JP2003525861A - 可溶性エフェクターＢＲ４３ｘ２およびその使用方法 - Google Patents

可溶性エフェクターＢＲ４３ｘ２およびその使用方法

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Abstract

(57)【要約】 可溶性の、分泌された腫瘍壊死因子レセプターポリペプチド、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、および関係する組成物および方法が開示される。ポリペプチドは、他の腫瘍壊死因子レセプター、例えば、トランスメンブランアクチベーターおよびＣＡＭＬ−インターラクター（ＴＡＣＩ）に対して相同的である、１つのシステインに富んだ反復を含んでなる。ポリペプチドは、リガンド、アゴニストおよびアンタゴニストを検出するために使用することができる。ポリペプチドは、また、Ｂ細胞の活性化をモジュレートするために使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 免疫応答間に起こる細胞相互作用は、腫瘍壊死因子レセプター（TNFR）ファミ
リーを包含する、細胞表面レセプターのいくつかのファミリーのメンバーにより
調節される。TNFRファミリーは多数の一体的膜糖タンパク質レセプターから成り
、それらの多くは、それらのそれぞれのリガンドと組み合わせて、異なる造血細
胞系列間の相互作用を調節する（Smith他、The TNF Recepotr Superfamily
of Cellular and Viral Proteins：Activation，Costimulation and Deat
h、76：959−62、1994；Cosman、Stem Cells 12：440−55、1994）。
【０００２】 1つのこのようなレセプターはTACI、トランスメンブランアクチベーターおよ
びCAML−インターラクターである（von BuelowおよびBram、Science 228：138
−41、1997およびWIPO公開WO 98／39361）。TACIは膜結合レセプターであり、2
つのシステインに富んだ擬反復を含有する細胞外ドメイン、トランスメンブラン
ドメインおよび細胞質ドメインを有し、この細胞質ドメインはJurkat細胞におい
て過剰発現されるときNF−AT活性化のコインデュサーである細胞内小胞に位置す
る一体的膜タンパク質である、CAML（カルシウムモジュレーターおよびシクロフ
ィリンリガンド）と相互作用する。TACIはB細胞に関連し、そして細胞のサブセ
ットに関連する。von BuelowおよびBram（前掲）は、TACIのリガンドが未知で
あることを報告している。
【０００３】 本発明のポリペプチド、ただ1つのシステインに富んだ擬反復を有するTACIイ
ソ型（BR43x2）、TACIおよび関係するB細胞タンパク質、BCMA（Gras他、Int. I
mmunol. 17：1093−106、1995）は、TNFリガンド、ztnf4、現在ニュートロカイ
ンα（WIPO公開WO 98／39361）として知られている、BLyS（Moore他、Science
285：260−3、1999）、BAFF（Schneider他、J. Exp. Med. 189：1747−56
、1999）、TALL−1（Shu他、J. Leukoc. Biol. 65：680−3、1999）またはTH
ANK（Mukhopadhyay他、J. Biol. Chem. 274：15978−81、1999）に結合する
ことが見出された。それら自体、BR43x2、TACIおよびBCMAはztnf4の活性化、特
にB細胞の活性化の調節に有効であろう。 この目的に向かって、本発明は、ztnf4または他のBR43x2、TACIまたはBCMAの
活性をモジュレートするタンパク質治療剤、関係する組成物および方法ならびに
本明細書における技術から当業者にとって明らかな他の使用を提供する。
【０００４】 発明の要約 1つの面において、本発明は、ある量の化合物を哺乳動物に投与することを含
んでなる、哺乳動物におけるztnf4活性を阻害する方法を提供し、前記化合物は
、 a）BR43x2の細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； b）TACIの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； c）BCMAの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； d）配列番号10の配列を含んでなるポリペプチド； e）配列番号2のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント
； f）配列番号4のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント
； g）配列番号6のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント
； h）配列番号8のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント
； i）配列番号10のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメン
ト； k）配列番号4のポリペプチド； l）配列番号6のアミノ酸残基1〜166のアミノ酸残基；および m）配列番号8のアミノ酸残基1〜150のアミノ酸残基； から成る群から選択される。
【０００５】 1つの態様において、化合物はペプチド結合により結合された第1部分と第2部
分とから成る融合タンパク質であり、前記第1部分は、 a）配列番号8の配列を含んでなるポリペプチド； b）配列番号2のアミノ酸残基25〜58を含んでなるポリペプチド； c）配列番号6のアミノ酸残基34〜66を含んでなるポリペプチド； d）配列番号6のアミノ酸残基71〜104を含んでなるポリペプチド； e）配列番号6のアミノ酸残基25〜104を含んでなるポリペプチド； f）配列番号8のアミノ酸残基8〜37を含んでなるポリペプチド； g）配列番号8のアミノ酸残基41〜88を含んでなるポリペプチド； h）配列番号8のアミノ酸残基8〜88を含んでなるポリペプチド； から成る群から選択されるポリペプチドを含んでなり、そして前記第2部分は
他のポリペプチドを含んでなる。
【０００６】 他の態様において、前記第1部分は、 a）配列番号2のアミノ酸残基59〜120； b）配列番号6のアミノ酸残基105〜166；および c）配列番号8のアミノ酸残基89〜150； から成る群から選択されるポリペプチドをさらに含んでなる。
【０００７】 他の態様において、第1部分は、 a）BR43x2の細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； b）TACIの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；および c）BCMAの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； から成る群から選択される。 関係する態様において、第1部分は、 a）配列番号4のポリペプチド； b）配列番号6のアミノ酸残基1〜154；および c）配列番号8のアミノ酸残基1〜48； から成る群から選択される。他の関係する態様において、第2部分は免疫グロ
ブリン重鎖定常領域である。
【０００８】 他の態様において、抗体または抗体フラグメントは、 a）ポリクローナル抗体； b）ネズミモノクローナル抗体； c）上記b）に由来するヒト化抗体；および d）ヒトモノクローナル抗体；から成る群から選択される。関係する態様にお
いて、抗体フラグメントは、F(ab')、F(ab)、Fab'、Fab、Fv、scFv、および最小
認識ユニットから成る群から選択される。他の態様において、哺乳動物は霊長類
である。
【０００９】 他の態様において、ztnf4活性はBリンパ球に関連する。他の関係する態様にお
いて、ztnf4活性は活性化Bリンパ球に関連する。なお他の態様において、ztnf4
活性は休止Bリンパ球に関連する。他の態様において、ztnf4活性は抗体産生に関
連する。関係する態様において、抗体産生は自己免疫疾患に関連する。関係する
態様において、前記自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、
多発性硬化症、または慢性関節リウマチである。他の態様において、ztnf4活性
はぜん息、気管支炎または気腫に関連する。なお他の態様において、ztnf4活性
は末期腎不全に関連する。
【００１０】 さらに他の態様において、ztnf4活性は腎臓病に関連する、関係する態様にお
いて、腎臓病は糸球体腎炎、脈管炎、腎炎または腎盂腎炎である。なお他の態様
において、腎臓病は腎臓新形成、多発性骨髄腫、リンパ腫、軽鎖神経疾患または
アミロイドーシスに関連する。他の態様において、ztnf4活性はエフェクターT細
胞に関連する。関係する態様において、ztnf4活性は免疫応答の緩和に関連する
。なお他の態様において、ztnf4活性は免疫抑制に関連する。なお他の態様にお
いて、免疫抑制は移植片拒絶、移植片対宿主の疾患または炎症に関連する。他の
態様において、活性は自己免疫疾患に関連する。
【００１１】 関係する態様において、自己免疫疾患はインスリン依存性真性糖尿病または膠
原病である。他の態様において、ztnf4活性は炎症に関連する。関係する態様に
おいて、炎症は関節の疼痛、腫脹、貧血、または敗血症性ショックである。他の
面において、本発明は、ある量の前記化合物物を投与することを含んでなる、BR
43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合を阻害する方法を提供する
。他の態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合は
Bリンパ球に関連する。他の関係する態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAの
レセプター−リガンドの結合は活性化Bリンパ球に関連する。
【００１２】 なお他の態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結
合は休止Bリンパ球に関連する。他の態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAの
レセプター−リガンドの結合は抗体産生に関連する。関係する態様において、抗
体産生は自己免疫疾患に関連する。関係する態様において、前記自己免疫疾患は
、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、多発性硬化症、または慢性関節リウ
マチである。他の態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガン
ドの結合はぜん息、気管支炎または気腫に関連する。なお他の態様において、BR
43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合は末期腎不全に関連する。
【００１３】 なお他の態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結
合は腎臓病に関連する。関係する態様において、腎臓病は糸球体腎炎、脈管炎、
腎炎または腎盂腎炎である。なお他の態様において、腎臓病は腎臓新形成、多発
性骨髄腫、リンパ腫、軽鎖神経疾患またはアミロイドーシスに関連する。他の態
様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合はエフェク
ターT細胞に関連する。関係する態様において、BR43x2、TACIまたはBCMAのレセ
プター−リガンドの結合は免疫応答の緩和に関連する。
【００１４】 なお他の態様において、活性は免疫抑制に関連する。なお他の態様において、
免疫抑制は移植片拒絶、移植片対宿主の疾患または炎症に関連する。他の態様に
おいて、活性は自己免疫疾患に関連する。関係する態様において、自己免疫疾患
はインスリン依存性真性糖尿病または膠原病である。他の態様において、BR43x2
、TACIまたはBCMAのレセプター−リガンドの結合は炎症に関連する。関係する態
様において、炎症は関節の疼痛、腫脹、貧血、または敗血症性ショックである。
【００１５】 他の態様において、本発明は、配列番号2のポリペプチドをコードする単離さ
れたポリヌクレオチド分子を提供する。また、配列番号1の単離されたポリヌク
レオチド分子が提供される。関係する態様において、下記の作用可能に連鎖され
た因子を含んでなる発現ベクターが提供される：転写プロモーター；前述のポリ
ヌクレオチド分子；および転写ターミネーター。他の態様において、発現ベクタ
ーはポリヌクレオチド分子に作用可能に連鎖された分泌レセプター−リガンドの
結合配列をさらに含んでなる。
【００１６】 また、前記ポリヌクレオチドセグメントによりコードされる前記ポリペプチド
を発現する、前述の発現ベクターは導入された培養された細胞が提供される。さ
らに、本発明は、前述の発現ベクターが導入された細胞を培養し；これにより前
記細胞は前記ポリヌクレオチド分子によりコードされる前記ポリペプチドを発現
し；そして前記発現されたポリペプチドを回収することを含んでなるポリペプチ
ドを産生する方法が提供される。本発明は、また、配列番号2の配列を有する単
離されたポリペプチドを提供する。関係する態様において、ポリペプチドを薬学
上許容されるビヒクルと組み合わせる。 本発明のこれらの面および他の面は、本発明の下記の詳細な説明および添付図
面を参照すると、明らかとなるであろう。
【００１７】 発明の詳細な説明 本発明を詳細に説明する前に、下記の用語を定義することはその理解の助けと
なるであろう： 親和標識：は、本明細書において、第2ポリペプチドの精製または検出を提供
するか、あるいは基質への第2ポリペプチドの結合部位を提供するために、第2ポ
リペプチドに結合させることができるポリペプチドのセグメントを表すために使
用される。原理的には、抗体または他の特異的な結合因子が利用可能な任意のペ
プチドまたはタンパク質を親和標識として使用することができる。
【００１８】 親和標識は下記のものを包含する：ポリヒスチジントラクト、プロテインA（N
ilsson他、EMBO J. 4：1075、1985；Nilsson他、Methods Enzymol. 198：3
、1991）、グルタチオンSトランスフェラーゼ（SmithおよびJohnson、Gene 67
：31、1988）、Glu−Glu親和標識（Grussenmeyer他、Proc. Natl. Acad. Sci
. USA 82：7952−4、1985）、サブスタンスP、FlagＴＭペプチド（Hopp他、Bi
otechnology 6：1204−10、1988）、ストレプチアビジン結合ペプチド、または
他の抗原性エピトープまたは結合ドメイン。一般に、Ford他、Protein Express
ion and Purification 2：95−107、1991、参照。親和標識をコードするDNA
は、商業的供給会社から入手可能である（例えば、Pharmacia Biotech、ニュー
ジャージイ州ピスカタウェイ）。
【００１９】 アレレ変異型：同一染色体遺伝子座を占有する遺伝子の2またはそれ以上のオ
ールタネイト形態の任意のもの。アレレの変動は突然変異により自然に起こり、
そして集団内に表現型の多形性を生じさせることがある。遺伝子の突然変異はサ
イレント（コードされたポリペプチドの非変化）であるか、あるいは変更された
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。アレレ変異型と
いう用語は、また、本明細書において遺伝子のアレレ変異型によりコードされる
タンパク質を表すために使用される。また、アレレの変動のために参照アミノ酸
配列と異なる同一種からの同一タンパク質が包含される。
【００２０】 アミノ末端およびカルボキシル末端：は、本明細書において、ポリペプチド内
の位置を表すために使用される。この関係が許す場合、これらの用語は近接性ま
たは相対的位置を表すためにポリペプチドの特定の配列または部分を参照して使
用される。例えば、ペプチド内の参照配列に対してカルボキシル末端に位置する
ある種の配列は、参照配列のカルボキシル末端に対して近接して位置するが、完
全なポリペプチドのカルボキシル末端に必ずしも存在しない。
【００２１】 相補体／抗相補体の対：は、適当な条件下に非共有結合的にアソシエートした
安定な対を形成する、非同一部分を表す。例えば、ビオチンおよびアビジン（ま
たはストレプトアビジン）は、相補体／抗相補体の対のプロトタイプのメンバー
である。他の典型的な相補体／抗相補体の対は、レセプター／リガンドの対、抗
体／抗原（またはハプテンまたはエピトープ）の対、センス／アンチセンスポリ
ヌクレオチドの対、およびその他を包含する。相補体／抗相補体の対の引き続く
解離を望む場合、補体／抗補体の対は好ましくは＜10９／Mの結合アフィニティ
ーを有する。
【００２２】 コンティグ（contig）：は、他のポリヌクレオチドに対して同一であるか、あ
るいは相補的な配列の隣接するストレッチを有するポリヌクレオチドを表す。隣
接する配列は、それらの全体においてあるいはポリヌクレオチドの部分的ストレ
ッチに沿って、ポリヌクレオチド配列の所定のストレッチを「オーバーラップ」
させると言われる。例えば、ポリヌクレオチド配列5'−ATGGTTAGCTT−3'に対す
る代表的なcontigは5'−TAGCTTgagtct−3'および3'−gtcgacTACCGA−3'である。
【００２３】 ポリヌクレオチド分子の相補体：は、相補的塩基配列を有しかつ参照配列に比
較して逆の向きを有するポリヌクレオチド分子である。例えば、配列5' ATGCAC
GGG 3'は5' CCCGTGCAT 3'に対して相補的である。
【００２４】 縮重ヌクレオチド配列または縮重配列：は、1またはそれ以上の縮重コドンを
含むヌクレオチド配列（ポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に
比較して）を表す。縮重コドンはヌクレオチドの異なるトリプレットを含有する
が、同一アミノ酸残基をコードする（すなわち、GAUおよびGACのトリプレットの
各々はAspをコードする）。
【００２５】 発現ベクター：その転写を提供する追加のセグメントに作用可能に連鎖された
、問題のポリペプチドをコードするセグメントからなる、線状または円形のDNA
分子。このような追加のセグメントは、プロモーターおよびターミネーターの配
列を包含し、そして、また、1またはそれ以上の複製起点、1またはそれ以上の選
択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、およびその他を包
含することができる。発現ベクターは、一般に、プラスミドまたはウイルスDNA
から誘導されるか、あるいは双方の因子を含有することができる。
【００２６】 イソ型：は、異なる遺伝子からまたは同一遺伝子からオールタネイトスプライ
シングにより製造できるタンパク質の異なる型を意味する。ある場合において、
イソ型はそれらの輸送活性、発生されており発現時間、組織分布、細胞中の位置
またはこれらの特性の組合わせにおいて異なる。
【００２７】 単離されたポリヌクレオチドオチド：は、ポリヌクレオチドがその自然の遺伝
的環境から取出され、こうして、他の余分または望ましくないコーディング配列
を含まず、そして遺伝子操作されたタンパク質の産生系内で使用するために適当
な形態であることを表す。このような単離された分子は、それらの自然環境から
分離されたものであり、そしてcDNAおよびゲノムのクローンを包含する。本発明
の単離されたDNA分子は、それらが通常アソシエートされる他の遺伝子を含まな
いが、天然に存在する5'および3'の非翻訳領域、例えば、プロモーターおよびタ
ーミネーター、およびその他を包含することができる。アソシエートされた領域
の同定は、当業者にとって明らかであろう（例えば、DynanおよびTijan、Nature
316：774−78、1985、参照）。
【００２８】 単離されたポリペプチドまたはタンパク質：は、その自然環境、例えば、血液
および動物の組織、以外の条件において見出されるポリペプチドまたはタンパク
質である。好ましい形態において、単離されたポリペプチドは他のポリペプチド
、特に動物由来の他のポリペプチドを実質的に含まない。高度に精製された形態
、すなわち、95％より大きい純度、より好ましくは99％より大きい純度のポリペ
プチドを提供することが好ましい。この関係において使用するとき、用語「単離
された」は別の物理的形態、例えば、二量体、あるいはグリコシル化または誘導
化された形態の同一のポリペプチドの存在を排除しない。
【００２９】 作用可能に連鎖された：は、DNAセグメントについて言及するとき、セグメン
トがそれらの意図する目的のために調和して機能するように、例えば、転写がプ
ロモーターにおいて開始し、コーディングセグメントを通してターミネーターに
進行するように、セグメントが配置されていることを示す。 オーソログ：は、異なる種からのポリペプチドまたはタンパク質の機能的対応
物である、1つの種から得られたポリペプチドまたはタンパク質を表す。オーソ
ログ間の配列の差は種形成の結果である。
【００３０】 ポリヌクレオチド：は、5'→3'末端の方向に読んだ、デオキシリボヌクレオチ
ドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖のポリマーである。ポリヌ
クレオチドはRNAおよびDNAを包含し、天然源から単離され、in vitroで合成さ
れるか、あるいは天然の分子と合成の分子との組合わせから製造することができ
る。ポリヌクレオチドのサイズは、塩基対（略号「bp」）、ヌクレオチド（「nt
」）、またはキロ塩基（「kb」）として表される。
【００３１】 この関係が許す場合、後者の2つの用語は一本鎖または二本鎖であるポリヌク
レオチドを記載することができる。この用語を二本鎖の分子に適用するとき、そ
れは全体の長さを表すために使用され、そして用語「塩基対」に等しいと理解さ
れるであろう。当業者は認識するように、二本鎖ポリヌクレオチドの2つの鎖は
わずかに長さが異なることがあり、そして酵素の切断の結果その末端は食い違う
ことがある；こうして、二本鎖ポリヌクレオチド内のすべてのヌクレオチドは対
合していなことがある。このような不対末端は一般に20ヌクレオチド長さを超え
ないであろう。
【００３２】 ポリペプチド：は、自然にまたは合成的に生産された、ペプチド結合により結
合されたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基より小さいポリペプ
チドは普通に「ペプチド」と呼ばれる。 プロモーター：は、RNAポリメラーゼの結合を提供しかつ転写を開始させるDNA
配列を含有する遺伝子の部分を表す。プロモーター配列は普通に、しかし常にで
はないが、遺伝子の5'非コーディング領域の中に見出される。
【００３３】 タンパク質：は、1または2以上のポリペプチド鎖を含んでなる高分子である。
タンパク質は、また、非ペプチド成分、例えば、炭水化物基を含んでなることが
できる。炭水化物および他の非ペプチド置換基を細胞によりタンパク質に付加す
ることができ、細胞においてタンパク質は産生され、そして細胞の型とともに変
化するであろう。タンパク質はアミノ酸主鎖構造により本明細書において定義さ
れる；置換基、例えば、炭水化物基は一般に特定されないが、それにもかかわら
ず、存在することができる。
【００３４】 レセプター：は、生物活性分子（すなわち、リガンド）に結合し、細胞上のリ
ガンドの作用を伝達する、細胞関連タンパク質を表す。レセプターへのリガンド
の結合は、エフェクタードメインと、細胞中の1またはそれ以上の他の分子との
間の相互作用を引き起こす、レセプターにおけるコンフォメーションの変化を生
ずる。この相互作用は、引き続いて、細胞の代謝の変更に導く。レセプター−リ
ガンドの相互作用に関係する代謝の事象は、遺伝子の転写、リン酸化、脱リン酸
化、細胞増殖、サイクル的AMP産生の増加、細胞のカルシウムの移動化、膜脂質
の移動化、細胞接着、イノシトール脂質の加水分解、およびリン脂質の加水分解
を包含する。BR43x2は、本明細書においていっそう詳細に説明するように、TNF
レセプターの特性を有する。
【００３５】 分泌シグナル配列：は、ポリペプチド（「分泌ペプチド」）をコードするDNA
配列を表し、それは、より大きいポリペプチドの1成分として、より大きいポリ
ペプチドが合成される細胞の分泌経路を通してそのポリペプチドを向ける。通常
、より大きいポリペプチドは、分泌経路を通る移行の間に切断されて、分泌ペプ
チドを除去する。
【００３６】 可溶性レセプター：細胞膜に結合しないレセプターポリペプチド。最も普通に
は、可溶性のレセプターはトランスメンブランおよび細胞質ドメインを欠如する
リガンド結合性レセプターのポリペプチドである。可溶性レセプターは、追加の
アミノ酸残基、例えば、ポリペプチドの精製を提供するまたは基質へのポリペプ
チドの結合部位を提供する親和標識を含んでなることができる。多数の細胞表面
のレセプターは、タンパク質分解により産生されるか、あるいは選択的にスプラ
イスされたmRNAから翻訳される、天然に存在する、可溶性対応物を有する。レセ
プターのポリペプチドは、それぞれ、膜の定着またはシグナルトランスダクショ
ンを提供する、これらのセグメントの十分な部分を欠如するとき、トランスメン
ブランおよび細胞内ポリペプチドのセグメントを実質的に含まないと言われる。
【００３７】 不正確な分析法（例えば、ゲル電気泳動）により決定されたポリマーの分子量
および長さは、近似値であると理解されるであろう。このような値を「約」Xま
たは「ほぼ」Xとして表すとき、Xの記載する値は±10％の正確さであると理解さ
れるであろう。 本明細書において引用するすべての参考文献の教示は、それらの全体において
引用することによって本明細書の一部とされる。
【００３８】 本発明は、1192bpのDNA配列（配列番号1）およびレセプターTACIのイソ型であ
る対応するポリペプチド配列（配列番号2の発見に一部分に基づく。イソ型はBR4
3x2と表示された。BR43x2の可溶性形態は配列番号4に開示され、可溶性レセプタ
ーをコードするポリヌクレオチドは配列番号3に開示される。本明細書において
いっそう詳しく説明されるように、本発明のBR43x2レセプターをコードするポリ
ヌクレオチドおよびポリペプチドは、ヒトRPMI 1788ライブラリーおよびNまた
はC末端的に標識化された、ビオチン−またはFITC標識化腫瘍壊死因子リガンドz
tnf4、現在ニュートロカインα（WIPO公開WO 98／39361）として知られている
、BLyS（Moore他、前掲）、BAFF（Schneider他、前掲）、TALL−1（Shu他、前掲
）またはTHANK（Mukhopadhyay他、前掲）を使用するシグナルトラップクローニ
ングにより、最初に同定された。
【００３９】 陽性プールはリガンド結合により同定され、単一クローンに破壊され、cDNA単
離され、配列決定された。BR43x2の推定されたアミノ酸配列（配列番号2に表示
されている）を既知の腫瘍壊死因子レセプターと比較すると、BR43x2はTACIのイ
ソ型であり、単一の、低度に保存された、システインに富んだ擬反復を有するこ
とが示された。
【００４０】 構造的には、TNFレセプターファミリーは、歴史的に「システインに富んだ擬
反復」と呼ばれる、いくつかのモジュールから構成された細胞外部分により特徴
づけられる。プロトタイプのTNFRファミリーメンバーは4つのこれらの擬反復を
有し、各々は交互に約29〜43の残基長さを有する。典型的な擬反復は6システイ
ン残基を有する。それらは共通のモジュールに由来するように思われ、正確に反
復しないので、擬反復と呼ばれる：擬反復＃1、＃2、＃3および＃4は互いに区別
する特徴ある配列を有する。p55 TNFレセプターの結晶構造は、各擬反復が1つ
のフォルディングドメインに対応し、すべての4つの擬反復が同一第3構造的の折
りたたまれ、ジサルファイド結合により内部に一緒に保持されることを示した。
【００４１】 TACIは2つのシステインに富んだ擬反復を有する（von BuelowおよびBram、前
掲）を含有し、第1はTNFレセプターファミリーの他のメンバーとともに構造の中
に保存され、第2は低度に保存される。本発明のBR43x2イソ型は第1のTACIシステ
インに富んだ擬反復を欠如し、第2の、低度に保存された反復のみを保持する。
【００４２】 配列番号2に表示されるようなBR43x2の推定されたアミノ酸配列の配列の解析
は、細胞外ドメイン（配列番号2の残基1〜120）を有する成熟タンパク質の存在
を示し、このタンパク質は1つのシステインに富んだ擬反復（pseudo-repeat)（
配列番号2の残基25〜58）、トランスメンブランドメイン（配列番号2の残基121
〜133）および細胞質ドメイン（配列番号2の残基134〜247）を含有する。BR43x2
のシステインに富んだ擬反復は6つのシステイン残基（配列番号2の残基25、40、
43、47、54および58）、保存されたアスパラギン酸残基（配列番号2の残基34）
および2つのロイシン残基（配列番号2の残基36および37）を有し、TACIの第1シ
ステインに富んだ擬反復（配列番号6）と46％の同一性およびBCMAのシステイン
に富んだ擬反復（配列番号8）と35％の同一性を共有する（図1）。
【００４３】 システインに富んだ擬反復は下記のモチーフにより表すことができる： CX［QEK］［QEKNRDHS］［QE］X｛0−2｝［YFW］［YFW］DXLLX｛2｝C［IMLV］XCX
｛3｝CX｛6−8｝CX｛2｝［YF］C（配列番号10）、 ここでCはアミノ酸残基システインを表し、Qはグルタミンを表し、Eはグルタ
ミン酸を表し、Kはリシンを表し、Nはアスパラギンを表し、Rはアルギニンを表
し、Dはアスパラギン酸を表し、Hはヒスチジンを表し、Sはセリンを表し、Yはチ
ロシンを表し、Fはフェニルアラニンを表し、Wはトリプトファンを表し、Lはロ
イシンを表し、Iはイソロイシンを表し、Vはバリンを表し、そしてXはシステイ
ン以外の任意の天然に存在するアミノ酸残基を表す。正方形の括弧中のアミノ酸
残基“［］”は、その位置において許容されたアミノ酸残基の変動を示す。中括
弧“｛｝”は、その位置において許容されたアミノ酸残基の数を示す。
【００４４】 本発明は、また、配列番号10により提供されるような32〜40アミノ酸残基長さ
の可溶性ポリペプチドを提供する。 可溶性BR43x2レセプターは、配列番号4の残基1〜120により表され、1つのシス
テインに富んだ擬反復（配列番号4の残基25〜58）を含有し、配列番号2に記載さ
れているようなBR43x2のトランスメンブランおよび細胞質ドメインを欠如する。 当業者は認識するように、これらのドメイン境界は近似であり、既知のタンパ
ク質との整列およびタンパク質フォルディングの予測に基づく。これらの特徴は
、配列番号1および3のDNA配列によりコードされるレセプターはTNFレセプターフ
ァミリーの1メンバーであることを示す。
【００４５】 BR43x2発現を検出するために予測されるBR43x1に対するヌクレオチドプローブ
に対応するmRNAの組織分布のノザンブロット分析およびドットブロット分析は、
脾臓、リンパ節、CD19＋細胞における発現、混合リンパ球反応細胞、Daudiおよ
びRaji細胞における弱い発現を示した。TACIについて報告されたように（von B
uelowおよびBram、前掲）、逆転写酵素PCRを使用して、BR43x1はB細胞のみにお
いて検出され、そして活性化されたT細胞において検出されなかった。対応するT
ACI配列と100％オーバーラップするBR43x2プローブを使用して、TACIおよびBR43
x2は脾臓、リンパ節および小腸、胃、唾液腺、虫垂、肺、骨髄、胎児脾臓、CD19
＋細胞、およびRaji細胞において検出された。
【００４６】 ノザンブロット分析を使用して、BCMAは小腸、脾臓、胃、結腸、虫垂、リンパ
節、気管、および精巣において検出された。BCMAはまた腺リンパ腫、非ホジキン
リンパ腫、および副甲状腺腫瘍において検出され、CD8＋、CD19＋、MLR細胞、Da
udi細胞、RajiおよびHut78細胞においてかすかに検出された。 また、ネズミztnf4（配列番号19）および同様なヒトTACI、BCMA、およびBR43x
2を使用してノザンブロット分析を実施し、ネズミztnf4の発現は主として脾臓お
よび胸腺において検出された。ネズミztnf4はまた肺において発現され、そして
かすかな発現は皮膚および心臓において検出された。
【００４７】 本発明は、また、本明細書に開示するBR43x2ポリペプチドをコードする、DNA
およびRNA分子を包含する、ポリヌクレオチド分子を提供する。当業者は容易に
認識するように、遺伝暗号のデジェネラシーにかんがみて、かなりの配列変動は
これらのポリヌクレオチド分子の間で可能である。配列番号11は、配列番号4の
可溶性BR43x2ポリペプチドをコードするすべてのDNAを包含する縮重DNA配列であ
る。同様に、配列番号12は、配列番号2のBR43x2ポリペプチドをコードするすべ
てのDNAを包含する縮重DNA配列である。
【００４８】 当業者は認識するように、配列番号12の縮重配列は、また、UをTと置換するこ
とによって配列番号4をコードするすべてをRNA配列を提供する。こうして、BR43
x2ポリペプチドをコードする配列番号11のヌクレオチド1〜ヌクレオチド360、配
列番号12のヌクレオチド1〜741を含んでなるポリヌクレオチドおよびそれらのRN
A同等物は、本発明に包含される。縮重ヌクレオチド位置を表すために配列番号1
1および12内で使用した1文字コードを表1に記載する。「分解能」はコード文字
により表されるヌクレオチドである。「補体」は1またはそれ以上の相補的ヌク
レオチドのコードである。例えば、コードYはCまたはTを表し、そしてその補体R
はAまたはGを表し、AはTに対して相補的であり、そしてGはCに対して相補的であ
る。
【００４９】
【表１】 所定のアミノ酸についてすべての可能なコドンを包含する、配列番号11および
12において使用する縮重コドンを、表2に記載する。
【００５０】
【表２】
【００５１】 当業者は認識するように、各アミノ酸をコードするすべての可能なコドンを代
表する縮重コドンを決定するとき、多少の不明確さが導入される。例えば、セリ
ンの縮重コドン（WSN）は、ある環境において、アルギニン（AGR）をコードする
ことができ、そしてアルギニンの縮重コドン（MGN）は、ある環境において、セ
リン（AGY）をコードすることができる。同様な関係はフェニルアラニンおよび
ロイシンをコードするコドンの間に存在する。したがって、縮重配列に包含され
る、いくつかのポリヌクレオチドは変異型アミノ酸配列をコードすることができ
るが、当業者は、配列番号2および4のアミノ酸配列を参照することによって、こ
のような変異型配列を容易に同定することができる。変異型配列は、本明細書に
おいて記載するように、機能性について容易に試験することができる。
【００５２】 また、当業者は認識するように、異なる種は「優先的コドンの使用」を示すこ
とができる。一般に、下記の文献を参照のこと：Grantham他、Nucl. Acids Re
s. 8：1893−912、1980；Haas他、Curr. Biol. 6：315−24、1996；Wain−Ho
bson他、Gene 13：355−64、1981；GrosjeanおよびFiers、Gene 18：199−209
、1982；Holm、Nucl. Acids Res. 14：3075−87、1986；Ikemura、J. Mol.
