PT1642972E

PT1642972E - Utilizações terapêuticas de receptores solúveis br43x2

Info

Publication number: PT1642972E
Application number: PT05018984T
Authority: PT
Inventors: Jane A Gross; Wenfeng Xu; Karen Madden; David P Yee
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 1999-01-07
Filing date: 2000-01-07
Publication date: 2010-04-07
Also published as: KR100699524B1; SK9712001A3; DE60005135D1; DE60005135T3; HU230024B1; UA74330C2; ATE249517T1; WO2000040716A2; JP2003525861A; DK1141274T4; ES2204502T3; SK288176B6; EA200100621A1; KR20010105322A; JP5021117B2; EP1141274B1; CN101518648A; ES2329254T3; IL144029A; NZ512753A

Description

ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Utilizações terapêuticas de receptores solúveis BR43X2"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As interacções celulares que ocorrem durante uma resposta imunitária são reguladas por membros de várias famílias de receptores de superfície celular, incluindo a família do receptor do factor de necrose de tumor (TNFR). A família do TNFR consiste de vários receptores de glicoproteínas de membrana integrais, muitas das quais, em conjunção com os seus ligandos respectivos, regulam as interacções entre diferentes linhagens de células hematopoiéticas, diferentes (Smith et al., The TNF Receptor Superfamiliy of Cellular and Virai Proteins: Activation, Costimulation and Death, 76:959-62, 1994; Cosman , Stem Cells 12:440-55, 1994).

Um destes receptores é o TACI, um activador

transmembranar e interactivo com CAML (von Biilow e Bram, Science 228:138-41, 1997 e Publicação ONPI, WO 98/39361. O TACI é um receptor ligado à membrana, com um domínio extracelular que contém duas pseudo unidades de repetição ricas em cisteína, um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático, que interage com CAML (modulador de cálcio e ligando ciclofilina), uma proteína de membrana integral, localizada em vesículas intracelulares, que é um co-indutor da activação de NF-AT, quando sobre-expressa em células Jurkat. O TACI está associado com células B e um subconjunto de células T. von Biilow e Bram (ibid. ) referem que o ligando para TACI não é conhecido.

Verificou-se que os polipéptidos da presente invenção, uma isoforma de TACI que possui apenas uma pseudo unidade de repetição rica em cisteína (BR43x2), TACI e uma proteína de células B relacionada, BCMA (Gras et al., Int. Immunol 1_7:1093-106, 1995), se ligam ao ligando de TNF, ztnf4, agora conhecido como neutróquina α (Publicação ONPI, WO 98/18921), BLyS (Moore et al., Science, 285:260-3, 1999), BAFF (Schneider et al. , J. Exp. Med. 189:1747-56, 1999), TALL-1 (Shu et al., J. Leukoc. Biol. 65:680-3, 1999) ou THANK (Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem. 274:15978-81, 1999). Deste modo, o BR43x2, 2 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ TACI e BCMA seriam úteis para regular a actividade de ztnf4, em particular a activação de células B.

Para este fim, a presente invenção proporciona terapêuticas de proteína para modular a actividade do ztnf4, ou outros ligandos de BR43x2, TACI ou BCMA, composições relacionadas e métodos, bem como outras utilizações que deverão ser evidentes para os peritos na arte, a partir destes ensinamentos. 285:260-3, 1999), BAFF (Schneider et al., J. Exp. Med. 189 : 1747-56, 1999), TALL-1 (Shu et al., J. Leukoc. Biol. 65:680-3, 1999) ou THANK (Mukhopadhyay et al., J. Biol. Chem. 274:15978-81, 1999). Deste modo, o BR43x2, TACI e BCMA seriam úteis para regular a actividade de ztnf4, em particular a activação de células B.

Para este fim, a presente invenção proporciona terapêuticas de proteína para modular a actividade do ztnf4, ou outros ligandos de BR43x2, TACI ou BCMA, composições relacionadas e métodos, bem como outras utilizações que deverão ser evidentes para os peritos na arte, a partir destes ensinamentos. WO 98/39361 descreve um receptor da superfície de linfócitos que se liga a CAML, ácidos nucleicos que codificam o mesmo e métodos para a sua utilização.

Science 278 (1997), páginas 138-141, descreve a activação de NF-AT induzida por um membro interactuante com CAML da Superfamília de Receptores do Factor de Necrose Tumoral. A presente invenção proporciona a utilização de um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 10 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de asma, bronquite, enfisema, nefrite, pielonefrite, neoplasmas renais, neuropatia de cadeia leve, amiloidose, Doença de Crohn ou inflamação associada a dor das articulações, inchaço ou choque séptico num mamífero.

Numa concretização, o referido polipéptido compreende os resíduos de aminoácido 34-66 de SEQ ID NO:6. Numa 3 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ concretização, ο referido polipéptido compreende os resíduos de aminoácido 71-104 de SEQ ID NO:6.

Numa concretização, o referido polipéptido está unido a um segundo polipéptido por uma ligação peptídica para formar uma proteína de fusão.

Numa concretização, a segunda porção é uma região constante da cadeia pesada de uma imunoglobulina. Numa concretização, a referida região constante de cadeia pesada de imunoglobulina é uma região constante de cadeia pesada de uma imunoglobulina humana. Numa concretização, a referida região constante de cadeia pesada de imunoglobulina humana é uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina humana de IgGl.

Numa concretização, a segunda porção é um fragmento Fc de uma região constante de cadeia pesada de uma imunoglobulina, que contém dois domínios da região constante e não tem a região variável. Numa concretização, o referido fragmento Fc é derivado de IgGl humana. Numa concretização, o referido fragmento Fc é modificado de modo a remover a função de ligação ao receptor de Fc e a função de ligação ao complemento (Clq) .

Numa concretização, o referido medicamento compreende um multímero das referidas proteínas de fusão.

DESCRIÇÃO SUMÁRIA DAS FIGURAS A Figura 1 mostra um alinhamento de sequências de aminoácidos múltiplo, entre BR43x2, TACI (von Búlow e Bram, ibid.) (SEQ ID NO:8), BCMA (Gras et al., ibid.) (SEQ ID NO:6) e BR43xl (SEQ ID NO:9). As pseudo unidades de repetição ricas em cisteína e o domínio transmembranar estão assinaladas. A Figura 2 mostra uma análise de gráfico Scatchard da ligação de I125-ztnf4 solúvel a TACI e BCMA, expressos pelos transfectantes BHK, estáveis. A Figura 3 mostra a co-activação de linfócitos B humanos, por ztnf4, para proliferar e segregar imunoglobulina. 4 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ A Figura 3Β mostra os níveis de IgM e IgG medidos em sobrenadantes obtidos a partir de células B, estimuladas com ztnf4 solúvel, na presença de IL4 ou IL4 + IL5, após 9 dias de cultura. A Figura 4 mostra células B de sangue periférico humano, com ztnf4 solúvel, ou proteína de controlo (ubiquitina), na presença de IL-4, durante 5 dias in vitro. Testaram-se a TACI-Ig, BCMA-Ig e Fc controlo quanto à inibição da proliferação específica de ztnf4. A Figura 5A mostra os resultados de animais transgénicos para ztnf4, que desenvolveram características de LES. A Figura 5B mostra nódulos linfáticos, células de baço e de timo, para animais transgénicos para ztnf4, corados com anticorpos para CD5, CD4 e CD8. A Figura 5C mostra os níveis de IgM, IgG e IgE totais no soro de animais transgénicos para ztnf4, com idades entre as 6 a 23 semanas. A Figura 5D mostra a deposição de amilóide e o mesângio espessado dos glomérulos, identificados em secções de rim, de animais transgénicos para ztnf4. A Figura 5E mostra células T efectoras em ratinhos transgénicos para ztnf4.

As Figuras 6A e B mostram níveis elevados de ztnf4 em soro obtido de ratinhos ZNBWF1 e MRL/lpr/lpr, que se correlacionam com o desenvolvimento de LES. A Figura 7 mostra a percentagem de ratinhos NZBWF1 que desenvolvem proteinúria no decorrer do estudo. A Figura 8 mostra níveis anti-ADNcd, por ELISA, a partir de ratinhos transgénicos para ztnf4 e pares de ninhada controlo, em comparação com o soro de ratinhos ZNBWF1 e MRL/1pr/lpr. 5 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

Estes e outros aspectos da invenção serão evidentes com referência à descrição pormenorizada que se segue.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Antes de apresentar a invenção, poderá ser útil, para um melhor entendimento da mesma, dar algumas definições de alguns termos que serão utilizados daqui para a frente:

Sinalizador de afinidade: é aqui utilizado para designar um segmento de polipéptido que pode ser ligado a um segundo polipéptido, para proporcionar a purificação ou detecção do segundo polipéptido, ou para proporcionar locais para a ligação do segundo polipéptido a um substrato. Em principio, pode-se utilizar como sinalizador de afinidade, qualquer péptido ou proteína para o qual está disponível um anticorpo ou outro agente de ligação específica. Os sinalizadores de afinidade incluem uma sequência de poli-histidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. _4, 1075, 1985; Nilsson et ai.,

Methods Enzymol. 198:3, 1991), glutationa S-transferase (Smith e Johnson, Gene 67:31, 1988), sinalizador de afinidade Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:7952-4, 1985), substância P, péptido Flag™ (Hopp et al.,

Biotechnology 6:1204-10, 1988), péptido de ligação a estreptavidina ou outro epítopo antigénico ou domínio de ligação. Veja-se, em geral, Ford et al., Protein Expression and Purification 2 :95-107, 1991. Os ADN que codificam para sinalizadores de afinidade estão disponíveis de fontes comerciais (e.g. Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Variante alélica: Qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossómico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação e pode resultar em polimorfismo fenotípico entre populações. As mutações de genes podem ser silenciosas (i.e., sem alteração no polipéptido codificado), ou podem codificar para polipéptidos que possuem uma sequência de aminoácidos alterada. O termo “variante alélica" também é utilizado aqui para designar uma proteína codificada por uma variante alélica de um gene. Também se inclui a mesma proteína a partir da mesma espécie, que difere de uma sequência de aminoácidos de referência, devido a variação alélica. A variação alélica 6 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ refere-se a diferenças que ocorrem naturalmente entre indivíduos, em genes que codificam para uma determinada proteína.

Terminal amino e terminal carboxilo: são aqui utilizados para designar posições nos polipéptidos e proteínas. Quando o contexto permite, estes termos são utilizados em relação a uma sequência, ou porção particular de um polipéptido ou proteína, para designar proximidade ou posição relativa. Por exemplo, uma determinada sequência posicionada no terminal carboxilo, em relação a uma sequência de referência numa proteína, está localizada próximo do terminal carboxilo da sequência de referência, mas não está necessariamente no terminal carboxilo da proteína completa.

Par complemento/anti-complemento: designa porções não idênticas que formam um par estável, ligado de forma não covalente, sob condições adequadas. Por exemplo, a biotina e avidina são membros protótipo de um par complemento/anti-complemento. Outros exemplos de pares complemento/anti-complemento incluem pares receptor/ligando, anticorpo/antigénio (ou hapteno ou epítopo), pares de polinucleótidos de sentido directo/sentido inverso e semelhantes. Quando uma dissociação subsequente do par complemento/anti-complemento é desejável, o par complemento/anti-complemento tem, preferencialmente, uma afinidade de ligação < 10-9M.

Contig: Designa um polipéptido que tem uma porção contígua de sequência idêntica ou complementar a outro polinucleótido. Diz-se que as sequências contíguas se "sobrepõem" a uma determinada porção de sequência de polinucleótidos, quer na sua totalidade, quer ao longo de uma porção parcial do polinucleótido. Por exemplo, contig representativos da sequência de polinucleótido 5'-ATGGCTTAGCTT-3' são 5'-TAGCTTgagtct-3' e 3'-gtcgacTACCGA-5' .

Complementos de moléculas de polinucleótidos: designa moléculas de polinucleótidos com uma sequência de bases complementar e orientação inversa, em comparação com a 7 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ sequência de referência. Por exemplo, a sequência 5' ATGCACGGG 3' é complementar a 5' CCCGTGCAT 3'.

Sequência de nucleótidos degenerada ou sequência degenerada: Designa uma sequência de nucleótidos que inclui um ou mais codões degenerados (em comparação com uma molécula de polinucleótido de referência), que codifica para um polipéptido). Os codões degenerados contêm diferentes tripletos de nucleótidos, mas codificam para o mesmo resíduo de aminoácidos (i.e., os tripletos GAU e GAC, codificam, cada um, para Asp).

Vector de expressão: Uma molécula de ADN, linear ou circular, que compreende um segmento que codifica para um polipéptido de interesse, operativamente ligado a segmentos adicionais que proporcionam a sua transcrição. Estes segmentos adicionais podem incluir sequências promotoras e de terminação e, opcionalmente, uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores seleccionáveis, um potenciador, um sinal de poliadenilação e semelhantes. Os vectores de expressão são geralmente derivados de ADN de plasmídeo ou virai, ou podem conter elementos de ambos.

Isoforma: refere-se a diferentes formas de uma proteína, que podem ser produzidas a partir de genes diferentes ou a partir do mesmo gene, por corte e rearranjo ("splicing") alternativo. Nalguns casos, as isoformas diferem na sua actividade de transporte, altura da expressão em desenvolvimento, distribuição nos tecidos, localização na célula, ou uma combinação destas propriedades.

Polinucleótidos isolados: designa que o polinucleótido foi removido do seu meio genético natural e está assim livre de outras sequências codificantes estranhas ou indesejadas, e está numa forma adequada para utilização em sistemas de produção de proteínas manipuladas geneticamente. Estas moléculas isoladas são as que são separadas do seu meio natural e incluem ADNc e clones genómicos. As moléculas de ADN isoladas da presente invenção, são isentas de outros genes com os quais estão normalmente associadas, mas podem incluir regiões não traduzidas 5' e 3', que ocorrem naturalmente, tais como promotores e sequências de terminação. A identificação de 8 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ regiões associadas será evidente para o perito na arte (veja-se, por exemplo, Dynan e Tijan, Nature 316:774-78, 1985).

Polipéptido ou proteína isolado: é um polipéptido ou proteína que se encontra numa condição que não o seu meio nativo, tal como fora do sangue e tecido animal. Numa forma preferida, o polipéptido isolado é substancialmente isento de outros polipéptidos, particularmente outros polipéptidos de origem animal. É preferido proporcionar o polipéptido numa forma altamente purificada, i.e. mais do que 95% puro, mais preferencialmente mais do que 99% puro. Quando utilizado neste contexto, o termo "isolado" não exclui a presença do mesmo polipéptido em formas físicas alternativas, tais como dímeros ou formas alternativamente glicosiladas ou derivatizadas.

Operativamente ligado: tal como aplicado a segmentos de nucleótidos, o termo "operativamente ligado" indica que os segmentos estão arranjados de modo a funcionar em acordo com os seus fins pretendidos; e.g. a transcrição começa no promotor e prossegue através do segmento codificante até à sequência de terminação.

Ortólogo: designa um polipéptido ou proteína obtido a partir de uma espécie que é o equivalente funcional de um polipéptido ou proteína de uma espécie diferente. As diferenças de sequência entre ortólogos são o resultado da especiação.

Polinucleótido: designa um polímero de cadeia simples ou dupla de bases de desoxirribonucleótido ou ribonucleótido, lidas da extremidade 5' para 3'. Os polinucleótidos incluem ARN e ADN e podem ser isolados a partir de fontes naturais, sintetizados in vitro, ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais ou sintéticas. Os tamanhos dos polinucleótidos são expressos como pares de bases (abreviado para "pb"), nucleótidos ("nt"), ou quilobases ("kb"). Quando o contexto permite, os dois últimos termos podem descrever polinucleótidos que são de cadeia simples ou de cadeia dupla. Quando o termo se aplica a moléculas de cadeia dupla, é utilizado para designar o comprimento total e será entendido como sendo equivalente ao termo "pares de bases". Será reconhecido pelos peritos na arte que as duas 9 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ cadeias de um polinucleótido de cadeia dupla, podem diferir ligeiramente em comprimento e que as suas extremidades podem estar descoordenadas, como resultados de clivagem enzimática; assim, todos os nucleótidos numa molécula de polinucleótido de cadeia dupla podem não estar emparelhadas. Estas extremidades não emparelhadas não excederão 20 nt em comprimento.

Polipéptido: é um polímero de resíduos de aminoácido ligados por ligações peptídicas, quer produzido naturalmente, quer sinteticamente. Os polipéptidos com menos do que cerca de 10 resíduos de aminoácidos são vulgarmente designados por "péptidos".

Promotor: Designa uma porção de um gene que contém sequências de ADN que proporcionam a ligação da polimerase de ARN e a iniciação da transcrição. As sequências de promotor são vulgarmente, mas não sempre, encontradas nas regiões não codificantes 5', dos genes.

Proteína: é uma macromolécula que compreende uma ou mais cadeias de polipéptido. Uma proteína pode também compreender componentes não peptídicos, tais como grupos de hidratos de carbono. Os hidratos de carbono e outros substituintes não peptídicos podem ser adicionados a uma proteína pela célula, na qual a proteína é produzida, e irão variar com o tipo de célula. As proteínas são aqui definidas em termos das suas estruturas de esqueleto de aminoácidos; os substituintes, como grupos de hidratos de carbono, não são geralmente especificados, mas podem, apesar de tudo, estar presentes.

Receptor: proteína associada à célula ou uma subunidade de um polipéptido dessa proteína, que se liga a uma molécula bioactiva (o "ligando") e medeia o efeito do ligando na célula. A ligação do ligando ao receptor resulta numa alteração no receptor (e, nalguns casos, na multimerização do receptor, i.e., associação de subunidades do receptor, idênticas ou diferentes) que provoca interacções entre o(s) domínio(s) efector(es) do receptor e outra(s) molécula(s) na célula. Estas interacções, por sua vez, levam a alterações no metabolismo da célula. Os fenómenos metabólicos que estão ligados a interacções receptor-ligando, incluem transcrição de genes, fosforilação, desfosforilação, proliferação de células, 10 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ aumento na produção de AMP cíclico, mobilização do cálcio celular, mobilização dos lípidos da membrana, adesão celular, hidrólise de lípidos de inositol e hidrólise de fosfolípidos. O BR43x2 tem características de receptores de TNF, como discutido em maior pormenor aqui.

Sequência de sinal secretória: Sequência de ADN que codifica para um polipéptido (um "péptido secretor") que, como um componente de um polipéptido maior, direcciona o polipéptido maior através de uma via secretora de uma célula, em que é sintetizado. 0 polipéptido maior é normalmente clivado, para remover o péptido secretor durante o trânsito, através da via secretora.

