JP2008504810A - キメラタンパク質およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
図1Aにて略図的に示したように、キメラTBP−PE遺伝子(図1C、配列番号:1)を調製するために、TBP(p55 TNFレセプターの細胞外部分)およびシュードモナスエクソトキシンのドメインII、IbおよびIIIを含む、PE(シュードモナスエクソトキシンの40kDa断片)をコードする各DNA断片を、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅によって増幅し、融合させた。
TBP−PEベクター(pTBP−PE)を含む、細菌株BL21(DE3)pLysを、0.4%グルコース、1.68mM MgSO4および100μg/ml アンピシリンを含む1リットルのSuperブロス中で、37℃にて培養した。600nmでの吸収が、2.6にn達したときに、組換え体タンパク質発現の誘導を、培養液に、最終濃度1mMで、IPTG(イソプロピル ベータ−D−チオ−ガラクトピラノシド)を、約90分間添加することによって実施した。細菌細胞を、4℃にて10分間、7500×gにて遠心することによって、培養液から回収し、細胞ペレットを、−70℃にて16時間凍結した。
TBP−PEキメラを、抗TBP−1架橋カラムでのアフィニティークロマトグラフィーによって、実施例2のTBP−PEを含む再折りたたみ未精製抽出物から精製した。
実施例を実施することにおいて、再折りたたみTBP−PEが、TBPI抗体によって認識されることが示された。以下の実験は、TBP−PEが、伸張因子II(EF−2)をADP−リボシル化可能であるかどうかを評価するために実施した。シュードモナスエクソトキシンの毒性は、タンパク質合成を阻害するエクソトキシンの能力による。エクソトキシンは、NAD+が存在する条件で、アミノ酸のタンパク質内への取り込みをすばやく阻害する。シュードモナスエクソトキシンの存在において、NAD+の二リン酸アデノシンリボース部位が、伸張因子II(EF−2)との共有結合内に移され、因子の不活性誘導体が産生される。毒素は、この反応において触媒的に働く。
TBP−PEキメラのADP−リボシル化活性を調査するために、再折りたたみキメラ、または封入体の分離前後の未精製大腸菌溶解物を含む試料を、200μlのTE−50(Tris、50mM、pH8)および20μlの小麦麦芽からのEF−2(シグマ)を含む溶液中でインキュベートした。ついで10μlのNAD+−14Cを添加し、反応混合液を短くボルテックスし、37℃にて20分間インキュベートして、すべてのNAD+−14Cを、TBP−PEによって誘導されたEF−2に組み込ませた。20分のインキュベーションに続いて、タンパク質を、0.5mlの10%TCAの添加(ボルテックス)と遠心(4℃にて5分間、3000rpm)によって沈殿させた。上清を捨てたのち、ペレットを1mlの10%TCAで洗浄し、100μlの1M NaOHを10分間添加し、頻繁に混合し(ボルテックス)、ペレットを溶解させた。10分後、0.4mlの0.4M酢酸を添加し、混合した。放射活性ラベルのタンパク質内への組み込みを、ガンマ計数器中で、4mlのシンチレーション溶液中で測定した。
未精製TBP−PEの濃度をまず、Bradford試薬で推定し、約70μg/mlであるとわかり(実施例2を参照のこと)、ついでウェスタンブロットのデンシトメトリー解析(図2A)によって、約45μg/mlであるとわかった。
2つの細胞株を、TBP−PEの細胞毒性効果を探索するために使用した。(a)(German Collection of Microorganisms and Cell Cultureから得た)ヒト急性単球性白血病THPI細胞。これらの細胞の単球性分化を、ホルボールミリスチル酸酢酸(PMA)で誘導可能である。これらの細胞を、10%Fcs、2mM L−グルタミン、1mM Na−ピルビン酸、1% 非必須アミノ酸、9mg/ml インスリン、100mg/ml ペニシリンおよび100mg/ml ストレプトマイシンを含む、RPMI1640培養中、0.3〜1×106/mlの細胞密度範囲で培養する。細胞表面TNF発現を促進するために、(16〜20時間、100ng/ml)PMAにて活性化したこれらの細胞を、LPS(1mkg/ml、1.5時間)で処理し、10μg/ml メタロプロテアーゼ阻害剤GM6001(カルビオケム(Calbiochem))で、試験の前に2時間処理した。
