MX2014009043A

MX2014009043A - Anticuerpos anti-ige y sus metodos de uso.

Info

Publication number: MX2014009043A
Application number: MX2014009043A
Authority: MX
Inventors: Heleen Scheerens; Jeffrey Mark Harris; John Matthews; Wendy Sue Putnam; X Charlene Liao
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2012-01-31
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2014-10-14
Also published as: AR091305A1; EP2809684A1; CA2863066A1; JP2015506950A; SG11201404486QA; US20130243750A1; BR112014018471A2; WO2013116287A1; IL233757A0; TW201334789A; KR20140119777A; AU2013215332A1

Abstract

Esta invención provee anticuerpos anti-IgE que se unen al segmento M1' de una IgE humana y a su uso en el tratamiento y la prevención de trastornos mediados por IgE, así como también a kits que comprenden los anticuerpos anti-IgE.

Description

ANTICUERPOS ANTI-IGE Y SUS MÉTODOS DE USO REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES DE PATENTES RELACIONADAS Esta solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud provisoria U.S. serie no. 61/593.282, presentada el 31 de enero de 2012, la solicitud provisoria U.S. serie no. 61/613.434, presentada el 20 de marzo de 2012, la solicitud provisoria U.S. serie no. 61/621.453, presentada el 6 de abril de 2012 y la solicitud provisoria U.S. serie no. 61/635.253, presentada el 18 de abril de 2012, todas las cuales se incorporan a la presente por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a anticuerpos anti-lgE que se unen al segmento MT de una IgE humana y a su uso en el tratamiento y la prevención de trastornos mediados por IgE.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Alergia se refiere a algunas enfermedades en las cuales las respuestas inmunológicas a los antígenos ambientales causan inflamación de los tejidos y disfunción orgánica. Las características clínicas de cada enfermedad alérgica reflejan la respuesta inflamatoria inducida inmunológicamente en el órgano o tejido involucrado. Estas características son generalmente independientes de las propiedades químicas o físicas del antígeno. La diversidad de respuestas alérgicas proviene de la participación de diferentes vías efectoras inmunológicas, cada una de las cuales genera un patrón de inflamación único.

La alergia es común en todo el mundo. La predilección por enfermedades específicas, sin embargo, varía entre diferentes grupos etarios, sexos y razas. El predominio de la sensibilidad a alérgenos específicos es determinado por la predilección genética y por los factores geográficos y culturales que son responsables de la exposición al alérgeno. Un estado clínico de alergia afecta sólo a algunos individuos que encuentran cada alérgeno. La aparición de la enfermedad alérgica ante la exposición a un alérgeno requiere no sólo la "sensibilización" previa sino también otros factores que determinan la localización de la reacción en un órgano particular.

Un proceso biológico que precede la enfermedad alérgica ante la exposición a un alérgeno es una respuesta inmunológica conocida como "sensibilización" o la fase de sensibilización. Una vez que ocurre la sensibilización, un individuo no se torna sintomático hasta que se produzca una exposición subsiguiente al alérgeno. El efecto de la sensibilización también es conocido como memoria inmunológica.

Los niveles elevados de IgE están asociados con enfermedades alérgicas incluyendo el asma alérgica. La IgE tiene un rol central en las alergias en virtud de su rol como receptores de alérgenos en la superficie de los mastocitos y los basófilos. Los anticuerpos de IgE están fijados a la superficie de los mastocitos y basófilos en la parte Fe de la molécula a un receptor de superficie celular de alta afinidad, denominado FceRI. La reacción alérgica se inicia cuando la molécula de alérgeno polivalente se une a los anticuerpos que están ocupando esos receptores. El resultado es un puenteo del FceRI, el que a su vez da una señal intracelularmente que causa la liberación y activación de los mediadores de la inflamación: histamina, leucotrienos, factores quimiotácticos, factor activador de plaquetas y proteinasas. Estos mediadores activados actúan localmente y causan mayor permeabilidad vascular, vasodilatación, contracción del músculo liso y secreción de las glándulas mucosas. Tales eventos son denominados clínicamente la fase inmediata o temprana, y ocurren dentro de los primeros 15 a 30 minutos después de la exposición al alérgeno. Durante las 12 horas siguientes hay una infiltración progresiva del tejido de las células inflamatorias, que avanza de los neutrófilos a los eosinófilos a las células mononucleares en respuesta a otros mediadores químicos que no se comprenden completamente aún. Este período de tiempo de 6 a 12 horas después de la exposición al alérgeno es denominado la fase tardía y está caracterizado por manifestaciones clínicas de inflamación celular. Como las reacciones de la fase tardía, especialmente en el pulmón, se producen en ausencia de las reacciones de la fase temprana, aún no se comprende completamente si la reacción de la fase tardía está mediada necesariamente por la IgE. Este mecanismo es responsable principalmente por la anafilaxis, la urticaria y las enfermedades atópicas, tales como rinitis alérgica, asma alérgica, dermatitis atópica y gastroenteropatía alérgica.

La IgE existe en una forma unida a la membrana y en una forma segregada. Estas formas distintas parecen ser variantes de corte y empalme. Propuestas previas para lograr un efecto terapéutico regulando hacia abajo la IgE se direccionaron principalmente a la forma segregada (por ejemplo, XOLAIR® omalizumab), de modo de prevenir o desarmar el "armado" subsiguiente del sistema inmunológico. La forma segregada de la IgE es una forma más corta, esencialmente la región Fe termina en el dominio CH4, mientras que la forma más larga incluye residuos C-terminales adicionales que incluyen los péptidos codificados por los exones conocidos como M1/M1 ' y M2. La terapia convencional con anticuerpos anti-lgE, que se unen a la forma segregada de la IgE, da por resultado la reducción de la IgE sérica segregada (la IgE total no complejada a Xolair). Cásale er a/., J. Allergy Clin. Immunol. 100 (1): 110-121 (1997).

La IgE unida a la membrana, que incluye la sección M1 ' está presente en las células B IgE-cambiadas humanas, células B de memoria IgE e IgE plasmablastos. La patente U.S. No. 8.071.097 (también descripta en el documento WO 2008/116149, las divulgaciones de ambas se incorporan por referencia en su totalidad) divulga anticuerpos que tienen como objetivo el segmento M1' de la IgE unida a la membrana. Estos anticuerpos pueden agotar las células B que expresan el M1 ' a través de la apoptosis y/o un mecanismo de citotoxicidad mediado por células dependientes de anticuerpos.

Todas referencias mencionadas en la presente, incluyendo las solicitudes de patentes y las publicaciones, se incorporan de este modo por referencia en su totalidad.

SÍNTESIS DE LA INVENCIÓN o prevención de un un paciente humano de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-lgE que se üne^eeQmento M1' de una IgE humana, en donde un intervalo entre administraciones del anticuerpo es de alrededor de un mes o mayor. En algunas formas de realización, el intervalo entre las administraciones es de alrededor de dos meses, alrededor de tres meses, alrededor de cuatro meses, alrededor de cinco meses, alrededor de seis meses o mayor. En algunas formas de realización, el intervalo entre administraciones es de alrededor de tres meses con una administración adicional en la semana 4 después de la primera administración. En algunas formas de realización, el anticuerpo es administrado a una dosificación de alrededor de 150 mg a alrededor de 450 mg por dosis. En algunas formas de realización, el anticuerpo es administrado a una dosificación de alrededor de 150 mg por dosis, alrededor de 300 mg por dosis o alrededor de 450 mg por dosis. En algunas formas de realización, el anticuerpo es administrado en forma subcutánea o intravenosa. En algunas formas de realización, la IgE total del suero en el paciente humano es reducida con relación a la línea de base después del tratamiento con el anticuerpo. En algunas formas de realización, la IgE específica del alérgeno en el paciente humano es reducida con relación a la línea de base después del tratamiento con el anticuerpo. En algunas formas de realización, un aumento inducido por el alérgeno de la IgE total sérica en el paciente humano es prevenida o reducida después del tratamiento con el anticuerpo. En algunas formas de realización, un aumento inducido por el alérgeno de la IgE específica del alérgeno en el paciente humano es prevenida o reducida después del tratamiento con el anticuerpo. En algunas formas de realización, la producción de nueva IgE es prevenida o reducida después del tratamiento con el anticuerpo.

También se provee en ia presente un método de tratamiento o prevención de un trastorno mediado por IgE que comprende la administración a un paciente humano de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE humana, en donde el anticuerpo es administrado a una dosis de alrededor de 150 mg a alrededor de 450 mg por dosis. En algunas formas de realización, el anticuerpo es administrado a una dosificación de alrededor de 150 mg/por dosis, alrededor de 300 mg/por dosis o alrededor de 450 mg por dosis. En algunas formas de realización, el anticuerpo es administrado en forma subcutánea o intravenosa.

También se provee en la presente un método para reducir la IgE total sérica y/o La IgE específica del alérgeno en un humano con relación a la línea de base que comprende la administración a un paciente humano de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE humana, en donde un intervalo entre las administraciones del anticuerpo es de alrededor de un mes o mayor. En algunas formas de realización, la IgE total sérica es reducida por al menos aproximadamente 20% del nivel de la línea de base. En algunas formas de realización, la IgE total sérica es reducida por al menos aproximadamente 25% del nivel de la línea de base. En algunas formas de realización, la reducción de la IgE total sérica es mantenida por lo menos un mes, por lo menos dos meses, por lo menos tres meses, por lo menos cuatro meses, por lo menos cinco meses, o por lo menos seis meses después de la última administración del anticuerpo. También se provee en la presente un método para prevenir la producción de nueva IgE, que comprende la administración a un paciente humano de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE humana.

También se provee en la presente un método para prevenir o reducir un aumento inducido por un alérgeno de la IgE total sérica y/o de la IgE específica del alérgeno en un paciente humano que comprende administrar a un paciente humano una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE humana. En algunas formas de realización, un intervalo entre administraciones del anticuerpo es de alrededor de un mes o mayor. En algunas formas de realización, un intervalo entre administraciones del anticuerpo es de alrededor de dos meses. En algunas formas de realización, un intervalo entre administraciones del anticuerpo es de alrededor de tres meses. En algunas formas de realización, un intervalo entre administraciones del anticuerpo es de alrededor de cuatro meses. En algunas formas de realización, un intervalo entre administraciones del anticuerpo es de alrededor de cinco meses. En algunas formas de realización, un intervalo entre administraciones del anticuerpo es de alrededor de seis meses. En algunas formas de realización, el anticuerpo es administrado a una dosis de alrededor de 150 a alrededor de 450 mg por dosis. En algunas formas de realización, el aumento inducido por el alérgeno de la IgE específica del alérgeno es prevenido o reducido. En algunas formas de realización, la prevención o reducción del aumento inducido por el alérgeno-alérgeno de la IgE total sérica y/o la IgE específica del alérgeno es mantenido durante por lo menos un mes, por lo menos dos meses, por lo menos tres meses, o por lo menos seis meses después de la última administración del anticuerpo.

En algunas formas de realización de los métodos descriptos en la presente, el anticuerpo es administrado para tratar un trastorno mediado por IgE seleccionado entre el grupo que consiste en: rinitis alérgica, asma alérgica, asma no alérgica, dermatitis atópica, gastroenteropatía alérgica, anafilaxis, urticaria, alergias a alimentos, aspergilosis broncopulmonar alérgica, enfermedades parasitarias, cistitis intersticial, síndrome de hiper-lgE, ataxia-telangiectasia, síndrome de Wiskott-Aldrich, linfoplasia atímica, mieloma IgE, reacción de injerto versus huésped y púrpura alérgica. En algunas formas de realización, el trastorno mediado por IgE es rinitis alérgica, asma alérgica o asma no alérgica. En algunas formas de realización, el método descripto en la presente es para el tratamiento de un paciente humano que tiene asma alérgica que es controlado en forma inadecuada por las normas de cuidado estándar, por ejemplo, una alta dosis de corticosteroides inhalada u oral en combinación con un segundo controlador. En algunas formas de realización, el método descripto en la presente es para el tratamiento de un paciente humano que tiene asma severa, moderada o leve. En algunas formas de realización, el método descripto en la presente es para el tratamiento de un paciente humano con asma alérgica controlada en forma inadecuada a pesar de la alta dosis de corticosteroides inhalada (ICS) (= 400 g/día dosis diaria total de propionato de fluticasona (FP) o equivalente) y un segundo controlador (por ejemplo, después de por lo menos 12 semanas o por lo menos 36 semanas de tratamiento). En algunas formas de realización, el segundo controlador es un broncodilatador o un agente anti-leucotrieno.

En algunas formas de realización, el método descripto en la presente comprende además la administración al paciente humano de un segundo fármaco junto con el anticuerpo para el tratamiento o la prevención de un trastorno mediado por IgE, en donde el segundo fármaco es seleccionado entre el grupo que consiste en: un anticuerpo anti-lgE, una antihistamina, un broncodilatador, un glucocorticoide, un NSAID, un descongestivo, un supresor de la tos, un analgésico, un antagonista de TNF, un antagonista de integrina, un agente inmunosupresor, un antagonista de IL-4, un antagonista de IL— 13, un antagonista de IL— 4/IL— 13 dual, un DMARD, un anticuerpo que se une a un marcador de superficie de las células B y un antagonista de BAFF. En algunas formas de realización de los métodos descriptos en la presente, el anticuerpo es administrado al paciente humano junto con un segundo método de tratamiento para un trastorno mediado por IgE. En algunas formas de realización, el segundo método de tratamiento comprende un régimen de tratamiento de desensibilización al alérgeno.

En los métodos descriptos en la presente, cualquiera de los anticuerpos anti-lgE descriptos en la presente puede ser administrado al paciente humano. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano. En algunas formas de realización, el anticuerpo se une específicamente al epitopo en el segmento M1' de una IgE humana mostrada en la Figura 14. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE se une específicamente al mismo epitopo que uno unido por un anticuerpo seleccionado entre el grupo que consiste en: 47H4, 7A6, 26A11 , 47H4v5, 7A6v1 y 26A11v6. En algunas formas de realización, el epitopo corresponde a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 y SEQ ID NO:7. En algunas formas de realización, el anticuerpo se une específicamente a un epitopo en el segmento MV de la IgE definido por los residuos 317 a 352 de la SEQ ID NO:1. En algunas formas de realización, el anticuerpo se une específicamente a un epitopo en el segmento M1" de la IgE definido por los residuos 317 a 352 de la SEQ ID NO:1 y tiene una afinidad de unión Scatchard que es equivalente a la del anticuerpo anti-IgE murino 47H4. En algunas formas de realización, la afinidad es entre 0,30 y 0,83 nM. En algunas formas de realización, el anticuerpo se une específicamente a un epitopo en el segmento M1' de la IgE definido por los residuos 317 a 352 de la SEQ ID NO:1 y tiene una afinidad de unión Scatchard que es equivalente a la del anticuerpo anti-lgE 47H4v5. En algunas formas de realización, la afinidad es de alrededor de 1,5 nM. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende las HVRs de cadena pesada y cadena liviana de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo seleccionado entre el grupo que consiste en: 26A11 , 26A11 v.1-16, 7A6, 7A6v1 , 47H4, y 47H4v1-6. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende regiones variables pesada y liviana de las cadenas pesada y liviana del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo seleccionado entre el grupo que consiste en: 26A11 , 26A11 v.1-16, 7A6, 7A6v1 , 47H4, 47H4v1-6.

En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE comprende una región variable de cadena pesada y cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:29 y la región variable de cadena liviana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:19. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y una de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende una HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, y la región variable de cadena liviana comprende una HVR-L1 , HVR-L2 y HVR-L3, y en donde (a) la HVR-H1 comprende los residuos 26-35 de la SEQ ID NO:29, (b) la HVR-H2 comprende los residuos 49-66 de la SEQ ID NO:29, (c) la HVR-H3 comprende los residuos 97-106 de la SEQ ID NO:29, (d) la HVR-L1 comprende los residuos 24-39 de la SEQ ID NO: 19, (e) la HVR-L2 comprende los residuos 55-61 de la SEQ ID NO: 19, y (f) la HVR-L3 comprende los residuos 94-102 de la SEQ ID NO: 19. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende además un marco de consenso humano. En algunas formas de realización, la región variable de cadena pesada del anticuerpo comprende un marco de consenso del subgrupo II. En algunas formas de realización, la región variable de cadena liviana comprende un marco de consenso de subgrupo I kappa. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE administrado a un paciente humano comprende una región variable de cadena pesada y una de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:39 y la región variable de cadena liviana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:40. En algunas formas de realización, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo anti-lgE es administrado a un paciente humano, en donde el anticuerpo anti-lgE comprende una región variable de cadena pesada y una de cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:39 y la región variable de cadena liviana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:40.

En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE tiene actividad ADCC. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE es afucosilado. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE agota las células B alteradas por ?a?. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-?a? aaota las células B de memoria loE. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE agota el plasmablasto de loE. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE es una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se provee en el presente un kit que comprende un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE humana y un inserto del envase que indica que el anticuerpo es administrado a un paciente humano para el tratamiento de un trastorno mediado por IgE, en donde un intervalo entre las administraciones del anticuerpo al paciente humano es de alrededor de un mes o mayor.

También se provee en la presente un kit que comprende un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE humana y un inserto del envase que indica que el anticuerpo es administrado a un paciente humano para el tratamiento de un trastorno mediado por IgE, en donde el anticuerpo es administrado a una dosificación de alrededor de 150 mg a alrededor de 450 mg por dosis.

En algunas formas de realización, el inserto del envase en el kit indica además que el tratamiento es efectivo para reducir la IgE total sérica con relación a la línea de base en un paciente humano. En algunas formas de realización, el inserto del envase en el kit indica además que el tratamiento es efectivo para reducir la IgE específica del alérgeno con relación a la línea de base en un paciente humano. En algunas formas de realización, el inserto del envase indica además que el tratamiento es efectivo para prevenir o reducir un aumento inducido por un alérgeno de la IgE total sérica en un paciente humano. En algunas formas de realización, el inserto del envase indica además que el tratamiento es efectivo para prevenir o reducir un aumento inducido por un alérgeno en una IgE específica de un alérgeno en un paciente humano. En algunas formas de realización, el paciente humano tiene asma severa, moderada o leve. En algunas formas de realización, el anticuerpo en el kit se encuentra en un frasco-ampolla. En algunas formas de realización, el anticuerpo en el kit se encuentra en una jeringa prellenada. En algunas formas de realización, el kit comprende además un dispositivo para inyección (tal como un auto-inyector).

En algunas formas de realización, el kit comprende además un segundo fármaco seleccionado entre el grupo que consiste en: un anticuerpo anti-lgE, un antihistamínico, un broncodilatador, un glucocorticoide, un NSAID, un descongestivo, un supresor de la tos, un analgésico, un antagonista de TNF, un antagonista de integrina, un agente inmunosupresor, un antagonista de IL— 4, un antagonista de IL— 13, un antagonista de IL— 4/IL-13 dual, un DMARD, un anticuerpo que se une a un marcador de superficie de células B y un antagonista de BAFF, y un inserto del envase que indica la administración del anticuerpo a un paciente humano a intervalos mensuales o trimestrales junto con el segundo fármaco para el tratamiento de un trastorno mediado por IgE. En algunas formas de realización, el segundo fármaco es un anticuerpo anti-lgE rhuMAbE25.

En algunas formas de realización, la invención provee cualquiera de los anticuerpos anti-lgE-M1' descriptos previamente para usar en cualquiera de los métodos descriptos previamente, en donde los anticuerpos son administrados por cualquiera de los intervalos de dosificación, cantidades o regímenes descriptos previamente.

En algunas formas de realización, la invención provee cualquiera de los anticuerpos anti-lgE-M1' descriptos previamente para usar en cualquiera de los métodos descriptos previamente, en donde los anticuerpos son preparados para ser administrados por cualquiera de los intervalos de dosificación, cantidades o regímenes descriptos previamente.

En algunas formas de realización, la invención provee el uso de cualquiera de los anticuerpos anti-lgE-M1' descriptos previamente en cualquiera de los métodos descriptos previamente, en donde los anticuerpos son administrados en cualquiera de los intervalos, cantidades o regímenes descriptos previamente.

Debe entenderse que una, algunas o todas las propiedades de las diversas formas de realización descriptas en la presente pueden ser combinadas para formar otras formas de realización de la presente invención. Estos y otros aspectos de la invención resultarán evidentes para un experto en el arte.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un diagrama del estudio de Fase 1a de dosis única ascendente en voluntarios sanos.

La Figura 2 es un diagrama del estudio de Fase 1b de dosis múltiples ascendentes en pacientes con asma leve.

La Figura 3 es un gráfico que demuestra la concentración sérica media en el tiempo en todas las cohortes en el estudio de Fase 1a.

La Figura 4 es un gráfico que demuestra la concentración sérica media en el tiempo en todas las cohortes en el estudio de Fase 1b.

La Figura 5A-B es un gráfico que demuestra la IgE total sérica a los 85 y 168 días después del tratamiento con MEMP1972A. Los datos son presentados para los Días 85 (5A) y 168 (5B) del estudio, definiéndose el Día 1 del estudio como el día de la administración de la dosis única. Los datos son expresados como % de cambio con respecto a la línea de base, en donde la línea de base es definida como el promedio de las visitas pre-dosis; media ± SD, n=3-4 pacientes en los grupos de 0,003, 0,03 y 0,3 mg/kg IV, n = 5 en los grupos de 1 , 3, 5 mg/kg IV y 3 mg/kg SC y n = 14 en el grupo de placebo.

La Figura 6 es un gráfico que demuestra la IgE total sérica en pacientes con rinitis alérgica después del tratamiento con MEMP1972A. Los datos son expresados como % de cambio con respecto a la línea de base, en donde la línea de base es definida como el promedio de las visitas pre-dosis; media ± SD, n = 8 pacientes en los grupos ME P1972A y n = 12 en el grupo placebo (IV y SC combinado).

La Figura 7 es un diagrama del estudio de Fase 2a de la prueba de actividad en el desafío con alérgeno en pacientes con asma leve.

La Figura 8A-B es un gráfico que demuestra que el anticuerpo anti-M1 prime (MEMP1972A) redujo tanto las reacciones asmáticas tempranas (EAR) como las reacciones asmáticas tardías (LAR) según se midió por la declinación en porcentaje del volumen espiratorio forzado en 1 segundo (FEV en el tiempo después de la inhalación del alérgeno en un estudio de Fase 2a. Fig. 8A) muestra el FEVi por ciento medio en comparación con la línea de base (predesafío) en el tiempo después de la inhalación del alérgeno en pacientes durante el examen antes de la administración del placebo o el fármaco. Fig 8B) muestra el FEVi por ciento medio en comparación con la línea de base (predesafío) en el tiempo después de la inhalación del alérgeno el Día 86 en pacientes con placebo o el fármaco (MEMP1972A).

La Figura 9A-D es un gráfico que demuestra que el anticuerpo anti-M1 prime previno el aumento inducido por el alérgeno en la IgE específica del alérgeno y redujo la IgE total en pacientes con asma leve en un estudio de Fase 2a. Fig.9A) muestra la IgE específica de alérgeno (para alérgenos de desafío) en pacientes tratados con placebo o Anti-M1 prime (MEMP1972A). *p=0,01;†p<0,05. Fig.9B) muestra la IgE específica de alérgeno (para alérgenos irrelevantes (es decir, alérgenos que no son del desafío)) en pacientes sometidos a un desafío con alérgenos de pulmón completo y tratados con placebo o Anti-M1 prime (MEMP1972A). Fig.9C) muestra la IgE total en pacientes tratados con placebo o Anti-M1 prime en resultados intermedios. Fig.9D) muestra la IgE total en pacientes tratados con placebo o Anti-M1 prime. Los niveles de IgE antes de comenzar el estudio fijando como línea de base de 100% (MEMP1972A). *p<0,01. Datos mostrados como media ± SEM. Para A)-C), no todos los sujetos incluidos en los puntos de tiempo tardíos; n = 4-5/grupo de tratamiento el Día 197.

La Figura 10A-B es un gráfico que muestra que MEMP1972A redujo los aumentos de eosinófilos inducidos por el desafío del alérgeno. Fig.lOA) muestra los niveles de eosinófilos en el esputo en el examen. Fig.lOB) muestra los niveles de eosinófilos en el esputo en la semana 12 del estudio. Los datos se presentan como media ± error estándar.

La Figura 11A-B es un gráfico que muestra la reducción de los eosinófilos en la sangre periférica en pacientes tratados con ME P1972A. Fig.1 1A) muestra el porcentaje de línea de base (examen) den eosinófilos (%). *p<0,10; †p<0,15. Fig.1 1 B) muestra el porcentaje de línea de base (examen) de eosinófilos (conteo absoluto). *p<0,10;†p<0,15. Los datos se presentan como media ± error estándar.

La Figura 12A-B es un gráfico que muestra aumentos de bloques de MEMP1972A de los niveles de CCL17 inducidos por alérgenos. Fig.12A) muestra los niveles de CCL17 como un porcentaje de la línea de base durante el curso del estudio. Fig.12B) muestra los niveles de CCL17 como un porcentaje de la línea de base durante el examen y el Día 86. Los datos se presentan como media ± error estándar.

La Figura 13 es un diagrama del estudio de Fase 2b en pacientes con asma. Los pacientes en el grupo placebo reciben un total de nueve dosis de placebo a intervalos mensuales (semanas 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 y 32). Los pacientes en el grupo de 300 mg de anticuerpo anti- 1 prime reciben un total de nueve dosis del anticuerpo a intervalos mensuales (semanas 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 y 32). Los pacientes en los grupos de 150 mg y 450 mg de anticuerpo anti-M1 prime reciben un total de cuatro dosis activas del anticuerpo incluyendo tres dosis a intervalos trimestrales (semanas 0, 12, y 24) así como también una dosis extra en la semana 4 y las cinco dosis restantes son placebo.

La Figura 14A-B es un alineamiento de regiones de cadena constante seleccionadas de IgE del humano (SEQ ID NO:1), del mono rhesus (SEQ ID NO:2) y del mono cynomolgous (SEQ ID NO:3). Se muestran las localizaciones aproximadas de los dominios CH2, CH3, CH4, M1 ', transmembrana e intracelular.

Las Figuras 15A-F muestran las secuencias variables de cadena liviana y pesada de los anticuerpos murinos 26A11 , 7A6 y 47H4 y varias variantes humanizadas de éstos. Las posiciones son numeradas de acuerdo con Kabat y se muestran en casilleros las regiones hipervariables que fueron injertadas en la red de consenso variable (Kappa I para cadena liviana, subgrupo III para cadena pesada). Fig.15 A) muestra, con relación a la cadena liviana kappa I humana (SEQ ID NO:8), la cadena liviana variable de 26A1 1 (SEQ ID NO:9) y las variantes humanizadas 1 ,4 (SEQ ID NO:10), las variantes 2,5 (SEQ ID NO:1 1 ), las variantes 3,6 (SEQ ID NO:12), las variantes 13,15 (SEQ ID NO:13) y las variantes 14,16 (SEQ ID NO:14). Fig.15B) muestra, con relación a la cadena liviana kappa I humana (SEQ ID NO:8), la cadena liviana variable de 7A6 (SEQ ID NO: 15) y la variante humanizada 1 (SEQ ID NO:16). Fig.15C) muestra, con relación a la cadena liviana kappa I humana (SEQ ID NO:8), la cadena liviana variable de 47H4 (SEQ ID NO: 17) y las variantes humanizadas 1 ,3 (SEQ ID NO: 18) y las variantes 2, 4-6 (SEQ ID NO:19). Fig.15D) muestra, con relación a la cadena pesada humana III (SEQ ID NO:20), la cadena pesada variable de 26A11 (SEQ ID NO:21) y las variantes humanizadas 1-3, 13, 14 (SEQ ID NO:22) y las variantes 4-6, 15, 16 (SEQ ID NO:23). Fig.15E) muestra, con relación a la cadena pesada humana (SEQ ID NO:20), la cadena pesada variable de 7A6 (SEQ ID NO:24) y la variante humanizada 1 (SEQ ID NO:25). Fig.15F) muestra, con relación a la cadena pesada humana III (SEQ ID NO:20), la cadena pesada variable de 47H4 (SEQ ID NO:26) y las variantes humanizadas 1 ,2 (SEQ ID NO:27), las variantes 3-4 (SEQ ID NO:28), la variante 5 (SEQ ID NO:29) y la variante 6 (SEQ ID NO:30).

La Figura 16A-B es un gráfico que demuestra que el anticuerpo anti-M1 prime redujo la IgE específica del desafío y la que no era del desafío en pacientes con asma leve en un estudio de Fase 2a. Fig.16A) muestra la IgE específica del alérgeno con respecto a alérgenos desafío en pacientes tratados con placebo o Anti-M1 prime (MEMP1972A). Fig.16B) muestra IgE específica del alérgeno con respecto a los alérgenos que no son del desafío en pacientes tratados con placebo o Anti- 1 prime (MEMP1972A). Los niveles de IgE se muestran como porcentaje de línea de base y los niveles de IgE antes del comienzo del estudio son la línea de base (100%). Los datos mostrados son medias o medianas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente solicitud provee métodos de tratamiento o prevención de un trastorno mediado por IgE usando un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE. Los inventores han mostrado en estudios clínicos que un anticuerpo anti-M1' humanizado fue efectivo para reducir la IgE total sérica y la IgE específica del alérgeno en sujetos sanos, y pacientes con rinitis alérgica o asma alérgica y esa reducción de la IgE total se mantuvo durante por lo menos tres meses después de la última dosis tanto en los estudios con dosis única como con dosis múltiple. Además, en un estudio separado, los inventores han mostrado que un aumento inducido por alérgenos de la IgE total sérica y de la IgE específica de alérgenos fue evitado o reducido en pacientes después del tratamiento con el anticuerpo anti-lgE.

I. Técnicas generales Las técnicas y los procedimientos descriptos o que se mencionan en la presente son bien entendidos en general y empleados comúnmente usando metodología convencional por los expertos en el arte, tal como, por ejemplo, las metodologías ampliamente utilizadas descriptas en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3a edición (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel, et al. eds., (2003)); la serie Methods ¡n Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames y G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow y Lañe, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, y Animal Cell Culture (RA. Freshney, ed. (1987)); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (RA. Freshney), ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather y P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, y D.G. Newell, eds., 1993-8) J. Wiley and Sons; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller y M.P. Calos, eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullís et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway y P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal Antibodies: A Practical Approach (P. Shepherd y C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using Antibodies: A Laboratory Manual (E. Harlow y D. Lañe (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti y J. D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995); y Cáncer: Principies and Practice of Oncology (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

II. Definiciones Un "alérgeno" o "inmunógeno" es cualquier molécula que puede disparar una respuesta inmunológica. Como se usa en la presente, el término cubre o bien la molécula antigénica propiamente dicha, o su fuente, tal como granos de polen, caspa de los animales, veneno de insectos o productos alimenticios. Esto está contrapuesto con el término antígeno, que se refiere a una molécula que puede ser reconocida específicamente por una inmunoglobulina o un receptor de células T. Cualquier sustancia extraña que es capaz de inducir una respuesta inmunológica es un alérgeno potencial. Muchos productos químicos diferentes, tanto de origen natural como sintético, son conocidos como alergénicos. Los productos químicos orgánicos naturales complejos, especialmente las proteínas, provocan probablemente alergias mediadas por anticuerpos, mientras que los compuestos orgánicos simples, los productos químicos inorgánicos y los metales provocan más preferentemente alergia mediada por las células T. En algunos casos, el mismo alérgeno puede ser responsable de más de un tipo de alergia. La exposición al alérgeno puede ser a través de inhalación, inyección o contacto con la piel.

El término "anticuerpo" incluye anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos de longitud completa que tienen una región de inmunoglobulina Fe), composiciones de anticuerpos con especificidad poliepitópica, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos, diacuerpos y moléculas de cadena simple, así como también fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, F(ab')2 y Fv). El término "inmunoglobulina" (Ig) se usa en forma intercambiable con "anticuerpo" en la presente.

La unidad de anticuerpo de 4 cadenas básica es una glicoproteína heterotetramérica compuesta por dos cadenas livianas (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Un anticuerpo IgM consiste en 5 de las unidades heterotetrámeras básicas junto con un polipéptido adicional denominado una cadena J, y contiene 10 sitios de unión de antígenos, mientras que los anticuerpos IgA comprenden de 2 a 5 de las unidades de 4 cadenas básicas que pueden polimerizarse para formar ensamblajes polivalentes en combinación con la cadena J. En el caso de las IgGs, la unidad de 4 cadenas es generalmente de aproximadamente 150.000 daltons. Cada cadena L está unida a una cadena H por un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de la cadena H. Cada cadena H y L también tiene puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente. Cada cadena H tiene en el extremo N-terminal, un dominio variable (VH) seguido por tres dominios constantes (CH) para cada una de las cadenas a y y y cuatro dominios CH para los isotipos µ y e?. Cada cadena L tiene en el extremo N-terminal, un dominio variable (VL) seguido por un dominio constante en su otro extremo. La VL está alineada con la VH y la CL está alineada con el primer dominio constante de la cadena pesada (CH1). Se cree que residuos de aminoácidos particulares forman una interfase entre los dominios variables de cadena liviana y de cadena pesada. El apareamiento de una VH y una VL juntas forma un sólo sitio de unión al antígeno. Para la estructura y propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, ver por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8a Edición, Daniel P. Sties, Abba I. Terr y Tristram G. Parsolw (eds), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 y Capítulo 6.

La cadena L de cualquier especie de vertebrados puede ser asignada a uno de dos tipos claramente distintos, denominados kappa y lambda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH), las inmunoglobulinas pueden ser asignadas a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen las cadenas pesadas denominadas a, d, e, ? y µ, respectivamente. Las clases ? y a se dividen adicionalmente en subclases en base a diferencias relativamente menores en la secuencia CH y la función, por ejemplo, los humanos expresan las siguientes subclases: lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2.

Un anticuerpo "aislado" es uno que ha sido identificado, separado y/o recuperado de un componente de su medio ambiente de producción (por ejemplo, en forma natural o recombinante). Preferentemente, el polipéptido aislado es libre de asociarse con todos los otros componentes de su medio ambiente de producción. Los componentes contaminantes de su medio ambiente de producción, tales como los que resultan de células transfectadas recombinantes, son materiales que interferirían típicamente con la investigación, los usos diagnósticos o terapéuticos para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En formas de realización preferidas, el polipéptido será purificado: (1) a más de 95% en peso de anticuerpo según se determinó, por ejemplo, por el método de Lowry, y en algunas formas de realización, a más de 99% en peso; (1) a un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de secuenciad de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de "spinning cup" o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones no reductoras o reductoras usando azul de Coomassie o, preferentemente, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que por lo menos un componente del medio ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Comúnmente, sin embargo, un polipéptido o anticuerpo aislado será preparado por al menos un paso de purificación.

La "región variable" o el "dominio variable" de un anticuerpo se refiere a los dominios aminoterminales de la cadena pesada o liviana del anticuerpo. Los dominios variables de la cadena pesada y de la cadena liviana pueden ser denominados "VH" y "VL", respectivamente. Estos dominios son generalmente las partes más variables del anticuerpo (con relación a otros anticuerpos de la misma clase) y contienen los sitios de unión al antígeno.

El término "variable" se refiere al hecho de que algunos segmentos de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre los anticuerpos. El dominio V media la unión al antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida en forma uniforme en todo el abanico de los dominios variables. En cambio, está concentrado en tres segmentos denominados regiones hipervariables (HVRs) tanto en los dominios variables de la cadena liviana como en la cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables son denominadas regiones marco (FR). Los dominios variables de cadenas pesadas y livianas nativas comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan en gran parte una configuración de lámina beta, conectada por tres HVRs, que forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina beta. Las HVRs en cada cadena se mantienen juntas en estrecha proximidad por las regiones FR y, con las HVRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Immunological Interest, Quinta Edición, National Institute of Health, Bethesda, MD (1991)). Los dominios constantes no están involucrados directamente en la unión del anticuerpo a un antígeno, pero presentan varias funciones efectoras, tales como participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente de los anticuerpos.

La expresión "anticuerpo monoclonal" como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones que ocurren naturalmente y/o modificaciones postraducción (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en menores cantidades. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un sólo sitio antigénico. Por contraste con los preparados de anticuerpos policlonales que incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un sólo determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos por cuanto son sintetizados por el cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo es obtenido de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no debe interpretarse como requiriendo la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a ser usados de acuerdo con la presente invención pueden ser preparados por una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, el método del hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein., Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybrídoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2da. ed. 1988); Hammerling et a/., en: Monoclonal Antibodies y T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981 )), métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, patente U.S. No. 4.816.567), tecnologías de display de fagos (ver, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991 ); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); y Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004), y tecnologías para producir anticuerpos humano o similares a los humanos en animales que tienen partes o todos los loci o genes de la inmunoglobulina humana que codifican las secuencias de las inmunoglobulinas humanas (ver, por ejemplo, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741 ; Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immunol. 7:33 (1993); patentes U.S. Nos. 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016; Marks et al., Bio Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995).

La expresión "anticuerpo desnudo" se refiere a un anticuerpo que no es conjugado a una parte citotóxica o radiomarcador.

Las expresiones "anticuerpo de longitud completa", "anticuerpo intacto" o "anticuerpo completo" se usan en forma intercambiable para referirse a un anticuerpo en su forma sustancialmente intacta, como opuesto a un fragmento de anticuerpo. Específicamente los anticuerpos completos incluyen aquellos con cadenas pesadas y livianas que incluyen una región Fe. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de secuencia nativa) o variantes de secuencias de aminoácidos de éstos. En algunos casos, el anticuerpo intacto puede tener una o más funciones efectoras.

Un "anticuerpo que se liga al mismo epitopo" como un anticuerpo de referencia se refiere a un anticuerpo que bloquea la unión del anticuerpo de referencia a su antígeno en un ensayo de competencia por 50% o más, y a la inversa, el anticuerpo de referencia bloquea la unión del anticuerpo a su antígeno en un ensayo de competencia por 50% o más. Los ensayos de competencia son conocidos en el arte.