Receptor solúvel: polipéptido receptor que não está ligado a uma membrana celular. Os receptores solúveis são mais vulgarmente polipéptidos receptores de ligação ao ligando, que não possuem domínios transmembranares e citoplasmáticos. Os receptores solúveis podem compreender resíduos de aminoácidos adicionais, tais como sinalizadores de afinidade, que proporcionam a purificação do polipéptido, ou proporcionam locais para a ligação do polipéptido a um substrato. Muitos receptores de superfície celular têm equivalentes que ocorrem naturalmente, que são produzidos por proteólise, ou traduzidos a partir de ARNm submetidos a corte e rearranjo alternativo. Diz-se que os polipéptidos receptores são substancialmente isentos de segmentos de polipéptidos transmembranares e intracelulares, quando não têm porções suficientes destes segmentos, para proporcionar a ancoragem na membrana ou a transdução do sinal, respectivamente.

Os pesos moleculares e comprimentos dos polímeros determinados por métodos analíticos imprecisos (e.g. electroforese em gel) serão entendidos como valores aproximados. Quando um destes valores é expressos como "cerca" de X ou "aproximadamente" X, o valor de X descrito deve ser entendido com um rigor de +10%.

Identificou-se uma sequência de ADN de 1192 pb (SEQ ID NO:l) e a sequência de polipéptido correspondente (SEQ ID NO:2), que é uma isoforma do receptor de TACI. A isoforma foi designada por BR43x2. Uma forma solúvel de BR43x2 está 11 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ descrita na SEQ ID NO:4, o polinucleótido que codifica para o receptor solúvel na SEQ ID NO:3. Tal como é descrito em maior pormenor aqui, os polinucleótidos que codificam para receptores BR43x2 e polipéptidos foram inicialmente identificados por clonagem de armadilha de sinal, utilizando uma biblioteca de RPMI 1788 humano e o ligando do factor de necrose de tumor sinalizado com FLAG, marcado com biotina ou FITC, no terminal N ou C, ztnf4, agora conhecido como neutróquina α (ONPI W098/18921), BLyS (Moore et al. , ibid.), BAFF (Schneider et al., ibid.) , TALL-1 (Shu et al., ibid. ) ou THANK (Mukhopadhyay et al., ibid.). Identificaram-se os estoques positivos, por ligação do ligando, foram degradados em clones individuais, o ADNc foi isolado e sequenciado. Uma comparação entre a sequência de aminoácidos deduzida para BR43x2 (representada na SEQ ID N0:2) e receptores do factor de necrose de tumor conhecidos, revelou que o BR43x2 é uma isoforma de TACI, com uma única pseudo unidade de repetição rica em cisteína, fracamente conservada.

Estruturalmente, a família do receptor de TNF caracteriza-se por uma porção extracelular composta por vários módulos, designados, historicamente, por "pseudo-unidades de repetição ricas em cisteína". Um membro protótipo da família do TNFR tem quatro destas pseudo-unidades de repetição, tendo cada uma cerca de 29-43 resíduos de comprimento, uns a seguir aos outros. Uma pseudo-unidade de repetição típica tem 6 resíduos de cisteína. Estes são designados por pseudo-unidades de repetição, embora pareçam resultar de um módulo ancestral comum, não se repetem exactamente: as pseudo-unidades de repetição #1, #2, #3 e #4 têm caracterí sticas de sequência próprias, que as distinguem umas das outras. A estrutura de cristal do receptor de TNF p55, revelou que cada pseudo-unidade de repetição corresponde a um domínio de empacotamento e que todas as quatro pseudo-unidades de repetição se organizam na mesma estrutura terciária, mantida em conjunto, internamente, por ligações dissulfureto. 0 TACI contém duas pseudo-unidades de repetição ricas em cisteína (von Bulow e Bram, ibid), sendo a primeira conservada na estrutura, para outros membros da família do receptor de TNF, e a segunda menos conservada. A isoforma de BR43x2 não possui a primeira pseudo-unidade de repetição rica em 12 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ cisteína, retendo apenas a segunda unidade de repetição, menos conservada. A análise de sequência de uma sequência de aminoácidos de BR43x2 deduzida, tal como representada na SEQ ID NO:2, indica a presença de uma proteína madura com um domínio extracelular (resíduos 1-120 de SEQ ID NO:2), que contém uma pseudo-unidade de repetição rica em cisteína (resíduos 25-58 da SEQ ID NO:2), um domínio transmembranar (resíduos 121-133 da SEQ ID NO:2) e um domínio citoplasmático (resíduos 134-247 da SEQ ID NO:2). A pseudo-unidade de repetição rica em cisteína de BR43x2 tem 6 resíduos de cisteína conservados (resíduos 25, 40, 43, 47, 54 e 58 da SEQ ID NO:2), um resíduo de ácido aspártico conservado (resíduo 34 da SEQ ID NO:2) e dois resíduos de leucina conservados (resíduos 36 e 37 da SEQ ID NO: 2) e partilha uma

identidade de 46% com a primeira pseudo-unidade de repetição rica em cisteína, de TACI (SEQ ID NO: 6) e 35% de identidade com a pseudo-unidade de repetição rica em cisteína de BCMA (SEQ ID NO:8) (Figura 1). A pseudo-unidade de repetição rica em cisteína pode ser representada pelo seguinte motivo: CX[QEK][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2}C[IMLV]XCX{3} CX{6-8}CX{2}[YF]C(SEQ ID NO:10),

em que C representa o resíduo de aminoácido cisteína, Q

glutamina, E ácido glutâmico, K, lisina, N asparagina, R

arginina, D ácido aspártico, H histidina, S serina, Y tirosina, F fenilalanina, W triptofano, L leucina, I isoleucina, V valina e X representa qualquer resíduo de aminoácido que ocorre naturalmente, excepto cisteína. Os resíduos de aminoácido entre parêntesis rectos "[]" indicam a variação de resíduo de aminoácido permitida, nessa posição. O número nas chavetas "{}" indica o número de resíduos de aminoácidos permitidos nessa posição. A presente invenção proporciona a utilização de polipéptidos solúveis de, desde 32 a 40 resíduos de aminoácidos de comprimento, como proporcionado pela SEQ ID NO:10, como definido nas reivindicações. O receptor de BR43x2 solúvel, tal como representado pelos resíduos 1-120 da SEQ ID NO:4, contém uma pseudo-unidade de repetição rica em cisteína (resíduos 25-58 da SEQ ID NO:4) e 13 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ nao possui os domínios transmembranar e citoplasmático de BR43x2, como descrito na SEQ ID NO:2.

Os peritos na arte reconhecerão que estas fronteiras de domínios são aproximadas e baseiam-se em alinhamentos com proteínas conhecidas e previsões de organização da proteína. Estas características indicam que o receptor codificado pelas sequências de ADN de SEQ ID NOS: 1 e 3 é um membro da família do receptor de TNF. A análise de transferência de Northern e de Pontos (Dot blot) da distribuição nos tecidos, do ARNm correspondente a sondas de nucleótido para Br43xl, que se prevê detectem a expressão de BR43x2, apresentaram expressão em células do baço, nódulos linfáticos, células CD19+, fracamente em células com reacção de linfócitos mista, células Daudi e Raji. Utilizando PCR com transcriptase inversa, detectou-se BR43xl apenas nas células B e não em células T activadas, como foi referido para TACI (von Biilow e Bram, ibid. ) . Utilizando uma sonda de BR43x2, que se sobrepõe 100% com a sequência de TACI correspondente, detectou-se TACI e BR43x2 no baço, nódulo linfático e intestino delgado, estômago, glândulas salivares, apêndice, pulmões, medula óssea, baço fetal, células CD19+ e células Raji.

Utilizando análise de transferência de Northern, detectou-se BCMA no intestino delgado, baço, estômago, cólon, apêndice, nódulo linfático, traqueia e testículos. O BCMA também foi detectado no adenolinforna, linfoma não Hodgkiniano e tumor da paratiróide, detectado fracamente em células CD8+, CD19+, MLR, células Daudi, Raji e Hut 78. A análise de transferência de Northern também foi realizada utilizando ztnf4 de murídeo (SEQ ID NO:19) e, tal como para o TACI, BCMA e BR43x2 humano, detectou-se a expressão de ztnf4 de murídeo predominantemente no baço e timo. O ztnf4 de murídeo também era expresso no pulmão e detectou-se uma expressão fraca na pele e coração. entre estas

Os peritos na arte reconhecerão que, tendo em vista a degenerescência do código genético, é possível uma variação de sequências considerável, entre estas moléculas de 14 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ polinucleótidos. A SEQ ID NO:11 é uma sequência de ADN degenerada, que engloba todos os ADN que codificam para o polipéptido BR43x2 solúvel, de SEQ ID NO:4. De igual modo, a SEQ ID NO: 12 é uma sequência de ADN degenerada, que engloba todos os ADN que codificam para o polipéptido BR43x2 da SEQ ID NO:2. Os peritos na arte reconhecerão que a sequência degenerada de SEQ ID NO:12 também proporciona todas as sequências de ARN que codificam para SEQ ID NO:4, substituindo U por T. A tabela 1 apresenta os códigos de uma letra utilizados na SEQ ID NOS: 11 e 12, para designar as posições de nucleótidos degeneradas. As "resoluções" são os nucleótidos designados por uma letra de código, "complemento" indica o código para o(s) nucleótido(s) complementar(es) . Por exemplo, o código Y designa quer C, quer T e o seu complemento R designa A ou G, sendo A complementar a T, e G complementar a C. TABELA 1

Nucleótido Resolução Complemento Resolução A A T T C C G G G G C C T T A A R A | G Y C | T Y C | T R A | G M A | C K G | T K G | T M A| C S C | G S C | G W A | T W A| T H A| C | T D A | G | T B C | G | T V A| C | G V A| C | G B H O O D A | G | T H A| C | T N A | C | G | T N A | C | G | T Os codões degenerados utilizados nas SEQ D NO:11 e 12 que englobam todos os codoes possíveis para um determinado aminoácido, são apresentado na tabela 2. 15 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ TABELA 2

Ο perito na arte terá em conta que é introduzida alguma ambiguidade na determinação de um codão degenerado, representativo de todos os codões possíveis que codificam para cada aminoácido. Por exemplo, o codão degenerado para a serina (WSN) pode, nalguns casos, codificar para arginina (AGR) e o codão degenerado para arginina (MGN) pode, nalguns casos, codificar para serina (AGY). Existe uma relação semelhante entre os codões que codificam para a fenilalanina e leucina. Assim, alguns polinucleótidos englobados pela sequência degenerada podem codificar para sequências de aminoácidos variantes, mas o perito na arte pode facilmente identificar estas sequências variantes, tendo por referência as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOS: 2 e 4. As sequências variantes podem ser facilmente testadas quanto à funcionalidade, como aqui descrito.

Um perito na arte terá também em conta que diferentes espécies podem exibir uma “utilização de codão preferencial". Em geral, veja-se, Grantham, et al., Nucl. Acids Res. 8:1893- 16 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ 912; Haas, et al. Curr. Biol. 6 ;315-24, 1996 ; Wain-Hobson, et al., Gene 13 :355-64, 1981 ; Gosjean e Fiers, Gene 18:199-209, 1982 ; Holm, Nucl. Acids Res. 14 :3075-87, 1986 ; Ikemura, J. Mol. Biol. 158, 573-97, 1982. Tal como aqui utilizado, o termo “utilização de codão preferencial" ou "codões preferenciais", é um termo da arte que se refere a codões de tradução de proteína que são utilizados com mais frequência em células de uma certa espécie, favorecendo assim um ou alguns representantes de codões possíveis, que codificam para cada aminoácido (veja-se Tabela 2). Por exemplo, o aminoácido treonina (Th) pode ser codificado por ACA, ACC, ACG ou ACT, mas em células de mamífero o ACC é o codão mais vulgarmente utilizado; noutras espécies, por exemplo, células de insecto, levedura, vírus ou bactérias, diferentes codões de Thr poderão ser preferenciais. Os codões preferenciais para uma espécie particular podem ser introduzidos nos polinucleótidos da presente invenção, por uma variedade de métodos conhecidos na arte. A introdução de sequências codão preferenciais no ADN recombinante pode, por exemplo, aumentar a produção da proteína, tornando a tradução de proteína mais eficaz num determinado tipo de células, ou espécie. Assim, as sequências codão degeneradas, descritas na SEQ ID Nos: 11 e 12, servem como um modelo para optimizar a expressão de polinucleótidos em vários tipos de células e espécies, vulgarmente utilizadas na arte e aqui descritas. As sequências que contêm codões preferenciais podem ser testadas e optimizadas para a expressão em várias espécies e testadas quanto à funcionalidade, como aqui descrito.

Os aminoácidos altamente conservados, na pseudo-unidade de repetição rica em cisteína, de BR43x2, podem ser utilizados como uma ferramenta para identificar novos membros da família. Por exemplo, pode-se utilizar a reacção em cadeia com polimerase-transcrição inversa (RT-PCR) para amplificar sequências que codificam para o domínio de ligação ao ligando, extracelular, acima descrito, a partir de ARN obtido de uma variedade de fontes de tecido ou linhas celulares. Em particular, os iniciadores altamente degenerados, concebidos a partir das sequências de BR43x2, são úteis para este fim.

Os polinucleótidos isolados irão hibridar com regiões de tamanho semelhante de SEQ ID NO:3 ou com uma sequência 17 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ complementar a esta, sob condições rigorosas. Em geral, as condições rigorosas são seleccionadas para ser cerca de 5°C inferior ao ponto de fusão térmica (Tm) para a sequência especifica, a uma força iónica e pH definidos. A Tm é a temperatura (sob força iónica e pH definidos) à qual 50% da sequência alvo hibrida com uma sonda perfeitamente condizente. As condições rigorosas típicas, são aquelas em que a concentração de sal é até cerca de 0,03 M a pH 7 e a temperatura é de pelo menos cerca de 60°C.

Os polinucleótidos isolados incluem ADN e ARN. Os métodos para isolar ADN e ARN são bem conhecidos na arte. Prefere-se, geralmente, isolar o ARN de células RPMI 1788, PBMNC, células B transfectadas, em repouso ou activadas, ou tecido de amígdala, embora o ADN também possa ser preparado utilizando ARN de outros tecidos, ou isolado como ADN genómico. Pode-se preparar ARN total, utilizando extracção com HCL guanidina, seguida de isolamento por centrifugação num gradiente de CsCl (Chirgwin et al. , Biochemistry 18:52-94, 1979). Prepara-se ARN poli(A)+ a partir de ARN total, utilizando o método de Aviv e Leder (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:1408-12, 1972). Prepara- se ADN complementar (ADNc) a partir de ARN poli(A+), utilizando métodos conhecidos. Os polinucleótidos que codificam para polipéptidos BR43x2 são então identificados e isolados por, por exemplo, hibridação ou PCR.

Os peritos na arte irão reconhecer que as sequências descritas na SEQ ID NOS: 1 e 3, representam um único alelo do gene humano e que é esperado que ocorra variação alélica e corte e rearranjo alternativos. As variantes alélicas das sequências de ADN apresentadas na SEQ ID NO: 1 e 3, incluindo as que contêm mutações silenciosas e aquelas em que as mutações resultam em alterações nas sequências de aminoácidos, estão no âmbito da presente invenção, tal como proteínas que são variantes alélicas da SEQ ID NOs: 2 e 4. As variantes alélicas e variantes de corte e rearranjo destas sequências, podem ser clonadas sondando bibliotecas de ADNc ou genómicas, de indivíduos ou tecidos diferentes, de acordo com processos convencionais conhecidos na arte.

Os polipéptidos BR43x2 isolados podem ser substancialmente homólogos aos polipéptidos de SEQ ID NO:2 e 4 18 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ e suas espécies ortólogas. A expressão "substancialmente homólogo" é agui utilizada para referir polipéptidos possuindo 50%, preferivelmente 60%, mais preferivelmente pelo menos 80%, de identidade de seguência com as seguências apresentadas em SEQ ID NOs:2 e 4 ou seus ortólogos. Estes polipéptidos serão mais preferivelmente pelo menos 90% idênticos, e o mais preferivelmente 95% ou mais, idênticos a SEQ ID NO: 2 ou seus ortólogos. A percentagem de identidade de sequências é determinada por métodos convencionais. Veja-se, por exemplo, Altschul et al., Buli. Math. Bio. 48: 603-66, 1986 e Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915-9, 1992. Resumidamente, duas sequências de aminoácidos são alinhadas para optimizar as pontuações do alinhamento utilizando uma penalidade de abertura de hiatos de 10, uma penalidade de extensão do hiato de 1, e a matriz de pontuação "blosum 62" de Henikoff e Henikoff (ibid.) como mostrado na Tabela 3 (os aminoácidos estão indicados pelos códigos padrão de uma letra). A percentagem de identidade é depois calculada como: Número total de correspondências idênticas x 100 [comprimento da sequência mais longa mais o número de hiatos introduzidos na sequência mais longa de modo a alinhar as duas sequências] 19 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

Tabela 3 A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y A 4 R -1 5 N -2 0 6 D -2 -2 1 6 C 0 -3 -3 -3 9 Q -1 1 0 0 -3 5 E -1 0 0 2 -4 2 5 G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6 P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 A identidade de sequências de moléculas de polinucleótidos é determinada por métodos similares utilizando uma razão como divulgada acima.

As proteínas de polipéptidos substancialmente homólogos são caracterizados como possuindo uma ou mais substituições, deleções ou adições de aminoácidos. Estas alterações são preferivelmente de pequena natureza, ou seja substituições conservativas de aminoácidos (veja-se a Tabela 4) e outras substituições que não afectam significativamente a dobragem ou a actividade da proteína ou do polipéptido; pequenas deleções, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; e pequenas extensões amino- ou carboxilo-terminais, tais como um resíduo de metionina amino-terminal, um pequeno péptido ligante com 20 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ até cerca de 20-25 resíduos, ou um sinalizador de afinidade. Os polipéptido compreendendo sinalizadores de afinidade podem ainda compreender um local de clivagem proteolítica entre o polipéptido BR43x2 e o sinalizador de afinidade. Os preferidos destes locais incluem locais de clivagem para trombina e locais de clivagem para factor Xa.

