CZ20012465A3 - Způsob inhibice aktivity ztnf4, izolovaná molekula polynukleotidu, expresní vektor, kultivovaná buňka, způsob přípravy polypeptidu a izolovaný polypeptid - Google Patents

Description

Vynález se týká buněčných povrchových receptorů, zvláště receptorů faktoru nádorové nekrózy (TNFR), které regulují interakce mezi různými liniemi hematopoetických buněk. Specielně se zabývá receptorem TACÍ a jeho uměle připravenými, rozpustnými analogy.

Dosavadní stav techniky

Buněčné interakce, ke kterým dochází v průběhu imunitní odpovědi, jsou regulovány členy několika rodin buněčných povrchových receptorů, včetně rodiny receptorů faktoru nádorové nekrózy (TNFR). Rodina TNFR se skládá z řady glykoproteinových receptorů integrovaných do buněčné membrány, z nichž mnohé ve spojení se svými odpovídajícími ligandy, regulují interakce mezi různými liniemi hematopoetických buněk (Smith a kol., Rodina TNF receptorů pro buněčné a virové proteiny: aktivace, souběžná stimulace a smrt, 76: 959-62, 1994; Cosman, Stem Celíš 12: 440-55, 1994).

Jedním takovým receptorem je TACÍ, transmembránový aktivátor a CAMLinteraktor (von Bůlow a Bram, Science 228: 138-41, 1997 a publikace WIPO WO 98/39 361). TACÍ je receptor vázaný na membránu, který má extracelulární doménu obsahující dvě nedokonalá opakování, bohatá na cystein, transmembránovou doménu a cytoplazmovou doménu, která interaguje s CALM (modulátor vápníku a cyklofylinový ligand), což je protein, který je součástí buněčné membrány, umístěný na vnitrobunéčných váčcích, který když je v nadbytku exprimován v buňkách Jurkat, se podílí na indukci NF-AT aktivace. TACÍ je spojen s B buňkami a subpopulací T buněk, von Bůlow a Bram (Science 228: 138-41, 1997) popisují, že ligand pro TACÍ není známý.

Bylo zjištěno, že polypeptidy předloženého vynálezu, isomerní forma TACÍ, která má pouze jedno nedokonalé opakování, bohaté na cystein (BR43x2), TACÍ a podobný protein B buněk, BCMA (Gras a kol., Int. Immunol. 17: 1093-106, 1995), se vážou • · · · · · · • · · · ·· ··· k ligandu TNF, ztnf4, nyní známý jako neutrokin a (publikace WIPO WO 98/18 921), BLyS (Moore a kol., Science, 285: 260-3, 1999), BAFF (Schneider a kol., J. Exp. Med., 189: 1747-56, 1999), TALL-1 (Shu a kol., J. Leukoc. Biol. 65: 680-3, 1999) nebo THANK (Mukhopadhyay a kol., J. Biol. Chem. 274: 15978-81, 1999). Jako takové by byly BR43x2, TACÍ a BCMA vhodné pro regulaci aktivity ztnf4, zvláště při aktivaci B buněk.

Závěrem lze říci, že předložený vynález poskytuje proteinová terapeutika pro modulaci aktivity ztnf4 nebo jiných BR43x2, TACÍ nebo BCMA ligandů, odvozené prostředky a metody, a rovněž další způsoby použití, které by byly ze zde uvedeného popisu zřejmé osobám se zkušeností v oboru.

Podstata vynálezu

V jednom provedení vynález poskytuje způsob potlačení aktivity ztnf4 u savce, který spočívá v podání množství látky vybrané ze skupiny zahrnující: a) polypeptid obsahující extracelulární doménu BR43x2; b) polypeptid obsahující extracelulární doménu TACÍ; c) polypeptid obsahující extracelulární doménu BCMA; d) polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID NO: (sekvenci číslo:) 10; e) protilátku nebo fragment protilátky, který se specificky váže k polypeptidu se sekvencí SEQ ID NO: 2; f) protilátku nebo fragment protilátky, který se specificky váže k polypeptidu se sekvencí SEQ ID NO: 4; g) protilátku nebo fragment protilátky, který se specificky váže k polypeptidu se sekvencí SEQ ID NO: 6; h) protilátku nebo fragment protilátky, který se specificky váže k polypeptidu se sekvencí SEQ ID NO: 8; i) protilátku nebo fragment protilátky, který se specificky váže k polypeptidu se sekvencí SEQ ID NO: 10;

k) polypeptid se sekvencí SEQ ID NO: 4; I) aminokyselinové zbytky 1 až 166 ze SEQ ID NO: 6; a m) aminokyselinové zbytky 1 až 150 ze SEQ ID NO: 8.

V jednom provedení vynálezu je látka fúzním proteinem, který obsahuje první a druhou část, které jsou spojeny peptidovou vazbou, přičemž první část obsahuje polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující: a) polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID NO: 8; b) polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 25 až 58 ze sekvence SEQ ID NO: 2; c) polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 34 až 66 ze sekvence SEQ ID NO: 6; d) polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 71 až 104 ze sekvence SEQ ID NO: 6; e) polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 25 až 104 ze sekvence SEQ ID

• · · · · ·

NO: 6; f) polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 8 až 37 ze sekvence SEQ ID NO: 8; g) polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 41 až 88 ze sekvence SEQ ID NO: 8; h) polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 8 až 88 ze sekvence SEQ ID NO: 8; a druhá část obsahuje jiný polypeptid. V jiném provedení první část dále obsahuje polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující: a) aminokyselinové zbytky 59 až 120 ze sekvence SEQ ID NO: 2; b) aminokyselinové zbytky 105 až 166 ze sekvence SEQ ID NO: 6; a c) aminokyselinové zbytky 89 až 150 ze sekvence SEQ ID NO: 8.

V jiném provedení je první část vybrána ze skupiny zahrnující: a) polypeptid obsahující extracelulární doménu BR43x2; b) polypeptid obsahující extracelulární doménu TACÍ; a

c) polypeptid obsahující extracelulární doménu BCMA. V podobném provedení je první část vybrána ze skupiny zahrnující: a) polypeptid se sekvencí SEQ ID NO: 4; b) aminokyselinové zbytky 1 až 154 ze sekvence SEQ ID NO: 6; a c) aminokyselinové zbytky 1 až 48 ze sekvence SEQ ID NO: 8. V jiném podobném provedení je druhou částí konstantní část těžkého řetězce imunoglobulinu.

V jiném provedení je protilátka nebo fragment protilátky vybrán ze skupiny zahrnující: a) polyklonální protilátku; b) myší monoklonální protilátku; c) zušlechtěnou protilátku odvozenou od b) a c) lidskou monoklonální protilátku. V podobném provedení je fragment protilátky vybrán ze skupiny zahrnující F(ab'), F(ab), Fab', Fv, scFv a minimální rozpoznávací jednotku. V jiném provedení je savcem primát.

V jiném provedení je aktivita ztnf4 spojena s B lymfocyty. V jiném podobném provedení je aktivita ztnf4 spojena s aktivovanými B lymfocyty. V ještě jiném provedení je aktivita ztnf4 spojena s klidovými B lymfocyty. V jiném provedení je aktivita ztnf4 spojena s produkcí protilátek. V podobném provedení je produkce protilátek spojena s autoimunitní chorobou. V podobném provedení je autoimunitní chorobou systemický lupus erythematodes, myastenie gravis, roztroušená skleróza nebo zánět kloubů.

V jiném provedení je aktivita ztnf4 spojena s astmatem, bronchitidou nebo rozedmou.

V ještě jiném provedení je aktivita ztnf4 spojena s konečným stavem selhání ledvin.

V ještě jiném provedení je aktivita ztnf4 spojena s nemocí ledvin. V podobném provedení je nemocí ledvin glomerulonefritida, vaskulitida, nefritida nebo pyrlonefritida.

V ještě jiném provedení je nemoc ledvin spojena s novotvary na ledvinách, mnohočetnými myelomy, lymfomy, neuropatií nebo amyloidózou. V jiném provedení je aktivita ztnf4 spojena s efektorovými T buňkami. V podobném provedení je aktivita ztnf4 spojena s tlumením imunitní odpovědi. V ještě jiném provedení je aktivita spojena s imunosupresí. V ještě jiném provedení je imunosuprese spojena s odmítnutím štěpu, reakcí štěpu proti hostiteli nebo zánětem. V jiném provedení je aktivita spojena s autoimunitní chorobou. V podobném provedení je autoimunitní chorobou cukrovka závislá na inzulínu nebo Crohnova nemoc. V jiném provedení je aktivita ztnf4 spojena se zánětem. V podobném provedení je zánět spojen s bolestí kloubů, otokem, anémií, nebo septickým šokem. V jiném provedení předložený vynález poskytuje metodu pro inhibici spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy, spočívající v podání množství sloučeniny, která je popsána výše. V jiném provedení je spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy spojeno s B lymfocyty. V jiném podobném provedení je spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy spojeno s aktivovanými B lymfocyty. V ještě jiném provedení je provedení je spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy spojeno s klidovými B lymfocyty.

V jiném provedení je provedení je spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy spojeno s produkcí protilátek. V podobném provedení je produkce protilátek spojena s autoimunitní chorobou. V podobném provedení je autoimunitní Chorobou systemický lupus erythematodes, myastenie gravis, roztroušená skleróza nebo zánět kloubů. V jiném provedení je spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy spojeno s astmatem, bronchitidou nebo rozedmou. V ještě jiném provedení je spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy spojeno s konečným stavem selhání ledvin. V ještě jiném provedení je spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy spojeno s nemocí ledvin. V podobném provedení je nemocí ledvin glomerulonefritida, vaskulitida, nefritida nebo pyrlonefritida. V ještě jiném provedení je nemoc ledvin spojena s novotvary na ledvinách, mnohočetnými myelomy, lymfomy, neuropatií nebo amyloidózou. V jiném provedení je spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy spojeno s efektorovými T buňkami. V podobném provedení je spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy spojeno s tlumením imunitní odpovědi. V ještě jiném provedení je aktivita spojena s imunosupresí. V ještě jiném provedení je imunosuprese spojena s odmítnutím štěpu, reakcí štěpu proti hostiteli nebo zánětem. V jiném provedení je aktivita spojena s autoimunitní chorobou. V podobném provedení je autoimunitní chorobou cukrovka závislá na inzulínu nebo Crohnova nemoc. V jiném provedení je spojení BR43x2, TACÍ nebo BCMA receptorů se svými ligandy spojeno se zánětem.

ς ··· ······· ° .. ···· ·· ·· .....

V podobném provedení je zánět spojen s bolestí kloubů, otokem, anémií, nebo septickým šokem.

Z jiného pohledu předložený vynález poskytuje izolovanou molekulu polynukleotidu, která kóduje polypeptid se sekvencí SEQ ID NO: 2. Je také poskytnuta izolovaná molekula polynukleotidu se sekvencí SEQ ID NO: 1. V podobném provedení je poskytnut expresní vektor, který obsahuje následující operativně vázané elementy: transkripční promotor; molekulu polynukleotidu popsanou výše a terminátor transkripce. V jiném provedení expresní vektor dále obsahuje sekretorickou sekvenci spojení receptor ligand, operativně vázanou k uvedené molekule polynukleotidu. Také je poskytnuta kultivovaná buňka, do níž byl vnesen expresní vektor, přičemž tato kultivovaná buňka exprimuje polypeptid kódovaný uvedeným polynukleotidovým segmentem. Předložený vynález dále poskytuje metodu produkce polypeptidu, která spočívá v: kultivaci buňky do které byl vnesen expresní vektor, jak bylo popsáno výše; tato buňka exprimuje polypeptid kódovaný uvedenou polynukleotidovou molekulou; a exprimovaný polypeptid je izolován. Vynález také poskytuje izolovaný polypeptid, který má sekvenci SEQ ID NO: 2. V podobném provedení je polypeptid v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

Tyto a ještě jiné aspekty vynálezu se stanou zřetelnější po uvedení následujícího podrobného popisu.

Před vyložením vynálezu může být pro jeho pochopení užitečné vyložit definice určitých termínů, které zde budou dále používány:

Termín „afinitní značka“ je zde používán pro označení polypeptidového segmentu, který může být připojen ke druhému polypeptidu, aby napomohl při purifikaci nebo detekci druhého polypeptidu, nebo aby poskytl místa pro připojení druhého polypeptidu k substrátu. V principu jakýkoli peptid nebo protein, pro který je dostupná protilátka nebo jiné specificky se vázající činidlo, může být použit jako afinitní značka. Mezi afinitní značky patří polyhistidinový úsek, protein A (Nilsson a kol., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson a kol., Methods Enzymol. 198: 3, 1991), glutathion S transferáza (Smith a Johnson, Gene 67: 31, 1988), afinitní značka Glu-Glu (Grussenmeyer a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985), substance P, peptid Flag™ (Hopp a kol., Biotechnology 6: 1204-10, 1988), peptid vázající streptavidin nebo jiný antigenní epitop nebo vazebná doména. Obecně viz Ford a kol., Protein Expression and Purification 2:

• ·

95-107, 1991. DNA kódující afinitní značky jsou dostupné od komerčních dodavatelů (např. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Termínem „alelová varianta“ je zde označována kterákoli ze dvou nebo více alternativních forem genu, které jsou umístěny na tomtéž lokusu na chromozómu. Alelové varianty vznikají přirozenou cestou mutacemi a mohou mít za následek fenotypový polymorfizmus uvnitř populací. Mutace v genech mohou být tiché (tj. nezpůsobují žádné změny v jimi kódovaném polypeptidu) nebo mohou kódovat polypeptidy, které mají pozměněnou aminokyselinovou sekvenci. Termín „alelová varianta“ je zde také používán pro označení proteinu kódovaného alelovou variantou genu. Patří sem také stejné proteiny od jednoho druhu, které se liší od standardní aminokyselinové sekvence alelovou variací. Alelová variabilita označuje přirozeně se vyskytující odchylky mezi jednotlivci v genech kódujících určitý protein.

Termíny „blíže k aminovému konci“ a „blíže ke karboxylovému konci“ jsou zde používány pro označení polohy uvnitř polypeptidů a proteinů. Tam kde to kontext dovoluje, jsou tyto termíny používány s odkazem na určitou sekvenci nebo část polypeptidu nebo proteinu, pro označení blízkosti nebo relativní polohy. Například určitá sekvence umístěná uvnitř proteinu blíže ke karboxylovému konci standardní sekvence je umístěna blíže směrem ke karboxylovému konci standardní sekvence, ale není nezbytně až na karboxylovém konci celého proteinu.

Termínem „pár komplement/antikomplement“ jsou zde označovány neidentické složky, které za vhodných podmínek vytvářejí nekovalentně spojený, stabilní pár. Například biotin a avidin (nebo streptavidin) jsou prototypickými členy takového páru komplement/antikomplement. Jiné příklady párů komplement/antikomplement zahrnují páry receptor/ligand, páry protilátka/antigen (nebo hapten nebo epitop), páry sense/antisense polynukleotidů, a podobně. Tam kde je žádoucí následná disociace páru komplement/antikomplement, má pár komplement/antikomplement vazebnou afinitu <10'⁹ M.

Termínem „kontig“ je zde označován polynukleotid, který obsahuje souvislý úsek totožné nebo komplementární sekvence jiného polynukleotidu. O souvislých sekvencích se uvádí že „pokrývají“ daný úsek polynukleotidové sekvence buď úplně nebo pokrývají pouze část úseku daného polynukleotidu. Například reprezentativní kontigy pro polynukleotidovou sekvenci 5-ATGGCTTAGCTT-3' jsou 5'TAGCTTgagtct-3' a 3'-gtcgacTACCGA-5'.

Termínem „komplementy polynukleotidových molekul“ jsou zde označovány polynukleotidy, které mají ve srovnání se standardní sekvencí komplementární sekvenci bází a reverzní orientaci. Například sekvence 5'-ATGCACGGG-3' je komplementární k 5-CCCGTGCAT-3'.

Termínem „degenerovaná nukleotidová sekvence nebo degenerovaná sekvence“ jsou zde označovány sekvence nukleotidů, které zahrnují jeden nebo více degenerovaných kodonů (ve srovnání se standardní polynukleotidovou molekulou, která kóduje polypeptid). Degenerované kodony obsahují odlišné triplety nukleotidů, ale kódují stejný aminokyselinový zbytek (tj. každý z tripletů GAU a GAC kóduje Asp).

Termínem „expresní vektor“ je zde označována DNA molekula, lineární nebo kruhová, která obsahuje segment kódující polypeptid, o který se jedná, který je operativně vázaný k dalším segmentům, zabezpečujícím jeho transkripci. Takové přídatné elementy mohou zahrnovat promotorové a terminátorové sekvence, a případně jeden nebo více počátků replikace, jeden nebo více selektovatelných markérů, zesilovač transkripce, polyadenylační signál a podobně. Expresní vektory jsou obecně odvozeny z plazmidové nebo virové DNA, nebo mohou obsahovat elementy z obou.

Termínem „isoforma“ jsou zde označovány různé formy proteinu, které mohou být produkovány z různých genů nebo z téhož genu následkem alternativního sestřihu. V některých případech se isoformy liší svou transportní aktivitou, obdobím kdy jsou ve vývoji exprimovány, tkáňovou distribucí, rozmístěním v buňce nebo kombinací těchto vlastností.

Termínem „izolovaný polynukleotid“ je zde označován polynukleotid, který byl vzat ze svého přirozeného genetického prostředí a je tedy zbaven vnějších nebo nechtěných kódujících sekvencí, a je ve formě vhodné pro použití v rámci produkčních systémů pro geneticky upravené proteiny. Takovými izolovanými molekulami jsou ty, které jsou vyděleny ze svého přirozeného prostředí a zahrnují cDNA a genomové klony. Izolované DNA molekuly, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou zbaveny jiných genů, se kterými jsou obyčejně asociovány, ale mohou obsahovat přirozeně se vyskytující 5 a 3' nepřekládané oblasti, jako jsou promotory a terminátory. Určení asociovaných oblastí bude zřejmé osobám se zkušeností v oboru (viz například Dynan a Tijan, Nátuře 316: 774-78, 1985).

• · • ·· · ···· • « · · · ·· • ·· ··· ·· • · · · ♦ ·· '· ·· ·· ···

Termínem „izolovaný polypeptid nebo protein“ je zde označován polypeptid nebo protein, který se nalézá v podmínkách jiných než ve svém přirozeném prostředí, jako je například mimo krev nebo mimo živočišnou tkáň. Ve výhodné formě je izolovaný polypeptid v podstatě zbaven jiných polypeptidů, zvláště jiných polypeptidů živočišného původu. Je výhodné poskytnout polypeptidy ve vysoce čisté formě, tj. ve více než 95% čistotě, výhodnější je ve více než 99% čistotě. Pokud je používán v tomto kontextu, termín “izolovaný“ nevylučuje přítomnost téhož polypeptidů v alternativních fyzikálních formách, jako jsou dimery nebo alternativně glykosylované nebo derivované formy.

„Operativně vázaný“: Pokud je aplikován na nukleotidové segmenty, termín „operativně vázaný“ označuje že segmenty jsou uspořádány tak, že fungují, pokud se týká jejich zamýšleného účelu, v harmonické součinnosti, například transkripce je započata na promotoru a probíhá podél kódujícího segmentu k terminátoru.

Termínem „ortolog“ je zde označován polypeptid nebo protein, který je získán z jednoho druhu a který je funkčním partnerem polypeptidů nebo proteinu z jiných druhů. Sekvenční rozdíly mezi ortology jsou výsledkem speciace.

Termínem „polynukleotid“ je zde označován jednořetězcový nebo dvouřetězcový polymer deoxyribonukleotidových nebo ribonukleotidových bází, čtený od 5' konce ke 3' konci. Polynukleotidy zahrnují RNA a DNA a mohou být izolované z přírodních zdrojů, syntetizované in vitro, nebo připravené kombinací přírodních a syntetických molekul. Velikosti polynukleotidů jsou vyjádřeny v párech bází (zkráceně „bp“), nukleotidech („nt“) nebo kilobázích („kb“). Tam kde to kontext umožňuje, poslední dva uvedené termíny mohou označovat polynukleotidy, které jsou jednořetězcové nebo dvouřetězcové. Když je termín použit pro dvouřetězcové molekuly, je použit pro označení celkové délky a bude chápán jako ekvivalent termínu „páry bází“. Osoby se zkušeností v oboru si uvědomují, že dva řetězce dvouřetězcového polynukleotidu se mohou svojí délkou slabě odlišovat a že jejich konce mohou být specificky uspořádány v důsledku enzymatického štěpení; tedy všechny nukleotidy v dvouřetězcové polynukleotidové molekuly nemusí být párovány. Takové nepárované konce obyčejně nebudou přesahovat na délku 20 nukleotidů.

Termínem „polypeptid“ je zde označován polymer aminokyselinových zbytků spojených peptidovými vazbami, ať jsou produkován přirozeně nebo synteticky. Polypeptidy obsahující méně než 10 aminokyselinových zbytků jsou běžně označovány jako „peptidy“.

Termínem „promotor“ je zde označována ta část genu, která obsahuje DNA sekvence zabezpečující vazbu RNA polymerázy a započetí transkripce. Promotorové sekvence se obyčejně, ale ne vždy, nacházejí v 5'nekódujících oblastech genů.

Termínem „protein“ je zde označována makromolekula obsahující jeden nebo více polypeptidových řetězců. Protein může také obsahovat nebílkovinné složky, jako jsou například sacharidové skupiny. Sacharidy a jiné nebílkovinné substituenty mohou být přidány k proteinu buňkou, v níž je protein vytvořen, a bude se měnit podle typu buňky. Proteiny jsou zde definovány v termínech struktur jejich aminokyselinové kostry; substituenty, jako jsou sacharidové skupiny, nejsou obyčejně specifikovány, nicméně však mohou být přítomny.

Termínem „receptor“ je zde označován s buňkou asociovaný protein nebo polypeptidová jednotka takového proteinu, který se váže k biologicky aktivní molekule („ligand“) a zprostředkuje účinek ligandu na buňku. Vazba ligandu k receptorů má za následek změnu receptorů (a v některých případech multimerizaci receptorů, tj. asociaci totožných nebo odlišných podjednotek receptorů), která způsobí interakci mezi efektorovou doménou (doménami) receptorů a jiné molekuly (molekul) v buňce. Tyto interakce pak vedou ke změnám v metabolizmu buňky. Metabolické jevy, které jsou vázány na interakce receptor-ligand zahrnují transkripci genu, fosforylaci, defosforylaci, buněčné množení, zvýšení produkce cyklického AMP, mobilizaci buněčného vápníku, mobilizaci membránových lipidů, buněčnou adhezi, hydrolýzu inozitolových lipidů a hydrolýzu fosfolipidů. BR43x2 má, jak je zde podrobněji diskutováno, charakteristiky TNF receptorů.

Termínem „sekreční signální sekvence“ je zde označována DNA sekvence, která kóduje polypeptid („sekreční peptid“), který jako součást většího polypeptidu, vede větší polypeptid sekreční dráhou buňky, ve které je syntetizován. Větší polypeptid je obyčejné během průchodu sekreční dráhou štěpen, aby byl sekreční peptid odstraněn.

Termínem „rozpustný receptor“ je zde označován takový polypeptid receptorů, který není vázán na buněčnou membránu. Rozpustnými receptory jsou nejčastěji takové receptorové polypeptidy, které postrádají transmembránové a cytoplazmové domény. Rozpustné receptory mohou obsahovat další aminokyselinové zbytky, jako jsou například afinitní značky, které napomáhají purifikaci polypeptidu nebo poskytují místa pro připojení polypeptidu k substrátu. Mnoho receptorů, vyskytujících se na buněčném povrchu, má přirozeně se vyskytující rozpustné protějšky, které vznikají • · · · · · • · · · · · ·· ·· ·· ··♦ proteolýzou nebo jsou překládány z alternativně sestřižených mRNA. O polypeptidech receptoru je možno říci, že jsou v podstatě zbaveny transmembránových a vnitrobuněčných polypeptidových segmentů, když postrádají podstatné části těch segmentů, které zabezpečují zakotvení v membráně, respektive přenos signálu.

Molekulární hmotnosti a délky polymerů určené nepřesnými analytickými metodami (např. gelovou elektroforézou), budou chápány jako přibližné hodnoty. Když je taková hodnota vyjádřena jako „asi“ X nebo „přibližně“ X, uvedená hodnota bude chápána s přesností +10 %.

Všechny zde uvedené dokumenty jsou tímto odkazem zahrnuty ve své úplnosti.

Předložený vynález je založen částečně na objevu DNA sekvence dlouhé 1192 bp (SEQ ID NO: 1) a odpovídající polypeptidové sekvence (SEQ ID NO: 2), která je isoformou receptoru TACÍ. Tato isoforma byla označena BR43x2. Rozpustná forma BR43x2 je uvedena v SEQ ID NO: 4 a polynukleotid kódující rozpustný receptor v sekvenci SEQ ID NO: 3. Jak je zde podrobněji popsáno, receptor BR43x2 kódující polynukleotidy a polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, byly původně určeny klonováním spojeným se zachycováním signálu, za použití lidské knihovny RPMI 1788 a ligandu ztnf4 faktoru nádorové nekrózy, nyní známého jako neutrokin a (WIPO WO 98/18 921), BLyS (Moore a kol., Science, 285: 260-3, 1999), BAFF (Schneider a kol., J. Exp. Med., 189: 1747-56, 1999), TALL-1 (Shu a kol., J. Leukoc. Biol. 65: 680-3, 1999) nebo THANK (Mukhopadhyay a kol., J. Biol. Chem. 274: 1597881, 1999), na N-konci nebo na C-konci označených pomocí FLAG, biotinu nebo FITC. Pozitivní soubory byly určovány pomocí vazby ligandů, poté byly rozděleny na jednotlivé klony, z nich byla izolována cDNA a ta sekvenována. Porovnání odvozené aminokyselinové sekvence BR43x2 (uvedené v sekvenci SEQ ID NO: 2) se známými receptory faktoru nádorové nekrózy ukázalo, že BR43x2 je isoformou TACÍ, která obsahuje jedno, špatně zachované nedokonalé opakování, bohaté na cystein.

Strukturálně je rodina TNF receptoru charakterizována extracelulární částí, složenou z několika modulů, které jsou z historických důvodů nazývány „na cystein bohatá, nedokonalá opakování“. Prototypový člen rodiny TNFR má čtyři tato nedokonalá opakování, každé asi 29 až 43 zbytků dlouhé, uspořádané přímo jedno za druhým. Typické nedokonalé opakování má 6 cysteinových zbytků. Jsou nazývány jako nedokonalá opakování, protože se zdá, že pocházejí ze společného původního modulu, ten však není opakován přesně: nedokonalá opakování #1, #2, #3 a #4 mají ·· · · «· · · ·«· · · · » · « · » · ·· · · · * »· · · · · · · · charakteristické sekvenční rysy, které je odlišují jedno od druhého. Při zkoumání krystalové struktury TNF receptoru p55 bylo zjištěno, že každé nedokonalé opakování odpovídá jedné prostorově uspořádané doméně a že všechna čtyři nedokonalá opakování jsou uspořádána do téže terciální struktury, která vnitřně drží pohromadě pomocí disulfidových vazeb.

TACÍ obsahuje dvě nedokonalé opakování bohatá na cystein (von Bůlow a Bram, Science 228? 138-41, 1997), z nichž první je konzervováno ve struktuře i jiných členů rodiny TNF receptorů a druhé je konzervováno méně. Isoforma BR43x2, která je předmětem tohoto vynálezu, postrádá první na cystein bohaté nedokonalé opakování TACÍ, obsahuje pouze druhé, méně konzervované nedokonalé opakování.

Sekvenční analýza odvozené aminokyselinové sekvence BR43x2, jak je představena v sekvenci SEQ ID NO: 2 ukazuje přítomnost zralého proteinu, který má extracelulární doménu (zbytky 1 až 120 v SEQ ID NO: 2), která obsahuje jedno nedokonalé opakování bohaté na cystein (zbytky 25 až 58 v SEQ ID NO: 2), transmembránovou doménu (zbytky 121 až 133 v SEQ ID NO: 2) a cytoplazmatickou doménu (zbytky 134 až 247 v SEQ ID NO: 2). Nedokonalé opakování bohaté na cystein v BR43x2 obsahuje 6 cysteinových zbytků (zbytky 25, 40, 43, 47, 54 a 58 v SEQ ID NO: 2), konzervovaný zbytek kyseliny asparagové (zbytek 34 v SEQ ID NO: 2) a dva konzervované leucinové zbytky (zbytky 36 až 37 v SEQ ID NO: 2) a sdílí 46% shodu s prvním nedokonalým opakováním bohatým na cystein v TACÍ (SEQ ID NO: 6) a 35% shodu s prvním nedokonalým opakováním bohatým na cystein v BCMA (SEQ ID NO: 8; obrázek 1). Nedokonalé opakování bohaté na cystein může být představeno následujícím motivem:

CX[QEK] [QEKNRDHS] [QE] X {0-2} [YFW] [YFWJ DXLLX {2} C [IMLV] XCX {3} CX {68} CX {2} [YF] C (SEQ ID NO: 10),

Kde C představuje zbytek aminokyseliny cysteinu, Q představuje zbytek aminokyseliny glutaminu, E představuje zbytek aminokyseliny kyseliny glutamové, K představuje zbytek aminokyseliny lyzinu, N představuje zbytek aminokyseliny asparaginu, R představuje zbytek aminokyseliny argininu, D představuje zbytek kyseliny asparagové, H představuje zbytek aminokyseliny histidinu, S představuje zbytek aminokyseliny šeřinu, Y představuje zbytek aminokyseliny tyrozinu, F představuje zbytek aminokyseliny fenylalaninu, W představuje zbytek aminokyseliny tryptofanu, L představuje zbytek aminokyseliny leucinu, I představuje zbytek ··· ·4«· 4 · · «· «««· >« ·* < · * · · aminokyseliny isoleucinu, V představuje zbytek aminokyseliny valinu a X představuje jakýkoli přirozeně se vyskytující zbytek aminokyseliny, kromě cysteinu. Aminokyselinové zbytky v hranatých závorkách „[ ]“ označují povolenou variabilitu aminokyselinových zbytků na této pozici. Číslo ve svorkách „{ }“ označuje počet aminokyselinových zbytků, povolených na této pozici.

Předložený vynález také poskytuje rozpustné polypeptidy dlouhé od 32 do 40 aminokyselinových zbytků, jak jsou uvedeny v SEQ ID NO: 10.

Rozpustný receptor BR43x2, jak je představován zbytky 1 až 120 v sekvenci SEQ ID NO: 4, obsahuje jedno nedokonalé opakování bohaté na cystein (zbytky 25 až 58 v sekvenci SEQ ID NO: 4) a postrádá transmembránovou a cytoplazmatickou doménu z BR43x2, jak je popsáno v sekvenci SEQ ID NO: 2.

Osobám se zkušeností v oboru bude zřejmé, že tato rozhraní mezi doménami jsou přibližná a jsou založena na porovnávání se známými proteiny a na předpovědích prostorového uspořádání proteinů. Tyto rysy ukazují na to, že receptor kódovaný DNA sekvencemi SEQ ID NO: 1a SEQ ID NO: 3 je členem rodiny TFN receptorů.

Pomocí metod Northern blot a Dot blot byla provedena analýza tkáňové distribuce mRNA, odpovídající nukleotidovým sondám, které byly navrženy pro detekci exprese BR43x2, ukázala expresi ve slezině, lymfatických uzlinách, buňkách CD19+, slabou expresi v buňkách smíšených reagujících lymfocytů, buňkách Daudi a Ráji. Pomocí PCR provedené s reverzní transkriptázou byl BR43x2 detekován pouze v B buňkách a nikoli v aktivovaných T buňkách, jak bylo zjištěno pro TACÍ (von Bůlow a Bram, Science 228: 138-41, 1997). Při použití BR43x2 sondy, která se 100% překrývá s odpovídající sekvencí TACÍ, TACÍ a BR43x2 byly detekovány ve slezině, lymfatických uzlinách a tenkém střevě, žaludku, slinných žlázách, slepém střevě, plících, kostním morku, slezině plodu, buňkách CD 19⁺ a buňkách Ráji.

Pomocí metody Northern blot byl BCMA detekován v tenkém střevě, slezině, žaludku, tlustém střevě, slepém střevě, lymfatických uzlinách, průdušnici a varlatech. BCMA byl také detekován v adenolymfomu, lymfomu ne-Hodgkinova typu a příušním nádoru, slabě byl detekován v CD 8⁺, CD 19⁺, buňkách MLR, Daudi, Ráji a buňkách Hut 78.

Byla také provedena analýza Northern blot za použití myšího ztnf4 (SEQ ID NO: 19) a stejně jako u lidských TACÍ, BCMA a BR43x2, exprese myšího ztnf4 byla detekována převážně ve slezině a brzlíku. Myší ztnf4 byl také exprimován v plících a slabá exprese byla detekována v kůži a srdci.