En un ensayo de competencia ilustrativo, el segmento M1' inmovilizado de IgE es incubado en una solución que comprende un primer anticuerpo marcado que se une al segmento M1' (por ejemplo, el anticuerpo 47H4, 47H4 v1 , v2, v3, v4, v5 o v6) y un segundo anticuerpo no marcado que es testeado con respecto a su capacidad para competir con el primer anticuerpo para unirse al segmento M1'. El segundo anticuerpo puede estar presente en un hibridoma sobrenadante. Como un control, el segmento inmovilizado MV es incubado en una solución que comprende el primer anticuerpo marcado pero no el segundo anticuerpo no marcado. Después de la incubación bajo condiciones permisivas para la unión del primer anticuerpo al segmento M1', se remueve el exceso de anticuerpo no unido, y se mide la cantidad de marcador asociado con el segmento M1' inmovilizado. Si la cantidad de marcador asociada con el segmento M1' inmovilizado es sustancialmente reducida en la muestra de prueba con relación a la muestra control, entonces esto indica que el segundo anticuerpo está compitiendo con el primer anticuerpo por la unión al segmento M1'. Ver Harlow y Lañe (1988) Antibodies: A Laboratory Manual cap.14 (Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor, NY).

Un "fragmento de anticuerpo" comprende una porción de un anticuerpo intacto, preferentemente la unión al antígeno y/o la región variable del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (ver patente U.S. 5.641.870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062

[1995]); moléculas de anticuerpo de cadena simple y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos.

La digestión de anticuerpos con papaína produjo dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", y un fragmento "Fe" residual, una denominación que refleja la capacidad de cristalizar rápidamente. El fragmento Fab consiste en una cadena L entera junto con el dominio de región variable de la cadena H (VH), y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH1). Cada fragmento de Fab es monovalente con respecto a la unión al antígeno, es decir, tiene un sólo sitio de unión al antígeno. El tratamiento de un anticuerpo con pepsina da un sólo fragmento grande F(ab')2 que corresponde aproximadamente a dos fragmentos Fab unidos por disulfuro que tiene diferente actividad de unión al antígeno y aún son capaces de unir en forma cruzada el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab porque tienen unos pocos residuos adicionales en el extremo carboxi del dominio CH1 , incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en la presente de Fab' en el cual el o los residuos de cisteína de los dominios constantes llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 fueron producidos originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.

El fragmento Fe comprende las porciones carboxi-terminales de ambas cadenas H unidas entre sí por disulfuros. Las funciones efectoras de anticuerpos son determinadas por secuencias en la región Fe, la región que también es reconocida por los receptores Fe (FcR) hallados en algunos tipos de células.

"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un reconocimiento de antígeno completo y sitios de unión al antígeno. Este fragmento consiste en un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y uno de cadena liviana en asociación estrecha, no covalente. Del plegado de estos dos dominios emanan seis bucles hipervariables (3 bucles cada uno de la cadena H y L) que contribuyen los residuos de aminoácidos para la unión al antígeno y confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un sólo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres HVRs específicos para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir el antígeno, aunque a una afinidad menor que el sitio de unión entero.

"FV de cadena simple" abreviado también como "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpos que comprenden los dominios de anticuerpos VH y VL conectados en una sola cadena de polipéptidos. Preferentemente, el polipéptido sFv comprende además un ligador de polipéptidos entre los dominios VH y VL que permite que el sFv forme la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión del sFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

"Fragmentos funcionales" de los anticuerpos de la invención comprenden una porción de un anticuerpo intacto, generalmente incluyendo la unión al antígeno o la región variable del anticuerpo intacto o la región F de un anticuerpo que retiene o tiene una capacidad de unión de FcR modificada. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de cadena simple y anticuerpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpos.

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos preparados construyendo fragmentos sFv (ver párrafo precedente) con ligadores cortos (aproximadamente 5-10) residuos) entre los dominios VH y VL de tal modo que se logra un apareamiento intercatenario pero no intracatenario de los dominios V, dando por resultado de este modo un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios de unión al antígeno. Los diacuerpos biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "crossover" en los cuales los dominios VH y VL de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas de polipéptidos. Los diacuerpos se describen con mayores detalles, por ejemplo, en EP 404,097; WO 93/1 1161 ; Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993).

Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en las cuales una porción de la cadena pesada y/o liviana es idéntica a, u homologa a, secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras el resto de la o las cadenas es idéntico a, u homólogo a, secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como también fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente U.S. No. 4.816.567; Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos PRIMATIZED® en donde la región de unión al antígeno del anticuerpo se deriva de un anticuerpo producido, por ejemplo, immunizando monos macacos con un antígeno de interés. Como se usa en la presente, "anticuerpo humanizado" se usa para un subconjunto de "anticuerpos quiméricos".

Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En una forma de realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo recipiente) en el cual residuos de una HVR del recipiente son reemplazados por residuos de una HVR de una especie no humana (anticuerpo dador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseada. En algunos casos, los residuos FR de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo recipiente o en el anticuerpo dador. Estas modificaciones pueden ser realizadas para refinar adicionalmente la performance del anticuerpo, tal como la afinidad de unión. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de por lo menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una secuencia de inmunoglobulina no humana, y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana, aunque las regiones FR pueden incluir una o más sustituciones de residuos FR individuales que mejoran la performance del anticuerpo, tal como afinidad de unión, isomerización, inmunogenicidad, etc. El número de estas sustituciones de aminoácidos en el FR son típicamente no más de 6 en la cadena H, y en la cadena L, no más de 3. El anticuerpo humanizado comprenderá también opcionalmente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mayores detalles, ver, por ejemplo, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Ver también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y patentes U.S. Nos. 6.982.321 y 7.087.409.

Un "anticuerpo humano" es uno que posee una secuencia de aminoácidos correspondiente a la de un anticuerpo producido por un humano y/o ha sido preparado usando cualquiera de las técnicas para preparar anticuerpos humanos como se divulga en la presente. Esta definición de un anticuerpo humano específicamente excluye un anticuerpo humanizado que comprende residuos que se unen a antígenos no humanos. Los anticuerpos humanos pueden ser producidos usando varias técnicas conocidas en el arte, incluyendo bibliotecas de display de fagos. Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991). También se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos los métodos descriptos en Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991). Ver también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001). Los anticuerpos humanos pueden ser preparados administrando el antígeno a un animal transgénico que ha sido modificado para producir tales anticuerpos en respuesta al desafío antigénico, pero cuyos loci endógenos han sido desactivados, por ejemplo, xenoratones inmunizados (ver, por ejemplo, patentes U.S. Nos. 6.075.181 y 6.150.584 con respecto a la tecnología XENOMOUSE™). Ver también, por ejemplo, Li et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006) con respecto a anticuerpos humanos generados mediante tecnología de hibridoma de células B humanas.

El término "región hipervaríable" , "HVR" o "HV" cuando se usa en la presente se refiere a las regiones de un dominio variable de anticuerpo que son hipervariables en secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. En general, los anticuerpos comprenden seis HVRs; tres en la VH (H1 , H2, H3) y tres en la VL (L1 , L2, L3). En anticuerpos nativos, H3 y L3 despliegan la mayor diversidad de las seis HVRs, y se cree que H3 en particular tiene un rol único en el otorgamiento de especificidad fina a los anticuerpos. Ver, por e., Xu et al. Immunity 13:37-45 (2000); Johnson y Wu en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)). En efecto, los anticuerpos de camélidos que se producen naturalmente, que consisten en una cadena pesada sólo son funcionales y estables en ausencia de la cadena liviana. Ver, por ejemplo, Hamers-Casterman ef al., Nature 363:446-448 (1993) y Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996).

Una cantidad de delineamientos de HVR se encuentran en uso y están comprendidos por la presente. Las HVRs que son regiones determinantes de complementariedad de Kabat (CDRs) se basan en la variabilidad de secuencia y son los que se usan más comúnmente (Kabat et al., supra). Chothia se refiere en cambio a la localización de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Las AbM HVRs representan un compromiso entre las CDRs de Kabat y los bucles estructurales de Chothia, y son usadas por el software de modelación de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las HVRs de "contacto" se basan en un análisis de las estructuras cristalinas complejas disponibles. Los residuos de cada una de estas HVRs se indican más abajo.

Bucle Kabat AbM Chothia Contacto L1 L24-L34 L24-L34 L26-L34 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L56 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeración de Kabat) H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H56 H47-H58 H3 H95-H102 H95-H102 H95-H102 H93-H101 Las HVRs pueden comprender "HVRs extendidas" como sigue: 24-36 ó 24-34 (L1), 46-56 o 50-56 (L2) y 89-97 u 89-96 (L3) en la VL, y 26-35 (H1), 50-65 ó 47-65 (una forma de realización preferida) (H2), y 93-102 (H3) en la VH. Los residuos de dominio variable son numerados de acuerdo con Kabat et al., supra, para cada una de estas definiciones de HVR extendidas.

Residuos "marco" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos de HVR como se define en la presente.

La expresión "numeración de residuos de dominio variable como en Kabaf o "numeración de la posición de aminoácidos como en Kabat' y sus variaciones, se refiere al sistema de numeración usado para dominios variables de cadena pesada o a dominios variables de cadena liviana de la compilación de anticuerpos en Kabat et al., supra. Usando este sistema de numeración, la secuencia de aminoácidos lineal real puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que corresponden a un acortamiento de, o inserción en, una FR o HVR del dominio variable. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir un sólo inserto de aminoácidos (residuo 52a de acuerdo con Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, los residuos82a, 82b y 82c, etc. de acuerdo con Kabat) después del residuo 82 de la FR de cadena pesada. La numeración de Kabat de residuos puede ser determinada para un anticuerpo dado por alineamiento en reglones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia numerada de acuerdo con Kabat "estándar".

Un "marco humano aceptor" para los propósitos en la presente es un marco que comprende la secuencia de aminoácidos de un marco VL o VH derivado de un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano. Un marco humano aceptor "derivado de" un marco de inmunoglobulina humana o un marco de consenso humano puede comprender la misma secuencia de aminoácidos de éste, o puede contener cambios de la secuencia de aminoácidos preexistente. En algunas formas de realización, el número de cambios de aminoácidos preexistentes es de 10 o menos, 9 o menos, 8 o menos, 7 o menos, 6 o menos, 5 o menos, 4 o menos, 3 o menos, o 2 o menos.

Un "marco de consenso humano" es un marco que representa los residuos de aminoácidos que ocurren más comúnmente en una selección de secuencias de marco VL o VH de inmunoglobulina. En general, la selección de las secuencias VL o VH de inmunoglobulina humana es de un subgrupo de secuencias de dominio variable. En general, el subgrupo de secuencias es un subgrupo como en Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta. Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). En una forma de realización, para la VL, el subgrupo es el subgrupo kappa I como en Kabat et al., supra. En una forma de realización, para la VH, el subgrupo es el subgrupo III como en Kabat et al., supra.

Un "marco de consenso del subgrupo III de VH" comprende la secuencia de consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo III de cadena pesada de Kabat et al., supra. En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos del marco de consenso del subgrupo III de VH comprende por lo menos una porción o toda de cada una de las siguientes secuencias: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAAS (SEQ ID NO:31) (H1), WVRQAPGKGLEWVA (SEQ ID N0.32) (H2), RFTISRDDSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR (SEQ ID NO:33) (H3), WGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:34) (H4).

Un "marco de consenso del subgrupo I de VL" comprende la secuencia de consenso obtenida de las secuencias de aminoácidos en el subgrupo I kappa liviano variable de Kabat et al., supra. En una forma de realización, la secuencia de aminoácidos de marco de consenso del subgrupo I de VH comprende por lo menos una porción o toda de cada una de las siguientes secuencias: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC (SEQ ID NO:35) (L1), WYQQKPGKAPKLLIY (SEQ ID NO:36) (L2), GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC (SEQ ID NO:37) (L3), FGQGTKVEIKR (SEQ ID NO:38) (L4).

Una "modificación de aminoácidos" en una posición especificada, por ejemplo de la región Fe, se refiere a la sustitución o supresión del residuo especificado, o a la inserción de por lo menos un residuo de aminoácidos adyacente al residuo especificado. La inserción "adyacente" a un residuo especificado significa la inserción dentro de uno a dos de los residuos de éstos. La inserción puede ser N-terminal o C-terminal con respecto al residuo especificado. La modificación de aminoácidos preferida en la presente es una sustitución.

Un anticuerpo "madurado por afinidad' es uno con una o más alteraciones en una o más HVRs del mismo que dan por resultado una mejora en la afinidad del anticuerpo por el antígeno, en comparación con el anticuerpo parental que no posee aquellas alteraciones. En una forma de realización, un anticuerpo madurado por afinidad tiene afinidades nanomolares o aún picomolares con respecto al antígeno objetivo. Los anticuerpos madurados por afinidad son producidos por procedimientos conocidos en el arte. Por ejemplo, Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992) describe la maduración por afinidad por transposición de dominios VH y VL. La mutagénesis aleatoria de HVR y/o residuos de marco se describe, por ejemplo, en: Barbas et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809-3813 (1994); Schier ef al., Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et al., J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995); y Hawkins ef al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

Un anticuerpo que "se une específicamente a" o es "específico con respecto a" un polipéptido o un epitopo particular en un polipéptido particular es uno que se une a un polipéptido o epitopo particular en un polipéptido particular sin unirse sustancialmente a cualquier otro polipéptido o epitopo de un polipéptido. Por ejemplo, los anticuerpos específicos de M1 ' de la presente invención son específicos con respecto al segmento extracelular M1 ' de IgE hallado en la IgE de membrana en células B, pero que no está presente en la IgE segregada. En algunas formas de realización, el anticuerpo que se une al segmento M1' de la IgE tiene una constante de disociación (Kd) de < 1µ?, < 100 nM, < 10 nM,= 1 nM, = 0,1 nM,= 0,01 nM o= 0,001 nM (por ejemplo, 10"8 M o menos, por ejemplo de ??^ ? a 10"13 M, por ejemplo, de 10"9 M a 10-13 M).

Los anticuerpos que "inducen apoptosis" o que son "apoptóticos" son aquellos que inducen la muerte celular programada como se determina por ensayos de apoptosis estándar, tal como la unión de anexina V, la fragmentación de ADN, contracción celular, la dilatación del retículo endoplasmático, la fragmentación celular y/o la formación de vesículas de membrana (denominadas cuerpos apoptóticos). Por ejemplo, la actividad apoptótica de los anticuerpos anti-IgE de la presente invención se puede mostrar tiñendo las células IgE unida a la superficie con anexina V.

La expresión "IgE sérica tota!' o "IgE total en suero" se refiere a una cantidad total de IgE presente en una muestra de suero.

La expresión "IgE específica de un alérgeno" se refiere a una IgE que es específica con respecto a un antígeno particular, que resulta de una exposición inicial a un alérgeno en un proceso conocido como sensibilización alérgica, y que se une a la superficie de los mastocitos y basófilos y que puede dar por resultado la activación de los mastocitos y basófilos después de la exposición subsiguiente al mismo alérgeno. Varios factores mitógenos en virus (por ejemplo, Cytomegalovirus - CMV), bacterias (por ejemplo, Staphylococcus), helmintos (por ejemplo, Ascaris, Schistosoma) y factores adyuvantes en la contaminación del aire (por ejemplo, humo de cigarrillos y gases de escape de diesel) estimulan la producción de moléculas de IgE sin iniciar una sensibilización de IgE específica del alérgeno. Así, como los niveles de IgE pueden elevarse de una manera que no predispone necesariamente al huésped a tornarse más susceptible a un trastorno mediado por IgE, los niveles de IgE específicos de un alérgeno se usan algunas veces en las evaluaciones clínicas.! Como se usa en la presente, un nivel de "línea de base" (tal como un nivel de línea de base para la IgE total sérica, y la IgE específica de un alérgeno) en un humano se refiere al nivel antes de la administración de un anticuerpo anti-lgE descripto en la presente al ser humano.

La expresión "agotar células B que expresan lgE-M1" significa la capacidad de agotar una o más células B alteradas por IgE, plasmablastos de IgE o células B de memoria de IgE, reduciendo en consecuencia la población de, o la efectividad de las células B que segregan específicamente la IgE (es decir, las células, plasmáticas), pero no afecta significativamente la población o la efectividad de las células B que segregan otras inmunoglobulina, tales como las lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA e Ig .

La expresión "fase sólida" describe una matriz no acuosa a la cual se puede adherir el anticuerpo de la presente invención. Ejemplos de fases sólidas comprendidos en la presente incluyen aquellos formados parcialmente o enteramente de vidrio (por ejemplo, vidrio de porosidad controlada), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En algunas formas de realización, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender la cavidad de una placa de ensayo; en otras es una columna de purificación (por ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). Este término también incluye una fase sólida discontinua de partículas discretas, tales como aquellas descriptas en la patente U.S. No. 4.275.149.

Las "funciones efectoras" del anticuerpo se refieren a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante de secuencia de aminoácidos) de un anticuerpo, y varían con el isotipo del anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras del anticuerpo incluyen: unión al C1q y citotoxicidad dependiente del complemento; la unión al receptor de Fe; citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCC); fagocitosis; regulación hacia abajo de los receptores de superficie de las células (por ejemplo, receptores de las células B); y activación de las células B.

"Citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo" o ADCC se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual la Ig segregada unida a receptores de Fe (FcRs) presentes en algunas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permiten que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula objetivo que lleva un antígeno y subsiguientemente eliminan la célula objetivo con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" a las células citotóxicas y se requieren para eliminar la célula objetivo por este mecanismo. Las células primarias para mediar en ADCC, las células NK, expresan FCYRIII solamente, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FCYRII y FCYRIII. La expresión de Fe en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 en la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, tal como el que se describe en la patente U.S. No. 5.500.362 o 5.821.337. Las células efectoras útiles para tales ensayos incluyen células mononucleares de la sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK). Alternativamente o adicionalmente, la actividad ADCC de la molécula de interés puede ser evaluada in vivo, por ejemplo, en un modelo animal tal como el divulgado en Clynes eí a/., PNAS USA 95:652-656 (1998).

A menos que se indique de otra manera en la presente, la numeración de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina es la del índice EU como en Kabat ef al., supra. El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo lgG1 EU humano.

La expresión "región Fe" en la presente se usa para definir una región C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, incluyendo regiones Fe de secuencias nativas y regiones Fe variantes. Aunque los límites de la región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región Fe de cadena pesada de IgG humana se define usualmente para la extensión de un residuo de aminoácidos en la posición Cys226, o de Pro230, al extremo carboxilo de estos. La lisina C-terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración de EU) de la región Fe puede ser removida, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o por ingeniería genética recombinante del ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 removidos, las poblaciones de anticuerpos sin residuos K447 removidos y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447. Las regiones Fe de secuencias nativas Fe para usar en los anticuerpos de la invención incluyen las lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4 humanas.

El "receptor Fe" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. La FcR preferida es una FcR humana de secuencia nativa. Además, una FcR preferida es una que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI, FcyRIl y FCYRIII, incluyendo variantes alélicas y alternativamente formas de corte y empalme de estos receptores, los receptores FcyRI I incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplasmáticos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina inmunoreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición basado en tirosina inmunoreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático (ver M. Daéron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Las FcRs son revisadas en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126. 330-^41 (1995). Otras FcRs, incluyendo aquellas a ser identificadas en el futuro, están comprendidas por el término "FcR" en la presente.

La expresión "receptor Fe" o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable de la transferencia de IgGs maternales al feto. Guyer et al., J. Immunol. 117: 587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994). Se conocen métodos para medir la unión a FcRn (ver, por ejemplo, Ghetie y Ward, Immunol. Today 18: (12): 592-8 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology 15 (7): 637-40 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279 (8): 6213-6 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.).

La unión a FcRn in vivo y la vida media sérica polipéptidos de unión de alta afinidad por FcRn humanos puede ser ensayada, por ejemplo, en ratones transgénicos o líneas celulares humanas que expresan el FcRn humano, o en primates a los cuales se administran los polipéptidos que tienen una región Fe variante. La WO 2004/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpos que mejoraron o disminuyeron la unión a los FcRs. Ver también, por ejemplo, Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).

"Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. Preferentemente, las células expresan por lo menos el FcyRIII y realizan la función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median la ADCC incluyen las células mononucleares de la sangre periférica (PBMC), las células asesinas naturales (NK), los monocitos, las células T citotóxicas y los neutrófilos, prefiriéndose las células PBMCs y MNK. Las células efectoras pueden ser aisladas de una fuente nativa, por ejemplo, sangre.

"Citotoxicidad dependiente del complemento" o "COC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en presencia de un complemento. La activación de la vía de complemento clásica es iniciada por la unión del primer componente del sistema de complementos (C1q) a anticuerpos (de la subclase apropiada) que son unidos a su antígeno cognato. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo CDC, por ejemplo, como se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996).

Las variantes de polipéptidos con secuencias de aminoácidos de región Fe alterada y capacidad de unión a C1q aumentada o disminuida se describen en las patentes US Nos. 6.194.551 B1 y W099/51642. El contenido de esas publicaciones de patentes es incorporado específicamente en la presente por referencia. Ver, también, Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-^4184 (2000).

El carbohidrato unido a la región Fe puede ser alterado. Los anticuerpos nativos producidos por células de mamíferos comprenden típicamente un oligosacárido biantenario, ramificado que está unido generalmente por una unión N a Asn297 del dominio CH2 de la región Fe. Ver, por ejemplo, Wright et al. (1997) TIBTECH 15:26-32. El oligosacárido puede incluir varios carbohidratos, por ejemplo, mañosa, N-acetil glucosamina (GIcNAc), galactosa y ácido siálico, así como también una fucosa unida a una GIcNAc en el "tallo" de la estructura de oligosacárido biantenario. En algunas formas de realización, las modificaciones del oligosacárido en una IgG pueden ser realizadas para crear IgGs con algunas propiedades mejoradas adicionalmente.

Por ejemplo, se proveen modificaciones de anticuerpos que tienen una estructura de carbohidratos que no tienen la fucosa unida (directamente o indirectamente) a una región Fe. Tales modificaciones pueden tener una función ADCC mejorada. Ver, por ejemplo, las publicaciones de patentes US Nos. US 2003/0157108 (Presta, L); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Ejemplos de publicaciones relacionadas con modificaciones de anticuerpos "defucosiladas" o "deficientes en fucosa" incluyen: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. MoL Biol. 336: 1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004). Ejemplos de líneas celulares capaces de producir anticuerpos defucosilados incluyen células Lee 13 CHO deficientes en fucosilación de proteínas (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); solicitud de patente US publicada No. 2003/0157108 Al, Presta, L; y WO 2004/056312 Al, Adams et al., especialmente en el Ejemplo 11), y líneas celulares "knockouf, tales como el gen de la alfa-1 ,6-fucosiltransferasa, FUT8, células CHO "knockouf (ver, por ejemplo, Yamane-Ohnuki et al., Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kya, Y. et al, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); y WO 2003/085107).

"Afinidad de unión" se refiere en general a la fuerza de la suma total de interacciones no covalentes entre un sólo sitio de unión de una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) y su parte asociada de unión (por ejemplo, un antígeno). A menos que se indique de otra manera, como se usa en la presente, "afinidad de unión" se refiere a la afinidad de unión intrínseca que refleja una interacción 1 :1 entre miembros de un par de unión (por ejemplo, anticuerpo y antígeno). La afinidad de una molécula X por su parte asociada Y puede estar representada generalmente por la constante de disociación (Kd). La afinidad puede medirse por métodos comunes conocidos en el arte, incluyendo aquellas descriptas en la presente. Los anticuerpos de baja afinidad se unen al antígeno en general lentamente y tienden a disociarse rápidamente, mientras que los anticuerpos de alta afinidad en general se unen al antígeno en forma más rápida y tienden a permanecer unidas más tiempo. Una variedad de métodos de medición de la afinidad de unión se conocen en el arte, cualquiera de los cuales se puede usar para los propósitos de la presente invención. Formas de realización ejemplificadoras e ilustrativas específicas para medir la afinidad de unión se describen a continuación.

En una forma de realización, el "Kd" o "valor Kd" de acuerdo con esta invención se mide por un ensayo de unión al antígeno radiomarcado (RIA) realizado con la versión Fab de un anticuerpo de interés y su antígeno como se describe en el siguiente ensayo. La afinidad de unión en solución de Fabs por el antígeno se mide equilibrando el Fab con una concentración mínima de antígeno marcado con (125l) en presencia de una serie de titulación de un antígeno no marcado, luego capturando el antígeno unido con una placa recubierto con el antígeno anti-Fab (ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)). Para establecer condiciones para el ensayo, las placas de microtitulación (DYNEX Technologies, Inc.) son recubiertas durante la noche con 5 pg/ml de un anticuerpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) en 50 mM de carbonato de sodio (pH 9,6) y bloqueadas subsiguientemente con 2% (w/v) de albúmina sérica bovina en PBS durante dos a cinco horas a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). En una placa no adsorbente (Nunc #269620), se mezclan 100 pM o 26 pM de [125l]-antígeno con diluciones seriadas de un Fab de interés (por ejemplo, que concuerda con la evaluación del anticuerpo anti-VEGF, Fab-12, en Presta et al., Cáncer Res. 57:4593-4599 (1997)). El Fab de interés es incubado luego durante la noche; sin embargo, la incubación puede continuar durante un período prolongado (por ejemplo, aproximadamente 65 horas) para asegurar que se alcanza el equilibrio. Luego las mezclas se transfieren a la placa de captura para incubación a temperatura amiente (por ejemplo, durante una hora). Luego se retira la solución y se lava la placa ocho veces con 0,1 % de tensioactivo TWEEN-20™ en PBS. Cuando se secaron las placas, se agregan 150 µ?/cavidad de centelleo (MICROSCINT-20™; Packard), y las placas son contadas con un contador gamma TOPCOUNT™ (Packard) durante diez minutos. Las concentraciones de cada Fab que dan menos que, o igual a 20% de unión máxima se eligen para usar en ensayos de unión competitivos.

De acuerdo con otra forma de realización, se mide el Kd usando ensayos de resonancia de plasmón superficial usando un instrumento BIACORE®-2000 o BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) a 25 °C con chips CM5 de antígeno inmovilizado a -10 unidades de respuesta (RU). Brevemente, se activan chips biosensores de dextrano carboximetilados (C 5, BIAcore Inc.) con clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) y N-hidroxisuccinimida (NHS) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. El antígeno es diluido con 10 mM de acetato de sodio, pH 4,8, a 5 pg/ml (~0,2 µ?) antes de la inyección a un caudal de 5 µ?/minuto para alcanzar aproximadamente 10 unidades de respuesta (RU) de proteína acoplada. Después de la inyección de antígeno, se inyecta 1 M etanolamina para bloquear grupos que no reaccionaron. Para las mediciones cinéticas, se inyectan diluciones seriadas dos veces de Fab (0,78 nM a 500 nM) en PBS con 0,05% de tensioactivo TWEEN 20™ (PBST) a 25 °C a un caudal de aproximadamente 25 µ?/min. Las tasas de asociación (kon) y las tasas de disociación (kdef) se calculan usando un modelo de unión de Langmuir uno a uno simple (BIAcore® Evaluation Software versión 3.2) ajustando simultáneamente los sensorgramas de asociación y disociación. La constante de disociación de equilibrio (Kd) se calcula como la relación kdef k0n- Ver, por ejemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Si la tasa "on" excede 106 M_1 s"1 por el ensayo de resonancia del plasmón superficial mencionado más arriba, entonces la tasa "on" puede ser determinada usando una técnica de extinción fluorescente que mide el aumento o la disminución de la intensidad de emisión de fluorescencia (excitación = 295 nm; emisión = 340 nm, 16 nm "by-pass") a 25 °C de 20 nM de un anticuerpo antiantígeno (forma Fab) en PBS, pH 7,2, en presencia de concentraciones crecientes de antígeno según se mide en un espectrómetro, tal como un espectrómetro equipado con "stop-flow" (Aviv Instruments) o un espectrofotómetro serie 8000 de SLM-AMINCO™ (ThermoSpectronic) con una cubeta agitada.

Una "tasa on", "tasa de asociación", "tasa asociativa" o ukon" de acuerdo con esta invención también puede ser determinada como se describe más arriba usando un sistema BIACORE^OOO o BIACORE®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ).

La frase "sustancia/mente reducido" o "sustancia/mente diferente", como se usa en la presente, denota un grado suficientemente alto de diferencia entre dos valores numéricos (generalmente uno asociado con una molécula y el otro asociado con una molécula de referencia/de comparación) de tal modo que un experto en el arte consideraría que la diferencia entre los dos valores sería de significancia estadística en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd). La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, mayor que aproximadamente 10%, mayor que aproximadamente 20%, mayor qué aproximadamente 30%, mayor que aproximadamente 40% y/o mayor que aproximadamente 50% en función del valor para la molécula de referencia/de comparación.

La expresión "sustancialmente similar" o "sustancialmente el mismo" como se usa en la presente, denota un grado suficientemente alto de similitud entre dos valores numéricos (por ejemplo, uno asociado con un anticuerpo de la invención y el otro asociado con un anticuerpo de referencia/de comparación), de tal modo que un experto en el arte consideraría que la diferencia entre los dos valores sería de poca o ninguna significancia biológica y/o estadística en el contexto de la característica biológica medida por dichos valores (por ejemplo, valores Kd). La diferencia entre dichos dos valores es, por ejemplo, menos de aproximadamente 50%, menos de aproximadamente 40%, menos de aproximadamente 30%, menos de aproximadamente 20%, y/o menos de aproximadamente 10% en función del valor de referencia/de comparación.

"Porcentaje (%) de identidad de secuencia de aminoácidos" y "homología" con respecto a una secuencia de péptido, polipéptido o anticuerpo se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidato que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de péptido o polipéptido específica, después de alinear las secuencias e introducir huecos ("gaps"), si es necesarios, para alcanzar el máximo de identidad de secuencia por ciento y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. El alineamiento con propósitos de determinar la identidad de secuencia de aminoácidos por ciento se puede lograr de varias maneras que se encuentran comprendidas en el conocimiento del experto en el arte, por ejemplo, usando software de computación disponible públicamente tal como software BLAST, BLAST-2, ALIGN o MEGALIGN™ (DNASTAR). Los expertos en el arte pueden determinar parámetros apropiados para medir el alineamiento, incluyendo cualesquiera algoritmos requeridos para alcanzar el máximo alineamiento en toda la longitud de las secuencias que se comparan. Para los propósitos de la presente, sin embargo, los valores de identidad de secuencia de aminoácidos % son generados usando el programa de computación de comparación de secuencias ALIGN-2, de propiedad de Genentech, Inc. El código fuente de ALIGN-2 ha sido llenado con documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, en donde está registrado bajo el No. de registro U.S. Copyright Registration No. TXU510087. El programa ALIGN-2 se encuentra disponible públicamente a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California. El programa ALIGN-2 debería ser compilado para el uso en un sistema operativo UNIX, preferentemente UNIX V4.0D digital. Todos los parámetros de comparación de secuencias son fijados por el programa ALIGN-2 y no varían.

En situaciones en donde se emplea ALIGN-2 para comparaciones de secuencias de aminoácidos, la identidad de secuencias de aminoácidos % de una secuencia de aminoácidos dada A con respecto a, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B (que puede ser expresado alternativamente como una secuencia de aminoácidos dada A que tiene o comprende una cierta identidad de secuencias de aminoácidos % con respecto a, con, o contra una secuencia de aminoácidos dada B) se calcula como sigue: 100 veces la fracción X/Y en donde X es el número de residuos de aminoácidos evaluados como apareamientos idénticos por el programa de alineamiento de secuencias ALIGN-2 en el alineamiento de A y B del programa, y en donde Y es el número total de residuos de aminoácidos en B. Se apreciará que en donde la longitud de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el % de identidad de secuencias de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al % de identidad de secuencias de aminoácidos secuencia de B con respecto a A.

A menos que se indique específicamente de otra manera, todos los valores de % de identidad de secuencias de aminoácidos usados en la presente se obtienen como se describe en el párrafo inmediatamente precedente usando el programa de computación ALIGN-2.

Una molécula de ácido nucleico "aislada" que codifica los anticuerpos en la presente es una molécula de ácido nucleico que es identificada y separada de por lo menos una molécula de ácido nucleico contaminante con la cual está asociada comúnmente en el medio ambiente en el cual se produjo. Preferentemente, el ácido nucleico aislado está libre de asociación con todos los componentes asociados con el medio ambiente de producción. Las moléculas de ácidos nucleicos aisladas que codifican los polipéptidos y anticuerpos en la presente se encuentran en una forma distinta que la forma o presentación en la cual se encuentran en la naturaleza. Las moléculas de ácidos nucleicos aisladas se distinguen por lo tanto del ácido nucleico que codifica los polipéptidos y anticuerpos en la presente que existen naturalmente en las células.

La expresión "secuencias control' se refiere a secuencias de ADN necesarias para la expresión de una secuencia de codificación unida en forma operativa en un organismo huésped particular. Las secuencias control que son adecuadas para los procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una secuencia operadora, y un sito de unión a ribosomas. Se conoce que las células eucarióticas utilizan promotores, señales de poliadenilación e intensificadores.

El ácido nucleico está "unido en forma operativa" cuando es colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN para una presecuencia o conductor segregador está unido en forma operativa con el ADN para un polipéptido si está expresado como una preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador está unido en forma operativa con una secuencia codificadora si afecta la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión al ribosoma está unido en forma operativa con una secuencia codificadora si está posicionado de modo de facilitar la traducción. En general, "unido en forma operativa" significa que las secuencias de ADN que se están uniendo son contiguas, y, en el caso de un conductor segregador, contiguas y en fase de lectura. Sin embargo, los intensificadores no tienen que ser contiguos. La unión se logra por la ligadura en sitios de restricción convenientes. Si tales sitios no existen, se usan los adaptadores de oligonucleótidos sintéticos o ligadores de acuerdo con la práctica convencional.

Una formulación "estable" es una en la cual la proteína en la misma retiene esencialmente su estabilidad e integridad física y química durante el almacenamiento. Varias técnicas analíticas para medir la estabilidad de las proteínas se encuentran disponibles en el arte y son revisadas en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, New York, Pubs. (1991) y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). La estabilidad puede medirse a una temperatura seleccionada durante un período de tiempo seleccionado. Para un examen rápido, la formulación puede mantenerse a 40 °C durante 2 semanas a 1 mes, momento en el que se mide la estabilidad. En donde la formulación tiene que almacenarse a 2-8 °C, en general la formulación debería ser estable a 30 °C o 40 °C durante por lo menos 1 mes y/o estable a 2-8 °C durante por lo menos 2 años. En donde la formulación debe almacenarse a 30 °C, en general la formulación debería ser estable durante por lo menos 2 años a 30 °C y/o estable a 40 °C durante por lo menos 6 meses. Por ejemplo, la medida de la aglomeración durante el almacenamiento puede ser usada como un indicador de la estabilidad de la proteína. Así, una formulación "estable" puede ser una en donde menos de aproximadamente 10% y preferentemente menos de aproximadamente 5% de la proteína está presente como un aglomerado en la formulación. En otras formas de realización, se puede determinar cualquier aumento de la formación de aglomerados durante el almacenamiento de la formulación.

Una formulación "reconstituida" es una que ha sido preparada disolviendo una formulación de proteína o anticuerpo liofilizada en un diluyente de tal modo que la proteína se encuentra dispersada en ella. La formulación reconstituida es adecuada para la administración (por ejemplo, administración parenteral) a un paciente que debe ser tratado con la proteína de interés y, en algunas formas de realización de la invención, puede ser una que es adecuada para la administración subcutánea.

Una formulación "isotónica" es una que tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las formulaciones ¡sotónicas tendrán en general una presión osmótica de alrededor de 250 a 350 mOsm. El término "hipotónica" describe una formulación con una presión osmótica menor que la de la sangre humana. Correspondientemente, el término "hipertónica" se usa para describir una formulación con una presión osmótica por encima de la de la sangre humana. La isotonicidad puede medirse, por ejemplo, usando un osmómetro de presión de vapor o de punto de congelación. Las formulaciones de la presente invención son hipertónicas como resultado de la adición de sal y/o buffer.

"Vehículos" como se usa en la presente incluyen vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes o estabilizantes que no son tóxicos para la célula o el mamífero expuesto ellos a las dosificaciones y concentraciones empleadas. Frecuentemente, el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución acuosa con buffer de pH. Ejemplos de vehículos fisiológicamente aceptables incluyen buffer tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico; polipéptido de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como alúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes, tales como EDTA; alcoholes de azúcar tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG), y PLURONICS™.

Un "inserto del envase" se refiere a instrucciones incluidas comúnmente en los envases comerciales de medicamentos que contienen información acerca de las indicaciones incluidas comúnmente en los envases comerciales de medicamentos que contienen información acerca de las indicaciones, el uso, la dosificación, la administración, las contraindicaciones, otros medicamentos a ser combinados con el producto envasado y/o advertencias con respecto al uso de tales medicamentos, etc.

Un "ácido farmacéuticamente aceptable" incluye ácidos inorgánicos y orgánicos que no son tóxicos a la concentración y en la manera en la que son formulados. Por ejemplo, ácidos inorgánicos adecuados incluyen los ácidos clorhídrico, perclórico, bromhídrico, yodhídrico, nítrico, sulfúrico, sulfónico, sulfínico, sulfanílico, fosfórico, carbónico, etc. Los ácidos orgánicos adecuados incluyen los ácidos alquílicos de cadena recta y ramificada, aromáticos, cíclicos, cicloalifáticos, arilalifáticos, heterocíclicos, saturados, insaturados, mono, di- y trí— carboxílicos, incluyendo por ejemplo, los ácidos fórmico, acético, 2-hidroxiacético, trifluoroacético, fenilacético, trimetilacético, í-butilacético, antranílico, propanoico, 2- hidroxipropanoico, 2-oxopropanoico, propanodioico, ciclopentanopropiónico, ciclopentano propiónico, 3-fenilpropiónico, butanoico, butanodioico, benzoico, 3-(4-hidroxibenzoil)benzoico, 2-acetoxi-benzoico, ascórbico, cinámico, laurilsulfúrico, esteárico, mucónico, mandélico, succínico, embónico, fumárico, málico, maleico, hidroximaleico, malónico, láctico, cítrico, tartárico, glicólico, glicónico, glucónico, pirúvico, glioxálico, oxálico, mesílico, succínico, salicílico, itálico, palmoico, palmeico, tiociánico, meta nos ulfón ico, etanosulfónico, 1 ,2-etanodisulfónico, 2-hidroxietanosulfónico, bencenesulfónico, 4-clorobencenosulfónico, naftaleno-2-sulfónico, p-toluenosulfónico, canfosulfónico, 4-metilbiciclo[2.2.21-oct-2-enc— 1-carboxílico, glucoheptónico, 4,4'-metilenobis- 3- (hidroxi-2-eno-1-carboxílico), hidroxinaftoico.

