farmakokinetyczne mogą być używane razem z wyznakowanymi radioaktywnie rozpuszczalnymi polipeptydami BR43x2, TACI i BCMA lub fuzjami, w celu ustalenia rozmieszczenia i pół rozpadu tych polipeptydów in vivo.
Dostarczono również sposób wykorzystania polipeptydów BR43x2, TACI i BCMA jako markerów zastępczych w chorobach autoimmunologicznych, chorobach nerek i chorobach związanych z komórkami B i T. Tacy pacjenci mogą być skrwawiani, po czym rozpuszczalne receptory BR43x2, TACI i BCMA oraz ich ligandy mogą być wykrywane w krwi.
Wynalazek dostarcza również przeciwciała. Przeciwciała przeciw BR43x2 lub peptydom o sekwencji aminokwasów Seq Id No: 8, mogą być otrzymane przykładowo, przy zastosowaniu produktu ekspresji wektora zawierającego sekwencję kodującą odpowiedni polipetyd, lub polipetyd wyizolowany z naturalnego źródła, jako antygenu. Szczególnie użyteczne przeciwciała wiążą specyficznie BR43x2 lub peptydy mające sekwencje aminokwasów SEQ ID NO: 10). Przeciwciała uważano za wiążące specyficznie, jeżeli wiążą polipeptyd BR43x2 lub polipeptyd o SEQ ID NO: 8), peptyd lub epitop z powinowactwem (Ka) 106M-1 lub wyższym, korzystnie 107M-1 lub wyższym, bardziej korzystnie 108M-1 lub wyższym, a najbardziej korzystnie 109M-1 lub wyższym. Powinowactwo przeciwciała może być określone przez biegłego w danej dziedzinie, na przykład w analizie Scatchard, (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660, 1949). Do odpowiednich przeciwciał należą te, które wiążą BR43x2, w szczególności domenę pozakomórkową (pozycje aminokwasów 1-120 na SEQ ID NO: 2) i te, które wiążą polipetydy mające sekwecje aminokwasów SEQ ID NO: 10.
Przeciwciała anty-BR43x2 mogą być wytwarzane przy wykorzystaniu zawierających epitopy antygenowych peptydów i polipeptydów BR43x2. Zawierające epitopy antygenowe peptydy i polipeptydy niniejszego wynalazku, zawierają przynajmniej 9, a korzystnie pomiędzy 15 a 30 aminokwasów z SEQ ID NO: 2. Jednakże, peptydy i polipeptydy zawierające dłuższy fragment sekwencji aminokwasowej wynalazku (od 30 do 50 aminokwasów) lub dowolnej długości fragmentu włączając pełną sekwencję aminokwasową polipeptydu niniejszego wynalazku, mogą być wykorzystywane w indukcji przeciwciał wiążących BR43x2. Pożądane jest, żeby sekwencja aminokwasowa peptydu zawierającego epitop była wybrana w taki sposób, aby umożliwiać odpowiednią rozpuszczalność w rozpuszczalnikach wodnych (tj. sekwencja powinna zawierać względnie hydrofilowe aminokwasy, podczas gdy hydrofobowe powinny być unikane). Hydrofilowe peptydy mogą być zaprojektowane przez specjalistę w danej dziedzinie z wykresu hydrofobowości, dla przykładu patrz Hopp i Woods (Proc. Natl. Acad. Sci USA 78: 3824-8, 1981) oraz Kyte i Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 105-142,1982). Ponadto, sekwencje aminokwasowe bogate w prolinę mogą być pożądane do wytwarzania przeciwciał.
Przeciwciała poliklonalne do zrekombinowanego białka BR43x2 lub BR43x2 wyizolowanego ze źródeł naturalnych mogą być przygotowane przy zastosowaniu metod dobrze znanych specjalistom w danej dziedzinie, dla przykładu patrz Green i WSP. „Production of Policlonal Antisera”
PL 209 535 B1 w Immunochemical Protocols (wyd. Manson), strony 1-5 (Humama Press 1992) oraz Williams i wsp. „Expression of foreign proteins in E. coli using plasmid and vectors and purification of specifie polyclonal antibodies” w DNA Cloning 2: Expression Systems. Wyd 2, Glover i wsp. (wyd.), str. 15 (Oxford University Press 1995). Immunogeniczność polipeptydu BR43x2 może być zwiększona poprzez zastosowanie adjuwanta, takiego jak ałun oraz kompletnego lub niekompletnego adjuwanta Freunda. Polipeptydy użyteczne przy immunizacji zawierają polipeptydy fuzyjne takie jak fuzje BR43x2 lub jego fragmentu z polipeptydami immunoglobin lub białkiem wiążącym maltozę. Immunogen polipeptydowy może być cząsteczką pełnej długości lub jej fragmentem. Jeżeli fragment polipeptydu jest heptenopodobny, taki fragment może być połączony z nośnikiem makromolekularnym (takim jak KLH, BSA lub TT) do immunizacji.
Pomimo, że przeciwciała poliklonalne normalnie są wytwarzane w zwierzętach takich jak konie, krowy, psy, kurczaki, szczury, myszy, króliki, chomiki, świnki morskie, kozy lub owce, przeciwciało anty-BR43x2 niniejszego wynalazku może również być pochodną pierwotnego przeciwciała ludzkiego. Znane są techniki wytwarzania przeciwciał użytecznych diagnostycznie i terapeutycznie w pawianach, np., Goldenberg i wsp., international patent publication No. WO 91/11465, i Losman i wsp., Int. J. Cancer 46: 310, 1990. Przeciwciała mogą być również wytwarzane w transgenicznych owcach, krowach, kozach i świniach, i mogą być wyrażane w zmodyfikowanych formach w drożdżach i grzybach, jak również w ssaczych i owadzich komórkach.
Jednocześnie, mogą być wytworzone monoklonalne przeciwciała anty-BR43x2. Monoklonalne przeciwciała do specyficznych antygenów mogą być otrzymane przez specjalistów w danej dziedzinie (patrz, np., Kohler i wsp., Nature 256: 495, 1975, Coligan i wsp., (wyd.), Current Protocols in Immunology, Vol. 1, strony 2.5 1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991), Picksley i wsp., „Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli” in DNA Cloing 2; Expression Systems, 2nd Edition, Gover i wsp., (wyd.) strona 93 (Oxford University Press 1995).
W skrócie, przeciwciała monoklonalne mogą być otrzymywane poprzez iniekcje myszy kompozycją zawierającą produkt genu BR43x2, sprawdzenie obecności przeciwciała w surowicy, wyizolowanie śledziony w celu otrzymania limfocytów B, fuzję limfocytów B komórkami nowotworowymi w celu otrzymania hybrydom, klonowanie hybrydom, selekcję pozytywnych klonów, które produkują przeciwciała przeciw antygenowi i izolację przeciwciał z kultur hybrydom.
Dodatkowo, przeciwciała anty-BR43x2 niniejszego wynalazku mogą być otrzymane z ludzkich przeciwciał monoklonalnych. Ludzkie przeciwciała monoklonalne mogą być otrzymywane z myszy transgenicznej, zmodyfikowanej tak by wytwarzać ludzkie specyficzne przeciwciała w odpowiedzi na prowokację antygenową. W tej technice fragmenty ludzkiego locus ciężkiego i lekkiego łańcucha są wprowadzane do szczepów myszy, pochodzących z linii komórek macierzystych, w których poddano delecji endogenne loci ciężkiego i lekkiego łańcucha. Takie transgeniczne myszy mogą produkować ludzkie przeciwciała specyficzne względem ludzkich antygenów i myszy te mogą być wykorzystywane do wytwarzania hybrydom produkujących ludzkie przeciwciała. Metody otrzymywania ludzkich przeciwciał z myszy transgenicznych są opisane np. w Green i wsp., Nat. Genet. 7: 13, 1994, Longerg i wsp., Nature 368: 856, 1994, i Taylor i wsp., Int. Immun. 6: 579, 1994.
Przeciwciała monoklonalne mogą być wyizolowane i oczyszczone z hodowli hybrydom przy wykorzystaniu wielu dobrze znanych technik. Do technik tych należą chromatografia powinowactwa z biał kiem A, chromatografię wielkoś ciową , chromatografi ę jonowymienną (patrz np., Coligan strony 2.7.1-2.7.12 i strony 2.9.1-2.9.3; Baines i wsp., „Purification of Immunoglobulin G (IgG)” in Methods in Molecular Biology, Vo. 10, strony 79-104 (The Humana Press, Inc 1992).
W szczególnych przypadkach, może być pożądane przygotowanie fragmentów przeciwciał anty-BR43x2. Takie fragmenty przeciwciał mogą być otrzymane poprzez proteolityczną hydrolizę przeciwciała. Fragmenty przeciwciał mogą być otrzymane przez trawienie pepsyną lub papaina całego przeciwciała konwencjonalnymi metodami. Przykładowo, fragment przeciwciała może być otrzymywany poprzez enzymatyczne cięcie przeciwciał pepsyną w celu otrzymania fragmentów 5S oznaczonych jako F(ab')2. Taki fragment może być dalej cięty czynnikiem redukującym grupy tiolowe, w celu otrzymania monowalencyjnych fragmentów 3,5S Fab'. W razie potrzeby, cięcie może być przeprowadzane przy wykorzystaniu grup blokujących grupy siarkowe, w wyniku czego dochodzi do przerwania mostków dwusiarczkowych. Dodatkowo, cięcie enzymatyczne pepsyną generuje dwa monowalencyjne fragmenty Fab oraz fragment Fc. Te metody są opisywane np. przez Goldenber, U.S. patent No. 4,331,647, Nisonoff i wsp., Arch Biochem. Biophys. 89: 230, 1960, Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959, Edelman i wsp., w Methods in Enzymology Vo. 1, strona 422 Academin Press 1967 i Coligan.
PL 209 535 B1
Inne metody cięcia przeciwciał, takie jak oddzielenie ciężkich łańcuchów w celu utworzenia monowalencyjnych fragmentów lekko ciężkich łańcuchów oraz dalsze cięcie uzyskanych fragmentów lub enzymatyczne, chemiczne lub genetyczne techniki mogą być również wykorzystywane, jeżeli fragmenty wiążą antygen, który jest rozpoznawany przez niecięte przeciwciało.
Na przykład, fragmenty Fv zawierające związane łańcuchy VH i VL. To powiązanie może być niekowalencyjne, tak jak opisano w Ibar i wsp., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2569, 1972. Jednocześnie, różne łańcuchy mogą być połączone wewnątrz cząsteczkowym wiązaniem dwusiarczkowym lub połączone związkami chemicznymi, takimi jak gluteraldehyd (patrz np., Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437, 1992).
Fragmenty Fv mogą zawierać łańcuchy VH i VL, które są połączone łącznikiem białkowym. Takie jedno łańcuchowe białka wiążące antygen (scFv) mogą być przygotowywane poprzez konstrukcję genu struktury, zawierającego sekwencję DNA, kodującą domeny VH i VL, połączone oligonukleotydem. Taki gen struktury może być wstawiony w wektor ekspresyjny, który jest wprowadzany do komórki gospodarza, takiej jak E. coli. Zrekombinowana komórka gospodarza wytwarza pojedynczy łańcuch polipeptydowy z peptydem łącznikowym, łączącym dwie domeny V. Metody wytwarzania scFvs są opisane przykładowo w Whitlow i wsp. Methods: A Companion to Methods i Enzymology 2: 97
1991, jak również Bird i wsp. Science 242: 423, 1998, Lander I wsp. U.S. Patent Nr 4946778, Pack I wsp., Bio/Technology 11: 1271, 1993 oraz Sandhu.
Jako przykład, scFvs może być otrzymywane poprzez ekspozycje limfocytów na polipeptyd BR43x2 in vitro i selekcję bibliotek eksponujących przeciwciało w fagu lub podobnym wektorze (przykładowo przez użycie umieruchominego lub wyznakowanego białka lub peptydu BR43x2). Geny kodujące polipeptydy mające domeny zdolne do wiązania polipeptydu BR43x2 mogą być otrzymane poprzez przeszukiwanie losowych bibliotek polipeptydów eksponowanych na fagu lub bakterii, takich jak E. coli. Sekwencje nukleotydowe kodujące te polipeptydy mogą być otrzymane na szereg sposobów, takich jak losowa mutageneza, czy losowa synteza. Takie losowe biblioteki mogą być wykorzystywane w celu do wyszukiwania peptydów, które oddziaływają ze znaną sekwencją docelową, która może budować białko lub polipeptyd, takie jak ligand lub receptor, cząsteczka biologiczna lub sztuczna lub substancja organiczna lub nieorganiczna. Techniki tworzenia i przeszukiwania takich losowych bibliotek peptydowych są znane w dziedzinie (Lander i wsp. U.S. Patent Nr 5223409, Lander i wsp. U.S. Patent Nr 4946778, Lander i wsp. U.S. Patent Nr 5403484, Lander i wsp. U.S. Patent Nr 5571698 I Kay I wsp. Phage Display of peptides and proteins (Academic Press Inc, 1996) oraz losowe biblioteki peptydowe oraz zestawy do przeszukiwania takich bibliotek są dostępne komercyjnie, przykładowo z Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen Inc (San Diego, Ca), New England Biolabs, Inc. (Bevery, MA) oraz Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Losowe biblioteki peptydowe mogą być przeszukiwane przy zastosowaniu sekwencji BR4 3x2 załączonych tutaj, w celu identyfikacji białek, wiążących BR43x2.
Inną formą fragmentu przeciwciała jest peptyd kodujący pojedynczy obszar warunkujący komplementarność (CDR). Peptydy CDR mogą być otrzymane przez konstrukcje genów, kodujących CDR odpowiedniego przeciwciała. Takie geny mogą być przygotowywane przy zastosowaniu reakcji PCR, w celu syntezy róż nych regionów na podstawie RNA z komórek produkujących przeciwciał a (patrz przykładowo Larrick i wsp. Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106 1991), Courtenay-Luck, „Genetics manipulation of Monoclonal Antibodies” w Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter i wsp. strona 166 (Cambridge University Press 1995) oraz Ward i wsp. „Genetics manipulation and Expression of Antibodies” w Monoclonal Antibodies: Principles and Application, Birch i wsp. strona 137 (Wiley-Liss, Inc 1995)
Jednocześnie, przeciwciało anty-BR43x2 może pochodzić od „uczłowieczonego” przeciwciała monoklonalnego. Uczłowieczone przeciwciało monoklonalne może być wytworzone poprzez transfer mysiego CDR z ciężkich i lekkich łańcuchów zmiennych mysiej immunoglobuliny do ludzkiej domeny zmiennej. Typowe pozycje ludzkich przeciwciał są podstawiane do mysich odpowiedników. Zastosowanie przeciwciał pochodzących z humanizowanych przeciwciał monoklonalnych może powodować potencjalne problemy związane z immunogenicznością mysich regionów stałych. Techniki klonowania zmiennych domen mysich immunoglobulin są opisane przykładowo w Orlandi i wsp. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833, 1989. Techniki opisujące wytwarzanie humanizowanych przeciwciał są opisane przykładowo w Johns i wsp. Nature 321: 522 1986, Carter i wsp. Proc. Nat. Acad. Sci USA 89: 4285,
1992, Sandu crit. Rev. Biotech. 12: 437, 1992. Siger i wsp. J immune. 150: 2844, 1993, Sudhir Antibody Engineering Protocols (Humana Press Inc, 1995), Kelly „Engineering Therapeutic Antibodies”
PL 209 535 B1 w Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland i wsp. strony 399-434 (John Wiley and Sons, Inc 1996) oraz przez Queen i wsp. U.S. patent Nr 5693762 (1997).
Poliklonalne przeciwciała anty-idiotyp mogą być przygotowywane poprzez immuniację zwierząt przeciwciałami anty-BR43x2 lub fragmentami przeciwciał przy zastosowaniu standardowych technik. Dla przykładu patrz Green i wsp. „Production of Policlonal Antisera” w Immunochemical Protocols (wyd. Manson), strony 1-5 (Humama Press 1992) oraz Coligan na stronach 2.4.1-2.4.7. Jednocześnie monoklonalne przeciwciała anty-idiotyp mogą być przygotowywane przy użyciu przeciwciał anty-BR43x2 lub fragmentów przeciwciał jako immunogenów, przy zastosowaniu technik opisanych powyżej. Również, uczłowieczone przeciwciała anty-idiotyp lub ludzkie pierwotne przeciwciała anty-idiotyp, przy zastosowaniu technik opisanych powyżej. Metody wytwarzania przeciwciał anty-idiotyp są opisane przykładowo w Irie U.S. Patent Nr 5208146, Greene i wsp. U.S. Patent Nr 5637677 oraz Varthakavi i Minocha, J. Gen. Virol 77: 1875, 1996.
Przeciwciała lub polipeptydy w niniejszym wynalazku mogą być bezpośrednio lub pośrednio łączone z lekami, toksynami, izotopami i podobnymi, uzyskane połączenia mogą natomiast być używane do diagnostyki i leczenia in vivo. Przykładowo, polipeptydy lub przeciwciała wynalazku mogą być wykorzystane w identyfikacji tkanek lub organów wyrażających odpowiednie antykomplementarne cząsteczki (np. odpowiednio receptor lub antygen). Dokładnie, polipeptydy lub przeciwciała anty-BR43x2 lub ich aktywne części i fragmenty, mogą być połączone z łatwo wykrywanymi lub cytotoksycznymi cząsteczkami i dostarczane komórek ssaczych, tkanek lub organów, które wyrażają antykomplementarne cząsteczki.
Odpowiednie łatwo wykrywalne cząsteczki mogą być pośrednio lub bezpośrednio przyłączone do polipeptydów lub przeciwciał i zawierać izotopy, substraty, enzymy, kofaktory, inhibitory, markery fluorescencyjne, markery chemiluminescencyjne, cząstki magnetyczne itp. Odpowiednie cząsteczki cytotoksyczne mogą być pośrednio i bezpośrednio przyłączone do polipeptydów lub przeciwciał i zawierać toksyny bakteryjne lub roślinne (np. toksynę dipterii, eksotoksynę Pseudomonas, rycynę, abrynę, itp.), jak również lecznicze izotopy, takie jak jodynę-131, renium-188, itryd-90 (zarówno bezpośrednio przyłączone do polipeptydów lub przeciwciał, jak pośrednio poprzez np. resztę chelatującą) Polipeptydy i przeciwciała mogą być również połączone to leków cytotoksycznych, takich jak: andrymycyna. W przypadku połączenia pośrednio łatwo wykrywalnej lub cytotoksycznej cząsteczki, łatwo wykrywalna lub cytotoksyczna cząsteczka może być połączona z jednym z elementów pary komplementarnej, podczas gdy pozostały element z częścią przeciwciała lub polipeptydu. Przykładem pary komplementarnej może być oddziaływanie biotyna/streptawidyna.
Rozpuszczalne polipeptydy BR43x2 lub przeciwciała przeciw BR43x2 mogą być pośrednio lub bezpośrednio łączone z lekami, toksynami, izotopami i podobnymi, uzyskane połączenia mogą natomiast być używane do diagnostyki i leczenia in vivo. Przykładowo, polipeptydy lub przeciwciała wynalazku mogą być wykorzystane w identyfikacji tkanek lub organów wyrażających odpowiednie antykomplementarne cząsteczki (np. odpowiednio receptor lub antygen). Dokładnie, polipeptydy lub przeciwciała anty-BR43x2 lub ich aktywne części i fragmenty, mogą być połączone z łatwo wykrywanymi lub cytotoksycznymi cząsteczkami i dostarczane komórek ssaczych, tkanek lub organów, które wyrażają antykomplementarne cząsteczki.
Odpowiednie łatwo wykrywalne cząsteczki mogą być pośrednio lub bezpośrednio przyłączone do polipeptydów lub przeciwciał i zawierać izotopy, substraty, enzymy, kofaktory, inhibitory, markery fluorescencyjne, markery chemiluminescencyjne, cząstki magnetyczne itp. Odpowiednie cząsteczki cytotoksyczne mogą być pośrednio i bezpośrednio przyłączone do polipeptydów lub przeciwciał i zawierać toksyny bakteryjne lub roślinne (np. toksynę dipterii, eksotoksynę Pseudomonas, rycynę, abrynę, itp.), jak również lecznicze izotopy, takie jak jodynę-131, renium-188, itryd-90 (zarówno bezpośrednio przyłączone do polipeptydów lub przeciwciał, jak pośrednio poprzez np. resztę chelatującą) Polipeptydy i przeciwciała mogą być również połączone do leków cytotoksycznych, takich jak: andrymycyna. W przypadku połączenia pośrednio łatwo wykrywalnej lub cytotoksycznej cząsteczki, łatwo wykrywalna lub cytotoksyczna cząsteczka może być połączona z jednym z elementów pary komplementarnej, podczas gdy pozostały element z częścią przeciwciała lub polipeptydu. Przykładem pary komplementarnej może być oddziaływanie biotyna/streptawidyna.
Białka fuzyjne polipeptyd-toksyna lub białka fuzyjne przeciwciało/fragment toksyny mogą być używane do kierowanej inhibicji lub odcięcia tkankowego lub komórkowego (przykładowo przy leczeniu komórek luba tkanek nowotworowych). Jednocześnie, gdy polipeptyd ma wiele domen funkcjonalnych (tj. domenę aktywującą lub domenę wiążącą ligand oraz domenę sygnałową), białko fuzyjne,
PL 209 535 B1 zawierające tylko domenę sygnałową (kierującą) może być odpowiednie do kierowania łatwo wykrywalnej cząsteczki, cząsteczki cytotoksycznej lub komplementarnej do odpowiedniej komórki lub tkanki. W przykładach, w których domenowe białko fuzyjne zawiera komplementarną cząsteczkę, cząsteczka antykomplementarna może być dołączona do łatwo wykrywalnej lub cytotoksycznej cząsteczki. Takie domena-cząsteczka komplementarna białka fuzyjne stanowi mechanizm kierowanego dostarczania komórkowo- i tkankowospecyficznego połączonych z łatwo wykrywalnymi/cytotoksycznymi cząsteczkami komplementarnych cząsteczek. Opisane aktywne biologicznie połączone polipeptydy i przeciwciała mogą być podawane dożylnie, dotętniczo i doprzewodowo lub miejscowo w pożądane miejsce działania.
Przeciwciała mogą być wywarzane przeciw rozpuszczalnym polipeptydom BR43x2, do których przyłączone są etykietki His lub FLAG™. Przeciwciała mogą być również wywarzane przeciw białkom fuzyjnym MBP, produkowanym w E. coli. Dodatkowo, takie polipeptydy mogą zawierać białka fuzyjne z ludzkimi Ig. Dokładnie, surowica zawierająca przeciwciał a przeciw rozpuszczalnemu BR43x2, do których przyłączone są etykietki His lub FLAG™, może być używana do analizy dystrybucji BR43x2 w tkankach z wykorzystaniem immunocytochemii na tkankach ludzkich lub naczelnych. Takie rozpuszczalne BR43x2 może być również wykorzystywane do immunizowania myszy w celu otrzymywania przeciwciał monoklonalnych przeciw rozpuszczalnemu ludzkiemu BR43x2. Przeciwciała monoklonalne przeciw rozpuszczalnemu ludzkiemu BR43x2 mogą być używane w naśladowaniu wiązania ligand/receptor, w wyniku czego może dojść aktywacji lub inaktywacji pary ligand/receptor. Przykładowo, zademonstrowano, że połączenie kowalencyjne przeciwciał monoklonalnych przeciw rozpuszczalnemu CD40, powoduje sygnał stymulujący dla komórek B, które prawie optymalnie aktywowano anty-IgM lub LPS, w wyniku czego dochodzi do proliferacji i produkcji immunoglobulin. Te same przeciwciała monoklonalne działają jako antagoniści, gdy są używane w roztworze, blokując aktywacje receptora. Przeciwciała monoklonalne przeciw BR43x2 mogą być używane do wykrywania dystrybucji, regulacji i oddziaływań biologicznych pary BR43x2/BR43x2-ligand w specyficznych liniach komórkowych, zidentyfikowanych w badaniach dystrybucji tkankowej.