Předložený vynález také poskytuje polynukleotidové molekuly, počítaje v to DNA a RNA molekuly, které kódují zde popisované BR43x2 polypeptidy. Osoby se zkušeností v oboru snadno rozpoznají, že z důvodu degenerace genetického kódu, je mezi těmito polynukleotidovými molekulami možná značná variabilita. SEQ ID NO: 11 je degenerovaná DNA sekvence, která v sobě zahrnuje všechny DNA, které kódují rozpustný polypeptid BR43x2 se sekvencí SEQ ID NO: 4. Podobně sekvence SEQ ID NO: 12 je degenerovaná DNA sekvence, která v sobě zahrnuje všechny DNA, které kódují polypeptid BR43x2 se sekvencí SEQ ID NO: 2. Osoby se zkušeností v oboru snadno rozpoznají, že degenerovaná sekvence SEQ ID NO: 12 také poskytuje všechny RNA sekvence kódující SEQ ID NO: 4, pouze je zaměněno U za T. Tedy za předmět předloženého vynálezu jsou považovány polynukleotidy, které obsahují nukleotidy 1 až 360 ze sekvence SEQ ID NO: 11, nukleotidy 1 až 741 ze sekvence SEQ ID NO: 12 a jejich RNA ekvivalenty, které kódují polypeptid BR43x2. Tabulka 1 uvádí jednopísmenové kódy používané v sekvencích SEQ ID NO: 11 a SEQ ID NO: 12 pro označení degenerovaných pozic nukleotidů. „Rozlišení“ jsou nukleotidy označené kódovým písmenem. „Komplement“ uvádí kód pro komplementární nukleotid (nukleotidy). Například kód Y označuje buď C nebo T, a jeho komplement R označuje buď A nebo G, přičemž A je komplementární k T a G je komplementární k C.

	14 Tabulka 1	• · ·· • · · · · • · ♦ · • · · · · • · · · • · · · · ·
Nukleotid	Rozlišení	Komplement	Rozlišení
A	A	T	T
C	C	G	G
G	G	C	C
T	T	A	A
R	A|G	Y	C |T
Y	C|T	R	A|G
M	A| C	K	G|T
K	G|T	M	A|C
S	C | G	S	C|G
W	A|T	W	A|T
H	A|C|T	D	A|G|T
B	C|G|T	V	A|C|G
V	A|C|G	B	C|G|T
D	A|G|T	H	A|C|T
N	A|C|G|T	N	A|C|G|T

Degenerované kodony použité v sekvenci SEQ ID NO: 11a SEQ ID NO: 12 zahrnující všechny možné kodony pro danou aminokyselinu, jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Amino kyselina	Jedno písmenový kód	Kodony	Degenerovaný kodon
Cys	C	TGC TGT	TGY
Ser	S	AGC AGT TCA TCC TCG TCT	WSN
Thr	T	ACA ACC ACG ACT	ACN
Pro	P	CCA CCC CCG CCT	CCN
Ala	A	GCA GCC GCG GCT	GCN
Gly	G	GGA GGC GGG GGT	GGN
Asn	N	AAC AAT	AAY
Asp	D	GAC GAT	GAY
Glu	E	GAA GAG	GAR
Gin	Q	CAA CAG	CAR
His	H	CAC CAT	CAY
Arg	R	AGA AGG CGA CGC CGG CGT	MGN
Lys	K	AAA AAG	AAR
Met	M	ATG	ATG
Ile	I	ATA ATC ATT	ATH
Leu	L	CTA CTC CTG CTT TTA TTG	YTN
Val	V	GTA GTC GTG GTT	GTN
Phe	F	TTC TTT	TTY
Tyr	Y	TAC TAT	TAY
Trp	w	TGG	TGG
Ter	•	TAA TAG TGA	TRR
Asn | Asp	B		RAY
Glu | Gin	Z		SAR
jakákoli	X		NNN

• η

Osoba s běžnou zkušeností v oboru si bude vědoma, že při určení degenerovaného kodonu, reprezentujícího všechny možné kodony kódující každou aminokyselinu, je vnášena jakási neurčitost. Například degenerovaný kodon pro serin (WSN) může za některých okolností kódovat arginin (AGR), a degenerovaný kodon pro arginin (MGN) může za některých okolností kódovat serin (AGY). Podobný vztah existuje mezi kodony kódujícími fenylalanin a leucin. Tedy některé polynukleotidy zahrnuté v degenerované sekvenci mohou kódovat variantní aminokyselinové sekvence, ale osoba s běžnou zkušeností v oboru může snadno takové variantní sekvence určit s odkazem na aminokyselinové sekvence v SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 4. U variantních sekvencí může být, jak je zde popsáno, snadno testována jejich funkčnost.

Osoba s běžnou zkušeností v oboru si také bude vědoma, že různé druhy mohou vykazovat „preferenční užívání kodonů“. Obecně viz Grantham a kol., Nuc. Acids Res. 8: 1893-912, 1980; Haas a kol., Curr. Biol. 6: 315-24, 1996; Wain-Hobson a kol., Gene 13: 355-64, 1981; Grosjean a Fiers, Gene 18; 199-209, 1982; Holm, Nuc. Acids Res. 14: 3075-87, 1986; lkemura, J. Mol. Biol. 158: 573-97, 1982. Zde používané termíny „preferenční užívání kodonů“ nebo „preferované kodony“ jsou termíny z oboru, které označují translační kodony proteinu, které jsou nejčastěji používány v buňkách určitých druhů, které tak dávají přednost jednomu nebo několika reprezentantům z možných kodonů, kódujících každou aminokyselinu (viz tabulka 2). Například aminokyselina threonin (Thr) může být kódována ACA, ACC, ACG nebo ACT, ale v savčích buňkách je nejběžněji používaným kodonem ACC; v jiných druzích, například v buňkách hmyzu, kvasinkách, virech nebo bakteriích mohou být přednostně používány odlišné kodony pro Thr. Preferované kodony pro určité druhy mohou být vneseny do polynukleotidů předloženého vynálezu pomocí různých metod v oboru známých. Vnesení sekvencí preferovaných kodonů do rekombinantní DNA může například zvýšit produkci proteinu tím, že učiní translaci proteinu v buňce určitého typu, nebo v určitém druhu, účinnější. Proto sekvence degenerovaných kodonů, uvedené v sekvencích SEQ ID NO: 11 a 12, slouží jako matrice pro optimalizaci exprese polynukleotidů v buňkách různých typů a druhů, které jsou v oboru obecně používány a zde popisovány. Sekvence obsahující preferované kodony mohou být testovány a optimalizovány pro expresi v různých druzích, a testovány na svoji funkčnost tak, jak je zde popsáno.

• ·

Vysoce konzervované aminokyseliny nedokonalých opakování bohatých na cystein v BR43x2, mohou být použity jako nástroj pro identifikaci nových členů rodiny. Například polymerázová řetězová reakce provedená pomocí reverzní transkriptázy (RT-PCR), může být použita pro namnožení sekvencí kódujících výše popsanou extracelulární doménu, která váže ligand, z RNA získaných z různých tkáňových zdrojů nebo z buněčných linií. Zvláště užitečné pro tento účel jsou vysoce degenerované primery, navržené podle sekvencí BR43x2.

Ve výhodném provedení vynálezu budou izolované polynukleotidy hybridizovat s podobně velikými oblastmi sekvence SEQ ID NO: 3 nebo sekvence k ní komplementární, za přísných hybridizačních podmínek. Obecně jsou přísné hybridizační podmínky vybírány tak, aby teplota byla asi 5 °C nižší než je teplota tání (T_m) specifické sekvence při definované iontové síle a pH. T_m je teplota (za definované iontové síly a pH) při které 50 % cílové sekvence hybridizuje s přesně se shodující sondou. Typické přísné hybridizační podmínky jsou takové, kdy koncentrace soli je asi 0,03 M, pH je 7 a teplota je alespoň 60 °C.

Jak bylo dříve zmíněno, izolované polynukleotidy předloženého vynálezu zahrnují DNA a RNA. Metody pro izolaci DNA a RNA jsou v oboru dobře známé. Obecně je dávána přednost izolaci RNA z buněk RPMI 1788, PBMNC, klidových nebo aktivovaných transfekovaných B buněk nebo z tkáně mandlí, třebaže DNA může být také připravena za použití RNA z jiných tkání nebo izolována jako genomová DNA. Celková RNA může být připravena extrakcí pomocí guanidin HCI, následovanou izolací pomocí centrifugace v gradientu CsCI (Chirgwin a kol., Biochemistry 18: 52-94, 1979). Póly (A)⁺ RNA je připravena z celkové RNA pomocí metody Aviva a Ledera (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69: 1408-1, 1972). Komplementární DNA (cDNA) je připravena z póly (A)⁺ RNA pomocí známých metod. Polynukleotidy kódující polypeptidy BR43x2 jsou potom identifikovány a izolovány, například pomocí hybridizace nebo PCR.

Osoby se zkušeností v oboru budou vědomi toho, že sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1 a 3 představují jednu alelu lidského genu, a že je možno očekávat, že se uplatní alelová variabilita a alternativní sestřih. Alelové varianty DNA sekvencí uvedené v SEQ ID NO: 1 a 3, včetně těch, které obsahují tiché mutace a těch, ve kterých mají mutace za následek změny v aminokyselinové sekvenci, jsou v rámci rozsahu předloženého vynálezu, stejně tak proteiny, které jsou alelovými variantami SEQ ID NO: 2 a 4. Alelové varianty a sestřihové varianty těchto sekvencí mohou být klonovány • · pomocí sondování cDNA nebo genomových knihoven z různých jedinců nebo tkání podle standardních postupů, známých v oboru.

Předložený vynález také poskytuje izolované polypeptidy BR43x2, které jsou v podstatě homologické s polypeptidy sekvencí SEQ ID NO: 2 a 4 a jejich druhovými ortology. Termín „v podstatě homologický“ je zde použit pro označení polypeptidů, které mají 50%, s výhodou 60% a ještě výhodněji alespoň 80% sekvenční shodu se sekvencemi uvedenými v SEQ ID NO: 2 a 4 nebo jejich ortology. Takové polypeptidy budou s výhodou alespoň z 90 % shodné a nejvýhodnější bude, když budou z 95 % nebo více shodné se sekvencemi uvedenými v SEQ ID NO: 2 a 4 nebo jejich ortology. Procento sekvenční shody je určováno běžnými metodami. Viz například Altschul a kol., Bull. Math. Bio. 48: 603-66, 1986 a Henikoff a Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-9, 1992. Krátce řečeno, dvě aminokyselinové sekvence jsou porovnány a skóre porovnání optimalizováno pomocí penalizace 10 za otevření mezery, penalizace 1 za rozšíření mezery a hodnotící matrice „blosum 62“ podle Henikoff a Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-9, 1992, jak je uvedeno v tabulce 3 (aminokyseliny jsou označovány standardními jednopísmenovými kódy). Procento shody je potom vypočteno jako:

celkový počet shod__________________________x 100 (délka delší sekvence plus počet mezer zavedených do delší sekvence, aby byly obě sekvence srovnány) • ·

3·

>	r- T
	CM °?
H	tD O

co i

CM

CM i

Q_

CO i

CM

LL

Tabulka 3

T- CO

I I

CM

I

CM i

I

I

CO

CO CO I I

V- CM I I

CM

I

CM

CM

CM

CO

I

0

CD

CM

1

1

Ol t

CO 1

cp

04

O

Ol 1

CM 1

co 1

CO 1

LU

CO

CM

O

co

co 1

V“

04

co

V“

O

1

cp

CM

CM

a

to

CM

CM

O

co

04

O

co 1

V

O

τι

CM 1

V

CM

o

CD

co 1

1

CO 1

CO 1

v

t

co 1

1

CM 1

co 1

τι

1

CM 1

CM 1

1

Q

co

CO 1

o

CM

1

T

co 1

xr 1

1

CO !

co 1

1

o

1

1

cp

co 1

z

CO

-

CO 1

o

O

o

-

CO 1

co 1

O

Ol 1

CO

Ol l

-

o

1

CM 1

CO t

CÉ

to

o

CM

CO 1

-

O

Ol 1

o

CO 1

Ol 1

Ol

1

cp

Ol 1

1

1

co 1

CM

C?

<

T“

CM

CM 1

O

v

1

O

CM

T

1

v— 1

T“

CM

T

-

O

cp

CM 1

o

<

ai

Z

Q

O

a

LU

0

T

—1

LL

CL

ω

H

>-

>

• · ··· ·· ··· · · • · ···· ·· ··

Sekvenční shoda polynukleotidových molekul je určována podobnými metodami za pomoci zlomku, který byl výše popsán.

V podstatě homologické proteiny a polypeptidy jsou charakterizovány tím, že mají jednu nebo více aminokyselinových substitucí, delecí nebo adicí. Je výhodné, když jsou tyto změny v podstatě malé, tedy když se jedná o konzervativní aminokyselinové substituce (viz tabulka 4) a jiné substituce, které neovlivní významně prostorové uspořádání nebo aktivitu proteinu nebo polypeptidu; malé delece, typicky jedna na asi 30 aminokyselin; a malá prodloužení na aminovém nebo karboxylovém konci, jako je metioninový zbytek na aminovém konci, malý spojovací peptid až asi do 20 až 25 zbytků, nebo afinitní značka. Polypeptidy obsahující afinitní značky mohou dále obsahovat proteolytické štěpné místo mezi polypeptidem BR43x2 a afinitní značkou. Výhodná místa tohoto druhu zahrnují štěpná místa pro thrombin a štěpná místa faktoru

Xa.	Tabulka 4 Konzervativní aminokyselinové substituce
Zásadité:	arginin lyzin histidin
Kyselé:	kyselina glutamová kyselina asparagová
Polární:	glutamin asparagin
Hydrofobní:	leucin izoleucin valin
Aromatické:	fenylalanin tryptofan tyrozin
Malé:	glycin alanin serin threonin metionin

Vedle 20 standardních aminokyselin, mohou být za aminokyselinové zbytky polypeptidů BR43x2, které jsou předmětem tohoto vynálezu, substituovány nestandardní aminokyseliny (jako jsou 4-hydroxyprolin, 6-N-methyllyzin, kyselina 2-aminoisomáselná, isovalin a a-methylserin). Omezené množství nekonzervativních aminokyselin, aminokyselin, které nejsou kódovány genetickým kódem a nepřirozených aminokyselin může být substituováno za aminokyselinové zbytky BR43x2. Proteiny předloženého vynálezu mohou také obsahovat v přírodě se nevyskytující aminokyselinové zbytky.

Mezi tyto přirozeně se nevyskytující aminokyseliny patří mimo jiné trans-3methylprolin, 2,4-methanoprolin, cis-4-hydroxyprolin, trans-4-hydroxyprolin, Nmethylglycin, allo-threonin, methylthreonin, hydroxyethylcystein, hydroxyethylhomocystein, nitroglutamin, homoglutamin, kyselina pipekolová, kyselina thiazolidinkarboxylová, dehydroprolin, 3- a 4-methylprolin, 3,3-dimethylprolin, tercleucin, norvalin, 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4-azafenylalanin a 4fluorofenylalanin. V oboru je známo několik metod pro zabudování těchto přirozeně se nevyskytujících aminokyselin do proteinů. Například může být použit in vitro systém, kde jsou nonsense mutace potlačeny pomocí supresorových tRNA, které byly připraveny chemickou aminoacylací. Metody pro syntézu aminokyselin a aminoacylaci tRNA jsou v oboru známé. Transkripce a translace plazmidů, obsahujících nonsense mutace se provádí v bezbuněčných systémech, které obsahují extrakt E. coli S30 a komerčně dostupné enzymy a další reagencie. Proteiny jsou purifikovány pomocí chromatografie. Viz například Robertson a kol., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722, 1991; Ellman a kol., Methods Enzymol. 202: 301, 1991; Chung a kol., Science 259: 806-9, 1993; a Chung a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 10 145-9,1993). Ve druhé metodě je translace provedena v oocytech Xenopus a mutovaná mRNA spolu s aminoacylovanými supresorovými tRNA je do nich vpravena pomocí mikroinjekce (Turcatti a kol., J. Biol. Chem. 271: 19 991-8, 1996). Ve třetí metodě jsou buňky E. coli pěstovány v nepřítomnosti přirozené aminokyseliny, která má být zaměněna (např. fenylalanin) a naopak v přítomnosti požadované, přirozeně se nevyskytující aminokyseliny (aminokyselin) (např. 2-azafenylalanin, 3-azafenylalanin, 4azafenylalanin a 4-fluorofenylalanin). Přirozeně se nevyskytující aminokyselina je zabudována do proteinu na místo svého přirozeného partnera. Viz Koide a kol., Biochem. 33: 7470-7476, 1994. Přirozeně se vyskytující aminokyselinové zbytky mohou být převedeny na přirozeně se nevyskytující druhy pomocí chemické modifikace in vitro. Aby se dále rozšířil rozsah substitučních možností, může být chemická modifikace kombinována s místně cílenou mutagenezí (Wynn a Richards, Protein Sci. 2: 395-403, 1993).

Omezený počet nekonzervativních aminokyselin, aminokyseliny, které nejsou kódovány genetickým kódem, přirozeně se nevyskytující aminokyseliny a nepřirozené aminokyseliny mohou být substituovány za aminokyselinové zbytky BR43x2.

Podstatné aminokyseliny v polypeptidech BR43x2 předloženého vynálezu je možno zjistit pomocí postupů v oboru známých, jako je místně cílená mutageneze nebo mutageneze pomocí skenování alaninem (Cunningham a Wells, Science 244: 1081-5, 1989). Jednotlivé alaninové mutace jsou vneseny na místo každého zbytku v molekule a výsledné mutované molekuly jsou testovány na svou biologickou aktivitu (např. způsobení snížení odpovědi B buněk v průběhu imunitní odpovědi, potlačení nebo snížení produkce autoprotilátek), aby byly určeny aminokyselinové zbytky, které jsou pro aktivitu molekuly kritické. Viz též Hilton a kol., J. Biol. Chem. 271: 4699-4708, 1996. Místa kde dochází k biologické interakci, oblasti které vážou ligand, jako jsou nedokonalá opakování bohatá na cystein, mohou být také určována pomocí analýzy fyzikální struktury, jako jsou techniky nukleární magnetická rezonance, krystalografie, elektronová difrakce nebo fotoafinitní značení, ve spojení s mutací aminokyselin na domnělém kontaktním místě. Viz například de Vos a kol., Science 255: 306-312, 1992; Smith a kol., J. Mol. Biol. 224: 899-904, 1992; Wlodaver a kol., FEBS Lett. 309: 59-64, 1992. Totožnost podstatných aminokyselin může být také odvozena z analýzy homologii s příbuznými členy rodiny TNFR, jako jsou TACÍ a BCMA.

Další aminokyselinové substituce mohou být prováděny uvnitř nedokonalých opakování bohatých na cystein u BR43x2, pokud konzervované zbytky cysteinu, kyseliny asparagové a leucinu jsou zachovány a struktura vyššího řádu není poškozena. Je výhodné provádět substituce uvnitř nedokonalých opakování bohatých na cystein u BR43x2 s tím, že se vezmou v úvahu sekvence jiných na cystein bohatých nedokonalých opakování. Sekvence SEQ ID NO: 10 je zobecněné nedokonalé opakování bohaté na cystein, kde jsou ukázány povolené aminokyselinové substituce, založené na takovém porovnání. Substituce v této doméně podléhají omezením, která jsou zde uvedena.

• · · · · · · • · · · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · • · ·· · · · ♦ 1

Mnoho aminokyselinových substitucí může být provedeno a testováno pomocí známých metod mutageneze a hromadného prohledávání, jak jsou například popsány v Reidhaar-Olson a Sauer (Science 241: 53-7, 1988) nebo Bowie a Sauer (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 2152-6, 1989). Krátce řečeno, tito autoři popisují metody pro současné náhodné obsazení dvou nebo více pozic v polypeptidu, selekci funkčního polypeptidu a potom sekvenování mutovaných polypeptidů, pro určení spektra přípustných mutací na každé pozici. Jiné metody, které mohou být použity, zahrnují reprezentaci pomocí fága (např. Lowman a kol., Biochem. 30: 10 832-10 837, 1991; Ladner a kol., patent US 5 223 409; Huse, publikace WIPO WO 92/06 204) a mutageneze cílená do určité oblasti (Derbyshire a kol., Gene 46: 145, 1986; Ner a kol., DNA 7: 127,1988).

Varianty popsaných BR43x2 DNA a polypeptidových sekvencí mohou být vytvořeny pomocí promíchávání DNA, jak bylo popsáno v Stemmer, Nátuře 370: 38991, 1994, Stemmer, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 10 747-51, 1994 a publikaci WIPO WO 97/20 078. Krátce řečeno, variantní DNA jsou vytvořeny in vitro homologickou rekombinací pomocí náhodné fragmentace rodičovské DNA, po které následuje opětné uspořádání pomocí PCR, což má za následek náhodně vnesené bodové mutace. Tato technika může být modifikována za použití rodiny rodičovských DNA, jako jsou alelové varianty nebo DNA z různých druhů, aby byla do procesu vnesena další variabilita. Selekce nebo testování na požadovanou aktivitu, následované dalšími opakováními mutageneze a testování, umožňuje rychlou evoluci sekvencí vybíráním požadovaných mutací, přičemž současné dochází k selekci proti nežádoucím změnám.

Metody mutageneze, které jsou zde výše popsány, mohou být spojeny s vysokou průchodností vzorků, automatizací prohledávacích metod při detekci aktivity klonovaných, mutovaných polypeptidů v hostitelských buňkách. Mutované DNA molekuly, které kódují aktivní polypeptidy (tj. takové, které způsobí snížení odpovědi B buněk v průběhu imunitní odpovědi, potlačení nebo snížení produkce autoprotilátek), mohou být z hostitelské buňky získány a rychle sekvenovány pomocí moderních zařízení. Tyto metody umožňují rychlé určení důležitosti jednotlivých aminokyselinových zbytků ve sledovaném polypeptidu a mohou být aplikovány na polypeptidy neznámé struktury.

Pomocí výše diskutovaných metod může osoba se zkušeností v oboru identifikovat a/nebo připravit množství rozmanitých polypeptidů, které jsou v podstatě • · homologické se zbytky 1 až 120 ze sekvence SEQ ID NO: 2 nebo jejich alelové varianty a přitom zachovat supresorické vlastnosti standardního typu proteinu vůči B buňkám. Takové polypeptidy mohou obsahovat další aminokyseliny nebo domény z jiných členů vyšší rodiny receptorů faktoru nádorové nekrózy, afinitní značky nebo podobně. Polypeptidy BR43x2 nebo fúzní konstrukty, obsahující funkční domény jiných členů TNFR vyšší rodiny, tvoří hybridní receptory faktoru nádorové nekrózy, které vykazují pozměněné schopnosti suprimovat B buňky.

Předložený vynález dále poskytuje funkční protějšky receptorů a polynukleotidů z jiných druhů (ortology). Tyto druhy zahrnují mimo jiné savce, ptáky, obojživelníky, plazy, ryby, hmyz a jiné druhy obratlovců a bezobratlých. Zvláště zajímavé jsou receptory BR43x2 z jiných savčích druhů, včetně myších, vepřových, ovčích, hovězích, psích, kočičích, koňských a receptorů jiných primátů. Ortology lidského receptoru BR43x2 mohou být klonovány za použití informace a prostředků poskytnutých předloženým vynálezem ve spojení s běžnými klonovacími technikami. Například cDNA může být klonována za použití mRNA, získané ze tkáně nebo typu buňky, která receptor exprimuje. Vhodné zdroje mRNA mohou být určeny sondováním Northern blotů pomocí sond, navržených podle zde popsaných sekvencí. Z mRNA pozitivní tkáně nebo buněčné linie je potom připravena knihovna. cDNA kódující receptor může být potom izolována různými metodami, jako je sondování kompletní nebo částečné lidské cDNA pomocí jednoho nebo více souborů degenerovaných sond, založených na popsaných sekvencích. cDNA může být také klonována pomocí PCR, za použití primerů navržených podle zde popsaných sekvencí. V rámci dalších metod může být cDNA knihovna použita pro transformaci nebo transfekci hostitelských buněk a exprese cDNA o kterou se jedná, může být detekována pomocí protilátek proti receptoru. Podobné techniky mohou být také aplikovány na izolaci genomových klonů.

Polypeptidy receptoru, které jsou předmětem tohoto vynálezu, včetně receptorových polypeptidů o plné délce, fragmentů polypeptidů a fúzních polypeptidů, mohou být produkovány v geneticky upravených hostitelských buňkách pomocí běžně užívaných technik. Vhodnými hostitelskými buňkami jsou takové typy buněk, které mohou být transformovány nebo transfekovány exogenní DNA a pěstovány v kultuře a patří mezi ně bakterie, buňky hub a kultivované buňky vyšších eukaryot. Výhodné jsou eukaryotické buňky, zvláště kultivované buňky mnohobuněčných organizmů. Techniky pro manipulaci s molekulami klonované DNA a vnesení exogenní DNA do rozličných • · hostitelských buněk jsou popsány v Sambrook a kol., Molekulární klonování: Laboratorní příručka, 2. vyd., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) a Ausubel a kol., vyd., Současné protokoly v molekulární biologii, John Wiley and Sons, lne., NY, 1987.

Obecně řečeno, sekvence DNA kódující polypeptid BR43x2 je operačně vázána k jiným genetickým elementům, vyžadovaným pro její expresi v expresním vektoru, obecně se jedná o transkripční promotor a terminátor. Vektor bude také obecně obsahovat jeden nebo více selekčních markérů a jeden nebo více počátků replikace, třebaže osoby se zkušeností v oboru si uvědomí, že v určitých systémech mohou být selekční markéry poskytnuty na oddělených vektorech a replikace vnější DNA může být zabezpečena integrací do genomu hostitelské buňky. Výběr promotorů, terminátorů, selekčních markérů, vektorů a jiných elementů je záležitostí návrhu v rámci běžné zkušenosti v oboru. Mnoho takových elementů je popsáno v literatuře a je dostupných od komerčních dodavatelů.

Pro nasměrování polypeptidu BR43x2 do sekreční dráhy hostitelské buňky je v expresním vektoru poskytnuta sekreční signální sekvence (také známá jako signální sekvence, leader sekvence, prepro sekvence nebo pre sekvence). Sekreční signální sekvence může pocházet z polypeptidu BR43x2, nebo může být odvozena z jiného sekretovaného proteinu (např. t-PA) nebo může být syntetizována de novo. Sekreční signální sekvence je připojena k DNA sekvenci BR43x2 ve správném čtecím rámci a umístěny tak, aby řídily nové syntetizovaný polypeptid do sekreční dráhy hostitelské buňky. Sekreční signální sekvence jsou obecně umístěny ve směru 5' vzhledem k DNA sekvenci, kódující polypeptid o který se jedná, třebaže určité sekreční signální sekvence mohou být umístěny jinde v DNA sekvenci o kterou se jedná (viz např. Welch a kol., patent US 5 037 743; Holland a kol., patent US 5 143 830).

V předloženém vynálezu jsou kultivované savčí buňky vhodnými hostiteli. Metody pro vnesení exogenní DNA do savčí hostitelské buňky zahrnují transfekci zprostředkovanou fosforečnanem vápenatým (Wigler a kol., Cell 14: 725, 1978; Corsaro a Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981; Graham a Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), elektroporaci (Neumann a kol., EMBO J. 1: 841-845, 1982), transfekci zprostředkovanou DEAE-dextranem (Ausubel a kol., vyd., Současné protokoly v molekulární biologii, John Wiley and Sons, lne., NY, 1987) a transfekci zprostředkovanou liposomy (Hawley-Nelson a kol., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone a kol., Focus 15: 80, 1993). Produkce rekombinantních polypeptidů v kultivovaných savčích buňkách je popsána například v Levinson a kol., patent US 4 713 339; Hagen a kol., patent US 4 784 950; Palmiter a kol., patent US 4 579 821 a Ringold a kol., patent US 4 656 950. Vhodné kultivované savčí buňky zahrnují buněčné linie COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10 314), 293 (ATCC No. CRL 1573); Graham a kol., J. Gen. Virol. 36: 59-72, 1977), Jurkat (ATCC No. CRL-8129), BF3 (prelymfoidní buněčná linie, závislá na interleukinu-3, odvozená z kostního morku myši. Viz Palacios a Steimetz, Cell 42: 727-34, 1985; Matchey-Prevot a kol., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-5, 1986) a buněčnou linii odvozenou z vaječníků čínského křečka (např. CHO-K1; (ATCC No. CCL 61). V oboru jsou známy další vhodné buněčné linie a jsou dostupné ve veřejných sbírkách, jako je americká sbírka typových kultur, Rockville, Maryland. Obecně jsou preferovány silné transkripční promotory, jako jsou promotory z SV40 nebo cytomegaloviru. Viz např. patent US 4 956 288. Jiné vhodné promotory zahrnují promotory z metallothioneinových genů (patenty US 4 579 821 a 4 601 978) a velký pozdní promotor adenovirů.

Selekce pomocí léků se obecně používá pro selekci těch kultivovaných savčích buněk, do nichž byla vložena cizí DNA. Takové buňky jsou obecně označovány jako transfekované. Buňky, které byly kultivovány v přítomnosti selekčního činidla a jsou schopny přenést gen o který se jedná, do svého potomstva, jsou označovány jako stabilně transfekované. Výhodným selekčním markérem je gen kódující rezistenci k antibiotiku neomycin. Selekce je provedena v přítomnosti léku neomycinového typu, jako je G-418 nebo podobně. Selekční systémy je možno také použít pro zvýšení expresní hladiny genu o který se jedná, v procesu nazývaném amplifikace. Amplifikace je provedena pěstováním transfekovaných buněk v přítomnosti nízkých hladin selekčního činidla a poté zvýšením množství selekčního činidla, aby došlo k selekci buněk, které produkují vysoké úrovně produktů vnesených genů. Výhodným amplifikačním selekčním markérem je reduktáza kyseliny dihydrolistové, která způsobuje rezistenci k methotrexátu. Také mohou být použity jiné geny rezistence k lékům (např. rezistence k hygromycinu, rezistence k více lékům, acetyltransferáza puromycinu). Alternativní markéry, které navozují změněný fenotyp, jako je zelený fluoreskující protein, nebo proteiny buněčného povrchu jako CD4, CD8, MHO třídy I, alkalická fosfatáza z placenty, mohou být použity pro roztřídění transfekovaných buněk od netransfekovaných, takovými způsoby jako separační technologie FACS nebo pomocí magnetických zrnek.

Jako hostitelské buňky mohou být také použity buňky jiných vyšších eukaryot, včetně rostlinných buněk, hmyzích buněk a ptačích buněk. Použití Agrobacterium rhizogenes jako vektoru pro expresi genů v rostlinných buňkách bylo přehledně zpracováno v Sinkar a kol., J. Biosci. (Bangalore) 11: 47-58, 1987. Transformace hmyzích buněk a produkce cizích polypeptidů v nich je popsána v Guarino a kol., patent US 5 162 222 a v publikaci WIPO WO 94/06 463. Hmyzí buňky mohou být infikovány rekombinantním bakulovirem, obecné odvozeným z viru nukleární polyhedrózy Autographa californica (AcNPV). Viz King a Possee, The Baculovirus Expression Systém: A Laboratory Guide, London, Chapman & Halí; O'Reilly a kol., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; a Richardson, vyd. Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Druhá metoda přípravy rekombinantního BR43x2 bakuloviru využívá systém založený na transpozonu a popsaný Luckowem (Luckow a kol., J. Virol. 67: 4566-79, 1993). Tento systém, který využívá přenášecí vektory, je prodáván v soupravě Bac-to-Bac™ (Life Technologies, Rockville, MD). Tento systém využívá přenášecí vektor pFastBad™ (Life Technologies), obsahující transpozon Tn7, aby přenesl DNA kódující polypeptid BR43x2 do genomu bakuloviru, který je udržován v E. coli jako velký plazmid nazývaný bacmid. Viz Hill-Perkins a Possee, J. Gen. Virol. 71: 971-6, 1990; Bonning a kol., J. Gen. Virol. 75:1551-6, 1994; a Chazenbalk a Rapoport, J. Biol. Chem. 270: 1543-9, 1995. Přenášecí vektory mohou dále obsahovat na C-konci nebo N-konci exprimovaného polypeptidu BR43X2 ve čtecím rámci fúzovanou DNA kódující epitopovou značku, například epitopovou značku Glu-Glu (Grussenmeyer a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 7952-4, 1985). Za použití techniky známé v oboru, je přenášecí vektor, obsahující BR43x2, transformován do E. coli a je provedena selekce na bacmidy, obsahující přerušený gen lacZ, což je známkou přítomnosti rekombinantního bakuloviru. DNA bacmidu, který obsahuje genom rekombinantního bakuloviru je izolována pomocí běžných technik, a použita k transfekci buněk Spodoptera frugiperda, např. buněk Sf9. Následně je produkován rekombinantní virus, který exprimuje BR43x2. Zásobní rekombinantní virus je připraven pomocí v oboru běžně používaných postupů.