"Bases farmacéuticamente aceptables" incluyen bases inorgánicas y orgánicas que no son tóxicas a la concentración y en la manera en la que son formuladas. Por ejemplo, las bases adecuadas incluyen aquellas formadas con metales de bases inorgánicas tales como litio, sodio, potasio, magnesio, calcio, amonio, hierro, zinc, cobre, manganeso, aluminio, N-metilglucamina, morfolina, piperidina y bases no tóxicas orgánicas que incluyen, aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas, aminas cíclicas y resinas básicas de intercambio de iones [por ejemplo, N(R')4+ (en donde R' es independientemente H o alquilo Ci_4, por ejemplo, amonio, Tris)], por ejemplo, isopropilamina, trimetilamina, dietilamina, trietilamina, tripropilamina, etanolamina, 2-dietilaminoetanol, trimetamina, diciclohexilamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilendiamina, glucosamina, metilglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N— etilpiperidina, resinas de poliamina y similares. Las bases no tóxicas orgánicas particularmente preferidas son isopropilamina, dietilamina, etanolamina, trimetamina, diciclohexilamina, colina y cafeína.

Los ácidos y bases farmacéuticamente aceptables adicionales que se pueden usar con la presente invención incluyen aquellos que se derivan de los aminoácidos, por ejemplo, histidina, glicina, fenilalanina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina y asparagina.

Buffer y sales "farmacéuticamente aceptables" incluyen aquellos derivados de sales de adición de ácidos y bases de los ácidos y bases indicados más arriba. Los buffer y/o sales específicos incluyen histidina, succinato y acetato.

Un "azúcar farmacéuticamente aceptable" es una molécula que, cuando se combina con una proteína de interés, evita o reduce significativamente la inestabilidad química y/o física de la proteína durante el almacenamiento. Cuando se pretende liofilizar y luego reconstituir la formulación, los "azúcares farmacéuticamente aceptables" también pueden ser conocidos como "lioprotector". Los azúcares ilustrativos y sus alcoholes de azúcar correspondientes incluyen: un aminoácido tal como glutamato monosódico o histidina; una metilamina tal como betaína; una sal liotrópica tal como sulfato de magnesio; un poliol tal como alcoholes de azúcar trihídricos o de peso molecular más alto, por ejemplo glicerina, dextrano, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol; propilenglicol; polietilenglicol; PLURONICS®; y combinaciones de estos. Los lioprotectores ilustrativos adicionales incluyen glicerina y gelatina, y los azúcares melibiosa, melezitosa, rafinosa, manotriosa y estaquiosa. Ejemplos de azúcares reductores incluyen glucosa, maltosa, lactosa, maltulosa, iso-maltulosa y lactulosa. Ejemplos de azúcares no reductores incluyen glicósidos no reductores de compuestos polihidroxi seleccionados entre alcoholes de azúcares y otros polialcoholes de cadena recta. Los alcoholes de azúcar preferidos son monoglicósidos, especialmente aquellos compuestos obtenidos por reducción de disacáridos tales como lactosa, maltosa, lactulosa y maltulosa. El grupo lateral glicosídico puede ser o bien glucosídico o galactosídico. Ejemplos adicionales de alcoholes de azúcar son glucitol, maltitol, lactitol e iso-maltulosa. Los azúcares farmacéuticamente aceptables preferidos son los azúcares no reductores trehalosa o sacarosa. Los azúcares farmacéuticamente aceptables se agregan a la formulación en una "cantidad protectora" (por ejemplo, preliofilización) lo que significa que la proteína retiene esencialmente su estabilidad e integridad física y química durante el almacenamiento (por ejemplo, después de la reconstitución y el almacenamiento).

El "diluyente" de interés en la presente es uno que es farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para la administración a un human) y es útil para la preparación de una formulación líquida, tal como una formulación reconstituida después de la liofilización. Diluyentes ilustrativos incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución con buffer pH (por ejemplo, solución salina con buffer fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa. En una forma de realización alternativa, los diluyentes pueden incluir soluciones acuosas de sales y/o buffer.

Un "conservante" es un compuesto que puede ser agregado a las formulaciones en la presente para reducir la actividad bacteriana. La adición de un conservante puede facilitar, por ejemplo, la producción de una formulación multiuso (dosis múltiple). Ejemplos de conservantes potenciales incluyen cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio (una mezcla de cloruros de alquilbencildimetilamonio en la cual los grupos alquilo son compuestos de cadena larga) y cloruro de benzetonio. Otros tipos de conservantes incluyen alcoholes aromáticos tales como fenol, alcohol butílico y bencílico, alquilparabenos tales como metil- o propil-parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol y m-cresol. El conservante que más se prefiere en la presente es el alcohol bencílico.

Como se usa en la presente, el término "tratamiento" se refiere a la intervención clínica para alterar el curso natural del individuo o célula que se está tratando durante el curso de la patología clínica. Los efectos deseables de tratamiento incluyen disminuir la tasa de avance de la enfermedad, mejorar o paliar el estado de la enfermedad y la remisión o el pronóstico mejorado. En algunas formas de realización, el tratamiento mejora el control del asma, reduce las exacerbaciones del asma, mejora la función pulmonar y/o mejora los síntomas informados por el paciente. Un individuo es "tratado" exitosamente, por ejemplo, si uno o más de los síntomas asociados con un trastorno mediado por IgE son mitigados o eliminados.

Como se usa en la presente, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento además de otra modalidad de tratamiento. Por lo tanto, "junto con" se refiere a la administración de una modalidad de tratamiento antes, durante o después de la administración de la otra modalidad de tratamiento al individuo.

Como se usa en la presente, el término "prevención" incluye proveer profilaxis con respecto a la aparición o recurrencia de una enfermedad en un individuo. Un individuo puede estar predispuesto a, ser susceptible a presentar un trastorno mediado por IgE, o estar en riesgo de desarrollar un trastorno mediado por IgE, pero aún no se le ha diagnosticado el trastorno. En algunas formas de realización, los anticuerpos anti-lgE descriptos en la presente se usan para retardar el desarrollo de un trastorno mediado por IgE. En algunas formas de realización, los anticuerpos anti-lgE descriptos en la presente previenen las exacerbaciones del asma y/o los estados de declinación de la función pulmonar o el asma. En algunas formas de realización, los anticuerpos anti-lgE descriptos en la presente previenen la respuesta inmunológica mediada por IgE.

Como se usa en la presente, un individuo "en riesgo" de desarrollar un trastorno mediado por IgE puede o no tener una enfermedad o síntomas de la enfermedad detectables, y puede o no haber presentado la enfermedad o síntomas de la enfermedad detectables antes de los métodos de tratamiento descriptos en la presente. ?? riesgo" denota que un individuo tiene uno o más factores de riesgo, que son parámetros mensurables que están correlacionados con el desarrollo del trastorno medado por IgE, como se conoce en el arte. Un individual que tiene uno o más de estos factores de riesgo tiene una mayor probabilidad de desarrollar el trastorno que un individuo que no tiene uno o más de estos factores de riesgo.

Una "cantidad efectiva" se refiere a por lo menos una cantidad efectiva, a dosificaciones y durante períodos de tiempo necesarios, para lograr el efecto deseado o indicado, incluyendo un resultado terapéutico o profiláctico. Una cantidad efectiva puede proveerse en una o más administraciones.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" es por lo menos la concentración mínima requerida para lograr una mejor mensurable de un trastorno particular. Una cantidad terapéuticamente efectiva en la presente puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del paciente, y la capacidad del anticuerpo de provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual los efectos terapéuticamente beneficiosos superan a los efectos tóxicos o perjudiciales del anticuerpo. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosificaciones y durante los períodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente, pero no necesariamente, ya que una dosis profiláctica se usa en sujetos antes de, o en la etapa más temprana de, la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva puede ser menor que la cantidad terapéuticamente efectiva.

Administración "crónica" se refiere a la administración del o de los medicamentos en un modo continuo en contraposición a modo agudo, de modo de mantener el efecto (actividad) terapéutico inicial durante un período de tiempo extendido. Administración "intermitente" es el tratamiento que no se realiza en forma consecutiva sin interrupción, sino más bien es de naturaleza cíclica.

Como se usa en la presente, un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero. Un "mamífero" a los fines del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo los seres humanos, los animales domésticos y de granja, y animales del zoológico, de los deportes, o mascotas, tales como perros, caballos, conejos, ganado vacuno, cerdos, hámsters, gerbos, ratones, hurones, ratas, gatos, etc. Preferentemente, el mamífero es un ser humano.

El término "formulación farmacéutica" se refiere a un preparado que se encuentra en una forma tal que permite que la actividad biológica del ingrediente activo sea efectiva, y que no contiene componentes adicionales que sean inaceptablemente tóxicos para un sujeto al cual se administraría la formulación. Tales formulaciones son estériles.

Una formulación "esté/7/" es aséptica o libre de todos los microorganismos vivientes y sus esporos.

Un "antihistamínico" como se usa en la presente es un agente que antagoniza el efecto fisiológico de la histamina. La unión de la histamina a sus receptores, Hi y hb da por resultado los síntomas alérgicos característicos y los efectos de picazón, enrojecimiento, hinchazón, etc. Muchos antihistamínicos actúan bloqueando la unión de la histamina a sus receptores, Hi, H2; sin embargo, se cree que otros actúan inhibiendo la liberación de histamina. Ejemplos de antihistamínicos son clorfeniramina, difenhidramina, prometazina, cromolín sódico, astemizol, maleato de azatadina, maleato de bromfeniramina, maleato de carbinoxamina, clorhidrato de cetirizina, fumarato de clemastina, clorhidrato de ciproheptadina, maleato de dexbromfeniramina, maleato de dexclorfeniramina, dimenhidrinato, clorhidrato de difenhidramina, succinato de doxilamina, clorhidrato de fexofendadina, clorhidrato de terfenadina, clorhidrato de hidroxizina, loratidina, clorhidrato de meclizina, citrato de tripelanamina, clorhidrato de tripelenamina, clorhidrato de triprolidina.

Un "broncodilatador" como se usa en la presente, describe agentes que antagonizan o revierten la broncoconstricción, un evento fisiológico que ocurre típicamente en las reacciones asmáticas en la fase temprana dando por resultado una capacidad pulmonar disminuida y dificultad para respirar. Ejemplos de broncodilatadores incluyen epinefrina, un alfa- y beta-adrenérgico de amplia acción, y los beta-adrenérgicos, albuterol, pirbuterol, metaproterenol, salmeterol e ¡soetarina. La broncodilatación también se puede lograr mediante la administración de xantinas, incluyendo aminofilina y teofilina.

Un "fármaco antiinflamatorio no esferoide" o "NSAID" (por sus siglas en inglés), como se usa en la presente describe agentes que tienen actividad antiinflamatoria que no están basados en esteroides. Ejemplos de NSAIDs incluyen acematacina, acetaminofeno, aspirina, azapropazona, benorilato, bromfenac sódico, inhibidores de la ciclooxigenasa (COX)-2 tales como GR 253035, MK966, celecoxib (CELEBREX®; 4-(5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1 H— pirazol— 1— il) benceno-sulfonamida) y valdecoxib (BEXTRA®), diclofenac, diclofenac retard, diclofenac sódico, diflunisal, etodolac, fenbufeno, fenoprofeno cálcico, flurbiprofeno, ibuprofeno, ibuprofeno retard, indometacina, ketoprofeno, meclofenamato sódico, ácido mefenámico, meloxicam (MOBIC®), nabumetona, naproxeno, naproxeno sódico, oxifenbutazona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tenoxicam, ácido tiaprofénico, tolmetina, tolmetina sódica, incluyendo sus sales y derivados, etc.

La expresión "trastornos mediados por IgE' son trastornos asociados con un exceso de actividad o niveles de IgE en los cuales se pueden manifestar los síntomas atípicos debido a niveles de IgE localmente y/o sistémicamente en el cuerpo. Tales trastornos incluyen, asma, dermatitis atópica, rinitis alérgica, fibrosis (por ejemplo, fibrosis pulmonar, tal como IPF). Trastornos mediados por IgE incluyen trastornos atópicos, que están caracterizados por una propensión heredada general a responder inmunológicamente a muchos antígenos comunes ingeridos e inhalados que existen naturalmente y la producción continua de anticuerpos IgE. Los trastornos atópicos específicos incluyen asma alérgica, rinitis alérgica (conjuntivitis), dermatitis atópica, alergia a alimentos, anafilaxis, dermatitis por contacto, gastroenteropatía alérgica, aspergilosis broncopulmonar alérgica y púrpura alérgica (Henoch-Schonlein). Los pacientes atópicos tienen frecuentemente alergias múltiples, lo que significa que tienen anticuerpos IgE con respecto a, y síntomas de, muchos alérgenos ambientales, incluyendo estacionales, perennes y ocupacionales. Ejemplos de alérgenos estacionales son polen (por ejemplo, de pasto, árboles, centeno, hierba timotea, ambrosia), mientras que ejemplos de alérgenos perennes incluyen hongos (por ejemplo, mohos, esporos de mohos), plumas, desechos animales (por ejemplo, caspa de mascotas u otros animales) e insectos (por ejemplo, ácaro del polvo). Ejemplo de alérgenos ocupaciones también incluye antígenos de animales (por ejemplo, ratones) y de plantas así como también drogas, detergentes, metales e inmunointensificadores tales como los isocianatos. Los estímulos específicos no antigénicos que pueden dar por resultado una reacción mediada por IgE incluyen infección, irritantes tales como el humo, gases de combustión, partículas de gases de escape de diesel y dióxido de azufre, ejercicio, frío y estrés emocional. Las reacciones de hipersensibilidad específicas en individuos atópicos y no atópicos con algunos antecedentes genéticos pueden ser el resultado de la exposición a proteínas en alimentos (por ejemplo, legumbres, maní), veneno (por ejemplo, insectos, víboras), vacunas, hormonas, antisuero, enzimas, látex, antibióticos, relajantes musculares, vitaminas, citotoxinas, opiáceos y polisacáridos, tales como dextrina, hierro dextrano y poligelina.

Otros trastornos asociados con elevados niveles de IgE, que parecen ser mediados por IgE y se pueden tratar con las formulaciones de esta presente invención incluyen: ataxia-telangiectasia, síndrome de Churg-Strauss, eczema, enteritis, gastroenteropatía, reacción de injerto versus huésped, síndrome de hiper-lgE (Job's), hipersensibilidad (por ejemplo, hipersensibilidad anafiláctica, candidiasis, vasculitis), mieloma IgE, enfermedad intestinal inflamatoria (por ejemplo, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, colitis indeterminada y colitis infecciosa), mucositis (por ejemplo, mucositis oral, mucositis gastrointestinal, mucositis nasal y proctitis), enterocolitis necrotizante y esofagitis, enfermedades parasitarias (por ejemplo, tripanosomiasis), hipersensibilidad vasculitis, urticaria y síndrome de Wiskott-Aldrich.

Adicionalmente, los trastornos que pueden ser tratados disminuyendo los niveles de IgE, independiente de que los trastornos propiamente dichos estén asociados con elevada IgE, y así deberían ser considerados dentro del alcance de "trastornos mediado por IgE" incluyen: enfermedad de Addison (insuficiencia adrenocortical crónica), alopecia, angioedema hereditario, anigioedema (enfermedad de Bannister, edema angioneurótico), espondilitis anquilosante, anemia aplástica, arteritis, amiloidosis, trastornos inmune, tales como anemia hemolítica autoinmune, ooforitis autoinmune, orquitis autoinmune, falla poliendocrina autoinmune, anemia hemolítica autoinmune, autoinmunocitopenia, glomerulonefritis autoinmune, enfermedad de Behcet, bronquitis, enfermedad de Buerger, penfigoide ampollar, síndrome de Caplan (pneumoconíosis reumatoide), carditis, esprue celíaco, síndrome de Chediak-Higashi, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), síndrome de Cogan-Reese (síndrome endotelial iridocorneal), síndrome de CREST, dermatitis herpetiformis (enfermedad de Duhring), diabetes mellitus, fascitis eosinofílica, nefritis eosinofílica, episcleritis, alveolitis alérgica extrínseca, poliserositis paroxística familiar, síndrome de Felty, alveolitis fibrosante, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, granulocitopenia, granuloma, granulomatosis, granuloma miositis, enfermedad de Graves, síndrome de Guillain-Barre (polineuritis), tiroiditis de Hashimoto (gota linfadeoide), hemocromatosis, histiocitosis, síndrome hipereosinofílico, síndrome del colon irritable, artritis juvenil, queratitis, lepra, lupus eritematoso, enfermedad de Lyell, enfermedad de Lyme, enfermedad del tejido conectivo mixto, mononeuritis, mononeuritis multiplex, síndrome de Muckle-Wells, síndrome linfoide mucocutáneo (enfermedad de Kawasaki), reticulohistiocitosis multicéntrica, esclerosis múltiple, myasthenia gravis, micosis fungoides, paniculitis, pemfigoide, pénfigo, pericarditis, polineuritis, poliarteritis nudosa, psoriasis, artritis psoriática, artritis pulmonar, adenomatosis pulmonar, fibrosis pulmonar, policondritis relapsante, fiebre reumática, artritis reumatoide, rinosinusitis (sinusitis), sarcoidosis, escleritis, colangitis esclerosante, enfermedad del suero, síndrome de Sézary, síndrome de Sjógren, síndrome de Stevens-Johnson, mastocitosis sistémica, rechazo de transplantes, púrpura trombocitopénica, alinfoplasia tímica, uveitis, vitíligo, granulomatosis de Wegener.

El término "asma" se refiere a un trastorno complejo caracterizado por síntomas variables y recurrentes, obstrucción reversible de las vías aéreas (por ejemplo, por broncodllatador) e hiperrespuesta bronquial que puede o no estar asociada con inflamación subyacente. Ejemplos de asma incluyen asma sensible/exacerbada por aspirina, asma atópica, asma severa, asma leve, asma moderada a severa, asma naive a corticosteroides, asma crónica, asma resistente a los corticosteroides, asma refractaria a los corticosteroides, asma no tratada y recién diagnosticada, asma debido a fumar, asma no controlada con corticosteroides y otras asmas como se menciona en J. Allergy Clin. Immunol. (2010) 126(5).926-938.

El síntoma tipo asma incluye un síntoma seleccionado entre el grupo que consiste en dificultad para respirar, tos (cambios en la producción de esputo y/o calidad del esputo y/o frecuencia de la tos), estornudos, opresión en el pecho, broncoconstricción y despertares nocturnos debido a uno de los síntomas arriba mencionados o una combinación de estos síntomas (Juniper et al (2000) Am. J. Respir. Crit. Care Med., 162(4), 1330-1334.).

El término "asma leve" se refiere a un paciente que experimenta generalmente síntomas o exacerbaciones menos de dos veces por semana, síntomas nocturnos menos de dos veces por mes, y es asintomático entre las exacerbaciones. El asma leve, intermitente es tratado frecuentemente según se requiera con lo siguiente: broncodilatadores inhalados (beta 2-agonistas inhalados de acción corta); evitar los disparadores conocidos; vacunación anual contra la influenza; vacunación contra pneumococos cada 6 a 10 años, y en algunos casos, un beta2-agonista inhalado, cromolín, o nedocromil antes de la exposición a disparadores identificados. Si el paciente tiene una necesidad creciente de beta2-agonistas de corta acción (por ejemplo, usa beta2-agonista de corta acción más de tres a cuatro veces en 1 día para una exacerbación aguda o usa más de un recipiente por mes para los síntomas), el paciente puede requerir un avance en la terapia.

El término "asma moderada" se refiere en general al asma en el cual el paciente experimenta exacerbaciones más de dos veces a la semana y las exacerbaciones afectan el sueño y la actividad; el paciente tiene despertares nocturnos debido al asma más de dos veces por mes; el paciente tiene síntomas de asma crónica que requieren la administración de un beta2-agonista inhalado de corta acción diariamente o día por medio; y la línea de base PEF o FEV1 pretratamiento del paciente es 60 a 80 por ciento predicha y la variabilidad PEF es de 20 a 30 por ciento.

La expresión "asma severa" se refiere en general al asma en el cual el paciente tiene síntomas casi continuos, exacerbaciones frecuentes, despertares nocturnos frecuentes debido al asma, actividades limitadas, línea de base PEF o FEV1 menor de 60 por ciento predicha, y variabilidad PEF de 20 a 30 por ciento.

El término "corticosteroide" incluye glucocorticoides y mineralocorticoides. Por ejemplo, corticosteroide incluye, pero no está limitado a fluticasona (incluyendo propionato de fluticasona (FP)), beclometasona, budesónido, ciclesónido, mometasona, flunisolida, betametasona, hidrocortisona, prednisona, prednisolona, metilprednisolona y triamcinolona. "Corticosteroide inhalable" significa un corticosteroide que es adecuado para suministrar por inhalación. Los corticosteroides inhalables ilustrativos son fluticasona, dipropionato de beclometasona, budenósido, furoato de mometasona, ciclesónido, flunisolida, acetónido de triamcinolona y cualquier otro corticosteroide disponible actualmente o que se encuentre disponible en el futuro. Ejemplos de corticosteroides que pueden ser inhalados y son combinados con un beta2-agonista de acción prolongada incluyen, pero no están limitados a: budesonida/formoterol y fluticasona/salmeterol.

Un "glucocorticoide" como se usa en la presente describe agentes basados en esteroldes que tienen actividad antiinflamatoria. Los glucocorticoides se usan comúnmente para atenuar la reacción asmática de fase tardía y para tratar exacerbaciones del asma. Ejemplos de glucocorticoides incluyen prednisona, dipropionato de beclometasona, acetónido de triamcinolona, flunisolida, betametasona, budesónido, dexametasona, dexametasona tramcinolona, acetato de fludrocortisona, flunisolida, propionato de fluticasona, hidrocortisona, prednisolona [incluyendo metilprednisolona (por ejemplo, SOLU-MEDROL® succinato de metilprednisolona sódica)] y triamcinolona.

El término "FEV1" se refiere al volumen de aire exhalado en el primer segundo de una expiración forzada. Es una medida de la obstrucción de las vías aéreas. La concentración provocadora de metacolina requerida para inducir una declinación de 20% en el FEV1 (PC20) es una medida de la hiperrespuesta de las vías aéreas. El FEV1 se puede notar en otras formas similares, por ejemplo, FEV^ y debería entenderse que todas estas variaciones similares tienen el mismo significado.

La expresión "cambio relativo en FEV1" = (FEV1 en la semana 12 de tratamiento - FEV1 antes del comienzo del tratamiento) dividido por FEV1.

Un "trastorno autoinmune" en la presente es una enfermedad o trastorno proveniente de, y dirigido contra, los tejidos u órganos de un individuo, o una cosegregación o manifestación de ésta, o la condición resultante de allí. En muchos de estos trastornos autoinmunes e inflamatorios, puede existir una cantidad de marcadores clínicos y de laboratorio, incluyendo, pero no limitado a, hipergammaglobulinemia, altos niveles de autoanticuerpos, depósitos complejos de antígeno-anticuerpo en tejidos, beneficio de tratamientos con corticosteroides o ¡nmunosupresores, y aglomerados celulares linfoides en tejidos afectados. Sin pretender quedar limitado por una teoría con respecto al trastorno autoinmune mediado por células B, se cree que las células B demuestran un efecto patogénico en las enfermedades autoinmunes humanas a través de numerosas vías mecanísticas, incluyendo la producción de autoanticuerpos, la formación de complejos inmunes, activación dendrítica y de células T, síntesis de citoquinas, liberación directa de quimioquinas y provisión de un nidus para la nec—linfogénesis ectóica. Cada una de estas vías puede participar en diferentes grados en la patología de las enfermedades autoinmunes.

"Enfermedad autoinmune" puede ser una enfermedad específica de un órgano (es decir, la respuesta inmunológica es específicamente dirigida contra un sistema orgánico tal como el sistema endocrino, el sistema hematopoyético, la piel, el sistema cardiopulmonar, los sistemas gastrointestinal y hepático, el sistema renal, el tiroideo, las orejas, el sistema neuromuscular, el sistema nervioso central, etc.) o una enfermedad sistémica que puede afectar múltiples sistemas de órganos (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico (SLE), artritis reumatoide (RA), polimiositis, etc.). Tales enfermedades preferidas incluyen trastornos reumatológicos autoinmunes (tales como, por ejemplo, RA, síndrome de Sjógren, escleroderma, lupus tal como SLE y lupus nefritis, polimiositis-dermatomiositis, crioglobulinemia, síndrome del anticuerpo antifosfolípido y artritis psoriática), trastornos autoinmunes gastrointestinales y hepáticos (tales como, por ejemplo, enfermedades intestinales inflamatorias (por ejemplo, colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn), gastritis autoinmunes y anemia perniciosa, hepatitis autoinmune, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, y enfermedad celíaca), vasculitis (tal como, por ejemplo, vasculitis ANCA-negativa y vasculitis asociada con ANCA, incluyendo vasculitis de Churg-Strauss, granulomatosis de Wegener y poliangitis microscópica), trastornos neurológicos autoinmunes (tales como, por ejemplo, esclerosis múltiple, síndrome de opsoclonus myoclonus, myasthenia gravis, neuromyelitis óptica, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer y polineuropatías autoinmunes), trastornos renales (tales como, por ejemplo, glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture y enfermedad de Berger), trastornos dermatológicos autoinmunes (tales como, por ejemplo, psoriasis, urticaria, urticaria, pénfigo vulgar, penfigoide ampollar y lupus eritematoso cutáneo), trastornos hematológlcos (tales como, por ejemplo, púrpura trombocotopénica, púrpura trombocitopénica trombótica, púrpura postransfusión y anemia hemolítica autoinmune), ateroesclerosis, uveítis, enfermedades del oído autoinmunes (tales como, por ejemplo, enfermedad el oído interno y pérdida de la audición), enfermedad de Behcet, síndrome de Raynaud, transplante de órganos y trastornos endocrinos autoinmunes (tales como, por ejemplo, enfermedades autoinmunes relacionadas con diabetes tales como diabetes mellitus insulinodependiente (IDDM), enfermedad de Addison y enfermedad tiroidea autoinmune (por ejemplo, enfermedad de Graves y tiroiditis)). Las enfermedades de este tipo más preferidas incluyen, por ejemplo, RA, colitis ulcerosa, vasculitis asociada con ANCA, lupus, esclerosis múltiple, síndrome de Sjógren, enfermedad de Graves, IDDM, anemia perniciosa, tiroiditis, y glomerulonefritis.

La expresión "agente citotóxico" como se usa en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o previene la función de las células y/o causa la destrucción de las células. El término incluye isótopos radioactivos (por ejemplo At2 1, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm 53, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu), y toxinas tales como toxinas de moléculas pequeñas o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o sus fragmentos.

El término "citoquina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citoquinas son linfoquinas, monoquinas; interleuquinas (ILs) tales como IL-1, IL-1a, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL— 13, IL— 15, incluyendo PROLEUKIN® rlL-2; un factor de necrosis tumoral tal como TNF-a o TNF-ß; y otros factores polipéptidos incluyendo LIF y ligando de kit (KL). Como se usa en la presente, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas de secuencia nativa, incluyendo entidades de moléculas pequeñas producidas en forma sintética y sus derivados y sales farmacéuticamente aceptables.

El término "hormona" se refiere a hormonas polipeptídicas, que son segregadas generalmente por órganos glandulares con conductos. Incluidas entre las hormonas se encuentran, por ejemplo, la hormona del crecimiento tal como la hormona del crecimiento humana, la hormona de crecimiento humana N-metionilo y la hormona del crecimiento bovina; la hormona paratiroides; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; estradiol; terapia de reemplazo hormonal; andrógenos tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol, mepitiostano, o testolactona; prorrelaxina; hormonas de glicoproteínas tales como la hormona foliculoestimulante (FSH), la hormona estimulante de la tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH); prolactina, lactógeno placentario, péptido asociado con la gonadotropina de ratón, hormona liberadora de gonadotropinas; inhibina; activina; sustancia inhibidora mulleriana; y trombopoyetina. Como se usa en la presente, el término hormona incluye proteínas de fuentes naturales o del cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de la hormona de secuencia nativa, incluyendo entidades de moléculas pequeñas producidas en forma sintética y sus derivados y sales farmacéuticamente aceptables.

La expresión "factor de crecimiento" se refiere a proteínas que promueven el crecimiento, e incluyen, por ejemplo, el factor de crecimiento hepático; el factor de crecimiento de fibroblastos; el factor de crecimiento endotelial vascular; los factores de crecimiento neuronales tales como NGF-ß; el factor de crecimiento derivado de plaquetas; los factores de crecimiento transformantes (TGFs) tales como TGF-a y TGF-ß; el factor de crecimiento I y II tipo insulina; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones tales como interferón-a, -ß, y -y; y factores estimulantes de colonias (CSFs) tales como macrófago-CSF (M-CSF); granulocitc— macrófago-CSF (GM-CSF); y granulocitc— CSF (G-CSF). Como se usa en la presente, el término factor de crecimiento incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos del factor de crecimiento de secuencia nativa, incluyendo entidades de moléculas pequeñas producidas en forma sintética y sus derivados y sales farmacéuticamente aceptables.

El término "integrina" se refiere a una proteína receptora que permite que las células se unan a, y respondan a, la matriz extracelular y está involucrada en una variedad de funciones celulares, tales como curación de heridas, diferenciación celular, el "homing" de células tumorales y apoptosis. Son parte de una gran familia de receptores de adhesión celular que están involucrados en interacciones célula-matriz extracelular y célula-célula. Las integrinas funcionales consisten en dos subunidades de glicoproteína transmembrana, denominadas alfa y beta, que están unidas en forma no covalente. Las subunidades alfa comparten todas una cierta homología entre sí, así como las subunidades beta. Los receptores siempre contienen una cadena alfa y una cadena beta. Ejemplos incluyen Alfa6beta1 , Alfa3beta1 , Alfa7beta1 , LFA-1 , etc. Como se usa en la presente, el término "integrina" incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de la integrina de secuencia nativa, incluyendo entidades de moléculas pequeñas producidas en forma sintética y sus derivados y sales farmacéuticamente aceptables.

Un "antagonista de TNF de define en la presente como una molécula que disminuye, bloquea, inhibe, suprime o interfiere con la actividad de TNFa in vitro, in situ y/o preferentemente in vivo. Un antagonista de TNF adecuado también puede disminuir bloquear, suprimir, interferir, prevenir y/o inhibir la síntesis de ARN, ADN o proteínas de TNF, la liberación de TNFa, la señalización del receptor de TNFa, la escisión de TNFa de la membrana, la actividad de TNFa, la producción y/o síntesis de TNFa. Tales antagonistas de TNF incluyen, pero no están limitados a, anticuerpos anti-TNFa, sus fragmentos de unión a antígenos, sus mutantes o dominios especificados que se unen específicamente a TNFa que, después de unirse a TNFa, destruyen o agotan las células que expresan el TNFa en un mamífero y/o interfiere con una o más funciones de esas células, un receptor de TNF soluble (por ejemplo, p55, p70 o p85) o fragmento, polipéptidos de fusión de estos, un antagonista de TNF de moléculas pequeñas, por ejemplo, proteína de unión a TNF I o II (TBP-I o TBP-II), nerelimonmab, CDP-571 , infliximab, enteracept (ENBREL™), adalimulab (HUMIRA™), CDP-571 , CDP-870, afelimomab, lenercept, y similares), fragmentos de unión a antígenos de los mismos, y moléculas de receptores que se unen específicamente a TNFa; compuestos que evitan y/o inhiben la síntesis de TNFa, la liberación de TNFa o su acción sobre las células objetivo, tales como talidomida, tenidap, inhibidores de fosfodiesterasa (por ejemplo, pentoxifilina y rolipram), agonistas de los receptores de A2b adenosina e intensificadores del receptor de A2b adenosina; compuestos que evitan y/o inhiben la señalización del receptor de TNFa, tales como los inhibidores de quinasa de la proteína activada por mitógeno (MAP); compuestos que bloquean y/o inhiben la escisión de TNFa de membrana, tales como los inhibidores de las metaloproteinasas; compuestos que bloquean y/o inhiben la actividad de TNFa, tales como los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE) (por ejemplo, captopril); y compuestos que bloquean y/o inhiben la producción y/o síntesis de TNFa, tales como los inhibidores de quinasas de MAP. El antagonista preferido comprende un anticuerpo.

El "factor de necrosis tumoral alfa", TNF-alfa" o "TNFa" se refiere a una molécula de TNFa humana que comprende la secuencia de aminoácidos de Pennica et al., Nature, 312:721 (1984) o Aggarwal et al., JBC, 260:2345 (1985). Un "inhibidor de TNFa" en la presente es un agente que inhibe, en cierta medida, una función biológica de TNFa, en general a través de la unión a TNFa y neutralizando su actividad. Ejemplos de inhibidores de TNFa en la presente incluyen etanercept (ENBREL®), infliximab (REMICADE®) y adalimumab (HU IRA™).

Ejemplos de "antagonistas de integrína o anticuerpos" en la presente incluyen un anticuerpo LFA-1 , tal como efalizumab (RAPTIVA®) disponible comercialmente de Genentech, o un anticuerpo de alfa 4 integrina, tal como natalizumab (ANTEGREN®) disponible de Biogen, o derivados de fenilalanina diazacíclicos (WO 2003/89410), derivados de fenilalanina (WO 2003/70709, WO 2002/28830, WO 2002/16329 y WO 2003/53926), derivados de ácido fenilpropiónico (WO 2003/10135), derivados de enamina (WO 2001/79173), derivados de ácido propanoico (WO 2000/37444), derivados del ácido alcanoico (WO 2000/32575), derivados de fenilo sustituidos (patentes US Nos. 6.677.339 y 6.348.463), derivados aromáticos de amina (patente US No. 6.369.229), polipéptidos del dominio de disintegrina ADAM (US 2002/0042368), anticuerpos a alfavbeta3 integrina (EP 633945), derivados de aminoácidos bicíclicos con puente aza (WO 2002/02556), etc.

La expresión "agente inmunosupresof se refiere a una sustancia que actúa para suprimir o enmascarar el sistema inmunológico del sujeto que se está tratando en la presente. Esto incluiría sustancias que suprimen la producción de citoquinas, regulan hacia abajo o suprimen la expresión auto-antígeno, o enmascaran los antígenos MHC. Ejemplos de tales agentes incluyen las pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sustituidas (ver U.S. 4.665.077); fármacos antiinflamatorios no esteroides (NSAIDs); ganciclovir, tacrolimus, glucocorticoides tales como cortisol o aldosterona, agentes antiinflamatorios tales como el inhibidor de ciclooxigenasa, un inhibidor de 5-lipoxigenasa o un antagonista del receptor de leucotrieno; antagonistas de purina, tales como azatioprina o micofenolato moftil (MMF); trocade (Ro32-355); un antagonista del receptor sigma periférico, tal como ISR-31747; agentes alquilantes, tales como ciclofosfamida; bromocriptina; danazol; dapsona; glutaraldehído (que enmascara los antígenos MHC, como se describe en la U.S. 4.120.649); anticuerpos antiidiotípicos para los antígenos MHC y fragmentos MHC; ciclosporina A; esteroides tales como los corticosteroides o glucocorticosteroides o análogos de glucocorticoides, por ejemplo, prednisona, metilprednisolona, incluyendo SOLU-MEDROL® succinato de metilprednisolona sódica, rimexolona y dexametasona; inhibidores de dihidrofolato reductasa, tales como metotrexato (oral o subcutáneo); agentes anti-malaria, tales como cloroquina e hidroxicloroquina; sulfasalazina; leflunomida; inhibidores de la liberación de citoquinas, tales como anticuerpos monoclonales SB-210396 y SB-217969 y un antagonista MHC II, tal como ZD2315; un antagonista del receptor PG1, tal como ZD4953; un bloqueador de adhesión VLA4, tal como ZD7349; anticuerpos anti-citoquina o anticuerpos de receptores anti-citoquina incluyendo anticuerpos anti-interferón-alfa, -beta, o -gamma, anticuerpos anti-TNF-a (infliximab (REMICADE®) o adalimumab), inmunoadhesina anti-TNF-V (etanercept), anticuerpos anti-TNF-beta, bloqueadores interleuquina-1 (IL-1), tales como inhibidor recombinante HulL-1Ra y IL-1 B, anticuerpos anti-interleuquina-2 (IL-2) y anticuerpos del receptor anti-IL-2; toxina de fusión IL-2; anticuerpos anti-L3T4; leflunomida; globulina heteróloga anti-linfocitos; OPC-14597; NISV (modificador de la respuesta inmunológica); un ácido graso esencial tal como el ácido gammalinolénico o el ácido eicosapentaenoico; bloqueadores CD-4, anticuerpos pan-T, preferentemente anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; modificador coestimulador (por ejemplo, fusión CTLA4-Fc, también conocido como ABATACEPT™; anticuerpos y antagonistas del receptor de anti-interleuquina-6 (IL— 6); anticuerpos anti-LFA- , incluyendo anticuerpos anti-CD11a y anti-CD18; péptido soluble que contiene un dominio de unión de LFA-3 (WO 1990/08187); estreptoquinasa; IL— 10; antagonistas anti-IL-4, antagonistas anti— IL— 13 y anticuerpos antagonistas anti— IL- /IL— 13 biespecíficos, factor de crecimiento transformante beta (TGF-beta); estreptodornasa; ARN o ADN del huésped; FK506; RS-6 443; enlimomab; CDP-855; inhibidor de PNP; CH-3298; GW353430; 4162W94, clorambucil; deoxispergualina; rapamicina; receptor de células T (US 5.114.721); fragmentos de receptores de las células T (Defner et al., Science, 251: 430-2 (1991); WO 1990/11294; Janeway, Nature, 341: 482-483 (1989); y WO 1991/01133); BAFF antagonistas tales como los anticuerpos BAFF y los anticuerpos BR3; antagonistas de zTNF4 (Mackay y Mackay, Trends Immunol., 23:113-5 (2002)); agentes biológicos que interfieren con señales "helper" de las células T, tales como el receptor ant¡-CD40 o el ligando anti-CD40 (CD154), incluyendo anticuerpos de bloqueo del ligando CD40-CD40 (por ejemplo, Durie et al., Science, 261: 1328-30 (1993); Mohán et al., J. Immunol., 154: 1470-80 (1995)) y CTLA4-lg (Finck et al., Science, 265: 1225-7 (1994)); y anticuerpos del receptor de células T (EP 340,109) tales como T10B9. Algunos agentes inmunosupresores preferidos en la presente incluyen ciclofosfamida, clorambucil, azatioprina, leflunomida, MMF o metotrexato (MTX).