Wynalazek dostarcza również wyizolowane i oczyszczone polinukleotydowe sondy i startery BR43x2, TACI i BCMA. Takie polinukleotydowe sondy mogą być w postaci DNA lub RNA. DNA może być DNA genomowym lub cDNA. Polinukleotydowe sondy to jedno- lub dwuniciowe DNA lub RNA, zwykle sztuczne oligonukleotydy, ale mogą być równiej wytwarzane ze sklonowanego cDNA lub sekwencji genomowej, i zawierają przynajmniej 16 nukleotydów, częściej od 17 do 25 nukleotydów, czasami od 40 do 60 nukleotydów, a w niektórych przykładach pokaźną część domeny lub nawet cały gen BR43x2 lub jego cDNA. Sondy i startery stanowią zwykle sztuczne oligonukleotydy, ale mogą być równiej wytwarzane ze sklonowanego cDNA, ich sekwencji genomowej lub ich odpowiedników. Sondy analityczne mają zazwyczaj 20 nukleotydów długości, chociaż czasami krótsze sondy (14 - 17 nukleotydów) mogą być używane. Startery do PCR muszą mieć przynajmniej 5 nukleotydów długości korzystnie 15 lub więcej nukleotydów, zaś najbardziej korzystnie 20 do 30 nukleotydów. Krótkie polinukleotydy mogą być używane, gdy analizowane są małe regiony genu. W przypadku dużych analiz genów sondy polinukleotydowe mogą zawierać cały ekson lub więcej. Sondy mogą być znakowane w celu wykrywania np. enzymatycznie, przez biotynę , izotopami, fluoroforami, chemiluminescencyjnie, cząstkami magnetycznymi itp., które są dostępne komercyjnie z wielu źródeł, takich jak Molecular Probes, Inc., Eugene, OR i Amersham Corp., Arlington Heights, IL, przy użyciu technik dobrze znanych w dziedzinie. Korzystnymi obszarami do konstrukcji sond są region wiążący ligant, pseudo powtórzenia bogate w cysteinę, sekwencje sygnałowe i podobne. Techniki wytwarzania sond polinukleotydowych oraz techniki hybrydyzacyjne są dobrze znane w dziedzinie, dla przykładu patrz Ausubel i wsp., wyd., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley i Sons, Inc., NY, 1991.
Peptydy i przeciwciała BR43x2, TACI i BCMA mogą być używane w systemach diagnostycznych w celu wykrywania obecności BR43x2, TACI i BCMA oraz polipetydów ligandowych BR43x2, TACI i BCMA, takich jak ztnf4. Informacje uzyskane przy zastosowaniu odpowiednich metod detekcji mogą dostarczyć wskazówek dotyczących znaczenia polipeptydów BR43x2 w różnych chorobach oraz mogą być wykorzystane jako narzędzia diagnostyczne w chorobach, w których zmienione poziomy BR43x2 mają znaczenie. Zmienione poziomy polipeptydów receptorowych BR43x2, TACI i BCMA mogą wskazywać stany patologiczne w chorobach nowotworowych, autoimmunologicznych i infekcyjnych.
W podstawowym teś cie jednoniciowa sonda jest inkubowana z RNA wyizolowanego z próbki biologicznej w temperaturze i sile jonowej, umożliwiającej parowanie pomiędzy sondą a cząsteczkami RNA BR43x2, TACI i BCMA. Po oddzieleniu niezwiązanej sondy można wykryć ilość powstałych hybryd.
PL 209 535 B1
Dobrze znane metody hybrydyzacji RNA, włączając analizę northern i hybrydyzację typu dot/slot blot (dla przykładu patrz Ausubel ibid. i Wu i wsp. (wyd.), „Analysis of Gene Expression at the RNA Level”, w Methods in Gene Biotechnology, strony 225-239 (CRC Press, Inc. 1997)). Sondy kwasów nukleinowych mogą być znakowane radioizotopami, takimi jak 32P i 35S. Dodatkowo, RNA BR43x2 może być wykrywane w metodach hybrydyzacji nieradioaktywnej (dla przykładu patrz Issac (wyd.), Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Humana Press, Inc., 1993). Zwykle, nieradioaktywna detekcja opiera się na chromogenicznych i chemiluminescencyjnych przemianach enzymatycznych, wykorzystujących biotynę, flouroesceinę i digoksygeninę.
Sondy oligonukleotydowe BR43x2, TACI i BCMA mogą być również użyteczne w diagnostyce in vivo. Przykładowo, oligonukleotydy wyznakowane 13F mogą być podane osobnikom badanym i wizualizowane poprzez pozytronową tomografię emisyjną (Tavitian i wsp., Nature Medicine 4: 467, 1998).
Wiele metod diagnostycznych, dla zwiększenia czułości detekcji, wykorzystuje reakcję PCR. Standardowe techniki przeprowadzania PCR są dobrze znane (patrz, Mathew (wyd.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (wyd.) PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (wyd.), Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek I Walaszek (wyd.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (wyd.), Clinical Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998), i Meltzer (wyd.) PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998). Startery do PCR mogą być projektowane tak, by amplifikować sekwencję kodującą odpowiednią domenę lub motyw BR43x2, taki jak BR43x2, TACI i BCMA pseudo powtórzenie bogate w cysteinę.
Jedną z odmian PCR wykorzystywaną w testach diagnostycznych jest RT-PCR. W technice RT-PCR RNA może być izolowane z próbki biologicznej, następnie poddawane reakcji odwrotnej transkrypcji, tak by powstał cDNA, następnie cDNA jest inkubowany ze starterami BR43x2 (dla przykładu patrz Wu i wsp. (wyd.), „Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR”, w Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc. strony 15-28, 1997). Po czym można przeprowadzić reakcję PCR i analizować produkty używając standardowych technik.
Przykładowo, RNA może być izolowane z próbki biologicznej przy zastosowaniu lizy komórek tiocyjankiem guanidyny (opisane powyżej). Jednocześnie, techniki stałej fazy mogą być wykorzystywane do izolacji mRNA z ekstraktu komórek. Reakcja odwrotnej transkrypcji może być rozpoczynana na matrycy wyizolowanego RNA przy wykorzystaniu losowych oligonukleotydów, krótkich homopolimerów dT lub antysensownych oligomerów BR43x2, TACI i BCMA. Startery oligo-dT są korzystne ze względu na to, że różne sekwencje mRNA mogą być amplifikowane, stanowiąc późniejszą kontrolę. Sekwencje BR43x2, TACI i BCMA mogą być amplifikowane w reakcji PCR przy użyciu otaczających starterów oligonukleotydowych o typowej długości, przynajmniej 5 nukleotydów.
Produkty amplifikacji w reakcji PCR mogą być wykrywane różnymi sposobami. Przykładowo, produkty PRC mogą być frakcjonowane poprzez elektroforezę w żelu i wizualizowane poprzez barwienie bromkiem etydyny. Dodatkowo, rozdzielone produkty PCR mogą być przenoszone na filtr, hybrydyzowane z wyznakowaną sondą BR43x2 oraz sprawdzane poprzez autoradiografię. Dodatkowe podejścia mogą zawierać użycie trójfosforanów kwasów deoksyrybonukleinowych wyznakowanych digoksygeniną, w celu detekcji chemiluminescencyjnej i testu kolorymetrycznego C-TRAK.
Innym podejściem jest ilościowa reakcja PCR czasu rzeczywistego (Real Time PCR) (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Ct.). Sonda fluorogeniczna, zawierająca oligonukleotyd z barwnikiem reporterowym i wytłumiającym, może się łączyć specyficznie pomiędzy prawym i lewym starterem. Przy wykorzystaniu 5' endonukleolitycznej aktywności polimerazy DNA Taq, barwnik reporterowy jest oddzielany od barwnika wytłumiającego i, w ten sposób, generowany jest specyficzny sygnał, który wzrasta wraz z postępem amplifikacji. Intensywność fluorescencji może być w sposób ciągły obserwowana i mierzona podczas trwania reakcji PCR.
Innym podejściem, umożliwiającym wykrywanie ekspresji BR43x2, TACI i BCMA, jest technika CPT, w której jednoniciowe DNA wiąże się z nadmiarem chimerycznej sondy DNA-RNA-DNA, tworząc kompleks, następnie RNA jest przecinane RNazą H, po czym badana jest obecność przeciętej chimerycznej sondy (dla przykładu patrz Beggs i wsp., J. Clin. Microbiol. 34: 2985, 1996 i Bekkaoui i wsp., Biotechniques 20: 240, 1996). Innymi metodami detekcji sekwencji BR43x2, TACI i BCMA są: NASBA, CATCH oraz LCR (dla przykładu patrz Marshall i wsp., U.S. Patent No. 5,686,272 (1997), Dyer i wsp., J. Virol. Methods 60: 161, 1996; Enricht i wsp., Eur. J. Blochem. 243: 358, 1997 i Chadwick i wsp., J. Virol. Methods 70: 59, 1998). Inne standardowe metody są dobrze znane specjalistom w danej dziedzinie.
PL 209 535 B1
Sondy i startery BR43x2, TACI i BCMA mogą być również używane w celu wykrywania i lokalizacji ekspresji genów BR43x2, TACI i BCMA w próbkach tkanek. Metody takiej hybrydyzacji in situ są dobrze znane specjalistom w danej dziedzinie (dla przykładu patrz Choo (wyd.), In Situ Hybridization Protocols, Humana press, Inc., 1994, Wu i wsp., (wyd.) „Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization (RISH)” w Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., strony 259-278, 1997 I Wu I wsp. (wyd.), „Localization of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH)”, w Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., strony 279-289, 1997).
Wiele innych podejść diagnostycznych jest dobrze znanych specjalistom w danej dziedzinie (dla przykładu patrz Methew (wyd.), Protocols in Human Molecular Genetics, Humana Press, Inc., 1991; Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics, Humana Press, Inc., 1996 i Elles, Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press, Inc., 1996).
Dodatkowo, opisane sondy polinuklotydowe mogą być wykorzystywane w hybrydyzacji do odpowiednich sekwencji na odpowiednich chromosomach. Identyfikacja na chromosomie i/lub mapowanie genu BR43x2 może dostarczyć użytecznej informacji na temat funkcji i powiązania z chorobami. Wiele technik mapowania jest dostępna specjalistom w dziedzinie, na przykład mapowanie hybryd komórek somatycznych i technika FISH. Korzystna metodą jest radiacyjne mapowanie hybryd. Radiacyjne mapowanie hybryd jest techniką genetyczną na komórkach somatycznych, opracowaną w celu konstruowania ciągłych map o wysokiej rozdzielczości ssaczych chromosomów (Cox i wsp., Science 250: 245-50, 1990). Częściowa lub pełna znajomość sekwencji genów pozwala na zaprojektowanie starterów do PCR odpowiednich do wykorzystania w radiacyjnym mapowaniu chromosomów hybryd. Dostępne są komercyjne panele do radiacyjnego mapowania hybryd, pokrywające cały ludzki genom, takie jak Stanford G3 RH Panel i GeneGridge 4 RH Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL.). Panele takie pozwalają na szybką, opartą na PCR lokalizację i uporządkowanie genów, sekwencji STS i innych niepolimorficznych i polimorficznych markerów w obrębie odpowiedniego obszaru. Podejście to pozwala na ustalenie proporcjonalnych fizycznych odległości pomiędzy nowo okrytymi genami i uprzednio zmapowanymi markerami. Precyzyjna znajomość pozycji genu może być użyteczna na wiele sposobów: 1) pozwala na ustalenie, czy sekwencja jest częścią istniejącego contigu i na uzyskanie otaczających sekwencji genetycznych w różnej postaci (YAC, BAC lub klony cDNA), 2) pozwala na ustalenie genu związanego z chorobą dziedziczną, który mieści się w tym samym obszarze chromosomu i 3) pozwala na odwoływanie się do sekwencji modelowych organizmów, takich jak mysz, co może być pomocne w określaniu funkcji danego genu.
Lokalizacja chromosomowa może być przeprowadzona z wykorzystaniem sekwencji STS. STS stanowi sekwencje DNA, która jest unikalna w genomie ludzkim i może być używana jako odniesienie dla danego chromosomu lub obszaru na chromosomie. STS może być zdefiniowany przez parę oligonukleotydowych starterów, które mogą być użyte w reakcji PCR do wykrycia obecności danej sekwencji w sekwencjach genomowych. Ponieważ STS są oparte na sekwencjach DNA, mogą być dokładnie opisane w ramach bazy danych, np. dbSTS, GenBank (National Center for Bilogical Information, National Institutes of Health, Bethesda, MD http: //www.ncbi.nlm.nih.gov) i mogą być przeszukiwane z sekwencją odpowiedniego genu pod kątem danych zawartych w pojedynczym STS.
Opisywany wynalazek dostarcza również odczynniki do dodatkowych zastosowań w diagnostyce. Na przykład, gen BR43x2, sonda zawierająca DNA lub RNA BR43x2 lub ich podsekwencje, które mogą być użyte w celu stwierdzenia, czy gen BR43x2 jest obecny na odpowiednim chromosomie lub czy zawiera mutacje. Wykrywalne aberracje chromosomowe w locus genu BR43x2 zawierają, nie będąc ograniczone do, aneuploidia, zmiany w liczbie kopii genu, insercje, delecje, zmiany w mapie restrykcyjnej oraz rearanżacje. Wymienione aberracje mogą powstawać w obrębie sekwencji kodującej, w obrębie intronów lub w obrębie sekwencji otaczających, zawierających promotor i obszary regulatorowe, i mogą dotyczyć zmian fizycznych sekwencji kodującej lub zmian w poziomie ekspresji genu.
Wymienione metody diagnostyczne składają się z następujących etapów: a) otrzymanie próbki genetycznej od pacjenta, b) inkubacja otrzymanej próbki z sonda polinukleotydową lub starterem opisanymi powyżej, w warunkach, w których polinukleotyd będzie hybrydyzował do komplementarnej sekwencji, wytwarzając pierwszy produkt reakcji i c) porównanie pierwszego produktu reakcji z produktem reakcji kontrolnej. Różnica pomiędzy pierwszym produktem reakcji i produktem reakcji kontrolnej jest równoznaczna z występowaniem nieprawidłowości genetycznych u pacjenta. Próbki genetyczne używane w ramach opisywanego wynalazku to: DNA genomowy, cDNA i RNA. Sondy polinukleotydowe oraz startery mogą być RNA lub DNA, i zawierać fragment SEQ ID NR: 3, składnik
PL 209 535 B1
SEQ ID NR: 1 lub ich odpowiednik w postaci RNA. Odpowiednie metody testowe w tym względzie zawierają techniki genetyki molekularnej znane specjalistom w dziedzinie, takie jak analiza RFLP, analiza STR wykorzystująca techniki PCR, technika LCR (Barany, PCR Methods and Applications 1: 5-16, 1991), testy typu ochrona przed rybonukleazą i inne techniki genetyczne znane w dziedzinie (Sambrook i wsp., ibid., Ausbel i wsp., idid., Marian, Chest 108: 255-65, 1995). Testy typu ochrona przed rybonukleazą (patrz np. Ausubel i wsp., ibid, ch. 4) zawierają hybrydyzację sondy RNA do próbki RNA pacjenta, po czym produkt reakcji (hybryda RNA-RNA) jest wystawiany na działanie RNAzy. Shybrydyzowane obszary RNA są zabezpieczone przed trawieniem. W ramach testów wykorzystujących PCR, genetyczna próbka pacjenta jest inkubowana z starterami polinukleotydowymi, następnie obszar pomiędzy starterami jest amplifikowany. Zmiany w rozmiarze i ilości otrzymywanego produktu są jednoznaczne z występowaniem mutacji u pacjenta. Inną techniką opierającą się na PCR, która może być wykorzystana jest analiza SSCP (Hayashi, PCR Methods and Applications 1: 34-8, 1991).
Metodologia wykorzystująca antysensowne RNA może być użyta w celu zablokowania transkrypcji genów BR43x2, TACI i BCMA, aby zatrzymać rozwój komórek B oraz oddziaływanie z innymi komórkami. Możliwe jest zaprojektowanie polinukleotydów komplementarnych do segmentów polinukleotydów kodujących BR43x2, TACI i BCMA (np. polinukleotyd przedstawiony w ramach SEQ ID NR: 3) w celu zwią zania mRNA kodującego BR43x2, TACI i BCMA i uniemożliwienia translacji takiego mRNA. Takie antysensowne polinukleotydy mogą być użyte do zatrzymania ekspresji genów kodujących polipeptydy BR43x2, TACI i BCMA w hodowlach komórkowych i u osobników badanych.
Myszy zmienione genetycznie tak, by wyrażać BR43x2, TACI lub BCMA są nazywane „myszami transgenicznymi”, natomiast myszy wykazujące całkowity brak funkcji BR43x2, TACI lub BCMA są nazywane myszami „znokautowanymi” i mogą być również wytworzone. (Snouwaert i wsp., Science 257: 1083, 1992; Lowell i wsp., Nature 366: 740-42, 1993; Cepecchi, Science 244: 1288-92, 1989; Palmiter i wsp. Ann Rev Genet. 20: 465-99, 1986). Na przykład, myszy transgeniczne, które nadeksprymują BR43x2, TACI lub BCMA zarówno we wszystkich tkankach, jak i w sposób specyficzny lub ograniczony tkankowo, mogą być wykorzystane dla zbadania, czy nadekspresja powoduje fenotyp. Przykładowo, nadekspresja dzikiej formy polipeptydu BR43x2, TACI lub BCMA, fragmentu polipeptydu lub mutanta może zmieniać procesy komórkowe, co będzie się objawiać fenotypem identyfikującym tkankę, w której ekspresja BR43x2, TACI lub BCMA wpływa na funkcje i może wyznaczać cel terapeutyczny dla BR43x2, TACI lub BCMA lub ich agonistów i antagonistów. Przykładowo, korzystne byłoby wytworzenie myszy transgenicznej nadeksprymującej rozpuszczalne BR43x2, TACI lub BCMA. Dodatkowo, taka nadekspresja może powodować fenotyp, wykazujący podobieństwa z ludzkimi chorobami. Podobnie knockout BR43x2, TACI lub BCMA może być wykorzystany w celu określenia, gdzie BR43x2 jest niezbędny in vivo. Fenotyp myszy znokautowanej może być podobny do efektu, który jest obserwowany w przypadku antagonistów BR43x2, TACI lub BCMA in vivo. Ludzkie cDNA DNA BR43x2, TACI lub BCMA może być wykorzystane w celu izolacji mysiego mRNA cDNA lub genomowego DNA BR43x2, TACI lub BCMA, które mogą być wykorzystane przy wytwarzaniu znokautowanych myszy. Te myszy mogą być wykorzystne w badaniach genu BR43x2, TACI lub BCMA i kodowanych białek w systemie in vivo i mogą być użyte jako modele in vivo dla odpowiednich chorób ludzkich. Dodatkowo, transgeniczna ekspresja antysensownych polinukleotydów lub rybozymów skierowanych przeciwko BR43x2, TACI lub BCMA opisanych tutaj, może być użyta analogicznie do opisanych powyżej myszy transgenicznych.
Farmaceutycznie efektywne ilości polipeptydów BR43x2, TACI lub BCMA niniejszego wynalazku mogą być przygotowane z akceptowanymi farmaceutycznie nośnikami dla podawania pozajelitowego, doustnego, donosowego, odbytniczego, miejscowego i przezskórnego itp., zgodnie z konwencjonalnymi metodami. Przygotowania mogą ponadto zawierać jeden lub więcej rozcieńczalników, wypełniaczy, konserwantów, buforów, emulsyfikatorów, zarobek i im podobnych, i mogą być dostarczane, jako płyny, proszki, emulsje, czopki, lipozomy, plastry, tabletki itp. Powolne lub wzmożone systemy dostarczania zawierające dowolne z wielu systemów biopolimerowych, zawierających lipozomy, oraz systemy polimerowe, mogą być również wykorzystywane w celu ciągłego i długoterminowego dostarczania polipeptydu BR43x2 lub antagonisty. Takie powolne systemy mogą być wykorzystywane w przypadku uż ycia doustnego, miejscowego i pozajelitowego. Termin „akceptowany farmaceutycznie nośnik” dotyczy nośnika, który nie wpływa na efektywność aktywności biologicznej aktywnych składników i który nie jest toksyczny dla gospodarza lub pacjenta. Specjalista w dziedzinie może przygotowywać związki niniejszego wynalazku w odpowiedni sposób i w zgodzie z uznanymi metodami, takimi
PL 209 535 B1 jak opisane w Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, wyd., Mack Publishing Co., Easton PA, 19th wyd., 1995.
Jak użyto w niniejszym opracowaniu, farmaceutycznie efektywna ilość polipeptydu BR43x2, TACI lub BCMA, antagonisty lub agonisty, jest ilością wystarczającą do wywołania pożądanego efekty biologicznego. Efektem może być złagodzenie oznak, symptomów lub przyczyn choroby lub inne pożądane zmiany systemu biologicznego. Przykładowo, efektywna ilość polipeptydu BR43x2, TACI lub BCMA to taka, która powoduje zarówno ustąpienie objawów jak i poprawę zauważalną przez lekarza lub innego wykwalifikowanego obserwatora. Przykładowo, efektywna ilość polipeptydu lub rozpuszczalnej fuzji BR43x2, TACI lub BCMA może powodować obniżenie odpowiedzi komórek B podczas odpowiedzi immunologicznej lub zmniejszoną produkcję autoprzeciwciał, zatrzymanie symptomów związanych z SLE, MG lub RA. Efektywne ilości BR43x2, TACI lub BCMA obniżają procent komórek B i krwi obiegowej. Efektywne iloś ci polipeptydów BR43x2, TACI lub BCMA mogą się wahać w zależności od choroby lub symptomów. Ilość polipeptydu, która ma być podana, oraz jego stężenie podczas przygotowywania zależy od wybranego podłoża, sposobu podania, potencji odpowiedniego polipeptydu, stanu klinicznego pacjenta, efektów ubocznych oraz stabilności związków. Zatem, lekarz powinien przygotować preparat o odpowiednim stężeniu i w odpowiedniej ilości, w zależności od historii klinicznej pacjenta z uwzględnieniem podobnych przypadków. Te ilości zależeć będą, w części, od szczególnego stanu, wieku, wagi, ogólnego stanu zdrowia pacjenta i innych czynników ewidentnych dla biegłych w danej dziedzinie. Zazwyczaj, dawka będzie się wahać z zakresie 0,1 - 100 mg/kg masy ciała osobnika. Dawki odpowiednich związków mogą być określone w badaniach in vitro lub ex vivo w połączeniu z badaniami na zwierzętach doś wiadczalnych. Stężenia związków, które były efektywne w badaniach in vitro lub ex vivo mogą dostarczyć wskazówek w badaniach nad zwierzętami, w których dawki są wyliczane tak, aby zachować te same stężenia w miejscu działania.
Wynalazek będzie dalej przedstawiony w następujących, nieograniczających przykładach.
Przykłady
P r z y k ł a d 1
Identyfikacja BR43x2
Izoformę TACI sklonowano przy użyciu biblioteki RPMI w postaci uporządkowanego zestawu i podejścia wykorzystującego sekrecję. Bibliotekę RPMI 1788 (aktywowane komórki B) uporządkowano wykorzystując 20 96-studzienkowych płytek mikrotitracyjnych. Każda studzienka zawierała ok. 100 kolonii E. coli; każda kolonia natomiast zawiarała jeden klon cDNA. Minipreparaty przygotowywano bezpośrednio na 96-studzienkowej płytce, stosując TomTech Quadra 9600. Wyizolowane DNA połączono w 120 puli, w której każda zawierała 1600 klonów. Pulami transfekowano komórki Cos-7 i wysiewano na 12-studzienkowe płytki. Mieszano 3 mikrolitry DNA pochodzącego z odpowiedniej puli, 5 μ l LipofectAMINE oraz 92 μ l poż ywki DMEM bez surowicy 50 mg pirogronianu sodu, 146 mg
L-glutaminy, 5 mg transferyny, 2,5 mg insuliny, 1 μl selenu i 5 mg fetuiny w 500 ml DMEM), inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 min., po czym dodawano 400 μl pożywki DMEM bez surowicy. Mieszaninę DNA-LipofectAMINE dodawawano do 220000 komórek Cos-7 na studzienkę, wysiewano na 12-studzienkową płytkę do hodowli tkankowych, a następnie inkubowano 5 godzin w temp. 37°C. Po 5 godzinach dowawano 500 μl pożywki DMEM z 20% FBS (100 ml FBS, 55 mg pirogronianiu sodu 146 mg L-glutaminy w 500 ml DMEM) i inkubowano komórki przez noc.