• · ♦ * · · · • · · · · · ♦ · ·

Rekombinantní virus je použit k infekci hostitelských buněk, obyčejně buněčné linie odvozené z vojnice podzimní, Spodoptera frugiperda. Obecně viz Glick a Pasternak, Molecular Biotechnology: Principles and Application of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Jinou vhodnou buněčnou linií je buněčná linie High FiveO™ (Invitrogen), odvozená z Trichoplusia ni (patent US 5 300 435). Pro růst a udržování buněk jsou používána komerčně dostupná média bez séra. Vhodnými médii pro buňky Sf9 jsou Sf900 II™ (Life Technologies) nebo ESF 921™ (Expression Systems); a pro buňky T. ni Ex-cellO405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) nebo Express FiveO™ (Life Technologies). Buňky jsou pěstovány z hustoty naočkování, která je přibližně 2 až 5x10⁵ buněk, na hustotu 1 až 2x10⁶ buněk, a v této době je přidán stok rekombinantního viru s multiplicitou infekce (MOl) 0,1 až 10, typicky okolo

3. Používané postupy jsou obecně popsány v dostupných laboratorních manuálech (King a Possee, The Baculovirus Expression Systém: A Laboratory Guide, London, Chapman & Halí; 0'Reilly a kol., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, New York, Oxford University Press., 1994; a Richardson, vyd. Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995). Následné purifikace polypeptidů BR43x2 ze supernatantu může být dosaženo zde popsanými metodami.

Buňky hub, včetně kvasinkových buněk, mohou také být použity v rámci předloženého vynálezu. Druhy kvasinek v tomto ohledu zvláště zajímavé zahrnují Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris a Pichia methanolica. Metody pro transformování buněk S. cerevisiae exogenní DNA a produkování rekombinantních polypeptidů v nich jsou popsány například v Kawasaki, patent US 4 599 311; Kawasaki, patent US 4 931 373; Brake, patent US 4 870 008; Welch a kol., patent US 5 037 743; a Murray a kol., patent US 4 845 075. Transformované buňky jsou vybrány podle fenotypu určeného selekčním markérem, obyčejně rezistence k léku nebo schopnost růst v nepřítomnosti určité živiny (např. leucin). Výhodný vektorový systém pro použití u Saccharomyces cerevisiae je vektorový systém POT1 popsaný v Kawasaki a kol., (patent US 4 931 373), který umožňuje aby byly transformované buňky selektovány růstem v médiu obsahujícím glukózu. Promotory a terminátory vhodné pro použití u kvasinek zahrnují promotory a terminátory od genů glykolytických enzymů (viz např. Kawasaki, patent US 4 599 311; Kingsman a kol., patent US 4 615 974; a Bitter, patent US 4 977 092) a genů pro alkoholdehydrogenázu. Viz také patenty US 4 990 447; 5 • 4

063 154; 5 139 936 a 4 661 454. Transformační systémy pro jiné kvasinky, včetně Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii a Candida maltosa jsou v oboru známé. Viz například Gleeson a kol., J. Gen. Microbiol. 132: 3459-3465, 1986 a Cregg, patent US 4 882 279. Buňky Aspergillus mohou být použity podle metod McKnight a kol., patent US 4 935 349. Metody pro transformování Acremonium chrysogenum jsou popsány v Sumino a kol., patent US 5 162 228. Metody pro transformování Neurospora jsou popsány v Lambowitz, patent US 4 486 533.

Například použití Pichia methanolica jako hostitele pro produkování rekombinantních proteinů je popsáno v Raymond, patent US 5 716 808, Raymond, patent US 5 736 383, Raymond, Yeast 14: 11-23, 1998 a mezinárodních publikacích WO 97/17 450, WO 97/17 451, WO 98/02 526 a WO 98/02 565. Molekuly DNA používané při transformování P. methanolica budou běžně připravovány jako dvouřetězcové, kruhové plazmidy, které jsou s výhodou před transformací linearizovány. Pro produkci polypeptidu v P. methanolica je výhodné, když promotor a terminátor v plazmidu bude pocházet z genu P. methanolica, jako je P. methanolica gen pro využívání alkoholu (AUG1 nebo AUG2). Jiné užitečné promotory zahrnují promotory z genů dihydroxyacetonsyntházy (DHAS), dehydrogenázy kyseliny mravenčí (FMD) a katalázy (CAT). Pro usnadnění integrace DNA do hostitelského chromozomu je výhodné, mít úplný expresní segment v plazmidu ohraničen na obou koncích sekvencemi hostitelské DNA. Výhodný selekční markér pro použití v Pichia methanolica je P. methanolica gen ADE2, který kóduje karboxylázu fosforibozyl-5-aminoimidazolu (AIRC; EC 4.1.1.21), která umožňuje hostitelským buňkám ade2 růst v nepřítomnosti adeninu. Pro velkoobjemové, průmyslové procesy, kde je žádoucí minimalizovat použití methanolu, je výhodné použít hostitelské buňky, u kterých byly oba geny pro využití methanolu (AUG1 a AUG2) odstraněny. Pro produkci sekretovaných proteinů jsou výhodné hostitelské buňky postrádající geny vakuolární proteázy (PEP4 a PRB1). Elektroporace se používá pro usnadnění vnášení plazmidu, obsahujícího DNA kódující polypeptid o který se jedná, do buněk P. methanolica. Je výhodné transformovat buňky P. methanolica elektroporací pomocí exponenciálně klesajícího, pulsujícího elektrického pole o napětí od 2,5 do 4,5 kV/cm, s výhodou asi

3,75 kV/cm s časovou konstantou (t) od 1 do 40 milisekund, nejvýhodněji asi 20 milisekund.

Prokaryotické hostitelské buňky, včetně kmenů bakterií Escherichia coli, Bacillus a jiných rodů, jsou také vhodnými hostitelskými buňkami v předloženém vynálezu. Techniky pro transformování těchto hostitelů a expresi cizorodých sekvencí DNA v nich klonovaných, jsou v oboru dobře známé (viz např. Sambrook a kol., Molekulární klonování: Laboratorní příručka, 2. vyd., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) a). Když je exprimován polypeptid BR43x2 v bakteriích jako jsou E. coli, polypeptid může být zadržován v cytoplazmě, typicky ve formě nerozpustných granulí, nebo může být směrován do periplazmatického prostoru působením bakteriální sekreční sekvence. V prvém případě jsou buňky lyžovány, granule získány a denaturovány pomocí například isothiokyanátu nebo močoviny. Denaturovaný polypeptid potom může být znovu sestaven a dimenzován zředěním denaturačního činidla, třeba dialýzou proti roztoku močoviny a kombinací redukovaného a oxidovaného glutathionu, následovanou dialýzou proti pufrovanému fyziologickému roztoku. Ve druhém případě může být polypeptid získán z periplazmatického prostoru v rozpustné a funkční formě tím, že buňky jsou rozrušeny (například pomocí sonikování nebo osmotickým šokem), aby se uvolnil obsah periplazmatického prostoru a získán protein, tímto je vyloučena potřeba denaturování a opětného sestavování.

Transformované a transfekované hostitelské buňky jsou pěstovány podle běžných postupů v kultivačním médiu, obsahujícím živiny a jiné složky potřebné pro růst vybraných hostitelských buněk. V oboru je znám široký výběr vhodných médií, včetně definovaných a komplexních médií; média běžně zahrnují zdroj uhlíku, zdroj dusíku, základní aminokyseliny, vitamíny a minerály. Média mohou také obsahovat, pokud je to vyžadováno, takové složky jako růstové faktory nebo sérum. Růstové médium bude obecné selektovat buňky, obsahující exogenně přidanou DNA, například pomocí selekce léky nebo nedostatkem základní živiny, která je doplňována selekčním markérem, neseném na expresním vektoru nebo společně transfekovaným do hostitelské buňky. Buňky P. methanolica jsou pěstovány v médiu obsahujícím odpovídající zdroje uhlíku, dusíku a stopové živiny při teplotě 25 až 35 °C. Tekutým kulturám je poskytováno dostatečné vzduchování běžnými způsoby, jako je třepání v malých lahvích nebo rozstřikováním ve fermentorech. Výhodné kultivační médium pro P. methanolica je YEPD (2% D-glukóza, 2% Bacto™ Pepton (Difco Laboratories, • « · · · * · «« ·· »· ·♦·

Detroit, Ml), 1% kvasničný extrakt Bacto™(Difco Laboratories), 0,004% adenin a 0,006% L-leucin).

Exprimované rekombinantní polypeptidy BR43x2 (nebo chimerní či fúzní polypeptidy BR43x2) mohou být čištěny pomocí frakcionačních a/nebo běžných purifikačních metod a prostředků. Je výhodné poskytnout proteiny nebo polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, ve vysoce purifikované formě, tj. ve více než 95% čistotě, výhodnější je ve více než 99% čistotě. Pro frakcionaci vzorků může být použito srážení síranem amonným a kyselá nebo chaotropní extrakce. Příklady purifikačních kroků mohou zahrnovat hydroxylapatit, dělení podle velikosti, FPLC a HPLC reverzní fáze. Vhodné chromatografické prostředky vyměňující anionty zahrnují deriváty dextranů, agarózu, celulózu, polyakrylamid, speciálně upravený kysličník křemičitý a podobně. Výhodné jsou PEI, DEAE, QAE a Q deriváty, přičemž zvláště výhodná je DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Pistcataway, NJ). Příklady chromatografických prostředků zahrnují ty, které jsou derivovány fenylovou, butylovou nebo oktylovou skupinou, jako je Phenyl-Sepharose FF (Pharmacia), Toyopearl butyl 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), Octyl-Sepharose (Pharmacia) a podobně; nebo polyakrylové pryskyřice, jako je Amberchrom CG 71 (Toso Haas) a podobně. Vhodnými pevnými podpůrnými médii jsou skleněná zrnka, pryskyřice založené na kysličníku křemičitém, celulózové pryskyřice, zrna agarózy, sesíťovaná zrna agarózy, polystyrénová zrna, sesíťované polyakrylamidové pryskyřice a podobné, které jsou nerozpustné za podmínek, za kterých budou používány. Tato podpůrná média mohou být modifikována pomocí reaktivních skupina, které umožňují připojení proteinů aminoskupinami, karboxylovými skupinami, sulfhydrylovými skupinami, hydroxylovými skupinami a/nebo cukernými složkami. Příklady chemických postupů, vhodných pro připojení, zahrnují aktivaci bromkyanem, aktivaci N-hydroxysuccinimidem, epoxidovou aktivaci, sulfhydrylovou aktivaci, aktivaci hydrazidem a karboxylové a aminové deriváty pro karbodiimidový chemický postup připojení. Tato a jiná pevná média jsou dobře známa a v oboru široce používána a jsou dostupná od komerčních dodavatelů. Metody pro vazbu polypeptidů receptorů na podkladová média jsou v oboru dobře známy. Výběr určité metody je záležitostí rutinního návrhu a je určen částečné vlastnostmi vybraného podkladového média. Viz například Affinity Chromatography: Principles & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988.

·· c

« · * · · • ♦ · · • · · · · • ·· · ♦ • 9 · *· · « ·· • · ·♦ ·· >· »··

Polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být izolovány za využití jejich fyzikálních vlastností. Například chromatografie absorbcí na i mobilizovaných iontech kovů (IMAC) může být použita pro čištění proteinů bohatých na histidin, včetně těch, které obsahují polyhistidinové značky. Krátce řečeno, gel je napřed nasycen ionty dvojmocných kovů, aby se vytvořil chelát (Sulkowski, Trends in Biochem. 3:1-7, 1985). Proteiny bohaté histidinem se budou adsorbovat na tuto základní hmotu s různými afinitami, závisejícími na použitém kovovém iontu a budou eluovány kompetitivní elucí, snižováním pH nebo použitím silných chelatačních činidel. Další metody čištění zahrnují čištění glykozylovaných proteinů afinitní chromatografií na lektinech a chromatografií výměny iontů (Methods in Enzymol., sv. 182, Guide to Protein Purification, M. Deutscher, (vyd.), Acad. Press, San Diego, 1990, str. 529 až 39). V jiných provedeních vynálezu mohou být, pro usnadnění čištění, konstruovány fúze polypeptidů o který se jedná, s afinitními značkami (např. s proteinem, který váže maltózu, se značkou FLAG (Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (SEQ ID NO: 13)), GluGlu značkou (Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu (SEQ ID NO: 14)), nebo s doménami imunoglobulinu).

S výhodou mohou být použity postupy pro opětné prostorové uspořádání proteinu (popřípadě reoxidace). Je výhodné čistit proteiny do >80% čistoty, výhodněji do >90% čistoty, ještě výhodněji do >95% čistoty a zvláště výhodný je farmaceuticky čistý stav, tj. vyšší než 99,9% čistota, pokud se týká kontaminujících makromolekul, zvláště jiných proteinů a nukleových kyselin, a zbavený infekčních a pyrogenních činidel. Je výhodné, když je čištěný protein v podstatě zbavený jiných proteinů, zvláště jiných proteinů živočišného původu.

Polypeptidy BR43x2 nebo jejich fragmenty mohou být také připraveny pomocí chemické syntézy. Polypeptidy BR43x2 mohou být monomery nebo multimery; glykozylované nebo neglykozylované; pegylované nebo nepegylované; a mohou nebo nemusí obsahovat počáteční metioninový aminokyselinový zbytek. Příklady polypeptidů BR43x2 zahrnují polypeptidy o délce 32 až 40 zbytků, jejichž aminokyselinová sekvence odpovídá motivu: XXCX[QEK] [QEKNRDHS] [QE] X {0-2} [YFW] [YFW] DXLLX {2} C [IMLV] XCX {3} CX {6-8} CX {2} [YF] CXX (SEQ ID NO: 10), a podléhá zde popsaným omezením.

Polypeptidy BR43x2 mohou být syntetizovány výlučně syntézou na pevné fázi, metodami částečné pevné fáze, kondenzací fragmentů nebo klasickou syntézou v ··· · · · · · • · ···· ·· ·· ·· roztoku. Polypeptidy jsou s výhodou připraveny pomocí syntézy peptidu na pevné fázi, popsané například v Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963. Syntéza je prováděna s aminokyselinami, které jsou na α-aminoskupině konci chráněny. Aminokyseliny se třemi funkčními skupinami s labilními postranními řetězci jsou také chráněny pomocí vhodných skupin, aby bylo zabráněno probíhání nežádoucích chemických reakcí v průběhu sestavování polypeptidů. Skupina chránící aaminoskupinu je selektivně odstraněna, aby se mohla uskutečnit na aminovém konci následující reakce. Za podmínek, kdy dochází k odstranění skupiny chránící aaminoskupinu, nedochází k odstranění chránících skupin na postranním řetězci.

Skupiny chránící α-aminoskupinu jsou ty, o kterých je známo, že jsou vhodné v oboru postupné syntézy polypeptidů. Zahrnuty jsou chránící skupiny typu acylu (např. formyl, trifluoroacetyl, acetyl), chránící skupiny typu arylu (např. biotinyl), chránící skupiny typu aromatického uretanu (např. benzyloxykarbonyl (Cbz), substituovaný benzyloxykarbonyl a 9-fluorenylmethyloxykarbonyl (Fmoc)), chránící skupiny typu alifatického uretanu (např. t-butyloxykarbonyl (tBoc), isopropyloxykarbonyl, cyklohexyloxykarbonyl) a chránící skupiny typu alkylu (např. benzyl, trifenylmethyl). Výhodnými chránícími skupinami jsou tBoc a Fmoc.

Vybrané chránící skupiny postranních řetězců musí zůstat v průběhu slučování nedotčené a nesmí být odstraněny v průběhu odstraňování skupiny chránící na aminovém konci nebo za podmínek slučování. Skupiny chránící na postranních řetězcích musí být také odstranitelné po kompletním dokončení syntézy a za použití takových reakčních podmínek, při kterých nedojde ke změně ukončeného polypeptidu. Při procesu používajícím tBoc jsou chránící skupiny postranních řetězců, pro aminokyseliny se třemi funkčními místy, založeny převážně na benzylu. Při procesu používajícím Fmoc jsou založeny převážně na terc-butylu nebo tritylu.

Při procesu používajícím tBoc jsou výhodné tyto chránící skupiny postranních řetězců: tosyl pro arginin, cyklohexyl pro kyselinu asparagovou, 4-methylbenzyl (a acetamidomethyl) pro cystein, benzyl pro kyselinu glutamovou, serin a threonin, benzyloxymethyl (a dinitrofenyl) pro histidin, 2-CI-benzyloxykarbonyl pro lyzin, formyl pro tryptofan a 2-brombenzyl pro tyrozin. Při procesu používajícím Fmoc jsou výhodné tyto chránící skupiny postranních řetězců: 2,2,5,7,8-pentamethylchroman-6-sulfonyl (Pmc) nebo 2,2,4,6,7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl (Pbf) pro arginin, trityl ··· ···· ·· ·· · · · · ·· ·· ·· pro asparagin, cystein, glutamin a histidin, terc-butyl pro kyselinu asparagovou, kyselinu glutamovou, serin, threonin a tyrozin, tBoc pro lyzin a tryptofan.

Pro syntézu fosforylovaných peptidů se používá zabudování fosfátové skupiny buď přímo při sestavování nebo až po sestavení peptidu. Při použití strategie přímého zabudování mohou být fosfátové skupiny šeřinu, threoninu nebo tyrozinu chráněny pomocí methylu, benzylu nebo terc-butylu v procesu používajícím Fmoc, nebo pomocí methylu, benzylu nebo fenylu v procesu používajícím tBoc. V procesu používajícím Fmoc může také být použito přímé zabudování fosfotyrozinu bez chránění fosfátové skupiny. Při použití strategie zabudování fosfátové skupiny až po sestavení peptidu jsou na pevné fázi vytvořeny deriváty nechráněných hydroxylových skupin šeřinu, threoninu nebo tyrozinu pomocí di-terc-butylfosforamiditu, dibenzylforamiditu nebo dimethyl-N,N'-diisopropylfosforamiditu a potom oxidovány terc-butylhydroperoxidem.

Syntéza na pevné fázi je obyčejně prováděna od karboxylového konce připojováním aminokyselin a chráněnou α-aminoskupinou (s chráněným postranním řetězcem) ke vhodnému pevnému podkladu. Esterová vazba se vytvoří, když se provede připojení k pryskyřici s chlormethylovými, chlortritylovými nebo hydroxymethylovými skupinami a výsledný polypeptid bude mít volnou karboxylovou skupinu na C-konci. Jinou možností je použití amidové pryskyřice jako je benzhydrylaminová nebo p-methylbenzhydrylaminová pryskyřice (v procesu používajícím tBoc) anebo Rink amid nebo PAL pryskyřice (v procesu používajícím Fmoc), kdy se tvoří amidová vazba a výsledný polypeptid bude mít karboxyamidovou skupinu na C-konci. Tyto pryskyřice, ať založené na polystyrenu, polyamidu nebo polyethylenglykolu, s linkerem nebo bez linkeru, s připojenou první aminokyselinou nebo nikoli, jsou komerčně dostupné a jejich příprava byla popsána Stewardem a kol., „Syntéza peptidů na pevné fázi“ (2. vydání), (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984) a v Bayer a Rapp, Chem. Pept. Prot 3: 3, 1986; a v Atherton a kol., Syntéza peptidů na pevné fázi: praktický přístup, IRL Press, Oxford, 1989.

C-koncová aminokyselina, pokud je to nezbytné s chráněným postranním řetězcem, a s chráněnou α-aminoskupinou, je připojena k hydroxymethylované pryskyřici pomocí různých aktivačních činidel, jako jsou dicyklohexylkarbodiimid (DCC), Ν,Ν'-diisopropylkarbodiimid (DIPCDI) a karbonylimidazol (CDI). Může být připojena k chlormethylované nebo chlortritylované pryskyřici přímo ve formě své cesium tetramethylamoniové soli nebo v přítomnosti triethylaminu (TEA) nebo diisopropylethylaminu (DIEA). Připojení první aminokyseliny k amidované pryskyřici je stejné jako tvorba amidové vazby během slučování.

Po připojení k pryskyřici je chránící skupina α-aminoskupinu odstraněna pomocí různých reagencií, v závislosti na používaném chemismu chránících skupin (např. tBoc, Fmoc). Rozsah odstranění Fmoc může být monitorován při 300 až 320 nm nebo pomocí buňky na měření vodivosti. Po odstranění skupiny chránící a-aminoskupinu jsou zbývající chráněné aminokyseliny postupně připojovány v požadovaném pořadí, aby byla získána žádaná sekvence.

Pro připojovací reakce mohou být používána různá aktivační činidla, jako jsou DCC, DIPCDI, hexafluorfosforečnan 2-chlor-1,3-dimethylimidia (CIP), hexafluorfosforečnan benztriazol-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)fosfonia (BOP) a jeho pyrrolodinový analog (PyBOP), hexafluorfosforečnan brom-tris-pyrrolidinfosfonia (PyBrOP), hexafluorfosforečnan O-(benztriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronia (HBTU) a jeho tetrafluorborátový analog (TBTU) nebo jeho pyrrolidinový analog (HBPyU), hexafluorfosforečnan O-(azabenztriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronia (HATU) a jeho tetrafluorborátový analog (TÁTU) nebo jeho pyrrolidinový analog (HAPyU). Nejběžnější katalytické přísady používané pro připojovací reakce zahrnují 4-dimethylaminopyridin (DMAP), 3-hydroxy-3,4-dihydro-4-oxo-1,2,3-benztriazin (HODhbt), Nhydroxybenztriazol (HOBt) a 1-hydroxy-7-azabenztriazol (HOAt). Každá chráněná aminokyselina je použita v nadbytku (>2,0 ekvivalenty) a sloučení je obyčejně provedeno v N-methylpyrrolidonu (NMP) nebo v DMF, CH2CI2 nebo jejich směsích. Do jaké míry proběhla připojovací reakce může být v každém stádiu monitorováno, např. pomocí ninhydrinové reakce, jak je popsáno v Kaiser a kol., Anal Biochem. 34: 595, 1970.

Po úplném sestavení žádaného peptidu je komplex peptid-pryskyřice štěpen reakčním činidlem s vhodnými čistícími přísadami. Fmoc peptidy jsou obvykle štěpeny a zbaveny chránících skupin pomocí TFA s čistícími přísadami (např. H₂O, ethandithiol, fenol a thioanisol). tBoc peptidy jsou obvykle štěpeny a zbaveny chránících skupin pomocí tekutého HF po dobu 1 až 2 hodiny při -5 až 0 °C, který odštěpuje polypeptid od pryskyřice a odstraňuje většinu chránících skupin z postranních řetězců. Čistící přísady, jako je anisol, dimethylsulfid a p-thiokresol, jsou obvykle používány spolu s tekutým HF, aby zabránily kationtům vytvářeným v průběhu odštěpování, aby alkylovaly a acylovaly aminokyselinové zbytky přítomné v polypeptidu. Formylová skupina tryptofanu a dinitrofenylová skupina histidinu musí být odstraněny pomocí piperidinu respektive thiofenylu v DMF, před odštěpováním HF. Acetamidomethylová skupina cysteinu může být odstraněna octanem rtuťnatým, popřípadě jodem, trifluoroctanem thalitým nebo tetrafluorborátem stříbrným, které současně oxidují cystein na cystin. Jinými silnými kyselinami používanými pro odštěpování peptidů tBoc a odstraňování chránících skupin jsou kyselina trifluormethansulfonová (TFMSA) a trifluoroacetát trimethylsilylu (TMSOTf).

Předložený vynález dále poskytuje další rozmanité fúzní polypeptidy a podobné multimerní proteiny, které obsahují jeden nebo více fúzních polypeptidů. Rozpustné polypeptidy BR43x2, TACÍ a BCMA mohou být exprimovány jako fúze s konstantní oblastí těžkého řetězce imunoglobulinu, typicky s F_c fragmentem, který obsahuje dvě konstantní domény a postrádá variabilní oblast. Metody pro přípravu takových fúzí jsou popsány v patentech US 5 155 027 a 5 567 584. Takové fúze jsou typicky sekretovány jako multimerní molekuly, ve kterých jsou F_c části vzájemně vázány disulfidickými vazbami a dva non-lg polypeptidy jsou uspořádány ve vzájemné těsné blízkosti. Polypeptidové fúze imunoglobulin-BR43x2 (TACÍ nebo BCMA) mohou být exprimovány v buňkách geneticky upravených tak, aby produkovaly rozmanité multimerní analogy BR43x2. K polypeptidům BR43x2 (TACÍ nebo BCMA) mohou být fúzovány omocné domény, aby je nasměrovaly na specifické buňky, tkáně nebo makromolekuly. Stejným způsobem, jak je zde diskutováno, mohou být také vytvořeny fúze za pomoci toxinů. Tímto způsobem mohou být polypeptidy a proteiny zaměřeny pro terapeutické nebo diagnostické účely. Polypeptid BR43x2 může být fúzován se dvěma nebo více složkami, jako je afinitní značka pro purifikaci a cílová doména. Fúzní polypeptidy také mohou obsahovat jedno nebo více štěpných míst, zvláště mezi doménami. Viz Tuan a kol., Connect. Tiss. Res. 34: 1-9, 1996. Fúze tohoto typu může být také použita, například, pro afinitní purifikaci příbuzných ligandů z roztoku, jako nástroj v in vitro testu, pro blokování signálů in vitro specifickým titrováním ligandů, pro vazbu ligandů na buněčném povrchu nebo jako antagonisty BR43x2 in vitro, kdy jsou podány aby blokovaly stimulaci ligandů. Pro použití v pokusech mohou být fúzní proteiny vázány k podkladu pomocí F_c oblasti a použity v testu ELISA.

Vynález také poskytuje rozpustné BR43x2 receptory a fragmenty polypeptidů, použité pro vytváření fúzních proteinů s afinitními značkami nebo označeními. Rozpustné BR43x2 fúzní proteiny s afinitními značkami se používají například pro identifikaci BR43x2 ligandů a rovněž agonistů a antagonistů přirozeného ligandu. Při použití značeného, rozpustného BR43x2 je možno identifikovat buňky, které exprimují ligand, agonisty nebo antagonisty, pomocí fluorescenční imunocytometrie nebo imunohistochemie. Rozpustné fúzní proteiny jsou užitečné při studiu distribuce ligandu na tkáních nebo specifických buněčných liniích a pro získání hlubšího pohledu na biologii vztahu receptor/ligand.

Při purifikaci ligandu, agonistů nebo antagonistů je fúzní protein BR43x2-lg přidán ke vzorku obsahujícímu ligand, agonistů nebo antagonistů, za podmínek které usnadňují vazbu receptor-ligand (typicky za teploty, pH a iontové síly které jsou blízké fyziologickým hodnotám). Komplex receptor-ligand je potom oddělen ze směsi pomocí proteinu A, který je připevněn k pevnému podkladu (např. nerozpustná zrna pryskyřice). Ligand, agonista nebo antagonista jsou potom vymyty za použití běžných chemických technik, jako jsou solný nebo pH gradient. Alternativně může být samotný fúzní protein připevněn k pevnému podkladu a vazba a eluce jsou provedeny, jak bylo výše popsáno. Metody pro připevnění polypeptidu receptoru k pevnému podkladu, jako jsou zrna agarózy, sesíťovaná agaróza, sklo, celulózové pryskyřice, pryskyřice založené na kysličníku křemičitém, polystyrén, sesíťovaný polyakrylamid nebo podobné materiály, které jsou stabilní za podmínek použití, jsou v oboru známé. Metody pro vazbu polypeptidů k pevnému podkladu jsou v oboru známé a zahrnují využití aminů, aktivaci bromkyanem, aktivaci N-hydroxysuccinimidem, epoxidovou aktivaci, sulfhydrylovou aktivaci a aktivaci hydrazidem. Výsledná média budou obecně uspořádána ve formě sloupce, a tekutiny obsahující ligand procházejí sloupcem jednou nebo vícekrát, aby bylo ligandu umožněno se navázat na polypeptid receptoru. Ligand je potom vymyt pomocí změn v koncentraci soli, chaotropních činidel (MnCI₂) nebo pH, aby došlo k přerušení vazby ligand-receptor.

Aby byl usměrněn export rozpustného receptoru z hostitelské buňky, je DNA rozpustného receptoru připojena k druhému DNA segmentu, který kóduje sekreční peptid, jako je například t-PA sekreční peptid. Aby byla usnadněna purifikace sekretované receptorové domény, může být k polypeptidu receptoru fúzováno prodloužení na N- nebo C-konci, jako je afinitní značka nebo jiný polypeptid nebo protein, pro něž je k dispozici protilátka nebo jiné specificky se vázající činidlo.

Buňky exprimující funkční rozpustné a na membránu vázané receptory, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou používány ve vyhledávacích testech. V oboru

jsou známy různé vhodné testy. Tyto testy jsou založeny na detekci biologické odpovědi v cílové buňce. Změny v metabolizmu ve srovnání s kontrolní hodnotou jsou známkou testované sloučeniny, která moduluje metabolizmus zprostředkovaný BR43x2. Jedním takovým testem je test buněčného množení. Buňky jsou pěstovány v přítomnosti nebo v nepřítomnosti testované sloučeniny a buněčné množení je detekováno například měřením inkorporace tymidinu označeného triciem, nebo kolorimetrickým testem založeným na metabolickém štěpení bromidu 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolia (MTT) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 5563, 1983). Alternativní formátu testu používá buňky, které jsou dále geneticky upraveny, aby exprimovaly reportérový gen. Reportérový gen je vázán k promotorovému elementu, který reaguje na biochemickou dráhu vázanou na receptor, a test tedy detekuje aktivaci transkripce reportérového genu. V oboru je známo množství reportérových genů, které se v buněčných extraktech snadno testují, například E. coli lacZ, chloramfenikol acetyltransferáza (CAT) a element odpovědi na sérum (SRE) (viz např. Shaw a kol., Cell 56: 563-72, 1989). Takovým výhodným reportérovým genem je luciferázový gen (de Wet a kol., Mol. Cell. Biol. 7: 725, 1987). Exprese luciferázového genu je detekována luminiscenčně pomocí metod známých v oboru, (např. Baumgartner a kol., J. Biol. Chem. 269: 29 094-101, 1994; Schenborg a Goiffin, Promega Notes 41:11, 1993). Soupravy na testování aktivity luciferázy jsou komerčně dostupné, například od Promega Corp., Madison, Wl. Cílové buněčné linie tohoto typu mohou být používány pro prohledávání knihoven chemikálií, buňkami upravených kultivačních médií, bujónů pro kultivaci hub, vzorků půdy, vzorků vody a podobně. Například banka vzorků buňkami upravených kultivačních médií může být testována na cílových buňkách, a určeny tak buňky, které produkují ligand. Pozitivní buňky jsou potom použity pro vytvoření cDNA knihovny v savčím expresním vektoru, který je pak rozdělen na části, transfekován do hostitelských buněk a exprimován. Vzorky média od transfekovaných buněk jsou potom testovány, s následným rozdělením na části, opětnou transfekci, další kultivací a opětným testováním pozitivních buněk, až je izolována klonovaná DNA kódující ligand.

S výhodou může být použit testovací systém, který používá receptor, který váže ligand (nebo protilátku či jeden člen páru komplement/antikomplement) nebo jeho vazebný fragment a komerčně dostupný přístroj s biosenzorem (např. BIAcore™, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). Takový receptor, protilátka člen páru komplement/antikomplement nebo fragment je imobilizován na povrchu receptorového čipu. Použití tohoto přístroje je popsáno v Karlsson, J. Immunol. Methods 145: 229240, 1991 a Cunningham a Wells, J. Mol. Biol. 234: 554-63, 1993. Například polypeptid BR43x2, fragment, protilátka nebo člen páru komplement/antikomplement je kovalentně připojen, pomocí aminoskupin nebo sulfhydrylových skupin k vláknům dextranu, jež jsou připojeny ke zlatému filmu, umístěnému v průtokové buňce. Testovaný vzorek prochází buňkou. Pokud je ve vzorku přítomen ligand, epitop nebo opačný člen páru komplement/antikomplement, bude se vázat k imobilizovanému receptoru, protilátce respektive druhému členu páru, a bude způsobovat změny v indexu lomu média, který je detekován jako změna v povrchové plazmonové rezonanci zlatého filmu. Tento systém umožňuje určení rychlostí vazby a uvolňování, z nichž může být spočtena afinita vazby, a stanovena stechiometrie vazby. Polypeptidy receptoru, které vážou ligand, mohou být také použity v rámci jiných, v oboru známých testovacích systémů. Takové systémy zahrnují analýzu podle Scatcharda pro určení afinity vazby (viz Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949) a kalorimetrické testy (Cunningham a kol., 253: 545-48, 1991; Cunningham a kol., Science 245: 821-25, 1991).

