BG105674A - Разтворим рецептор br43x2 и методи за използването му - Google Patents

Разтворим рецептор br43x2 и методи за използването му Download PDF

Info

Publication number
BG105674A
BG105674A BG105674A BG10567401A BG105674A BG 105674 A BG105674 A BG 105674A BG 105674 A BG105674 A BG 105674A BG 10567401 A BG10567401 A BG 10567401A BG 105674 A BG105674 A BG 105674A
Authority
BG
Bulgaria
Prior art keywords
polypeptide
seq
br43x2
antibody
taci
Prior art date
Application number
BG105674A
Other languages
English (en)
Other versions
BG65603B1 (bg
Inventor
Jane Gross
Wenfeng Xu
Karen Madden
David Yee
Original Assignee
Zymogenetics, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22849300&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=BG105674(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Zymogenetics, Inc. filed Critical Zymogenetics, Inc.
Publication of BG105674A publication Critical patent/BG105674A/bg
Publication of BG65603B1 publication Critical patent/BG65603B1/bg

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

Изобретението се отнася до разтворими, секретирани полипептиди на рецептора за туморно-некрозисен фактор, както и до полинуклеотиди, кодиращи полипептидите, и до свързани с тях състави и методи. Полипептидите могат да бъдат използвани за откриване на лиганди, агонисти и антагонисти, както и да се прилагат в методи, модулиращи В клетъчна активация. Изобретението се отнася и до методи за инхибиране на ztnf4 активност при бозайници, включващи прилагането на определено количество съединение, избрано от групата, състояща се от полипептид, съдържащизвънклетъчен домен на BR43x2, TACI или ВСМА. Изобретението включва и методи за получаване на полипептиди. Полипептидите съдържат едно цистеиново повторение, което е хомолог на други рецептори за туморно-некрозисен фактор, такива като трансмембраненактиватор и CAML-интегратор (TACI).