Biol. 158：573−97、1982。本発明において使用するとき、用語「優先的コ
ドンの使用」または「優先的コドン」は、ある種の細胞において最も頻繁に使用
され、こうして各アミノ酸をコードする可能なコドンの1つまたはわずかの代表
的なものに好んで使用される、タンパク質翻訳コドンを言及する、この分野の用
語である（表2参照）。 例えば、アミノ酸のスレオニン（Thr）はACA、ACC、ACG、またはACTによりコ
ードされることができるが、哺乳動物細胞において、ACCは最も普通に使用され
るコドンである；他の種、例えば、昆虫細胞、酵母、ウイルスまたは細菌におい
て、異なるThrコドンは優先的であることができる。特定の種の優先的コドンを
、この分野において知られている種々の技術により、本発明のポリヌクレオチド
の中に導入することができる。組換えDNAの中への優先的コドンの導入は、例え
ば、特定の細胞の型または種内のタンパク質の翻訳を効率よくすることによって
、タンパク質の産生を増強することができる。
【００５３】 したがって、配列番号11に開示されている縮重コドンの配列は、この分野にお
いて普通に使用されかつ本明細書において開示する、種々の細胞の型および種に
おけるポリヌクレオチドの発現を最適化するための鋳型として働く。優先的コド
ンを、本明細書において開示するように、種々の種における発現について試験し
、発現のために最適化し、そして機能性について試験することができる。
【００５４】 BR43x2のシステインに富んだ擬反復の中に高度に保存されたアミノ酸を、新し
いファミリーメンバーを同定するツールとして使用することができる。例えば、
種々の組織源または細胞系統から得られたRNAからの、前述の、細胞外リガンド
結合性ドメインをコードする配列を増幅するために、逆転写−ポリメラーゼ連鎖
反応（RT−PCR）を使用することができる。特に、BR43x2配列から設計された高
度に保存されたプライマーはこの目的に有用である。
【００５５】 本発明の好ましい態様の範囲内において、単離されたポリヌクレオチドは、ス
トリンジェント条件下に、配列番号3の同様なサイズの領域またはそれ対して相
補的配列に対してハイブリダイゼーションするであろう。一般に、ストリンジェ
ント条件は、規定されたイオン強度およびpHにおいて、特定の配列の熱的融点（
Tm）よりも約5℃低いように選択される。Tmはターゲット配列の50％が完全に合
致するプローブにハイブリダイゼーションする温度（規定されたイオン強度およ
びpHにおいて）である。典型的にはストリンジェント条件は、pH7において塩濃
度が約0.03Mまででありかつ温度が少なくとも約60℃である条件である。
【００５６】 前述したように、本発明の単離されたポリヌクレオチドはDNAおよびRNAを包含
する。DNAおよびRNAを製造する方法はこの分野においてよく知られている。一般
にRPMI 1788細胞、PBMNC、B細胞または扁桃腺組織からRNAを単離することが好
ましいが、また、DNAは他の組織からのRNAを使用して製造することができるか、
あるいはゲノムDNAとして単離することができる。全RNAはグアジニウムイソチオ
シアネート抽出および引き続くCsCl勾配の遠心により製造することができる（Ch
irgwin他、Biochemistry 18：52−94、1979）。ポリ（A）＋RNAは全RNAからAvi
vおよびLederの方法（Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 69：1408−12、1972
）により製造される。相補的DNA（cDNA）はポリ（A）＋RNAから既知の方法によ
り製造される。次いでBR43x2ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、例
えば、ハイブリダイゼーションまたはPCRにより、同定し、単離する。
【００５７】 当業者は認識するように、配列番号1および3に開示する配列はヒト遺伝子の単
一アレレ表し、そしてアレレの変動およびオールタネイティブスプライシングが
起こることが期待される。配列番号1および3に示すDNA配列のアレレ変異型は、
サイレント突然変異を含有するものおよび突然変異がアミノ酸配列の変化を生ず
るものを包含し、本発明の範囲内に入り、そして配列番号2および4のアレレ変異
型であるタンパク質もまた本発明の範囲内に入る。この分野において知られてい
る標準的手順に従い異なる個体または組織からのcDNAまたはゲノムライブラリー
をプロービングすることによって、アレレ変異型およびこれらの配列のスプライ
ス変異型をクローニングすることができる。
【００５８】 本発明は、また、配列番号2および4のポリペプチドおよびそれらの種オーソロ
グに対して実質的に類似する、単離されたBR43x2ポリペプチドを提供する。用語
「実質的に類似する」は、本明細書において、配列番号2および4に示す配列また
はそれらのオーソログに対して50％、好ましくは60％、より好ましくは少なくと
も80％の配列の同一性を有するポリペプチドを表すために使用される。このよう
なポリペプチドは配列番号2に示す配列またはそれらのオーソログに対して好ま
しくは少なくとも90％、最も好ましくは少なくとも95％配列の同一性を有する。
【００５９】 配列の同一性の百分率は慣用法により決定される。例えば、下記の文献を参照
のこと：Altschul他、Bull. Math. Bio. 48：603−66、1986およびHenikoff
およびHenikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89：10915−9、1992。簡単
に述べると、表3（アミノ酸は標準的1文字コードにより示されている）に示すよ
うに10のギャップオープニングペナルティー、1のギャップエクステンションペ
ナルティー、およびHenikoffおよびHenikoff（前掲）の「ブロサム（blosum）62
」スコアリングマトリックスを使用して、2つのアミノ酸配列を整列させて整列
スコアを最適化する。
【００６０】
【数１】
【００６１】
【表３】
【００６２】 ポリヌクレオチド分子の配列の同一性は、上に開示した比を使用する同様な方
法により決定される。
【００６３】 実質的に相同性のタンパク質およびポリペプチドは、1またはそれ以上のアミ
ノ酸の置換、欠失または付加を有するとして特性決定される。これらの変化は好
ましくは小さい特質を有する、すなわち、保存的アミノ酸置換（表4参照）およ
びタンパク質またはポリペプチドのフォルディングまたは活性に影響を実質的に
与えない他の置換；小さい欠失、典型的には1〜約30アミノ酸の欠失；およびア
ミノ末端およびカルボキシル末端のエクステンション、例えば、アミノ末端のメ
チオニン残基、約20〜25残基までの小さいリンカーペプチド、または親和標識を
有する。親和標識を含んでなるポリペプチドは、さらに、BR43x2ポリペプチドと
親和標識との間にタンパク質分解切断部位を含むことができる。好ましいこのよ
うな部位は、トロンビン切断部位および因子Xa切断部位を包含する。
【００６４】
【表４】 20の標準的アミノ酸に加えて、非標準的アミノ酸（例えば、4−ヒドロキシプ
ロリン、6−N−メチルリシン、2−アミノイソ酪酸、イソバリンおよびα−メチ
ルセリン）を本発明のBR43x2ポリペプチドのアミノ酸残基と置換することができ
る。制限された数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸
、および非天然アミノ酸をBR43x2ポリペプチドのアミノ酸残基と置換することが
できる。また、本発明のタンパク質は、天然に存在しないアミノ酸残基を含んで
なることができる。
【００６５】 天然に存在しないアミノ酸は、限定されずに、下記のものを包含する：トラン
ス−3−メチルプロリン、2,4−メタノプロリン、シス−4−ヒドロキシプロリン
、トランス−4−ヒドロキシプロリン、N−メチルグリシン、アロ−スレオニン、
メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキシエチルホモシステ
イン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボ
ン酸、デヒドロプロリン、3−および4−メチルプロリン、3,3−ジメチルプロリ
ン、tert−ロイシン、ノルバリン、2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニル
アラニン、4−アザフェニルアラニン、および4−フルオロフェニルアラニン。
【００６６】 天然に存在しないアミノ酸残基をタンパク質の中に組込む、いくつかの方法は
この分野において知られている。例えば、化学的にアミノアシル化されたサプレ
ッサーtRNAを使用してナンセンス突然変異を抑制する、in vitro系を使用する
ことができる。アミノ酸を合成し、tRNAをアミノアシル化する方法はこの分野に
おいて知られている。大腸菌（E.coli）S30抽出物および商業的に入手可能な酵
素および他の試薬を含んでなる、無細胞系において、ナンセンス突然変異を含有
するプラスミドの転写および翻訳は実施される。タンパク質をクロマトグラフィ
ーにより精製する。
【００６７】 例えば、下記の文献を参照のこと：Robertson他、J. Am. Chem. Soc. 113
：2722、1991；Ellman他、Methods Enzymol. 202：301、1991；Chung他、Scie
nce 259：806−809、1993；およびChung他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA
90：10145−10149、1993）。第2の方法において、突然変異したmRNAおよび化
学的にアミノアシル化されたサプレッサーtRNAのマイクロインジェクションによ
り、キセノプス・オオサイト（Xenopus oocytes）中で翻訳を実施する（Turcat
ti他、J. Biol. Chem. 271：19991−8、1996）。
【００６８】 第3の方法において、置換すべき天然アミノ酸（例えば、フェニルアラニン）
の非存在においてかつ所望の天然に存在しない1またはそれ以上のアミノ酸（例
えば、2−アザフェニルアラニン、3−アザフェニルアラニン、4−アザフェニル
アラニンまたは4−フルオロフェニルアラニン）の存在において、大腸菌（E.col
i）細胞を培養する。天然に存在しないアミノ酸をその天然対応物の代わりにタ
ンパク質の中に組込む。Koide他、Biochem. 33：7470−6、1994、参照。in vi
tro化学的修飾により、天然に存在するアミノ酸残基を天然に存在しない種に変
換することができる。化学的修飾を部位特異的突然変異誘発と組合わせて、置換
の範囲をさらに拡張することができる（WynnおよびRichards、Protein Sci. 2
：395−403、1993）。
【００６９】 制限された数の非保存的アミノ酸、遺伝暗号によりコードされないアミノ酸、
天然に存在しないアミノ酸、および非天然のアミノ酸をBR43x2アミノ酸残基と置
換することができる。
【００７０】 本発明のBR43x2ポリペプチドにおける必須アミノ酸は、この分野において知ら
れている手順、例えば、部位特異的突然変異誘発またはアラニン走査突然変異誘
発に従い同定することができる（CunninghamおよびWells、Science 244：1081
−5、1989；Bass他、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88：4498−502、1991）
。後者の技術において、単一のアラニンの突然変異を分子中のすべての残基にお
いて導入し、そして、後述するように、生ずる突然変異体分子を生物学的活性に
ついて試験して、分子の活性に対して決定的であるアミノ酸残基を同定する。ま
た、下記の文献を参照のこと：Hilton他、J. Biol. Chem. 271：4699−708、
1996。
【００７１】 また、リガンド−レセプターまたは他の生物学的相互作用の部位は、構造の物
理的解析により決定することができ、例えば、核磁気共鳴、結晶学、電子回折ま
たはフォトアフィニティー標識化のような技術と、推定上の接触部位のアミノ酸
の突然変異との組合わせにより決定することができる。例えば、下記の文献を参
照のこと：de Vos他、Science 255：306−12、1992；Smith他、J. Mol. Bio
l. 224：899−904、1992；Wlodaver他、FEBS Lett. 309：59−64、1992。必
須アミノ酸の同定は、また、関係するポリペプチドとの相同性から推定すること
ができる。
【００７２】 保存されたシステイン、アスパラギン酸およびロイシン残基が混乱されないか
ぎり、BR43x2のシステインに富んだ擬反復内で追加のアミノ酸置換を行うことが
できる。他のシステインに富んだ擬反復の配列を参照することによって、BR43x2
のシステインに富んだ擬反復内で追加のアミノ酸置換を行うことが好ましい。配
列番号10は、このような整列に基づく許容可能なアミノ酸配列を示す、一般化さ
れたシステインに富んだ擬反復である。このドメイン内の置換は本明細書におい
て記載する限定に付される。
【００７３】 既知の突然変異誘発およびスクリーニングの方法、例えば、下記の文献に記載
されている方法を使用して、多重アミノ酸置換を行い、試験することができる：
Reidhaar−OlsonおよびSauer、Science 241：53−7、1988またはBowieおよびSa
uer、Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 86：2152−6、1989。簡単に述べると
、これらの著者らはポリペプチド中の2またはそれ以上の位置を同時にランダム
化し、機能的ポリペプチドについて選択し、次いで突然変異化ポリペプチドを配
列決定して、各位置における許容可能な置換のスペクトルを決定する方法を開示
している。使用できる他の方法は下記の方法を包含する：ファージディスプレイ
（例えば、Lowman他、Biochem. 30：10832−7、1991；Ladner他、米国特許第5,
223,409号；Huse、WIPO公開WO 92／06204）および領域特異的突然変異誘発（De
rbyshire他、Gene 46：145、1986；Ner他、DNA 7：127、1988）。
【００７４】 開示したBR43x2のDNAおよびポリペプチド配列の変異型は、下記の文献に開示
されているように、DNAシャフリングにより発生させることができる：Stemmer、
Nature 370：389−91、1994、Stemmer、Proc. Natl'l. Acad. Sci. USA 9
1：10747−51、1994およびWIPO公開WO 90／20078。簡単に述べると、親DNAをラ
ンダムフラグメント化し、次いでPCRを使用してリアセンブリーして、ランダム
に導入された点突然変異を生じさせることによって、in vitro相同的組換えに
より変異型DNAを発生させる。
【００７５】 親DNAのファミリー、例えば、アレレ変異型または異なる種からのDNAを使用し
て、追加の可変性をプロセスの中に導入することによって、この技術を修飾する
ことができる。所望の活性について選択またはスクリーニングし、次いで突然変
異誘発およびアッセイをさらに反復して、所望の突然変異を選択すると同時に有
害な変化に対して選択することによって、配列を急速に「進化」させる。
【００７６】 本明細書に開示する突然変異誘発法を大きい処理量の自動化スクリーニング法
と組合わせて、宿主細胞においてクローニングされ、突然変異化ポリペプチドの
活性を検出することができる。活性ポリペプチド（例えば、免疫応答間のB細胞
の応答を減少させ、自己抗体の産生を阻害または減少させる）をコードする突然
変異化DNA分子を宿主細胞から回収し、現代的装置を使用して急速に配列決定す
ることができる。これらの方法は、問題のポリペプチドにおける個々のアミノ酸
残基の重要性の急速な決定を可能とし、未知構造のポリペプチドに適用すること
ができる。
【００７７】 前述の方法を使用して、配列番号2の残基1〜120に対して実質的に相同的であ
る種々のポリペプチドまたはそれらのアレレ変異型を同定しおよび／または製造
することができ、そして野生型タンパク質のB細胞の抑制特性を保持することが
できる。このようなポリペプチドは腫瘍壊死因子レセプターのスーパーファミリ
ーの他のメンバー、親和標識またはその他からの追加のアミノ酸およびドメイン
包むことができる。TNFRのスーパーファミリーの他のメンバーの機能的ドメイン
を含有する、BR43x2ポリペプチドまたは融合構築物は、修飾されたB細胞抑制能
力を示すハイブリッド腫瘍壊死因子レセプターを構築する。
【００７８】 さらに、本発明は、他の種からの対応物のレセプターおよびポリヌクレオチド
（オーソログ）を提供する。これらの種は下記のものを包含するが、これらに限
定されない：哺乳動物、トリ、両生類、爬虫類、魚類、昆虫および他の脊椎動物
および無脊椎動物の種。他の哺乳動物種からのBR43x2レセプター、例えば、ネズ
ミ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ウマ、および他の霊長類のレセプターは特に重
要である。本発明により提供される情報および組成物を慣用クローニング技術と
組み合わせて使用することによって、ヒトBR43x2レセプターのオーソログをクロ
ーニングすることができる。
【００７９】 例えば、レセプターを発現する組織または細胞型から得られたmRNAを使用して
、cDNAをクローニングすることができる。本明細書に開示する配列から設計され
たプローブを使用するノザンブロットをプロービングすることによって、mRNAの
適当な源を同定することができる。次いで陽性の組織または細胞系統のmRNAから
、ライブラリーを調製する。次いで種々の方法、例えば、完全なまたは部分的ヒ
トcDNAを使用するか、あるいは開示された配列をベースとする縮重プローブの1
またはそれ以上の組を使用してプロービングする方法により、レセプターをコー
ドするcDNAを単離することができる。
【００８０】 また、本明細書に開示する配列から設計されたプローブを使用するPCRにより
、cDNAをクローニングすることができる。追加の方法において、cDNAライブラリ
ーを使用して宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトすることができ、そし
て問題のcDNAの発現をレセプターに対する抗体で検出することができる。また、
同様な技術をゲノムクローンの単離に適用することができる。
【００８１】 全長のレセプターポリペプチド、可溶性レセプターポリペプチド、ポリペプチ
ドフラグメント、および融合ポリペプチドを包含する、本発明のレセプターポリ
ペプチドを、慣用技術に従い、遺伝子操作された宿主細胞において製造すること
ができる。適当な宿主細胞は、外因的DNAで形質転換またはトランスフェクトし
、培養において増殖させることができる細胞の型であり、そして細菌、真菌細胞
、および培養された高等真核細胞を包含する。
【００８２】 真核細胞、特に多細胞微生物の培養された細胞は好ましい。クローニングされ
たDNA分子を操作し、外因的DNAを種々の宿主細胞の中に導入する技術は、下記の
文献に記載されている：Sambrook他、Molecular Cloning：A Laboratory Man
ual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbo
r、NY、1989、およびAusubel他編、Current Protocols in Molecular Biolo
gy、John Wiley and Sons，Inc.、NY、1987。
【００８３】 一般に、BR43x2ポリペプチドをコードするDNA配列は、発現ベクター内に一般
に転写プロモーターおよびターミネーターを含む、その発現に必要な他の遺伝因
子に作用可能に連鎖される。ベクターは、また、1またはそれ以上の選択可能な
マーカーおよび1またはそれ以上の複製起点を普通に含有するが、当業者は認識
するように、ある種の系内で選択可能なマーカーを別々のベクター上に提供し、
そして宿主細胞のゲノムの中への組込みにより外因的DNAの複製を得ることがで
きる。プロモーター、ターミネーター、選択可能なマーカー、ベクターおよび他
の因子の選択は、当業者のレベル内の日常的設計事項である。多数のこのような
因子は文献に記載されており、そして商業的供給会社から入手可能である。
【００８４】 BR43x2ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路の中に向けるために、分泌シグナル
配列（また、リーダー配列、プレプロ配列または前配列として知られている）を
発現ベクターの中に準備する。分泌シグナル配列はBR43x2ポリペプチドのそれで
あることができるか、あるいは他の分泌されたタンパク質（例えば、t−PA）か
ら誘導するか、あるいは新規に合成することができる。分泌シグナル配列をBR43
x2 DNA配列に作用可能に連鎖して、すなわち、2つの配列を正しいリーディング
フレームで結合して、新しく合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路の中
に向けるように位置させる。分泌シグナル配列は普通に問題のポリペプチドをコ
ードするDNA配列に対して5'に配置されるが、ある種の分泌シグナル配列は問題
のDNA配列の中のどこかに位置決定することができる（例えば、Welch他、米国特
許第5,037,743号；Holland他、米国特許第5,143,830号、参照）。
【００８５】 培養された哺乳動物細胞は本発明において適当な宿主である。外因的DNAを哺
乳動物の宿主細胞の中に導入する方法は下記の方法を包含する：リン酸カルシウ
ム仲介トランスフェクション（Wigler他、Cell 14：725、1978；Corsaroおよび
Pearson、Somatic Cell Genetics 7：603、1981；GrahamおよびVan der Eb
、Virology 52：456、1973）、エレクトロポレーション（Neumann他、EMBO J.
1：841−5、1982）、DEAE−デキストリン仲介トランスフェクション（Ausubel
他、前掲）、およびリポソーム仲介トランスフェクション（Hawley−Nelson他、
Focus 15：73、1993；Ciccarone他、Focus 15：80、1993）、およびウイルス
ベクター（MillerおよびRosman、BioTechniques 7：980−90、1989；Wangおよ
びFiner、Nature Med. 2：714−6、1996）。
【００８６】 培養された哺乳動物細胞における組換えポリペプチドの産生は、例えば、下記
の特許文献に記載されている：Levinson他、米国特許第4,713,339号；Hagen他、
米国特許第4,784,950号；Palmiter他、米国特許第4,579,821号；およびRingold
、米国特許第4,656,134号。適当な培養された哺乳動物細胞は下記のものを包含
する：
【００８７】 COS−1（ATCC No. CRL 1650）、COS−7（ATCC No. CRL 1651）、BHK（A
TCC No. CRL 1632）、BHK570（ATCC No. CRL 10314）、293（ATCC No.
CRL 1573；Graham他、J. Gen. Virol. 36：59−72、1977）；Jurkat（ATCC
No. CRL−8129）、BaF3（ネズミ骨髄に由来するインターロイキン−3依存的
前リンパ系細胞系統、下記の文献を参照のこと：PalaciosおよびSteinmetz、Cel
l 41：727−34、1985；Mathey−Prevot他、Mol. Cell. Biol. 6：4135−5、
1986）およびチャイニーズハムスター卵巣（例えば、CHO−K1；ATCC No. CRL
61）細胞系統。追加の適当な細胞系統はこの分野において知られており、そし
て公衆の寄託機関、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
American Type Culture Collection）バージニア州マンナッサス、から入手
可能である。
【００８８】 一般に、強い転写プロモーター、例えば、SV−40またはサイトメガロウイルス
からのプロモーターは好ましい。例えば、米国特許第4,956,288号参照。他の適
当なプロモーターは、メタロチオネイン遺伝子からのプロモーター（米国特許第
4,579,821号および米国特許第4,601,978号）およびアデノウイルスの主要な後期
プロモーターを包含する。薬剤選択を一般に使用して、外来DNAが挿入された、
培養された哺乳動物細胞について選択する。このような細胞は普通に「トランス
フェクタント」と呼ばれる。例えば、選択因子の存在において培養され、問題の
遺伝子をそれらの子孫に移行させることができる細胞は、「安定なトランスフェ
クタント」と呼ばれる。
【００８９】 好ましい選択可能なマーカーは、抗生物質のネオマイシンに対する耐性をコー
ドする遺伝子である。選択はネオマイシン型薬剤、例えば、G−418またはその他
の存在において実施される。また、選択系を使用して、問題の遺伝子の発現レベ
ルを増加することができる、「増幅」と呼ぶ方法。低いレベルの選択因子の存在
においてトランスフェクタントを培養し、次いで選択因子の量を増加して、導入
された遺伝子の産物を高いレベルで産生する細胞について選択することによって
、増幅は実施される。好ましい増幅可能な選択可能なマーカーは、メトトレキセ
ートに対する耐性を付与する、ジヒドロフォレートリダクターゼである。
【００９０】 他の薬剤耐性遺伝子（例えば、ヒグロマイシン耐性、多薬剤耐性、プロマイシ
ンアセチルトランスフェラーゼ）を使用することもできる。因子によるトランス
フェクションのセットに加えて、変更された表現型を導入するオールタネイティ
ブマーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質、または細胞表面のタンパク質、例え
ば、CD4、CD8、クラスIのMHC、胎盤アルカリ性ホスファターゼを使用して、FACS
ソーティングまたは磁気ビーズ分離技術により、トランスフェクトされない細胞
からトランスフェクトされた細胞をソーティングすることができる。
【００９１】 植物細胞、昆虫細胞およびトリの細胞を包含する、他の高等真核細胞を宿主細
胞として使用することもできる。植物細胞中で遺伝子を発現するのためのベクタ
ーとしてアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）を使
用することは、Sinkar他、J. Biosci.（Bangalore）11：47−58、1987、におい
て概観されている。昆虫細胞の形質転換およびその中の外来ポリペプチドの産生
は、Guarino他、米国特許第5,162,222号およびWIPO公開WO 94/06463に開示され
ている。オートグラファト・カリフォルニカ（Autographa californica）核多
角体病ウイルス（AcNPV）から普通に誘導される、組換えバキュロウイルスで、
昆虫細胞を感染させることができる。
【００９２】 下記の文献を参照のこと：King、L. A. およびPossee、R. D. The Bacul
ovirus Expression System：A Laboratory Guide、London、Chapman & Ha
ll、O'Reilly、D. R. 他、Baculovirus Expression Vectors：A Laborator
y Manual、New York、Oxford University Press、1994；およびRichardson
、C. D. 編、Baculovirus Expression Protocols、 Methods in Molecul
ar Biology、Totowa、NJ、Humana Press、1995。組換えバキュロウイルスを作
る第2の方法は、Luckowが記載するトランスポゾンをベースとする系を利用する
（Luckow、V. A.、他、J. Virol. 67：4566−79、1993）。
【００９３】 この系はBac−to−Bacキット（Life Technologies、マリイランド州ロックビ
レ）で販売されている。この系は転移ベクター、pFastBac1（商標）（Life Tec
hnologies）を利用し、ここでpFastBac1（商標）は「バクミド（bacmid）」と呼
ばれる大きいプラスミドとして大腸菌（E. coli）の中に維持されたバキュロウ
イルスのゲノムの中にBR43x2ポリペプチドをコードするDNAを動かすために、Tn7
トランスポゾンを含有する。下記の文献を参照のこと：Hill−Perkins、M. S.
およびPossee、R. D.、J. Gen. Virol. 71：971−6、1990；Bonning、B.
C.、他、J. Gen. Virol. 75：1551−6、1994；および、Chazenbalk、G. D
.、およびRapoport、B.、J. Biol. Chem. 270：1543−9、1995。
【００９４】 さらに、転移ベクターは、発現されたBR43x2ポリペプチドのC末端またはN末端
におけるエピトープ標識、例えば、Glu−Gluエピトープ標識をコードするDNAと
のインフレーム融合物を含むことができる（Grussenmeyer、T.、他、Proc. Nat
l. Acad. Sci. 82：7952−4、1985）。この分野において知られている技術を
使用して、BR43x2を含有する転移ベクターを大腸菌（E.coli）の中に形質転換し
、そして組換えバキュロウイルスを示す中断されたlacZ遺伝子を含有するバクミ
ドについてスクリーニングする。組換えバキュロウイルスのゲノムを含有するバ
クミドDNAを普通の技術に従い単離し、そしてスポドプテラ・フルギペルダ（Spo
doptera frugiperda）細胞、例えば、Sf9細胞をトランスフェクトする。BR43x2
を発現する組換えベクターを引き続いて生成させる。この分野において普通に使
用されている方法により、組換えウイルスの系統を作る。
【００９５】 宿主細胞、典型的にはヨトウガ、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera
frugiperda）から誘導された細胞系統を感染させるために、組換えウイルスを使
用する。一般に、下記の文献を参照のこと：GlickおよびPasternak、Molecular
Biotechnology：Principle and Applications of Recombinant DNA、ASM
Press、Washington、D. C.、1994。他の適当な細胞系統は、トリコデルマ・
ニ（Trichoderma ni）に由来するHigh FiveO（商標）細胞系統（Invitrogen）
である（米国特許第5,300,435号）。商業的に入手可能な無血清培地を使用して
、細胞を増殖させかつ維持する。
【００９６】 適当な培地はSf9細胞についてSf900 II（商標）（Life Technologies）また
はESF 921（商標）（Expression System）；およびトリコデルマ・ニ（T.ni）
細胞についてEx−cellO450（商標）（JRH Bioscience、カンサス州レネクサ）
またはExpress FiveO（商標）（Life Technologies）である。細胞をほぼ2〜5
×105細胞の接種密度から1〜2×106細胞の密度に増殖させ、この時組換えウイル
スの系統を0.1〜10、より典型的には約3付近の感染の多重度で添加する。使用す
る手順は一般に入手可能な実験室のマニュアルに記載されている（King、L. A.
およびPossee、R. D.、前掲；O'Reilly、D. R.、他、前掲；Richardson、C.