Analýzu vynesení podle Scatcharda pro rozpustný I¹²⁵-ztnf4, vázající se k TACÍ a BCMA, je uvedena na obrázku 2 a je porovnána s vazebnými konstantami jiných členů rodiny TNFR v tabulce 7.

Tabulka 7

Ligand	KdM	Buněčný zdroj	Odkaz
TNFa vysoký	7.14E-11	HL-60	a
TNFa nízký	3.26E-10	HEP-2	a
TNFa vysoký	2.00E-10	HL-60	b
CD27L	3.70E-10	MP-1	c
CD27L	8.30E-09	MP-1	c
CD40L	5.00E-10	EL40.5	d
CD40L	1.00E-09	EBNA	d
(125I-CD40)
4-1BBL	1,16E-09	Biacore	e

anti 41 Bbmab	4.14E-10	Biacore	e
ztnf4 sol.	1,11E-09	TACI-BHK
ztnf4 sol.	1.25E-09	BCMA-BHK

a Hohmann a kol., J. Biol. Chem. 264: 14 927-34, 1989 b Manna a Aggarwal, J. Biol. Chem. 274: 33 333-41, 1998 c Goodwin a kol., Cell 73: 447-56, 1993 d Armitage a kol., Nátuře 357: 80-82, 1992 e Shuford a kol., J. Exp. Med. 186: 47-55, 1997

Protože se jedná o receptor, aktivace polypeptidu BR43x2 může být měřena na křemíku založeným biosenzorovým mikrofyziometrem, který měří rychlost extracelulárního okyselování nebo vylučování protonů, spojené s vazbou receptorů a následujícími fyziologickými buněčnými změnami. Příkladem takového zařízení je Cytosensor™ Microphysiometer vyrobený v Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Touto metodou mohou být měřeny různé buněčné odpovědi, jako je buněčné množení, transport iontů, produkce energie, zánětlivá odpověď, aktivace regulace a aktivace receptorů a podobně. Viz například McConnell a kol., Science 257: 1906-1912, 1992; Pitchford a kol., Meth. Enzymol. 228: 84-108, 1997; Arimilli a kol., J. Immunol. Meth. 212: 49-59, 1998; Van Liefde a kol., Eur. J. Pharmacol. 346: 87-95, 1998. Mikrofyziometr může být používán pro testování přichycených nebo nepřichycených eukaryotických nebo prokaryotických buněk. Při měření změn extracelulárního okyselení v buněčném médiu v průběhu času, mikrofyziometr přímo měří buněčné odpovědi na různé podněty, včetně agonistů, ligandů nebo antagonistů polypeptidu BR43x2. S výhodou je mikrofyziometr používán pro měření odpovědí eukaryotických buněk, které exprimují BR43x2, ve srovnání s kontrolními eukaryotickými buňkami, které polypeptid BR43x2 neexprimují. Eukaryotické buňky exprimující BR43x2 obsahují buď buňky, do kterých byl BR43x2 transfekován, jak je zde popsáno, čímž vznikla buňka odpovídající na BR43x2 modulační podněty, nebo buňky, které exprimují BR43x2 přirozeně, jako jsou BR43x2 exprimující buňky odvozené z tkáně sleziny. Rozdíly měřené změnou extracelulárního okyselení, například zesílení nebo zeslabení odpovědi buněk exprimujících BR43x2, vzhledem ke kontrole, jsou přímou mírou buněčných odpovědí modulovaných BR43x2. Kromě toho mohou být takové buněčné odpovědi, modulované BR43x2, testovány pod vlivem rozličných podnětů. Použití mikrofyziometru také poskytuje metodu určování agonistů a antagonistů polypeptidu BR43x2, která sestává z poskytnutí buněk exprimujících polypeptid BR43x2, kultivování první části buněk v nepřítomnosti testované sloučeniny, kultivování druhé části buněk v přítomnosti testované sloučeniny, a detekování změny, například zesílení nebo zeslabení buněčné odpovědi druhé části buněk ve srovnání s částí první. Změny v buněčné odpovědi se projevují jako měřitelné změny rychlosti extracelulárního okyselování. Antagonisti a agonisti polypeptidu BR43x2 mohou být pomocí této metody rychle určeny.

Rozpustný BR43x2 je vhodný při studiu distribuce ligandů na tkáních nebo specifických buněčných liniích a pro získání hlubšího pohledu na biologii vztahu receptor/ligand. Specifitu TNF receptorů pro jejich ligandy lze také využít jako mechanizmu, kterým je možno destruovat cílové buňky nesoucí ligand. Například k rozpustnému receptorů BR43x2 nebo k BR43x2 fúzi je možno připojit toxickou sloučeninu. Příklady toxických sloučenin by zahrnovaly radioaktivně značené farmaceutické přípravky, které inaktivují cílové buňky; chemoterapeutická činidla jako jsou doxorubicin, daunorubicin, methotrexát a cytoxan; toxiny jako jsou ricin, difterický toxin, exotoxin A z Pseudomonas a abrin; a protilátky k povrchovým molekulám cytotoxických T buněk.

Pomocí FACS analýzy (průtoková cytometrie a třídění, Melemed a kol., vyd. Wiley-Liss, 1990 a Imunofluorescence a třídění buněk, Současné protokoly v imunologii, svazek 1, Coligan a kol., vyd. John Wiley a syn, 1997) bylo zjištěno, že ztnf4 (5 ng/ml) se váže k BR43x2 (SEQ ID NO: 2), TACÍ (SEQ ID NO: 6), BCMA (SEQ ID NO: 8) a BR43x1 (SEQ ID NO: 9). Pomocí FACS analýzy bylo také zjištěno, že rozpustný ztnf4 označený pomocí FITC, se specificky váže mimo jiné na B lymfocyty v PBMNC, buňky mandlí, k B buňkám lymfomových buněčných linií (Ráji, lidský Burkittův lymfom, ATCC CCL86), Ramos (buněčná linie z Burkittova lymfomu, ATCC CRL-1596), Daudi (lidský Burkittův lymfom, ATCC CCL213) a RPMI 1788 (buněčná linie zB lymfocytů, ATCC CCL-156). Žádná vazba nebyla pozorována na HL-60 (promyelocytická buněčná linie, ATCC CCL-240). Specifita vazby k B buňkám z PBMNC a buňkám mandlí byla potvrzena společným barvením pomocí protilátek proti specifickým molekulám B buněk, jako jsou CD19, IgD, IgM a CD20. Podobnost ztnf4 s CD40L naznačuje širší tkáňovou distribuci, než byla pozorována. Afinita ztnf4 byla testována na monocytech, dendritických buňkách a purif i kovaných T buňkách například • · · ···· ·· • · · ···· ·· ·· ···· ·· ·· ·· pomocí testů cytokinové proliferace a proliferace T buněk, a nebylo možno detekovat vazbu ztnf4 ani žádný jiný biologický vliv na žádný jiný typ testovaných buněk. Proto specifita ligandu a receptoru pro B buňky naznačuje, že jsou vhodné pro studium a léčení autoimunity, rakovin B buněk, imunomodulaci, IBD a jakýchkoli protilátkami zprostředkovaných patologických stavů, např. ITCP, myastenie gravis a podobně, nemocí ledvin, nepřímé imunitní odpovědi T buněk, odmítnutí štěpu a reakce štěpu proti hostiteli.

Bylo ukázáno, že ztnf4 aktivuje B buňky, což má za následek množení B buněk, produkci protilátek a aktivování markérů in vitro (viz příklady uvedené dále). Tyto účinky mohou vyžadovat současnou stimulaci zprostředkovanou IL-4 nebo jinými cytokiny nebo stimulaci zprostředkovanou receptorem antigenu B buněk nebo jinými receptory na buněčném povrchu, které aktivují B buňky, tj. CD40. Jiné ligandy faktoru nekrózy nádoru, jako jsou gp39 a TNF0 také stimulují množení B buněk. Tedy polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být zaměřeny na specifické regulování odpovědí B buněk, inhibování aktivovaných B buněk v průběhu imunitní odpovědi, bez toho že by ovlivňovaly jiné buněčné populace, což je výhodné pro léčení nemoci. Dále polypeptidy, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být využity k modulování vývoje B buněk, vývoje jiných buněk, produkce protilátek a produkce cytokinů. Polypeptidy BR43x2 také mohou najít použití při indukování apoptózy v buňkách. Polypeptidy předloženého vynálezu také mohou modulovat komunikaci B buněk a T buněk neutralizování proliterativních účinků ztnf4. Biologické testy a testy ELISA jsou schopné měřit buněčnou odpověď na ztnf4 v přítomnosti rozpustného BR43x2, TACÍ a/nebo BCMA. Mezi jiné testy patří takové, které měří změny v produkci cytokinů, jakožto míry odpovědi buněk (viz například Současné protokoly v imunologii, vyd. John E. Coligan a kol., NIH, 1996). Testy pro měření dalších buněčných reakcí zahrnují isotyp protilátky, aktivaci monocytu, tvorbu buněk NK, buněčnou funkci prezentace antigenu a apoptózu.

Polypeptidy BR43x2, které jsou předmětem tohoto vynálezu, by byly vhodné pro neutralizování vlivů ztnf4 při léčení leukémií pre-B buněk nebo B buněk, jako jsou leukémie plazmatických buněk, chronické nebo akutní leukémie lymfocytů, myelomy jako je roztroušený myelom, myelom plazmatických buněk, endoteliální myelom a myelom obrovských buněk; a lymfomů jako je lymfom ne-Hodgkinova typu, s nimiž je

spojeno zvýšení úrovně ztnf4 polypeptidu. Rozpustný BR43x2 by byl vhodnou složkou v léčebném režimu pro potlačení postupu nádoru a přežití pacienta.

Analýza metodou Northern blot ukázala, že ztnf4 je exprimován v buňkách CD8⁺, monocytech dendrocytech a aktivovaných monocytech. To znamená, že při některých autoimunitních potížích mohou cytotoxické T buňky stimulovat produkci B buněk nadbytečnou produkcí ztnf4. Imunosuprimující proteiny, které selektivně blokují působení B lymfocytů, by mohly být použitelné při léčení nemoci. Produkce autoprotilátek je společná několika autoimunitním nemocem a přispívá k destrukci tkáně a zhoršování nemoci. Autoprotilátky také mohou vést k objevení se komplikací s usazováním imunního komplexu a vedou k mnoha symptomům systemického lupus erythematodes, včetně selhání ledvin, neuralgických symptomů a smrti. Modulování produkce protilátek nezávislé na buněčné odpovědi by také bylo užitečné v mnoha chorobných stavech. Bylo také ukázáno, že B buňky hrajou roli při sekreci imunoglobulinů způsobujících artritidu při revmatickém zánětu (Korganow a kol., Immunity 10: 451-61, 1999). Jako taková, inhibice produkce protilátek proti ztnf4 by byla užitečná při léčení autoimunitních nemocí, jako je myastenie gravis a zánět kloubů. Imunosuprimující léčiva, jako je rozpustný BR43x2, který selektivně blokuje nebo neutralizuje působení B lymfocytů, by byl pro takové účely užitečný. Pro ověření takovýchto schopností polypeptidů rozpustného receptoru BR43x2, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou tyto polypeptidy BR43x2 hodnoceny pomocí testů, známých v oboru a zde popsaných.

Vynález poskytuje metody využití polypeptidů BR43x2, TACÍ a BCMA, fúzních polypeptidů, protilátek, agonistů a antagonistů pro selektivní blokování nebo neutralizování účinků B buněk v souvislosti s konečným stadiem nemocí ledvin, které mohou nebo nemusí být spojeny s autoimunitními chorobami. Takové metody by také byly užitečné pro léčení imunologických nemocí ledvin. Takové metody by také byly užitečné pro léčení glomerulonefritidy spojené s nemocemi, jako je nefropatie, IgA nefropatie nebo Bergerovy nemoci, IgM nefropatie, Goodpasturovy nemoci, postinfekční glomerulonefritidy, proliferativní nemoci a nefrotického syndromu minimální změny. Takové metody by také sloužily jako léčebné aplikace při léčení druhotné glomerulonefritidy nebo vaskulitidy, spojených s takovými nemocemi jako je lupus, polyartritida, Henoch.Schonlein, sklerodermie, nemoci spojené s HIV, amyloidóza nebo hemolytický uremický syndrom. Metody předloženého vynálezu by také byly užitečné ·· · ···· ·· • ♦ · ··«· · · ·· ···· ·· · · ·· jako součást léčebné aplikace při léčení intersticiální nefritidy nebo pyelonefritidy spojené s chronickou pyelonefritidou, zneužití analgetik, nefrokalcinózy, nefropatie způsobené jinými činidly, nefrolitiázy nebo chronické či akutní intersticiální nefritidy.

Metody předloženého vynálezu také zahrnují použití polypeptidů BR43x2, TACÍ a BCMA, fúzních polypeptidů, protilátek, agonistů a antagonistů pro léčení vysokého tlaku nebo nemocí velkých cév, včetně zúžení nebo uzavření ledvinové tepny a cholesterové embolie nebo embolie ledviny.

Předložený vynález také poskytuje metody pro zjišťování diagnózy a pro léčení ledvinových a urologických novotvarů, mnohočetných myelomů, lymfomů, neuropatií způsobených lehkým řetězcem nebo amyloidózy.

Vynález také poskytuje metody pro blokování nebo inhibování aktivovaných B buněk pomocí polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA, fúzních polypeptidů, protilátek, agonistů a antagonistů pro léčení astmatu a jiných chronických nemocí dýchacích cest, jako je bronchitida a rozedma.

Také jsou poskytnuty metody pro inhibici nebo neutralizaci odpovědi efektorových T buněk pomocí polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA, fúzních polypeptidů, protilátek, agonistů a antagonistů pro použití v imunosupresi, a zvláště pro takové terapeutické použití, jako je nemoc reakce štěpu proti hostiteli a odmítnutí štěpu. Další použití by se nalezly v regulaci imunitní odpovědi, zvláště při aktivaci a regulaci lymfocytů. Polypeptidy BR43x2, TACÍ nebo BCMA, fúzních polypeptidů, protilátek, agonistů a antagonistů by byly užitečné v terapeutických postupech při léčení imunitních nedostatečností. Polypeptidy BR43x2, TACÍ nebo BCMA, fúzních polypeptidů, protilátek, agonistů a antagonistů by byly užitečné v terapeutických protokolech pro léčení takových autoimunitních chorob, jako je cukrovka závislá na inzulínu (IDDM) nebo Crohnova nemoc. Metody předloženého vynálezu by měly další terapeutickou hodnotu pro léčení chronických zánětlivých stavů, zvláště pro znížení bolesti kloubů, otoku, anémie a jiných souvisících symptomů a rovněž tak léčení septického šoku.

Účinky polypeptidů rozpustného BR43x2, TACÍ nebo BCMA a fúzních proteinů na imunitní odpověď může být měřena pomocí podávání polypeptidů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, živočichům imunizovaným antigenem, po čemž následuje injekce ztnf4 a měření produkce isotypu protilátky a odpovědí B a T buněk, včetně • · ··· ·· ··· · · ·*· · · · · · · · * « ···· ·· ·· ·· ··· opožděné přecitlivělosti a in vitro množení a produkce cytokinů, pomocí metod známých v oboru.

Předložený vynález proto poskytuje metodu inhibice ztnf4 aktivity v savci, která spočívá v podání uvedenému savci množství sloučeniny, vybrané ze skupiny zahrnující: a) polypeptid sekvence SEQ ID NO: 4; b) polypeptid sekvence SEQ ID NO: 8; c) fúzní protein; d) polypeptid sekvence SEQ ID NO: 6 od aminokyselinového zbytku 1 do zbytku 166; e) polypeptid sekvence SEQ ID NO: 8 od aminokyselinového zbytku 1 do zbytku 150; f) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu sekvence SEQ ID NO: 4; a g) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu sekvence SEQ ID NO: 10. Příklady fúzních proteinů zahrnují fúze rozpustného BR43x2 (SEQ ID NO: 4), TACÍ (od aminokyselinového zbytku 1 do zbytku 166 sekvence SEQ ID NO: 6) nebo BCMA (od aminokyselinového zbytku 1 do zbytku 150 sekvence SEQ ID NO: 8) s jiným polypeptidem, s výhodou s konstantní oblastí těžkého řetězce F_c fragmentu. Vynález podobně poskytuje metodu pro inhibování vzájemné vazby ligandu a receptoru BR43x2, TACÍ nebo BCMA.

Takové metody by byly zvláště užitečné tam, kde aktivita ztnf4 je spojena s aktivovanými B lymfocyty a pro léčení pre-B buněk a rakovin B buněk. Takové metody by byly také užitečné tam, kde aktivita ztnf4 je spojena s produkcí protilátky. Zvláště takové produkce protilátky, která souvisí s autoimunitními chorobami jako jsou systemický lupus erythematodes, myastenie gravis nebo zánět kloubů.

Předložený vynález také poskytuje agonisty a antagonisty BR43x2. Sloučeniny určené jako antagonisti BR43x2 jsou vhodné pro modifikaci množení a vývoje cílových buněk in vitro a in vivo. Například sloučeniny agonistů jsou vhodné samotné nebo v kombinaci s jinými cytokiny a hormony jako složky definovaných médií pro buněčné kultury. Agonisti jsou tedy užiteční při specifickém zprostředkování růstu a/nebo vývoje buněk B lymfocytů nesoucích BR43x2, rostoucích v kultuře. Agonisti a antagonisti se mohou také ukázat užiteční ve studiích efektorové funkce B lymfocytů, zvláště aktivace a diferenciace B lymfocytů. Antagonisti jsou užiteční jako reagencie při zkoumání charakteristik interakce ligand-receptor.

Sloučeniny určené jako antagonisti jsou také užitečné pro zesílení humorální imunitní odpovědi. Odpovědi B buněk jsou důležité pro potírání infekčních onemocnění, včetně infekcí způsobených bakteriemi, viry, prvoky a parazity. Protilátky proti infekčním mikroorganizmům mohou imobilizovat patogen tím, že se k antigenu vážou a • a · · · · ♦ · ·· • · · ···· · · ··· ·····* ^,v «····· · · · ♦ ♦ · po vazbě následuje komplementem zprostředkovaná lýza nebo buňkou zprostředkovaný útok. Antagonisti BR43x2 by sloužili pro zesílení humorální odpovědi a byli by užitečnými léčivy pro jedince, kteří jsou ohroženi infekční nemocí nebo jako doplněk k očkování.

Vynález také poskytuje antagonisty, kteří se buď vážou na polypeptidy BR43x2 nebo naopak k ligandu, ke kterému se vážou polypeptidy BR43x2, tudíž inhibují nebo ruší funkci BR43x2. Tito antagonisti BR43x2 by zahrnovali protilátky; oligonukleotidy, které se vážou buď k polypeptidu BR43x2 nebo kjeho ligandu; přirozené nebo syntetické analogy ligandů BR43x2, které si podržely schopnost vázat se k receptoru, následkem této vazby však nevydá signál ani ligand ani receptor. Takové analogy mohou být peptidy nebo sloučeniny podobající se peptidům. Přirozené nebo syntetické malé molekuly, které se vážou k polypeptidům BR43x2 a zabraňují vzniku signálu, jsou také počítány mezi antagonisty. Jako takoví, antagonisti BR43x2 by byli užiteční jako léčiva pro léčení určitých poruch, kde by bylo prospěšné blokování signálu buď od receptoru BR43x2 nebo ligandu. Antagonisti jsou užiteční jako reagencie při zkoumání charakteristik interakce ligand-receptor. BR43x2 je exprimován v transformovaných liniích B buněk, včetně EBV indukovaného a spontánního Burkittova lymfomu a v několika B buněčných myelomů. Inhibice funkce BR43x2 by byla užitečná pro léčení B buněčných lymfomů nebo mnohočetných myelomů. Antagonisti BR43x2, jako jsou rozpustné receptory BR43x2 nebo protilátky, mohou být použiti terapeuticky pro zprostředkování progrese nádoru.

Aktivita agonistů a antagonistů může být určena testy aktivity, které určují sílu spojení receptor/ligand. Stabilně transfekované linie B buněk, jako jsou Baf3 (linie myších pre-B buněk, Palacios a Steimetz, Cell 42: 727-34, 1985; Matchey-Prevot a kol., Mol. Cell. Biol. 6: 4133-5, 1986), které souběžně exprimují ve vysokých hladinách konstrukty pro NfKB, NFAT-1 a AP-1 s reportérovým genem, byly upraveny pro expresi BR43x2. Podobným způsobem byly také připraveny buněčné linie exprimující TACÍ a BCMA, také byly připraveny v buňkách Jurkat a v jiných buněčných liniích pocházejících z B lymfomů. Bylo zjištěno, že ztnf4 v těchto konstruktech signalizuje prostřednictvím reportérových genů. Pro měření vazby se mohou použít rozpustný BR43x2 a protilátky.

Přístup in vivo pro testování proteinů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, zahrnuje dodávací systémy virového typu. Příklady virů vhodných pro tento účel * · « ·· ·· ·· * · · * · · · · · · · · · · · · zahrnují adenovirus, herpesvirus, vakciniavirus a s adenovirem asociovaný virus (AAV). Adenovirus, virus s dvouřetězcovou DNA, je nyní nejlépe prostudovaný vektor pro přenos heterologní nukleové kyseliny (pro přehled viz Becker a kol., Meth. Cell Biol. 43: 161-89, 1994; a Douglas a Curiel, Science & Medicine 4: 44-53, 1997). Adenovirový systém poskytuje několik výhod: (i) adenovirus může pojmout relativně velké DNA inzerty; (ii) může vyrůst do vysokého titru; (iii) infikuje široké spektrum typů savčích buněk; a (iv) může být použit velký počet dostupných vektorů, které obsahují různé promotory. Také, protože adenoviry jsou stabilní v krevním oběhu, mohou být podávány pomocí nitrožilní injekce.

Po odstranění částí adenovirového genomu, mohou být do vektoru zabudovány větší inzerty (až do 7 kb) heterologní DNA. Tyto inzerty mohou být zabudovány do virové DNA pomocí přímé ligace nebo pomocí homologické rekombinace se současně transfekovaným plazmidem. V systému, který je uveden jako příklad, byl odstraněn z virového vektoru esenciální gen E1, a virus se nebude replikovat, pokud není gen E1 poskytnut hostitelskou buňkou (příkladem je lidská buněčná linie 293). Když je adenovirus podán nitrožilně do nedotčeného živočicha, primárně směřuje do jater. Pokud má dodávací adenovirový systém deleci genu E1, virus se nemůže v hostitelské buňce replikovat. Avšak hostitelská tkáň (např. játra) budou exprimovat a zpracovávat (a jestliže je přítomna signální sekvence, i sekretovat) heterologní protein. Sekretované proteiny vstoupí do oběhu ve vysoce krevně zásobených játrech a mohou být určeny účinky na infikovaného živočicha.

Adenovirový systém může být také použit pro produkci proteinu in vitro. Při kultivaci adenovirem infikovaných buněk, jiných než jsou buňky 293, za podmínek, kdy se buňky příliš rychle nedělí, buňky mohou produkovat proteiny po dlouhá časová období. Například buňky BHK jsou vypěstovány do souvislého nárůstu, potom jsou vystaveny adenovirovému vektoru, který kóduje požadovaný sekretovaný protein. Buňky jsou potom pěstovány za podmínek bez séra, které umožní infikovaným buňkám přežívat několik týdnů bez výrazného buněčného dělení. Jinou možností je, že adenovirovým vektorem infikované buňky 293S mohou být pěstovány v suspenzní kultuře při relativně vysoké hustotě buněk, což umožňuje produkovat významná množství proteinu (viz Gamier a kol., Cytotechnol. 15: 145-55, 1994). Podle kteréhokoli postupu, může být exprimovaný, sekretovaný heterologní protein opakovaně izolován • 4 · 1 ·· > · ··· · β · ·· · · *· · • 6 · · » · · ·»· • · * » · · · · ·* l · ««·· · · · · · ···· ze supernatantu buněčné kultury. Při použití protokolu produkce v infikovaných buňkách 293S mohou být také efektivně získávány nesekretované proteiny.

Pro testování in vivo účinnosti rozpustných polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA, které jsou předmětem tohoto vynálezu, při určitých chorobných stavech, jsou k dispozici dobře zavedené živočišné modely. Zvláště mohou být rozpustné polypeptidy a polypeptidové fragmenty BR43x2, TACÍ nebo BCMA testovány in vivo na řadě živočišných modelů autoimunních chorob, jako jsou kongenní myší kmeny MRL-Ipr/lpr nebo NZBxNZB F1, které slouží jako modely pro SLE (systemický lupus erythematodes). Takové živočišné modely jsou v oboru známé, viz například Modely autoimunních chorob - příručka, Cohen a Miller, vyd. Academie Press. U potomků křížení mezi kmenem novozélandské černé myši (NZB) a novozélandské bílé myši (NZW) se vyvíjí spontánní forma SLE, která se silně podobá SLE u lidí. Myš tohoto potomstva, známá jako NZBW, počíná ve věku 1 měsíce vyvíjet autoprotilátky IgM proti T buňkám, a ve věku 5 až 7 měsíců jsou u ní převládajícími imunoglobuliny lg anti-DNA autoprotilátky. Přecitlivělost polyklonálních B buněk vede k nadprodukci autoprotilátek. Ukládání těchto autoprotilátek, zvláště těch, které jsou zaměřené proti jednořetězcové DNA, je spojeno s vývojem glomerulonefritidy, která se klinicky projevuje jako vylučování proteinů močí, azotemie a smrt ze selhání ledvin. Selhání ledvin je hlavní příčinou smrti u myší se spontánním SLE a u kmene NZBW, tento proces je chronický a ucpává vnitřní dutiny. Průběh nemoci je rychlejší a prudší u samic než u samců, což znamená průměrné přežití pouze 245 dní u samic ve srovnání s 406 dny u samců. Zatímco mnoho samic bude mít příznaky (vylučování proteinů močí) ve stáří 7 až 9 měsíců, některé mohou být v době, kdy vyvinou příznaky, mnohem mladší nebo starší. Smrtelná imunní nefritida, projevující se u myší NZBW, je velmi podobná glomerulonefritidě, pozorované u lidského SLE, což činí tento spontánní myší model velmi atraktivní pro testování potenciálních léčiv SLE (Pitterman a Naparstek, Myší modely spontánního systemického lupus erythematodes, Modely autoimunních chorob - příručka, kap. 14, str. 217 až 234, 1994; Mohan a kol., J. Immunol. 154: 1470-80, 1995; a Daikh a kol., J. Immunol. 159: 3104-08, 1997). Podání rozpustného TACI-IG, BR43x2-lg, BCMA-lg nebo jiných rozpustných a fúzních proteinů těmto myším, aby mohl být zhodnocen vliv TACÍ, BR43x2 nebo BCMA na zmírnění příznaků a změnu průběhu nemoci je popsáno dále v oddílu příkladů.

44 ·* » *· ♦ ··*» 44·· · 44 * · * » -** » ··. »»··»· • 4 4444 · 4 ♦· ♦

Myší modely pro experimentální alergickou encefalomyelitidu (EAE) byly použity jako nástroj pro zkoumání jak mechanizmů této imunitou zprostředkované choroby, tak metod potenciálního terapeutického zásahu. Model připomíná lidskou roztroušenou sklerózu a nastává u ní demyelinizace, která je následkem aktivace T buněk neuroproteiny, jako je myelinový zásaditý protein (MBP) nebo proteolipidový protein (PLP). Očkování antigenem vede k indukci CD4+, třídy II MHC omezených T buněk (Th1). Změny v protokolu pro EAE mohou vyvolat akutní, chronicky se vracející nebo pasivně přenosnou variantu modelu (Weinberg a kol., J. Immunol. 162: 1818-26, 1999; Mijaba a kol., Cell. Immunol. 186: 94-102, 1999 a Glabinski, Meth. Enzym. 288: 182-90,

1997). Podání rozpustného TACI-IG, BR43x2-lg, BCMA-lg nebo jiných rozpustných a fúzních proteinů těmto myším, aby mohl být zhodnocen vliv TACÍ, BR43x2 nebo BCMA na zmírnění příznaků a změnu průběhu nemoci je popsáno dále v oddílu příkladů.

V modelu kolagenem indukované artritidy (CIA) se u myší vyvíjí chronická zánétlivá artritida, která silně připomíná revmatický zánět u lidí (RA). Protože CIA má společné imunologické a patologické příznaky s RA, činí ji to ideálním modelem pro testování lidských protizánětlivých sloučenin. Jinou výhodou při použití CIA modelu je, že jsou známy mechanizmy patogeneze. Na molekule kolagenu typu II byly identifikovány epitopy pro T a B buňky, a byly zjištěny různé imunologické (opožděná přecitlivělost a protilátky proti kolagenu) a zánětlivé (cytokiny, chemokiny a enzymy rozkládající matrix) parametry, které souvisejí s touto imunitou zprostředkovanou artritidou, a mohou být použity pro hodnocení účinnosti testovaných sloučenin na modelech (Wooley, Curr. Opin. Rheu. 3: 407-20, 1999; Williams a kol., Immunol. 89: 9784-788, 1992; Myers a kol., Life Sci. 61: 1861-78, 1997 a Wang a kol., Immunol. 92: 8955-959, 1995). Podání rozpustného TACI-IG, BR43x2-lg, BCMA-lg nebo jiných rozpustných a fúzních proteinů těmto myším, aby mohl být zhodnocen vliv TACÍ, BR43x2 nebo BCMA na zmírnění příznaků a změnu průběhu nemoci je popsáno dále v oddílu příkladů.

Modely pro bronchiální infekce, jako je astma, je možno vytvořit, když je myším injekčně podán ovalbumin a poté jsou opakovaně nazálně stimulovány antigenem, který vyvolá v průduškách astmatickou odpověď, která je podobná astmatu. Podání rozpustného TACI-lg, BR43x2-lg, BCMA-lg nebo jiných rozpustných a fúzních proteinů těmto myším, aby mohl být zhodnocen vliv TACÍ, BR43x2 nebo BCMA na zmírnění příznaků a změnu průběhu nemoci je popsáno dále v oddílu příkladů.

· · » • · · : :

• A · · · · • e · * ♦«· • · · · · ··· » »V · ·· *· * « · · í «· • * · 9 C ·* • 9 «· 99 999

Jiným použitím pro modely in vivo je podání provokační injekce antigenu živočichovi tak, že je mu podán rozpustný BR43x2 (TACÍ) nebo jeho ligand ztnf4 a je měřena odpověď T a B buněk.

Imunitní odpověď závislá na T buňkách a imunitní odpověď nezávislá na T buňkách mohou být měřeny tak, jak je popsáno v Perez-Melgosa a kol., J. Immunol. 163: 1123-7, 1999.

Může být vyvolána imunitní odpověď živočichů, kteří jsou podrobeni pravidelným dávkám antigenu, (například ovalbumin nebo kolagen), po kterých jsou podávány polypeptidy BR43x2, TACÍ nebo BCMA nebo jejich rozpustné fúzní konstrukty s Ig, a měřen účinek na odpověď B buněk.

Mohou být provedeny farmakokinetické studie za použití radioaktivně značených rozpustných polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA nebo jejich fúzí, pro určení distribuce a poločasu těchto peptidů in vivo. Další živočišné modely mohou být použity pro zjišťování účinků rozpustných BR43x2, TACÍ nebo BCMA na nádory a vývoj nádorů in vivo.

Polypeptidy BR43x2, TACÍ nebo BCMA je také možno použít jako náhradní markéry pro autoimunní choroby, nemoci ledvin a nemoci B a T buněk. Takovýmto pacientům je možno odebrat krev a rozpustné receptory BR43x2, TACÍ nebo BCMA a jejich ligandy mohou být v krvi detekovány.

Vynález také poskytuje protilátky. Protilátky proti BR43x2 nebo peptidům, které aminokyselinovou sekvenci jako SEQ ID NO: 8, mohou být získány, například tak, že je jako antigen použit produkt expresního vektoru, který obsahuje polypeptid o který se jedná nebo polypeptid izolovaný z přirozeného zdroje. Zvláště užitečné jsou protilátky jsou takové, které se „specificky vážou“ k BR43x2 nebo peptidům, které mají aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10. Protilátky jsou považovány za specificky se vázající, jestliže se protilátky vážou k polypeptidu BR43x2 nebo polypeptidu sekvence SEQ ID NO: 8, peptidu nebo epitopu s vazebnou afinitou (Ka) 10⁶ M'¹ nebo větší, výhodněji 10⁷ M’¹ nebo větší, ještě výhodněji 10⁸ M'¹ nebo větší a nejvýhodněji 10⁹ M‘¹ nebo větší. Vazebná afinita protilátky může být snadno určena osobou s běžnou zkušeností v oboru, například pomocí analýzy podle Scatcharda (Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51:660, 1949). Mezi vhodné protilátky patří takové protilátky, které se vážou k BR43x2, zvláště k extracelulární doméně BR43x2 (aminokyselinové zbytky ··· «··· ·· ·· ···· ·· ·· ·· až 120 ze sekvence SEQ ID NO: 2) a ty, které se vážou k polypeptidům, které mají aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 10.