"Fármacos antirreumáticos que modifican la enfermedad' o "DMARDs" (por sus siglas en inglés) incluyen, por ejemplo, cloroquina, hidroxicloroquina, miocrisina, aurandeína, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, etanercept, ¡nfliximab (y MTX oral y subcutáneo), azatioprina, D-penicilamina, sales de oro (oral), sales de oro (intramuscular), minociclina, ciclosporina, por ejemplo, ciclosporina A y ciclosporina tópica, proteína A estafilocócica (Goodyear y Silverman, J. Exp. Med., 197:1125-39 (2003)), incluyendo sus sales y derivados, etc.

Una "célula B" es un linfocito que madura dentro de la médula ósea, e incluye una célula B naif, una célula B de memoria o una célula B efectora (células plasmáticas). La célula B en la presente puede ser normal o no maligna.

Un "marcador de superficie de la célula B" o "antígeno de superficie de la célula B" en la presente es un antígeno expresado en la superficie de una célula B que puede ser tomado como objetivo con un antagonista que se une al mismo. Los marcadores de superficie de las células B ilustrativos incluyen los marcadores de superficie de leucocitos CD10, CD19, CD20, CD21 , CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81 , CD82, CD83, CDw84, CD85 y CD86 (para descripciones, ver The Leu ocyte Antigen Facts Book, 2a Edición. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co., Nueva York). Otros marcadores de superficie de las células B incluyen RP105, FcRH2, Células B CR2, CCR6, P2X5, H LA-DO B, CXCR5, FCER2, BR3, Btig, NAG14, SLGC16270, FcRH1 , IRTA2, ATWD578, FcRH3, IRTA1 , FcRH6, BCMA, y 239287. El marcador de superficie de las células B preferido es expresado preferentemente en las células B comparado con otros tejidos de las células B de un mamífero y puede ser expresado tanto en las precursoras como en las células B maduras. Los marcadores de este tipo que más se prefieren son CD20 y CD22.

El antígeno "CD2(T o ilCD20" es una fosfoproteína no glicosilada de aproximadamente 35-kDa, que se encuentra en la superficie de más de 90% de las células B de la sangre periférica o de los órganos linfoides. El CD20 está presente tanto en células B normales como también en las células B malignas, pero no es expresado en las células madre. Otras denominaciones para el CD20 en la literatura incluyen "antígeno restringido a linfocitos B" y "Bp35". El antígeno CD20 se describe, por ejemplo, en Clark et al., Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 82:1766 (1985).

El antígeno UCD22" o UCD22" también conocido como BL-CAM o Lyb8, es una glicoproteína de membrana integral tipo 1 con peso molecular de aproximadamente 130 (reducido) a 140kD (no reducido). Es expresado tanto en el citoplasma como en la membrana celular de los linfocitos B. El antígeno CD22 aparece temprano en la diferenciación de linfocitos de las células B en aproximadamente la misma etapa que el antígeno CD19. A diferencia de otros marcadores de células B, la expresión en membrana de CD22 es limitada a las etapas de diferenciación tardías comprendidas entre las células B maduras (CD22+) y las células plasmáticas (CD22-). El antígeno CD22 se describe, por ejemplo, en Wilson et al., J. Exp. Med. 173:137 (1991) y Wilson et al., J. Immunol. 150:5013 (1993).

Un "anticuerpo que se une a un marcador de superficie de las células B" es una molécula que, después de unirse a un marcador de superficie de las células B, destruye o agota las células B en un mamífero y/o interfiere con una o más funciones de las células B, por ejemplo, reduciendo o previniendo una respuesta humoral provocada por la célula B. El anticuerpo es preferentemente capaz de agotar las células B (es decir, reducir los niveles circulantes de células B) en un mamífero tratado con el mismo. Tal agotamiento puede lograrse a través de varios mecanismos tales como citotoxicidad mediada por células dependientes del anticuerpo (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), inhibición de la proliferación de las células B y/o inducción de la muerte de las células B (por ejemplo, vía apoptosis).

Ejemplos de anticuerpos CD20 incluyen: "C2B8", que es denominado ahora "rituximab" ("RITUXAN®") (patente US No. 5.736.137); el anticuerpo murino 2B8 marcado con itrio— [90] denominado ?2?8" o "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALIN®) disponible comercialmente de IDEC Pharmaceuticals, Inc. (patente US No. 5.736.137; 2B8 depositada en ATCC bajo el número de acceso HB11388 el 22 de junio de 1993); el lgG2a murino "B1", también denominado "Tositumomab", marcado opcionalmente con 31l para generar el anticuerpo "131 I-B1" o "tositumomab yodo 1131" (BEXXAR™) disponible comercialmente de Corixa (ver, también, la patente US No. 5.595.721); el anticuerpo monoclonal murino "1F5" (Press et al. Blood 69(2):584-591 (1987) y sus variantes, incluyendo 1F5 de "marco remendado" o humanizado (WO 2003/002607, Leung, S.; ATCC depósito HB-96450); anticuerpo 1H7 murino y 2H7 quimérico (patente US No. 5.677.180); un 2H7 humanizado (WO 2004/056312 (Lowman et al.) y como se indica más abajo); HUMAX-CD20™ anticuerpo completamente humano, de alta afinidad, que es el objetivo en la molécula CD20 en la membrana de las células B (Genmab, Dinamarca; ver, por ejemplo, Glennie y van de Winkel, Drug Discovery Toóla 8: 503-510 (2003) y Cragg et al., Blood 101 : 1045-1052 (2003)); los anticuerpos monoclonales humanos presentados en la WO04/035607 (Teeling et al.); anticuerpos AME-133™ (Applied Molecular Evolution); el anticuerpo A20 o sus variantes, tales como el anticuerpo A20 quimérico o humanizado (cA20, hA20, respectivamente) (US 2003/0219433, Immunomedics); y los anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1 B3, B-C1 o NU-B2 que se pueden obtener de International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., en: Leukocyte Typing III (Mc ichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987)). Los anticuerpos CD20 preferidos en la presente son los anticuerpos CD20 quiméricos, humanizados o humanos, más preferentemente rituximab, un anticuerpo 2H7 humanizado, A20 quimérico o humanizado (Immunomedics), y HUMAX-CD20™, un anticuerpo CD20 humano (Genmab).

Las expresiones "rituximab" o "RITUXAIF" en la presente se refieren al anticuerpo monoclonal murino/humano quimérico creado por ingeniería genética dirigido contr el antígeno CD20 y denominado "C2B8" en la patente US No. 5.736.137, incluyendo sus fragmentos que retienen la capacidad de unirse a CD20.

Sólo a los fines de presente y a menos que se indique de otra manera, un anticuerpo "2H7 humanizado" se refiere a un anticuerpo CD20 humanizado o a un fragmento de unión al antígeno del mismo, en donde el anticuerpo es efectivo para agotar las células B de primates in vivo. El anticuerpo incluye aquellos presentados en US 2006/0062787 y las figuras en la misma, e incluyendo la versión 114, cuyas secuencias se proveen en la US 2006/0188495. Ver también US 2006/0034835 y US 2006/0024300. En un resumen de varias formas de realización preferidas de la invención, la región V de variantes basada en 2H7 versión 16 como se divulga en la US 2006/0062787 tendrá las secuencias de aminoácidos de v16 excepto en las posiciones de sustituciones de aminoácidos que están indicadas en la tabla más abajo. A menos que indique de otra manera, las variantes 2H7 tendrán la misma cadena L que la de v16.

Un anticuerpo 2H7 humanizado preferido es un anticuerpo intacto o un fragmento de anticuerpo que tiene la secuencia de versión 16. Otro 2H7 humanizado preferido tiene las secuencias de versión 114.

Los "antagonistas de BAFF' son cualesquiera moléculas que bloquean la actividad de BAFF o BR3. Incluyen las inmunoadhesinas que comprenden una porción de BR3, TACI o BCMA que se une a BAFF, o sus variantes que se unen a BAFF. En otros aspectos, el antagonista de BAFF es un anticuerpo a BAFF. Un "anticuerpo a BAFF" es un anticuerpo que se une a BAFF, y preferentemente se une a BAFF dentro de una región de BAFF humano que comprende los residuos 162-275 de BAFF humano. En otro aspecto, el antagonista de BAFF es un anticuerpo a BR3. A "anticuerpo a BR3" es un anticuerpo que se une a BR3, y preferentemente se une a BR3 dentro de una región de BR3 humano que comprende los residuos 23-38 de BR3 humano. Las secuencias de BAFF humano y BR3 humano se encuentran, por ejemplo, en la US 2006/0062787. Otros ejemplos de polipéptidos que se unen a BAFF o anticuerpos a BAFF se pueden hallar en, por ejemplo, WO 2002/092620, WO 2003/014294, Gordon et al., Biochemistry 42(20):5977-83 (2003), Kelley et al., J. Biol.Chem. 279:16727-35 (2004), WO 1998/18921 , WO 2001/12812, WO 2000/68378 y WO 2000/40716.

El "anticuerpo anti-lgE" incluye cualquier anticuerpo que se une específicamente a IgE de una manera tal como para no inducir la unión cruzada cuando la IgE es unida al receptor de alta afinidad en mastocitos y basófilos. Los anticuerpos ilustrativos incluyen los anticuerpos de la invención así como también rhuMabE25 (E25, XOLAIR®), E26, E27, así como también CGP-5101 (Hu-901) y el anticuerpo HA. Las secuencias de aminoácidos de los dominios variables de cadena pesada y de cadena liviana de los anticuerpos anti-lgE humanizados E25, E26 y E27 se divulgan, por ejemplo, en U.S.P. 6.172.213 y WO99/01556. El anticuerpo CGP-5101 (Hu-901) se describe en Come et al., (1997) J. Clin. Invest. 99(5): 879-887, WO 92/17207 y ATCC Dep. Nos. BRL-10706, BRL-11130, BRL-11131 , BRL-11132 y BRL-11133. El anticuerpo HA se describe en USSN 60/444,229, WO 2004/070011 y WO 2004/070010.

El término "aproximadamente" como se usa en la presente se refiere al rango de error usual para el valor respectivo conocido fácilmente por el experto en este campo técnico. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) formas de realización que son dirigidas a ese valor o parámetro per se.

Como se usa en la presente y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una" y "el o la" incluyen la referencia plural a menos que el contexto indique claramente de otro modo. Por ejemplo, la referencia a un "anticuerpo" es una referencia a desde uno a muchos anticuerpos, tales como las cantidades molares, e incluye equivalentes de estos conocidos por los expertos en el arte, etc.

Se entiende que el aspecto y las formas de realización de la invención descriptas en la presente incluye "que comprende", "que consiste" y "que consiste esencialmente en" aspectos y formas de realización.

III. Composiciones y métodos de la invención Se proveen en la presente los anticuerpos anti-lgE que se unen al segmento M1' de una IgE y el método de usar los anticuerpos anti-lgE para el tratamiento o la prevención de un trastorno mediado por IgE.

Con respecto todos los métodos descriptos en la presente, la referencia a un anticuerpo anti-lgE/M' también incluye composiciones que comprenden uno o más de esos agentes. Tales composiciones pueden comprender además excipientes adecuados, tales como los excipientes farmacéuticamente aceptables (vehículos) incluyendo buffers, ácidos, bases, azúcares, diluyentes, conservantes, y similares, que son bien conocidos en el arte y se describen en la presente. Los presentes métodos se pueden usar solos o en combinación con otros métodos de tratamiento convencionales.

A. Anticuerpos anti-lgE Los anticuerpos que se pueden usar en los métodos descriptos en la presente incluyen anticuerpos anti-lgE que se unen al segmento M1' de la IgE. Los anticuerpos anti-lgE descriptos en la presente tienen una o más de las siguientes características: (a) se unen específicamente al segmento MV de la IgE (tal como una IgE humana); (b) inducen la apoptosis de las células B que expresan la IgE in vitro y/o in vivo; (c) agotan las células que expresan lgE-M1' (tal como las células B IgE-alteradas, los plasmablastos de IgE y las células B de memoria de IgE) vía apoptosis y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos in vitro; (d) agotan las células que expresan lgE-M1' en un mamífero; (e) reducen la IgE total sérica en un mamífero; (f) reducen la IgE específica de alérgenos en un mamífero; (g) previenen o reducen un aumento inducido por alérgenos de la IgE total sérica o la IgE específica de alérgenos en un mamífero; (h) inducen flujo de calcio en las células B que expresan IgE in vitro y/o in vivo; y (i) tratan y/o previenen un trastorno mediado por IgE (por ejemplo, rinitis alérgica y asma alérgica).

Los métodos para medir el agotamiento de las células que expresan IgE— MV (tales como las células B Ig E-alteradas, los plasmablastos de IgE y las células B de memoria de IgE) son conocidos en el arte y se describen en la patente U.S. No. 8.071.097. Las células B que expresan M1 ' pueden ser detectadas por PCR cuantitativa en sangre periférica humana. Brevemente, el ARN es extraído de la sangre entera recogida en tubos de recolección PaxGene. El ARN es convertido en cADN y se usan cebadores inversos (GTGGCAGAGCACCCTATCC) (SEQ ID NO:41) y directos (CAGCGAGCGGTGTCTGT) (SEQ ID NO:42), y sonda fluorescente (CCAGCCCGGGATTT) (SEQ ID NO:43) para amplificar M1' mARN por TaqMan. Las células B que expresan M1' también pueden ser detectadas por citometría de flujo en la sangre periférica humana. Brevemente, las células B son enriquecidas a partir de aproximadamente 40-50 mi de sangre entera usando el kit RossetteSep. Las células B enriquecidas son teñidas subsiguientemente para marcadores de superficie de células B de memoria y M1'.

Los métodos (tales como ELISA) conocidos en el arte se pueden usar para medir el nivel de la IgE total sérica y la IgE específica de alérgenos. Los ensayos clínicos estándar para la IgE específica de alérgenos y total son ensayos Siemens Immulite 2000 (Siemens Medical Solutions Diagnostics, Los Angeles CA) y Phadia ImmunoCAP assays (Phadia Inc.). Ver Li, et ai, Ann Clin Lab Sci., 34(1):67-74 (2004) y Libeer, et al., Clin Chem Lab Med., 45(3):413-415.

Los métodos para medir el flujo de calcio en las células B que expresan IgEs inducidas por anticuerpos anti-lgE son conocidos en el arte. Ver, por ejemplo, patente U.S. No. 8.071.097, Ejemplo 7.

En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE se une a cualquier epitopo dentro del segmento M1' de la IgE humana, IgE de rhesus y/o IgE de Cyno mostrado en la Figura 14A-B. En algunas formas de realización, el anticuerpo se une específicamente al mismo epitopo que el unido por un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste en: 47H4, 7A6, 26A11 , 47H4v1, 47H4v2, 47H4v3, 47H4v4, 47H4v5, 47H4v6, 7A6v1 y 26A11v6. Estos anticuerpos se describen en la patente U.S. No. 8.071.097. Las secuencias de aminoácidos variables de cadena pesada y de cadena liviana de estos anticuerpos se muestran en las Figuras 15A-15F. En algunas formas de realización, el anticuerpo se une a un epitopo correspondiente a un péptido seleccionado entre el grupo que consiste en: SAQSQRAPDRVLCHS (SEQ ID NO:4), RAPDRVLCHSGQQQG (SEQ ID NO:5), GQQQGLPRAAGGSVP (SEQ ID NO:6) o PRAAGGSVPHPRCH (SEQ ID NO:7). En algunas formas de realización, el anticuerpo es un fragmento de unión al antígeno. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico. En algunas formas de realización, el anticuerpo es afucosilado.

En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE comprende las HVRs de cadena pesada y cadena liviana (tales como una, dos, tres, cuatro, cinco o seis HVRs) del anticuerpo mostrado en las Figuras 15A-15F. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE comprende una cadena liviana que comprende HVR1, HVR2 y HVR3 (tal como las tres CDRs de Kabat, las CDRs de Chothia o las CDRs de contacto) de la cadena liviana del anticuerpo mostrado en las Figuras 15A-15C, y/o una cadena pesada que comprende las HVR1 , HVR2 y HVR3 (tales como las tres CDRs de Kabat, CDRs de Chothia o CDRs de contacto) de la cadena pesada del anticuerpo mostrado en las Figuras 15D-15F. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y cadena liviana de los anticuerpos mostrados en las Figuras 15A-15F. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende las HVRs de cadena pesada y cadena liviana del anticuerpo 47H4v5. En algunas formas de realización, el anticuerpo comprende las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena liviana del anticuerpo 47H4v5. En algunas formas de realización, el anticuerpo es un anticuerpo seleccionado entre los que consisten en 26A11 v1-16, 7A6v1 y 47H4v1-6. En algunas formas de realización, el anticuerpo es afucosilado.

En algunas formas de realización, el anticuerpo es el anticuerpo 47H4v5 o un fragmento de unión al antígeno del mismo. El anticuerpo 47H4v5 (MEMP1972A) tiene la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO:39 y la secuencia de aminoácidos de cadena liviana de la SEQ ID NO:40. En algunas formas de realización, el anticuerpo es afucosilado. 47H4v5 cadena pesada EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYGIAWVRQAPGKGLEWVA FISDU\YTIYYADTVTGRFTISRDNSKNTLILQMNSLRAEDTAVYYCARDNWDAMD YWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWN SGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKK VEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHE DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEA LHNHITQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:39) 47H4v5 cadena liviana DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQSLVHNNANTILHWYQQKPGKAPK LLIYKVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCSQNTLVPWTFGQ GTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQ SGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF NRGEC (SEQ ID NO:40) En algunas formas de realización, los anticuerpos anti-lgE descriptos en la presente se unen a un segmento M1' de la IgE humana con una afinidad de unión de Scatchard con respecto a la IgE humana que es equivalente a la del anticuerpo 47H4 anti-lgE murino o una variante humanizada del mismo (tal como 47H4v1-6). La afinidad de unión de Scatchard se mide como se describe en el Ejemplo 2A de la patente U.S. No. 8.071.097. En algunas formas de realización, la afinidad es equivalente a la afinidad de unión de 47H4. En algunas formas de realización, la afinidad es de entre 0,30 y 0,83 nM. En otro aspecto específico, la afinidad es equivalente a la afinidad de unión de 47H4v5. En otro aspecto específico, la afinidad es de aproximadamente 1 ,5 nM.

B. Preparación de anticuerpos Los anticuerpos útiles en la presente invención pueden comprender anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv y F(ab')2), anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos multivalentes, anticuerpos heteroconjugados, proteínas de fusión que comprenden una porción de anticuerpo, anticuerpos humanizados, y cualquier otra configuración modificada de la molécula de inmunoglobulina que comprende un sitio de reconocimiento del antígeno de la especificidad requerida, incluyendo variantes de glicosilación de anticuerpos, variantes de secuencias de aminoácidos de anticuerpos, y anticuerpos modificados en forma covalente. Los anticuerpos pueden ser murinos, de rata, humanos o de cualquier otro origen (incluyendo anticuerpos quiméricos o humanizados). 1) Anticuerpos policlonales Los anticuerpos policlonales sen producidos en general en animales por múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica en la especie a ser inmunizada, por ejemplo, la hemocianina de lapa californiana (KLH), la albúmina sérica, la tiroglobulina bovina o el inhibidor de tripsina de soja, usando un agente bifuncional o derivador, por ejemplo, éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisterna), N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina), glutaraldehído, anhídrido succínico. SOCI2, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son independientemente grupos alquilo inferiores. Ejemplos de adyuvantes que se pueden emplear incluyen el adyuvante completo de Freund y el adyuvante MPL-TDM (Lípido A monofosforilo, trehalosa dicorinomicolato sintética). El protocolo de inmunización puede ser seleccionado por un experto en el arte sin excesiva experimentación.

Los animales son inmunizados contra el antígeno, conjugados inmunogénicos, o derivados, combinando, por ejemplo, 100 pg o 5 pg o la proteína o el conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectando la solución en forma intradérmica en múltiples sitios. Un mes después, se les administra a los animales un refuerzo de 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. Siete a catorce días después, se extrae sangre de los animales y se ensaya el suero con respecto al título de anticuerpos. Se les da un refuerzo a los animales hasta la meseta de titulación. Los conjugados también pueden ser preparados en cultivo de células recombinante como fusiones de proteína. Además, agentes agregantes tales como alumbre son adecuados para aumentar la respuesta inmunológica. 2) Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se obtienen de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones y/o modificaciones postrad uccionales que ocurren naturalmente (por ejemplo, isomerizaciones, amidaciones) que pueden estar presentes en cantidades menores. Así, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, indicando que no es una mezcla de anticuerpos discretos.

Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados usando el método del hibridoma descripto primero por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o puede ser preparado por métodos de ADN recombinante (patente U.S. No. 4.816.567).

En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, tal como un hámster, es inmunizado como se describe en la presente más arriba para provocar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína usada para inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Los linfocitos son fusionados luego con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986).

El agente inmunizante incluirá típicamente la proteína antigénica o una variante de fusión de la misma. En general se usan o bien linfocitos de la sangre periférica ("PBLs") si se desean células de origen humano, o células del bazo o células del nodulo linfático se usan si se desean fuentes de mamíferos no humanos. Los linfocitos son fusionados luego con una línea celular inmortalizada usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma. Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press (1986), pp. 59-103.

Las líneas celulares inmortalizadas son usualmente células de mamíferos transformadas, particularmente células de mieloma de origen bovino, humano o de roedores. Usualmente, se emplean líneas celulares de mieloma de rata o de ratón. Las células de hibridoma así preparadas son sembradas y cultivadas en un medio de cultivo adecuado que contiene preferentemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales no tienen la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicametne hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT), que son sustancias que previenen el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan en forma eficiente, soportan la producción de alto nivel estable de anticuerpos por las células que producen anticuerpos seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre éstas se prefieren las líneas de mieloma de ratón, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 que se pueden obtener del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y las células SP-2 (y sus derivados, por ejemplo, X63- Ag8-653) que se pueden obtener de la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, EE.UU. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón/humano también se han descripto para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma se ensaya para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Preferentemente, la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma es determinada por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA).

El medio de cultivo en el cual se cultivan las células de hibridoma puede ser ensayado con respecto a la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno deseado. Preferentemente, la afinidad de unión y la especificidad del anticuerpo monoclonal puede ser determinada por inmunoprecipitación o por un ensayo de unión in vitro, tal como un radioinmunoensayo (RIA) o un ensayo ligado a enzimas (ELISA). Tales técnicas y ensayos son conocidos en el arte. Por ejemplo, la afinidad de unión puede ser determinada por el análisis de Scatchard de Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Después que se identifican las células de hibridoma que producen anticuerpos de la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones pueden ser subclonados por procedimientos de dilución limitantes y cultivados por métodos estándar (Goding, supra). Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden ser cultivadas in vivo como tumores en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales segregados por los subclones son separados adecuadamente del medio de cultivo, fluido de ascitis o suero por procedimientos de ¡nmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, A-Sepharose de proteínas, cromatografía de hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también pueden ser preparados por métodos de ADN recombinante, tales como los descriptos en la patente U.S. No. 4.816.567, y como se describió más arriba. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales es aislado y secuenciado fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y livianas de los anticuerpos murinos). Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN puede ser colocado en vectores de expresión, que son transfectados luego en células huésped tales como células de E. col, células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otro modo la proteína ¡nmunoglobulina para sintetizar anticuerpos monoclonales en tales células huésped recombinantes. Artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias de ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Inmunol., 5:256-262 (1993) y Plückthun, Inmunol. Revs. 130:151-188 (1992).

En otra forma de realización, los anticuerpos pueden ser aislados de las bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando las técnicas descriptas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Publicaciones subsiguientes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) por transposición de cadena (Marks et ai, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), así como también infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nucí. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)). Así, estas técnicas son alternativas viables para las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.

El ADN también puede ser modificado, por ejemplo, sustituyendo la secuencia codificadora para los dominios constantes de cadena pesada y liviana humanos en lugar de las secuencias murinas homologas (patente U.S. No. 4.816.567; Morrison, et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 81 :6851 (1984)), o uniendo en forma covalente a la secuencia codificadora de inmunoglobulinas toda o parte de la secuencia codificadora para un polipéptido que no es una inmunoglobulina. Típicamente tales polipéptidos que no son inmunoglobulinas son sustituidos para los dominios constantes de un anticuerpo, o son sustituidos para los dominios variables de un sitio de combinación de antígenos de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígenos que tiene la especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígenos que tiene especificidad para un antígeno diferente.

Los anticuerpos monoclonales descriptos en la presente pueden ser monovalentes, cuya preparación es bien conocida en el arte. Por ejemplo, un método involucra la expresión recombinante de la cadena liviana de la inmunoglobulina y una cadena pesada modificada. La cadena pesada es truncada generalmente en cualquier punto en la región Fe de modo de evitar la unión cruzada de la cadena pesada. Alternativamente, los residuos de cisteína relevantes pueden ser sustituidos con otros residuos de aminoácidos o son suprimidos de modo de evitar la unión cruzada. Los métodos in vitro también son adecuados para preparar anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos Fab, puede lograrse usando técnicas de rutina conocidas en el arte.

Los anticuerpos quiméricos o híbridos también pueden ser preparados in vitro usando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que involucran unión cruzada. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden ser construidas usando una reacción de intercambio de disulfuro o formando una unión tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato. 3) Anticuerpos humanizados.

Los anticuerpos de la invención pueden comprender además anticuerpos humanizados o humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de los mismos (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a antígenos) que contienen secuencias mínimas derivadas de inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) en donde residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del recipiente son reemplazados por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo dador) tal como ratón, rata o conejo que tienen la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de marco Fv de la inmunoglobulina humana son reemplazados por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo recipiente y tampoco en la CDR importada o las secuencias de marco. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de por lo menos un, y típicamente dos, dominios variables, en donde todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de consenso de una inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá óptimamente por lo menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Jones et al., Nature 321 : 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323-329 (1988) y Presta, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992).

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en el arte. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos en el mismo de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son denominados frecuentemente residuos "importados", que son tomados típicamente de un dominio variable "importado". La humanización puede ser realizada esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores, Jones eí al., Nature 321 :522-525 (1986); Riechmann eí al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen eí al., Science 239:1534-1536 (1988), o sustituyendo CDRs o secuencias de CDR de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente U.S. No. 4.816.567), en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en donde algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de dominios variables humanos, tanto livianos como pesados, a ser usados para preparar los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el método así llamado de "mejor ajuste" ("best-fíf), la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es rastreada contra toda la biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana que es más cercana a la del roedor es aceptada luego como el marco humano (FR) para el anticuerpo humanizado. Sims et al., J. Inmuno/., 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987). Otro método usa un marco particular derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas livianas o pesadas. El mismo marco se puede usar para varios anticuerpos humanizados diferentes. Cárter et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta er a/., J. Inmuno/., 151:2623 (1993).

También es importante que los anticuerpos sean humanizados con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un método preferido, los anticuerpos humanizados son preparados por un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales se pueden obtener comúnmente y son familiares para los expertos en el arte. Se encuentran disponibles programas de computación que ilustran y despliegan estructuras conformaciones tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionares. La inspección de estos displays permite el análisis del probable rol de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulinas candidatas, es decir, el análisis de residuos que influyen sobre la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos FR pueden ser seleccionados y combinados de las secuencias recipientes e importadas de modo que se logra la característica deseada del anticuerpo, tal como una mayor afinidad por el o los antígenos objetivo. En general, los residuos de CDR están involucrados directamente y más sustancialmente en la influencia sobre la unión al antígeno.

Se contemplan varias formas del anticuerpo humanizado. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede ser un fragmento de anticuerpo, tal como un Fab, que es conjugado opcionalmente con uno o más agentes citotóxicos para generar un inmunoconjugado. Alternativamente, el anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo intacto, tal como un anticuerpo lgG1 intacto. 4) Anticuerpos humanos Como una alternativa a la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos. Por ejemplo, es posible ahora producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, después de la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descripto que la supresión homocigota del gen de la región de unión de cadena pesada del anticuerpo (JH) en ratones mutantes quiméricos y de línea germinal da por resultado una inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia del arreglo de genes de la inmunoglobulina de línea germinal humana en tales ratones mutantes de línea germinal dará por resultado la producción de anticuerpos humanos después del desafío del antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits er a/., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Inmuno., 7:33 (1993); patentes U.S. Nos. 5.591.669 y WO 97/17852.

Alternativamente, se puede usar la tecnología de display de fagos para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, de repertorios de genes de dominio variable de inmunoglobulinas (V) de dadores no inmunizados. McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol. 227: 381 (1991). De acuerdo con esta técnica, los genes del dominio del anticuerpo V son clonados en el marco en o bien un gen de proteína de recubrimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y desplegado como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADN de hebra simple del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan por resultado la selección de los genes que codifican el anticuerpo que presenta estas propiedades. Así, el fago imita algunas de las propiedades de las células B. El display de fagos se puede realizar en una variedad de formatos, revisados en, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J., Curr. Opin Struct. Biol. 3:564-571 (1993). Se pueden usar varias fuentes de segmentos de genes V para el display de fagos. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) aislaron un arreglo diverso de anticuerpos antioxazolona de una biblioteca combinatoria aleatoria pequeña de genes V derivados de los bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V de dadores humanos no inmunizados y se pueden aislar anticuerpos a un arreglo diverso de antígenos (incluyendo autoantígenos) esencialmente siguiendo las técnicas descriptas por Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) o Griffith et al., EMBO J. 12:725-734 (1993). Ver también, patentes U.S. Nos. 5.565.332 y 5.573.905.

Las técnicas de Colé et al., y Boerner et al., también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner et al., J. Inmunol. 147(1): 86-95 (1991). Similarmente, se pueden preparar anticuerpos humanos introduciendo loci de ¡nmunoglobulinas humanas en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en los cuales los genes de inmunoglobulina endógenos han sido inactivados en forma parcial o completa. Después del desafío, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja estrechamente a la vista en los humanos en todos los aspectos, incluyendo el reordenamiento de genes, el ensamblado y el repertorio de anticuerpos. Esta propuesta se describe, por ejemplo, en las patentes U.S. Nos. 5.545.807; 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425, 5.661.016 y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-13 (1994), Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996), Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996) y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Inmunol. 13: 65-93 (1995).

Finalmente, los anticuerpos humanos también pueden ser generados in vitro por células B activadas (ver patentes U.S. Nos. 5.567.610 y 5.229.275). 5) Fragmentos de anticuerpos En algunas circunstancias hay ventajas usando fragmentos de anticuerpos, en lugar de anticuerpos enteros. Los tamaños de fragmentos más pequeños permiten una depuración más rápida, y pueden llevar a un mejor acceso a los tumores sólidos.

Varias técnicas han sido desarrolladas para la producción de los fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos fueron derivados a través de la digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto eí al., J Biochem Biophys. Method. 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos pueden ser producidos ahora directamente por células huésped recombinantes. Los fragmentos de anticuerpos Fab, Fv y scFv pueden ser expresados todos en, y segregados de, E. coli, permitiendo así la producción fácil de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos de anticuerpos pueden ser aislados de las bibliotecas de fagos de anticuerpos comentados más arriba. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden ser recuperados directamente de E. coli y acoplados químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otra propuesta, los fragmentos F(ab')2 pueden ser aislados directamente de cultivo de células huésped recombinantes. Fab y F(ab')2 con aumento de la vida media in vivo han sido descriptos en la patente U.S. No. 5.869.046. En otras formas de realización, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFv). Ver WO 93/16185; patente U.S. No. 5.571.894 y patente U.S. No. 5.587.458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo, como se describe en la patente U.S. 5.641.870. Tales fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. 6) Terapia con profármacos mediados por enzimas dependientes de anticuerpos (ADEPT) Los anticuerpos de la presente invención también se pueden usar en ADEPT conjugando el anticuerpo a una enzima activadora de profármacos que convierte un profármaco (por ejemplo, un agente quimioterapéutico peptidilo, ver WO 81/01145) a un fármaco anticáncer activo. Ver, por ejemplo, WO 88/07378 y patente U.S. No. 4.975.278.

El componente enzimático del inmunoconjugado útil para ADEPT incluye cualquier enzima capaz de actuar en un profármaco de tal modo de convertirlo en su forma más activa, citotóxica.

Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no están limitadas a, glicosidasa, glucosa oxidasa, lisozima humana, glucuronidasa humana, fosfatasa alcalina útil para convertir profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulfatasa útil para convertir los profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina desaminasa útil para convertir 5-fluorocitosina no tóxica en el fármaco anti-cáncer 5-fluorouracilo; proteasas, tales como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas (por ejemplo, carboxipeptidasa G2 y carboxipeptidasa A) y catepsinas (tales como catepsinas B y L), que son útiles para convertir los profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; las D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen D-aminoácidos sustituyentes; enzimas de escisión de carbohidratos tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa útiles para convertir profármacos glicosilados en fármacos libres; ß-lactamasa útil para convertir fármacos derivados con ß-lactamas en fármacos libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir fármacos derivados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en el arte como "abzimas" pueden usarse para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos libres (ver, por ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados de anticuerpo-abzima pueden ser preparados como se describe en la presente para suministrar la abzima a una población celular tumoral.

Las enzimas arriba mencionadas pueden ser unidas en forma covalente al polipéptido o los anticuerpos descriptos en la presente por técnicas bien conocidas en el arte tales como el uso de los agentes de unión cruzada heterobifuncionales comentados más arriba. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden por lo menos la región de unión al antígeno del anticuerpo de la invención unidas a por lo menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención pueden ser construidas usando técnicas de ADN recombinante bien conocidas en el arte (ver, por ejemplo Neuberger et al., Nature 312: 604-608 (1984)). 7) Anticuerpos biespecíficos y poliespecíficos Los anticuerpos biespecíficos (BsAbs) son anticuerpos que tiene especificidades de unión con respecto a por lo menos dos diferentes epitopos, incluyendo aquellos en la misma proteína o en otra proteína. Alternativamente, se puede armar un brazo para unir al antígeno objetivo, y otro brazo puede ser combinado con un brazo que se une a una molécula activadora en un leucocito tal como una molécula del receptor de las células T (por ejemplo, CD3), o receptores Fe para IgG (FcyR) tales como FcyR1 (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16), de modo de enfocar y localizar los mecanismos de defensa celulares para a la célula objetivo que expresa el antígeno. Tales anticuerpos pueden ser derivados de anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F(ab')2).

Los anticuerpos biespecíficos también pueden ser usados para localizar agentes citotóxicos en células que expresan el antígeno objetivo. Tales anticuerpos poseen un brazo que se une al antígeno deseado y otro brazo que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-a, alcaloide de vinca, cadena A de ricino, metotrexato o hapteno de isótopo radioactivo). Ejemplos de anticuerpos biespecíficos conocidos incluyen anti-ErbB2/anti-FcgRIII (WO 96/16673), anti-ErbB2/anti-FcgRI (patente U.S. 5.837.234), anti-ErbB2/anti-CD3 (patente U.S. 5.821.337).

Los métodos para preparar anticuerpos biespecíficos son conocidos en el arte. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada/cadena liviana de ¡nmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades. illstein eí al., Nature, 305:537-539 (1983). Debido a la cantidad aleatoria de cadenas pesadas y livianas de la ¡nmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpos, de los cuales sólo uno tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, que es realizada usualmente por pasos de cromatografía por afinidad, es bastante engorrosa y los rendimientos del producto son bajos. Procedimientos similares se divulgan en la WO 93/08829 y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

De acuerdo con una propuesta diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación anticuerpo-antígeno) son fusionadas a secuencias de dominio constante de inmunoglobulinas. La fusión es preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de una ¡nmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena liviana, presente en por lo menos una de las fusiones. Las codificaciones de ADNs de las fusiones de cadena pesada de la ¡nmunoglobulina y, si se desea, la cadena liviana de la ¡nmunoglobulina, son insertadas en vectores de expresión separados, y son cotransfectadas en un organismo huésped adecuado. Esto brinda una gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en formas de realización cuando las relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos usadas en la construcción proveen los rendimientos óptimos. Es posible, sin embargo, insertar las secuencias codificadoras para dos o las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de por lo menos dos cadenas de polipéptidos en relaciones iguales da por resultado altos rendimientos o cuando las relaciones no tienen significancia particular.

En una forma de realización preferida de esta propuesta, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de una inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena liviana de inmunoglobulina híbrida (que provee una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se halló que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulinas no deseadas, ya que la presencia de una cadena liviana de inmunoglobulina en sólo una mitad de las moléculas biespecíficas provee una forma fácil de separación. Esta propuesta es divulgada en la WO 94/04690. Para mayores detalles para la generación de anticuerpos biespecíficos, ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymologv 121 : 210 (1986).