Description

Клетъчните взаимодействия, които се наблюдават по време на имунния отговор, са регулирани от членове на няколко фамилии на клетъчно повърхностни рецептори, включващи фамилията на туморния некротичен факторен рецептор (TNFR). TNFR фамилията съдържа определен брой интегрални мембранно гликопротеинови рецептори, много от които са свързани с техните съответни лиганди и регулират взаимодействията между различните хематопоетични клетъчни линии ( Smith et al., The TNF Receptor Superfamily of Cellular and Viral Proteins: Activation, Costimulation and Death, 76:959-62, 1994; Cosman, Stem Cells 12:440-55, 1994).
Такъв един рецептор е TACI, трансмембранен активатор и CAMLинтерактор (von Bulow and Bram, Science 228:138-41, 1997 и PCT публикация на WO 98/39361). TACI е мембранно свързващ рецептор c извънклетъчен домен, съдържащ две цистеинови псевдо повторения, трансмембранен домен и цитоплазмен домен, който взаимодейства с CAML (калциев модулатор и циклофилинов лиганд), неделим мембранен протеин, разположен върху вътреклетъчни везикули, който е ко-стимулатор на NF-АТ активация при свръхекспресиране в клетки на Jurkat. TACI е свързан с В клетки и конфигурация от Т клетки. Bulow and Bram посочват, че не е известен лиганд за TACI.
Установено е, че поЛипептидите съгласно настоящото изобретение, TACI изоформа само с едно цистеиново псевдо повторение (BR43x2), TACI и съответния В клетъчен протеин, ВСМА (Gras et al., Int.Immunol. 17:1093-106, 1995) се свързват към TNF лиганд, ztnf4, сега известно като неутрокин ( РСТ публикация, WO98/18921), BlyS (Moore et al., Science, 285:260-3, 1999), BAFS (Schneider et al., J. Exp. Med. 189&1747-56, 1999) TALL-1 (Shu et al., J. Leukoc.
ft
Biol. 65:680-3, 1999) или THANK (Mukhopadhyay et al., J.Biol. Chem. 274:15978-81, 1999). Както BR43x2, TACI, така и BCMA могат да се използват за регулиране в частност на активността на ztnf4 при активацията на В клетки.
В тази връзка настоящото изобретение предлага лечебни средства за модулиране на активността на ztnf4 или други BR43x2, TACI или ВСМА лиганди, съответните им състави и методи както и други употреби, които ще станат очевидни за специалиста в областта от обясненото тук.
СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
В един от аспектите си изобретението се отнася до метод за инхибиране на ztnf4 активност при бозайници, включващ прилагането на определено количество съединение, избрано от групата, състояща се от: а) полипептид, съдържащ извънклетъчен домен на BR43x2; б) полипептид, съдържащ извънклетъчен домен на TACI; в) полипептид, съдържащ извънклетъчен домен на ВСМА; г) полипептид с последователност от SEQ ID N0:10; д) антитяло или фрагмент от антитяло, което се свързва специфично с полипептид от SEQ ID N0:2; е) антитяло или фрагмент от антитяло, което се свързва специфично с полипептид от SEQ ID N0:4; ж) антитяло или фрагмент от антитяло, което се свързва специфично с полипептид от SEQ ID N0:6; з) антитяло или фрагмент от антитяло или фрагмент от антитяло, които се свързват специфично с полипептид от SEQ ID N0:8; и антитяло или фрагмент от антитяло, което се свързва специфично с полипептид от SEQ ID N0:10; к) полипептид с последователност от SEQ ID N0:4; л) аминокиселинни остатъци 1-166 на SEQ ID N0:6; и м) аминокиселинни остатъци 1-150 на SEQ ID N0:8.
В едно от изпълнението съединението е съставено от протеин , съдържащ първа част и втора част, свързани чрез пептидна връзка, като първата част съдържа полипептид, избран от групата, съдържаща :а) полипептид с последователност от SEQ ID N0:8; б) полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци 25-58 на SEQ ID N0:2; в) полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци 34-66 на SEQ ID N0:6; г) полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци 71-104 на SEQ ID N0:6; д) полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци 25-104 на SEQ ID N0:6; е полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци 8-37 на SEQ ID N0:8; ж) полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци 41-88 на SEQ ID N0:8; з) полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци 8-88 на SEQ ID N0:8; и така наречената втора част съдържа друг полипептид. В друго изпълнение първата част допълнително съдържа полипептид, избран от групата , съдържаща: а) аминокиселинни остатъци 59120 на SEQ ID N0:2; б) аминокиселинни остатъци 105-166 на SEQ ID N0:6; в) аминокиселинни остатъци 89-150 на SEQ ID N0:8. Според друго изпълнение първата част е избрана от групата съдържаща : а) полипептид съдържащ извънклетъчния домен на BR43x2; б) полипептид съдържащ извънклетъчния домен на TACL; в) полипептид съдържащ извънклетъчния домен на ВСМА.
В съответно изпълнение първата част е избрана от групата съдържаща : а) полипептид с последователност от SEQ ID N0:4; б) аминокиселинни остатъци 1-154 на SEQ ID N0:6; и в) полипептид съдържащ аминокиселинни остатъци 34-66 на SEQ ID N0:6; г) аминокиселинни остатъци 1-48 на SEQ ID N0:8. В друга съотносимо изпълнение втората част е имуноглуболинова тежко верижна константна област.
В друго изпълнение антитялото или фрагмента от антитяло е избрано от групата съдържаща: а) поликлонално антитяло; б) мурин моноклонолно антитяло; в) хуманизирано антитяло получено от б) и г) човешко моноклонално антитяло. В съответно изпълнение фрагментът от антитяло е избран от групата, съдържаща F(ab', F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv и минимално различаваща се частичка. В друга изпълнение бозайникът е примат.
В друго изпълнение ztnf4 активността е свързана с В лимфоцити. В друго съответно изпълнение ztnf4 активността е свързана с активирани В лимфоцити. В едно друго изпълнение ztnf4 активността е свързана с остатъци В лимфоцити. В друго изпълнение ztnf4 активността е свързана с продукцията на антитела. В друго изпълнение антитяло продукцията е свързана с t 7 автоимунна болест. В друго изпълнение автоимунната болест е системен еритроматозен лупус, миастения гравис, мултиплетна склероза или ревматоиден артрит. В друго изпълнение ztnf4 активността е свързана с астма, бронхит или емфизем. В друго изпълнение ztnf4 активността може да е свързана с краен стадий на бъбречна недостатъчност. В съвсем друго изпълнение ztnf4 активността е свързана с бъбречно заболяване. В съответното изпълнение бъбречното заболяване може да бъде гломерулонефрит, вазкулит, нефрит или пиелонефрит. В едно друго изпълнение бъбречното заболяване е свързано с бъбречна неоплазма, мултиплетен миелом, лимфом, светло ф верижна невропатия или амилоидоза. В друго изпълнение ztnf4 активността е свързана с Т клетъчен ефектор. В съответно изпълнение ztnf4 активността е свързана с регулиращ имунен отговор. В едно друго изпълнение ztnf4 активността е свързана с имуносупресия. В друго изпълнение имуносупресията е свързана с отхвърляне при трансплантация, множество трансплантационни заболявания или възпаления. В друго изпълнение ztnf4 активността е свързана с автоимунно заболяване. В съответно изпълнение авноимунното заболяване е инсулинзависим диабетен мелитус или болест на Крон. В друго изпълнение ztnf4 активността е свързана с възпаление. В съответно изпълнение възпалението е свързано със ставна болка, гълтане, ф анемия или септичен шок. В друг аспект изобретението се отнася до метод за инхибиране на BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лигандни прояви, включващи прилагане на определено количество съединение както е описано по-горе. В друго изпълнение BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лигандната проява е свързана с В лимфоцити. В друго съответно изпълнение BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лигандната проява е свързана с активирани В лимфоцити. В едно друго изпълнение, BR43x2, TACI или ВСМА рецепторлигандната проява е свързана с оставащи В лимфоцити.
В друго изпълнение, BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лигандната е свързана с антитяло продукция. В съответно изпълнение антитяло продукцията е свързана с автоимунна болест. В съответно изпълнение автоимунната болест е системен еритроматозен лупус, миастения гравис, мултиплетна склероза или ревматоиден артрит. В друго изпълнение BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лигандната проява е свързана с астма, бронхит или емфизем. В друго изпълнение BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лигандната проява може да е свързана с краен стадий на бъбречна недостатъчност. В съвсем друго изпълнение BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лигандната проява е свързана с бъбречно заболяване. В съответното изпълнение бъбречното заболяване може да бъде гломерулонефрит, вазкулит, нефрит или пиелонефрит. В още друго изпълнение бъбречното заболяване е свързано с бъбречна неоплазма, мултиплетен миелом, лимфом, светло верижна невропатия или амилоидоза. В друго изпълнение BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лигандната проява е свързана с Т клетъчен ефектор. В съответно изпълнение BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лигандната проява е свързана с регулиращ имунен отговор. В още по- друго изпълнение активността е свързана с имуносупресия. В друго изпълнение имуносупресията е свързана с отхвърляне при трансплантация, множество трансплантационни заболявания или възпаления. В друго изпълнение активността е свързана с автоимунно заболяване. В съответно изпълнение авноимунното заболяване е инсулинозависим диабетен мелитус или болест на Крон. В друго изпълнение BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лигандната проява е свързана с възпаление. В съответно изпълнение възпалението е свързано със ставна болка, гълтане, анемия или септичен шок.
В друг аспект изобретението се отнася до изолирана полинуклеотидна молекула, кодираща полипептид от SEQ ID N0:2. Отнася се също до изолирана полинуклеотидна молекула от SEQ ID N0:1. В съответно изпълнение осигурява експресивен вектор, съдържащ следващите действащи свързващи елементи: транскрибиращ промотер; полинуклеотидна молекула както е описано по- горе и транскрибиращ терминатор. В друго изпълнение експресивният вектор допълнително съдържа секреционна рецептор- лигандна
I Т посрледователност, свързана действащо към полинуклеотидната молекула.
Отнася се също и до културална клетка, в която е въведен експресивен вектор, както е описано по- горе, където културалната клетка проявява полипептидното кодиране чрез полинуклеотидният сегмент.
Изобретението освен това се отнася и до метод за получаване на полипептид, включващ: културиране на клетка, в която се вкарва експресивен вектор както е описано по- горе; чрез тази клетка се извършва полипептидното кодиране чрез полинуклеотидна молекула; и възстановяване на експресирания полипептид. Изобретението се отнася и до изолиран полипептид с ф последователност SEQ ID N0:2. В съответно изпълнение полипептидът е в комбинация с фармацевтично приемлив носител.
КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ
Фигура 1 показва многочислена аминокиселинна последователност намираща се между BR43x2, TACI (von Bulow and Bram, ibid.)(SEQ ID N0:6), BCMA(Gras et al., ibid.)(SEQ ID N0:6) и BR43xl (SEQ ID N0:7). Отбелязани са цистеиновите псевдо отговори и трансмембранният домен .
Фигура 2 показва диаграмни анализи на разтворим I125- ztnf4 свързване към
TACI и ВСМА експресирани чрез стабилни ВНК трансфектанти.
Фигура ЗА показва ztnf4 ко-активиращи човешки В лимфоцити да Ф полиферират и секретират имуноглобулини.
Фигура ЗВ показва степени на IgM и IgG стойности в супернатанти, получени от В клетки, стимулирани с разтворим ztnf4 в присъствие на IL4 или IL4+ IL5 след 9 дни в култура.
ί
Фигура 4 показва човешки периферно кръвни В клетки стимулирани с | разтворим ztnf4 или контролен протеин в присъствие на IL4 за 5 дни и вито |
Пречистен TACI-Ig, BCMA-Ig и контролен Fc са изследвани за инхибиране на ztnf4 специфична полиферация.
Фигура 5А показва резултати от ztnf4 трансгенни животни, които развиват
SLE -характеристики.
I <
Фигура 5B показва лимфен възел, далачни и тимусни клетки от ztnf4 трансгенни животни белязани с антитела към CD5, CD4 и CD8.
Фигура 5С показва общи IgM,IgG и IgE нива в серум от трансгенни ztnf4 животни, разпределени от 6 до 23 седмична възраст.
Фигура 5D показва амилоидно отстраняване и изтънен мезангиум на гломерула, идентифицирано в бъбречна секция от ztnf4 трансгенни животни. Фигура 5Е показва Т ефекторни клетки в ztnf4 трансгенна мишка.
Фигура 6А и В показват високи ztnf4 нива в серум, получен от ZNBWF1 мишки и MRL/lpr/lpr мишки, които са съпоставими с развитие на S1E.
Фигура 7 показва процента на NZBWF1 мишки, които развиват протеинурия по време на курса на изследване.
Фигура 8 показва анти- dsDNA нива по ELISA от ztnf4 трансгенни мишки и контролния тигър в сравнение със серум от ZNBWF1 и MRL/lpr/lpr мишки.
Тези и други аспекти на изобретението ще станат ясни след обясненията на следващото подробно описание.
ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО
Преди да се поясни същността на изобретението, може би е полезно да се представят дефинициите на определени термини, използвани по-нататък:
Афинитетен таг: използва се за означаване на полипептиден сегмент, който може да се прикрепи към втори полипептид, за да осигури пречистване или откриване на втори полипептид или да осигури места за прикрепяне на втория полипептид към субстрата. По принцип всеки пептид или протеин, който е използваем за антитяло или друг специфично свързващ агент, може да се използва като афинитетен таг. Афинитетни тагове включват полихистидинов тракт, протеин A (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991) глутатион S трансфераза (Smith and Johnson, Gene 67:31, 1988), Glu-Glu афинитетен таг (Grussenmeyer et al., Proc.Natl.Acad. SCIUSA 82:7952-4,1985), субстанция P, Flag™ пептид (Hopp et al.,Biotechnology 6:1204-10, 1988), стрептавидин свързващ пептид или друг антигенен епитоп или свързващ домен. Най- общо е описано при Ford et al., Protein expression and Purification 2:95-107,1991. DNAs кодиращи афинитетни тагове са достъпни от търговските снабдители (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).
Алелов вариант: Всяка от две или повече алтернативни форми на ген, снабдяваща едно и също хромозомно място. Алелов вариант се появява спонтанно чрез мутация и може да резултира във фенотипен полиморфизъм в популациите. Гениите мутации могат да бъдат незабележими (например без промяна в кодирането на полипептидите) или могат да кодират полипептиди с променлива аминокиселинна последователност. Терминът алелов вариант също се използва за означаване на протеин, кодиран чрез алелов вариант на ген. Също включен е същият протеин от същите видове, който се различава от описаната аминокиселинна последователност по отношение на алеловия вариант. Алеловият вариант се отнася до природно случващите се различия между индивидите при генното кодиране на даден протеин.
Амино-терминал и карбокси-терминал: използват се за означаване на позиции в полипептиди и протеини. Когато контекстът позволява, тези термини се използват в описание на частни последователности или части на полипептид или протеин за означаване на близостта или съответната позиция. Например, известна последователност поставя карбоксилен терминал към описана последователност в протеин, разположена близо до карбоксилния терминал на описаната последователност, но не обезателно върху карбоксилния терминал на целия протеин.
Двойка комплемент/ антикомплемент: Определени неидентични общности, които формират не-ковалентно свързване, стабилна двойка при определени условия. Например, биотин и адивин (или стрептавидин) са прототипични членове на комплемент/анти-комплемент двойка. Други примерни комплимент/антикомплемент двойки включват рецептор/лиганд двойка, антитяло/антиген (или хаптен или епитоп) двойка, чувствителна/нечувствителна полинуклеотидна двойка и други. Когато е
желателна последователностната дисоциация на комплемент/ алтикомплементната двойка, то двойката комплемент/алтикомплемент за предпочитане има свързваща активност < 10'9М.
Допирен: Означава полинуклеотид, който има близко напрежение на идентична или комплементарна последователност към друг полинуклеотид. Допирни напрежения са такива, които частично покриват дадено напрежение на полинуклеотидна последователност, както в тяхната цялост или по отношение на частично напрежение на полинуклеотидите. Например, представители на допирен към полинуклеотидна последователност са 5'ATGGCTTAGCTT-3' са 5'-TAGCTTgagtct-3' 3'-gtcgacTACCGA-5'.
Комплементи или полинуклеотидни молекули: Означава полинуклеотидни молекули с комплементарна основна последователност и обратна ориентация в сравнение с описаната последователност. Например, последователността 5ATGCACGGG 3' е комплементна на 5'CCCGTGCAT 3'.
Дегенеративна нуклеотидна последователност или дегенеративна последователност: означава последователност на нуклеотиди, която включва един или повече дегеративни кодона (в сравнение с описаната полинуклеотидна молекула, която кодира полипептида.). Дегенеративните кодони съдържат различни тройки нуклеотиди, но кодират един и същ аминокиселинен остатък (например GAU и GAC тройки всяка кодира Asp).
Експресионен вектор: за описанието се предлага DNA молекула, линейна или кръгова, която съдържа сегмент, който кодира полипептид, полезно действащо свързан към допълнителни сегменти. Такива допълнителни сегменти могат да включват промотер и терминаторна последователност и по избор един или повече оригинала или копия, един или повече избрани маркери, усилвател, полиаденилативен сигнал и други. Експресивните вектори са общо произхождащи от плазмид или вирусна DNA или могат да съдържат елементи от двете.
Изоформа: Отнася се до различни форми на протеин, който може да бъде получен от различни гени или от същия ген чрез редуващо се разрастване. В някои случаи изоформите се различават по тяхната транспортна активност, време на експресия при развитие, тъканно разпределение, локализация в клетката или комбинация от тези свойства.
Изолирани полинуклеотиди: Означава, че полинуклеотидът е отместен от неговата естествена генетична среда и той е свободен от други извънредни или нежелани кодиращи последователности и е във форма, подходяща за използване в най-общо конструирани протеинови системи. Такива изолирани молекули са такива, които са отделени от тяхната природна среда и включват cDNA и геномни клона. Изолираните DNA молекули съгласно настоящото изобретение са освободени от други гени, с които те обикновено се свързват, но могат да включват природно срещащи се 5' и 3' неизяснени региони, такива като промотери и терминатори. Идентификацията на свързаните региони е очевидна за всеки от специалистите в областта на техника (например Dylan and Titan, Nature 316:774-78,1985).
Изолиран полипептид или протеин: това е полипептид или протеин, който е намерен при условие, различно от неговата околна среда, такива като кръв и животинска тъкан. В препоръчителна форма, изолираният полипептид е по същество освободен от други полипептиди, в частност други полипептиди от животински органи. Препоръчително е да се осигуряват пречистени във висока степен полипептиди , т.е. повече от 95 % чистота, още по- добре повече от 99% чистота. Когато се използва в контекст терминът изолиран, той не включва присъствие на същия полипептид в алтернативна физическа форма, като димер или по желание гликозилирана или производна форма.
Действащо свързан: Както е приложен към нуклеотидните сегменти, терминът действащо свързан показва, че сегментите са аранжирани така, че те функционират в съгласие с тяхната желана цел, например транскрипцията започва в промотера и преминава през кодиращите сегменти до терминатора.
Ортолог: Означава полипептид или протеин, получен от един вид, който е функционално копие на полипептид или протеин от различен вид. Различията в последователностите между ортологове са резултат от видовете.
Полинуклеотид: означава единичен или двоен нишковиден полимер или дезоксирибонуклеотидна или рибонуклеотидна база от 5' до 3' окончания. Полинуклеотидите включват RNA и DNA и могат да бъдат изолирани от природни ресурси, синтезирани ин витро или получени от комбинация от природни и синтетични молекули. Размерите на полинуклеотиди са показани като основни двойки (отбелязани като Ьр), нуклеотиди (nt) или килобази (kb). Където позволява контекстът, последните два термина могат да бъдат описани, като единично-нишковидни или двойно нишковидни полинуклеотиди. Когато терминът се прилага към двойно нишковидни молекули, той се използва да покаже свръх дължина и ще бъде разбран като еквивалентен на термина основни двойки. Той се приема от специалист в тази областта на техниката като двете нишки на двойно-нишковиден полинуклеотид могат да се различават слабо по дължина и краищата им могат да се колебаят в резултат на ензимно разцепление; така всички нуклеотиди в двойно-нишковидна полинуклеотидна молекула могат да не бъдат по двойки. Такива не групирани по двойки краища най- общо няма да надхвърлят 20 nt дължина.
Полипептид: Това е полимер от амино киселинни остатъци, присъединен чрез пептидна връзка, който е получен или природно или синтетично. Полипептиди с по- малко от около 10 амино киселинни остатъка най- общо са означени като пептиди.
Промотор: Означава част от ген, съдържащ DNA последователности, които се използват за свързване на RNA полимераза и начало на транскрипция. Промоторните последователности са най- общо, но не винаги, установени в 5' некодирани региони на гени.
Протеин: е макромолекула, съдържаща една или повече полипептидни вериги. Протеин може да съдържа също непептидни компоненти, такива като карбохидратни групи. Карбохидрати и други не-пептидни заместители могат да се добавят към протеин чрез клетката , от която протеинът е получен и ще варира от вида клетка. Протеините се определят от техните основни ши
аминокиселинни структури; заместители като карбохидратни групи са найобщо не-специфицирани, но понякога могат да присъстват.
Рецептор: Клетъчно свързан протеин или полипептидно подразделение на такъв протеин, който се свързва към биоактивна молекула (лиганд) и предизвиква ефект на лиганд върху клетката. Свързване на лиганд към рецептор предизвиква промяна в рецептора (в някои случаи рецептор мултимеризация, например свързване на идентични или различни рецепторни подразделения), който предизвиква взаимодействия между ефекторни домен(и) на рецептора и друга(и) молекула(и) в клетката. Тези взаимодействия обратно водят до изменения в метаболизма на клетката. Метаболитните явления, които са свързани с рецептор-лигандни взаимодействия, включват генна транскрипция, фосфорилация, дефосфорилация, клетъчна пролиферация, повишаване на цикличната АМР продукция, мобилизация на клетъчния калций, мобилизация на мембранните липиди, клетъчна адхезия, хидролиза на инозитол липиди и хидролиза на фосфолипиди. BR43x2 има характеристики на TNF рецептори, както са разисквани по- подробно тук.
Секреторна сигнална последователност: DNA последователност, която кодира полипептид(секреторен пепетид), който като компонент на обширен полипептид, води обширния полипептид през секреторен проход на клетка, в която е синтезиран. Обширният полипептид е най- общо разцепен до отделяне на секреторен пептид по време на преминаване през секреторния проход.
Разтворим рецептор: Рецепторен полипептид, който не е свързан към клетъчна мембрана. Разтворими рецептори са най-общо лиганд-свързващи рецепторни полипептиди, които губят трансмембранни и цитоплазмени домени. Разтворими рецептори могат да съдържат допълнителни амино киселинни остатъци, като афинитетни тагове, които осигуряват пречистването на полипептидите или осигуряват метата за прикрепване на полипептидите към субстрата. Много клетъчно- повърхностни рецептори имат природен произход, разтворими копия, които са получени чрез протеолиза или преместени от алтернативно съединени mRNA. Рецепторните полипептиди са
по същество освободени от трансмембранни и вътреклетъчни полипептидни сегменти, когато те губят специфични части от тези сегменти, за да осигурят мембранни приспособления или съответно сигнална транс ду кция.
Молекулните тегла и дължини на полимери, определени чрез импресивни аналитични методи (гел електрофореза), имат приблизителни стойности. Когато такава стойност се представя като около X или приблизително X, трябва да се разбира, че точната стойност на X е ±10%.
Всички споменати препратки са включени изцяло в същността.
Настоящото изобретение се базира в частност на откриването на 1192 вр DNA последователност (SEQ ID N0:1) и съответстващата полипептидна последователност(8Е() ID N0:2), която е изоформа на рецептор TACI. Изоформата е описана като BR43x2. Разтворима форма BR43x2 е разкрита като последователност SEQ ID N0:4, полипептидно кодиране на разтворим рецептор в SEQ ID N0:3. Както е описано по- подробно тук, BR43x2 рецепторкодиращи полинуклеотид и полипептиди съгласно настоящото изобретение, отначало са идентифицирани чрез сигнален търсещ клонинг чрез RPMI 1788 библиотека от човешки материал и N- или С- краен FLAG-таг, биотин или FITC-белязан туморен некрозен фактор-лиганд ztnf4,cera известен като неврокинин a(WIP0 WO98/18921), Blys(Moore et al.,), BASF(Schneider et al.,) TALL-1 (Shu et al.,) или THANK (Mukhopadhyay et al.,). Положителните места се определят чрез лигандно свързване, прекъсвано до единични клонове, изолиран cDNA и включен в последователност. При сравнение на BR43x2 извадена аминокиселинна последователност (както е представена в SEQ ID N0:2) с известни тумурно некрозни факторни рецептори показват, че BR43x2 е изоформа на TACI с единичен, лошо съхранен цистеинов псевдо-отговор.
Структурно TNF рецепторната фамилия се характеризира с извънклетъчна част, съставена от няколко модула, наречени исторически цистеинови псевдо-повторения. Прототипичен TNFR фамилен член има четири от тези псевдо- повторения, всяко с около 29-43 остатъка дължина, точно един след друг. Типично псевдо- повторение има 6 цистеинови остатъка. Те са наречени псевдо-повторения, въпреки че изглежда, че произлизат от общ наследствен модул, те не се повтарят точно: псевдо повторения #1, #2, #3 и #4 имат характеристични последователностни признаци, които ги различават един от друг. Кристалната структура на р55 TNF рецептор показва, че всяко псевдо- повторение кореспондира с един сгъващ се домен и затова всички четири псевдо- повторения се включват в същата терциерна структура, държаща ги заедно вътрешно чрез дисулфидни връзки.
TACI съдържа две цистеинови псевдо- повторения (Bulow and Bram,...), като първото е запазено в структура с други членове на TNF рецепторната фамилия, второто повторение е по-малко съхранено. BR43x2 изоформата съгласно настоящото изобретение губи първото TACI цистеинов псевдоповторение, оставяйки само второто, по- слабо съхранено повторение.
Анализът на последователността на разцепената амино киселинна последователност на BR43x2, както е представена в SEQ ID N0:2, показва присъствие на развит протеин с външноклетъчен домен (остатъци 1-120 от SEQ ID N0:2), който съдържа едно цистеиново псевдо- повторение (остатъци 25-58 от SEQ ID N0:2), трансмембранен домен (остатъци 121-133 от SEQ ID N0:2) и цитоплазмен домен (остатъци 134-247 от SEQ ID N0:2). Цистеиновото псевдо- повторение на BR43x2 има съхранени цистеинови остатъка (остатъци 25, 40, 43, 47, 54, и 58 на SEQ ID N0:2), съхранен аспартатно киселинен остатък (остатък 34 на SEQ ID N0:2) и два съхранени левцинови остатъка (остатъци 36 и 37 на SEQ ID N0:2) и разделя 46% от идентичността си с първото цистеиново псевдо- повторение на TACI (SEQ ID N0:6) и 35% от идентичността си с цистеиново псевдо-повторение на ВСМА (SEQ ID N0:8) (Фигура 1). Цистеиново псевдо- повторение може да бъде представено по следния начин: CX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2}C[IMLV]XCX{3} CX{6-8}CX{2}[YF]C (SEQ ID N0:10),
Където С представлява аминокиселинен остатък на цистеин, Q глутамин, Е - глутаминова киселина, К - лизин, N - аспарагин, R- аргинин, D аспартанова киселина, Н- хистидин, S- серин, Y- тирозин, F—фенилаланин, Wтриптофан, L-левцин, 1-изолевцин, V-валин и X- представлява всеки природно явяващ се амино киселинен остатък, вариантен на тази позиция. Номерът в скоби {} показва аминокиселинните остатъци на тази позиция.
Настоящото изобретение също представя разтворими полипептиди на 32 до 40 аминокиселинни остатъка в дължина както е представено с SEQ ID N0:10.
Разтворимият BR43x2 рецептор, както е представен чрез остатъци 1-120 на SEQ ID N0:4, съдържа едно цистеиново псевдо- повторение (остатъци 2-58 на SEQ ID N0:4) и губи транс мембранен и цитоплазмен домени на BR43x2, както е описан в SEQ ID N0:2.
Специалист в областта ще разпознае, че тези граници на домени са приблизителни и се базират на постановки с известни протеини и предположение на протеинни нагъвания. Тези свойства показват, че рецепторът, кодиран чрез DNA последователности на SEQ ID №1 и №3, е член на TNF рецепторната фамилия.
Северен блот и дот-блот анализ на тъканно пренасяне на mRNA, съответстващи на нуклеотидни проби към BR43x2, които се предполага, че откриват BR43x2 експресия, показват експресия при далак, лимфен възел, CD 19+ клетки, отслабени в смес лимфоцитна реакция клетки, Daudi и Raji клетки. Използвайки обратна транскриптаза PCR BR43x2 се открива само в В клетки и не се откриват в активирани Т клетки, както е съобщено за TACI (Bulow и Bram). Чрез използване на BR43x2 проба, която се покрива 100% със съответната TACI последователност, TACI и BR43x2 се откриват в далак, лимфен възел и тънките черва, стомах, слюнна жлеза, апендикс, бели дробове, костен мозък, ембрионален далак, CD19+ клетки, и Raji клетки .
Използвайки Южен блот анализ, ВСМА се открива в тънки черва, далак, стомах, дебело черво, апендикс, лимфен възел, трахея и тестис. ВСМА също се
1М|111'Йм!'|ЗДЙ
открива в аденолимфом, не- Хочкинов лимфом и паротиден тумор, открит точно в CD 8+, CD19+, MLR клетки, Daudi, Raji и Hut 78 клетки.
Северен блот анализ се извършва също чрез муринов ztnf4(SEQ ID N0:19) и подобни човешки TACL, ВСМА и BR43x2, като се открива муринова ztnf4 експресия преимуществено в далак и тимус. Муринов ztnf4 се проявява в бял дроб и конкретна експресия е открита в кожа и сърце.
Настоящото изобретение се отнася също до полинуклеотидни молекули, включващи DNA и RNA молекули, които кодират BR43x2 полипептиди разкрити тук. Специалистите в областта лесно ще различат, че по отношение на дегенерацията на генетичния код е възможна значителна вариация в последователността между тези полинуклеотидни молекули. SEQ ID N0:11 е дегенеративна DNA последователност, която обхваща всички DNA, които кодират разтворимия BR43x2 полипептид на SEQ ID N0:4. Подобно SEQ ID N0:12 е дегенеративна DNA последователност, която обхваща всички DNA, които кодират BR43x2 полипептид на SEQ ID N0:2. Специалистите в областта ще разпознаят, че дегенеративната последователност на SEQ ID N0:12 също осигурява всички RNA последователности, кодиращи SEQ ID N0:4 чрез заместване на U за Т. По този начин BR43x2 полипептид-кодиращи полинуклеотиди, съдържащи нуклеотид от 1 до 360 на SEQ ID N0:11, нуклеотид от 1 до 741 на SEQ ID N0:12 и техните RNA еквиваленти са предвидени в настоящото изобретение. Таблица 1 представя еднобуквени кодове, използвани в SEQ ID N0:11 и 12 за означаване на дегенеративни нуклеотидни позиции. Решенията са нуклеотиди, означени чрез еднобуквен код. Комплемент означава кода за допълнителни нуклеотиди. Например кодът Y означава също С или Т, а неговият комплемент R означава А или G, А като допълнителен на Т и G като допълнителен на С.
ТАБЛИЦА 1
Нуклеотид Решение Комплемент Решение
А А T Τ
С С G G
G G С С
Т Т A A
R A|G Y C|T
Y С|Т R A|G
М А|С Κ G|T
К G|T Μ A|C
S C|G S C|G
W А|Т W A|T
н А|С|Т D A|G|T
в C|G|T V A|C|G
V A|C|G Β C|G|T
D A|G|T Η A|C|T
N A|C|G|T N A|C|G|T
Дегенеративните кодони, използвани в SEQ ID N0:11 и 12, обхващащи всички възможни кодони за дадена амино киселина, са представени в Таблица 2.
ТАБЛИЦА 2
Амино киселина Еднобуквен код Кодони Дегенеративен кодон
Cys C TGC TGT TGY
Ser S AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN
Thr T ACA ACC ACG ACT CAN
Pro P CCA CCC CCG CCT CCN
Ala A GCA GCC GCG GCT GCN
Gly G GGA GGC GGG GGT GGN
Asn N AACAAT AAY
Asp D GAC GAT GAY
Glu E GAA GAG GAR
Gin Q CAA CAG CAR
His H CAC CAT CAY
Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN
Lys K AAA AAG AAR
Met M ATG ATG
He I ATA ATC ATT ATH
Leu L CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN
Vai V GTA GTC GTG GTT GTN
Phe F TTC TTT TTY
Tyr Y TAC TAT TAY
Trp W TGG TGG
Ter - TAA TAG TGA TRR
Asn|Asp B RAY
Glu|Gln z SAR
Any X NNN
Един специалист в областта на техниката ще забележи, че има някои неясноти при определение на дегенеративен кодон, съответно на всички възможни кодони, кодиращи всяка амино киселина. Например, дегенеративният кодон за серин (WSN) може при някои условия да кодира аргинин (ARG), а дегенеративният кодон за аргинин (MRG) може при някои условия да кодира серин (AGY). Подобна зависимост съществува между кодони, кодиращи фенилаланин и левцин. По този начин, някои полинуклеотиди, обхванати от дегенеративна последователност, могат да кодират различни амино киселинни последователности, но един специалист в областта може лесно да идентифицира такива вариантни последователности чрез отпратка към аминокиселинната последователност на SEQ ID N02 и 4. Вариантни последователности могат лесно да се изследват за функционалност
както е описано тук.
Един специалист в областта на техниката ще прецени също, че различните видове могат да проявяват преференциална употреба на кодона. Най-общо, виж Grantham et al., Nuc. Acid. Res. 8:1893-912,1980; Haas et al., Curr. Biol. 6:315-24, 1996; Wain-Hobson, et al., Gene 13:355-64, 1981; Grosjen and Fiers, Gene 18:199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075-87, 1986; Ikemura, J.Mol. Biol. 158:573-97, 1982. Както е използвано тук, термините преференциална употреба на кодони или преференциални кодони са термини в областта , отнасящи се до протеинови транслационни кодони, които много често се използват в клетките на известни видове, като благоприятен един или няколко представители на възможни кодони, кодиращи всяка амино киселина (Таблица 2). Например, аминокиселинен треонин (Thr) може да бъде кодиран от АСА,АСС, ACG или ACT, но в клетки на бозайник АСС е найобщо използван кодон; при други видове, например инсектицидни клетки, мая, вируси или бактерии, могат да са преференциални различни Thr кодони. Преференциални кодони отделни видове могат да бъдат представени в ф полинуклеотидите съгласно настоящото изобретение чрез голям брой методи, известни в областта. Представяне на преференциална кодонова последователност в рекомбинантна DNA, например може да предизвика продукция на протеин чрез извършване на протеинова транслация порезултатна в частичен клетъчен тип или вид. Освен това дегенеративните кодонови последователности, разкрити в SEQ ID N0:11 и 12, служат като образец за оптимизираща експресия на полинуклеотиди в различни клетъчни { типове и видове, най- общо използвани в нивото на техника и разкрити тук.
Последователности, съдържащи преференциални кодони, могат да бъдат ; изпитвани и оптимизирани за експресия в различни видове и изпитвани за функционалност, както е разкрито тук.
'1 а Я i
Стабилно съхранени амино киселини в цистеин псевдо-повторение на BR42x2 могат да бъдат използвани като средство за идентификация на нови фамилни членове. Например, обратна транскрипционно-полимеразна верижна реакция (RT-PCR) може да бъде използвана за да увеличи последователности, кодиращи извънклетъчен лиганд- свързващ домен, описан по- горе, от RNA получена от вид от тъканен източник или клетъчни линии. В частност за такава цел се използват високо дегенеративни образци, получени от BR42x2 последователности.
В предпочитани изпълнения съгласно изобретението изолирани полинуклеотиди ще хибридизират до подобни региони на SEQ ID N0:3 или до комплементарна последователност при строги условия. Най- общо строги условия са температура с около 5° С по- ниска от крайната точка на топене (Тт) за специфичната последователност при дефинирани йонна сила и pH. Тт е температурата (при дефинирана йонна сила и pH), при която 50% от целевата последователност хибридизира до перфектно чифтосана проба. Типични строги условия са тези, при които солевата концентрация е до около 0.03 М при рн 7 и температурата е поне около 60 °C.
Както е споменато по-горе, изолираните полинуклеотиди съгласно настоящото изобретение включват DNA и RNA. Методи за изолиране на DNA и RNA са добре известни в областта на техниката. Най-общо е препоръчително да се изолира RNA от RPMI 1788 клетки, PBMNC, почиващи или активирани трансфектни В клетки или тъкан от сливица, обаче DNA също може да бъде получена чрез използване на RNA от други тъкани или изолирана като геномна DNA. Цяла RNA може да бъде получена чрез използване на гуанидинова HCI екстракция, след което чрез изолиране чрез центрофугиране в CsCl rpaflneHT(Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979). Поли (A)+ RNA се получава от цяла RNA по метод на Avin и Leder (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:1408-12, 1972). Комплементарна DNA се получава от поли (A)+ RNA чрез
познати методи. Полинуклеотиди, кодиращи BR43x2 полипептиди, след това са идентифицирани и изолирани, например от хибридизация или PRC.
За специалиста в областта е ясно, че последователностите, разкрити в SEQ ID N0:1 и 3, представят единичен алел на човешки ген и, че се очаква да се случи алелов вариант и обратно срастване. Алелови варианти на DNA последователности показват в SEQ ID N0:1 и 3, включващи онези съдържащи тихи мутациии и онези, в които мутации се проявяват в амино киселинни последователностни промени, са в обхвата на настоящото изобретение, тъй като са протеини, които са алелови варианти на SEQ ID N0:2 и 4. Алелови варианти и срастнали варианти на тези последователности могат да бъдат клонирани чрез проби на cDNA или геномни библиотеки от различни индивиди или тъкани съгласно стандартни процедури, известни в областта на техниката.
Настоящото изобретение се отнася също до изолирани BR43x2 полипептиди, които са специфични хомолози на полипептиди с SEQ ID N0:2 и 4 и техни видове ортологове. Терминът специфични хомолози е използван тук, за да определи полипептиди с 50%, за предпочитане 60 % и още по- добре поне 80% идентичност на последователността към последователностите, показани в SEQ ID N0:2 и 4 или техни ортологове. Такива полипептиди ще бъдат по- предпочитани, ако са поне 90% идентични и най- предпочитани при над 95% и повече идентични с SEQ ID N0:2 или нейни ортологове. Процентната идентичност на последователността е определена чрез конвенционални методи. Например Alschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603-66, 1986 и Henikooff, Proc. Natl. Acad. USA 89:10915-9, 1992. Накратко две амино киселинни последователности са изравнени, за да оптимизират рзултатите, използвайки интервал отварящо изискване от 10, интервал изтеглящо изискване от 1 и blosum 62 резултатна матрица на Henikoff и Henikoff, както е показано в таблица 3 (амино киселини са белязане чрез стандартни еднобуквени кодове). Процентната идентификация след това е изчислена като:
Общ брой на идентични резултати____________________________ х100 [дължина на най- дългата последователност плюс броя на интервали, включени в най- дългата последователност, за да изравни двете последователности.
ТАБЛИЦА 3
А R N D с Q Е G Н I L к М F Р S т W Y V
А 4
R -1 5
N -2 0 6
D -2 -2 1 6
С 0 -3 -3 -3 9
Q -1 1 0 0 -3 5
Е -1 0 0 2 -4 2 5
G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6
Н -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8
I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4
L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4
К -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5
М -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5
F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6
Р -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7
S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4
т 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5
W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11
Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7
V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4
Идентичността на последователността на полинуклеотидните молекули е определена по подобни методи чрез използване на съотношение, описано погоре.
Специфично хомоложни протеини и полипептиди представляват един или повече отнети или добавени аминокиселинни заместители. Тези промени 1 са предпочитани за малък организъм, който е с консервативни аминокиселинни заместители (например Таблица 4) и други заместители, т които не предизвикват значителни дразнения или активност на протеин или полипептид; малки отнемания, типично на един до около 30 амино киселини; и амино- или карбокси-терминални удължения, като амино-терминален метионинов остатък, малък свързан пептид или до около 20-25 остатъка или афинитетен таг. Полипептиди, съдържащи афинитетни тагове, могат допълнително да съдържат протеолитично разцепващо място между BR43x2 полипептид и афинитетен таг. За предпочитане такива места включват тромбин-разцепващи места и фактор Ха-разцепващи места.
ТАБЛИЦА 4
Консервативни амино киселинни заместители
Основни: аргинин лизин хистидин
Киселинни: глутамова киселина аспартова киселина
Поларни: глутамин аспарагин
Хидрофобни: левцин изолевцин валин
Ароматни: фенилаланин триптофан тирозин
Малки: глицин аланин серин треонин метионин
В допълненине на 20 стандартни амино киселини, нестандартни амино киселини (като 4-хидроксипролин, ό-Ν-метил лизин, 2-амино изобутирова киселина, изовалин и а-метил серин) могат да бъдат заместители за амино киселинни остатъци на BR43x2 полипептиди съгласно настоящото изобретение. Ограничен брой не- консервативни амино киселини, амино киселини, които не са кодирани чрез генетичен код и неприродни амино киселини могат да бъдат заместители за BR43x2 полипептидни амино киселинни остатъци. Протеините съгласно настоящото изобретение могат също да съдържат не- природно явяващи се амино киселинни остатъци.