Tabela 4

Substituições conservativas de aminoácidos Básicos: arginina lisina histidina Ácidos: ácido glutâmico ácido aspártico Polares: glutamina asparagina Hidrófobos: leucina isoleucina valina Aromáticos: fenilalanina triptofano tirosina Pequenos: glicina alanina serina treonina metionina Em adição aos 20 aminoácidos padrão, aminoácidos não padrão (tais como 4-hidroxiprolina, 6-iV-metil-lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina e a-metilserina) podem substituir os resíduos de aminoácido de polipéptidos BR43x2. Um número limitado de aminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genético, e aminoácidos não naturais, podem substituir os resíduos de aminoácido dos polipéptidos BR43x2. As proteínas podem também 21 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ compreender resíduos de aminoácido que nao ocorrem naturalmente.

Os aminoácidos que não ocorrem naturalmente incluem, sem limitação, trans-3-metilprolina, 2,4-metanoprolina, cis-4- hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo-treonina, metiltreonina, hidroxi-etilcisteína, hidroxietil-homocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, terc-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4-azafenilalanina e 4-fluorofenilalanina. São conhecidos na arte vários métodos para a incorporação de resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente em proteínas. Por exemplo, pode ser empregue um sistema in vitro em que mutações sem sentido ("nonsense") são suprimidas utilizando ARNt supressores quimicamente aminoacilados. Os métodos para a síntese de aminoácidos e aminoacilação de ARNt são conhecidos na arte. A transcrição e tradução de plasmídeos contendo mutações sem sentido é realizada num sistema isento de células compreendendo um extracto de E. coli S30 e enzimas e outros reagentes comercialmente disponíveis. As proteínas são purificadas por cromatografia. Veja-se, por exemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellman et ai.,

Methods Enzymol. 202:301, 1991; Chung et al., Science 259:806-9, 1993; e Chung et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:10145-9, 1993). Num segundo método, a tradução é realizada em oócitos de Xenopus por micro-injecção de ARNm mutado e ARNt supressores quimicamente aminoacilados (Turcatti et al., J. Biol. Chem. 271:19991-8, 1996). Num terceiro método, as células de E. coli são cultivadas na ausência de um aminoácido natural que vai ser substituído (e.g., fenilalanina) e na presença do(s) aminoácido(s) que não ocorre(m) naturalmente desejados (e.g., 2-azafenilalanina, 3-azafenilalanina, 4- azafenilalanina ou 4-fluorofenilalanina). O aminoácido que não ocorre naturalmente é incorporado na proteína no lugar da sua contrapartida natural. Veja-se, Koide et al., Biochem. 33:7470-6, 1994. Os resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente podem ser convertidos em espécies que não ocorrem naturalmente por modificação química in vitro. A modificação química pode ser combinada com mutagénese dirigida ao local para adicionalmente expandir a gama de substituições (Wynn e Richards, Protein Sei. 2:395-403, 1993). 22 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

Um número limitado de aminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genético, aminoácidos que não ocorrem naturalmente e aminoácidos não naturais podem substituir os resíduos de aminoácido de BR43x2.

Os aminoácidos essenciais nos polipéptidos BR43x2 podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na arte, tais como mutagénese dirigida ao local ou mutagénese por varrimento de alaninas (Cunningham e Wells, Science 244:1081-5, 1989). São introduzidas mutações de alanina individuais em todos os resíduos na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas quanto a actividade biológica (e.g., proporcionando uma diminuição na resposta de células B durante a resposta imunitária, inibição ou diminuição em produção de auto-anticorpos) para identificar resíduos de aminoácido que são críticos para a actividade da molécula. Veja-se também, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271 : 4699-708, 1996 . Os locais de interacção biológica, as porções de ligação aos ligandos tais como pseudo-repetições ricas em cisteína, podem também ser determinadas por análise física da estrutura, como determinado por técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difracção electrónica ou marcação por fotoafinidade, em conjunto com a mutação de aminoácidos de locais de contacto putativos. Veja-se, por exemplo, de Vos et al., Science 255:306-12, 1992; Smith et al., J. Mol. Biol. 224:899-904, 1992; Wlodaver et al., FEBS Lett. 309:59-64, 1992. As identidades de aminoácidos essenciais podem também ser inferidas por análise de homologias com membros da família do TNFR relacionados tais como TACI e BCMA.

Podem ser feitas substituições adicionais de aminoácidos no interior da pseudo-repetição rica em cisteínas de BR43x2 desde que os resíduos conservados de cisteína, ácido aspártico e leucina sejam retidos e a estrutura de ordem superior não seja perturbada. Prefere-se fazer substituições no interior da pseudo-repetição rica em cisteínas de BR43x2 por referência às sequências de outras pseudo-repetições ricas em cisteínas. A SEQ ID NO: 10 é uma pseudo-repetição rica em cisteínas generalizada que mostra substituições de aminoácidos permitidas com base num destes alinhamentos. As substituições neste domínio estão sujeitas às limitações aqui estabelecidas. 23 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ Múltiplas substituições de aminoácidos podem ser feitas e testadas utilizando métodos conhecidos de mutagénese e rastreio, tais como os divulgados por Reidhaar-Olson e Sauer (Science 241:53-7, 1988) ou Bowie e Sauer (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:2152-6, 1989). Resumidamente, estes autores revelam métodos para simultaneamente tornar aleatórias duas ou mais posições num polipéptido, seleccionar um polipéptido funcional, e depois sequenciar os polipéptidos mutados para determinar o espectro de substituições permitidas em cada posição. Outros métodos que podem ser utilizados incluem exibição em fagos (e.g., Lowman et ai., Biochem. 30:10832-7, 1991; Ladner et ai., Patente U.S. 5,223,409; Huse, Publicação da ONPI WO 92/06204) e mutagénese dirigida à região (Derbyshire et ai., Gene 46:145, 1986; Ner et ai., DNA 7:127, 1988) .

As variantes das sequências de ADN e polipeptidicas de BR43x2 divulgadas podem ser geradas através de baralhamento de ADN como divulgado por Stemmer, Nature 370:389-91, 1994, Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91:10747-51, 1994 e Publicação da ONPI WO 97/20078. Resumidamente, ADN variantes são gerados por recombinação homóloga in vitro através de fragmentação aleatória de um ADN progenitor seguida de re-montagem utilizando PCR, resultando mutações pontuais introduzidas aleatoriamente. Esta técnica pode ser modificada utilizando uma família de ADN progenitores, tais como variantes alélicas ou ADN de espécies diferentes, para introduzir variabilidade adicional no processo. A selecção ou rastreio da actividade desejada, seguidos de iterações adicionais de mutagénese e ensaio proporcionam uma rápida "evolução" de sequências através da selecção de mutações desejáveis enquanto simultaneamente seleccionando contra alterações detrimentais.

Os métodos de mutagénese acima divulgados podem ser combinados com métodos de rastreio automáticos de elevada produção para detectar a actividade de polipéptidos clonados, mutados, nas células hospedeiras. As moléculas de ADN mutadas que codificam polipéptidos activos (e.g., que proporcionam uma diminuição na resposta de células B durante a resposta imunitária, inibição ou diminuição na produção de auto-anticorpos) podem ser recuperadas a partir das células 24 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ hospedeiras e rapidamente sequenciadas utilizando equipamento moderno. Estes métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos de aminoácido individuais num polipéptido de interesse, e podem ser aplicados a polipéptidos de estrutura desconhecida.

Utilizando os métodos acima discutidos, uma pessoa competente na material pode identificar e/ou preparar uma variedade de polipéptidos que são substancialmente homólogos dos resíduos 1 a 120 de SEQ ID NO:2 ou suas variantes alélicas e retêm as propriedades de supressão de células B da proteína do tipo selvagem. Estes polipéptidos podem incluir aminoácidos adicionais ou domínios de outros membros da superfamília de receptores do factor de necrose tumoral, sinalizadores de afinidade ou similares. O polipéptido BR43x2 ou construções de fusão, contendo domínios funcionais de outros membros da superfamília dos TNFR, constituem receptores de factor de necrose tumoral híbridos que exibem capacidades de supressão de células B modificadas.

Contrapartidas receptores e polinucleótidos de outras espécies (ortólogos). Estas espécies incluem, mas não lhes estão limitadas, mamíferos, aves, anfíbios, répteis, peixes, insectos e outras espécies de vertebrados e invertebrados. Têm particular interesse os receptores BR43x2 de outras espécies de mamíferos, incluindo receptores murinos, porcinos, ovinos, bovinos, caninos, felinos, equinos e outros primatas. Os ortólogos do receptor BR43x2 humano podem ser clonados utilizando informação e composições aqui descritas em combinação com técnicas de clonagem convencionais. Por exemplo, um ADNc pode ser clonado utilizando ARNm obtido de um tecido ou tipo de célula que expressa o receptor. As fontes adequadas de ARNm podem ser identificadas sondando transferências de Northern com sondas desenhadas a partir das sequências aqui divulgadas. É então preparada uma biblioteca a partir do ARNm de um tecido ou de uma linha celular positivos. Um ADNc que codifica um receptor pode ser isolado por uma variedade de métodos, tais como por sondagem com um ADNc humano completo ou parcial ou com um ou mais conjuntos de sondas degeneradas baseadas na sequência divulgada. Um ADNc pode também ser clonado utilizando PCR, utilizando iniciadores desenhados a partir das sequências aqui divulgadas. Num método 25 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ adicional, a biblioteca de ADNc pode ser utilizada para transformar ou transfectar células hospedeiras, e a expressão do ADNc de interesse pode ser detectada com um anticorpo para o receptor. Podem também ser aplicadas similares para o isolamento de clones genómicos.

Polipéptidos receptores, incluindo polipéptidos receptores de comprimento total, polipéptidos receptores solúveis, fragmentos de polipéptidos e polipéptidos de fusão, podem ser produzidos em células hospedeiras manipuladas geneticamente, de acordo com técnicas convencionais. As células hospedeiras adequadas, são os tipos de células que podem ser transformadas ou transfectadas com ADN exógeno e crescidas em cultura, e incluem bactérias, células de fungos e células de eucariotas superiores. Preferem-se as células eucarióticas, em particular células de cultura de organismos multicelulares. As técnicas para manipular as moléculas de ADN clonado e introduzir ADN exógeno numa variedade de células hospedeiras, são descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring

Harbor, NY, 1989; e Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987.

Em geral, uma sequência de ADN que codifica para um polipéptido BR43x2 está operativamente ligada a outros elementos genéticos, necessários para a sua expressão, incluindo, geralmente, um promotor e sequência de terminação da transcrição, num vector de expressão. 0 vector também conterá, normalmente, um ou mais marcadores seleccionáveis e uma ou mais origens de replicação, embora os peritos na arte reconheçam que, nalguns sistemas, se podem proporcionar marcadores seleccionáveis em vectores separados, e a replicação de ADN exógeno pode ser proporcionada pela integração no genoma da célula hospedeira. A selecção de promotores, sequências de terminação, marcadores seleccionáveis, vectores e outros elementos, é trabalho de rotina para o perito na arte. Muitos destes elementos estão descritos na literatura e estão disponíveis de fontes comerciais. A fim de direccionar um polipéptido BR43x2 para a via secretória de uma célula hospedeira, proporciona-se uma 26 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ sequência de sinal secretora (também conhecida como sequência sinal, sequência de comando ("leader"), sequência prepro ou sequência pre) no vector de expressão. A sequência de sinal secretora pode ser a do polipéptido BR43x2, ou pode ser derivada de outra proteína segregada (e.g. t-PA), ou sintetizada de novo. A sequência de sinal secretora é ligada à sequência de ADN de BR43x2 na sequência de leitura correcta e posicionada de modo a direccionar o polipéptido sintetizado de novo, na via secretora da célula hospedeira. As sequências de sinal secretoras estão normalmente posicionadas 5' em relação à sequência de ADN que codifica para o polipéptido de interesse, embora algumas sequências de sinal possam estar posicionadas noutro local na sequência de ADN de interesse (veja-se, e.g. Welch et al., patente U.S. No. 5,037,743; Holland et al., patente U.S. 5.143.830).

As células de mamífero de cultura são hospedeiros adequados. Os métodos para introduzir ADN exógeno em células de hospedeiro de mamífero, incluem transfecção mediada por fosfato de cálcio (Wigler et al., Cell 14:725, 1978; Corsaro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7:603, 1981; Graham e Van der Erb, Virology 52:456, 1973), electroporação (Neumann et al., EMBO J. 1:841-45, 1982), transfecção mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., ibid.) e transfecção mediada por lipossomas (Hawley-Nelson et al., Focus 15:73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15:80, 1993). Descreve-se a produção de polipéptidos recombinantes em células de mamífero de cultura, por exemplo por Levinson et al., patente U.S. 4.713.339; Hagen et al., patente U.S. 4.784.950; Palmiter et al., patente U.S. 4.579.821; e Ringold, patente U.S. 4.656.134. As células de mamífero de cultura adequadas incluem as células COS-1 (ATCC No. CRL 1650), COS-7 (ATCC No. CRL 1651), BHK (ATCC No. CRL 1632), BHK 570 (ATCC No. CRL 10314), 293 (ATCC No. CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977), Jurkat (ATCC No. CRL-8129), BaF3 (uma linha celular pré-linfóide dependente de interleucina-3, derivada de medula óssea de murídeo. Veja-se Palacios e Steinmetz, Cell 41: 727-34, 1985; Mathey-Prevot et al. , Mol. Cell. Biol. 6:4133-5, 1986) e linhas de células de ovário de Hamster Chinês (e.g. CHO-K1; ATCC No. CCL 61). São conhecidas na arte outras linhas celulares adequadas e estão disponíveis de depósitos públicos, como a American Type Culture Collection, Rockville, Maryland. Em geral, preferem-se 27 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ promotores de transcrição fortes, tais como promotores de SV-40 ou citomegalovirus. Veja-se, e.g. patente U.S. 4.956.288. Outros promotores adequados incluem os de genes de metalotionenia (patente U.S. 4.579.821 e 4.601.978 e o promotor tardio principal, de adenovirus. A selecção de drogas é geralmente utilizada para seleccionar células de mamífero de cultura, nas quais se inseriu ADN estranho. Estas células são vulgarmente designadas por "transfectantes". As células que foram cultivadas na presença do agente selectivo e que são capazes de passar o gene de interesse à sua descendência, são referidas como "transfectantes estáveis". Um marcador seleccionável preferido é um gene que codifica para a resistência ao antibiótico neomicina. A selecção é realizada na presença de uma droga do tipo neomicina, tal como G-418 e semelhantes. Também se podem utilizar sistemas de selecção para aumentar o nível de expressão do gene de interesse, um processo designado por "amplificação". A amplificação é realizada fazendo a cultura dos transfectantes na presença de um nível baixo do agente selectivo e aumentando em seguida a quantidade de agente selectivo, para seleccionar as células que produzem níveis elevados dos produtos dos genes introduzidos. Um marcador seleccionável amplificado, preferido, é a di-hidrofolato- redutase, que confere resistência ao metotrexato. Também se podem utilizar outros genes de resistência a drogas (e.g. resistência a higromicina, resistência a multi-drogas, puromicina-acetiltransferase). Os marcadores alternativos que introduzem um fenótipo alterado, tais como a proteína fluorescente verde, ou proteínas de superfície celular, tais como CD4, CD8, MHC de classe I, fosfatase alcalina de placenta, podem ser utilizados para distinguir as células transfectadas das não transfectadas, por meios como a discriminação FACS ou tecnologia de separação por pérolas magnéticas.

Também se podem utilizar outras células de eucariotas superiores como hospedeiros, incluindo células de plantas, células de insectos e células de aves. A utilização de Agrobacterium rhizogenes como um vector para a expressão de genes, em células de plantas foi revista por Sinkar et al.r J. Biosci. (Bangalore) ]Λ:47-58, 1987. A transformação de células 28 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ de insecto e a produção de polipéptidos estranhos nestas é descrita por Guarino et al., patente U.S. 5.162.222 e publicação ONPI WO 94/06463. As células de insecto podem ser infectadas com baculovirus recombinantes, vulgarmente derivados de virus de poliedrose nuclear de Autographa californuca (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV). Veja-se, King e Possee, The Baculovirus Expression System: a Laboratory Guide, Londres, Chapman & Hall; 0'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: a Laboratory Manual, Nova Iorque, Oxford University Press., 1994; e Richardson, Ed., Baculovirus Expression Protocols. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995. Um segundo método para produzir baculovirus BR43x2 recombinantes, utiliza um sistema de transporte baseado em transposões, descrito por Luckow et ai., J. Virol 67:4566-79, 1993). Este sistema que utiliza vectores de transferência, é comercializado no kit Bac-to-Bac~™ (Life Technologies, Rockville, MD) . Este sistema utiliza um vector de transferência, pFastBacl™ (Life Technologies) contendo um transposão tn7, para mover o ADN que codifica para o polipéptido BR43x2, para um genoma de baculovirus mantido em E. coli, como um plasmídeo grande, designado por "bacmídeo". Veja-se, Hill-Perkins e Possee, J. Gen. Virol. 71 : 971-6, 1990; Bonning et al., J. Gen. Virol. 75 :1551-6, 1994 ; e Chazenbalk e Rapoport, J. Biol. Chem. 270:1543-9, 1995. Além disso, os vectores de transferência podem incluir uma fusão "in-frame" com o ADN que codifica para um sinalizador de epítopo no terminal C ou N do polipéptido BR43x2 expresso, por exemplo, um sinalizador de epítopo Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 82:7952-4, 1985). Utilizando uma técnica conhecida na arte, transforma-se um vector de transferência contendo BR43x2 em E. coli e pesquisa-se quanto a baemídeos, que contêm um gene de lacZ interrompido, indicativo de baculovirus recombinantes. O ADN de bacmídeo que contém o genoma de baculovirus recombinante é isolado, utilizando técnicas comuns e é utilizado para transferir células de Spodoptera frugiperda, e.g. células Sf9. Os vírus recombinantes que expressam BR43x2 é subsequentemente produzido. Os estoques virais recombinantes são produzidos por métodos vulgarmente utilizados na arte. O vírus recombinante é utilizado para infectar células hospedeiras, tipicamente uma linha celular derivada da "fali 29 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ armyworm", Spodoptera frugiperda. Veja-se, em geral, Glick e

Pasternak, Molecular_Biotechnology :_Principies_and

Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington, D.C., 1994. Outra linha celular adequada é a linha celular High FiveO (Invitrogen), derivada de Trichoplusia ni (Patente U.S. #5.300.435). Utilizam-se meios isentos de soro vulgarmente conhecidos, para crescer e manter as células. Os meios adequados são Sf900 II™ (Life Technologies) ou ESF 921™ (Expression Systems) para as células Sf9; e Ex-CellO405™ (JRH Biosciences, Lenexa, KS) ou Express FiveO™ (Life Technologies para as células T. ni. As células são crescidas a partir de uma densidade de inoculação de aproximadamente 2-5 x 105 células, a uma densidade de 1-2 x 106 células, altura em que se adiciona um estoque virai, recombinante, a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,1 a 10, mais tipicamente próximo de 3. Os processos utilizados estão descritos em geral nos manuais de laboratórios disponíveis (King e Possee, ibid.; 0'Reilly, et al., Ibid., Richardson, ibid.). A purificação subsequente do polipéptido BR43x2 a partir do sobrenadante, pode ser conseguida utilizando métodos aqui descritos.