Protilátky proti BR43x2 mohou být připravovány pomocí peptidů a polypeptidů nesoucích antigenní epitopy BR43x2. Peptidy a polypeptidy nesoucí antigenní epitopy BR43x2, které jsou předmětem tohoto vynálezu, obsahují sekvence alespoň devíti, výhodně mezi 15 až 30 aminokyselin, obsažených v sekvenci SEQ ID NO: 2. Avšak peptidy nebo polypeptidy, obsahující větší část aminokyselinové sekvence předloženého vynálezu, obsahující od 20 do 50 aminokyselin, nebo jakoukoli větší délku až k zahrnutí celé aminokyselinové sekvence polypeptidů, který je předmětem tohoto vynálezu, jsou také vhodné pro indukování protilátek, které se vážou k BR43x2. Je žádoucí, když je aminokyselinová sekvence peptidů nesoucího epitop vybrána tak, aby zabezpečila dobrou rozpustnost ve vodných roztocích (tj. sekvence obsahuje relativně hydrofilní zbytky, zatímco je výhodné vynechat zbytky hydrofobní). Hydrofilní peptidy může předpovědět osoba se zkušeností v oboru podle vynesení hydrofobnosti, viz například Hopp a Woods., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 3824-3828, 1981) a Kyte a Doolittle (J. Mol. Biol. 157: 105-142, 1982). Dále mohou být pro produkci protilátek žádoucí aminokyselinové sekvence, které obsahují prolinové zbytky.

Polyklonální protilátky proti rekombinantnímu BR43x2 proteinu nebo proti BR43x2, izolovanému z přirozených zdrojů, mohou být připraveny pomocí metod, které jsou dobře známé osobám se zkušeností v oboru. Viz například Green a kol., Produkce polyklonálních antisér, v Imunochemické protokoly (Manson, vyd.), str. 1 až 5 (Humana Press 1992), a Williams a kol., Exprese cizorodých proteinů v E. coli pomocí plazmidových vektorů a purifikace specifických polyklonálních protilátek, v Klonování DNA 2: Exprimující systémy, 2. vydání, Glover a kol., (vyd.), str. 15 (Oxford University Press 1995). Imunogenicita polypeptidů BR43x2 může být zvýšena použitím adjuvans, jako je alum (hydroxid hlinitý) nebo kompletní či nekompletní Freudovo adjuvans. Polypeptidy výhodné pro imunizaci také zahrnují fúzní polypeptidy, jako jsou fúzní polypeptidy BR43x2 nebo jeho části s polypeptidem imunoglobulinu nebo s proteinem, který váže maltózu. Polypeptidový imunogen může být molekula o plné délce nebo její část. Pokud část polypeptidů je podobná haptenu, taková část může být pro imunizaci s výhodou připojena nebo vázána k makromolekulárnímu nosiči (jako je hemokyanin keyhole limpet (KLH), hovězí sérumalbumin (BSA) nebo tetanický toxoid).

4 · · · * ♦ ·· · • 4 · · ····4·· ·· · ···· 4·

Třebaže polyklonální protilátky jsou typicky vyvolávány u živočichů jako jsou koně, krávy, psi, kuřata, krysy, myši, králíci, křečci, morčata, kozy nebo ovce, protilátky proti BR43x2, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být také odvozeny z protilátek primátů. Obecné techniky pro vyvolání diagnosticky a terapeuticky vhodných protilátek u paviánů je možno nalézt například v Goldenberg a kol., mezinárodní patent WO 91/11 465 a v Losman a kol., Int. J. Cancer 46: 310, 1990. Vznik protilátek je možno také vyvolat u transgenních živočichů,jako jsou transgenní ovce, krávy, kozy nebo vepři, nebo mohou být v pozměněných formách exprimovány v kvasinkách a houbách, a stejně tak v savčích a hmyzích buňkách.

Jinou možností je příprava monoklonálních protilátek. Hlodavčí monoklonální protilátky proti specifickým antigenům je možno získat pomocí metod, které jsou známé osobám se zkušeností v oboru (viz například Kohler a kol., Nátuře 256: 495, 1975, Coligan a kol. (vyd.), Současné protokoly v imunologii, sv. 1, str. 2.5.1 až 2.6.7 (John Wiley & Sons 1991), Picksley a kol., Produkce monoklonálních protilátek proti proteinům exprimovaným v E. coli, v Klonování DNA 2: Exprimující systémy, 2. vydání, Glover a kol., (vyd.), str. 93 (Oxford University Press 1995)).

Krátce řečeno, monoklonální protilátky je možno získat tak, že myši je injekčně podán prostředek obsahující produkt genu BR43x2, je ověřena přítomnost produkce protilátek pomocí odebrání vzorku séra, je odstraněna slezina, aby byly získány B lymfocyty, B lymfocyty jsou fúzovány s myelomovými buňkami a jsou tak vytvořeny hybridomy, hybridomy jsou klonovány, jsou vybrány pozitivní klony, které produkují protilátky proti antigenu, tyto produkující klony jsou pěstovány a jsou izolovány protilátky z hybridomových kultur.

Dále mohou být protilátky proti BR43x2, které jsou předmětem tohoto vynálezu, odvozeny z lidských monoklonálních protilátek. Lidské monoklonální protilátky je možno získat z transgenních myší, které byly přizpůsobeny pro produkování specifických lidských protilátek, jakožto odpověď na antigenní podnět. V této technice jsou elementy lokusu lidského těžkého a lehkého řetězce vneseny do myších kmenů odvozených z linií embryonálních kmenových buněk, které obsahují cílená přerušení v endogenních lokusech těžkého a lehkého řetězce. Transgenní myši mohou syntetizovat lidské protilátky specifické proti lidským antigenům a myši je možno použít pro produkci hybridomů, které sekretují lidské protilátky. Metody pro získání lidských protilátek z transgenních myší jsou popsány například v Green a kol., Nat. Genet. 7:

13, 1994, Lonberg a kol., Nátuře 368: 856, 1994 a Taylor a kol., int. Immun. 6: 579, 1994.

Monoklonální protilátky mohou být izolovány a purifikovány z hybridomových kultur pomocí řady dobře vypracovaných technik. Takové izolační techniky zahrnují afinitní chromatografií s Protein-A Sepharosou, chromatografií podle velikosti molekul a chromatografií na iontoměničích (viz například Coligan na str. 2.7.1 až 2.7.12 a str.

2.9.1 až 2.9.3; Baines a kol., Purifikace imunoglobulinu G (IgG), v Metody v molekulární biologii, sv. 10, str. 79 až 104 (The Humana Press, lne. 1992)).

Pro zvláštní účely může být žádoucí připravit fragmenty protilátek proti BR43x2. Takové fragmenty protilátek mohou být získány například proteolytickým štěpením protilátky. Fragmenty protilátek mohou být získány běžnými metodami štěpením celých protilátek pomocí pepsinu nebo papainu. Pro ilustraci, fragmenty protilátek mohou být připraveny enzymatickým štěpením protilátek pomocí pepsinu, které poskytne 5S fragment označovaný F(ab')2· Tento fragment může být dále štěpen pomocí činidla redukujícího sulfanylové sloučeniny a vzniknou jednomocné fragmenty 3,5S Fab'. Popřípadě může být štěpící reakce provedena za použití blokující skupiny pro sulfanylové skupiny, která vzniká štěpením disulfidických vazeb. Jako alternativa, enzymatické štěpení pomocí papainu produkuje přímo dva jednomocné fragmenty Fab a fragment F_c. Tyto metody jsou popsány například v Goldenberg, patent US 4 331 647, Nisonoff a kol., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230, 1960, Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959, Edelman a kol., Metody v enzymologii, sv. 1, str. 422 (Academie Press 1967) a Coligan a kol. (vyd.), Současné protokoly v imunologii, sv. 1, str. 2.5.1 až 2.6.7 (John Wiley & Sons 1991).

Jiné metody pro štěpení protilátek, jako je oddělení těžkých řetězců, aby byly získány jednomocné fragmenty lehko a těžkého řetězce, další štěpení fragmentů nebo jiné enzymatické, chemické nebo genetické techniky mohou být použity, pokud se fragmenty vážou ktomu antigenu, který je rozpoznáván intaktní protilátkou.

Například fragmenty Fv obsahují spojení řetězců V_H a V_L. Toto spojení může být nekovalentní, jak je popsáno v Inbar a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69: 2659, 1972. Alternativně mohou být variabilní řetězce vázány disulfidickou vazbou mezi nebo mezi sebou spojeny pomocí chemikálií jako je glutaraldehyd (viz například Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12. 437, 1992).

• · • ·

Fv fragmenty mohou obsahovat řetězce V_H a V_L, které mohou být spojeny peptidovým linkerem. Tyto jednořetězcové proteiny vázající se na antigen (scFv) jsou připraveny pomocí konstrukce strukturálního genu obsahujícího DNA sekvence kódující domény V_H a V_L, které jsou vzájemně spojeny pomocí oligonukleotidů. Strukturální gen je vložen do expresního vektoru, který je potom vnesen do hostitelské buňky, jako je například E. coli. Rekombinantní hostitelské buňky syntetizují jeden polypeptidový řetězec s peptidem linkeru, který překlenuje dvě V domény. Metody pro přípravu scFv jsou popsány například veWhitlow a kol., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 97, 1991, také viz Bird a kol., Science 242: 423, 1988, Ladner a kol., patent US 4 946 778, Pack a kol., Bio/Technology 11: 1271, 1993, a Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437, 1992. Pro ilustraci, scFV může být získán tak, že lymfocyty jsou vystaveny in vitro BR43x2 a jsou jimi selektovány knihovny prezentující protilátky na fágu nebo podobných vektorech (například pomocí imobilizovaného nebo značeného proteinu nebo peptidů BR43x2). Geny kódující polypeptidy, které mají potenciální domény, vázající se na polypeptid BR43x2, mohou být získány prohledáváním náhodných peptidových knihoven prezentovaných na fágu (prezentace pomocí fága) nebo na bakterii, jako je například E. coli. Nukleotidové sekvence kódující polypeptidy je možno získat řadou způsobů, jako je pomocí náhodné mutageneze a náhodné syntézy polynukleotidů. Tyto knihovny prezentující náhodné peptidy mohou být použity pro hledání peptidů, které interagují se známým cílem, což může být protein nebo polypeptid, jako je ligand nebo receptor, makromolekula biologického nebo syntetického původu, nebo organické či anorganické sloučeniny. Techniky pro tvorbu a prohledávání takových knihoven, prezentujících náhodné peptidy, jsou v oboru známé (Ladner a kol., patent US 5 223 409, Ladner a kol., patent US 4 946 778, Ladner a kol., patent US 5 403 484, Ladner a kol., patent US 5 571 698 a Kay a kol., Phage Display of Peptides and Proteins (Academie Press, lne. 1996)) a knihovny prezentující náhodné peptidy a soupravy pro prohledávání takových knihoven jsou komerčně dostupné, například od Clontech (Palo Alto, CA), Invitrogen lne. (San Diego, CA), New England Biolabs, lne. (Beverly, MA) a Pharmacia LKB Biotechnology lne. (Piscataway, NJ). Knihovny prezentující náhodné peptidy mohou být prohledávány, kvůli identifikaci proteinů, které e vážou na BR43x2, pomocí zde uvedených sekvencí BR43x2.

Jinou formou fragmentu protilátky je peptid kódující jednu oblast, která určuje komplementaritu (CDR). CDR peptidy (tzv. minimální rozpoznávací jednotky) mohou • ·

být získány konstruováním genů kódujících CDR protilátky o kterou se jedná. Takové geny jsou připraveny například využitím polymerázové řetězové reakce pro syntézu variabilní oblasti podle RNA buňky produkující protilátku (viz například Larrick a kol., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991, Courtenay-Luck, Genetic Manipulation of Monoclonal, v Monoclonal Antibodies: Production, Engeneering and Clinical Application, Ritter a kol. (vyd.), str. 166 (Cambridge University Press 1995), a Ward a kol., Genetic Manipulation and Expression of Antibodies, v Monoclonal Antibodies: Principles and Application, Birch a kol., (vyd.), str. 137 (Wiley-Liss, lne. 1995)).

Jiná možnost je derivovat protilátku proti BR43x2 ze zušlechtěné monoklonální protilátky. Zušlechtěné monoklonální protilátky jsou připraveny přenesením myších oblastí, určujících komplementaritu, z těžkého a lehkého variabilního řetězce myšího imunoglobulinu, do lidské variabilní domény. Typické zbytky lidských protilátek jsou potom v podpůrných oblastech zaměněny za své myší protějšky. Použití proti látkových složek derivovaných ze zušlechtěných monoklonálních protilátek předchází potenciální problémy spojené s imunogenitou myších konstantních oblastí. Obecné techniky pro klonování variabilních domén myších imunoglobulinů jsou popsány například v Orlandi a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 3833, 1989. Techniky pro přípravu zušlechtěných monoklonálních protilátek jsou popsány například vJones a kol., Nátuře 321: 522, 1986, Carter a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 4285, 1992, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12: 437, 1992, Singer a kol., J. Immun. 150: 2844, 1993, Sudhir (vyd.) Antibody Engineering Protocols (Humana Press, lne. 1995, Kelley, Engineering Therapeutic Antibodies, v Protein Engineering: Principles and Practice, Cleland a kol., (vyd.) str. 399 až 434 (John Wiley & Sons, lne. 1996), a Queen a kol., patent US 5 693 762 (1997).

Polyklonální protilátky proti idiotypu je možno připravit imunizací živočicha protilátkami proti BR43x2 nebo jejich fragmenty, za pomoci standardních technik. Viz například Green a kol., Production of Polyclonal Antisera, v Methods in Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (vyd.), str. 1 až 12 (Humana Press 1992). Viz též Coligan a kol. (vyd.), Současné protokoly v imunologii, sv. 1, str. 2.4.1 až 2.4.7 (John Wiley & Sons 1991).

Jinou možností je připravit monoklonální protilátky proti idiotypu tím, že jsou za využití výše popsaných technik použity jako imunogeny protilátky proti BR43x2 nebo

jejich fragmenty. Jako jiná alternativa mohou být za využití výše popsaných technik připraveny zušlechtěné protilátky proti idiotypu nebo protilátky primátů proti idiotypu. Metody pro přípravu protilátek proti idiotypu jsou popsány například v Irie, patent US 5 208 146, Greene a kol., patent US 5 637 677 a Varthakavi a Minocha, J. Gen. Virol. 77: 1875, 1996.

Zde uvedené protilátky nebo polypeptidy mohou také být přímo nebo nepřímo konjugovány s léky, toxiny, radioaktivními izotopy a podobně, a tyto konjugáty pak použity pro in vivo diagnostické nebo terapeutické aplikace. Například polypeptidy nebo protilátky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být použity pro identifikaci nebo léčení tkání nebo orgánů, které exprimují odpovídající antikomplementární molekulu (například receptor respektive antigen). Přesněji, polypeptidy BR43x2 nebo protilátky proti BR43x2, nebo biologicky aktivní fragmenty nebo jejich části, mohou být připojeny k detekovatelným nebo cytotoxickým molekulám a dopraveny k savčím buňkám, tkáním nebo orgánům, které exprimují antikomplementární molekulu.

K polypeptidu nebo protilátce mohou být přímo nebo nepřímo připojeny vhodné detekovatelné molekuly, jedná se mimo jiné o radioaktivní izotopy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční markéry, chemiluminiscenční markéry, magnetické částice a podobně. K polypeptidu nebo protilátce mohou být přímo nebo nepřímo připojeny vhodné cytotoxické molekuly, jedná se mimo jiné o bakteriální nebo rostlinné toxiny (například difterický toxin, exotoxin Pseudomonas, ricin, abrin a podobně), rovněž terapeutické radioaktivní izotopy, jako je jód-131, rhenium-188 nebo yttrium-90 (buď jsou připojeny k polypeptidu nebo protilátce přímo nebo jsou připojeny nepřímo, například pomocí chelatační složky). Polypeptidy nebo protilátky mohou také být konjugovány s cytotoxickými léky, jako je adriamycin. Při nepřímém připojení detekovatelné nebo cytotoxické molekuly může být detekovatelná nebo cytotoxická molekula konjugována se členem páru komplement/antikomplement, přičemž druhý člen je připojen k polypeptidové nebo protilátkové části. Pro tyto účely je příkladem takového páru komplement/antikomplement pár biotin/streptavidin.

Rozpustné polypeptidy BR43x2 nebo protilátky proti BR43x2 mohou být přímo nebo nepřímo konjugovány s léky, toxiny, radioaktivními izotopy a podobně, a tyto konjugáty mohou potom být použity pro in vivo diagnostické nebo terapeutické aplikace. Například polypeptidy nebo protilátky, které jsou předmětem tohoto vynálezu, • · • · ·

• · mohou být použity pro identifikaci nebo léčení tkání nebo orgánů, které exprimují odpovídající antikomplementární molekulu (například receptor respektive antigen). Přesněji, polypeptidy BR43x2 nebo protilátky proti BR43x2, nebo biologicky aktivní fragmenty nebo jejich části, mohou být připojeny k detekovatelným nebo cytotoxickým molekulám a dopraveny k savčím buňkám, tkáním nebo orgánům, které exprimují antikomplementární molekulu.

K polypeptidu nebo protilátce mohou být přímo nebo nepřímo připojeny vhodné detekovatelné molekuly, jedná se mimo jiné o radioaktivní izotopy, enzymy, substráty, kofaktory, inhibitory, fluorescenční markéry, chemiluminiscenční markéry, magnetické částice a podobně. K polypeptidu nebo protilátce mohou být přímo nebo nepřímo připojeny vhodné cytotoxické molekuly, jedná se mimo jiné o bakteriální nebo rostlinné toxiny (například difterický toxin, exotoxin Pseudomonas, ricin, abrin a podobně), rovněž terapeutické radioaktivní izotopy, jako je jód-131, rhenium-188 nebo yttrium-90 (buď jsou připojeny k polypeptidu nebo protilátce přímo nebo jsou připojeny nepřímo, například pomocí chelatační složky). Polypeptidy nebo protilátky mohou také být konjugovány s cytotoxickými léky, jako je adriamycin. Při nepřímém připojení detekovatelné nebo cytotoxické molekuly může být detekovatelná nebo cytotoxická molekula konjugována se členem páru komplement/antikomplement, přičemž druhý člen je připojen k polypeptidové nebo protilátkové části. Pro tyto účely je příkladem takového páru komplement/antikomplement pár biotin/streptavidin.

Takové fúzní proteiny polypeptid-toxin nebo fúzní proteiny protilátka/fragmenttoxin mohou být použity pro potlačení nebo odstranění cílové buňky nebo tkáně (například při léčení nádorových buněk nebo tkání). Jiná možnost je, pokud polypeptid má mnoho funkčních domén (tj. aktivační doménu nebo doménu pro vazbu ligandu, plus cílovou doménu), pak fúzní protein obsahující pouze cílovou doménu může být vhodný pro nasměrování detekovatelné molekuly, cytotoxické molekuly nebo komplementární molekuly na buňku nebo typ tkáně, o který se jedná. V případech, kdy pouze doména fúzního proteinu obsahuje komplementární molekulu, pak antikomplementární molekula může být konjugována k detekovatelné nebo cytotoxické molekule. Takové fúzní proteiny doména-komplementární molekula tedy představují základní cílené prostředky pro dopravu konjugátů antikomplementárníchdetekovatelných/cytotoxických molekul ke specifickým buňkám/tkáním. Zde popisované konjugáty biologicky aktivních polypeptidů nebo protilátek mohou být podávány ·· ·· ·· ·· · · • ·· · · ·· · · • · · ···· · nitrožilně, do tepny nebo do kanálku, nebo mohou být podávány lokálně, na místo zamýšleného působení.

Mohou být připraveny protilátky proti rozpustným polypeptidům BR43x2, které jsou označeny His nebo FLAG™. Mohou být také připraveny protilátky proti MBPfúzním proteinům, produkovaným v E. coli. Alternativně mohou takové proteiny obsahovat fúzní protein s lidským Ig. Zvláště antisérum obsahující protilátky proti rozpustným polypeptidům BR43x2 označeným His-značkou nebo FLAG™ značkou, mohou být použity při imunohistochemické analýze tkáňové distribuce BR43x2 na lidských tkáních nebo tkáních z primátů. Rozpustné polypeptidy BR43x2 mohou být také použity k imunizaci myší pro přípravu monoklonálních protilátek k rozpustnému polypeptidů lidského BR43x2. Monoklonální protilátky k rozpustnému polypeptidů lidského BR43x2 mohou také být použity k napodobení spojení ligand/receptor, výsledkem toho je aktivace nebo inaktivace páru ligand/receptor. Například bylo ukázáno, že křížové propojení monoklonálních protilátek proti rozpustnému CD40 je stimulačním signálem pro B buňky, které byly suboptimálně aktivovány protilátkami proti IgM nebo LPS, a výsledkem je množení buněk a produkce imunoglobulinu. Tyto samé monoklonální protilátky, když jsou použity v roztoku, působí jako antagonisti tím, že blokují aktivaci receptoru. Monoklonální protilátky proti BR43x2 mohou být použity pro určování distribuce, regulace a biologické interakce páru BR43x2/BR43x2-ligand na specifických buněčných liniích, identifikovaných ve studiích tkáňové distribuce.

Vynález také poskytuje izolované a purifikované polynukleotidové sondy nebo primery pro BR43x2, TACÍ a BCMA. Takovými polynukleotidovými sondami může být RNA nebo DNA. DNA může být buď cDNA nebo genomová DNA. Polynukleotidové sondy jsou jednořetězcová nebo dvouřetězcové DNA nebo RNA, obecně se jedná o syntetické oligonukleotidy, ale mohou být vytvořeny z klonované cDNA nebo genomových sekvencí a budou obecně obsahovat alespoň 16 nukleotidů, častěji od 17 nukleotidů do 25 nebo více nukleotidů, někdy 40 až 60 nukleotidů a některých případech podstatnou část, doménu nebo dokonce celý gen nebo cDNA BR43x2. Sondy a primery jsou obecně syntetické oligonukleotidy, ale mohou být vytvořeny z klonované cDNA nebo genomových sekvencí nebo jejích komplementů. Analytické sondy budou obecně alespoň 20 nukleotidů dlouhé, třebaže se mohou použít i sondy poněkud kratší (14 až 17 nukleotidů). PCR primery jsou alespoň 5 nukleotidů dlouhé, s výhodou 15 nebo více nt, ještě výhodněji 20 až 30 nt. Krátké polynukleotidy je možno použít, když jsou cílem analýzy malé oblasti genu. Pro hrubé analýzy genů může polynukleotidová sonda obsahovat celý exon nebo více. Aby byl signál sond detekovatelný, mohou být pomocí technik, které jsou v oboru dobře známé, označeny enzymem, biotinem, radioaktivním izotopem, fluorescenčně, chemiluminiscenčné, paramagnetickou částicí a podobně, tyto značky jsou komerčně dostupné z mnoha zdrojů, jako jsou Molecular Probes, lne., Eugene, OR a Amersham Corp., Arlington Heights, IL. Výhodné oblasti, ze kterých je možno konstruovat sondy, jsou oblasti, které vážou ligand, nedokonalá opakování bohatá na cystein, signální sekvence a podobně. Techniky pro vývoj polynukleotidových sond a hybridizační techniky jsou v oboru známé, viz například Ausubel a kol., vyd., Současné protokoly v molekulární biologii, John Wiley and Sons, lne., NY, 1991. Polypeptidy BR43x2, TACÍ a BCMA a protilátky proti nim mohou být použity v diagnostických systémech pro detekování přítomnosti BR43x2, TACÍ a polypeptidů ligandů BCMA a BR43x2, TACÍ a BCMA, jako je ztnf4. Informace odvozená z takových detekčních metod by poskytla hlubší pohled na význam polypeptidů BR43x2 v různých nemocech a na to, jak mohou sloužit jako diagnostické nástroje u nemocí, pro něž jsou významné změněné hladiny BR43x2. Změněné hladiny polypeptidů receptorů BR43x2, TACÍ a BCMA mohou být znakem patologických stavů, včetně rakoviny, autoimunních poruch a infekčních nemocí.

V základním testu je molekula jednořetězcové sondy inkubována s RNA, izolovanou z biologického vzorku, za takových podmínek teploty a iontové síly, které podporují párování bází mezi sondou a cílovými druhy RNA BR43x2, TACÍ a BCMA. Po oddělení nevázané sondy od hybridizovaných molekul, je množství hybridů detekováno.

Zavedené hybridizační metody pro detekci RNA zahrnují analýzu typu Northern a dot/slot blot hybridizaci (viz například Ausubel a kol., vyd., Současné protokoly v molekulární biologii, John Wiley and Sons, lne., NY, 1991 a Wu a kol., (vyd.) Analýza exprese genů na úrovni RNA, v Metody genové biotechnologie, str. 225 až 239, (CRC Press, lne. 1997)). Sondy nukleové kyseliny mohou být kvůli detekci značeny radioaktivními izotopy jako je ³²P nebo ^S. Jiná možnost je detekovat BR43x2 RNA pomocí neradioaktivních hybridizačních metod (viz například Isaac (vyd.) Protokoly pro analýzu nukleové kyseliny pomocí neradioaktivních sond, Humana Press, lne., 1993). V typickém případě je neradioaktivní detekce dosaženo pomocí enzymatické přeměny chromogenních nebo chemiluminiscenčních substrátů. Pro ilustraci je možno jako neradioaktivní uvést biotin, fluorescein a digoxigenin.

Oligonukleotidové sondy BR43x2, TACÍ a BCMA jsou také užitečné pro diagnózu in vivo. Pro ilustraci, jedinci mohou být podány oligonukleotidy značené ¹⁸F a poté vizualizovány pomocí emisní pozitronové tomografie (Tavitian a kol., Nátuře Medicine 4: 467, 1998).

Řada diagnostických procedur využívá pro zvýšení citlivosti detekčních metod výhodu polymerázové řetězové reakce (PCR). Standardní techniky provádění PCR jsou dobře zavedeny (obecně viz Mathew (vyd.), Protokoly v lidské molekulární genetice (Humana Press, lne. 1991), White (vyd.), PCR protokoly: Současné metody a aplikace (Humana Press, lne. 1993), Cotter (vyd.), Molekulární diagnostika rakoviny (Humana Press, lne. 1996), Hanausek a Walaszek (vyd.) Protokoly nádorových markérů (Humana Press, lne. 1998), Lo (vyd.), Klinické aplikace PCR (Humana Press, lne.

1998) a Meltzer (vyd.) PCR v bioanalýze (Humana Press, lne. 1998)). Pro PCR mohou být navrženy primery tak, aby byla amplifikována sekvence kódující určitou doménu nebo motiv BR43x2, jako jsou například nedokonalá opakování bohatá na cystein v BR43x2, TACÍ nebo BCMA.

Jednou variantou PCR diagnostických testů je PCT pomocí reverzní transkriptázy (RT-PCR). V technice RT-PCR je z biologického vzorku izolována RNA, reverzně transkribována na cDNA a cDNA je inkubována s BR43x2 primery (viz například Wu a kol., (vyd.), Rychlá izolace specifických cDNA nebo genů pomocí PCR, v Metody genové biotechnologie, CRC Press, lne., str. 15 až 28, 1997). Potom je provedena PCR a její produkty jsou analyzovány pomocí standardních metod.

Pro ilustraci, RNA je izolována z biologického vzorku například pomocí metody lyžování buněk guanidium-thiokyanátem, která byla výše popsána. Alternativně je možno pro izolaci mRNA z buněčného lyzátu použít techniku pevné fáze. Jako primery pro reakci reverzní transkripce mohou být u izolované RNA použity náhodné oligonukleotidy, krátké homopolymery dT nebo antisense oligomery BR43x2, TACÍ nebo BCMA. Oligo-dT primery mají tu výhodu, že jsou amplifikovány různé nukleotidové sekvence mRNA, které mohou sloužit jako kontrola cílových sekvencí. Sekvence BR43x2, TACÍ nebo BCMA jsou amplifikovány polymerázovou řetězovou reakcí pomocí dvou oligonukleotidových primerů, sousedících s danou oblastí, které jsou alespoň 5 baží dlouhé.

Produkty PCR amplifikace mohou být detekovány pomocí řady přístupů. Například PCR produkty mohou být frakcionovány pomocí gelové elektroforézy a zviditelněny barvením ethidium bromidem. Jiná možnost je přenést frakcionované produkty na membránu, hybridizovat s označenou BR43x2 sondou a testovat autoradiograficky. Mezi jiné přístupy patří použití deoxyribonukleotidtrifosfátů značených digoxigeninem a provedení chemiluminiscenční detekce a kolorimetrický test C-TRAK.

Jiným přístupem je kvantitativní PCR v reálném čase (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Ct). Fluorogenní sonda, která se skládá z oligonukleotidu ke kterému je připojena jak reportérové, tak zhášecí barevná skupina, hybridizuje specificky mezi přímý a reverzní primer. Vlivem 5' endonukleázové aktivity Taq DNA polymerázy je reportérové barevná skupina oddělena od zhášecí barevné skupiny, vytvoří se tak sekvenčně specifický signál, který se zvyšuje stejně, jak se zvyšuje amplifikace. Intenzita fluorescence může být v průběhu PCR reakce kontinuálně sledována a kvantifikována.

Jiným přístupem pro detekci exprese BR43x2, TACÍ nebo BCMA je technologie cyklování sondy (CPT), při níž se jednořetězcová cílová DNA váže s přebytkem chimerní sondy DNA-RNA-DNA a vytváří komplex, jeho RNA část je štěpena Rnázou H, a je detekována přítomnost štěpené chimerní sondy (viz například Beggs a kol., J. Clin. Microbiol. 34: 2985, 1996 a Bekkanoui a kol., Biotechniques 20: 240, 1996). Alternativní metody pro detekci sekvencí BR43x2, TACÍ nebo BCMA mohou využívat přístupy jako je amplifikace založená na sekvenci nukleové kyseliny (NASBA), kooperativní amplifikace matric pomocí křížové hybridizace (CATCH) a ligázová řetězové reakce (LCR) (viz například Marshall a kol., patent US 5 686 272 (1997), Dyer a kol., J. Virol. Methods 60: 161, 1996; Ehricht a kol., Eur. J. Biochem. 243: 358, 1997 a Chadwick a kol., J. Virol. Methods 70: 59, 1998). Osobám se zkušeností v oboru jsou známy i jiné standardní metody.

Sondy a primery BR43x2, TACÍ a BCMA mohou být také použity pro detekci a lokalizaci genové exprese BR43x2, TACÍ a BCMA ve vzorcích tkání. Metody pro takovou in sítu hybridizaci jsou osobám se zkušeností v oboru dobře známy (viz například Choo (vyd.), Protokoly pro hybridizaci in šitu, Humana Press, lne., 1994; Wu a kol. (vyd.), Analýza buněčné DNA nebo nadbytku RNA pomocí radioaktivní in šitu hybridizace (RISH), v Metody genové biotechnologie, CRC Press, lne., str. 259 až 278,

1997 a Wu a kol. (vyd.), Analýza buněčné DNA nebo nadbytku mRNA pomocí radioaktivní hybridizace in šitu (RISH), v Metody genové biotechnologie, CRC Press, lne., str. 279 až 289, 1997).

Osobám se zkušeností v oboru jsou dobře známy další diagnostické přístupy (viz například Mathew (vyd.), Protokoly v lidské molekulární genetice, Humana Press, lne., 1991; Coleman a Tsongalis, Molekulární diagnostika, Humana Press, lne., 1996 a Elles, Molekulární diagnostika genetických chorob, Humana Press, lne., 1996).

Dále mohou být takové polynukleotidové sondy použity pro hybridizaci s odpovídajícími sekvencemi na jednotlivých chromozomech. Chromozomální identifikace a/nebo mapování genu BR43x2 může poskytnout užitečnou informaci o funkci genu a jeho spojení s chorobou. Osoby se zkušeností v oboru mají k dispozici mnoho mapovacích technik, například mapování hybridů somatických buněk a fluorescenční hybridizace in šitu (FISH). Výhodnou metodou je radiační hybridní mapování. Radiační hybridní mapování je genetická technika pro somatické buňky, vyvinutá pro konstruování souvislých map lidských chromozomů s vysokým rozlišením (Cox a kol., Science 250: 245-50, 1990). Částečná nebo úplná znalost sekvence genu umožňuje navržení PCR primerů vhodných pro použití s chromozomálními mapovacími panely radiačních hybridů. Mapovací panely radiačních hybridů, které pokrývají celý lidský genom, jako jsou Stanford G3 RH Panel a GeneBridge 4 RH Panel (Research Genetics, lne., Huntsville, AL), jsou komerčně dostupné. Tyto panely umožňují rychlou, na PCR založenou, chromozomální lokalizaci a zjištění pořadí genů, sekvenčně označených míst (STS) a jiných nepolymorfních a polymorfních markérů v zájmové oblasti. To zahrnuje stanovení přímo úměrných fyzikálních vzdáleností mezi nově objevenými geny o které se jedná a dříve mapovanými markéry. Přesná znalost polohy genů může být užitečná pro různé účely, mimo jiné: 1) určení, zda sekvence je částí existujícího kontigu a získání dalších okolních genetických sekvencí v různých formách, jako jsou YAC, BAC nebo cDNA klony, 2) poskytnutí možného kandidátního genu pro dědičnou chorobu, která vykazuje vazbu k téže oblasti chromozomu a 3) poskytnutí možného kandidátního genu pro modelové organizmy, jako je myš, které mohou být užitečné a nápomocné při zjišťování, jakou funkci určitý gen může mít.