D.、前掲）。本明細書に記載する方法に従い、上清からのBR43x2ポリペプチド
の引き続く精製を実施することができる。
【００９７】 酵母細胞を包含する真菌細胞を本発明において使用することもできる。これに
関して特に興味ある酵母種は、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces c
erevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、およびピキア・メタ
ノリカ（Pichia metanolica）を包含する。外因的DNAでサッカロミセス・セレ
ビシエ（S. cerevisiae）を形質転換し、それから組換えポリペプチドを生産す
る方法は、例えば、下記の特許文献に記載されている：Kawasaki、米国特許第4,
599,311号；Kawasaki他、米国特許第4,931,373号；Brake、米国特許第4,870,008
号；Welch他、米国特許第5,037,743号；およびMurry他、米国特許第4,845,075号
。
【００９８】 選択可能なマーカーにより決定された表現型、普通の薬剤耐性または特定の栄
養（例えば、ロイシン）の非存在において増殖する能力により、形質転換された
細胞を選択する。サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）
において使用するために好ましいベクター系は、Kawasaki他（米国特許第4,931,
373号）により開示されているPOT1ベクター系であり、これによりグルコースを
含有する培地中の増殖により形質転換細胞を選択することができる。酵母におい
て使用するために適当なプロモーターおよびターミネーターは、解糖酵素遺伝子
（例えば、Kawasaki、米国特許第4,599,311号；Ingsman他、米国特許第4,615,97
4号；およびBitter、米国特許第4,977,092号、参照）およびアルコールデヒドロ
ゲナーゼ遺伝子からのものを包含する。
【００９９】 また、米国特許第4,990,446号；米国特許第5,063,154号；米国特許第5,139,93
6号および米国特許第4,661,454号、参照。ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenul
a polymorpha）、シゾサッカラロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pomb
e）、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、クルイベロマ
イセス・フラギリス（Kluyveromyces frgilis）、ウスチラゴ・マイディス（Us
tilago maydis）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ピキア・メタノ
リカ（Pichia metanolica）、ピキア・グイレルモンディイ（Pichia guillerm
ondii）およびカンジダ・マルトサ（Candida maltosa）を包含する、他の酵母
のための形質転換系はこの分野において知られている。
【０１００】 例えば、Gleeson他、J. Gen. Microbiol. 132：3459−3465、1986およびCr
egg、米国特許第4,882,279号、参照。McKnight他、米国特許第4,935,349号の方
法に従い、アスペルギルス（Aspergillus）細胞を利用することができる。アク
レモニウム・クリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）は、Sumino他、米国特
許第5,162,228号に開示されている。ニューロスポラ（Neurospora）を形質転換
する方法は、Lambowitz、米国特許第4,486,533号に開示されている。
【０１０１】 例えば、組換えタンパク質の生産のための宿主としてピキア・メタノリカ（Pi
chia metanolica）を使用することは、WIPO公開WO 97／17450、WO 97／17451
、WO 98／02536、およびWO 98／02565に開示されている。ピキア・メタノリカ
（P. metanolica）の形質転換において使用するDNA分子は二本鎖、円形のプラ
スミドとして普通に製造され、これらは好ましくは形質転換の前に線状化される
。ピキア・メタノリカ（P. metanolica）におけるタンパク質の生産のために、
プラスミド中のプロモーターおよびターミネーターはピキア・メタノリカ（P.
metanolica）の遺伝子、例えば、ピキア・メタノリカ（P. metanolica）のアル
コール利用遺伝子（AUG1またはAUG2）のそれであることが好ましい。
【０１０２】 他の有用なプロモーターは、ジヒドロキシアセトンシンターゼ（DHAS）、ホル
メートデヒドロゲナーゼ（FMD）、およびカタラーゼ（CAT）遺伝子のプロモータ
ーを包含する。宿主染色体の中へのDNAの組込みを促進するために、宿主DNA配列
により双方の末端においてフランクされたプラスミドの全体の発現セグメントを
有することが好ましい。ピキア・メタノリカ（Pichia metanolica）において使
用するために好ましい選択可能なマーカーはピキア・メタノリカ（P. metanoli
ca）のADE2遺伝子であり、これはホスホリボシル−5−アミノイミダゾールカル
ボキシラーゼ（AIRC；EC4.1.1.21）をコードし、これはアデニンの非存在におい
てade2宿主細胞を増殖させる。
【０１０３】 メタノールの使用を最小としようとする、大規模の工業的方法のために、双方
のメタノール利用遺伝子（AUG1およびAUG2）が欠失されている、宿主細胞を使用
することが好ましい。分泌されたタンパク質の生産のために、液胞プロテアーゼ
遺伝子（PEP4およびPRB1）を欠如する宿主細胞は好ましい。問題のポリペプチド
をコードするDNAを含有するプラスミドをピキア・メタノリカ（P. metanolica
）細胞の中に導入することを促進するために、エレクトロポレーションを使用す
る。2.5〜4.5kV／cm、好ましくは約3.75kV／cmの電界強度を有する、指数的に減
衰する、パルス電界、および1〜40ミリセカント、最も好ましくは約20ミリセカ
ントの時間定数（t）を使用する、エレクトロポレーションにより、ピキア・メ
タノリカ（P. metanolica）細胞を形質転換することが好ましい。
【０１０４】 細菌大腸菌（Escherichia coli）、バシラス（Bacillus）および他の属の株
を包含する、原核宿主細胞は、また、本発明において有用である。これらの宿主
を発現させ、その中でクローニングされた外来DNA配列を発現する技術はこの分
野においてよく知られている（例えば、Sambrook他、前掲参照）。大腸菌（E.
coli）のような細菌においてBR43x2ポリペプチドを発現させるとき、ポリペプチ
ドを、典型的には不溶性粒子として、細胞質の中に保持させることができるか、
あるいは細菌の分泌配列によりペリプラスミック空間の中に向けることができる
。
【０１０５】 前者の場合において、細胞を溶解し、粒子を回収し、例えば、グアニジンイソ
チオシアネートまたは尿素を使用して、変性する。次いで変性されたポリペプチ
ドをリフォルディングさせ、変性物の希釈により、例えば、尿素の溶液および還
元されたグルタチオンおよび酸化されたグルタチオンとの組合わせに対する透析
、および引き続く緩衝化生理食塩水に対する透析により、二量体化させることが
できる。後者の場合において、細胞を崩壊させて（例えば、超音波処理または浸
透圧ショックにより）ペリプラスミック空間の内容物を解放し、これにより変性
およびリフォルディングの必要性を排除することによって、ポリペプチドをペリ
プラスミック空間から可溶性の、機能的形態で回収することができる。
【０１０６】 形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞を、慣用手順に従い、栄養素
および選択した宿主細胞の成長に必要な他の成分を含有する培地中で培養する。
規定された培地および複合培地を包含する、種々の適当な培地は、この分野にお
いて知られており、そして一般に炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミンおよ
び無機質を含む。培地は、また、必要に応じて、成長因子または血清のような成
分を含有することができる。一般に、外因的に添加されたDNAを含有する細胞に
ついて成長培地を選択する。この選択は、例えば、薬剤選択または必須栄養素の
欠如により実施され、必須栄養素は発現ベクター上に担体されるか、あるいは宿
主細胞の中に共トランスフェクトされた選択可能なマーカーにより補足される。
【０１０７】 炭素、窒素および微量栄養素の適切な源を含む培地中で約25℃〜35℃の温度に
おいて、ピキア・メタノリカ（P. metanolica）細胞を培養する。慣用の手段、
例えば、小さいフラスコの震盪または発酵槽のスパージにより、液体培地を十分
にエアレーションする。ピキア・メタノリカ（P. metanolica）のために好まし
い培地は、YEPD（2％のD−グルコース、2％のBacto（商標）ペプトン（Difco L
aboratories、ミシガン州デトロイト）、1％のBacto（商標）酵母エキス（Difco
Laboratories）、0.004％のアデニンおよび0.006％のL−ロイシン）である。
【０１０８】 分画および／または慣用の精製方法および培地を使用して、発現された組換え
BR43x2ポリペプチド（またはキメラBR43x2ポリペプチド）を精製することができ
る。試料の分画のために、硫酸アンモニウム沈降および酸またはカオトロープ抽
出を使用することができる。典型的な精製工程は、ヒドロキシアパタイト、サイ
ズ排除、FPLCおよび逆相高性能液体クロマトグラフィーを包含することができる
。適当なアニオン交換媒質は、誘導化デキストラン、アガロース、セルロース、
ポリアクリルアミド、特製シリカ、およびその他を包含する。PEI、DEAE、QAEお
よびQ誘導体は好ましく、DEAE高速流れセファローズ（Pharmacia、ニュージャー
ジイ州ピスカタウェイ）は特に好ましい。
【０１０９】 典型的なクロマトグラフィー媒質は、フェニル、ブチル、またはオクチル基で
誘導化された媒質、例えば、フェニル−セファローズFF（Pharmacia）、トヨパ
ールブチル650（Toso Haas、ペンシルベニア州モントゴメリヴィレ）、オクチ
ル−セファローズ（Pharmacia）およびその他；またはポリアクリル樹脂、例え
ば、Amberchrom CG 71（Toso Haas）およびその他を包含する。適当な固体支
持体は、ガラスビーズ、シリカをベースとする樹脂、セルロース樹脂、アガロー
スビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、架橋ポリアクリルアミ
ド樹脂、およびその他を包含し、これらはこれらを使用する条件下に不溶性であ
る。
【０１１０】 これらの支持体は、アミノ基、カルボキシル基、スルフヒドリル基、ヒドロキ
シル基および／または炭水化物部分によるタンパク質の結合を可能とする反応性
基で修飾することができる。化学的カップリングの例は、臭化シアン活性化、N
−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフヒドリル活性化
、ヒドラジド活性化、およびカーボジイミドの化学的カップリングのためのカル
ボキシルおよびアミノ誘導体を包含する。これらおよび他の固体の媒質はこの分
野においてよく知られており、かつ広く使用されており、そして商業的供給会社
から入手可能である。
【０１１１】 レセプターのポリペプチドを固体の媒質に結合する方法は、この分野において
よく知られている。特定の方法の選択は日常的設計事項であり、そして一部分選
択した支持体の性質により決定される。例えば、下記の文献を参照のこと：Affi
nity Chromatography：Principle & Methods、Pharmacia LKB Biotechnolo
gy、スイス国ウップサラ、1988；およびscopes、R.（編）Protein Purificatio
n：Principles and practice、Springer−Verlag、New York、1987。
【０１１２】 本発明のポリペプチドは、それらの物理的性質を利用することによって、単離
することができる。例えば、固定化金属イオン吸着（IMAC）クロマトグラフィー
を使用して、ポリヒスチジン標識からなるものを包含する、ヒスチジンに富んだ
タンパク質を精製することができる。簡単に述べると、ゲルにまず2価の金属イ
オンを負荷してキレート化剤を形成する（Sulkowski、Trends in Biochem. 3
：1−7、1985）。ヒスチジンに富んだタンパク質は、使用する金属イオンに依存
して、異なるアフィニティーでこのマトリックスに吸着され、競合的溶離、pHの
低下、または強いキレート剤の使用により溶離されるであろう。
【０１１３】 他の精製法は、レクチンアフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換
クロマトグラフィーによるグリコシル化タンパク質の精製を包含する（Methods
in Enzymol.、Vol. 182、″Guide to Protein Purification″、M. Deu
tscher（編）、Academic Press、サンディエゴ、1990、pp. 529−39）。本発
明の追加の態様の範囲内において、問題のポリペプチドと親和標識（例えば、マ
ルトース結合性タンパク質、FLAG−タグ（Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp
Lys（配列番号13））、Glu−Gluタグ（Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu（
配列番号14））免疫グロブリンドメイン）との融合物を構築して、精製を促進す
ることができる。
【０１１４】 タンパク質の再フォルディング（および必要に応じて再酸化）手法を好都合に
使用することができる。汚染する高分子、特に他のタンパク質および核酸に関し
て＞80％の純度、より好ましくは＞90％、なおより好ましくは99.9％より大きい
純度にタンパク質を精製すること、そしてタンパク質は感染因子および発熱因子
を含有しないことが好ましい。好ましくは、精製されたタンパク質は他のタンパ
ク質、特に動物由来の他のタンパク質を実質的に含まない。
【０１１５】 BR43x2ポリペプチドまたはそのフラグメントは、また、化学的合成により製造
することができる。BR43x2ポリペプチドはモノマーまたはマルチマーであること
ができ、グリコシル化されているか、あるいはされていないことができ、ペギル
化されているか、あるいはされていないことができ、そして初期のメチオニンア
ミノ酸残基を含むか、あるいは含まないことができる。典型的なBR43x2ポリペプ
チドは下記のモチーフに相当するアミノ酸配列を有しかつ本明細書に記載する限
定に付される、32〜40残基長さのポリペプチドを包含する：XXCX［QEK］［QEKNR
DHS］［QE］X｛0−2｝［YFW］［YFW］DXLLX｛2｝C［IMLV］XCX｛3｝CX｛6−8｝C
X｛2｝［YF］C（配列番号10）。
【０１１６】 BR43x2ポリペプチドは、独占的固相合成、部分的固相法、フラグメント縮合ま
たは古典的溶液合成により合成することができる。ポリペプチドは好ましくは、
例えば、Merrifield、J. Am. Chem. Soc. 85：2149、1963、に記載されてい
るように、固相ペプチド合成により製造される。アルファ−アミノ末端が保護さ
れたアミノ酸を使用して、この合成は実施される。不安定性側鎖を有する3官能
性アミノ酸を、また、適当な基で保護して、ポリペプチドの組立ての間に望まし
くない化学的反応が起こるのを防止する。アルファ−アミノ保護基を選択的に除
去して、引き続いてアミノ末端において反応が起こるようにする。アルファ−ア
ミノ保護基を除去する条件は、側鎖の保護基を除去しない。
【０１１７】 アルファ−アミノ保護基は、段階的ポリペプチド合成の分野において有用であ
ることが知られている基である。アシル型保護基（例えば、ホルミル、トリフル
オロアセチル、アセチル）、アリール型保護基（例えば、ビオチニル）、芳香族
ウレタン型保護基［例えば、ベンジルオキシカルボニル（Cbz）、置換ベンジル
オキシカルボニルおよび9−フルオレニルメチルオキシ−カルボニル（Fmoc）］
、脂肪族ウレタン保護基［例えば、t−ブトキシカルボニル（tBco）、イソプロ
ピルオキシカルボニル、シクロヘキシルオキシカルボニル］およびアルキル型保
護基（例えば、ベンジル、トリフェニルメチル）が包含される。好ましい保護基
はtBocおよびFmocである。
【０１１８】 選択される側鎖の保護基はカップリングの間に無傷に止まらなくてはならず、
そしてアミノ末端の保護基の脱保護の間に、またはカップリング条件の間に除去
されてはならない。側鎖の保護基は、また、合成の完結後に、仕上げられたポリ
ペプチドを変更しなであろう反応条件を使用して除去されなくてはならない。tB
oc化学において、3官能性アミノ酸のための側鎖の保護基は大部分ベンジルに基
づく。Fmoc化学において、側鎖の保護基は大部分ブチルまたはトリチルに基づく
。
【０１１９】 tBoc化学において、好ましい側鎖の保護基はアルギニンについてトシル、アス
パラギン酸についてシクロヘキシル、システインについて4−メチルベンジル（
およびアセトアミドメチル）、グルタミン酸、セリンおよびスレオニンについて
ベンジル、ヒスチジンについてベンジルオキシメチル（およびジニトロフェニル
）、リシンについて2−Cl−ベンジルオキシカルボニル、トリプトファンについ
てホルミルそしてチロシンホルミル2−ブロモベンジルである。Fmoc化学におい
て、好ましい側鎖の保護基は、アルギニンについて2,2,5,7,8−ペンタメチルク
ロマン−6−スルホニル（Pmc）または2,2,4,6,7−ペンタメチルジヒドロベンゾ
フラン−5−スルホニル（Pbf）、アスパラギン、システイン、グルタミンおよび
ヒスチジンについてトリチル、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオ
ニンおよびチロシンについてt−ブチル、リシンおよびトリプトファンについてt
Bocである。
【０１２０】 ホスホペプチドの合成のために、ホスフェート基の直接的または組立て後の組
込みを使用する。直接的組込みの戦略において、セリン、スレオニンまたはチロ
シン上のホスフェート基は、Fmoc化学においてメチル、ベンジル、またはｔ−ブ
チルにより保護するか、あるいはtBoc化学においてメチル、ベンジルまたはフェ
ニルにより保護することができる。ホスフェート保護なしのホスホチロシンの直
接的組込みをFmoc化学において使用することができる。組立て後の組込みの戦略
において、セリン、スレオニンまたはチロシンの非保護のヒドロキシル基を固相
上でジ−t−ブチル−、ジベンジル−またはジメチル−N,N'−ジイソプロピル−
ホスホアミダイトで誘導化し、次いでt−ブチルヒドロ−ペルオキシドで酸化す
る。
【０１２１】 固相合成は、通常、アルファ−アミノ保護（側鎖保護）アミノ酸を適当な固体
の支持体にカップリングさせることによってカルボキシル末端から実施される。
クロロメチル、クロロトリチルまたはヒドロキシメチル樹脂に結合させるとき、
エステル結合が形成し、そして生ずるポリペプチドはＣ末端に遊離のカルボキシ
ル基を有するであろう。あるいは、アミド樹脂、例えば、ベンズヒドリルアミン
またはｐ−メチルベンズヒドリルアミン樹脂（tBoc化学について）およびリンク
（Rink）アミドまたはPAL樹脂（Fmoc化学について）を使用するとき、アミド結
合が形成し、そして生ずるポリペプチドはＣ末端にカルボキシアミド基を有する
であろう。
【０１２２】 これらの樹脂は、ハンドルまたはリンカーを含むか、あるいは含まない、結合
した第1アミノ酸を含むか、あるいは含まない、ポリスチレン−またはポリアミ
ド−をベースとするか、あるいはポリエチレングリコール−グラフト化されてい
るかどうかにかかわらず、商業的に入手可能であり、そしてそれらの製造は下記
の文献に記載されている：Stewart、他、″Solid Phase Peptide Synthesis
″（第2版）、（Pierce Chemical Co.、イリノイ州ロックフォード、1984）お
よびBayerおよびRapp、Chem. Pept. Prot. 3：3、1986；およびAtherton、他
、Solid Phase Peptide Synthesis ：A Practical Approach、IRL Press
、Oxford、1989。
【０１２３】 必要に応じて側鎖において、およびアルファ−アミノ基において保護された、
C末端のアミノ酸を、種々の活性化剤、例えば、ジシクロヘキシルカーボジイミ
ド（DCC）、N,N'−ジイソプロピルカーボジイミド（DIPCDI）およびカルボニル
ジイミダゾール（CDI）を使用して、ヒドロキシメチル樹脂に結合させる。それ
はクロロメチルまたはクロロトリチル樹脂に直接的にそのセシウムテトラメチル
アンモニウム塩の形態で、あるいはトリエチルアミン（TEA）またはジイソプロ
ピルエチルアミン（DIEA）の存在において結合させることができる。アミド樹脂
への第１アミノ酸の結合は、カップリング反応の間のアミド結合の形成と同一で
ある。
【０１２４】 樹脂の支持体への結合後、保護化学（例えば、tBoc、Fmoc）に依存して種々の
の試薬を使用して、アルファ−アミノ保護基を除去する。Fmoc除去の程度は、30
0〜320nmにおいて、あるいは導電性セルによりモニターすることができる。アル
ファ−アミノ保護基を除去した後、残りの保護されたアミノ酸を要求される順序
で段階的にカップリングして、所望の配列を得る。
【０１２５】 種々の活性化剤、例えば、下記のものをカップリング反応に使用することがで
きる：DCC、DIPCDI、2−クロロ−1,3−ジメチルイミジウムヘキサフルオロホス
フェート（CIP）、ベンゾトリアゾール−1−イル−オキシ−トリス−（ジメチル
アミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（BOP）およびそのピロリ
ジン類似体（PyBOP）、ブロモ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフル
オロホスフェート（PyBrOP）、O−（ベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3
−テトラメチル−ウロニムヘキサフルオロホスフェート（HBTU）およびそのテト
ラフルオロボレート類似体（TBTU）またはそのピロリジン類似体（HBPyU）、O−
（7−アザベンゾトリアゾール−1−イル）−1,1,3,3−テトラメチル−ウロニム
ヘキサフルオロホスフェート（HATU）およびそのテトラフルオロボレート類似体
（TATU）またはそのピロリジン類似体（HAPyU）。
【０１２６】 カップリング反応において使用する最も普通の触媒添加剤は、4−ジメチルア
ミノピリジン（DMAP）、3−ヒドロキシ−3,4−ジヒドロ−4−オキソ−1,2,3−ベ
ンゾトリアジン（HODhbt）、N−ヒドロキシベンゾトリアゾール（BOBt）および1
−ヒドロキシ−7−アザベンゾトリアゾール（HOAt）を包含する。各保護された
アミノ酸は過剰量（＞2.0当量）で使用し、そしてカップリングは通常N−メチル
ピロリドン（NMP）中で、あるいはDMF、CH2Cl2またはそれらの混合物中で実施す
る。各段階において、例えば、Kaiser、他、Anal. Biochem. 34：595、1970、
に記載されているように、ニンヒドリン反応により、カップリング反応の完結の
程度をモニターすることができる。
【０１２７】 所望のペプチドが完全に組立てられた後、適切な掃去剤とともに試薬を使用し
てペプチド−樹脂を切り放す。掃去剤（例えば、H2O、エタンジチオール、フェ
ノールおよびチオアニソール）とともにTFAにより、Fmocペプチドは通常切り放
し、脱保護される。tBocペプチドは通常液状ＨＦで1〜2時間−5〜0℃において切
り放し、脱保護され、これはポリペプチドを樹脂から切り放し、側鎖の保護基の
大部分を除去する。掃去剤、例えば、アニソール、ジメチルサルファイドおよび
ｐ−チオクレゾールを通常液状HFとともに使用して、切り放しの間にポリペプチ
ドの中に存在するアミノ酸残基のアルキル化およびアシル化からカチオンが形成
するのを防止する。
【０１２８】 トリプトファンのホルミル基およびヒスチジンのジニトロフェニル基を、HFの
切り放し前にDMF中で、それぞれ、ピペリジンおよびチオフェニルにより、除去
することが必要である。システインのアセトアミドメチル基は、酢酸水銀（II）
により除去するか、あるいはヨウ素、トリフルオロ酢酸タリウム（III）または
テトラフルオロホウ酸銀（これは同時にシステインをシスチンに酸化する）によ
り除去することができる。tBocペプチドの切り放しおよび脱保護のために使用さ
れる他の強酸は、トリフルオロメタンスルホン酸（TFMSA）およびトリメチルシ
リルトリフルオロアセテート（TMSOTf）を包含する。
【０１２９】 本発明は、さらに、種々の他のポリペプチド融合物および1またはそれ以上の
ポリペプチド融合物を含んでなる関係するマルチマータンパク質を提供する。可
溶性BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドは、2つの定常領域ドメインを含有し
かつ可変領域を欠如する、免疫グロブリン重鎖定常領域、典型的にはFcフラグメ
ントとの融合物として発現させることができる。このような融合物を製造する方
法は、米国特許第5,155,027号および米国特許第5,567,584号に開示されている。
このような融合物は典型的にはマルチマー分子として分泌され、ここでFc部分は
互いにジサルファイド結合されておりそして2つの非Igポリペプチドは互いに密
接して配列されている。
【０１３０】 免疫グロブリン−BR43x2（TACIまたはBCMA）ポリペプチド融合物を遺伝子操作
された細胞において発現させて、種々のマルチマーBR43x2アナローグを産生する
ことができる。補助的ドメインをBR43x2（TACIまたはBCMA）ポリペプチドに融合
させて、それらのドメインを特異的細胞、組織、または高分子にターゲットする
ことができる。また、本明細書において記載するようにトキシンを使用して、融
合物をつくることができる。このようにして、ポリペプチドおよびタンパク質を
療法および診断の目的でターゲットすることができる。BR43x2ポリペプチドを2
またはそれ以上の分子、例えば、精製のために親和標識およびターゲッティング
ドメインに融合することができる。
【０１３１】 また、ポリペプチド融合物は、特にドメイン間の、1またはそれ以上の切断部
位を含んでなることができる。下記の文献を参照のこと：Tuan他、Connect. Ti
ss. Res. 34：1−9、1996。例えば、in vitroアッセイツールとして、溶液か
ら同種リガンドをアフィニティー精製するために、細胞表面上にリガンドを結合
するために、あるいはリガンドの刺激をブロックするために投与することによっ
てin vivoにおけるBR43x2アンタゴニストとして、この型の融合物を使用するこ
とができる。アッセイにおいて使用するために、融合タンパク質を支持体にFc領
域を介して結合し、そしてELISAフォーマットにおいて使用することができる。
【０１３２】 また、本発明は、親和標識または標識との融合タンパク質を形成するために使
用する、可溶性BR43x2レセプターを提供する。可溶性BR43x2親和標識融合タンパ
ク質は、例えば、BR43x2リガンド、ならびに自然リガンドのアゴニストおよびア
ンタゴニストを同定するために使用される。標識化された、可溶性BR43x2を使用
して、リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストを発現する細胞を蛍光免疫サ
イトメトリーまたは免疫組織化学により同定する。組織または特定の細胞系統上
のリガンドの分布を研究し、レセプター／リガンドの生物学の洞察を提供するた
めに、可溶性融合タンパク質は有用である。
【０１３３】 リガンド、アゴニストまたはアンタゴニストを精製するために、レセプター−
リガンドの結合を促進する条件（典型的には生理学的温度、pH、およびイオン強
度）下にリガンド、アゴニストまたはアンタゴニストを含有する試料に、BR43x2
−Ig融合タンパク質を添加する。次いで固体支持体（例えば、不溶性樹脂ビーズ
）上に固定化された、プロテインAを使用する混合物により、レセプター−リガ
ンド複合体を分離する。次いで慣用化学技術、例えば、塩またはpH勾配を使用し
て、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストを溶離する。別法において、融合タ
ンパク質それ自体を固体支持体に結合することができ、結合および溶離は前述し
たように実施する。
【０１３４】 使用条件下に安定である固体支持体、例えば、アガロース、架橋したアガロー
ス、ガラス、セルロース樹脂、シリカをベースとする樹脂、ポリスチレン、架橋
したポリアクリルアミド、または同様な物質のビーズにレセプターポリペプチド
を固定化する方法はこの分野において知られている。固体支持体にポリペプチド
を結合させる方法はこの分野において知られており、そしてアミン化学、臭化シ
アン活性化、N−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシド活性化、スルフ
ヒドリル活性化、およびヒドラジン活性化を包含する。生ずる媒質は一般にカラ
ムの形態であり、そしてリガンドを含有する流体をカラムに1またはそれ以上の
回数通過させて、リガンドをレセプターポリペプチドに結合させる。次いでリガ
ンド−レセプターの結合を崩壊させるために塩濃度、カオトロープ因子（MgCl2
）、またはpHの変化を使用して、リガンドを溶離する。
【０１３５】 宿主細胞からの可溶性レセプターの輸送を向けるために、分泌ペプチド、例え
ば、t−PA分泌ペプチドをコードする第2DNAセグメントに、可溶性レセプターDNA
を結合する。分泌されたレセプタードメインの精製を促進するために、抗体また
は他の特異的結合因子を利用できる、NまたはC末端のエクステンション、例えば
、親和標識または他のポリペプチドまたはタンパク質をレセプターポリペプチド
に融合することができる。
【０１３６】 本発明の機能的可溶性、膜結合レセプターを発現する細胞をスクリーニングア
ッセイにおいて使用する。種々の適当なアッセイはこの分野において知られてい
る。これらのアッセイはターゲット細胞における生物学的応答の検出に基づく。
対照値に比較した代謝変化は、BR43x2仲介代謝をモジュレートする被検化合物を
示す。1つのこのようなアッセイは細胞増殖アッセイである。細胞を被検化合物
の存在または非存在下に培養し、そして、例えば、トリチウム化チミジンの組込
みの測定または3−（4,5−ジメチルチアゾル−2−イル）−2,5−ジフェニルテト
ラゾリウムヌロミド（MTT）の代謝的破壊に基づく比色アッセイにより、細胞増
殖を検出する（Mosman、J. Immunol. Meth. 65：55−63）。
【０１３７】 他のアッセイのフォーマットにおいて、リポーター遺伝子を発現するようにさ
らに操作される細胞を使用する。レセプター結合経路に対して応答性であるプロ
モーター因子にリポーター遺伝子を結合させ、アッセイにおいて、リポーター遺
伝子の転写の活性化を検出する。細胞抽出物について容易にアッセイされる多数
のリポーター遺伝子、例えば、大腸菌（E. coli）lacZ、クロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（CAT）および血清応答因子（SRE）はこの分野にお
いて知られている（例えば、Shaw他、Cell 56：563−72、1989参照）。
【０１３８】 好ましいこのようなリポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である（de We
t他、Mol. Cell. Biol. 7：725、1987）。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、
この分野において知られている方法を使用するルミネセンスにより検出される（
例えば、Baumgartner他、J. Biol. Chem. 269：29094−101、1994；Schenbor
nおよびGoiffin、Promega Notes 41：11、1993）。ルシフェラーゼ活性アッセ
イキットは、例えば、Promega Corp.、ウイスコンシン州マディソンから商業的
に入手可能である。
【０１３９】 この型のターゲット細胞系統を使用して、化学物質、コンディショニングした
培地、菌類ブロス、土壌試料、水試料、およびその他のライブラリーをスクリー
ニングことができる。例えば、1連の細胞コンディショニング培地の試料をター
ゲット細胞についてアッセイして、リガンドを産生する細胞を同定する。次いで
陽性細胞を使用して、哺乳動物発現ベクターにおいてcDNAライブラリーを産生し
、これをプールに分割し、宿主細胞の中にトランスフェクトし、発現させる。次
いでトランスフェクトされた細胞からの培地試料をアッセイし、引き続いてプー
ルに分割し、再トランスフェクトし、継代培養し、陽性細胞を再アッセイして、
リガンドをコードするクローニングされたcDNAを単離する。
【０１４０】 リガンド結合性レセプター（または抗体、補体／抗補体の対の一方のメンバー
）またはその結合性フラグメント、および商業的に入手可能なバイオセンサー計
器（BIAcore（商標）、Pharmacia Biosensor、ニュージャージイ州ピスカタウ
ェイ）を使用してアッセイシステムを好都合に使用することができる。このよう
なレセプター、抗体、補体／抗補体の対のメンバーまたはフラグメントをレセプ
ターのチップの表面上に固定化する。この計器の使用は、Karlsson、J. Immuno
l. Methods 145：229−40、1991およびCunninghamおよびWells、J. Mol. Bi
ol. 234：554−63、1993、に開示されている。
【０１４１】 例えば、アミンまたはスルフヒドリルの化学を使用して、BR43x2ポリペプチド
、フラグメント、抗体または補体／抗補体のメンバーを、フローセル内の金薄膜
に結合させたデキストラン繊維に共有結合させる。被験試料をセルに通過させる
。リガンド、エピトープ、または補体／抗補体の反対のメンバーが試料の中に存
在する場合、それは、それぞれ、固定化されたレセプター、抗体またはメンバー
に結合し、媒質の屈折率を変化させ、これは金薄膜の表面のプラズモンの共鳴の
変化として検出される。
【０１４２】 このシステムは、オンおよびオフの割合の測定（これから結合アフィニティー
を計算することができる）および結合の化学量論的評価を可能とする。リガンド
結合性ポリペプチドを、また、この分野において知られている他のアッセイシス
テムにおいて使用することができる。このようなシステムは、結合アフィニティ
ーを測定するスキャッチャード分析（Scatchard、Ann. NY Acad. Sci. 51：
660−72、1949、参照）および比色アッセイ（Cunningham他、Science 253：545
−48、1991；Cunningham他、Science 245：821−25、1991、参照）を包含する
。 TACIおよびBCMAに対する可溶性I125−ztnf4についてのスキャッチャードプロ
ット分析を図2に示し、表5におけるTNFRファミリーの他のメンバーの結合定数と
比較する。
【０１４３】
【表５】