Не- природно явяващи се амино киселинни остатъци включват, без това да се счита като ограничение, транс-3-метилпролин, 2,4- метанопролин, цис-4хидроксипролин, транс-4-хидроксипролин, N-метилглицин, ало-треонин, метилтреонин, хидрокси-етилцистеин, хидроксиетил-хомоцистеин, нитроглутамин, хомоглутамин, пипеколова киселина, терт-левцин, норвалин, 2-азафенилаланин, 3-аза-фенилаланин, 4-азафенилаланин и 4-флуорофенилаланин. Няколко метода са известни в областта на техника, включващи не- природно явяващи се амино киселинни остатъци в протеини. Например една ин витро система може да бъде използвана, когато се супресират безсмислени мутации чрез използавне на аминоацилиран супресор tRNAs. Методи за синтезиращи амино киселини и аминоациклиращи tRNA са известни в областта. Транскрипция и транслация на плазмиди, съдържащи безсмислени мутации се провеждат в клетъчна свободна система, съдържаща екстракт от E.coli S 30 и търговско достъпни ензими и техни реагенти. Протеините се пречистват чрез хроматография. Например Robertson et al., J. Am. Chem.Soc. 113:2722, 1991; Eltman et al., Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9; Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993). При втори метод, транслация се провежда в Xenopus ооцити чрез микроинжекция на мутирала mRNA и химически аминоацилиран супресор tRNA (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271: 19991-8, 1996). В трети метод клетки на E.coli са културирани в отсъствие на природна амино киселина, която може да бъде заместена (например фенилаланин) и в присъствие на желана не- природна амино киселина /и( например 2-азафенилаланин, 3азафенилаланин, 4-азафенилаланин или 4-флуоро-фенилаланин). Не природната амино киселина се включва в протеина на мястото на неговия природен двойник. Виж Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994. Природно явяващи се амино киселинни остатъци могат да се превърнат в не- природно явяващи се видове чрез ин витро химическа модификация. Химическа модификация може да бъде комбинирана с място-насочена мутагенеза към допълнително увеличение на обхвата на заместители (Wynn and Richards, Protein Sci. 2:395-403, 1993).
Определен брой не-консервативи амино киселини, амино киселини, които не са кодирани с генетичен код, не- природно явяващи се амино киселини и неприродни амино киселини могат да бъдат заместители за BR43x2 полипептидни амино киселинни остатъци.
Специфични амино киселини в BR43x2 полипептиди съгласно настоящото изобретение могат да бъдат идентифицирани съгласно известни в областта процедури, такива като място- насочена мутагенеза или аланинсканираща мутагенеза (Cunningham and Wells, Science 244:1081-5, 1989). Единични аланин мутации са включени при всеки остатък в молекулата и получените мутантни молекули са изследвани за биологична активност /например осигурява намаляване в клетъчен отговор по време на имунния отговор, инхибиране или намаление в автоантитяло продукцията/ до идентифициране на амино киселинни остатъци, които са решаващи за активността на молекулата. Например при Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699-708, 1996. Места на биологично взаимодействие, лиганд-свързващи части, като цистеин псевдо-повторения могат също да бъдат определени чрез физични анализи на структура, чрез методите на ядрено- магнитен резонанс, кристалография, електронна дифракция или фотоафинитено белязване, при взаимодействие с мутация на предполагаеми контактни амино киселини. Например Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. Идентичности на специфични амино киселини могат също да бъдат предположени от анализ на хомолози със съответни TNFR фамилни членове, като TACI и ВСМА.
Допълнителни амино киселинни заместители могат да бъдат направени с цистеин псевдо- отговор на BR43x2, толкова дълъг, колкото запазените цистеин, аспартова киселина и левцин остатъци са съхранени и най- висшата по ред структура не е разрушена. За предпочитане е да се направят заместители с цистеин псевдо- повторения на BR43x2 чрез отпратка към последователности на други цистеин псевдо- отговори. SEQ ID N0:10 е обобщено цистеин псевдо-повторение, което показва възможни амино киселинни заместители върху същата линия. Заместители в този домен са обект на ограниченията, споменати тук.
Множество амино киселинни заместители могат да бъдат направени или изпитани чрез познати методи на мутагенеза и скрининг, като тези описани от Reidhaar-Olson and Sauer (Science 241:53-7, 1988). Накратко, тези автори разкриват методи за едновременно рандомизиране на две или повече позиции в полипептид, избран за функционален полипептид и след това последващо мутагенизирани полипептиди до определяне на спектъра на възможни заместители на всяка позиция. Други методи, които могат да бъдат използвани, включват дисплей на фаги, обяснени от Lowman et al., Biochem. 30-10832-7, 1991; Landner et al., U.S. Patent No 5,223“,409; Huse,WIPO Publication WO 92/06204) и регион- насочена мутагенеза (напр. Derbyshire et al., Gene 46:145, 1986; Neret al., DNA 7:127,1988).
Варианти на разкритите BR43x2 DNA и полипептидни последователности могат да бъдат получени чрез DNA разместване както е описано от Stemmer, Nature 370:389-91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-51, 1994 и WIPO публикация WO97/ 20078. Накратко, варианти DNA са получени чрез ин витро хомоложна рекомбинация чрез произволна фрагментация на двойка DNA, последвано от разграждане чрез PRC, предизвикващо произволно представени местйи мутации. Този метод може да бъде променян чрез използване на семейство от двойки QNA, такива като алелови варианти или DNA от различни видове до постигане на допълнителна изменчивост в процесите. Селекция или изследване на желаната активност,
последвана от допълнителни взаимодействия на мутагенеза и опит са условия да се осигури бърза “еволюция” на последователности чрез селектиране на желани мутации, при едновременно селектиране срещу вредни промени.
Мутагенни методи съгласно настоящото изобретение могат да бъдат комбинирани със силно пропадащи, автоматизирани скриннингови методи за откриване на клонирани, мутагенни полипептиди в клетките-гостоприемник. Мутагенни DNA молекули, които кодират активни полипептиди (например, осигуряващи увеличение в В клетъчен отговор по време на имунния отговор, инхибиране или намаляване в антитяло продукция) могат да бъдат превърнати от клетки-гостоприемник и бързо вкарани в последователност чрез модерно оборудване. Тези методи позволяват бързо определяне на значението на отделните амино киселинни остатъци в желания полипептид и могат да бъдат прилагани към полипептиди с неизвестна структура.
Чрез използването на методите, дискутирани по- горе, един специалист в областта на техниката може да идентифицира и получи множество полипептиди, които са специфично хомоложни към остатъци от 1 до 120 на SEQ ID N02 или техни алелови варианти и да съхрани В клетъчни супресивни свойства на некултивиран-тип протеин. Такива полипептиди могат да включват допълнителни амино киселини или домени от други членове на туморен некрозно факторен рецептор надфамирно, афинитетни тагове или други подобни. BR43x2 полипептид или реакция на структури, съдържащи функционални домени на други членове на TNFR надфамилно, образуват хибридни туморни некрозни факторни рецептори, проявяващи променени в клетъчни супресивни възможности.
Настоящото изобретение допълнително осигурява двойници рецептори и полинуклеотиди от други видове (ортологове). Тези видове включват, но не се ограничават до бозайници, птици, земноводни, рептилии, риби, инсекти и други гръбначни и безгръбначни видове. От особен интерес са BR43x2 рецептори от други бозйникови видове, включващи муринни, свински, овчи, говежди, кучешки, фелинни, конски и други рецептори на примати.
Ортологове на човешки BR43x2 рецептор могат да бъдат клонирани чрез използване на информация и състави, осигурени с настоящото изобретение в комбинация с конвенционални техники на клониране. Например cDNA може да бъде клонирана чрез използване на mRNA, получена от тъкан или клетъчен тип, който експресира рецептора. Подобен вид mRNA може да бъде идентифициран чрез използавне на Northern блотове с проби, създадени от последователности, описани тук. След това е приготвена библиотека от mRNA на позитивна тъкан или клетъчна линия. Рецептор, кодиращ cDNA може след това да бъде изолиран чрез различни методи, такива като пробиране с цяла или частична cDNA или с една или повече рамки на разградени проби, основани на разкритата последавателност. cDNA може също да бъде клонирана чрез PRC, чрез използване на праймери, създадени от последователността,описана тук. В допълнителен метод, cDNA- коликция може да бъде използвана за трансформирани или трансфектирани клетки на гостоприемник, и експресия на интересуващата cDNA може да бъде открита с антитяло към рецептор. Подобни техники могат също да се приложат при изолиране на геномни клонове.
Рецепторните полипептиди съгласно настоящото изобретение, включващи рецепторни полипептиди с пълна дължина, разтворими рецепториполипептиди, полипептидни фрагменти и смесени полипептиди, могат да се получат чрез генно инженерство на клетки- гостоприемници съгласно конвенционални техники. Подходящи клетки- гостоприемници са тези клетъчни типове, които могат да бъдат трансформирани или трансфектирани с екзогенна DNA и израстват в култура и включват бактерии, гъбични клетки и културирани високи еукариотни клетки. Предпочитани са еукариотни клетки и частично културирани клетки на многоклетъчни организми. Техники за работа с клонирани DNA молекули и представяне на екзогенна DNA в различни клетки- гостоприемници са разкрити от Sambrook et al., Molecular Cloning: Alaboratory manual, Second Edition, Cold Spring habor, NY, 1989;
Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Jhon Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.
Най- общо, DNA последователност, кодираща BR43x2 полипептид е действено свързана към други генетични елементи, препоръчани за експресия, общо включваща транскрипционен промотер и терминатор в експресионния вектор. Векторът също ще съдържа един или повече селективни маркери и един или повече източника на репликация, въпреки това един специалист в областта на техниката ще различи, че в известни системи селективни маркери могат да се осигуряват върху отделните вектори, и репликации на екзогенна DNA могат да се осигуряват чрез обединяване в гостоприемниковия клетъчен домен. Селекцията на промотери, терминатори, селективни маркери, вектори и други елементи е рутинен метод в обхвата на възможностите на специалист в областта. Много такива елемени са описани в литературата и са възможни чрез използване на търговско оборудване.
За насочване на BR43x2 полипептид в секреторния канал на клеткагостопоремник в експресионния вектор се осигурява секреторна сигнална последователност (известна като сигнална последователност, водеща последователност, пре- про- последователност или пре- последователност). Секреторната сигнална последователност може да бъде от BR43x2 полипептид или може да бъде получена от друг секретеращ протеин (например t-PA) или ново синтезиран. Секреторна сигнална последователност е присъединена към BR43x2 DNA последователност в коректно четяща се рамка и разположена към пряк ново синтезиран полипептид в секреторен канал на клеткатагостоприемник. Секреторни сигнални последователности са най- общо разположени 5’ към DNA последователност, кодираща полипептида. Въпреки това позната сигнална последователност може да бъде разположена където и да е в DNA последователността (например Welch et al., US Patent No 5,037,743; Holland et al.,US Patent No 5,143,830).
Културирани клетки от бозайник са подходящи гостоприемници съгласно настоящото изобретение. Методи за въвеждане на екзогенна DNA в гостоприемникови клетки на бозайник, включват калциево-фосфатно изменена трансфекция (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro and Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham and Van der Eb, Virology 52:456, 1973), електропорация (Neumann et al., EMBO J. 1:841-45, 1982) , DEAE- декстран изменена трансфекция(АизиЬе1 et al.,) (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73,1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993). Продукцията на рекомбинантни полипептиди в културални клетки на бозайник е разкрита например от Levinson et al., US 4,713,339; Hagen et al., US 4,784,950; Palmiter et al., US 4,579,821 и Ringold, Us 4,656,134. Подобни културирани клетки от бозайник © включват COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7(ATCC No CRL 10314),
BHK(ATCC No CRL 1632), BHK 570 (ATCC No CRL 10314),293 (ATCC No CRL 1573); Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72,1977), Jurcat (ATCCNo CRL 8129), BaF3 (интерлевкин-3 зависима пре- лимфоидна клетъчна линия от муринов костен мозък, например Placios Steinmetz, Cell 41:727-34, 1985; Mathey -Prevot et al., Mol. Cell. Biol.6:4133-5, 1986) и яйчникова клетъчна линия от китайски хамстер (CHO-KI; ATCC No CCL 61). Допълнителни подходящи клетъчни линии, известни в нивото на техника и достъпни за публични демонстрации такива като Американска типово културална колекция АТСС, Роквил, Мериланд. Най- общо са препоръчани силни © транскрипционни промотери като промотер от SV-40 или цитомегаловируси, например в US 4,956,288. Други подходящи промотери включват такива от металотионни гени (US 4,579,821 и US 4,601,978 ) и аденовирусен голям късен промотер.
За отделяне на културални клетки на бозайник, в които е поместена чужда DNA, най-общо се използва лекарствена селекция. Такива клетки найобщо са отбелязани като “трансфектанти”. Клетки, които са културирани в присъствие на селективен агент и са способни да преминават през желания ген към техния проген, са обозначени като “стабилни трансфектанти”. Препоръчан селектиращ маркер е ген, кодиращ устойчивост към антибиотика неомицин. Селекцията е проведена в присъствие на неомицинов тип лекарство като G-418
или подобно. Селекционни системи могат също да бъдат използвани за повишаване на експесивното ниво на търсения ген, метод известен като “амплификация”. Амплификацията се провежда чрез културирани трансфектанти в присъствие на ниско ниво на селективен агент и повишаване на количество на селективен агент и след това повишаване на количеството на селективния агент да селектира клетки, които продуцират високи нива на продукти на въведените гени. Препоръчан амплификационен селектиращ маркер е дихидрофолат редуктаза, която притежава устойчивост към метотрексат. Могат да бъдат използвани и други лекарствено устойчиви гени, например хидромицинова устойчивост, полилекарствена устойчивост, пуромицин ацетилтрансфераза. Алтернативни маркери, които въвеждат изменен фенотип, като зелен флуорисцентен протеин или клетъчно повърхностни протеини като CD4, CD8, Клас I МАС, плацентна алкална фосфата могат да бъдат използвани за отделяне на трансфектирани клетки от нетрансфектирани клетки чрез такива начини като FACS, сортиращи или магнитно зрънчеви сепаративни технологии.
Могат да бъдат използвани и други високи еукаритични клетки като гостоприемници, такива като растителни клетки, инсектни клетки и клетки от хвърчащи. Използването на Agrobacterium rhizogenes като вектор за експресиращи гени в растителни клетки е представено от Sinkar et al., J.Biosci. (Bangalore) 11:47-58, 1987. Трансформация на инсектни клетки и продукция на чужди техни полипептиди е разкрито от Guarino et al., US 5,162,222 и публикация WO 94/06463. Инсектните клетки може да бъдат инфектирани с рекомбинантни бакуловируси, най- общо получени от Autographa califomica ядрено полихидрозен вирус (AcNPV). Например при Posse, The Baculovirus expression System: Al aboratory Guide, London, Chapman and Hall; O’Reilly et al., Baculovirus expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; Richardson, Ed., Baculovirus expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Втори метод, използван за създаване на рекомбинантен BR43x2 бакуловирус, е транспортно базирана система ан Luckov, et al., J. Virol. 67:4566-79, 1993). Тази система, която използва трансферни вектори, е твърд Bac-to-Bac™ кит (Life Technologies Rockville, MD). Тази система използва трансферен вектор, pFastBacl™ (Life Technologies), съдържаща Τη 7 транспорт за задвижване на DNA кодирането на BR43x2 полипептида в бакуловирусен геном, установен при E.coli като пространен плазмид, наречен “бакмид”. Например Hill-Perkins and Possee, J. Gen.Virol. 71:971-6, 1990; Bonning, et al., J. Gen. Virol. 75:1551-6, 1994; Chazenbalk and Rapport, j. Biol. Chem.270: 1543-9,1995. В допълнение, трансферните вектори могат да включват вътрешно рамково смесено cDNA кодиране на епитопен таг на С- или N- терминал на експресиран BR43x2 полипептид, например Glu-glu епитопен таг (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci). Използвайки известна техника в областта трансферен вектор, съдържащ BR43x2, е трансформиран в E.coli и направен скрининг за бакмиди, които съдържат разрушен lacz ген, показателен за бакуловирус. Бакмидът DNA, съдържащ рекомбинантния бакуловирусен геном, е избиран чрез позната техника и се използва да трансфектира Spodoptera frugipera клетки, например Sf9 клетки. Рекомбинантен вирус, който експресира BR43x2 е последващо продуциран. Рекомбинантен вирусен запас се създава чрез методи общо използване в практиката.
Рекомбинантният вирус се използва да засегне клетки- гостоприемници, обикновено клетъчна линия, получена от падналия хелминт spodopteria frugiperda. Например най- общо в Glick and Pasternak, Molecular Biotechnology; Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C.,1994. Друга подходяща клетъчна линия е High Fiveo® клетъчна линия получена ин витро от Trichoplusia ni9US 5,300,435). Търговско достъпни, свободни от серум среди са използавани за растеж и съхраняване на клетките. Подходящи среди са Sf900 II® (Life Technologies) или ESF 921® (Expression Systems) за Sf9 клетки; и Ex-клетка 405® (JRH Bioscienes, Lenexa, KS) Express Fiveo® (Life Technologies) за T.ni клетки. Клетките са израснали от инокулационна плътност на приблизително 2-5 х 106 клетки, през което рекомбинантен вирусен запас се добавя към мултиплициране на дразнене (MOI) от 0.1 до 10, по- типично близо 3. Използваните процедури са описани в лабораторните ръководства (King and Posse, O’Reilly, et al.; Richardson). Последователно пречистване на BR43x2 полипептида от супернатанта може да бъде постигнато чрез използване на методи, описани тук.
Гъбни клетки, включващи клетки от хлебна мая, също могат да бъдат използвани в настоящото изобретение. Видове хлебна мая с известен интерес, в това отношение са Saccaromyces cerevisiae, Pichia pastoris и Pichia methanolica. Методи за трансформиране на Saccaromyces cerevisiae клетки с екзогенна DNA и продуциращи рекомбинантни техни полипептиди са разкрити например от Kawasaki et al., US 4,931,373; Brake, US 5,037,743; Murray et al., US 4,845,075. Избрани са трансформирани клетки от фенотип, определен от селективен маркер, най- общо лекарствена устойчивост или способност за растеж в присъствие на частична хранителна среда, например левцин. Препоръчителна векторна система за използване в Saccharomyces cerevisiae е POTI векторна система, разкрита от Kawasaki et al., US 4,931,373), който предлага да бъдат селектирани трансформирани клетки чрез растеж в глюкозо-съдържаща среда. Подходящи промотери и терминатори за използване в хлебна мая са тези от гликолитичните ензимни гени (Kawasaki et al., US 4,599,311; Kingsman et al. US 4,615,974 и Bitter, US 4,977,092) и алкохолно дехидрогеназни гени. Също и US 4,990,446; US 5,063,154; US 5,139,936 и US 4,661,454. От областта на техниката са известни трансформационни системи за други хлебни май, включително Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermodii и Candida maltosa. Например Gleeson et al., J.Gen. Microbiol. 132: 3459-65, 1986 Cregg, US 4,935,349. Клетки от Aspergillus могат да бъдат използвани съгласно методи на McKnight et al., US 4,935,349. Методи за трансформиране на
Acremonium chrysogenum са разкрити от Sumino et al., US 5,162,228. Методи за трансформираща Neuspora са разкрити от Lambowitz в US 4,486,533.
Например използването на Pichia methanolica като гостоприемник за продуциране на рекомбинантни протеини е разкрита от Raymond в патенти US 5,716,808, US 5,736,383, Raymond, Yeast 14:11-23, 1998г. и в международна публикация WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 и WO 98/02565. DNA молекули за трансформиране Pichia methanolica могат най- общо да се приготвят като двойно навити кръгли плазмиди, които са предварително изправени преди трансформацията. За полипептидна продукция в Pichia methanolica е за предпочитане промотерът и терминаторът в плазмида да бъдат Р. methanolica- гена, като например Pi.methanolica -алкохолен ген (AUG1 или AUG2). Други полезни промотери включват тези на дихидроацетон синтаза (DHAS), форматна дехидрогеназа (FMD) и каталаза (CAT) гени. За облекчено включване на DNA в хромозомата -гостоприемник, за предпочитане е да има пълен експресионен сегмент на плазмид, разположен на двата края от гостоприемник DNA последователности. Препоръчителен селективен маркер за използване в Pichia methanolica е Р. methanolica ADE2 ген, който кодира фосфорибозил-5-аминоимидазолова карбоксилаза (AIRC; ЕС 4.1.1.21 ), която позволява ade2 гостоприемникови клетки да растат в отсъствие на аденин. За разширена скала, при индустриални процеси, където е позволено да се минимизира използването на метанол, е за предпочитане да се използват клетки- гостоприемник, в които са отстранени двата метанол обработени гени (AUG1 или AUG2). За продукция на декретирани протеини, е за предпочитане недостиг на клетки- гостоприемник в бакуларни протеазни гени (РЕР4 и PRB1). Използва се електропорация за облекчаване на включването на плазмид, съдържащ DNA, кодираща полипептид в Р. methanolica клетки. За предпочитане е да се трансформират Р. methanolica клетки чрез електропорация чрез експотенциален разпад, пулсиращо електрическо поле със сила на полето от 2.5 до 4.5 kv/cm, за предпочитане 3.75 kv/cm и постоянно време (t) от 1 до 40 милисекунди, още по- добре около 20 милисекунди.
Съгласно настоящото изобретение прокариотични клетки на гостоприемник, включващи родове на бактерията Escherichia coli, Bacillus и други, са също полезни гостоприемникови клетки. Техники за трансформиране на тези гостоприемници и експресиращи чужди DNA последователности клонирани сами по себе си са добре известни в областта (Sambrook et al.). При експресиране на BR43x2 полипептид в бактерия, като Е. coli, полипептидът може да бъде съхранен в цитоплазмата, най- често като неразтворими гранули или може да бъде насочен към периплазменото пространство чрез бактериална секреторна последователност. В по-ранен случай, клетките се лизирани и гранулите се възстановяват и денатурират например чрез гуанидин изотиоцианат или уреа. Денатурираният полипептид може след това да бъде разгънат и димеризиран чрез разреждане на денатуранта, като диализа срещу разтвор на урея и комбиниране на редуциран и оксидиран глутатион, последвано от диализа на буферен солеви разтвор. В по-късен случай полипептидът може да бъде възстановен от периплазменото пространство в разтворима и функционална форма чрез разграждане на клетките (например чрез соникация или осмотичен шок) до освобождаване на съдържанието на периплазменото пространство и възстановяване на протеина, като по този начин се избягва необходимостта от денатурация и разгъване.
Трансформирани или трансфектирани гостоприемникови клетки са културирани съгласно конвенционални методи в културална среда, съдържаща хранителни вещества и други компоненти, препоръчани за растеж на избрани гостоприемникови клетки. Разнообразие на подходящи среди, включващи определена среда и комплекс среди, са известни в областта на техника и найобщо включват въглероден източник, азотен източник, специфични амино киселини, витамини и минерали. Средата може да съдържа също такива компоненти като растежни фактори или серум, както е препоръчано. Растежната среда се избира най-общо от клетки, съдържащи екзогенно добавена DNA например чрез лекарствена селекция или недостиг на специфичен хранителен компонент, който е добавен чрез селективен маркер,
изведен върху експресивния вектор или ко-транфектиран в клеткатагостоприемник. Р. methanolica клетки са културирани в среда, съдържаща адекватни източници на въглерод, азот и следи на хранителни вещества при температура от около 25°С до 35° С. Течни култури със значителна аерация се използват чрез конвенционални методи, като например чрез разклащане на малки колби или разпръскване на ферментатори. Препоръчителна културална среда за Р. methanolica е YEPD (2% О-глюкоза,2% Bacto® Peptone (Difco Laboratories, Detroit, MI) 1% Bacto® екстракт от хлебна мая (Difco Laboratories)!).004% аденин и 0.006% L-левцин.
Експресирани рекомбинантни BR43x2 (или химерни или смеси на BR43x2 полипептиди) могат да бъдат пречистени чрез фракциониране и/или обичайни пречистващи методи и среди. Съгласно изобретението е препоръчително да се осигуряват протеини или полипептиди с висока чистота, например повече от 95% чистота, още по- добре по- висока от 99%. Амониевосулфатна преципитация и кисела или произволна екстракция може да бъде използвана за фракциониране на пробите. Примерно пречистващи етапи могат да включват хидроксиапатит, размерно изключване, FPLC и обратно- фазова високо-скоростна течна хроматография. Подходяща анион-обменна среда може да бъде: производни декстрани, агароза, целулоза, полиакриламид, специални силикати и други подобни. PEI, DEAE, QAE и Q производни са предпочитани, като DEAE fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) e предпочитана при отделни случаи. Примерни хроматографски среди са тези, получени с фенил, бутил, или октилови групи, такива като Фенил-сефароза FF(Pharmacia), Toyopearl butil 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Октил сефароза (Pharmacia) и други подобни; или полиакрилни гуми, като Amberchrom CG 71 (Toso Haas) и други. Подходящи твърди подложки са стъклени зърна, силиконови зърна, целулозни зърна, агарозни зърна, кръстосано -свързани агарозни зърна, полистиренови зърна, кръстосаносвързани полиакриламидни гуми и други подобни, които са неразтворими при
условията, в които се използват. Тези подложки могат да бъдат променяни с реактивни групи, които позволяват прикрепяне на протеини чрез амино групи, карбоксилни групи, сулфхидрилни групи, хидроксилни групи и/или карбохидратни общности. Примери за куплиращи структури са цианогеннобромидна активация, N-хидроксисукциамидна активация, епоксидна активация, сулфхидрилна активация, хидразидна активация и карбоксилни и амино производни за карбодиамидно куплиращи структури. Тези или други твърди среди са добре известни в областта на техника и са търговско достъпни. Методи за свързване на рецептор полипептиди към поддържаща среда са също известни в областта на техниката. Отделяне на частен метод е рутинен прийом и е определено в частност чрез свойствата на избрания поддържащ материал. Например в Affinity Chromatography: Principles and Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988.
Полипиптедите съгласно настоящото изобретение могат да бъдат изолирани чрез използване на техните свойства. Например може да бъде използвана мобилизирана метално-йонна адсорбционна (IMAC) хроматография за пречистване на хистидинови протеини, включващи тези, които съдържат полихистидинови тагове. Накратко, най-напред се зарежда гел с бивалентни метални йони до образуване на хелат (Sulkovski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985). Към тази матрица се адсорбират хистидин- богати протеини с отделни афинитета, зависещи от използвания метален йон и се отмиват чрез конкурентно отмиване, понижаващо pH или чрез използване на силни хелатни агенти. Други методи за пречистване са пречистване на гликозилирани протеини чрез лектин афинитетна хроматография (Methods in Enzymol., Vol. 182, “Guide to Protein Purification”, M. Deutscer, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529-39). В допълнителни изпълнения съгласно изобретението за улесняване на пречистването могат да бъдат създадени излив на полипептида и афинитетния таг (например малтоза- свързващ протеин, FLAG-tag (Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (SEQ ID No: 13)), Glu-Glu tag (Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu (SEQ ID No: 13)), имуноглобулинов домен).
За предпочитане могат да бъдат използвани протеин разгъващи (и по желание ре-оксидиращи) процедури. За предпочитане е протеинът да се пречиства до > 80% чистота, още по- добре до > 90% , най- добре >95% в отделни случаи е предпочитано фармацевтично чисто състояние, което е повисоко от 99.9% чистота по отношение на контаминиращи макромолекули, в частност други протеини и ядрени киселини и онечистен от инфекции и пирогенни агенти. За препоръчване пречистеният протеин е специфично освободен от други протеини, в частност други протеини или животински източници.
BR43x2 полипептиди или техни фрагменти могат да бъдат получени също чрез химически синтези. BR43x2 полипептиди могат да бъдат мономери или мултимери; гликозилирани или не-гликозилирани; фиксирани или нефиксирани; и могат да включват или да не включват определящ метионин амино киселинен остатък. Примерни BR43x2 полипептиди включват полпептиди от 32-40 остатъка в дължина, с аминокиселинна последователност, съответстваща на следния мотив: ХХСХ [QEK] [QEKNRDHS] [QE] х{02}[YFW] [YFW] DXXLLX{2} C[IMLV] ХСХ {3}CX{6-8}CX{2}[YE}CXX (SEQ ID N0:10) и c ограниченията, описани тук.
BR43x2 полипептиди могат да бъдат синтезирани чрез специални твърдо-фазови синтези, частично твърдо-фазови методи, франгментна кондензация или класически разтворими синтези. За предпочитане полипептидите се получават чрез твърдо-фазови пептидни синтези, например както е описано от Merrifield, J.Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963. Синтезът се провежда с амино киселини, които са защитени на алфа-амино терминалите. Трифункционални амино киселини с лабилни странични вериги са защитени също с подходящи групи за предпазване от нежелани химически реакции с явяващите се по време на групиране полипептиди. Алфа- амино защитната група е селективно отместена към позволена следваща реакция за поместване на амино-терминалите. Условията за отместване на алфа-амино защитната група не отстраняват странично- верижни защитни групи.
Алфа-амино защитни групи са добре известни в областта на техника за степенни полипептидни синтези. Включените ацилови типови защитни групи (например формил, трифлуорацетил, ацетил) арилов тип защитни групи (биотинил), ароматен уретанов тип защитни групи [например бензилоксикарбонил (Cbz), заместен бензилоксикарбонил и 9-флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc)], алифатни уретанови защитни групи [например, tбутилоксикарбонил (tBoc), изопропил-оксикарбонил, циклохексилоксикарбонил] и алкилов тип защитни групи (например бензил, трифенилметил). Препоръчани защитни групи са tBoc и Fmoc.
Странично-верижни защитните групи, избрани от останало образование по време на куплиране, не се отместват по време на депротекцията на аминотерминалните защитни групи или по време на куплиращи условия. Страничноверижните защитни групи трябва също да са отстраними по време на синтеза чрез реакционни условия, които не изменят крайният полипептид. В tBoc химизма странично-верижните защитни групи за трифункционални амино киселини най- много са бензилови. В Fmoc химизма те са предимно терт-бутил или тритилови.
В tBoc химизма, за предпочитане странично-верижните защитни групи са тозил за аргинин, циклохексил за аспартова киселина, 4-метилбензил и ацетамидометил за цистеин, бензил за глутамова киселина, серин за треонин, бензилоксиметил и динитрофенил за хистидин, 2-С1-бензилоксикарбонил за лизин, формил за триптофан и 2-бромбензил за тирозин. В Fmoc химизма, препоръчителните странично-верижни защитни групи са 2,2,5,7,8пентаметилхроман-6-сулфонил (Ртс) или 2,2,4,6,7пентаметилдихидробензофуран-5-сулфонил (Pbf) за аргинин, тритил за аспарагин, цистеин, глутамин и хистидин, терт-бутил за аспартова киселина, глутамова киселина, серин, треонин и тирозин, tBoc за лизин и триптофан.
За синтеза на фосфопептидите се използва както пряко, така и следобединяващо включване на фосфатната група. При метода на директното включване фосфатната група върху серин, треонин или тирозин може да бъде
защитена чрез метил, бензил или терт-бутил в Fmoc химията или чрез метил, бензил или фенил в tBoc химията. В Fmoc химията може да бъде използвано пряко включване на фосфотирозин без фосфатна защита. При метода на следобединяващото включване незщитени хидроксилни групи на серин, треонин или тирозин се получават върху твърда фаза с дитерт-бутил-, дибензил- или диметил-М,М’-диизопропил-фосфорамидид, след което се оксидизира чрез терт-бутилхидропероксид.
Твърдофазовата синтеза се провежда обикновено от карбоксилтерминала чрез свързване на алфа-амино защитена (странично-верижно защитена) аминокоселина към подходяща твърда подложка. Естерната връзка се образува, когато прикрепването е извършено към хлорметил, хлортритил или хидрокси метил смола и полученият пептид може да има свободна карбоксилна група при С-терминала. Алтернативно, когато се използва амидна смола, такава като бензхидриламинна или р-метилбензхидриламинна смола (за tBoc химия) и Ring -амид или PAL смола (за Fmoc химия), амидната връзка се образува и полученият полипептид има карбоксамидна група при Стерминала. Тези смоли независимо дали са базирани на полистирен или полиамид или полиетиленгликол с/или без прихващан или връзка, с или без първо аминокиселинно прикрепяне са търговско достъпни и техните препарати са описани от Steward et al., “Solid Phase Peptid Synthesis” (2nd Edition), (Pierce Chemical Co., Roeford, IL, 1984) и Bayer and Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986; и Atherton et al., Solid Phase Peptid Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989.
С-терминалната амино киселина, защитена на страничната верига при необходимост и на α-амино групата се прикрепя към хидроксиметил смола чрез различни активиращи агенти, като дициклохексилкарбодиимид (DCC), NN'-диизопропилкарбодиимид (DIPCDI) и карбонилдиимидазол (CDI). Тя може да бъде прикрепена към хлортритилна смола пряко в нейната цезиева тетраметиламониева солева форма или в присъствие на триетиламин (TEA) или диизопропилетиламин (DIEA). Първото амино киселинно прикрепване
към амидна смола е същото като амидно свързаната форма чрез куплиращи реакции.
След прикрепването към подложката от смола алфа-амино защитната група се отстранява чрез различни реагенти в зависимост от химията на защита (напр. Tboc, Fmoc). Степента на Fmoc отсраняването може да бъде наблюдавано при 300 - 320 nm или чрез провеждаща клетка. След отстраняване на алфа-амино защитната група, оставащите защитени аминокиселини се свързват постепенно в необходимия ред до получаване на желаната последователност.
Могат да бъдат използвани различни активиращи агенти за куплиращи реакции, включително DCC, DIPCDI, 2-хлор-1,3-диметилимидиум хексафлуорфосфат (CIP), бензотриазол-1 -ил-окси-трис-(диметил-амино)фосфониум хексафлуорфосфат (ВОР) и неговия пиролидинов аналог (РуРОР), бром-трис-пиролидин-фосфониум хексафлуорфосфат (РуВгОР),
О(бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурониум хексфлуор фосфат (HBTU) и неговия флуорборат аналог (TBTU) или негов пиролидинов аналог (HBPYU), О-(7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетра метил уроний хексафлуоро фосфат (HATU) и негов тетрафлуорборат аналог (TATU) или негов пиролидинов аналог (HAPyU). Най-използваните каталитични добавки в куплиращи реакции са 4-диметиламинопиридин (DMAP), 3-хидрокси-3,4-дихидро-4-оксо1,2,3-бензотриазин (HODhbt), N-хидроксибензотриазол (HOBt) и 1-хидрокси7-азабензотриазол (HOAt). Всяка защитена аминокиселина се използва с излишък (>2.0 еквивалента), като свързването се извършва в Nметилпиролидон (NMP) или в DMF, СН2С12 или техни смеси. Степента на завършване на куплиращата реакция може да бъде наблюдавана на всеки етап, например чрез нинхидринова реакция, както е описано от Kaiser et al., Anal. Biochim. 34:595, 1970.
След цялостното получаване на желания пептид, пептидната смола се разцепва с реагент с подходящи почистващи вещества. Fmoc- пептидите се разцепват и де-защитават чрез TFA с почистващи вещества, например вода,
етандитиол, фенол и тиоанизол. ТЬос пептидите обикновено се разцепват и дезащитават с течен HF за 1-2 часа при -5° до 0°С, което разцепва полипептида от смолата и отстранява по-голямата част от странично-верижните защитни групи. Почистващи вещества като анизол, диметилсулфамид и р-тиокрезол се използват обикновено в течен HF за предпазване на катиони, образувани по време на разцеплението от алкилираните и ацилираните амино киселинни остатъци, присъстващи в полипептида. Формилната група на триптофана и динитрофенилната група на хистидина е необходимо да бъдат заменени съответно от пиперидин или тиофенил в DMF преди HF разцепване. Ацетамидометилната група на цистеина може да бъде отстранена с живачен (II) ацетат и по избор с йод, талиев (III) трифлуорацетат или сребърен тетрафлуорборат с едновременно оксидиране на цистеина до цистин. Други силни киселини, използване за tBoc пептидно разцепване и депротекция, са трифлуорметансулфонова киселина (TFMSA) и триметилсилилтрифлуороцетна киселина (TMSOTf).
Настоящото изобретение допълнително предлага множество други полипептидни смеси и съответни многомерни протеини, съдържащи една или повече полипептидни смеси. Разтворим BR43x2, TACI или ВСМА полипептид може да бъде експресиран като смес с имуноглуболин тежко верижен постоянен регион, най- често като Fc фрагмент, който съдържа два постоянни регионни домена и липсва променливият регион. Методи за получаване на такива смеси са разкрити в US 5,155,027 и US 5,567,584. Такива смеси найчесто са секретирани като многомерни молекули, в които Fc частите са дисулфидно свързани с всеки друг и два не-Ig полипептиди са подредени в близост към всеки друг. Имуноглобулин- BR43x2 (TACI или ВСМА) полипептидни смеси могат да бъдат експресирани в клетки, получени чрез генно инженерство до продуциране на множество многомерни BR43x2 аналози. Допълнителни (помощни) домени могат да бъдат насочени към BR43x2 (TACI или ВСМА) полипептиди за достигане до специфични клетки, тъкани или макромолекули. Смесите също могат да бъдат получени чрез използване на токсини, както е дискусирано тук. По този начин, полипептиди и протеини могат да бъдат насочвани за терапевтични или диагностични цели. BR43x2 полипептид може да бъде насочен към две или повече структури, такива като афинитетен таг за пречистване и целеви домен. Полипептидни смеси могат също да съдържат един или повече разцепващи сайта, в частност между домени. Tuan et al., Connect. Tiss. Res. 34:1-9, 1996. Смеси от такъв тип също могат да бъдат използвани, например към афинитетен пречистващ приближен лиганд от разтвор, като ин витро анализно средство за блокиране на сигнали ин витро, чрез специфично титриране на лиганда към свързване на лиганд върху клетъчна повърхност или като BR43x2 антагонисти ин виво, чрез прилагането им за блокиране на лигандната стимулация. Например в изследване, сместа от протеини може да бъде свързана за поддържане през Fc регион и използвана в ELISA формат.
Изобретението също се отнася до разтворими BR43x2 рецептори и полипептидни фрагменти, използвани да образуват смес от протеини с афинитетни тагови или означения. Разтворими Е^43х2-афинитетни тагови смеси протеини са използвани например за идентификация на BR43x2 лиганди, както и като агонисти и антагонисти на природни лиганди. Използвайки означен, разтворим BR43x2 чрез флуоресцентна имуносиметрия или имунохистохимия са идентифицирани клетки, експресиращи лиганда, агонисти или антагонисти. Разтворимите смесени протеини се използват при изучаването на пренос на лиганда върху тъкани или специфични клетъчни линии и да осигурят яснота в рецептор/лиганд биологията.
За пречистване на лиганд, агонисти или антагонисти се добавя BR43x2 Ig смесен протеин към проба, съдържаща лиганд, агонист или антагонист при условия, които улесняват рецепто- лиганд свързване (най- често температура, pH и йонна сила близки до физиологичната). След това рецептор-лиганд комплексът се отделя чрез смес, използвайки протеин А, който е имобилизиран върху твърда подложка (например неразтворими смолни зърна). Лигандът, агонист, антагонист след това се промива по конвенционални
химически методи, като например със сол или pH градиент. В алтернативен случай смесеният протеин сам може да се свърже към твърда подложка с връзка или промиване, както е посочено по- горе. Методи за имобилизиране на рецептор полипептид към твърда подложка, като например зърна от агароза, кръстосано-свързана агароза, стъкло, целулозни смоли, силициеви смоли, полистирен, кръстосано-свързан поликриламид или други подобни материали, които са стабилни при тези условия на използване, са известни в областта на техника. Методи за свързване на полипептиди към твърди подложки са също известни и включват амино химия, цианогенна бромидна активация, Nхидроксисукцинимидна активация, епоксидна активация, сулфхидрилна активация и хидразид активация. Получените среди най- общо са под формата на колона и флуиди, съдържащи лиганд, които минават през колоната един или повече пъти, докато лигандът се свърже към рецепторния полипептид. Лигандът след това се промива чрез промени в солевата концентрация, хаотропични агенти (МпС12) или pH до разрушаване на лиганд- рецепторното свързване.
За да се насочи изнасянето на разтворимия рецептор от клеткатагостоприемник, разтворимият рецептор DNA се свързва към втори DNA сегмент, кодиращ секреторен пептид, като например t-PA секреторен пептид. За да улесни пречистването на секреторния рецептор домен, към рецепторен полипептид може да бъде добавено N- или С- терминално удъление, като например афинитетен таг или друг полипептид или протеин, за който е подходящо антитяло или друг специфичен свързващ агент.
Съгласно настоящото изобретение в скрининг изследвания се използват клетки, които експресират функционално разтворими и мембранно свързани рецептори. Множество подходящи изследвания са известни в областта на техниката. Тези изследвания се базират на откриването на биологичен отговор в целева клетка. Промяна в метаболизма, сравнена с контролна стойност показва тест- съединение, което модулира BR43x2 променен метаболизъм. Едно такова изследване е клетъчно пролиферативно изследване. Клетки се
културират в присъствие или отсъствие на тест съединение и клетъчна пролиферация се открива например чрез измерване на включването на тритиев тимидин или чрез колориметрично изследване на база на метаболитно прекъсване на 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)2,5-дифенил тетразол бромид (МТТ) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55-63, 1983). При едно алтернативно изследване се използват клетки, които са допълнително обработени да експресират репортерен ген. Репортерният ген е свързан към усилващ елемент (промотер), който е отговорен за рецептор-свързания канал и изследването открива активация на транскрипция на репортерния ген. В областта на техниката са известни голям брой репортерни гени, които са лесно проучвани за клетъчни екстракти, например E.coli, хлорамфеникол ацетил трансфераза (CAT) и серумен отговор елемент (SRE) (Shaw et al., Cell 56:563-72, 1989). Такъв препоръчителен репортерен ген е луциферазен ген (Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725, 1987). Експресията на луциферазен ген се открива чрез луминисценция като се използват методи, известни в областта на техниката (Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269:29094-101, 1994; Schenbom and Goiffin, Promega Notes 41:11, 1993). Луциферазни активностни изследователски кита са търговско достъпни, например от Prmega Corp., Medison, WI. Целеви клетъчни линии от този тип могат да се използват за скринингови библиотеки на химикали, клетъчноусловни културални среди, гъбни бульони, почвени примери, водни примери и други подобни. Например банка на клетъчно- условни среди могат да бъдат изследвани върху целева клетка за идентифициране на клетки, които продуцират лиганд. След това позитивни клетки се използват за продуциране на cDNA библиотека при бозайников експресионен вектор, която е разделена в гнезда, трансфектирани в гостоприемникови клетки и експресирани. След това проби на среди от трансфектирани клетки се изследват с последващо деление на гнезда, ре-трансфекция, субкултуриране и повторно изследване на позитивни клетки до изолиране на клонирани клетки DNA, кодиращи лиганд.