Przeszukiwanie z wykorzystaniem sekrecji przeprowadzano przy użyciu biotynowanego, ztnf4 z etykietką FLAG. Komórki przemywano PBS i utrwalano przez 15 minut 1,8% formaldehydem w PBS. Następnie przemywano komórki byforem TNT (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl i 0.05% Tween-20 w H2O). Następnie komórki permeabilizowano 0,1% Triton-X w PBS, przez 15 minut i przenywano TNT. Następnie komórki blokowano przez 1 godzinę w buforze TNB (0,1 M Tris-HCl, 0,15 M NaCl i 0.5% odczynnik blokujący) przy użyciu zestawu NEN Renaissance© TSA-Direct Kit (NEN, Boston, MA), zgodnie z zaleceniami producenta. Komórki przemywano TNT i blokowano przez 15 minut awidyna a późnej biotyną (Vector Labs Cat# SP-2001), przemywając TNT pomiędzy poszczególnym blokowaniem. Komórki inkubowano przez 1 godzinę z 1 nl/ml ztnf4/Flag/Biotyna w TNB, a następnie przepłukiwano TNT. W kolejnym kroku komórki inkubowano z połączeniem streptawidyina-HRP (NEN) rozcieńczonym 1:300 w TNB i przepłukiwane TNT. Hybrydyzację wykrywano tyramidem fluoresceiny rozcieńczonym 1:50 w buforze do rozcieńczania (NEN), inkubując przez 4,4 minuty i przepłukując TNT. Komórki zabezpieczano w Vectashield Mounting Media (Vector Labs, Burlingame, CA) rozcieńczonym 1:5 w TNT.
PL 209 535 B1
Komórki wizualizowano w mikroskopie fluorescencyjnym z filtrem FITC. Dwanaście puli było pozytywnych pod względem wiązania ztnf4. Pulę D8 (zawierającą 1600 klonów) rozbito na pojedyncze klony (D8-1) i wyizolowano pozytywne pod względem ztnf4. Przy użyciu sekwencjonowania ustalano, że klon D8-1, zawierał sekwencje polipeptydu, będącego izoformą TACI, w którym Phe21-Arg67 pierwsze pseudo powtórzenie bogate w cysteinę było zastąpione pojedynczym aminokwasem (tryptofanem). Uzyskaną izoformę nazwano BR43x2, zaś jej sekwencja polinukleotydową przedstawiono na Seq. Id nr: 1.
P r z y k ł a d 2
Lokalizacja BR43x1 w limfocytach i monocytach.
W celu zlokalizowania ekspresji BR43x1 w komórkach B i T oraz monocytach wykorzystano technikę RT-PCR. Użyto startery ZC19980 (SEQ ID Nr: 15) i ZCI9981 (SEQ ID Nr: 16) w celu przeszukania cDNA CD19+, CD3+ i monocytów pod kątem BR43. Reakcję odwrotnej transkrypcji przeprowadzano w 94°C przez 3 minuty, po czym przez 30 cykli w 94°C przez 30 sekund, 68°C przez 2 minuty i 72°C przez 1 minutę, a następnie 7 minutowe wydłuż anie w 72°C. Prążek o długości 720 bp wykryto tylko w przypadku komórek B, przy braku w aktywowanych komórkach T, tak jak donoszono w przypadku przeciwciał dla TACI (von Bulow i Bram).
P r z y k ł a d 3
Test proliferacji komórek B, wykorzystujący ligand BR43-ztnf4.
Probówkę zawierającą 1 x 108 zamrożonych komórek PBMCS szybko rozmrożono w łaźni wodnej w in 37°C i zawieszono w 25 ml pożywki dla komórek B (Iscovels Modified Dulbecco's Medium, 10% FSB inaktywowana termicznie, 5% L-glutamina, 5% Pen/Strep) w 50 ml probówce. Przeżywalność komórek testowano za pomocą barwnika Trypan Blue (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). 10 μl mieszaniny Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) dodano pod zawiesinę komórek i wirowano prze 30 minut w 1800 rpm zatrzymując bez hamowania. Następnie usunięto interfazę i przeniesiono do nowych probówek na 50 ml, doprowadzono do objętości 40 ml buforem PBS i wirowano prze 10 minut w 1200 rpm zatrzymując z hamowaniem. Przeżywalność komórek B testowano barwnikiem Trypan Blue. Komórki B zawieszono w gęstości 1 x 106 komórek/ml w pożywce do komórek B w wysiawano 180 μl/studzienka w 96-studzienkowej płytce z dnami w kształcie litery „U” (Falcon, VWR, Seattle, WA).
Do komórek dodawano jeden z poniżej wymienionych stymulatorów tak by całkowita objętość wynosiła 200 gl.
Rozpuszczalne, ztnf-4sCF z etykietką FLAG lub ztnf-4sCF w rozcieńczeniach 10 krotnych od 1 mg-1 ng/ml, zarówno same jak i z 10 gg/ml anty-IgM (kozie przeciwciało anty ludzkie IgM) rozpuszczone w NaH2CO3, ph 9,5, (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) lub z 10 gg/ml anty-IgM i 10 ng/ml zrekombinowanego IL4 (rozpuszczonego w PBS i 0,1% BSA). Dodatkowo testowano również inne cytokiny takie jak IL-3 i IL-6 jak również rozpuszczalne przeciwciało CD40 (sCD40) (Pharmingen, San Diego, CA). W ramach kontroli komórki inkubowano z 0,1% BSA i PBS, 10 gg/ml anty-IgM lub 10 gg/ml anty-IgM i 10 ng/ml IL4 (lub innymi cytokinami). Następnie komórki inkubowano w at 37°C w wilgotnym inkubatorze przez 72 godziny. 16 godzin przed zebraniem 1 gCi 3H tymidyny dodawano do każdej studzienki. Komórki zbierano do 96-studzienkowej filtrowanej płytki (UniFilter GF/C, Packard, Meriden, CT), poczym zbierano przy użyciu odpowiedniego urządzenia zbierającego (Packard), zgodnie z zaleceniami producenta. Następnie płytki suszono w 55°C przez 20-30 minut, po czym zatykano denka płytki. Do każdej studzienki dodawano 0.25 ml płynu scyntylacyjnego (Microscint0, Packard) i odczytywano płytki przy użyciu TopCount Microplate Scintillation Counter (Packard).
W celu zmierzenia indukcji produkcji IgG w odpowiedzi na różne mitogeny komórek B po stymulacji oczyszczonych komórek B, komórki przygotowywano zgodnie z opisem i inkubowano przez 9 dni. Zbierano odsącz komórek w celu zbadania produkcji IgG.
W celu zmierzenia aktywacji markerów powierzchniowych w odpowiedzi na różne mitogeny komórek B po stymulacji oczyszczonych komórek B, komórki przygotowywano zgodnie z opisem i inkubowano tylko przez 48 godzin. Komórkowe markery powierzchniowe mierzono wykorzystując analizę FACS.
Proliferacja ludzkich oczyszczonych komórek B stymulowanych różnymi mitogenami komórek B jest podsumowana w tabeli 5.
PL 209 535 B1
T a b e l a 5
| Stymulant | Indeks proliferacji |
| ztnf 4 | 1.5 |
| ztnf4 + IL4 | 9.9 |
| ztnf4 + anty-IgM + IL4 | 15. 8 |
Synergiczny wpływ ztnf4 z IL4, IL3 (10 μg/ml) I IL6 (10 μg/ml) zaobserwowano w przypadku proliferacji komórek B. Obserwowano też dwukrotne zwiększenie przekazywania sygnału komórek B przy użyciu sCD40.
Indukcja produkcji IgG (ng/ml) w odpowiedzi na różne mitogeny komórek B po stymulacji oczyszczonych komórek B jest podsumowana w Tabeli 6.
T a b e l a 6.
| Stymulant | kontrola | Ztnf4 |
| anti-IgM | 3 | 7,5 |
| anti-IgM + IL-4 | 13 | 32 |
| anti-IgM+ IL-4+ IL-5 | 10 | 45 |
Zaobserwowano wzrost aktywacji markerów powierzchniowych po stymulacji oczyszczonych komórek B tylko zntf4, z anty-IgM lub z anty-IgM i IL4. Nie zaobserwowano natomiast wpływu na proliferację PBMNC w obecności optymalnej lub suboptymalnej dawki mitogenów komórek T. Jednocześnie nie zaobserwowano wpływu na produkcję TNFa w oczyszczonych monocytach w odpowiedzi na stymulację LPS.
Figura 3 przedstawia koaktywacje ludzkich limfocytów B do proliferacji i wydzielania immunoglobulin przez ztnf4. Fig. 3A, przedstawia proliferację oczyszczonych ludzkich komórek PBMNC w odpowiedzi na stymulację rozpuszczalnym ztnf4 (25 ng/ml) w obecności tylko IL-4, IL-4 z anty-IgM, anty-CD40 lub anty-CD19 po 5 dniach hodowli. Fig. 3B przedstawia poziomy IgM i IgG mierzone w supernatantach, otrzymanych z ludzkich komórek B stymulowanych rozpuszczalnym ztnf4 w obecności IL-4, IL-4 i IL-5 po 9 dniach hodowli.
Wyniki te sugerują, że rozpuszczalne ztnf4 jest cząstką aktywującą komórki B, która działa razem z innymi stymulantami komórek B i słabo jako jedyna. Rozpuszczalne ztnf4 powoduje proliferacje komórek B i produkcję IgG. Podnoszenie poziomów cząsteczek adhezyjnych, kostymulujących i receptorów aktywujących sugeruje udział w funkcjach APC komórek B.
Figura 4 przedstawia stymulowanie ludzkich komórek PBMNC rozpuszczalnym ztnf4 (25 ng/ml) lub białek kontrolnych (ubikwityna) w obecności 10 ng/ml IL-4 przez 5 dni in vitro. Oczyszczone TACI-IG, BCMA-IG oraz kontrolne Fc testowano pod względem hamowania specyficznej proliferacji pod wpływem rozpuszczalnego ztnf4.
P r z y k ł a d 4
Selekcja komórek BHK stransformowanych TACI i BCMA przy wykorzystaniu wiązania ztnf4.
Komórki BHK wyrażające TACI na wysokim poziomie selekcjonowano poprzez klonowanie rozcieńczone pul transfektantów. Stransfekowane komórki (2 x 105) inkubowano w lodzie przez 30 minut z biotynolowanym ztnf4 o stężeniu 1 μg/ml w buforze do wiązania (PBS, 2% BSA, 0.02% NaN3), następnie komórki przemywano kolejno w buforze do przemywania, inkubowano z SA-PE (Caltag) (rozcieńczenie 1: 1000 w buforze do wiązania) w lodzie przez 30 minut. Następnie komórki przemywano 2 razy w buforze do wiązania, zawieszano również w buforze do wiązania i analizowano przy użyciu FACS (FACS Vantage, Becton Dickinson). Wyselekcjonowano klony wykazujące najwyższe wiązanie TNF4.
Komórki BHK wyrażające białko BCMA na wysokim poziomie wyselekcjonowano na drodze znakowania powierzchniowego puli transfektantów wyrażających BCMA przy użyciu biotynylowanego ztnf4. Następnie dokonywano sterylnego sortowania poprzez Streptavidin-Phyco-Erythrin (SA-PE Caltag Burlingame, CA) w FL2, przy użyciu FACS Vantage (Becton Dickinson). Pojedyncze kolonie przeszukiwano pod kątem wiązania ztnf4.
PL 209 535 B1
P r z y k ł a d 5
Dystrybucja tkankowa
Ludzkie Multiple Tissue Northern Blots (MTN I, MTN II and MTN III; Clontech) próbowano w celu wyznaczenia dystrybucji tkankowej ekspresji ludzkiego BR43x2 i TACI. Sonda PCR o d ł ugoś ci około 500 bp (SEQ ID NR: 21) amplifikowano przy użyciu BR43x2 (SEQ ID NR: 1) jako matrycy i oligonukleotydów ZC20061 (SEQ ID NR: 22) i ZC20062 (SEQ ID NR: 23) jako starterów. Ta sekwencja jest identyczna z homologicznym obszarem TACI. Reakcję PCR przeprowadzano w następujący sposób: 1 cykl 94°C przez 1 minutę, po czym przez 30 cykli w 94°C przez 30 sekund, 60°C przez 30 sekund i 72°C przez 30 sekund, a następnie 10 minutowe wydłużanie w 72°C. Produkty PCR wizualizowano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym, a następnie produkt PCR o długości 500 bp oczyszczano stosując Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, CA), zgodnie z zaleceniami producenta. Sondę znakowano radioaktywnie przy użyciu MULTIPRIME DNA labeling kit (Amersham, Arlington Heights, IL) zgodnie z zaleceniami producenta i oczyszczono stosując NUCTRAP push column (Stratagene). EXPRESSHYB (Clontech) stosowano w czasie prehybrydyzacji i jako roztwór do hybrydyzacji. Hybrydyzację przeprowadzano przez noc w 65°C stosując 106 cpm/ml wyznakowanej sondy. Filtry przepłukiwano w 2X SSC i 0,1% SDS w temperaturze pokojowej, po czym dwukrotnie w 0,1X SSC i 0,1% SDS w 50°C. Transkrypt o długości około 1,5 kb wykryto w ś ledzionie, węzłach chłonnych i jelicie cienkim.
Ludzkie Multiple Tissue Northern Blots (MTN I, MTN II and MTN III; Clontech) próbowano w celu wyznaczenia dystrybucji tkankowej ekspresji ludzkiego BCMA. Sonda PCR o d ł ugoś ci okoł o 257 bp (SEQ ID NR: 24) amplifikowano przy użyciu cDNA komórek Daudi jako matrycy i oligonukleotydów ZC21065 (SEQ ID NR: 25) i ZC21067 (SEQ ID NR: 26) jako starterów. Reakcję PCR przeprowadzano w następujący sposób: 1 cykl 94°C przez 1 minutę, po czym przez 35 cykli w 94°C przez 30 sekund, 60°C przez 30 sekund i 72°C przez 30 sekund, a następnie 10 minutowe wydłużanie w 72°C. Produkty PCR wizualizowano poprzez elektroforezę w żelu agarozowym, a następnie produkt PCR o dł ugości 257 bp oczyszczano stosując Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, CA), zgodnie z zaleceniami producenta. Sondę znakowano radioaktywnie przy użyciu MULTIPRIME DNA labeling kit (Amersham, Arlington Heights, IL) zgodnie z zaleceniami producenta i oczyszczono stosując NUCTRAP push column (Stratagene). EXPRESSHYB (Clontech) stosowano w czasie prehybrydyzacji i jako roztwór do hybrydyzacji. Hybrydyzację przeprowadzano przez noc w 65°C stosując 106 cpm/ml wyznakowanej sondy. Filtry przepłukiwano w 2X SSC i 0,1% SDS w temperaturze pokojowej, po czym dwukrotnie w 0,1X SSC i 0,1% SDS w 50°C. Transkrypt o długości około 1,2 kb wykryto w żołądku, węzłach chłonnych i jelicie cienkim, śledzionie, tchawicy i jądrach.
RNA Master Dot Blots (Clontech) zawierające RNA z różnych tkanek standaryzowane względem 8 genów typu housekeeping próbowano zarówno sondą TACI (SEQ ID NR: 21), jak i sondą BCMA (SEQ ID NR: 24) i hybrydyzowano zgodnie z powyższym opisem. Zaobserwowano ekspresję BR43x2/TACI w żołądku, węzłach chłonnych i jelicie cienkim, śledzionie, płucach, szpiku kostnym, śledzionie płodowej, gruczołach ślinowych i wyrostku robaczkowym. Wykryto ekspresje BCMA w jelicie cienkim, ś ledzionie, żołądku, jelicie grubym, węzłach chłonnych i wyrostku robaczkowym.
A human Tumor Panel Biot V (Invitrogen Inc., San Diego, CA) i ludzkie filtry z próbkami chłoniaków (Invitrogen) próbowanowo zarówno z sondą BR43x2/TACI, (SEQ ID NR: 21), jak i sondą BCMA (SEQ ID NR: 24). Transkrypt o długości 1,5 kb odpowiadający TACI znaleziono w chłoniaku typu non-Hodgkin i nowotworze ślinianki przyustnej. Transkrypt o długości 1,2 kb odpowiadający BCMA znaleziono w chłoniaku gruczołowym, chłoniaku typu non-Hodgkin i nowotworze ślinianki przyustnej.
Całkowite RNA z CD4+, CD8+, CD19+ z komórek limfocytów (CellPro, Bothell, WA) przygotowano przy użyciu tiocyjanku guanidyny (Chirgwin et al., Biochemistry 18: 52-94, 1979), po czym przeprowadzono wirowanie w gradiencie CsCL. Poly(A)+ RNA wyizolowano przy użyciu chromatografii z oligo d(T) celulozą (Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69: 1408-12, 1972). Analizę typu Northern blot przeprowadzono jak następuje.
Około 2 mg każdego poly A+ RNA denaturowano w 2,2 M formaldehyd/bufor forsforanowy (50 mM Na2HPO4, 50 mM NaH2PO4, 50 mM NaOAc, 1 mM EDTA and 2,2 M formaldehyd) i rozdzielono w 1,5% mini żelu agarozowym (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA). Electroforezę przeprowadzano w formaldehyd/bufor forsforanowy. RNA transferowano na filtr nitranowy przez noc(Schleicher & Schuell, Keene, NH), a następnie filtr poddawano działaniu UV (1,200 mdżuli) w STRATALINKERA UV Crosslinker (Stratagene Cloning Systems), po czym zapiekano w 80°C przez jedną godzinę.
PL 209 535 B1
Filtry próbowano zarówno z sondą TACI, (SEQ ID NR: 21), jak i sondą BCMA (SEQ ID NR: 24). Fragment o długości 1,5 kb odpowiadający TACI znaleziono wyłącznie w komórkach CD 19+. Transkrypt o długości 1,2 kb odpowiadający BCMA znaleziono na niskim poziomie w komórkach CD8+,
CD19+ i MLR.
Dodatkową analizę typu Northern Blot przeprowadzano na filtrach z poly(A) RNA z komórek K-562 (komórki erytroidalne, ATCC CCL 243), komórki HUT 78 (komórki T, ATCC TIB161), komórki Jurkat (komórki T), DAUDI (ludzki chłoniak Burkitta, Clontech, Palo Alto, CA), RAJI (ludzki chłoniak Burkitta, Clontech) i HL60 (Monocyty) zgodnie z powyższym opisem. Fragment o długości 1,5 kb odpowiadający TACI znaleziono w komórkach Raji. Transkrypt o długości 1,2 kb odpowiadający BCMA znaleziono w komórkach Daudi, Raji i Hut 78.
Przeszukiwanie oparte o PCR zastosowano w celu identyfikacji tkanek wyrażające ludzkie lub mysie TACI lub ludzkie BCMA. Ludzkie i mysie Rapid-Scan Gene Expression Panels (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) przeszukiwano zgodnie z zaleceniami producenta. Zaprojektowano startery oligonukleotydowe ZC24200 (SEQ ID NR: 27) i ZC24201 (SEQ ID NR: 28), tak aby pokrywały połączenie eksonu i umożliwiały amplifikację fragmentu odpowiadającemu mysiemu TACI o długości 257 bp. Wykryto ekspresję w śledzionie, grasicy, płucach, klatce piersiowej, sercu, mięśniach, skórze, gruczole nadnercza, żołądku, jelicie cienkim, mózgu, jajowodzie, gruczole prostaty i embrionach. Dodatkowe prążki o długości około 500 i 800 bp wykryto w wielu tkankach.
Zaprojektowano startery oligonukleotydowe ZC24198 (SEQ ID NR: 29) i ZC24199 (SEQ ID NR: 30), tak aby pokrywały połączenie eksonu i umożliwiały amplifikację fragmentu odpowiadającemu ludzkiemu TACI o długości 204 bp. Wykryto ekspresję w śledzionie, mózgu, sercu, wątrobie, jelicie grubym, płucach, jądrach, łożysku, gruczole śliniankowym, trzustce, mięśniach, gruczole nadnercza, żołądku, jelicie cienkim, gruczole prostaty, limfocytach i szpiku kostnym.
Zaprojektowano startery oligonukleotydowe ZC24271 (SEQ ID NR: 31) i ZC24272 (SEQ ID NR: 32), tak aby pokrywały połączenie eksonu i umożliwiały amplifikację fragmentu odpowiadającemu ludzkiemu BCMA o długości 329 bp. Wykryto ekspresję w śledzionie, mózgu, wątrobie płodowej, jelicie grubym, płucach, jądrach, gruczole śliniankowym, gruczole nadnercza, żołądku, jelicie cienkim, gruczole prostaty, jajowodzie, limfocytach i szpiku kostnym.
Zaprojektowano startery oligonukleotydowe ZC24495 (SEQ ID NR: 33) i ZC24496 (SEQ ID NR: 34), tak aby pokrywały połączenie eksonu i umożliwiały amplifikację fragmentu odpowiadającemu mysiemu BCMA o długości 436 bp. Wykryto ekspresję w wątrobie.
P r z y k ł a d 6
Przygotowanie wektorów fuzyjnych TACI-Ig i BCMA-Ig
Konstrukcja fragmentu Ig Gammal Fc4
W celu przygotowania białka fuzyjnego TACI-Ig region Fc ludzkiego IgG1 (region „zawiasowy” oraz domeny CH2 i CH3) zmodyfikowano tak, by usunąć receptor Fc (FcgRI) i fragmenty odpowiedzialne za wiązanie dopełniacza Clq. Zmodyfikowaną wersję ludzkiego IgG1 Fc nazwano Fc4.
Region Fc wyizolowano z ludzkiej płodowej biblioteki pochodzącej z wątroby (Clontech) przy użyciu PCR i starterów ZC10134 (SEQ ID NR: 43) i ZC10135 (SEQ ID NR: 44). Reakcje PCR wykorzystano do wprowadzenia mutacji w obrębie regionu Fc, w celu ograniczenia wiązania FcgRI. Miejsce wiązania FcgRI (Leu-Leu-Gly-Gly) zmutowano do Ala-Glu-gly-Ala (pozycje aminokwasów 38-41 w SEQ ID NR: 45) zgodnie z Baum i wsp. EMBO J. 13: 3992-4001, 1994), aby obniżyć wiązanie FcRl (Duncan i wsp., Nature 332: 563-4, 1988). Zastosowano startery oligonukleotydowe ZC15345 (SEQ ID NR: 46) i ZC15347 (SEQ ID NR: 47) w celu wprowadzenia mutacji. Do 50 μl końcowej objętości dodano 570 ng IgFc matrycy, 5 μl 10X Pfu buforu do reakcji (Stratagene), 8 μl 1,25 mM dNTP, 31 μl dH2O, 2 μί 20 mM ZC15345 (SEQ ID NR: 46) i ZC15347 (SEQ ID NR: 47). Następnie dodano równą objętość oleju mineralnego i zagrzano do 94°C przez minutę. Po czym dodano polimerazy Pfu (2,5 jednostki, Stratagene), a następnie przeprowadzono 25 cykli w 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund,72°C przez 1 minutę kończąc wydłużaniem przez 7 minut w 72°C. Produkt reakcji poddano elektroforezie, wykrywając produkt o długości 676 bp. Prążek wycięto z żelu i odzyskano stosując QIAGEN QIAquickTM Gel Extraction Kit (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta.