Também se podem utilizar na presente invenção células de fungos, incluindo células de leveduras. As espécies de leveduras de interesse particular, a este respeito, incluem Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris e Pichia methanolica. Os métodos para transformar células de S. cerevisiae com ADN exógeno e produzir polipéptidos recombinantes a partir destes, estão descritos, por exemplo, em Kawasaki, patente U.S. 4.599.311; Kawasaki et al., patente U.S. 4.931.373; Brake, patente U.S. 4.870.008; Welch et al., patente U.S. 5.037.743 e Murray et al., patente U.S. 4.845.075. As células transformadas são seleccionadas por fenótipo, determinado pelo marcador seleccionável, normalmente resistência a drogas ou a capacidade de crescer na ausência de um nutriente particular (e.g. leucina). Um sistema vector preferido para utilização em Saccharomyces cerevisiae é o sistema vector POTl, descrito por Kawasaki et al. (patente U.S. 4.931.373), que permite que as células transformadas sejam seleccionadas por crescimento em meios contendo glucose. Os promotores e sequências de terminação adequados para utilização em leveduras, incluem os de genes de enzimas glicolíticas (veja-se, por exemplo, Kawasaki, patente U.S. 30 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ 4.599.311; Kingsman et al., patente U.S. 4.615.974; e Bitter, patente U.S. 4.977.092) e genes de álcool desidrogenase. Veja-se também as patentes U.S. 4.990.446, 5.063.154; 5.139.936 e 4.661.454. Os sistemas de transformação para outras leveduras, incluindo Hansenula polymorpha, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces fragilis, Ustilago maydis, Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia guillermondii e Candida maltosa são conhecidos na arte. Veja-se, por exemplo, Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132:3459-65, 1986 e Cregg, patente U.S. 4.882.279. Podem-se utilizar células de Aspergillus de acordo com os métodos de McKnight et al., patente U.S. 4.935.349. Os métodos para transformar Acremonium chrysogenum são descritos por Sumino et al., patente U.S. 5.162.228. Os métodos para transformar Neurospora são descritos por Lambowitz, Patente U.S. 4.486.533.

Por exemplo, a utilização de Pichia methanolica como hospedeiro para a produção de proteínas recombinantes é descrita por Raymond, patente U.S. 5.716.808, Raymond, patente U.S. 5.736.383, Raymond et al., Yeast _l_4:ll-23, 1998 e nas publicações internacionais Nos. WO 97/17450, WO 97/17451, WO 98/02536 e WO 98/02565. As moléculas de ADN para utilização na transformação de P. methanolica transformantes, serão normalmente preparadas como plasmídeos circulares, de cadeia dupla, que são preferencialmente linearizados antes da transformação. Para a produção de polipéptidos em P. methanolica, prefere-se que o promotora e sequência de terminação no plasmídeo, sejam a do gene de P. methanolica, tal como um gene de utilização de álcool de P. methanolica (AUG1 ou AUG2) . Outros promotores úteis incluem os dos genes de di-hidroxiacetona-sintase (DHAS), formato desidrogenase (FMD) e catalase (CAT). Para facilitar a integração do ADN no cromossoma dos hospedeiro, é preferido ter todo o segmento de expressão do plasmídeo flanqueado em ambas as extremidades por sequências de ADN hospedeiro. Um marcador seleccionável preferido para utilização em Pichia methanolica é um gene de ADE2 de P. methanolica, que codifica para a fosforribosil-5-aminoimidazolo-carboxilase (AIRC; EC 4.1.1.21), que permite que as células hospedeiras ade2 cresçam na ausência de adenina. Para processos industriais em grande escala, em que é desejável minimizar a utilização de metanol, é preferido utilizar células hospedeiras em que ambos os genes de 31 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ utilização de metanol estão eliminados (AUG1 e AUG2) . Para a produção de proteínas segregadas, as células hospedeiras deficientes em genes de protease vacuolar (PEP4 e PRBl) são preferidos. A electroporação é utilizada para facilitar a introdução de um plasmídeo que contém ADN que codifica para um polipéptido de interesse, em P. methanolica. Prefere-se transformar células de P. methanolica por electroporação, utilizando um campo eléctrico pulsado, em decaimento exponencial, com uma força de campo de 2,5 a 4,5 kV/cm, de preferência de cerca de 3.75 kV/cm e uma constante de tempo (t) desde 1 a 40 mili-segundos, mais preferencialmente cerca de 20 mili-segundos.

As células hospedeiras procariotas, incluindo estirpes da bactéria Escherichia coli, Bacillus e outros géneros, são também úteis como células hospedeiras. As técnicas para transformar estes hospedeiros e expressão sequências de ADN estranhas, aí clonadas, são bem conhecidas na arte (veja-se, e.g. Sambrook et al., ibid.) . Quando se expressa um polipéptido BR43x2 em bactérias como a E. coli, o polipéptido pode ser retido no citoplasma, tipicamente na forma de grânulos insolúveis, ou pode ser direccionado para o espaço periplasmático, por uma sequência de secreção bacteriana. No primeiro caso, as células são lisadas e os grânulos são recuperados e desnaturados, utilizando, por exemplo, isotiocianato de guanidina ou ureia. O polipéptido desnaturado pode então ser reorganizado e dimerizado, diluindo o desnaturante, tal como por diálise contra uma solução de ureia e uma combinação de glutationa reduzido e oxidado, seguido de diálise contra uma solução salina tamponada. No último caso, o polipéptido pode ser recuperado a partir do espaço periplasmático, numa forma solúvel e funcional, rompendo as células (por, por exemplo, ultra-sons ou choque osmótico), para libertar os conteúdos do espaço periplasmático e recuperar a proteína, obviando assim a necessidade de desnaturação e reorganização.

As células hospedeiras transformadas ou transfectadas são cultivadas de acordo com processos convencionais, num meio de cultura contendo nutrientes e outros componentes necessários para o crescimento das células hospedeiras escolhidas. Uma variedade de meios adequados, incluindo meios definidos e 32 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ meios complexos, são conhecidos na arte e incluem, geralmente, uma fonte de carbono, uma fonte de azoto, aminoácidos essenciais, vitaminas e minerais. Os meios podem também conter componentes como factores de crescimento, ou soro, como necessário. 0 meio de crescimento irá, geralmente, seleccionar células contendo ADN adicionado exogenamente por, por exemplo, selecção de drogas ou deficiência num nutriente essencial, que é complementado pelo marcador seleccionável, transportado no vector de expressão ou co-transfectado na células hospedeira. As células de P. methanolica são cultivadas num meio que compreende fontes adequadas de carbono, azoto e nutrientes vestigiários, a uma temperatura de cerca de 25°C a 35°C. As culturas líquidas são proporcionadas com arejamento suficiente, por meios convencionais, tais como agitação de frascos pequenos ou forçando ar através do líquido de fermentadores. Um meio de cultura preferido para P. methanolica é YEPD (2% de D-glucose, 2% de Bacto™Peptona (Difco Laboratories, Detriot, MI), 1% de extracto de levedura Bacto™ (Difco Laboratories), 0,004% de adenina e 0,006% de L-leucina).

Os polipéptidos BR43x2 recombinantes, expressos (ou polipéptidos BR43x2 quiméricos ou de fusão), podem ser purificados utilizando fraccionamento e/ou métodos e meios de purificação convencionais. É preferido proporcionar proteínas ou polipéptidos numa forma altamente purificada, i.e. mais do que 95% pura, mais preferencialmente mais do que 99% pura. A precipitação com sulfato de amónio e extracção com ácido ou caotrópico pode ser utilizada para fraccionamento de amostras. Exemplos de passos de purificação podem incluir a hidroxiapatite, exclusão de tamanhos, FPLC e cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa. Os meios de troca aniónica adequados incluem dextranos derivatizados, agarose, celulose, poliacrilamida, sílicas especiais e semelhantes. Os derivados de PEI, DEAE, QAE e Q são preferidos, sendo particularmente preferido a DEAE Fast-Flow Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ). Exemplos de meios cromatográficos incluem os meios derivatizados com grupos fenilo, butilo, ou octilo, tais como fenil-Sepharose FF (Pharmacia) , Toyopearl butil 650 (Toso Haas, Montgomeryville, PA), octil-Sepharose (Pharmacia) e semelhantes; ou resinas poliacrílicas, tais como Amberchrom CG 71 (Toso Haas) e semelhantes. Os suportes 33 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ sólidos adequados incluem pérolas de vidro, resinas à base de sílica, resinas celulósicas, pérolas de agarose, pérolas de agarose reticuladas, pérolas de poliestireno, resinas de poliacrilamida reticulada e semelhantes, que são insolúveis nas condições em que devem ser utilizadas. Estes suportes podem ser modificados com grupos reactivos que permitem a ligação de proteínas por grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfidrilo, grupos hidroxilo e/ou porções de hidratos de carbono. Exemplos de químicas de acoplamento incluem activação com brometo de cianogénio, activação com N-hidroxissuccinimida, activação com epóxido, activação com sulfidrilo, activação com hidrazida e derivados de carboxilo e amino, para químicas de acoplamento de carbodi-imida. Estes e outros meios sólidos são bem conhecidos e amplamente utilizados na arte e estão disponíveis de fontes comerciais. Os métodos para ligação de polipéptidos receptores a meios de suporte são bem conhecidos na arte. A selecção de um método particular é trabalho de rotina e é determinada, em parte, pelas propriedades do suporte escolhido. Veja-se, por exemplo, Affinity Chromatography: Principies & Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Suécia, 1988.

Os polipéptidos aqui descritos podem ser isolados por exploração das suas propriedades físicas. Por exemplo, pode-se utilizar cromatografia de adsorção de iões metálicos imobilizados (IMAC), para purificar proteínas ricas em histidina, incluindo as que compreendem sinalizadores de poli-histidina. Em resumo, um gel é primeiro carregado com iões metálicos bivalentes, para formar um quelato (Sulkowski, Trends in Biochem 3:1-7, 1985). As proteínas ricas em histidina serão absorvidas a esta matriz com diferentes afinidades, dependendo do ião metálico utilizado, e serão eluídas por eluição competitiva, abaixamento do pH, ou utilização de agentes quelantes fortes. Outros métodos de purificação incluem purificação de proteínas glicosiladas, por cromatografia de afinidade de lectina e cromatografia de troca iónica (Methods in Enzymol, vol. 182, "Guide to protein

Purification", M. Deutscher, (ed.), Acad. Press, San Diego, 1990, pp. 529-39. Pode construir-se uma fusão do polipéptido de interesse e um sinalizador de afinidade (e.g. proteína de ligação a maltose, sinalizador FLAG (Asp Tyr Lys Asp Asp Asp

Asp Lys (SEQ ID NO:13)), sinalizador Glu-Glu (Glu Glu Tyr Met 34 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

Pro Met Glu (SEQ ID NO:14)), um domínio de imunoglobulina) , para facilitar a purificação.

Podem-se utilizar, com vantagem, processos de reorganização da proteína (e opcionalmente reoxidação). É preferido purificar a proteína até > 80% de pureza, mais preferencialmente > 90% de pureza, ainda mais preferencialmente > 95% e prefere-se em particular um estado farmaceuticamente puro, isto é, mais do que 99,9% puro, em relação às macromoléculas contaminantes, particularmente outras proteínas e ácidos nucleicos e isentas de agentes infecciosos e pirogénicos. De preferência, uma proteína purificada é substancialmente isenta de outras proteínas, particularmente outras proteínas de origem animal.

Os polipéptidos BR43x2 ou seus fragmentos podem também ser preparados por síntese química. Os polipéptidos BR43x2 podem ser monómeros ou multímeros; glicosilados ou não glicosilados; peguilados ou não peguilados; e podem ou não incluir um resíduo de aminoácido de metionina inicial. Exemplos de polipéptidos BR43x2 incluem polipéptidos de 32-40 resíduos de comprimento, com uma sequência de aminoácidos conforme ao motivo: XXCX[QEX][QEKNRDHS][QE]X{0-2}[YFW][YFW]DXLLX{2} C[IMLV]XCX{3}CX{6-8}CX{2}[YF]CXX (SEQ ID NO:10) e sujeito às limitações aqui descritas.

Os polipéptidos BR43x2 podem ser sintetizados por síntese em fase sólida exclusiva, métodos de fase sólida parcial, condensação de fragmentos ou síntese em solução, clássica. Os polipéptidos são preferencialmente preparados por síntese de péptidos em fase sólida, por exemplo como descrito por Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149, 1963. A síntese é realizada com aminoácidos que estão protegidos no terminal alfa-amino. Aminoácidos trifuncionais com cadeias laterais lábeis são também protegidos com grupos adequados para prevenir a ocorrência de reacções químicas indesejadas durante a montagem dos polipéptidos. O grupo protector de alfa-amino é selectivamente removido para permitir a ocorrência da reacção subsequente no terminal amino. As condições para a remoção do grupo protector de alfa-amino não removem os grupos protectores de cadeias laterais. 35 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

Os grupos protectores de alfa-amino são os que sabe serem úteis na arte da síntese de polipéptidos por passos. Estão incluídos grupos protectores do tipo acilo (e.g., formilo, trifluoroacetilo, acetilo), grupos protectores do tipo arilo (e.g., biotinilo), grupos protectores do tipo uretano aromático [e.g., benziloxicarbonilo (Cbz), benziloxicarbonilo substituído e 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc)], grupos protectores uretano alifático [e.g., t-butiloxicarbonilo (tBoc), isopropiloxicarbonilo, ciclo-hexiloxicarbonilo] e grupos protectores do tipo alquilo (e.g., benzilo, trifenilmetilo). Os grupos protectores preferidos são tBoc e Fmoc.

Os grupos protectores da cadeia lateral seleccionados têm que permanecer intactos durante o acoplamento e não serem removidos durante a desprotecção do grupo protector do terminal amino ou durante as condições de acoplamento. Os grupos protectores da cadeia lateral têm também que removíveis depois de completada a síntese utilizando as condições reaccionais que não irão alterar o polipéptido acabado. Na química do tBoc, os grupos protectores da cadeia lateral para aminoácidos trifuncionais são principalmente à base de benzilo. Na química do Fmoc, são principalmente à base de terc-butilo ou tritilo.

Na química do tBoc, os grupos protectores da cadeia lateral preferidos são tosilo para arginina, ciclo-hexilo para ácido aspártico, 4-metilbenzilo (e acetamidometilo) para cisteína, benzilo para ácido glutâmico, serina e treonina, benziloximetilo (e dinitrofenilo) para histidina, 2-C1-benziloxicarbonilo para lisina, formilo para triptofano e 2-bromobenzilo para tirosina. Na química do Fmoc, os grupos protectores das cadeias laterais preferidos são 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo (Pmc) ou 2,2,4, 6, 7-pentametildi-hidrobenzofurano-5-sulfonilo (Pbf) para arginina, tritilo para asparagina, cisteína, glutamina e histidina, terc-butilo para ácido aspártico, ácido glutâmico, serina, treonina e tirosina, tBoc para lisina e triptofano.

Para a síntese de fosfopéptidos, utiliza-se a incorporação, directa ou após montagem, do grupo fosfato. Na estratégia da incorporação directa, o grupo fosfato na serina, 36 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ treonina ou tirosina pode ser protegido por metilo, benzilo ou terc-butilo na química do Fmoc ou por metilo, benzilo ou fenilo na química do tBoc. A incorporação directa de fosfotirosina sem protecção do fosfato pode também ser utilizada na química do Fmoc. Na estratégia da incorporação após montagem, os grupos hidroxilo não protegidos de serina, treonina ou tirosina são derivatizados em fase sólida com di-terc-butil-, dibenzil- ou dimetil-N,N'- diisopropilfosforamidito e depois oxidados por terc-butil-hidroperóxido. A síntese em fase sólida é usualmente realizada a partir do terminal carboxilo por acoplamento do aminoácido protegido em alfa-amino (protegido na cadeia lateral) a um suporte sólido adequado. É formada uma ligação éster quando a ligação é feita a uma resina de clorometilo, clorotritilo ou hidroximetilo, e o polipéptido resultante terá um grupo carboxilo livre no terminal C. Alternativamente, quando se utilizam uma resina de amida tal como resina de benzidrilamina ou p-metilbenzidrilamina (para a química do tBoc) e resina de amida Rink ou PAL (para a química do Fmoc) , é formada uma ligação peptídica e o polipéptido resultante terá um grupo carboxamida no terminal C. Estas resinas, quer à base de poliestireno ou de poliamida quer enxertadas com polietilenoglicol, com ou sem uma "pega" ou um ligante, com ou sem o primeiro aminoácido ligado, estão comercialmente disponíveis, e as suas preparações foram descritas por Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (2nd Edition), (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984) e Bayer e Rapp, Chem. Pept. Prot. 3:3, 1986; e Atherton et al., Solid Phase Peptide

Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989. 0 aminoácido C-terminal, protegido na cadeia lateral se necessário, e no grupo alfa-amino, é ligado a uma resina de hidroxilmetilo utilizando vários agentes de activação incluindo diciclo-hexilcarbodiimida (DCC), N,N'- diisopropilcarbodiimida (DIPCDI) e carbonildiimidazole (CDI). Pode ser ligado a resina de clorometilo ou clorotritilo directamente na sua forma de sal de tetrametilamónio de césio ou na presença de trietilamina (TEA) ou diisopropiletilamina (DIEA). A ligação do primeiro aminoácido a uma resina de amida 37 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ é a mesma que a formação da ligação peptídica durante as reacções de acoplamento.

Após a ligação ao suporte de resina, o grupo protector de alfa-amino é removido utilizando vários reagentes dependendo da química da protecção (e.g., tBoc, Fmoc). A extensão da remoção do Fmoc pode ser monitorada a 300-320 nm ou através de uma célula de condutividade. Após a remoção do grupo protector de alfa-amino, os aminoácidos protegidos restantes são acoplados passo a passo pela ordem requerida para obter a sequência desejada.