Chromozomální lokalizace může být také provedena za pomoci STS. STS je DNA sekvence, která je jedinečná v lidském genomu a může být použita jako vztažný bod pro určitý chromozom nebo oblast chromozomu. STS může být definována pomocí páru oligonukleotidových primerů, které mohou být použity v polymerázové řetězové reakci pro specifickou detekci tohoto místa, v přítomnosti všech ostatních genomových sekvencí. Protože STS jsou založeny pouze na DNA sekvenci, mohou být kompletně popsány v databázi, například Databáze sekvenčně značených míst (dbSTS), GenBank, (Národní centrum pro biologické informace, Národní zdravotní instituty, Bethesda, MD http://www.ncbi.nlm.nih.gov), mapová data obsažená uvnitř těchto krátkých význačných orientačních STS sekvencí genomu mohou být vyhledávána spolu s genovou sekvencí, o kterou se jedná.

Předložený vynález také poskytuje reagencie pro další diagnostické aplikace. Například gen BR43x2, sonda obsahující BR43x2 DNA nebo RNA, nebo jeho sekvence může být použita pro určování, zda je BR43x2 gen přítomen na určitém chromozomu nebo zda nastala mutace. Detekovatelné chromozomální odchylky v lokusu genu BR43x2 zahrnují mimo jiné aneuploidii, změny počtu genových kopií, inzerce, delece, změny restrikčních míst a změny uspořádání. Tyto odchylky mohou nastat uvnitř kódující sekvence, uvnitř intronů nebo v okolních sekvencích, včetně promotorových a regulačních oblastí, nacházejících se proti směru přepisu, a mohou se projevovat jako fyzické změny uvnitř kódující sekvence nebo změnami v úrovni exprese genu.

Obecně tyto diagnostické metody obsahují kroky a) získání genetického vzorku od pacienta; b) inkubace genetického vzorku s polynukleotidovou sondou nebo primerem, jak bylo popsáno výše, za podmínek kdy polynukleotid bude hybridizovat s komplementární polynukleotidovou sekvencí a vytvářet první reakční produkt; a c) porovnání prvního reakčního produktu s kontrolním reakčním produktem. Rozdíly mezi prvním reakčním produktem a kontrolním reakčním produktem jsou znakem genetické abnormality u pacienta. Genetické vzorky, vhodné pro použití v rámci předloženého vynálezu, zahrnují genomovou DNA, cDNA a RNA. Polynukleotidovou sondou nebo primerem může být RNA nebo DNA a bude obsahovat část SEQ ID NO: 3, sekvenci komplementární k SEQ ID NO: 1 nebo jejich RNA ekvivalent. Mezi vhodné testy v tomto směru patří takové techniky, které jsou známy osobám se zkušeností v oboru, jako jsou analýza polymorfizmu restrikčních fragmentů (RFLP) analýza krátkých tandemových repetic (STR) používající PCR techniky, ligační řetězová reakce (Barany, PCR Metods and Application 1: 5-16, 1991), testy protekce před ribonukleázou a jiné techniky genetické vazebné analýzy, známé v oboru (Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989;

Ausubel a kol., vyd., Současné protokoly v molekulární biologii, John Wiley and Sons, lne., NY, 1991; Marian, Chest 108: 255-65, 1995). Testy protekce před ribonukleázou (viz např. Ausubel a kol., vyd., Současné protokoly v molekulární biologii, John Wiley and Sons, lne., NY, 1991; Marian, Chest 108: 255-65, 1995, kap. 4) obsahují hybridizaci RNA sondy ke vzorku RNA od pacienta a poté je reakční produkt (RNARNA hybrid) vystaven RNáze. Hybridizované oblasti RNA jsou před štěpením chráněny. V PCR testech je genetický vzorek od pacienta inkubován s párem polynukleotidových primerů a oblast mezi primery je amplifikována a izolována. Změny ve velikosti nebo množství získaného produktu jsou znakem mutací u pacienta. Jiná technika založená na PCR, která může být použita, je analýza jednořetězcového konformačního polymorfizmu (SSCP) (Hayashi, PCR metody a aplikace 1: 34-8, 1991).

Aby se dosáhlo potlačení transkripce genů BR43x2, TACÍ nebo BCMA, mohou být použity antisense metody, jako např. pro potlačení vývoje B buněk a interakce s jinými buňkami. Jsou navrženy polynukleotidy, které jsou komplementární k úseku polynukleotidu kódujícího BR43x2, TACÍ nebo BCMA (např. polynukleotid uvedený v SEQ ID NO: 3), které se vážou k mRNA kódující BR43x2, TACÍ nebo BCMA, a inhibuji translaci této mRNA. Takové antisense polynukleotidy jsou použity pro inhibici exprese genů kódujících polypeptid BR43x2, TACÍ nebo BCMA v buněčné kultuře nebo v jedinci.

Mohou také být připraveny myši geneticky upravené tak, aby exprimovaly BR43x2, TACÍ nebo BCMA, označované jako „transgenní myši“ a myši, kterým funkce BR43x2, TACÍ nebo BCMA zcela chybí, označované jako „knockoutované myši“ (Snouwaert a kol., Science 257: 1083, 1992; Lowell a kol., Nátuře 366: 740-42, 1993; Capecchi, Science 244: 1288-92, 1989; Palmiter a kol., Annu. Rev. Genet. 20: 465-99, 1986). Například transgenní myši, které syntetizují nadbytek BR43x2, TACÍ nebo BCMA buď všeobecné nebo specificky v určité tkáni nebo pod promotorem omezeným na určitou tkáň, mohou být použity k řešení otázky, zda nadbytečná exprese způsobuje specifický fenotyp. Například nadbytečná exprese standardního typu polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA, fragmentu polypeptidů nebo jejich mutace, může změnit normální buněčné procesy a mít za následek fenotyp, který vyznačuje tkáň ve které je exprese BR43x2, TACÍ nebo BCMA funkčně významná, a může znamenat léčebný cíl pro BR43x2, TACÍ nebo BCMA nebo pro jejich agonisty nebo antagonisty. Například je výhodné připravit takovou transgenní myš, která v nadbytku produkuje BR43x2, TACÍ • ·

nebo BCMA. Dále taková nadbytečná exprese může mít za následek fenotyp, který vykazuje podobnost s lidskými chorobami. Podobně myš s knockoutovaným BR43x2, TACÍ nebo BCMA může být použita pro určení, kde in vivo je BR43x2 absolutně vyžadován. Podle fenotypu knockoutované myši je možno předpovědět in vivo účinky, které mohou mít antagonisti BR43x2, TACÍ nebo BCMA, které jsou předmětem tohoto vynálezu. Lidská BR43x2, TACÍ nebo BCMA cDNA může být použita pro izolaci myší BR43x2, TACÍ nebo BCMA mRNA, cDNA a genomové DNA, které jsou potom použity pro přípravu knockoutované myši. Tyto myši mohou být použity pro studium BR43x2, TACÍ nebo BCMA genu a jím kódovaného proteinu v in vivo systému, a mohou být použity jako in vivo modely pro odpovídající lidské choroby. Dále transgenní exprese BR43x2, TACÍ nebo BCMA antisense polynukleotidů nebo ribozymů, namířených proti BR43x2, TACÍ nebo BCMA, která je zde popsána, může být použita analogicky k transgenním myším, popsaným výše.

Farmaceuticky účinná množství polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být sestavena běžnými metodami s farmaceuticky přijatelnými nosiči pro parenterální, orální, nosní, rektální, místní, dermální podávání nebo podobně. Přípravky mohou dále obsahovat jeden nebo více ředidel, plnidel, emulgátorů, konzervačních činidel, pufrů, excipientů a podobně, a mohou být podávány v takových formách jako jsou například roztoky, prášky, emulze, čípky, lipozómy, kožní náplasti a tablety. Aby byl zabezpečen kontinuální nebo dlouhodobý zdroj BR43x2 polypeptidu nebo antagonisty, mohou být se zde popsanými prostředky také použity dodávací systémy pro pomalé či zvýšené uvolňování, včetně jakéhokoli z množství biologických polymerů (systémy na biologickém základě), systémy využívající lipozómy a polymerové dodávací systémy. Takové systémy pro pomalé uvolňování jsou použitelné například pro přípravky pro orální, místní a parenterální použití. Termín „farmaceuticky přijatelný nosič“ označuje nosičové médium, které neinterferuje s účinností biologické aktivity aktivních složek a které není pro hostitele nebo pacienta toxické. Osoba se zkušeností v oboru může sestavit sloučeniny, které jsou předmětem tohoto vynálezu, vhodným způsobem a v souhlase s přijatou praxí, jak je uvedeno v Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, vyd., Mack Publishing Co., Easton PA, 19. vyd. 1995.

Zde použitý termín „farmaceuticky účinné množství“ polypeptidu BR43x2, TACÍ nebo BCMA, agonistů nebo antagonisty, je množství postačující k indukci • · *♦ · · * *· · • »· · » » · · · >· • · · ······ · · · » · · ·· ·

ΌΌ 9 9 ♦ » · · »· ··9 9 9 požadovaného biologického výsledku. Výsledek může být zmírnění příznaků, symptomů nebo příčin nemoci, nebo jakákoli jiná požadovaná změna biologického systému. Například účinné množství polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA je takové, které poskytne buď subjektivní úlevu od příznaků nebo objektivně zjistitelné zlepšení, pozorované klinikem nebo jiným kvalifikovaným pozorovatelem. Například účinné množství polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA nebo rozpustného fúzního polypeptidů by poskytlo snížení odpovědi B buněk v průběhu imunitní odpovědi, potlačení nebo snížení produkce autoprotilátek, potlačení nebo zmenšení příznaků spojených s SLE, MG nebo RA. Účinná množství BR43x2, TACÍ nebo BCMA sníží procento B buněk v periferní krvi. Účinná množství polypeptidů BR43x2, TACÍ nebo BCMA mohou široce varírovat v závislosti na nemoci nebo příznaku, který má být léčen. Množství polypeptidů, které bude podáváno a jeho koncentrace v přípravku závisí na vybraném nosiči, způsobu podávání, síle účinku určitého polypeptidů, klinických podmínkách pacienta, vedlejších účincích a stabilitě sloučeniny v přípravku. Klinik tedy použije vhodný prostředek obsahující vhodnou koncentraci v přípravku, rovněž množství podaného přípravku, v závislosti na klinické zkušenosti s pacientem o kterého se jedná nebo s pacienty podobnými. Takové množství závisí bude záviset částečně na určitém léčeném stavu, věku, váze a všeobecném zdravotním stavu pacienta a jiných faktorech, které jsou zřejmé osobám se zkušeností v oboru. V typickém případě bude dávka v rozmezí 0,1 až 100 mg/kg hmotnosti jedince. Dávky pro specifické sloučeniny mohou být určeny ze studií in vitro nebo ex vivo, v kombinaci se studiemi na pokusných zvířatech. Koncentrace sloučenin, které byly zjištěny jako účinné in vitro nebo ex vivo, poskytují vodítko pro studie na zvířatech, kde dávky jsou spočítány tak, aby zabezpečily v místě působení podobné koncentrace.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje porovnání aminokyselinových sekvencí mezi BR43x2, TACÍ (von Búlow a Bram, Science 228: 138-41, 1997) (SEQ ID NO: 6), BCMA (Gras a kol., tamtéž) (SEQ ID NO: 6) a BR43x1 (SEQ ID NO: 7). Jsou vyznačeny na cystein bohatá nedokonalá opakování a transmembránová doména.

«4 · · · · · · · · • · · · · · · · ·· « · · · · · · ··

Obrázek 2 ukazuje analýzu vynesení podle Scatcharda pro rozpustný I¹²⁵-ztnf4, vázající se k TACÍ a BMCA, které jsou exprimovány stabilně transfekovanými buňkami BHK.

Obrázek 3A ukazuje jak ztnf4 aktivuje lidské B lymfocyty k proliferaci a sekreci imunoglobulinu.

Obrázek 3B ukazuje hladiny IgM a IgG měřené v supernatantech získaných z B buněk, stimulovaných rozpustným ztnf4 v přítomnosti IL4 nebo IL4+IL5, po 9 dnech v kultuře.

Obrázek 4 ukazuje B buňky z lidské periferní krve, stimulované rozpustným ztnf4 nebo kontrolním proteinem (ubiquitin) v přítomnosti IL4 po dobu 5 dní in vitro. Vyčištěný TACI-lg, BMCA-lg a kontrolní Fc byly testovány na inhibování proliferace specifické pro ztnf4.

Obrázek 5A ukazuje výsledky ze zvířat transgenních na ztnf4, u kterých se vyvinuly charakteristiky SLE.

Obrázek 5B ukazuje buňky lymfatické uzliny, sleziny a brzlíku ze zvířat transgenních na ztnf4, barvené pomocí protilátek proti CD5, CD4 a CD8.

Obrázek 5C ukazuje celkové hladiny IgM, IgG a IgE v séru zvířat transgenních na ztnf4, starých v rozmezí od 6 do 23 týdnů.

Obrázek 5D ukazuje ukládání amyloidu a ztloustnutí mesangia v ledvinových klubíčkách, zjištěné na řezech ledvin ze zvířat transgenních na ztnf4.

Obrázek 5E ukazuje efektorové T buňky z myších transgenních na ztnf4.

Obrázky 6A a 6B ukazují zvýšené hladiny ztnf4 v séru získaném z ZNBWF1 a MRL/Ipr/lpr myší, které korelují s vývojem SLE.

Obrázek 7 ukazuje procento NZBWF1 myší, u kterých se v průběhu studie vyvinulo vylučování proteinů močí.

Obrázek 8 ukazuje hladiny anti-dsDNA zjišťované pomocí ELISA u myší transgenních na ztnf4a kontrolních jedinců z téhož vrhu, v porovnání se sérem z ZNBWF1 a MRL/Ipr/lpr myší.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Identifikace BR43x2 « ·· · · · · * · «· ·· 0 · · 0 · » * «··»»· ·· ♦· ·· »

Isoforma TACÍ byla klonována z RPMI knihovny pomocí přístupu se zachycením pomocí sekrece. Knihovna RPMI 1788 (aktivovaná linie B buněk) byla uspořádána pomocí dvaceti 96-jamkových destiček. Každá jamka obsahovala asi 100 kolonií E. coli, přičemž každá kolonie obsahovala 1 cDNA klon. Pomocí zařízení TomTech Quadra 9600 byly připraveny minipreparáty DNA v 96-jamkovém formátu. Izolované DNA byly potom spojeny do 120 směsí, z nichž každá představovala 1600 klonů. Tyto směsi byly transfekovány do buněk Cos-7 a vysety do 12-jamkových destiček. Tři mikrolitry směsné DNA a 5 pl LipofectAMINE byly smíchány v 92 μΙ média DMEM bez séra (55 mg pyrohroznanu sodného, 146 mg L-glutaminu, 5 mg transferinu, 2,5 mg inzulínu, 1 pg selenu a 5 mg fetuinu v 500 ml DMEM), inkubovány při teplotě místnosti po dobu 30 minut a potom bylo přidáno 400 μΙ média DMEM bez séra. Směs DNA-LipofectAMINE byla přidána na 220 000 buněk COS-7/jamku, vysetých v 12-jamkových tkáňových destičkách a inkubovány po dobu 5 hodin při teplotě 37 °C. Po inkubaci bylo ke každé jamce přidáno 500 μΙ 20% FBS DMEM média (100 ml FBS, 55 mg pyrohroznanu sodného a 146 mg L-glutaminu v 500 ml DMEM) a buňky byly inkubovány přes noc.

Výběr pomocí zachycení sekrece byl proveden biotinylovaným ztnf4, označeným pomocí FLAG. Buňky byly opláchnuty PBS a fixovány po dobu 15 minut s1,8% formaldehydem v PBS. Buňky byly potom promyty pomocí TNT (0,1 M Tris-HCI, 0,15 NaCl a 0,05% Tween-20 v H₂O). U buněk byla učiněna buněčná membrána prostupnou pomocí 0,1% Tritonu-X v PBS po dobu 15 minut a potom následovalo promytí v TNT. Buňky byly blokovány po dobu 1 hodiny sTNB (0,1 M Tris-HCI, 0,15 M NaCl a 0,5% Blokující činidlo) za použití soupravy NEN Renaissance® TSA-Direct Kit (NEN, Boston, MA) podle návodu výrobce. Buňky byly promyty pomocí TNT a blokovány po dobu 15 minut s avidinem a potom biotinem (Vector Labs Cat # SP-2001), mezi těmito kroky byly buňky promývány TNT. Buňky byly inkubovány po dobu 1 hodiny s 1 pg/ml ztnf4/Flag/biotin v TNB, poté následovalo promytí s TNT. Buňky byly potom inkubovány po dobu 1 hodiny s 1:300 ředěním streptavidin-HRP (NEN) v TNB a promyty sTNT. Hybridizace byla detekována činidlem fluorescein tyramid ředěným 1:50 v ředícím pufru (NEN), inkubovány 4,4 minuty a promyty TNT. Buňky byly uchovány v médiu Vectashield Mounting Medium (Vector Labs, Burlingame, CA), ředěném 1:5 v TNT.

Buňky byly vizualizovány pomocí fluorescenční mikroskopie s použitím filtru FITC. Dvanáct směsí bylo pozitivních na vazbu ztnf4. Směs D8 (představující 1600 klonů) byla rozdělena a byl izolován jeden klon (D8-1), pozitivní na vazbu ztnf4. Sekvenční analýza odhalila, že klon D8-1 obsahoval polypeptidovou sekvenci, která kódovala isoformu TACÍ, v níž první nedokonalé opakování TACÍ bohaté na cystein Phe21 až Arg67, bylo zaměněno jedním aminokyselinovým zbytkem, tryptofanem. Tato isoforma byla označena BR43x2, jejíž polynukleotidová sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 1.

Příklad 2: Lokalizace BR43x2 v lymfocytech a monocytech

Pro lokalizaci exprese BR43x2 v T a B buňkách a monocytech byla použita PCR reakce prováděná pomocí reverzní transkriptázy. Oligonukleotidové primery ZC19 980 (SEQ ID NO: 15) a ZC19 981 (SEQ ID NO: 16) byly použity pro prohledávání cDNA z CD19⁺, CD3⁺ a monocytů na BR43. Reakce s reverzní transkriptázou byla provedena při 94 °C po dobu 3 minut, následovalo 30 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 68 °C po dobu 2 minut a 72 °C po dobu 1 minuty, nakonec následovalo 7 minutové prodloužení při 72 °C. Zóna o očekávané délce 720 bp byla detekována pouze v B buňkách a nikoli v aktivovaných T buňkách, jak bylo po použití protilátek publikováno pro TACÍ (von Búlowa Bram, Science 228: 138-41, 1997).

Příklad 3: Test množení B buněk za použití BR43 ligandu ztnf4

Lahvička obsahující 1x10⁸ zmražených mononukleárních buněk z periferní krve (PBMC) byla rychle rozmražena ve vodní lázni 37 °C a resuspendována v 25 ml média pro B buňky (Dulbeccovo médium modifikované Iscovem, 10% tepelné inaktivované fetální hovězí sérum, 5% L-glutamin, 5% Pen/Strep) v 50 ml zkumavce. Životaschopnost buněk byla testována pomocí trypanové modři (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Deset mililitrů Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology lne., Piscataway, NJ) bylo navrstveno pod buněčnou suspenzi a centrifugováno po dobu 30 minut při 1800 otáčkách za minutu a ponecháno zastavit bez brždění. Potom byla vrstva mezifáze odebrána a přenesena do čerstvé 50 ml zkumavky, doplněna do výsledného objemu 40 ml PBS a centrifugována po dobu 10 minut při 1200 otáčkách za minutu s brzděním. Životaschopnost izolovaných B buněk byla testována pomocí trypanové modři. B buňky byly resuspendovány na konečnou koncentraci 1x10⁶ buněk/ml v médiu pro B buňky a vysety v objemu 180 μΙ/jamku do 96-jamkových destiček se dnem ve tvaru „U“ (Falcon, VWR, Seattle, WA).

ΊΟ · «· · 9 »9«9 ···· · · · ·99 • · 9 · 9 9 99«

9« 9 9 9 9 99 9*99

Κ buňkám byl přidán jeden následujících stimulátorů, kterým byl objem doplněn do 200 pl/jamku:

Rozpustný ztnf-4sCF značený pomocí FLAG nebo ztnf-4sNF, při 10-násobných ředěních od 1 mg do 1 ng/ml buď samotný, s 10 pg/ml anti-IgM (kozí protilidský IgM) ředěný v NaHCO₃, pH 9,5, (Southern Biotechnology Associates, lne., Birmingham, AL); nebo s 10 pg/ml anti-IgM a 10 ng/ml rekombinantního lidského IL4 (ředěný v PBS a 0,1% BSA). Dále rovněž byly testovány jiné cytokiny, jako je IL-3 a IL-6, stejně tak i rozpustná protilátka CD40 (sCD40) (Pharmingen, San Diego, CA). Jako kontrola byly buňky inkubovány s 0,1% hovězím albuminem (BSA) a PBS, 10 pg/ml anti-IgM nebo 10 pg/ml anti-IgM a 10 ng/ml IL4 (nebo jiné cytokiny). Buňky byly potom inkubovány při 37 °C v inkubátoru s vlhkou atmosférou po dobu 72 hodin. Šestnáct hodin před závěrečným odebíráním buněk bylo ke všem jamkám přidáno 1 pCi ³H tymidinu. Buňky byly potom odebrány do 96-jamkové filtrační destičky (UniFilter GF/C, Packard, Meriden, CT) kde byly sesbírány pomocí zařízení na sbírání buněk (Packard) a shromážděny podle návodu výrobce. Destičky byly sušeny při 55 °C po dobu 20 až 30 minut a dno jamek bylo utěsněno pomocí matného těsnění pro tyto destičky. Ke každé jamce bylo přidáno 0,25 ml scintilační tekutiny (Microscint-0, Packard) a destičky byla změřena pomocí zařízení pro měření scintilace TopCount Microplate Scintillation Counter (Packard).

Pro měření indukování produkce IgG jako odpověď na různé mitogeny B buněk po stimulaci purif i kovaných B buněk, byly buňky připraveny podle popsaného postupu a inkubovány po dobu 9 dní. Supernatant z buněk byl sbírán pro zjišťování produkce IgG.

Pro měření aktivace markérů na buněčném povrchu jako odpověď na různé mitogeny B buněk po stimulaci purifikovaných B buněk, byly buňky připraveny podle výše popsaného postupu, ale inkubovány pouze po dobu 48 hodin. Markéry na buněčném povrchu byly měřeny pomocí FACS analýzy.

Množení purifikovaných lidských B buněk, stimulovaných různými mitogeny B buněk je souhrnně uvedeno v tabulce 5.

4· «« ·* *9 «9

Stimul

Proliferativní index • 3 · i ♦ · · 09 • · · · < * · · < · 9 »9 »·Ι· ·· 99 Λ· ···

Tabulka 5 ztnf4 ztnf4 + IL4

1,5

9,9 ztnf4 + anti-IgM + IL4

15,8

Byl vidět synergický efekt ztnf4 s IL4, IL3 (10 pg/ml) a IL6 (10 pg/ml) na množení B buněk. Při použití sCD40 bylo viditelné dvojnásobné zvýšení signální schopnosti B buněk.

Indukce produkce IgG (ng/ml) jako odpověď na různé mitogeny B buněk po stimulaci purifikovaných B buněk je souhrnně uvedeno v tabulce 6.

Tabulka 6
Stimul	Kontrola	Ztn
anti-IgM	3	7,5
anti-IgM + IL-4	13	32
anti-IgM + IL-4 + IL-5	10	45

Bylo vidět zvýšení aktivace markérů na povrchu buněk po stimulaci purifikovaných B buněk samotným ztnf4 nebo s anti-IgM nebo anti-IgM + IL-4. Neprojevil se žádný vliv na množení PBMNC v přítomnosti optimálních nebo suboptimálních mitogenů T buněk. Také nebyl zjištěn vliv LPS stimulace na produkci TNFa u purifikovaných monocytů.

Obrázek 3 ukazuje současnou aktivaci lidských B lymfocytů kproliferaci a sekreci imunoglobulinu pomocí rozpustného ztnf4. Obrázek 3A ukazuje proliferaci purifikovaných lidských B buněk z periferní krve jako odpověď na stimulaci pomocí rozpustného ztnf4 (25 ng/ml) v přítomnosti IL-4 samotného a IL-4 s anti-IgM, anti-CD40 nebo anti-CD19, po pěti dnech v kultuře. Obrázek 3B ukazuje hladiny IgM a IgG měřené v supernatantech získaných v lidských B buněk stimulovaných pomocí rozpustného ztnf4 v přítomnosti IL-4 nebo IL-4 + IL-5, po devíti dnech v kultuře.

Tyto výsledky naznačují, že rozpustný ztnf4 je molekula aktivující B buňky, která působí se spolupráci s jinými stimulátory B buněk a slabě i samotná. Rozpustný ztnf4 podněcuje množení B buněk a produkci Ig. Zvýšení aktivity adhezních molekul, současně stimulujících molekul a aktivace receptoru naznačuje roli při podporování APC funkce B buněk.

Obrázek 4 ukazuje stimulaci B buněk lidské periferní krve pomocí rozpustného ztnf4 (25 ng/ml) nebo kontrolního proteinu (ubiquitin) v přítomnosti 10 ng/ml IL-4 po pěti dnech in vitro. Purifikované TACI-lg, BCMA-lg nebo kontrolní Fg byly testovány na inhibici proliferace specificky vyvolané rozpustným ztnf4.

Příklad 4: Selekce BHK buněk transformovaných TACÍ a BCMA pomocí vazby ztnf4

BHK buňky exprimující vysoké hladiny proteinu TACÍ byly selektovány pomocí klonování směsi transfekovaných buněk. Transfekované buňky (2x10⁵) byly inkubovány na ledu po dobu 30 minut s biotinylovaným ztnf4 v koncentraci 1 pg/ml ve vazebném pufru (PBS, 2% BSA, 0,02% NaN₃). Buňky byly 2x promyty vazebným pufrem, potom inkubovány s SA-PE (Caltag) (ředění 1:1000 ve vazebném pufru) na ledu po dobu 30 minut. Buňky byly potom 2x promyty vazebným pufrem a odečítány pomocí metody FACS (FACS Vantage, Becton Dickinson). Byly vybrány klony s nejvyšší schopností vázat TNF4.

BHK buňky exprimující vysoké hladiny proteinu BCMA byly selektovány pomocí povrchového značení směsi transfekovaných buněk exprimujících BCMA pomocí biotinylovaného ztnf4. Poté následoval streptavidin-Phyco-Erythrin (SA-PE Calteg Burlingame, CA) a sterilní třídění jasně svítících buněk v FL2 na zařízení FACS Vantage (Becton Dickinson). Jednotlivé kolonie pak byly testovány na vázání ztnf4.

Příklad 5: Distribuce v tkáních

Mnohočetné Northern bloty z lidských tkání (MTN I, MTN II a MTN III; Clontech) byly testovány, aby se zjistila tkáňová distribuce exprese lidského BR43x2 a TACÍ. Sonda dlouhá přibližně 500 bp (SEQ ID NO: 21) byla amplifikována za použití BR43x2 (SEQ ID NO: 1) jako matrice a oligonukleotidů ZC 20 061 (SEQ ID NO. 22) a ZC 20 062 (SEQ ID NO: 23) jako primerů. Tato sekvence je totožná s homologickou oblastí TACÍ. Amplifikace byla provedena následujícím způsobem: 1 cyklus při 94 °C po dobu 1,0 minuty, 30 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 60 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 30 sekund, následováno 1 cyklem při 72 °C po dobu 10 minut. Produkty PCR reakce byly vizualizovány pomocí elektroforézy v agarózovém gelu a produkt PCR • ·· · · ·« · · ·· • · · ···· ·· reakce o délce 500 bp byl purifikován pomocí soupravy Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) podle návodu výrobce. Sonda byla radioaktivně označena pomocí soupravy MULTIPRIME DNA labeling kit (Amersham, Arlington Heights, IL) podle návodu výrobce. Sonda byla purifikována pomocí NUCLTRAP push column (Stratagene). Pro prehybridizaci byl použit roztok EXPRESSHYB (Clontech) a také jako hybridizační roztok pro Northern bloty. Hybridizace proběhla přes noc při teplotě 65 °C za použití značené sondy o specifické aktivitě 10⁶ cpm/ml. Bloty byly potom promyty v2xSSC a 0,1% SDS při teplotě místnosti, poté následovala dvě promytí v0,1xSSC a 0,1% SDS při teplotě 50 °C. Produkt transkripce dlouhý přibližně 1500 bp byl detekován ve slezině, lymfatických uzlinách a v tenkém střevě.

Mnohočetné Northern bloty z lidských tkání (MTN I, MTN II a MTN III; Clontech) byly testovány, aby se zjistila tkáňová distribuce exprese lidského BCMA. Sonda dlouhá přibližné 257 bp (SEQ ID NO: 24) byla amplifikována pomocí PCR, kdy jako matrice byla použita cDNA z buněk Daudi (SEQ ID NO: 1) a oligonukleotidy ZC 21 065 (SEQ ID NO: 25) a ZC 21 067 (SEQ ID NO: 26) jako primery. Amplifikace byla provedena následujícím způsobem: 1 cyklus při 94 °C po dobu 1,0 minuty, 35 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 60 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 30 sekund, následováno 1 cyklem ph 72 °C po dobu 10 minut. Produkty PCR reakce byly vizualizovány pomocí elektroforézy v agarózovém gelu a produkt PCR reakce o délce 257 bp byl purifikován pomocí soupravy Gel Extraction Kit (Qiagen, Chatsworth, CA) podle návodu výrobce. Sonda byla radioaktivně označena pomocí soupravy MULTIPRIME DNA labeling kit (Amersham, Arlington Heights, IL) podle návodu výrobce. Sonda byla purifikována pomocí NUCLTRAP push column (Stratagene). Pro prehybridizaci byl použit roztok EXPRESSHYB (Clontech) a také jako hybridizační roztok pro Northern bloty. Hybridizace proběhla přes noc při teplotě 65 °C za použití značené sondy o specifické aktivitě 10⁶ cpm/ml. Bloty byly potom promyty v2xSSC a 0,1% SDS při teplotě místnosti, poté následovala dvě promytí v0,1xSSC a 0,1% SDS při teplotě 50 °C. Produkt transkripce dlouhý přibližně 1,2 kb byl detekován v žaludku, tenkém střevě, lymfatických uzlinách, průdušnici, slezině a ve varlatech.

RNA Master Dot Bloty (Clontech), které obsahovaly RNA z různých tkání, které byly normalizovány vzhledem k8 housekeeping genům, byly také sondovány buď sondou TACÍ (SEQ ID NO: 21) nebo sondou BCMA (SEQ ID NO: 24) a hybridizace byla provedena tak, jak bylo popsáno výše. Exprese BR43x2/TACI byla pozorována ve slezině, lymfatických uzlinách, tenkém střevě, žaludku, slinných žlázách, slepém střevě, plících, kostním morku a ve slezině plodu. Exprese BCMA byla detekována v tenkém střevě, slezině, žaludku, tlustém střevě, lymfatických uzlinách a slepém střevě.

Lidský nádorový Panel Blot V (Invitrogen lne., San Diego, CA) a lidský lymfomatický blot (Invitrogen) byly sondovány tak, jak bylo výše popsáno buď se sondou BR43x2fTACI (SEQ ID NO: 21) nebo se sondou BCMA (SEQ ID NO: 24). Produkt transkripce dlouhý 1,5 kb, odpovídající TACÍ, byl nalezen v lymfomu neHodgkinova typu a v příušním nádoru. Produkt transkripce dlouhý 1,2 kb, odpovídající BCMA, byl nalezen v adenolymfomu, v lymfomu ne-Hodgkinova typu a v příušním nádoru.

Celková RNA zCD4+, CD8+, CD19+ a směsných lymfocytických buněk (CelIPro, Bothell, WA) byla připravena pomocí guanidinisothiokyanátu (Chirgwin a kol., Biochemistry 18: 52-94, 1979) a poté pomocí centrifugace v CsCI. Poly(A)+ RNA byla izolována pomocí chromatografie na oligo(dT) celulóze (Aviv a Leder, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69: 1408-12, 1972). Analýza typu Northern blot byla provedena následujícím způsobem.