Reakcję PCR zastosowano również do wprowadzenia mutacji: Ala do Ser (pozycja aminokwasowa 134, SEQ ID NR: 45) i Pro do Ser (pozycja aminokwasowa 135, SEQ ID NR: 45) w celu obniżenia wiązania komplementu Clq (Dunca i Winter, Nature 332: 788, 1988) i wprowadzenia kodonu stop (TAA). Dwie pierwsze reakcje przeprowadzono używając sekwencji IgFc ze zmutowanym miejscem wiązania FcyRI jako matrycy. Do 50 μί końcowej objętości dodano 1 μί sekwencji IgFc ze zmutowanym
PL 209 535 B1 miejscem wiązania FcyRI, 5 gl 10X buforu do reakcji Pfu (Stratagene), 8 gl 1,25 mM dNTP, 31 gl dH2O, 2 gl 20 mM ZC15517 (SEQ ID NR: 48), starter 5' rozpoczynający się od 26 nukleotydu SEQ ID NR: 45 i 2 gl 20 mM ZC15530 (SEQ ID NR: 49) starter 3' rozpoczynający się w obszarze dopełniacza począwszy od nukleotydu 405 SEQ ID NR: 45. Druga reakcja zawierała 2 gl 20 mM startera ZC15518 (SEQ ID NR: 50), starter 5' rozpoczynający się od 388 nukleotydu SEQ ID NR: 45 i ZC15347 (SEQ ID NR: 47), starter 3' wprowadzający mutacje Ala do Ser oraz miejsce rozpoznawane przez Xbal i kodon stop. Następnie dodano równą objętość oleju mineralnego i zagrzano do 94°C przez minutę. Po czym dodano polimerazy Pfu (2,5 jednostki, Stratagene), a następnie przeprowadzono 25 cykli w 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund,72°C przez 2 minuty kończąc wydłużaniem przez 7 minut w 72°C. Produkty reakcji poddano elektroforezie, wykrywając produkty odpowiednio o długościach 370 i 395 bp. Prążki wycięto z żelu i odzyskano stosując QIAGEN QIAquickTM Gel Extraction Kit (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta. Drugą reakcję przeprowadzano, aby połączyć powyższe fragmenty i wprowadzić miejsce dla restrykatazy BamHI na końcu 5'. Do 50 gl końcowej objętości dodano 30 gl dH2O, 8 gl 1,25 mM dNTP, 5 gl 10X buforu do reakcji Pfu (Stratagene) i po 1 gl każdego z produktów uzyskanych powyżej. Następnie dodano równą objętość oleju mineralnego i zagrzano do 94°C przez minutę. Po czym dodano polimerazy Pfu (2,5 jednostki, Stratagene), a następnie przeprowadzono 5 cykli w 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund, 72°C przez 2 minuty. Następnie temperaturę podwyższono ponownie do 94°C i dodano 2 gl 20 mM startera ZC15516 (SEQ ID NR: 51), starter 5' rozpoczynający się od 1 nukleotydu SEQ ID NR: 45 oraz ZC15347 (SEQ ID NR: 47), a następnie przeprowadzono 25 cykli w 94°C przez 30 sekund, 55°C przez 30 sekund, 72°C przez 2 minuty kończąc wydłużaniem przez 7 minut w 72°C. Produkt reakcji poddano elektroforezie, wykrywając produkt długości 789 bp.
Konstrukcja wektorów ekspresyjnych TACI-Fc4 i BCMA-Fc4.
Plazmidy ekspresyjne, zawierające fuzje białkowe TACI-Fc4 i BCMA-Fc4 wytworzono korzystając z homologicznej rekombinacji w drożdżach. Fragment cDNA TACI wyizolowano w reakcji PCR, tak aby zawierał sekwencję polinukleotydową od 15 do 475 nukleotydu z SEQ ID NR: 5. Starterami użytymi do amplifikacji fragmentu TACI były: (1) starter, zawierający 40 bp sekwencji otaczającej od strony 5' wektora i 17 bp odpowiadające końcowi N fragmentu TACI (SEQ ID NO: 52); (2) 40 bp sekwencji otaczającej od strony 3' Fc4 i 17 bp odpowiadające końcowi C fragmentu TACI (SEQ ID Nr: 53). Do 100 gl końcowej objętości dodano 10 ng matrycy TAIC, 10 gl 10X buforu do reakcji Pfu (Stratagene), 8 gl 2,5 mM dNTP, 78 gl dH2O, po 2 gl 20 mM każdego ze starterów SEQ ID NR: 52 i SEQ ID NR: 53 oraz polimerazy Tag (2,5 jednostki, Life Technology). Później dodano równą objętość oleju mineralnego i zagrzano do 94°C przez 2 minuty, a następnie przeprowadzono 25 cykli w 94°C przez 30 sekund, 65°C przez 30 sekund, 65°C przez 30 sekund, 72°C przez 1 minutę kończąc wydłużaniem przez 5 minut w 72°C.
Fragment cDNA BCMA wyizolowano w reakcji PCR, tak aby zawierał sekwencję polinukleotydową od 219 do 362 nukleotydu z SEQ ID NR: 7. Starterami użytymi do amplifikacji fragmentu TACI były starter, zawierający 40 bp sekwencji otaczającej od strony 5' z wektora i 17 bp odpowiadające końcowi N fragmentu BCMA (SEQ ID Nr: 54); oraz starter 40 bp sekwencji otaczającej od strony 3' z Fc4 i 17 bp odpowiadające końcowi C fragmentu BCMA (SEQ ID Nr: 55). Do 100 gl końcowej objętości dodano 10 ng matrycy BCMA, 10 gl 10X buforu do reakcji Pfu (Stratagene), 8 gl 2,5 mM dNTP, 78 gl dH2O, po 2 gl 20 mM każdego ze starterów SEQ ID NR: 54 i SEQ ID NR: 55 oraz polimerazy Taq (2,5 jednostki, Life Technology). Później dodano równą objętość oleju mineralnego i zagrzano do 94°C przez 2 minuty, a następnie przeprowadzono 25 cykli w 94°C przez 30 sekund, 65°C przez 30 sekund, 65°C przez 30 sekund, 72°C przez 1 minutę kończąc wydłużaniem przez 5 minut w 72°C.
Fragment zawierające cDNA, kodujące Fc4 konstruowano w podobny sposób, zarówno dla konstruktów fuzyjnych TACI i BCMA. W przypadku TACI dwoma starterami użytymi do amplifikacji fragmentu Fc4 były: starter, zawierający 40 bp sekwencji otaczającej od strony 5' z TACI i 17 bp odpowiadające końcowi N fragmentu Fc4 (SEQ ID NR: 56); oraz starter 40 bp sekwencji otaczającej od strony 3' z sekwencji wektora i 17 bp odpowiadające końcowi C fragmentu Fc4 (SEQ ID Nr: 57). W przypadku BCMA dwoma starterami użytymi do amplifikacji fragmentu Fc4 były: starter, zawierający 40 bp sekwencji otaczającej od strony 5' z BCMA i 17 bp odpowiadające końcowi N fragmentu Fc4 (SEQ ID NR: 58); Prawy do konstrukcji fragmenty Fc4 dla konstruktu z BCMA, był taki sam jak w przypadku TACI-Fc4 (SEQ ID NR: 57)
Do 100 gl końcowej objętości dodano 10 ng matrycy Fc4, 10 gl 10X buforu do reakcji Pfu (Stratagene), 8 gl 2,5 mM dNTP, 78 gl dH2O, po 2 gl 20 mM każdego ze starterów SEQ ID NR: 56
PL 209 535 B1 i SEQ ID NR: 57 w przypadku TACI lub SEQ ID NR: 58 i SEQ ID NR: 57 w przypadku BCMA oraz polimerazy Taq (2,5 jednostki, Life Technology). Później dodano równą objętość oleju mineralnego i zagrzano do 94°C przez 2 minuty, a następnie przeprowadzono 25 cykli w 94°C przez 30 sekund, 65°C przez 30 sekund, 65°C przez 30 sekund, 72°C przez 1 minutę kończąc wydłużaniem przez 5 minut w 72°C.
μl każdej ze 100 μl opisanej powyżej reakcji PCR rozdzielono na 0,8% agarozie LMP (Seaplaque GTG) z 1x buforem TBE. Pozostałe 90 μl poddano precypitacji poprzez dodanie 5 μl 1 M NaCl i 250 μl absolutnego etanolu. Plazmid pZMP6 przecięto enzymem Smal w celu linearyzacji w miejscu wielokrotnego klonowania. Plazmid pZMP6 otrzymano z plazmidu pCZR199 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, ATCC# 98668) I jest ssaczym plazmidem do ekspresji, zawierającym kasetę ekspresyjną, wczesny promotor CMV, sekwencję najwyższej zgodności intronu ze zmiennego obszaru ciężkiego łańcucha mysiej immunoglobuliny, miejsce wielokrotnego klonowania do wstawiania sekwencji kodujących, kodon stop i ludzki terminator pochodzący z ganu na hormon wzrostu. Plazmid ma również ori replikcaji z E. coli, ssaczy marker selekcyjny z promotorem SV40, sekwencje wzmacniacza, ori replikacji, gen DHFR oraz terminator SV40. Wektor pZMP6 skonstruowano na bazie pCZR199, zastępując promotor metalotioninowy wczesnym promotorem CMV i sekwencje Kozak na 5' końcu otwartej ramki odczytu.
100 μl kompetentnych komórek drożdży (S. cerevisiae) zmieszano z 10 μ!, zawierającego ok. 1 μg, każdej z pozakomórkowej domeny TAIC i BCMA oraz odpowiednie do rekombinacji fragmenty PCR Fc4 oraz 100 ng wektora pZMP6, przeciętego enzymem Smal, przeniesiono do kuwety do elektroporacji o grubości 0,2 cm. Mieszaninę drożdże/DNA elektroporowano (0,75 kV - 5 kV/cm, brak oporności, 25 μF). Do każdej kuwety dodawano 600 μl 1,2 M sorbitolu, a następnie drożdże wysiewano na w objętości 300 μl na szalki URA-D i inkubowano w 30°C.
Po 48 godzinach pojedyncze transformanty ura+ zawieszano w 1 ml bufory do lizy (2% Triton Χ-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). 500 μl tego buforu dodawano do 300 μl kulek szklanych przemytych kwasem i 200 μl mieszaniny fenol/chloroform, wytrząsano dwa lub trzy razy z minutowymi przerwami i wirowano w wirówce do probówek typy Eppendorf przy maksymalnej prędkości. 300 μl fazy wodnej przenoszono do nowych probówek typy Eppendorf, a następnie wytrącano DNA przy użyciu 600 μl etanolu, po czym wirowano przez 10 minut w 4°C, osad zawieszono w 100 μl H2O.
Transformację elektrokompetentnych komórek E. coli (DH10B, GibcoBRL) przeprowadzano z 0.5-2 ml drożdżowego DNA i 40 μl komórek DH10B. Komórki elektroporowano przy 2,0 kV, 400 omach i 25 μΡ. Po elektroporacji zawieszano w 1 ml SOC (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0.5% yeast extract (Difco), 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukoza) i wysiewano w porcjach 250 μl na 4 szalki LB Amp (LB broth (Lennox), 1.8% Bacto' Agar (Difco), 100 mg/L ampicylina).
Pojedyncze klony zawierające prawidłowe konstrukty TACI-Fc4 lub BCMA-Fc4 z odpowiednią wstawką i prawidłowo połączonymi DNA identyfikowano poprzez analizę restrykcyjną. Pozytywne klony sekwencjonowano. Plazmidy na wysoką skalę przygotowywano przy pomocy Qiagen Maxi kit (Qiagen) zgodnie z zaleceniami producenta.
P r z y k ł a d 7
Ekspresja TACI-Fc4 i BCMA-Fc4 w komórkach ssaczych.
Komórki BHK 570 (ATCC NO: CRL-10314) wysiewano na 10 cm szalki do hodowli tkankowych i hodowano do osiągnięcia 50-70% zlewania przez noc w 5% atmosferze CO2 w pożywce DMEM/FCS (DMEM, Gibco/BRL o wysokiej zawartości glukozy, (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 5% FBS (Hyclone, Logan, UT), 1 mM L-glutamina (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM pirogronian sodu (Gibco BRL)). Następnie komórki transferowano plazmidami TACI-Fc4/pZMP6 i BCMA-Fc4/pZMP6 przy użyciu Lipofectamine (Gibco DRL) oraz pożywki DMEM bez surowicy (DMEM, 1% pirogronianu sodu, 1% L-glutaminy, 10 mg/ml transferyny, 5 mg/ml mg insuliny i 2 mg/ml fetuiny). Plazmidy TACI-Fc4/pZMP6 i BCMA-Fc4/pZMP6 rozcieńczano w 15 ml probówkach do całkowitej objętości 640 μl w pożywce bez surowicy. Mieszano 35 μl LipofectAMINE oraz 605 μl pożywki DMEM bez surowicy. Mieszaninę LipofectAMINE dodawano do DNA i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 30 min. 5 ml pożywki bez surowicy dodawano do mieszaniny DNA-LipofectAMINE. Komórki przemywano jednokrotnie 5 ml pożywki bez surowicy i dodawano 5 ml mieszaniny DNA-LipofectAMINE. Komórki inkubowano w 37°C przez 5 godzin, następnie 6,4 ml pożywki DMEM/10% FCS, 1% PSN dodawano do każdej szalki. Szalki inkubowano przez noc w 37°C, a następnie następnego dnia pożywkę zawierająca DNA42
PL 209 535 B1
-LipofectAMINE zmieniano na świeżą pożywkę DMEM/FSB 5%. Piątego dnia po transfekcji komórki przenoszono do pożywki selekcyjnej w butelkach T-162 (DMEM/ 5% FBS, 1% L-GLU, 1% NaPyr). Około 10 dni po transfekcji dwie 150 mm szalki do hodowli tkankowych z komórkami opornymi na metotreksan z każdej transfekcji trypsynizowano, połączono w pule, przesiano do butelek T-162 i przeniesiono do hodowli na dużą skalę.
P r z y k ł a d 9
Transgeniczna ekspresja ztnf4.
Zwierzęta transgeniczne wyrażające ztnf4 otrzymano wykorzystując dorosłe płodne samce (B6C3fl), przedpokwitaniowe płodne samice (B6C3fl), pozbawione nasieniowodów samce (B6D2fl) i dojrzałe samice (B6D2fl) (wszystkie Taconic Farms, Germantown, NY). Przedpokwitaniowe płodne samice poddawano zabiegowi superowulacji używając gonadotropiny Pregnant Mare's Serum (Sigma, St. Loui.5, MO) i ludzkiej Chorionic Gonadotropin (hCG (Sigma)). Samice poddawano zabiegowi superowulacji krzyżowano z płodnymi samcami, a zajście kopulacji potwierdzano obecnością czopów spermy w pochwie.
Zapłodnione jaja zbierano pod mikroskopem chirurgicznym (Leica MZ12 Stereo Microscope, Leica, Wetzlar, Germany). Jaja przemywano w hialuronidazie i pożywce Whittena W640 (Tabela; wszystkie odczynniki dostępne w Sigma Chemical Co.), która była inkubowana z 5% CO2, 5% O2, i 90% N2 w 37°C. Jaja przechowywano w inkubatorze 37°C/5% CO2 aż do momentu microinjekcji.
T a b e l a 8
| mg/200 ml | mg/500 ml | |
| NaCl | 1280 | 3200 |
| KCl | 72 | 180 |
| KH2PO4 | 32 | 80 |
| MgSO4-7H2O | 60 | 150 |
| Glukoza | 200 | 500 |
| Ca2+ mleczan | 106 | 265 |
| Benzylpenicylina | 15 | 37,5 |
| Streptomycyna SO4 | 10 | 25 |
| NaHCOa | 380 | 950 |
| Na pirogronian | 5 | 12,5 |
| H2O | 200 ml | 500 ml |
| 500 mM EDTA | 100 μl | 250 μl |
| 5% Phenol Red | 200 μl | 500 μl |
| BSA | 600 | 1500 |
Amplifikowano przy wykorzystaniu PCR otwartą ramkę odczytu od długości 858 bp, kodującą pełnej długości ludzkie TACI (SEQ ID Nr: 35) tak by wprowadzić optymalne kodony i odpowiednie miejsca restykcyjne, Pmel na końcu 5' i AscI na końcu 3', używając starterów SEQ ID Nr: 36 i SEQ ID Nr: 37.
Otrzymany fragment Pmel - AscI subklonowano do plazmidu pKFO24, zawierającego sekwencje wzmacniacza Ig Em, specyficznego dla komórek B i/lub T (Bodrug i wsp., EMBO J. 13: 2124-30, 1994), promotor Ig Vh (536 bp HincII/XhoI fragment z pJHlX(-); Hu i wsp., J. Exp. Med. 177: 1681-90, 1993), intron SV40 16S (171 bp XhoI/HindIII fragment z pEmSR), miejsce klonowania Pmel/AscI i sygnał poliadenylacji pochodzący z ludzkiego genu kodującego hormon wzrostu (627 bp Smal/EcoRI fragment; Seeburg, DNA 1: 239-49, 1982). Wstawkę wycięto z plazmidu enzymem Notl i oczyszczono po elektroforezie w żelu agarozowym, a następnie dokonano mikroinjekcji do zapłodnionych jaj z krzyżówki myszy B6C3FITac opisanej powyżej i implantowano do pseudociężarnych samic tak jak opisano poprzednio (Malik i wsp., Molec. Cell. Biol. 15: 2349-58, 1995).
PL 209 535 B1
Samice trzymano w klatkach w parach i przez 19-21 dniowy okres ciąży. Po porodzie, myszy trzymano 19-21 dni przed określeniem płci i odstawianiem od karmienia, a następnie dokonano biopsji (do genotypowania) poprzez odcięcie fragmentu ogona czystymi nożyczkami.
Przygotowano genomowe DNA z fragmentów ogonów przy zastosowaniu komercyjnie dostępnego zestawu (DNeasy 96 Tissue Kit; Qiagen, Valencia, CA), zgodnie z zaleceniami producenta. DNA genomowe sprawdzano stosując startery zaprojektowane tak by amplifikować 3' UTR ludzkiego genu kodującego hormon wzrostu (hGH) na wektorze transgenicznym. Startery ZC17251 (SEQ ID Nr: 38) i ZC17252 (SEQ ID Nr: 39) amplifikowały fragment hGH o długości 368 bp. Zastosowanie obszaru unikalnego w ludzkiej sekwencji (zidentyfikowanego przez przyrównanie sekwencji ludzkiego i mysiego 3' UTR hGH) daje pewność, że nie amplifikowano sekwencji mysiej. Dodatkowo, startery ZC17156 (SEQ ID Nr: 40) I ZC17157 (SEQ ID Nr: 41), hybrydyzujące z sekwencją wektora i amplifikujące cDNA wstawki mogą być używane razem ze starterami do hGH. W tych eksperymentach, DNA ze zwierząt pozytywnych pod względem obecności transgenu, po amplifikacji pozwala na zaobserwowanie dwóch prążków: jednego o długości 368 bp, odpowiadającego 3' UTR hGH oraz drugiego o zmiennej długości, odpowiadającego wstawce cDNA.
Po potwierdzeniu transgeniczności zwierząt, krzyżowano je wstecznie ze szczepami wsobnymi poprzez umieszczenie transgenicznej samicy z dzikim samcem lub transgenicznego samca z dziką samicą (samicami). Wszystkie osobniki potomne odstawiano od karmienia, rozdzielano ich płcie i odcinano kawałki ogonów do genotypowania.
W celu zbadania ekspresji transgenu w żywym zwierzęciu, doponywano biopsji przyżyciowej. Analizowano poziomy ekspresji mRNA każdego transgenu wykorzystując test hybrydyzacji RNA lub real-time PCR w aparacie ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA), zgodnie z zaleceniami producenta.
Przygotowanie komórek do cytometrii przepływowej.
Analizowano pierwotne myszy w różnym wieku. Dla dalszej analizy w cytometrze przepływowym wyizolowano tkankę limfoidalną oraz szpik kostny z kości udowych i piszczelowych, poprzez ostrożne rozłamanie w PBS przy użyciu moździerza. Komórki zawieszono i pozbawiono resztek kości poprzez bierną sedymentację i osadzono przez wirowanie w 1000 x g. Limfocyty śledzionowe, grasicowe i komórki węzłów chłonnych otrzymano poprzez zgniecenie tkanek pomiędzy szkiełkami, zawieszanie i osadzenie tak jak w przypadku szpiku kostnego. Przed barwieniem komórki zawieszono w buforze do płukania FACS (FACS WB) (HBSS, 1% BSA, 10 mM Hepes, pH 7.4) w gęstości 20 x 106 komórek/ml. Podczas barwieni, 1 x 106 komórek przenoszono do s ml probówki i przemywano 1 ml FACS WB, po czym osadzano w 1000 x g. Następnie komórki inkubowano w lodzie przez 20 minut w obecności odpowiednich przeciwciał z dołączonymi FITC, PE, i/lub TriColor (TC) w całkowiej 100 ml FACS WB. Komórki przemywano 1,5 ml WB, osadzano i zawieszano w 400 ml WB i analizowano na cytometrze przepływowym FACSCalibur używając oprogramowania CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Detektory FSC i SSC ustawiono w skali liniowej, podczas gdy logarytmiczne detektory ustawiono dla wszystkich kanałów fluorescencyjnych (FL-1, FL-2 i FL-3).
Kompensacje nałożenia spektralnego pomiędzy kanałami FL przeprowadzano dla każdego eksperymentu używając populacji komórek wybarwionych jednym kolorem. Dane dla wszystkich komórek zgromadzono na dysku i analizowano przy użyciu oprogramowania CellQuest. Komórki RBC oraz komórki nie żywe wykluczano elektronicznie na podstawie danych z profili FSC vs. SSC.
Monoklonalne przeciwciała anty-CD8 połączone z FITC (klon 53-6,7) i anty-CD4 połączone z PE (klon RM4-5), anty-CD5 (klon 53-7,3), anty-CD19 (klon 1D3) oraz antysydekan (klon 281-2) przeciwciała monoklonalne kupiono w PharMingen (San Diego, CA). Przeciwciała anty-CD45R/B220 połączone z TriColor(TC) (klon RA3-6B2) zakupiono w Caltag.
Transgeniczne myszy nadeksprymujące ztnf4 w przedziałach limfoidalnych wykazywały podwyższoną liczbę obiegowych komórek B, zwiększoną liczbę komórek plazmy oraz podwyższone poziomy immunoglobulin osocza. Zwierzęta te miały podwyższoną liczbę komórek B200+ w trzustce, węzłach chłonnych i grasicy. Podwyższona liczba trzustkowych komórek B obejmuje zarówno komórki B-2 i normalnie rzadko występującą populację komórek B-1. Zwykle komórki B-1 występują głównie w jamie otrzewnowej i innych jamach ciała, produkując samo reagujące przeciwciała o niskim powinowactwie i są często związane z rozwojem chorób autoimmunologicznych takich, jak SLE.
Starsze transgeniczne zwierzęta wytwarzają autoprzeciwciała powodujące schorzenia typu białko w moczu, stwardnienie kłębków charakterystycznych dla SLE.
PL 209 535 B1
Figura 5a przedstawia zawiesiny pojedynczych komórek trzustki (górna ramka), węzłów chłonnych (środkowa ramka) i szpiku kostnego (dolna ramka), przygotowanych tak, jak opisano poniżej, barwionych anty-B220-TC i analizowanych przez cytometrię przypływową. Liczę komórek B220+ w każdej tkance obliczano mnożąc procent komórek B220+ przez całkowitą liczbę żywych komórek liczoną na hemocytometrze. Każdy słupek przedstawia dane z pojedynczej ztnf4 myszy transgenicznej (Tg, cieniowane słupki) lub nietransgenicznej myszy kontrolnej (niecieniowane słupki).
Figura 5B przedstawia komórki wyizolowane z transgenicznej myszy ztnf4 (prawa ramka) i nietransgenicznej myszy z tego samego miotu (lewa ramka) węzłów chłonnych (górny rząd), trzustki (środkowy rząd) oraz grasicy (dolny rząd), które barwiono monoklonalnymi przeciwciałami przeciw zaznaczonym cząsteczkom (C5, CD4 i CD8) i analizowane za pomocą cytometrii przepływowej. Przedstawione dane nie zawierają komórek martwych oraz komórek RBC.
Figura 5C przedstawia całkowite poziomy IgG, IgM i IgE w osoczu myszy transgenicznej ztnf4 względem wieku w zakresie od 6 do 23 tygodni.
Figura 5D przedstawia rozmieszczenia amyloidu i grubość tkanki łącznej kłębuszka nerki mierzoną poprzez barwienie sekcji nerki H&E u myszy transgenicznej ztnf4 w porównaniu z myszami kontrolnymi z tego samego miotu.
Figura 5E przedstawia wzrost efektorowych komórek T w myszy transgenicznej podobnie jak pokazano w Mackay i wsp. (J. Exp. Med. 190: 1697-1710, 1999).
Rozpuszczalne fuzje TACI(BR43x2) lub BCMA-Ig wstrzykiwano (dootrzewnowo, domięśniowo lub dożylnie) transgenicznym zwierzętom nadeksprymującym ztnf4. Analiza przy pomocy cytometrii przepływowej tkanki limfoidalnej może być użyta w celu identyfikacji zmian w liczbie komórek B220+ w trzustce, węzłach chłonnych i grasicy.