Podem ser utilizados vários agentes de activação para as reacções de acoplamento incluindo DCC, DIPCDI, hexafluorofosfato de 2-cloro-l,3-dimetilimídio (CIP), hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxi-tris- (dimetilamino)fosfónio (BOP) e seu análogo de pirrolidina (PyBOP), hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidinofosfónio (PyBrOP), hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilurónio (HBTU) e seu análogo de tetra-fluoroborato (TBTU) ou seu análogo de pirrolidina (HBPyU), hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-l-il)-1,1,3,3- tetrametilurónio (HATU) e seu análogo de tetrafluoroborato (TATU) ou seu análogo de pirrolidina (HAPyU). Os aditivos catalíticos mais comuns utilizados em reacções de acoplamento incluem 4-dimetilaminopiridina (DMAP), 3-hidroxi-3,4-di-hidro-4-oxo-l,2,3-benzotriazina (HODhbt), N-hidroxibenzotriazole (HOBt) e l-hidroxi-7-azabenzotriazole (HOAt). Cada aminoácido protegido é utilizado em excesso (>2,0 equivalentes), e os acoplamentos são usualmente realizados em N-metilpirrolidona (NMP) ou em DMF, CH2CI2 ou suas misturas. A extensão da reacção de acoplamento pode ser monitorada em cada etapa, e.g., pela reacção da ninidrina como descrito por Kaiser et al., Anal. Biochem. 34:595, 1970.

Depois da completa montagem do péptido desejado, o péptido-resina é clivado com um reagente com os sequestrantes correctos. Os péptidos Fmoc são usualmente clivados e desprotegidos por TFA com sequestrantes (e.g., H2O, etanoditiol, fenol e tioanisole). Os péptidos tBoc são usualmente clivados e desprotegidos com HF líquido durante 1-2 horas a -5 a 0°C, o que cliva o polipéptido da resina e 38 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ remove a maioria dos grupos protectores das cadeias laterais. Os sequestrantes como anisole, dimetilsulfureto e p-tiocresol são usualmente utilizados com o HF liquido para impedir que catiões formados durante a clivagem alquilem e acilem os resíduos de aminoácido presentes no polipéptido. 0 grupo formilo do triptofano e o grupo dinitrofenilo da histidina não precisam de ser removidos, respectivamente por piperidina e tiof enilo em DMF antes da clivagem com HF. 0 grupo acetamidometilo da cisteína pode ser removido por acetato de mercúrio(II) e alternativamente por iodo, trifluoroacetato de tálio(III) ou tetrafluoroborato de prata, que simultaneamente oxidam a cisteína a cistina. Outros ácidos fortes utilizados para a clivagem de péptidos tBoc e desprotecção incluem ácido trifluorometanossulfónico (TFMSA) e trifluoroacetato de trimetilsililo (TMSOTf). 0 presente fascículo descreve uma variedade de fusões de polipéptidos e proteínas multiméricas relacionadas, compreendendo uma ou mais fusões de polipéptidos. Um polipéptido BR43x2, TACI ou BCMA solúvel pode ser expresso como uma fusão com uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina, tipicamente um fragmento Fc, que contém dois domínios de região constante e não possui a região variável. Os métodos para preparar estas fusões estão descritos nas patentes U.S. 5.155.027 e 5.567.584. Estas fusões são tipicamente segregadas como moléculas multiméricas, em que as porções Fc estão ligadas por ligações dissulfureto umas às outras e dois polipéptidos não Ig estão dispostos em série, numa proximidade estreita um com o outro. As fusões de

Imunoglobulina-polipéptido BR43x2 (TACI ou BCMA) podem ser expressas em células manipuladas geneticamente, para produzir uma variedade de análogos de BR43x2 multiméricos. Os domínios auxiliares podem ser fundidos a polipéptidos BR43x2 (TACI ou BCMA) para os direccionar para células, tecidos ou macromoléculas específicas. As fusões podem também ser feitas utilizando toxinas, como aqui discutido. Deste modo, os polipéptidos e proteínas podem ser alvos para fins terapêuticos ou de diagnóstico. Pode-se fundir um polipéptido BR43x2 a duas ou mais porções, tais como um sinalizador de afinidade, para purificação e um domínio para direccionamento. As fusões de polipéptidos podem também compreender um ou mais locais de clivagem, particularmente entre domínios. Veja-se, 39 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

Tuan et al., Connect. Tiss. Res. 34 :l-9, 1996 . Fusões deste tipo podem também ser utilizadas, por exemplo, para purificar por afinidade um ligando cognato a partir de uma solução, como ferramenta de ensaio in vitro, para bloquear sinais in vitro através da titulação especifica do ligando, para ligar o ligando na superfície celular ou como antagonistas de BR43x2 in vivo através da sua administração para bloquear a estimulação dos ligandos. Para utilização em ensaios, as proteínas de fusão podem ser ligadas a um suporte por via da região Fc e utilizadas num formato ELISA. 0 fascículo também descreve receptores de BR43x2 solúveis e fragmentos de polipéptidos utilizados para formar proteínas de fusão com sinalizadores ou marcadores de afinidade como definido nas reivindicações. As proteínas de fusão BR43x2 solúvel-sinalizador de afinidade são utilizadas, por exemplo, para identificar ligandos de BR43x2, bem como agonistas e antagonistas do ligando natural. Utilizando BR43x2 marcado, solúvel, células que expressam o ligando, identificam-se agonistas ou antagonistas por imunocitometria de fluorescência ou imuno-histoquímica. As proteínas de fusão solúveis são úteis no estudo da distribuição do ligando em tecidos, ou linhas de células específicas e para proporcionar conhecimento sobre a biologia do receptor/ligando.

Para purificar o ligando, agonistas ou antagonistas, adiciona-se uma proteína de fusão, BR34x2-Ig a uma amostra que contém o ligando, agonista ou antagonista, sob condições que facilitam a ligação receptor-ligando (tipicamente temperatura próxima da fisiológica, pH e força iónica). 0 complexo receptor-ligando é então separado pela mistura utilizando proteína A, que é mobilizada num suporte sólido (e.g., pérolas de resina insolúvel). 0 ligando, agonista, antagonista é então eluído, utilizando técnicas químicas convencionais, tais como com um gradiente de sal ou pH. Em alternativa, a própria proteína de fusão pode ser ligada a um suporte sólido, sendo a ligação e eluição realizadas como acima descrito. Os métodos para a imobilização do polipéptido receptor num suporte sólido, tal como contas de agarose, agarose reticulada, vidro, resinas celulósicas, resinas à base de sílica, poliestireno, poliacrilamida reticulada, ou materiais similares que são estáveis sob as condições de utilização, são conhecidos na arte. Os métodos para ligação de polipéptidos a suportes 40 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ sólidos são conhecidos na arte, e incluem quimica das aminas, activação por brometo de cianogénio, activação por N-hidroxissuccinimida, activação por epóxido, activação por sulfidrilo e activação por hidrazida. Os meios resultantes serão geralmente configurados na forma de uma coluna e os fluidos contendo ligando são passados através da coluna, uma ou mais vezes, para permitir que o ligando se ligue ao polipéptido receptor. O ligando é então eluido utilizando alterações na concentração de sal, agentes caotrópicos (MnCl2) ou pH, para romper a ligação ligando-receptor.

Para direccionar a exportação de receptor solúvel a partir da célula hospedeira, o ADN receptor solúvel é ligado a um segundo segmento de ADN que codifica para um péptido secretor, tal como um péptido secretor t-PA. Para facilitar a purificação do domínio receptor segregado, pode-se fundir uma extensão de terminal-N ou -C, tal como um sinalizador de afinidade, ou outro polipéptido ou proteína, para os quais está disponível um anticorpo ou outro agente de ligação específica, ao polipéptido receptor.

As células que expressam receptores funcionais, solúveis e ligados a membranas, da presente invenção, são utilizadas no âmbito de ensaios de rastreio. São conhecidos a arte uma variedade de ensaios adequados. Estes ensaios são baseados na detecção de uma resposta biológica numa célula alvo. Uma alteração no metabolismo comparativamente com um valor de controlo indica um composto de teste que modula o metabolismo mediado por BR43x2. Um destes ensaios é um ensaio de proliferação celular. As células são cultivadas na presença ou na ausência de um composto de teste, e é detectada a proliferação celular através de, por exemplo, medição da incorporação de timidina tritiada ou por ensaio colorimétrico baseado na quebra metabólica de brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT) (Mosman, J. Immunol. Meth. 65: 55-63, 1983) . Um formato de ensaio alternativo utiliza células que são adicionalmente manipuladas para expressar um gene repórter. 0 gene repórter é ligado a um elemento promotor que é responsivo à via ligada ao receptor, e o ensaio detecta a activação de transcrição do gene repórter. São conhecidos na arte numerosos genes repórter que são facilmente ensaiados em extractos celulares, por exemplo, o lacZ de E. coli, cloranfenicol-acetiltransferase (CAT) e 41 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ elemento de resposta sérica (SRE) (veja-se, e.g., Shaw et al., Cell 56:563-72, 1989). Um destes genes repórter preferidos é um gene de luciferase (de Wet et al., Mol. Cell. Biol. 7:725, 1987) . A expressão do gene da luciferase é detectada por luminescência utilizando métodos conhecidos na arte (e.g., Baumgartner et al., J. Biol. Chem. 269:29094-101, 1994; Schenborn e Goiffin, Promega Notes 41:11, 1993). Estão disponíveis comercialmente klts de ensaio para a actividade de luciferase de, por exemplo, Promega Corp., Madison, WI. Linhas celulares alvo deste tipo podem ser utilizadas para o rastreio de bibliotecas de químicos, meios de cultura condicionados por células, caldos fúngicos, amostras de solo, amostras de água, e similares. Por exemplo, pode ser ensaiado um banco de amostras de meios condicionados por células numa célula alvo para identificar células que produzem ligando. As células positivas são então utilizadas para produzir uma biblioteca de ADNc num vector de expressão de mamífero, que é dividida em conjuntos, transfectada em células hospedeiras e expressa. Amostras de meios das células transfectadas são então ensaiadas, com subsequente divisão em conjuntos, re- transfecção, subcultura e re-ensaio de células positivas para isolar um ADNc clonado que codifica o ligando.

Um sistema de ensaio que utilize um receptor que se liga ao ligando (ou um anticorpo, um membro de um par complemento/anti-complemento) ou um seu fragmento de ligação, e um instrumento biossensor comercialmente disponível (BIAcore™, Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ) podem também ser empregues com vantagem. Este receptor, anticorpo, membro de um par complemento/anti-complemento ou fragmento, é imobilizado na superfície de um chip receptor. A utilização deste instrumento é divulgada por Karlsson, J. Immunol. Meth. 145:229-40, 1991 e Cunningham e Wells, J. Mol. Biol. 234:554- 63, 1993. Por exemplo, um polipéptido BR43x2, um fragmento, um anticorpo ou um membro de um par complemento/anti-complemento, é fixado covalentemente, utilizando a química das aminas ou do sulfidrilo, a fibras de dextrano que são ligadas película de ouro no interior da célula de fluxo. Uma amostra de teste é passada através a célula. Se estiver presente na amostra um ligando, um epítopo ou o membro oposto do par complemento/anti-complemento, este ligar-se-á ao receptor, anticorpo ou membro, respectivamente, imobilizado, provocando uma alteração no índice de refracção do meio, que é detectada 42 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ na forma de uma alteração em ressonância plasmónica de superfície da película de ouro. Este sistema também permite a determinação de taxas de associação (on-rate) e dissociação (off-rates), a partir das quais a afinidade de ligação pode ser calculada, e a determinação da estequiometria da ligação. Os polipéptidos receptores que se ligam ao ligandos podem também ser utilizados no âmbito de outros sistemas de ensaio conhecidos na arte. Estes sistemas incluem análise Scatchard para determinação da afinidade de ligação (veja-se, Scatchard, Ann. NY Acad. Sei. 51: 660-72, 1949) e ensaios calorimétricos (Cunningham et al., Science 253:545-48, 1991; Cunningham et al., Science 245:821-25, 1991). A análise do gráfico de Scatchard para a ligação de 125I-ztnf4 a TACI e BCMA é apresentada na Figura 2 e comparada com as constantes de ligação de outros membros da família TNFR, na tabela 7. TABELA 7

Ligando Kd M Fonte celular Referência TNFa elevado 7,14E-11 HL-60 a TNFa baixo 3,26E-10 HEP-2 a TNFa elevado 2,00E-10 HL-60 b CD27L 3,70E-10 MP-1 c CD27L 8,30E-9 MP-1 c CD40L 5,00E-10 EL40,5 d CD40L 1,00E-09 EBNA d (125I-CD40) 4-1BBL 1,16E-09 Biacore e mAc anti 41BB 4,14E-10 Biacore e ztnf4 sol. 1,11E-09 TACI-BHK ztnf4 sol. 1,25E-09 BCMA-BHK a Hohmann et al., J. Biol. Chem. 264 :14927-34, 1989 b Manna e Aggarwal, J. Biol. Chem. 273:33333-41, 1998 c Goodwin et al., Cell 73:447-56, 1993 d Armitage et al., Nature 357 :80-82, 1992 e Shuford et al., J. Exp. Med. 186 :47-55, 1997 43 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

Como um receptor, a activação de polipéptido BR43x2 pode ser medida por um microfisiómetro biossensor à base de silício que mede a taxa de acidificação extracelular ou a excreção protónica associada à ligação ao receptor e subsequentes respostas celulares fisiológicas. Um dispositivo exemplificativo é o microfisiómetro Cytosensor™ fabricado por Molecular Devices, Sunnyvale, CA. Uma variedade de respostas celulares, tais como proliferação celular, transporte iónico, produção de energia, resposta inflamatória, reguladora e activação do receptor, e similares, podem ser medidas por este método. Veja-se, por exemplo, McConnell et al., Science 257:1906-12, 1992; Pitchford et al., Meth. Enzymol. 228:84-108, 1997; Arimilli et al., J. Immunol. Meth. 212:49-59, 1998; Van Liefde et al., Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998. O microfisiómetro pode ser utilizado para o ensaio de células eucariotas ou procariotas, aderentes ou não aderentes. Por medição das alterações de acidificação extracelular em meios celulares ao longo do tempo, o microfisiómetro mede directamente as respostas celulares a vários estímulos, incluindo agonistas, ligandos ou antagonistas do polipéptido BR43x2. Preferivelmente, o microfisiómetro é utilizado para medir respostas de uma célula eucariota que expressa BR43x2, comparativamente com uma célula eucariota de controlo que não expressa o polipéptido BR43x2. As células eucariotas que expressam BR43x2 compreendem células nas quais foi transfectado BR43x2, como aqui descrito, criando uma célula que é responsiva a estímulos que modulam BR43x2; ou células que expressam naturalmente BR43x2, tais como células que expressam BR43x2 derivadas de tecido esplénico. As diferenças, medidas por uma alteração na acidificação extracelular, por exemplo, um aumento ou uma diminuição na resposta de células que expressam BR43x2, relativamente a um controlo, são uma medida directa das respostas celulares moduladas por BR43x2. Adicionalmente, estas respostas moduladas por BR43x2 podem ser ensaiadas sob uma variedade de estímulos. Igualmente, utilizando o microfisiómetro, proporciona-se um método de identificação de agonistas e antagonistas de polipéptido BR43x2, compreendendo proporcionar células que expressam um polipéptido BR43x2, cultivar uma primeira porção das células na ausência de um composto de teste, cultivar uma segunda porção das células na presença de um composto de teste, e detectar uma alteração, por exemplo, um aumento ou uma 44 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ diminuição, numa resposta celular da segunda porção das células comparativamente com a primeira porção das células. A alteração na resposta celular é apresentada como uma alteração mensurável da taxa de acidificação extracelular. Os antagonistas e agonistas para o polipéptido BR43x2 podem rapidamente ser identificados utilizando este método. 0 BR43x2 solúvel é útil no estudo da distribuição de ligandos em tecidos ou linhagens celulares especificas, e para proporcionar um entendimento da biologia do receptor/ligando. Também se pode aplicar a especificidade de receptores de TNF para com os seus ligandos como um mecanismo através do qual se destroem células alvo portadoras do ligando. Por exemplo, compostos tóxicos podem ser acoplados a receptor BR43x2 solúvel ou a fusão de BR43x2. Exemplos de compostos tóxicos incluirão radiofarmacêuticos que inactivam células alvo; agentes quimioterapêuticos tais como doxorubicina, daunorubicina, metotrexato e citoxano; toxinas, tais como ricina, difteria, exotoxina A de Pseudomonas e abrina; e anticorpos contra moléculas da superfície de células T citotóxicas.

Verificou-se que o ztnf4 (5 ng/ml) se liga a BR43x2 (SEQ ID NO : 2) , TACI (SEQ ID NO :6), BCMA (SEQ ID NO : 8) e BR43xl (SEQ ID NO :9), por análise FACS (citometria de fluxo e discriminação, Melamed et al., eds. Wiley-Liss, 1990 e Imunofluorescência e discriminação celular, Current Protocols in Immunology, volume 1, Coligan et al. eds. John Wiley & Sons, 1997) . Também se verificou que o ztnf4 solúvel, sinalizado com FITC se liga especificamente a, entre outros, linfócitos B, em PBMNC, células de amígdala, a linhas celulares de linfoma de células B (Raji, linfoma humano de Burkitt, ATCC CCL86), Ramos (linha celular de linfoma de

Burkitt, ATCC CRL-1596), Daudi (linfoma humano de Burkitt, ATCC CCL213) e RPMI 1788 (uma linha celular de linfócitos B, ATCC CCL-156) utilizando análise FACS. Não se observou nenhuma ligação com HL-60 (ATCC uma linha celular promielocítica, ATCC CCL-240). A especificidade para ligação a células B de PBMNC e células de amígdala, foi confirmada por co-coloração com anticorpos para moléculas específicas de células B, incluindo CD19, IgD, IgM e CD20. A semelhança entre ztnf4 e CD40L sugeriu uma maior distribuição de tecido do que 45 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ a que foi observada. A afinidade de ztnf4 foi testada em monócitos, células dendríticas e células T purificadas, utilizando proliferação de citóquinas e testes de proliferação de células T, por exemplo, e não conseguiu detectar a ligação de ztnf4 ou de qualquer outro efeito biológico em nenhum outro tipo de célula testada. Assim, a especificidade para as células B por parte do ligando e receptor, sugere que estes são úteis para o estudo e tratamento da auto-imunidade, cancros de células B, imunomodulação, IBD e quaisquer patologias mediadas por anticorpos, e.g. ITCP, miastenia grave e semelhantes, doenças renais, resposta imunitária de células T indirecta, rejeição de enxertos, doença de enxerto versus hospedeiro.