キメラタンパク質TBP−PE(および対照として、可溶性TNFレセプターのみ)の細胞毒性活性を、両方が膜結合TNFを過剰発現している、2つの種類の細胞、上皮細胞および単球様細胞で試験した。
HeLa−M9およびHeLa細胞を、ウェルあたり、4×104の密度にて、96−ウェル組織培養液プレート中に、アッセイの1日前にまいた。600ng/mlの濃度でのTBP−PEを、3時間細胞に添加した。いくつかのウェルで、TBPIを、TBPI−PEと同時に適用して、TNF結合に関して競合させた。3時間のインキュベーションの後、培地をDMEM+10%Fcsで置換し、細胞を、16時間さらに増殖させた。細胞をPBSにて1回洗浄し、Met、Cis−を含まないRPMI中で10分間、そして、100mlの35S−Met−含有、Met、Cis−を含まないRPMI(55mcCi/100μlの35S−Met)中で30分間インキュベートした。30分のインキュベーション後、培地を除去し、細胞をMet、Cis−を含まないRPMIにて3回洗浄し、200μl SDS−緩衝液[PBS中1% SDS、20mM 2−メルカプトエタノール、2mM EDTA]中で溶解し、100℃まで前加熱した。細胞溶解物をマイクロチューブに移し、5分間ゆで、5分間遠心した。上清(約100μl容量)中のタンパク質を、TCA沈殿にかけた。
TNF−α発現細胞(HeLa M9または他)を、0.1mg/mlのBSAを含む培地中で、37℃にて、[125I]−共役物(1μg/ml)で標識化した。ついで細胞をトリプシン処理し、氷冷PBSで洗浄し、PBS中の0.3%プロナーゼ中で再懸濁し、ジブチルフタレートを介する遠心の前に2Cにて40分間維持した。エンドサイトーシス効率を、取り込み30分後の、細胞関連[125I]−共役物のプロナーゼ−耐性割合として表す(Taupiac M-P.ら, 1999から変性された)。
遠心によって回収した細胞ペレットを、Laemmli緩衝液中に溶解させた。試料を、0.1%SDS、10%アクリルアミドスラブゲルに適用する前に5分間沸騰させた。ゲルをクーマシーブルーによって、または銀染色によって染色可能である。
6ヵ月齢Balb/cマウスに、0.1μg/マウス〜40μg/マウスの範囲で、種々の用量のキメラタンパク質(および、対照として、キメラタンパク質に組み込まれた毒素および可溶性TNFレセプター)を腹腔内に注射した。マウスの生存を、48時間以降査定した。
キメラタンパク質の、(そして対照として、キメラタンパク質に組み込まれた毒素の、および可溶性TNFレセプターの)インビボ細胞殺傷活性を、細胞結合TNFを産生する腫瘍を持つマウス中で査定した。HeLa−M9細胞のコンフルエント培養を、PBS中5mM EDTAで回収し、懸濁して、PBSにて2回洗浄した。Balb/cヌードマウス(7〜8週齢、20〜21g体重)に、HeLa−M9細胞(1×107細胞/0.1ml/マウス)で、フランク領域内で、皮下に移植した。5日後、マウスに、種々の用量の試験したキメラタンパク質を腹腔内に注射し、ついで、毎週1回再び注射した。細胞の移植部位での発生、大きさおよび質量を11週後に査定した。
その発現の翻訳調節を提供する、3’非コード領域が、β−グロブリン遺伝子のものとともに発現した[17]、ヒトTNFトランスジーンを発現しているトランスジェニックマウスを使用した。生誕の2週間後、マウスに、種々の用量の試験したキメラタンパク質を腹腔内に注射し(以下を、対照としてマウスに注射するために使用する。毒素のみまたは可溶性TNFレセプターのみ)、ついで、9週間の間隔で、1週間に1回、再び注射した。マウスの後ろ足首関節の腫れを、関節の直径を決定することによって、定期的に査定する。関節構造に関連する損傷/変化:関節鞘、関節空間、滑膜、関節軟骨および軟骨下骨を組織学的に評価した。
Lewisラットを、完全フロイドアジュバント中の0.5mg メチル化ウシ血清アルブミン(mBSA)で、後ろ脇腹中で免疫した。21日後(0日)、動物に、ピローゲンを含まない生理食塩水中の50μg mBSAを、両後ろ膝関節中に注射した。ラットに、その日、および続く2日間(0、1および2日)、両膝関節中に、試験タンパク質を関節内に注射した(対照として、毒素のみまたは可溶性TNFレセプターのみを注射した)。膝関節幅を、治療に相対して、0〜6日で毎日測定する。6日目に回収した関節の組織病理学実験を実施した。関節構造に関連する損傷/変化:関節鞘、関節空間、滑膜、関節軟骨および軟骨下骨を組織学的に評価した。