P r z y k ł a d 10
Test ELISA typu bezpośredniego wiązania
Test ELISA typu bezpośredniego wiązania opracowano w celu scharakteryzowania zdolności do wiązania i hamowania aktywności ztnfr4 in vitro zarówno przez rozpuszczalne TACI-Ig, jak i rozpuszczalne BCMA-Ig.
studzienkową płytkę pokryto 1 μg/ml kozim przeciwciałem anty-ludzkie Ig (Jackson Labs, Bar Harbor, MA) w buforze ELISA (0,1 M Na2HCO, pH 9,6, 0,02% NaN3) i inkubowano przez noc w 4°C. TACI, BCMA i niezwiązany receptor TNF taki, jak ztnfr10 (SEQ ID NR: 42) jako kontrolę miareczkowano począwszy od 10 μg/ml poprzez 5-krotne rozcieńczenia do 320 ng/ml (oraz 0), a następnie koinkubowano z 2,5, 0,5 i 0,1 μg/ml biotynylowanego ztnf4 lub owalbuminy jako kontroli negatywnej przez godzinę w temperaturze pokojowej.
Koinkubowaną mieszaninę receptor-biotynylowany ligand dodawano do 96 studzienkowych płytek pokrytych kozim przeciwciałem anty-ludzkie Ig. Następnie płytki płukano (ELISA C, 500 μl Tween 20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), 200 mg NaN3 i PBS do końcowej objętości 1 litra) i blokowano odczynnikiem Superblock (Pierce, Rockford, IL) inkubując w 37°C przez 2 godziny.
Płytki przemywano ponownie ELISA C i dodawano po 100 μl na studzienkę neutr-avidin-HRP w rozcieńczeniu 1: 10000 w ELISA B (5 lub 10 μg BSA (Sigma) tak, by otrzymać odpowiednio 1% lub 2% BSA, 250 ul Tween 20 (Sigma), 100 mg NaN3 PBS pH 7,2 (PBS, Sigma) do końcowej objętości 500 ml. Względnie, bufor może być przygotowany jako 1% lub 2% BSA w ELISA C. Nastęnie płytki inkubowano 10 min. w temperaturze pokojowej i sczytywano przy długości fali 492.
P r z y k ł a d 11
Test aktywności biologicznej
Opracowano test aktywności biologicznej w celu zmierzenia hamowania ludzkich komórek B stymulowanych rozpuszczalnym ztnf4 przez rozpuszczalne TACI-FC. Komórki B izolowano z komórek PBMNC przy użyciu kulek magnetycznych z CD19 oraz systemu separacji magnetycznej VarioMacs (Miltenyi Biotec Auburn, CA) zgodnie z zaleceniami producenta. Zmieszano oczyszczone komórki B z rozpuszczalnym ztnf4 (25 mg/ml) oraz zrekombinowanym ludzkim IL-4 (10 ng/ml Pharmingen) i wysiewano w 3 powtórzeniach na 96 studzienkowej płytce o zaokrąglonych denkach w zagęszczeniu 1 x 105 komórek na studzienkę.
Rozpuszczalne TACI-FC rozcieńczono od 5 μg/ml do 6 ng/ml i i nkubowano z komórkami B przez 5 dni, dodając przez noc 4 dnia 1 uCi 3H Tymidyny (Amersham) na studzienkę. Jako kontrolę rozpuszczalne TACI-FC inkubowano z komórkami B i IL-4 bez obecności ztnf4.
Komórki z płytek zbierano stosując urządzenie Packard plate harvester i liczono na czytniku Packard. Rozpuszczalny receptor TACI-Ig hamował zdolność rozpuszczalnego ztnf4 do stymulacji
PL 209 535 B1 proliferacji komórek B in vitro zależnie od dawki. 10-krotny molarny nadmiar TACI-Ig zupełnie hamował proliferację ludzkich komórek B, w odpowiedzi na rozpuszczalne ztnf4 w obecności Il-4.
P r z y k ł a d 12
Test typu ORIGIN
Zbadano poziomy ztnf4 u osobników cierpiących na choroby takie, jak SLE lub RA, względem zdrowych osobników, wykorzystując test elektrochemiluminescencyjny. Krzywą wzorcową przygotowaną na podstawie rozpuszczalnego ludzkiego ztnf4 w stężeniach 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml 0,01 ng/ml i 0 ng/ml w buforze ORIGIN (Igen, Gaithersburg, MD). Próbki surowicy rozcieńczano w buforze ORIGIN. Standard i próbki inkubowano w temperaturze pokojowej przez 2 godziny z biotynylowanym króliczym przeciwciałem anty-ludzki ztnf4-NF BV rozcieńczonym do stężenia 1 gg/ml w buforze do testu Origin (IGEN) oraz rutenylowanym króliczym przeciwciałem poliklonalnym anty-ludzki ztnf4-NF BV rozcieńczonym do stężenia 1 gg/ml w buforze do testu Origin (IGEN). Po inkubacji próbki wytrząsano i dodawano 0,4 mg/ml streptavidin Dynabeads (Dynal, Oslo, Norway) do każdego standardu i próbki w ilości 50 gl na probówkę i inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie próbki inkubowano i sczytywano na Origin Analyzer (Igen) zgodnie z zaleceniami producenta. Test Origin jest oparty na elektrochemiluminescencji i umożliwia odczyt w ECL.
Wykryto podwyższony poziom ztnf4 w próbkach surowicy zarówno z myszy NZBWF1/J, jak i myszy MRL/Mpj-Fas1pr, które wykazywały daleko posunięte stadium stwardnienia kłębków nerkowych i choroby autoimmunologicznej.
P r z y k ł a d 13
Rozpuszczalne TACI-Ig w spontanicznym modelu SLE
Myszy NZBW wykazują spontaniczne symptomy SLE w wieku około 7-9 miesięcy. Myszom NZBW podawano TACI-FC w celu monitorowania jego hamującego efektu na komórki B po 5 tygodniach, po których średni poziom autoprzeciwciał komórek B jest uważany za wysoki.
100, ośmiotygodniowych samic myszy (NZBxNZW)F1 (Jackson Labs) podzielono na 6 grup po 15 myszy w grupie. Przed leczeniem myszy monitorowano raz w miesiącu pod względem występowania białek w moczu, jak również pobierano im krew w celu zachowania CBC i surowicy. Surowicę przeszukiwano pod kątem obecności autoprzeciwciał. Ponieważ białkomocz jest głównym objawem w stwardnieniu kłębków nerkowych, poziom białek w moczu mierzono w regularnych odstępach w trakcie trwania badań. Przed leczeniem zwierzęta zważono. Dozowanie rozpoczęto, gdy myszy osiągnęły 5 miesięcy. Myszy otrzymywały dootrzewnowe zastrzyki podłoża (PBS), ludzkiego IgG-FC (białko kontrolne) lub TACI-FC4 (białko testowe) trzy razy w tygodniu przez 5 tygodni.
| Grupa (po 5 myszy) | Leczenie | Dawka |
| 1 | Nietraktowana kontrola | |
| 2 | Tylko podłoże | |
| 3 | Ludzkie IgG-FC | 20 gg |
| 4 | Ludzkie IgG-FC | 100 gg |
| 5 | Ludzkie TACI-FC4 | 20 gg |
| 6 | Ludzkie TACI-FC4 | 100 gg |
Myszom pobierano krew dwukrotnie podczas podawania leku i przynajmniej 2 razy po leczeniu. Wartości białkomoczu oraz masy ciała odczytywano co 2 tygodnie po rozpoczęciu leczenia. Wartości białkomoczu oraz masy ciała odczytano po uśmierceniu zwierząt. Zmierzono masę trzustki, grasicy, wątroby z woreczkiem wątroby, lewej nerki i mózgu. Trzustkę i grasicę podzielono w celu analizy FACS i analizy histologicznej. Do analizy histologicznej pobrano również ślinianki podżuchwowe, krezkowy węzeł limfatyczny, płat wątrobowy z woreczkiem żółciowym, jelito grube, żołądek, jelito cienkie, trzustkę, prawą nerkę, gruczoł nadnercza, język z tchawicą i przełykiem, serce i płuca.
Figura 6 przedstawia podwyższony poziom ztnf4 w surowicy myszy NZBWF1 i MRL/1pr/1pr, który koreluje z rozwojem SLE. Górna ramka na Fig. 6A przedstawia korelację poziomów ztnf4 w surowicy i wieku, dla 68 NZBWF1 myszy w wieku od 10 do 40 tygodni i dla kontrolnych myszy NZB/B w wieku od 10 do 30 tygodni. Środkowa ramka przestawia korelację z białkomoczem w trzech zakresach: śladowe do 20 mg/dl (T-30), 100-300 ng/dl i 2000 mg/dl u myszy NZBWF1 w porównaniu z myszami
PL 209 535 B1
NZB/B. Dolna ramka przedstawia poziomy ztnf4 z różnymi mianami przeciwciał anty-dwuniciowe DNA u myszy NZBWF1 w porównaniu z myszami NZB/B.
Figura 6B przestawia te same zależności dla 23 myszy MRL/1pr/1pr w wieku od 18 do 24 tygodni i dla 10 myszy kontrolnych MRL/MpJ w wieku 11 tygodni.
Figura 7 przedstawia wyniki analizy moczu. Myszy uważano za cierpiące na białkomocz, jeżeli pomiary były równe lub większe 100 mg/dl. (A) PBS, (B) ludzkie IgG FC, 100 mg, (C) ludzkie IgG FC, 20 mg, (D) ludzkie TACI-IgG, 100 mg i (E) ludzkie TACI-IgG, 20 mg. Myszy traktowane rozpuszczalnym TACI IgG wykazywały obniżone poziomy białkomoczu.
Analiza krwi obiegowej traktowanych zwierząt wykazała, że liczba białych krwinek i limfocytów była zredukowana u myszy traktowanych TACI-FC (20 i 100 mg) w porównaniu z myszami traktowanymi FC (20 i 100 mg) i PBS, w 2 tygodnie od rozpoczęcia leczenia. Analiza FAC krwi obiegowej, pobranej 6 tygodni po leczeniu (2 tygodnie po ostatni podaniu) wykazała znaczne obniżenie procentowości komórek B w próbkach. Poziomy komórek B były obniżone nawet w 5 tygodni po ostatnim podaniu, ale nie aż tak znacząco. Tabela 9 przedstawia średnią (i odchylenie standardowe) dla myszy z każdej grupy. Obniżenie procentu komórek B w krwi obiegowej obserwowano również podczas leczenia.
T a b e l a 9
| Leczenie | 2 Tygodnie | 5 Tygodni | |
| % komórek B | % komórek T | % komórek B | |
| PBS | 26,05 (6,52) | 67,05 (6,80) | 20,83 (3,14) |
| 100 mg FC | 23,34 (5,77) | 68,23 (7,30) | 25,04 (8,07) |
| 20 mg FC | 24,09 (6,26) | 65,27 (7,18) | 18,96 (6,42) |
| 100 mg TACI-FC | 11,07 (5,03) | 79,06 (6,71) | 14,79 (4,76) |
| 20 mg TACI-FC | 16,37 (7,27) | 69,72 (8,90) | 19,14 (5,27) |
P r z y k ł a d 14
Rozpuszczalne TACI-Ig u zdrowych myszy
TACI-FC podawano myszom Blab/C w celu monitorowania efektu u zdrowych myszy. 60 8-tygodniowych samic myszy Blab/C (HSD) podzielono na 12 grup po pięć myszy. Przed leczeniem myszom pobrano krew w celu zachowania surowicy i CBC oraz zważono. Grupy 1-9 otrzymały 12 dootrzewnowych zastrzyków podłoża (PBS) lub ludzkiego IgG-FC (białko kontrolne) lub TACI-FC4 (białko testowe) dziennie, myszy uśmiercono 14 dnia. Grupy 10 i 11 otrzymały dootrzewnowe zastrzyki trzy razy w tygodniu przez 2 tygodnie, myszy uśmiercono 14 dnia.
| Grupa (po 5 myszy) | Leczenie | Dawka |
| 1 | Ludzkie TACI-FC4 | 200 mg |
| 2 | Ludzkie TACI-FC4 | 100 mg |
| 3 | Ludzkie TACI-FC4 | 20 μg |
| 4 | Ludzkie TACI-FC4 | 5 μg |
| 5 | Ludzkie FC4 | 200 μg |
| 6 | Ludzkie FC4 | 100 mg |
| 7 | Ludzkie FC4 | 20 mg |
| 8 | Ludzkie FC4 | 5 mg |
| 9 | Tylko podłoże | Jak użyto |
| 10 | Ludzkie TACI-FC4 | 100 mg |
| 11 | Ludzkie FC4 | 100 mg |
| 12 | Nietraktowana kontrola |
PL 209 535 B1
Krew pobrano 7 i 12 dnia. Pobrano krew i zważono osobniki po eutanazji. Zważono śledzionę, grasicę i mózg. Śledzionę i grasicę podzielono w celu analizy FACS i analizy histologicznej. Do analizy histologicznej pobrano również skórę, ślinianki podrzuchwowe, krezkowy węzeł limfatyczny, płat wątrobowy z woreczkiem żółciowym, jelito grube, żołądek, jelito cienkie, trzustkę, jajowód, macicę, szyjkę macicy, pęcherz, grasicę, mięśnie, prawą i lewą kość udową, mózg, prawą nerkę, gruczoł nadnercza, język z tchawicą i przełykiem, serce i płuca. Jak opisano w przykładzie 13, zaobserwowano obniżenie procentu komórek B 7 dnia (CBC) i 12 dnia (FACS) w obiegowej krwi pobranej z wszystkich TACI-FC4 traktowanych próbek w porównaniu z traktowanymi FC4 lub PBS. Dodatkowo, zaobserwowano około 50% obniżenie poziomu komórek B w śledzionach pobranych ze zwierząt traktowanych TACI-FC4 w porównaniu z myszami traktowanymi FC4 po 14 dniach.
P r z y k ł a d 15
Test ELISA anty-dwuniciowe DNA
Autoimmunogenność cechuje się wysokimi poziomami przeciwciał anty-dwuniciowe DNA. W celu zmierzenia poziomów przeciwciał anty-dwuniciowe DNA zarówno u myszy nadeksprymują ce ztnf4, jak i myszach NZBW, opracowano test ELISA. 96 studzienkowe płytki mikrotitracyjne (Nunc) pokryto poli-L-lizyną (Sigma) (20 μΐ/ml w 0,1 M Tris pH 7.3), 75 μΐ/studzienkę i inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej. Płytki przemywano w dH2O i pokrywano poli dAdT (Sigma) (20 nl/ml w 0,1 M Tris pH 7.3), 75 Ll/studzienkę i inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Płytki przemywano w dH2O i blokowano w 2% BSA (Sigma) w buforze Tris przez 30 minut w temperaturze pokojowej, po czym przepłukiwano w dH2O.
Próbki surowicy pobrano z transgenicznych myszy ztnf4 opisanych w przykładzie 10 i myszy NZBW opisanych w przykładzie 11. Próbki surowicy rozcieńczono 1:50 w 1% BSA/2% BGG (Calbiochem) w buforze Tris. Rozcieńczone próbki miareczkowano do pokrytych płytek w rozcieńczeniach 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200 i 1:6400 (50 L l/studzienka) a następnie inkubowano przez 90 miunut w temperaturze pokojowej.
Następnie płytki przepłukiwano w dH2O i dodawano kozie przeciwciała anty-mysie IgG-Fc-HRP (Cappel) rozcieńczone 1:1000 w 1% BSA/2% BGG - 50 L l/studzienka. Płytkę inkubowano przez 60 minut w temperaturze pokojowej, przepłukiwano 5 razy w dH2O i wywoływano w celu odczytania gęstości optycznej - 1 tableka/10 ml Novo D - 100 L l/studzienka. Wywoływanie zatrzymano 1N H2SO4, 100 L l/studzienka i odczytywano OD przy 492 nm.
Figura 8 przedstawia poziomy przeciwciał anty-dwuniciowe DNA u dwóch transgenicznych myszy ztnf4 (23 tygodnie), dwóch nietransgenicznych myszy z tego samego miotu, w porównaniu z poziomami wykrytymi w surowicach myszy NZBWF1 (32 tygodnie) i MRL/1pr/1pr (19 tygodni).
P r z y k ł a d 16
Rozpuszczalne TACI-Ig w spontanicznym modelu ELE samic myszy PlxSJL F1 (12 tygodni, Jackson Labs) poddano podskórnemu szczepieniu 125 L g/mysz antygenu (białko proteolipidu mielinowego, PLP, pozycje 139-151), przygotowanych w kompletnym adjuwancie Freunda. Myszy podzielono na 5 grup po 5 myszy. Myszom podano dootrzewnowo 400 ng toksyny krztuśca w dniu 0 i dniu 2. Grupom podawano 1x, 10x lub 100x dawkę TACI, BCMA lub BR43x2, jednej grupie podawano wyłącznie podłoże, natomiast ostatnia grupa pozostała nietraktowana. Terapię prewencyjną rozpoczęto w dniu 0, zaś terapię interwencyjną rozpoczęto w dniu 7 lub po zauważeniu objawów klinicznych. Objawy chorobowe (utrata wagi, paraliż) objawiały się 10-14 dnia lub po 1 tygodniu. Zwierzęta badano codziennie ważąc i określając objawy kliniczne odpowiadające rozmiarowi symptomów. Kliniczne objawy EAE pojawiły się 10-14 dnia po podaniu i trwały przez około tydzień. Po zakończeniu badań, wszystkie zwierzęta uśmiercono i poddano sekcji. Pobrano mózg i rdzeń kręgowy do analizy histologicznej lub zamrożono do analizy mRNA. Dane dotyczące wagi ciała i miarę objawów klinicznych przedstawiono indywidualnie i dla grupy.
Miara objawów klinicznych
Norma
0,5 Słaby, obniżona ruchliwość ogona
Bezwładny ogon (mysz nie może podnieść ogona podczas podnoszenia)
Bezwładny ogon, słabe łapy (mysz nie może podnieść ogona, może stać na tylnich łapach, ale łapy trzęsą się)
Paraliż (mysz nie może siedzieć z podkurczonymi łapami, ciągnie nogi za sobą)
Paraliż (mysz nie może ruszyć tylnymi łapami)
Porażenie cztero kończynowe (paraliż przednich łap lub chodzenie w kółko, może mieć przechył głowy)
PL 209 535 B1
Stan agonalny (mysz całkowicie sparaliżowana, nie może dosię gnąć jedzenia i picia, uś miercić mysz)
P r z y k ł a d 17
Model TACI-FC i CIA Reumatoidalnego Zapalenia Stawów (RA)
Ośmiotygodniowe samce myszy DBA/1J (Jackson Labs) podzielono w grupy po 5 myszy. Myszom podano dwa podskórne zastrzyki 50-100 μ! 1 mg/ml kolagenu (pochodzenia kurzego lub bydlęcego) w odstępach trzy tygodniowych. Jedna kontrola nie otrzymała zastrzyku. Pierwszy zastrzyk przygotowano w kompletnym adjuwancie Freunda, drugi w niekompletnym adjuwancie Freunda. TACI-FC podawano profilaktycznie w momencie lub przed drugim zastrzykiem lub po tym, jak u zwierzęcia zaobserwowano miarę objawów klinicznych o wartości 2 i wyższej, utrzymującej się przynajmniej przez 24 godziny. Zwierzęta wykazywały symptomy zapalenia stawów po drugim zastrzyku kolagenowym, zwykle w 2-3 tygodniu. Postęp choroby mierzono w każdej łapie, stosując miarkę do mierzenie grubości łapy i przypisując odpowiednią miarę kliniczną do każdej łapy (0-3). Miara kliniczna, 0 - Norma, 1 - Stan zapalny w palcach, 2 - Łagodne zapalenie łap, 3 - Średnie zapalenie łap, 4 - Ciężkie zapalenie łap. Zwierzęta uśmiercano po wykryciu choroby przez okres 7 dni. Łapy zbierano w celu analiz histologicznych i analizy mRNA, natomiast surowicę pobierano do testów immunoglobulin i cytokin.
P r z y k ł a d 18
Neutralizujące przeciwciała TACI
Poliklonalne przeciwciała przeciwko peptydowi przygotowano poprzez immunizację dwóch samic królików New Zealand White peptydem huztnf4-1 SAGIAKLEEGPELQLAIPRE (SEQ ID NR: 59) lub peptydem huztnf4-2 SFKRGSALEEKENKELVKET (SEQ ID NR: 60). Peptydy syntetyzowano przy użyciu Applied Biosystems Model 431A (Applied Biosystems, Inc,. Foster City, CA) zgodnie z zaleceniami producenta. Peptydy łączono z białkami nośnikowymi KLH z aktywacją maleimidową. Każdemu królikowi zrobiono wstępne dootrzewnowe zastrzyki 200 μg peptydu w kompletnym adjuwancie Freunda, po których wykonano zastrzyki wzmagające 100 μg peptydu w niekompletnym adjuwancie Freunda co 3 tygodnie. 7-10 dni po podaniu drugiego zastrzyku wzmagającego (w sumie 3 zastrzyki), zwierzęta skrwawiono w celu pobrania surowicy, a następnie zwierzętom podawano zastrzyki wzmagające i skrwawiano je co 3 tygodnie.
Surowice królicze specyficzne wobec ztnf4 scharakteryzowano w teście ELISA przy użyciu 1 μg/ml peptydu użytego do wytworzenia przeciwciał (SEQ ID NR: 59 i 60). Surowice dwóch królików przeciw huztnf4-1 (SEQ ID NR: 59) miały miana wobec specyficznego peptydu w rozcieńczeniach 1:100000. Surowice dwóch królików przeciw huztnf4-2 (SEQ ID NR: 60) miały miana wobec specyficznego peptydu w rozcieńczeniach 1:5000000 oraz wobec zrekombinowanego białka pełnej długości (ztnf4 wytworzone w bakulowirusie z etykietką FLAG na końcu N (huztnf4s-NF-Bv) i ztnf4 wytworzonego w komórkach BHK z etykietką FLAG na końcu C) w rozcieńczeniach 1:5000000.
Poliklonalne przeciwciała specyficzne przeciw ztnf4 oczyszczono z króliczej surowicy przy użyciu chromatografii powinowactwa na kolumnie białkowej CNBR-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB) przygotowanej z 10 mg peptydu (SEQ ID NR: 59 lub 60) na gram CNBr-SEPHAROSE, po czym dializowano w PBS przez noc. Przeciwciała wobec ztnf4 scharakteryzowano w teście ELISA używając 1 μg/ml odpowiedniego peptydu antygenowego lub zrekombinowanego białka pełnej długości (huztnf4s-NF-BV). Najniższy poziom wykrywalności (LLD) króliczego anty-huztnf4-1 oczyszczonego przez powinowactwo przeciwciała specyficznego antygenu (peptyd huztnf4-1, SEQ ID NR: 59) wynosił 5 ng/ml. Najniższy poziom wykrywalności (LLD) króliczego anty-huztnf4-2 oczyszczonego przez powinowactwo przeciwciała specyficznego antygenu (peptyd huztnf4-2, SEQ ID NR: 60) wynosił 0,5 ng/ml. Najniższy poziom wykrywalności (LLD) króliczego anty-huztnf4-2 oczyszczonego przez powinowactwo przeciwciała białka huztnf4s-NF-Bv wynosił 5 ng/ml.
Wytworzono również mysie monoklonalne przeciwciała i wyselekcjonowano pod względem hamowania rozpuszczalnego ztnf4 wyznakowanego biotyną. Żadne z przeciwciał monoklonalnych przeciw TACI (248,14, 248,23, 248,24, 246,3) nie blokowało wiązania ztnf4 do BCMA. Przeciwciało monoklonalne to 248,23 obniżało wiązanie 10 ng/ml ztnf4-biotyna do około 50% w momencie, gdy pożywka była rozcieńczania do 1:243 i obniżała wiązanie do około 2x w nierozcieńczonej pożywce. Przeciwciało monoklonalne to 246,3 obniżało wiązanie 10 ng/ml ztnf4-biotyna do około 50% w momencie, gdy pożywka była rozcieńczania od 1:243 do 1:181 i obniżała wiązanie do około 5x w nierozcieńczonej pożywce.