【０１４４】 レセプターとして、BR43x2ポリペプチドの活性化はシリコンをベースとするバ
イオセンサーミクロフィジオメーターにより測定することができる。このミクロ
フィジオメーターは、レセプター結合に関連する細胞外酸性化速度またはプロト
ン外分泌および引き続く生理学的細胞応答を測定する。典型的な装置は、Cytose
nsor（商標）Microphysiometer（製造会社：Molcular Divices、カリフォルニ
ア州サニイヴァイル）である。種々の細胞応答、例えば、細胞増殖、イオン輸送
、エネルギー産生、炎症性応答、調節およびレセプターの活性化、およびその他
をこの方法により測定することができる。
【０１４５】 例えば、下記の文献を参照のこと：McConnell他、Science 257：1906−12、1
992；Pitchford他、Meth. Enzymol. 228：84−108、1997；Arimilli他、J. I
mmunol. Meth. 212：49−59、1998；Van Lifde他、Eur. J. Pharmacol. 3
46：87−95、1998。付着性または非付着性真核または原核細胞をアッセイするた
めに、ミクロフィジオメーターを使用することができる。
【０１４６】 細胞培地の細胞外酸性化の経時的変化を測定することによって、ミクロフィジ
オメーターは、種々の刺激、例えば、BR43x2ポリペプチドのアゴニスト、リガン
ドまたはアンタゴニストに対する細胞の応答を直接測定する。好ましくは、BR43
x2ポリペプチドを発現しない対照真核細胞に比較して、BR43x2を発現する真核細
胞の応答を測定するためにミクロフィジオメーターを使用する。BR43x2を発現す
る真核細胞は、本明細書において記載するように、BR43x2がトランスフェクトさ
れ、BR43x2刺激性刺激に対して応答性である細胞をつくる、細胞；またはBR43x2
を自然に発現する細胞、例えば、脾臓組織に由来するBR43x2を発現する細胞を含
んでなる。
【０１４７】 対照に関する、細胞外酸性化の変化、例えば、BR43x2を発現する細胞の応答の
増加または減少により測定された差は、BR43x2モジュレート細胞応答の直接的測
定である。そのうえ、このようなBR43x2モジュレート応答を種々の刺激下にアッ
セイすることができる。また、ミクロフィジオメーターを使用して、BR43x2ポリ
ペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを同定する方法が提供される。この
方法は、BR43x2ポリペプチドを発現する細胞を準備し、細胞の第1部分を被検化
合物の非存在下に培養し、細胞の第2部分を被検化合物の存在下に培養し、そし
て、例えば、細胞の第1部分に比較した細胞の第2部分の細胞応答の増加または減
少を検出することを含んでなる。細胞外酸性化速度の測定可能な変化として、細
胞応答の変化は示される。この方法を使用して、BR43x2ポリペプチドのアンタゴ
ニストおよびアゴニストを急速に同定することができる。
【０１４８】 組織または特異的細胞系統に対するリガンドの分布を研究するとき、そしてレ
セプター／リガンドの生物学の洞察を提供するために、可溶性BR43x2は有用であ
る。リガンドを支持するターゲット細胞を破壊するメカニズムとして、それらの
リガンドに対するTNFレセプターの特異性を利用することができる。例えば、毒
性化合物をBR43x2可溶性レセプターまたはBR43x2融合物にカップリングすること
ができる。毒性化合物の例は、ターゲット細胞を不活性化する放射性薬品；化学
療法剤、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メトトレキセート、および
シトキサン；トキシン、例えば、リシン、ジフテリア、シュードモナスエキソト
キシンAおよびアブリン；および細胞障害性T細胞表面分子に対する抗体を包含す
るであろう。
【０１４９】 FACS分析（Flow Cytometry and Sorting、Melamed他、編、Wiley−Liss、1
990およびImmunofluorescnce and Cell Sorting、Current Protocols in
Immunology、Vol. 1、Coligann他、編、John Wiley & Sons、1997）により
、ztnf4（5ng／ml）はBR43x2（配列番号2）、TACI（配列番号6）、BCMA（配列番
号8）およびBR43x1（配列番号9）に結合することが見出された。FITC標識化可溶
性ztnf4は、また、FACS分析を使用して、なかでも、下記のものに特異的に結合
することが示された：PBMNC、扁桃腺細胞中のBリンパ球、B細胞リンパ腫細胞（R
aji、バーキットヒトリンパ腫、ATCC CCL86）、Ramos（バーキットヒトリンパ
腫細胞系統、ATCC CRL−1596）、Daudi（バーキットヒトリンパ腫、ATCC CCL2
13）およびRPMI 1788（Bリンパ球細胞系統、ATCC CCL−156）。HL−60（ATCC
前骨髄細胞系統、ATCC CCL−240）との結合は見られなかった。
【０１５０】 PBMNCおよび扁桃腺細胞からのB細胞に対する結合の特異性は、CD19、IgD、IgM
、およびCD20を包含するB細胞特異的分子に対する抗体との共染色により確証さ
れた。CD40Lに対するztnf4の類似性は、より広い組織分布が見られることを示唆
した。例えば、サイトカイン増殖およびT細胞増殖を使用して、単球、樹枝状細
胞、および精製されたT細胞に対するztnf4のアフィニティーを試験し、そしてzt
nf4のアフィニティーは試験した他の型の細胞に対するztnf4の結合または生物学
的作用を検出することができなかった。したがって、リガンドおよびレセプター
によるB細胞に対する特異性は、自己免疫、B細胞癌、免疫調節、IBDおよび抗体
仲介病理学、例えば、ITCP、重症筋無力症およびその他、腎疾患、間接的T細胞
免疫応答、移植片拒絶反応、移植片対宿主疾患の研究および治療のために、リガ
ンドおよびレセプターが有用であることを示唆する。
【０１５１】 ztnf4はB細胞を活動性し、B細胞を増殖させ、抗体を産生させ、in vitroにお
いて活動性マーカーをアップレギュレートすることが示された（下記実施例参照
）。これらの作用は、IL−4または他のサイトカインを介する共刺激あるいはB細
胞抗原レセプターまたはB細胞を活性化する他の細胞表面レセプター、すなわち
、CD40による刺激に必要である。他の腫瘍壊死因子のリガンド、例えば、gp39お
よびTNFβはまたB細胞増殖を刺激する。こうして、本発明のポリペプチドをター
ゲッティングしてB細胞の応答を特異的に調節し、他の細胞集団に影響を与えな
いで免疫応答の間に、活性化されたB細胞を阻害することができ、これは疾患の
治療において好都合である。
【０１５２】 さらに、本発明のポリペプチドはB細胞の発生、他の細胞の発生、抗体産生お
よびサイトカイン産生をモジュレートするために使用することができる。また、
BR43x2ポリペプチドはアポトーシスおよび／または細胞内のアネルギーを誘導す
るとき使用することができる。本発明のポリペプチドは、また、ztnf4の増殖作
用を中和することによってT細胞およびB細胞をモジュレートすることができる。
可溶性BR43x2、TACIおよび／またはBCMAの存在下にztnf4に対する細胞の応答を
測定するために、バイオアッセイおよびELISAを利用することができる。
【０１５３】 他のアッセイは、細胞応答の測度としてサイトカイン産生の変化を測定するア
ッセイを包含する（例えば、下記の文献を参照のこと：Current Protocols in
Imunology、John E. Coligan他、編、NIH、1996）。他の細胞応答、例えば
、抗体イソ型、単球の活性化、NK細胞の形成、抗原提示細胞の機能、アポトーシ
スを測定するアッセイ。
【０１５４】 本発明のBR43x2ポリペプチドは、ztnf4の作用を中和して、前B細胞またはB細
胞白血病、例えば、形質細胞白血病、慢性または急性リンパ球白血病、骨髄腫、
例えば、多発性骨髄腫、プラスマ細胞腫、内皮骨髄腫および巨細胞骨髄腫；およ
びリンパ腫、例えば、非ホジキンリンパ腫（ztnf4ポリペプチドの増加が関連づ
けられる）の治療に有効であろう。可溶性BR43x2は腫瘍の進行および生き残りを
阻害するための療法的養生法において有用な成分であろう。
【０１５５】 ノザンブロット分析において、ztnf4はCD8+細胞、単球、樹枝状細胞、活性化
単球において発現されることが示された。これが示唆するように、ある自己免疫
疾患において、細胞障害性T細胞はztnf4の過剰産生を通してB細胞の産生を刺激
する。Bリンパ球の作用を選択的にブロックする免疫抑制タンパク質は、疾患の
治療において使用される。自己抗体の産生はいくつかの自己免疫疾患に対して普
通であり、疾患の組織分布および悪化に寄与する。また、自己抗体は免疫複合沈
着合併症に導き、腎不全、神経痛性症候および死を包含する、全身性エリテマト
ーデスの多数の症候に導く。細胞応答に対して独立である抗体のモジュレーショ
ンは、また、多数の疾患の状態において有益であろう。
【０１５６】 また、B細胞は慢性関節リウマチにおける関節炎発生性免疫グロブリンの分泌
においてある役割を演ずる（Korganow他、Immunity 10：451−61、1999）。そ
れ自体、ztnf4抗体産生の阻害は自己免疫疾患、例えば、重症筋無力症および慢
性関節リウマチの治療において有益であろう。免疫抑制治療剤、例えば、Bリン
パ球の活性を選択的にブロックまたは中和する可溶性BR43x2はこのような目的に
有効であろう。本発明のBR43x2可溶性レセプターポリペプチドにおけるこれらの
能力を確認するために、このようなBR43x2ポリペプチドはこの分野において知ら
れておりかつ本明細書に記載するアッセイを使用して評価される。
【０１５７】 本発明は、自己免疫疾患に関連するか、あるいは関連しない、末期腎疾患に関
連するB細胞の作用を選択的にブロックまたは中和するために、BR43x2、TACIま
たはBCMAポリペプチド、融合物、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストを使用
する方法を提供する。このような方法は、また、免疫学的腎疾患の治療のために
有用である。このような方法は、下記のような疾患に関連する糸球体腎炎の治療
に有用であろう：膜性腎症、IgA腎症またはベルガー病、IgM腎症、グッドパスチ
ャー病、感染後糸球体腎炎、脈管増殖性疾患、微少変化ネフローゼ症候群。
【０１５８】 このような方法は、また、狼瘡、多発性関節炎、ヘノッホ・シェーンライン、
硬皮症、HIV関係疾患、アミロイドーシスまたは溶血尿毒症症候群のような疾患
に関連する二次的糸球体腎炎または脈管炎を治療するための療法上の応用として
働くであろう。本発明の方法は、また、慢性腎盂腎炎、鎮痛剤乱用、腎石灰症、
他の薬剤により引き起こされる腎症、腎石症、または慢性もしくは急性間質性腎
炎に関連する間質性腎炎または腎盂腎炎を治療する療法的応用の一部分として有
用であろう。
【０１５９】 本発明の方法は、また、腎臓動脈狭窄または閉塞およびコレステロール性塞栓
症または腎臓塞栓症を包含する、高血圧性または大きい血管の疾患の治療におけ
るBR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチド、融合物、抗体、アゴニストまたはアン
タゴニストの使用を包含する。 本発明は、また、腎臓または泌尿器科の新形成、多発性骨髄腫、リンパ腫、軽
鎖神経疾患またはアミロイドーシスを診断または治療する方法を提供する。 本発明は、また、ぜん息および他の慢性気道疾患、例えば、気管支炎および気
腫を治療するためにBR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチド、融合物、抗体、アゴ
ニストまたはアンタゴニストを使用して活性化B細胞をブロックまたは阻害する
方法を提供する。
【０１６０】 また、免疫抑制において使用するために、特に移植片対宿主疾患および移植片
拒絶反応のために療法的に使用するために、BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチ
ド、融合物、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストを使用してエフェクターT
細胞の応答を阻害または中和する方法が提供される。追加の使用は、免疫応答、
特にリンパ球の活性化または調節において見出されるであろう。
【０１６１】 BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチド、融合物、抗体、アゴニストまたはアン
タゴニストは、免疫欠損症を治療する療法において有用であろう。BR43x2、TACI
またはBCMAポリペプチド、融合物、抗体、アゴニストまたはアンタゴニストは、
インスリン依存性真性糖尿病（IDDM）および膠原病のような自己免疫疾患を治療
する療法的プロトコルにおいて有用であろう。本発明の方法は、慢性炎症性疾患
の治療、特に関節痛、腫脹、貧血および他の関連する症候を軽減するためになら
びに敗血性ショックを治療するために追加の療法上の価値を有するであろう。
【０１６２】 抗原で免疫化した動物に本発明のポリペプチドを投与し、次いでztnf4を注射
し、この分野において知られている方法に従い遅延型過敏性およびin vitro増
殖およびサイトカイン産生を包含する、抗体アイソタイプの産生およびB細胞お
よびT細胞の応答を測定することによって、免疫応答に対する可溶性BR43x2、TAC
IまたはBCMAポリペプチドの作用を測定することができる。
【０１６３】 したがって、本発明は、ある量の化合物を哺乳動物に投与することを含んでな
る哺乳動物におけるztnf4活性を阻害する方法を提供し、前記化合物は a）配列番号4のポリペプチド； b）配列番号8のポリペプチド； c）融合タンパク質； d）配列番号6のアミノ酸残基1〜残基166のポリペプチド； e）配列番号8のアミノ酸残基1〜残基150のポリペプチド； f）配列番号4のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメント
；および g）配列番号10のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメン
ト； から成る群から選択される。
【０１６４】 融合タンパク質の例は、可溶性BR43x2（配列番号4）、TACI（配列番号6のアミ
ノ酸残基1〜残基166）またはBCMA（配列番号8のアミノ酸残基1〜残基150）と他
のポリペプチド、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域Fcフラグメントとの融
合物を包含する。本発明は、BR43x2、TACIまたはBCMAレセプター−リガンドの結
合を阻害する方法を提供する。
【０１６５】 このような方法は、ztnf4活性が活性化Bリンパ球に関連する場合、前B細胞ま
たはB細胞の癌を治療するために特に有用であろう。このような方法は、また、z
tnf4活性が抗体産生、特に、自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデス、
重症筋無力症または慢性関節リウマチに関連する抗体産生に関連する場合におい
て有用であろう。
【０１６６】 本発明は、また、BR43x2のアゴニストおよびアンタゴニストを提供する。BR43
x2アゴニストとして同定される化合物は、in vitroおよびin vivoにおけるタ
ーゲット細胞の増殖および発生を変更するために有用である。例えば、アゴニス
ト化合物は、単独でまたは他のサイトカインおよびホルモンと組み合わせて、規
定された細胞培地の化合物として有用である。こうして、培養におけるBR43x2を
支持するBリンパ球細胞の成長および／または発生を特異的に変更するとき、ア
ゴニストは有用である。アゴニストおよびアンタゴニストは、また、Bリンパ球
のエフェクター機能、特にBリンパ球の活性化および分化の研究において有用で
あることを証明することができる。アンタゴニストはリガンド−レセプターの相
互作用のための研究試薬として有用である。
【０１６７】 BR43x2アンタゴニストとして同定された化合物は、また、体液性免疫応答を促
進するために有用である。B細胞の応答は、細菌、ウイルス、原生動物および寄
生生物の感染を包含する感染症を戦うとき重要である。感染性微生物に対する抗
体は、抗原に結合させ、次いで補体仲介溶解または細胞仲介攻撃により病原体を
固定化することができる。BR43x2アンタゴニストは体液性応答を増強する働きを
し、そして感染症の危険にある個体のために有効な治療剤であるか、あるいはワ
クチン接種に対する補助物質として有効であろう。
【０１６８】 本発明は、また、BR43x2ポリペプチドに結合するか、あるいはBR43x2ポリペプ
チドが結合するリガンドに結合し、これによりBR43x2の機能を阻害または排除す
る、アンタゴニストを提供する。このようなBR43x2アンタゴニストは、抗体；BR
43x2ポリペプチドまたはそのリガンドに結合するオリゴヌクレオチド；レセプタ
ーに結合する能力を保持するが、リガンドまたはレセプターのシグナリングを生
じない、BR43x2リガンドの天然または合成のアナローグを包含する。このような
アナローグはペプチドまたはペプチド様化合物であることができる。BR43x2ポリ
ペプチドに結合しかつシグナリングを妨害する天然または合成の小さい分子は、
また、アンタゴニストとして考えられる。
【０１６９】 それ自体、BR43x2アンタゴニストは、BR43x2レセプターまたはリガンドからの
ブロッキングシグナルが有益である、ある種の疾患を治療する治療剤として有用
であろう。アンタゴニストは、リガンド−レセプターの相互作用を特性決定する
研究試薬として有用である。BR43x2は、EBV誘導および自発的バーキットリンパ
腫およびいくつかのB細胞骨髄腫を包含する形質転換されたB細胞系統上で発現さ
れる。BR43x2機能の阻害は、B細胞リンパ腫または多発性骨髄腫の治療において
有用であろう。BR43x2アンタゴニスト、例えば、BR43x2可溶性レセプターまたは
抗体は、腫瘍の進行を仲介するために治療的に使用することができるであろう。
【０１７０】 アゴニストおよびアンタゴニストの活性は、レセプター／リガンドの結合の効
力を測定する活性アッセイにより測定することができる。NfKB、NFAT−1およびA
P−1のためのリポーター遺伝子構築物を高いレベルで共発現する、安定にトラン
スフェクトされたB細胞系統、例えば、Baf3（ネズミ前B細胞系統、Palaciosおよ
びSteinmetzy、前掲、およびMathey−Prevot他、前掲）がつくられ、これらはBR
43x2を発現する。また、TACIおよびBCMAを発現する細胞系統は、同様な方法によ
り、Jurkatおよび他のBリンパ腫細胞系統において調製された。ztnf4はこれらの
構築物においてリポーター遺伝子を通してシグナリングすることが見出された。
可溶性BR43x2および抗体を使用して、結合を測定することができる。
【０１７１】 本発明のタンパク質をアッセイするin vivoアプローチは、ウイルスデリバリ
ー系を包含する。この目的のために典型的なウイルスは、アデノウイルス、ヘル
ペスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノ関連ウイルス（AAV）を包含す
る。二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスは、異種核酸のデリバリーのため
の、現在最良の研究されている遺伝子転移ベクターである（概観については下記
の文献を参照のこと：Becker他、Mol. Cell. Biol. 43：161−89、1994；お
よびDouglasおよびCuriel、Science and Medicine 4：44−53、1997）。
【０１７２】 アデノウイルスはいくつかの利点を提供する：アデノウイルスは（i）比較的
大きいインサート収容することができる；（ii）高い力価に成長することができ
る；（iii）広い範囲の哺乳動物細胞型を感染することができる；そして（iv）
多数の異なるプロモーターを含有する入手可能なベクターとともに使用すること
ができる。また、アデノウイルスは血流中で安定であるので、静脈内注射により
投与することができる。
【０１７３】 アデノウイルスゲノムの一部分を欠失することによって、異種DNAの大きい（7
kbまでの）インサートを収容することができる。これらのインサートは直接的結
合によりまたは共トランスフェクトされたプラスミドとの相同的組換えによりウ
イルスDNAの中に組込むことができる。典型的な系において、必須E1遺伝子をウ
イルスベクターから欠失されており、そしてE1遺伝子が宿主細胞（ヒト293細胞
系統が典型的である）により提供されないかぎり、ウイルスは複製しないであろ
う。
【０１７４】 無傷の動物に静脈内投与されるとき、アデノウイルスは主として肝臓をターゲ
ットとする。アデノウイルスデリバリー系がE1遺伝子欠失を有する場合、ウイル
スは宿主細胞中の複製することができない。しかしながら、宿主組織（例えば、
肝臓）は異種タンパク質を発現し、プロセシングする（そして、シグナル配列が
存在する場合、分泌する）であろう。分泌されたタンパク質は高度に脈管化した
肝臓中の循環の中に入り、そして感染した動物に対する作用を測定することがで
きる。
【０１７５】 また、in vitroタンパク質産生のためにアデノウイルス系を使用することが
できる。細胞が急速に分裂しない条件下にアデノウイルス感染した非293細胞を
培養することによって、細胞は延長時間の間タンパク質を産生することができる
。例えば、BHK細胞を細胞ファクトリー中でコンフルエンスに成長させ、次いで
問題の分泌されたタンパク質をコードするアデノウイルスベクターに暴露させる
。次いで細胞を無血清条件下に成長させ、この条件下に感染した細胞は有意な細
胞分裂なしに数週間生存することができる。
【０１７６】 あるいは、アデノウイルスベクターが感染した293S細胞は比較的高い細胞密度
において懸濁培養において成長して、有意な量のタンパク質を産生することがで
きる（Garnier他、Cytotechnol. 15：145−55、1994参照）。いずれのプロトコ
ルを使用しても、発現され、分泌された組織学的タンパク質は細胞培養上清から
反復して単離することができる。感染した293S細胞産生プロトコルにおいて、分
泌しないタンパク質をまた効果的に得ることができる。
【０１７７】 ある種の疾患の状態において本発明の可溶性BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプ
チドのin vivo効能を試験するために、よく確立された動物モデルは入手可能で
ある。特に、多数の自己免疫疾患の動物モデル、例えば、SLE（全身性エリテマ
トーデス）のモデルとして働くMRL−lpr／lprまたはNZB×NZW F1コンジェニッ
クマウス系統において、可溶性BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドおよびポリ
ペプチドフラグメントを試験することができる。このような動物モデルはこの分
野において知られている、例えば、下記の文献を参照のこと：Autoimmune Dise ase Models A Guidebook、CohenおよびMiller、編、Academic Press。
【０１７８】 ニュージーランドブラック（NZB）マウスとニュージーランドホワイト（NZW）
マウスとの間の交雑の子孫は、ヒトにおけるSLEに密接に類似する自発的形態のS
LEを発生する。NZBWとして知られている子孫のマウスは1月齢においてT細胞に対
するIgM自己抗体を発生し始め、5〜7月齢までに、Ig抗DNA自己抗体は優性免疫グ
ロブリンである。ポリクローナルB細胞機能亢進は自己抗体の過剰産生に導く。
これらの自己抗体、特に一本鎖DNAに対して向けられた自己抗体は、タンパク尿
、窒素血症、および腎不全からの死として臨床的に発現する、糸球体腎炎の発生
に関係づけられる。
【０１７９】 腎不全は自発的SLEの影響を受けたマウスおよびNZBWにおける死の主要な原因
であり、このプロセスは慢性でありかつ遮断性である。この疾患は雄よりも雌に
おいていっそう急速でありかつ重く、平均の生存期間は雄について406日に比較
してわずかに245日である。雌マウスの多くは7〜9月齢までに症候性（タンパク
尿）であるが、あるものは症候を発生するとき非常に若いか、あるいは老いてい
ることがある。
【０１８０】 NZBWマウスにおいて見れられる致死的免疫腎炎はヒトSLEにおいて見られる糸
球体腎炎に非常に類似し、この自発的ネズミモデルを潜在的SLE療法の試験のた
めに非常に魅力的とする（PuttermanおよびNaparstek、Murine Models of Sp ontaneous Systemic Lupus Erythematousus 、Autoimmune Desease Models
：A Guidebook、chapter 14、pp. 217−34、1994；Mohan他、J. Immunol. 1 54 ：1470−80、1995；およびDaikh他、J. Immunol. 159：3104−08、1997）。
症候の改善および疾患の過程の変更に対するTACI、BR43x2またはBCMAの効能を評
価するために、これらのマウスに可溶性TACI−IG、BR43x2−Ig、BCMA−Igまたは
他の可溶性および融合タンパク質を投与することは実施例の節において後述され
る。
【０１８１】 実験的アレルギー性脳脊髄炎（EAE）のためのマウスモデルは、免疫仲介疾患
のメカニズム、および潜在的療法上の関与の両方を研究するために道具として使
用されてきている。このモデルはヒト多発性硬化症に類似し、神経タンパク質、
例えば、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）またはプロテオリピドタンパク質（P
LP）へのT細胞の活性化の結果として脱髄を産生する。抗原の接種はCD4＋、クラ
スII MHC−制限T細胞（Th1）の誘導に導く。
【０１８２】 EAEのプロトコルの変化は、モデルの急性、慢性−回帰性、または受動−転移
変異型を産生することができる（Weihberg他、J. Immunol. 162：1818−26，19
99；Mijaba他、Cell Immunol. 186：94−102、1999；およびGlabinski、Meth. Enzym. 288：182−90、1997）。症候の改善および疾患の過程の変更に対する
TACI、BR43x2またはBCMAの効能を評価するために、これらのマウスに可溶性TACI
−IG、BR43x2−Ig、BCMA−Igまたは他の可溶性および融合タンパク質を投与する
ことは実施例の節において後述される。
【０１８３】 コラーゲン誘導関節炎（CIA）モデルにおいて、マウスはヒト慢性関節リウマ
チ（RA）に密接に類似する慢性炎症性関節炎を発生する。CIAはRAと同様な免疫
学的および病理学的特徴を共有するので、CIAは潜在的ヒト抗炎症化合物をスク
リーニングするための理想的モデルである。CIAモデルを使用する他の利点は、
病原性のメカニズムが知られていることである。
【０１８４】 II型コラーゲン上のT細胞およびB細胞エピトープが同定され、免疫仲介関節炎
に関係する種々の免疫学的（遅延型過敏性および抗コラーゲン抗体）および炎症
性（サイトカイン、ケモカイン、およびマトリックス分解酵素）のパラメーター
が決定され、モデルにおける被験化合物の効能を評価するために使用することが
できる（Wooley、Curr. Opin. Rheum. 3：407−20、1999；Williams他、Immu nology 89：9784−788、1992；Myers他、Life Sci. 61：1861−78、1997；お
よびWang他、Immunology 92：8955−959、1995）。症候の改善および疾患の過
程の変更に対するTACI、BR43x2またはBCMAの効能を評価するために、これらのマ
ウスに可溶性TACI−IG、BR43x2−Ig、BCMA−Igまたは他の可溶性および融合タン
パク質を投与することは実施例の節において後述される。
【０１８５】 マウスにオバルブミンを注射し、そしてぜん息に類似する気管支におけるぜん
息性応答を産生する抗原でマウス経鼻的で再刺激するとき、気管支の感染、例え
ば、ぜん息のためにモデルをつくることができる。症候の改善および疾患の過程
の変更に対するTACI、BR43x2またはBCMAの効能を評価するために、これらのマウ
スに可溶性TACI−IG、BR43x2−Ig、BCMA−Igまたは他の可溶性および融合タンパ
ク質を投与することは実施例の節において後述される。 in vivoモデルについての他の使用は、動物に対する抗原チャレンジのデリバ
リーおよび引き続く可溶性BR43x2（TACI）またはそのリガンドの投与およびT細
胞およびB細胞の応答の測定を包含する。
【０１８６】 T細胞依存的およびT細胞独立的免疫応答は、Perez−Melgosa他、J. Immunol.
163：1123−7、1999に記載されているように、測定することができる。 正規の抗原チャレンジ（例えば、オバルブミンまたはコラーゲン）に対して暴
露される動物における免疫応答および引き続くBR43x2、TACIまたはBCMAポリペプ
チドまたは可溶性Ig−融合物の投与を実施して、B細胞の応答に対する作用を測
定することができる。
【０１８７】 薬物速度論の研究を放射能標識化、可溶性BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチ
ドまたは融合物に関連して使用して、このようなポリペプチドのin vivoの分布
および半減期を測定することができる。さらに、in vivoにおける腫瘍および腫
瘍発生に対する可溶性BR43x2、TACIまたはBCMAの作用を測定するために、動物モ
デルを使用することができる。 また、自己免疫疾患、腎疾患、B細胞およびT細胞の疾患のための代理マーカー
としてBR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドを使用することが提供される。この
ような患者から採血し、血液中のBR43x2、TACIまたはBCMA可溶性レセプターおよ
びそれらのリガンドを検出することができる。
【０１８８】 本発明は、また、抗体を提供する。例えば、問題のポリペプチド、または天然
源から単離されたポリペプチドを含有する発現ベクターの産物を抗原として使用
して、BR43x2または配列番号8のアミノ酸配列を有するペプチドに対する抗体を
得ることができる。特に有効な抗体は、BR43x2または配列番号10のアミノ酸配列
を有するペプチドに「特異的に結合する」。抗体が10６／Mまたはそれより大き
い、好ましくは10７／Mまたはそれより大きい、より好ましくは10８／Mまたはそ
れより大きい、最も好ましくは10９／Mまたはそれより大きい結合アフィニティ
ー（Ka）でBR43x2ポリペプチドまたは配列番号8のポリペプチド、ペプチドまた
はエピトープに結合する場合、抗体はBR43x2または配列番号10のアミノ酸配列を
有するペプチドに「特異的に結合する」。
【０１８９】 抗体の結合アフィニティーは、例えば、スキャッチャード分析（Scatchard、A nn. NY Acad. Sci. 51：660、1949）により、容易に決定することができる
。適当な抗体は、BR43x2、特にBR43x2の細胞外ドメイン（配列番号2のアミノ酸
残基1〜120）に結合する抗体および配列番号10のアミノ酸配列を有するペプチド
に結合する抗体を包含する。
【０１９０】 抗原性BR43x2エピトープ支持ペプチドおよびポリペプチドを使用して、抗BR43
x2抗体を製造することができる。本発明の抗原性エピトープ支持ペプチドおよび
ポリペプチドは、配列番号2内の少なくとも9、好ましくは15〜約30アミノ酸の配
列を含有する。しかしながら、本発明のアミノ酸配列のより大きい部分を含んで
なり、30〜50アミノ酸、または本発明のポリペプチドのアミノ酸配列の全体まで
の任意の長さのアミノ酸を含有する、ペプチドまたはポリペプチドは、また、BR
43x2に結合する抗体を誘導するために有効である。
【０１９１】 水性溶媒中の実質的な溶解度を提供するようにエピトープ支持ペプチドのアミ
ノ酸配列を選択することが望ましい（すなわち、配列は比較的親水性の残基を含
むが、疎水性残基を回避することが好ましい）。親水性ペプチドは疎水性プロッ
トから予測することができる、例えば、下記の文献を参照のこと：HoppおよびWo
ods、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 78：3824−8、1981およびKyteおよびDoo
little、J. Mol. Biol. 157：105−142、1982。そのうえ、プロリン残基を含
有するアミノ酸配列は、また、抗体産生に望ましいことがある。
【０１９２】 組換えBR43x2タンパク質または天然源から単離されたBR43x2に対するポリクロ
ーナル抗体は、この分野においてよく知られている方法を使用して製造すること
ができる。例えば、下記の文献を参照のこと：Green他、“Production of Pol
yclonal Antsera，”in Immunochemical Protocols（Manson、編）、pp. 1
−5（Humana Press 1992）、およびWilliams他、“Expression of foreign
proteins in E. coli using plasmid vectors and purification of
specific polyclonal antibodies，”in DNA Cloning 2：Expression S ystems 、第2版、Glover他（編）、p. 15（Oxford University Press 1995）
。
【０１９３】 アジュバント、例えば、明礬（水酸化アルミニウム）またはフロインド完全ア
ジュバントまたはフロインド不完全アジュバントを使用して、BR43x2ポリペプチ
ドの免疫原性を増加することができる。免疫化に有効なポリペプチドは、また、
融合ポリペプチド、例えば、BR43x2またはその一部分と免疫グロブリンまたはマ
ルトース結合性タンパク質との融合物を包含する。ポリペプチド免疫原は全長の
分子またはその一部分であることができる。ポリペプチドの一部分が「ハプテン
様」である場合、このような一部分は免疫化のために好都合には高分子担体（例
えば、キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（BSA）
または破傷風トキソイド）に結合または連鎖することができる。
【０１９４】 ポリクローナル抗体は典型的には動物、例えば、ウマ、雌牛、イヌ、ニワトリ
、割合、マウス、ウサギ、ハムスター、モルモット、ヤギまたはヒツジ中で発生
させるが、本発明の抗BR43x2抗体は類人猿の抗体に由来することができる。ヒヒ
において診断的、療法的に有効な抗体を発生させる一般的技術は、例えば、下記
の文献に記載されている：Goldenberg、国際特許公開No.WO 91／11465、および
Losman他、Int. J. Cancer 46：310、1990。また、抗体はトランスジェニッ
ク動物、例えば、トランスジェニックヒツジ、雌牛、ヤギまたはブタにおいて発
生させることができ、そして酵母および真菌中の修飾された形態でならびに哺乳
動物細胞および昆虫細胞中で発現させることができる。
【０１９５】 あるいは、モノクローナル抗BR43x2抗体を発生させることができる。特異的抗
原に対する齧歯類モノクローナル抗体は、この分野において知られている方法に
より得ることができる（例えば、下記の文献を参照のこと：Kohler他、Nature 256 ：495、1975；Coligan他（編）、Current Protocols in Imunology、Vol.