オスDBA/1マウス(8〜12週齢)を、尾の根本での皮内注射によって、FCA内(ディフコ(Difco)、Detroit,MI)で乳化させたII型コラーゲン、100μgで免役した。免疫の時間から開始して、マウスに、臨床的関節炎の開始まで、PBS中の試料タンパク質を、1週間に2回、腹腔内に注射した(対照として、毒素のみまたは可溶性TNFレセプターのみを注射した)。免疫後15日から、マウスを10日間、2つの臨床パラメータ、足のふくらみと臨床スコアを用いて、疾患の開始に関して毎日試験した。足のふくらみは、カリパスで最初に影響を受けた後ろ足の厚さを測定することによって査定した。
Harlan UKにて購入した、IL−10ノックアウトマウスを、IL10遺伝子欠損に関するマウス同型を産生するために交雑し、その尾DNAにて実施したPCRによて同型に関してスクリーンした。4週齢で開始して、マウスに、20週齢まで、PBS中の試験タンパク質を毎週3回腹腔内に注射した(対照として、毒素のみまたは可溶性TNFレセプターのみを注射した)。臨床スコア、腸の組織学的解析、スツール中の炎症性サイトカインの含量を、[18]で示したように評価した。
共役物内に組み込まれたp75 TNFレセプター(TNFRSF1B、Genbank ID M32315)の可溶性系列の配列は、レセプターの細胞外ドメインの前配列(Leu1からAsp235まで)に相当する。この配列を、PEの配列に融合させ、実施例1で記述したようにpET−ベクター内に挿入した。
Claims (67)
- TNF/NGFファミリーのレセプターのリガンドを異常に高レベルで発現している細胞を殺すか、または改変できるキメラタンパク質であって、該レセプターの細胞外部分からなる少なくとも1つのポリペプチドのアミノ酸配列を含み、該ポリペプチドが、エフェクター分子に連結されているキメラタンパク質、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分。
- 前記ポリペプチドが、TNFレセプター、CD27、CD30、CD40およびFasからなる群より選択されるレセプターの細胞外部分からなる請求項1記載のキメラタンパク質。
- 前記ポリペプチドが、TNFレセプターの細胞外部分からなる請求項2記載のキメラタンパク質。
- TNFレセプターが、p55 TNFレセプターであり、細胞外部分が、TNF結合タンパク質−1(TBPI)である請求項3記載のキメラタンパク質。
- 前記エフェクター分子が、シュードモナスエクソトキシン、ジフテリア毒素、リシン、アブリン、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、サポリンおよびゲロニン、またはそれらの断片からなる群より選択される細胞傷害性分子である請求項1〜4のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
- 前記エフェクター分子が、シュードモナスエクソトキシンの断片である請求項5記載のキメラタンパク質。
- 本明細書でPEと表記する、シュードモナスエクソトキシンの前記断片が、配列番号:3のアミノ酸配列に相当する請求項6記載のキメラタンパク質。
- 配列番号:2のアミノ酸配列に相当する、本明細書でTBP−PEと表記する請求項1〜7のいずれか1項に記載のキメラタンパク質、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分または塩。
- 前記エフェクター分子が、哺乳動物細胞死タンパク質である請求項1〜4のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
- 前記哺乳動物細胞死タンパク質が、Bax、BakおよびDNAフラグメンテーション因子40からなる群より選択される請求項9記載のキメラタンパク質。
- 前記エフェクター分子が、蛍光組成物または放射活性組成物である請求項1〜4のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