PL 209 535 B1
Lista sekwencji <110> ZymoGenetics, Inc.
<120=» ROZPUSZCZALNY RECEPTOR BR43X2 I SPOSOBY JEGO ZASTOSOWANIA <130> 98-75 <150> 09/226,533 <151> 1999-01-07 <160> 60 <170> FastSEQ for Windows Version 3.0 <210> 1 <211> 1192 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (6)...(746) <400> 1 gagta atg agt ggc ctg ggc cgg agc agg ega ggt ggc cgg age cgt gtg 50
Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val
10 15
| gac | cag gag | gag | ege | tgg | tea | ctc | agc | tgc | ege | aag | gag | caa | ggc | aag | 98 |
| Asp | Gin Glu | Glu | Arg | Trp | Ser | Leu | Ser | Cys | Arg | Lys | Glu | Gin | Gly | Lys | |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| ttc | tat gac | cat | ctc | ctg | agg | gac | tgc | atc | agc | tgt | gee | tcc | atc | tgt | 146 |
| Phe | Tyr Asp | His | Leu | Leu | Arg | Asp | Cys | Ile | Ser | Cys | Ala | Ser | Ile | Cys | |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| gga | cag cac | cct | aag | caa | tgt | gca | tac | ttc | tgt | gag | aac | aag | ctc | agg | 194 |
| Gly | Gin His | Pro | Lys | Gin | Cys | Ala | Tyr | Phe | Cys | Glu | Asn | Lys | Leu | Arg |
55 60 agc cca gtg aac ctt cca cca gag ctc agg aga cag cgg agt gga gaa 242
Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gin Arg Ser Gly Glu
70 75
PL 209 535 B1
| gtt Val 80 | gaa aac aat | tca gac aac tcg gga agg tac caa gga ttg gag cac | 290 | |||||||||||||
| Glu | Asn Asn | Ser Asp 85 | Asn | Ser | Gly | Arg | Tyr Gin Gly Leu Glu His | |||||||||
| 90 | 95 | |||||||||||||||
| aga | ggc | tca | gaa | gca | agt | cca | gct | ctc | ccg | ggg | ctg | aag | ctg | agt | gca | 338 |
| Arg Gly | Ser | Glu | Ala | Sen | Pro | Ala | Leu | Pro | Gly | Leu | Lys | Leu | Ser | Ala | ||
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| gat | cag | gtg | gcc | ctg gtc | tac | agc | acg | ctg | ggg | ctc | tgc ctg tgt | gcc | 386 | |||
| Asp | Gin | Val | Ala | Leu | Val | Tyr | Ser Thr | Leu Gly | Leu | Cys | Leu | Cys | Ala | |||
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| gtc | ctc | tgc tgc | ttc | ctg gtg | gcg | gtg | gcc | tgc | ttc | ctc | aag | aag | agg | 434 | ||
| Val | Leu | Cys Cys | Phe | Leu | Val | Ala | Val | Ala | Cys | Phe | Leu | Lys | Lys | Arg | ||
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| ggg | gat | ccc | tgc | tcc | tgc | cag | ccc | cgc | tca | agg | ccc. | cgt | caa | agt | ccg | 482 |
| Gly Asp | Pro | Cys | Ser | Cys | Gin | Pro | Arg Ser Arg | Pro Arg | Gin | Ser | Pro | |||||
| 145 | 150 | 155 | ||||||||||||||
| gcc | aag | tct | tcc | cag | gat | cac | gcg | atg | gaa | gcc | ggc | agc | cct | gtg | agc | 530 |
| Ala | Lys | Ser | Ser | Gin | Asp | His | Ala | Met | Glu Ala | Gly | Ser | Pro | Val | Ser | ||
| 160 | 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| aca | tcc | ccc | gag | cca | gtg | gag | acc | tgc | agc | ttc | tgc | ttc | cct | gag | tgc | 578 |
| Thr | Ser | Pro | Glu | Pro | Val | Glu | Thr | Cys | Ser | Phe | Cys | Phe | Pro | Glu | Cys | |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| agg | gcg | ccc | acg | cag | gag | agc | gca | gtc | acg | cct | ggg | acc | ccc | gac | ccc | 626 |
| Arg | Ala | Pro | Thr | Gin | Glu | Ser Ala | Val | Thr | Pro | Gly | Thr | Pro | Asp | Pro | ||
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| act | tgt | gct | gga | agg | tgg | ggg | tgc | cac | acc | agg | acc | aca | gtc ctg | cag | 674 | |
| Thr | Cys | Ala | Gly Arg | Trp Gly | Cys | His Thr | Arg | Thr | Thr | Val | Leu | Gin | ||||
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
| cct | tgc | cca | cac | atc | cca | gac | agt | ggc ctt | ggc | att | gtg tgt gtg | cct | 722 | |||
| Pro | Cys | Pro | His | Ile | Pro | Asp | Ser | Gly Leu | Gly | Ile | Val | Cys Val | Pro | |||
| 225 | 230 | 235 | ||||||||||||||
| gcc | cag | gag | ggg | ggc | cca | ggt | gca | taaatggggg tcagggaggg aaaggaggag | 776 | |||||||
| Ala | Gin | Glu | Gly Gly | Pro | Gly | Ala | ||||||||||
| 240 | 245 |
PL 209 535 B1 ggagagagat ggagaggagg aggagagaga gacagaggag gagacagagg gagagagaga gaaagaggca gagagggaga gagggacaga gagagataga gctgtaggtc gtcatcacct gcccccgaga gcccctcctc ggagagagaa agagaggtgg gcagagaggg agagaaacag cagaggggaa gagaggcaga gaggcagaga gggagagagg gcaggaggtc ggggcactct aaccacacgt gcaataaagt ctggagaata aaacctttgg ggagagggga gagagatatg aggagacaga gagggagaga gagggaaaga ggcagagaag cagagagaca gagagggaga gagtcccagt tcccagtgca cctcgtgcct gctgctcaca cagctgccct tcctca
836
896
956
1016
1076
1136
1192
| <210> | 2 | |||||||||||||
| <211> | 247 | |||||||||||||
| <212> | PRT | |||||||||||||
| <213> | Homo sapien: | |||||||||||||
| <400> | 2 | |||||||||||||
| Met | Ser Gly | Leu | Gly | Arg | Ser | Arg | Arg | Gly | Gly | Arg | Ser | Arg | Val | Asp |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Gin | Glu Glu | Arg | Trp | Ser | Leu | Ser | Cys | Arg | Lys | Glu | Gin | Gly | Lys | Phe |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Tyr | Asp His | Leu | Leu | Arg | Asp | Cys | Ile | Ser | Cys | Ala | Ser | Ile | Cys | Gly |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Gin | His Pro | Lys | Gin | Cys | Ala | Tyr | Phe | Cys | Glu | Asn | Lys | Leu | Arg | Ser |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Pro | Val Asn | Leu | Pro | Pro | Glu | Leu | Arg | Arg | Gin | Arg | Ser | Gly | Glu | Val |
| 65 | 70 | 75 | 80 | |||||||||||
| Glu | Asn Asn | Ser | Asp | Asn | Ser | Gly | Arg | Tyr | Gin | Gly | Leu | Glu | His | Arg |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||
| Gly | Ser Glu | Ala | Ser | Pro | Ala | Leu | Pro | Gly | Leu | Lys | Leu | Ser | Ala | Asp |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||
| Gin | Val Ala | Leu | Val | Tyr | Ser | Thr | Leu | Gly | Leu | Cys | Leu | Cys | Ala | Val |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||
| Leu | Cys Cys | Phe | Leu | Val | Ala | Val | Ala | Cys | Phe | Leu | Lys | Lys | Arg | Gly |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||
| Asp | Pro Cys | Ser | Cys | Gin | Pro | Arg | Ser | Arg | Pro | Arg | Gin | Ser | Pro | Ala |
| 145 | 150 | 155 | 160 | |||||||||||
| Lys | Ser Ser | Gin | Asp | His | Ala | Met | Glu | Ala | Gly | Ser | Pro | Val | Ser | Thr |
| 165 | 170 | 175 | ||||||||||||
| Ser | Pro Glu | Pro | Val | Glu | Thr | Cys | Ser | Phe | Cys | Phe | Pro | Glu | Cys | Arg |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||
| Ala | Pro Thr | Gin | Glu | Ser | Ala | Val | Thr | Pro | Gly | Thr | Pro | Asp | Pro | Thr |
| 195 | 200 | 205 |
Cys Ala Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val Leu Gin Pro 210 215 220
Cys Pro His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Val Cys Val Pro Ala 225 230 235 240 Gin Glu Gly Gly Pro Gly Ala
PL 209 535 B1
245 <210> 3 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (1)...(360) <400> 3
| atg Met 1 | agt ggc | ctg Leu | ggc cgg Gly Arg 5 | agc agg ega | ggt ggc cgg agc cgt gtg gac Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp | 48 | ||||
| Ser | Gly | Ser | Arg | Arg | ||||||
| 10 | 15 | |||||||||
| cag | gag | gag | cgc | tgg tca | ctc | agc | tgc | cgc | aag gag caa ggc aag ttc | 96 |
| Gin | Glu | Glu | Arg | Trp Ser | Leu | Ser | Cys Arg | Lys Glu Gin Gly Lys Phe | ||
| 20 | 25 | 30 | ||||||||
| tat | gac | cat | ctc | ctg agg | gac | tgc | atc | agc | tgt gcc tcc atc tgt gga | 144 |
| Tyr Asp | His | Leu | Leu Arg | Asp | Cys | Ile | Ser | Cys Ala Ser Ile Cys Gly | ||
| 35 | 40 | 45 | ||||||||
| cag | cac | cct | aag | caa tgt | gca | tac | ttc | tgt | gag aac aag ctc agg agc | 192 |
| Gin | His | Pro | Lys | Gin Cys | Ala | Tyr | Phe | Cys | Glu Asn Lys Leu Arg Ser | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||
| cca | gtg | aac | ctt | cca cca | gag | ctc | agg | aga | cag cgg agt gga gaa gtt | 240 |
| Pro | Val | Asn | Leu | Pro Pro | Glu | Leu | Arg | Arg | Gin Arg Ser Gly Glu Val | |
| 65 | 70 | 75 80 | ||||||||
| gaa | aac | aat | tca | gac aac | teg | gga | agg | tac | caa gga ttg gag cac aga | 288 |
| Glu | Asn | Asn | Ser | Asp Asn | Ser | Gly Arg Tyr Gin Gly Leu Glu His Arg | ||||
| 85 | 90 | 95 | ||||||||
| ggc | tca | gaa | gca | agt cca | get | ctc | ccg | ggg ctg aag ctg agt gca gat | 336 | |
| Gly | Ser | Glu | Ala | Ser Pro | Ala | Leu | Pro | Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp | ||
| 100 | 105 | 110 |
cag gtg gcc ctg gtc tac agc acg 360
Gin Val Ala Leu Val Tyr Ser Thr
115 120
PL 209 535 B1 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
| Met | Ser | Gly | Leu | Gly | Arg | Ser | Arg | Arg | Gly | Gly | Arg | Ser | Arg | Val | Asp |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Gin | Glu | Glu | Arg | Trp | Ser | Leu | Ser | Cys | Arg | Lys | Glu | Gin | Gly | Lys | Phe |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Tyr | Asp | His | Leu | Leu | Arg | Asp | Cys | Ile | Ser | Cys | Ala | Ser | Ile | Cys | Gly |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Gin | His | Pro | Lys | Gin | Cys | Ala | Tyr | Phe | Cys | Glu | Asn | Lys | Leu | Arg | Ser |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Pro | Val | Asn | Leu | Pro | Pro | Glu | Leu | Arg | Arg | Gin | Arg | Ser | Gly | Glu | Val |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Glu | Asn | Asn | Ser | Asp | Asn | Ser | Gly | Arg | Tyr | Gin | Gly | Leu | Glu | His | Arg |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Gly | Ser | Glu | Ala | Ser | Pro | Ala | Leu | Pro | Gly | Leu | Lys | Leu | Ser | Ala | Asp |
| 100 | 105 | 110 |
Gin Val Ala Leu Val Tyr Ser Thr 115 120 <210> 5 <211> 1377 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (14)...(895) .
<400> 5 agcatcctga gta atg agt ggc ctg ggc cgg agc agg ega ggt ggc cgg Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg
5 10
| agc | cgt | gtg | gac | cag | gag | gag | ege | ttt | cca | cag | ggc | ctg | tgg | acg | ggg |
| Ser | Arg | Val | Asp | Gin | Glu | Glu | Arg | Phe | Pro | Gin | Gly | Leu | Trp | Thr | Gly |
| 15 | 20 | 25 | |||||||||||||
| gtg | get | atg | aga | tcc | tgc | ccc | gaa | gag | cag | tac | tgg | gat | cct | ctg | ctg |
| Val | Ala | Met | Arg | Ser | Cys | Pro | Glu | Glu | Gin | Tyr | Trp | Asp | Pro | Leu | Leu |
| 30 | 35 | 40 |
145
PL 209 535 B1
| ggt acc tgc | atg tcc Met Ser | tgc aaa acc att tgc aac cat cag agc cag cgc | 193 | |||||||||||||
| Gly 45 | Thr | Cys | Cys 50 | Lys Thr | Ile | Cys | Asn 55 | His | Gin | Ser | Gin | Arg 60 | ||||
| acc | tgt | gca | gcc | ttc | tgc agg | tca | ctc | agc | tgc | cgc | aag | gag | caa | ggc | 241 | |
| Thr | Cys | Ala | Ala | Phe | Cys Arg | Ser | Leu | Ser | Cys Arg | Lys | Glu | Gin | Gly | |||
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
| aag | ttc | tat | gac | cat | ctc | ctg | agg | gac | tgc | atc | agc | tgt | gcc | tcc | atc ' | 289 |
| Lys | Phe | Tyr Asp | His | Leu | Leu | Arg Asp | Cys | Ile | Ser | Cys | Ala | Ser | Ile | |||
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||||
| tgt | gga | cag | cac | cct | aag | caa | tgt | gca | tac | ttc | tgt | gag | aac | aag | ctc | 337 |
| Cys | Gly | Gin | His | Pro | Lys | Gin | Cys | Ala | Tyr | Phe | Cys | Glu | Asn | Lys | Leu | |
| 95 | 100 | 105 | ||||||||||||||
| agg | agc | cca | gtg | aac | ctt | cca | cca | gag | ctc | agg | aga | cag | cgg | agt | gga | 385 |
| Arg | Ser | Pro | Val | Asn | Leu | Pro | Pro Glu | Leu | Arg Arg | Gin | Arg | Ser | Gly | |||
| 110 | 115 | 120 | ||||||||||||||
| gaa | gtt | gaa | aac | aat | tca | gac | aac | tcg | gga | agg tac | caa | gga | ttg | gag | 433 | |
| Glu | Val | Glu | Asn | Asn | Ser | Asp | Asn | Ser | Gly Arg Tyr | Gin | Gly | Leu | Glu | |||
| 125 | 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| cac | aga | ggc | tca | gaa | gca | agt | cca | gct | ctc | ccg | ggg | ctg | aag | ctg | agt | 481 |
| His | Arg Gly Ser Glu Ala | Ser | Pro Ala | Leu | Pro | Gly | Leu | Lys | Leu | Ser | ||||||
| 145 | 150 | 155 | ||||||||||||||
| gca | gat | cag | gtg | gcc | ctg gtc | tac | agc | acg | ctg | ggg | ctc | tgc ctg tgt | 529 | |||
| Ala | Asp | Gin | Val | Ala | Leu | Val | Tyr | Ser | Thr | Leu | Gly | Leu | Cys | Leu | Cys | |
| 160 | 165 | 170 | ||||||||||||||
| gcc | gtc | ctc | tgc tgc | ttc | ctg gtg | gcg | gtg | gcc | tgc | ttc | ctc | aag | aag | 577 | ||
| Ala | Val | Leu | Cys Cys | Phe | Leu | Val | Ala | Val | Ala | Cys | Phe | Leu | Lys | Lys | ||
| 175 | 180 | 185 | ||||||||||||||
| agg | ggg | gat | ccc | tgc | tcc | tgc | cag | ccc | cgc | tca | agg | ccc | cgt | caa | agt | 625 |
| Arg | Gly Asp | Pro | Cys | Ser | Cys | Gin | Pro | Arg | Ser | Arg | Pro | Arg | Gin | Ser | ||
| 190 | 195 | 200 | ||||||||||||||
| ccg | gcc aag | tct | tcc | cag | gat | cac | gcg | atg | gaa | gcc | ggc | agc | cct | gtg | 673 | |
| Pro Ala Lys | Ser | Ser | Gin Asp His | Ala | Met | Glu | Ala | Gly | Ser | Pro | Val | |||||
| 205 | 210 | 215 | 220 |
PL 209 535 B1
| agc aca Ser Thr | tcc ccc gag Ser Pro Glu 225 | cca Pro | gtg gag acc Val Glu Thr | tgc agc ttc tgc ttc cct gag | 721 | |||||||||||
| Cys 230 | Sen | Phe | Cys | Phe | Pro 235 | Glu | ||||||||||
| tgc | agg | gcg | ccc | acg | cag | gag | agc | gca | gtc | acg | cct | ggg | acc | ccc | gac | 769 |
| Cys Arg | Ala | Pro | Thr | Gin | Glu | Ser | Ala | Val | Thr | Pro | Gly | Thr | Pro | Asp |
240 245 250
| ccc | act | tgt | gct | gga | agg | tgg | ggg | tgc | cac | acc | agg | acc | aca | gtc | ctg | 817 |
| Pro | Thr | Cys | Ala | Gly | Arg | Trp | Gly | Cys | His | Thr | Arg | Thr | Thr | Val | Leu | |
| 255 | 260 | 265 | ||||||||||||||
| cag | cct | tgc | cca | cac | atc | cca | gac | agt | ggc | ctt | ggc | att | gtg | tgt | gtg | 865 |
| Gin | Pro | Cys | Pro | His | Ile | Pro | Asp | Ser | Gly | Leu | Gly | Ile | Val | Cys | Val | |
| 270 | 275 | 280 |
cct gcc cag gag ggg ggc cca ggt gca taa atgggggtca gggagggaaa 915
Pro Ala Gin Glu Gly Gly Pro Gly Ala * .