1、pp. 2.5.1−2,6,7（John Wiley & Sons 1991）；Picksley他、“Prod
uction of monoclonal antibodies against proteins expressed in E.
coli，”in DNA Cloning：Expression Systems、第2版、Glover他（編）、
p. 63（Oxford University Press 1995））。
【０１９６】 簡単に述べると、モノクローナル抗体は次のようにして得ることができる。BR
43x2遺伝子産物を含んでなる組成物をマウスに注射し、血清試料を取出すことに
よって抗体産生を確認し、脾臓を取出してBリンパ球を獲得し、Bリンパ球を骨髄
腫細胞と融合してハイブリドーマを産生し、ハイブリドーマをクローニングし、
抗原に対する抗体を産生する陽性クローンを選択し、抗原に対する抗体を産生す
るクローンを培養し、そしてハイブリドーマ培養物から抗体を単離する。
【０１９７】 さらに、本発明の抗BR43x2抗体はヒトモノクローナル抗体に由来することがで
きる。抗原チャレンジに応答して特異的ヒト抗体を産生するように操作されたト
ランスジェニックマウスから、ヒトモノクローナル抗体は得られる。この技術に
おいて、内因的重鎖および軽鎖遺伝子座のターゲッテッド崩壊を含有する胚幹細
胞系統に由来したマウスの中に、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子座の因子を導入する
。トランスジェニックマウスはヒト抗原に対して特異的なヒト抗体を合成するこ
とができ、そしてこのマウスを使用してヒト抗体分泌ハイブリドーマを産生する
ことができる。トランスジェニックマウスからヒト抗体を得る方法は、例えば、
下記の文献に記載されている：Green他、Nat. Genet. 7：13、1994；Lonberg
他、Nature 368：856、1994；およびTaylor他、Int. Immun. 6：579、1994。
【０１９８】 種々のよく確立された技術により、モノクローナル抗体をハイブリドーマ培養
物から単離し、精製することができる。このような単離技術は、プロテインAセ
ファローズを使用するアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマト
グラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーを包含する（例えば、下記の
文献を参照のこと：Coligen、pp. 2.7.1−2.7.12およびpp. 2.9.1−2.9.3；Ba
ines他、“Purification of Immunoglobulin G（IgG），”in Methods in
Molecular Biology、Vol. 10、pp. 79−104（The Humana Press，Inc.
1992））。
【０１９９】 特定の用途に、抗BR43x2抗体のフラグメントを製造することが望ましい。この
ような抗体フラグメントは、例えば、抗体のタンパク質分解的加水分解により、
得ることができる。抗体フラグメントは、慣用法に従い全抗体のペプシンまたは
パパイン消化により得ることができる。例示として、抗体をペプシンで酵素的に
消化してF（ab）'２と表示する5Sフラグメントを形成することによって、抗体フ
ラグメントを製造することができる。チオール還元剤を使用して、このフラグメ
ントをさらに切断して、3.5SFab'1価フラグメントを産生することができる。
【０２００】 必要に応じて、ジサルファイド結合の切断から生ずるスルフヒドリル基のブロ
ッキング基を使用して、切断反応を実施することができる。別法として、ペプシ
ンを使用する酵素的切断は2つの1価FabフラグメントおよびFcフラグメントを直
接的に産生する。これらの方法は、例えば、下記の文献に記載されている：Gold
enberg、米国特許第4,331,647号；Nisonoff他、Arch. Biochem. Biophys. 89 ：230、1960；Porter、Biochem. J. 73：119、1959；Edelman他、in Methods in Enzymology 、Vol. 1、p. 422（Academic Press 1967）；およびColig
an、前掲。
【０２０１】 フラグメントが無傷の抗体により認識される抗原に結合するかぎり、抗体を切
断する他の方法、例えば、重鎖を分離して1価の軽−重鎖フラグメントを形成す
る方法、フラグメントをさらに切断する方法、または他の酵素的、化学的または
遺伝学的技術を使用することもできる。 例えば、FvフラグメントはVＨおよびVＬ鎖のアソシエーションを含んでなる。
下記の文献に記載されているように、このアソシエーションは非共有結合である
ことができる：Inbar他、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69：2659、1972。あ
るいは、可変鎖は細胞間ジサルファイド結合により結合するか、あるいは化学物
質、例えば、グルタルアルデヒドにより架橋することができる（例えば、下記の
文献を参照のこと：Sandhu、Crit. Rev. Biotch. 12：437、1992）。
【０２０２】 Fvフラグメントは、ペプチドリンカーにより接続されたVＨおよびVＬ鎖を含ん
でなることができる。オリゴヌクレオチドにより接続されたVＨおよびVＬドメイ
ンをコードするDNA配列を含んでなる構造的遺伝子を構築することによって、こ
れらの一本鎖抗原結合性タンパク質（scFv）は製造される。構造遺伝子を発現ベ
クターの中に挿入し、次いで発現ベクターを宿主細胞、例えば、大腸菌（E. co
li）の中に導入する。これらの組換え宿主細胞は、2つのVドメインを架橋するリ
ンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。scFvを産生する方法
は、例えば、下記の文献に記載されている：Whitlow他、Methods：A Companion to Methods in Enzymology 2：97、1991；また、Bird他、Science 242：
423、1988；Ladner他、米国特許第4,946,778号；Pack他、Bio／Technology 11
：1271、1993；およびSandhu、前掲。
【０２０３】 例示として、リンパ球をin vitroにおいてBR43x2ポリペプチドに暴露し、フ
ァージまたは同様なベクター中の抗体表示ライブラリーを選択することによって
、scFvを得ることができる（例えば、固定化または標識化BR43x2タンパク質また
はペプチドを使用する）。潜在的BR43x2ポリペプチド結合性ドメインを有するペ
プチドをコードする遺伝子は、ファージ上で（ファージ表示）または細菌、例え
ば、大腸菌（E. coli）上で表示されたランダムペプチドライブラリーをスクリ
ーニングすることによって得ることができる。
【０２０４】 ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、多数の方法、例えば、ランダ
ム突然変異誘発およびランダムポリヌクレオチド合成により得ることができる。
これらのランダムペプチド表示ライブラリーを使用して、既知のターゲットと相
互作用するペプチドについてスクリーニングすることができる。このターゲット
はタンパク質またはポリペプチド、例えば、リガンドまたはレセプター、生物学
的または合成的高分子、または有機または無機の物質であることができる。
【０２０５】 このようなランダムペプチド表示ライブラリーをつくりかつスクリーニングす
る技術はこの分野において知られている（Ladner他、米国特許第5,223,409号、L
adner他、米国特許第4,946,778号、Ladner他、米国特許第5,403,484号、Ladner
他、米国特許第5,571,698号、およびKay他、Phage Display of Peptides an d Poteins （Academic Press，Inc. 1996）そしてランダムペプチド表示ライ
ブラリーおよびこのようなライブラリーをスクリーニングするキットは、例えば
、Clontech（カリフォルニア州パロアルト）、Invitrogen Inc.（カリフォルニ
ア州サンディエゴ）、New England Biolabs，Inc.（マサチュセッツ州ベバー
リイ）、およびPharmacia LKB Biotechnology Inc.（ニュージャージイ州ピ
スカタウェイ）から商業的に入手可能である。本明細書に開示するBR43x2配列を
使用して、ランダムペプチド表示ライブラリーをスクリーニングして、BR43x2に
結合するタンパク質を同定することができる。
【０２０６】 抗体フラグメントの他の形態は、単一の相補性決定領域（CDR）をコードする
ペプチドである。問題の抗体のCDRをコードする遺伝子を構築することによって
、CDRペプチド（「最小認識単位」）を得ることができる。このような遺伝子は
、例えば、抗体産生細胞のRNAから可変領域を合成するPCRにより製造される（例
えば、下記の文献を参照のこと：Larrick他、Methods：A Companion to Meth ods in Enzymology 2：106、1991）；Courtenay−Luck、“Genetic Manipul
ation of Monoclonal Antibodies，”in Monoclonal Antibodies：Product ion，Engineering and Clinical Application 、Ritter他、（編）、p. 166
（Cambridge University Press 1995）；およびWard他、“Genetic Manipul
ation and Expression of Antibodies，”in Monoclonal Antibodies：Pr inciples and Applications 、Birch他、（編）、p. 137（Wiley−Liss，Inc.
1995））。
【０２０７】 あるいは、抗BR43x2抗体は「ヒト化」モノクローナル抗体から誘導することが
できる。マウス相補的決定領域をマウス免疫グロブリンの重および軽可変鎖から
ヒト可変ドメインの中に転移することによって、ヒト化モノクローナル抗体を産
生する。次いでヒト抗体の典型的な残基を、ネズミ対応物のフレームワーク領域
において置換する。ヒトモノクローナル抗体に由来する抗体成分の使用は、ネズ
ミ定常領域の免疫原性に関連する潜在的問題を排除する。
【０２０８】 ネズミ免疫グロブリン可変領域をクローニングする一般的技術は、例えば、下
記の文献に記載されている：Orlandi他、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86：
3833、1989。ヒト化モノクローナル抗体を産生する技術は、例えば、下記の文献
に記載されている：Jones他、Nature 321：522、1986；Carter他、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89：4285、1992；Sandhu、Crit. Rev. Biotch. 12：43
7、1992；Singer他、J. Immun. 150：2844、1993；Sudhir（編）、Antibody E ngineering Protocols （Humana Press，Inc. 1995）；Kelley、“Engineerin
g Therapeutic Antibodies，”in Protein Engineering：Principles and
Practice、Cleland他（編）、pp. 399−434（John Wiley & Sons，Inc.
1996）；およびQueen他、米国特許第5,693,762号（1997）．xxx。
【０２０９】 ポリクローナル抗イディオタイプ抗体は、動物を抗BR43x2抗体または抗体フラ
グメントで標準的技術に従い免疫化することによって製造することができる。例
えば、下記の文献を参照のこと：Green他、“Production of Polyclonal Ant
isera，”in Methods In Molecular Biology：Immunochemical Protocols
、Manson（編）、pp. 1−12（Humana Press 1992）。また、Coligan、前掲、
pp. 2.4.1−2.4.7参照。
【０２１０】 あるいは、モノクローナル抗イディオタイプ抗体は、前述の技術に従い、免疫
原として抗BR43x2抗体または抗体フラグメントを使用して製造することができる
。別法として、ヒト化抗イディオタイプ抗体または類人猿抗イディオタイプ抗体
は前述の技術に従い製造することができる。抗イディオタイプ抗体を製造する方
法は、例えば、下記の文献に記載されている：Irie、米国特許第5,208,146号、G
reene他、米国特許第5,637,677号、およびVarthakaviおよびMinocha、J. Gen.
Virol. 77：1875、1996。
【０２１１】 本発明における抗体またはポリペプチドは、また、薬剤、トキシン、放射性核
種およびその他と直接的または間接的に複合化することができ、そしてこれらの
複合体はin vivoの診断または療法の応用において使用することができる。例え
ば、対応する抗相補的分子（例えば、それぞれ、レセプターまたは抗原）を発現
する組織または器官を同定または処置するために、本発明のポリペプチドまたは
抗体を使用することができる。さらに詳しくは、BR43x2ポリペプチドまたは抗BR
43x2抗体、またはそれらの生物活性フラグメントまたは部分を検出可能なまたは
細胞障害性分子にカップリングさせ、そして抗相補的分子を発現する細胞、組織
または器官を有する哺乳動物に送達することができる。
【０２１２】 適当な検出可能な分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間接的に結合
させることができ、そしてこのような分子は放射性核種、酵素、基質、コファク
ター、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子、およびその
他を包含する。適当な細胞障害分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間
接的に結合させることができ、そしてこのような分子は細菌または植物のトキシ
ン（例えば、ジフテリアトキシン、シュードモナス・エキソトキシン（Pseudomo
nas exotoxin）、リシン、アブリンおよびその他）、ならびに治療用放射性核
種、例えば、ヨウ素−131、レニウム−188またはイットリウム−90（ポリペプチ
ドまたは抗体に直接的に結合されているか、あるいは、例えば、キレート化部分
の手段により間接的に結合されている）を包含する。
【０２１３】 また、ポリペプチドまたは抗体を細胞障害性薬剤、例えば、アドリアマイシン
に結合させることができる。検出可能なまたは細胞障害性分子の間接的結合のた
めに、検出可能なまたは細胞障害性分子を補体／抗補体の対の1メンバーに結合
することができ、ここで他方のメンバーをポリペプチドまたは抗体の部分に結合
させる。これらの目的に対して、ビオチン／ストレプトアビジンは典型的な補体
／抗補体の対である。
【０２１４】 可溶性BR43x2ポリペプチドまたは抗体を薬剤、放射性核種およびその他に直接
的または間接的に複合化することができ、そしてこれらの複合体をin vivoの診
断または療法的応用に使用することができる。例えば、対応する抗相補的分子（
例えば、それぞれ、レセプターまたは抗原）を発現する組織または器官を同定ま
たは処置するために、本発明のポリペプチドまたは抗体を使用することができる
。さらに詳しくは、BR43x2ポリペプチドまたは抗BR43x2抗体、またはそれらの生
物活性フラグメントまたは部分を検出可能なまたは細胞障害性分子にカップリン
グさせ、そして抗相補的分子を発現する細胞、組織または器官を有する哺乳動物
に送達することができる。
【０２１５】 適当な検出可能な分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間接的に結合
させることができ、そしてこのような分子は放射性核種、酵素、基質、コファク
ター、インヒビター、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁気粒子、およびその
他を包含する。適当な細胞障害分子をポリペプチドまたは抗体に直接的または間
接的に結合させることができ、そしてこのような分子は細菌または植物のトキシ
ン（例えば、ジフテリアトキシン、シュードモナス・エキソトキシン（Pseudomo
nas exotoxin）、リシン、アブリンおよびその他）、ならびに治療用放射性核
種、例えば、ヨウ素−131、レニウム−188またはイットリウム−90（ポリペプチ
ドまたは抗体に直接的に結合されているか、あるいは、例えば、キレート化部分
の手段により間接的に結合されている）を包含する。
【０２１６】 また、ポリペプチドまたは抗体を細胞障害性薬剤、例えば、アドリアマイシン
に結合させることができる。検出可能なまたは細胞障害性分子の間接的結合のた
めに、検出可能なまたは細胞障害性分子を補体／抗補体の対の1メンバーに結合
することができ、ここで他方のメンバーをポリペプチドまたは抗体の部分に結合
させる。これらの目的に対して、ビオチン／ストレプトアビジンは典型的な補体
／抗補体の対である。
【０２１７】 このようなポリペプチド−トキシン融合タンパク質または抗体／フラグメント
−トキシン融合タンパク質は、ターゲッテッド細胞を組織の阻害または離解のた
めに使用することができる（例えば、癌細胞または組織を処理するために）。あ
るいは、ポリペプチドが多重機能のドメイン（すなわち、活性化ドメインまたは
リガンド結合性ドメイン、＋ターゲッティングドメイン）を有する場合、ターゲ
ッティングドメインのみを含む融合タンパク質は検出可能分子、細胞障害性分子
または相補的分子を問題の細胞または組織の型に向けるために適当であることが
ある。
【０２１８】 ドメインの融合タンパク質のみが相補的分子を含む場合、抗相補的分子を検出
可能なまたは細胞障害性分子に複合化することができる。こうして、このような
ドメイン−相補的分子の融合タンパク質は、一般的抗相補的−検出可能／細胞障
害性分子の複合体の細胞／組織−特異的デリバリーのための一般的ターゲッティ
ングベヒクルを表す。本明細書に記載する生物活性ポリペプチドまたは抗体複合
体は静脈内、動脈内または管内に送出すことができるか、あるいは意図する作用
部位に局所的に導入することができる。
【０２１９】 HisまたはFLAG（商標）標識化されている、可溶性BR43x2ポリペプチドに対し
て、抗体をつくることができる。また、大腸菌（E. coli）産生MBP−融合タン
パク質に対して、抗体を製造することができる。あるいは、このようなポリペプ
チドはヒトIgとの融合タンパク質を包含することができるであろう。特に、His
標識化、またはFLAG（商標）標識化可溶性BR43x2に対するポリペプチド抗体を含
有する抗血清を、ヒトまたは霊長類組織上の免疫組織化学によるBR43x2の組織分
布の分析において使用することができる。また、これらの可溶性BR43x2ポリペプ
チドを使用してマウスを免疫化して、可溶性ヒトBR43x2ポリペプチドに対してモ
ノクローナル抗体を産生することができる。
【０２２０】 可溶性ヒトBR43x2ポリペプチドに対するモノクローナル抗体をまた使用して、
リガンド／レセプターのカップリングを模擬して、リガンド／レセプター対を活
性化または不活性化することができる。例えば、架橋性抗可溶性CD40モノクロー
ナル抗体は、抗IgMまたはLPSで次善的に活性化されたB細胞系統に対する刺激シ
グナルを提供し、増殖および免疫グロブリンの産生を生ずることが証明された。
これらの同一モノクローナル抗体は、溶液中で使用するとき、レセプターの活性
化をブロックすることによって、アンタゴニストとして作用する。BR43x2に対す
るモノクローナル抗体を使用して、組織分布の研究により同定された特異的細胞
系統上の分布、調節および生物学的相互作用を決定することができる。
【０２２１】 本発明は、また、単離され、精製されたBR43x2、TACIおよびBCMAポリヌクレオ
チドのプローブまたはプライマーを提供する。このようなポリヌクレオチドのプ
ローブはRNAまたはDNAであることができる。DNAはcDNAまたはゲノムDNAであるこ
とができる。ポリヌクレオチドのプローブは一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNA
、一般に合成オリゴヌクレオチドであるが、クローニングしたcDNAまたはゲノム
配列から発生させることができ、一般に少なくとも16ヌクレオチド、よりしばし
ば17ヌクレオチド〜25またはそれより多いヌクレオチド、時には40〜60ヌクレオ
チド、ある場合においてBR43x2遺伝子またはcDNAの実質的な部分、ドメインまた
はさらに全体を含んでなるであろう。
【０２２２】 プローブおよびプライマーは一般に合成オリゴヌクレオチドであるが、クロー
ニングされたcDNAまたはゲノム配列またはその補体から発生させることができる
。分析用プローブは一般に少なくとも20ヌクレオチド長さであるが、多少短いプ
ローブ（14〜17ヌクレオチド）を使用することができる。PCRプライマーは少な
くとも5ヌクレオチド長さ、好ましくは15またはそれより多いヌクレオチド、よ
り好ましくは20〜30ヌクレオチドである。遺伝子を小さい領域を分析のためにタ
ーゲッティングするとき、短いポリヌクレオチドを使用することができる。遺伝
子全体の分析のために、ポリヌクレオチドのプローブは全体のエクソンまたはそ
れより多くを含んでなることができる。
【０２２３】 この分野においてよく知られている技術を使用して、プローブを、例えば、酵
素、ビオチン、放射性核種、蛍光体、化学発光体、常磁性プロトコルおよびその
他標識化して検出可能なシグナルを提供することができ、これらは多数の源、例
えば、Molecular Probes，Inc.、Eugene、OR、およびAmersham Corp.、イリノ
イ州アーリントンハイツ、から商業的に入手可能である。プローブを構築するた
めに好ましい領域は、リガンド結合性領域、システインに富んだ擬反復、シグナ
ル配列、およびその他を包含する。ポリヌクレオチドのプローブを発生させる技
術およびハイブリダイゼーション技術はこの分野において知られており、例えば
、下記の文献を参照のこと：Ausubel他、Current Protocols in Molecular Biology 、John Wiley and Sons，Inc.、NY、1991。
【０２２４】 BR43x2、TACIおよびBCMAポリペプチドおよび抗体を、診断系において使用して
、BR43x2、TACIおよびBCMAおよびBR43x2、TACIおよびBCMAリガンドポリペプチド
、例えば、ztnf4の存在を検出することができる。このような検出法から誘導さ
れる情報は種々の疾患におけるBR43x2ポリペプチドの意味の洞察を提供し、BR43
x2レベルの変更が有意である疾患の診断ツールとして働くであろう。BR43x2、TA
CIおよびBCMAレセプターポリペプチドのレベルの変更は、癌、自己免疫疾患およ
び感染症を包含する病理学的状態を示すことができる。
【０２２５】 基本的アッセイにおいて、一本鎖プローブ分子を生物学的試料から単離された
RNAと、プローブとターゲットBR43x2 TACIまたはBCMA RNA種との間の塩基対合
を促進する温度およびイオン強度の条件下に、インキュベートする。非結合プロ
ーブをハイブリダイゼーションした分子から分離した後、ハイブリッドの量を検
出する。
【０２２６】 RNA検出のよく確立されたハイブリダイゼーション法は、ノザン分析およびド
ット／スロットブロットハイブリダイゼーションを包含する（例えば、下記の文
献を参照のこと：Ausbel前掲およびWu他（編）、″Analysis of Gene Expres
sion at the RNA Level″、Methods in Gene Biotechnology、pp. 225
−239（CRC Press，Inc.、1997））。核酸プローブを放射性同位元素、例えば
、３２Pおよび３５Sで直接標識化することができる。あるいは、BR43x2 RNAを
非放射線的ハイブリダイゼーション法で検出することができる（例えば、下記の
文献を参照のこと：Isaac（編）、Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes 、Humana Press，Inc.、1993）。典型的には、非
放射線的検出は、色素形成または化学発光基質の酵素的変換により達成される。
例示的非放射性成分はビオチン、フルオレセイン、およびジゴキシゲニンを包含
する。
【０２２７】 BR43x2、TACI、およびBCMAオリゴヌクレオチドプローブは、また、in vivo診
断に有用である。例示として、１８F標識化オリゴヌクレオチドを被検体に投与
し、陽電子放射断層撮影法により可視化することができる（Tavitian他、Nature Medicine 4：467、1998）。
【０２２８】 多数の診断手順は、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を利用して検出方法の感度
を増加する。PCRを実施する標準技術はよく知られている（一般に、下記の文献
を参照のこと：Mathew（編）、Protocols in human Molecular Genetics（H
umana Press，Inc.、1991）、White（編）、PCR Protocols：Current Method s and Applications （Humana Press，Inc.、1993）、Cotter（編）、Molecul ar Diagnosis of Cancer （Humana Press，Inc.、1996）、HanausekおよびWa
laszek（編）、Tumor Marker Protocols（Humana Press，Inc.、1998）、Lo
（編）、Clinical Applications of PCR（Humana Press，Inc.、1998）、お
よびMeltzer（編）、PCR in Bioanalysis（Humana Press，Inc.、1998））。
特定のBR43x2ドメインまたはモチーフ、例えば、BR43x2、TACIまたはBCMAシステ
インに富んだ擬反復をコードする配列を増幅するために、PCRを設計することが
できる。
【０２２９】 診断アッセイのためのPCRの1つの変法は逆転写PCR（RT−PCR）である。RT−PC
R技術において、RNAを生物学的試料から単離し、cDNAに逆転写し、そしてcDNAを
BR43x2プライマーとインキュベートする（例えば、下記の文献を参照のこと：Wu
他（編）、″Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR″
、Methods in Gene Biotechnology、pp. 15−28（CRC Press，Inc.、1997
）。次いでPCRを実行し、産物を標準技術により分析する。
【０２３０】 例示として、RNAを生物学的試料から、例えば、前述のグアニジニウム−チオ
シアネート細胞溶解手順により単離する。あるいは、固相技術を使用して細胞ラ
イゼイトからmRNAを単離することができる。ランダムオリゴヌクレオチド、dTの
短いホモポリマー、またはBR43x2、TACIまたはBCMAアンチセンスオリゴマーを使
用して、逆転写反応を単離されたRNAでプライムすることができる。オリゴ−dT
プライマーは、対照ターゲット配列を提供できる、種々のmRNAヌクレオチド配列
が増幅されるという利点を提供する。典型的には20塩基長さである、2つのフラ
ンキングオリゴヌクレオチドプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応により
、BR43x2、TACIまたはBCMA配列を増幅する。
【０２３１】 種々のアプローチを使用して、PCR増幅生成物を検出することができる。例え
ば、PCR生成物ゲル電気泳動により分画し、臭化エチジウム染色により可視化す
ることができる。あるいは、分画したPCR生成物を膜に移し、検出可能に標識化
されたBR43x2プローブとハイブリダイゼーションさせ、オートラジオグラフィー
により検査することができる。追加の別のアプローチは、ジゴキシゲニン標識化
デオキシリボ核酸トリホスフェートを使用して化学発光を検出する方法、および
C−TRAK比色アッセイを包含する。
【０２３２】 他のアプローチは実時間定量的PCRである（Perkin−Elmer Cetus、コネチカ
ット州ノーウォーク）。結合したリポーターおよびクエンチャー色素の両方を有
するオリゴヌクレオチドから成る、蛍光発生プローブは、特異的に前方向プライ
マーと逆方向プライマーとの間をアニールする。TaqDNAポリメラーゼの5'エンド
ヌクレアーゼ活性を使用して、リポーター色素をクエンチャー色素から分離し、
配列特異的シグナルを発生させ、このシグナルは増幅が増加するにつれて増加す
る。PCR反応の間に、蛍光強度を連続的にモニターし、定量する。
【０２３３】 BR43x2、TACIまたはBCMAの発現を検出する他のアプローチはサイクリングプロ
ーブ技術（CPT）であり、ここで一本鎖DNAターゲットは過剰のDNA−RNA−DNAキ
メラプローブと結合して複合体を形成し、RNA部分をRNアーゼHで切断し、そして
切断されたキメラプローブの存在を検出する（例えば、下記の文献を参照のこと
：Beggs他、J. Clin. Microbiol. 34：2985、1996、Bekkaoui他、Biotechniq ues 20：240、1996）。BR43x2、TACIまたはBCMA配列を検出する別の方法は、核
酸配列をベースとする増幅（NASBA）、交差ハイブリダイゼーションにより鋳型
の共同増幅（CATCH）、およびリガーゼ連鎖反応（LCR）のようなアプローチを利
用することができる（例えば、下記の文献を参照のこと：Mrshall他、米国特許
第5,686,272号（1997）、Dyer他、J. Virol. Methods 60：161、1996；Ehric
ht他、Eur. J. Biochem. 243：358、1997およびChadwick他、J. Virol. Me thods 70：59、1998）。他の標準的方法はこの分野において知られている。
【０２３４】 また、BR43x2、TACIまたはBCMAプローブおよびプライマーを使用して、組織試