- 前記エフェクター分子が、シクロスポリン含有リポソームである請求項1〜4のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
- 前記エフェクター分子がサイトカインである請求項1〜4のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
- 前記サイトカインが免疫抑制性である請求項13記載のキメラタンパク質。
- 前記エフェクター分子が増殖因子である請求項1〜4のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
- 前記エフェクター分子が抗体である請求項1〜4のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
- 前記抗体が、腫瘍細胞抗原に対して特異的である請求項16記載のキメラタンパク質。
- 前記エフェクター分子が、Bclx、CAD−タンパク質、カスパーゼおよびIκBからなる群より選択された細胞内調節タンパク質である請求項1〜4のいずれか1項に記載のキメラタンパク質。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載のキメラタンパク質をコードする単離DNA配列。
- さらに、真核細胞における分泌のためのシグナルペプチドをコードする請求項19記載のDNA配列。
- TBP−PEまたはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分のアミノ酸配列をコードする請求項19または20記載のDNA、。
- 配列番号:1のヌクレオチド配列に相当する請求項21記載のDNA。
- 請求項19〜22のいずれか1項に記載のDNA配列を含む発現ベクター。
- 請求項23記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 前記細胞が真核細胞である請求項24記載の宿主細胞。
- 前記真核細胞が、HeLa、CHO、HEK293、THPI、酵母および昆虫細胞からなる群から選択される請求項25記載の宿主細胞。
- 前記細胞が原核細胞である請求項24記載の宿主細胞。
- 請求項24〜27のいずれか1項に記載の宿主細胞を培養すること、および産生されたキメラタンパク質を単離すること、を含む請求項1〜18のいずれか1項に記載のキメラタンパク質の製造方法。
- 産生された前記キメラタンパク質が、TBP−PE、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体または活性画分である請求項28記載の方法。
- 請求項1〜18のいずれか1項に記載のキメラタンパク質および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
- 前記キメラタンパク質が、TBP−PE、そのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩である請求項30記載の医薬組成物。
- 請求項19〜22のいずれか1項に記載のDNAおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
- 請求項23に記載のベクターおよび薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
- 疾患の治療のための医薬品の製造における請求項1〜18のいずれか1項に記載のキメラタンパク質の使用。
- 前記疾患が自己免疫疾患である請求項34記載の使用。
- 前記キメラタンパク質が、TBP−PE、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項35記載の使用。
- TNF/NGFファミリーのレセプターのリガンドが、疾患の発病および/または経過に関与する、疾患の治療のための請求項34記載の使用。
- 前記疾患の発病および/または経過に関与する前記リガンドが、TNFである請求項37記載の使用。
- 前記疾患が、敗血性ショック、移植片対宿主疾患、マラリア、関節性肝炎および結核からなる群より選択される急性疾患である請求項38記載の使用。
- 疾患が、慢性移植片対宿主疾患、関節リウマチ、若年性糖尿病、癌関連悪液質、炎症性腸疾患(IBD)および乾癬からなる群より選択される慢性疾患である請求項38記載の使用。