285 290 ggaggaggga gagagatgga gaggagggga gagagaaaga gaggtgggga gaggggagag 975 agatatgagg agagagagac agaggaggca gaaagggaga gaaacagagg agacagagag 1035 ggagagagag acagagggag agagagacag aggggaagag aggcagagag ggaaagaggc 1095 agagaaggaa agagacaggc agagaaggag agaggcagag agggagagag gcagagaggg 1155 agagaggcag agagacagag agggagagag ggacagagag agatagagca ggaggtcggg 1215 gcactctgag tcccagttcc cagtgcagct gtaggtcgtc atcacctaac cacacgtgca 1275 ataaagtcct cgtgcctgct gctcacagcc cccgagagcc cctcctcctg gagaataaaa 1335 cctttggcag ctgcccttcc tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1377
| <210> | 6 | |||||||||||||
| <211> | 293 | |||||||||||||
| <212> | PRT | |||||||||||||
| <213> | Homo sapiens | |||||||||||||
| <400> | 6 | |||||||||||||
| Met | Ser Gly | Leu | Gly | Arg | Ser | Arg | Arg | Gly | Gly | Arg | Ser | Arg | Val | Asp |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Gin | Glu Glu | Arg | Phe | Pro | Gin | Gly | Leu | Trp | Thr | Gly | Val | Ala | Met | Arg |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Sen | Cys Pro | Glu | Glu | Gin | Tyr | Trp | Asp | Pro | Leu | Leu | Gly | Thr | Cys | Met |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| Ser | Cys Lys | Thr | Ile | Cys | Asn | His | Gin | Ser | Gin | Arg | Thr | Cys | Ala | Ala |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Phe | Cys Arg | Ser | Leu | Ser | Cys | Arg | Lys | Glu | Gin | Gly | Lys | Phe | Tyr | Asp |
| 65 | 70 | 75 | 80 |
PL 209 535 B1
| His | Leu Leu | Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gin His | |||||||||||||
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Pro | Lys | Gin | Cys | Ala | Tyr | Phe Cys | Glu | Asn | Lys | Leu | Arg | Ser | Pro | Val | |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Asn | Leu | Pro | Pro | Glu | Leu | Arg Arg | Gin | Arg | Ser | Gly | Glu | Val | Glu | Asn | |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Asn | Ser | Asp | Asn | Ser | Gly Arg Tyr | Gin | Gly | Leu | Glu | His | Arg Gly | Ser | |||
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Glu | Ala | Ser | Pro | Ala | Leu | Pro | Gly | Leu | Lys | Leu | Ser | Ala | Asp Gin | Val | |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ala | Leu | Val | Tyr | Ser | Thr | Leu | Gly | Leu | Cys | Leu | Cys | Ala | Val | Leu | Cys |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Cys | Phe | Leu | Val | Ala | Val | Ala | Cys | Phe | Leu | Lys | Lys Arg Gly Asp | Pro | |||
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Cys | Ser | Cys | Gin | Pro | Arg | Ser | Arg | Pro | Arg | Gin | Ser | Pro | Ala | Lys | Ser |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Ser | Gin | Asp | His | Ala | Met | Glu | Ala | Gly | Ser | Pro | Val | Ser | Thr | Ser | Pro |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Glu | Pro | Val | Glu | Thr | Cys | Ser | Phe | Cys | Phe | Pro | Glu | Cys | Arg | Ala | Pro |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Thr | Gin | Glu | Ser | Ala | Val | Thr | Pro | Gly | Thr | Pro | Asp | Pro | Thr | cys | Ala |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Gly Arg Trp Gly Cys | His | Thr | Arg | Thr | Thr | Val | Leu | Gin | Pro | Cys | Pro | ||||
| 260 | 265 | 270 | |||||||||||||
| His | Ile Pro Asp Ser Gly | Leu | Gly | Ile | Val | Cys | Val | Pro | Ala | Gin | Glu |
275 280 285
Gly Gly Pro Gly Ala 290 <210 7 <211> 995 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (219)...(773) <400> 7 aagactcaaa cttagaaact tgaattagat gtggtattca aatccttacg tgccgcgaag 60 acacagacag cccccgtaag aacccacgaa gcaggcgaag ttcattgttc tcaacattct 120 agctgctctt gctgcatttg ctctggaatt cttgtagaga tattacttgt ccttccaggc 180 tgttctttct gtagctccct tgttttcttt ttgtgatc atg ttg cag atg gct ggg 236
Met Leu Gin Met Ala Gly 1 5
PL 209 535 B1
| cag tgc tcc caa | aat Asn | gaa tat Glu Tyr | ttt gac agt ttg ttg cat get tgc | ata Ile | 284 | |||||||||||
| Gin | Cys | Ser | Gin 10 | Phe Asp 15 | Ser | Leu Leu | His | Ala 20 | Cys | |||||||
| cct | tgt | caa | ctt | ega | tgt | tet | tet | aat | act | cct | cct | eta | aca | tgt | cag | 332 |
| Pro | Cys | Gin | Leu | Arg Cys | Ser | Ser | Asn | Thr | Pro | Pro | Leu | Thr | Cys | Gin | ||
| 25 | 30 | 35 | ||||||||||||||
| cgt | tat | tgt | aat | gca agt gtg | acc | aat | tea | gtg | aaa | gga | acg | aat | gcg | 380 | ||
| Arg | Tyr Cys | Asn | Ala | Ser | Val | Thr | Asn | Ser | Val | Lys | Gly | Thr | Asn | Ala | ||
| 40 | 45 | 50 | ||||||||||||||
| att | ctc | tgg | acc | tgt ttg | gga | ctg | agc | tta | ata | att | tet | ttg | gca | gtt | 428 | |
| Ile | Leu | Trp | Thr | Cys | Leu | Gly | Leu | Ser | Leu | Ile | Ile | Ser | Leu | Ala | Val | |
| 55 | 60 | 65 | 70 | |||||||||||||
| ttc | gtg | eta | atg | ttt | ttg | eta | agg | aag | ata | agc | tet | gaa | cca | tta | aag | 476 |
| Phe | Val | Leu | Met | Phe | Leu | Leu | Arg | Lys | Ile | Ser | Ser | Glu | Pro | Leu | Lys | |
| 75 | 80 | 85 | ||||||||||||||
| gac | gag | ttt | aaa | aac | aca | gga | tea | ggt | ctc | ctg | ggc | atg | get | aac | att | 524 |
| Asp | Glu | Phe | Lys | Asn | Thr | Gly | Ser | Gly | Leu | Leu | Gly | Met | Ala | Asn | Ile | |
| 90 | 95 | 100 | ||||||||||||||
| gac | ctg | gaa | aag | agc | agg | act | ggt | gat | gaa | att | att | ctt | ccg | aga | ggc | 572 |
| Asp | Leu | Glu | Lys | Ser | Arg | Thr | Gly Asp | Glu | Ile | Ile | Leu | Pro | Arg Gly | |||
| 105 | 110 | 115 | ||||||||||||||
| ctc | gag | tac | acg | gtg | gaa | gaa | tgc | acc | tgt | gaa | gac | tgc | atc | aag | agc | 620 |
| Len | Glu | Tyr | Thr | Val | Glu | Glu | Cys | Thr | Cys | Glu | Asp Cys | Ile | Lys | Ser | ||
| 120 | 125 | 130 | ||||||||||||||
| aaa | ccg | aag | gtc | gac | tet | gac | cat | tgc | ttt | cca | ctc | cca | get | atg | gag | 668 |
| Lys | Pro | Lys | Val | Asp | Ser | Asp | His | Cys | Phe | Pro | Leu | Pro | Ala | Met | Glu | |
| 135 | 140 | 145 | 150 | |||||||||||||
| gaa | ggc | gca | acc | att | ctt | gtc | acc | acg | aaa | acg | aat | gac | tat | tgc | aag | 716 |
| Glu | Gly | Ala | Thr | Ile | Leu | Val | Thr | Thr | Lys | Thr | Asn | Asp | Tyr Cys | Lys | ||
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||||
| agc | ctg | cca | get get ttg | agt | get | acg | gag | ata | gag | aaa | tea | att | tet | 764 | ||
| Ser | Leu | Pro | Ala | Ala | Leu | Ser | Ala | Thr | Glu | Ile | Glu | Lys | Ser | Ile | Ser | |
| 170 | 175 | 180 |
PL 209 535 B1 gct agg taa ttaaccattt cgactcgagc agtgccactt taaaaatctt 813 Ala Arg * ttgtcagaat agatgatgtg tcagatctct ttaggatgac tgtatttttc agttgccgat 873 acagcttttt gtcctctaac tgtggaaact ctttatgtta gatatatttc tctaggttac 933 tgttgggagc ttaatggtag aaacttcctt ggtttcatga ttaaagtctt tttttttcct 993 <210> 8 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
| Met | Leu | Gin | Met | Ala | Gly | Gin | Cys | Ser | Gin | Asn | Glu | Tyr | Phe | Asp | Ser |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Leu | Leu | His | Ala | Cys | Ile | Pro | Cys | Gin | Leu | Arg | Cys | Ser | Ser | Asn | Thr |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Pro | Pro | Leu | Thr | Cys | Gin | Arg | Tyr | Cys | Asn | Ala | Ser | Val | Thr | Asn | Ser |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Val | Lys | Gly | Thr | Asn | Ala | Ile | Leu | Trp | Thr | Cys | Leu | Gly | Leu | Ser | Leu |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Ile | Ile | Ser | Leu | Ala | Val | Phe | Val | Leu | Met | Phe | Leu | Leu | Arg | Lys | Ile |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Ser | Ser | Glu | Pro | Leu | Lys | Asp | Glu | Phe | Lys | Asn | Thr | Gly | Ser | Gly | Leu |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Leu | Gly | Met | Ala | Asn | Ile | Asp | Leu | Glu | Lys | Ser | Arg | Thr | Gly | Asp | Glu |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Ile | Ile | Leu | Pro | Arg | Gly | Leu | Glu | Tyr | Thr | Val | Glu | Glu | Cys | Thr | Cys |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Glu | Asp | Cys | Ile | Lys | Ser | Lys | Pro | Lys | Val | Asp | Ser | Asp | His | Cys | Phe |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Pro | Leu | Pro | Ala | Met | Glu | Glu | Gly | Ala | Thr | Ile | Leu | Val | Thr | Thr | Lys |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Thr | Asn | Asp | Tyr | Cys | Lys | Ser | Leu | Pro | Ala | Ala | Leu | Ser | Ala | Thr | Glu |
| 165 | 170 | 175 |
Ile Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg 180 <210> 9 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens
PL 209 535 B1 <400> 9
| Gly | Arg | Ser | Arg | Arg | Gly | Gly | Arg | Ser | Arg | Val | Asp | Gin | Glu | Glu | Arg |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Phe | Pro | Gin | Gly | Leu | Trp | Thr | Gly | Val | Ala | Met | Arg | Ser | Cys | Pro | Glu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Glu | Gin | Tyr | Trp | Asp | Pro | Leu | Leu | Gly | Thr | Cys | Met | Ser | Cys | Lys | Thr |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ile | Cys | Asn | His | Gin | Ser | Gin | Arg | Thr | Cys | Ala | Ala | Phe | Cys | Arg | Ser |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Leu | Ser | Cys | Arg | Lys | Glu | Gin | Gly | Lys | Phe | Tyr | Asp | His | Leu | Leu | Arg |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Asp | Cys | Ile | Ser | Cys | Ala | Ser | ile | Cys | Gly | Gin | His | Pro | Lys | Gin | Cys |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Ala | Tyr | Phe | Cys | Glu | Asn | Lys | Leu | Arg | Ser | Pro | Val | Asn | Leu | Pro | Pro |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Glu | Leu | Arg | Arg | Gin | Arg | Ser | Gly | Glu | Val | Glu | Asn | Asn | Ser | Asp | Asn |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ser | Gly | Arg | Tyr | Gin | Gly | Leu | Glu | His | Arg | Gly | Ser | Glu | Ala | Ser | Pro |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Ala | Leu | Pro | Gly | Leu | Lys | Leu | Ser | Ala | Asp | Gin | Val | Ala | Leu | Val | Tyr |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ser | Thr | Leu | Gly | Leu | Cys | Leu | Cys | Ala | Val | Leu | Cys | Cys | Phe | Leu | Val |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Ala | Val | Ala | Cys | Phe | Leu | Lys | Lys | Arg | Gly | Asp | Pro | Cys | Ser | Cys | Gin |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Pro | Arg | Ser | Arg | Pro | Arg | Gin | Ser | Pro | Ala | Lys | Ser | Ser | Gin | Asp | His |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Ala | Met | Glu | Ala | Gly | Ser | Pro | Val | Ser | Thr | Ser | Pro | Glu | Pro | Val | Glu |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Thr | Cys | Ser | Phe | Cys | Phe | Pro | Glu | Cys | Arg | Ala | Pro | Thr | Gin | Glu | Ser |
| 225 | 230 | 235 | 240 |
Ala Val Thr Pro Gly 245 <210> 10 <211> 40 <212> PRT · <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Motyw opisany j ako domena z . pseudo-powtórzeniem bogatym w cysteinę <221> Wariant.
<222> (1)...(2)
PL 209 535 B1 <223> Każdy Xaa jest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny, lub brak <221>
<222>
<223>
Wariant (4)...(4)
Xaa jest dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny <22l> Wariant <222> (5)...(5) <223> Xaa jest glutaminą, kwasem glutaminowym lub lizyną <221> Wariant <222> (6)...(6) <223> xaa jest glutaminą, kwasem glutaminowym, lizyną asparaginą, argininą, kwasem asparaginowym, histydyną Lub seryną <221> Wariant <222> (7)...(7) <223> Xaa jest glutaminą lub kwasem glutaminowym <221>
<222>
<223>
<221>
<222>
<223>
<221>
<222>
<223>
<221>
<222>
<223>
<221>
<222>
<223>
<221>
Wariant (8)...(9)
Każdy Xaajest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny, lub brak
Wariant (10)...(11)
Xaa jest tyrozyną, fenyloalaniną lub tryptofanem Wariant ' (13)...(13)
Xaajest dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny Wariant (16)...(17)
Każdy Xaa jest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny
Wariant (19)...(19)
Xaa jest izoleucyną, metioniną, leucyną lub waliną ie' Wariant
PL 209 535 B1 <222>
<223>
<221>
<222>
<223= <221>
<222>
<223>
<221>
<222>
<223>
<221>
<222>
<223>
<221>
<222>
<223>
<221>
<222>
<223>
(20)...(20)
Xaajest dowolną resztą aminokwasową · z wyjątkiem cysteiny Wariant (22)...(24)
Każdy Xaajest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny Wariant (26)...(31)
Każdy Xaajest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny Wariant (32)...(33)
Każdy Xaajest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny, lub brak
Wariant (35)...(36;
Każdy Xaajest niezależnie dowolną resztą aminokwasowa z wyjątkiem cysteiny
Wariant (37)...(37)
Xaa jest tyrozyną lub fenyloalaniną Wariant (39)...(40) ( Każdy Xaa jest niezależnie dowolną resztą aminokwasową z wyjątkiem cysteiny, lub brak <400> 10
| Xaa | Xaa | Cys | Xaa | Xaa | Xaa | Xaa | Xaa | Xaa | Xaa | Xaa | Asp | Xaa | Leu | Leu | Xaa |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Xaa | Cys | Xaa | Xaa | Cys | Xaa | Xaa | Xaa | Cys | Xaa | Xaa | Xaa | Xaa | Xaa | Xaa | Xaa |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Xaa | Cys | Xaa | Xaa | Xaa | Cys | Xaa | Xaa | ||||||||
| 35 | 40 |
<210> 11 <211> 360 <212> DNA <213>
Sekwencja sztuczna
PL 209 535 B1 <220>
<223>
Zdegenerowana sekwencja oligonukleotydowa kodująca polipeptyd o SEQ ID Nr 4 <221> wariant <222> (1)...(360) <223> Każde N jest niezależnie A, T, G lub C <400> 11 atgwsnggny tnggnmgnws nmgnmgnggn ggnmgnwsnm gngtngayca tggwsnytnw sntgymgnaa rgarcarggn aarttytayg aycayytnyt athwsntgyg cnwsnathtg yggncarcay ccnaarcart gygcntaytt aarytnmgnw snccngtnaa yytnccnccn garytnmgnm gncarmgnws garaayaayw sngayaayws nggnmgntay carggnytng arcaymgngg wsnccngcny tnccnggnyt naarytnwsn gcngaycarg tngcnytngt <210> 12 <211> 741 <212> DNA <213> , Sekwencja sztuczna rgargarmgn nmgngaytgy ytgygaraay nggngargtn nwsngargcn ntaywsnacn
120
180
240
300
360 <220>
<223>
Zdegenerowana sekwencja oligonukleotydowa kodująca polipeptyd o SEQ ID Nr 2 <221>
<222> (1)...(741) <223> .
wariant <400> 12 atgwsnggny tnggnmgnws nmgnmgnggn ggnmgnwsnm gngtngayca tggwsnytnw sntgymgnaa rgarcarggn aarttytayg aycayytnyt athwsntgyg cnwsnathtg yggncarcay ccnaarcart gygcntaytt aarytnmgnw snccngtnaa yytnccnccn garytnmgnm gncarmgnws garaayaayw sngayaayws nggnmgntay carggnytng arcaymgngg wsnccngcny tnccnggnyt naarytnwsn gcngaycarg tngcnytngt ytnggnytnt gyytntgygc ngtnytntgy tgyttyytng tngcngtngc aaraarmgng gngayccntg ywsntgycar ccnmgnwsnm gnccnmgnca aarwsnwsnc argaycaygc natggargcn ggnwsnccng tnwsnacnws gtngaracnt gywsnttytg yttyccngar tgymgngcnc cnacncarga acnccnggna cnccngaycc nacntgygcn ggnmgntggg gntgycayac gtnytncarc cntgyccnca yathccngay wsnggnytng gnathgtntg cargarggng gnccnggngc n rgargarmgn nmgngaytgy ytgygaraay nggngargtn nwsngargcn ntaywsnacn ntgyttyytn rwsnccngcn nccngarccn rwsngcngtn nmgnacnacn ygtnccngcn
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
741 <210> 13
PL 209 535 B1 <211> 8 <212> PRT <213> sekwencja sztuczna <220 <223> FLAG tag <400 13
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220> .
<223> Glu-Glu tag <400> 14
Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> oiinukleotydZC19980 <400> 15 ' cgaagagcag tactgggatc ctct 24 <210> 16 <211> 23 <212> DNA sekwencja sztuczna <220>
<223> Olinukleotyd ZC19981 <400> 16 gccaaggcca ctgtctggga tgt 23
PL 209 535 B1 <210=* 17 <211> 1149 <212> DNA <213=* Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (236)...(1027) .
<400> 17 gaattcggca cgaggcagaa aggagaaaat tcaggataac tctcctgagg ggtgagccaa 60 gccctgccat gtagtgcacg caggacatca acaaacacag ataacaggaa atgatccatt 120 ccctgtggtc acttattcta aaggccccaa ccttcaaagt tcaagtagtg atatggatga 180 ctccacagaa agggagcagt cacgccttac ttcttgcctt aagaaaagag aagaa atg 238
Met
| aaa ctg aag gag tgt gtt tcc | atc ctc cca | cgg Arg | aag gaa agc ccc tct Lys Glu Sen Pro Sen 15 | 286 | ||||||||||||
| Lys Leu Lys Glu | Cys | Val | Ser | Ile | Leu Pro 10 | |||||||||||
| 5 | ||||||||||||||||
| gtc | ega | tcc | tcc | aaa | gac | gga | aag | ctg | ctg | gct | gca | acc | ttg | ctg | ctg | 334 |
| Val | Arg | Ser | Ser | Lys Asp Gly Lys | Leu | Leu | Ala | Ala | Thr | Leu | Leu | Leu | ||||
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| gca | ctg | ctg | tct | tgc | tgc | ctc | acg | gtg | gtg | tct | ttc | tac | cag | gtg | gcc | 382 |
| Ala | Leu | Leu | Ser | Cys | Cys | Leu | Thr | Val | Val | Sen | Phe | Tyr | Gin | Val | Ala | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| gcc | ctg | caa | ggg | gac | ctg | gcc | agc | ctc | cgg | gca | gag | ctg | cag | ggc | cac | 430 |
| Ala | Leu | Gin | Gly Asp | Leu | Ala | Ser | Leu | Arg | Ala | Glu | Leu | Gin | Gly | His | ||
| 50 | 55 | 60 | 65 | |||||||||||||
| cac | gcg | gag | aag | ctg | cca | gca | gga | gca | gga | gcc | ccc | aag | gcc | ggc | ctg | 478 |
| His | Ala | Glu | Lys | Leu | Pro | Ala | Gly | Ala | Gly | Ala | Pro | Lys | Ala | Gly | Leu | |
| 70 | 75 | 80 | ||||||||||||||
| gag | gaa | gct | cca | gct gtc | acc | gcg | gga | ctg | aaa | atc | ttt | gaa | cca | cca | 526 | |
| Glu | Glu | Ala | Pro | Ala | Val | Thr | Ala | Gly | Leu | Lys | Ile | Phe | Glu | Pro | Pro | |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||||
| gct | cca | gga | gaa | ggc | aac | tcc | agt | cag | aac | agc | aga | aat | aag | cgt | gcc | 574 |
| Ala | Pro | Gly | Glu | Gly | Asn | Ser | Ser | Gin | Asn | Sen Arg | Asn | Lys Arg | Ala | |||
| 100 | 105 | 110 |
PL 209 535 B1
| gtt cag ggt cca | gaa gaa aca gtc | act caa gac tgc ttg caa ctg att | 622 | |||||||||||||
| Val Gin Gly | Pro | Glu Glu Thr 120 | Val | Thr Gin Asp | Cys 125 | Leu | Gin | Leu | Ile | |||||||
| 115 | ||||||||||||||||
| gca | gac | agt | gaa | aca | cca | act | ata | caa | aaa | gga | tet | tac | aca | ttt | gtt | 670 |
| Ala | Asp | Ser | Glu | Thr | Pro | Thr | Ile | Gin | Lys Gly | Ser | Tyr | Thr | Phe | Val | ||
| 130 | 135 | 140 | 145 | |||||||||||||
| cca | tgg | ctt | ctc | agc | ttt | aaa | agg | gga | agt | gcc | eta | gaa | gaa | aaa | gag | 718 |
| Pro | Trp | Leu | Leu | Ser | Phe | Lys Arg Gly | Ser | Ala | Leu | Glu | Glu | Lys | Glu |
150 155 160 aat aaa ata ttg gtc aaa gaa act ggt tac ttt ttt ata tat ggt cag 766
Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Gly Gin
165 170 175 gtt tta tat act gat aag acc tac gcc atg gga cat eta att cag agg 814
Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His.Leu Ile Gin Arg
180 185 190 aag aag gtc cat gtc ttt ggg gat gaa ttg agt ctg gtg act ttg ttt 862
Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Val Thr Leu Phe
195 200 205 ega tgt att caa aat atg cct gaa aca eta ccc aat aat tcc tgc tat 910
Arg Cys Ile Gin Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys Tyr
210 215 220 225
| tea | get | ggc | att | gca | aaa | ctg | gaa | gaa | gga | gat | gaa | ctc | caa | ctt | gca | 958 |
| Ser | Ala | Gly | Ile | Ala | Lys | Leu | Glu | Glu | Gly | Asp | Glu | Leu | Gin | Leu | Ala | |
| 230 | 235 | 240 | ||||||||||||||
| ata | cca | aga | gaa | aat | gca | caa | ata | tea | ctg | gat | gga | gat | gtc | aca | ttt | 1006 |
| Ile | Pro | Arg | Glu | Asn | Ala | Gin | Ile | Ser | Leu | Asp | Gly | Asp | Val | Thr | Phe | |
| 245 | 250 | 255 |
ttt ggt gca ttg aaa ctg ctg tgacctactt acaccatgtc tgtagctatt 1057
Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu
260 ttcctccctt tctctgtacc tctaagaaga aagaatctaa ctgaaaatac caaaaaaaaa 1117 aaaaaaaaaa aaaaaaccct cgagcggccg cc 1149 <210> 18 <211> 264
PL 209 535 B1 <212> PRT <213> Homo sapiens
| <1 | 400> | 18 | |||||||||||||
| Met | Lys | Leu | Lys | Glu | Cys | Val | Ser | Ile | Leu | Pro | Arg | Lys | Glu | Ser | Pro |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Ser | Val | Arg | Ser | Ser | Lys | Asp | Gly | Lys | Leu | Leu | Ala | Ala | Thr | Leu | Leu |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Leu | Ala | Leu | Leu | Ser | Cys | Cys | Leu | Thr | Val | Val | Ser | Phe | Tyr | Gin | Va 1 |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Ala | Ala | Leu | Gin | Gly | Asp | Leu | Ala | Ser | Leu | Arg | Ala | Glu | Leu | Gin | Gly |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| His | His | Ala | Glu | Lys | Leu | Pro | Ala | Gly | Ala | Gly | Ala | Pro | Lys | Ala | Gly |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Leu | Glu | Glu | Ala | Pro | Ala | Val | Thr | Ala | Gly | Leu | Lys | Ile | Phe | Glu | Pro |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Pro | Ala | Pro | Gly | Glu | Gly | Asn | Ser | Ser | Gin | Asn | Ser | Arg | Asn | Lys | Arg |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| Ala | Val | Gin | Gly | Pro | Glu | Glu | Thr | Val | Thr | Gin | Asp | Cys | Leu | Gin | Leu |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Ile | Ala | Asp | Ser | Glu | Thr | Pro | Thr | Ile | Gin | Lys | Gly | Ser | Tyr | Thr | Phe |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Val | Pro | Trp | Leu | Leu | Ser | Phe | Lys | Arg | Gly | Ser | Ala | Leu | Glu | Glu | Lys |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Glu | Asn | Lys | Ile | Leu | Val | Lys | Glu | Thr | Gly | Tyr | Phe | Phe | Ile | Tyr | Gly |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Gin | Val | Leu | Tyr | Thr | Asp | Lys | Thr | Tyr | Ala | Met | Gly | His | Leu | Ile | Gin |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Arg | Lys | Lys | Val | His | Val | Phe | Gly | Asp | Glu | Leu | Ser | Leu | Val | Thr | Leu |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Phe | Arg | Cys | He | Gin | Asn | Met | Pro | Glu | Thr | Leu | Pro | Asn | Asn | Ser | Cys |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Tyr | Ser | Ala | Gly | Ile | Ala | Lys | Leu | Glu | Glu | Gly | Asp | Glu | Leu | Gin | Leu |
| 225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
| Ala | Ile | Pro | Arg | Glu | Asn | Ala | Gin | Ile | Ser | Leu | Asp | Gly | Asp | Val | Thr |
| 245 | 250 | 255 | |||||||||||||
| Phe | Phe | Gly | Ala | Leu | Lys | Leu | Leu |
260 <210> 19 <211> 1430 <212> DNA <213> Mus musculus <220>
PL 209 535 B1 <221> CDS <222> (102)...(848) <400> 19 ttggcgcagg agcgtgcgta ggattgctcg ctcacaacag gcacctgact ggtattgaaa 60 gccgagtctt cccttcctct ttaaaggatt ggtgaccagg c atg gct atg gca ttc 116
Met Ala Met Ala Phe 1 5 ·
| tgc Cys | ccc aaa | gat Asp | cag tac | tgg gac tcc tca agg aaa tcc tgt gtc tcc | 164 | |||||||||||
| Pro | Lys | Gin 10 | Tyr | Trp Asp Ser | Ser 15 | Arg | Lys | Ser | Cys | Val 20 | Ser | |||||
| tgt | gca | ctg | acc | tgc | agc | cag | agg | agc | cag | cgc | acc | tgt | aca | gac | ttc | 212 |
| Cys | Ala | Leu | Thr | Cys | Ser | Gin | Arg | Ser | Gin | Arg | Thr | Cys | Thr | Asp | Phe | |
| 25 | 30 | 35 | ||||||||||||||
| tgc | aaa | ttc | atc | aat | tgc | ega | aaa | gag | caa | ggc | agg | tac | tac | gac | cat | 260 |
| Cys | Lys | Phe | ile | Asn | Cys Arg Lys | Glu | Gin | Gly Arg | Tyr | Tyr Asp | His | |||||
| 40 | 45 | 50 | ||||||||||||||
| ctc | ctg | ggg | gcc | tgc gtc | agc | tgt | gac | tcc | acc | tgc | aca | cag | cac | cct | 308 | |
| Leu | Leu | Gly | Ala | Cys | Val | Ser | Cys Asp | Sen | Thr | Cys | Thr | Gin | His | Pro | ||
| 55 | 60 | 65 | ||||||||||||||
| cag | cag | tgt | gcc | cac | ttc | tgt | gag | aaa | agg | ccc | aga | agc | cag | gcg | aac | 356 |
| Gin | Gin | Cys | Ala | His | Phe | Cys | Glu | Lys | Arg | Pro | Arg | Ser | Gin | Ala | Asn | |
| 70 | 75 | 80 | 85 | |||||||||||||
| ctc | cag | ccc | gag | ctc | ggg | aga | cca | cag | gcc | ggg | gag | gtg | gaa | gtc | agg | 404 |
| Leu | Gin | Pro | Glu | Leu | Gly Arg | Pro Gin Ala | Gly | Glu | Val | Glu | Val | Arg | ||||
| 90 | 95 | 100 | ||||||||||||||
| tca | gac | aac | tca | gga | agg | cac | cag | gga | tct | gag | cat | ggt | cca | gga | ttg | 452 |
| Sen | Asp | Asn | Ser | Gly Arg | His | Gin | Gly | Ser | Glu | His | Gly | Pro | Gly | Leu | ||
| 105 | 110 | 115 | ||||||||||||||
| agg | eta | agt | agc | gac | cag | ctg | act | ctc | tac | tgc | aca | ctg | ggg | gtc tgc | 500 | |
| Ang | Leu | Ser | Ser | Asp | Gl n | Leu | Thr | Leu | Tyr Cys | Thr | Leu | Gly | Val | Cys | ||
| 120 | 125 | 130 | ||||||||||||||
| ctc | tgc | gcc | atc | ttc | tgc tgt | ttc | ttg gtg gcc ttg | gcc | tcc | ttc | ctc | 548 | ||||
| Leu | Cys | Ala | Ile | Phe | Cys Cys | Phe | Leu Val | Ala | Leu | Ala | Ser | Phe | Leu | |||
| 135 | 140 | 145 |
PL 209 535 B1
| agg cgt Arg Arg 150 | aga Arg | gga gag cca Gly Glu Pro 155 | eta ccc age cag cct gee ggg cca | cgt Arg | ggg Gly 165 | 596 | ||||||||||
| Leu | Pro | Ser | Gin Pro 160 | Ala | Gly | Pro | ||||||||||
| tca | caa | gca | aac | tct | ccc | cac | gee | cac | cgc | ccc | gtg | aca | gag | get tgc | 644 | |
| Ser | Gin | Ala | Asn | Ser | Pro | His | Ala | His | Arg | Pro | Val | Thr | Glu | Ala | Cys | |
| 170 | 175 | 180 | ||||||||||||||
| gac | gag | gtg | acc | gcg | tca | ccc | cag | cct | gtg | gaa | acg | tgt | age | ttc | tgc | 692 |
| Asp | Glu | Val | Thr | Ala | Ser | Pro | Gin | Pro | Val | Glu | Thr | Cys | Ser | Phe | Cys | |
| 185 | 190 | 195 | ||||||||||||||
| ttc | ccg | gag | cgc | agt | tct | ccc | act | cag | gag | age | gcg | ccg | cgt | teg | etc | 740 |
| Phe | Pro | Glu | Arg | Ser | Ser | Pro | Thr | Gin | Glu | Ser | Ala | Pro | Arg | Ser | Leu | |
| 200 | 205 | 210 | ||||||||||||||
| ggg | ata | cac | ggc | ttc | gcg | ggc | act | gee | gee | ccg | cag | ccc | tgt | atg | cgt | 788 |
| Gly | Ile | His | Gly | Phe | Ala | Gly | Thr | Ala | Ala | Pro | Gin | Pro | Cys | Met | Arg | |
| 215 | 220 | 225 | ||||||||||||||
| gca | aca | gta | ggc | ggc | ctg | ggt gtc ctg | cgc | gca | tcc | act | ggg | gac | get | 836 | ||
| Ala | Thr | Val | Gly Gly | Leu | Gly Val | Leu Arg | Ala | Ser | Thr | Gly Asp | Ala | |||||
| 230 | 235 | 240 | 245 |
cgt ccg gca act tgacagcccg aaaaataaaa aagacaattt agaggatgga 888
Arg Pro Ala Thr gtgacagagg gggaaaggga tggagaagag acagatgaag acacgataaa ggaagcccgg 948 ctgcacccac gcagagcaac aaagcaacca cctgcagcgc ccacgttccc agcaccgcct 1008 gtgcctgccg ctgtgtccta tactttccag agcagtcaac ctgtgccttt tttctttagt 1068 cgagaaagat ggagaatgac cggcacctag cattaccctt acaattctta caaacaagtg 1128 gtctttccta tggccttagg cagatagctg agtgcagtgt ggatgtattt gtgatttaag 1188 taacttgtat gtgtatgtgc agattcgggg ttatgtcata tgtgcatgta tacgtgagtt 1248 gtgtgtctgt atgagttgtg tgtatatgtg cgcctataaa tatgtgtgtg aattctgtgc 1308 atgcagatgt gtgtgtacat atgtgtctgg ctgatgtggt atagccagaa agatgagggc 1368 ccttctaggt gaaggccaaa catctaaaaa ccatctaggt gatgggtgct cgtgccgaat 1428 tc 1430 <210> 20 <211> 249 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 20
PL 209 535 B1
| Met | Ala | Met | Ala | Phe | Cys | Pro | Lys | Asp | Gin | Tyr | Trp | Asp | Ser | Ser | Arg |
| 1 | 5 | 10 | 15 | ||||||||||||
| Lys | Ser | Cys | Val | Ser | Cys | Ala | Leu | Thr | Cys | Ser | Gin | Arg | Ser | Gin | Arg |
| 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| Thr | Cys | Thr | Asp | Phe | Cys | Lys | Phe | Ile | Asn | Cys | Arg | Lys | Glu | Gin | Gly |
| 35 | 40 | 45 | |||||||||||||
| Arg | Tyr | Tyr | Asp | His | Leu | Leu | Gly | Ala | Cys | Val | Ser | Cys | Asp | Ser | Thr |
| 50 | 55 | 60 | |||||||||||||
| Cys | Thr | Gin | His | Pro | Gin | Gin | Cys | Ala | His | Phe | Cys | Glu | Lys | Arg | Pro |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Arg | Ser | Gin | Ala | Asn | Leu | Gin | Pro | Glu | Leu | Gly | Arg | Pro | Gin | Ala | Gly |
| 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| Glu | Val | Glu | Val | Arg | Ser | Asp | Asn | Ser | Gly | Arg | His | Gin | Gly | Ser | Glu |
| 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| His | Gly | Pro | Gly | Leu | Arg | Leu | Ser | Ser | Asp | Gin | Leu | Thr | Leu | Tyr | Cys |
| 115 | 120 | 125 | |||||||||||||
| Thr | Leu | Gly | Val | Cys | Leu | Cys | Ala | Ile | Phe | Cys | Cys | Phe | Leu | Val | Ala |
| 130 | 135 | 140 | |||||||||||||
| Leu | Ala | Ser | Phe | Leu | Arg | Arg | Arg | Gly | Glu | Pro | Leu | Pro | Ser | Gin | Pro |
| 145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
| Ala | Gly | Pro | Arg | Gly | Ser | Gin | Ala | Asn | Ser | Pro | His | Ala | His | Arg | Pro |
| 165 | 170 | 175 | |||||||||||||
| Val | Thr | Glu | Ala | Cys | Asp | Glu | Val | Thr | Ala | Ser | Pro | Gin | Pro | Val | Glu |
| 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| Thr | Cys | Ser | Phe | Cys | Phe | Pro | Glu | Arg | Ser | Ser | Pro | Thr | Gin | Glu | Ser |
| 195 | 200 | 205 | |||||||||||||
| Ala | Pro | Arg | Ser | Leu | Gly | Ile | His | Gly | Phe | Ala | Gly | Thr | Ala | Ala | Pro |
| 210 | 215 | 220 | |||||||||||||
| Gin | Pro | Cys | Met | Arg | Ala | Thr | Val | Gly | Gly | Leu | Gly | Val | Leu | Arg | Ala |
| 225 | 230 | 235 | 240 |
Ser Thr Gly Asp Ala Arg Pro Ala Thr 245 ' <210> 21 <211> 473 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Sonda do analizy typu Northern .