Могат да бъдат успешно използвани система за изследване, която използва лиганд-свързващ рецептор (или антитяло, един член на
комплемент/анти-комплементна двойка) или техен свързващ фрагмент и търговско достъпен биосензорен инструмент (BIAcore®, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NY). Такъв рецептор, антитяло, член на комплемент/антикомплементна двойка или техен свързващ фрагмент е имобилизиран върху повърхността на рецепторен чип. Използване на този инструмент е разкрито от Karlsson, J.Immunol. Meth. 145:229-40, 1991 и Cunnigham and Wells, J.Mol. Biol. 234:554-63, 1993. Например BR43x2 полипептид, фрагмент, антитяло или член на комплемент/анти-комплементна двойка е ковалентно прикрепен чрез използване на амин или сулфхидрилен химизъм към декстранови влакна, които са прикрепени към златен филм вътре в клетката. Изследваният образец преминава през клетката. Ако лиганд, епитоп или противоположен член на комплемент/антикомплементна двойка присъства в тази проба, то те ще се свържат с имобилизирания рецептор, антитяло или член, съответно предизвикващ промяна в рефрактивния индекс на средата, която е открита кат промяна в повърхностно плазмения резонанс на златния филм. Тази система позволява определянето на повърхностните и отместени стойности, от които може да се изчисли и оцени стехиометрично свързващият афинитет. Лиганд свързващи рецепторни полипептиди могат също да бъдат използвани в други опитни системи, известни в областта на техниката. Такива системи включват графични анализи за определяне на свързващ афинитет (например Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660-72, 1949) и калориметрични опити (Cunningham et al., Science 253:545-48, 1991; Cunningham etal., Science 245:5821-25, 1991.).
Scatchard плот анализ за разтворим I -ztnf4p, свързващ към TACI и ВСМА е показан във Фигура 2 и е сравнен със свързващите константи на други членове на TNFR фамилията в Таблица 7.
ТАБЛИЦА 7
Лиганд kdM Клетъчен източник Отпратка
TNFa high 7.14E-11 HL-60 a
TNFa low 3.26E-10 HEP-2 a
TNFa high 2.00E-10 HL-60 b
CD27L 3.70E-10 MP-1 c
CD27L 8.30E-09 MP-1 c
CD40L 5.00E-10 EL40.5 d
CD40L 1.00E-09 EBNA d
(125I-CD40)
4-1 BBL 1.16E-09 Biacore e
Anti 41Bbmab 4.14E-10 Biacore e
Ztnf4 ztnf4 sol. 1.25E-09 TACI-BHK
Ztnf4 ztnf4 sol. 1.25E-09 BCMA-BHK
a Hohman et al., J.Biol. Chem. 264:14927-34,1989 b Manna and Aggarwal, J.Biol. Chem. 273:33333-41, 1998 c Goodwin al., Cell 73:447-56, 1993 d Armitage et al. Nature 357:80-82, 1992 e Shuford et al., J.Exp. Med. 186:47-55, 1997
Активността на BR43x2 полипептид като рецептор може да бъде измерена чрез силиконов биосензорен микрофизиометър, който мери извънклетъчната киселинна степен или протон-отделянето, свързано с рецепторно свързване и последващи физиологични клетъчни отговори. Едно примерно устройство е Cytosensor Microphysiometer®, произведено от
Molecular Devices, Sunnyvale, СА. C този метод могат да бъдат измерени различни клетъчни отговори, такива като клетъчна полиферация, йонен транспорт, енергийна продукция, възпалителен отговор, регулаторна и рецепторна активация и други подобни. Например McConnell et al., Science 257:1906-12, 1992; Pitchford et al., Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli et al., J.Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde etal., Eur.J. Pharmacol. 346:8795, 1998. Микрофизиометърът може да бъде използван за изследване на адхерентни или неадхерентни еукариотични или прокариотични клетки. Чрез измерване на извънклетъчни киселинни промени в клетъчна среда за определено време, микрофизиометърът пряко измерва клетъчните отговори към различни дразнители, включващи агонисти, лиганди или антагонисти на BR43x2 полипептид. За предпочитане микрофизиометърът се използва за измерване на отговори на 1Ж43х2-експресираща еукариотична клетка, сравнена с контролна еукариотична клетка, която не експресира BR43x2 полипептид. BR43x2-eKcnpecHpaniH еукариотични клетки съдържат клетки, в които BR43x2 е трансфектиран, както е описано тук, създавайки клетка, която отговаря на ВВ43х2-модулиращ дразнител; или клетки, природно експресиращи BR43x2, такива като BR43x2-eKcnpecHpaniH клетки, получени от далачна тъкан. Разлики, измерени чрез смяна в извънклетъчна киселинност, например повишаване или намаляване в отговора на клетки, експресиращи BR43x2, съпоставимо с контрола, са пряко измерени от BR43x2-мoдyлиpaни клетъчни отговори. Освен това, такива BR43x2-мoдyлиpaни отговори могат да бъдат изследвани при различни дразнители. Чрез използване на микрофизиометър се предлага и метод за идентифициране на агонисти и антагонисти на BR43x2 полипептид, който включва осигуряване на клетки, експресиращи BR43x2 полипептид, културиране на първа порция на клетките в отсъствие на тест-съединение, културиране на втора порция на клетките в присъствие на тест-съединение и откриване на промяна, например повишаване или намаляване в клетъчния отговор на втората порция на клетките, в сравнение с първата порция на клетките. Промяната в клетъчния отговор е
показана като измерима променена извънклетъчна киселинна степен. Чрез този метод могат да бъдат идентифицирани антагонисти и агонисти за BR43x2 полипептид.
Разтворимият BR43x2 се използва при изследване на разпределението на лиганди в тъкани или специфични клетъчни линии за изясняване на рецептор/лиганд биологията. Може също да бъде приложено при специфицирането на TNF рецептори за техни лиганди като механизъм, чрез който се разграждат лиганд-носещите целеви клетки. Например токсични съединения, като радиофармацевтици, които инактивират целеви клетки; хемотерапевтични агенти, като доксорубин, даунорубицин, метотрексат и цитоксан; токсини, такива като рицин, дифтерия, Pseudomonas екцотоксин А и абрин; и антитела към токсични Т-клетъчно повърхностни молекули.
Ztnf4 (5 ng/ml) е установено, че са свързани към BR43x2 (SEQ ID N0:2), TACI (SEQ ID N0:6), BCMA (SEQ ID N0:8) и BR43x2(SEQ ID N0:9) чрез FACS анализ (Flow Cytometry and Sorting, Melamed et al., eds. Wiley-Liss, 1990 and Immunofluorescence and Cell Sorting, Current Protocol in Immunology, Vol.l, Coligan et al., John Wiley & Son, 1997). FITC-тагов разтворим ztnf4 също e препоръчан за специфично свързване и на В лимфоцити в PBMNC, клетки от сливици, към В клетъчни лимфомно клетъчни линии (Raji, Burkitt's human lymphoma,ATCC CCL86), Ramos (Burkitt's human lymphoma cell line, ATCC CRL-1596), Daudi (Burkitt's human lymphoma, ATCC CCL213) и RPMI 1788 (B лимфоцитно клетъчна линия, ATCC CCL-156) чрез използване на FACS анализ. Не е наблюдавано свързване с HL-60 (АТСС промиелоцитна клетъчна линия, ATCC CCL-240). Спецификата на свързване към В клетки от PBMNC и клетки от сливици е потвърдено от ко-оцветяване с антитела в В клетъчно специфични молекули, включващи CD 19, IgD, IgM и CD20. Близостта на ztnf4 към CD40L предполага по-широко тъканно разпространение, отколкото изглежда. Афинитетът на ztnf4 е изследван върху моноцити, дентритни клетки и пречистени Т клетки, използващи цитокин пролиферация, например Т клетъчно пролиферативно изследване, и не би могъл да открива свързване на
ztnf4 или друг биологичен ефект върху друг тип изпитани клетки. Въпреки това, специфичността за В клетки от лиганда и рецептора предполага, че те са полезни за изследване и лечение на автоимунност, В клетъчни канцери, имуномодулация, IBD и всяка антитяло-променена патология, например ITCP, миастения гравис и подобни, бъбречни заболявания, непряк Т клетъчен имунен отговор, реакция на отхвърляне при присаждане, заболяване на отхвърляне на гостоприемника.
Ztnf4 е показан при активиране на В клетки, произтичащи от В клетъчна пролиферация, антитяло продукция и up-регулация на активирани маркери ин витро (виж примерите по- долу). Тези ефекти могат да изискат ко- стимулация през IL-4 или други цитокини или стимулация през В клетъчен антиген рецептор или други клетъчно повърхностни рецептори, които активират В клетки, например CD40. Други туморно некротично факторни лиганди, като gp39 и TNF3, също стимулират В клетъчна пролиферация. По този начин полипептидите съгласно настоящото изобретение могат да бъдат насочени към специфично регулирани В клетъчни отговори, инхибиращи активирани В клетки по време на имунния отговор без засягане на други клетъчни популации, което е предимство при лечението на болести. Освен това полипептидите съгласно настоящото изобретение могат да бъдат използвани за модулиране на В клетъчно развитие, развитие на други клетки, антитяло продукция и цитокинова продукция. BR43x2 полипептиди могат също да намерят приложение за предизвикване на апоптоза и/или алергия в клетките. Полипептидите съгласно настоящото изобретение могат също да модулират Т и В клетъчна комуникация чрез неутрализиране на пролиферативните ефекти на ztnf4. Био-изследвания и ELISA са възможни за измерване на клетъчен отговор към ztnf4 в присъствие на разтворим BR43x2, TACI и/или ВСМА. Други опити включват онези, които измерват разликите в цитокинова продукция като мярка за клетъчен отговор (например Current Protocol in Immunology ed. John E. Coligan et al., NIH, 1996); опити за измерване на други
клетъчни отговори, включващи антитяло изотип, моноцитна активация, NK клетъчна формация, антиген присъстваща клетъчна функция, апоптоза.
BR43x2 полипептидите съгласно настоящото изобретение биха били полезни за неутрализиране на ефектите на ztnf4 за лечение на пре-В или Вклетъчна левкемия, като плазмено клетъчна левкемия, хронична или акутна лимфоцитна левкемия, миелом като мултиплетен миелом, плазмено клетъчен миелом, ендотелен миелом и гигантски клетъчен миелом; лимфоми като неХочкинов лимфом, който е свързан с нарастването на ztnf4 полипептиди. Разтворимият BR43x2 може да бъде полезен компонент при лечебен режим за инхибираща туморна прогресия и възстановяване.
Northern blot анализ показва ztnf4 експресирано в CD8+ клетки, моноцити, дентроцити, активирани моноцити. Това предполога, че в някои автоимунни разтройства, цитотоксични Т-клетки могат да стимулират Вклетъчна продукция чрез излишък на продуциране на ztnf4. Имуносупресивните протеини, които селективно блокират действието на Влимфоцити могат да бъдат използвани при лечение на заболявания. Продуцирането на автоантитяло е типично за няколко автоимунни заболявания и е разпространено при тъкънно разграждане и обостряне на заболявания. Автоантитела могат също да доведат до наблюдаване на имунно комплексно разместващи усложнения и до много симптоми на системен лупус еритроматозис, включващ бъбречни заболявания, невралгични симптоми и смърт. Модулираща антитяло продукция, независима от клетъчен отговор също би могла да бъде успешна при много болестни състояния. В клетки също могат да бъдат показани като играещи роля в секрецията на артритогенни имуноглобулини в ревматоиден артрит (Korganow et al., Immunity 10:451-61, 1999). Самата инхибиция на ztnf4 антитяло продукцията би била успешна при лечение на автоимунни заболявания като миастения гравис и ревматоиден артрит. Имуносупресанти терапевтици като разтворим BR43x2, който селективно блокира или неутрализира действието на В-лимфоцити, могат успешно да се използват за такива цели. За да се проверят тези способности в
BR43x2 разтворими рецепторни полипептиди съгласно настоящото изобретение, такива BR43x2 полипептиди се оценяват чрез използване на опити, известни в областта на техниката и описани тук.
Изобретението се отнася и до методи, използващи BR43x2, TACI или ВСМА полипептиди, смеси, антитела, агонисти или антагонисти за селективно блокиране или неутрализиране на действията на В- клетки във връзка с крайни стадии на бъбречни заболявания, които могат или не могат да бъдат свързани с автоимунни заболявания. Такива методи биха могли да бъдат полезни за лечение на глумеронефрит, свързан със заболявания, като например мембранна нефропатия, IgA нефропатия или Бергерова болест, IgM нефропатия или Гудпастьорова болест, след- инфекциозни глумерулонефрити, мезангио-пролиферативни заболявания, малко променен нефричен синдром. Такива методи могат също да се наложат като терапевтични приложения за лечение на вторични гломерулонефрити или васкулити, свързани с такива заболявания като лупус, полиартрит, Henoch-Schonlein, склеродерма, HIVзависими заболявания, амилоидози или хемолитичен уремичен синдром. Методите съгласно настоящото изобретение могат също да бъдат използвани като част от терапевтични приложения за лечение на интерестициален нефрит или пиелонефрит, свързан с хроничен пиелонефрит, злоупотреба с аналгетици, нефрокалциноза, нефропатия предизвикана от други агенти, нефролитиаза или хроничен или остър интерестициален нефрит.
Методите съгласно настоящото изобретение също включват използване на BR43x2, TACI или ВСМА полипептиди, смеси, антитела, агонисти или антагонисти при лечението на хипертензивни или сърдечно-съдови заболявания, включващи бъбречно-артериална стеноза или непроходима и холестеролна емболия или бъбречна емболия.
Методите съгласно настоящото изобретение се отнасят също до диагноза и лечение на бъбречни или урологични неоплазми, мултиплетни миеломи, лимфоми, леко верижни невропатии или амилоидози.
Изобретението се отнася и до методи за блокиране или инхибиране на активирането на В клетки, използващи BR43x2, TACI или ВСМА полипептиди, смеси, антитела, агонисти или антагонисти за лечение на астма и други хронични заболявания на дихателните пътища, като бронхит и емфизема.
Съгласно изобретението са разкрити и методи за инхибиране или неутрализиране на ефекторен Т клетъчен отговор, използващ BR43x2, TACI или ВСМА полипептиди, смеси, антитела, агонисти или антагонисти за използване в имуносупресия, в частност за терапевтична употреба при реакция на отхвърляне и трансплантационни обратни заболявания. Друго приложение може да бъде при регулиране на имунен отговор, в частност активиране и регулиране на лимфоцити. BR43x2, TACI или ВСМА полипептиди, смеси, антитела, агонисти или антагонисти могат да се използват при терапия и лечение на имунна недостатъчност. BR43x2, TACI или ВСМА полипептиди, смеси, антитела, агонисти или антагонистимогат да се използват при терапевтични указания за лечение на такива автоимунни заболявания като инсулино зависим диабетен мелитус (IDDM) и болест на Крон. Методите съгласно настоящото изобретение могат да имат допълнителна терапевтична стойност при лечение на хронични възпалителни заболявания, в частност за намаляване на ставна болка, преглъщане, анемия и други свързани симптоми, както и за лечение на септичен шок.
Ефектът от разтворими BR43x2, TACI или ВСМА полипептиди и смес от протеини върху имунен отговор може да бъде измерен чрез прилагане на полипептидите съгласно настоящото изобретение върху животни, имунизирани с антиген, последвано от инжектиране на ztnf4 и измерване на антитяло изотопната продукция и В и Т клетъчни отговори, включващи забавен тип хиперсензивност и ин витро пролиферация и цитокинна продукция съгласно методите известни в областта на техника.
Настоящото изобретение се отнася и до метод за инхибиране на ztnf4 активност при бозайници, включващо прилагане към тези бозайници на
количество съединение, избрано от групата, съдържаща: а) полипептид от SEQ ID N0:4; б) полипептид от SEQ ID N0:8; в) смесен протеин; г) полипептид от SEQ ID N0:6 от амино киселинен остатък 1 до остатък 166; д) полипептид от SEQ ID N0:8 от амино киселинен остатък от 1 до остатък 150; е) антитяло или антитяло фрагмент, който се свързва специфично към полипептид от SEQ ID N0:4; и ж) антитяло или антитяло фрагмент, който се свързва специфично към полипептид от SEQ ID N0:10. Примери за смесени протеини са смеси на разтворими BR43x2 (SEQ ID N0:4), TACI (от амино киселинен остатък 1 до остатък 166 на SEQ ID N0:6) или ВСМА (от амино киселинен остатък от 1 до остатък 150 на SEQ ID N0:8) с друг полипепти, за предпочитане имуноглуболин тежко верижен постоянен регион Fc фрагмент. Изобретението се отнася и до метод за инхибиране на BR43x2, TACI или ВСМА рецепторлигандно образувание.
Такива методи биха могли да бъдат частично използвани където ztnf4 активността е свързана с активирани В лимфоцити и при лечение на пре-В клетъчни или В-клетъчни тумори. Такива методи могат също да бъдат използвани където ztnf4 активността е свързана с антитяло продукция, в частност антитяло продукция, свързана с автоимунни заболявания, като системен лупус еритроматозис, миастения гравис или ревматоиден артрит.
Настоящото изобретение се отнася и до BR43x2 агонисти и антагонисти. Съединения, идентифицирани като BR43x2 агонисти, се използват за модифициране на полиферацията и развитието на целеви клетки ин витро и ин виво. Например, агонист съединения се използват единично или в комбинация с други цитокини и хормони, като компоненти на определена клетъчно културална среда. По този начин агонистите се използват в специфично медииране на растежа и/или развитието на BR43x2-Hocenjn В лимфоцитни клетки в култура. Агонисти и антагонисти могат също да бъдат полезни при изследване на ефекторни функции на лимфоцити, в частност В лимфоцитна активация и диференциация. Антагонистите се използват като реагенти при изследвания за характеризиране на лиганд-рецепторно взаимодействие.
Съединения, идентифицирани като BR43x2 антагонисти, се използват и за повишаване на хуморалния имунен отговор. В- клетъчните отговори са важни при борба с инфекциозните заболявания, включващи бактериални, вирусни, протозойни и паразитни инфекции. Антитела срещу инфекциозни микроорганизми могат да имобилизират патогена чрез свързване към антиген, последвано от комплемент медииран лизис или клетъчно медиирана атака. BR43x2 антагонист може да предизвика повишаване на хуморалния отговор и би могъл да се използва лечебно при индивиди в риск за инфекциозни заболявания или като добавка към ваксинация.
Изобретението се отнася и до антагонисти, които също се свързват към BR43x2 полипептиди или алтернативно към лиганд, към който е свързан BR43x2 полипептид, като по този начин инхибират или елиминират функцията на BR43x2. Такива BR43x2 антагонисти могат да включват антитела; олигонуклеотиди, които се свързват или с BR43x2 полипептид, или с негов лиганд; природни или синтетични аналози на BR43x2 лиганди, които запазват способността да свързват рецептора, но не предизвикват сигнал при всеки лиганд или рецептор. Такива аналози могат да бъдат пептиди или пептидоподобни съединения. Природни или синтетични малки молекули, които се свързват към BR43x2 полипептиди и предпазват сигнала, също могат да бъдат антагонисти. Също така BR43x2 антагонисти могат да се използват като терапевтични средства за лечение на познати заболявания, където блокиращи сигнали от такъв BR43x2 рецептор или лиганд ще бъдат благотворни. Антагонистите са полезни като изследователски реагенти за характеризиране на лиганд-рецепторно взаимодействие. BR43x2 се експресира върху трансформирани В клетъчни линии, включващи EBV индуциран и спонтанен лимфом на Буркит и няколко В клетъчни миеломи. Инхибиране на функцията на BR43x2 може да бъде използвано при лечение на В клетъчен лимфом или множествен миелом. BR43x2 антагонисти, като BR43x2 разтворими рецептори или антитела, могат да бъдат използвани лечебно да предизвикват туморно повлияване.
ОМ
Активността на агонисти и антагонисти може да бъде определена чрез тестове за активност, които определят силата на рецептор/лиганд свързването. Стабилно трансфектирани В-клетъчни линиии, като Bafi (murine pre-B cell line Palacios and Steinmetz, and Mathey- Prevot et al.,), които ко-експресират високи нива на репортерно генна конструкция, са създадени за NfKB, NFAT-1 и АР-1, които еспресират BR43x2. Клетъчни линии, екпресиращи TACI и ВСМА, също се получават по подобен начин и при Jurcat и други В лимфомни клетъчни линии. Установено е, че Ztnf4 сигнализира чрез репортерните гени в тези конструкции. За измерване на свързването могат да бъдат използвани разтворими BR43x2 и антитела.
Един ин виво подход за изследване на протеини съгласно настоящото изобретение включва вирусни преносни системи. Примерни вируси за тази цел са адено-вируси, херпес-вируси, ваксинен вирус и адено-свързан вирус (AAV). Аденовирус, двойно-верижен DNA вирус е по-настоящем най- добре изследваният генен трансферен фактор за пренасяне на хетерологна нуклеинова киселина (Becker et al., Meth. Cell Biol. 43:161-89,1994: and Douglas and Curiel, Science & Medecine 4:44-53, 1994). Аденовирусните системи предлагат няколко предимства: аденовирусът може: (i) да приеме относително голямо множество DNA вмествания; (й) може да нарастне до висок тигър; (iii) може да инфектира голям брой от различни клетки на бозайници; и (iv) може да се използва с голям брой от наличните вектори, съдържащи различни промотери. Също така, поради това, че аденовирусите са стабилни в кръвния поток, те могат да се прилагат чрез интравенозно инжектиране.
Чрез отделяне на порции от аденовирусния геном могат да бъдат привлечени по-голям брой вмествания на хетерологова DNA (до 7 kb). Тези вмествания могат да бъдат включени във вирусната DNA чрез пряко свързване или хомоложна рекомбинация с ко- трансфектен плазмид. В една примерна система същественият Е1 ген се отделя от виралния вектор и вирусът не се удвоява, освен ако Е1 генът е от гостоприемниковата клетка (човешката 293 клетъчна линия е пример). Когато се прилага интравенозно при здрави
животни, аденовирусите преимуществено се насочват в черния дроб. Ако аденовирусна преносна система има Е1 генна липса, вирусът няма да се удвои в гостоприемниковите клетки. Въпреки това, гостоприемниковата тъкан (например черен дроб) ще експресира и произведе (и ако присъства сигнална последовотелност, секретира) хетерологов протеин. Секретирани протеини ще влязат в циркулацията на силно васкуларизирания черен дроб и могат да бъдат определени ефектите върху инфектираното животно.
Аденовирусните системи могат също да се използват за протеиново продукция ин витро. Чрез културиращи аденовирусно-инфектирани не-293 клетки при условия, при които клетките не се делят бързо, клетките могат да продуцират протеини за продължителен период от време. Например, ВНК клетки се развиват до сливане в клетъчни фактори, след което се подлагат на аденовирусно векторно кодиране на съответния секретиран протеин. Клетките след това израстват при свободни от серум условия, които позволяват на инфектирани клетки да се възстановят до няколко седмици без значително клетъчно делене. Алтернативно, аденовирусно векторно инфектирани 293S клетки могат да израстват в суспензионна култура при съответна висока клетъчна плътност до получаване на значими количества на протеин (Gamier et al., Cytotechnol. 15:145-55, 1994). По същия начин един експресиран, секретиран хетерологов протеин може да бъде повторно изолиран от клетъчно културалния супернатант. По правилата за инфектирана 293 S клетъчна продукция могат да бъдат ефективно получени не- секретирани протеини.
Добре установени животински модели са достъпни за изследване ин виво ефикасност на разтворими BR43x2, TACI или ВСМА полипептиди съгласно настоящото изобретение при познати болестни състояния. В частност, разтворими BR43x2, TACI или ВСМА полипептидни фрагменти могат да се изследват при ин виво при голям брой животински модели на автоимунни заболявания, като MRL-lpr или NZB х NZW F1 конгенни породи мишки, които служат като модел на SLE (системен еритроматозин лулус). Такива животински модели са известни в областта на техниката, например
Модели за автоимунни заболявания, Guidebook, Cohen and Miller eds. Academic Press. Резултат на кръстосване между новозеландски черни мишки (NZB) и новозеландски бели мишки (NZW) развиват спонтанна форма на SLE, която е много сходна на SLE при хора. Получените мишки, известни като NZBW, образуват IgM автоантитела срещу Т- клетки на възраст един месец и след 5-7 месечна възраст IgM анти-DNA автоантителата са доминантния антиглобулин. Поликлоналната В-клетъчна хиперактивност води до хиперпродукция на автоантитела. Премахването на тези авто-антитела, по-специално на тези, насочени срещу единично верижна DNA, е свързано с развитие на гломерулонефрит, който се проявява клинично като протеинурия, азотемия и смърт от бъбречна недостатъчност. Бъбречната недостатъчност е водеща причина за смъртта на мишките, засегнати от спонтанна SLE, и при NZBW породи този процес е хроничен и унищожителен. Болестта е по-бърза и силна при женски животни, отколкото при мъжки с продължителност на живот само 245 дни, в сравнение с 406 дни за мъжките животни. Докато много от женските животни са симптоматични (протеинурия) при 7-9 месечна възраст, при развиването на симптоми някои могат да бъдат много по-млади или постари. Фаталният имунен нефрит, наблюдаван при NZBW мишки, наподобява много гломерулонефрита, наблюдаван при човешка SLE, което прави този спонтанен муринов модел много подходящ за изследване на потенциални SLE терапевтични средства. (Putterman and Naparstek, Муринов модел на спонтанен системен еритроматозен лупус, модели за автоимунни заболявания: Guidebook, Chapter 14, рр. 217-34, 1994; Mohan et al., J.Immunol. 154:1470-80, 1995, and Daikh et al., J.Immunol. 159:3104-09, 1997). Прилагането на разтворим TACI -IG, BR43x2-Ig или BCMA-Ig или други разтворими протеини и смеси върху тези мишки за оценка на ефикасността на TACI, BR43x2 или ВСМА за подобряване на симптоми и изменения на курса на болестта, е описано подолу в примерната част.
Като инструмент за едновременно откриване на механизма на имунноповлияна болест и методи за потенциално терапевтични намеси се използват
модели на мишки за експериментален алергичен енцефаломиелит (ЕАЕ). Моделът наподобява човешка мултиплетна склероза и предизвиква демиелизация като резултат на Т-клетъчна активация към невропротеини, такива като миелин базов протеин (МВР) или протеолипиден протеин (PLP). Инокулация с антиген води до индукция на CD4+, клас II МНС-ограничени -Тклетки (Thl). Промени в реда за ЕАЕ могат да предизвикат остър, хроничен рецидив или пасивен транспортен вариант на модела (Weinberg et al., J. Immunol. 162:1818-26, 1999; Mijaba et al., Cell. Immunol. 186:94-102, 1999; Glabinski, Meth. Enzym. 288:182-90, 1997). Прилагането на разтворим TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig или други разтворими протеини или смеси към тези мишки за оценяване ефикасността на TACI, BR43x2 или ВСМА за подобряване на симптоми и изменения при курса на заболяването, е описано по-долу в примерната част.
В колаген-индуциран артритен (CIA) модел мишки развиват хроничен възпалителен артрит, който силно наподобява човешки възпалителен артрит (RA). Тъй като CIA има сходни имунологични и патофизиологични признаци с RA, това го прави идеален модел за скрининг потенциални човешки противовъзпалителни съединения. Друго предимство при използване на CIA модел е това, че механизмите на патогенеза са известни. Идентифицирани са Т- и В- клетъчните епитопи върху тип II колаген и са определени множество имунологични параметри (забавен тип хиперсензитивност и анти-колаген антитяло) и възпалителни (цитокини, хемокини и матрикс-деградиращи ензими), отнасящи се до имуно-медииращ артрит, които могат да бъдат използвани за оценка на ефикасността на тест съединение в моделите (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89:9784-788, 1992; Myers et al., Life Sci. 61:1861-78, and Wang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995). Прилагането на разтворими TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig или други разтворими протеини или смеси към тези мишки за оценяване ефикасността на BR43x2, TACI или ВСМА за подобряване на симптоми и изменения при курса на заболяването, е описано по- долу в примерната част.
Могат да бъдат създадени модели на бронхиална инфекция като астма, когато мишки са инфектирани с овалбумин и са ре-стимулирани назално с антиген, който продуцира астматичен отговор в бронхите, подобен на астма. Прилагането на разтворими TACI-Ig, BR43x2-Ig, BCMA-Ig или други разтворими протеини или смеси към тези мишки за оценяване ефикасността на BR43x2, TACI или ВСМА за подобряване на симптоми и изменения при курса на заболяването, е описано по-долу в примерната част.
Друга употреба за ин виво модели включва пренос на антигенпредизвикване към животното, последвано от прилагане на разтворим BR43x2 (TACI) или негов лиганд ztnf4 и измерване на Т и В клетъчен отговор.
Т клетъчно зависим и Т клетъчно независим имунен отговор може да бъде измерен както е описано от Perez-Melgosa et al., J. Immunol. 163:1123-7, 1999.
Имунен отговор при животни, подложени на постояна антигенна обработка (например, овалбумин или колаген), последвано от прилагане на BR43x2, TACI или ВСМА полипептиди или разтворими Ig-смеси може да бъде извършено за измерване на ефект върху клетъчен отговор.
Фармакокинетични изследвания могат да бъдат използвани във връзка с радиологично белязани, разтворими BR43x2, TACI или ВСМА полипептиди или смеси за определяне на разпространението и полу-живото на такива полипептиди ин виво. Допълнително животински модели могат да бъдат използвани за определяне на ефектите на разтворими BR43x2, TACI или ВСМА върху тумори и туморен растеж ин виво.
Предвижда се също така използване на BR43x2, TACI или ВСМА полипептиди като заместителни маркери за автоимунни заболявания, бъбречни заболявания, В и Т клетъчни заболявания. Такива пациенти могат да получават кръвотечения и BR43x2, TACI или ВСМА разтворими рецептори и техни лиганди могат да бъдат откривани в кръвта.
Изобретението предвижда също антитела. Антитела срещу BR43x2 или пептиди с амино киселинна последователност SEQ ID N0:8 могат да бъдат
получени например чрез използване като антиген на продукт на експресивен вектор, съдържащ желания полипептид или полипептид, изолиран от природен източник. По-специално използвани антитела свързани специфично с BR43x2 или пептиди с аминокиселинна последователност SEQ ID N0:10. Счита се, че антителата са специфично свързани, ако се свързват с BR43x2 полипептид или полипептида с SEQ ID N0:8, пептид или епитоп със свързващ афинитет (Ка) от 10 М' или повече, за предпочитане 10 М' или повече, подобре П^М’1 или повече и най-добре 109М-1 или повече. Свързващият афинитет на едно антитяло може да бъде лесно определен от специалист в областта, например чрез Scatchard анализ (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660, 1949). Подходящи антитела са антитела, които свързват с BR43x2, поспециално извънклетъчен домен на BR43x2 (аминокиселинни остатъци 1-120 на SEQ ID N0:2) и такива, които свързват с полипептиди с аминокиселинна последователност SEQ ID N0:10.
Анти- BR43x2 антитела могат да се получат посредством антигенни BR43x2 епитоп-носещи пептиди и полипептиди. Антигенни епитоп-носещи пептиди и полипептиди, съгласно настоящото изобретение, съдържат последователност от поне девет, за предпочитане между 15 и 30 аминокиселини, включени в последователност SEQ ID N0:2. Въпреки това, пептиди или полипептиди, съдържащи голяма част от аминокиселинна последавателност съгласно изобретението, съдържащи от 30 до 50 аминокиселини или каквато и да е дължина, и включващи пълна аминокиселинна последователност на полипептид, съгласно изобретението, също се използват за индуциране на антитела, които се свързват с BR43x2. Подходящо е аминокиселинната последователност да е избрана от епитопносещ пептид за осигуряване на специфична разтворимост във водни разтворители (например последователността да включва съответни хидрофилни остатъци, докато хидрофобните остатъци да се избягват). Хидрофилни пептиди могат да бъдат избрани от специалист в областта на техника от хидрофобен плот, например (Hopp and Woods (Proc. Nat. Acad. Sci.
USA 78:3824-8, 1981) and Kyte and Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 105-142, 1982). Освен това аминокиселинни последователности, съдържащи пролинови остатъци, могат да бъдат подходящи за продукция на антитела.
Поликлонални антитела за рекомбинантен BR43x2 протеин или за BR43x2, изолиран от природен източник, могат да бъдат получени чрез използване на методи, известни на специалисти в областта на техниката. Например Green et al., “Production of Polyclonal Antisera” in Immunochemical Protocols (Manson, ed), pages 1-5 (Humana Press 1992), and Williams et al., “Expression of foreign proteins in E.coli using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies” in DNA Cloning 2: Expression Systems. 2nd Edition, Glover et al., p.15 (Oxford University Press 1995). Имуногенността на BR43x2 полипептид може да бъде повишена чрез използване на адювант, като например алум (алуминиев хидроксид) или пълен или непълен адювант на Freund. Полипептиди, използвани за имунизация, са също смесени полипептиди и също така смеси на BR43x2 или части от тях с имуноглобулинов полипептид или малтоза свързващ протеин. Полипептиден имуноген може да бъде молекула с пълна дължина или част от нея. Ако полипептидната част е “Хаптеново-подобна”, такава част може за предпочитане да се присъедини или свърже към макромолекулен носител (такъв като ключово блюдо хемоциан (KLH), говежди серумен албумин (BSA) или тетанов токсин) за имунизация.
Въпреки че поликлонални антитела най-често се развиват в животни като коне, кучета, птици, плъхове, мишки, зайци, хамстери, гвинейски прасета, гъски и овце, aHTH-BR43x2 антитяло съгласно настоящото изобретение може да бъде получено също и от приматно антитяло. Общи техники за развиване на диагностично и терапевтично полезни антитела в бабуни може да бъде намерено например при Goldenberg et al., WO91/11465 and Losman et al., Int. J. Cancer 46:310, 1990. Антитела могат също да бъдат получени в трансгенни животни, като например трансгенни овце, крави, гъски или прасета и могат да бъдат експресирани в бирена мая и гъби в променени форми, както и в бозайникови и инсектни клетки.
Алтернативно могат да бъдат получени моноклонално анти-ВЯ43х2 антитела. Моноклонални тела на RODENT срещу специфични антигени могат да бъдат получени чрез методи, известни за специалистите в областта на техника, например (Kohler et al., Nature 256:495, 1975, Coligan et al., Current Protocols in Immunology, Vol.l pages 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons, 1991), Picksley et al., “Production of monoclonal antibodies againist proteins expressed in E.coli” in DNA Cloning 2: Expression Systems, 2nd Edition, Glover et al., page 93 (Oxford University Press 1995).
Най-общо казано, моноклонални антитела могат да бъдат получени чрез инжектиране на мишки със състав, съдържащ BR43x2 генен продукт, потвърждаване на наличието на антитяло продукция чрез отстраняване на серума, отстраняване на далака до получаване на В-лимфоцити, смесване на Влимфоцитите с миеломни клетки за продуциране на хибридоми, клониране на хибридоми, отделяне на положителни клони, които продуцират антитела срещу антигена, културиране на клони, които продуцират антитела срещу антигена и изолиране на антителата от хибридомните култури.
Освен това едно анти-ВК43х2 антитяло съгласно настоящото изобретение може да бъде получено от човешко моноклонално антитяло. Човешки моноклонални антитела се получават от трансгенни мишки, които са създадени да продуцират специфични човешки антитела в отговор на антигенно предизвикване. При този метод, елементи на човешко тежко и леко верижно месторазположение са включени в породи мишки, произхождащи от ембрионално видови клетъчни линии, които съдържат насочени разкъсвания на ендогенни тежко и леко верижни локации. Трансгенните мишки могат да синтезиран човешки антитела, специфични за човешки антигени, и мишките могат да се използват за продуциране на човешки антитяло-секретиращи хибридоми. Методи за получаване на човешки антитела от трансгенни мишки са описани у например от Green et al., Nat. Genet. 7:13, 1994, Lonberg et al., Nature 368:856, 1994 Taylor et al., Int. Immun. 6:579, 1994.
Моноклинални антитела могат да бъдат изолирани и пречистени от хибридомни култури чрез множество добре установени техники. Такива изолационни техники включват афинитетна хроматография с протеин-А сефароза, размер-изключваща хроматография и йонно-обменна хроматография, (виж например Coligan, pages 2.7.1-2.7.12 - 2.9.1-2.9.3; Baines et al., “Purification of Immunoglobulin G (IgG)“ в Методи в молекулярната биология, Vol. 10, р. 79-104 (The Humana Press, Inc. 1992).
В определени случаи може да се иска да се получат фрагменти на антиBR43x2 антитела. Такива антитяло фрагменти могат да бъдат получени например чрез протеолитична хидролиза на антитялото. Антитяло фрагменти могат да бъдат получени чрез пепсиново и папаиново разграждане на цели антитела по конвенционални методи. Като илюстрация, антитяло фрагменти могат да се получат чрез разцепване на антитела с пепсин до получаване на 5S фрагмент, означен като F(ab’)2. Този фрагмент може допълнително да бъде разцепен чрез тиолен редуциращ агент за получаване на 3.5S Fab’ моновалентни фрагменти. По желание, разцепващата реакция може да се извърши чрез блокираща група за сулфхидрилните групи, които се образуват от разцепването на дисулфидните връзки. Като алтернатива, ензимно разцепване чрез пепсин води пряко до два моновалентни Fab фрагмента и един Fc фрагмент. Тези методи са описани например от Goldenberg, US 4,331,647, Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960, Porter, Biochem. J. 73:119, 1959, Edelman et al., in Methods in Enzymology Vol. 1, p.422 (Academic Press 1967) and Coligan.
Могат да бъдат използвани и други методи на разцепване на антитела, такива като сепарация на тежки вериги до образуване на моновалентни лекотежко верижни фрагменти, допълнително разцепване на фрагментите или други ензимни, химични или генетични техники, доколкото фрагментите се j | свързват към антитялото, което е признато от цялото антитяло.
I
S ц
Μ
I
Например Fv фрагменти съдържат асоциация от VH и VL вериги. Тази асоциация може да бъде не-ковалентно, както е описано от Inbar et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 69:2559, 1972. Алтернативно, различните вериги могат да бъдат свързани чрез вътрешно молекулна дисулфидна връзка или кръстосано свързани чрез химикали, например глутералдехид (виж например Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992).
Fv фрагментите могат да съдържат VH и VL вериги, които са съединении с пептидно свързващо тяло. Тези единично-верижни антиген-свързващи протеини (scFv) са получени чрез създаване на структурен ген, съдържащ DNA последователност, кодиращи VH и VL домени, които са свързани чрез олигонуклеотид. Структурният ген е вместен в експресионен вектор, който е последователно представен в гостоприемникова клетка, като например E.coli. Рекомбинантните гостоприемникови клетки синтезират единична полипептидна верига със свързващ пептид, свързващ мостовидно двата V домена. Методи за получаване на scFv са описани например от Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97, 1991, Bird et al., Science 242:423, 1988, Ladner et al., US 4,946,778, Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993,Sandhu.
Като илюстрация един scFv може да бъде получен чрез въздействие на лимфоцити върху BR43x2 полипептид ин витро и селектиране на антитяло заместващи колекции във фагови или подобни вектори (например чрез използване на имобилизиран или белязан BR43x2 протеин или пептид). Гени, кодиращи полипептиди с потенциално BR43x2 пептидно свързващи домени могат да бъдат получени чрез скрининг на произволни пептидни колекции, преместени върху фаг (ф^гово заместване) или върху бактерия, като E.coli. Нуклеотидни последователности, кодиращи полипептидите, могат да бъдат получени по много начини, като например чрез произволна мутагенеза и произволна полинуклеотидна синтеза. Тези произволни пептидни заместени колекции могат да бъдат използвани за изследване на пептиди, които взаимодействат с известни цели, които могат да бъдат протеин или полипептид, като например лиганд или рецептор, биологична или синтетична молекула, органична или неорганична субстанция. Техники за създаване и скрининг на такива произволни пептидни колекции са известни от нивото на техниката (Ladner et al., US 5,223,409, Ladner et al., US 4,946,778, Ladner et al., US 5,403,484, Ladner et al., US 5,571,698 and Kay et al., Phage Display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)) и произволни пептидни обясняващи колекции и кит за скрининг на такива колекции са търговско достъпни, например от Clontech (Palo Alto, СА), Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) and Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ). Произволни пептидни колекции могат да бъдат изследвани чрез BR43x2 последователностите, разкрити тук, за идентифициране на протеини, които се свързват към BR43x2.
Друга форма на антитяло фрагмент е пептидно кодиране за единично комплементарно-определящ регион (CDR). CDR пептиди (“минимално разпознати части”) могат да бъдат получени чрез създаване на гени, кодиращи CDR на антитялото, представляващо интерес. Такива гени са получени например чрез използване на полимеразна верижна реакция за синтезиране на различни региони от RNA на антитяло, продуциращи клетки (Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:106, 1991), Courtenay-Luck, “Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies”, in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application, Ritter et al., p. 166 (Cambridge University Press 1995), and Ward et al. “Genetic Manipulation and Expression of Antibodies” in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Birch et al., p.137 (Wiley-Liss, Inc. 1995).
Алтернативно, едно aHTH-BR43x2 антитяло може да бъде извлечено от “хуманизирано” моноклонално антитяло. Хуманизирани моноклонални антитела се получават чрез трансфериращи мишки, комплементарно определени региони от тежки и леки изменчиви вериги на миши имуноглобулин в човешки изменчив домен. След това типични остатъци от човешки антитела се заместват в рамкирани региони на муринови двойници.
Използването на антитяло компоненти, произхождащи от хуманизирани моноклонални антитела, спомага за избягване на потенциални проблеми, свързани с имуногенността на муринови константни региони. Общи техники за клонирано муринови имуноглобулин- изменчиви домени са описани например от Orlandi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:3833, 1989. Техники за получаване на хуманизирани моноклонални антитела са описани например от Jones et al., Nature 321:522, 1986, Carter et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:4285,
1992, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992, Singer et al., J. Immun. 150:2844,
1993, Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press. Inc. 1995), Kelley “Engineering Therapeutic Antibodies” in Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland et al., p. 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) и Queen et al., US 5,693,762 (1997).