- キメラタンパク質が、TBP−PE、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項37〜40のいずれか1項に記載の使用。
- 前記疾患が癌であり、前記キメラタンパク質が、癌細胞によって発現されるTNF/NGFファミリーのレセプターのリガンドに結合する請求項34記載のキメラタンパク質の使用。
- 前記リガンドがTNFである請求項42記載の使用。
- 前記キメラタンパク質が、TBP−PE、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項43記載の使用。
- 前記癌が上皮由来である請求項44記載の使用。
- 前記癌が乳癌である請求項45記載の使用。
- キメラタンパク質が結合するリガンドを発現している有害な細胞を殺すための、自己移植前に癌患者の幹細胞を治療するための医薬品の製造における請求項1〜18のいずれか1項に記載のキメラタンパク質の使用。
- 前記キメラタンパク質が、幹細胞の採取前に患者に投与される請求項47記載の使用。
- TNFを発現している上皮細胞が、疾患の発病および/または経過に関与している疾患の治療のための医薬品の製造における、TBP−PE、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩の使用。
- 前記疾患が、乳癌、移植片対宿主疾患(GVH)、乾癬および炎症性腸疾患(IBD)からなる群より選択される請求項49記載の使用。
- 前記炎症性腸疾患が、クローン病または潰瘍性大腸炎である請求項50記載の使用。
- 必要としている対象に、治療的に有効量の、請求項1〜18のいずれか1項に記載のキメラタンパク質を投与することを含む、自己免疫疾患の治療方法。
- 前記キメラタンパク質が、TBP−PE、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項52記載の方法。
- 必要とする対象に、治療的に有効量の、請求項1〜18のいずれか1項に記載のキメラタンパク質を投与することを含む、TNF/NGFファミリーのレセプターのリガンドの活性が、前記疾患の発病、または経過に関与する、疾患の治療方法。
- 前記疾患の発病または経過に関与する前記リガンドが、TNFである請求項54記載の方法。
- 前記疾患が、敗血性ショック、移植片対宿主疾患、マラリア、感染性肝炎および結核からなる群より選択される急性疾患である請求項55記載の方法。
- 疾患が、慢性移植片対宿主疾患、関節リウマチ、若年性糖尿病、癌関連悪液質、炎症性腸疾患(IBD)および乾癬からなる群より選択される慢性疾患である請求項55記載の方法。
- 前記キメラタンパク質が、TBP−PE、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項54〜57のいずれか1項に記載の方法。
- 必要とする対象に、治療的に有効量の請求項1〜18のいずれか1項に記載のキメラタンパク質を投与することを含む、前記癌細胞が、TNF/NGFファミリーのレセプターのリガンドを発現する癌の治療方法。
- 前記リガンドがTNFである請求項59記載の方法。
- 前記キメラタンパク質が、TBP−PE、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩からなる請求項59または60のいずれか1項に記載の方法。
- 前記癌が上皮由来である請求項61記載の方法。
- 前記癌が乳癌である請求項62記載の方法。
- 必要とする対象に、治療的に有効量の請求項1〜18のいずれか1項に記載のキメラタンパク質を投与することを含む、自己移植の前に、TNFを発現している骨髄および/または動員末梢血細胞有害な細胞を殺すための方法。
- 前記キメラタンパク質を、骨髄細胞または動員末梢血細胞の採取前に必要な対象に投与する請求項64記載の方法。
- 必要な対象に、治療的に有効量のTBP−PE、またはそのムテイン、融合タンパク質、機能的誘導体、円順列誘導体、活性画分または塩を投与することを含む、TNFを発現している上皮細胞が、前記疾患の発病および/または経過に関与する疾患の治療方法。
- 前記疾患が、乳癌、移植片対宿主疾患、乾癬および炎症性腸疾患からなる群より選択される請求項66記載の方法。
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