Verificou-se que o ztnf4 activa células B, resultando na proliferação de células B, produção de anticorpos e supra-regulação de sinalizadores de activação, in vitro (vejam-se exemplos, a seguir). Estes efeitos poderão necessitar da co-estimulação através de IL-4 ou outras citóquinas, ou de estimulação através do receptor de antigénios de células B ou outros receptores de superfície celular que activam células B, i.e. CD40. Outros ligandos do factor de necrose de tumor, tais como gp39 e ΤΝΕβ, também estimulam a proliferação de células B. Assim, os polipéptidos aqui descritos podem ser direccionados para regular especificamente respostas de células B, inibindo células B activadas, durante a resposta imunitária, sem afectar outras populações de células, o que é vantajoso no tratamento da doença. Adicionalmente, os polipéptidos aqui descritos podem ser utilizados para modular o desenvolvimento de células B, desenvolvimento de outras células, produção de anticorpos e produção de citóquinas. Os polipéptidos BR43x2 também têm utilidade em induzir a apoptose e/ou anergia, nas células. Os polipéptidos aqui descritos também podem modular a comunicação entre células T e B, neutralizando os efeitos proliferativos de ztnf4. Estão disponíveis bioensaios e ELISA, para medir a resposta celular ao ztnf4, na presença de BR43x2 solúvel, TACI e/ou BCMA. Outros testes incluem os que medem alterações na produção de citóquinas, como uma medida da resposta celular (veja-se, por exemplo, Current Protocols in Immunology ed. John E. Coligan et al.r NIH, 1996). Testes para medir outras respostas celulares, incluindo o isotipo do anticorpo, activação de 46 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ monócitos, formação de células NK, função da célula que apresenta antigénios, apoptose.

Os polipéptidos compreendendo a sequência SEQ ID NO: 10 são úteis para o fabrico de um medicamento para o tratamento das condições enumeradas nas reivindicações. A análise de transferência de Northern mostrou que o ztnf4 é expresso em células CD8+, monócitos, dendrócitos, monócitos activados. Isto sugere que nalgumas desordens auto-imunes, as células T citotóxicas possam estimular a produção de células B, através de um excesso de produção de ztnf4. As proteínas imunossupressoras que bloqueiam selectivamente a acção de linfócitos-B teriam utilidade no tratamento da doença. A produção de auto-anticorpos é comum a várias doenças auto-imunes e contribui para a destruição de tecidos e exacerbação da doença. Os auto-anticorpos também podem levar à ocorrência de complicações de deposição do complexo imunitário e levam a muitos sintomas do lúpus eritematoso sistémico, incluindo insuficiência renal, sintomas neurálgicos e morte. A modulação da produção de anticorpos independente da resposta celular também seria benéfica em muitos estados de doença. Também se verificou que as células B desempenham um papel na secreção de imunoglobulinas artritogénicas, na artrite reumatóide (Korganow et ai., Immunity 10:451-61, 1999). Assim, a inibição da produção de anticorpos de ztnf4 seria benéfica no tratamento de doenças auto-imunes, tais como a miastenia grave e artrite reumatóide. Uma terapêutica imunossupressora, tal como BR43x2 solúvel que bloqueia selectivamente ou neutraliza a acção de linfócitos B, seria útil para estes fins. Para verificar estas capacidades em polipéptidos receptores solúveis BR43x2, da presente invenção, estes polipéptidos BR43x2 são avaliados utilizando testes conhecidos na arte e aqui descritos. A invenção proporciona a utilização de um polipéptido ou uma fusão, como estabelecido nas reivindicações para o fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças enumeradas nas reivindicações. A presente invenção proporciona assim a utilização de um polipéptido compreendendo a SEQ ID NO:10 para o fabrico de um 47 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ medicamento para tratamento de neoplasmas renais, neuropatia de cadeia leve, amiloidose, asma, bronquite e enfisema. As utilizações dos polipéptidos e fusões da presente invenção são para o fabrico de um medicamento para tratamento de Doença de Crohn, ou para tratamento de inflamação associada a dor das articulações, inchaço OU choque séptico, como definido nas reivindicações. 0 efeito de polipéptidos BR43x2, TACI ou BCMA, solúveis e proteínas de fusão, na resposta imunitária, pode ser medido administrando os polipéptidos a animais imunizados com antiqénios, sequido de injecção de ztnf4 e medição da produção de isotipos de anticorpos e respostas de células B e T, incluindo hipersensibilidade do tipo retardado e proliferação in vitro e produção de citóquinas, de acordo com os métodos conhecidos na arte.

Os compostos identificados como aqonistas de BR43x2 são úteis para a modificação da proliferação e desenvolvimento de células alvo in vitro e in vivo. Por exemplo, os compostos agonistas são úteis sozinhos ou em combinação com outras citóquinas e hormonas como componentes de meios de cultura celular definidos. Os agonistas são assim úteis para mediar especificamente o crescimento e/ou o desenvolvimento de células linfócitos B portadores de BR43x2 em cultura. Os agonistas e antagonistas podem também provar-se úteis no estudo de funções efectoras de linfócitos B, em particular activação e diferenciação de linfócitos B. Os antagonistas são úteis como reagentes de investigação para a caracterização da interacção ligando-receptor.

Os compostos identificados como antagonistas de BR43x2 são também úteis para reforças a resposta imunitária humoral. As respostas de células B são importantes no combate a doenças infecciosas incluindo infecções bacterianas, virais, protozoárias e parasíticas. Anticorpos contra microorganismos infecciosos podem imobilizar o patogénio por ligação ao antigénio seguida de lise mediada pelo complemento ou ataque mediado por células. Um antagonista de BR43x2 servirá para reforçar a resposta humoral e será um útil terapêutico para indivíduos em risco de ter uma doença infecciosa ou como suplemento de vacinação. 48 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

Os antagonistas ligam-se a polipéptidos BR43x2 ou, alternativamente, a um ligando ao qual polipéptidos BR43x2 se ligam, desse modo inibindo ou eliminando a função de BR43x2. Estes antagonistas de BR43x2 incluirão anticorpos; oligonucleótidos que se ligam quer ao polipéptido BR43x2 quer ao seu ligando; análogos naturais ou sintéticos de ligandos BR43x2 que retêm a capacidade de se ligar ao receptor mas não resultam em sinalização nem do ligando nem do receptor. Estes análogos podem ser péptidos ou compostos de tipo peptídico. Moléculas pequenas, naturais ou sintéticas, que se ligam aos polipéptidos BR43x2 e previnem a sinalização estão também contemplados como antagonistas. Como tal, os antagonistas de BR43x2 serão úteis como terapêuticos para o tratamento de determinadas desordens onde seria benéfico o bloqueio do sinal de um receptor ou ligando de BR43x2. Os antagonistas são úteis como reagentes de investigação para a caracterização da interacção ligando-receptor. 0 BR43x2 é expresso em linhas de células B transformadas incluindo linfoma de Burkitt espontâneo e induzido por EBV e vários mielomas de células B. A inibição da função de BR43x2 seria útil no tratamento de linfornas de células B ou mielomas múltiplos. Os antagonistas de BR43x2, como receptores BR43x2 solúveis ou anticorpos, podem ser utilizados terapeuticamente para mediar a progressão de tumores. A actividade de agonistas e antagonistas pode ser determinada por ensaios de actividade que determinam a potência da ligação receptor/ligando. Foram feitas linhas de células B transfectadas estavelmente, como Baf3 (uma linha de células pré-B murina, Palacios e Steinmetz, ibid. e Mathey-Prevot et al., ibid.), que co-expressam níveis elevados de construções de genes repórteres para NfKB, NFAT-1 e AP-1, que expressam BR43x2. Foram também preparadas linhas celulares que expressam TACI e BCMA de maneira similar e em linhas de células Jurkat e outras linhas celulares de linfoma B. Verificou-se que ztnf4 assinala através dos genes repórteres nestas construções. 0 BR43x2 solúvel e anticorpos podem ser utilizados para medir a ligação.

Uma abordagem in vivo para o ensaio de proteínas envolve sistemas de entrega virais. Os exemplos de vírus para este fim 49 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ incluem adenovírus, herpesvírus, vírus vaccinia e vírus adeno-associados (AAV) . 0 adenovírus, um vírus de ADN de cadeia dupla, é correntemente o vector de transferência de genes mais bem estudado para a entrega de ácido nucleico heterólogo (para uma revisão, veja-se Becker et ai., Meth. Cell Biol. 43:161-89, 1994; e Douglas e Curiel, Science & Medicine 4:44-53, 1997). 0 sistema de adenovírus oferece várias vantagens: o adenovírus pode (i) acomodar inserções de ADN relativamente grandes; (i i) ser crescido até títulos elevados; (iii) infectar uma ampla gama de tipos de células de mamífero; e (iv) ser utilizado com um grande número de vectores disponíveis contendo diferentes promotores. Igualmente, porque os adenovírus são estáveis na corrente sanguínea, podem ser administrados por injecção intravenosa.

Eliminando porções do genoma do adenovírus, podem ser acomodadas inserções maiores (até 7 kb) de ADN heterólogo. Estas inserções podem ser incorporadas no ADN virai por ligação directa ou por recombinação homóloga com um plasmídeo co-transfectado. Num sistema exemplificativo, o gene EI essencial foi eliminado do vector virai, e o vírus não irá replicar a menos que o gene EI seja proporcionado pela célula hospedeira (a linha de células 293 humana é exemplificativa). Quando administrado intravenosamente a animais intactos, o adenovírus tem como principal alvo o fígado. Se o sistema de entrega adenoviral tem uma deleção do gene El, o vírus não pode replicar nas células hospedeiras. Contudo, o tecido do hospedeiro (e.g., fígado) irá expressar e processar (e, se estiver presente uma sequência de sinal, segregar) a proteína heteróloga. As proteínas segregadas entrarão na circulação no fígado altamente vascularizado, e podem ser determinados os efeitos no animal infectado. 0 sistema de adenovírus também pode ser utilizado para a produção de proteínas in vitro. Fazendo a cultura de células não 293 infectadas com adenovírus, sob condições em que as células não estão em divisão rápida, as células podem produzir proteínas durante períodos de tempo alargados. Por exemplo, as células BHK são crescidas até à confluência em fábricas de células, em seguida são expostas ao vector adenoviral que codifica para a proteína segregada de interesse. As células são então crescidas sob condições isentas de soro, o que 50 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ permite que as células infectadas sobrevivam durante várias semanas, sem divisão celular significativa. Alternativamente, as células 293S infectadas com os vectores de adenovirus podem ser crescidas em culturas em suspensão, a uma densidade de células relativamente elevada, para produzir quantidades significativas de proteína (veja-se Garnier et al., Cytotechnol. 15:145-55, 1994). Com qualquer dos protocolos, pode-se isolar repetidamente uma proteína heteróloga segregada, expressa, a partir do sobrenadante da cultura de células. No protocolo de produção de células 293S infectadas, também se podem obter eficazmente proteínas não segregadas.

Estão disponíveis modelos animais bem estabelecidos, para testar a eficácia in vivo de polipéptidos BR43x2, TACI ou BCMA solúveis, nalguns estados de doença. Em particular, os polipéptidos BR43x2, TACI ou BCMA solúveis e os fragmentos polipeptídicos podem ser testados in vivo em vários modelos animais de doença auto-imune, tais como estirpes de ratinhos congénicos MRL-lpr/lpr ou NZB x NZW F1 que servem como modelo de LES (lúpus eritematoso sistémico). Estes modelos animais são conhecidos na arte, veja-se por exemplo Autoimmune Disease Models A Guidebook, Cohen and Miller eds. Academic Press. A descendência de um cruzamento entre ratinhos New Zealand Black (NZB) e New Zealand White (NZW) desenvolve uma forma espontânea de LES que se assemelha proximamente à LES nos seres humanos. A descendência de ratinhos, conhecidos como NZBW, começa a desenvolver auto-anticorpos igM contra células T com 1 mês de idade, e aos 5-7 meses de idade, auto-anticorpos Ig anti-ADN são a imunoglobulina dominante. A hiperactividade de células B policlonais conduz a sobreprodução de auto-anticorpos. A deposição destes auto-anticorpos, particularmente aqueles dirigidos contra ADN de cadeia simples, está associada ao desenvolvimento de glomerulonefrite, que se manifesta clinicamente como proteinúria, azotemia, e morte por falha renal. A falha renal é a principal causa de morte em ratinhos afectados com LES espontânea, e na estirpe NZBW, este processo é crónico e obliterativo. A doença é mais rápida e grave em fêmeas do que em machos, com uma sobrevivência média de apenas 245 dias em comparação com 406 dias para os machos. Embora muitos dos ratinhos-fêmea venham a ser sintomáticos (proteinúria) aos 7-9 meses de idade, alguns podem ser muito mais novos ou mais 51 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ velhos quando desenvolvem os sintomas. A nefrite imunitária fatal observada nos ratinhos NZBW é muito similar à glomerulonefrite observada em LES humana, tornando este modelo murino espontâneo muito atractivo para testar potenciais terapêuticos para LES (Putterman e Naparstek, Murine Models of Spontaneous Systemic Lupus Erythematosus, Autoimmune Disease Models: A Guidebook, chapter 14, pp.217-34, 1994; Mohan et al.r J. Immunol. 154:1470-80, 1995; e Daikh et al., J.

Immunol. 159:3104-08, 1997). A administração de TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig solúveis ou outras proteínas solúveis e de fusão a estes ratinhos para avaliar a eficácia de TACI, BR43x2 ou BCMA para melhorar os sintomas e as alterações ao curso da doença, está descrita adiante na secção de Exemplos.

Os modelos de ratinho para encefalomielite alérgica experimental (EAE) têm sido utilizados como ferramenta para investigar tanto os mecanismos da doença imuno-mediada, como métodos de potencial intervenção terapêutica. O modelo assemelha-se a esclerose múltipla humana, e produz desmielinização em resultado de activação de células T para neuroproteinas tais como a proteina básica da mielina (MBP), ou a proteina proteolipídica (PLP). A inoculação com antigénio conduz a indução de células T restritas do MHC de classe II, CD4+, (Thl). Alterações no protocolo para a EAE podem produzir variantes agudas, crónicas-recidivantes ou de transferência passiva, do modelo (Weinberg et al., J. Immunol. 162:1818-26, 1999; Mijaba et al.r Cell. Immunol. 186:94-102, 1999; e

Glabinski, Meth. Enzym. 288:182-90, 1997). A administração de TACI-IG, BR43x2-Ig, BCMA-Ig solúveis ou outras proteínas solúveis e de fusão a estes ratinhos para avaliar a eficácia de TACI, BR43x2 ou BCMA para melhorar os sintomas e alterações do curso da doença, está descrita adiante na secção de Exemplos.

No modelo de artrite induzida por colagénio (AIC), os ratinhos desenvolvem artrite inflamatória crónica que se assemelha proximamente a artrite reumatóide humana (AR) . Como a AIC partilha características imunológicas e patológicas similares com a AR, isto torna-o um modelo ideal para o rastreio de potenciais compostos anti-inflamatórios humanos. Outra vantagem da utilização do modelo de AIC é que os mecanismos de patogénese são conhecidos. Os epítopos de 52 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ células Τ e Β no colagénio de tipo II foram identificados, e vários parâmetros imunológicos (hipersensibilidade de tipo retardada e anticorpo anti-colagénio) e inflamatórios (citoquinas, quimioquinas e enzimas degradadoras da matriz) que relacionam com a artrite imuno-mediada foram determinados, e podem ser utilizados para avaliar a eficácia de compostos de teste nos modelos (Wooley, Curr. Opin. Rheum. 3:407-20, 1999; Williams et al., Immunol. 89 : 9784-788, 1992; Myers et al., Life Sei., 61:1861-78, 1997; e Wang et al., Immunol. 92:8955-959, 1995). A administração de TACI-Ig, BR43x2-Ig, BCMA-Ig ou outras proteínas solúveis e de fusão, a ratinhos para avaliar a eficácia de TACI, BR43x2 ou BCMA para melhorar os sintomas e alterações do curso de doença, está descrita adiante na secção de Exemplos.

Modelos para infecção brônquica, tal como asma, podem ser criados quando ratinhos são injectados com ovalbumina e re-estimulados nasalmente com antigénio que produz uma resposta asmática nos brônquios similar à asma. A administração de TACI-Ig, BR43x2-Ig, BCMA-Ig ou outras proteínas solúveis e de fusão, a ratinhos para avaliar a eficácia de TACI, BR43x2 ou BCMA para melhorar os sintomas e alterações do curso de doença, está descrita adiante na secção de Exemplos.

Outra utilização para modelos in vivo inclui a entrega de uma provocação com antigénio ao animal seguida de administração de BR43x2 (TACI) solúvel ou do seu ligando ztnf4 e medição da resposta de células T e B. A resposta imunitária dependente de células T e independente de células T pode ser medida como descrito em Perez-Melgosa et al., J. Immunol. 163:1123-7, 1999. A resposta imunitária em animais sujeitos a um desafio regular com antigénio (por exemplo, ovalbumina ou colagénio) seguido da administração de polipéptidos BR43x2, TACI ou BCMA, ou fusões-Ig solúveis, pode ser realizada para medir o efeito na resposta de células B.

Podem-se utilizar estudos farmacocinéticos em associação com polipéptidos BR43x2, TACI ou BCMA solúveis, radiomarcados, para determinar a distribuição e semivida destes polipéptidos 53 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ in vivo. Adicionalmente, podem-se utilizar modelos animais, para determinar os efeitos de BR43x2, TACI ou BCMA solúvel em tumores e no desenvolvimento de tumores in vivo.

Polipéptidos BR43x2, TACI ou BCMA como marcadores substitutos, para doenças auto-imunes, doenças de rins, doenças de células B e T. Estes pacientes podem ser sangrados e podem-se detectar receptores BR43x2, TACI ou BCMA solúvel e seus ligandos, no sangue.

Os anticorpos contra BR43x2 ou péptidos com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:8 podem ser obtidos, por exemplo, utilizando como antigénio, o produto de um vector de expressão contendo o polipéptido de interesse, ou um polipéptido isolado a partir de uma fonte natural. Anticorpos particularmente úteis "ligam-se especificamente" com BR43x2 ou péptidos com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10. Considera-se que os anticorpos se ligam especificamente, quando os anticorpos se ligam a um polipéptido BR43x2 ou a um polipéptido de SEQ ID NO:8, péptido ou epítopo com uma afinidade de ligação (Ka) de 106M_1 ou superior, de preferência 107M-1 ou superior, mais preferencialmente 108M_1 ou superior e mais preferencialmente 109M-1 ou superior. A afinidade de ligação de um anticorpo pode ser facilmente determinada por um perito na arte, por exemplo, por análise de Scatchard (Scatchard, Ann. NY Acad. Sei. 5_1:660, 1949). Anticorpos adequados incluem anticorpos que se ligam a BR43x2, em particular o domínio extracelular de BR43x2 (resíduos de aminoácidos 1-120 de SEQ ID NO: 2) e os que se ligam com polipéptidos com uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:10.