Поликлонални анти-идиотип антитела могат да се получат чрез имунизиране на животни с aHTH-BR43x2 антитела или антитяло фрагменти по стандартни техники. Например при Green et al., “Production of Polyclonal Antisera, в Methods in Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), pages 1-12 (Humana Press 1992). Също и при Coligan, p. 2.4.1-2.4.7. Алтернативно, моноклинални анти-идиотип антитела могат да бъдат получени чрез aHTH-BR43x2 антитела или антитяло фрагменти като имуногени по начините, описани по-горе. Като друга алтернатива, хуманизирани антиидиотип антитела или приматни анти-идиотип антитела могат да бъдат получени чрез по-горе описаните техники. Методи за получаване на антиидиотип антитела са описани например от Irie в US 5,208,146, Greene et al., US 5,637,677 и Varthakavi and Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875, 1996.
Антитела или полипептиди могат също да бъдат директно или индиректно включени в лекарствени средства, токсини, радионуклиди и други, и тези конюгати да бъдат използвани за ин виво диагностика или терапевтични приложения. Например полипептиди или антитела съгласно настоящото изобретение могат да бъдат използвани за идентифициране или третиране на тъкани или органи, които експресират съответстваща анти-комплементарна
молекула (съответно рецептор или антиген). По-специално BR43x2 полипептиди или aHTH-BR43x2 антитела или биоактивни фрагменти или части от тях могат да бъдат куплирани до откриваеми или цитотоксични молекули и пренесени към бозайникови клетки, тъкани или органи, които експресират анти-комплементарни молекули.
Подходящи откриваеми молекули могат да бъдат директно или индиректно прикрепени към полипептида или антитялото и включват радионуклиди, ензими, субстрати, ко-фактори, инхибитори, флуоресцентни маркери, хемилуминисцентни маркери, магнитни частици и други подобни. Подходящи цитотоксични молекули могат директно или индиректно да бъдат прикрепени към полипептид или антитяло и включват бактериални или растителни токсини (например дифтериен токсин, Pseudomonas екзотоксин, рицин, абрин и др.) както и терапевтични радионуклиди, като йод-131, рений 188 или итрий-90 (или директно прикрепен към полипептид или антитяло, или индиректно прикрепен чрез хелиращо образувание). Полипептиди или антитела могат също да бъдат включени в цитотоксични лекарствени средства, като адриамицин. За индиректно прикрепване на откриваема или цитотоксична молекула, тя може да бъде включена в член на комплементарно/ антикомплементарна двойка, като другият член е свързан към полипептида или частта-антитялото. Примерна комплементарно/антикомплементарна двойка за тези цели е биотин/стрептавидин.
Разтворими BR43x2 полипептиди или антитела към BR43x2 могат да бъдат директно или индиректно конюгирани към лекарства, токсини, радионуклиди и други, и тези конюгати могат да бъдат използвани за ин виво диагностика или терапевтична употреба. Например полипептиди или антитела съгласно настоящото изобретение могат да бъдат използвани за идентифициране или третиране на тъкани или органи, които експресират съответстваща анти- комплементарна молекула (съответно, рецептор или антиген). По-специално, BR43x2 полипептиди или aHTH-BR43x2 антитела или биоактивни фрагменти или техни части могат да се съединяват към откриваеми или цитотоксични молекули и да се пренасят към бозайникови
клетки, тъкани или органи, които експресират анти-комплементарната молекула.
Подходящи откриваеми молекули могат да бъдат директно или индиректно прикрепени към полипептид или антитяло и включват радионуклиди, ензими, субстрати, ко-фактори, инхибитори, флуоресцентни маркери, хемилуминисцентни маркери, магнитни частици и други подобни. Подходящи цитотоксични молекули могат да бъдат директно или индиректно прикрепени към полипептид или антитяло и включват бактериални или растителни токсини (например дифтериен токсин, Pseudomonas екзотоксин, рицин, абрин и др.), както и терапевтични радионуклиди, като йод-131, рений -188 или итрий-90 (или директно прикрепен към полипептид или антитяло, или индиректно прикрепен чрез хелиращо образувание). Полипептиди или антитела могат също да бъдат конюгирани към цитотоксични лекарствени средства, като адриамицин. За индиректно прикрепване на откриваема или цитотоксична молекула, тя може да бъде включена в член на комплементарно/ антикомплементарна двойка, като другият член е свързан към полипептида или частта-антитяло. Примерна комплементарно/ антикомплементарна двойка за тези цели е биотин/ стрептавидин.
Такива полипептидни-токсични смесени протеини или антитела/ фрагмент-токсин смесени протеини могат да бъдат използвани за целево клетъчно или тъканно инихибиране или отстраняване (например при лечение на ту морни клетки или тъкани). Алтернативно, ако полипептидът има множество функционални домена (например активиран домен или лиганд свързан домен плюс целеви домен), един смесен протеин, включващ само целеви домен, може да бъди подходящ за насочване на откриваема молекула, цитотоксична молекула или комплементарна молекула към определен тип клетка или тъкан. В примерите, където доменът - смесен протеин включва комплементарна молекула, анти-комплементарната молекула може да бъде конюгирана до откриваема или цитотоксична молекула. Такава домен-
комплементарна молекула смесени протеини представлява генеричен целеви носител за клетъчно/тъканно-специфичен пренос на генетична антикомплементарно-откриваема/цитотоксично молекулени конюгати. Биоактивните полипептидно или антитяло конюгати, описани тук, могат да се пренасят интравенозно, интраартериално или интрадуктално или могат да бъдат въведени локално на желаното место или разположение.
Антителата могат да бъдат превърнати в разтворими BR43x2 полипептиди, които са His или FLAG® тагирани. Антитела могат също да бъдат получени от E.coli, продуцирани МВР-смесени протеини. Алтернативно такива полипептиди могат да включват смесен протеин в човешки Ig. Поспециално, антисерум, съдържащ полипептидни антитела срещу His-тагов или FLAG-тагов разтворим BR43x2, може да бъде използван при анализ на тъканно пренасяне на BR43x2 чрез имуно-хистохимия върху човешка или приматна тъкан. Тези разтворими BR43x2 полипептиди могат също да бъдат използвани за имунизация на мишки, за да продуцират моноклонални тела към разтворим човешки BR43x2 полипептид. Моноклонални антитела срещу разтворим човешки BR43x2 полипептид могат да бъдат използвани към симулирано лиганд/рецептор свързване, водещо до активация или инактивация на лиганд/рецептор двойка. Например, показано е, че кръстосаносвързани анти-разтворими CD40 моноклонални антитела осигуряват стимулаторен сигнал към В клетки, които са суб-оптимално активирани с анти-IgM или LPS и води до пролиферация и имуноглобулинова продукция. Тези моноклонални антитела действат като антагонисти, когато се използват в разтвор чрез блокираща активация на рецептора. Моноклонални антитела срещу BR43x2 могат да бъдат използвани за определяне на разпространението, регулирането и биологичното взаимодействие на BR43x2/BR43x2-nHraua двойка върху специфични клетъчни линии, идентифицирани чрез изследване на тъканното разпределение.
Изобретението също се отнася до изолирани и пречистени BR43x2, TACI или ВСМА полинуклеотидни проби или праймери. Такива полинуклеотидни проби могат да бъдат RNA или DNA. DNA може да бъде също cDNA или геномна DNA. Полинуклеотидни проби са единични или двойно-верижни RNA или DNA, най-общо синтетични олигонуклеотиди, но
могат да се получат от клонирана cDNA или геномни последователности и най-общо съдържат поне 16 нуклеотида, по-често от 17 до 25 и повече нуклеотида, понякога от 40 до 60 нуклеотида, и в някои случаи от 40 до 60 нуклеотида, и в някои примери една специфична част, домен или дори пълен BR43x2 ген или cDNA. Проби и праймери са най-общо синтетични олигонуклеотиди, но могат да произхождат и от клонирана cDNA или геномни последователности или техни комплементи. Аналитични проби ще бъдат найобщо поне 20 нуклеотиди в дължина, въпреки това могат да бъдат използвани и по-къси проби (14-17 нуклеотида). PCR праймери са с дължина поне 5 нуклеотида, за предпочитане 15 или повече, още по-добре 20-30 нуклеотида. Късите нуклеотиди могат да бъдат използвани, когато малък регион на гена е насочен за анализ. За обширен анализ на гени, полинуклеотидна проба може да съдържа пълен ексон или повече. Проби могат да бъдат маркирани да осигуряват откриваем сигнал като ензим, биотин, радионуклид, флуорофор, хемилуминисцер, пара-магнитна частица и други подобни, които са търговско достъпни от много източници, като например Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, and Amersham Corp., Arlington Heights, IL чрез използване на техники, които са добре известни в областта на техниката. Препоръчителни региони, от които могат да бъдат създадени проби, са лиганд-свързващият регион, цистеин псевдо-отговори, сигнални последователности и други. Техники за усъвършенствани полипептидни проби и хибридизиционни методи са известни в областта, например: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1991.
BR43x2, TACI и BCMA полипептиди и антитела могат да бъдат използвани в диагностични системи за откриване на наличието на BR43x2, TACI или ВСМА и BR43x2, TACI или ВСМА лиганд полипептиди, такива като ztnf4. Информацията, получена от такива методи за детекция, би
осигурила яснота за значението на BR43x2 полипептиди при различни заболявания и също би ги наложила като диагностични инструменти за заболявания, за които са от значение променените нива на BR43x2. Променените нива на BR43x2, TACI или ВСМА рецептор полипептиди могат да бъдат индикатор за патофизиологични състояния като тумор, автоимонни разстройства и инфекциозни заболявания.
При едно основно изследване, единична странична пробна молекула се инкубира с RNA, изолирана от биологичен материал, при температура и йонна сила, които усилват базовото групиране между пробата и целеви BR43x2, TACI или ВСМА RNA видове. След отделяне на несвързана проба от хибридизирани молекули, се открива количеството хибриди.
Добре разработени хибридизационни методи на RNA откриване са Northern анализи и дот/слот блот хибридизация (Ausubel and Wu et al., “Analysis of Gene Expression at the RNA Level”, in Methods in Gene Biotechnology, p. 225-239 (CRC Press, Inc. 1997)). Нуклеотидно киселинни проби могат също да бъдат открити, когато са белязани с радиоизотопи, като Р или S . Алтернативно, BR43x2 RNA могат да бъдат открити с нерадиоакативен хибридизационен метод (Isaac, Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Humana Press, Inc., 1993). Най-често нерадиоактивно откриване се постига чрез ензимна конверсия на хромогенни или хемилуминисцентни субстрати. Илюстративно не-радиоактивни общности са биотин, флуоресцеин и дигоксигенин.
BR43x2, TACI или ВСМА олигонуклеотидни проби също се използват за ин виво диагностика. Като илюстрация, 18Е-белязани олигонуклеотиди могат да се прилагат към даден обект и да се визуализират чрез позитронова емисионна томография (Tavitian et al., Nature Medicine 4:467, 1998).
Голям брой диагностични процедури дават преимущество на полимеразната верижна реакция (PCR) за повишаване на чувствителността на метода за откриване. Стандартните техники за извършване на PCR са добре известни (Mathew, Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc.
1991), White, PCR Protocols: Current Methods and Applictions (Humana Press, Inc. 1993), Cotter, Molecular Diagnosis of Cancer (Humana Press Inc. 1996), Hanausek and Walaszek, Tumor Marker Protocols (Humana Press Inc. 1998), Lo, Clinical Applications of PCR (Humana Press Inc. 1998) и Meltzer, PCR in Bioanalysis (Humana Press Inc. 1998). PCR праймери могат да бъдат създадени да усилват една последователност кодираща определен BR43x2 домен или мотив, като BR43x2, TACI или ВСМА цистеин богат псевдо-отговор.
Един вариант на PCR за диагностичен анализ е обратна транскриптазаPCR (RT-PCR). При RT-PCR техниката, RNA е изолирана от биологичен материал, обратно транскрибиран към cDNA, a cDNA е инкубирана с BR43x2 праймери (виж например Wu et al., “Rapid Isolation of Specific cDNA or Genes by PCR”, in Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc.p. 15-28, 1997). След това се извършва PCR и продуктите се анализират чрез стандартни методи.
Като една илюстрация, RNA е изолирана от биологичен материал като се използва например гуанидин тиоцианатно клетъчна лизисната процедура, описана по горе. Алтернативно, за изолиране на mRNA от клетъчен лизат може да бъде използвана твърдо-фазова техника. Една обратнотранскрипционна реакция може да бъде инициирана с изолираната RNA чрез произволни олигонуклеотиди, къси хомополимери на dT или BR43x2, TACI или ВСМА анти-чувствителни олигомери. Олиго-dT праймери предлагат преимуществото, че различни mRNA нуклеотидни последователности са усилени и може да се получат контролирани целеви последователности. BR43x2, TACI или ВСМА последователности са подсилени чрез полимеразната верижна реакция, като са използвани два странични олигопептидни праймери, които обикновено са поне 5 бази дълги.
PCR подсилени продукти могат да бъдат открити по много начини. Например, PCR продукти могат да бъдат фракционирани чрез гел електрофореза и визуализирани чрез етидиево бромидно белязване. Алтернативно, фракционирани PCR продукти могат да бъдат трансферирани към мембрана, хибридизирана с откриваемо-белязана BR43x2 проба и изследвани чрез авторадиография. Допълнителни алтернативни начини са използването на дигоксигенин-белязани дезоксирибонуклеиново киселинни трифосфати до осигуряване на хемилуминисцентно откриване и C-TRAK
колориметричен метод.
Друг начин е количествена PCR в реално време (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Ct.). Флуорогенна проба, съдържаща един олигонуклеотид с два закрепени репортерен и потушаващ участък, се закалява специфично между предния и обратния праймер. Чрез използване на 5’ ендонуклеазната активност на Tag DNA полимераза се отделя репортерният участък от потушаващия участък и се получава последователно-специфичен сигнал и се усилва като нарастващо увеличение. Флуоресцентният интензитет може да бъде продължително наблюдаван и измерван чрез PCR реакция.
Друг начин за откриване на BR43x2, TACI или ВСМА експресия е цикличната пробна технология (СРТ), в която единично-странична DNA цел се свързва с излишък на DNA-RNA-DNA имагинерна проба до получаване на комплекс, като RNA-частта се разцепва с рибонуклеаза Н и се открива присъствието на имагинерната разцепена проба (виж например Beggs et al., J. Clin. Microbiol. 34:2985, 1996 and Bekkaoui et al., Biotechniques 20:240, 1996). Алтернативни методи за откриване на BR43x2, TACI или ВСМА последователности могат да използват подходи като например нуклеино киселинна последователно-базирана амплификация (NASBA), кооперативна амплификация на шаблони чрез кръстосана хибридизация (CATCH) и лигазноверижна реакция (LCR) (виж например Marshall et al., US Patent 5,686,272 (1972), Dyer et al., J.Virol. Methods 60:161, 1996; Ehricht et al., Eur. J. Biochem. 243:358, 1997 and Chadwick et al., J. Virol. Methods 70:59, 1998). Ha специалистите от тази област на техниката са известни и други стандартни методи.
BR43x2, TACI или ВСМА проби и праймери също могат да бъдат използвани за откриване и локализиране на BR43x2, TACI или ВСМА генна експресия в тъканни примери. Методи за такава in situ хибридизация са добре известни за специалистите в областта на техниката (виж например Choo, In Situ Hybridization Protocols, Humana Press, Inc., 1994; Wu et al., “Analysis of Cellular DNA or Abudance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization (RISH)” in Metods in Gene Biotchnology, CRC Press, Inc., p. 259-278, 1997 and Wu et al., “Localization of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH)” in Metods in Gene Biotchnology, CRC Press, Inc., p. 279289,1997).
За специалистите в тази област на техниката са известни множество допълнителни методи за диагностика (например Mathew, Protocols in Human Molecular Genetics, Humana Press, Inc., 1991; Coleman and Tsongalis, Molecular Diagnostics, Humana Press, Inc. 1996 and Elies, Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press, Inc. 1996).
Освен това такива полипептидни проби могат да се използват за хибридизиране на двойникови последователности върху индивидуални
хромозоми. Хромозомна идентификация и/или BR43x2 генна карта може да осигури информация относно генната функция и връзката със заболяването. Много такива техники са достъпни за специалиста в областта, например карта за соматични клетъчни хибриди и флуоресценция по време на хибридизация in situ (FISH). Препоръчителен метод е радиационната хибридна карта. Радиационна хибридна карта е соматично клетъчна генетична техника, развита за създаване на съседни карти на бозайникови хромозоми с високо разрешение (Cox et al., Science 250:245-50, 1990). Частична или пълна информация за генна последователност позволява създаването на PRC праймери, подходящи за използване с хромозомни радиационно-хибридни картографски панели. Търговско достъпни радиационно хибридни картографски панели, които покриват целия геном, са например Stanford G3RH panel and GeneBrige 4 RH Panel (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). Тези панели позволяват бързи, PRC базирани, хромозомни локализации и насочване на гени, последователно тагирани места (STSs) и други не-полиморфни и полиморфни маркери в желания регион. Този метод включва установяване на директно пропорционални физически разстояния между новооткрити гени и по-рано картографирани маркери. Точната информация за позицията на гена може да бъде използвана по много начини: 1/ определяне дали последователността е част от съществуващ приближен и получаване на допълнителни обкръжаващи генетични последователности в различни форми, като например YAC-, ВАСили cDNA клонове; 2/ осигуряване на възможен кандидат ген за наследствено заболяване, който показва връзка към същия хромозомен регион; и 3/ за кръстосано- рефериращ модел организъм, като мишка, която може да бъде подходяща за определяне каква функция може да има частният ген.
Хромозомната локализация също може да бъде проведена чрез използване на STS. Един STS е DNA последователност, която е уникална в човешкия геном и може да бъде използвана като отправна точка за специфичен хромозом или регион на хромозома. Един STS може да бъде определен чрез двойка олигонуклеотидни праймери, които могат да се използват в полимеразно-верижна реакция за специфично определяне на това място при наличие на всички други геномни последователности. Докато STSs са базирани само върху DNA последователност, те могат да бъдат напълно описани в база данни, например Database of Sequence Tagged Sites (dbSTS), GenBank, (National Center for Biological Information, National Institutes of Health, Bethesda, MD http://www.ncbi.nlm.nih.gov, които могат да бъдат ползвани за търсене на генна последователност за данните на картата, която съдържа тези кратки геномно означени STS последователности.
Настоящото изобретение също осигурява реагенти за допълнителни диагностични подходи. Например, BR43x2 ген, проба, съдържаща BR43x2 DNA или RNA или тяхна последователност, могат да бъдат използвани за определяне дали BR43x2 генът присъства върху конкретна хромозома или дали се е получила мутация. Откриваеми хромозомни аберации при BR43x2 генното местоположение включват, без да се ограничават до тях, анеплоид, брой промени на генно копие, вмъквания, отстранявания, ограничаване на сайтови промени и подреждания. Тези отклонения от нормата могат да се ма
наблюдават в кодиращата последователност, в интроните или в страничните последователности, включващи обратен промотер и регулаторни региони и могат да бъдат проявени като физични изменения в кодираща последователност или промени на ген експресивно ниво.
Най-общо, тези диагностични методи включват следните етапи: а/ получаване на генетична проба от пациент; б/ инкубация на генетичната проба с полинуклеотидна проба или праймер, както е описано по-горе, при условия, при които полинуклеотидът ще се хибридизира към комплементарно полинуклеотидна последователност, за да продуцира първо реакционен продукт; и в/ сравнение на първо реакционния продукт с контролен реакционен продукт. Една разлика между първия продукт и контролния продукт е индикация за генетично несъответствие в пациента. Генетичен пример за използване в настоящото изобретение са геномни DNA, cDNA и RNA. Полинуклеотидната проба или праймер може да бъде RNA или DNA и ще съдръжа част от SEQ ID N0:3, комплемент от SEQ ID N0:1 или RNA техен еквивалент. Подходящи методи за изследване в този смисъл са молекулярни генетични методи, известни в областта на техниката, като рестрикционно фрагментарен дължинен полиморфичен анализ (RFLP), кратък тандемен отговор (STR)-aнaлиз, използващ PCR техники, свързано-верижна реакция (Barany, PCR Methods and Applications 1:5-16, 1991), рибонуклеазно протекционно изследване и други генетично-свързани методи, известни в областта на техниката (Sambrook et al., Ausubel et al., Ausubel et al.,Marian, Chest 108:225-65, 1995). Рибонуклеазно протекционно изследване (виж например Ausubel et al.) включва хибридизация на RNA проба, след което реакционният продукт (RNA-RNA хибрид) е подложен на действието на рибонуклеаза. Хибридизирани региони на RNA са защитени от разграждане. В PCR изследвания, генетичен пример от пациент се инкубира в двойка полинуклеотидни праймери и регионът между праймерите се разширява и възстановява. Промени в размера или количеството на възстановен продукт са показатели за мутации в пациента. Друг метод, основан на PCR, който може да ί
бъде използван, е единично страничен структурен полиморфичен (SSCP) анализ (Hayashi, PCR Methods and Applications 1:34-8, 1991).
За инхибиране на BR43x2, TACI или ВСМА генна транскрипция, като например при инхибирано В-клетъчно развитие и взаимодействие с други клетки може да бъде използвана антисензитивна методология. Полинуклеотиди, които са комплементарни към сегмент на BR43x2, TACI или ВСМА-кодиращи полинуклеотиди, например полинуклеотид, посочен в SEQ ID N0:3, са създадени да се свързват към BR43x2, TACI или ВСМА-кодираща mRNA и да инхибират транслация на такава mRNA. Такива антисензивни q полинуклеотиди се използват за инхибиране на експресия на BR43x2, TACI или ВСМА полинуклеотид-кодиращи гени в клетъчна култура или в обект.
Могат да бъдат създадени мишки, които да експресират BR43x2, TACI или ВСМА, обозначени тук като “трансгенни мишки”, и мишки, които проявяват пълна липса на BR43x2, TACI или ВСМА функция, обозначени като : “ударни мишки” (Snouwaert et al,. Science 257:1083, 1992; Lowell et al., Nature
366:740-42, 1993; Capecchi, Science 244:1288-92, 1989; Palmiter et al. Annu. Rev. Genet. 20:465-99, 1986). Например трансгенни мишки, които пре-експресират BR43x2, TACI или ВСМА, или повсеместно или при тъканно-специфичен или тъканно-рестриктивен промотер, могат да бъдат използвани, за да се разбере дали пре-експресията води до фенотип. Например, пре-експресия на див-тип BR43x2, TACI или ВСМА полипептид, полипептиден фрагмент или техен мутант може да промени нормално клетъчно функциониране, водещо до ί j фенотип, който определя тъкан, в която BR43x2, TACI или ВСМА експресия е функционално релевантна и може да покаже терапевтична цел за BR43x2, j TACI или ВСМА или техни агонисти или антагонисти. Например, предпочитана трансгенна мишка за извършване на генна инженерия е такава, която пре-експресира разтворим BR43x2, TACI или ВСМА. Освен това, такава пре-експресия може да предизвиква получаване на фенотип, който показва j j сходство с човешки заболявания. Аналогично, “ударни” BR43x2, TACI или j
ί ВСМА мишки могат да бъдат използвани, когато BR43x2 е абсолютно j
I
необходим ин виво. Фенотипът на “ударни мишки” е предсказание за ин виво ефектите, които може да има BR43x2, TACI или ВСМА антагонист като тези, описани. Човешка BR43x2, TACI или ВСМА cDNA може да бъде използвана за изолиране на муринова BR43x2, TACI или ВСМА mRNA, cDNA и геномна DNA, които са последователно използвани за създаване на ударни мишки. Тези мишки могта да бъдат използвани за изучаване на BR43x2, TACI или ВСМА гена и протеинът, кодиран чрез тях в ин виво система, и могат да бъдат използвани в ин виво модели за съответстващи човешки заболявания. Освен това, трансгенна експресия на BR43x2, TACI или ВСМА антисензивни полинуклеотиди или рибозоми, насочени срещу BR43x2, TACI или ВСМА, описани тук, могат да бъдат използвани аналогично към описаните трансгенни мишки.
Фармацевтично ефективни количества на BR43x2, TACI или ВСМА полипептиди, съгласно настоящото изобретение могат да бъдат включени с фармацевтично приемливи носители за парантерална, орална, назална, ректална, външна, трансдермална употреба или други подобни по конвенционални методи. Фармацевтичните форми могат допълнително да включват едно или повече разредители, пълнители, емулгатори, консерванти, буфери, ексципиенти и други, и могат да са под формата на течности, прахове, емулсии, супозитории, липозоми, трансдермални пластири и например, таблетки. Преносни системи с бавно или с продължително освобождаване, включващи всеки от големия брой биополимерни (биологично-базирани системи) системи, използващи липозоми и полимерно преносни системи, могат също да бъдат използвани със състави, описани тук, за да осигурйт непрекъснат или продължителен източник на BR43x2 полипептид или антагонист. Такива системи за бавно освобождаване са приложими за лекарствени форми, например за орално, външно и парантерално приложение. Терминът “фармацевтично приложим носител” означава носител на среда, която не нарушава ефикасността на биологичната активност на активните инградиенти, и която не е токсична към гостоприемника или пациента. Един специалист в областта на техниката може да формулира съединенията, съгласно настоящото изобретение по подходящ начин и в съгласие с приети практики, като тези, разкрити от Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, Mack Publishing Co., Easton PA., 19th ed., 1995.
Както е използвано тук “фармацевтично ефективно количество” от BR43x2, TACI или ВСМА полипептид, агонист или антагонист е количество,
достатъчно да предизвика желания биологичен резултат. Резултатът може да бъде намаляване на следи, симптоми или предизвикване на заболяване, или други желани промени на биологична система. Например, ефективно количество от BR43x2, TACI или ВСМА полипептид е това, което осигурява същото субективно облекчение на симптоми или обективно установимо подобрение, което е отбелязано чрез клинично или друго квалифицирано наблюдение. Например, като ефективно количество от BR43x2, TACI или ВСМА полипептид или разтворима смес могат да осигурят понижение в Вклетъчен отговор по време на имунен отговор, инхибиция или понижение в антитяло продукция, инхибиция на намалението на симптоми, свързани с SLE, MG или RA. Ефективни количества на BR43x2, TACI или ВСМА ще понижат процента на В-клетки в периферната кръв. Ефективни количества от BR43x2, TACI или ВСМА полипептиди могат да варират значително в зависимост от заболяването или симптома за лечение. Количеството на полипептида за прилагане и неговата концентрация във фармацевтичната форма зависят от избрания носител, пътя на прилагане, силата на конкретния полипептид, клиничното състояние на пациента, страничните ефекти и стабилността на съединението във формата. По този начин клиницистът може да използва подходящ препарат, съдържащ подходяща концентрация във формата, както и количеството на прилаганата форма, зависещо от клиничния опит с дадения пациент или с други пациенти. Тези количества зависят в частност от конкретните условия на лечение, възраст, тегло и общо здравословно състояние на пациента, както и други фактори, очевидни за специалистта в областта. Най- често дозата е бъде в границата от 0.1 до 100mg/kg на обекта.
Дози за специфични съединения могат да бъдат определени от ин витро или ин виво изследвания в комбинация с изследвания върху експериментални животни. Концентрации на съединения, за които е установено, че са ефективни при ин витро или ин виво, могат да бъдат ръководство за животински изследвания, при които дозите се изчисляват, за да се получат подобни концентрации на мястото на действие.
По-нататък изобретението е илюстрирано чрез следващите примери, с които не се ограничава неговият обхват.
ПРИМЕРИ
ПРИМЕР 1
Откриване на BR43x2
TACI изоформата е клонирана от RPMI създадена колекция чрез секретиран трап подход. RPMI 1788 (активирана В-клетъчна линия) колекция е създадена чрез използване на 96-гнездни поставки. Всяка клетка съдържа около 100 E.coli колонии, всяка от които съдържа един cDNA клон. DNA представители се получават в 96-гнездна форма, чрез TomTech Quadra 9600. Изолираната DNA след това се поставя в 120 фонда, всеки от които представя 1600 клона. Тези фондове се трансфектират в Cos-7 клетки и се поставят в 12 гнездни поставки. Три микролитъра от DNA фонда и 5 μΐ LipofectAMINE се смесват в 92 μΐ свободна от серум DMEM среда (55 mg натриев пируват, 146mg L-глутамин, 5mg трансферни, 2.5mg инсулин, 1 mg селен и 5 mg фетуин в 500ml DMEM), инкубирана при стайна температура за 30 минути, след което се добавя 400 μΐ свободна от серум DMEM среда. DNA - LipofectAMINE смес се добавя към 220,000 Cos-7 клетки/ гнездна поставка върху 12-гнездни клетъчни културални поставки и се инкубира за 5 часа при 37°С. След инкубация, 500μ1 от 20% FBS DMEM (100 ml FBS, 55 mg натриев пируват, 146mg L-глутамин в 500ml DMEM) се добавят към всяко гнездо и клетките се инкубират за една нощ.
Секретиран трапов екран се представя чрез биотинилиран, FLAG тагово ztnf4. Клетките се промиват с PBS и се фиксират за 15 минути с 1.8% формалдехид в PBS. След това клетките се промиват с TNT (0.1 М трис-НС1, 0.15 М NaCl и 0.05% Твин-20 във Н2О). Клетки проникват в 0.1% Тритон-Х в PBS за 15 минути, последвано от промиване с TNT. Клетките се блокират за един час с TNB (0.1 М Трис-НС1, 0.15 М NaCl и 0.5% блокиращ реагент) посредством NEN Renaissance® TSA-Direct Kit (Nen, Boston, МА) съгласно инструкциите на производителя. Клетките се промиват с TNT и се блокират за 15 минути с авидин и след това биотин (Vector Labs Cat# SP-2001), промиващ в/между с TNT. Клетките се инкубират за един час с lpg/ml ztnf4/Flag/Biotin в TNB, последвано от TNT промиване. След това клетките се инкубират за един час със стрептавидин - HRP (NEN) с 1:300 разреждане в TNB и след това се промиват cTNT. Откриват се хибридизации с флуоресцин тирамиден реагент, разреден 1:50 в разреден буфер (NEN), инкубира се за 4.4 минути и се промива с TNT. Клетките се консервират с Vectashield Mounting среда (Vector Labs, Burlingame, СА) разредена 1:5 в TNT.
Клетките се визуализират чрез флуоресцентна микроскопия чрез FITC филтър. Дванадесет фонда са позитивни за ztnf4 свързване. Фонд D8, представляващ 1600 клона, се прекъсва долу и се изолира единичен клон D8-1, положителен за ztnf4 свързване. Последващи анализи откриват клон D8-1 със съдържание на полипептидна последователност, която кодира изоформа на TACI, в която Phe21-Arg67 първо цистеиново псевдо-повторение на TACI се замества от единичен аминокиселинен остатък, триптофан. Тази изоформа е обозначена BR43x2, полинуклеотидната последователност на която присъства в SEQ ID N0:1.
ПРИМЕР 2
Локализация на BR43xl в лимфоцити и моноцити
Обратно транскриптазна PCR се използва за локализиране на BR43xl експресия в Т и В клетки и моноцити. Олигонуклеотидни праймери ZC19980 м
(SEQ ID N0:15) и ZC19981 (SEQ ID N0:16) се използват за екраниране на CD19+, CD3+ и моноцит cDNA за BR43. Обратно транскриптазната реакция се провежда при 94°С за три минути, след което чрез 30 цикъла при 94°С за 30 секунди, при 68°С за 2 минути и при 72°С за една минута, последвано от 7 минути екстензия при 72°С. Установява се връзка с очакван размер 720 Ьр само в В клетки и не се открива в активирани Т клетки, както това е установена за TACI чрез използване на антитела (Billow and Bram).
ПРИМЕР 3
В клетъчно полиферационно изследване посредством BR43 лиганд ztnf4 η
Епруветка, съдържаща 1x10 замразени периферни кръвни мононуклеарни клетки (РВМС) се поставя бързо в 37°С водна баня и се ресуспендира в среда 25мл В клетки (Iscove’s модифицирана Dulbecco среда, 10% загрят инактивиран ембрионален говежди серум, 5% L- глутамин, 5% Pen/Strep) в 50 мл флакон. Клетките се изследват за жизнеспособност, използвайки Trypan Blue (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD). Десет милилитра от Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) ce поставят под клетъчна суспензия, въртят се 30 минути при 1800 оборота/мин. и спират рязко. Междуфазовият пласт след това се отделя и се премества в нов 50мл флакон, довежда се до краен обем от 40 мл с PBS и се завърта за 10 минути при 1200 оборота/мин. с рязко прекъсване. Жизнеспособността на изолираните В клетки се изследва чрез Trypan Blue. В клетките се ресуспендират при крайна концентрация от lx 106 клетки на милилитър в Вклетъчна среда и се поставят при 180 рл/гнездо в 96 гнездна поставка с Uобразно дъно (Falcon, VWR, Seattle, WA).
Към клетките се добавя един от следните стимулатори за довеждане до крайния обем от 200мл/гнездо:
Разтворим, FLAG-тагов ztnf-4sCF или ztnf-4sNF при 10 кратно разреждане от 1 мг-1 ng/мл или самостоятелно, с 10 pg/мл анти-IgM (кози анти човешки IgM) разреден в натриев бикарбонат, pH 9.5, (Southern Biotechnology
Associates, Inc., Birmingham, AL); или c 10pg/ml анти-IgM и 10нг/мл рекомбинантно човешко IL4 (разредено в PBS и 0.1% BSA). Допълнително се тестуват други цитокини като IL-3 и IL-6, както и разтворими CD40 (sCD40) антитела (Pharmingen, San Diego, СА). Като контрол на клетките, инкубирани с 1% говежди серумен албумин (BSA) и PBS, 10pg/ml анти-IgM или 10pg/ml анти-IgM и 10 нг/мл рекомбинантно човешко IL4 или други цитокини. След това клетките се инкубират при 37°С в овлажнен инкубатор за 72 часа. Шестнадесет часа преди прибирането на резултата към гнездата се добавя 1цС1 3Н тимидин. Клетките се прибират в 96 гнездна филтърна поставка (UniFilter GF/C, Packard, Meriden, СТ), където са прибрани чрез клетъчен инструмент (Packard) и се съхраняват съгласно инструкции на производителя. Поставките се сушат при температура 5 5 °C за 20-30 минути и основата на поставките се запечатва с непрозрачно лепило за поставки. Към всяко гнездо се добавя 0.25мл сцинтилационна течност (Microscint-O, Packard) и поставката се проверява чрез микропоставъчен сцинтилационен брояч (Packard).
За измерване на индукцията на IgG продукция в отговор на различни В клетъчни митогени, последващи стимулация на пречистени В клетки, клетки се приготвят както е описано и инкубирано за 9 дни. Клетъчният супернатант се събира за определяне на IgG продукция.
За измерване на клетъчно повърхностна маркерна активация в отговор на различни В клетъчни митогени, следващи стимулация на пречистени В клетки, клетки се приготвят по начин, описан по-горе, но се инкубират 48 часа. Клетъчно повърхностни маркери се измерват чрез FACS анализ.
Пролиферацията на човешки пречистени В клетки, стимулирани с различни В клетъчни митогени, е обобщено в Таблица 5:
ТАБЛИЦА 5
Дразнители ztnf4 ztnf4 + IL 4 ztnf4 + анти-IgM + IL 4
Пролиферативен индекс
1.5
9.9
15.8
Синергетичен ефект на Ztnf4 + IL 4, IL 3 (10pg/ml) и IL 6 се наблюдава върху В клетъчна пролиферация. Двукратно повишение в В клетъчно сигнализиране се наблюдава, когато се използва sCD40.
Индукцията на IgG продукция (ng/ml) в отговор на различни В клетъчни митогени след стимулиране на пречистени В клетки, е обобщено в Таблица 6.
ТАБЛИЦА 6 Ztnf4 7.5
Дразнители анти-IgM Контрола 3
• анти-IgM + IL 4 13 32
анти-IgM + IL 4+ IL 5 10 45
Повишение на клетъчните повърхностно активационни маркери се наблюдава след дразнене на пречистени В клетки с Ztnf4 самостоятелно, с анти-IgM или с анти-IgM + IL 4. Няма ефект на пролиферация на PBMNC в присъствие на оптимални или под оптимални Т клетъчни мито гени. Също така, никакъв ефект на TNFa продукция не е наблюдаван в пречистени моноцити в отговор срещу LPS дразнене.
Фигура 3 показва разтворима Ztnf4 активация на човешки В лимфоцити срещу пролиферативни и секретирани имуноглобулини. Фигура ЗА показва В клетъчна пролиферация на пречистени човешки периферни В кръвни клетки в отговор на дразнене с разтворим Ztnf4 (25 нг/мл) в присъствие на IL-4 самостоятелно и IL-4 с анти-IgM, анти-СО40 или анти-СО19 след пет дни в култура. Фигура ЗВ показва нивата на IgM и IgG, измерени в супернатант, получен от човешки В клетки, стимулирани с разтворим Ztnf4 в присъствие на IL-4 или IL-4 + IL-5 след девет дни в култура.
Тези резултати предполагат, че разтворим ztnf4 е В-клетъчно активирана молекула, която действа в съгласие с други В клетъчни дразнения и е слаба самостоятелно. Разтворим ztnf4 усилва В клетъчната пролиферация и Ig индукция. Подрегулацията на адхезионни молекули, ко-стимулаторни молекули и активирани рецептори предполага участие на В клетки за усилване АРС функция.
Фигура 4 показва стимулиране на човешки периферни кръвни В клетки с разтворим ztnf4 (5ng/ml) или контролен протеин в присъствие на 10 ng/ml IL-4 за 5 дни ин витро. Пречистени TACI-Ig, BCMA-Ig или контролен Fc се изследват за инхибиция на разтворима ztnf4 специфична пролиферация.
ПРИМЕР 4
Селектиране на BACI или ВСМА трансформирани ВНК клетки чрез ztnf4 свързване
ВНК клетки, експресиращи високо ниво TACI протеин, са избрани чрез разредено клониране на трансфектантен фонд. Трансфектантни клетки (2х105) се инкубират в ледена баня за 30 минути с биотинилиран ztnf4 при 1цг/мл в свързващ буфер (PBS, 2% BSA, 0.02% NaN3). Клетките се промиват 2 пъти със свързващ буфер, след което се инкубират с SA-РЕ (Caltag) (1:1000 разреждане в свързващ буфер) във водна баня за 30 минути. След това клетките се промиват отново 2 пъти в свързващ буфер, ресуспендират се в свързващ буфер и се преброяват чрез FACS (FACS Vantage, Becton Dickinson). Избират се клонинги с най-високо свързване на TNF4.
ВНК клетки, експресиращи висока степен от ВСМА протеин, се селектират чрез повърхност, белязваща ВСМА-експресиращ трансфектен фонд с биотинилиран ztnf4. Следва стрептавидин-Рюо-еритрин (SA-РЕ- Caltag Burlingame, СА) и стерилно сортиране за светли клетки в FL2 върху FACS Vantage устройство (Becton Dickinson). След това единични клонинги се изследват за ztnf4 свързване.
ПРИМЕР 5
Тъканно пренасяне
Човешки множествено тъканни Northern блотове (MTN I, MTN II и
MTN III; Clontech) се апробират за определяне на тъканно пренасяне на
човешки BR43x2 и TACI експресия. Приблизително 500 бр PRC проби (SEQ ID N0:21) се амплифицират чрез BR43x2 (SEQ ID N0:1) като шаблони и олигонуклеотид ZC20061 (SEQ ID N0:22) и ZC20062(SEQ ID N0:23) като праймери. Тази последователност е идентична на хомоложен регион на TACI. Амплификацията се провежда както следва: 1 цикъл при 94°С за 1.0 минута, 30 цикъла от 94°С за 30 секунди, 60°С за 30 секунди и 72°С за 30 секунди, последвано от 1 цикъл при 72°С за 10 минути. PCR продукцията се визуализира чрез агарозно гелна електрофореза и 500 бр PCR продукт се пречиства чрез гел екстракционен кит (Qiagen, Chatsworth, СА) съгласно инструкциите на производителя. Пробата се белязва радоактивно чрез MULTIPRIME DNA бележещ кит (Amersham, Arlington Heights, IL) съгласно инструкциите на производителя. Пробата се пречиства чрез NUCTRAP ударна колона (Stratagene). За прехибридизиране и като хибридизиращ разтвор за Northern блотове се използва EXPRESSHYB (Clontech) разтвор. Хибридизацията се провежда една нощ при 65°С чрез използване на 106cpm/ml на белязана проба. Блотовете след това се промиват в 2XSSC и 0.1% SDS при стайна температура, последвано от 2 промивания в 0.1XSSC и 0.1% SDS при 50°С. Копие на приблизително 1.5 кб се откриват в далак, лимфен възел и тънки черва.
Човешки множествено тъканни Northern блотове (MTN I, MTN II и MTN III; Clontech) се апробират за определяне на тъканно пренасяне на човешка ВСМА експресия. Приблизително 257 бп PRC проби (SEQ ID N0:24) се амплифицират чрез Daudi клетъчна cDNA като шаблон и олигонуклеотид ZC21065 (SEQ ID N0:25) и ZC21067 (SEQ ID N0:26) като праймери. Амплификацията се провежда както следва: 1 цикъл при 94°С за 1.0 минута, 35 цикъла от 94°С за 30 секунди, 60°С за 30 секунди и 72°С за 30 секунди, последвано от 1 цикъл при 72°С за 10 минути. PCR продукцията се визуализира чрез агарозно гелна електрофореза и 257 бп PCR продукт се пречиства чрез гел екстракционен кит (Qiagen, Chatsworth, СА) съгласно инструкциите на производителя. Пробата се белязва радоактивно чрез MULTIPRIME DNA бележещ кит (Amersham, Arlington Heights, IL) съгласно инструкциите на производителя. Пробата се пречиства чрез NUCTRAP ударна колона (Stratagene). За прехибридизиране и като хибридизиращ разтвор за Northern блотове се използва EXPRESSHYB (Clontech) разтвор. Хибридизацията се провежда за една нощ при 65°С чрез използване на 106cpm/ml от белязана проба. Блотовете след това се промиват в 2Х SSC и 0.1% SDS при стайна температура, последвано от 2 промивания в 0.1 SSC и 0.1% SDS при 50°С. Копие на приблизително 1.5 кб се откриват в стомах, тънки черва, далак, лимфен възел, трахея и тестиси.
RNA Master Dot блотове (Clontech), които съдържат RNA от различни тъкани, нормалзирани към 8 домашни гена, се апробират или с TACI проба (SEQ ID N0:21) или с ВСМА проба (SEQ ID N0:24) и се хибридизират, както е описано по-горе. BR43x2/TACI експресия се наблюдава в далак, лимфен възел, тънки черва, стомах, слюнна жлеза, апендикс, бял дроб, костен мозък и ембрионален далак. ВСМА експресия се открива в тънки черва, далак, стомах, дебело черво, лимфен възел и апендикс.
Човешки туморно панелен блот V (Invitrogen Inc., San Diego, СА) и човешки лимфома блот (Invitrogen Inc., San Diego, СА) се използват както е описано по-горе, едновременно с BR43x2/TACI проба (SEQ ID N0:21) или ВСМА проба (SEQ ID N0:24). В аденолимфом, не-Хочкинов лимфом и паротиден тумор е намерено 1.5 кб копие, съответстващо на TACI.
Цяла RNA от CD4+, CD8+, CD 19+ и смес от лимфоцитно реакционни клетки (CellPro, Bothell, WA) се приготвят чрез гуанидин изотиоцианатен анализ (Chirgwin et al., Biochemistry 18:52-94, 1979), след което се извършва CsCl центрофугиране. Поли(А)+ RNA се изолира чрез олиго d(T) целулозна хроматография (Aviv and Leder, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69:1408-12, 1972). След това се провежда Northern блот анализ както следва:
Около 2 мг от всека от поли А+ RNAs се денатурира в 2.2М формалдехид/фосфатен буфер (50mM Na2HPO4, 50тМ NaH2PO4, 50тМ NaOAc, ImM EDTA и 2.2М формалдехид) и се сепарира чрез 1.5% агароза мини гел (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, СА) електрофореза във формалдехид/фосфатен буфер. RNA се изследва чрез блот за една нощ върху нитриран филтър (Schleicher & Schuell, Keene, NH), като филтърът е UV кръстосано свързан (1,200 mJoules) в STRATALINKER® UV свързващ инструмент (Stratagene Cloning Systems, LaJolla, СА), след което се загрява при 80°С за 1 час.
Блотовете се пробират или с TACI проба (SEQ ID N0:21), или с ВСМА (SEQ ID N0:24) проба. 1.5 кб връзка, съответстваща на TACI, се открива само в CD 19+ клетки. 1.2 кб копие, съответстващо на ВСМА, се открива в CD 8+, CD19+ и MLR клетки.