料におけるBR43x2、TACIまたはBCMA遺伝子の発現を検出し、位置決定することが
できる。このようなin situハイブリダイゼーションの方法は、この分野におい
てよく知られている（例えば、下記の文献を参照のこと：Choo（編）、In Situ Hybridization Protocols 、Humana Press，Inc.、1994、Wu他（編）、″Ana
lysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In
Situ Hybridization（RISH）″、Methods in Gene Biotechnology、CRC Pr
ess，Inc.、pp. 259−278、1997、およびWu他（編）、″Localization of DN
A or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization（R
ISH）″、Methods in Gene Biotechnology、CRC Press，Inc.、pp. 279−2
89、1997）。
【０２３５】 種々の追加の診断アプローチは当業者によく知られている（例えば、下記の文
献を参照のこと：Mathew（編）、Protocols in Human Molecular Genetics
、Humana Press，Inc.、1991；ColemanおよびTsongalis、Molecular Diagnost ics 、Humana Press，Inc.、1996およびElles、Molecular Diagnosis of Gen etic Diseases 、Humana Press，Inc.、1996）。
【０２３６】 さらに、個々の染色体上の対応配列にハイブリダイゼーションさせるために、
このようなポリヌクレオチドのプローブを使用することできるであろう。染色体
の同定および／またはBR43x2遺伝子のマッピングは、遺伝子の機能および疾患の
関連についての有用な情報を提供することができるであろう。多数のマッピング
技術、例えば、体細胞ハイブリッドのマッピング、および蛍光in situハイブリ
ダイゼーション（FISH）は当業者に入手可能である。好ましい方法は放射線ハイ
ブリッドマッピングである。放射線ハイブリッドマッピングは、哺乳動物染色体
の高い分解能の、連続的マップを構成するために開発された体細胞遺伝学的技術
である（Cox他、Science 250：245−50、1990）。
【０２３７】 遺伝子の配列の部分的または完全な知識は、染色体放射線ハイブリッドマッピ
ングパネルとともに使用するために適当なPCRプライマーの設計を可能とする。
ヒトゲノム全体をカバーする、商業的に入手可能な放射線ハイブリッドマッピン
グパネル、例えば、Stanford G3 RH PanelおよびGeneBridge 4 RH Panel
（Research Genetics，Inc.、アラバマ州ハンツヴィレ）が入手可能である。こ
れらのパネルは、急速な、PCRをベースとする、染色体の位置決定および問題の
領域内の遺伝子、配列タッグド部位（STS）、および他の非多形性および多形性
マーカーの排列を可能とする。これは、問題の新しく発見された遺伝子と以前に
マッピングされたマーカーとの間の比例的物理的距離を直接的に確立することを
包含する。
【０２３８】 遺伝子の位置についての正確な知識は、下記の方法を包含する多数の方法にお
いて有効であることがある：1）配列が現存するcontigの一部分であるかどうか
を決定し、そして種々の形態の追加の取り囲む遺伝学的配列、例えば、YAC−、B
AC−またはcDNAクローンを得ること、2）ｓｍａ染色体領域に対する結合を示す
遺伝可能な疾患について可能な候補を提供すること、および3）特定の遺伝子が
どんな機能を有することができるかの決定を促進するために有益である相互参照
モデル生物、例えば、マウスのため。
【０２３９】 また、染色体の位置決定はSTSを使用して実施することができる。STSはヒトゲ
ノムにおいてユニークであるDNA配列であり、そして特定の染色体または染色体
の領域のための参照点として使用することができる。すべての他のゲノム配列の
存在下にこの部位を特異的に検出するために、PCRにおいて使用することができ
る、1対のオリゴヌクレオチドのプライマーにより、STSを定めることができる。
STSはもっぱらDNA配列に基づくので、STSはデータベース、例えば、Database o
f Sequence Tagged Sites（dbSTS）、GeneBank（National Center for Bi
ological Information、National Institutes of Health、マリイランド州
ベセスダ、http://www.ncbi.nlm.nih.fov）内に完全に記載することができ、問
題の遺伝子配列を使用して、これらの短いゲノムランドマークSTS配列内に含有
されるマッピングデータについて検索することができる。
【０２４０】 本発明は、また、診断用途において使用する試薬を提供する。例えば、BR43x2
遺伝子、BR43x2 DNAまたはRNAを含んでなるプローブ、またはそれらのサブ配列
を使用して、BR43x2遺伝子が特定の染色体上に存在するかどうか、あるいは突然
変異が起こったかどうかを決定することができる。BR43x2遺伝子座における検出
可能な染色体異常は下記のものを包含するが、これらに限定されない：異数性、
遺伝子コピー数の変化、挿入、欠失、制限部位の変化および再配列。これらの異
常はコーディング配列内、イントロン内、またはフランキング配列内で起こるこ
とができ、上流のプロモーターおよび調節領域を包含し、そしてコーディング配
列内の物理的変更または遺伝子発現レベルの変化として発現されることがある。
【０２４１】 一般に、これらの診断方法は下記の工程を含んでなる：（a） 患者から遺伝
的試料を取り；（b） ポリヌクレオチドが相補的ポリヌクレオチド配列にハイ
ブリダイゼーションして第1反応産物を産生する条件下に、遺伝的試料をポリヌ
クレオチドのプローブまたはプライマーとインキュベートし、そして（iii）
第1反応産物を対照反応産物と比較する。第1反応産物と対照反応産物との間の差
は患者における遺伝的異常性を示す。本発明において使用する遺伝的試料は、ゲ
ノムDNA、cDNA、およびRNAを包含する。ポリヌクレオチドのプローブまたはプラ
イマーはRNAまたはDNAであることができ、そして配列番号3の一部分、配列番号1
の相補体、またはそれらのRNA同等物を含んでなるであろう。
【０２４２】 これに関して適当なアッセイ方法は、この分野において知られている分子遺伝
的技術、例えば、制限フラグメント長さの多形性（RFLP）の解析、PCR技術を使
用する短い縦列反復（STR）の解析、結合連鎖反応（Barany、PCR Methods and
Applications 1：5−16、1991）、リボヌクレアーゼ光受容体アッセイ、およ
びこの分野において知られている他の遺伝的既知解析（Sambrook他、ibid. ;Au
subel他、ibid. ;Marian、Chest、108：255−65、1995）。
【０２４３】 リボヌクレアーゼ保護アッセイ（例えば、Ausubel他、ibid.、ch. 4参照）は
患者のRNA試料に対するRNAプローブのハイブリダイゼーションを含んでなり、そ
の後反応産物（RNA−RNAハイブリッド）をRNアーゼに暴露させる。RNAのハイブ
リダイゼーションした領域は消化から保護される。PCRアッセイにおいて、患者
の遺伝的試料を1対のポリヌクレオチドのプライマーとインキュベートし、そし
てプライマーの間の領域を増幅し、回収する。回収された産物のサイズまたは量
の変化は、患者における突然変異体を示す。技術使用できる他のPCRをベースと
する技術は、一本鎖コンフォメーション多形性（SSCP）解析である（Hayashi、P
CR Methods and Applications 1：34−8、1991）。
【０２４４】 アンチセンス方法を使用してBR43x2、TACIまたはBCMA遺伝子の転写を阻害する
ことができ、例えば、B細胞系統の発生および他の細胞との相互作用を阻害する
ことができる。BR43x2、TACIまたはBCMAをコードするmRNAに結合しかつこのよう
なRNAの翻訳を阻害するように、BR43x2、TACIまたはBCMAをコードするポリヌク
レオチド（例えば、配列番号3に記載されているようなポリヌクレオチド）のセ
グメントに対して相補的であるポリヌクレオチドを設計する。細胞培養物または
被検体におけるBR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドをコードする遺伝子の発現
を阻害するために、このようなアンチセンスポリヌクレオチドを使用する。
【０２４５】 BR43x2、TACIまたはBCMAを発現する操作されたマウス（「トランスジェニック
マウス」と呼ぶ）およびBR43x2、TACIまたはBCMAの機能の完全な非存在を示すマ
ウス（「ノックアウトマウス」と呼ぶ）を、また、発生させることができる（Sn
ouwaert他、Science 257：1083、1992；Lowell他、Nature 366：740−42、199
3；Capecchi、Science 244：1288−92、1989；Palmiter他、Annu. Rev. Gene t. 20：465−99、1986）。例えば、偏在的にまたは組織特異的または組織制限
的プロモーター下にBR43x2、TACIまたはBCMAを過剰に発現するトランスジェニッ
クマウスを使用して、過剰発現が表現型を引き起こすかどうかを決定することが
できる。
【０２４６】 例えば、野生型BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチド、ポリペプチドフラグメ
ントまたはその突然変異体の過剰発現は正常細胞のプロセスを変更し、表現型を
生ずることができ、この表現型はBR43x2、TACIまたはBCMAの発現が機能的に関係
する組織を同定し、そしてBR43x2、TACI、BCMAまたはそれらのアゴニストまたは
アンタゴニストの療法上のターゲットを示すことができる。例えば、操作するた
めに好ましいトランスジェニックマウスは、可溶性BR43x2、TACIまたはBCMAを過
剰に発現するマウスである。そのうえ、このような過剰発現はヒト疾患とに類似
性を示す表現型を生ずることがある。
【０２４７】 同様に、ノックアウトBR43x2、TACIまたはBCMAマウスを使用して、BR43x2がin
vivoにおいて絶対的に要求されるかどうかを決定することができる。ノックア
ウトマウスの表現型は、BR43x2、TACIまたはBCMAアンタゴニスト、例えば、本明
細書に記載するアンタゴニストが有することができるin vivo作用を予測させる
。ヒトBR43x2、TACIまたはBCMA cDNAを使用して、ネズミBR43x2、TACIまたはBC
MA mRNA、cDNAおよびゲノムDNAを単離し、これらを引き続いてノックアウトマ
ウスの発生に使用する。
【０２４８】 BR43x2、TACIまたはBCMA遺伝子およびそれによりコードされるタンパク質をin
vivo系において研究するために、これらのマウスを使用することができ、そし
て対応するヒト疾患のためのin vivoモデルとして、これらのマウスを使用する
ことができる。そのうえ、本明細書に記載するBR43x2、TACIまたはBCMAに対して
向けられたBR43x2、TACIまたはBCMAアンチセンスポリヌクレオチドまたはリボザ
イムのトランスジェニック発現を、前述のトランスジェニックマウスと同様に使
用することができる。
【０２４９】 薬学的に有効量の本発明のBR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドは、慣用法に
従い、非経口的、経口的、経鼻的、経直腸的、局所的、経皮的投与またはその他
のために薬学上許容される担体を使用して処方することができる。処方物はさら
に1種または2種以上の希釈剤、充填剤、乳化剤、保存剤、緩衝剤、賦形剤、およ
びその他を含むことができ、そして例えば、液体、粉末、乳濁液、坐剤、リポソ
ーム、経皮パッチおよび錠剤のような形態で提供することができる。多数のバイ
オポリマー（生物学をベースとする系）の任意のものを含む、遅延または延長放
出性デリバリー系、リポソームを使用する合成、およびポリマーのデリバリー系
を、また、本明細書に記載する組成物とともに、利用してBR43x2ポリペプチドま
たはアンタゴニストの連続的または長期間の源を提供することができる。
【０２５０】 このような遅延放出系は、例えば、経口的、局所的および非経口的使用のため
の処方物に適用可能である。用語「薬学上許容される担体」は、活性成分の生物
学的活性の有効性を妨害せずかつ宿主または患者に対して無毒である、担体媒質
を意味する。当業者は、下記の文献に記載されているように、本発明の化合物を
適当な方法で、許容される実施に従い処方することができる：Remington：The Science and Practice of Pharmacy 、Gennaro、編、Mack Publishing Com
pany、ペンシルベニア州イーストン、第19版、1995。
【０２５１】 本明細書において使用するとき、BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチド、アゴ
ニストまたはアンタゴニストの「薬学的に有効量」は所望の生物学的結果を誘導
するために十分な量である。この結果は疾患の徴候、症候、または原因の軽減、
あるいは生物学的系の任意の他の所望の変更であることができる。例えば、BR43
x2、TACIまたはBCMAポリペプチドの有効量は、臨床医または他の適格とされた観
察者により認められた症候の主観的軽減または客観的同定可能な改善を提供する
量である。例えば、このような有効量のBR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドま
たは可溶性融合物は、免疫応答間のB細胞応答の減少、自己抗体産生の阻害また
は減少、SLE、MGまたはRAに関連する症候の阻害または減少を提供するであろう
。
【０２５２】 有効量のBR43x2、TACIまたはBCMAは末梢血中のB細胞の百分率を減少させるで
あろう。BR43x2、TACIまたはBCMAポリペプチドの有効量は、治療すべき疾患また
は症候に依存して広く変化させることができる。投与すべきポリペプチドの量お
よび処方物中のその濃度は、選択したベヒクル、投与経路、特定のポリペプチド
の効力、患者の臨床的症状、処方物中の化合物の副作用および安定性に依存する
。したがって、臨床医は、問題の患者または同様に患者を使用する臨床的経験に
依存して、処方物の中に適当な濃度を含有する適当な調製物、ならびに処方物の
投与量を使用するであろう。
【０２５３】 このような量は、一部分、治療すべき特定の症状、年齢、体重、および患者の
一般的健康、および当業者にとって明らかな他の因子に依存するであろう。典型
的には、投与量は0.1〜100mg／被検体kgの範囲であろう。特定の化合物の投与量
は、実験動物についての研究と組合わせたin vitroまたはex vivo研究から決定
することができる。in vitroまたはex vivoにおいて有効であることが見出され
た化合物の濃度は動物の研究のために手引きを提供し、ここで投与量は作用部位
において同様な濃度を提供するように計算される。 下記の非限定的実施例により、本発明をさらに例示する。
【０２５４】 実施例 実施例1．BR43x2の同定 分泌トラップアプローチを使用してRPMIアレイから、TACIイソ型をクローニン
グした。20の96ウェルのプレートを使用して、RPMI 1788（活性化B細胞系統）
ライブラリーをアレイした。各ウェルは約100の大腸菌（E. coli）コロニーを
含有し、各コロニーは1つのcDNAクローンを含有した。TomTech Quadra 9600を
使用して96ウェルのフォーマットで、DNAミニプレプを調製した。次いで単離さ
れたDNAを120プールにプールし、各プールは1600コロニーを表した。これらのプ
ールをCos−7細胞の中にトランスフェクトし、12ウェルのプレートの中にプレー
トした。
【０２５５】 12μlのプールDNAおよび5μlのLipofectAMINEを92μlの無血清DMEM培地（500m
lのDMEM中の55mgのピルビン酸ナトリウム、146mgのL−グルタミン、5mgのトラン
スフェリン、2.5mgのインスリン、1μgのセレンおよび5mgのフェツイン）中で混
合し、室温において30分間インキュベートし、次いで400μlの無血清DMEM培地を
添加した。12ウェルの組織培養プレート上にプレートした220,000のCos−7細胞
／ウェル上にDNA−LipofectAMINE混合物を添加し、37℃において5時間インキュ
ベートした。インキュベーション後、500μlの20％PBS DMEM培地（500mlのDMEM
中の100mlのFBS、55mgのピルビン酸ナトリウムおよび146mgのL−グルタミン）を
各ウェルに添加し、細胞を一夜インキュベートした。
【０２５６】 ビオチニル化、FLAGタッグドztnf4を使用して、分泌トラップスクリーンを実
施した。細胞をPBSでリンスし、PBS中の1.8％ホルムアルデヒドで15分間固定し
た。次いで細胞をTNT（H２O中の0.1MのTris−HCl、0.15MのNaCl、および0.05％
のTween−20）で洗浄した。細胞をPBS中の0.1％Triton−Xで浸透させ、次いでTN
T中で洗浄した。製造業者のインストラクションに従いNEN Renaissance（商標
） TSA−Direct Kit（NEN、マサチュセッツ州ボストン）を使用して、TNB（0.
1MのTris−HCl、0.15MのNaClおよび0.5％Blocking Reagent）で細胞を1時間ブ
ロックした。
【０２５７】 細胞をTNTで洗浄し、15分間アビジンで、次いでビオチン（Vector Labs Cat
＃ SP−2001）ブロックし、それらの間においてTNTで洗浄した。細胞をTNB中の
1μg／mlのztnf4／Flag／Biotinと1時間インキュベートし、次いでTNT中で洗浄
した。次いで細胞をTNB中のストレプトアビジン−HRP（NEN）の1：300希釈物と1
時間インキュベートし、TNTで洗浄した。希釈緩衝液（NEN）中で1：50に希釈し
たフルオレセインチラミド試薬でハイブリダイゼーションを検出し、4.4分間イ
ンキュベートし、TNTで洗浄した。細胞をTNT中で1：5に希釈したVectashield M
ounting Media（Vector Labs、カリフォルニア州バーリンゲイム）で保存した
。
【０２５８】 FITCフィルターを使用して蛍光顕微鏡により、細胞を可視化した。12プールは
ztnf4結合について陽性であった。プールD8（1600クローンを表す）を破壊し、z
tnf4結合について陽性の単一クローン（D8−1）を単離した。配列決定分析はク
ローンD8−1を明らかにし、このクローンはTACIのイソ型をコードするポリペプ
チド配列を含有し、ここでTACIのPhe21−Arg67第1システインに富んだ擬反復は
単一アミノ酸残基、トリプトファンで置換されていた。このイソ型をBR43x2と表
示し、そのポリヌクレオチド配列を配列番号1に表す。
【０２５９】 実施例2．リンパ球および単球中のBR43x1の位置決定 逆転写PCRを使用して、TおよびB細胞および単球におけるBR43x1発現を位置決
定した。オリゴヌクレオチドプライマーZC19980（配列番号15）およびZC199810
（配列番号165）を使用して、CD19＋、CD3＋および単球cDNAをBR43についてスク
リーニングした。逆転写酵素反応を94℃において3分間実施し、次いで30サイク
ルで94℃において30秒間、68℃において2分間、そして72℃において1分間実施し
、次いで72℃において7分のエクステンションを実施した。抗体を使用するTACI
について報告されたように（von BuelowおよびBram、前掲）、期待したサイズ
の720bpのバンドはB細胞中でのみ検出され、活性化T細胞中で検出されなかった
。
【０２６０】 実施例3．BR43リガンドztnf4を使用してB細胞の増殖アッセイ 1×10８凍結、アフェレスド（apheresed）末梢血単核細胞（PBMC）を含有する
バイアルを37℃の水浴中で急速融解し、50mlの管中の25mlのB細胞培地（Iscove'
s Modified Dulbecco's Medium、10％熱不活性化胎仔ウシ血清、５％L−グル
タミン、5％Pen／Strep）の中に再懸濁させた。トリパンブルー（GIBCO BRL、
マリイランド州ガイサースバーグ）を使用して、細胞を生活能力について試験し
た。
【０２６１】 10mlのFicoll／Hypaque Plus（Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.、ニュ
ージャージイ州ピスカタウェイ）を細胞懸濁液の下に層状にし、1800rpmにおい
て30分間回転し、ブレーキをオフにして停止させた。次いで相間層を除去し、新
しい50mlの管に移し、PBSで40mlの最終体積し、ブレーキをオンにして1200rpmに
おいて10分間回転させた。単離されたB細胞の生活能力をトリパンブルーで試験
した。B細胞をB細胞培地の中に1×10６細胞／mlの最終濃度に再懸濁させ、96ウ
ェルのU字形底のプレート（Falcon、VWR、ワシントン州シアトル）の中に180μl
／ウェルでプレートした。
【０２６２】 細胞に下記の刺激因子の1つを添加して、最終体積を200ml／ウェルにした： 可溶性、FLAGタッグドztnf−4sCFまたはztnf−4sNFを1mg〜１ng／mlの10倍希
釈で単独で、NaH２CO３、pH9.5中で希釈した10μg／mlの抗IgM（ヤギ抗ヒトIgM
）（Southern Biotechnology Associates，Inc.、アラバマ州バーリンガム）
とともに；または10μg／mlの抗IgM、および10ng／mlの組換えヒトIL4（PBSおよ
び０．１％BSA中で希釈下）。さらに、他のサイトカイン、例えば、IL−3および
IL−6ならびに可溶性CD40（sCD40）抗体（Pharmngen、カリフォルニア州サンデ
ィエゴ）をその上試験した。対照として、細胞を0.1％ウシ血清アルブミン（BSA
）およびPBS、10μg／mlの抗IgMまたは10μg／mlの抗IgMおよび10ng／mlのIL4（
または他のサイトカイン）。
【０２６３】 次いで細胞を37℃において加湿インキュベーター中で72時間インキュベートし
た。収集前16時間に、1μCiの３H−チミジンをすべてのウェルに添加した。細胞
を96ウェルのフィルタープレート（UniFlter GF／C、Packard、コネチカット州
ベリデン）の中に収集し、ここで細胞収集器（Packard）で細胞を収集し、製造
業者のインストラクションに従い収集した。プレートを55℃において20〜30分間
乾燥し、ウェルの底を不透明プレートシーラーでシールした。各ウェルに0.25ml
のシンチレーション流体（Microscint−O、Packard）を添加し、トップカウント
・マイクロプレート・シンチレーション・カウンター（TopCount Microplate
Scintillation Counter）（Packard）を使用してプレートを読んだ。
【０２６４】 精製したB細胞を刺激した後、種々のB細胞マイトジェンに応答したIgG産生の
誘導を測定するために、細胞を記載されているように製造し、9日間インキュベ
ートした。IgG産生を測定するために、細胞上清を収集した。 精製したB細胞を刺激した後、種々のB細胞マイトジェンに応答した細胞表面の
マーカー活性化を測定するために、細胞を記載されているように製造したが、48
時間だけインキュベートした。 FACS分析により、細胞表面のマーカーを測定し
た。 種々のB細胞マイトジェンで刺激したヒト精製B細胞の増殖を表6に要約する。
【０２６５】
【表６】
【０２６６】 IL4、IL3（10μg／ml）およびIL6とのztnf4の相乗作用はB細胞増殖について見
られた。CD40を使用するとき、B細胞のシグナリングの2倍の増加が見られた。 精製したB細胞を刺激した後、種々のB細胞マイトジェンに応答したIgG産生（n
g／ml）の誘導を表7に要約する。
【０２６７】
【表７】
【０２６８】 精製したB細胞をztnf4単独、または抗IgMまたは抗IgM＋IL−4で刺激した後、
細胞表面活性化マーカーの増加が見られた。最適または次善のT細胞マイトジェ
ンの存在下にPBMNCの増殖に対する作用は存在しなかった。また、LPS刺激に応答
した精製単球においてTNFα産生に対する作用は見られなかった。
【０２６９】 増殖しかつ免疫グロブリンを分泌するヒトBリンパ球の可溶性ztnf4共活性化を
第3図に示す。5日間培養後、可溶性ztnf4（25ng／ml）でIL−4の存在下に、そし
てIL4および抗IgM、抗CD40、または抗CD19を使用する刺激に応答する、精製した
ヒト末梢血B細胞増殖を第3A図に示す。9日間培養後、IL−4またはIL−4＋IL−5
の存在下に可溶性ztnf4で刺激したヒトB細胞から得られた上清中で測定されたIg
MおよびIgGのレベルを第3B図に示す。
【０２７０】 これらの結果が示唆するように、可溶性ztnf4は他のB細胞刺激と共同して作用
しかつそれ自体で弱く作用するB細胞活性化分子である。可溶性ztnf4はB細胞増
殖およびIgG産生を促進する。接着分子、共同刺激分子および活性化レセプター
のアップレギュレーションは、B細胞のAPC機能を促進する役割を示唆する。 in vitroにおいて5日間における10ng／mlのIL−4の存在下に可溶性ztnf4（25
ng／ml）または対照タンパク質（ユビクイチン）を使用する、ヒト末梢血B細胞
の刺激を第4図に示す。可溶性ztnf4特異的増殖の阻害について、精製TACI−Ig、
BCMA−Ig、または対照Fcを試験した。
【０２７１】 実施例4．ztnf4結合を使用するTACIおよびBCMA形質転換BHK細胞の選択 トランスフェクタントのプールの希釈クローニングにより、高いレベルのTACI
タンパク質を発現するBHK細胞を選択した。トランスフェクタント細胞（2×10５ ）を、結合緩衝液（PBS、2％BSA、0.02％NaN３）中で1μg／mlのビオチニル化zt
nf4と、氷上で30分間インキュベートした。細胞を結合緩衝液で2×洗浄し、次い
でSA−PE（Caltag）（結合緩衝液中の1：1000希釈）と氷上で30分間インキュベ
ートした。次いで細胞を結合緩衝液中で2×洗浄し、結合緩衝液の中に再懸濁さ
せ、FACS（FACS Vantage、Becton Dickinson）により読んだ。TNF4の最高の結
合を有するクローンを選択する。
【０２７２】 BCMAを発現するトランスフェクタントプールをビオチニル化ztnf4で表面標識
化することによって、BCMAタンパク質を高いレベルで発現するBHK細胞を選択し
た。次いでストレプトアビジン−フィコ−エリトリン（SA−PE Caltag Burlin
game、カリフォルニア州）およびFACS Vantage（Becton Dickinson）上のFL2
中の輝いた細胞の無菌ソーティングを実施した。次いで単一コロニーをztnf4結
合についてスクリーニングした。
【０２７３】 実施例5．組織分布 ヒト多重組織ノザンブロット（MTN I、MTN IIおよびMTN III：Clontech）
をプロービングして、ヒトBR43x2およびTACIの発現の組織分布を決定した。鋳型
としてBR43x2（配列番号1）およびプライマーとしてオリゴヌクレオチドZC20061
（配列番号22）およびZC20062（配列番号23）を使用して、ほぼ500bpのPCR由来
プローブ（配列番号21）を増幅した。この配列はTACIの相同的領域と同一である
。
【０２７４】 増幅を次のようにして実施した：1サイクルの94℃において1.0分間、30サイク
ルの94℃において30秒間、60℃において30秒間および72℃において30秒間、次い
で1サイクルの72℃において10分間。PCR生成物をアガロースゲル電気泳動により
可視化し、Gel Extraction Kit（Qiagen、カリフォルニア州チャツワース）を
製造業者のインストラクションに従い使用して500bpのPCR生成物を精製した。MU
LTIPRIME DNA標識化キット（Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ）を製
造業者のインストラクションに従い使用して、プローブを放射能標識化した。NU
CTRAPプッシュカラム（Stratagene）を使用して、プローブを精製した。
【０２７５】 EXPRESSHYB（Clontech）溶液をハイブリダイゼーションのためにかつノザンブ
ロットのハイブリダイゼーション溶液として使用した。10６cpm／mlの標識化プ
ローブを使用して65℃において、ハイブリダイゼーションを一夜実施した。次い
でブロットを室温において2×SSCおよび0.1％SDS中で洗浄し、次いで50℃におい
て0.1×SSCおよび0.1％SDS中で2回洗浄した。ほぼ1.5kbの転写物が脾臓、リンパ
節および小腸において検出された。
【０２７６】 ヒト多重組織ノザンブロット（MTN I、MTN IIおよびMTN III：Clontech）
をプロービングして、ヒトTACIの発現の組織分布を決定した。鋳型としてDaudi
細胞cDNAおよびプライマーとしてオリゴヌクレオチドZC21065（配列番号25）お
よびZC21067（配列番号26）を使用して、ほぼ257bpのPCR由来プローブ（配列番
号24）を増幅した。増幅を次のようにして実施した：1サイクルの94℃において1
.0分間、35サイクルの94℃において30秒間、60℃において30秒間および72℃にお
いて30秒間、次いで1サイクルの72℃において10分間。PCR生成物をアガロースゲ
ル電気泳動により可視化し、Gel Extraction Kit（Qiagen、カリフォルニア州
チャツワース）を製造業者のインストラクションに従い使用して257bpのPCR生成
物を精製した。
【０２７７】 MULTIPRIME DNA標識化キット（Amersham、イリノイ州アーリントンハイツ）
を製造業者のインストラクションに従い使用して、プローブを放射能標識化した
。NUCTRAPプッシュカラム（Stratagene）を使用して、プローブを精製した。EXP
RESSHYB（Clontech）溶液をハイブリダイゼーションのためにかつノザンブロッ
トのハイブリダイゼーション溶液として使用した。10６cpm／mlの標識化プロー
ブを使用して65℃において、ハイブリダイゼーションを一夜実施した。次いでブ
ロットを室温において2×SSCおよび0.1％SDS中で洗浄し、次いで50℃において0.