Podem-se produzir anticorpos anti-BR43x2, utilizando péptidos e polipéptidos com epítopos de BR43x2 antigénicos. Os péptidos e polipéptidos com epítopo antigénicos contêm uma sequência de pelo menos nove, de preferência entre 15 a cerca de 30 aminoácidos contidos na SEQ ID NO: 2. No entanto, os péptidos ou polipéptidos que compreendem uma maior porção de uma sequência de aminoácidos aqui descrita, contendo de 30 a 50 aminoácidos ou qualquer comprimento até e incluindo toda a sequência de aminoácidos de um polipéptido aqui descrito, também são úteis para induzir anticorpos que se ligam a BR43x2. É desejável que a sequência de aminoácidos do péptido 54 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ que possui ο epítopo seja seleccionada para proporcionar um solubilidade substancial em solventes aquosas (i.e., a sequência inclui resíduos relativamente hidrófilos, sendo preferencialmente evitados os resíduos hidrófobos). Os peritos na arte podem prever péptidos hidrófilos, a partir de um gráfico de hidrofobicidade, veja-se, por exemplo, Hopp e Woods (Proc. Natl Acad. Sei. USA 78:3824-8, 1981) e Kyte e Doolittle (J. Mol. Biol. 157:105-142, 1982). Além disso, as sequências de aminoácidos contendo resíduos de prolina, podem também ser desejáveis para a produção de anticorpos.

Os anticorpos policlonais contra a proteína recombinante BR43x2 ou BR43x2 isolada de fontes naturais, podem ser preparados utilizando métodos bem conhecidos dos peritos na arte. Veja-se por exemplo, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera", em Immunochemical Protocols (Manson, ed.), páginas 1-5 (Humana Press 1992) e Williams et al., "Expression of foreign proteins in E. coli, using plasmid vectors and purification of specific polyclonal antibodies" em DNA Cloning 2: Expression Systems, 2 a edição, Glover et al. (eds.), página 15 (Oxford University Press 1995). A imunogenicidade de um polipéptido BR43x2 pode ser aumentada através da utilização de um adjuvante, tal como alúmen (hidróxido de alumínio) ou adjuvante completo ou incompleto de Freund. Os polipéptidos úteis para a imunização também incluem polipéptidos de fusão, tais como fusões de BR43x2 ou uma sua porção, com um polipéptido de imunoglobulina ou com proteína de ligação a maltose. O polipéptido imunogénico pode ser uma molécula de comprimento total ou uma sua porção. Quando a porção de polipéptido é do "tipo hapteno", esta porção pode ser unida ou ligada, com vantagem, a um transportador macromolecular (tal como hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH), albumina de soro bovino (BSA) ou toxóide do tétano) para imunização.

Embora os anticorpos policlonais sejam tipicamente produzidos em animais como cavalos, vacas, cães, galinhas, ratos, ratinhos, coelhos, hamsters, porquinhos-da-índia, cabras ou ovelhas, um anticorpo anti-BR43x2 também pode ser derivado de um anticorpo de primata sub-humano. As técnicas gerais para produzir anticorpos úteis para diagnóstico e terapêutica, em babuínos, podem ser encontradas, por exemplo, 55 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ em Goldenberg et al., patente internacional No. de publicação WO 91/11465 e em Losman et al., Int. J. Câncer 46:310, 1990.

Os anticorpos também podem ser produzidos em animais transgénicos, tais como ovelhas, vacas, cabras ou porcos transgénicos e podem ser expressos em leveduras e fungos, em formas modificadas, bem como em células de mamífero e de insecto.

Alternativamente, podem-se produzir anticorpos anti-BR43x2. Os anticorpos monoclonais de roedores contra antigénios específicos, podem ser obtidos por métodos conhecidos dos peritos na arte (veja-se, por exemplo, Kohler et al., Nature 256:495, 1975, Coligan et al. (eds.), Current

Protocols in Immunology, Vol. 1, páginas 2.5.1-2.6.7 (John Wiley & Sons 1991), Picksley et al., "Production of monoclonal antibodies against proteins expressed in E. coli em DNA cloning 2:Expression systems, 2a edição, Glover et al. (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)) .

Em resumo, podem-se obter anticorpos monoclonais, injectando ratinhos com uma composição que compreende um produto de gene BR43x2, verificando a presença da produção de anticorpos por remoção de uma amostra de soro, removendo o baço, para obter linfócitos-B, fundindo os linfócitos-B com células de mieloma, para produzir hibridomas, clonando os hibridomas, seleccionando clones positivos que produzem anticorpos contra o antigénio, fazendo a cultura dos clones que produzem anticorpos contra o antigénio e isolando os anticorpos a partir de culturas de hibridoma.

Além disso, um anticorpo anti-BR43x2 pode ser derivado de um anticorpo monoclonal humano. Os anticorpos monoclonais humanos são obtidos a partir de ratinhos transgénicos que foram manipulados para produzir anticorpos humanos específicos, em resposta ao desafio antigénico. Nesta técnica, introduzem-se elementos dos locus de cadeia pesada e leve, humanas, em estirpes de ratinhos derivadas de linhas de hemocitoblastos embrionários, que contêm rupturas alvo dos loci de cadeia pesada e cadeia leve, endógenas. Os ratinhos transgénicos podem sintetizar anticorpos humanos específicos para antigénios humanos e os ratinhos podem ser utilizados para produzir hibridomas que segregam anticorpos humanos. Os 56 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ métodos para obter anticorpos humanos a partir de ratinhos transgénicos estão descritos, por exemplo, em Green et ai., Nat. Genet. 7:13, 1994, Lonberg et al., Nature 368 :856, 1994 e Taylor et al., Int. Immun. 6 :5 7 9, 1994.

Os anticorpos monoclonais podem ser isolados e purificados a partir de culturas de hibridomas, por uma variedade de técnicas bem conhecidas. Estas técnicas de isolamento incluem cromatografia de afinidade com proteína-A Sepharose, cromatografia de exclusão de tamanhos e cromatografia de troca iónica (veja-se por exemplo, Coligan, nas páginas 2.7.1-2.7.12 e páginas 2.9.1-2.9.3; Baines et al., "Purification of Immunoglobulin G (IgG)" em Methods in Molecular Biology Vol. 10, páginas 79-104 (The Human Press, Inc. 1992)) .

Para utilizações particulares, pode ser desejável preparar fragmentos de anticorpos anti-BR43x2. Estes fragmentos de anticorpo podem ser obtidos, por exemplo, por hidrólise proteolítica do anticorpo. Podem-se obter fragmentos de anticorpo por digestão com pepsina ou papaína, de anticorpos totais, por métodos convencionais. Como exemplo, podem-se produzir fragmentos de anticorpo por clivagem enzimática de anticorpos com pepsina, para proporcionar um fragmento 5S designado por F(ab')2. Este fragmento pode ser ainda clivado, utilizando um agente redutor de tiol, para produzir fragmentos Fab' monovalentes 3,5S. Opcionalmente, a reacção de clivagem pode ser realizada utilizando um grupo bloqueador para os grupos sulfidrilo, que resultam da clivagem de ligações dissulfureto. Como alternativa, uma clivagem enzimática utilizando pepsina, produz dois fragmentos Fab monovalentes e um fragmento Fc directamente. Estes métodos estão descritos, por exemplo, por Goldenberg, patente U.S. 4,331,647, Nisonoff et al., Arch Biochem. Biophys 89:230, 1960, Porter, Biochem J,,73;119, 1959, Edelman et al., em Methods in Enzymology vol. 1, página 442 (Academic Press 1967) e por Coligan, ibid.

Também se podem utilizar outros métodos para clivar anticorpos, tais como a separação de cadeias pesadas, para formar fragmentos de cadeia leve-pesada monovalentes, nova clivagem de fragmentos ou outras técnicas enzimáticas, química 57 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ ou genéticas, desde que os fragmentos se liguem ao antigénio que é reconhecido pelo anticorpo intacto.

Por exemplo, os fragmentos Fv compreendem uma associação entre cadeias VH e VL. Esta associação pode ser não covalente, como descrito por Inbar et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 6_9:2659, 1972. Alternativamente, as cadeias variáveis podem ser ligadas por uma ligação dissulfureto intermolecular ou reticuladas por químicos como o gluteraldeído (veja-se, por exemplo, Sandhu, Crit. Ver. Biotech. 12:437, 1992).

Os fragmentos Fv podem compreender cadeias VH e VL que são ligadas por um ligante peptídico. Estas proteínas de ligação ao antigénio de cadeia simples (scFv), são preparadas construindo um gene estrutural compreendendo sequências de ADN que codificam para os domínios VH e VL, que são ligados por um oligonucleótido. 0 gene estrutural é inserido num vector de expressão, que é subsequentemente introduzido numa célula hospedeira, tal como E. coli. As células hospedeiras recombinantes sintetizam uma única cadeia de polipéptidos com um péptido ligante, fazendo uma ponte entre os dois domínios V. Os métodos para produzir scFv estão descritos, por exemplo, por Whitlow et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97, 1991, veja-se também Bird et al., Science 2 42:423, 1988, Ladner et al., patente U.S. 4.946.778, Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993 e Sandhu, ibid.

Como exemplo, pode-se obter um scFv expondo linfócitos ao polipéptido BR43x2 in vitro e seleccionando bibliotecas de apresentação de anticorpos em fagos ou vectores semelhantes (por exemplo através da utilização de proteína ou péptido BR43x2, imobilizado ou marcado). Os genes que codificam para polipéptidos com domínios potenciais de ligação ao polipéptido BR43x2, podem ser obtidos pesquisando bibliotecas de péptidos ao acaso apresentadas em fago (apresentação em fagos) ou em bactérias, tais como E. coli. As sequências de nucleótidos que codificam para os polipéptidos, podem ser obtidas de várias formas, tal como através de mutagénese ao acaso e síntese de polinucleótidos ao acaso. Estas bibliotecas de apresentação de fagos ao acaso, podem ser utilizadas para pesquisar péptidos que interagem com um alvo conhecido, que pode ser uma proteína ou polipéptido, tal como um ligando ou receptor, uma 58 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ macromolécula biológica ou sintética, ou substâncias orgânicas ou inorgânicas. As técnicas para criar e pesquisar estas bibliotecas de apresentação de péptidos ao acaso, são conhecidas na arte (Ladner et al., Patente U.S. 5.223.409, Ladner et al., Patente U.S. 4.946.778, Ladner et al., patente U.S. 5.403.484, Ladner et al., patente U.S. 5.571.698 e Kay et al., Phage display of Peptides and Proteins (Academic Press, Inc. 1996)) e bibliotecas de apresentação de péptidos ao acaso e estão disponíveis no mercado, kits para pesquisa destas bibliotecas, por exemplo da Clontech (Paio Alto, CA) , Invitrogen Inc. (San Diego, CA), New England Biolabs, Inc. (Beverly, MA) e Pharmacia LKB Biotechnology Inc. (Piscataway, NJ) . As bibliotecas de apresentação de péptidos ao acaso podem ser pesquisadas utilizando as sequências de BR43x2 aqui apresentadas, para identificar proteínas que se ligam a BR43x2.

Outra forma de um fragmento de anticorpo é um péptido que codifica para uma única região determinante de complementaridade (CDR). Os péptidos CDR (“unidades de reconhecimento mínimo") podem ser obtidos construindo genes que codificam para a CDR de um anticorpo de interesse. Estes genes são preparados, por exemplo, utilizando a reacção em cadeia com polimerase, para sintetizar a região variável do ARN de células que produzem anticorpos (veja-se, por exemplo, Larrick et al., Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2gl06, 1991) Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal antibodies" em Monoclonal antibodies; Production, Engineering and Clinicai Applications, Ritter et al. (eds.) página 166 (Cambridge University Press, 1995) e Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" em Monoclonal Antibodies: Principies and Applications, Birch et al., (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).

Alternativamente, um anticorpo anti-BR43x2 pode ser derivado de um anticorpo monoclonal "humanizado". Os anticorpos monoclonais humanizados são produzidos transferindo regiões determinantes de complementaridade de ratinho, de cadeias variáveis leve e pesada da imunoglobulina do ratinho, para um domínio variável humano. Os resíduos típicos de anticorpos humanos são então substituídos nas regiões de sequência dos equivalentes de murídeo. A utilização de 59 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ componentes de anticorpos, derivados de anticorpos monoclonais humanizados, obvia os problemas potenciais associados com a imunogenicidade das regiões constantes de murídeo. As técnicas gerais para clonar domínios variáveis de imunoglobulina de murídeo estão descritas, por exemplo, em Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:3833, 1989. As técnicas para produzir anticorpos monoclonais humanizados estão descritas, por exemplo, por Jones et al., Nature 321: 522, 1986, Cárter et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 89:4285, 1992, Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992, Singer et al., J. Immun. 150 :2844, 1993, Sudhir (ed.), Antibody Engineering Protocols (Humana Press, Inc. 1995), Kelley, "Engineering Therapeutic Antibodies" em Protein Engineering: Principies and Practice, Cleland et al. (eds.), páginas 399-434 (John Wiley & Sons, Inc. 1996) e por Queen et al., patente U.S. 5.693.762 (1997).

Os anticorpos anti-idiotipo, policlonais, podem ser preparados imunizando animais com anticorpos anti-BR43x2 ou fragmentos de anticorpo, utilizando técnicas convencionais. Veja-se, por exemplo, Green et al., "Production of Polyclonal Antisera" em Methods in Molecular Biology: Immunochemical Protocols, Manson (ed.), páginas 1-12 (Humana Press 1992). Veja-se também Coligan, ibid. nas páginas 2.4.1-2.4.7. Alternativamente, podem-se preparar anticorpos anti-idiotipo, monoclonais, utilizando anticorpos anti-BR43x2 ou fragmentos de anticorpo como imunogénios, com as técnicas descritas acima. Como outra alternativa, os anticorpos anti-idiotipo humanizados ou anticorpos anti-idiotipo de primata sub-humano, podem ser preparados utilizando as técnicas acima descritas. Os métodos para produzir anticorpos anti-idiotipo estão descritos, por exemplo, em Irie, patente U.S. 5.208.146, Greene et al., patente U.S. 5.637.677 e Varthakavi e Minocha, J. Gen. Virol. 77:1875, 1996. por

Os anticorpos ou polipéptidos aqui descritos também podem ser conjugados directa ou indirectamente a drogas, toxinas, radionuclidos e semelhantes e estes conjugados utilizados para aplicações de diagnóstico ou terapêuticas in vivo. Por exemplo, os polipéptidos ou anticorpos, podem ser utilizados para identificar ou tratar tecidos ou órgãos que expressam uma molécula anti-complementaridade correspondente (receptor ou antigénio, respectivamente, por exemplo). Mais 60 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ especificamente, os polipéptidos BR43x2 ou anticorpos anti-BR43x2 ou fragmentos bioactivos ou suas porções, podem ser acoplados a moléculas detectáveis ou citotóxicas e fornecidos a um mamífero com células, tecidos ou órgãos que expressam a molécula anti-complementaridade.

As moléculas detectáveis adequadas podem ser directa ou indirectamente ligadas ao polipéptido ou anticorpo e incluem radionuclidos, enzimas, substractos, cofactores, inibidores, marcadores fluorescentes, marcadores de quimioluminescência, partículas magnéticas e semelhantes. As moléculas citotóxicas adequadas podem ser ligadas directa ou indirectamente ao polipéptido ou anticorpo e incluem toxinas bacterianas ou toxinas de plantas (por exemplo, toxina da difteria, endotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina e semelhantes), bem como radionuclidos terapêuticos, tais como iodo-131, rénio-188 ou ítrio-90 (quer ligados directamente ao polipéptido ou anticorpo, quer ligados indirectamente por meio de uma porção quelante, por exemplo). Os polipéptidos ou anticorpos também podem ser conjugados a drogas citotóxicas, tais como adriamicina. Para a ligação indirecta de uma molécula detectável ou citotóxica, a molécula detectável ou citotóxica pode ser conjugada com um membro de um par complementar/anti-complementar, em que o outro membro está ligado ao polipéptido ou porção de anticorpo. Para este fim, a biotina/estreptavidina é um exemplo de um par de complementaridade/anti-complementaridade.

Os polipéptidos BR43x2 solúveis ou anticorpos contra BR43x2, podem ser directa ou indirectamente conjugados a drogas, toxinas, radionuclidos e semelhantes e estes conjugados podem ser utilizados para aplicações de diagnóstico ou terapêuticas in vivo. Por exemplo, os polipéptidos ou anticorpos podem ser utilizados para identificar ou tratar tecidos ou órgãos que expressam uma molécula anti-complementaridade correspondente (receptor ou antigénio, respectivamente, por exemplo). Mais especificamente, os polipéptidos BR43x2 ou anticorpos anti-BR43x2, ou fragmentos bioactivos ou suas porções, podem ser acoplados a moléculas detectáveis ou citotóxicas e fornecidos a um mamífero com células, tecidos ou órgãos que expressam a molécula anti-complementaridade . 61 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

As moléculas detectáveis adequadas podem ser directa ou indirectamente ligadas ao polipéptido ou ao anticorpo, e incluem radionuclidos, enzimas, substratos, cofactores, inibidores, marcadores fluorescentes, marcadores quimioluminescentes, partículas magnéticas e similares. As moléculas citotóxicas adequadas podem ser ligadas directa ou indirectamente ao polipéptido ou ao anticorpo e incluem toxinas de bactérias ou plantas (por exemplo, toxina de difteria, exotoxina de Pseudomonas, ricina, abrina e semelhantes), bem como radionuclidos terapêuticos, tais como iodo-131, rénio-188 ou ítrio-90 (quer ligados directamente ao polipéptido ou ao anticorpo, quer ligados indirectamente, por meio de uma porção quelante, por exemplo). Os polipéptidos ou anticorpos também podem ser conjugados com drogas citotóxicas, tais como a adriamicina. Para ligação indirecta de uma molécula detectável ou citotóxica, a molécula detectável ou citotóxica pode ser conjugada com um membro de um par de complementaridade/anti-complementaridade, em que o outro membro é ligado à porção de polipéptido ou anticorpo. Para estes fins, biotina/estreptavidina constituem um exemplo de um par de complementaridade/anti-complementaridade.