Допълнителен Northern блотов анализ се провежда върху блотове, изработени от поли (A) RNA от К-562 клетки (еритроид, ATTC CCL 243), HUT78 клетки (Т, ATCC TIB-161), Jurkat клетки (Т клетки), DAUDI (Burkitt’s human lymphoma, Clontech, Palo Alto, CA), RAJI (Burkitt’s human lymphoma Clontech) и HL60 (моноцит), както е описано по-горе. Блотовете са апробирани или с TACI (SEQ ID N0:21), или с ВСМА (SEQ ID N0:24) проби. В Raji клетки се открива копие на 1.5кб, съответстващ към TACI. В Daudi, Raji и Hut 78 клетки се отктива копие на 1.2кб, съответстващо на ВСМА.
За определяне на тъкани, които експресират човешки или муринови TACI и човешки ВСМА се използва PCR-базиран екран. Човешки и муринови Rapid-Scan™ генно експресионни панели (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD) се отделят съгласно инструкциите на производителя. Олигонуклеотидни праймери ZC24200 (SEQ ID N0:27) и ZC24201 (SEQ ID N0:28) са конструирани за спин екзон образувание и продуцират 272 Ьр фрагмент, съответстващ на муринов TACI. Експресия се открива в далак, тимус, бял дроб, гърди, сърце, мускул, кожа, надбъбречна жлеза, стомах, тънки черва, мозък, яйчници, простата и ембрион. Допълнителни връзки на —500 и 800 Ьр се откриват в много тъкани.
Олигонуклеотидни праймери ZC24198 (SEQ ID N0:29) и ZC24199(SEQ ID N0:30) са конструирани за спин екзон образувание и продуцират 204Ьр фрагмент, съответстващ на човешки TACI. Експресия се открива в далак, мозък, сърце, черен дроб, дебело черво, бял дроб, тънки черва, мускул, стомах, тестиси, плацента, слюнна жлеза, надбъбречна жлеза, панкреас, простата, периферни кръвни лимфоцити и костен мозък.
Олигонуклеотидни праймери ZC24271 (SEQ ID N0:31) и ZC24272 (SEQ ID N0:32) са конструирани за спин екзон образувание и продуцират 329 Ьр фрагмент, съответстващ на човешки ВСМА. Експресия се открива в мозък, далак, дебело черво, бял дроб, тънки черва, стомах, яйчници, тестиси, слюнна жлеза, надбъбречна жлеза, простата, периферно кръвни лимфоцити, костен мозък и ембрионален черен дроб.
Олигонуклеотидни праймери ZC24495 (SEQ ID N0:33) и ZC24496 (SEQ ID N0:34) са конструирани за спин екзон образувание и продуцират 436 Ьр фрагмент, съответстващ на човешки ВСМА. Експресия се открива в черен дроб.
ПРИМЕР 6
Получаване на TACI-Ig или BCMAI-Ig смесени вектори
Ig Гама1 Fc4 фрагментна конструкция
За да се получи TACI-Ig смесен протеин Fc регион на човешки IgGl (възловият регион и СН2 и СНЗ домените) се модифицират така, че да се отстранят Fc рецептор (FcgRI) и комплемент (Clq) свързващи функции. Тази модифицирана версия на човешки IgGl Fc се нарича Fc4.
Fc регионът се изолира от човешка ембрионална чернодробна колекция (Clontech) посредством PRC чрез олиго праймери ZC10,134 (SEQ ID N0:43) и ZC10,135 (SEQ ID N0:44). PRC се използва, за да се включат мутации в Fc регион за редуциране на FcgRI свързване. FcgRI свързаният сайт (Leu-Leu-gly91
Gly) е изменен за Ala-Glu-glu-Ala (амно киселинни остатъци 38-41 на SEQ ID N0:45) съгласно Baum (EMBO J. 13:3992-4001, 1994), за да редуцира FcgRl свързване (Duncan et al., Nature 332:563-4, 1988). Олигонуклеотидни праймери ZC 15,345 (SEQ ID N0:46) и ZC 15,347 (SEQ ID N0:47) се използват за въвеждане на мутацията. До 50μ1 краен обем се добавят 570 ng IgFc еталон, 5μ1 10х Pfu реакционен буфер (Stratagene), 8μ1 1.25 mM dNTPs, 31μ1 dH2O, 2μ1 20mM ZC 15,345 (SEQ ID N0:46) и ZC 15347 (SEQ ID N0:47). Добавя се еквивалентно количество минерално масло и реакцията се нагрява до 94°С за 1 минута. Добавя се Pfu полимераза (2.5 единици, Stratagene), последвана от 25 цикъла при 94°С за 30 секунди, 55°С за 30 секунди, 72°С за 1 минута и 7 минутна екстензия при 72°С. Реакционните продукти се подлагат на електрофореза и се открива връзката, съответстваща на предполагаемия размер -676 Ьр. Връзката се възбужда от гела и се възстановява чрез QIAGEN QIAquck™ гел екстракционен кит (Qiagen) съгласно инструкциите на производителя.
За въвеждане на мутация на Ala към Ser (аминокиселинен остатък 134 на SEQ ID N0:45) и Pro към Ser (аминокиселинен остатък 135 на SEQ ID N0:45) за редуциране на комплемент Clq свързване и/или комплемент фиксация (Duncan and Winter, Nature 332:788, 1988) и спиране на кодона ТАА се използва PCR. Второ, първи кръгови реакции се извършват чрез FcyRI свързваща сайт-мутантна IgFc последователност като еталон. До 50μ1 краен обем се добавя 1 μΐ FcyRI свързваща сайт-мутантен IgFc еталон, 5μ1 10х Pfu реакционен буфер (Stratagene) и 8μ1 1.25 mM dNTPs, 31μ1 dH2O, 2μ1 20mM ZC15,517 (SEQ ID N0:48), 5’ праймер, започващ при нуклеотид 26 на SEQ ID N0:45 и 2μ1 20тМ ZC15,530(SEQ ID N0:49), 3’ праймер, започващ на комплемента на нуклеотид 405 на SEQ ID N0:45. Втората реакция съдържа по 2μ1 от всеки 20 мМ наличности от олигонуклеотидни праймери ZC 15,518 (SEQ ID N0:50), един 5' праймер, започващ при нуклеотид 388 на SEQ ID N0:45 и ZC 15,347 (SEQ ID N0:47), един 3' праймер за включване на Ala към Ser мутация, Xba I рестрикционно място и спиращ кодон. Добавя се еквивалентно количество минерално масло и реакциите се нагряват до 94°С за една минута. Добавя се Pfu полимераза (2.5 единици, Stratagene), след което следват 25 цикъла при 94°С за 30 секунди, 55°С за 30 секунди, 72°С за 2 минути; следва 7 минутна екстензия при 72°С. Реакционните продукти се подлагат на електрофореза и се откриват връзките, съответстващи на предполагаемите размери —370 и —390 Ьр. Връзките се възбуждат от гела и се екстрахират чрез QIAGEN QIAquckTM гел екстракционен кит (Qiagen) съгласно инструкциите на производителя. За присъединяване на споменатите по-горе фрагменти се извършва втори кръг на реакцията и се добавя 5' Bam Ш рестрикционен сайт. До 50 μΐ краен обем се добавя 30μ1 dH2O, 8μ1 1.25 mM dNTPs, 5 μΐ 10x Pfu полимеразен реакционен буфер (Stratagene) и Ιμΐ от всеки от двата първи, втори PCR продукта. Добавя се еквивалентно количество минерално масло и реакциите се нагряват до 94°С за една мнута. Добавя се Pfu полимераза (2.5 единици, Stratagene), последвано от 5 цикъла при 94°С за 30 секунди, 55°С за 30 секунди и 72°С за 2 минути. Температурата се повишава отново до 94°С и се добавят по 2μ1 от всеки 20 мМ наличности от олигонуклеотидни праймери ZC15,516 (SEQ ID N0:51), 5' праймер, започващ при нуклеотид 1 на SEQ ID N0:45 и ZC 15,347 (SEQ ID N0:47), след което следват 25 цикъла при 94°С за © 30 секунди, 55°С за 30 секунди, 72°С за 2 минути и крайна екстензия за 7 минути при 72°С. Част от реакцията се визуализира чрез гел електрофореза.
Открива се 789Ьр връзка, съответстваща на предполагаемия сайт.
TACI-Fc4 и BCMA-Fc4 експресионно векторна конструкция
Експресионни плазмиди, съдържащи TACI-Fc4 и BCMA-Fc4 смесени протеини, се създават чрез хомоложна рекомбинация в хлебна мая. Фрагмент от TCAI cDNA се изолира чрез PCR, която включва полинуклеотидна последователност от нуклеотид 15 до нукелотид 475 от SEQ ID N0:5. Двата j праймера, използвани в продукцията на TACI фрагмент, са: (1) праймер,
I съдържащ 40 bp на 5' векторна странична последователност и 17 Ьр, съответстваща на амино терминал на TACI фрагмент от (SEQ ID N0:52); (2) 40 bp на 3' край, съответстващ на странична Fc4 последователност и 17 Ьр, съответстваща на карбоксилен терминал на TACI фрагмент (SEQ ID N0:53). До 100 μΐ краен обем се добавя 10 ng TACI еталон, 10 μΐ 10х Taq полимеразен реакционен буфер (Perkin Elmer), 8μ1 2.5 ηΜ dNTPs, 78μ1 dH2O, 2μ1 от всеки от 20 тМ наличности на олигонуклеотидни праймери SEQ ID N0:52 и SEQ ID N0:53 и Taq полимераза (2.5 единици, Life Technology). Добавя се еквивалентно количество минерално масло и реакциите се нагряват до 94°С за две минути, последвано от 25 цикъла при 94°С за 30 секунди, 65°С за 30 секунди, 65°С за 30 секунди, 72°С за 1 минута и рзаширяване при 72°С за 5 минути.
Фрагмент от ВСМА cDNA се изолира чрез PCR, която включва полинуклеотидна последователност от нуклеотид 219 до нуклеотид 362 на SEQ ID N0:7. Двата праймера, използвани при получаването на ВСМА фрагмент, са олигонуклеотиден праймер, съдържащ 40 Ьр на 5’ векторна странична последователност и 17 Ьр, съответстващи на амино-терминал на ВСМА фрагмент (SEQ ID N0:54); и олигонуклеотиден праймер, съдържащ 40 Ьр на 3' край, съответстващ на странична Fc4 последователност и 17 Ьр, съответстваща на карбоксилен терминал на ВСМА фрагмент (SEQ ID N0:55). До 100 μΐ краен обем се добавя 10 ng ВСМА еталон, 10 μΐ 1 Ох Taq полимеразен реакционен буфер (Perkin Elmer), 8μ1 2.5 mM dNTPs, 78μ1 Η2Ο, 2μ1 от всеки от 20 mM наличностни разтвори на олигонуклеотидни праймери SEQ ID N0:54 и SEQ ID N0:55. Добавя се еквивалентно количество минерално масло и реакциите се нагряват до 94°С за две мнути, последвано от 25 цикъла при 94°С за 30 секунди, 65°С за 30 секунди, 72°С за 1 минута, последвано от разширение при 72 °C за 5 минути.
Фрагментът, съдържащ cDNA кодиращата Fc4 фрагменти, се създава по същия начин, един за всяка от TACI и ВСМА смесени конструкции. За TACI двата праймера, използвани при получаването на Fc4 фрагмент, са (горно и долно направление) олигонуклеотиден праймер, съдържащ 40 Ьр от 5' TACI странична последователност и 17 Ьр, съответстващи на карбоксилен терминал на Fc4 фрагмент (SEQ ID N0:56); и олигонуклеотиден праймер, съдържащ 40 Ьр на 3' край, съответстващ на странична векторна последователност и 17 Ьр, съответстваща на карбоксилен терминал на Fc4 фрагмент (SEQ ID N0:57). За ВСМА, праймерът от горното направление при получаването на Fc4 фрагмент е олигонуклеотиден праймер, съдържащ 40 Ьр на 5' ВСМА странична последователност и 17 Ьр, съответстващи на амино терминал на Fc4 фрагмент (SEQ ID N0:58). Праймерът от долното направление за получаване на Fc4 за ВСМА конструкция е същият както този, описан по-горе за TACI- Fc4 (SEQ ID N0:57).
До 100 μΐ краен обем се добавя 10 ng Fc4 еталон, описан по-горе, 10 μΐ 10х Taq полимеразен реакционен буфер (Perkin Elmer), 8μ12.5 mM dNTPs, 78μ1 dH2O, 2μ1 от всеки от 20 mM наличностни разтвори на олигонуклеотидни праймери SEQ ID N0:56 и SEQ ID N0:57 за TACI и олигонуклеотиди SEQ ID N0:58 и SEQ ID N0:57 за ВСМА и Taq полимераза (2.5 единици, Life Technology). Добавя се еквивалентно количество минерално масло и реакциите се нагряват до 94°С за две мнути, последовано от 25 цикъла при 94°С за 30 секунди, 65°С за 30 секунди, 72°С за 1 минута, последвано от разширение при 72°С за 5 минути.
Десет микролитъра от всяка от 100 μΐ PCR реакции, описани по-горе, се поставят върху 0.8% LMP агарозен гел (Seaplaque GTG) с ΙχΤΒΕ буфер за анализ. Останалите 90 μΐ от всяка от 100 μΐ PCR реакция се преципитират с добавка на 5 μΐ IM NaCl и 250μ1 абсолютен етанол. Плазмид ρΖΜΡ6 се срязва с Smal до закрепване върху свързващия агент. Плазмид pZMP6 се получава от плазмид pCZR199 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, ATCC# 98668) и е бозайников експресионен вектор, съдържащ експресионни касети с CMV бърз ранен промотер, консенсусен интрон от изменям регион на миши имуноглобулинов тежко верижен локус, множество рестрикционни сайта за вмъкване на кодиращи последователности, стоп кодон и човешки растежно хормонен терминатор. Плазмидът също има E.coli източник на репликация, бозайник-селективна маркерна експресийна част с SV40 промотер, усилвател и източник на репликация, DHFR ген и SV40 терминатор. Векторът pZMP6 се получава от вектор pCZR199 чрез заместване на металотионин промотер с CMV бърз ранен промотер и Kozac последователности при 5' край на отворената четяща се рамка.
Сто микролитъра на подходящи клетки от хлебна мая (S. cerevisiae) се Ф комбинират с 10 μΐ, съдържащи приблизително 1 μΐ от всеки TACI или ВСМА извънклетъчен домен и Fc4 PCR фрагменти, благоприятни за рекомбинация с всеки, и 100ng от Smal усвоен pZMP6 вектор и трансферирани към 0.2 cm електропорационна кювета. Смесите хлебна мая/DNA се подлагат на електропулсация при 0.75 kV (5kV/cm), безкрайно съпротивление и 25 μΕ. Към всяка кювета се добавят 600μ1 от 1.2 М сорбитол и хлебната мая се разделя на два 300μ1 обема върху URA-D поставки и се инкубира при 30°С.
След около 48 часа Ura+ трансформанти от хлебната мая от единична поставка се ресуспендират в 1 μΐ Н2О и се завъртат кратко към пелети - клетки на хлебната мая. Клетъчната пелета се ресуспендира в 1 μΐ от лизис буфер (2% Ф Тритон Х-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 тМ Tris, pH 8.0, 1 тМ EDTA).
Петстотин микролитъра от лизираната смес се добавят към колба на Eppendorf, съдържаща 300 μΐ киселинно промити стъклени зърна и 200 μΐ фенолхлороформ, разбърква се вихрово два или три пъти за по една минута, последвано от 5 минутно въртене в Eppendorf центофуга при максимална скорост. 300 микролитъра от водната фаза се премества в нова колба и DNA преципитира с 600 μΐ етанол, последвано от центрофугиране за 10 минути при 4°С. DNA пелет се ресуспендира в 100 μΐ вода.
Трансформация на електрореагиращи E.coli клетки (DH10B, GibcoBRL) се извършва с 0.5-2 мл DNA преципитат от хлебна мая и 40 μΐ от DH10B клетки. Клетките се подлагат на електрически импулси при 2.0 kV/cm, 400 ома и 25 mF. След електропорацията се поставят 1 мл SOC (2% Bacto Tryptone (Difco, Detroit, MI), 0.5% екстракт от хлебна мая (Difco), 10 mM NaCl, 2.5 тМ КС1, 10 тМ MgCl2, 10 тМ MgSO4, 20 тМ глюкоза) в 250 μΐ кратни части върху четири LB АМР поставки (LB broth Lennox), 1.8% Бакто- arap (Difco) и 100 mg/L ампицилин).
Отделни клонове, притежаващи правилната експресионна конструкция за TACL-Fc4 или BCMA-Fc4, са идентифицирани чрез рестриктивно усвояване за потвърждаване на наличието на вмъкването и това, че различните DNA последователности са свързани правилно една към друга. Вмъкването на положителни клонинги е потвърдено чрез анализи на последователностите. Разширена скала на плазмидна DNA е изолирана чрез използване на Qiagen Maxi кит (Qiagen), съгласно инструкциите на производителя.
ПРИМЕР 7
Експресия на TACI-Fc4 и BCMA-Fc4 при бозайцици
ВНК 570 клетки (ATCC NO: CRL-10314) се поставят в 10 cm клетъчни културални чинийки и се оставят да растат до приблизително 50 до 70% сливане една нощ при 37°С, 5% СО2, в DMEM/FBS среда (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco BRL, Gaithersbrug, MD), 5% ембрионален говежди серум (Hyclone, Logan, UT), ImM L-глутамин (JRH Biosciences, Lenexa, KS), ImM натриев пируват (Gibco BRL). След това клетките се трансфектират с всеки от плазмидите TACI-Fc4/pZMP6 или BCMA-Fc4/pZMP6 чрез използване на Липофектамин™ (Gibco BRL), в свободна от серум (SF) среда (DMEM, 10мг/мл трансферни, 5 мг/мл инсулин, 2 мг/мл фетуин, 1% L-глутамин и 1% натриев пируват). TACI-Fc4/pZMP6 или BCMA-Fc4/pZMP6 се разтваря в 15 мл колби до пълен краен обем от 640 μΐ с SF среда. 35 μΐ от Липофектамин™ (Gibco BRL) се смесва с 605 μΐ SF среда. Тази Липофектамин™ смес се добавя към DNA смес и се оставя да инкубира около 30 минути при стайна температура. Пет милилитъра от SF среда се добавят към DNA
Липофектамин™ сместа. Клетките се промиват веднъж с 5мл от SF среда, аспирират се и се добавя DNA-Липофектамин™ смес. Клетките се инкубират при 37°С за пет часа, след което се добавя среда от 6.4 мл DMEM/10% FBS, 1% PSN към всяка поставка. Поставките се инкубират при 37°С цяла нощ и на следващия ден сместа DNА-Липофектамин™ се разменя със свежа 5% DMEM/FBS среда. При извършване дневно по 5 пост-трансфекции, клетките се разцепват в Т-162 колба в селектираща среда (DMEM/5% FBS, 1% L-GLU, 1% NaPyr). При приблизително 10 дни пост-трансфекция, две чинийки с 150мм култура от метотрексат устойчиви колонии от всяка трансфекция се трипсинизират и клетките се поставят в Т- 162 колба и се трансферират към широка скала култури.
ПРИМЕР 9
Трансгенна експресия на ztnf4
Трансгенни животински експресиращи ztnf4 гени се получават чрез използване на възрастни, фертилни мъжки животни, достигнали плодова зрелост (В6СЗП), фертилни женски (В6СЗП), вазектомирани мъжки (B6D2fl) и възрастни фертилни женски (B6D2A) (всички от Taconic Farms, Germantown, NY). Достигналите плодова зрелост фертилни женски се супервулират чрез Pregnant Mare's серумен гонадотропин (Sigma, St. Lois, МО) и човешки хорионов гонадотропин (hCG(Sigma)). Супервулираните женски се съчетават последователно с възрастни фертилни мъжки екземпляри и копулацията се потвърждава чрез наличието на вагинални проби.
Оплодени яйцеклетки се събират чрез хирургическа скопия (Leica MZ12 Stereo Microscope, Leica, Weitzlar, Germany). След това яйцеклетките се промиват с хиалоронидаза и Whitten's W640 среда (Таблица 8, всички реагенти могат да се доставят от Sigma Chemicl Co.), която се инкубира с 5% СО2, 5% О2, 90% N2 при 37°С. Яйцеклетките се съхраняват при 37°С/5% СО2 инкубатор до микроинжектиране.
ТАБЛИЦА 8
WHITTEN’S 640 СРЕДА
mgs/200 ml mgs/500 ml
NaCl 1280 3200
КС1 72 180
КН2С1 32 80
MgSO4-7H2O 60 150
Глюкоза 200 500
Са2+ Лактоза 106 265
Бензилпеницилин 15 37.5
Стрептомицин SO4 10 25
NaHCO3 380 950
Na пируват 5 12.5
н2о 200 ml 500 ml
500 mM EDTA 100 μΐ 250 μΐ
5% фенолово червено 200 μΐ 500 μΐ
BSA 600 1500
858 bp отворената четяща рамка, кодираща пълен човешки TACI лиганд Blys (SEQ ID N0:35), се амплифицира чрез PCR така, че да въведе оптимално обозначен кодон и странични 5' Pmelw 3' Asci посредством олигонуклеотидни праймери на SEQ ID N0:36 и SEQ ID N0:37. Този фрагмент PmellAscI се субклонира в pKFO24, а В- и/или Т клетъчен рестрикционен трансгенен вектор, съдържащ Ig Em усилвател (690bp Notl/Xbal от pEmSR; (Bodrug et al., EMBO J. 13:2124-30, 1994), Ig Vh промотер (536 bp HincII/XhoI фрагмент от pJHlX(-); Hu et al., J. Exp. Med. 177:1681-90, 1993) SV40 16S интрон (171 bp Xhol/Hindlll фрагмент от pEmSR), PmellAscI полисвързващ агент и човешкия растежно хормонен генен полиаденилационен сигнал (627 bp Smal/EcoRI фрагмент; Seeburg, DNA 1:239-49, 1982). Трансгенното вмъкване се сепарира от плазмидна черна кост чрез Notl усвояване и агарозно гел-пречистване, и оплодени яйцеклетки от съчетания на B6C3FlTac мишки, описани по-горе, са микроинжектирани и имплантирани в псевдо бременни женски, по-специално както е описано по-рано (Malik et al., Molec. Cell. Biol. 15:2349-58, 1995)
Реципиентите се връщат в кафези по двойки и следва 19-21 дни бременност. След раждането се допуска период от 19-21 дни преди секс и отделяне на малкото, и с чиста ножица от опашката се прави 0.5см биопсия (използвана за генотипизиране).
Геномна DNA се получава от част от опашката чрез търговско достъпен кит (DNeasy 96 Tissue Kit; Qiagen, Valencia, СА) като се следват инструкциите на производителя. Геномна DNA се анализира чрез PCR чрез използване на праймери, означени като човешки разстежен хормон (hGH) 3' UTR част на трансгенния вектор. Праймерите ZC17251 (SEQ ID N0:38) и ZC17252 (SEQ ID N0:39) амплифицират 368-базова двойка фрагмент на hGH. Използването на еднакъв регион към човешката последователност (идентифициран от подреждане на DNA последователности на човешки и миши хормон на разстежа 3' UTR) показва, че PCR реакцията не амплифицира мишата последователност. Освен това, праймери ZC17156 (SEQ ID N0:40) и ZC17157 (SEQ ID N0:41), които хибридизират към векторни последователности и амплифицират cDNA вмъкване, могат да бъдат използвани заедно с hGH праймери. В тези експерименти DNA от животни позитивни за трансгенно получени две връзки, една 368-основна-двойка-връзка, съответстваща на hGH 3' UTR фрагмента, и връзка с изменчив размер, съответстват на cDNA вмъкване.
Веднъж установено, че животните са трансгенни (TG), те се кръстосват обратно в изродена верига чрез поставяне на TG женска с див тип мъжки или TG мъжки с една или две женски от див тип. Когато поколението се роди и отдели, двойките се разделят и техните опашки се отрязват за генотипизиране.
100
За проверка на експресия на грансгенно живо животно, се провежда биопсия. Анализът на степента на mRNA експресия на всеки трансген се извършва чрез RNA разствор хибридизационен опит или PCR в реално време върху ABI Prism 7700 (РЕ Applied Biosystems, Inc., Foster City, СА) като се спазват инструкциите на производителя.
Клетъчно получаване и течна цитометрия
Анализират се основни мишки при различни възрасти. За течен цитометричен анализ (FACS) на лимфоидни тъкани се изолират костно мозъчни (ВМ) клетки от бедрената и тибийната кост чрез внимателно разчупване във фосфатно буферен разтвор (PBS) като се използва хаванче и чукче. Клетките се ресуспендират, отделят се от костните фрагменти чрез пасивна седиментация и се пелетират при 1000 х g. Спленоцити, тимоцити или лимфно възелни клетки се получават чрез раздробяване на целите тъкани между стъклени пластини, след което се извършва ресуспендиране и пелетиране на клетките както за костния мозък (ВМ). Клетки се ресуспендират в FACS воден буфер (FACS WB) (Hank’s balanced salt solution, 1% BSA, 10 mM Hepes , pH 7.4) при концентрация от 20 x 106 клетки/мл преди оцветяване. За оцветяване, 1 х 106 клетки се трансферират към 5 мл туби и се промиват с 1 мл FACS WB, след което се пелетират при 1000 х g. След това клетките се инкубират върху лед за 20 минути в присъствие на насищащи количества от подходящите FITC-, РЕ- и/или TriColor (ТС)-конюгиран mAbs в цял обем от 100 мл в FACS WB. Клетките се промиват с 1.5 мл от WB, пелетират, след което ресуспендират в 400 мл и се анализират върху FACSCalibur течен цитометър, като се използва CellQuest софтуер (Becton Dickinson, Mountain View, СА). Детектори за преден (FSC) и страничен (SSC) светлинни дифузери са настроени на линейна скала, докато за всички три флуорисцентни канала (FL-1, FL-2 и FL-3) са използвани логаритмични детектори.
Извършва се компенсация за спектрално покриване между FL канали за всеки експеримент като се използват едноцветно означени клетъчни
101 популации. Всички клетки са събрани към диск и даните са анализирани чрез CellQuest софтуер. RBC и мъртви клетки се изключват от електронно получените данни на базата на FSC спрямо SSC профили.
Антитела
Флуоресцентно изотиоцианатно (Р1ТС)-конюгирано анти-СО8 моноклонално антитяло (mAb) (клон 53-6.7) и фикоертирин (РЕ) - конюгиран антиCD4 (клон RM4-5), анти-СО5 (клон 53-7.3), анти-СО19 (клон 1D3) и антисиндекан (клон 281-2) mAbs са закупени от PharMingen (San Diego, СА). ТпСо1ог(ТС)-конюгиран aHTH-CD45R/B220 mAb (клон RA3-6B2) е закупен от Caltag.
Трансгенни мишки над експресиращи ztnf4 в лимфоидните отделения развиват нарастващ брой на периферни В клетки, увеличени плазмени клетки и по-високи нива на серумен имуноглобулин. Тези трансгенни животни имат повишен брой В200+ клетки в далака, лимфните възли и тимуса. Повишеният брой на далачни В клетки включва едновременно обикновени В-2 клетки и нормално рядката популация на В-1 клетки. Най-общо В-1 клетки са твърде ограничени към перитониалните и други телесни кухини, продуцират ниско афинитетни самореактивни антитела и често могат да бъдат свързани с развитието на автоимунни заболявания, като системен еритоматозен лупус в SLE.
По-възрастни трансгенни животни продуцират автоантитела, развиват протеинурия и склеротични глумерулни характеристики на системен еритроматозен лупус.
Фигура 5А показва единични клетъчни суспензии на далак (горен панел), мезентеричен лимфен възел (среден панел) и костен мозък (долен панел), получени както е описано по долу, белязани с анти-В220-ТС и анализирани чрез течна цитометрия. Броят В220+ клетки във всяка тъкан се изчислява чрез умножение на процента В220+ клетки по общия брой живи клетки (трипан синьо изключване), преброени с хемоцитометър. Всеки бар
102 jgjjjggji представя данни от индивидуални ztnf4 трансгенни (Tg, полутъмен бар) или не-трансгенни контролни мишки.
Фигура 5В показва клетки, изолирани от ztnf4 TG (десни панели) или не-трансгенни (леви панели), лимфен възел (горен ред), далак (средни редове), и тимус (долен ред), които са белязани с mAbs към молекулите, обозначени с (DC5, CD4, CD8), след което са анализирани чрез течна цитометрия. Показаните данни изключват умрели клетки RBC.
Фигура 5С показва общо IgG, IgM и IgE нива в серум от ztnf4 трансгенни мишки, избрани във възраст от 6 до 23 седмици.
ф Фигура 5D показва амилуидно отлагане и удебелен мезангиум на гломерули, идентифицирани в Н&Е бъбречни секции от ztnf4 трансгенни мишки в сравнение с нормални гломерули от контролни екземпляри.
Фигура 5Е показва повишение в ефектор Т клетки в ztnf4 трансгенни мишки, подобно на това, съобщено от Mackay et al., (J. Exp. Med. 190:16971710, 1999).
Разтворими TACI(BR43x2) или смеси BCMA-Ig се инжектират (IP, IM или IV) в ztnf4 пре-експерсирани трансгенни животни. Използва се течен цитометричен анализ (FACS) на лимфоидни тъкани за идентифициране на всяка промяна в броя на В220+ В клетки в далака, лимфните възли и тимуса.
ПРИМЕР 10
Пряко свързване ELISA
За характеризиране на способността на разтворимия TACI-Ig или разтворимия BCMA-Ig да свърже и инхибира биологическата активност на ztnf4 ин витро се използва пряко свързване ELISA.
Една 96 гнездна поставка е обвита с 1 pg/ml кози-анти-човешки Ig (Jackson Labs, Bar Harbor, МА) в ELISA А буфер (0.1 M Na2HCO3, pH 9.6, 0.2% NaN3) и се инкубира за една нощ при 4°С. TACI, ВСМА и несвързан TNF рецептор, такъв като ztnf4 (SEQ ID N0:42) като контролен, се титруват с от 10pg/ml чрез петкратно разреждане до 320ng/ml плюс нула и се ко-инкубира с
103
2.5, 0.5 или 0.1pg/ml биотинилирано ztnf4 или овариален албумин като негативна контрола и се инкубира за един час при стайна температура.
След това ко-инкубираната рецептор биотинилирана лигандна смес се добавя към кози-анти-човешки Ig-обвити 96 гнездни поставки, които след това се промиват (ELISA С, 500 μΐ, Tween 20 (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), 200mg NaN3, PBS до краен обем 1 литър) и се блокират със Superblock (Pierce, Rockford, IL). След това поставките се инкубират за два часа при 37°С.
Поставките се промиват още веднъж с ELISA С, последвано от добавяне на 100 μΐ/гнездо от неутро-адивин HRP при 1:10,000 в ELISA В (5 или 10μ1 BSA (Sigma) за 1% или 2% BSA съответно, 250 μΐ Tween 20 (Sigma), lOOrng NaN3, фосфатно буфериран солев разтвор pH 7.2 (PBS, Sigma) до краен обем от 500мл. Алтернативно, буферът може да бъде съставен от 1% или 2% BSA в ELISA С буфер. Поставките след това се обработват с ДЗА за 10 минути при стайна температура и са определени при 492.
ПРИМЕР 11
Биологично активен опит
Биологично активен опит се провежда за измерване на разтворима TACI-FC инхибиция на човешка В клетъчна стимулация чрез разтворим ztnf4. В клетки се изолират от периферни кръвни мононуклеарни клетки (PBMNC) чрез CD 19 магнитни легла и VarioMacs магнитна сепарационна система (Miltenyi Biotec Auburn, СА) съгласно инструкциите на производителя. Пречистени В клетки се смесват с разтворим z tnf4 (25 ng/ml) и рекомбинантно човешко IL-4 (10 ng/ml Pharmingen) и се поставят (трикратно) върху кръгли дънни 96 гнездни поставки при lxl05 клетки за гнездо.
Разтворим TACI-FC се разрежда от 5pg/ml до 6 ng/ml и се инкубира с В клетката за 5 дни, подлага се на пулсиране за една нощ на 4-тия ден с 1 pCi 3Н тимидин (Amersham) за гнездо. Като контролен разтворим TACI-FC също се инкубира с В клетки и без наличие на ztnf4.
104
Поставките се прибират чрез Packard устройство и се преброяват чрез Packard четец. Разтворимият TACI-Ig рецептор инхибира способността на разтворим ztnf4 да стимулира В клетъчна пролиферация ин витро по начин, зависещ от дозата. Десет-кратен моларен излишък TACI-Ig напълно инхибира пролиферацията на човешки В клетки в отговор на разтворим ztnf4 в присъствие на IL-4.
ПРИМЕР 12
ORIGIN Изследване
Нива на ztnf4 в индивиди с болестни симптоми (например такива като SLE, ревматоиден артрит) спрямо нормалните индивиди, са определени чрез електрохемилуминисцентно изследване. Стандартна крива, получена от разтворим, човешки ztnf4 при 10 ng/ml, lng/ml, 0.1ng/ml, 0.01 ng/ml и 0 ng/ml, е получена в ORIGIN буфер (Igen, Gaithersburg, MD). Серумни примери се разреждат в ORIGIN буфер. Стандартите и примерите инкубират при стайна температура за 2 часа с биотинилирано заешко анти-човешко ztnf4 -NF BV антитяло, разредено до 1 pg/ml в Origin буфер (IGEN) и рутенилиран заешко анти-човешко ztnf4-NF BV поликлонално антитяло, разредено до lpg/ml в Origin буфер (IGEN). След инкубацията примерите се центрофугират и към всеки от стандартите и примерите се добавя 0.4mg/ml стрептавидин Dynabeads (Dynal, Oslo, Norway) при 50ggl на туба и се инкубират за 30 минути при стайна температура. След това примерите се центрофугират и се четат с анализатор Origin Analyzer (Igen) съгласно инструкциите на производителя. Origin изследването се базира на електрохемилуминисценция и предоставя резултати в ECL - какво представлява това, как работи и какво означава.
Повишено ниво на ztnf4 е открито в серумните примери от двете NZBWF1/J и MRL/Mpj-Faslpr мишки, които прогресират към напреднал стадии на гломерулонефрит и автоимунно заболяване.
ПРИМЕР 13
Разтворим TACI-Ig в спонтанен модел на SLE
Мишки стават симптоматични за спонтанен SLE приблизително на 7-9
105
месечна възраст. TACL-Fc се прилага на NZBW мишки за наблюдаване на техния супресивен ефект върху В клетки по време на 5 седмичния период, когато средно В клетъчна авто-антитяло продукция би трябвало да бъде на високи нива в NZBW мишки.
Сто осем седмични женски мишки (NZB х NZW) Fi (Jackson Labs) се разделят на 6 групи по 15 мишки. Преди лечение мишките се наблюдават веднъж на месец за протеин и кръв в урината, което е отбелязано и за СВС и серумни банки. Серум се изследва за присъствие на авто- антитела. Тъй като протеинурията е важен знак за гломерулонефрит, протеинните нива в урината са наблюдавани чрез устройство на равни интервали по време на курса на изследване. Преди лечение животните се претеглят. Дозирането започва когато мишките са приблизително 5 месечни. Мишките получават три пъти седмично за 5 седмици интраперитонеално инжекции само с носител (PBS) или човешки IgG-FC (контролен протеин) или TACI-FC4 (тест протеин).
Група (5 мишки всяка) Лечение доза
1 нетретирана контролна
2 само носител
3 човешки IgG-FC 20 pg
4 човешки IgG-FC ЮО pg
5 човешки IgG-FC4 20 pg
6 Човешки IgG-FC4 ЮО pg
Кръв се събира два пъти по време на дозирането и поне два пъти след дозиране. Нивата на урината за протеинуриа и телесни тегла се измерват всеки 2 седмици след започването. Стойностите на нивата на кръв и урина и телесно тегло се събират по време на ефтаназията. Измерват се и теглото на далака, тимуса, черния дроб с жлъчния мехур, левия бъбрек и мозъка. Далакът и тимусът се разделят за FACS анализ и хистология. За хистология се събират
106
също субмандибуларни слюнчени жлези, мезентерична лимфно-възелна верига, чернодробен лоб с жлъчен мехур, сляпо черво и дебело черво, стомах, тънки черва, панкреас, десен бъбрек, надбъбречна жлеза, език с трахея и езофагус, сърце и бели дробове.
Фигура 6 показва повишено ниво на ztnf4 в серум от NZBWF1 и MRL/ Ipr/lpr мишки, които съответстват на развитието на SLE. Горният панел на фигура 6 показва корелацията на ztnf4 серумни нива с възрастта, 68 NZBWF1 мишки избрани от 10 до 40 седмична възраст и 10 седмични и 30 седмични NZB/B контролни мишки. Средният панел показва корелация с протеинурията на три степени - следи към 20 mg/dl (Т-30), 100-300 ng/dl и 2000 mg/dl в NZBWF1 мишки в сравнение с NZB/B контролни мишки. Долният панел показва ztnf4 нива с различни тигри на анти-ds DNA антитяло в NZBWF1 мишки в сравнение с контролни NZB/B мишки.
Фигура 6В показва същата корелация, направена на 23 MRL/lpr/lpr мишки разпределени от 18 до 24 седмична възраст и 10 контролни 11 седмични MRL/MpJ мишки.
Фигура 7 показва резултати от анализа на урина. Счита се, че мишките имат протеинурия, ако резултатът е > 100mg/dl. (A) PBS, (В) човешки IgG FC, 100 мг, (С) човешки IgG FC, 20 mg, (D) човешки TACI-IgG, 100 мг и (Е) човешки TACI-IgG, 20 мг. Мишки, третирани с разтворима TACI-IgG смес, показват намаление на протеинурия.
Анализ на периферна кръв от третирани животни показва, че бяла кръвна клетка и лимфоцити са редуцирани при TACI-FC третирани мишки (20 и 100 мг) в сравнение с (20 и 100 мг) и PBS третирани мишки 2 седмици след началото на третирането. FAC анализи (лимфоцитен изход) на периферна кръв, взета 6 седмици след започване на третирането (2 седмици след последното третиране) и показва драматично намаляване в процента на В клетките, присъстващи в примерите. В- клетъчните нива са все още в наклонил участък при 5 седмици след последното третиране, но не толкова драматично. Таблица 9 показва среден резултат (стандартно отклонение) за мишките във
107 всяка третирана група (таблица 9). Отклонението в % на В- клетките в периферната кръв също се наблюдава 2 седмици по време на третирането.
ТАБЛИЦА 9
Лечение Седмица 2 Седмица 5
% В клетки % T клетки % В клетки
PBS 26.05 (6.52) 67.05 (6.80) 20.83 (3.14)
100 mg FC 23.34 (5.77) 68.23 (7.30) 25.04 (8.07)
20 mg FC 24.09 (6.26) 65.27 (7.18) 18.96 (6.42)
100 mg TACI-FC 11.07 (5.03) 79.06 (6.71) 14.79 (4.76)
20 mg TACI-FC 16.37 (7.27) 69.72 (8.90) 19.14(5.27)
ПРИМЕР 14
Разтворим TACI-Ig в нормални мишки
TACI-FC се прилага към Blab/C мишки за наблюдение на неговия ефект върху нормални мишки. Шестдесет осеммесечни женски мишки Blab/C (HSD) се разделят на 12 групи по 5 мишки. Преди третирането мишките се претеглят и се отделя кръв за СВС и серумни банки. Групи от 1 до 9 получават интраперитонеални инжекции (IP) само от носител (PBS) или човешки IgG-FC (контролен протеин) или TACI-FC4 (тест протеин) дневно за 12 дни и до загиването на 14“ ден. Групи 10 и 11 се инжектират с IP инжекции 3 пъти седмично за две седмици до загиване на 14ия ден.
Група (5 мишки всяка) Лечение Доза
1 Човешки TACI-FC4 200 mg
2 Човешки TACI-FC4 100 mg
3 Човешки TACI-FC4 20pg
4 Човешки TACI-FC4
5 Човешки FC4 200pg
108
6 Човешки FC4 100 mg
7 Човешки FC4 20 mg
8 Човешки FC4 5 mg
9 Носител Както е използван
10 Човешки TACI-FC4 100 mg
11 Човешки FC4 100 mg
12 Нетретирана контрола
Кръв се събира на 7мия и 12ия ден. Кръв и телесно тегло се събират по време на ефтаназията. Измерва се теглото на далака, тимуса и мозъка. Далакът и тимусът се разделят за FACS анализ и хистология. Кожа, далак, мезентерична LN верига, надмандибуларни слюнчени жлези, яйчници, матка, цервикален канал, пикочен мехур, мезентерична лимфно-възелна верига, чернодробен лоб с жлъчен мехур, сляпо и дебело черво, стомах, тънки черва, панкреас, десен бъбрек, надбъбречна жлеза, език с трахея и езофагос, сърце, тимус, бедрен мускул, лява и дясна бедрена кост и мозък също могат да бъдат събрани за хистологично изследване.
Както е описано по-горе в Пример 13, наблюдава се значително намаление в проценти на В клетките в периферни кръвни клетки, взети от всички TACI-FC4 третирани примери, в сравнение с тези, третирани с FC4 или PBS самостоятелно и анализирани чрез СВС или FACS на седмия ден (чрез СВС) и дванадесетия ден (като се използва FACS). Освен това има около 50% намаление на В клетки в далаци, взети от животни, третирани с TACI-FC4, в сравнение с тези от FC4- третирани мишки на четиринадесетия ден.
ПРИМЕР 15
Анти ds-DNA ELISA
Автоимунността се характеризира чрез високи нива на анти-удвоени верижни DNA антитела. За измерване на нивата на анти-dsDNA антитела в двете пре-експресиращи ztnnf4 трансгенни мишки и MZBW мишките е
109
проведено ELISA изследване. 96 гнездна микротитърна поставка (Nunc) се обвива с поли-Е-лизин (Sigma) (20 μΐ/ml в 0.1 М Tris буфер, pH 7.3) при 75р1/гнездо и инкубира една нощ при стайна температура. Поставките след това се промиват в dH2O и пълнят с поли dAdT (Sigma) (20 μΐ/ml в 0.1 М Tris буфер pH 7.3) при 75 μΐ/гнездо и инкубират при стайна температура за 60 мин., след което се промиват с dH2O и блокират с 2% BSA (Sigma) в Tris буфер за 30 минути при стайна температура, последвано от крайно промиване с dH2O.
Серумни примери се вземат от ztnf4 трансгенни мишки, описани в пример 10 и NZBW мишките, описани в пример 11. Серумните примери се разреждат 1:50 в 1% BSA/2% BGG (Calbiochem) в Tris буфер. Разредените примери след това се титрират в поставката при съотношения 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200 и 1:6400 (μΐ /гнездо) и инкубират за 90 минути при стайна температура.
След това поставките се промиват във dH2O и кози анти-миши IgG-FcHRP (Cappel) разреден до 1:1000 в 1% BSA/2%BGG и се добавя при 50ц1/гнездо. Поставките се инкубират за 60 минути при стайна температура и се промиват 5 пъти в dH2O и се обработват с OPD, една таблетка/10 мл и Novo D се поставят в ΙΟΟμΙ/гнездо. Обработката се стопира с IN H2SO4, ΙΟΟμΙ/гнездо и OD четене при 492nm.
Фигура 8 показва анти-ds DNA нива в две ztnf4 трансгенни мишки (23 седмична възраст), 2 не-трансгенни титърни двойки, сравнени с нивата, определени в серум от NZBWF1 (32 седмична възраст) и MRL///?r//pr (19 седмична възраст) мишки.
ПРИМЕР 16
Разтворим TACI-Ig в спонтанен модел на ELE
На 25 женски PLxSJL Fl мишки (12 седмична възраст, Jackson Labs) са поставени субкутанни инжекции от антиген (миелин протеолипиден протеин, PLP, остатъци 139-151), формулирани в пълен Freund’s адювант при доза 125μg/мишκa. Мишките са разделени на 5 групи по 5 мишки. Поставени са
110 интраперитонеални инжекции от пертусивен токсин (400ng) на нулевия и на втория ден. Групите получават еднократна, десетократна или стократна доза от TACI, ВСМА или BR43x2, една група получава само носител и една група не е третирана. Предпазваща терапия започва на 0 ден, интервенцията започва на 7 ден или при клинически симптом. Симптоми на заболяване, загуба на тегло и парализни прояви на приблизително 10-14 ден и накрая за около 1 седмица. Животните се изследват дневно чрез събиране на телесните тегла и
определяне на клиничния резултат, който съответства на усилването на техните симптоми. Клинични прояви на ЕАЕ се наблюдават на 10-14 ден от заразяването и продължават приблизително 1 седмица. В края на изследването всички животни се ефтанзират чрез свръх доза газ и загиват. Главният и гръбначният мозък се събират за хистология или се замразяват за mRNA анализ. Телесното тегло и данни от клинични резултати са отбелязани индивидуално и по групи.
Клиничен резултат
нормално слабо, опашният тонус може да бъде редуциран, но не отсъства опашен сегмент (не може да си вдигне опашката, когато мишката е поставена на основата на опашката) опашен сегмент, слаби крака (не може да си вдигне опашката, може да стои права върху задните крака, но краката са огънати) пареза (не може да стои с краката под тялото, пълзи с прострени назад крака) парализа (не може да мърда задните крака, влачи краката, когато се опитва да ходи) квадриплегия (парализа на предните крака или движение в кръг, може да има наклонена глава) агонизиращ (напълно парализирано, не може да достигне храна или вода, загиващо животно)
Ill
ПРИМЕР 17
TACI-FC и CIA модел за ревматоиден артрит
Осем седмични мъжка DBA/1J мишки (Jackson Labs) се разделят на групи по 5 мишки в група и получават две подкожни инжекции от 50-100 μΐ от 1мг/мл колаген (птичи или говежди източник) на 3 седмични интервали. Една контролна група не се инжектира. Първата инжекция се оформя в пълен адювант на Freund, а втората инжекция се оформя в непълен адювант на Freund. TACI-FC се прилага профилактично във или преди втората инжекция или след като животното проявява клиничен резултат от 2 или повече прояви поне след 24 часа. Животните започват да показват симптоми на артрит след втората колагенова инжекция, обикновено по време на 2-3 седмица. Продължителността на заболяването се оценява по всяка лапа чрез уред за измерване на дебелината на лапата и се отбелязва клиничния резултат (0-3) за всяка лапа. Клиничен резултат 0 означава нормален, 1 - възпалени пръсти, 2 леко възпаление на лапата, 3 - средно възпаление на лапа, 4 - силно възпаление на лапата. Животните се ефтанзират след като се установи болестта след определен период от време, обикновено 7 дни. Лапите се събират за хистология или mRNA анализ и серумът се събира за имуноглобулиново и цитокиново изследване.
ПРИМЕР 18
Неутрализиращи TACI антитела
Поликлонални анти-пептидни антитела се получават чрез имунизиране на два женски ново зеландски бели зайци с пептида или huztnf4-l SAGIAKLEEGPELQLAIPRE (SEQ ID N0:59) или huztnf4-2 SAGIAKLEEGPELQLAIPRE (SEQ ID N0:60). Пептидите са синтезирани чрез Приложен биосистемен модел 431А пептиден синтезатор (Applied Biosystems, Inc. Foster City, СА) съгласно инструкциите на производителя. Пептидите след това се конюгират към носител-протеинов ключов хемоцианин (KLH) с малеимид активация. На всеки от зайците се поставя начална
112 интраперитонеална (ip) инжекция от 200pg пептид в пълен Freund адювант, последвано от активиращи ip инжекции от 100 pg пептид в непълен Freund адювант всеки 3 седмици. Седем до десет дни след прилагането на втората активираща инжекция (три пълни инжекции) от животните се взема кръв и серумът се събира. След това животните се активират и се взема кръв на всеки три седмици.
ztnf4 пептид-специфични заешки серуми се охарактеризират чрез ELISA титърна проверка чрез lpg/ml от пептидите, използвани за получаване на антитялото (SEQ ID N0:59 и N0:60) като антитяло цел. Два заешки серума на huztnf4-l nenrafl(SEQ ID N0:59) имат титър към техния специфичен пептид при разреждане от 1: 1Е5 (1:100 000). Два заешки серума на huztnf4-2 пептид (SEQ ID N0:60) имат титър към техния специфичен пептид при разреждане от 1:5Е6 и към рекомбинантни с пълна дължина протеини (N-TepMHiiaji-FLAGтагов ztnf4, получен в бакуловирус (huztnf4-NF-Bv) и С-терминален FLAGтагов ztnf4q, получен в ВНК клетки) при разреждане 1:5Е6.
ztnf4-nennmH0 специфични поликлонални антитела са афинитетно пречистени от заешки серум чрез CNBR-SEPHAROSE 4В протеин колони (Pharmacia LKB), които са получени чрез lOmgs от специфичните пептиди (SEQ ID N0:59 или N0:60) за грам CNBr-SEPHAROSE, последвано от 20Х диализа в PBS за една нощ. Ztnf4 специфични антитела са охарактеризирани чрез ELISA титърна проверка, използвайки lpg/ml от подходящ пептиден антиген или рекомбинантен пълна дължина протеин (huztnf4-NF-Bv) като антитяло цели. Долната граница на откриване (LLD) на заешки aHTH-huztnf4-l афинитет пречистено антитяло върху неговият специфичен антиген (huztnf4-lпептид, SEQ ID N0:59) е с разреждане от 5ng/ml. Долната граница (LLD) на откриване на заешки aHTH-huztnf4-2 афинитет пречистено антитяло върху неговият специфичен антиген (huztnf4-2 пептид, SEQ ID N0:60) е с разреждане от 0.5 ng/ml. Долната граница на откриване (LLD) на заешки анти
113 huztnf4-l афинитет пречистено антитяло върху рекомбинантен протеин huztnf4-NF-Bv е с разреждане от 5 ng/ml.
Моноклонални антитела на мишки са получени и избрани за инхибиция от инхибиция на биотин белязан разтворим ztnf4. Никой от TACI монклоналните антитела (248.14, 248.23, 248.24 или 246.3) не блокира ztnf4 свързване върху ВСМА. Моноклонално 248.23 редуцира свързване на 10 ng/ml ztnf4-6HOTHH до около 50%, когато средата е разредена до 1:243 и намалява свързване до около два пъти в неразредена среда. Моноклонално 246.3 редуцира свързване на 10ng/ml ztnf4-6noTHH към около 50% между 1:243 и
1:181 разреждане на установена среда и намалява свързване пет пъти в неразредена среда.
От изложеното по-горе е ясно, че въпреки специфичните изпълнения на изобретението, описани тук като илюстрация, различни модификации могат да бъдат направени без отклонение от смисъла и обхвата на изобретението, с които то не се ограничава, освен чрез патентните претенции.