De acuerdo con otra propuesta descripta en la WO 96/27011 o la patente U.S. 5.731.168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede ser manipulado por ingeniería genética para maximizar el porcentaje de heterodímeros que son recuperados de cultivos celulares recombinantes. La interfase preferida comprende por lo menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo son reemplazadas por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano). "Cavidades" compensadoras de tamaño idéntico o similar a la o las cadenas laterales grandes se crean en la interfase de la segunda molécula del anticuerpo reemplazando las cadenas laterales de aminoácidos grandes por unas más pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina). Esto provee un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero con respecto a otros productos finales no deseados tales como los homodímeros.

Se han descripto en la literatura técnicas para generar anticuerpos biespecíficos a partir de fragmentos de anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden ser preparados usando uniones químicas. Brennan eí al., Science 229: 81 (1985) describe un procedimiento en donde los anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente complejante de ditiol arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuro ¡ntermolecular. Los fragmentos Fab' generados son convertidos luego a derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB es reconvertido luego al derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden ser usados como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Los fragmentos Fab' pueden ser recuperados directamente de E. coli y acoplados químicamente para formar anticuerpos biespecíficos. Shalaby et al., J. Exp. Med. 175: 217-225 (1992) describe la producción de moléculas de F(ab')2 de anticuerpos biespecíficos completamente humanizados. Cada fragmento Fab' fue segregado separadamente de E. coli y sometido a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico así formado fue capaz de unirse a células que sobreexpresan el receptor de ErbB2 y las células TI humanas normales, así como también de activar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra los objetivos de tumores mamarios humanos.

También se han descripto varias técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpos bivalentes directamente de cultivos celulares recombinantes. Por ejemplo, se han producido heterodímeros bivalentes usando cremalleras ("zippers") de leucina. Kostelny et al., J. Inmunol., 148(5): 1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpos fueron reducidos en la región bisagra para formar monómeros y luego reoxidadas para formar los heterodímeros de anticuerpos. La tecnología de "diacuerpo" descripta por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) proporcionó un mecanismo alternativo para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos/bivalentes. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena liviana (VL) por un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando de este modo dos sitios de unió a antígenos. Otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpos biespecíficos/bivalentes mediante el uso de dímeros Fv (sFv) de cadena simple también ha sido reportada. Ver Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994).

Se contemplan también anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt et al., J. Immunol. 147: 60 (1991).

Los anticuerpos biespecíficos ilustrativos pueden unirse a dos diferentes epitopos en una molécula dada. Alternativamente, un brazo antiproteína puede ser combinado con un brazo que se une a una molécula activadora en un leucocito tal como una molécula de receptor de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28 o B7), o receptores Fe para IgG (FCYR), tales como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FCYRIII (CD16) de modo de enfocar mecanismo de defensa celular a la célula que expresa la proteína particular. Los anticuerpos biespecíficos también se pueden usar para localizar agentes citotóxicos a células que expresan una proteína particular. Tales anticuerpos poseen un brazo de unión a proteínas y un brazo que se une a un agente citotóxico o un quelador radionúclido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés se une a la proteína de interés y se une además al factor tisular (TF). 8) Anticuerpos multivalentes Un anticuerpo multivalente puede ser internalizado (y/o catabolizado) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno al cual se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son distintos de la clase de IgM) con tres o más sitios de unión a antígenos (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes), que pueden ser producidos fácilmente por expresión recombinante de ácidos nucleicos que codifican las cadenas de polipéptido del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión al antígeno. El dominio de dimerización preferido comprende (o consiste en) una región Fe o una región bisagra. En este escenario, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más sitios de unión al antígeno aminoterminales con respecto a la región Fe. Los anticuerpos multivalentes preferidos en la presente comprenden (o consisten en) tres a aproximadamente ocho, pero preferentemente cuatro, sitios de unión al antígeno. El anticuerpo multivalente comprende por lo menos una cadena de polipéptido (y preferentemente dos cadenas de polipéptido), en donde la o las cadenas de polipéptido comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la o las cadenas de polipéptidos pueden comprender VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena de polipéptido de una región Fe, X1 y X2 representan un aminoácido o polipéptido, y n es 0 o 1. Por ejemplo, la o las cadenas de polipéptidos pueden comprender: VH-CH1-ligador flexible-VH-CH1-cadena de región Fe; o VH-CH1-VH-CH1 -cadena de región Fe. El anticuerpo multivalente en la presente comprende además preferentemente por lo menos dos (y preferentemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de cadena liviana. El anticuerpo multivalente en la presente pueden comprender, por ejemplo, aproximadamente dos a aproximadamente ocho polipéptidos de dominio variable de cadena liviana. Los polipéptidos de dominio variable de cadena liviana contemplados en la presente comprenden un dominio variable de cadena liviana y, opcionalmente, comprenden además un dominio CL. 9) Anticuerpos heteroconjugados Los anticuerpos heteroconjugados también se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos en forma covalente. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede ser acoplado a avidina, el otro a biotina. Se ha propuesto que tales anticuerpos tienen como objetivo, por ejemplo, células de sistemas inmunes a células no deseadas, patente U.S. 4.676.980, y para el tratamiento de la infección HIV. WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 0308936. Se considera que los anticuerpos pueden ser preparados in vitro usando métodos conocidos en la química de las proteínas sintéticas, incluyendo aquellas que involucran a los agentes de unión cruzada. Por ejemplo, las inmunotoxinas pueden ser construidas usando una reacción de intercambio de disulfuros o formando una unión tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen ¡minotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato y aquellos divulgados, por ejemplo, en la patente U.S. No. 4.676.980. Los anticuerpos heteroconjugados pueden ser preparados usando cualesquiera métodos de unión cruzada convenientes. Agentes de unión cruzada adecuados son bien conocidos en el arte, y se divulgan en la patente U.S. No. 4.676.980, junto con una cantidad de técnicas de unión cruzada.

Ingeniería de función efectora Puede ser conveniente modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo, de modo de aumentar la citotoxicidad mediada por células dependiente del antígeno (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede lograr introduciendo una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fe del anticuerpo. Alternativamente o adicionalmente, el o los residuos de cisteína pueden ser introducidos en la región Fe, permitiendo de este modo la formación de una unión disulfuro intercatenaria en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o una mayor capacidad de eliminación de células mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Ver Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Inmunol. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con mayor actividad antitumoral también pueden ser preparados usando agentes de unión cruzada heterobifuncionales como se describe en Wolff et al., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, un anticuerpo puede ser manipulado por ingeniería genética, el cual tiene dos regiones Fe y puede de este modo tener mayores capacidades de lisis por el complemento y ADCC. Ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

Para aumentar la vida media sérica del anticuerpo, se puede incorporar un epitopo de unión del receptor de salvataje en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en la patente U.S. 5.739.277, por ejemplo. Como se usa en la presente, el término "epitopo de unión al receptor de salvataje" se refiere a un epitopo de la región Fe de una molécula de IgG (por ejemplo, IgGi, lgG2, lgG3 o lgG ) que es responsable de aumentar la vida media sérica in vivo de la molécula de IgG. 11) Inmunoconjugados La invención también se refiere a inmunoconjugados o conjugados de anticuerpo-fármaco (ADC), que comprenden un anticuerpo conjugado a un agente citotóxico tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o sus fragmentos), o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado). Un ADC de este tipo tiene que demostrar un perfil de seguridad aceptable.

El uso de ADCs para el suministro local de agentes citotóxicos o citostáticos, por ejemplo, fármacos para eliminar o inhibir células tumorales en el tratamiento del cáncer [Syrigos y Epenetos, Anticancer Research 19: 605-14 (1999); Niculeascu-Duvaz y Springer, Adv. Drug Del. Rev. 26: 151-72 (1997); US 4,975,278] permite teóricamente un suministro direccionado de la parte del fármaco a los tumores, y la acumulación intracelular allí, en donde la administración sistémica de estos agentes de fármacos no conjugados pueden dar por resultado niveles inaceptables de toxicidad para las células normales así como también las células tumorales que se busca eliminar (Baldwin et al., Lancet, 603-05 (1986); Thorpe, (1985) Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies '84: Biológica! and Clinical Applications, A. Pinchera et al. (eds), pp. 475-506). De este modo se busca la máxima eficacia con mínima toxicidad. Se ha informado que tanto los anticuerpos policlonales como los anticuerpos monoclonales son útiles en estas estrategias (Rowly et al., Cáncer Inmunol. Inmunother. 21:183-87 (1986)). Los fármacos usados en estos métodos incluyen daunomicina, doxorrubicina, metotrexato y vindesina. Las toxinas usadas en conjugados de anticuerpo-toxina incluyen toxinas bacterianas tales como la toxina de la difteria, las toxinas de plantas tales como el ricino, las toxinas de moléculas pequeñas tales como la geldanamicina (Miler et al., J. Nat. Cáncer Inst. 92(19): 1573-81 (2000); Miler et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:1025-28 (2000); Miler et al., Bioconjugate Chem. 13: 786-91 (2002)), los maitansinoides (EP 1391213; Liu et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93: 8618-23 (1996)), y la caliqueamicina (Lode et al., Cáncer Res. 58:2928 (1998); y Hinman et al., Cáncer Res. 53:3336-42 (1993)). Las toxinas pueden ejercer sus efectos citotóxicos y citostáticos por mecanismos que incluyen la unión de tubulina, la unión de ADN o la inhibición de la topoisomerasa. Algunos fármacos citotóxicos tienden a ser inactivos o menos activos cuando son conjugados a grandes anticuerpos o ligandos receptores de proteínas.

Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de tales inmunoconjugados han sido descriptos más arriba, e incluyen BCNU, estreptozoicina, vincristina, vinblastina, adriamicina y 5-fluorouracilo.

Las toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden usarse incluyen la cadena A de difteria, fragmentos activos no ligantes de la toxina de la difteria, la cadena A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), la cadena A de ricina, la cadena A de abrina, la cadena A de modeccina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurítes fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phitolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S), inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Una variedad de radionúclidos se encuentran disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen 212Bi, 1311, 131 In, 90Y, y 186Re. Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se preparan usando una variedad de agentes acopladores de proteína bifuncionales tales como propionato de N— succinimidil— 3— (2— piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCI), esteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 ,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, se puede preparar una inmunotoxina de ricina como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-¡sotiocianatobencil-3-metildietilentriamina-pentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente que ilustrativos para la conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Ver, por ejemplo, WO 1994/11026.

Conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se preparan usando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncionales tales como el propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCL), ésteres activos (tales como disuccinimidil suberato), aldehidos (tales como glutareldehído), compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tales como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tales como tolueno 2,6-diisocianato) y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1 ,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede ser preparado como se describe en Vitetta et al., Science, 238: 1098 (1987). El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietilentriamina-pentaacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ilustrativo para conjugación de radionucleótidos al anticuerpo. Ver WO94/11026. El ligador puede ser un "ligador escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un ligador lábil a los ácidos, un ligador sensible a la peptidasa, un ligador dimetilo o un ligador que contiene disulfuro (Chari er a/., Cáncer Res. 52:127-131 (1992)).

Adicionalmente, las toxinas de moléculas pequeñas tales como caliqueamicina, maitansina (patente U.S. 5.208.020), tricoteno y CC1065 también son contemplados como toxinas conjugables para usar con la formulación de la invención. En una forma de realización, el anticuerpo de longitud completa o los fragmentos de unión al antígeno del mismo pueden ser conjugados a una o más moléculas de maitansinoides (por ejemplo, aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansinoide por molécula de anticuerpo). Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de tubulina. Los maitansinoides, aislados de fuentes naturales o preparados sintéticamente, incluyendo maitansina, maitansinal y sus derivados y análogos han sido descriptos, ver por ejemplo, patente U.S. No. 5.208.020 y las referencias mencionadas allí (ver col. 2, línea 53 a col. 3, línea 10) y patentes U.S. 3.896.111 y 4.151.042. Métodos de preparación de conjugados de anticuerpo-maitansinoide también se describen en la patente U.S. No. 5.208.020. En una forma de realización preferida, un maitansinoide está unido al anticuerpo a través de un disulfuro o de otro grupo ligador que contiene azufre. La maitansina puede ser convertida, por ejemplo, en May-SS-Me, que puede ser reducida a May-SH3 y hacerse reaccionar con un anticuerpo modificado para generar un inmunoconjugado de maitansinoide-anticuerpo. Chari et al., Cáncer Res. 52: 127-131 (1992). El anticuerpo puede ser modificado por métodos conocidos y el anticuerpo que contiene grupos tiol libres o protegidos se hace reaccionar luego con un disulfuro que contiene maitansinoide para producir el conjugado. La citotoxicidad del conjugado de anticuerpo-maitansinoide se puede medir in vitro o in vivo por métodos conocidos y se determina la C o- La caliqueamicina es otro inmunoconjugado de interés. La familia de la caliqueamicina de antibióticos es capaz de producir rupturas de ADN de doble hebra en concentraciones sub-picomolares. Los análogos estructurales de caliqueamicina que se pueden usar incluyen, pero no están limitados a, ?? a2\ a31, N-acetil-?? PSAG y ? ? (Hinman et al., Cáncer Res. 53:3336-3342 (1993) y Lode et al., Cáncer Res. 58:2925-2928 (1998)). Otros fármacos anti-tumorales que pueden ser conjugados con el anticuerpo incluyen QFA que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como el QFA tienen sitos intracelulares de acciones y no cruzan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular de estos agentes a través de la internalización mediada por el anticuerpo aumenta mucho sus efectos citotóxicos.

Los ¡nmunoconjugados formados entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolitica (por ejemplo, una ribonucleasa o una ADN endonucleasa, tal como desoxirribonucleasa, ADNasa) también se consideran.

En los ADCs de la invención, un anticuerpo (Ab) es conjugado a una o más partes de fármacos (D), por ejemplo aproximadamente 1 a aproximadamente 20 partes de fármaco por anticuerpo, a través de un ligador (L). El ADC de Fórmula I puede ser preparado por varias vías, empleando reacciones de química orgánica, condiciones y reactivos conocidos por los expertos en el arte, incluyendo: (1) reacción de un grupo nucleofílico de un anticuerpo con un reactivo ligador bivalente, para formar Ab-L, a través de un enlace covalente, seguido por la reacción con una parte de un fármaco D; y (2) reacción de un grupo nucleofílico de una parte de un fármaco con un reactivo de ligador bivalente, para formar D-L, a través de un enlace covalente, seguido por la reacción con el grupo nucleofílico de un anticuerpo.

Ab-(L-D)p Fórmula I Los grupos nucleofílicos en anticuerpos incluyen, pero no están limitados a: (i) grupos amina N-terminales, (¡i) grupos amina de cadena lateral, por ejemplo lisina, (iii) grupos tiol de cadena lateral, por ejemplo, cisteína, y (iv) grupos amino o hidroxilo de azúcar en donde el anticuerpo es glicosilado. Los grupos amina, tiol e hidroxilo son nucleofílicos y capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en partes de ligador y reactivos de ligador incluyendo: (i) ésteres activos tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos y haluros ácidos; (ii) alquil y bencil haluros tales como haloacetamidas; y (iii) grupos de aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida. Algunos anticuerpos tienen disulfuros intercatenarios reductibles, es decir, puentes de cisteína. Los anticuerpos pueden hacerse reactivos para la conjugación con reactivos ligadores por tratamiento con un agente reductor, tal como DTT (ditiotreitol). Cada puente de cisteína formará por lo tanto, teóricamente, dos nucleófilos de tiol reactivos. Los grupos nucleofílicos adicionales pueden ser introducidos en los anticuerpos a través de la reacción de lisinas con 2-iminotiolano (reactivo de Traut) dando por resultado la conversión de una amina en un tiol.

Los ADCs de la invención también pueden ser producidos por modificación del anticuerpo para introducir partes electrofílicas, que pueden reaccionar con sustituyentes nucleofílicos en el reactivo o fármaco ligador. Los azúcares de los anticuerpos glicosilados pueden ser oxidados, por ejemplo, con reactivos oxidantes de peryodato, para formar grupos aldehido o cetona que pueden reaccionar con el grupo amina de reactivos ligadores o partes de fármacos. Los grupos de base de Schiff imina resultantes pueden formar una unión estable, o pueden ser reducidos, por ejemplo, por reactivos borohidruro para formar uniones amina estables. En una forma de realización, la reacción de la porción carbohidrato de un anticuerpo glicosilado con o bien galactosa oxidasa o meta-peryodato de sodio puede dar grupos carbonilo (aldehido y cetona) en la proteína que pueden reaccionar con grupos apropiados en el fármaco (Domen et al., J.

Chromatog., 510: 293-302 (1990)). En otra forma de realización, las proteínas que contienen residuos de serina o treonina N-terminales pueden reaccionar con meta-peryodato de sodio, dando por resultado la producción de un aldehido en lugar de los primeros aminoácidos (Geoghegan y Stroh, Bioconjugate Chem. 3:138-46 (1992); US 5,362,852). Tales aldehidos pueden hacerse reaccionar con una parte de un fármaco o un nucleófilo ligador.

Igualmente, los grupos nucleofílicos en una parte de un fármaco incluyen, pero no están limitados a: grupos amina, tiol, hidroxilo, hidrazida, oxima, hidrazina, tiosemicarbazona, hidrazina carboxilato y arilhidrazida capaces de reaccionar para formar enlaces covalentes con grupos electrofílicos en partes de ligadores y reactivos ligadores que incluyen: (i) ésteres activos, tales como ésteres NHS, ésteres HOBt, haloformatos y haluros ácidos; (ii) haluros de alquilo y bencilo, tales como haloacetamidas; y (iii) grupos aldehidos, cetonas, carboxilo y maleimida.

Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y un agente citotóxico pueden ser preparados, por ejemplo, por técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud de ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado o bien una adyacente a la otra o separadas por una región que codifica un péptido ligador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

En otra forma de realización, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para su utilización en un predireccionado al tumor en donde el conjugado anticuerpo-receptor es administrado al paciente, seguido por la remoción del conjugado no unido de la circulación usando un agente de depuración y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que es conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido).

Los ADCs en la presente son preparados opcionalmente con reactivos de unión cruzada: BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, y sulfo-SMPB, y SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona)benzoato), que se pueden obtener comercialmente (por ejemplo, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL).

El anticuerpo también puede ser conjugado a un átomo altamente radioactivo. Una variedad de radionúclidos se encuentra disponible para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen At211, Bi212, I131 , ln131, Y90, Re186, Re188, Sm153, P32 y Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando se usa el conjugado para diagnóstico, éste puede comprender un átomo radioactivo para estudios escintigráficos, por ejemplo Te" o I123, o un marcador de espín para toma de imágenes por resonancia magnética nuclear (nmr) (también conocida como toma de imágenes por resonancia magnética, mri), tales como yodo-123, yodo-131 , indio— 1 1 1 , flúor-19, carbono-13, nitrógeno-15, oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

Los radiomarcadores u otros marcadores pueden ser incorporados en el conjugado en formas conocidas. Por ejemplo, el péptido puede ser biosintetizado o puede ser sintetizado por síntesis química de aminoácidos usando precursores de aminoácidos adecuados que involucran, por ejemplo, flúor-19 en lugar de hidrógeno. Marcadores tales como Te" o I123, Re186, Re188 e ln 11 pueden ser unidos a través de un residuo de cisteína en el péptido. Se puede unir itrio-90 por medio de un residuo de lisina. el método IODOGEN® se puede usar para incorporar yodo-123, Fraker eí al., Biochem. Biophis. Res. Commun. 80:49-57 (1978). Otros métodos de conjugación de radionúclidos se describen en "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy", (Chatal, CRC Press 1989).

Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y el agente citotóxico puede ser preparada por técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede comprender regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado o bien adyacentes una a la otra o separadas por una región que codifica un péptido ligador que no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

En otra forma de realización, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en predireccionado a un tumor en donde el conjugado anticuerpo-receptor es administrado al paciente, seguido por la remoción del conjugado no unido de la circulación usando un agente de depuración y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que es conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido). 12) Otras modificaciones de secuencias de aminoácidos Se contemplan las modificaciones de secuencias de aminoácidos de los anticuerpos descriptos en la presente. Por ejemplo, puede ser conveniente mejorar la afinidad de unión y/o otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo son preparadas introduciendo cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del anticuerpo, o por síntesis de péptidos. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en, y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución se realiza para llegar al constructo final, siempre que el constructo final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos postraduccionales del anticuerpo, tales como cambiar el número o la posición de los sitios de glicosilación.

Un método útil para la identificación de algunos residuos o regiones del anticuerpo que son localizaciones preferidas para la mutagénesis es denominado "mutagénesis de exploración de alanina" como describen Cunningham y Wells en Science, 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo son identificados (por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplazados por aminoácidos neutros o cargados negativamente (más preferentemente alanina o polialanina) para afectar la interacción del antígeno de los aminoácidos. Aquellas localizaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional a las sustituciones son refinadas luego introduciendo otras variantes o variantes adicionales en, o para, los sitios de sustitución. Así, si bien el sitio para introducir una variación de secuencias de aminoácidos es predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, para analizar la performance de una mutación en un sitio dado, se realiza una exploración ala o mutagénesis aleatoria en el codón o región objetivo y las variantes de anticuerpos expresadas son rastreadas con respecto a la actividad deseada.

Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino-y/o carboxilo-terminales que oscilan en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como también inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserciones de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo para ADEPT) o un polipéptido que aumenta la vida media sérica del anticuerpo.

Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácidos. Estas variantes tienen por lo menos un residuo de aminoácidos en la molécula de anticuerpo reemplazada por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustituciones incluye las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones de FR. Las sustituciones conservadoras se muestran en la Tabla A más abajo bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si tales sustituciones dan por resultado un cambio en la actividad biológica, entonces se pueden introducir más cambios sustanciales, denominados "sustituciones ilustrativas" en la Tabla A, o como se describe adicionalmente más abajo con referencia a las clases de aminoácidos, y se examinan los productos.

Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran seleccionando sustituciones que difieren significativamente en su efecto para mantener (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Los residuos que existen naturalmente se dividen en grupos basados en propiedades comunes de las cadenas laterales: (1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las sustituciones no conservadoras comprenderán intercambiar un miembro de una de esas clases por otra clase.

Cualquier residuo de cisteína no involucrado en el mantenimiento de la conformación propia del anticuerpo también puede ser sustituido, en general con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar uniones cruzadas aberrantes. A la inversa, las uniones de cisteína pueden ser agregadas TABLA A Sustituciones de aminoácidos al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).

Un tipo particularmente preferido de variante de sustituciones comprende la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo parental (por ejemplo un anticuerpo humanizado o humano). En general, las variantes resultantes seleccionadas para el desarrollo ulterior tendrán propiedades biológicas mejoradas con relación al anticuerpo parental del cual son generadas. Un modo conveniente para generar tales variantes de sustituciones comprende la maduración de afinidad usando el display de fagos. Brevemente, varios sitios de regiones hipervariables (por ejemplo 6-7 sitios) son mutados para generar todas las sustituciones amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpos así generadas son desplegadas de un modo monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto del gen III de M13 empaquetado dentro de cada partícula. Las variantes por display de fagos son rastreadas luego con respecto a su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) como se divulga en la presente. Para identificar los sitios de región hipervariable candidatos para la modificación, se puede realizar una mutagénesis de exploración de alanina para identificar los residuos de la región hipervariable que contribuyen significativamente a la unión al antígeno. Alternativamente, o adicionalmente, puede ser beneficioso analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y la IgE. Tales residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en la presente. Una vez que se generaron tales variantes, el panel de variantes es sometido a rastreo como se describe en la presente y se pueden seleccionar anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes para el desarrollo ulterior.

Otro tipo de variantes de aminoácidos del anticuerpo altera el patrón de glicosilacion original del anticuerpo. Por altera se entiende que deleciona una o más partes carbohidrato que se encuentran en el anticuerpo, y/o agregar uno o más sitios de glicosilacion que no están presentes en el anticuerpo.

La glicosilacion de anticuerpos es típicamente o bien unida a N o unida a O. Unida a N se refiere a la unión de la parte carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento de la unión enzimática de la parte de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido crea un sitio de glicosilacion potencial. La glicosilacion unida a O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también se puede usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina.

La adición de sitios de glicosilacion al anticuerpo es lograda convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos de tal modo que contiene una o más e las secuencias de tripéptidos descriptas más arriba (para sitios de glicosilacion unidos a N). La alteración también se puede realizar por la adición de, o la sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación unidos a O).

Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican variantes de secuencias de aminoácidos del anticuerpo anti-lgE son preparadas por una variedad de métodos conocidos en el arte. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos que existen naturalmente) o la preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida a un sitio), mutagénesis por PCR y mutagénesis de cassette de una variante preparada anteriormente o una versión no variante del anticuerpo anti-lgE. 13) Otras modificaciones de anticuerpos Los anticuerpos de la presente invención pueden ser modificados adicionalmente para contener partes adicionales no proteináceas que son conocidas en el arte y se pueden obtener fácilmente. Preferentemente, las partes adecuadas para la derivación del anticuerpo son polímeros solubles en agua. Ejemplos no limitativos de polímeros solubles en agua incluyen, pero no están limitados a, polietilenglicol (PEG), copolímeros de etilenglicol/propilenglicol, carboximetilcelulosa, dextrano, alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, poli— 1 ,3— dioxolano, poli— 1 ,3,6-trioxano, copolímero de etileno/anhídrido maleico, poliaminoácidos (o bien homopolímeros o copolímeros aleatorios), y dextrano o poli(n— inil pirrolidona)polietilenglicol, homopolímeros de polipropilenglicol, copolímeros de óxido de polipropileno/óxido de etileno, poiioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol), alcohol polivinílico, y mezclas de estos. El propionaldehído de polietilenglicol puede tener ventajas en la preparación debido a su estabilidad en agua. El polímero puede ser de cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. El número de polímeros unidos al anticuerpo puede varia, y si se une más de un polímero, estos pueden ser moléculas iguales o diferentes. En general, el número y/o el tipo de polímeros usados para la derivación puede ser determinado en base a consideraciones que incluyen, pero no están limitadas a, las propiedades o funciones particulares del anticuerpo a ser mejorado, ya sea que el derivado de anticuerpo se use en una terapia bajo condiciones definidas, etc. Tales técnicas y otras formulaciones adecuadas se divulgan en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Ed., Alfonso Gennaro, Ed., Philadelphia College of Pharmacy and Science (2000).

C. Preparación recombinante de anticuerpos anti-lgE La invención también provee un ácido nucleico aislado que codifica anticuerpos anti-lgE apoptóticos, vectores y células huésped que comprenden tales ácidos nucleicos y técnicas recombinantes para la producción del anticuerpo.

Para la producción recombinante del anticuerpo, el ácido nucleico que lo codifica es aislado e insertado en un vector replicable para clonación ulterior (amplificación del ADN) o para la expresión. El ADN que codifica el anticuerpo monoclonal es aislado y secuenciado fácilmente usando procedimientos convencionales (por ejemplo, usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y livianas del anticuerpo). Muchos vectores se encuentran disponibles. Los componentes de los vectores incluyen generalmente, pero no están limitados a, uno o más de los siguientes, una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, y un elemento intensificador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. (1) Componente de secuencia de señales Los anticuerpos anti-lgE de esta invención pueden ser producidos en forma recombinante no sólo directamente sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es preferentemente una secuencia de señales u otro polipéptido que tiene un sitio de escisión específico en el extremo N de la proteína madura o polipéptido. La secuencia de señales heteróloga seleccionada preferentemente es una que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una peptidasa de señales) por la célula huésped. Para las células huésped procariotas que no reconocen y procesan la secuencia de señales de mamíferos nativa, la secuencia de señales es sustituida por una secuencia de señales procariota seleccionada, por ejemplo, entre el grupo de la fosfatasa alcalina, la penicilinasa, Ipp, o conductores de enterotoxina II estables al calor. Para la secreción de levaduras la secuencia de señales nativa puede ser sustituida por ejemplo, por el conductor invertasa de levaduras, el conductor factor (incluyendo los conductores de los factores Saccharomyces y Kluyveromyces), o el conductor de fosfatasa ácida, el conductor de glucoamilasa de C. albicans o la señal descripta en la WO 90/13646. En la expresión celular en mamíferos, las secuencias de señales de mamíferos así como también los conductores segregadores virales, por ejemplo, la señal de herpes simplex gD, se encuentran disponibles.

El ADN para esa región precursora está unido en el marco de lectura al ADN que codifica el anticuerpo que se une a IgE. (2) Origen de replicación Ambos vectores, de expresión y clonación, contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. En general, en los vectores de clonación esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación autónoma. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de la replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido de 2µ es adecuado para levaduras y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para vectores de clonación en células de mamíferos. En general, el origen del componente de replicación no se necesita para los vectores de expresión de mamíferos (el origen SV40 se puede usar típicamente sólo porque contiene el promotor temprano). (3) Componente del gen de selección Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, denominado también un marcador seleccionable. Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, (b) deficiencias auxotróficas del complemento, o (c) nutrientes críticos del suministro no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Las células que son transformadas exitosamente con un gen heterólogo producen una proteína que confiere resistencia al fármaco y así sobrevive al régimen de selección. Ejemplos de tal selección dominan usa los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

Otro ejemplo de marcadores seleccionabas adecuados para las células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células competentes para captar el ácido nucleico del anticuerpo que se une a IgE, tal como DHFR, timidina quinasa, metalotioneína-l y -II, preferentemente genes de metalotioneína de primates, adenosina desaminasa, ornitina descarboxilasa, etc.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR son identificadas primero cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx), un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea el DHFR de tipo salvaje es la línea celular de ovario de hámster chino (CHO) deficiente en actividad DHFR (por ejemplo, ATCC CRL-9096).

Alternativamente, las células huésped (particularmente los huéspedes de tipo salvaje que contienen DHFR endógeno) transformadas o cotransformadas con secuencias de ADN que codifican un anticuerpo de unión a la IgE, la proteína DHFR de tipo salvaje, y otro marcador seleccionare tal como aminoglicósido 3'-fosfotransferasa (APH) pueden ser seleccionados por cultivo celular en medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable tal como un antibiótico aminoglicosídico, por ejemplo, kanamicina, neomicina, o G418. Ver patente U.S. No. 4.965.199.

Un gen de selección adecuado para usar en levaduras es el gen frp1 presente en el plásmido de levadura YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)). El gen f/p1 provee un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que no tiene la capacidad de crecer en triptófano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión ? 1 en el genoma de la célula huésped de levadura provee luego un ambiente efectivo para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano. Similarmente, las cepas de levadura deficientes en Leu2 (ATCC 20.622 o 38.626) son complementadas por plásmidos conocidos que llevan el gen Leu2.

Además, los vectores derivados del plásmido circular de 1 ,6 µ?t? pKD1 se pueden usar para la transformación de levaduras Kluyveromyces. Alternativamente, un sistema de expresión para la producción en gran escala de quimosina de ternero recombinante fue informada para K. lactis. Van den Berg, Bio Technology, 8:135 (1990). Los vectores de expresión de copias múltiples estables para la secreción de albúmina sérica humana recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces también han sido divulgados. Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991). (4) Componente promotor Los vectores de expresión y clonación contienen usualmente un promotor que es reconocido por el organismo huésped y está unido operativamente al ácido nucleico que codifica el anticuerpo que se une a IgE. Los promotores adecuados para usar con huéspedes procariotas incluyen el promotor phoA, sistemas promotores de lactamasa y lactosa, promotor de fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Sin embargo, también son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores para usar en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el anticuerpo de unión a IgE.

Las secuencias de promoteres son conocidas para los eucariotas. Casi todos los genes eucariotas tienen una región rica en AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases corriente arriba del sitio en donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada 70 a 80 bases corriente arriba del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucariotas se encuentra una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificadora. Todas estas secuencias son insertadas adecuadamente en vectores de expresión eucariotas.

Ejemplos de secuencias de promotores adecuados para usar con huéspedes de levadura incluyen los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfo-fructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa.

Otros promotores de levaduras, que son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de cultivo, son las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para el uso en la expresión en levaduras se describen además en la EP 73.657. Los intensificadores de levaduras también se usan ventajosamente con los promotores de levaduras.

La transcripción del anticuerpo que se une a IgE de vectores en células huésped de mamíferos es controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de los genomas de virus tales como el virus del polioma, el virus de la viruela de las aves, adenovirus (tal como Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferentemente el virus del simio 40 (SV40), de los promotores heterólogos de mamíferos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores del shock térmico, siempre que tales promotores sean compatibles con los sistemas de células huésped.

Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen viral SV40 de replicación. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano es obtenido convenientemente como un fragmento de restricción Hindlll E. Un sistema para expresar el ADN en huéspedes de mamíferos usando el virus del papiloma bovino como un vector se divulga en la patente U.S. No. 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente U.S. No. 4.601.978. Ver también Reyes et al., Nature 297:598-601 (1982) sobre la expresión del cADN de interferón humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina quinasa del virus del herpes simplex. Alternativamente, se puede usar la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous como el promotor. (5) Componente del elemento intensificador La transcripción de un ADN que codifica el anticuerpo de unión a la IgE de esta invención por eucariotas superiores es aumentada frecuentemente insertando una secuencia intensificadora en el vector. Muchas secuencias intensificadoras son conocidas ahora de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, fetoproteína, e insulina). Típicamente, sin embargo, se usará un intensificador de un virus de una célula eucariota. Ejemplos incluyen el intensificador SV40 en el lado tardío del origen de replicación (bp 100-270), el intensificador del promotor temprano del citomegalovirus, el intensificador del polioma en el lado tardío del origen de replicación e intensificadores de adenovirus. Ver también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos intensificadores para la activación de los promotores eucariotas. El intensificador puede ser sometido a corte y empalme en el vector en una posición 5' o 3' con respecto a la secuencia codificadora del anticuerpo de unión a la IgE, pero está ubicado preferentemente en un sitio 5' del promotor. (6) Componente de terminación de transcripción Los vectores de expresión usados en células huésped eucariotas (células de levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanas, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrán secuencias necesarias para la terminación de transcripción y para estabilizar el mARN. Tales secuencias se pueden obtener comúnmente de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3', de ADNs o cADNs eucariotas o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcriptos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mARN que codifica el anticuerpo de unión al IgE. Un componente de terminación de transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Ver el documento WO 94/11026 y el vector de expresión divulgado allí. (7) Selección y transformación de células huésped Las células huésped adecuadas para la clonación o la expresión del ADN en los vectores en la presente son las células procariotas, levaduras o eucariotas superiores descriptas más arriba. Los procariotas adecuados para este propósito incluyen eubacterias, tales como los organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriaceae tales como Escheríchia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurio, Serratía, por ejemplo, Serratia marcescans, y Shigella, así como también Bacilli tales como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41 P divulgado en la DD 266.710 publicada el 12 de abril de 1989), Pseudomonas tales como P. aeruginosa, y Streptomyces. Un huésped de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31 ,446), aunque también son adecuadas otras cepas tales como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537), y E. coli W3110 (ATCC 27.325). Estos ejemplos son ilustrativos en lugar de limitativos.

Anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos y proteínas de fusión de anticuerpos puede ser producidos en bacterias, en particular cuando no se requiere la función de glicosilación y la función efectora Fe, tal como cuando el anticuerpo terapéutico es conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoconjugado por sí mismo muestra efectividad en la destrucción de células tumorales. Los anticuerpos de longitud completa tienen mayor vida media en circulación. La producción en E. coli es más rápida y más eficiente con respecto a los costos. Para la expresión de fragmentos de anticuerpos y polipéptidos en bacterias, ver, por ejemplo, U.S. 5.648.237 (Cárter et al.), U.S. 5.789.199 (Joly eí al.) y U.S. 5.840.523 (Simmons et al.) que describen la región de iniciación de traducción (TIR) y las secuencias de señales para optimizar la expresión y la secreción. Después de la expresión, el anticuerpo es aislado de la pasta celular de E. coli en una fracción soluble y puede ser purificada mediante, por ejemplo, una columna de proteína A o G dependiendo del isotipo. La purificación final puede ser realizada en forma similar al procedimiento para purificar el anticuerpo expresado, por ejemplo, en células CHO.

Además de los procariotas, también son adecuados los microbios eucariotas tales como los hongos o levaduras filamentosos como huéspedes de clonación o expresión para los vectores que codifican los anticuerpos de unión a IgE. La Saccharomyces cerevisiae, o levadura común de panificación, es el más usado comúnmente entre los microorganismos huéspedes eucariotas inferiores. Sin embargo, una cantidad de otros géneros, especies y cepas se encuentran disponibles comúnmente y son útiles en la presente, tales como Schizosaccharomyces pombe; huéspedes de Kluyveromyces tales como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906), K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, los huéspedes Neurospora, Penicillio, Tolypocladio, y Aspergillus tales como A. nidulans y A. niger.

Células huésped adecuadas para la expresión del anticuerpo de unión a IgE glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Se han identificado numerosas cepas baculovirales y variantes y células huésped de insectos permisivas correspondientes de tales huéspedes, tales como Spodoptera frugiperda (oruga), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx morí. Una variedad de cepas virales para la transfección se encuentran disponibles públicamente, por ejemplo, la variante L-1 de Autographa califomica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx morí NPV, y tales virus pueden ser usados como el virus en la presente de acuerdo con la presente invención, particularmente para la transfección de células de Spodoptera frugiperda.

Cultivos de células de plantas de algodón, maíz, papa, soja, petunia, tomate y tabaco también se pueden utilizar como huéspedes.