1×SSCおよび0.1％SDS中で2回洗浄した。ほぼ1.2kbの転写物が胃、小腸、リンパ
節、気管、脾臓および精巣において検出された。
【０２７８】 8ハウスキーピング遺伝子に正規化した種々の組織からのRNAを含有するRNA M
aster Dot Blots（Clontech）を、また、TACIプローブ（配列番号21）またはB
CMAプローブ（配列番号24）でプロービングし、前述したようにハイブリダイゼ
ーションした。BR43x2／TACIの発現は脾臓、リンパ節、小腸、胃、唾液腺、虫垂
、肺、骨髄および胎児脾臓イン見られた。
【０２７９】 ヒト腫瘍パネルブロットV（Invitrogen Inc.、カリフォルニア州サンディエ
ゴ）およびヒトリンパ腫ブロット（Invitrogen）を、前述したように、BR43x2／
TACIプローブ（配列番号21）またはBCMAプローブ（配列番号24）でプロービング
した。TACIに対応する1.5kbの転写物が非ホジキンリンパ腫および耳下腺腫瘍に
おいて見出された。BCMAに対応する1.2kbの転写物が腺リンパ腫、非ホジキンリ
ンパ腫、および耳下腺腫瘍において見出された。
【０２８０】 グアニジンイソチオシアネート（Chirgwin他、Biochemistry 18：52−94、19
79）、次いでCsCl遠心工程を使用して、CD4＋、CD8＋、CD19＋および混合反応細
胞（CellPro、ワシントン州ボセル）からの全RNAを調製した。オリゴd（T）セル
ロースクロマトグラフィー（AvivおよびLeder、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69：1408−12、1972）を使用して、ポリ（A）＋RNAを単離した。次いでノザン
ブロット分析を次のようにして実施した。
【０２８１】 約2mgの各ポリA＋RNAを2.2Mのホルムアルデヒド／リン酸塩緩衝液（50mMのNa
２HPO４、50mMのNaH２PO４、50mMのNaOAc、1mMのEDTAおよび2.2Mのホルムアルデ
ヒド）中で変性し、ホルムアルデヒド／リン酸塩緩衝液中の1.5％のアガロース
ミニゲル（Stratagene Cloning Systems、カリフォルニア州ラジョラ）電気泳
動により分離した。RNAをニトランフィルター（Schleicher & Schuell、ニュ
ーハンプシャイヤー州ケーネ）上に一夜ブロットし、フィルターをSTRATLALINKE
Rue紫外線架橋装置（Stratagene Cloning Systems）中で紫外線架橋し（1,200
ミリジュール）、次いで80℃において1時間ベーキングした。
【０２８２】 ブロットをTACI（配列番号21）またはBCMA（配列番号24）プローブでプロービ
ングした。TACIを表す1.5kbのバンドはCD19＋細胞においてのみ検出された。BCM
Aを表す1.2kbの転写物がCD8＋、CD19＋およびMLR細胞においてわずかに検出され
た。前述したように、K−562細胞（赤血球系、ATCC CCL 243）、HUT78細胞（T
細胞、ATCC TIB−161）、Jurkat細胞（T細胞）、DAUDI（バーキットヒトリンパ
腫、Clontech、カリフォルニア州パロアルト）、RAJI（バーキットヒトリンパ腫
、Clontech）およびHL60（単球）からのポリ（A）RNAを使用して作ったブロット
上で、追加のノザンブロット分析を実施した。TACIに対応する1.5kbの転写物がR
aji細胞において検出された。BCMAに対応する1.2kbの転写物がDauji、Rajiおよ
びHut78細胞において検出された。
【０２８３】 PCRをベースとするスクリーンを使用して、ヒトまたはネズミTACIおよびヒトB
CMAを発現する組織を同定した。ヒトおよびネズミRapid−Scan（商標）遺伝子発
現パネル（OriGene Technologies，Inc.、マリイランド州ロックビレ）を製造
業者のインストラクションに従いスクリーニングした。エクソン連結をスパンし
、かつネズミTACIに対応する272bpのフラグメントを産生するように、オリゴヌ
クレオチドプライマーZC24200（配列番号27）およびZC24201（配列番号28）を設
計した。発現は脾臓、胸腺、肺、乳房、心臓、筋肉、皮膚、副腎、胃、小腸、脳
、卵、前立腺および胚において検出された。約500および800bpの追加のバンドが
多数の組織において検出された。
【０２８４】 エクソン連結をスパンし、かつヒトTACIに対応する204bpのフラグメントを産
生するように、オリゴヌクレオチドプライマーZC24198（配列番号29）およびZC2
4199（配列番号30）を設計した。発現は脾臓、脳、心臓、肝臓、結腸、肺、小腸
、筋肉、胃、精巣、胎盤、唾液腺、副腎、膵臓、末梢血リンパ球および骨髄にお
いて検出された。
【０２８５】 エクソン連結をスパンし、かつヒトBCMAに対応する329bpのフラグメントを産
生するように、オリゴヌクレオチドプライマーZC24271（配列番号31）およびZC2
4272（配列番号32）を設計した。発現は脳、脾臓、結腸、肺、小腸、胃、卵、精
巣、唾液腺、副腎、前立腺、末梢血リンパ球、骨髄および胎児肝臓において検出
された。 エクソン連結をスパンし、かつネズミBCMAに対応する436bpのフラグメントを
産生するように、オリゴヌクレオチドプライマーZC24495（配列番号33）およびZ
C24496（配列番号34）を設計した。発現は肝臓において検出された。
【０２８６】 実施例6．TACI−IgおよびBCMA−Ig融合ベクターの製造 Igガンマ1Fc4フラグメントの構築 TACI−Ig融合タンパク質を製造するために、ヒトIgG1のFc領域（ヒンジ領域お
よびCH2およびCH3ドメイン）を修飾してFcレセプター（FcgRI）および補体（C1g
）結合機能を除去した。ヒトIgG1 Fcのこの修飾されたバージョンをFc4と呼ん
だ。オリゴプライマーZC10,134（配列番号43）およびZC10,135（配列番号44）を
使用するPCRにより、ヒト胎児肝臓ライブラリー（Clontech）からFc領域を単離
した。PCRを使用してFc領域内に突然変異を導入してFcgRI結合を減少させた。
【０２８７】 FcgRI結合部位（Leu−Leu−Gly−Gly）をBaum他、（EMBO J. 13：3992−400
1、1994）に従いAla−Glu−Gly−Ala（配列番号45のアミノ酸残基38〜41）突然
変異させて、FcgRI結合を減少させた（Duncan他、Nature 332：563−4、1988）
。オリゴヌクレオチドプライマーZC15,345（配列番号46）およびZC15,347（配列
番号47）を使用して突然変異を導入した。50μlの最終体積に、570ngのIgFc鋳型
、5μlの10×Pfu反応緩衝液（Stratagene）、8μlの1.25mMのdNTPs、31μlのdH
２O、2μlの20mMのZC15,345（配列番号46）およびZC15,347（配列番号47）を添
加した。等しい体積の鉱油を添加し、反応を94℃に1分間加熱した。
【０２８８】 Pfuポリメラーゼ（2.5単位、Stratagene）を添加し、次いで25サイクルの94℃
において30秒間、55℃において30秒間、72℃において1分間、および引き続いて7
2℃において7分間エクステンションを実施した。反応生成物を電気泳動させ、約
676bpの予測されたサイズに対応するバンドが検出された。バンドをゲルから切
除し、QIAGEN QIAquickTMゲル抽出キット（Qiagen）を製造業者のインストラク
ションに従い使用して回収した。
【０２８９】 また、PCRを使用してAla→Ser（配列番号45のアミノ酸残基134）およびPro→S
er（配列番号45のアミノ酸残基135）の突然変異を導入して、補体C1g結合および
／または補体固定（DuncanおよびWinter、Nature 332：788、1988）および停止
コドンTAAを減少させた。鋳型としてFcγRI結合側突然変異IgFc配列を使用して
、2回の第1ラウンドの反応を実施した。50μlの最終体積に、1μlのFcγRI結合
側突然変異IgFc鋳型、5μlの10×Pfu反応緩衝液（Stratagene）、8μlの1.25mM
のdNTPs、31μlのdH２O、2μlの20mMのZC15,517（配列番号48）、配列番号45の
ヌクレオチド26において開始する5'プライマーおよび2μlの20mMのZC15,530（配
列番号49）、配列番号45のヌクレオチド405において開始する3'プライマーを添
加した。
【０２９０】 第2反応は2μlの各20mMのストックのオリゴヌクレオチドプライマーZC15,518
（配列番号50）、配列番号45のヌクレオチド388において開始する5'プライマー
およびZC15,347（配列番号47）、3'プライマーを含有して、Ala→Ser突然変異、
XbaI制限部位および停止コドンを導入した。等しい体積の鉱油を添加し、反応を
94℃に1分間加熱した。Pfuポリメラーゼ（2.5単位、Stratagene）を添加し、次
いで25サイクルの94℃において30秒間、55℃において30秒間、72℃において1分
間、および引き続いて72℃において7分間エクステンションを実施した。反応生
成物を電気泳動させ、それぞれ、約370および約395bpの予測されたサイズに対応
するバンドが検出された。
【０２９１】 バンドをゲルから切除し、QIAGEN QIAquickTMゲル抽出キット（Qiagen）を製
造業者のインストラクションに従い使用して回収した。第2ラウンドの反応を実
施して上記フラグメントを結合し、5'BamHI制限部位を付加した。50μlの最終体
積に、30μlのdH２O、8μlの1.25mMのdNTPs、5μlの10×Pfuポリメラーゼ反応緩
衝液（Stratagene）および1μlの2回の第1の2つのPCR生成物の各々を添加した。
等しい体積の鉱油を添加し、反応を94℃に1分間加熱した。
【０２９２】 Pfuポリメラーゼ（2.5単位、Stratagene）を添加し、次いで5サイクルの94℃
において30秒間、55℃において30秒間、および72℃において2分間を実施した。
温度を再び94℃にし、2μlの各20mMのストックのZC15,516（配列番号51）、配列
番号45のヌクレオチド1において開始する5'プライマーおよびZC15,347（配列番
号47）を添加し、次いで25サイクルの94℃において30秒間、55℃において30秒間
および72℃において1分間、および引き続いて72℃において最後の7分間エクステ
ンションを実施した。反応生成物をゲル電気泳動により可視化した。予測された
サイズに対応する789bpのバンドが検出された。
【０２９３】 TACI−Fc4およびBCMA−Fc4発現ベクターの構築 酵母中の相同的組換えにより、TACI−Fc4およびBCMA−Fc4融合タンパク質を含
有する発現プラスミドを構築した。配列番号5のヌクレオチド15〜ヌクレオチド4
75のポリヌクレオチド配列を含むTACI cDNAのフラグメントをPCRにより単離し
た。TACIフラグメントの製造に使用した2つのプライマーは次の通りであった：
（1）40bpsの5'ベクターフランキング配列およびTACIフラグメントのアミノ末端
に対応する17bpsを含有するプライマー（配列番号52）；（2）40bpsのフランキ
ングFc4配列に対応する3'末端およびTACIフラグメントのカルボキシル末端に対
応する17bpを含有するプライマー（配列番号53）。
【０２９４】 100μlの最終体積に、10ngのTACI鋳型、10μlの10×Taqポリメラーゼ反応緩衝
液（Perkin Elmer）、8μlの2.5nMのdNTPs、78μlのdH２O、2μlの各20mMのス
トックのオリゴヌクレオチドプライマー配列番号52および配列番号53、およびta
qポリメラーゼ（2.5単位、Life Technology）を添加した。等しい体積の鉱油を
添加し、反応を94℃に2分間加熱し、次いで25サイクルの94℃において30秒間、6
5℃において30秒間、65℃において30秒間、72℃において1分間、および引き続い
て72℃において5分のエクステンションを実施した。
【０２９５】 配列番号7のヌクレオチド219〜ヌクレオチド362のポリヌクレオチド配列を含
むBCMA cDNAのフラグメントをPCRにより単離した。BCMAフラグメントの製造に
使用した2つのプライマーは次の通りであった：40bpsの5'ベクターフランキング
配列およびBCMAフラグメントのアミノ末端に対応する17bpsを含有するプライマ
ー（配列番号54）；および40bpsのフランキングFc4配列に対応する3'末端および
BCMAフラグメントのカルボキシル末端に対応する17bpを含有するプライマー（配
列番号55）。
【０２９６】 100μlの最終体積に、10ngのBCMA鋳型、10μlの10×Taqポリメラーゼ反応緩衝
液（Perkin Elmer）、8μlの2.5nMのdNTPs、78μlのdH２O、2μlの各20mMのス
トックのオリゴヌクレオチドプライマー配列番号54および配列番号55を添加した
。等しい体積の鉱油を添加し、反応を94℃に2分間加熱し、次いで25サイクルの9
4℃において30秒間、65℃において30秒間、72℃において1分間、および引き続い
て72℃において5分のエクステンションを実施した。
【０２９７】 TACIおよびBCMA融合タンパク質の各々について1つの、Fc4フラグメントをコー
ドするcDNAを含有するフラグメントを同様な方法において構築した。TACIについ
て、Fc4フラグメントの製造において使用した2つのプライマーは次の通りであっ
た（上流および下流）：40bpsの5'TACIフランキング配列およびFc4のアミノ末端
に対応する17bpsを含有するオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号56）；お
よび40bpsのフランキングベクター配列に対応する3'末端およびFc4フラグメント
のカルボキシル末端に対応する17bpsを含有するオリゴヌクレオチドプライマー
（配列番号57）。BCMAについて、Fc4フラグメントの製造において使用した上流
プライマーは、40bpsの5'BCMAフランキング配列およびFc4のアミノ末端に対応す
る17bpsを含有するオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号58）。BCMA構築物
についてFc4フラグメントの下流プライマーは、TACI−Fc4について前述のものと
同一であった（配列番号57）。
【０２９８】 100μlの最終体積に、10ngの前述のFc4鋳型、10μlの10×Taqポリメラーゼ反
応緩衝液（Perkin Elmer）、8μlの2.5nMのdNTPs、78μlのdH２O、2μlの各20m
MのストックのTACIについてオリゴヌクレオチド配列番号56および配列番号57お
よびBCMAについてオリゴヌクレオチド配列番号58および配列番号57、およびtaq
ポリメラーゼ（2.5単位、Life Technology）を添加した。等しい体積の鉱油を
添加し、反応を94℃に2分間加熱し、次いで25サイクルの94℃において30秒間、6
5℃において30秒間、72℃において1分間、および引き続いて72℃において5分の
エクステンションを実施した。
【０２９９】 分析のために0.8％のLMPアガロースゲル（Seaplaque GTG）上に1×TBE緩衝液
とともに、前述の100μlのPCR反応の各々の10μlを展開させた。5μlの1M NaCl
および250μlの無水エタノールの添加により、各PCR反応の残りの90μlを沈降さ
せた。プラスミドpZMP6をSmaIで切断して、それをポリリンカーとして線状化し
た。プラスミドpZMP6をプラスミドpCZR199（American Type Culture Collect
ion、バージニア州マンナッサス、ATCC＃ 98668）から誘導され、そしてCMV即
時型プロモーター、マウス免疫グロブリン重鎖遺伝子座の可変領域からのコンセ
ンサスイントロン、コーディング配列の挿入のための多重制限部位およびヒト成
長ホルモンターミネーターを含有する哺乳動物発現ベクターである。
【０３００】 また、このプラスミドは大腸菌（E. coli）複製起点、sCD40プロモーター、
エンハンサーおよび複製起点を有する哺乳動物選択可能なマーカー発現単位、DH
FR遺伝子およびsCD40ターミネーターを有する。メタロチオネインプロモーター
をCMV即時型プロモーター、およびオープンリーディングフレームの5'末端にお
けるKozac配列で置換することによって、ベクターpZMP6をpCZR199から構築した
。
【０３０１】 100μlのコンピテント酵母細胞（S. cerevisiae）を、ほぼ1μgのTACIまたは
BCMA細胞外ドメインおよび各々との組換えに適当なFc4 PCRフラグメントの各々
、および100ngのSmaI消化pZMP6ベクターを含有する10μlと組合わせ、0.2cmのエ
レクトロポレーションキュベットに移した。酵母／DNA混合物を0.75kV（5kV／cm
）、∞オーム、25μFにおいてエレクトロパルスした。各キュベットに、600μl
の1.2Mのソルビトールを添加し、酵母を2×300μlのアリコートでURA−Dプレー
ト上にプレートし、30℃においてインキュベートした。
【０３０２】 約48時間後、単一プレートからのUra＋酵母形質転換体を1μlのH２Oの中に再
懸濁させ、短時間回転して酵母細胞をペレット化した。細胞ペレットを1mlの溶
解緩衝液（2％トリトンX−100、1％SDS、100mM NaCl、10mM Tris、pH8.0、1mM
EDTA）の中に再懸濁させた。300μlの酸洗浄ガラスビーズおよび200μlのフェ
ノール−クロロホルムを含有するエッペンドルフ管に、500μlの溶解混合物を添
加し、1分の間隔で2または3回渦形成し、次いでエッペンドルフ遠心機中で最大
速度で5分間回転した。300μlの水性相を新しい管に移し、DNAを600μlのエタノ
ール（EtOH）で沈降させ、次いで4℃において10分間遠心した。DNAペレットを10
0μlのH２Oの中に再懸濁させた。
【０３０３】 0.5〜2mlの酵母DNAプレプおよび40μlのDH10B細胞を使用して、エレクトロコ
ンピテント大腸菌（E. coli）細胞（DH10B、GibcoBRL）の形質転換を実施した
。細胞を2.0kV、25mFおよび400オームにおいてエレクトロパルスした。エレクト
ロポレーション後、1mlのSOC（2％のバクトトリプトン（Difco、ミシガン州デト
ロイト）、0.5％の酵母エキス（Difco）、10mMのNaCl、2.5mMのKCl、10mMのMgCl ２ 、10mMのMgSO４、20mMのグルコース）を4×LB AMPプレート（LBブロス（Lenn
ox）、1.8％のバクト寒天（Difco）、100mg／lのアンピシリン）上に250μlのア
リコートでプレートした。
【０３０４】 TACI−Fc4またはBCMA−Fc4について正しい発現構築物を収容する個々のクロー
ンを制限消化により同定して、インサートの存在を確認し、種々のDNA配列が互
いに対して正しく結合されていることを確証した。陽性クローンのインサートを
配列分析した。Qiagen Maxi Kit（Qiagen）を製造業者のインストラクション
に従い使用して、より大きい規模のプラスミドDNAを単離する。
【０３０５】 実施例7．TACI−Fc4およびBCMA−Fc4の哺乳動物発現 BHK570細胞（ATCC No. CRL−10314）を10cmの培養皿の中にプレートし、DME
M／PBS培地（DMEM、Gibco／BRL、高グルコース（Gibco BRL、マリイランド州ガ
イサースバーグ）、5％胎仔ウシ血清（Hyclone、ユタ州ローガン）、1mM L−グ
ルタミン（JRH Biosciences、カンサス州レネクサ）、1mM ピルビン酸ナトリ
ウム（Gibco BRL））中で37℃、5％CO２においてほぼ50〜70％のコンフルエン
シーに成長させた。
【０３０６】 次いで細胞をLipofectamine（商標）（Gibco BRL）を使用して無血清（SF）
培地処方物（DMEM、10mg／mlのトランスフェリン、5mg／mlのインスリン、2mg／
mlのフェツイン、1％のL−グルタミンおよび1％のピルビン酸ナトリウム）中で
プラスミドTACI−Fc4／pZMP6またはBCMA−Fc4／pZMP6でトランスフェクトした。
TACI−Fc4／pZMP6またはBCMA−Fc4／pZMP6を15mlの管の中にSF培地で640μlの全
最終体積に希釈した。35μlのLipofectamine（商標）（Gibco BRL）を605μlの
SF培地と混合した。Lipofectamine（商標）混合物をDNA混合物に添加し、室温に
おいてほぼ30分間インキュベートした。5mlのSF培地をDNA：Lipofectamine（商
標）混合物に添加した。
【０３０７】 細胞を1回5mlのSF培地でリンスし、吸引し、DNA：Lipofectamine（商標）混合
物に添加した。細胞を37℃において5時間インキュベートし、次いで6.4mlのDMEM
／10％FBS、1％PSN培地を各プレートに添加した。プレートを37℃において一夜
インキュベートし、DNA：Lipofectamine（商標）混合物を次の日に新鮮な5％ FB
S／DMEM培地と置換した。トランスフェクション後5日に、細胞を選択培地（DMEM
／5％FBS、1％L−グルタミン、1％ピルビン酸ナトリウム）中でT−162フラスコ
の中に分割した。トランスフェクション後ほぼ10日に、各トランスフェクション
からの2×150mmの培養皿のメトトレキセート耐性コロニーをトリプシン処理し、
細胞をプールし、T−162フラスコの中にプレートし、大規模培養に移した。
【０３０８】 実施例9．ztnf4のトランスジェニック発現 成体の生殖能力のある雄（B6C3f1）、青春期直前の生殖能力のある雌（B6C3f1
）、精管切除雄（B6D2f1）、および成体生殖能力のある雌（B6D2f1）（すべては
Raconic Farms、ニューヨーク州ジャマンウン、から）を使用して、ztnf4遺伝
子を発現するトランスジェニック動物を作った。Pregnannt Mare's Serumコナ
ドトロピン（Sigma、ミゾリー州セントルイス）およびヒトChorionic Gonadotr
pin（hCG（Sigma））を使用して、青春期直前の生殖能力のある雌を過剰排卵さ
せた。引き続いて過剰排卵させた雌を成体の生殖能力のある雄と交配させ、膣栓
の存在により交尾を確認した。
【０３０９】 受精卵を外科用スコープ（Leica MZ12 Stereo Microscope、Leica、ドイツ
国ウェッツラー）下に収集した。次いでヒアウロニダーゼおよび5％CO２、5％O
２、および９０，％N２と37℃においてインキュベートしたウィッテンW640培地
（表8；すべての試薬はSigma Chemical Co.から入手可能である）中で卵を洗
浄した。マイクロインジェクションまで、卵を37℃／5％CO２において貯蔵した
。
【０３１０】
【表８】
【０３１１】 配列番号36および配列番号37のオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して最
適化開始コドンおよびフランキング5'PmeIおよび3'AscI部位を導入するようにPC
Rにより、全長のヒトTACIリガンドBlys（配列番号35）をコードする858bpのオー
プンリーディングフレームを増幅した。このPmeI／AscIフラグメントをpKFO24、
B細胞および／またはT細胞制限トランスジェニックベクター［Ig Emエンハンサ
ー（pEmSRからの690bpのNotI／XbaI；（Bodrug他、EMBO J. 13：2124−30，19
94）、Ig Vｈプロモーター（pJH1X（−）からの５３６bpのHincII／XhoIフラグ
メント；Hu他、J. Exp. Med. 177：1681−90、1993）、SV40 16Sイントロン
（pEmSRからの171bpのXhoI／HindIIIフラグメント）、PmeI／AscIポリリンカー
、およびヒト成長ホルモン遺伝子ポリアデニル化シグナル（627bpのSmaI／EcoRI
フラグメント；Seeburg、DNA 1：239−49、1982）を含有する］の中にサブクロ
ーニングした。
【０３１２】 トランスジーンインサートをプラスミドバックボーンからNotI消化およびアガ
ロースゲル精製により分離し、前述のB6C3F1Tacマウスの交配からの受精卵を本
質的に以前に記載されているように擬妊娠雌の中にマイクロインジェクトし、移
植した（Malik他、Mol. Cell. Biol. 15：2349−58、1995）。 レシピエントを対でカゴに戻し、19〜21日間妊娠させた。出産後、分娩後19〜
21日経過させた後、雌雄鑑別および離乳させ、0.5cmのバイオプシー（遺伝子型
別のために使用する）をきれいなハサミで尾から切り取る。
【０３１３】 商業的に入手可能なキット（DNeasy 96 Tissue Kit；Qiagen、カリフォル
ニア州バレンシア）を製造業者のインストラクションに従い使用して、尾の切り
取り物からゲノムDNAを調製した。トランスジェニックベクターのヒト成長ホル
モン（hGH）3'UTR部分に対して設計されたプライマーを使用するPCRにより、ゲ
ノムDNAを分析した。プライマーZC17251（配列番号38）およびZC17252（配列番
号39）をhGHの368塩基対のフラグメントを増幅する。
【０３１４】 ヒト配列に対してユニークな領域（ヒトおよびマウス成長ホルモン3'UTR DNA
配列の整列から同定された）を使用して、PCR反応がマウス配列を増幅しないこ
とを保証した。さらに、プライマーZC17156（配列番号40）およびZC17157（配列
番号41）は、ベクター配列に対してハイブリダイゼーションしかつcDNAインサー
トを増幅し、hGHプライマーと一緒に使用することができる。これらの実験にお
いて、トランスジーンについて陽性の動物からのDNAを2つのバンド、すなわち、
hGH3'UTRフラグメントに対応する368塩基対のバンドおよびcDNAインサートに対
応する可変サイズのバンドを発生させた。
【０３１５】 いったん動物がトランスジェニック（TG）であると確証されたとき、TG雌を野
生型マウスと一緒に、またはTG雄を1つまたは2匹の野生型雌と一緒に配置するこ
とによって、動物を同系交配系統の中に戻し交雑させる。子供が生まれ、これら
を離乳させ、雌雄で分離し、それらの尾を遺伝子型別のために切り取った。 生きている動物におけるトランスジーンの発現をチェックするために、生存バ
イオプシーを実施する。RNA溶液ハイブリダイゼーションアッセイを使用するか
、あるいはABI Prism 7700（PE Applied Biosystems，Inc.、フォスターシ
ティー、カリフォルニア州）上で製造業者のインストラクションに従い実時間PC
Rを実施することによって、各トランスジーンのmRNA発現レベルの分析を実施し
た。
【０３１６】 細胞増殖およびフローサイトメトリー 基本系統のマウスを種々の週齢において分析した。リンパ系組織のフローサイ
トメトリー（FACS）分析のために、乳鉢および乳棒を使用してリン酸塩緩衝液（
PBS）中で注意して崩壊することによって、骨髄（BM）細胞を大腿および脛骨か
ら単離した。細胞を再懸濁させ、受動的沈降により骨断片を分離し、1000×gに
おいてペレット化した。ガラススライドの間で無傷の組織を破砕することによっ
て、脾細胞、胸腺細胞、またはリンパ節細胞を獲得し、次いで再懸濁させ、BMに
ついてのように細胞をペレット化した。細胞をFACS洗浄緩衝液（FACS WB）（ハ
ンク均衡塩溶液、1％BSA、10mMのHepes、pH7.4）の中に20×10６細胞／mlの濃度
に再懸濁させた後染色した。
【０３１７】 染色するために、1×10６細胞を5mlの管に移し、1mlのFACS WBで洗浄し、次
いで1000×gにおいてペレット化した。次いで細胞を氷上で飽和量の適当なFITC
−、PE−および／またはTriColor（TC）−結合モノクローナル抗体の存在下にFA
CS WB中の全体積100mlで20分間インキュベートした。細胞を1.5mlのWBで洗浄し
、ペレット化し、次いで400mlのWBの中に再懸濁させ、CellQuestソフトウェア（
Becton Dickinson、カリフォルニア州マウンテンビュー）を使用してFACSCalib
urフローサイトメーター上で分析した。前方向（FSC）および側面（SSC）光散乱
装置の検出器を線形目盛り上に設定したが、これに対して対数検出器をすべての
3つの蛍光チャンネル（FL−1、FL−2、およびFL−3）について使用した。
【０３１８】 単一色で染色された細胞集団を使用する各実験のために、FLチャンネルの間で
オーバーラップするスペクトルを使用した。すべての細胞を収集し、ディスクに
アンゲート（ungate）し、CellQuestソフトウェアを使用してデータを分析した
。FSC対SSCプロファイルに基づいて電子的にゲーティングしたデータにより、RB
Cおよび死んだ細胞を排除した。
【０３１９】 フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合抗CD8モノクローナル抗体（m
Ab）（クローン53−6.7）およびフィコエリトリン（PE）結合抗CD4（クローンRM
4−5）、抗CD5（クローン53−7.3）。抗CD19（クローン1D3）、および抗シンデ
カン（クローン281−2）モノクローナル抗体をPharMingen（カリフォルニア州サ
ンディエゴ）から購入した。TriColor（TC）結合抗CD45R／B220モノクローナル
抗体（クローンRA3−6B2）をCaltagから購入した。
【０３２０】 リンパ系区画においてztnf4を過剰に発現するトランスジェニックマウスは、
増加した数の末梢B細胞、増加した形質細胞および増加したレベルの血清免疫グ
ロブリンを発生させる。これらのトランスジェニック動物は、脾臓、リンパ節お
よび胸腺において増加した数のB200＋細胞を有する。増加した数の脾B細胞は、
慣用B−2細胞および通常稀な集団のB−1細胞の両方を包含する。一般に、B−1細
胞は大部分腹膜および他の体腔に制限され、低いアフィニティーの自己反応性抗
体を産生し、しばしば自己免疫疾患、例えば、全身性エリテマトーデスSLEの発
生に関係づけられてきている。
【０３２１】 高齢のトランスジェニック動物は、自己抗体を産生し、全身性エリテマトーデ
スの特徴を示すタンパク尿および硬化性糸球体を発生する。 第5A図は、後述するように調製し、抗B220−TCで染色し、フローサイトメトリ
ーにより分析した脾臓（上部パネル）、腸間膜リンパ節（中央パネル）、および
骨髄（下部パネル）の単細胞懸濁液を示す。B220＋細胞の百分率に血球計で計数
した生きている（トリパンブルー排除）細胞の総数を掛けることによって、各組
織におけるB220＋の数を計算した。各バーは個々のztnf4トランスジェニックマ
ウス（Tg、陰影をつけたバー）または非Tg同腹子対照マウス（白抜きバー）を表
す。
【０３２２】 第5B図は、示した分子（DC5、CD4およびCD8）に対するモノクローナル抗体で
染色し、次いでフローサイトメトリーにより分析した、ztnf4 TG（右側パネル
）または非TG同腹子（左側列）、脾臓（中央列）、および胸腺（下部列）から単
離された細胞を示す。示されたデータはゲーティングして死亡した細胞およびRB
Cは排除されている。 第5C図は、6〜23週齢の範囲のztnf4トランスジェニックマウスからの血清中の
全IgG、IgM、およびIgEのレベルを示す。
【０３２３】 第5D図は、対照同腹子からの正常の糸球体に比較して、ztnf4トランスジェニ
ックマウスからのH&E染色腎臓切片において同定された糸球体のアミロイド沈着
および厚くなった糸球体間質を示す。 第5E図は、Mckay他（J. Exp. Med. 190：1697−1710、1999）の報告に類似
する、ztnf4トランスジェニックマウスにおけるエフェクターT細胞の増加を示す
。 ztnf4を過剰発現するトランスジェニック動物の中に、可溶性TACI（BR43x2
）またはBCMA−Ig融合物を注射した（IP、IMまたはIV）、リンパ球系組織のフロ
ーサイトメトリー（FACS）分析を使用して、脾臓、リンパ節および胸腺における
B220＋細胞の数の変化を同定する。
【０３２４】 実施例10．直接的結合性ELISA in vitroにおけるztnf4の生物学的活性に結合しかつそれを阻害する可溶性TA
CI−Igまたは可溶性BCMA−Igの能力を特性決定するために、直接的結合性ELISA
を開発した。 96ウェルのプレートを1μg／mlのヤギ抗ヒトIgG（Jackson Labs、マサチュセ
ッツ州バールハーバー）でELISA A緩衝液（0.1MのNa２HCO３、pH9.6、0.02％の
NaN３）中の被覆し、4℃において一夜インキュベートした。TACI、BCMA、および
対照として無関係のTNFレセプター、例えば、ztnfr10（配列番号42）を10μg／m
lから320ng／ml＋ゼロに5倍希釈することによって力価決定し、2.5、0.5または0
.1μg／mlのビオチニル化ztnf4または陰性対照としてオバルブミンと共インキュ
ベートし、室温において1時間インキュベートした。
【０３２５】 次いで共インキュベートしたレセプター−ビオチニル化リガンド混合物を、ヤ
ギ抗ヒトIgG被覆した96ウェルのプレートに添加した。次いでプレートを洗浄し
（ELISA C、500μlのTween 20（Sigma Chemical Co.、ミゾリー州セントル
イス）、200mgのNaN３、PBSで1リットルの最終体積にした）、Superblock（Pier
ce、イリノイ州ロックフォード）でブロックした。次いでプレートを37℃におい
て2時間インキュベートした。
【０３２６】 プレートを再びELISA Cで洗浄し、次いで100μl／ウェルのnetr−avidin−HR
PをELISA B（それぞれ、1％または2％について5または10μgのBSA（Sigma）、2
50μlのTween 20（Sigma）、100mgのNaN３、リン酸塩緩衝液pH7.2（PBS、Sigma
）で500mlの最終体積にした。あるいは、緩衝液はELISA C緩衝液中で1％または
2％のBSAとして構成した）中で1：10,000に添加した。次いでプレートを室温に
おいて10分間OPDで展開し、492において読んだ。
【０３２７】 実施例11．生物学的活性のアッセイ ヒトB細胞の可溶性TACI−FC阻害、可溶性ztnf4の刺激を測定するために、生物
学的活性のアッセイを展開した。CD19磁気ビーズおよびVarioMacs磁気分離シス
テム（Miltenyi Biotec Auburn、カリフォルニア州）を製造業者のインストラ
クションに従いを使用して、B細胞を末梢血単核細胞（PBMNC）から単離した。精
製したB細胞を可溶性ztnf4（25ng／ml）および組換えヒトIL−4（10ng／ml、Pha
rmingen）と混合し、丸底96ウェルのプレート上に1×10５細胞／ウェルにおいて
プレートした（トリプリケート）。
【０３２８】 可溶性TACI−FCを5μg／mlから6ng／mlに希釈し、B細胞と5日間インキュベー
トし、第4日に1μCiの３H−チミジン（Amersham）／ウェルで一夜パルスした。
対照として、可溶性TACI−FCをまたB細胞およびIL−4とztnf4の非存在下にイン
キュベートした。 プレートをPackardプレート収集器で収集し、Packardリーダーにより計数した
。TACI−Ig可溶性レセプターは、投与量従属的方法でin vitroにおいてB細胞増
殖を刺激する可溶性ztnf4の能力を阻害した。10倍モル過剰のTACI−Igは、IL−4
の存在下に可溶性ztnf4に応答してヒトB細胞の増殖を完全に阻害する。
【０３２９】 実施例12．ORIGINアッセイ 正常個体に関する疾患の症状（例えば、SLE、慢性関節リウマチ）を有する個
体におけるztnf4のレベルを、電気化学的ルミネセンスアッセイにより測定した
。10ng／ml、1ng／ml、0.1ng／ml、0.01ng／mlおよび0ng／mlにおいて可溶性ヒ
トztnf4から作成した標準曲線をORIGIN緩衝液（Igen、マリイランド州ガイサー
スバーグ）中で調製した。血清試料をORIGIN緩衝液中で希釈した。オリジンアッ
セイ緩衝液（IGEN）中で1μg／mlに希釈したビオチニル化ウサギ抗ヒトztnf4−N
F BV抗体およびオリジンアッセイ緩衝液（IGEN）中で1μg／mlに希釈したルテ
ニル化ウサギ抗ヒトztnf4−NF BVポリクローナル抗体と、標準および試料を室
温において2時間インキュベートした。
【０３３０】 インキュベーション後、試料を渦形成し、0.4mg／mlのストレプトアビジンDyn
abeads（Dynal、ノールウェイ国オスロ）を標準および試料の各々に50μl／管で
添加し、室温において30分間インキュベートした。次いで試料を渦形成し、試料
をOrigin分析装置（Igen）で製造業者のインストラクションに従い読んだ。Orig
inアッセイは電気化学的ルミネセンスに基づき、これは何であるか、これはどの
ように働くか、そしてこれは何を語るかのECLのリードアウトを生成する。 糸球体腎炎および自己免疫疾患の進行した段階に進行した、NZBWF1／JおよびM
RL／Mpj−Fasｌｐ（商標）マウスからの血清試料において、増大したレベルのzt
nf4が検出された。
【０３３１】 実施例13．SLEの自発的モデルにおける可溶性TACI−Ig NZBWマウスはほぼ7〜9月齢において自発的SLEについて症候性となる。平均、B
細胞自己抗体産生がNZBWマウスにおいて高いと考えられるとき、TACI−FcをNZBW
マウスに投与して、5週にわたってB細胞に対するその抑制作用をモニターした。
【０３３２】 100匹の、8週齢マウス（NZB×NZW）F１マウス（Jackson Labs）を15匹のマウ
スの6グループに分割した。処置前に、マウスを尿タンパク質について1回／月モ
ニターし、血液をCBCおよび血清バンキングのために抜き出した。血清を自己抗
体についてスクリーニングする。タンパク尿は糸球体腎炎の特徴あるサインであ
るので、尿タンパク質レベルをディップスティックにより規則的間隔で研究過程
にわたってモニターした。処置前に、動物を秤量した。マウスがほぼ5月齢のと
き投与を開始した。マウスにベヒクルのみ（PBS）またはヒトIgG−FC（対照タン
パク質）を3回／週で5週間腹腔内注射した。
【０３３３】
【表９】 血液を投与の間に2回収集し、投与後少なくとも2回収集する。タンパク尿につ
いての尿ディップスティック値および体重を投与開始後2週毎に取った。血液、