Claims (9)

  1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ
    1. Метод за инхибиране ztnf4 активност в бозайници, включващ прилагане върху бозайниците на количество от съединение, избрано от групата, съдържаща:
    а) полипетид, съдържащ извънклетъчен домен на BR43x2;
    б) полипетид, съдържащ извънклетъчен домен на TACI;
    в) полипетид, съдържащ извънклетъчен домен на ВСМА;
    г) полипетид, съдържащ последователността SEQ ID N0:10;
    д) антитяло или антитяло фрагмент, който свързва специфично към полипептид на SEQ ID N0:2;
    е) антитяло или антитяло фрагмент, който свързва специфично към полипептид на SEQ ID N0:4;
    ж) антитяло или антитяло фрагмент, който свързва специфично към полипептид на SEQ ID N0:6;
    з) антитяло или антитяло фрагмент, който свързва специфично към полипептид на SEQ ID N0:8;
    и) антитяло или антитяло фрагмент, който свързва специфично към полипептид на SEQ ID N0:10;
    к) полипептид на SEQ ID N0:4;
    л) амино киселинни остатъци 1-166 на SEQ ID N0:6 и
    м) амино киселинни остатъци 1-150 на SEQ ID N0:8.
  2. 2. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че съединението е смесен протеин, съдържащ първа част и втора част, присъединени чрез пептидна връзка, като първата част съдържа полипептид, избран от групата, съдържаща:
    а) полипептид, съдържащ последователността SEQ ID N0:8;
    б) полипептид, съдържащ амино киселинни остатъци 25-58 на SEQ ID
    N0:2;
    в) полипептид, съдържащ амино киселинни остатъци 34-66 на SEQ ID N0:6;
    г) полипептид, съдържащ амино киселинни остатъци 71-104 на SEQ ID N0:6;
    д) полипептид, съдържащ амино киселинни остатъци 25-104 на SEQ ID N0:6;
    е) полипептид, съдържащ амино киселинни остатъци 8-37 на SEQ ID
    Ф N0:8;
    ж) полипептид, съдържащ амино киселинни остатъци 41-88 на SEQ ID N0:8;
    з) полипептид, съдържащ амино киселинни остатъци 8-88 на SEQ ID N0:8; и втората част, съдържаща друг полипептид.
  3. 3. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че първата част съдържа допълнително полипептид, избран от групата, съдържаща :
    а) амино киселинни остатъци 59-120 на SEQ ID N0:2;
    б) амино киселинни остатъци 105-166 на SEQ ID N0:6; и
    в) амино киселинни остатъци 89-150 на SEQ ID N0:8.
  4. 4. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че първата част е избрана от групата, съдържаща :
    а) полипетид, съдържащ извънклетъчен домен на BR43x2;
    б) полипетид, съдържащ извънклетъчен домен на TACI; и
    в) полипетид, съдържащ извънклетъчен домен на ВСМА.
  5. 5. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че първата част е избрана от групата, съдържаща:
    а) полипептид на SEQ ID N0:4;
    б) амино киселинни остатъци 1-154 на SEQ ID N0:6 и
    в) амино киселинни остатъци 1-48 на SEQ ID N0:8.
  6. 6. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че втората част е имуноглобулинов тежко верижен постоянен регион.
  7. 7. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че антитялото или антитяло- фрагментът е избран от групата, съдържаща:
    а) поликлонално антитяло;
    б) муриново моноклонално антитяло;
    в) хуманизирано антитяло, получено от б); и
    г) човешко моноклонално антитяло.
  8. 8. Метод съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че антитяло фрагмента е избран от групата, съдържаща F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv и минимално различаващ се участък.
  9. 9. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че бозайникът е примат.
    10. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с В лимфоцити. 11. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с активирани В лимфоцити. 12. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с остатъци на В лимфоцити. 13. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с антитяло продукция. 14. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че антитяло продукцията е свързана с автоимунното заболяване.
    15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че автоимунното заболяване е системен лупус еритроматозис, миастения гравис, мултиплетна склероза или ревматоиден артрит.
    16. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с астма, бронхит или емфизем.
    з
    17. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с краен стадий бъбречна недостатъчност.
    18. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с бъбречно заболяване.
    19. Метод съгласно претенция 18, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с глумерулонефрит, васкулит, нефрит или пиелонефрит.
    20. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с бъбречни неоплазми, мултиплетни миеломи, лимфоми, леко верижна невропатия или амилоидоза.
    21. Метод съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с ефекгорни Т клетки.
    22. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с умерен имунен отговор.
    23. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с имуносупресия.
    24. Метод съгласно претенция 21, характеризиращ се с това, че имуносупресията е свързана с трансплантационно отхвърляне, трансплантационно обратно гостоприемниково заболяване или възпаление.
    25. Метод съгласно претенция 24, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с автоимунни заболявания.
    26. Метод съгласно претенция 25, характеризиращ се с това, че автоимунното заболяване е инсулин зависим диабетен мелитус или болест на Крон.
    27. Метод съгласно претенция 26, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с възпаление.
    28. Метод съгласно претенция 27, характеризиращ се с това, че възпалението е свързано със ставна болка, гълтане, анемия, или септичен шок.
    29. Метод за инхибиране на BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лиганд образувание, включващо прилагане на количество от съединение, избрано от групата, съдържаща:
    а) полипетид, съдържащ извънклетъчен домен на BR43x2;
    б) полипетид, съдържащ извънклетъчен домен на TACI; и
    в) полипетид, съдържащ извънклетъчен домен на ВСМА.
    г) полипетид, съдържащ последователността SEQ ID N0:10;
    д) антитяло или антитяло фрагмент, който свързва специфично към полипептид на SEQ ID N0:2;
    е) антитяло или антитяло фрагмент, който свързва специфично към полипептид на SEQ ID N0:4;
    ж) антитяло или антитяло фрагмент, който свързва специфично към полипептид на SEQ ID N0:6;
    з) антитяло или антитяло фрагмент, който свързва специфично към полипептид на SEQ ID N0:8;
    и) антитяло или антитяло фрагмент, който свързва специфично към полипептид на SEQ ID N0:10;
    к) антитяло или антитяло фрагмент, който свързва специфично към полипептид на SEQ ID N0:18;
    л) антитяло или антитяло фрагмент, който свързва специфично към полипептид на SEQ ID N0:20;
    м) полипептид на SEQ ID N0:4;
    н) амино киселинни остатъци 1-166 на SEQ ID N0:6 и
    о) амино киселинни остатъци 1-150 на SEQ ID N0:8.
    30. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че съединението е смесен протеин, съдържащ първа част и втора част, присъединени чрез пептидна връзка, като първата част съдържа полипептид, избран от групата, съдържаща :
    а) полипептид, съдържащ последователността SEQ ID N0:8;
    б) полипептид, съдържащ амино киселинни остатъци 25-58 на SEQ ID N0:2;
    в) полипептид, съдържащ амино киселинни остатъци 34-66 на SEQ ID N0:6;
    г) полипептид, съдържащ амино киселинни остатъци 71-104 на SEQ ID N0:6;
    д) полипептид, съдържащ амино киселинни остатъци 25-104 на SEQ ID N0:6;
    е) полипептид, съдържащ амино киселинни остатъци 8-37 на SEQ ID N0:8;
    ж) полипептид, съдържащ амино киселинни остатъци 41-88 на SEQ ID N0:8;
    з) полипептид, съдържащ амино киселинни остатъци 8-88 на SEQ ID N0:8; и втората част, съдържаща друг полипептид.
    31. Метод съгласно претенция 30, характеризиращ се с това, че първата част допълнително съдържа полипептид, избран от групата съдържаща:
    а) амино киселинни остатъци 59-120 на SEQ ID N0:2;
    б) амино киселинни остатъци 105-166 на SEQ ID N0:6; и
    в) амино киселинни остатъци 89-150 на SEQ ID N0:8.
    32. Метод съгласно претенция 30, характеризиращ се с това, че първата част е избрана от групата, съдържаща:
    а) полипетид, съдържащ извънклетъчен домен на BR43x2;
    б) полипетид, съдържащ извънклетъчен домен на TACI; и
    в) полипетид, съдържащ извънклетъчен домен на ВСМА
    33. Метод съгласно претенция 30, характеризиращ се с това, че първата част е избрана от групата, съдържаща :
    а) полипептид на SEQ ID N0:4;
    б) амино киселинни остатъци 1-154 на SEQ ID N0:6 и
    в)аминокиселинни остатъци 1-48 на SEQ ID N0:8.
    34. Метод съгласно претенция 30, характеризиращ се с това, че втората част е имуноглобулинов тежко верижен постоянен регион.
    35. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че антитялото или антитяло- фрагментът е избрано от групата, съдържаща :
    а) поликлонално антитяло;
    б) муриново моноклонално антитяло;
    в) хуманизирано антитяло, получено от б); и
    г) човешко моноклонално антитяло.
    36. Метод съгласно претенция 35, характеризиращ се с това, че антитяло фрагментът е избран от групата, съдържаща F(ab'), F(ab), Fab', Fab, Fv, scFv и минимално различаващ се участък.
    37. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лиганд образуванието е свързано с В лимфоцити.
    38. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лиганд образуванието е свързано с активирани В лимфоцити.
    39. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лиганд образуванието е свързано с остатаци на В лимфоцити.
    40. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лиганд образуванието е свързано с антитяло продукция.
    41. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че антитяло продукцията е свързана с автоимунно заболяване.
    42. Метод съгласно претенция 41, характеризиращ се с това, че автоимунното заболяване е системен лупус еритроматозис, миастения гравис, мултиплетна склероза или ревматоиден артрит.
    Ί
    43. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лиганд образуванието е свързано с астма, бронхит или емфизем.
    44. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лиганд образуванието е свързано с краен стадий бъбречна недостатъчност.
    45. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лиганд образуванието е свързан с бъбречно заболяване.
    46. Метод съгласно претенция 45, характеризиращ се с това, BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лиганд образуванието е свързан с глумерулонефрит, васкулит, нефрит или пиелонефрит.
    47. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, че ztnf4 активността е свързана с бъбречни неоплазми, мултиплетни миеломи, лимфоми, леко верижна неуропатия или амилоидоза.
    48. Метод съгласно претенция 29, характеризиращ се с това, BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лиганд образуванието е свързан с ефекторни Т клетки.
    49. Метод съгласно претенция 48, характеризиращ се с това, че BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лиганд образуванието е свързан с регулиране на имунен отговор.
    50. Метод съгласно претенция 49, характеризиращ се с това, че рецепторлиганд образуванието е свързан с имуносупресия.
    51. Метод съгласно претенция 50, характеризиращ се с това, че имуносупресията е свързана с трансплантационно отхвърляне, трансплантационно обратно гостоприемниково заболяване или възпаление.
    52. Метод съгласно претенция 50, характеризиращ се с това, че рецепторлиганд образуванието е свързано с автоимунни заболявания.
    53. Метод съгласно претенция 52, характеризиращ се с това, че автоимунното заболяване е инсулин зависим диабетен мелитус или болест на Крон.
    54. Метод съгласно претенция 50, характеризиращ се с това, че BR43x2, TACI или ВСМА рецептор-лиганд образуванието е свързано с възпаление.
    55. Метод съгласно претенция 54, характеризиращ се с това, че възпалението е свързано със ставна болка, гълтане, анемия, или септичен шок.
    56. Изолирана полинуклеотидна молекула, кодираща полипептид на SEQ ID NO: 2.
    57. Изолирана полинуклеотидна молекула, кодираща полипептид на SEQ ID NO: 1
    58. Експресионен вектор, съдържащ следните оперативно свързани елементи:
    транскрипционен промотер;
    полинуклеотидна молекула, съгласно претенция 56; и транскрипционен терминатор.
    59. Културална клетка, в която е въведен експресионен вектор, съгласно претенция 58, характеризираща се с това, че културалната клетка експресира полипептида, кодиран чрез полинуклеотиден сегмент.
    60. Метод за получаване на полипептид, съдържащ:
    културиране на клетка, в която е въведен експресионен вектор съгласно претенция 58, характеризиращ се с това, че клетката експресира полипептида, кодиран чрез полинуклеотидната молекула; и възстановяване на експресирания полипептид.
    61. Изолиран полипептид с последователност SEQ ID NO: 2.
    62. Полипептид съгласно претенция 61, характеризиращ се с това, че е в комбинация с фармацевтично приемлив носител.
BG105674A 1999-01-07 2001-07-05 Разтворим рецептор br43x2 и методи за използването му BG65603B1 (bg)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22653399A 1999-01-07 1999-01-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
BG105674A true BG105674A (bg) 2002-03-29
BG65603B1 BG65603B1 (bg) 2009-02-27