<40 0> 21 . .
ctgtggacgg gggtggctat gagatcctgc cccgaagagc agtactggga tcctctgctg 60 ggtacctgca tgtcctgcaa aaccatttgc aaccatcaga gccagcgcac ctgtgcagcc 120 ttctgcaggt cactcagctg ccgcaaggag caaggcaagt tctatgacca tctcctgagg 180
PL 209 535 B1 gactgcatca gctgtgcctc catctgtgga cagcacccta agcaatgtgc atacttctgt 240 gagaacaagc tcaggagccc agtgaacctt ccaccagagc tcaggagaca gcggagtgga 300 gaagttgaaa acaattcaga caactcggga aggtaccaag gattggagca cagaggctca 360 gaagcaagtc cagctctccc ggggctgaag ctgagtgcag atcaggtggc cctggtctac 420 agcacgctgg ggctctgcct gtgtgccgtc ctctgctgct tcctggtggc ggt 473 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> ZC20061 <400> 22 ctgtggacag gggtggctat gagat 25 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220 <223>QiigOnukleotyd ZC20062 <400> 23 accgccacca ggaagcacag aggac 25 <210> 24 <211> 256 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna ’, <220>
<223> sonaa do analizy typu Northern <400> 24 tgcgattctc tggacctgtt tgggactgag cttaataatt tctttggcag ttttcgtgct 60 aatgtttttg ctaaggaaga taagctctga accattaaag gacgagttta aaaacacagg 120 atcaggtctc ctgggcatgg ctaacattga cctggaaaag agcaggactg gtgatgaaat 180 tattcttccg agaggcctcg agtacacggt ggaagaatgc acctgtgaag actgcatcaa 240 gagcaaaccg aaggtc 256 <210> 25 <211> 22
PL 209 535 B1 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd ZC21065 <40 0 25 .
tgcgattctc tggacctgtt tg 22 <210> 25 <211> 22 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd ZC21067 <400> 26 gaccttcggt ttgctcttga tg 22 <210> 27 <211> 20 <212> ONA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> oiigóriukleotyd ZC24200 <400> 27 acactggggg tctgcctctg ' 20 <210> 28 ' 1 <211> 17 ' <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> oligonukleotyd ZC24201 <400> 28 gcgaagccgt gtatccc 17 <210> 29 <211> 17 <212> DNA
PL 209 535 B1 <213> sekwencja sztuczna <220=>
<223> 1 Oligonukleotyd ZC24198 <400> 29 tctacagcac gctgggg <210> 30 <211=» 16 <212> DNA <213=- . sekwencja sztuczna <220>
<223> Oligonukleotyd ZC24199 <400> 30 gcacaagtgg ggtcgg <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> . Sekwencja sztuczna <220>
<??3>
0 Oligonukleotyd ZC24271 <400> 31 ttattgtaat gcaagtgtg 19 <210> 32 <211> 17 <212> DNA <2^3> Sekwencja sztuczna <220>
<223=»
Oligonukleotyd ZC4272 <400> 32 tagctgggag tggaaag <210=» 33 <211=» 20 <212> DNA <213=» Sekwencja sztuczna
PL 209 535 B1 <220>
<223> Oligonukleotyd ZC4495 <400> 33 tccaagcgtg accagttcag 20 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> oligonukleotyd ZC24496 <400> 34 agttggcttc tccatccc 18 <210> 35 <211> 1090 <212> DNA <213> Homo sapiens <40Q> 35 taactctcct gaggggtgag ccaagccctg ccatgtagtg cacgcaggac atcaacaaac 60 acaęataaca ggaaatgatc cattccctgt ggtcacttat tctaaaggcc ccaaccttca 120 aagttcaagt agtgatatgg atgactccac agaaagggag cagtcacgcc ttacttcttg 180 ccttaagaaa agagaagaaa tgaaactgaa ggagtgtgtt tccatcctcc cacggaagga 240 aagcccctct gtccgatcct ccaaagacgg aaagctgctg gctgcaacct tgctgctggc 300 actgctgtct tgctgcctca cggtggtgtc tttctaccag gtggccgccc tgcaagggga 360 cctggccagc ctccgggcag agctgcaggg ccaccacgcg gagaagctgc cagcaggagc 420 aggagccccc aaggccggcc tggaggaagc tccagctgtc accgcgggac tgaaaatctt 480 tgaaccacca gctccaggag aaggcaactc cagtcagaac agcagaaata agcgtgccgt 540 tcagggtcca gaagaaacag tcactcaaga ctgcttgcaa ctgattgcag acagtgaaac 600 accaactata caaaaaggat cttacacatt tgttccatgg cttctcagct ttaaaagggg 660 aagtgcccta gaagaaaaag agaataaaat attggtcaaa gaaactggtt acttttttat 720 atatggtcag gttttatata ctgataagac ctacgccatg ggacatctaa ttcagaggaa 780 gaaggtccat gtctttgggg atgaattgag tctggtgact ttgtttcgat gtattcaaaa 840 tatgcctgaa acactaccca ataattcctg ctattcagct ggcattgcaa aactggaaga 900 aggagatgaa ctccaacttg caataccaag agaaaatgca caaatatcac tggatggaga 960 tgtcacattt tttggtgcat tgaaactgct gtgacctact tacaccatgt ctgtagctat 1020 tttcctccct ttctctgtac ctctaagaag aaagaatcta actgaaaata ccaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa 1090 <210=* 36
PL 209 535 B1 <211> 35 <212> DNA < 1 * Sekwencja sztuczna <220>
<223> Oligonukleotyd <400> 36 cgcgcggttt aaacgccacc atggatgact ccaca <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> oligonukleotyd <400> 37 gtatacggcg cgcctcacag cagtttcaat gc 32 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Oligonukleotyd ZC17251 <400> 38 tctggacgtc ctcctgctgg tatag <210 39 <211> 25 <212> DNA
Sekwencja sztuczna <220 <223> oligonukleotyd ZC17252 <400 39 ggtatggagc aaggggcaag ttggg <210> 40 <211> 27
PL 209 535 B1 <212> DNA <213> ι Sekwencja sztuczna <220>
<223> Oligonukleotyd ZC17156 <400> 40 ' gagtggcaac ttccagggcc aggagag 27 <210> 41 <211> 27 <212> DNA <213> Sekwencja sztiiczna <220 , <223> Oligonukleotyd ZC17157 <400> 41 .
cttttgctag cctcaaccct gactatc 27 <210> 42 <211> 813 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 42 ggcacagcac ggggcgatgg gcgcgtttcg ggccctgtgc ggcctggcgc tgctgtgcgc 60 gctcagcctg ggtcagcgcc ccaccggggg tcccgggtgc ggccctgggc gcctcctgct 120 tgggacggga acggacgcgc gctgctgccg ggttcacacg acgcgctgct gccgcgatta 180 cccgggcgag gagtgctgtt ccgagtggga ctgcatgtgt gtccagcctg aattccactg 240 cggagaccct tgctgcacga cctgccggca ccacccttgt cccccaggcc agggggtaca 300 gtcccagggg aaattcagtt ttggcttcca gtgtatcgac tgtgcctcgg ggaccttctc 360 cgggggccac gaaggccact gcaaaccttg gacagactgc acccagttcg ggtttctcac 420 tgtgttccct gggaacaaga cccacaacgc tgtgtgcgtc ccagggtccc cgccggcaga 480 gccgcttggg tggctgaccg tcgtcctcct ggccgtggcc gcctgcgtcc tcctcctgac 540 ctcggcccag cttggactgc acatctggca gctgaggagt cagtgcatgt ggccccgaga 600 gacccagctg ctgctggagg tgccgccgtc gaccgaagac gccagaagct gccagttccc 660 cgaggaagag cggggcgagc gatcggcaga ggagaagggg cggctgggag acctgtgggt 720 gtgagcctgg ctgtcctccg gggccaccga ccgcagccag cccctcccca ggagctcccc 780 aggccgcagg gctctgcgtt ctgctctggg ccg 813 <210> 43 <211> 44 <212> DNA <213> * Sekwencja sztuczna
PL 209 535 B1 <220 <223> oligonukleotyd ZC10.134 <40Ο 43 atcagcggaa ttcagatctt cagacaaaac tcacacatgc ccac 44 <210> 44 · <211> 35 <212> DNA <213> sekwencja sztuczna <220>
<223> QXigOnukieotyd ZC10135 <400> 44 ggcagtctct agatcattta cccggagaca gggag 35 <210> 45 ' <211> 768 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>
<221> CDS <222> (7). ..(759) <223> .
Sekwencja IgFc <400 45 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro
| 1 | 5 | 10 | ||||||||||||||
| aga | tgg | gtc | ctg | tcc | gag | ccc | aga | tct | tca | gac | aaa | act | cac | aca | tgc | 96 |
| Arg | Trp | Val | Leu | Ser | Glu | Pro | Arg | Ser | Ser | Asp | Lys | Thr | His | Thr | Cys | |
| 15 | 20 | 25 | 30 | |||||||||||||
| cca | ccg | tgc | cca | gca | cct | gaa | gcc | gag | ggg | gca | ccg | tca | gtc | ttc | ctc | 144 |
| Pro | Pro | Cys | Pro | Ala | Pro | Glu | Ala | Glu | Gly | Ala | Pro | Ser | Val | Phe | Leu | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| ttc | ccc | cca | aaa | ccc | aag | gac | acc | ctc | atg | atc | tcc | cgg | acc | cct | gag | 192 |
| Phe | Pro | Pro | Lys | Pro | Lys | Asp | Thr | Leu | Met | Ile | Ser | Arg | Thr | Pro | Glu | |
| 50 | 55 | 60 |
PL 209 535 B1
| gtc Val | aca tgc | gtg gtg gtg Val Val Val | gac Asp | gtg agc cac gaa gac cct gag gtc | aag Lys | 240 | ||||||||||
| Thr | Cys 65 | Val 70 | Ser His | Glu | Asp | Pro 75 | Glu | Val | ||||||||
| ttc | aac | tgg tac | gtg | gac | ggc | gtg | gag | gtg | cat | aat | gcc | aag | aca | aag | 288 | |
| Phe | Asn | Trp Tyr | Val | Asp | Gly | Val | Glu | Val | His | Asn | Ala | Lys | Thr | Lys | ||
| 80 | 85 | 90 | ||||||||||||||
| ccg | cgg | gag | gag | cag | tac | aac | agc | acg | tac | cgt gtg gtc | agc | gtc | ctc | 336 | ||
| Pro | Arg | Glu | Glu | Gin | Tyr | Asn | Ser | Thr | Tyr Arg | Val | Val | Ser | Val | Leu | ||
| 95 | 100 | 105 | 110 | |||||||||||||
| acc | gtc | ctg | cac | cag | gac | tgg ctg | aat | ggc aag | gag | tac | aag | tgc | aag | 384 | ||
| Thr | Val | Leu | His | Gin | Asp Trp | Leu | Asn | Gly Lys | Glu Tyr | Lys | Cys | Lys | ||||
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| gtc | tcc | aac | aaa | gcc | ctc | cca | tcc | tcc | atc | gag | aaa | acc | atc | tcc | aaa | 432 |
| Val | Ser | Asn | Lys | Ala | Leu | Pro | Ser | Ser | Ile | Glu | Lys | Thr | Ile | Ser | Lys | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| gcc | aaa | ggg | cag | ccc | ega | gaa | cca | cag | gtg | tac | acc | ctg | ccc | cca | tcc | 480 |
| Ala | Lys Gly | Gin | Pro | Arg | Glu | Pro | Gin | Val | Tyr | Thr | Leu | Pro | Pro | Ser | ||
| 145 | 150 | 155 | ||||||||||||||
| cgg | gat gag | ctg | acc | aag | aac | cag | gtc | agc | ctg | acc | tgc ctg gtc | aaa | 528 | |||
| Arg Asp Glu | Leu | Thr | Lys | Asn | Gin | Val | Ser | Leu | Thr | Cys | Leu | Val | Lys | |||
| 160 | 165 | 170 | ||||||||||||||
| ggc | ttc tat | ccc | agc | gac | atc | gcc | gtg | gag | tgg | gag | agc | aat | ggg | cag | 576 | |
| Gly | Phe Tyr | Pro | Ser | Asp | Ile | Ala | Val | Glu Trp | Glu | Ser | Asn | Gly | Gin | |||
| 175 | 180 | 185 | 190 | |||||||||||||
| ccg | gag | aac | aac | tac | aag | acc | acg | cct | ccc | gtg ctg | gac | tcc | gac | ggc | 624 | |
| Pro Glu | Asn | Asn | Tyr | Lys | Thr Thr | Pro | Pro | Val | Leu | Asp | Sen | Asp | Gly | |||
| 195 | 200 | 205 | ||||||||||||||
| tcc | ttc | ttc | ctc | tac | agc | aag | ctc | acc | gtg | gac | aag | agc | agg | tgg | cag | 672 |
| Ser | Phe | Phe | Leu | Tyr | Ser | Lys | Leu | Thr | Val | Asp Lys | Ser | Arg | Trp | Gin | ||
| 210 | 215 | 220 | ||||||||||||||
| cag | ggg | aac | gtc | ttc | tea | tgc | tcc | gtg | atg cat gag | get | ctg | cac | aac | 720 | ||
| Gin | Gly | Asn | Val | Phe | Ser | Cys | Ser | Val | Met His | Glu | Ala | Leu | His | Asn |
225 230 235
PL 209 535 B1 cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg tct ccg ggt aaa taatctaga 768
His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
240 245 250 <210> 46 <211> 52 .
<212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Oligonukleotyd ZC15345 <400> 46 ccgtgcccag cacctgaagc cgagggggca ccgtcagtct tcctcttccc cc 52 <210> 47 <211> 31 <212> DNA <213>
Sekwencja sztuczna <22Q>
<223> Oligonukleotyd ZC15347 <400> 47 ggattctaga ttttataccc ggagacaggg a 31 <210> 48 <211> 55 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna ' <220>
<223> Oligonukleotyd ZC15517 <400> 48 ggtggcggct cccagatggg tcctgtccga gcccagatct tcagacaaaa ctcac 55 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> . , Ί
Oligonukleotyd ZC15530
PL 209 535 B1 <400> 49 tgggagggct ttgttgga 18 <210> 50 <211> 42 <212> DNA · sekwencja sztuczna <220>
<223> Oligonukleotyd ZC15518 <400> 50 tccaacaaag ccctcccatc ctccatcgag aaaaccatct cc 42 <210> 51 <211> 57 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Oligonukleotyd ZC15516 <400> 51 ggatggatcc atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatg 57 <210> 52 <211> 59 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
' <223> Starter oligonukleotydowy <400> 52 ctcagccagg aaatccatgc cgagttgaga cgcttccgta gaatgagtgg cctgggccg 59 <210> 53 <211> 48 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter oligonukleotydowy
PL 209 535 B1 <400> 53 gcatgtgtga gttttgtctg aagatctggg ctccttcagc cccgggag 48 <210> 54 <211> 59 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna .
<220>
<223> Starter oligonukleotydowy <400 54 ctcagccagg aaatccatgc cgagttgaga cgcttccgta gaatgagtgg cctgggccg 59 <210> 55 <211> 59 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna · <220>
<223> Starter oligonukleotydowy <400> 55 gcacggtggg catgtgtgag ttttgtctga agatctgggc tccttcagcc ccgggagag 59
60 DNA
Sekwencja sztuczna <210=* <211>
<212=* <213=* <220>
<223=* <400=*
Starter oligonukleotydowy 56 gcacagaggc tcagaagcaa gtccagctct cccggggctg aaggagccca gatcttcaga 60 <210> 57 <211> 56 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Starter oligonukleotydowy <400> 57
PL 209 535 B1 ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa tctagattat ttacccggag acaggg 56 <210> 58 <211> 59 <212> DNA <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Starter oligonukleotydowy <400 58 ctaacatgtc agcgttattg taatgcaagt gtgaccaatt cagagcccag atcttcaga 59 <210> 59 <211> 20 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220>
<223> Peptyd przeciwciała <400> 59
Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Pro Glu Leu Gin Leu Ala
10 15
Ile Pro Arg Glu 20 <210> 60 <211> 20 <212> PRT <213> Sekwencja sztuczna <220 <223> Peptyd przeciwciała <400> 60
Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu
10 15
Val Lys Glu Thr 20
PL 209 535 B1
Claims (5)
Hide Dependent
translated from
Claims (5)
Hide Dependent
translated from
1. Zastosowanie białka fuzyjnego składającego się z pierwszej części i drugiej części połączonych wiązaniem peptydowym, przy czym wspomniana pierwsza część stanowi reszty aminokwasowe 25-104 SEQ ID nr. 6 i wspomniana druga część jest regionem stałym ciężkiego łańcucha immunoglobuliny, do wytworzenia leku do leczenia astmy, zapalenia oskrzeli, rozedmy płuc, zapalenia nerek, odmiedniczkowego zapalenia nerek, neuropatii lekkiego łańcucha, skrobiawicy, kłębuszkowego zapalenia nerek, nefropatii IgA, choroby Berger'a, nefropatii IgM, choroby Goodpastur'a, postzakaźnego zapalenia kłębuszków nerkowych, błonisto-rozplemowego kłębuszkowego zapalenia nerek, zmian minimalnych w zespole nerczycowym, lub zapalenia naczyń krwionośnych związanego z toczniem układowym u człowieka przez hamowanie sprzęgania ztnf4-receptor BR43X2, TACI lub BCMA.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że region stały ciężkiego łańcucha immunoglobuliny jest stałym regionem ciężkiego łańcucha immunoglomuliny ludzkiej.
3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że wspomniany stały region ciężkiego łańcucha immunoglomuliny ludzkiej jest stałym regionem ciężkiego łańcucha immunoglomuliny ludzkiej IgGl.
4. Zastosowanie według zastrz. 1-3, znamienne tym, że wspomniany lek zawiera multimer wspomnianego białka fuzyjnego.
5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że wspomniany lek zawiera stały region ciężkiego łańcucha immunoglomuliny, który zawiera dwie domeny stałego regionu i nie zawiera regionu zmiennego.