Asi 2 mg každé z póly A+ RNA byly denaturovány ve fosfátovém pufru s 2,2 M formaldehydem (50 mM Na₂HPO4, 50 mM NaH₂PO4, 50 mM octan sodný, 1 mM EDTA a

2,2 M formaldehyd) a rozdělena pomocí elektroforézy v 1,5% agarózovém minigelu (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) ve fosfátovém pufru s 2,2 M formaldehydem. RNA byla blotována přes noc na nytranový filtr (Schleicher & Schuell, Keene, NH) a upevněna na filtr pomocí UV (1 200 mJoulů) v zařízení

STRATALINKER³ UV crosslinker (Stratagene Cloning Systems) a potom zapečena při 80 °C po dobu 1 hodiny.

Bloty byly potom sondovány buď sondou TACÍ (SEQ ID NO: 21) nebo BCMA (SEQ ID NO: 24). Zóna odpovídající 1,5 kb, představující TACÍ byla detekována pouze v buňkách CD 19⁺. Transkript dlouhý 1,2 kb, představující BCMA, byl slabě detekován v buňkách CD 8⁺, CD 19⁺ a MLR.

Další analýza typu Northern blot byla provedena na blotech připravených z poly/A) RNA z buněk K-562 (erytroidní buňky, ATCC CCL 243), buněk HUT78 (T buňky, ATCC TIB-161), buněk Jurkat (T buňky), DAUDI (lidský Burkittův lymfom, Clontech, Palo Alto, CA), RÁJI (lidský Burkittův lymfom, Clontech, Palo Alto) a HL60 (monocyty) tak, jak bylo popsáno výše. Bloty byly sondovány buď se sondou TACÍ • · (SEQ ID NO: 21) nebo se sondou BCMA (SEQ ID NO: 24). Produkt transkripce dlouhý

1,5 kb, odpovídající TACÍ, byl detekován v buňkách Ráji. Produkt transkripce dlouhý

1,2 kb, odpovídající BCMA, byl detekován v buňkách Daudi, Ráji a HUT 78.

Pro identifikaci tkání exprimujících lidský nebo myší TACÍ a lidský BCMA byly použity panely založené na PCR. Lidské a myší panely Rapid-Scan™ Gene Expression (OriGene Technologies, lne., Rockville, MD) byly prohledávány podle návodu výrobce. Oligonukleotidové primery ZC 24 200 (SEQ ID NO: 27) a ZC 24 201 (SEQ ID NO: 28) byly navrženy tak, aby přesahovaly exonové spojení a vytvořily fragment dlouhý 272 bp, odpovídající myšímu TACÍ. Exprese byla detekována ve slezině, brzlíku, plících, prsech, srdci, svalu, kůži, nadledvinkách, žaludku, tenkém střevě, mozku, vaječníku, prostatě a embryu. V mnoha tkáních byly detekovány další zóny dlouhé ~500 a 800 bp.

Oligonukleotidové primery ZC 24 198 (SEQ ID NO: 29) a ZC 24 199 (SEQ ID NO: 30) byly navrženy tak, aby přesahovaly exonové spojení a vytvořily fragment dlouhý 204 bp, odpovídající lidskému TACÍ. Exprese byla detekována ve slezině, mozku, srdci, játrech, tlustém střevě, plících, tenkém střevě, svalu, žaludku, varlatech, placentě, slinných žlázách, nadledvinkách, slinivce, prostatě, lymfocytech periferní krve a v kostním morku.

Oligonukleotidové primery ZC 24 271 (SEQ ID NO: 31) a ZC 24 272 (SEQ ID NO: 32) byly navrženy tak, aby přesahovaly exonové spojení a vytvořily fragment dlouhý 329 bp, odpovídající lidskému BCMA. Exprese byla detekována v mozku, slezině, tlustém střevě, plících, tenkém střevě, žaludku, vaječníku, varlatech, slinných žlázách, nadledvinkách, prostatě, lymfocytech periferní krve, kostním morku a v játrech plodu.

Oligonukleotidové primery ZC 24 495 (SEQ ID NO: 33) a ZC 24 496 (SEQ ID NO: 34) byly navrženy tak, aby přesahovaly exonové spojení a vytvořily fragment dlouhý 436 bp, odpovídající myšímu BCMA. Exprese byla detekována v játrech.

Příklad 6: Příprava fúzních vektorů TACI-lg a BCMA-lg

Konstrukce fragmentu Gammal Fc4

Pro přípravu fúzního proteinu TACI-lg, byla oblast Fc lidského lgG1 (kloubová oblast a domény CH2 a CH3) modifikovány tak, že byly odstraněny funkce vázání ke • · • ·· · · · · · · ·· • · · ···· ··

.......... ’.. .

Fc receptoru (FcgRI) a komplementu (C1q). Tato modifikovaná verze lgG1 Fc byla nazvána Fc4.

Oblast Fc byla izolována z knihovny připravené z jater lidského plodu (Clontech) pomocí PCR reakce za použití oligonukleotidových primerů ZC 10 134 (SEQ ID NO: 43) a ZC 10 135 (SEQ ID NO: 44). PCR byla použita pro vnesení mutací do oblasti Fc, aby došlo ke snížení vazby FcgRI. Vazebné místo pro FcgRI (Leu-Leu-gly-Gly) bylo mutováno na Ala-Glu-gly-Ala (aminokyselinové zbytky 38 až 41 ze SEQ ID NO: 45) podle Baum a kol., (EMBO J. 13: 3992-4001, 1994), aby došlo ke snížení vazby FcRI (Duncan a kol., Nátuře 332: 563-4, 1988). Pro vnesení mutace byly použity oligonukleotidové primery ZC 15 345 (SEQ ID NO: 46) a ZC 15 347 (SEQ ID NO: 47). Do výsledného objemu 50 pl bylo přidáno 570 ng matrice IgFc, 5 μΙ 10xPfu reakčního pufru (Stratagene), 8 μΙ 1,25 mM směsi dNTP, 31 μΙ dH₂O, 2 μΙ 20 mM ZC 15 345 (SEQ ID NO: 46) a ZC 15 347 (SEQ ID NO: 47). Byl přidán stejný objem minerálního oleje a reakce byla zahřátá na 94 °C po dobu 1 minuty. Byla přidána Pfu polymeráza (2,5 jednotky, Stratagene) a následovalo 25 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 1 minuty, pak následovalo 7 minut prodlužování při 72 °C. Reakční produkty byly elektroforézovány a byla určena zóna s předpověděnou velikostí fragmentu -676 bp. Zóna byla z gelu vyříznuta a získána pomocí extrakční soupravy QIAGEN QIAquickTM Gel Extraction Kit (Qiagen) podle návodu výrobce.

PCR byla také použita pro vnesení mutace Ala na Ser (aminokyselinový zbytek 134 v SEQ ID NO: 45) a Pro na Ser (aminokyselinový zbytek 135 v SEQ ID NO. 45) pro snížení vazby komplementu C1q a/nebo fixace komplementu (Duncan a Winter, Nátuře 332: 788, 1988) a stop kodonu TAA. V prvním kole byly provedeny dvě reakce a jako matrice byla použita IgFc sekvence s mutovaným vazebným místem FcyRI. Do výsledného objemu 50 μΙ byl přidán 1 μΙ IgFc matrice s mutovaným vazebným místem FcyRI, 5 μΙ 10xRfu reakčního pufru (Stratagene), 8 μΙ 1,25 mM směsi dNTP, 31 μΙ dH₂O, 2 μΙ 20 mM ZC 15 517 (SEQ ID NO: 48), což je 5' primer začínající na nukleotidu 26 v SEQ ID NO: 45 a 2 μΙ 20 mM ZC 15 530 (SEQ ID NO: 49), což je 3' primer začínající na komplementárním nukleotidu k nukleotidu 405 v SEQ ID NO: 45. Druhá reakce obsahovala 2 μΙ každého z 20 mM zásobních roztoků primerů ZC 15 518 (SEQ ID NO: 50), což je 5' primer začínající na nukleotidu 388 v SEQ ID NO: 45 a ZC 15 347 (SEQ ID NO: 47), což je 3' primer, aby byla vnesena mutace Ala na Ser, restrikční místo pro Xba I a stop kodon. Byl přidán stejný objem minerálního oleje a reakce byla • · • · γγ ·· ···· ·· · · ·· zahřátá na 94 °C po dobu 1 minuty. Byla přidána Pfu polymeráza (2,5 jednotky, Stratagene) a následovalo 25 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 1 minuty, pak následovalo 7 minut prodlužování při 72 °C. Reakční produkty byly elektroforézovány a byly určeny zóny s předpověděnou velikostí fragmentů -370 bp respektive -395 bp. Zóny byly z gelu vyříznuty a extrahovány pomocí extrakční soupravy QIAGEN QIAquickTM Gel Extraction Kit (Qiagen) podle návodu výrobce. Reakce druhého kola byla provedena kvůli spojení výše uvedených fragmentů a přidání Bam Hl restrikčního místa. Do výsledného objemu 50 pl bylo přidáno 30 μΙ dH₂O, 8 μΙ 1,25 mM směsi dNTP, 5 μΙ 10xPfu reakčního pufru (Stratagene) a 1 μΙ každého z produktů prvních dvou PCR reakcí. Byl přidán stejný objem minerálního oleje a reakce byla zahřátá na 94 °C po dobu 1 minuty. Byla přidána Pfu polymeráza (2,5 jednotky, Stratagene) a následovalo 5 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 2 minut. Pak byla teplota opět zvednuta na 94 °C a byly přidány 2 μΙ každého z 20 mM zásobních roztoků primerů ZC 15 516 (SEQ ID NO: 51), což je 5' primer začínající na nukleotidu 1 v SEQ ID NO: 45 a ZC 15 347 (SEQ ID NO: 47) a následovalo 25 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 55 °C po dobu 30 sekund a 72 °C po dobu 2 minut, pak následovalo 7 minut prodlužování při 72 °C. Část reakce byla zviditelněna pomocí elektroforézy na gelu. Byla zjištěna zóna 789 bp, odpovídající předpověděné velikosti.

Konstrukce expresního vektoru TACI-Fc4 a BCMA-Fc4

Expresní plazmidy obsahující fúzní proteiny TACI-Fc4 a BCMA-Fc4 byly konstruovány pomocí homologické rekombinace v kvasinkách. Fragment TACÍ cDNA byl izolován pomocí PCR reakce, která zahrnovala polynukleotidovou sekvenci od nukleotidu 15 k nukleotidu 475 v SEQ ID NO: 5. Dva primery použité pro přípravu fragmentu TACÍ byly: (1) primer obsahující 40 bp z vektorové sekvence, sousedící s 5' koncem a 17 bp, odpovídajících aminovému konci fragmentu TACÍ (SEQ ID NO: 52); (2) 40 bp ze 3' konce, odpovídající sousedící Fc4 sekvenci a 17 bp, odpovídajících karboxylovému konci fragmentu TACÍ (SEQ ID NO: 53). Do výsledného objemu 100 μΙ bylo přidáno 10 ng TACÍ matrice, 10 μΙ 10x reakčního pufru pro Taq polymerázu (Perkin Elmer), 8 μΙ 2,5 nM směsi dNTP, 78 μΙ dH₂O, 2 μΙ každého z 20 mM zásobních roztoků oligonukleotidových primerů SEQ ID NO: 52 a SEQ ID NO: 53 a Taq polymeráza (2,5 jednotky, Life Technology). Byl přidán stejný objem minerálního oleje a reakce byla zahřátá na 94 °C po dobu 2 minut, poté následovalo 25 cyklů při 94 °C po • · dobu 30 sekund, 65 °C po dobu 30 sekund, 65 °C po dobu 30 sekund, 72 °C po dobu 1 minuty a pak následovalo 5 minut prodlužování při 72 °C.

Fragment BCMA cDNA byl izolován pomocí PCR reakce, která zahrnovala polynukleotidovou sekvenci od nukleotidu 219 k nukleotidu 362 v SEQ ID NO: 7. Dva primery použité pro přípravu fragmentu BCMA byly oligonukleotidový primer obsahující 40 bp z vektorové sekvence, sousedící s5' koncem a 17 bp, odpovídajících aminovému konci fragmentu BCMA (SEQ ID NO: 54); a oligonukleotidový primer obsahující 40 bp ze 3' konce, odpovídající sousedící Fc4 sekvenci a 17 bp, odpovídajících karboxylovému konci fragmentu BCMA (SEQ ID NO: 55). Do výsledného objemu 100 pl bylo přidáno 10 ng BCMA matrice, 10 μΙ 10x reakčního pufru pro Taq polymerázu (Perkin Elmer), 8 μΙ 2,5 mM směsi dNTP, 78 μΙ dH₂O, 2 μΙ každého z 20 mM zásobních roztoků oligonukleotidových primerů SEQ ID NO: 54 a SEQ ID NO:

55. Byl přidán stejný objem minerálního oleje a reakce byla zahřátá na 94 °C po dobu 2 minut, poté následovalo 25 cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 65 °C po dobu 30 sekund, 72 °C po dobu 1 minuty a pak následovalo 5 minut prodlužování při 72 °C.

Fragment obsahující cDNA kódující fragment Fc4 byl konstruován podobným způsobem, vždy jeden pro TACÍ fúzní konstrukt a jeden pro BCMA fúzní konstrukt. Při přípravě Fc4 pro TACÍ fúzní konstrukt byly použity tyto dva oligonukleotidové primery: oligonukleotidový primer obsahující 40 bp ze sekvence, sousedící s 5' koncem TACÍ a 17 bp, odpovídajících aminovému konci fragmentu Fc4 (SEQ ID NO: 56); a oligonukleotidový primer obsahující 40 bp ze 3' konce, odpovídající sousedící vektorové sekvenci a 17 bp, odpovídajících karboxylovému konci fragmentu Fc4 (SEQ ID NO: 57). Při přípravě Fc4 pro BCMA fúzní konstrukt byl použit oligonukleotidový primery obsahující 40 bp ze sekvence, sousedící s5' koncem BCMA a 17 bp, odpovídajících aminovému konci fragmentu Fc4 (SEQ ID NO: 58). Druhým primerem při přípravě Fc4 pro BCMA fúzní konstrukt byl shodný s primerem, popsaným výše pro TACI-Fc4 (SEQ ID NO. 57).

Do výsledného objemu 100 μΙ bylo přidáno 10 ng výše popsané Fc4 matrice, 10 μΙ 10x reakčního pufru pro Taq polymerázu (Perkin Elmer), 8 μΙ 2,5 nM směsi dNTP, 78 μΙ dH₂O, 2 μΙ každého z 20 mM zásobních roztoků oligonukleotidů SEQ ID NO: 56 a SEQ ID NO: 57 pro TACÍ a oligonukleotidů SEQ ID NO: 58 a SEQ ID NO: 57 pro BCMA a Taq polymeráza (2,5 jednotek, Life Technology). Byl přidán stejný objem minerálního oleje a reakce byla zahřátá na 94 °C po dobu 2 minut, poté následovalo 25 « · ·· · · ·· ·· • · * · · · · * · · · ·· · ···· ·· yg ’··’ ···* *·** ’·** ’·*’ cyklů při 94 °C po dobu 30 sekund, 65 °C po dobu 30 sekund, 72 °C po dobu 1 minuty a pak následovalo 5 minut prodlužování při 72 °C.

Deset mikrolitrů každé z výše popsaných 100 pl reakcí bylo pro analytické účely elektroforézováno na 0,8% LMP agarózovém gelu (Seaplaque GTG) v 1x TBE pufru. Zbylých 90 μΙ každé PCR reakce bulo precipitováno po přidání 5 μΙ 1M NaCl a 250 μΙ absolutního ethanolu. Plazmid pZMP6 byl štěpen Smál, aby byl linearizován na místě polylinkeru. Plazmid pZMP6 byl odvozen z plazmidu pCZR199 (Americká sbírka typových kultur, Manassas, VA, ATCC# 98 668) a je savčím expresním vektorem, který obsahuje expresní kazetu, která má bezprostředně časný promotor CMV, konsenzuální intron z variabilní oblasti lokusu těžkého řetězce mušího imunoglobulinu, mnohočetná restrikční místa pro vložení kódujících sekvencí, stop kodon a terminátor z lidského růstového hormonu. Plazmid má také počátek replikace z E. coli, savčí expresní jednotku selekčního markéru, která obsahuje promotor SV40, zesilovač transkripce a počátek replikace, gen pro DHFR a SV40 terminátor. Vektor pZMP6 byl konstruován zpCZR199 zaměněním metallothioneinového promotoru za bezprostředně časný promotor CMV a Kozákovy sekvence na 5' konci otevřeného čtecího rámce.

Sto mikrolitrů kompetentních kvasinkových buněk (S. cerevisiae) bylo smícháno s 10 μΙ, obsahujícími přibližně 1 pg extracelulární domény buď TACÍ nebo BCMA, Fc4 fragmenty vhodné pro rekombinaci s nimi a 100 ng vektoru pZMP6, štěpeného Smál, a bylo přeneseno do 0,2 cm elektroporační kyvety. Na směsi kvasinky/DNA bylo působeno elektrickými pulsy při 0,75 kV (5 kV/cm), °° ohmů, 25 pF. Ke každé kývete bylo přidáno 600 μΙ 1,2 M sorbitolu a kvasinky byly vysety ve dvou 300 μΙ alikvotech na URA-D plotny a inkubovány při 30 °C.

Po asi 48 hodinách byly Ura⁺ kvasinkové transformanty z jedné plotny resuspendovány v 1 ml H₂O a krátce centrifugovány, aby došlo k usazení kvasinkových buněk. Buněčný sediment byl resuspendován v 1 ml lyzačního pufru (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA). Pět set mikrolitrů lyzační směsi bylo přidáno do zkumavky typu eppendorf, obsahující 300 Ml skleněných zrnek promytých kyselinou a 200 μΙ směsi fenol-čhloroform, vortexováno 2 až 3x po dobu 1 minuty, následovalo 5 minut centrifugace v centrifuze typu eppendorf při maximální rychlosti. Tři sta mikrolitrů vodní fáze bylo přeneseno do nové zkumavky a DNA byla vysrážena přidáním 600 μΙ ethanolu (EtOH), následovala centrifugace po dobu 10 minut při teplotě 4 °C. Sediment DNA byl resuspendován v 100 μΙ H₂O.

• · • · · · · · • · · ···· ··

Transformace elektrokompetentních buněk E. coli (DH10B, GibcoBRL) byla provedena s preparáty kvasinkové DNA o objemech 0,5 až 2 ml a se 40 pl buněk DH10B. Na buňky bylo působeno elektrickými pulsy pulsy při 2,0 kV, 25 pF a 400 ohmů. Po elektroporaci bylo 1 ml SOC (2% Bacto' Tryptone (Difco, Detroit, Ml), 0.5% kvasničný extrakt (Difco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCI₂, 10 mM MgSO₄, 20 mM glukóza) vyseto v 250 μΙ alikvotech na čtyři plotny LB AMP (LB bujón (Lennox), 1,8% Bacto' Agar (Difco), 100 mg/ml ampicilin).

Jednotlivé klony obsahující správný expresní konstrukt pro TACI-Fc4 nebo BCMA-Fc4 byly určeny pomocí restrikčního štěpení pro ověření přítomnosti inzertu a potvrzení, že různé DNA sekvence byly správně vzájemně spojeny. Inzert pozitivních klonů byl podroben sekvenční analýze. Plazmidová DNA byla ve velkém měřítku izolována pomocí soupravy Qiagen Maxi kit (Qiagen) podle návodu výrobce.

Příklad 7: Exprese TACI-Fc4 a BCMA-Fc4 u savců

Buňky BHK 570 (ATCC #: CRL-10 314) byly vysety do 10 cm misek pro tkáňové kultury a ponechány růst do přibližně 50 až 70% souvislého nárůstu přes noc při 37 °C, v 5% CO2, v médiu DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD), 5% fetální hovězí sérum (Hyclone, Logan, UT), 1 mM L-glutamin (JRH Biosciences, Lenexa, KS), 1 mM pyrohroznan sodný (Gibco-BRL)). Buňky byly potom transfekovány buď plazmidem TACI-Fc4/pZMP6 nebo BCMA-Fc4/pZMP6, pomocí Lipofectamine™ (Gibco-BRL), v médiu bez séra (SF) o složení (DMEM, 10 mg/ml transferin, 5 mg/ml inzulín, 2 mg/ml fetuin, 1% L-glutamin a 1% pyrohroznan sodný). Plazmid obsahující TACI-Fc4/pZMP6 nebo BCMA-Fc4/pZMP6 byl naředěn v 15 ml zkumavkách do celkového konečného objemu 640 ml SF médiem. 35 ml Lipofectamine™ (Gibco BRL) bylo smícháno s 605 ml SF média. Směs Lipofectamine™ byla přidána ke směsi DNA a ponechány inkubovat po dobu přibližně 30 minut při teplotě místnosti. Pět mililitrů SF média bylo přidáno ke směsi DNA:Lipofectamine™. Buňky byly jednou opláchnuty 5 ml SF média, to bylo odsáto a poté byla přidána směs DNA:Lipofectamine™. Buňky byly inkubovány při 37 °C po dobu 5 hodin, potom bylo ke každé plotně přidáno 6,4 ml média DMEM/10% FBS, 1% PSN. Plotny byly inkubovány při 37 °C přes noc a směs DNA:Lipofectamine™ byla příští den nahrazena čerstvým 5% FBS/DMEM médiem. Pět dní po transfekci byly buňky rozděleny do lahví T-162 se selekčním médiem (DMEM/5% FBS, 1% L-GLU, 1% • ·

NaPyr). Přibližně 10 dní po transfekci byly z každé transfekce dvě 150 mm kultivační misky kolonií rezistentních na methotrexát trypsinizovány, buňky spojeny a vysety do lahví T-162 a převedeny na kultury ve velkém měřítku.

Příklad 9: Transgenní exprese Ztnf4

Transgenní živočichové, kteří exprimují geny ztnf4 byli připraveni pomocí dospělých, plodných samců (B6Cf1), předpubertálních plodných samic (B6Cf1), samců s odňatými chámovody (B6D2f1) a dospělých plodných samic (B6D2f1) (všechny od Taconic farms, Germantown, NY). Předpubertální plodné samice byly uvedeny do stavu nadměrné ovulace pomocí gonadotropinu ze séra březích kobyl ((Sigma, St. Louis, MO) a lidského gonadotropinu z chorionu (hCG (Sigma)). Samice ve stavu nadměrné ovulace byly poté spářeny s dospělými, plodnými samci a kopulace byla potvrzena přítomností vaginálních zátek.

Oplodněná vajíčka byla odebírána pomocí chirurgického mikroskopu (Leica MZ12 Stereo Microscope, Leica, Wetzlar, Germany). Vajíčka byla potom omyta v hyaluronidáze a Whittenově médiu W640 (tabulka 8; všechny reagencie byly od firmy Sigma Cemical Co.), které bylo inkubováno s 5% CO₂, 5% O₂ a 90% N₂ při teplotě 37 °C. Vajíčka byla do provedení mikroinjekce uložena v 5% CO₂ v inkubátoru při 37 °C.

Tabulka 8

Médium 640 podle Whittena

	mg/200 ml	mg/500 r
NaCI	1280	3200
KCI	72	180
KH2PO4	32	80
MgSO4 - 7 H2O	60	150
glukóza	200	500
mléčnan vápenatý	106	265
benzylpenicilin	15	37,5
streptomycin SO4	10	25
NaHCO3	380	950
pyrohroznan sodný	5	12,5
H2O (ml)	200	500

·· ·· ·· ·· ·· • ·· · · · · · · ♦ ·

	82	• · · · · ·
500 mM EDTA (pl)	100	250
5% fenolová červeň (pl)	200	500
BSA	600	1500

Otevřený čtecí rámec 858 bp, kódující celou délku lidského TACÍ ligandů Blys (SEQ ID NO: 35), byl namnožen pomocí PCR tak, že do něho byly pomocí oligonukleotidových primerů SEQ ID NO: 36 a SEQ ID NO: 37 vneseny optimalizovaný počáteční kodon a na 5' konci sousedící Pmel restrikční místo a na 3' konci sousedící Ascl restrikční místo. Tento fragment Pmel/Ascl byl klonován do pKFO24, což je transgenní vektor pro B a/nebo T buňky, který obsahuje zesilovač transkripce Ig Em (690 bp Notl/Xbal z pEmSR; (Bodrug a kol., EMBO J. 13: 2124-30, 1994), promotor IG V_h (536 bp Hincll/Xhol fragment zpJH1X(-); Hu a kol., J. Exp. Med. 177: 1681-90, 1993), polylinker Pmel/Ascl a polyadenylační signál lidského růstového hormonu (627 bp dlouhý fragment Smal/EcoRI; Seeburg, DNA 1: 239-49, 1982). Transgenní inzert byl z plazmidu oddělen štěpením Notl, purifikován na agarózovém gelu a pomocí mikroinjekce vnesen do oplodněných vajíček, pocházejících z páření myší B6C3F1Tac, popsaného výše, a vajíčka byla potom implantována do myších samic, u kterých byla vyvolána falešná březost v podstatě tak, jak bylo popsáno výše (Malík a kol., Molec. Cell. Biol. 15: 2349-58, 1995).

Myší samice s takto implantovanými vajíčky byly navráceny v párech do klecí a jejich těhotenství bylo ponecháno probíhat 19 až 21 dní. Po vrhu bylo ponecháno období 19 až 21 dní a poté bylo provedeno zjišťování pohlaví, mláďata byla odstavena, a čistými nůžkami byla z ocásku odstřižena 0,5 cm biopsie (použita pro zjištění genotypu).

Genomová DNA byla z ústřižků ocásků připravena pomocí komerčně dostupné soupravy (Dneasy 96 Tissue Kit; Qiagen, Valencia, CA) podle návodu výrobce. Genomová DNA byla analyzována pomocí PCR za použití primerů navržených pro lidský růstový hormon (hGH), který tvoří 3' UTR část transgenního vektoru. Primery ZC 17 251 (SEQ ID NO: 38) a ZC 17 252 (SEQ ID NO: 39) amplifikují fragment hGH, dlouhý 368 bp. Použití jediné oblasti shodné s lidskou sekvencí (zjištěná pomocí srovnání lidské DNA sekvence a 3' UTR sekvence myšího růstového hormonu) zajistilo, že PCR reakcí nebyla amplifikována myší sekvence. Dále primery ZC 17 156 (SEQ ID NO: 40) a ZC 17 157 (SEQ ID NO: 41), které hybridizují se sekvencemi • · vektoru a amplifikují inzert cDNA, mohou být použity spolu s primery hGH. V těchto pokusech tvořila DNA ze zvířat pozitivních na transgen dvě zóny, zónu 368 bp odpovídající fragmentu hGH 3' UTR a zónu variabilní velikosti, odpovídající cDNA inzertu.

Jakmile bylo u zvířat po tvrzeno, že je transgenní (TG), byla zpětně křížena s inbredním kmenem tak, že byla TG samice umístěna společně se standardním typem samce nebo TG samec byl umístěn společně s jednou nebo dvěma samicemi standardního typu. Po vrhu a odstavení potomků byly tito odděleni podle pohlaví a byly jim odstřiženy ocásky pro zjištění genotypu.

Pro kontrolu exprese transgenu v živém zvířeti byly provedeny chirurgické odběry biopsie. Analýza úrovně exprese mRNA každého transgenu byla provedena pomocí testu hybridizace roztoku RNA nebo pomocí měření PCR v reálném čase na přístroji ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, lne., Foster City, CA) podle návodu výrobce.

Příprava buněk a průtoková cytometrie

Výchozí myši byly analyzovány v různém stáří. Pro analýzu pomocí průtokové cytometrie (FACS) byly ze stehenních a holenních kostí izolovány buňky lymfoidní tkáně, kostního morku (BM) tak, že bylo provedeno opatrné rozrušení ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS) pomocí třecí misky s tloukem. Buňky byly resuspendovány, pasivní sedimentací zbaveny kostních fragmentů a sedimentovány při 1000x g. Splenocyty, thymocyty nebo buňky lymfatických uzlin byly získány rozdrcením intaktních tkání mezi skleněnými destičkami, potom resuspendováním a sedimentováním buněk, stejně jako u BM. Buňky byly před barvením resuspendovány v promývacím pufru pro FACS (FACS WB) (balancovaný solný roztok podle Hankse, 1% BSA, 10 mM Hepes, pH 7,4) na koncentraci 20 x 10⁶ buněk/ml. Pro barvení bylo 1 x 10⁶ buněk přeneseno do 5 ml zkumavek a promyto 1 ml FACS WB a potom sedimentováno při 1000x g. Buňky byly potom inkubovány na ledu po dobu 20 minut v přítomnosti dostatečného množství vhodných monoklonálních protilátek, konjugovaných s FITC-, PE- a/nebo TriColor(TC)-, v celkovém objemu 100 ml ve FACS WB. Buňky byly promyty 1,5 ml WB, sedimentovány, potom resuspendovány v 400 ml WB a analyzovány na průtokovém cytometru FACSCalibur za použití CellQuest software (Becton Dickinson, Moutain View, CA). Detektory pro přímý (FSC) a boční (SSC) • ·

..........

rozptyl světla byly nastaveny na lineární škálu, zatímco pro všechny tři fluorescenční kanály (FL-1, FL-2 a FL-3) byly použity logaritmické detektory.

Kompenzace spektrálního překrývání mezi FL kanály byla provedena pro každý pokus za použití buněčných populací barvených jednou barvou. Všechny buňky byly sebrány na disk a údaje byly analyzovány pomocí CellQuest software. Červené krvinky a mrtvé buňky byly vyloučeny pomocí elektronických údajů, získaných na základě profilů FSC oproti SSC.

Protilátky

Monoklonální protilátka (mAb) anti-CD8 konjugovaná sfluorescein isothiokyanátem (FITC) (klon 53-6.7) a monoklonální protilátky proti CD4 (klon RM4-5), proti CD5 (klon 53-7.3), proti CD19 (klon 1D3) a proti syndekanu (klon 281-2), konjugované s fycoerythrinem (PE), byly zakoupeny od PharMingen (San Diego, CA). Monoklonální protilátky proti CD45R/B220 konjugované s TriColor(TC) (klon RA3-6B2) byly zakoupeny od Caltag.

Transgenní myši, které exprimují nadbytek ztnf4 v lymfoidním oddíle, vyvíjejí zvýšené počty periferních B buněk, zvýšené počty plazmatických buněk a zvýšené hladiny sérového imunoglobulinu. Tato transgenní zvířata mají zvýšený počet buněk B200+ ve slezině, lymfatických uzlinách a v brzlíku. Zvýšený počet slezinných B buněk zahrnuje jak běžné B-2 buňky, tak i normálně vzácnou populaci B-1 buněk. Obecně jsou buňky B-1 vázány hlavně na pobřišniční a jiné tělní dutiny, produkují autoprotilátky se slabou reaktivitou a byly často spojeny s vývojem autoimunních chorob, jako je systemický lupus erythematodes SLE.

Starší transgenní zvířata produkují autoprotilátky, vyvíjí se u nich vylučování bílkoviny v moči a sklerotická ledvinová klubíčka, což jsou charakteristické znaky systemického lupus erythematodes.

Obrázek 5A ukazuje suspenze jednotlivých buněk ze sleziny (horní panel), z mezenterické lymfatické uzliny (střední panel) a z kostního morku (dolní panel), připravené výše popsaným postupem, barvené pomocí protilátek proti B220-TC a analyzované pomocí průtokové cytometrie. Počet buněk B220+ v každé tkáni byl vypočítán násobením procenta buněk B220+ celkovým počtem živých buněk (vyjma buněk obarvených trypanovou modří), spočtených pomocí hemocytometru. Každý sloupeček představuje údaje z jednotlivých myší transgenních na ztnf4 (Tg, vyplněné sloupce) nebo netransgenní (nonTG, prázdné sloupce) kontrolní myši ze stejného vrhu.

Obrázek 5B ukazuje buňky izolované z ztnf4 TG myši (panely napravo) nebo nonTG myši ze stejného vrhu (panely nalevo), a to z lymfatické uzliny (horní řada), ze sleziny (prostřední řady) a z brzlíku (dolní řada), které byly obarveny monoklonálními protilátkami proti vyznačeným molekulám (DC5, CD4 a CD8) a potom analyzovány pomocí průtokové cytometrie. Z údajů byly vyloučeny mrtvé buňky a červené krvinky.

Obrázek 5C ukazuje celkové úrovně IgG, IgM a IgE v séru myší transgenních na ztnf4 ve stáří od 6 do 23 týdnů.

Obrázek 5D ukazuje ukládání amyloidu a zesílené mesangium ledvinových klubíček, zjištěných v řezech ledvin z myší transgenních na ztnf4, které jsou barveny podle H&E, ve srovnání s normálními ledvinovými klubíčky kontrolních myší ze stejného vrhu.