尿のディップスティック値および体重を安楽死時に収集した。脾臓、胸腺、胆嚢
を有する肝臓、左腎臓および脳の重量を測定した。脾臓および胸腺をFACSおよび
組織学のために分割した。顎下唾液腺、腸間膜リンパ節鎖、胆嚢を有する肝臓小
葉、大脳皮質膜および大腸、胃、小腸、膵臓、右腎臓、副腎、気管および食道を
有する舌、心臓および肺をまた組織学のために収集する。
【０３３４】 図6は、SLEの発生と相関するNZBWF1およびMRL／lpr／lprマウスからの血清中
のztnf4のレベルの増加を示す。第6A図の上のパネルは、ztnf4血清レベルと週齢
、10〜40週齢範囲の68匹のNZBWF1マウス、および10週齢および30週齢のNZB／B対
照マウスとの相関を示す。中央パネルは、対照NZB／Bマウスに比較して、NZBWF1
マウスにおける3つの範囲、すなわち、微量〜20mg／dl（T−30）、100〜300ng／
dlおよび2000mg／dlのタンパク尿の相関を示す。下のパネルは、対照NZB／Bマウ
スに比較して、NZBWF1マウスにおける抗dsDNA抗体の種々の力価とztnf4レベルと
を示す。
【０３３５】 図6Bは、18〜24週齢範囲の23匹のMRL／lpr／lprマウスおよび10匹の11週齢のM
RL／MpJマウスに対して行った同一相関を示す。 図7は尿分析の結果を示す。ディップスティックの読みが＞100mg／dlである場
合、マウスはタンパク尿を有すると考えた。（A）PBS、（B）ヒトIgG FC、100m
g、（C）ヒトIgG FC、20mg、（D）ヒトTACI−IgG、100mg、および（E）ヒトTAC
I−IgG、20mg。可溶性TACI−IgG融合物で処置したマウスはタンパク尿の減少を
示した。
【０３３６】 処置した動物からの末梢血の分析において、FC（20および100mg）およびPBS処
置マウスに比較したとき、処置開始後2週において、白血球およびリンパ球の計
数はTACI−FC（20および100mg）処置マウスにおいて減少することが明らかにさ
れた。処置後6週に抜き出した末梢血のFAC分析（リンパ球ゲート）は試料の中に
存在するB細胞の百分率の減少を示し始め（最後の処置を投与した後2週）そして
百分率の劇的な減少を示した。最後の処置を投与した後5週にB細胞レベルはなお
減少したが、劇的ではなかった。表10は各処置グループ（表10）におけるマウス
について平均（および標準偏差）を提供する。末梢血中のB細胞レベルの百分率
の減少は、また、処置の2週に入って観測された。
【０３３７】
【表１０】
【０３３８】 実施例14．正常マウスにおける可溶性TACI−Ig TACI−FCをBalb/Cマウスに投与して、正常マウスに対するその作用をモニター
した。60匹の8週齢の雌Balb/Cマウス（HSD）を5匹の12グループに分割した。処
置前に、マウスを秤量し、血液をCBCおよび血清バンキングのために抜き出した
。グループ1〜9にベヒクルのみ（PBS）またはヒトIgG−FC（対照タンパク質）ま
たはTACI−FC4（被験タンパク質）を毎日12日間腹腔内注射（IP）し、第14日に
殺した。グループ10および11に、3回／週2週間腹腔内注射し、第14日に殺した。
【０３３９】
【表１１】
【０３４０】 血液を第7日および第12日に収集した。血液および体重を安楽死時に収集した
。脾臓、胸腺、および脳の重量を測定した。脾臓および胸腺をFACSおよび組織学
のために分割した。皮膚、脾臓、腸間膜LN鎖、顎下唾液腺、卵巣、子宮、頸、膀
胱、腸間膜リンパ節鎖、胆嚢を有する肝臓小葉、大脳皮質膜および大腸、胃、小
腸、膵臓、右腎臓、副腎、気管および食道を有する舌、心臓、胸腺、大腿筋肉、
左および右大腿骨、脳を、また、組織学のために収集する。
【０３４１】 実施例13において前述したように、FC4またはPBS単独で処置しかつCBCによりF
ACSにより分析したものに比較して、すべてのTACI−FC4処置試料から採った末梢
血細胞において第7日（CBCによる）および第12日（FACSを使用する）に、B細胞
百分率の有意な減少が見られた。さらに、第14日にFC4処置したマウスからのも
のに比較して、TACI−FC4で処置した動物から採った脾臓中のB細胞は50％減少し
た。
【０３４２】 実施例15．抗dsDNA ELISA 自己免疫性は高いレベルの抗二本鎖DNA抗体により特性決定される。ztnf4を過
剰に発現するマウスおよびNZBWマウスの両方における抗dsDNA抗体のレベルを測
定するために、ELISAアッセイを開発した。96ウェルのマイクロタイタープレー
ト（Nunc）をポリ−L−リシン（Sigma）（0.1MのTris緩衝液pH7.3中の20μl／ml
）で75μl／ウェルにおいて被覆し、室温において一夜インキュベートした。次
いでプレートをdH２O中で洗浄し、ポリdAdT（Sigma）（0.1MのTris緩衝液pH7.3
中の20μl／ml）で75μl／ウェルにおいて被覆し、室温において60分間インキュ
ベートした。次いでプレートをdH２O中で洗浄し、Tris緩衝液中の2％BSA（Sigma
）で室温において30分間ブロックし、次いでdH２O中で最後に洗浄した。
【０３４３】 実施例10に記載するztnf4トランスジェニックマウスおよび実施例11に記載す
るNZBWマウスから、血清試料を採った。血清試料をTris緩衝液中の１％BSA／2％
BGG（Calbiochem）中で1：50に希釈した。次いで希釈試料を被覆したプレートの
中に1：50、1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200および1：6400
（50μl／ウェル）で滴定し、室温において90分間インキュベートした。
【０３４４】 次いでプレートをdH２O中で洗浄し、そして1％BSA／2％BGG中で1：1000に希釈
したヤギ抗マウスIgG−Fc−HRP（Cappel）を50μl／ウェルにおいて添加した。
プレートを室温において60分間インキュベートした。プレートをdH２O中で5×洗
浄し、OPD、1タブレット／10mlのDnovo Dで現像し、100μl／ウェルでプレート
した。現像剤を1N H２SO４、100μl／ウェルで停止させ、ODを492nmにおいて読
んだ。 図8は、NZBWF1（32週齢）およびMRL／lpr／lpr（19週齢）マウスからの血清中
で検出されたレベルに比較して、2匹のztnf4トランスジェニックマウス（23週齢
）、2匹の非トランスジェニック同腹交配体における抗dsDNAレベルを示す。
【０３４５】 実施例16．ELEの自発的モデルにおける可溶性TACI−Ig 25匹の雌PLxSJL F1マウス（12週齢、Jackson Labs）に、完全フロインドア
ジュバント中で処方した125μg／マウスの抗原（ミエリンプロテオリピドタンパ
ク質、PLP、残基139〜151）を皮下注射した。マウスを5匹のマウスの5グループ
に分割する。百日咳トキシン（400ng）を第0日および第2日に腹腔内注射する。
グループに1×、10×、または100×投与量のTACI、BCMAまたはBR43x2を与え、1
つのグループにベヒクルのみを与え、そして1つのグループを処置しない。
【０３４６】 予防的処置は第0日に開始し、関与的処置は第7日に、あるいは臨床的徴候の発
現において開始する。疾患の徴候、体重喪失、および麻痺はほぼ10〜14日に発現
し、約1週連続する。体重を収集し、それらの症状の程度に対応する臨床的スコ
アを割当てることによって、動物を評価する。EAEの臨床的徴候は接種の10〜14
日以内に出現し、ほぼ1週間持続する。研究の終わりにおいて、すべての動物を
ガスの過剰投与により安楽死させ、剖検する。脳および脊髄を組織学のために収
集するか、あるいはmRNA分析のために凍結させる。体重および臨床的スコアのデ
ータを個体およびグループによりプロットする。
【０３４７】 臨床的スコア 0 正常 0.5 弱い、尾の緊張が減少するが、非存在ではない。 1 力のない尾（マウスを尾の基部で持ち上げるとき直立しない）。 2 力のない、弱い脚（尾を持ち上げることができない、後ろ脚で直立す るが、脚は不安定である）。 3 麻痺（体重下に脚で座ることができず、脚でこいで後方に歩くことが できない）。 4 麻痺（後ろ脚を後方に動かすことができない、歩こうとしたとき、脚 を引きずる）。 5 四肢麻痺（前脚の麻痺または円形パターンの歩き、頭を傾けることが できる）。 6 瀕死（完全に麻痺、食物または水に到達することができない、動物を 殺す）。 実施例17．慢性関節リウマチのTACI−FCおよびCIAモデル 8週齢の雄DBA／1Jマウス（Jackson Labs）を5マウス／移植片拒絶反応のグル
ープに分割し、3週の間隔で50〜100μlの1mg／mlのコラーゲン（ヒヨコまたはウ
シ由来）を2回皮下注射する。1匹の対照にコラーゲンを注射しない。第1注射を
完全フロインドアジュバント中で処方し、第2注射を不完全フロインドアジュバ
ント中で処方する。第2注射時にまたはその前に、あるいは動物が少なくとも24
時間持続する2またはそれより大きい臨床的スコアを発生した後、TACI−FCを予
防的に投与する。
【０３４８】 第2コラーゲン注射後、通常2〜3週以内に、動物は関節炎の症候を示し始める
。足の厚さをキャリパーで測定し、各足に対する臨床的スコア（0〜3）を評価す
ることによって、疾患の程度を各足において評価する。臨床的スコア、0 正常
、1 足指の炎症、2 軽度の足の炎症、3 中程度の足の炎症、および4 重度の
足の炎症。1組の期間、使用7日間に確立された疾患を有するようになった後、動
物を安楽死させる。足を組織学またはmRNA分析のために収集し、そして血清を免
疫グロブリンおよびサイトカインのアッセイのために収集する。
【０３４９】 実施例18．中和性TACI抗体 2匹の雌ニュージーランド白ウサギをペプチド、huztnf4−1 SAGIAKLEEGPELQL
AIPRE（配列番号59）またはhuztnf4−2 SFKRGSALEEKENKELVKET（配列番号60）
で免疫化することによって、ポリクローナル抗ペプチド抗体を調製した。Applie
d Biosystems 431A型ペプチド合成装置（Applied Biosystems，Inc.、フォス
ターシティー、カリフォルニア州）を製造業者のインストラクションに従い使用
して、ペプチドを合成した。
【０３５０】 次いでペプチドを担体タンパク質キーホールリンペットヘモシアニン（KLH）
にマレイミド活性化により複合化した。ウサギの各々に完全フロインドアジュバ
ント中の200μgのペプチドを初期腹腔内（ip）注射を与え、次いで3週毎に不完
全フロインドアジュバント中の100μgのペプチドをブースターip注射した。第2
ブースター注射（3回の全注射）の投与後7〜10日に、動物を放血させ、血清を収
集した。次いで動物にブースター投与し、3週毎に放血させた。
【０３５１】 抗体ターゲットとして抗体（配列番号59および60）をつくるために使用した1
μg／mlのペプチドを使用するELISA力価チェックにより、ztnf4ペプチド特異的
ウサギ血清を特性決定した。huztnf4−1ペプチド（配列番号59）に対する2つの
ウサギ血清は、1：1E5（1：100000）の希釈でそれらの特異的ペプチドに対する
力価を有する。huztnf4−2ペプチド（配列番号60）に対する2つのウサギ血清は
、1：1E5の希釈でそれらの特異的ペプチドに対して、そして組換え全長のタンパ
ク質（バキュロウイルス（huztnf4s−NF−Bv）においてつくられたN末端のFLAG
タッグドztnf4およびBHK細胞においてつくられたC末端のFLAGタッグドztnf4）に
対して力価を有した。
【０３５２】 10mgの特異的ペプチド（配列番号59または60）／gのCNBr−SEPHAROSEを使用し
て調製されたCNBr−SEPHAROSE 4Bタンパク質カラム（Pharmacia LKB）を使用
してウサギ血清から、ztnf4ペプチド特異的ポリクローナル抗体をアフィニティ
ー精製し、次いでPBS中の一夜20×透析した。抗体ターゲットとして1μg／mlの
適当なペプチド抗原または組換え全長のタンパク質（huztnf4s−NF−Bv）を使用
するELISA力価チェックにより、ztnf4特異的抗体を特性決定した。
【０３５３】 その特異的抗原（huztnf4−1ペプチド、配列番号59）に対するウサギ抗huztnf
4−1アフィニティー精製した抗体のより低い検出限界（LLD）は、5ng／mlの希釈
である。その特異的抗原（huztnf4−2ペプチド、配列番号60）に対するウサギ抗
huztnf4−2アフィニティー精製した抗体のより低い検出限界（LLD）は、0.5ng／
mlの希釈である。組換えタンパク質huztnf4s−NF−Bvに対するウサギ抗huztnf4
−2アフィニティー精製した抗体のより低い検出限界（LLD）は、5ng／mlの希釈
である。
【０３５４】 マウスモノクローナル抗体をまた発生させ、ビオチン標識化可溶性ztnf4の阻
害の阻害のために選択した。TACIモノクローナル抗体（248.14、248.23、248.24
、または246.3）のいずれもBCMAに対するztnf4の結合をブロックしない。モノク
ローナル248.23は、コンディショニングした培地を1：243に希釈したとき、10ng
／mlのztnf4−ビオチンの結合を約50％に減少させ、そして未希釈測定中で約2×
に結合を減少させる。モノクローナル246.3はコンディショニングした培地の1：
243および1：181の希釈においてztnf4−ビオチンの結合を約50％減に少させ、そ
して未希釈測定中で約5×に結合を減少させる。
【０３５５】 以上から、理解されるように、本発明の特定の態様を例示の目的で本明細書に
記載したが、本発明の精神および範囲から逸脱しないで種々の変更が可能である
。したがって、本発明は添付された特許請求の範囲による以外制限されない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図1は、BR43x2、TACI（von BuelowおよびBram、前掲）（配列番号6）、BCMA
（Gras他、前掲）（配列番号6）およびBR43x1（配列番号7）の間の多重アミノ酸
配列整列を示す。システインに富んだ擬反復およびトランスメンブランドメイン
が記載されている。
【図２】 図2は、安定なBHKトランスフェクタントにより発現されたTACIおよびBCMAに結
合する可溶性I１２５−ztnf4のスキャッチャードプロット分析を示す。
【図３Ａ】 図3Aは、免疫グロブリンを増殖させかつ分泌するztnf4共活性化ヒトBリンパ球
を示す。
【図３Ｂ】 図3Bは、9日の培養後にIL4またはIL4＋IL5の存在下に可溶性ztnf4で刺激したB
細胞から得られた上清中で測定したIgMおよびIgGのレベルを示す。
【図４】 図4は、in vitroにおいて5日間IL−4の存在下に可溶性ztnf4または対照タン
パク質（ユビクイチン）で刺激したヒト末梢血B細胞で刺激した。精製したTACI
−Ig、BCMA−Igおよび対照Fcをztnf4特異的増殖の阻害について試験した。
【図５Ａ】 図5Aは、SLEの特性を発生させたztnf4トランスジェニック動物からの結果で刺
激した。
【図５Ｂ】 図5Bは、CD5、CD4およびCD8に対する抗体で染色したztnf4トランスジェニック
動物からのリンパ節、脾臓および胸腺細胞で刺激した。
【図５Ｃ】 図5Cは、6〜23週齢の範囲のトランスジェニックztnf4動物からの血清中の全Ig
M、IgGおよびIgEで刺激した。
【図５Ｄ】 図5Dは、ztnf4トランスジェニック動物からの腎臓切片において同定された糸
球体のアミロイドの沈着および厚くなった糸球体間質で刺激した。
【図５Ｅ】 図5Eは、ztnf4トランスジェニックマウスにおけるエフェクターT細胞を示す。
【図６Ａ】 図6Aは、SLEの発生と相関するZNBWF1マウスおよびMRL／lpr／lprマウスから得
られた血清中の増加したztnf4レベルを示す。
【図６Ｂ】 図6Bは、SLEの発生と相関するZNBWF1マウスおよびMRL／lpr／lprマウスから得
られた血清中の増加したztnf4レベルを示す。
【図７】 図7は、研究の過程にわたってタンパク尿を発生するNZBWF1マウスの百分率を
示す。
【図８】 図8は、ZNBWF1およびMRL／lpr／lprマウスからの血清と比較したztnf4トラン
スジェニックマウスおよび対照同腹子からのELISAによる抗dsDNAレベルを示す。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 7/02 Ａ６１Ｐ 7/06 ４Ｈ０４５ 7/06 9/12 9/12 11/00 11/00 11/06 11/06 13/12 13/12 19/02 19/02 21/04 21/04 25/28 25/28 29/00 29/00 １０１ １０１ 31/04 31/04 31/18 31/18 35/00 35/00 35/02 35/02 37/00 37/00 37/02 37/02 37/06 37/06 43/00 １０５ 43/00 １０５ １１１ １１１ Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ０７Ｋ 14/715 16/28 16/28 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 21/08 15/09 ＺＮＡ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ， ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，Ｓ Ｌ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 シュー，ウェンフェン アメリカ合衆国，ワシントン 98275，マ キルテオ，フィフティーフォース アベニ ュ ウエスト 12432 (72)発明者 マデン，カレン アメリカ合衆国，ワシントン 98102，シ アトル，フェアビュー アベニュ イース ト 2364 ＃２ (72)発明者 イー，デビッド ピー． アメリカ合衆国，マサチューセッツ 02139，ケンブリッジ，２ウエスト，メモ リアル ドライブ 640 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA44 BA61 BA63 CA01 CA04 CA07 CA11 DA01 DA02 DA05 DA11 EA01 EA02 EA03 EA04 FA01 FA02 FA07 GA03 GA11 HA01 4B064 AG20 AG27 CA01 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 4B065 AA01X AA57X AA87X AA90Y AB01 AB02 BA01 BA08 CA24 CA25 CA44 4C084 AA02 AA07 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 BA41 BA44 CA18 DA01 DA39 DA58 NA14 ZA021 ZA421 ZA551 ZA591 ZA811 ZA941 ZA961 ZB021 ZB051 ZB071 ZB111 ZB151 ZB212 ZB261 ZB271 ZB351 ZC311 ZC351 ZC511 ZC551 4C085 AA13 AA14 AA22 AA34 BB14 BB17 DD61 DD62 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA75 DA76 EA20 FA72 FA74

Claims (63)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 哺乳動物におけるｚｔｎｆ４活性を阻害する方法において、 ａ） ＢＲ４３ｘ２の細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； ｂ） ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； ｃ） ＢＣＭＡの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； ｄ） 配列番号１０の配列を含んでなるポリペプチド； ｅ） 配列番号２のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメ
    ント； ｆ） 配列番号４のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメ
    ント； ｇ） 配列番号６のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメ
    ント； ｈ） 配列番号８のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメ
    ント； ｉ） 配列番号１０のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグ
    メント； ｋ） 配列番号４のポリペプチド； ｌ） 配列番号６のアミノ酸残基１〜１６６のアミノ酸残基；および ｍ） 配列番号８のアミノ酸残基１〜１５０のアミノ酸残基； から成る群から選択されるある量の化合物を哺乳動物に投与することを含んでな
    る方法。
  2. 【請求項２】 前記化合物がペプチド結合により結合された第１部分と第２
    部分とから成る融合タンパク質であり、前記第１部分が ａ） 配列番号８の配列を含んでなるポリペプチド； ｂ） 配列番号２のアミノ酸残基２５〜５８を含んでなるポリペプチド； ｃ） 配列番号６のアミノ酸残基３４〜６６を含んでなるポリペプチド； ｄ） 配列番号６のアミノ酸残基７１〜１０４を含んでなるポリペプチド； ｅ） 配列番号６のアミノ酸残基２５〜１０４を含んでなるポリペプチド； ｆ） 配列番号８のアミノ酸残基８〜３７を含んでなるポリペプチド； ｇ） 配列番号８のアミノ酸残基４１〜８８を含んでなるポリペプチド； ｈ） 配列番号８のアミノ酸残基８〜８８を含んでなるポリペプチド； から成る群から選択されるポリペプチドを含んでなり、そして 前記第２部分が他のポリペプチドを含んでなる、 請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記第１部分が、 ａ） 配列番号２のアミノ酸残基５９〜１２０； ｂ） 配列番号６のアミノ酸残基１０５〜１６６；および ｃ） 配列番号８のアミノ酸残基８９〜１５０； から成る群から選択されるポリペプチドをさらに含んでなる、請求項２に記載の
    方法。
  4. 【請求項４】 前記第１部分が、 ａ） ＢＲ４３ｘ２の細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； ｂ） ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；および ｃ） ＢＣＭＡの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 前記第１部分が、 ａ） 配列番号４のポリペプチド； ｂ） 配列番号６のアミノ酸残基１〜１５４；および ｃ） 配列番号８のアミノ酸残基１〜４８； から成る群から選択される、請求項２に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記第２部分が免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求項
    ２に記載の方法。
  7. 【請求項７】 前記抗体または抗体フラグメントが、 ａ） ポリクローナル抗体； ｂ） ネズミモノクローナル抗体； ｃ） 上記ｂ）に由来するヒト化抗体；および ｄ） ヒトモノクローナル抗体； から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記抗体フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）、Ｆａ
    ｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、および最小認識ユニットから成る群から選択さ
    れる、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記哺乳動物が霊長類である、請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 前記ｚｔｎｆ４活性がＢリンパ球に関連する、請求項１に
    記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記ｚｔｎｆ４活性が活性化Ｂリンパ球に関連する、請求
    項１に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記ｚｔｎｆ４活性が休止Ｂリンパ球に関連する、請求項
    １に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記ｚｔｎｆ４活性が抗体産生に関連する、請求項１に記
    載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記抗体産生が自己免疫疾患に関連する、請求項１３に記
    載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、重症筋無
    力症、多発性硬化症、または慢性関節リウマチである、請求項１４に記載の方法
    。
  16. 【請求項１６】 前記ｚｔｎｆ４活性がぜん息、気管支炎または気腫に関連
    する、請求項１に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記ｚｔｎｆ４活性が末期腎不全に関連する、請求項１に
    記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記ｚｔｎｆ４活性が腎臓病に関連する、請求項１に記載
    の方法。
  19. 【請求項１９】 前記腎臓病が糸球体腎炎、脈管炎、腎炎または腎盂腎炎で
    ある、請求項１８に記載の方法。
  20. 【請求項２０】 前記腎臓病が腎臓新形成、多発性骨髄腫、リンパ腫、軽鎖
    神経疾患またはアミロイドーシスに関連する、請求項１に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 前記ｚｔｎｆ４活性がエフェクターＴ細胞に関連する、請
    求項１に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 前記ｚｔｎｆ４活性が免疫応答の緩和に関連する、請求項
    ２１に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記ｚｔｎｆ４活性が免疫抑制に関連する、請求項２１に
    記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記免疫抑制が移植片拒絶、移植片対宿主病または炎症に
    関連する、請求項２１に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記活性が自己免疫疾患に関連する、請求項２４に記載の
    方法。
  26. 【請求項２６】 前記自己免疫疾患がインスリン依存性真性糖尿病または膠
    原病である、請求項２５に記載の方法。
  27. 【請求項２７】 前記ｚｔｎｆ４活性が炎症に関連する、請求項２６に記載
    の方法。
  28. 【請求項２８】 前記炎症が関節の疼痛、腫脹、貧血、または敗血症性ショ
    ックである、請求項２７に記載の方法。
  29. 【請求項２９】 ＢＲ４３ｘ２、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡのレセプター−リ
    ガンド結合を阻害する方法において、 ａ） ＢＲ４３ｘ２の細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； ｂ） ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； ｃ） ＢＣＭＡの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； ｄ） 配列番号１０の配列を含んでなるポリペプチド； ｅ） 配列番号２のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメ
    ント； ｆ） 配列番号４のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメ
    ント； ｇ） 配列番号６のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメ
    ント； ｈ） 配列番号８のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグメ
    ント； ｉ） 配列番号１０のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグ
    メント； ｊ） 配列番号１８のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグ
    メント； ｋ） 配列番号２０のポリペプチドに特異的に結合する抗体または抗体フラグ
    メント； ｋ） 配列番号４のポリペプチド； ｌ） 配列番号６のアミノ酸残基１〜１６６のアミノ酸残基；および ｍ） 配列番号８のアミノ酸残基１〜１５０のアミノ酸残基； から成る群から選択されるある量の化合物を投与することを含んでなる方法。
  30. 【請求項３０】 前記化合物がペプチド結合により結合された第１部分と第
    ２部分とから成る融合タンパク質であり、前記第１部分が ａ） 配列番号８の配列を含んでなるポリペプチド； ｂ） 配列番号２のアミノ酸残基２５〜５８を含んでなるポリペプチド； ｃ） 配列番号６のアミノ酸残基３４〜６６を含んでなるポリペプチド； ｄ） 配列番号６のアミノ酸残基７１〜１０４を含んでなるポリペプチド； ｄ） 配列番号６のアミノ酸残基２５〜１０４を含んでなるポリペプチド； ｆ） 配列番号８のアミノ酸残基８〜３７を含んでなるポリペプチド； ｇ） 配列番号８のアミノ酸残基４１〜８８を含んでなるポリペプチド； ｈ） 配列番号８のアミノ酸残基８〜８８を含んでなるポリペプチド； から成る群から選択されるポリペプチドを含んでなり、そして 前記第２部分が他のポリペプチドを含んでなる、 請求項２９に記載の方法。
  31. 【請求項３１】 前記第１部分が、 ａ） 配列番号２のアミノ酸残基５９〜１２０； ｂ） 配列番号６のアミノ酸残基１０５〜１６６；および ｃ） 配列番号８のアミノ酸残基８９〜１５０； から成る群から選択されるポリペプチドをさらに含んでなる、請求項３０に記載
    の方法。
  32. 【請求項３２】 前記第１部分が、 ａ） ＢＲ４３ｘ２の細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； ｂ） ＴＡＣＩの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド；および ｃ） ＢＣＭＡの細胞外ドメインを含んでなるポリペプチド； から成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  33. 【請求項３３】 前記第１部分が、 ａ） 配列番号４のポリペプチド； ｂ） 配列番号６のアミノ酸残基１〜１５４；および ｃ） 配列番号８のアミノ酸残基１〜４８； から成る群から選択される、請求項３０に記載の方法。
  34. 【請求項３４】 前記第２部分が免疫グロブリン重鎖定常領域である、請求
    項３０に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 前記抗体または抗体フラグメントが、 ａ） ポリクローナル抗体； ｂ） ネズミモノクローナル抗体； ｃ） 上記ｂ）に由来するヒト化抗体；および ｄ） ヒトモノクローナル抗体； から成る群から選択される、請求項２９に記載の方法。
  36. 【請求項３６】 前記抗体フラグメントが、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）、Ｆ
    ａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、および最小認識ユニットから成る群から選択
    される、請求項３５に記載の方法。
  37. 【請求項３７】 前記ＢＲ４３ｘ２、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡのレセプター
    −リガンド結合がＢリンパ球に関連する、請求項２９に記載の方法。
  38. 【請求項３８】 前記ＢＲ４３ｘ２、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡのレセプター
    −リガンド結合が活性化Ｂリンパ球に関連する、請求項２９に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 前記ＢＲ４３ｘ２、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡのレセプター
    −リガンド結合が休止Ｂリンパ球に関連する、請求項２９に記載の方法。
  40. 【請求項４０】 前記ＢＲ４３ｘ２、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡのレセプター
    −リガンド結合が抗体産生に関連する、請求項２９に記載の方法。
  41. 【請求項４１】 前記抗体産生が自己免疫疾患に関連する、請求項２９に記
    載の方法。
  42. 【請求項４２】 前記自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、重症筋無
    力症、多発性硬化症、または慢性関節リウマチである、請求項４１に記載の方法
    。
  43. 【請求項４３】 前記ＢＲ４３ｘ２、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡのレセプター
    −リガンドの結合がぜん息、気管支炎または気腫に関連する、請求項２９に記載
    の方法。
  44. 【請求項４４】 前記ＢＲ４３ｘ２、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡのレセプター
    −リガンド結合が末期腎不全に関連する、請求項２９に記載の方法。
  45. 【請求項４５】 前記ＢＲ４３ｘ２、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡのレセプター
    −リガンド結合が腎臓病に関連する、請求項２９に記載の方法。
  46. 【請求項４６】 前記腎臓病が糸球体腎炎、脈管炎、腎炎または腎盂腎炎で
    ある、請求項４５に記載の方法。
  47. 【請求項４７】 前記レセプター−リガンド結合が腎臓新形成、多発性骨髄
    腫、リンパ腫、軽鎖神経疾患またはアミロイドーシスに関連する、請求項２９に
    記載の方法。
  48. 【請求項４８】 前記ＢＲ４３ｘ２、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡのレセプター
    −リガンド結合がエフェクターＴ細胞に関連する、請求項２９に記載の方法。
  49. 【請求項４９】 前記ＢＲ４３ｘ２、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡのレセプター
    −リガンド結合が免疫応答の緩和に関連する、請求項４８に記載の方法。
  50. 【請求項５０】 前記レセプター−リガンド結合が免疫抑制に関連する、請
    求項４９に記載の方法。
  51. 【請求項５１】 前記免疫抑制が移植片拒絶、移植片対宿主病または炎症に
    関連する、請求項５０に記載の方法。
  52. 【請求項５２】 前記活性が自己免疫疾患に関連する、請求項５０に記載の
    方法。
  53. 【請求項５３】 前記自己免疫疾患がインスリン依存性真性糖尿病または膠
    原病である、請求項５２に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 前記ＢＲ４３ｘ２、ＴＡＣＩまたはＢＣＭＡのレセプター
    −リガンド結合が炎症に関連する、請求項５０に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 前記炎症が関節の疼痛、腫脹、貧血、または敗血症性ショ
    ックである、請求項５４に記載の方法。
  56. 【請求項５６】 配列番号２のポリペプチドをコードする単離されたポリヌ
    クレオチド分子。
  57. 【請求項５７】 配列番号１の単離されたポリヌクレオチド分子。
  58. 【請求項５８】 下記の作用可能に連鎖された因子： 転写プロモーター； 請求項５６に記載のポリヌクレオチド分子；および 転写ターミネーター； を含んでなる発現ベクター。
  59. 【請求項５９】 前記ポリヌクレオチド分子に作用可能に連鎖された分泌レ
    セプター−リガンドの結合配列をさらに含んでなる、請求項５８に記載の発現ベ
    クター。
  60. 【請求項６０】 前記培養された細胞が前記ポリヌクレオチドセグメントに
    よりコードされる前記ポリペプチドを発現する、請求項１８に記載の発現ベクタ
    ーが導入された培養された細胞。
  61. 【請求項６１】 ポリペプチドを産生する方法において、 請求項５８に記載の発現ベクターが導入された細胞を培養し； これにより前記細胞は前記ポリヌクレオチド分子によりコードされる前記ポリ
    ペプチドを発現し；そして 前記発現されたポリペプチドを回収する； ことを含んでなる方法。
  62. 【請求項６２】 配列番号２の配列を有する単離されたポリペプチド。
  63. 【請求項６３】 薬学上許容されるビヒクルと組み合わせた、請求項６２に
    記載のポリペプチド。
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