Sin embargo, el mayor interés se ha centrado en las células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha tornado un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas celulares de huéspedes mamíferos útiles son la línea CV1 de riñón de mono CV1 transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); la línea de riñón embrionario humano (293 o células 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de riñón de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980) ); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario del ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N. Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

Las células huésped son transformadas con los vectores de expresión o clonación arriba descriptos para la producción de anticuerpos de unión a IgE y cultivadas en medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. (8) Cultivo de las células huésped Las células huésped usadas para producir el anticuerpo de unión a IgE de esta invención pueden ser cultivadas en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles tales como Ham's F10 (Sigma), medio esencial mínimo ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) y el medio Eagle modificado por Dulbecco ((DMEM), Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descriptos en Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem.102:255 (1980), patentes U.S. Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; o 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; o la patente U.S. Re. 30.985 se pueden usar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios puede ser suplementado como sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruro de sodio, calcio, magnesio, y fosfato), buffers (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos (tales como el fármaco GENTAMYCIN™), oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes a concentraciones finales en el rango micromolar), y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualesquiera otros suplementos necesarios también pueden ser incluidos en concentraciones apropiadas que son conocidas por los expertos en el arte. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH, y similares, son aquellas usadas previamente con la célula huésped seleccionada para expresión, y resultarán evidentes para el experto en el arte. (9) Purificación del anticuerpo Cuando se usan técnicas recombinantes, el anticuerpo puede ser producido en forma intracelular, en el espacio periplasmático, o segregado directamente en el medio. Si el anticuerpo es producido en forma intracelular, como un primer paso, los desechos en partículas, o bien células huésped o fragmentos lisados, son removidos, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Cárter et al., Bio Technology 10:163-167 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que son segregados al espacio periplasmático de E. coli. Brevemente, la pasta celular es descongelada en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF) durante aproximadamente 30 min. Los desechos celulares pueden ser removidos por centrifugación. En donde el anticuerpo es segregado en el medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión son concentrados primero en general usando un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa tal como PMSF puede ser incluido en cualquiera de los pasos precedentes para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para evitar el crecimiento de contaminantes adventicios.

La composición del anticuerpo preparado a partir de células puede ser purificada usando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis, y cromatografía de afinidad, prefiriéndose la cromatografía de afinidad como técnica de purificación. La adecuación de la proteína A como un ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fe de ¡nmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A se puede usar para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas 1, 2 o 4 humanas (Lindmark et al., J. Inmunol. Meth. 62:1-13 (1983)). La proteína G es recomendada para todos los ¡sotipos de ratón y para humano 3 (Guss et al., EMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando de afinidad es frecuentemente agarosa, pero se encuentran disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio poroso controlado o poli(estireno-divinil)benceno permiten que se puedan alcanzar caudales más rápidos y tiempos de procesamiento más cortos que con agarosa. En donde el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, NJ) es útil para la purificación. Otras técnicas para purificación de proteínas, tales como fraccionamiento en una columna de intercambio de iones, precipitación en etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE™ en una resina de intercambio de aniones o cationes (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio también se encuentran disponibles dependiendo del anticuerpo que se debe recuperar.

Siguiendo cualesquiera pasos de purificación preliminares, la mezcla que comprende el anticuerpo de interés y los contaminantes puede ser sometida a cromatografía de interacción hidrófoba de bajo pH usando un buffer de elución a un pH entre aproximadamente 2.5-4,5, preferentemente realizado a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, de aproximadamente 0-0,25M de sal).

D. Formulaciones farmacéuticas Se preparan las formulaciones terapéuticos para el almacenamiento mezclando el ingrediente activo que tiene el grado deseado de pureza con vehículos, excipientes o estabilizantes opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a Ed., Lippincott Williams & Wiklins, Pub., Gennaro Ed., Philadelphia, PA 2000). Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los recipientes a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen buffers, antioxidantes que incluyen ácido ascórbico, metionina, vitamina E, metabisulfito de sodio; conservantes, isotonificadores, estabilizantes, complejos metálicos (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); agentes quelantes tales como EDTA y/o tensioactivos no iónicos.

Cuando el agente terapéutico es un fragmento de anticuerpo, se prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une específicamente al dominio de unión de la proteína objetivo. Por ejemplo, en base a las secuencias de región variable de un anticuerpo, se pueden diseñar fragmentos de anticuerpos o incluso moléculas de péptidos que retienen la capacidad para unir la secuencia de proteína objetivo. Tales péptidos pueden ser sintetizados químicamente y/o producidos por tecnología de ADN recombinante (ver, por ejemplo, Marasco et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 7889-7893

[1993]).

Los buffers se usan para controlar el pH en un rango que optimiza la efectividad terapéutica, especialmente si la estabilidad es dependiente del pH. Los buffers se encuentran presentes preferentemente en concentraciones que oscilan entre aproximadamente 50 mM y aproximadamente 250 mM. Los agentes buffer adecuados para usar con la presente invención incluyen tanto ácidos orgánicos como inorgánicos y sus sales. Por ejemplo, citrato, fosfato, succinato, tartrato, fumarato, gluconato, oxalato, lactato, acetato. Adicionalmente, los buffers pueden consistir en histidina y sales de trimetilamina tales como Tris.

Los conservantes se agregan para retardar el crecimiento microbiano y están presentes típicamente en un rango de 0,2% - 1 ,0% (p/v). Los conservantes adecuados para usar con la presente invención incluyen cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro), cloruro de benzetonio; timerosal, fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos tales como metil- o propilparabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol, 3-pentanol, y m-cresol.

Los agentes de tonicidad, denominados algunas veces "estabilizantes" están presentes para ajustar o mantener la tonicidad del líquido en una composición. Cuando se usan con biomoléculas cargadas, grandes, tales como proteínas y anticuerpos, frecuentemente son denominados "estabilizantes" porque pueden interactuar con los grupos cargados de las cadenas laterales de aminoácidos, disminuyendo de este modo el potencial para interacciones inter- e intramoleculares. Los agentes de tonicidad pueden estar presentes en cualquier cantidad entre 0,1% y 25% en peso, preferentemente 1 a 5%, teniendo en cuenta las cantidades relativas de los otros ingredientes. Los agentes de tonicidad preferidos incluyen alcoholes de azúcar polihídricos, preferentemente alcoholes trihídricos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol.

Los excipientes adicionales incluyen agentes que pueden servir como uno o más de los siguientes: (1) agentes espesantes, (2) intensificadores de la solubilidad, (3) estabilizantes y (4) y agentes que evitan la desnaturalización o adherencia a la pared del contenedor. Tales excipientes incluyen: alcoholes de azúcares polihídricos (enumerados más arriba); aminoácidos tales como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutámico, treonina, etc.; azúcares orgánicos o alcoholes de azúcares tales como sacarosa, lactosa, lactitol, trehalosa, estaquiosa, mañosa, sorbosa, xilosa, ribosa, ribitol, mioinisitosa, mioinositol, galactosa, galactitol, glicerol, ciclitoles (por ejemplo, inositol), polietilenglicol; agentes reductores que contiene azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monotioglicerol y tiosulfato de sodio; proteínas de bajo peso molecular tales como albúmina sérica humana, albúmina sérica bovina, gelatina u otras ¡nmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; monosacáridos (por ejemplo, xilosa, mañosa, fructosa, glucosa; disacáridos (por ejemplo, lactosa, maltosa, sacarosa); trisacáridos tales como rafinosa; y polisacáridos tales como dextrina o dextrano.

Los tensioactivos no iónicos o detergentes (también conocidos como "agentes humectantes") están presentes para ayudar a solubilizar el agente terapéutico así como también para proteger a la proteína terapéutica contra la aglomeración inducida por agitación, que también permite que la formulación sea expuesta a estrés de superficie de corte sin causar desnaturalización de la proteína o anticuerpo terapéutico activo. Los tensioactivos no iónicos están presentes en un rango de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1 ,0 mg/ml, preferentemente aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.

Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 40, 60, 65, 80, etc.), poloxámeros (184, 188, etc.), polioles PLURONIC®, TRITON®, monoéteres de sorbitán polioxietileno (TWEEN®-20, TWEEN®-80, etc.), lauromacrogol 400, estearato de polioxilo 40, aceite de ricino hidrogenado polioxietileno 10, 50 y 60, monoestearato de glicerol, éster de ácido graso de sacarosa, metilcelulosa y carboximetilcelulosa. Detergentes aniónicos que se pueden usar incluyen lauril sulfato de sodio, dioctil sulfosuccinato de sodio y dioctil sulfonato de sodio. Los detergentes catiónicos incluyen cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio.

Para que las formulaciones se usen para la administración ¡n vivo, tienen que ser estériles. La formulación se puede hacer estéril por filtración a través de membranas de filtración estériles. Las composiciones terapéuticas en la presente se colocan generalmente en un contenedor que tiene una puerta de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución endovenosa o un frasco ampolla que tiene un tapón que se puede perforar por una aguja de inyección hipodérmica.

La vía de administración es de acuerdo con métodos conocidos y aceptados, tales como por un bolo simple o múltiple o una infusión durante un largo período de tiempo de una manera adecuada, por ejemplo, inyección o infusión por vía subcutánea, endovenosa, intraperitoneal, intramuscular, ¡ntraarterial, intralesional o intraarticular, administración tópica, inhalación o por medios de liberación sostenida o liberación prolongada.

La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo como sea necesario para la indicación particular que se está tratando, preferentemente aquellas actividades complementarias que no se afecten adversamente entre sí. Alternativamente, o adicionalmente, la composición puede comprender un agente citotóxico, citoquina o agente inhibidor del crecimiento. Tales moléculas están presentes adecuadamente en combinación en cantidades que son efectivas para el propósito previsto.

Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfases, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanc—partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se divulgan en Remington's Pharmaceutical Sciences 18a edición, supra.

La estabilidad de las proteínas y anticuerpos descriptos en la presente puede ser aumentada mediante el uso de "sales de metales polivalentes solubles en agua" no tóxicas. Ejemplos incluyen Ca2+, Mg2+, Zn2+, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Sn2+, Sn4+, Al2+ y Al3+. Ejemplos de aniones que pueden formar sales solubles en agua con los cationes metálicos polivalentes incluyen aquellos formados a partir de ácidos inorgánicos y/o ácidos orgánicos. Tales sales solubles en agua tienen una solubilidad en agua (a 20 °C) de por lo menos aproximadamente 20 mg/ml, alternativamente por lo menos aproximadamente 100 mg/ml, alternativamente por lo menos aproximadamente 200 mg/ml.

Los ácidos inorgánicos adecuados que se pueden usar para formar las "sales de metales polivalentes solubles en agua" incluyen los ácidos clorhídrico, acético, sulfúrico, nítrico, tiociánico y fosfórico. Los ácidos orgánicos adecuados que se pueden usar incluyen los ácidos carboxílicos alifáticos y los aromáticos. Los ácidos alifáticos comprendidos en esta definición pueden ser definidos como ácidos carboxílicos C2-9 saturados o ¡nsaturados (por ejemplo, ácidos mono-, di- y tri-carboxílicos alifáticos). Por ejemplo, los ácidos monocarboxílicos ilustrativos comprendidos en esta definición incluyen los ácidos monocarboxílicos C2-9 saturados acético, propiónico, butírico, valérico, caproico, enántico, caprílico, pelargónico y capriónico, y los ácidos monocarboxílicos C2-9 ¡nsaturados acrílico, propiólico, metacrílico, crotónico e isocrotónico. Los ácidos dicarboxílicos ilustrativos incluyen los ácidos dicarboxílicos C2-9 saturados malónico, succínico, glutárico, adípico y pimélico, mientras que los ácidos dicarboxílicos C2-9 ¡nsaturados incluyen los ácidos maleico, fumárico, citracónico y mesacónico. Los ácidos tricarboxílicos ilustrativos incluyen los ácidos tricarboxílicos C2-9 saturados tricarbalílico y 1 ,2,3-butanotricarboxílico. Adicionalmente, los ácidos carboxílicos de esta definición también pueden contener uno o dos grupos hidroxilo para formar los ácidos hidroxicarboxílicos. Los ácidos hidroxicarboxílicos ilustrativos incluyen los ácidos glicólico, láctico, glicérico, tartrónico, málico, tartárico y cítrico. Los ácidos aromáticos comprendidos en esta definición incluyen los ácidos benzoico y salicílico.

Las sales de metales polivalentes solubles en agua que se emplean comúnmente que se pueden usar para ayudar a estabilizar los polipéptidos encapsulados de esta invención incluyen, por ejemplo: (1) las sales metálicas de ácidos inorgánicos de haluros (por ejemplo, cloruro de zinc, cloruro de calcio), sulfatos, nitratos, fosfatos y tiocianatos; (2) las sales metálicas de ácidos carboxílicos alifáticos (por ejemplo, acetato de calcio, acetato de zinc, propionato de calcio, glicolato de zinc, lactato de calcio, lactato de zinc y tartrato de zinc); y (3) las sales metálicas de ácidos carboxílicos aromáticos de benzoatos (por ejemplo, benzoato de zinc) y salicilatos.

En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE se encuentra en una formulación que comprende 100 mg/mL de anticuerpo, 30 mM de histidina/clorhidrato de histidina, 140 mM de clorhidrato de arginina, 0,04% (p/v) de polisorbato 20, pH 5,5.

E. Métodos de tratamiento Se proveen en la presente métodos para el tratamiento o la prevención de un trastornos mediado por IgE que comprende la administración a un paciente humano de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE (tal como una IgE humana). En algunas formas de realización, se le ha diagnosticado al paciente humano el trastorno medicado con la IgE o se encuentra en riesgo de desarrollar el trastorno medicado con la IgE.

Se proveen en la presente métodos para reducir la IgE total sérica y/o la IgE específica del alérgeno con relación a la línea de base en un humano que comprende administrar a un paciente humano una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE (tal como una IgE humana). La IgE total sérica se refiere a una cantidad total de IgE presente en una muestra se suero. La IgE total sérica incluye todas las IgEs específicas de alérgenos e incluye IgE libre o no unida, así como también IgE que está complejizada con una parte asociada de unión (por ejemplo, anticuerpo anti-lgE, células B que llevan IgE).

Se proveen en la presente métodos para la prevención o reducción de un aumento inducido por un alérgeno de la IgE sérica total y/o la IgE específica del alérgeno que comprende administrar a un paciente humano una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE (tal como una IgE humana). En algunas formas de realización, la prevención o reducción del aumento inducido por el alérgeno se mide comparando el aumento inducido por el alérgeno después del tratamiento con el anticuerpo con el aumento inducido por el alérgeno antes del tratamiento con el anticuerpo. En algunas formas de realización, la prevención o reducción del aumento inducido por el alérgeno se mide comparando el aumento inducido por el alérgeno después del tratamiento con el anticuerpo con el aumento inducido por el alérgeno en otro paciente o el aumento promedio en pacientes humanos sin el tratamiento con el anticuerpo. En algunas formas de realización se evita la producción de nueva IgE.

Se proveen en la presente métodos para evitar la producción de nueva IgE que comprenden la administración a un paciente humano de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE (tal como una IgE humana).

En algunas formas de realización de los métodos descriptos en la presente, un intervalo entre administraciones del anticuerpo es de aproximadamente un mes o mayor. En algunas formas de realización, el intervalo entre administraciones es de aproximadamente dos meses, aproximadamente tres meses, aproximadamente cuatro meses, aproximadamente cinco meses, aproximadamente seis meses o mayor. Como se usa en la presente, un intervalo entre administraciones se refiere al período de tiempo entre una administración del anticuerpo y la siguiente administración del anticuerpo. Como se usa en la presente, un intervalo de aproximadamente un mes incluye cuatro semanas. Por consiguiente, en algunas formas de realización, el intervalo entre administraciones es de aproximadamente cuatro semanas, aproximadamente ocho semanas, aproximadamente doce semanas, aproximadamente dieciséis semanas, aproximadamente veinte semanas, aproximadamente veinticuatro semanas, o mayor. En algunas formas de realización, el tratamiento incluye múltiples administraciones del anticuerpo, en donde el intervalo entre administraciones puede variar. Por ejemplo, el intervalo entre la primera administración y la segunda administración es de aproximadamente un mes, y los intervalos entre las administraciones subsiguientes son de aproximadamente tres meses. En algunas formas de realización, el intervalo entre la primera administración y la segunda administración es de aproximadamente un mes, el intervalo entre la segunda administración y la tercera administración es de aproximadamente dos meses, y los intervalos entre las administraciones subsiguientes son de aproximadamente tres meses.

En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE descripto en la presente es administrado a una dosis plana. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE descripto en la presente es administrado a un paciente humano a una dosificación de aproximadamente 150 a aproximadamente 450 mg por dosis. En algunas formas de realización, el anticuerpo anti-lgE es administrado a un paciente humano a una dosificación de aproximadamente cualquiera de 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg, y 450 mg por dosis. Se puede usar cualquiera de las frecuencias de dosificación descriptas más arriba.

En algunas formas de realización, la administración del anticuerpo al paciente humano reduce la IgE total sérica y/o la IgE específica de un alérgeno en el paciente humano. En algunas formas de realización, la IgE total sérica es reducida por lo menos aproximadamente 20% con respecto a la línea de base. En algunas formas de realización, la IgE total sérica es reducida por lo menos aproximadamente 25% con respecto a la línea de base. En algunas formas de realización, la reducción de la IgE total sérica es mantenida por lo menos durante un mes, por lo menos dos meses, por lo menos tres meses, por lo menos cuatro meses, por lo menos cinco meses, por lo menos seis meses, o más después de la última administración del anticuerpo. En algunas formas de realización, la IgE específica del alérgeno es reducida con respecto a la línea de base. En algunas formas de realización, la administración del anticuerpo al paciente humano evita o reduce un aumento inducido por un alérgeno de la IgE total sérica y/o de la IgE específica de un alérgeno. En algunas formas de realización, la prevención o reducción del aumento inducido por un alérgeno de la IgE total sérica y/o de la IgE especifica de un alérgeno es mantenido durante por lo menos un mes, por lo menos dos meses, por lo menos tres meses, por lo menos cuatro meses, por lo menos cinco meses, por lo menos seis meses o más después de la última administración del anticuerpo. Los métodos conocidos en el arte y descriptos en la presente pueden ser usados para medir los niveles de la IgE total sérica y de la IgE específica de un alérgeno.

En algunas formas de realización, la administración del anticuerpo tiene por lo menos uno de los siguientes efectos: 1) reduce la tasa de exacerbación por= 50% en comparación con el placebo, y por lo menos uno de los siguientes: mejora el FEV1 por= 5%, reduce la frecuencia o la severidad de los síntomas en comparación con el placebo dentro de 12 semanas de la primera dosis y después de 36 semanas de la dosificación activa, y aumenta las semanas bien controladas en comparación con el placebo durante 24 a 36 semanas de dosificación activa; 2) reduce la tasa de exacerbación por > 50% en comparación con el placebo, mejora el FEV1 por < 5%, ninguna reducción en la frecuencia o la severidad de los síntomas en comparación con el placebo dentro de las 12 semanas de la primera dosis y después de 36 semanas de dosificación activa, y sin cambios en las semanas bien controladas en comparación con el placebo durante las 24 a 36 semanas de dosificación activa; 3) reduce la tasa de exacerbación por 40-49% en comparación con el placebo, mejora el FEV1 por < 5%, y por lo menos uno de los siguientes: reduce la frecuencia o la severidad de los síntomas en comparación con el placebo dentro de las 12 semanas de la primera dosis y después de 36 semanas de la dosificación activa y aumenta las semanas bien controladas en comparación con el placebo durante 24 a 36 semanas de dosificación activa; 4) reduce la tasa de exacerbación por 40-49% en comparación con el placebo, y por lo menos uno de los siguientes: mejora el FEV1 por > 5%, reduce la frecuencia o la severidad de los síntomas en comparación con el placebo dentro de las 12 semanas de la primera dosis y después de 36 semanas de dosificación activa, y aumenta las semanas bien controladas en comparación con el placebo durante 24 -36 semanas de dosificación activa; y 5) reduce la tasa de exacerbación por <40% en comparación con el placebo, y por lo menos dos de los siguientes: mejora el FEV1 por > 5%, reduce la frecuencia o severidad de los síntomas en comparación con el placebo dentro de las 12 semanas de la primera dosis y después de 36 semanas de dosificación activa, y aumenta las semanas bien controladas en comparación con el placebo durante 24 -36 semanas de dosificación activa.

Como se usa en la presente, un nivel de línea de base (tal como un nivel de línea de base para la IgE total sérica y la IgE específica de un alérgeno) en un ser humano se refiere al nivel antes de una administración de un anticuerpo anti-lgE descripto en la presente al ser humano.

Para la prevención o el tratamiento de la enfermedad, la dosificación apropiada de un agente activo, dependerá del tipo de enfermedad a ser tratada, como se definió más arriba, la severidad y el curso de la enfermedad, si el agente es administrado con propósitos preventivos o terapéuticos, la terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al agente, y la discreción del médico que realiza el tratamiento. El agente es administrado adecuadamente al paciente de una sola vez o durante una serie de tratamientos.

Un método de tratamiento preferido es el tratamiento de los trastornos mediados por IgE. Los trastornos mediados por IgE incluyen los trastornos atópicos, que están caracterizados por una tendencia heredada a responder ¡nmunológicamente a muchos antígenos comunes inhalados e ingeridos que existen naturalmente y la producción continua de anticuerpos a IgE. Los trastornos atópicos específicos incluyen asma alérgica, rinitis alérgica, dermatitis atópica y gastroenteropatía alérgica. Los pacientes atópicos frecuentemente tienen múltiples alergias, lo que significa que tienen anticuerpos a IgE con respecto a, y síntomas de, muchos alérgenos ambientales, incluyendo polen, hongos (por ejemplo, mohos), desechos animales y de insectos y a algunos alimentos.

Sin embargo, los trastornos asociados con elevados niveles de IgE no están limitados a aquellos con un etiología heredada (atópica). Otros trastornos asociados con elevados niveles de IgE, que parecen ser mediados por IgE y se pueden tratar con las formulaciones de la presente invención incluyen hipersensibilidad (por ejemplo, hipersensibilidad anafiláctica), eczema, urticaria, aspergilosis broncopulmonar alérgica, enfermedades parasitarias, síndrome hiper-IgE, ataxia-telangiectasia, síndrome de Wiskott-Aldrich, alinfoplasia típica, mieloma IgE y reacción de injerto versus huésped.

La rinitis alérgica, también conocida como rinoconjuntivitis alérgica o fiebre de heno, es la manifestación más común de una reacción atópica a alérgenos inhalados, cuya severidad y duración frecuentemente es correlativa con la intensidad y duración de la exposición al alérgeno. Es una enfermedad crónica, que puede aparecer primero a cualquier edad, pero su aparición es usualmente durante la infancia o la adolescencia. Un ataque típico consiste en una rinorrea acuosa profusa, estornudos paroxísticos, obstrucción nasal y picazón de la nariz y el paladar. El drenaje de mucus posnasal también provoca dolor de garganta, carraspera y tos. También puede haber síntomas de blefaroconjuntivitis alérgica, con picazón intensa de las conjuntivas y párpados, enrojecimiento, lagrimeo y fotofobia. Los ataques severos son acompañados frecuentemente por molestias sistémicas, debilidad, fatiga y algunas veces, dolor muscular después de períodos intensos de estornudos.

El asma, también conocido como enfermedad de las vías aéreas obstructiva reversible, está caracterizada por la hiperrespuesta del tronco traqueobronquial a los irritantes respiratorios y sustancias químicas broncoconstrictoras, produciendo ataques de estornudos, disnea, opresión en el pecho y tos que revierten espontáneamente o con tratamiento. Es una enfermedad crónica que involucra todas las vías aéreas, pero varía en severidad desde episodios transitorios leves ocasionales a obstrucción bronquial crónica, severa, de riesgo vital. El asma y la atopia pueden coexistir, pero sólo alrededor de la mitad de los asmáticos también son atópicos, y un porcentaje aún menor de los pacientes atópicos también tiene asma. Sin embargo, la atopia y el asma no son completamente independientes por cuanto el asma ocurre más frecuentemente entre los individuos atópicos que entre los no atópicos, especialmente durante la niñez. El asma se ha dividido además históricamente en dos subgrupos, el asma extrínseca y el asma intrínseca.

El asma extrínseca, también conocida como asma alérgica, atópica o inmunológica, describe los pacientes que generalmente desarrollan asma muy temprano en la vida, usualmente durante la infancia o la niñez. Otras manifestaciones de atopia, incluyendo eczema o rinitis alérgica frecuentemente coexisten. Los ataques asmáticos pueden ocurrir durante estaciones en las que aparece el polen, en presencia de animales, o ante la exposición a polvo doméstico, almohadas de plumas u otros alérgenos. Los tests en la piel muestran reacciones positivas de pápulas y reacción eritematosa a los alérgenos causantes. Es interesante destacar que las concentraciones de IgE total sérica son frecuentemente elevadas, pero algunas veces son normales.

El asma intrínseca, también conocida como asma no alérgica o idiopática, ocurre primero típicamente durante la vida adulta, después de una infección respiratoria aparente. Los síntomas incluyen obstrucción bronquial crónica o recurrente no relacionada con las estaciones de polen o la exposición a otros alérgenos. Los tests en la piel son negativos a los alérgenos atópicos usuales, la concentración sérica de IgE es normal. Los síntomas adicionales incluyen sangre en el esputo y eosinofilia. Otros esquemas para clasificar el asma en subgrupos, como sensible a la aspirina, inducida por ejercicios, infecciosa y psicológica definen simplemente factores externos que la activan que afectan a algunos pacientes más que a otros.

Finalmente, es importante destacar que si bien algunas clasificaciones han asociado históricamente sólo el asma alérgica con la dependencia de IgE, hay ahora importantes datos estadísticamente significativos que muestran una correlación entre IgE y asma (tanto alérgica como no alérgica). Capítulo 27, "The Atopic Diseases", A.l. Terrin Medical Inmunology, 9a Ed., Simón y Schuster, Stites et al, Ed. (1997). Como resultado, el término "trastornos mediados por IgE", para los propósitos de esta solicitud de patente, incluyen tanto el asma alérgica como el asma no alérgica.

Los signos físicos de un ataque de asma incluyen taquipnea, estornudos audibles y el uso de los músculos accesorios de respiración. El pulso rápido y la presión sanguínea elevada también están típicamente presentes, así como los niveles elevados de eosinófilos en la sangre periférica y las secreciones nasales. Las funciones pulmonares muestran una disminución de los caudales y un volumen espiratorio forzado de 1 segundo (FEVi). La capacidad pulmonar total y la capacidad residual funcional son típicamente normales o están levemente aumentadas, pero pueden estar disminuidas con broncospasmo extremo.

La patología del asma puede distinguirse por las reacciones de fase temprana y de fase tardía. La fase temprana está caracterizada por la contracción de los músculos lisos, edema e hipersecrecion, mientras que las reacciones de fase tardía están caracterizadas por inflamación celular. El asma puede ser inducida por varios disparadores no específicos incluyendo infecciones (por ejemplo, infecciones respiratorias virales), factores fisiológicos (por ejemplo, ejercicio, hiperventilación, respiración profunda, factores psicológicos), factores atmosféricos (por ejemplo, dióxido de azufre, amoníaco, aire frío, ozono, vapor de agua destilada), ingestión de sustancias (por ejemplo, propranolol, aspirina, fármacos antiinflamatorios no esferoides), inhalantes experimentales (por ejemplo, soluciones hipertónicas, ácido cítrico, histamina, metacolina, prostaglandina F2Q) e inhalantes ocupacionales (por ejemplo, isocianatos). Varios alérgenos ocupacionales o ambientales adicionales que causan el asma alérgica pueden incluir productos animales, polvos de insectos, criaturas marinas, productos de plantas, frutas, semillas, hojas y polen, tinturas orgánicas y tintas, agentes microbianos, enzimas, agentes terapéuticos, agentes esterilizantes y sustancias químicas inorgánicas y orgánicas.

La dermatitis atópica, también conocida como eczema, neurodermatitis, eczema atópico o prurigo de Besnier, es un trastornos de la piel crónico común específico de un subconjunto de pacientes con las características familiares e inmunológicas de la atopia. La característica esencial es una respuesta inflamatoria dérmica con prurito, que induce una erupción de la piel distribuida simétricamente característica con predilección por algunos sitios. Hay también una frecuente sobreproducción de IgE por las células plasmáticas. Si bien la dermatitis atópica es clasificada como una forma de atopia cutánea porque está asociada con rinitis alérgica y asma y altos niveles de IgE, la severidad de la dermatitis, sin embargo, no siempre está correlacionada con la exposición a alérgenos en los tests de la piel, y la desensibilización (a diferencia de otras enfermedades alérgicas) no es un tratamiento efectivo. Si bien el alto nivel sérico de IgE confirma un diagnóstico de asma alérgica, los niveles normales no lo eliminan. La aparición de la enfermedad puede ocurrir a cualquier edad y las lesiones comienzan en forma aguda con pápulas edematosas eritematosas o placas con escamas. La picazón lleva a exudación y formación de costras, luego a liquenificación crónica. A nivel celular, la lesión aguda es edematosa y la dermis está infiltrada con células mononucleares, linfocitos CD4. Los neutrófilos, eosinófilos, células plasmáticas y basófilos son raros, pero mastocitos desgranulados están presentes. Las lesiones crónicas presentan hiperplasia epidérmica, hiperqueratosis y paraqueratosis, y la dermis está infiltrada con células mononucleares, células de Langerhans y mastocitos. Puede haber también áreas focales de fibrosis, incluyendo el compromiso del perineurio de nervios pequeños.

La gastroenteropatía alérgica, también conocida como gastroenteropatía eosinofílica, es una manifestación atópica inusual en la cual múltiples sensibilidades a alimentos por IgE están asociadas con una reacción de la mucosa del tracto gastrointestinal local. Es rara en los adultos, pero más común, pero transitoria, en los infantes. La condición se produce cuando los alérgenos de alimentos ingeridos reaccionan con los anticuerpos a IgE locales en la mucosa del yeyuno que liberan mediadores de mastocitos, dando por resultado síntomas gastrointestinales poco después de la comida. La exposición continua produce inflamación crónica, dando por resultado la pérdida de proteínas gastrointestinales y edema hipoproteinémico. La pérdida de sangre a través de la mucosa intestinal inflamada puede ser suficientemente significativa como para causar anemia por deficiencia de hierro. La reacción alérgica ocurre localmente en la mucosa gastrointestinal superior después de la exposición al alérgeno, pero se resuelve con evitar el alérgeno.

La anafilaxis y la urticaria son claramente mediadas por IgE, pero no tienen determinantes genéticos, y no tienen predilección por individuos atópicos. La anafilaxis es una reacción alérgica aguda, generalizada, con compromiso simultáneo de varios sistemas de órganos, usualmente cardiovascular, respiratorio, cutáneo y gastrointestinal. La reacción es mediada inmunológicamente, y ocurre por la exposición a un alérgeno al cual el sujeto fue sensibilizado previamente. La urticaria y el angioedema se refieren a la hinchazón física, eritema y picazón resultantes de un receptor de histamina estimulado en los vasos sanguíneos cutáneos superficiales, y es la marca distintiva de la característica cutánea de la anafilaxis sistémica. La anafilaxis sistémica es la aparición de una reacción mediada por IgE simultáneamente en múltiples órganos resultante de un fármaco, veneno de insectos o alimentos. Es causada repentinamente por IgE cargada en mastocitos, inducida por el alérgeno, dando por resultado una alteración profunda y de riesgo vital en el funcionamiento de varios órganos vitales. El colapso vascular, la obstrucción aguda de las vías aéreas, la vasodilatador! cutánea y el edema, y espasmos musculares gastrointestinales y genitourinarios ocurren casi simultáneamente, aunque no siempre en el mismo grado.

La patología de la anafilaxis incluye angioedema y pulmones hiperinflados, con taponamiento mucoso de las vías aéreas y atelectasis focal. A nivel celular, los pulmones aparecen de forma similar como durante un ataque de asma agudo, con hipersecreción de glándulas submucosas bronquiales, edema mucoso y submucoso, congestión vascular peribronquial y eosinofilia en las paredes bronquiales. Pueden estar presentes edema pulmonar y hemorragia. El espasmo muscular bronquial, hiperinflación y aún ruptura de los alvéolos también pueden estar presentes. Importantes características de la anafilaxis humana incluyen edema, congestión vascular y eosinofilia en la lamina propia de la laringe, la tráquea, la epiglotis y la hipofaringe.

La exposición al alérgeno puede ser por ingestión, inyección, inhalación o contacto con la piel o la membrana mucosa. La reacción comienza dentro de segundos o minutos después de la exposición al alérgeno. Puede haber una sensación inicial de miedo o de inminente fatalidad, seguida rápidamente por síntomas en uno o más sistemas de órganos objetivo: cardiovascular, respiratorio, cutáneo o gastrointestinal.

Los alérgenos responsables de anafilaxis difieren de aquellos asociados comúnmente con atopia. Alimentos, fármacos, venenos de insectos o látex son las fuentes comunes. Los alérgenos de alimentos incluyen aquellos hallados en crustáceos, moluscos (por ejemplo, langosta, langostino, camarón), pescados, legumbres (por ejemplo, maní, arvejas, porotos, regaliz), semillas (por ejemplo sésamo, semilla de algodón, comino, mostaza, semilla de lino, girasol), nueces, bayas, albúminas, alforfón y leche. Los alérgenos de fármacos incluyen aquellos hallados en proteínas y polipéptidos heterólogos, polisacáridos y fármacos hapténicos. Los alérgenos de insectos incluyen insectos himenópteros, incluyendo la abeja, la avispa amarilla, el avispón, la avispa común y la hormiga roja.

Si bien la epinefrina es el tratamiento típico para la anafilaxis, también se prescriben antihistamínicos u otros bloqueadores de histamina para urticaria o reacción angioedémica menos severa.

F. Terapias combinadas El método de la invención puede combinarse con métodos de tratamiento conocidos para el trastorno mediado por IgE, ya sea como pasos de tratamiento combinados o adicionales o como componentes adicionales de una formulación terapéutica.

Por ejemplo, los antihistamínicos, especialmente los antihistamínicos no sedantes pueden ser administrados antes, previo a, o junto con los anticuerpos anti-lgE de la invención. Los antihistamínicos adecuados incluyen aquellos de la alquilamina (por ejemplo, clorfeniramina), etanolamina (por ejemplo, difenhidramina) y fenotiazina (por ejemplo, prometazina). Si bien muchos antihistamínicos antagonizan los efectos farmacológicos de la histamina bloqueando sus sitios receptores en las células efectoras, otros fármacos antihistamínicos comunes operan bloqueando la liberación de histamina de los mastocitos que han sido sensibilizados y armados con IgE específica de un alérgeno (por ejemplo, cromolín sódico). Ejemplo de antihistamínicos incluyen astemizol, maleato de azatadina, maleato de brofeniramina, maleato de carbinoxamina, clorhidrato de cetirizina, fumarato de clemastina, clorhidrato de ciproheptadina, maleato de dexbromfeniramina, maleato de dexclorfeniramina, dimenhidrinato, clorhidrato de difenhidramina, succinato de doxilamina, clorhidrato de fexofendadina, clorhidrato de terfenadina, clorhidrato de hidroxizina, loratidina, clorhidrato de meclizina, citrato de tripelannamina, clorhidrato de tripelennamina, clorhidrato de triprolidina.

Los síntomas particulares de los trastornos mediados por IgE (por ejemplo, las reacciones de la fase temprana) pueden ser mejorados con simpaticomiméticos o fármacos que tienen un efecto broncodilatador. La epinefrina es un alfa y beta-adrenérgico de amplia acción administrado frecuentemente en forma subcutánea en una dosis de 0,2 - 0,5 mL de 1:100 de solución acuosa. Una forma de epinefrina de acción prolongada (es decir, terbutalina) en una suspensión 1:200 también se usa cuando se desea un efecto de duración prolongada. Los beta-adrenérgicos adicionales adecuados incluyen albuterol, pirbuterol, metaproterenol, salmeterol, isoetarina y formeterol para administración nasal (por ejemplo, nebulizador manual, dispositivo respirador de presión positiva intermitente o inhaladores presurizados de dosis dosificada) u oral.

La broncodilatación también se puede lograr por medio de la administración de xantinas, especialmente cuando son administradas en combinación con los fármacos simpaticomiméticos arriba mencionados. Ejemplos de xantinas incluyen aminofilina (iv. 250-500 mg) y teofilina (oral, 10-20 pg/ml de concentración sérica).

Otros síntomas de varios trastornos mediados por IgE (por ejemplo, reacciones de fase tardía) pueden ser atenuados por el tratamiento con glucocorticoides u otros fármacos que tienen efectos antiinflamatorios. La prednisona (30-60 mg por día) se administra sistémicamente para ataques severos, mientras que el dipropionato de beclometasona, el acetónido de triamcinolona y el la flunisolida son administrados en forma de aerosol como terapia de mantenimiento de largo plazo. Los corticosteroides adicionales que tienen efectos antiinflamatorios incluyen: betametasona, budesónido, dexametasona, acetato de fludrocortisona, flunisolida, propionato de fluticasona, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona.

Los fármacos antiinflamatorios no esteroides que también se pueden usar en combinación con los métodos terapéuticos de la invención incluyen, acetaminofeno, aspirina, bromfenac sódico, diclofenac sódico, diflunisal, etodolac, fenoprofeno cálcico, flurbiprofeno, ibuprofeno, indometacina, ketoprofeno, meclofenamato sódico, ácido mefenámico, nabumetona, naproxeno, naproxeno sódico, oxifenbutazona, fenilbutazona, piroxicam, sulindac, tolmetin sódico.

Adicionalmente, el máximo beneficio terapéutico también se puede obtener con la administración de descongestivos (por ejemplo, fenilefrina, fenilpropanolamina, pseudoefedrina), supresores de la tos (por ejemplo, dextrometorfán, codeína o hidrocodona) o analgésicos (por ejemplo, acetaminofeno, aspirina).

La desensibilización al alérgeno es una forma de tratamiento en la cual se inyectan alérgenos al paciente con el propósito de reducir o eliminar la respuesta alérgica. También se conoce como inmunoterapia a alérgenos, hiposensibilización o terapia inyectable para alergias. Se usa frecuentemente en combinación con otros tratamientos para la alergia, pero no frecuentemente como tratamiento primario. Se ha empleado exitosamente cuando es imposible evitar el alérgeno. Un tratamiento de desensibilización a alérgenos típico incorpora una inyección subcutánea de alérgeno estéril en dosis crecientes una o dos veces por semana hasta que se alcanza una dosis que produce un área local pequeña transitoria de inflamación en el sitio de la inyección. La dosis se administra entonces con un esquema de mantenimiento de una vez cada 2-4 semanas. La desensibilización alérgica es usada más frecuentemente en el tratamiento del asma alérgica y de la rinitis alérgica, aunque ha tenido éxito en el tratamiento de anafilaxis. La desensibilización también se ha usado efectivamente mediante el uso de adyuvantes, tales como el adyuvante incompleto de Freund, que es una emulsión de un antígeno acuoso en aceite mineral oil. El efecto fisiológico crea un depósito líquido insoluble del cual se liberan gradualmente gotas de alérgeno. Otra forma de de desensibilización a alérgenos es polimerizar alérgenos monoméricos con glutaraldehído para crear una molécula con alergenicidad relativamente baja (es decir, causa respuesta alérgica), mientras retiene un grado efectivo de inmunogenicidad.