Family

ID=22849300

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BG105674A BG65603B1 (bg) 1999-01-07 2001-07-05 Разтворим рецептор br43x2 и методи за използването му

Country Status (29)

Country Link
EP (5) EP1141274B2 (bg)
JP (2) JP5021117B2 (bg)
KR (1) KR100699524B1 (bg)
CN (2) CN1342202A (bg)
AT (3) ATE437227T1 (bg)
AU (1) AU780805B2 (bg)
BG (1) BG65603B1 (bg)
BR (1) BR0007423A (bg)
CA (2) CA2753331A1 (bg)
CY (1) CY1109977T1 (bg)
CZ (1) CZ303272B6 (bg)
DE (3) DE60042617D1 (bg)
DK (3) DK1642972T3 (bg)
EA (1) EA007471B1 (bg)
EE (2) EE05460B1 (bg)
ES (3) ES2204502T5 (bg)
HK (1) HK1041497B (bg)
HU (1) HU230024B1 (bg)
IL (2) IL144029A0 (bg)
NO (2) NO331902B1 (bg)
NZ (1) NZ512753A (bg)
PL (3) PL211033B1 (bg)
PT (2) PT1642972E (bg)
SI (1) SI1642972T1 (bg)
SK (1) SK288176B6 (bg)
TR (1) TR200101998T2 (bg)
UA (1) UA74330C2 (bg)
WO (1) WO2000040716A2 (bg)
ZA (1) ZA200105288B (bg)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8212004B2 (en) 1999-03-02 2012-07-03 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha fusion proteins
US6689579B1 (en) 1996-10-25 2004-02-10 Human Genome Sciences, Inc. Polynucleotides encoding neutrokine-α
US6812327B1 (en) 1996-10-25 2004-11-02 Human Genome Sciences, Inc. Neutrokine-alpha polypeptides
US6503184B1 (en) 1997-10-21 2003-01-07 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor necrosis factor receptor-like proteins TR11, TR11SV1 and TR11SV2
US6689607B2 (en) 1997-10-21 2004-02-10 Human Genome Sciences, Inc. Human tumor, necrosis factor receptor-like proteins TR11, TR11SV1 and TR11SV2
US7488590B2 (en) 1998-10-23 2009-02-10 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US7833529B1 (en) 1999-01-07 2010-11-16 Zymogenetics, Inc. Methods for inhibiting B lymphocyte proliferation with soluble ztnf4 receptor
ATE437227T1 (de) * 1999-01-07 2009-08-15 Zymogenetics Inc Verfahren zur therapeutischen verwendung von löslichen rezeptoren br43x2
US20030095967A1 (en) 1999-01-25 2003-05-22 Mackay Fabienne BAFF, inhibitors thereof and their use in the modulation of B-cell response and treatment of autoimmune disorders
CZ299819B6 (cs) 1999-01-25 2008-12-03 Biogen Idec Ma Inc. Farmaceutické kompozice obsahující protilátky specifické pro rozpustný BAFF
US20030022233A1 (en) 1999-04-30 2003-01-30 Raymond G. Goodwin Methods of use of the taci/taci-l interaction
AU4986700A (en) 1999-05-06 2000-11-21 National Jewish Medical And Research Center Tall-1 nucleic acid molecules, proteins, receptors and methods of use thereof
EE05673B1 (et) * 1999-08-17 2013-08-15 Biogen, Inc. BAFF-retseptor (BCMA), immunoregulatoorne agens
UA74798C2 (uk) * 1999-10-06 2006-02-15 Байоджен Айдек Ма Інк. Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами
AU3695801A (en) * 2000-02-11 2001-11-20 Amgen, Inc. Receptor from tnf family
US20040002068A1 (en) * 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US6969519B2 (en) 2000-03-10 2005-11-29 Human Genome Sciences, Inc. Methods of using an agonistic antibody human tumor necrosis factor receptor (TR17)
CA2404945C (en) * 2000-04-27 2010-02-09 Biogen, Inc. Taci as an anti-tumor agent
EP1746106A3 (en) * 2000-04-27 2007-03-14 Biogen Idec MA Inc. Use of TACI as an anti-tumor agent
US7371388B1 (en) 2000-05-04 2008-05-13 Human Genome Sciences, Inc. Treatment of Sjogren's syndrome by administration of TR18 polypeptides
MXPA02011130A (es) * 2000-05-12 2003-03-10 Amgen Inc Metodos y composiciones de materia que se refieren a april/g70, bcma, blys/agp-3, y taci.
US7220840B2 (en) 2000-06-16 2007-05-22 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator protein
NZ522700A (en) * 2000-06-16 2006-02-24 Human Genome Sciences Inc Antibodies that immunospecifically bind to blys
US7879328B2 (en) 2000-06-16 2011-02-01 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies that immunospecifically bind to B lymphocyte stimulator
WO2002016411A2 (en) 2000-08-18 2002-02-28 Human Genome Sciences, Inc. Binding polypeptides and methods based thereon
DE60140773D1 (de) * 2000-08-18 2010-01-21 Dyax Corp Polypeptide zur Bindung an das B-Lymphozyten-stimulatorische Protein (BLyS)
UA83458C2 (uk) 2000-09-18 2008-07-25 Байоджен Айдек Ма Інк. Виділений поліпептид baff-r (рецептор фактора активації в-клітин сімейства tnf)
AU2002215753A1 (en) * 2000-12-07 2002-06-18 The University Of British Columbia Caml-binding peptides
EP2301971A1 (en) * 2001-02-20 2011-03-30 ZymoGenetics, L.L.C. Antibodies that bind both BCMA and TACI
CA2446189C (en) 2001-05-11 2011-10-18 Amgen, Inc. Peptides and related molecules that bind to tall-1
RS20120253A1 (en) 2001-05-24 2013-02-28 Zymogenetics Inc. TACI-IMUNOGLOBULINSKI PROTEIN FUNCTIONS
CN1636067A (zh) * 2001-08-03 2005-07-06 杰南技术公司 TACls和BR3多肽及其用途
WO2003013582A1 (en) * 2001-08-06 2003-02-20 Genset S.A. Genoxit agonists and antagonists for use in the treatment of metabolic disorders
WO2003045421A1 (en) * 2001-11-28 2003-06-05 Genset S.A. Agonists and antagonists of ryzn for the treatment of metabolic disorders
AU2004233164B2 (en) 2003-03-28 2009-10-08 Biogen Ma Inc. Truncated BAFF receptors
PT2272868E (pt) 2003-06-05 2015-07-07 Genentech Inc Terapêutica de combinação para distúrbios de células b
CA2554526A1 (en) 2004-01-29 2005-08-18 Genentech, Inc. Variants of the extracellular domain of bcma and uses thereof
JP4940136B2 (ja) * 2004-06-28 2012-05-30 イエダ リサーチ アンド ディベロップメント カンパニー リミテッド キメラタンパク質およびその使用
WO2006067210A1 (en) 2004-12-23 2006-06-29 Laboratoires Serono S.A. Bcma polypeptides and uses thereof
CA2618763A1 (en) 2005-08-09 2007-02-15 Zymogenetics, Inc. Methods for the treatment and prevention of abnormal cell proliferation using taci-fusion molecules
EA016083B1 (ru) 2005-08-09 2012-02-28 Займоджинетикс, Инк. СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ НЕХОДЖКИНСКОЙ ЛИМФОМЫ С ПОМОЩЬЮ СЛИТОЙ МОЛЕКУЛЫ TACI-Ig
US9168286B2 (en) 2005-10-13 2015-10-27 Human Genome Sciences, Inc. Methods and compositions for use in treatment of patients with autoantibody positive disease
WO2007142667A2 (en) * 2005-10-13 2007-12-13 Human Genome Sciences, Inc. Treatment of patients with autoantibody positive disease
MY149159A (en) 2005-11-15 2013-07-31 Hoffmann La Roche Method for treating joint damage
WO2007062090A2 (en) 2005-11-23 2007-05-31 Genentech, Inc. Methods and compositions related to b cell assays
WO2007123765A2 (en) 2006-03-31 2007-11-01 Human Genome Sciences Inc. Neutrokine-alpha and neutrokine-alpha splice variant
MX2008014365A (es) 2006-05-15 2008-11-27 Ares Trading Sa Metodos para tratar enfermedades autoinmunitarias utilizando una molecula de fusion del activador de transmembrana-inmunoglobulina.
PT2061803T (pt) 2006-08-28 2019-11-21 Ares Trading Sa Processo de purificação de proteinas contendo fc
ATE509107T1 (de) 2007-01-26 2011-05-15 Merck Serono Sa Aufreinigung von fc-tact-fusionsproteinen unter verwendung der ölkörper-technik
WO2009052293A1 (en) 2007-10-16 2009-04-23 Zymogenetics, Inc. Combination of blys inhibition and anti-cd 20 agents for treatment of autoimmune disease
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
JP6061469B2 (ja) 2009-03-10 2017-01-25 バイオジェン・エムエイ・インコーポレイテッドＢｉｏｇｅｎ ＭＡ Ｉｎｃ． 抗ｂｃｍａ抗体
IN2012DN02485A (bg) 2009-09-03 2015-08-28 Hoffmann La Roche
WO2011109280A1 (en) 2010-03-05 2011-09-09 Lerner Research Institute Methods and compositions to treat immune-mediated disorders
EP3974453A3 (en) 2010-11-16 2022-08-03 Amgen Inc. Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
JP6271254B2 (ja) 2011-02-28 2018-01-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｂ細胞アンタゴニストに対する生物学的マーカー及び応答を予測するための方法
UA112434C2 (uk) 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
MX2014009043A (es) 2012-01-31 2014-10-14 Genentech Inc Anticuerpos anti-ige y sus metodos de uso.
TW201425336A (zh) * 2012-12-07 2014-07-01 Amgen Inc Ｂｃｍａ抗原結合蛋白質
PL2953972T3 (pl) 2013-02-05 2021-03-08 Engmab Sàrl Metoda wyboru przeciwciał przeciwko bcma
JOP20140087B1 (ar) 2013-03-13 2021-08-17 Amgen Inc بروتينات مخصصة ل baff و b7rp1 وإستخداماتها
US9458246B2 (en) 2013-03-13 2016-10-04 Amgen Inc. Proteins specific for BAFF and B7RP1
DK3126383T3 (en) 2014-04-03 2019-04-01 Igm Biosciences Inc MODIFIED J-CHAIN
JP7179464B2 (ja) 2015-01-20 2022-11-29 アイジーエム バイオサイエンシズ インコーポレイテッド 腫瘍壊死因子 （ｔｎｆ） スーパーファミリー受容体結合分子およびその使用
AU2016329197B2 (en) 2015-09-30 2021-01-21 Igm Biosciences, Inc. Binding molecules with modified J-chain
DK3356401T3 (da) 2015-09-30 2020-09-07 Igm Biosciences Inc Bindingsmolekyler med modificeret j-kæde
KR20190053835A (ko) 2016-06-21 2019-05-20 테네오바이오, 인코포레이티드 Cd3 결합 항체
WO2018052503A1 (en) 2016-09-14 2018-03-22 Teneobio, Inc. Cd3 binding antibodies
MX2019004621A (es) 2016-11-02 2019-11-28 Engmab Sarl Anticuerpo biespecifico contra bcma y cd3 y un farmaco inmunologico para uso combinado en el tratamiento del mieloma multiple.
JP7254699B2 (ja) 2016-12-21 2023-04-10 テネオバイオ， インコーポレイテッド 抗ｂｃｍａ重鎖のみ抗体
EP3596100A4 (en) * 2017-03-15 2021-01-13 Juneau Biosciences, L.L.C. METHODS OF USING GENETIC MARKERS ASSOCIATED WITH ENDOMETRIOSIS
KR20200018498A (ko) 2017-06-20 2020-02-19 테네오바이오, 인코포레이티드 항-bcma 중쇄-단독 항체
CA3098420A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Novartis Ag Binding molecules against bcma and uses thereof
CN111944047B (zh) * 2019-05-15 2022-04-08 重庆精准生物技术有限公司 抗bcma的人源化单链抗体及应用
AR119746A1 (es) 2019-06-14 2022-01-05 Teneobio Inc Anticuerpos multiespecíficos de cadena pesada que se unen a cd22 y cd3
CN115894703A (zh) 2020-04-29 2023-04-04 特尼奥生物股份有限公司 具有经修饰重链恒定区的多特异性重链抗体
CN116903727A (zh) 2020-05-08 2023-10-20 高山免疫科学股份有限公司 具有和不具有t细胞抑制蛋白的april和baff抑制性免疫调节蛋白及其使用方法
US20230303665A1 (en) 2020-08-28 2023-09-28 Sana Biotechnology, Inc. Modified anti-viral binding agents
KR20240019124A (ko) 2021-05-07 2024-02-14 알파인 이뮨 사이언시즈, 인코포레이티드 Taci-fc 융합 면역조절 단백질의 투여 및 치료 방법
WO2024077018A2 (en) 2022-10-04 2024-04-11 Alpine Immune Sciences, Inc. Methods and uses of taci-fc fusion immunomodulatory protein

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4331647A (en) 1980-03-03 1982-05-25 Goldenberg Milton David Tumor localization and therapy with labeled antibody fragments specific to tumor-associated markers
US4615974A (en) 1981-08-25 1986-10-07 Celltech Limited Yeast expression vectors
US4579821A (en) 1981-11-23 1986-04-01 University Patents, Inc. Control of DNA sequence transcription
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US4486533A (en) 1982-09-02 1984-12-04 St. Louis University Filamentous fungi functional replicating extrachromosomal element
US4599311A (en) 1982-08-13 1986-07-08 Kawasaki Glenn H Glycolytic promotersfor regulated protein expression: protease inhibitor
US4977092A (en) 1985-06-26 1990-12-11 Amgen Expression of exogenous polypeptides and polypeptide products including hepatitis B surface antigen in yeast cells
US4601978A (en) 1982-11-24 1986-07-22 The Regents Of The University Of California Mammalian metallothionein promoter system
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
US4661454A (en) 1983-02-28 1987-04-28 Collaborative Research, Inc. GAL1 yeast promoter linked to non galactokinase gene
US5139936A (en) 1983-02-28 1992-08-18 Collaborative Research, Inc. Use of the GAL1 yeast promoter
US4870008A (en) 1983-08-12 1989-09-26 Chiron Corporation Secretory expression in eukaryotes
US4931373A (en) 1984-05-25 1990-06-05 Zymogenetics, Inc. Stable DNA constructs for expression of α-1 antitrypsin
US4766073A (en) 1985-02-25 1988-08-23 Zymogenetics Inc. Expression of biologically active PDGF analogs in eucaryotic cells
ATE54167T1 (de) 1984-12-06 1990-07-15 Fina Research Promotoren fuer die expression von fremden genen in hefe, plasmide, die diese promotoren enthalten, sowie deren verwendung zur herstellung von polypeptiden.
GR860984B (en) 1985-04-17 1986-08-18 Zymogenetics Inc Expression of factor vii and ix activities in mammalian cells
US4882279A (en) 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4935349A (en) 1986-01-17 1990-06-19 Zymogenetics, Inc. Expression of higher eucaryotic genes in aspergillus
GB8611832D0 (en) 1986-05-15 1986-06-25 Holland I B Polypeptide
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5063154A (en) 1987-06-24 1991-11-05 Whitehead Institute For Biomedical Research Pheromone - inducible yeast promoter
US5637677A (en) 1987-07-16 1997-06-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Biologically active compounds and methods of constructing and using the same
EP0325224B1 (en) 1988-01-22 1996-07-31 ZymoGenetics, Inc. Methods of producing secreted receptor analogs
US5567584A (en) 1988-01-22 1996-10-22 Zymogenetics, Inc. Methods of using biologically active dimerized polypeptide fusions to detect PDGF
US4956288A (en) 1988-04-22 1990-09-11 Biogen, Inc. Method for producing cells containing stably integrated foreign DNA at a high copy number, the cells produced by this method, and the use of these cells to produce the polypeptides coded for by the foreign DNA
US5037743A (en) 1988-08-05 1991-08-06 Zymogenetics, Inc. BAR1 secretion signal
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5162228A (en) 1988-12-28 1992-11-10 Takeda Chemical Industries, Ltd. Gylceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and promoter
US5162222A (en) 1989-07-07 1992-11-10 Guarino Linda A Use of baculovirus early promoters for expression of foreign genes in stably transformed insect cells or recombinant baculoviruses
ATE149841T1 (de) 1990-01-26 1997-03-15 Immunomedics Inc Impfstoffe gegen krebs und infektionskrankheiten
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
US5208146A (en) 1990-11-05 1993-05-04 The Regents Of The University Of California Murine monoclonal anti-idiotype antibodies
US5686272A (en) 1992-05-29 1997-11-11 Abbott Laboratories Amplification of RNA sequences using the ligase chain reaction
CA2144651A1 (en) 1992-09-14 1994-03-31 Timothy J. Miller Immortalized cells and uses therefor
US6117679A (en) 1994-02-17 2000-09-12 Maxygen, Inc. Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination
EP0862640A2 (en) 1995-11-09 1998-09-09 ZymoGenetics, Inc. Production of gad65 in methylotrophic yeast
US5716808A (en) 1995-11-09 1998-02-10 Zymogenetics, Inc. Genetic engineering of pichia methanolica
WO1998002536A2 (en) 1996-07-17 1998-01-22 Zymogenetics, Inc. Preparation of pichia methanolica auxotrophic mutants
US5736383A (en) 1996-08-26 1998-04-07 Zymogenetics, Inc. Preparation of Pichia methanolica auxotrophic mutants
IL128073A0 (en) 1996-07-17 1999-11-30 Zymogenetics Inc Transformation of pichia methanolica
ATE302272T1 (de) * 1996-10-25 2005-09-15 Human Genome Sciences Inc Neutrokin alpha
US5969102A (en) 1997-03-03 1999-10-19 St. Jude Children's Research Hospital Lymphocyte surface receptor that binds CAML, nucleic acids encoding the same and methods of use thereof
CA2232743A1 (en) * 1997-04-02 1998-10-02 Smithkline Beecham Corporation A tnf homologue, tl5
JP2002504818A (ja) * 1997-06-06 2002-02-12 リジェネロン ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド リガンドファミリーのｎｔｎ−２メンバー
IL133316A0 (en) * 1997-06-06 2001-04-30 Regeneron Pharma Ntn-2 member of tnf ligand family
ATE437227T1 (de) * 1999-01-07 2009-08-15 Zymogenetics Inc Verfahren zur therapeutischen verwendung von löslichen rezeptoren br43x2

Also Published As

Publication number Publication date
KR100699524B1 (ko) 2007-03-23
SK9712001A3 (en) 2002-02-05
DE60005135D1 (de) 2003-10-16
DE60005135T3 (de) 2015-04-09
HU230024B1 (hu) 2015-05-28
UA74330C2 (uk) 2005-12-15
ATE249517T1 (de) 2003-09-15
WO2000040716A2 (en) 2000-07-13
PT1642972E (pt) 2010-04-07
JP2003525861A (ja) 2003-09-02
DK1141274T4 (en) 2015-01-19
ES2204502T3 (es) 2004-05-01
SK288176B6 (sk) 2014-04-02
EA200100621A1 (ru) 2002-04-25
KR20010105322A (ko) 2001-11-28
JP5021117B2 (ja) 2012-09-05
EP1141274B1 (en) 2003-09-10
CN101518648A (zh) 2009-09-02
ES2329254T3 (es) 2009-11-24
IL144029A (en) 2009-11-18
NZ512753A (en) 2003-10-31
SI1642972T1 (sl) 2010-05-31
EP1642972A1 (en) 2006-04-05
JP2012001550A (ja) 2012-01-05
EE05539B1 (et) 2012-04-16
BR0007423A (pt) 2002-01-22
DE60043626D1 (de) 2010-02-11
EA007471B1 (ru) 2006-10-27
CN1342202A (zh) 2002-03-27
EE200100360A (et) 2002-12-16
ATE437227T1 (de) 2009-08-15
CA2753331A1 (en) 2000-07-13
DK1642972T3 (da) 2010-05-10
DK1141274T3 (da) 2003-12-29
ATE453712T1 (de) 2010-01-15
PL364817A1 (en) 2004-12-13
DK1642973T3 (da) 2009-11-02
HK1041497B (zh) 2004-06-18
PT1141274E (pt) 2004-02-27
WO2000040716A3 (en) 2000-09-21
NO20013316L (no) 2001-09-06
EP1141274B2 (en) 2014-11-12
NO20013316D0 (no) 2001-07-04
BG65603B1 (bg) 2009-02-27
TR200101998T2 (tr) 2002-06-21
EE201100048A (et) 2011-10-17
EP1642973A1 (en) 2006-04-05
IL144029A0 (en) 2002-04-21
ES2338661T3 (es) 2010-05-11
EP2256199A1 (en) 2010-12-01
DE60005135T2 (de) 2004-07-15
AU2408400A (en) 2000-07-24
PL211033B1 (pl) 2012-04-30
HUP0200429A2 (en) 2002-06-29
EP1642973B1 (en) 2009-07-22
CY1109977T1 (el) 2014-09-10
DE60042617D1 (de) 2009-09-03
NO331902B1 (no) 2012-04-30
HK1041497A1 (en) 2002-07-12
EP1141274A2 (en) 2001-10-10
EE05460B1 (et) 2011-08-15
PL393286A1 (pl) 2011-06-06
ZA200105288B (en) 2002-06-26
CA2358520C (en) 2011-12-13
CA2358520A1 (en) 2000-07-13
ES2204502T5 (es) 2015-01-21
NO20111595L (no) 2001-09-06
CZ20012465A3 (cs) 2002-03-13
PL209535B1 (pl) 2011-09-30
EP1354598A3 (en) 2003-11-19
EP1642972B1 (en) 2009-12-30
EP1354598A2 (en) 2003-10-22
CZ303272B6 (cs) 2012-07-11
NO333915B1 (no) 2013-10-21
AU780805B2 (en) 2005-04-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
BG105674A (bg) Разтворим рецептор br43x2 и методи за използването му
US7772365B2 (en) Soluble receptor BR43x2
US20060067933A1 (en) Soluble receptor BR43x2 and methods of using
AU2005200008B2 (en) Soluble receptor BR43x2 and methods of using
MXPA01006938A (en) SOLUBLE RECEPTOR BR43x2 AND METHODS OF USING
CA2548769A1 (en) Ztnf 12, a tumor necrosis factor