Obrázek 5E ukazuje zvýšení počtu efektorových T buněk u myší transgenních na ztnf4, podobně jak bylo popsáno vMackay a kol. (J. Exp. Med. 190: 1697-1710,

1999).

Rozpustné fúzní proteiny TACI(BR43x2) nebo BCMA-lg byly injekčně podány (IP, IM nebo IV) transgenním zvířatům, která exprimují vysoké úrovně ztnf4. Analýza lymfoidních tkání pomocí průtokové cytometrie (FACS) byla použita pro zjištění jakékoli změny v počtu B buněk B220+ ve slezině, lymfatických uzlinách a brzlíku.

Příklad 10: Test ELISA z přímým navázáním

Test ELISA z přímým navázáním byl vyvinut pro charakterizování schopnosti buď rozpustného TACI-lg nebo rozpustného BCMA-lg vázat se a inhibovat biologickou aktivitu ztnf4 in vitro.

Destička s 96 jamkami byla potažena kozím protilidským lg o koncentraci 1 g/ml (Jackson Labs, Bar Harbor, MA) v ELISA A pufru (0,1 M NaHCO₃, pH 9,6, 0.02% NaN₃) a inkubována přes noc při 4 °C. TACÍ, BCMA a nepříbuzný TNF receptor, jako je ztnflO (SEQ ID NO: 42) jako kontrola, byly titrovány od 10 pg/ml v5násobných ředěních do 320 ng/ml plus nula a společně inkubovány s 2,5, 0,5 nebo 0,1 pg/ml biotinylovaného ztnf4 nebo ovalbuminu jako negativní kontrolou, a inkubovány 1 hodinu při teplotě místnosti.

Směs společně inkubovaného receptorů a biotinylovaným ligandem byla potom přidána na 96jamkové destičky, potažené kozím protilidským lg. Destičky byly potom promyty (ELISA C, 500 pl Tween 20 (Sigma Chemical, St, Louis, MO), 200 mg NaN₃,

PBS do konečného objemu 1 litr) a blokovány pomocí Superblock (Pierce, Rockford, IL). Destičky byly potom inkubovány 2 hodiny při teplotě 37 °C.

Destičky byly ještě jednou opláchnuty ELISA C, následovalo přidání 100 μΙ/jamku neutr-avidin-HRP zředěné 1:10 000 v ELISA B (5 nebo 10 pg BSA (Sigma) v případě 1% popřípadě 2% BSA, 250 μΙ Tween 20 (Sigma), 100 mg NaN₃, fosforečnanem pufrovaný fyziologický roztok pH 7,2 (PBS, Sigma) do konečného objemu 500 ml. Jinou možností je připravit pufr jako 1 % nebo 2% BSA v ELISA C pufru). Destičky jsou potom vyvíjeny s OPD po dobu 10 minut při teplotě místnosti a odečítány při 492 pm.

Příklad 11: Test biologické aktivity

Test biologické aktivity byl vyvinut pro měření toho, jak je rozpustným TACI-FC inhibována stimulace lidských B buněk rozpustným ztnf4. B buňky byly izolovány z mononukleárních buněk periferní krve (PBMNC) pomocí CD19 magnetická zrnka a magnetický separační systém VarioMACS (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) podle návodu výrobce. Vyčištěné B buňky byly smíchány s rozpustným ztnf4 (25 ng/ml) a rekombinantním lidským IL-4 (10 ng/ml Pharmingen) a byly vysety (ve třech paralelách) do 96jamkových destiček s kulatým dnem v množství 1x10⁶ buněk na jamku.

Rozpustný TACI-FC byl rozpuštěn od 5 pg/ml do 6 ng/ml a inkubován s B buňkou po dobu 5 dní, přičemž přes noc na 4. den byl do každé jamky přidán puls 1 pCi ³H tymidinu (Amersham). Jako kontrola byl rozpustný TACI-FC také inkubován s B buňkami a IL-4 bez přítomného ztnf4.

Buňky z destiček byly odebírány pomocí přístroje Packard Plate Harvester a radioaktivita byla měřena pomocí přístroje Packard. TACI-lg rozpustný receptor inhiboval schopnost rozpustného ztnf4 stimulovat množení B buněk in vitro způsobem, který závisel na dávce. Desetinásobný molární nadbytek TACI-lg zcela inhibuje množení lidských B buněk, které je odpovědí na rozpustný ztnf4 v přítomnosti IL-4.

Příklad 12: Test ORIGIN

Hladiny ztnf4 u jedinců s chorobnými stavy (jako je například SLE, zánět kloubů) v porovnání k jedincům normálním, byly zjišťovány pomocí elektrochemiluminiscenčního testu. Standardní křivka rozpustného lidského ztnf4 v koncentracích 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml a 0 ng/ml byla připravena • · «··· ··· ···· ·« « · ·· .·» v pufru ORIGIN (Igen, Gaithersburg, MD). Vzorky sér byly zředěny v pufru ORIGIN. Standardy a vzorky byly inkubovány 2 hodiny při teplotě místnosti s biotinylovanou králičím protilidskou ztnf4NF BV protilátkou, zředěnou na 1 pg/ml v pufru pro test Origin (IGEN) a ruthenylovanou králičí protilidskou ztnf4NF BV polyklonální protilátkou, zředěnou na 1 pg/ml v pufru pro test Origin (IGEN). Po inkubaci byly vzorky vortexovány a ke každému ze standardů a vzorků bylo přidáno 0,4 mg/ml streptavidin Dynabeads (Dynal, Oslo, Norway) v množství 50 pl/zkumavku a byly inkubovány 30 minut při teplotě místnosti. Vzorky byly potom vortexovány a odečítány na přístroji Origin Analyzer (Igen) podle návodu výrobce. Test Origin je založen na elektrochemiluminiscenci a vytváří odečet jako ECL - to je způsob, jak pracuje a co nám to říká.

Zvýšená úroveň zthf4 byla detekována ve vzorcích séra jak od myší NZBWF1/J, tak myší MRL/Mpj-Fas^lpr, které dospěly do pokročilých stádií glomerulonefritidy a autoimunní choroby.

Příklad 13: Rozpustný TACI-lg a spontánní model SLE

Myši NZBW se stávají symptomatické pro spontánní SLE ve věku přibližně 7 až 9 měsíců. TACI-Fc byl podáván myši NZBW, aby byla sledován jeho supresivní účinek na B buňky v průběhu 5 týdenního období, protože se má za to, že průměrná produkce autoprotilátek k B buňkám má u NZBW myší vysokou úroveň.

Sto osmitýdenních samic myší (NZB x NZW) F1 (Jacobson Labs) bylo rozděleno do 6 skupin po 15 myších. Před léčením byl u myší jednou za měsíc kontrolován protein v moči a byla odebírána krev pro uložení CBC a séra. Sérum bude testováno na přítomnost autoprotilátek. Protože vylučování proteinu v moči je charakteristickým příznakem glomerulonefritidy, hladiny proteinu v moči byly kontrolovány pomocí testovacího papírku v pravidelných intervalech v celém průběhu studie. Před léčením byla zvířata zvážena. Dávkování bylo započato, když byly myši přibližně 5 měsíců staré. Myši dostávaly intraperitoneální injekce buď pouze nosiče (PBS) nebo lidského IgG-FC (kontrolní protein) nebo TACI-FC4 (testovaný protein) 3x týdně po dobu 5 týdnů.

• β • ·

Skupina (5 myší v každé)	Způsob léčení	Dávka
1	neléčené kontroly
2	pouze nosič
3	lidský IgG-FC	20 g
4	lidský IgG-FC	100 pg
5	lidský TACI-FC4	20 pg
6	lidský TACI-FC4	100 pg

Krev byla odebírána 2x v průběhu dávkování a bude odebrána alespoň 2x po jeho ukončení. Hodnoty zjištěné testovacím papírkem pro vylučování proteinu v moči a tělesné hmotnosti byly zjišťovány každé dva týdny od započetí dávkování. V době usmrcení byla odebrána krev a byla zaznamenána hodnota zjištěná testovacím papírkem a tělesná hmotnost. Byly zjištěny hmotnosti sleziny, brzlíku, jater se žlučníkem, levé ledviny a mozku. Slezina a brzlík byly rozděleny pro FACS analýzu a histologii. Podčelistní slinné žlázy, mezenterická lymfatická žláza, jaterní lalok se žlučníkem, tlusté střevo, žaludek, tenké střevo, slinivka, pravá ledvina, nadledvina, jazyk s průduškou a jícnem, srdce a plíce budou také odebrány pro histologii.

Obrázek 6 ukazuje zvýšené hladiny ztnf4 v séru myší NZBWF1 a MRL/Ipr/lpr, které koreluje s vývojem SLE. Horní panel na obrázku 6A ukazuje korelaci hladiny ztnf4 v séru s věkem, 68 NZBWF1 myší ve stáří v rozmezí od 10 do 40 týdnů a 10 týdnů a 30 týdnů staré kontrolní myši NZB/B. Střední panel ukazuje korelaci s vylučováním proteinu v moči ve třech rozsazích, a to od stopových množství do 0,2 mg/ml (T-30), 1 až 3 ng/ml a 20 mg/ml u NZBWF1 myši ve srovnání s kontrolní myší NZB/B. Dolní panel ukazuje hladiny ztnf4 s různými titry protilátek proti dsDNA u NZBWF1 myší ve srovnání s kontrolními NZB/B.

Obrázek 6B ukazuje stejné korelace zjištěné na 23 myších MRL/Ipr/lpr v rozmezí 18 až 24 měsíců starých a u 10 kontrolních MRL/MpJ myší, starých 11 týdnů.

Obrázek 7 ukazuje výsledky analýzy moče. U myší bylo považovány za trpící vylučováním proteinu v moči, když testovací papírek ukázal hodnotu >1 mg/ml. (A) PBS, (B) lidský IgG FC, 100 mg, (C) lidský IgG FC, 20 mg, (D) lidský TACI-lgG, 100 mg a (E) lidský TACI-lgG, 20 mg. Myši léčené fůzním proteinem TACI-lgG vykazovaly snížené vylučování proteinu v moči.

Analýzou periferní krve z léčených zvířat bylo zjištěno, že dva týdny po začátku léčení byly u myší léčených TACI-FC sníženy počty bílých krvinek a lymfocytů (20 a

100 mg) ve srovnání s myšmi léčenými FC (20 a 100 mg) a PBS. Analýza FAC (branka pro lymfocyty) periferní krve odebrané šest týdnů po zahájení léčení (dva týdny po podání poslední dávky) ukázala dramatický pokles procenta B buněk, přítomných ve vzorku. Hladiny B buněk stále klesaly v období pěti týdnů po podání poslední dávky, ale pokles již nebyl tak dramatický. Tabulka 9 uvádí průměrné procento (a standardní odchylku) pro myši v každé léčené skupině (tabulka 9). Pokles procenta B buněk v periferní krvi byl také pozorován 2 týdny v průběhu léčení.

Tabulka 9

Léčení	týden 2	týden 5 % B buněk
% B buněk	% T buněk
PBS	26,05 (6,52)	67,05 (6,80)	20,83 (3,14)
100 mg FC	23,34 (5,77)	68,23 (7,30)	25,04 (8,07)
20 mg FC	24,09 (6,26)	65,27 (7,18)	18,96(6,42)
100 mg TACI-FC	11,07 (5,03)	79,06 (6,71)	14,79 (4,76)
20 mg TACI-FC	16,37 (7,27)	69,72 (8,90)	19,14(5,27)

Příklad 14: Rozpustný TACI-lg v normální myši

TACI-FC byl podáván myším Balb/C, aby byl sledován jeho účinek na normální myši. Šedesát samic myší Balb/C (HSD), starých 8 týdnů, bylo rozděleno do 12 skupin po pěti myších. Před léčením byly myši zváženy a byla jim odebrána krev pro uložení CBC a séra. Skupiny 1 až 9 dostávaly intraperitoneální injekce (IP) buď pouze nosiče (PBS) nebo lidského IgG-FC (kontrolní protein) nebo TACI-FC4 (testovaný protein) denně po dobu 12 dnů a byly 14. den utraceny.

Skupina (5 myší v každé)	Způsob léčení	Dávka
1	lidský TACI-FC4	200 mg
2	lidský TACI-FC4	100 mg
3	lidský TACI-FC4	20 pg
4	lidský TACI-FC4	5pg
5	lidský FC4	200 pg
6	lidský FC4	100 mg
7	lidský FC4	20 mg
8	lidský FC4	5 mg

9	pouze nosič	používaný
10	lidský TACI-FC4	100 mg
11	lidský FC4	100 mg
12	neléčené kontroly

Krev byla odebírána 7. a 12. den. V době usmrcení byla odebrána krev a byla zaznamenána hodnota tělesné hmotnosti. Byly zjištěny hmotnosti sleziny, brzlíku a mozku. Slezina a brzlík byly rozděleny pro FACS analýzu a histologii. Kůže, slezina, mezenterická lymfatická žláza, podčelistní slinné žlázy, vaječník, děloha, děložní čípek, močový měchýř, jaterní lalok se žlučníkem, tlusté střevo, žaludek, tenké střevo, slinivka, pravá ledvina, nadledvina, jazyk s průduškou a jícnem, srdce, brzlík, stehenní sval, levá a pravá stehenní kost a mozek budou také odebrány pro histologii.

Jak bylo uvedeno výše v příkladu 13, významné snížení procenta B buněk mezi buňkami periferní krve bylo pozorováno 7. den (pomocí CBC) a 12. den (pomocí FACS) u krví odebraných od všech jedinců léčených TACI-FC4, ve srovnání s těmi, kteří byli léčeni samotným FC4 nebo PBS a analyzovaných pomocí CBC nebo FACS. Dále nastalo téměř 50% snížení počtu B buněk ve slezinách odebraných ze zvířat léčených TACI-FC4, ve srovnání se slezinami z myší léčených FC4 čtrnáctý den.

Příklad 15: ELISA test protilátek proti dsDNA

Autoimunita je charakterizována vysokými hladinami protilátek proti dvouřetězcové DNA. Pro měření hladin protilátek proti dsDNA, jak v transgenních myších, které exprimují nadbytek ztnf4, tak v myších NZBW, byl vyvinut ELISA test. 96jamková mikrotitrační destička (Nunc) byla potažena poly-L-lyzinem (Sigma) (20 μΙ/ml v 0,1 M Tris pufru pH 7,3) v množství 75 pl na jamku a inkubována přes noc při teplotě místnosti. Destičky byly potom promyty dH₂O a potaženy póly dAdT (Sigma) (20 μΙ/ml v 0,1 M Tris pufru pH 7,3) v množství 75 μΙ na jamku a inkubována po dobu 60 minut při teplotě místnosti. Destičky byly potom promyty dH₂O a blokovány 2% BSA (Sigma) v Tris pufru po dobu 30 minut při teplotě místnosti, poté následovalo konečné promytí dH₂O.

Vzorky séra byly odebrány ze ztnf4 transgenních myší, popsaných v příkladě 10 a z myší NZBW, popsaných v příkladě 11. Vzorky séra byly zžeděny 1:50 v1% BSA/2% BGG (Calbiochem) v Tris pufru. Ředěné vzorky byly potom titrovány na potažené destičce při ředěních 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600, 1:3200 a 1:6400 (50 μΙ/jamku) a inkubovány po dobu 90 minut při teplotě místnosti.

Destičky byly potom promyty dH₂O a bylo přidáno 50 μΙ/jamku kozího protimyšího IgG-Fc-HRP (Cappel) zředěného 1:1000 v 1% BSA/2% BGG. Destičky byly potom inkubovány po dobu 60 minut při teplotě místnosti. Destičky byly potom 5x promyty dH₂O a vyvíjeny s OPD, 1 tableta/10 ml Novo D a rozplněno po 100 μΙ/jamku. Vývojka byla zastavena pomocí 1 M H₂SO₄, 100 μΙ/jamku, a OD byla odečítána při 492 nm.

Obrázek 8 ukazuje hladiny protilátek proti dsDNA ve dvou ztnf4 transgenních myších (staré 23 týdnů), dvou netransgenních jedinců ze stejného vrhu a porovnáno s hladinami zjištěnými v séru myši NZBWF1 (stará 32 týdnů) a myši MRL/Ipr/lpr (stará 19 týdnů).

Příklad 16: Rozpustný TACI-lg ve spontánním modelu ELE

Dvacet pět myších samic PLxSJL F1 (staré 12 týdnů, Jackson Labs) dostalo podkožní injekci 125 pg/myš antigenu (protein myelinového proteolipidu, PLP, zbytky 139 až 151), připraveného v kompletním Freudově adjuvans. Myši jsou rozděleny do pěti skupin po pěti. V den 0 a 2 jim jsou podány intraperitoneální injekce toxinu černého kašle (400 ng). Skupiny dostanou 1 násobnou, 10násobnou nebo 100násobnou dávku TACÍ, BCMA nebo BR43x2, jedna skupina dostane pouze nosič a jedna skupina léčena nebude. Preventivní léčba započne v den 0, léčba jako zásah započne v den 7 nebo při objevení se klinických příznaků. Příznaky nemoci, ztráta hmotnosti a paralýza, se projevují přibližně 10. až 14. den a trvají asi po dobu 1 týdne. Zvířata jsou hodnocena denně zaznamenáváním tělesné hmotnosti a hodnocením klinického skóre, které odpovídá rozsahu jejich příznaků. Klinické příznaky EAE se objevují mezi 10. a 14. dnem po očkování a přetrvávají přibližně 1 týden. Na konci studie byla všechna zvířata utracena vysokou dávkou plynu a poté pitvána. Mozek a páteř byly odebrány pro histologii nebo zmraženy pro analýzu mRNA. Údaje o tělesné hmotnosti a klinickém skóre jsou vyneseny jak pro jednotlivé jedince, tak pro skupiny.

Klinické skóre

Normální

0,5 Slabý, napětí ocasu může být sníženo, ale nechybí • ·

..·».· ..·· ···

Ochablý ocas (když je myš zatahána za kořen ocasu, není schopna jej pozvednout)

Ochablý ocas, slabost v nohou (není schopna pozvednout ocas, může stát vzpřímeně na zadních nohách, ale nohy se třesou)

Paréza (nemůže sedět s nohami pod tělem, při chůzi se potácí)

Paralýza (nemůže hýbat zadními nohami, při pokusu o chůzi je vleče za sebou)

Ochrnutí čtyř končetin (paralýza předních končetin nebo chození v kruhu, může mít sklopenou hlavu)

Umírání (kompletně paralyzována, nemůže dosáhnout potravy nebo vody)

Příklad 17: TACI-FC a CIA modely revmatického zánětu

Osm týdnů staří samci myšího kmene DBA/1J (Jackson Labs) byli rozděleni do skupin po pěti a v třítýdenním intervalu dostali dvě podkožní injekce 50 až 100 pl roztoku kolagenu 1 mg/ml (kuřecího nebo hovězího původu). Jedna kontrola kolagenové injekce nedostala. První injekce byla připravena v kompletním Freudově adjuvans a druhá injekce byla připravena v nekompletním Freudově adjuvans. TACI-FC byl podán preventivně při druhé injekci nebo před ní, nebo po tom, až se u zvířete vyvinulo klinické skóre 2 nebo více, které přetrvalo alespoň 24 hodin. Zvířata začala vykazovat příznaky revmatického zánětu po druhé injekci kolagenu, obvykle během 2 až 3 týdnů. Rozsah nemoci byl hodnocen na každé tlapce pomocí kaliperu, kterým byla měřena tloušťka tlapky a hodnoceno klinické skóre (0 až 3) u každé tlapky. Klinické skóre, 0 normální, 1 prst (prsty) zanícen, 2 slabý zánět tlapky, 3 mírný zánět tlapky a 4 prudký zánět tlapky. Zvířata byla utracena poté, co se nemoc vyvíjela stanovené časové období, obvykle 7 dní. Tlapky byly sbírány pro histologii nebo analýzu mRNA a sérum bylo odebíráno pro testy imunoglobulinů a cytokinů.

Příklad 18: Neutralizační TACÍ protilátky

Polyklonální protilátky proti peptidu byly připraveny imunizací dvou samic novozélandských bílých králíků peptidem, huzntf4-1 SAGIAKLEEGPELQLAIPRE (SEQ ID NO: 59) nebo huzntf4-2 SFKRGSALEEKENKELVKET (SEQ ID NO: 60). Peptidy byly syntetizovány pomocí syntetizátoru peptidů Applied Biosystems model 431A (Applied Biosystems, lne., Foster City, CA) podle návodu výrobce. Peptidy byly

konjugovány k proteinu keyhole limpet hemocyanin (KLH) jako nosiči, pomocí aktivace maleinimidem. Každý králík dostal počáteční intraperitoneální (ip) injekci 200 pg peptidu v kompletním Freudově adjuvans, poté následovaly posilující ip injekce 100 pg peptidu v nekompletním Freudově adjuvans každé tři týdny. Sedm až deset dní po podání druhé posilující injekce (celkem třetí injekce) byla zvířatům odebrána krev a z něho odebráno sérum. Zvířatům potom byla podávána posilující injekce a byla jim odebírána krev každé tři týdny.

Králičí séra specifická pro peptid ztnf4 byla charakterizována zjištěním ELISA titru, přičemž jako cíl pro protilátku byl použit v koncentraci 1 pg/ml ten peptid, pomocí kterého byla připravena protilátka (SEQ ID NO: 59 a SEQ ID NO: 60). Dvě králičí séra proti peptidu huztnf4-1 (SEQ ID NO: 59) měly titr proti jejich specifickému peptidu při ředění 1:1 E5 (1:100 000). Dvě králičí séra proti peptidu huztnf4-2 (SEQ ID NO: 60) měly titr proti jejich specifickému peptidu 1:5E6 a proti rekombinantním proteinům o plné délce (N-koncový ztnf4 označený FLAG, vytvořený v buňkách BHK) 1:5E6.

Polyklonální protilátky specifické proti peptidu ztnf4 byly purifikovány afinitní chromatografií z králičího séra pomocí sloupců CNBR-SEPHAROSE 4B (Pharmacia LKB), které byly připraveny pomocí 10 mg specifických peptidů (SEQ ID NO: 59 nebo SEQ ID NO: 60) na gram CNBr-SEPHAROSE, následováno 20x dialýzou v PBS přes noc. Protilátky specifické proti peptidu ztnf4 byly charakterizovány zjištěním ELISA titru, přičemž jako cíl pro protilátky byl použit v koncentraci 1 pg/ml vhodný peptidový antigen nebo rekombinantní protein v plné délce (huztnf4s-NF-Bv). Spodní hranice detekce (LLD) králičích protilátek proti huztnf4-1, purifikovaných afinitní chromatografií, při použití jejich specifického antigenu (peptid huztnf4-1, SEQ ID NO: 59) je při ředění 5 ng/ml. Spodní hranice detekce (LLD) králičích protilátek proti huztnf4-2, purifikovaných afinitní chromatografií, při použití jejich specifického antigenu (peptid huztnf4-2, SEQ ID NO: 60) je při ředění 0,5 ng/ml. Spodní hranice detekce (LLD) králičích protilátek proti huztnf4-2, purifikovaných afinitní chromatografií, při použití k rekombinantního proteinu huztnf4s-NF-Bv je při ředění 5 ng/ml.

Monoklonální protilátky byly vytvořeny a selektovány pro inhibici inhibice biotinem značeného rozpustného ztnf4. Žádná z monoklonálních protilátek proti TACÍ (248.14, 248.23, 248.24 nebo 246.3) neblokuje vazbu ztnf4 k BCMA. Monoklonální protilátka 248.23 snižuje vazbu 10 ng/ml biotinem značeného ztnf4 asi na 50 %, když jsou upravená média zředěna 1:243 a snižuje vazbu asi 2x v neředěných médiích.

Monoklonální protilátka 246.3 snižuje vazbu 10 ng/ml biotinem značeného ztnf4 asi na 50 %, když jsou upravená média ředěna v rozmezí 1:243 až 1:181 a snižuje vazbu asi 5x v neředěných médiích.

Zvýše uvedeného vyplývá, že třebaže zde byla pro účely ilustrace popsána specifická provedení vynálezu, mohou být provedeny různé modifikace bez toho, že by došlo k odchýlení od smyslu a rozsahu vynálezu. Proto tedy tím není vynález omezen, omezen je pouze připojenými patentovými nároky.

Claims (36)

1. Použití sloučeniny, vybrané ze skupiny zahrnující:

a) polypeptid obsahující extracelulární doménu BR43x2;

b) polypeptid obsahující extracelulární doménu TACÍ;

c) polypeptid obsahující extracelulární doménu BCMA;

d) polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID NO: 10;

e) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidů, který má sekvenci SEQ ID NO: 2;

f) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidů, který má sekvenci SEQ ID NO: 4;

g) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidů, který má sekvenci SEQ ID NO: 6;

h) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidů, který má sekvenci SEQ ID NO: 8;

i) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidů, který má sekvenci SEQ ID NO: 10;

j) polypeptid sekvence SEQ ID NO: 4;

k) aminokyselinové zbytky 1 až 166 ze sekvence SEQ ID NO: 6

l) aminokyselinové zbytky 8 až 37 ze sekvence SEQ ID NO: 8; a

m) aminokyselinové zbytky 1 až 48 ze sekvence SEQ ID NO: 8 pro výrobu léčiva pro inhibování ztnf4 aktivity v savci.

2. Použití podle nároku 1, kde savcem je primát.

3. Použití sloučeniny, vybrané ze skupiny zahrnující:

a) polypeptid obsahující extracelulární doménu BR43x2;

b) polypeptid obsahující extracelulární doménu TACÍ;

c) polypeptid obsahující extracelulární doménu BCMA;

d) polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID NO: 10;

e) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidů, který má sekvenci SEQ ID NO: 2;

f) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu, který má sekvenci SEQ ID NO: 4;

g) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu, který má sekvenci SEQ ID NO: 6;

h) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu, který má sekvenci SEQ ID NO: 8;

i) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu, který má sekvenci SEQ ID NO: 10;

j) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu, který má sekvenci SEQ ID NO: 18;

k) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu, který má sekvenci SEQ ID NO: 20;

l) polypetid SEQ ID NO: 4

m) aminokyselinové zbytky 1 až 166 ze sekvence SEQ ID NO: 6

n) aminokyselinové zbytky 8 až 37 ze sekvence SEQ ID NO: 8; a

o) aminokyselinové zbytky 1 až 48 ze sekvence SEQ ID NO: 8 pro výrobu léčiva pro inhibování BR43x2 , TACÍ, nebo BCMA vazby receptor-ligand.

4. Použití podle nároku 1 až 3, sloučenina je fúzní protein, který obsahuje první část a druhou část spojené peptidickou vazbou, první část obsahuje polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující:

a) polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID NO: 8;

b) polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 25 až 58 ze sekvence SEQ ID NO: 2;

c) polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 34 až 66 ze sekvence SEQ ID NO: 6;

d) polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 71 až 104 ze sekvence SEQ ID NO: 6;

e) polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 25 až 104 ze sekvence SEQ ID NO: 6;

f) polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 8 až 37 ze sekvence SEQ ID NO: 8;

g) polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 41 až 88 ze sekvence SEQ ID NO: 8;

* ..· · .··· . ... . · . . . . · ιζ< · · · · ...

s ..... ............

h) polypeptid obsahující aminokyselinové zbytky 8 až 88 ze sekvence SEQ ID NO: 8; a druhá část obsahuje jiný polypeptid.

5. Použití podle nároku 4, kde první část dále obsahuje polypeptid vybraný ze skupiny zahrnující:

a) aminokyselinové zbytky 59 až 120 ze sekvence SEQ ID NO: 2;

b) aminokyselinové zbytky 105 až 166 ze sekvence SEQ ID NO: 6; a

c) aminokyselinové zbytky 89 až 150 ze sekvence SEQ ID NO: 8.

6. Použití podle nároku 4, kde první část je vybrána ze skupiny zahrnující:

a) polypeptid obsahující extracelulární doménu BR43x2;

b) polypeptid obsahující extracelulární doménu TACÍ; a

c) polypeptid obsahující extracelulární doménu BCMA.

7. Použití podle nároku 4, kde první část je vybrána ze skupiny zahrnující:

a) polypeptid sekvence SEQ ID NO: 4;

b) aminokyselinové zbytky 1 až 154 ze sekvence SEQ ID NO: 6; a

c) aminokyselinové zbytky 1 až 48 ze sekvence SEQ ID NO: 8.

8. Použití podle nároku 4 až 7, kde druhá část je konstantní oblast těžkého řetězce imunoglobulinu.

9. Použití podle nároku 1 až 3, kde protilátka nebo fragment protilátky je vybrán ze skupiny zahrnující:

a) polyklonální protilátka;

b) myší monoklonální protilátka;

c) zušlechtěné protilátka odvozená z b); a

d) lidská monoklonální protilátka.

10. Použití podle nároku 9, kde fragment protilátky je vybrán ze skupiny zahrnující

F(ab'), F(ab), Fab', Fv, scFv a minimální rozpoznávací jednotku.

11. Použití podle nároku 1 až 10, kde léčivo je pro léčení B lymfocytu.

12. Použití podle nároku 11, kde B lymfocyty jsou aktivované B lymfocyty.

13. Použití podle nároku 11, kde B lymfocyty jsou klidové B lymfocyty.

14. Použití podle nároku 1 až 11, kde léčivo je pro inhibování produkce protilátek.

15. Použití podle nároku 14, kde produkce protilátek je spojena s autoimunní chorobou.

16. Použití podle nároku 15, kde autoimunní chorobou je systemický lupus erythematodes, myastenie gravis, roztroušená skleróza nebo zánět kloubů.

17. Použití podle nároku 1 až 16, pro léčení astmatu, bronchitidy, rozedmy, a konečným stadiem ledvinového selhání, nebo ledvinovou nemoci.

18. Použití podle nároku 17, kde ledvinová nemoc je glomerulonefritida, vaskulitida, nefritida nebo pyelonefritida.

19. Použití podle nároku 1 až 18 , pro léčení ledvinových novotvarů, mnohočetných myelomů, lymfomů, neuropatie nebo amyloidózy.

20. Použití podle nároku 20, pro inhibování efektorových T buněk..

21. Použití podle nároku 20, kde souvisí s regulací imunitní odpovědi.

22. Použití podle nároku 20, kde spojení receptoru s ligandem souvisí s imunosupresí.

23. Použití podle nároku 22, kde imunosuprese souvisí s odmítnutím štěpu, reakcí štěpu proti hostiteli, autoimunní chorobou nebo zánětem.

24. Použití podle nároku 23, kde autoimunní chorobou je cukrovka závislá na inzulínu nebo Crohnova nemoc.

25. Použití podle nároku 1 až 24, pro léčení zánětu.

.: .··. .: .·*. ♦’· ··· · · · · · · »·· · · ♦ · · · ·

1K · · · · · * r* .................

26. Použití podle nároku 25, kde zánět souvisí s bolestí kloubů, otokem, anemií nebo septickým šokem.

27. Izolovaná molekula polynukleotidu kódující polypeptid sekvence SEQ ID NO: 2.

28. Izolovaná molekula polynukleotidu sekvence SEQ ID NO: 1.

29. Expresní vektor obsahující následující operativně vázané elementy:

a) transkripční promotor;

b) molekulu polynukleotidu podle nároku 56; a

c) terminátor transkripce.

30. Kultivovaná buňka do které byl vnesen expresní vektor podle nároku 29, přičemž kultivovaná buňka exprimuje polypeptid kódovaný úsekem polynukleotidu.

31. Způsob přípravy polypeptidu, vyznačující se tím, že obsahuje:

kultivaci buněk, do kterých byl vnesen expresní vektor podle nároku 58;

pomocí něho buňka exprimuje polypeptid kódovaný molekulou polynukleotidu; a získání exprimovaného polypeptidu.

32. Izolovaný polypeptid, který má sekvenci SEQ ID NO: 2.

33. Polypeptid podle nároku 62 v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem.

34. Farmaceutický prostředek obsahující:

a) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu, který má sekvenci SEQ ID NO: 2;

b) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu, který má sekvenci SEQ ID NO: 4;

c) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu, který má sekvenci SEQ ID NO: 6;

d) protilátku nebo fragment protilátky, která se specificky váže k polypeptidu, který má sekvenci SEQ ID NO: 8;

e) protilátku nebo fragment protilátky, kter

f)

g) á se specificky váže k polypeptidů, který má sekvenci SEQ ID NO: 10 a farmaceuticky přijatelný nosič.

35. Farmaceutický prostředek podle nároku 34, kde protilátka nebo fragment protilátky je vybrán ze skupiny zahrnující:

a) polyklonální protilátku

b) murinovou polyklonální protilátku

c) humanizovanou protilátku odvozenou od b) a

d) lidskou polyklonální protilátku.

36. Farmaceutický prostředek podle nároku 34 a 35, kde fragment protilátky je vybrán ze skupiny zahrnující: F(ab), F(ab), Fab, Fab, scFV, a minimální rozpoznávací jednotku.