G. Dosificaciones farmacéuticas y administración Las dosificaciones y concentraciones de fármacos deseadas de las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar dependiendo del uso particular previsto. En algunas formas de realización, la dosificación para el anticuerpo anti-lgE es de aproximadamente 150 mg a aproximadamente 450 mg por dosis para un paciente humano. En algunas formas de realización, la dosificación es de aproximadamente cualquiera de 150 mg, 200 mg, 250 mg, 300 mg, 350 mg, 400 mg o 450 mg por dosis para un paciente humano. En algunas formas de realización, el anticuerpo es administrado en forma subcutánea o intravenosa. En algunas formas de realización, el anticuerpo es administrado a intervalos mensuales o intervalos mayores que los mensuales. En algunas formas de realización, el anticuerpo es administrado a intervalos trimestrales. El avance de la terapia puede ser monitoreado durante el tratamiento por técnicas y ensayos convencionales, tales como la medición de los niveles de IgE total sérica, los niveles de la IgE específica de un alérgeno, el aumento inducido por alérgeno de la IgE total sérica y la IgE específica de un alérgeno, etc.

En algunas formas de realización, los anticuerpos anti-lgE descriptos en la presente son administrados al mamífero por administración subcutánea (es decir, debajo de la piel). Para tales propósitos, la formulación puede ser inyectada usando una jeringa. Sin embargo, otros dispositivos para la administración de la formulación se encuentran disponibles, tales como dispositivos para inyección (por ejemplo los dispositivos INJECT-EASE™ y GENJECT™); lapiceras inyectoras (tales como la GENPEN™); dispositivos auto-inyectores, dispositivos sin aguja (por ejemplo MEDIJECTOR y BIOJECTORIM); y sistemas de suministro por parche subcutáneo.

H. Artículos manufacturados y kits En otro aspecto, se provee un artículo manufacturado o kit que comprende un anticuerpo anti-lgE descripto en la presente. El artículo manufacturado o kit puede comprender además instrucciones para el uso del anticuerpo en los métodos de la invención. Así, en algunas formas de realización, el artículo manufacturado o kit comprende instrucciones para el uso de un anticuerpo anti-IgE en métodos para el tratamiento o la prevención de un trastorno mediado por IgE en un individuo que comprende la administración al individuo de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-lgE. En algunas formas de realización, el individuo es un ser humano. En algunas formas de realización, el individuo tiene asma severa, moderada o leve.

El artículo manufacturado o kit puede comprender además un recipiente.

Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, frascos-ampolla (por ejemplo, frascos-ampolla de cámara doble), jeringas (tales como jeringas de cámara simple o doble) y tubos de ensayo. El recipiente puede estar formado por una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene la formulación. El artículo manufacturado o kit puede comprender además una etiqueta o un inserto del envase, que está sobre o asociado con el recipiente, puede indicar instrucciones para la reconstitución y/o el uso de la formulación. La etiqueta o el inserto del envase puede indicar demás que la formulación es útil o está prevista para la administración subcutánea, intravenosa, u otros modos de administración para el tratamiento o la prevención de un trastorno mediado por IgE en un individuo. El recipiente que contiene la formulación puede ser un frasco-ampolla de un sólo uso o un frasco- ampolla de múltiples usos, que permite las administraciones repetidas (por ejemplo, de 2 a 6 administraciones) de la formulación reconstituida. El artículo manufacturado o kit puede comprender además un segundo recipiente que comprende un diluyente adecuado (por ejemplo, BWFI). Después de mezclar el diluyente y la formulación liofilizada, la concentración final de la proteína, el polipéptido, o la molécula pequeña en la formulación reconstituida será en general de por lo menos 50 mg/ml. El artículo manufacturado o kit puede incluir además otros materiales convenientes desde un punto de vista comercial, terapéutico y del usuario, incluyendo otros buffers, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e insertos del envase con instrucciones para el uso.

En una forma de realización específica, la presente invención provee kits para una unidad de administración de una sola dosis. Tales kits comprenden un recipiente de una formulación acuosa de la proteína o el anticuerpo terapéutico, incluyendo tanto jeringas prellenadas de una sola cámara o de múltiples cámaras. Jeringas prellenadas ilustrativas se encuentran disponibles de Vetter GmbH, Ravensburg, Alemania.

El artículo manufacturado o kit en la presente comprende además opcionalmente un recipiente que comprende un segundo medicamento, en donde el anticuerpo anti-lgE es un primer medicamento, y en donde el artículo o kit comprende además instrucciones en la etiqueta o el inserto del envase para el tratamiento del sujeto con el segundo medicamento, en una cantidad efectiva. El segundo medicamento puede ser cualquiera de aquellos mencionados más arriba, siendo un segundo medicamento ilustrativo un anticuerpo anti-lgE, un antihistamínico, un broncodilatador, un glucocorticoide, un NSAID, un descongestivo, un supresor de la tos, un analgésico, un antagonista de TNF, un antagonista de integrina, un agente inmunosupresor, un antagonista de IL-4, un antagonista de IL— 3, un antagonista dual de IL-4/IL-13, un DMARD, un anticuerpo que se une a un marcador de superficie de las células B y un antagonista de BAFF.

En otra forma de realización, se provee en la presente un artículo manufacturado o kit que comprende las formulaciones descriptas en la presente para la administración en un dispositivo autoinyector. Un autoinyector puede describirse como un dispositivo de inyección que después de la activación suministrará su contenido sin la acción necesaria adicional del paciente o el administrador. Son particularmente adecuados para la automedicación de formulaciones terapéuticas cuando la tasa de suministro tiene que ser constante y el tiempo de suministro es mayor que algunos momentos.

La invención se comprenderá mejor por referencia a los siguientes ejemplos. No deberían interpretarse, sin embargo, como limitativos del alcance de la invención. Todas las citas en la divulgación se incorporan de este modo expresamente por referencia.

EJEMPLOS Ejemplo 1 : El tratamiento con el anticuerpo monoclonal anti-M1 prime, MEMP1972A, redujo la IgE sérica en voluntarios sanos y en sujetos con rinitis alérgica en un estudio de fase 1a/b.

Los niveles elevados de IgE están asociados con enfermedades alérgicas incluyendo el asma alérgica. La IgE de la membrana incluyen una secuencia denominada 'M1 prime', que está presente en las células B alteradas con IgE humanas, las céluls B de memoria de IgE y los plasmablastos de IgE. El MEMP1972A es un anticuerpo monoclonal humanizado que tiene como objetivo M1 prime, que agota las células que expresan M1-prime a través de apoptosis y/o mecanismos de citotoxicidad mediada por céluls dependiente del anticuerpo in vitro, reduciendo de este modo los niveles de IgE sin afectar otros isotipos de inmunoglobulina. El desarrollo de MEMP1972A para el tratamiento del asma alérgica se inició con ensayos de fase 1 para testear la seguridad en voluntarios sanos y sujetos alérgicos.

Métodos Dos estudios de fase 1 , aleatorizados, a ciegas, controlados con placebo investigaron la seguridad, tolerabilidad, farmacocinética y farmacodinámica de MEMP1972A en (1) voluntarios adultos sanos (n=31 MEMP1972A, n=14 placebo) y (2) sujetos adultos con rinitis alérgica (n=24 MEMP1972A, n=12 placebo [NCT01160861]).

Estudio de fase 1A. Un total de 45 voluntarios sanos fueron enrolados en siete cohortes predefinidas de una sola dosis creciente de 7 sujetos cada una (Cohortes A-G) (Tabla 1). Los sujetos fueron examinados para evaluar si podían ser elegidos para ingresar en el estudio dentro de los 35 días antes del Día 1 de tratamiento y se requirió que los sujetos elegibles ingresaran en la clínica el día antes del tratamiento (Día -1). Cada sujeto elegible fue asignado al azar para recibir una sola dosis intravenosa (IV) o subcutánea (SC) de MEMP1972A o del placebo correspondiente de acuerdo con un esquema de aumento de una sola dosis creciente (Fig. 1).

Tabla 1. Cohortes del estudio para el estudio de fase 1A MEMP1972A fue producido usando células de ovario de hámster chino (CHO), purificadas y formuladas como 100 mg/mL de MEMP1972A en 30 mM histidina/clorhidrato de histidina, 140 mM de clorhidrato de arginina y 0,04% (p/v) de polisorbato 20 a pH 5,5 con agua para inyección. El producto del fármaco MEMP1972A fue suministrado como una solución líquida libre de conservantes estéril para la administración IV y SC, un frasco-ampolla de 2 mL de vidrio transparente, de un solo uso, que fue tapado con un tapón laminado de fluoro-resina de 13 mm y cubierto con una cubierta de aluminio con un sello de plástico "flip-off. Cada frasco-ampolla contenía 150 mg de ingrediente farmacéutico activo (API). El diluyente y el placebo correspondiente para MEMP1972A contenían los mismos excipientes que el producto del fármaco, sin el API. El placebo fue suministrado en una configuración de frasco-ampolla idéntica a la del producto del fármaco. El diluyente fue suministrado en un frasco-ampolla de vidrio transparente de 50 mL tapado con un tapón laminado de fluoro-resina de 20 mm y cubierto con una cubierta de aluminio con un sello "flip-off' que contenía 25 mL de diluyente. El MEMP1972A fue administrado como una sola dosis que oscilaba entre 0,003 y 5 mg/kg IV o 3 mg/kg SC el Día 1. Los frascos-ampolla del MEMP1972A, del placebo y del diluyente fueron refrigerados a 2 °C-8 °C hasta el uso. Las preparaciones de las dosis para las infusiones IV de las Cohortes A-D se realizaron diluyendo el MEMP1972A o el placebo con diluyente en un frasco-ampolla estéril vacío. Una vez diluidos usando el diluyente, las soluciones de MEMP1972A o de placebo fueron almacenadas a temperaturas refrigeradas o ambiente de 2 °C-25 °C durante hasta 8 horas antes del uso. No se requirió dilución para las Cohortes E, F, IV y la Cohorte G SC. Para los sujetos que recibían las dosis IV, el MEMP1972A o el placebo fueron suministrados usando una bomba de jeringa con una extensión de microperforación fijada para una duración de 1 hora. Para los sujetos que recibían las dosis SC, el MEMP1972A o el placebo fueron administrados por inyección SC, usando jeringas (jeringa de insulina BD). Para la administración de la dosis de 3 mg/kg (Cohorte G), se suministraron hasta 1 ,0 ml_ en forma SC en el sitio de inyección usando una jeringa de 1 ,0 ce con una aguja de calibre 25 ó 27 que tiene 5/8 de pulgada de longitud. Las inyecciones SC fueron administradas en el abdomen.

Después del inicio del estudio el Día 1 , se requirió a los sujetos que volvieran a la clínica el Día 5 para la primera evaluación de seguimiento. Para las siete cohortes (A-G), se obtuvieron evaluaciones físicas y muestras farmacocinéticas (PK) el Día 1 , 30 minutos predosis, 0-60 minutos postadministración del fármaco en estudio y 24 horas post-administración del fármaco en estudio. Se realizaron evaluaciones adicionales y se obtuvieron muestras PK los Días 5, 14, 29, 85, y 168. Las muestras de suero sanguíneo fueron evaluadas con respecto a los niveles de suero totales de MEMP1972A por inmunoensayos cuantitativos, con respecto a la presencia de anti-anticuerpos terapéuticos (ATA) usando un ELISA de puente, y la medición de la IgE total y la IgE específica de un alérgeno usando un ensayo clínico estándar, Immulite 2000 (Siemens Medical Solutions Diagnostics, Los Angeles CA). Ver Li, er a/., Ann Clin Lab Sci., 34(1 ):67-74 (2004).

Se pueden usar métodos conocidos en el arte para detectar la presencia de anticuerpos anti-terapéuticos en una muestra de suero. Por ejemplo, para la detección de anticuerpos a MEMP1972A en el suero humano, se diluyeron muestras de suero 1/50 y se sometieron a ELISA de puente. Una muestra de 70 µ?_ del suero diluido fue cargada por cavidad en una microplaca de polipropileno de 96 cavidades (Corning Inc., Lowell, MA) junto con 70 µ1_ de Master Mix que contenía 2,0 pg/mL de MEMP1972A biotinilado y 2,0 pg/mL de MEMP1972A conjugado con digoxigenina para capturar los anticuerpos dirigidos contra el MEMP1972A. La microplaca fue incubada durante la noche duran 16 a 24 horas a temperatura ambiente con agitación. Las muestras de la microplaca de polipropileno fueron transferidas luego a una microplaca de 96 cavidades recubierta con estreptavidina Reacti-Bind High Bind microplate (Pierce, Rockford, IL) y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación para capturar los complejos puenteados. Después de lavar las cavidades, se agregó un anticuerpo antidigoxina de ratón conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) y las muestras se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se agregó subsiguientemente un substrato de peroxidasa, tetrametil bencidina, para desarrollar el color y la reacción se detuvo agregando ácido fosfórico 1M. Las placas se leyeron a 450 nm para la detección de la absorbancia y se leyeron a 630 nm para la absorbancia de referencia usando un lector Elx800 (BioTEK, Winooski, VT). Se determinaron los títulos del anticuerpo mediante un programa de reducción de datos de titulación log, Watson LIMS versión 7.2.0.04 (Thermo Electron Corp., Louisville, CO).

Se usaron muestras de ARN sanguíneas para medir la expresión de mARN de M1 prime por reacciones en cadena de polimerasa cuantitativas (qPCR). Brevemente, se purificó el ARN de las muestras de sangre entera recogidas de los pacientes usando el kit PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen Inc.). Después de la purificación, 250 ng de ARN total fueron transcriptos en forma inversa a cADN usando el kit SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (11754-050, Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante en un BioRad C1000 Thermal Cycler (BioRad, Hercules CA). Para qPCR, se amplificó el cADN con cebador directo (5 -CAGCGAGCGGTGTCTGT- 3') (SEQ ID NO:42), cebador inverso (5 -GTGGCAGAGCACCCTATCC - 3') (SEQ ID NO:41) y 6 FAM— MGB sonda (5 -CCAGCCCGGGATTT - 3') (SEQ ID NO:43 en una máquina de POR ABI7900HT Fast Real-Time POR machine (Qiagen Inc.) usando el software SDS2.3 (Qiagen Inc.).

Los criterios de Inclusión para los sujetos elegibles eran: edad 18 a 55 años; índice de masa corporal (BMI) entre 18 y 32 kg/m2; peso 40 a 120 kg; en buen estado de salud según se determinó por la falta de hallazgos clínicamente significativos en la historia clínica, ECG de 12 derivaciones y signos vitales incluyendo la temperatura corporal oral a 35-37,5 °C, presión sanguínea sistólica a 90-140 mm Hg, y presión sanguínea diastólica a 50-90 mm Hg; recuentos de neutrófilos en el examen y en la visita del Día -1 > 1.600 células/pL; recuentos de plaquetas en el examen y en la visita del Día -1 > 140.000 células/pL; hombres o mujeres que fueron esterilizados quirúrgicamente, post-menopáusicas durante el año previo, o que usaran dos métodos de contracepción aceptables contra embarazos durante por lo menos 6 meses (> 5 vidas medias anticipadas de MEMP1972A) después de la dosis del fármaco en estudio; no fumadores, así como también fumadores leves u ocasionales capaces de pasar los exámenes de laboratorio y que no fumaran en el período de confinamiento designado; y que fueran capaces de cumplir con los requerimientos del estudio, incluyendo el período de seguimiento. Los criterios de exclusión incluían: diagnóstico activo de asma o alergia con evidencia de historia reciente de síntomas y/o tratamiento dentro de los 5 años previos; historia de anafilaxis, e hipersensibilidad o alergias a fármacos. Los criterios de exclusión adicionales se pueden hallar con el identificador NCT01160861 en la world wide web en clinicaltrials.gov.

Estudio de fase 1B. Un total de 36 sujetos con rinitis alérgica estacional o perenne (SAR o PAR) fueron aleatorizados en base a una asignación del tratamiento de aproximadamente 2:1 MEMP1972A:placebo, dentro de 3 cohortes de dosis crecientes múltiples planificadas (X, Y, Z) con 12 sujetos por cohorte (8 activos y 4 placebo) (Tabla 2). Los sujetos fueron examinados para evaluar su elegibilidad para Ingresar en el estudio dentro de los 35 días antes del Día 1 de tratamiento. Cada sujeto elegible fue asignado al azar para recibir una sola dosis intravenosa (IV) o subcutánea (SC) de MEMP1972A o del placebo correspondiente de acuerdo con un esquema de iniciación de la dosis y aumento de la dosis (Fig. 2). Los niveles de dosis eran 1 ,5 mg/kg IV en la primera cohorte (X), seguido por 5 mg/kg IV en la segunda cohorte (Y), y luego 3 mg/kg administrados SC en la tercera cohorte (Z). Cada sujeto recibió tres dosis administradas cada 4 semanas. La dosificación en la primera cohorte (Cohorte X: 1 ,5 mg/kg IV) se basó en la revisión de los datos clínicos y de laboratorio de las cohortes A-E en el estudio de fase 1A. La iniciación de la dosificación para la segunda cohorte (Cohorte Y: 5 mg/kg IV) se basó en la revisión de los datos de la cohorte F en el estudio de fase 1A y 14 días de datos de seguimiento posdosificación de la cohorte de dosis múltiple IV de 1 ,5 mg/kg (X). La iniciación de la dosificación para la tercera cohorte (Cohorte Z: 3 mg/kg SC) se basó en la revisión de 14 días de los datos de seguimiento post-dosificación de la cohorte de una sola dosis SC de 3 mg/kg (G) en el estudio de fase 1A, así como también 14 días de seguimiento post-primera dosis de todos los sujetos en la cohorte de múltiples dosis IV de 1 ,5 mg/kg (X).

Tabla 2. Cohortes del estudio para el estudio de fase 1B El MEMP1972A fue administrado como una dosis de 1,5 mg/kg IV, 5,0 mg/kg IV o 3,0 mg/kg SC de acuerdo con el estudio de la cohorte los Días 1 , 29, y 57. Las preparaciones de las dosis para las infusiones IV de la Cohorte X (1 ,5 mg/kg IV) se realizaron diluyendo el MEMP1972A o el placebo con diluyente en un frasco-ampolla vacío estéril. No se requirió dilución para la Cohorte Y (5,0 mg/kg IV) y la Cohorte Z (3,0 mg/kg SC). Para los sujetos que recibían las dosis IV, el MEMP1972A o el placebo fueron suministrados usando una bomba de jeringa con una extensión de microperforación fijada para una duración de 1 hora para las primeras dos dosis (Día 1 y Día 29) y para una duración de 30 minutos para la tercera dosis (Día 57). Para los sujetos que recibían las dosis SC, el MEMP1972A o el placebo fueron administrados por inyección SC, usando jeringas (jeringa de insulina BD). Para la administración de la dosis de 3 mg/kg (Cohorte Z), se suministraron hasta 1 ,0 mL SC por sitio de inyección usando una jeringa de 1 ,0 ce con una aguja de calibre 25 o 27 que tiene 5/8 de pulgada de longitud. Las inyecciones SC fueron administradas en el abdomen.

Para las Cohortes X y Y, se realizaron evaluaciones físicas y se obtuvieron muestras farmacocinéticas (PK) 0-60 minutos después de finalizar la infusión del fármaco en estudio del Día 1 , así como también 24 horas después de la dosificación. Para la segunda dosis (Día 29), se obtuvieron muestras PK antes de la dosificación y 0-60 minutos después de finalizar la infusión. Para la dosis tercera y final (Día 57), se obtuvieron muestras antes de la dosificación, así como también 0-60 minutos después de finalizar la infusión. Las muestras PK adicionales se obtuvieron los Días 8, 15, 85, 140, y 224. Para la Cohorte Z, se obtuvieron muestras PK 0-60 minutos después de la inyección del fármaco en estudio el Día 1 , así como también 24 horas después de la dosificación. Para la segunda y la tercera dosis (Días 29 y 57), se obtuvieron muestras PK predosis solamente. Las muestras PK adicionales se obtuvieron los Días 8, 15, 36, 64, 85, 140, y 224. Se evaluaron las muestras de suero sanguíneo con respecto a los niveles séricos totales de MEMP1972A por inmunoensayos cuantitativos, con respecto a la presencia de anti-anticuerpos terapéuticos (ATA) usando un ELISA de puente (ver ensayo descripto en el estudio de fase 1A), y la medición de la IgE total y la IgE específica de un alérgeno usando un ensayo clínico estándar, Immulite 2000 (Siemens Medical Solutions Diagnostics, Los Angeles CA). Ver L¡, et al., Ann Clin Lab Sc , 34(1):67-74 (2004).

Las muestras de ARN sanguíneas se usaron para medir la expresión de mARN de M1 prime por reacciones en cadena de polimerasa cuantitativas (qPCR). Brevemente, se purificó ARN de las muestras de sangre entera recogidas de pacientes usando el kit PAXgene Blood RNA Kit (Qiagen Inc.). Después de la purificación, 250 ng de ARN total fueron transcriptos en forma inversa a cADN usando el kit SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit (11754-050, Invitrogen), de acuerdo con las instrucciones del fabricante en un BioRad C1000 Thermal Cycler (BioRad, Hercules CA). Para qPCR, se amplificó el cADN cebador directo (5'-CAGCGAGCGGTGTCTGT- 3') (SEQ ID NO:42), cebador inverso (5 -GTGGCAGAGCACCCTATCC - 3') (SEQ ID NO:41) y 6 FAM— MGB sonda (5 -CCAGCCCGGGATTT - 3') (SEQ ID NO:43) en una máquina de PCR ABI7900HT Fast Real-Time PCR machine (Qiagen Inc.) usando el software SDS2.3 (Qiagen Inc.).

Los criterios de inclusión para los sujetos elegibles eran: edad 18 a 55 años; diagnóstico de rinitis alérgica estacional o perenne; índice de masa corporal (BMI) entre 18 y 32 kg/m2; peso 40 a 120 kg; nivel sérico de IgE total >10 Ul/ml o >10 Ul/ml y por lo menos una IgE específica de un alérgeno >0,1 klU/L; en buen estado de salud según se determinó porque no se determinaron hallazgos clínicamente significativos en la historia clínica, ECG de 12 derivaciones y signos vitales incluyendo una temperatura corporal oral de 35-37,5 °C, presión sanguínea sistólica a 90-140 mm Hg, y presión sanguínea diastólica a 50 -90 mm Hg; hombres o mujeres que fueron esterilizados quirúrgicamente, post-menopáusica durante el año previo, o que estuvieran usando dos métodos de contracepción aceptables contra embarazo durante por lo menos 6 meses (> 5 vidas medias anticipadas de MEMP1972A) después de la dosis del fármaco en estudio; y que se consideraba que eran capaces de cumplir con los requerimientos del estudio, incluyendo el período de seguimiento. Los criterios de exclusión incluían: historia de anafilaxis, hipersensibilidad o alergias a fármacos; historia de un diagnóstico de asma que requería el uso de una medicación diaria controladora o el uso de rescate de un broncodilatador de rápida acción dentro de los últimos 3 años; y un volumen espiratorio forzado en 1 segundo (FEVi) < 80% de lo predicho en el examen. Los criterios de exclusión adicionales se pueden encontrar con el identificador NCT01160861 en la world wide web en clinicaltrials.gov.

Resultados El MEMP1972A fue bien tolerado en ambos estudios, de fase 1a/b. La evaluación de las características farmacocinéticas después de la administración única o múltiple IV demostró exposiciones proporcionales a las dosis. En base a análisis no compartimentados, la vida media terminal media se encontraba en el rango de 20-21 días y la depuración media fue de 2,2-2,7 mlJdía/kg en los dos estudios.

En el estudio de fase 1a, después de la administración IV, el MEMP1972A tuvo una depuración promedio lenta (2,31-2,74 mL/día/kg), y una vida media terminal larga (~21 días), de acuerdo con los datos para un anticuerpo monoclonal de lgG1. El volumen de distribución osciló entre 66,6 y 81 ,6 ml/kg. Las concentraciones séricas medias eran proporcionales a las dosis (Fig. 3). La exposición total (AUCo-¡nf) y Cmax mostró aumentos proporcionales a las dosis con niveles de dosis crecientes en las cohortes de IV de 0,3 a 5,0 mg/kg (Tabla 3). La biodisponibilidad SC relativa fue de 66,4%, lo que se estimó como la relación entre la AUCo-inf media para las cohortes IV y SC del mismo nivel de dosis. En el estudio de fase 1b, las concentraciones farmacocinéticas de MEMP1972A eran proporcionales a las dosis después de la administración IV repetida a 1,5 o 5,0 mg/kg (Tabla 4; Fig. 4). La biodisponibilidad SC relativa se estimó como la relación entre la AUCo-¡nf normalizada de la dosis o la dosis SC y aquellas de las cohortes IV. La biodisponibilidad SC relativa media fue de aproximadamente 55,1%.

El análisis PK de la población de los dos estudios de fase I de MEMP1972A demostró una vida media terminal media de 19,6 días, una depuración (CL) de 216 mL/día y un volumen central de distribución (Vc) de 3,5 L después de la administración IV, y una biodisponibilidad de 68,8% después de la administración SC. Se halló que el peso corporal era un covariado significativo para CL y Vc.

El tratamiento con MEMP1972A llevó a una reducción dependiente de la dosis de la IgE total sérica. En voluntarios sanos, una sola dosis de MEMP1972A a 3 y 5 mg/kg IV dio por resultado una reducción de la IgE total sérica de 28% y 23%, respectivamente, el Día 85 con relación a la línea de base, mientras que no se observó una reducción en las cohortes de placebo, la IV más baja y SC de 3 mg/kg (Fig. 5A). En los sujetos con rinitis alérgica, tres dosis mensuales de MEMP1972A a 5 mg/kg IV y 3 mg/kg SC dieron por resultado una reducción media de la IgE total sérica de 24% y 26%, respectivamente, el Día 85 con relación a la línea de base, mientras que no se observó una reducción significativa en las cohortes de placebo y 1 ,5 mg/kg IV (Fig. 6). La reducción de la IgE total sérica se mantuvo 6 meses después de la dosificación en ambos estudios (Fig. 5B y Fig. 6). El día 224, la IgE específica de un alérgeno se encontraba significativamente reducida en un 40% con respecto a la línea de base en la cohorte de 3 mg/kg SC, mientras que se observaron reducciones de 9%, 14% y 33% con respecto a la línea de base en los pacientes que recibieron placebo, 1,5 mg/kg IV y 5 mg/kg IV, respectivamente. Las respuestas de IgE de ambos estudios de fase I, según se caracterizan por un modelo PK-PD que describe las dinámicas de las células B/plasmablastos que expresan el M1 prime, las células plasmáticas que producen IgE y los niveles séricos de IgE, demostraron una CI50 de 2,7 Mg/mL para el efecto de MEMP1972A sobre el agotamiento de las células B y la vida media de las células que producen IgE de aproximadamente 130 días. Considerados juntos, estos datos demuestran que el direccionamiento a las células B que expresan el M1 prime usando el MEMP1972A lleva a una reducción de la IgE total sérica en sujetos humanos con o sin enfermedad alérgica. Además, el tratamiento con MEMP1972A lleva a una reducción dependiente de la dosis de los niveles de la IgE total sérica, con reducciones de la IgE mantenidas durante seis meses después de la última dosis. En ambos estudios de fase 1 , los perfiles de eventos adversos (AE) eran similares entre los grupos de tratamiento con MEMP1972A y con placebo y la mayoría de los eventos eran leves o moderados. En el estudio de dosis creciente única de fase 1a, los AEs informados comúnmente incluían cefalea, fatiga, hematoma en el sitio de punción y nasofaringitis. La proporción de sujetos con > 1 AE debido al tratamiento AE (TEAE) fue comparable en el grupo tratado con placebo (11/14; 78,6%) y el grupo tratado con MEMP1972A (21/31; 67,7%). La mayoría de los AEs no se consideraron relacionados con el fármaco en estudio. La cefalea era el AE relacionado con el fármaco en estudio informado más frecuentemente (n = 5 [16,1%]) en los sujetos tratados con MEMP1972A y n = 1 [8,3%] en el grupo tratado con placebo IV). En el estudio de dosis crecientes múltiples de fase 1b, los AEs más comunes fueron cefalea, congestión nasal, dolor de espalda, mareos y fatiga. Los TEAEs fueron experimentados por 83% (20/24) de los sujetos tratados con MEMP1972A y 75% (9/12) de los sujetos tratados con placebo, la mayoría de los cuales fueron leves. Sólo se informó un TEAE severo durante el estudio por un sujeto que recibía el placebo. Los TEAEs que se informaron con mayor frecuencia en sujetos que recibían el MEMP1972A fueron infección del tracto respiratorio superior (n = 7 [29,2%] en los sujetos tratados con MEMP1972A, n = 2 [25%] en el grupo tratado con placebo IV) y cefalea (n = 6 [25,0%], n = 1 IV y n = 1 SC [12,5%] de los grupos de placebo respectivos). No se informaron eventos adversos serios en ninguno de los estudios. Los niveles de anti-anticuerpo terapéutico permanecieron negativos durante los dos estudios de fase I para todos los sujetos que recibieron el MEMP1972A.

Tabla 3. Parámetros farmacocinéticos de MEMP1972A en voluntarios sanos.

AUCo-¡nf = área bajo la curva de concentración-tiempo desde el tiempo 0 a infinito; Cmax = concentración máxima observada; t½ = vida media de eliminación; CL = depuración sérica total para cohortes IV (C - F); CIJF = depuración sérica total aparente después de la administración SC (cohorte G); Vz = volumen de distribución para las cohortes IV (C - F); Vz/F = el volumen aparente de distribución después de la administración SC (cohorte G). Se obtuvieron insuficientes datos de concentración de las cohortes A (0,003 mg/kg IV) y B (0,03) mg/kg para estimar los parámetros PK.

Tabla 4. Parámetros farmacocinéticos de MEMP1972A en pacientes con rinitis alérgica.

AUCo-inf = área bajo la curva de concentración-tiempo desde tiempo 0 a infinito; Cmax,úit¡ma = concentración máxima observada post-última dosis el Día 57; t½ = vida media de eliminación; CL = depuración sérica total para las cohortes IV (X y Y); CL7F = depuración sérica total aparente después de la administración SC (cohorte Z); Vz = volumen de distribución para las cohortes IV (X y Y); Vz/F = volumen aparente de distribución después de la administración SC (cohorte Z).

Conclusiones En ambos estudios de fase I, el MEMP1972A fue bien tolerado hasta 5 mg/kg IV y a 3 mg/kg SC en voluntarios sanos y en pacientes con rinitis alérgica. Los perfiles de AE eran similares entre los grupos de tratamiento con MEMP1972A y con placebo y la mayoría de los eventos fueron leves o moderados. El tratamiento con EMP1972A llevó a una reducción de la IgE total sérica en voluntarios sanos y en pacientes con rinitis alérgica, en las cohortes de 3 mg/kg SC y 5 mg/kg IV, que se mantuvo aproximadamente 6 meses después de la última dosis.

Ejemplo 2: Efecto de un anticuerpo monoclonal anti-M1 prime, MEMP1972A, en un estudio de desafío con alérgeno de demostración de actividad de fase 2a en sujetos con asma leve Se evaluó el MEMP1972A en un estudio de fase 2a (NCT01196039) para testear la demostración de actividad después del desafío de inhalación del alérgeno (AIC).

Métodos Este estudio multicéntrico, aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo, evaluó la actividad, seguridad y tolerabilidad de MEMP1972A en sujetos con asma leve después de AIC. El MEMP1972A fue producido usando células de ovario de hámster chino (CHO), purificado y formulado como 100 mg/mL de MEMP1972A en 30 mM de histidina/clorhidrato de histidina, 140 mM de clorhidrato de arginina y 0,04% (p/v) de polisorbato 20 a pH 5,5 con agua para inyección. El producto del fármaco MEMP1972A fue suministrado como una solución líquida libre de conservantes estéril para la administración IV y SC en un frasco-ampolla de 2 mL de vidrio transparente, de un solo uso, que estaba tapado con un tapón laminado de fluorc— resina de 13 mm y cubierto con una cubierta de aluminio con un sello de plástico "flip-off". Cada frasco-ampolla contenía 150 mg de ingrediente farmacéutico activo (API). El placebo correspondiente para el MEMP1972A contenía los mismos excipientes que el producto del fármaco, sin API. El placebo fue suministrado en una configuración de frasco-ampolla idéntica al producto del fármaco. Pacientes con asma alérgica leve, estable, fueron examinados (Días -35 a 1) para obtener una cohorte de pacientes con EAR (respuesta asmática temprana) y LAR (respuesta asmática tardía) documentadas al desafío ¡ncremental inhalado. Veintinueve sujetos adultos fueron aleatorizados (1 :1) para recibir placebo o MEMP1972A, que fue administrado intravenosamente a 5 mg/kg cada 4 semanas durante un total de 12 semanas (es decir, Días 1 , 29 y 57) y seguido por un seguimiento de seguridad de cinco meses (es decir, Días 57-197) (Fig. 7). La línea de base y las características demográficas eran similares entre los grupos de tratamiento grupos (Tabla 5). El examen y las muestras de sangre fueron extraídas de los sujetos pre-tratamiento. El desafío con el alérgeno se proporcionó pre-tratamiento el Día- y un desafío de alérgeno postratamiento se proporcionó el Día 86 (más o menos 3 días), aproximadamente veintinueve días después de la tercera y la última dosis de infusión. Para el desafío con el alérgeno, se midieron diez diferentes IgEs específicas en todos los pacientes (pelo de gato, caspa de gato, caballo, HDMf, HDMp, pasto mallín, ambrosía, agróstide blanca, césped vernal dulce, hierba timotea) y cada paciente recibió un desafío con uno de esos 10 alérgenos, dependiendo de su reactividad a la piel. Este alérgeno de desafío relevante fue diferente para cada paciente. La IgE específica de un alérgeno detectable debido a alérgenos con los que el sujeto no fue desafiado, fueron capturados como niveles de IgE irrelevantes o no específicos del desafío. Los alérgenos Irrelevantes o que no pertenecían al desafío que estaban altamente relacionados con el alérgeno del desafío relevante (por ejemplo, caspa de gato vs pelo de gato) fueron excluidos de las evaluaciones de IgE irrelevantes o no específicos del desafío. Los desafíos con metacolina se realizaron 24 horas antes y 24 horas después de los desafíos con alérgenos. El stock de cloruro de metacolina (cloruro de metacolina en polvo para inhalación) fue preparado a una concentración de 128 mg/mL en 0,9% de cloruro de sodio (solución salina normal). La metacolina fue diluida adicionalmente en solución salina normal para alcanzar concentraciones de 0,031 mg/mL a 128 mg/mL. La inhalación de metacolina se realizó usando el método de Cockcroft (Cockcroft et al. 1987). Brevemente, los sujetos inhalaron la metacolina de una válvula de Hans Rudolf conectada a un nebulizador Wright con una entrega de 0,13 mIJmin. Se instruyó a los sujetos que usaran clips para la nariz y que respiraran normalmente de la boquilla durante el período de inhalación de 2 minutos. Los sujetos inhalaron solución salina normal, seguido por concentraciones dobles de metacolina durante 2 minutos. Se midió el FE\A| 30 y 90 segundos después de cada inhalación. El test finalizó cuando ocurrió una declinación de 20% en el FEVi de un valor de línea de base del sujeto y se calculó la PC20 de metacolina. Se realizó un procedimiento de inducción del esputo de acuerdo con el método descripto por Pizzichini et al. 1996 (Eur. Respir. J. 9:1174-1180) 24 horas antes del desafío con el alérgeno y 7 horas y 24 horas después de cada desafío con el alérgeno. Las muestras de esputo se midieron con respecto a los niveles de proteínas y la expresión de mARN para el análisis de la IgE total y M1 prime. El desafío con metacolina precedió a la inducción del esputo. También se midieron los eosinófilos en el esputo y la sangre como biomarcadores exploratorios. Los niveles de eosinófilos en la sangre periférica se midieron usando un ensayo de recuento de sangre completo estándar (CBC). Los eosinófilos en el esputo fueron identificados en base a la morfología celular y la tinción, y se contaron subsiguientemente bajo un microscopio para la determinación de los niveles de eosinófilos. No se permitió la modificación de los niveles de dosis de MEMP1972A durante el estudio. La medida del resultado primaria era el área bajo la curva (AUC) de la respuesta asmática tardía inducida con alérgenos (LAR) entre 3 y 7 horas después del desafío con el alérgeno en la semana 12 (Día 86) después de la dosis 1. Las medidas de los resultados secundarios incluían la respuesta asmática temprana (EAR) AUC entre 0 y 3 horas o 0 y 2 horas postratamiento del desafío con el alérgeno para obtener el área de la declinación por ciento en FEN^ en el tiempo e incluyendo el cambio en el desafío con metacolina PC20 el Día 87 (24 horas después del desafío con el alérgeno post-dosificación) con relación al la PC20 predesafío con el alérgeno calculada el Día 85. La IgE total sérica y la IgE específica de un alérgeno fueron evaluadas para demostrar la actividad mecanística del MEMP1972A usando un ensayo clínico estándar, Phadia InmunoCAP (Phadia Inc.). Los niveles de CCL17 en el suero se midieron usando un kit Human CCL17/TARC Quantikine ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN; no. de catálogo DDN100).

Tabla 5. Línea de base y características demográficas FE i = volumen espiratorio forzado 1 segundo; LAR = respuesta asmática tardía; AUC = área bajo la curva; SD= desviación estándar Los criterios de inclusión para sujetos elegibles eran: edad 18 a 65 años; peso entre 50 y 125 kg; asma alérgica leve, estable; historia de estornudos episódicos y falta de aliento; FEN^ en la línea de base > 70% del valor predicho; hombres o mujeres que fueron esterilizados quirúrgicamente, posmenopáusicas durante el año previo, o que usaban dos métodos de contracepción aceptables contra el embarazo durante por lo menos 5 meses después de la última administración de fármaco en estudio; valor PC2o documentado para la predicción de la concentración de alérgeno inicial en el examen; test cutáneo de punción positivo para extractos aeroalergenos estándar comunes; y respuesta de las vías aéreas temprana y tardía inducida por alérgenos positiva. La respuesta positiva temprana de las vías aéreas inducida por alérgenos fue definida como una declinación=20% en el FEN^ del valor más alto pre-alergeno medido 0-2 horas o 0-3 horas posdesafío con el alérgeno. La respuesta tardía de las vías aéreas fue definida como una declinación >15% en el FEN^ desde el valor más alto prealergeno medido 3-7 horas posdesafío con el alérgeno. Los criterios de exclusión incluían: un empeoramiento del asma dentro de las 6 semanas precedentes a la Visita 1 ; infección respiratoria aguda dentro de las 6 semanas precedentes a la Visita 2 o cualquier infección crónica presente; historia de infección bacteriana recurrente como un adulto o historia o presencia de cualquier condición infecciosa crónica; enfermedad pulmonar distinta del asma alérgica leve; uso crónico de otra medicación para el tratamiento de enfermedad pulmonar alérgica distinta de 2-agonistas de rápida acción o bromuro de ipratropio; uso de cromoglicato, nedocromil, antagonistas del receptor de leucotrieno e inhibidores de la 5-lipoxigenasa no están permitidos dentro 4 semanas antes de la Visita 2; alérgeno o péptido inmunoterapia dentro de los 6 meses antes del tratamiento del estudio; y tratamiento con un anticuerpo monoclonal o una biomolécula quimérica dentro de los 5 meses previos, incluyendo omalizumab, en el momento de la Visita 2. Los criterios de exclusión adicionales se pueden hallar con el identificador NCT01196039 en la world wide web en clinicaltrials.gov.

Resultados Un total de 28 sujetos fueron incluidos en el análisis de punto final primario (n=15 MEMP1972A, n=13 placebo); un sujeto del grupo placebo se retiró del estudio debido a un aumento de los síntomas de asma. En el examen, los dos grupos de tratamiento tenían un porcentaje similar de declinaciones en las evaluaciones del volumen espiratorio forzado en 1 segundo (FEVi). En la segunda visita, un mes después de la tercera dosis de fármaco en estudio, se observaron mejoras tanto en la EAR y la LAR en comparación con el placebo. El tratamiento con MEMP1972A fue bien tolerado después de 12 semanas en sujetos con asma leve. En la semana 12, la AUC de la LAR en los sujetos tratados con MEMP1972A se redujo por una media de 36% vs. placebo (90% Cl: -14, 69%, p=0,21) (Fig. 8A y B). Además, la AUC de la EAR había disminuido significativamente por una media de 26% vs. placebo (90% Cl: 6, 43%, p=0,046), mientras que no hubo efecto sobre la hiperrespuesta de las vías a metacolina. La AUC de la EAR se calculó entre 0 y 2 horas después del desafío con el alérgeno en la semana 12. La máxima declinación del FEVT en la LAR fue de 13% (90% Cl: -33%, 44; p=0,58) vs. placebo (Fig. 8A-B). La máxima declinación del FEVi en la EAR fue de 11% (90% Cl: -7%, 26; p=0.27) vs. placebo (Fig. 8A-B). Los análisis de los subgrupos demostraron que los sujetos con caídas de=2 consecutivas=15% (subgrupo A) o caídas >3 consecutivas 10% en el FEVi de LAR predesafío (subgrupo B) mostraron una mayor respuesta al tratamiento con MEMP1972A, con reducciones AUC de LAR de 43% (90% Cl: -5%, 77%) y 62% (90% Cl: 29%, 88%), respectivamente comparadas con el placebo (Tabla 6). Los sujetos que mostraron una AUC de LAR >10%/hora en el examen (subgrupo C) también mostraron una respuesta mejorada, con una reducción de AUC de LAR de 54% (90% Cl 10%, 84%) (Tabla 6).

Los niveles de la IgE total sérica de la línea de base (que oscilaban entre 7-254 Ul/ml) eran bajos pero estaban equilibrados entre los pacientes tratados con placebo (48,5 Ul/ml) y MEMP1972A- (57 Ul/ml). En el grupo de placebo, el desafío con alérgeno del pulmón total indujo un aumento tanto en la IgE total como en la IgE específica de un alérgeno (Fig. 9A y C). El día 29, los desafíos con alérgenos administrados durante el examen aumentaron la IgE total y la IgE específica de un alérgeno de línea de base por 117% y 188%, respectivamente. El día 113, el segundo desafío con alérgeno, administrado el día 86, dio por resultado aumentos adicionales de la IgE total y la IgE específica del alérgeno de la línea de base de 141 % y 308%, respectivamente. El tratamiento con EMP1972A evitó completamente este aumento inducido por el alérgeno de la IgE sérica total y la IgE específica de un alérgeno. El desafío de inhalación de alérgenos en el examen y en la semana 12 en el grupo de tratamiento indujo un aumento de aproximadamente 2 veces en la IgE específica de un alérgeno sérica, que estaba completamente bloqueada por el tratamiento con MEMP1972A (p<0,01 vs. placebo) (Fig. 9A). No se observó un aumento en la IgE específica de un alérgeno en ningún momento en los pacientes tratados con MEMP1972A. Adicionalmente, las evaluaciones de IgE irrelevantes o no especificas del desafío demostraron que no hubo un aumento en los niveles de la IgE irrelevante o de la IgE específica de un alérgeno no específico del desafío en los pacientes con placebo y los tratados con MEMP1972A (Fig. 9B). El Día 85 (predesafío), la reducción media por ciento en los niveles de IgE era de aproximadamente 20% de la línea de base para los niveles de la IgE total y la específica (alérgeno relevante del desafío o alérgenos no relevantes del desafío) en los sujetos tratados con MEMP1972A (Fig. 16A y B). En el Día 197, la reducción media por ciento en los niveles de IgE era de aproximadamente 20% de la línea de base tanto para los niveles de IgE total como para los de la IgE relevante para el desafío específicos y más de 20% de la línea de base tanto para los niveles de IgE total como para los de la IgE específicos no del desafío en los sujetos tratados con el MEMP1972A (Fig. 16A y B). Similarmente al aumento de la IgE sérica específica de un alérgeno, la AIC en el examen y en la semana 12 indujo más que un aumento de aproximadamente 10 veces en los eosinófilos del esputo, que fue reducido por el tratamiento con MEMP1972A en la semana 12 (Fig. 10B). El día 86, 7 horas después del desafío con el alérgeno, los eosinófilos del esputo en los pacientes tratados con placebo eran 16% ± 4,5% (media ± error estándar). En los pacientes tratados con MEMP1972A, los niveles de eosinófilos del esputo 7 horas después del desafío con el alérgeno el día 86 eran 8,0% ± 2,2%. Adicionalmente, el tratamiento con MEMP1972A redujo la IgE total sérica en aproximadamente 20% con respecto a la línea de base a las 8 semanas después de la iniciación del tratamiento (p<0,01 vs. placebo) (Fig. 9A y C) y redujo los eosinófilos sanguíneos en aproximadamente 45% en la semana 28 (Fig. 11A-B). El análisis ulterior con datos de pacientes adicionales mostró que el tratamiento con MEMP1972A llevó a hasta un 25% de la reducción con respecto a la línea de base en la IgE total sérica en el día 197 (Fig. 9D). Los eosinófilos sanguíneos disminuyeron en los pacientes tratados con MEMP1972A en el tiempo, mostrando reducciones medias en los recuentos absolutos de 20% y 28% de los niveles de la línea de base en la semana 20 y la semana 38, respectivamente. Por contraste, los niveles de eosinófilos sanguíneos en los pacientes tratados con placebo estaban aumentados con relación a la línea de base y permanecieron por encima de la línea de base durante todo el estudio. Después del desafío con el alérgeno, los niveles séricos del quimioatrayente "?,2, CCL17, estaban significativamente aumentados en los tratados con placebo, pero no en los pacientes tratados con MEMP1972A (Fig. 12A-B). En los pacientes tratados con placebo, el desafío con alérgenos causó un aumento de 116 pg/ml en los niveles séricos de CCL17 del Día 85 (24 horas antes del desafío con el alérgeno) al Día 87 (24 horas después del desafío con el alérgeno). En los pacientes tratados con MEMP1972A, los niveles séricos CCL17 aumentaron en 26 pg/ml después del desafío con el alérgeno del Día 85 al Día 87. La atenuación de la EAR, LAR, IgE sérica, CCL17 sérica inducida por el alérgeno así como también de los eosinófilos del esputo y de la sangre después de AIC concordaba con el mecanismo de acción de MEMP1972A. Los resultados de este estudio sugieren que el agotamiento del linaje de células B que expresan el M1 prime es una estrategia terapéutica efectiva para el tratamiento del asma alérgica. No hubo un aumento significativo de los eventos adversos o de los eventos adversos serios en el grupo de tratamiento en comparación con el grupo placebo. El MEMP1972A fue bien tolerado, sin efectos adversos provocados por el tratamiento (AEs) en el grupo activo, no se observó ningún conjunto de AEs que indique un efecto tóxico para un sistema de órganos, y ningún AE serio, AE severo, o AE que condujera a la discontinuación del fármaco en estudio. El término de AE más frecuente preferido fue cefalea, que ocurrió en cinco pacientes; tres en el brazo de placebo y dos en el brazo de MEMP1972A. Otros AEs informados en por lo menos dos pacientes en cualquier brazo eran nasofaringitis (más frecuente en el grupo de MEMP1972A), molestias en el pecho (dos pacientes en el grupo de MEMP1972A), mareos y dolor orofaríngeo, con dos pacientes de placebo cada uno, respectivamente (Tabla B).

Tabla B. Eventos adversos comunes que ocurren en= 2 pacientes por grupo Dolor orofaríngeo 2 (14) 0 Todos eran eventos leves, Grado 1 Tabla 6. Análisis del subgrupo de FEVi de LAR predesafío AUC = área bajo la curva; Cl = intervalo de confianza; EAR = respuesta asmática temprana; FEVi = volumen espiratorios forzado en 1 segundo; LAR = respuesta asmática tardía Conclusiones Después de la administración de tres dosis mensuales, el tratamiento con MEMP1972A redujo el nivel total de respuesta asmática en comparación con el placebo. No se observaron aumentos en la IgE específica de un alérgeno en ningún momento en los sujetos tratados con ME P1972A demostrando persistencia del efecto postratamiento. La reducción observada de la IgE total después del tratamiento con MEMP1972A concuerda con los datos de los estudios de fase I en voluntarios sanos y sujetos con rinitis alérgica. El MEMP197A fue bien tolerado, sin que se observaran diferencias significativas en AEs entre los grupos de tratamiento. Estos datos sostienen la investigación continua de MEMP1972A como un tratamiento para el asma y se planificó un estudio de fase I Ib» de MEMP1972A en sujetos con asma poco controlada a pesar del tratamiento con ICS y LABA.

Ejemplo 3: Efecto de un anticuerpo monoclonal anti-M1 prime, MEMP1972A, en un estudio de demostración del concepto de fase 2b para un régimen de dosificación trimestral en sujetos con asma Se evaluó MEMP1972A en un estudio de demostración del concepto de fase 2b en pacientes con asma alérgica inadecuadamente controlados con esferoides inhalados y un segundo controlador. Este estudio aleatorizado, doble ciego, controlado con placebo, de 36 semanas se realizó para evaluar la eficacia, seguridad y tolerabilidad de un régimen de dosificación de MEMP1972A en sujetos con asma alérgica que permanecen inadecuadamente controlados con terapia crónica con altas dosis de corticosteroides inhalados y una segunda medicación controladora. Aprox. 560 sujetos de una población objetivo de 18 a 75 años de edad son aleatorizados (1 :1 :1 :1) en cuatro cohortes (A-D) para recibir placebo o MEMP1972A (Fig. 13). Se administró a los 140 sujetos en la Cohorte A una dosis subcutánea (SC) de 300 mg del fármaco en estudio cada cuatro semanas durante el transcurso de 36 semanas (Semanas 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28 y 32). A los 140 sujetos en la Cohorte B se les administró un total de cuatro dosis SC de 450 mg del fármaco en estudio con dosis activas a intervalos trimestrales así como también como una dosis extra en la Semana 4 (Semanas 0, 4, 12, y 24). A los 140 sujetos en la Cohorte C se les administró un total de cuatro dosis SC de 150 mg del fármaco en estudio con dosis activas a intervalos trimestrales así como también una dosis extra en la Semana 4 (Semanas 0, 4, 12, y 24). A los 140 sujetos en la Cohorte D se les administró una dosis de placebo cada cuatro semanas en el transcurso del estudio de 36 semanas (Semanas 0, 4, 8, 12, 16, 20, 24, 28, y 32). El tiempo anticipado de tratamiento del estudio es de 36 semanas, con un seguimiento de 48 semanas.

El punto final primario para el régimen de dosificación trimestral es la tasa de exacerbaciones definidas por el protocolo resultante con el uso de esteroides sistémicos durante 36 semanas. La tasa es estimada por el número total de exacerbaciones definidas por el protocolo observadas en el grupo durante el período de tratamiento dividido por el total de pacientes-semanas en riesgo para el grupo. Para cada paciente individual, las semanas en riesgo son computadas como el número de días entre la finalización del tratamiento o la fecha de discontinuación del período de tratamiento y la fecha de la administración del primer fármaco en estudio, dividido por 7 días. Se usa la regresión de Poisson sobre la dispersión en el análisis para evaluar el efecto del tratamiento sobre la tasa de exacerbaciones del asma definidas por el protocolo. El modelo se ajusta para el nivel sérico de periostina (< 50 ng/mL,= 50 ng/mL), requiriendo el número de exacerbaciones el uso de corticosteroides sistémícos en los 18 meses previos (1 , >1), nivel IgEl (< 75 UI/mL, 75- 200 UI/mL, > 200 UI/mL), y campo.

Los puntos finales secundarios son cambio relativo con respecto a la línea de base a las semanas 12 y 36 en el FEV-?, prebroncodilatador, cambio con respecto a la línea de base a las semanas 12 y 36 en el resultado de los síntomas del asma y porcentaje de semanas de las semanas 24 a 36 que el asma está bien controlada. "Bien controlada" significa que no tiene despertares nocturnos debido a los síntomas del asma y < 2 días de uso de agonista beta de acción rápida (SABA) por semana, como se documenta por el diario del paciente.

Los puntos finales exploratorios incluyen la tasa de exacerbaciones más allá de la semana 36, la respuesta a las semanas 36 y 84, el FEVi y otras medidas espirométricas del cambio en la función pulmonar en el control del asma, cambio en los resultados de síntomas del asma y biomarcadores exploratorios. Los análisis exploratorios para todas las medidas de resultado se realizan dentro de los subconjuntos de diagnóstico (periostina y otros candidatos biomarcadores preespecificados).

La medida de resultado de seguridad incluye la incidencia de eventos adversos en 48 semanas y la incidencia de antianticuerpos terapéuticos (ATAs) en 84 semanas. La medida de los resultados farmacocinéticos incluye el área bajo la curva de concentración-tiempo (AUC) medida pre- y posdosis de MEMP1972 a las semanas 0, 4, 12, 24, y 36.

El punto final primario para demostrar la eficacia clínica del régimen de dosificación trimestral en el estudio de fase 2b es > 55% de reducción de la tasa de exacerbación en comparación con el placebo. El punto final secundario es= 5% de mejora en el FEVi, o la reducción en la frecuencia o severidad de síntomas de asma en comparación con el placebo dentro de las 12 semanas de la primera dosis y después de 36 semanas de dosificación activa, o el porcentaje aumentado de semanas bien controladas en comparación con el placebo durante 24 semanas a 36 semanas de dosificación activa como se demostró por una diferencia de=1 de semanas bien controladas con el control medido por el uso de agonista beta de acción rápida (SABA) y los despertares nocturnos. La determinación de la eficacia clínica del régimen de dosificación trimestral es evaluada adicionalmente en sujetos que demuestran puntos finales primarios y secundarios fuera de los rangos descriptos más arriba (ver Tabla 7).

Tabla 7. Criterios de eficacia clínica para el régimen de dosificación trimestral. con el placebo durante 24 semanas a 36 semanas de dosificación activa Para este estudio, el evento de exacerbación del asma que se usó para evaluar el punto final primario se define como síntomas de asma nuevos o incrementados que llevan a la hospitalización o al tratamiento con corticosteroides sistémicos. Los síntomas de asma nuevos o incrementados incluyen por lo menos uno de los siguientes síntomas nuevos o incrementados (si son preexistentes): estornudos, tos (incluyendo cambios en la producción de esputo o la calidad así como también la frecuencia de la tos), opresión en el pecho, dificultad para respirar o despertares nocturnos debido a uno de los síntomas mencionados más arriba. Como resultado de cualquiera de estos síntomas de asma, uno de los siguientes tiene que ser documentado: Hospitalización para el tratamiento del asma o tratamiento con corticosteroides sistémicos. El tratamiento con corticosteroides sistémico se define como: tratamiento con corticosteroides orales, intravenosos (IV) o intramusculares (I ) durante por lo menos 3 días, o la visita a un sala de emergencia con por lo menos una dosis de corticosteroides IV o IM. La aparición o el comienzo de una exacerbación del asma se define por la fecha de hospitalización o la fecha de inicio del tratamiento con esferoides sístémicos (oral, IM o IV), lo que ocurra primero. El fin de una exacerbación se define por la discontinuación de los esferoides sístémicos. Cualquier episodio de exacerbación del asma definido por el protocolo que ocurra dentro de los 7 días de la última dosis del tratamiento con corticosteroides (oral, IM, IV) para una exacerbación definida por el protocolo previa es considerado una continuación de la exacerbación previa.

Los criterios de seguridad clínica son: 1) reacciones anafilácticas aceptables como se demuestra por < o igual a 2 sujetos con serias reacciones anafilácticas relacionadas con el Anti-M1 prime; 2) sin reacciones en el sitio de la inyección en sujetos con ant¡-M1 prime con Grado 4; 3) sin neutropenia o trombocitopenia persistente Grado 4 (<500 células/mcl) (<20.000 células/mcl) en con anti-M1 prime; y 3) aumento mínimo de las tasas de infección como se demostró por menos que, o igual a, 15% de sujetos con anti-M1 prime con respecto al placebo con infecciones y menos de 6% de sujetos con ant¡-M1 prime con respecto al placebo con infecciones Grado 4.

Los criterios de inclusión para sujetos elegibles incluyen: edad 18 a 75 años; peso = 40 kg; diagnóstico de asma durante por lo menos 12 meses; evidencia de reversibilidad por broncodilatador documentada definida por o bien 12% o más de reversibilidad del ß-agonista usando hasta 4 "disparos" (dosis activadas) de albuterol (en el examen o dentro de los dos últimos años), o PC20 FEV1 metacolina (concentración provocadora de metacolina que produce una caída de 20% en el FEVi) de 8 mg/ml o menos (dentro de los últimos 2 años); prebroncodilatador FEVi= 40% y < 80% predicho en la Visita 1 ; requirió el uso diario de ICS (> 400 pg/día de dosis diaria total de fluticasona propionato (FP) o equivalente (Tabla 8 más abajo) y un segundo controlador durante un mínimo de 3 meses consecutivos antes de la Visita 1 ; historia de por lo menos una exacerbación del asma que requiere un tratamiento con corticosteroides sistémicos durante por lo menos 3 días (o administrado en la formulación para proveer una dosis terapéutica= 72 horas) y no más de 30 días en los 18 meses antes de la Visita 1 ; asma controlada inadecuadamente en las Visitas 1 y 2 como se documenta por el resultado del cuestionario de control del asma (ACQ) > 1,50 en cada visita; asma controlada inadecuadamente a pesar de cumplir con la terapia del controlador de asma documentada por el diario que se lleva diariamente durante el período de ingreso como se define por, con entrada de datos diarios completos durante por lo menos 10 de 14 días antes de la aleatorización, > 1 despertar nocturno/semana y uso de medicación de rescate (por lo menos un "disparo" de un agonista beta de acción rápida [SABA] o SABA nebulizado por lo menos 2 días/semana); o bien IgE sérica "positiva" a por lo menos un aeroalergeno "clínicamente relevante" o una IgE total sérica de por lo menos 75 UI/mL; ECG en el examen dentro de los límites normales.

Tabla 8. Dosis equivalentes de ICS: con relación a propionato de fluticasona 400 pg/día dosis Nota: Dosis equivalentes derivadas en base al número de microgramos de esteroides por actuación sin ajuste por potencia. CFC = clorofluorocarbonos; DPI = inhalador de polvo seco; FP = propionato de fiuticasona, HFA = hidrofluoroalcano; ICS = corticosteroide inhalado; MDI = dosis inhaladadosificada d = día.

Los sujetos con los siguientes criterios son excluidos del ingreso al estudio: exacerbación del asma que requiere esteroides sistémicos en los 30 días antes de la Visita 1 o entre la Visita 1 y la Visita 2; > 20% de cambio relativo en el FEV1 entre la Visita 1 y la Visita 2; fracaso del examen para este estudio más de una vez (los pacientes pueden volver a examinarse una vez si la razón del fracaso del examen es transitoria); si tienen una enfermedad pulmonar activa preexistente distinta del asma; cualquier infección que incluye infecciones crónicas o latentes que requieren tratamiento durante el examen, esto incluye infecciones del tracto respiratorio (incluyendo, pero no limitado a, enfermedad de los senos paranasales y bronquitis); enfermedad médica clínicamente significativa que no está controlada a pesar del tratamiento o que probablemente requiera un cambio de terapia durante el estudio o tiene una etiología desconocida (por ejemplo, enfermedad hepática crónica) incluyendo enfermedades crónicas que puedan exacerbar (por ejemplo, enfermedad intestinal inflamatoria o artritis reumatoide), una enfermedad maligna conocida (recién diagnosticada o tratada inadecuadamente) o la evaluación actual para una enfermedad maligna potencial, inmunodeficiencia conocida, incluyendo pero no limitada a infección por HIV, independientemente del estado de tratamiento; niveles elevados de IgE por razones distintas que la alergia (incluyendo, pero no limitado a, infecciones parasitarias, síndrome de la hiperinmunoglobulina E, aspergilosis broncopulmonar y síndrome de Wiskott-Aldrich); cualquier condición que contraindique el uso de un fármaco en investigación o que pueda afectar la interpretación de los resultados o la capacidad del paciente para participar incluyendo abuso de sustancias en el pasado o actualmente, falta de cumplimiento, participación actual o reciente en otro ensayo de investigación (dentro de los 30 días antes de la Visita 1 o 5 vidas medias del fármaco en investigación, el que sea más largo); historia de exposición significativa a parásitos transportados por el agua (dentro de las 6 semanas antes de la Visita 1) y/o tener enfermedad diarreica reciente de etiología indeterminada (dentro de los 3 meses antes de la Visita 1), se hace una excepción si se obtiene el test de las heces y los resultados son negativos y documentados; fumador anterior con una historia de >10 paquetes por año o fumador actual (el fumador actual tiene que haber dejado de fumar más de 12 meses antes de la Visita 1); historia de anafilaxis (de cualquier activador) o reacción alérgica durante el uso (o posible uso si el estudio es a ciegas) de un anticuerpo monoclonal; uso de cualesquiera terapias concomitantes excluidas (ver Tabla 9); hombres y mujeres que no desean usar un método de contracepción altamente efectivo durante por lo menos la semana 60 del estudio; mujeres que no están embarazadas o amamantando en el momento de la Visita 1; y recuento de neutrófilos absolutos < 1 ,5 x 109/L durante el examen.

Tabla 9. Medicaciones concomitantes y ventanas ICS= corticosteroides inhalados; IM=intramuscular; IV=intravenosa; QOD=día por medio Nota: Los pacientes que toman cualesquiera esteroides de liberación prolongada (inyección de depósito), agentes inmunomoduladores o fármacos en investigación tienen que discontinuar el fármaco en estudio, pero deberían permanecer en el estudio para la observación continua y las evaluaciones. Los esteroides orales, IV o IM (preparado no de depósito), terbutalina o ipratropio pueden ser usados para tratar una exacerbación del asma mientras el paciente continúa recibiendo el fármaco en estudio, sin embargo la duración del tratamiento tiene que ser menor que 30 días o debe discontinuarse el fármaco en estudio. Los esteroides usados para tratar indicaciones distintas que el asma están prohibidos. Si es necesario para el tratamiento de otra indicación, la duración del tratamiento tiene que ser menos de 30 días o debe discontinuarse el fármaco en estudio. Las dosis de ICS, inmunoterapia con alérgenos, y modificadores de leucotrieno deberían permanecer estables durante el estudio. Sin embargo, si las dosis de estas medicaciones se cambian durante un breve período (menos de 30 días) durante el período de tratamiento, se puede permitir que el paciente continúe con el fármaco en estudio. Si la dosis se cambia para un período de 30 días o más, debe discontinuarse el fármaco en estudio. El paciente debería permanecer en el estudio para la observación continuada y las evaluaciones. Debería consultarse el "Medical Monitor" para asegurarse que no hay riesgos de seguridad asociados con la continuación del fármaco en estudio además de las medicaciones concomitantes. a Un curso corto estándar (de 3 a 30 días) de agentes esteroides orales o intravenosos para el tratamiento de una exacerbación del asma es apropiado y admisible en cualquier momento= 30 días antes de la Visita 1 y después de la Visita 2. Entre las Visitas 1 y 2 el uso de esteroides orales o IV o IM o el cambio de la dosis de ICS hace que el paciente no sea elegible. b Los pacientes que participan en un ensayo de un anticuerpo monoclonal en investigación que no ha sido revelado, deberían asumir que han recibido el agente activo. c Las vacunaciones se permiten antes o durante el estudio. Para interpretar con mayor claridad cualquier reacción que ocurra subsiguiente a una inyección (del fármaco en estudio o la vacuna), se recomienda que la vacunación no ocurra en el mismo día que la administración del fármaco en estudio. Si ambos tienen que ser administrados el mismo día, el sitio de la inyección para la vacunación debería estar alejado (en un miembro diferente) del o de los sitios de administración del fármaco en estudio.

Claims

REIVINDICACIONES Habiendo así especialmente descrito y determinado la naturaleza de la presente invención y la forma como la misma ha de ser llevada a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y derecho exclusivo:

1. Un método de tratamiento o prevención de un trastorno mediado por IgE que comprende la administración a un paciente humano de una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento V de una IgE humana, en donde un intervalo entre administraciones del anticuerpo es de aproximadamente un mes o mayor.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el intervalo entre administraciones es de aproximadamente dos meses.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el intervalo entre administraciones es de aproximadamente tres meses.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el intervalo entre administraciones es de aproximadamente cuatro meses.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el intervalo entre administraciones es de aproximadamente cinco meses.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1 , en donde el intervalo entre administraciones es de aproximadamente seis meses.

7. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo es administrado a una dosificación de aproximadamente 150 mg a aproximadamente 450 mg por dosis.

8. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el anticuerpo es administrado a una dosificación de aproximadamente 150 mg, aproximadamente 300 mg o aproximadamente 450 mg por dosis.

9. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el anticuerpo es administrado en forma subcutánea o intravenosa.

10. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el intervalo entre administraciones es de aproximadamente tres meses con una administración adicional en la semana 4 después de la primera administración.

11. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la IgE total sérica en el paciente humano es reducida con relación a la línea de base después del tratamiento con el anticuerpo.

12. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la IgE específica de un alérgeno en el paciente humano es reducida con relación a la línea de base después del tratamiento con el anticuerpo.

13. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde un aumento inducido por un alérgeno en la IgE total sérica en el paciente humano es evitado o reducido después del tratamiento con el anticuerpo.

14. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde un aumento inducido por un alérgeno en una IgE específica de un alérgeno en el paciente humano es evitado o reducido después del tratamiento con el anticuerpo.

15. Un método de tratamiento o prevención de un trastorno mediado por IgE que comprende la administración a un paciente humano de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE humana, en donde el anticuerpo es administrado a una dosis de aproximadamente 150 a aproximadamente 450 mg por dosis.

16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el anticuerpo es administrado a una dosificación de aproximadamente 150 mg, aproximadamente 300 mg, o aproximadamente 450 mg por dosis.

17. El método de acuerdo con la reivindicación 15 ó 16, en donde el anticuerpo es administrado en forma subcutánea o intravenosa.

18. Un método para reducir la IgE total sérica en un humano con relación a la línea de base que comprende la administración a un paciente humano de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE humana, en donde un intervalo entre administraciones del anticuerpo es de aproximadamente un mes o mayor.

19. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la IgE total sérica es reducida por lo menos aproximadamente 20% con respecto al nivel de la línea de base.

20. El método de acuerdo con la reivindicación 18, en donde la IgE total sérica es reducida por lo menos aproximadamente 25% con respecto al nivel de la línea de base.

21. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en donde la reducción de la IgE total sérica es mantenida durante por lo menos un mes después de la última administración del anticuerpo.

22. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en donde la reducción de la IgE total sérica es mantenida durante por lo menos dos meses después de la última administración del anticuerpo.

23. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en donde la reducción de la IgE total sérica es mantenida durante por lo menos tres meses después de la última administración del anticuerpo.

24. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en donde la reducción de la IgE total sérica es mantenida durante por lo menos cuatro meses, por lo menos cinco meses, o por lo menos seis meses después de la última administración del anticuerpo.

25. Un método para la prevención o reducción de un aumento inducido por un alérgeno de la IgE total sérica en un paciente humano que comprende la administración a un paciente humano de una cantidad efectiva de un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE humana.

26. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde un intervalo entre administraciones del anticuerpo es de aproximadamente un mes o mayor.

27. El método de acuerdo con la reivindicación 25, en donde un intervalo entre administraciones del anticuerpo es de aproximadamente tres meses.

28. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en donde el anticuerpo es administrado a una dosis de aproximadamente 150 a aproximadamente 450 mg por dosis.

29. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, en donde un aumento inducido por un alérgeno de la IgE específica de un alérgeno es evitado o reducido.

30. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde la prevención o reducción de la IgE específica de un alérgeno es mantenida durante por lo menos un mes después de la última administración del anticuerpo.

31. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde la prevención o reducción de la IgE específica de un alérgeno es mantenida durante por lo menos dos meses después de la última administración del anticuerpo.

32. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde la prevención o reducción de la IgE específica de un alérgeno es mantenida durante por lo menos tres meses después de la última administración del anticuerpo.

33. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde la reducción de la IgE específica de un alérgeno es mantenida durante por lo menos seis meses después de la última administración del anticuerpo.

34. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en donde el trastorno mediado por la IgE es rinitis alérgica, asma alérgica o asma no alérgica.

35. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 33, en donde el paciente humano tiene asma alérgica que está controlada inadecuadamente por una alta dosis de corticosteroides inhalada u oral en combinación con un segundo controlador.

36. El método de acuerdo con la reivindicación 35, en donde el segundo controlador es un broncodilatador o un agente antileucotrieno.

37. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, que comprende además la administración al paciente humano de un segundo fármaco junto con el anticuerpo para el tratamiento o la prevención de un trastorno mediado por IgE, en donde el segundo fármaco es seleccionado entre el grupo que consiste en: un anticuerpo anti-lgE, un antihistamínico, un broncodilatador, un glucocorticoide, un NSAID, un descongestivo, un supresor de la tos, un analgésico, un antagonista de TNF, un antagonista de integrina, un agente inmunosupresor, un antagonista de IL-4, un antagonista de IL-13, un antagonista dual de IL-4/IL-13, un DMARD, un anticuerpo que se une a un marcador de superficie de las células B, y un antagonista de BAFF.

38. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 36, en donde el anticuerpo es administrado al paciente humano junto con un segundo método de tratamiento para un trastorno mediado por IgE

39. El método de acuerdo con la reivindicación 38, en donde el segundo método de tratamiento comprende un régimen de tratamiento de desensibilización del alérgeno.

40. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.

41. El método de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el anticuerpo se une específicamente al mismo epitopo que uno unido por un anticuerpo seleccionado entre el grupo que consiste en: 47H4, 7A6, 26A11 , 47H4v5, 7A6v1 y 26A11v6.

42. El método de acuerdo con la reivindicación 41 , en donde el epitopo corresponde a un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en: SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, y SEQ ID NO:7.

43. El método de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el anticuerpo se une específicamente a un epitopo en el segmento M1 ' de IgE definido por los residuos 317 a 352 de SEQ ID NO:1.

44. El método de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el anticuerpo se une específicamente a un epitopo en el segmento M1 * de la IgE definido por los residuos 317 a 352 de la SEQ ID NO:1 y tiene una afinidad de unión Scatchard que es equivalente a la del anticuerpo anti-lgE murino 47H4.

45. El método de acuerdo con la reivindicación 44, en donde la afinidad es de entre 0,30 y 0,83 nM.

46. El método de acuerdo con la reivindicación 41 , en donde el anticuerpo se une específicamente a un epitopo en el segmento M1 ' de la IgE definido por los residuos 317 a 352 de la SEQ ID NO:1 y tiene una afinidad de unión Scatchard que es equivalente a la del anticuerpo anti-lgE murino 47H4v5.

47. El método de acuerdo con la reivindicación 46, en donde la afinidad es de aproximadamente 1 ,5 nM.

48. El método de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el anticuerpo comprende las HVRs de cadena pesada y cadena liviana de un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de éste seleccionado entre el grupo que consiste en: 26A11, 26A11 v.1-16, 7A6, 7A6v1, 47H4, y 47H4v1-6.

49. El método de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el anticuerpo comprende las regiones variables pesada y liviana de las cadenas pesadas y livianas del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno de éste seleccionado entre el grupo que consiste en: 26A11 , 26A11 v.1-16, 7A6, 7A6v1, 47H4, 47H4v1-6.

50. El método de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N0.29 y la región variable de cadena liviana comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19.

51. El método de acuerdo con la reivindicación 40, en donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada y cadena liviana, en donde la región variable de cadena pesada comprende una HVR-H1 , HVR-H2 y HVR-H3, y la región variable de cadena liviana comprende HVR-L1, HVR-L2 y HVR-L3, y en donde (a) la HVR-H1 comprende los residuos 26-35 de SEQ ID NO:29, (b) la HVR-H2 comprende los residuos 49-66 de SEQ ID NO:29, (c) la HVR-H3 comprende los residuos 97-106 de SEQ ID NO:29, (d) la HVR-L1 comprende los residuos 24-39 de SEQ ID NO: 19, (e) la HVR-L2 comprende los residuos 55-61 de SEQ ID NO: 19, y (f) la HVR-L3 comprende los residuos 94-102 de SEQ ID NO:19.

52. El método de acuerdo con la reivindicación 51 , en donde el anticuerpo comprende además un marco de consenso humano.

53. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en donde la región variable de cadena pesada del anticuerpo comprende un marco de consenso del subgrupo III.

54. El método de acuerdo con la reivindicación 52, en donde la región variable de cadena liviana comprende un marco de consenso de subgrupo I kappa.

55. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 54, en donde el anticuerpo tiene actividad ADCC.

56. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 55, en donde el anticuerpo es afucosilado.

57. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 56, en donde el anticuerpo agota específicamente las células B alteradas por IgE.

58. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 57, en donde el anticuerpo se encuentra en una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

59. Un kit que comprende un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento M1' de una IgE humana y un inserto del envase que indica que el anticuerpo es administrado a un paciente humano para el tratamiento o la prevención de un trastorno mediado por IgE, en donde un intervalo entre administraciones del anticuerpo al paciente humano es de aproximadamente un mes o mayor.

60. Un kit que comprende un anticuerpo anti-lgE que se une al segmento MV de una IgE humana y un inserto del envase que indica que el anticuerpo es administrado a un paciente humano para el tratamiento o la prevención de un trastorno mediado por IgE, en donde el anticuerpo es administrado a una dosificación de aproximadamente 150 mg a aproximadamente 450 mg por dosis.

61. El kit de acuerdo con la reivindicación 59 ó 60, en donde el inserto del envase indica además que el tratamiento es efectivo para reducir la IgE total sérica con relación a la línea de base en un paciente humano.

62. El kit de acuerdo con la reivindicación 59 ó 60, en donde el inserto del envase indica además que el tratamiento es efectivo para reducir una IgE específica de un alérgeno con relación a la línea de base en un paciente humano.

63. El kit de acuerdo con la reivindicación 59 ó 60, en donde el inserto del envase indica además que el tratamiento es efectivo para la prevención o la reducción de un aumento inducido por un alérgeno de la IgE total sérica en un paciente humano.

64. El kit de acuerdo con la reivindicación 59 ó 60, en donde el inserto del envase indica además que el tratamiento es efectivo para prevenir o reducir un aumento inducido por un alérgeno de la IgE específica de un alérgeno en un paciente humano.

65. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 64, en donde el anticuerpo se encuentra en un frasco-ampolla.

66. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 64, en donde el anticuerpo se encuentra en una jeringa prellenada.

67. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 64, que comprende además un dispositivo de inyección.

68. El kit de acuerdo con la reivindicación 67, en donde el dispositivo de inyección es un auto-inyector.

69. El kit de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 59 a 68, que comprende además un segundo fármaco seleccionado entre el grupo que consiste en: un anticuerpo anti-lgE, un antihistamínico, un broncodilatador, un glucocorticoide, un NSAID, un descongestivo, un supresor de la tos, un analgésico, un antagonista de TNF, un antagonista de integrina, un agente inmunosupresor, un antagonista de IL-4, un antagonista de IL— 13, un antagonista dual de IL-4/IL-13, un DMARD, un anticuerpo que se une a un marcador de superficie de las células B, y un antagonista de BAFF, y un inserto del envase que indica la administración del anticuerpo a un paciente humano a intervalos mensuales o trimestrales junto con el segundo fármaco para el tratamiento de un trastorno mediado por IgE.

70. El kit de acuerdo con la reivindicación 69, en donde el segundo fármaco es un anticuerpo anti-lgE rhuMAbE25.