Estas proteínas de fusão polipéptido-toxina ou proteínas de fusão anticorpo/fragmento-toxina, podem ser utilizadas para a inibição ou ablação direccionada de células ou tecidos (por exemplo, para tratar células ou tecidos cancerosos). Alternativamente, quando o polipéptido tem domínios funcionais múltiplos (i.e., um domínio de activação ou um domínio de ligação ao ligando, mais um domínio para direccionamento), uma proteína de fusão incluindo apenas o domínio de direccionamento, pode ser adequada para direccionar uma molécula detectável, uma molécula citotóxica ou uma molécula complementar, a um tipo de célula ou tecido de interesse. Nos casos em que o domínio da proteína de fusão inclui uma molécula de complementaridade, a molécula anti-complementaridade pode ser conjugada a uma molécula detectável ou citotóxica. Estas proteínas de fusão domínio-molécula de complementaridade, representam assim um veículo de direccionamento genérico para o fornecimento específico de células/tecidos de conjugados anti-complementaridade/molécula detectável/citotóxica, genéricos. Os conjugados de polipéptido 62 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ bioactivo ou anticorpo aqui descritos, podem ser fornecidos intravenosa, intra-arterial ou intraductalmente, ou podem ser introduzidos localmente no local de acção pretendido.

Podem-se produzir anticorpos contra polipéptidos BR43x2 solúveis, que são sinalizados com His ou FLAG™. Os anticorpos também podem ser preparados para proteínas de fusão MBP produzidas em E. coli. Alternativamente, estes polipéptidos poderão incluir uma proteína de fusão com Ig humana. Em particular, os anti-soros contendo anticorpos de polipéptidos contra BR43x2 solúvel, sinalizado com His ou sinalizado com FLAG™, podem ser utilizados na análise da distribuição de BR43x2 nos tecidos, por imuno-histoquímica em tecido humano ou de primata. Estes polipéptidos BR43x2 solúveis, podem também ser utilizados para imunizar ratinhos, de modo a produzir anticorpos monoclonais contra um polipéptido BR43x2 humano, solúvel. Os anticorpos monoclonais contra um polipéptido BR43x2 humano solúvel, também podem ser utilizados para mimetizar o acoplamento ligando/receptor, resultando na activação ou inactivação do par ligando/receptor. Por exemplo, demonstrou-se que os anticorpos monoclonais anti-CD40 solúvel reticulados, proporcionam um sinal estimulador para células B, que foram activadas de forma sub-óptima com anti-IgM ou LPS e resultam na proliferação e produção de imunoglobulinas. Estes mesmos anticorpos monoclonais actuam como antagonistas, quando utilizados em solução, bloqueando a activação do receptor. Os anticorpos monoclonais contra BR43x2 podem ser utilizados para determinar a distribuição, regulação e interacção biológica do par BR43x2/ligando de BR43x2, em linhagens de células específicas, identificadas por estudos de distribuição tecidular. 0 fascículo descreve sondas ou iniciadores polinucleotídicos de BR43x2, TACI e BCMA isolados e purificados. Estas sondas polinucleotídicas podem ser ARN ou ADN. 0 ADN pode ser ADNc ou ADN genómico. As sondas polinucleotídicas são ADN ou ARN de cadeia simples ou dupla, geralmente oligonucleótidos sintéticos, mas podem ser geradas a partir de ADNc clonado ou sequências genómicas e irá geralmente compreender pelo menos 16 nucleótidos, mais frequentemente de 17 nucleótidos a 25 ou mais nucleótidos, por vezes 40 a 60 nucleótidos, e em alguns casos uma porção 63 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ substancial, um domínio ou mesmo a totalidade do gene ou do ADNc de BR43x2. As sondas e iniciadores são geralmente oligonucleótidos sintéticos, mas podem ser gerados a partir de ADNc clonado ou sequências genómicas ou seus complementos. As sondas analíticas terão geralmente pelo menos 20 nucleótidos de comprimento, embora possam ser utilizadas sondas um pouco mais curtas (14-17 nucleótidos). Os iniciadores de PCR têm pelo menos 5 nucleótidos de comprimento, preferivelmente 15 ou mais nt, mais preferivelmente 20-30 nt. Podem ser utilizados polinucleótidos curtos quando o alvo para análise é uma pequena região do gene. Para grandes análises de genes, uma sonda polinucleotídica pode compreender a totalidade de um exão ou mais. As sondas podem ser sinalizadas para proporcionar um sinal detectável, tal como com uma enzima, biotina, um radionuclido, um fluoróforo, quimioluminescente, partícula paramagnética e semelhantes, que estão comercialmente disponíveis de muitas fontes, tais como Molecular Probes, Inc., Eugene, OR, e Amersham Corp., Arlington Heights, IL, utilizando técnicas que são bem conhecidas na arte. As regiões preferidas para construir sondas incluem a região de ligação ao ligando, pseudo-repetições ricas em cisteína, sequências de sinal, e semelhantes. As técnicas para o desenvolvimento de sondas polinucleotídicas e técnicas de hibridação são conhecidas na arte, veja-se por exemplo, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1991.

Os polipéptidos BR43x2, TACI e BCMA e anticorpos podem ser utilizados no âmbito de sistemas de diagnóstico para detectar a presença de polipéptidos BR43x2, TACI e BCMA e ligandos de BR43x2, TACI e BCMA, tais como ztnf4. A informação derivada destes métodos de detecção proporcionará entendimento do significado dos polipéptidos BR43x2 em várias doenças, e servirá como ferramenta de diagnóstico para doenças nas quais níveis alterados de BR43x2 são significativos. Os níveis alterados de polipéptidos receptores BR43x2, TACI e BCMA podem ser indicativos de condições patológicas incluindo o cancro, desordens auto-imunes e doenças infecciosas.

Num ensaio básico, uma molécula de sonda de cadeia simples é incubada com ARN, isolado de uma amostra biológica, 64 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ sob condições de temperatura e força iónica que promovem o emparelhamento de bases entre a sonda e a espécie de ARN de BR43x2, TACI ou BCMA alvo. Após a separação da sonda não ligada das moléculas hibridadas, é detectada a quantidade de híbridos.

Os métodos de hibridação bem estabelecidos de detecção de ARN incluem análise de Northern e hibridação dot/Slot (veja-se, por exemplo, Ausubel ibid. e Wu et al. (eds.), "Analysis of Gene Expression at the RNA Levei", em Methods in Gene Biotechnology, páginas 225-239 (CRC Press, Inc. 1997)). As sondas de ácido nucleico podem ser marcadas detectavelmente com radioisótopos tais como 32P ou 35S. Alternativamente, o ARN de BR43x2 pode ser detectado com um método de hibridação não radioactivo (veja-se, por exemplo, Isaac (ed.), Protocols for Nucleic Acid Analysis by Nonradioactive Probes, Humana Press, Inc., 1993). Tipicamente, a detecção não radioactiva é conseguida por conversão enzimática de substratos cromogénicos ou quimioluminescentes. Porções não radioactivas ilustrativas incluem biotina, fluoresceína e digoxigenina.

As sondas oligonucleotídicas de BR43x2, TACI, e BCMA são também úteis para o diagnóstico in vivo . Como ilustração, oligonucleótidos marcados com 18F podem ser administrados a um indivíduo e visualizados por tomografia de emissão de positrões (Tavitian et al., Nature Medicine 4:467, 1998) .

Numerosos procedimentos de diagnósticos tomam vantagem da reacção em cadeia pela polimerase (PCR) para aumentar a sensibilidade dos métodos de detecção. Técnicas padrão para a realização das PCR são bem conhecidas (veja-se, genericamente, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics (Humana Press, Inc. 1991), White (ed.), PCR Protocols: Current Methods and Applications (Humana Press, Inc. 1993), Cotter (ed.), Molecular Diagnosis of Câncer (Humana Press, Inc. 1996), Hanausek and Walaszek (eds.), Tumor Marker Protocols (Humana Press, Inc. 1998), Lo (ed.), Clinicai Applications of PCR (Humana Press, Inc. 1998), e Meltzer (ed.), PCR in Bioanalysis (Humana Press, Inc. 1998)). Os iniciadores de PCR podem ser desenhados para amplificar uma sequência que 65 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ codifica um domínio ou motivo particular de BR43x2, tal como a pseudo-repetição rica em cisteína BR43x2, TACI ou BCMA.

Uma variação de PCR para ensaios de diagnóstico é a transcritase inversa-PCR (RT-PCR). Na técnica RT-PCR, ARN é isolado de uma amostra biológica, transcrito de modo inverso em ADNc, e o ADNc é incubado com iniciadores de BR43x2 (veja-se, por exemplo, Wu et al. (eds.), "Rapid Isolation of Specific cDNAs or Genes by PCR", em Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., pages 15-28, 1997). A PCR é então realizada e os produtos são analisados utilizando técnicas padrão.

Como ilustração, ARN é isolado a partir da amostra biológica utilizando, por exemplo, o procedimento de lise celular com tiocianato de guanidínio descrito acima. Alternativamente, pode ser utilizada uma técnica em fase sólida para isolar ARNm de um lisado celular. Uma reacção de transcrição inversa pode ser iniciada com o ARN isolado utilizando oligonucleótidos aleatórios, homopolímeros curtos de dT, ou oligómeros anti-sentido de BR43x2, TACI ou BCMA. Os iniciadores oligo-dT oferecem a vantagem de serem amplificadas várias sequências de nucleótidos de ARNm que podem proporcionar as sequências alvo de controlo. As sequências de BR43x2, TACI ou BCMA são amplificadas pela reacção em cadeia pela polimerase utilizando dois iniciadores oligonucleotídicos flanqueadores que têm tipicamente pelo menos 5 bases de comprimento.

Os produtos de amplificação por PCR podem ser detectados utilizando uma variedade de abordagens. Por exemplo, os produtos de PCR podem ser fraccionados por electroforese em gel, e visualizados por coloração com brometo de etídio. Alternativamente, os produtos de PCR fraccionados podem ser transferidos para uma membrana, hibridados com uma sonda de BR43x2 marcada de forma detectável, e examinados por autorradiografia. Abordagens alternativas adicionais incluem a utilização de ácido desoxirribonucleico-trifosfatos marcados com digoxigenina para proporcionar detecção de quimioluminescência, e o ensaio colorimétrico C-TRAK. 66 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

Outra abordagem é a PCR quantitativa em tempo real (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Ct.) . Uma sonda fluorogénica, consistindo num oligonucleótido com um corante repórter e um extintor ligados, híbrida especificamente entre os iniciadores directo e inverso. Utilizando a actividade de 5' endonuclease da ADN-polimerase Taq, o corante repórter é separado do corante extintor e é gerado um sinal específico da sequência e aumenta à medida que a amplificação aumenta. A intensidade de fluorescência pode ser continuamente monitorada e quantificada durante a reacção PCR.

Outra abordagem para a detecção de expressão de BR43x2, TACI ou BCMA é a tecnologia da sonda de ciclagem (CPT), em que um alvo de ADN de cadeia simples se liga a um excesso de sonda quimérica ADN-ARN-ADN para formar um complexo, a porção de ARN é clivada com ARNase H, e a presença de sonda quimérica clivada é detectada (veja-se, por exemplo, Beggs et al., J. Clin. Microbiol. 34:2985, 1996 e Bekkaoui et al.,

Biotechniques 20:240, 1996). Métodos alternativos para a detecção de sequências de BR43x2, TACI ou BCMA podem utilizar abordagens tais como ampliação à base de sequências de ácido nucleico (NASBA), amplificação cooperativa de moldes por hibridação cruzada (CATCH), e a reacção em cadeia pela ligase (LCR) (veja-se, por exemplo, Marshall et al., Patente U.S. 5,686,272 (1997), Dyer et al., J. Virol. Methods 60:161, 1996; Ehricht et al., Eur. J. Biochem. 243:358, 1997 e Chadwick et al., J. Virol. Methods 70:59, 1998) . Outros métodos padrão são conhecidos dos peritos na arte.

Sondas e iniciadores de BR43x2, TACI e BCMA podem também ser utilizados para detectar e localizar a expressão de genes de BR43x2, TACI ou BCMA em amostras de tecidos. Os métodos para esta hibridação in situ são bem conhecidos dos peritos na arte (veja-se, por exemplo, Choo (ed.), In Situ Hybridization Protocols, Humana Press, Inc., 1994; Wu et al. (eds.), "Analysis of Cellular DNA or Abundance of mRNA by Radioactive In Situ Hybridization (RISH)," em Methods in Gene

Biotechnology, CRC Press, Inc., páginas 259-278, 1997 e Wu et al. (eds.), "Localization of DNA or Abundance of mRNA by Fluorescence In Situ Hybridization (RISH)," em Methods in Gene Biotechnology, CRC Press, Inc., páginas 279-289, 1997). 67 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ Várias abordagens de diagnóstico adicionais são bem conhecidas dos peritos na arte (veja-se, por exemplo, Mathew (ed.), Protocols in Human Molecular Genetics Humana Press, Inc., 1991; Coleman e Tsongalis, Molecular Diagnostics, Humana Press, Inc., 1996 e Elles, Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press, Inc., 1996).

Em adição, estas sondas polinucleotídicas podem ser utilizadas para hibridar com sequências contrapartidas em cromossomas individuais. A identificação e/ou mapeamento de cromossomas do gene de BR43x2 pode proporcionar uma informação útil acerca da função do gene e associação da doença. Muitas técnicas de mapeamento estão disponíveis para um perito na arte, por exemplo, mapeamento de híbridos de células somáticas e hibridação in situ com fluorescência (FISH). Um método preferido é o mapeamento de híbridos de radiação. 0 mapeamento de híbridos de radiação é uma técnica genética com células somáticas desenvolvida para a construção de mapas contíguos, de alta resolução, de cromossomas de mamíferos (Cox et al., Science 250:245-50, 1990). O conhecimento parcial ou total de uma sequência génica permite o desenho de iniciadores de PCR adequados para utilização com painéis de mapeamento de híbridos de radiação cromossómicos. Estão disponíveis comercialmente painéis de mapeamento de híbridos de radiação que cobrem a totalidade do genoma humano, tais como o painel Stanford G3 RH Panei e o painel GeneBridge 4 RH Panei (Research Genetics, Inc., Huntsville, AL). Estes painéis permitem localizações cromossómicas rápidas, à base de PCR, e a ordenação de genes, locais marcados com sequências (STS), e outros marcadores não polimórficos e polimórficos no interior de uma região de interesse. Isto inclui o estabelecimento de distâncias físicas proporcionais directamente entre genes de interesse identificados pela primeira vez e marcadores previamente mapeados. O conhecimento preciso da posição de um gene pode ser útil de várias maneiras incluindo: 1) determinar se uma sequência faz parte de um contig existente e obter sequências genéticas circundantes adicionas em várias formas tais como clones YAC-, BAC- ou de ADNc, 2) proporcionar um possível gene candidato para uma doença hereditária que apresenta ligação à mesma região cromossómica, e 3) para organismos modelos de referência cruzada como ratinho que 68 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ podem ser benéficos para auxiliar a determinação de que função pode ter um gene particular. A localização cromossómica pode também ser realizada utilizando STS. Uma STS é uma sequência de ADN que é única no genoma humano e pode ser utilizada como ponto de referência para um cromossoma ou uma região de um cromossoma

particulares. Uma STS pode ser definida por um par de iniciadores oligonucleotidicos que podem ser utilizados numa reacção em cadeia pela polimerase para detectar especificamente este local na presença de todas as outras sequências genómicas. Como as STS são baseadas somente na sequência de ADN podem ser completamente descritas numa base de dados, por exemplo, a Database of Sequence Tagged Sites (dbSTS), GenBank, (National Center for Biological Information, National Institutes of Health, Bethesda, MD http://www.ncbi.nlm.nih.gov), podem ser pesquisadas com uma sequência génica de interesse para mapeamento de dados contidos nestas sequências genómicas curtas STS notáveis. 0 gene de BR43x2, uma sonda compreendendo ADN ou ARN de BR43x2, ou uma sua subsequência, podem ser utilizados para determinar se o gene de BR43x2 está presente num cromossoma particular ou se ocorreu uma mutação. Aberrações cromossómicas detectáveis no locus do gene de BR43x2 incluem, mas não se lhes limitam, aneuplóidia, alterações no número de cópias do gene, inserções, deleções, alterações de locais de restrição e rearranjos. Estas aberrações podem ocorrer no interior da sequência de codificação, no interior de intrões, ou no interior de sequências de flanqueamento, incluindo regiões promotoras a montante e regiões reguladoras, e podem manifestar-se como alterações físicas no interior de uma sequência de codificação ou alterações no nível de expressão do gene.

Em geral, estes métodos de diagnóstico compreendem os passos de (a) obtenção de uma amostra genética de um paciente; (b) incubação da amostra genética com uma sonda ou um iniciador polinucleotídicos como divulgado acima, sob condições em que o polinucleótido irá hibridar com a sequência polinucleotídica complementar, para produzir um primeiro produto de reacção; e (iii) comparação do primeiro produto de 69 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ reacção com um produto de reacção de controlo. Uma diferenças entre o primeiro produto de reacção e o produto de reacção de controlo é indicativa de uma anomalia genética no paciente. As amostras genéticas para utilização na presente invenção incluem ADN genómico, ADNc e ARN. A sonda ou o iniciador polinucleotidicos podem ser ARN ou ADN, e compreenderão uma porção de SEQ ID NO:3, o complemento de SEQ ID N0:1, ou um seu equivalente de ARN. Os métodos de ensaio adequados neste caso incluem técnicas de genética molecular conhecidas do peritos na arte, tais como análise de polimorfismos de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP), análise de repetições em tandem curtas (STR) empregando a técnica de PCR, reacção em de ligação cadeia (Barany, PCR Methods and Applications 1:5-16, 1991), ensaios de protecção com ribonuclease, e outras técnicas de análise de ligação genética conhecidas na arte (Sambrook et ai., ibid.; Ausubel et al., ibid.; Marian, Chest 108:255-65, 1995). Os ensaios de protecção com ribonuclease (veja-se, e.g., Ausubel et al., ibid., ch. 4) compreendem a hibridação de uma sonda de ARN com uma amostra de ARN do paciente, após o que o produto de reacção (híbrido ARN-ARN) é exposto a ARNase. As regiões hibridadas do ARN são protegidas da digestão. Nos ensaios por PCR, a amostra genéticas do paciente é incubada com um par de iniciadores polinucleotidicos, e a região entre os iniciadores é amplificada e recuperada. Alterações de tamanho ou da quantidade de produto recuperado são indicativas de mutações no paciente. Outra técnica à base de PCR que pode ser empregue é a análise de polimorfismos conformacionais na cadeia simples (SSCP) (Hayashi, PCR Methods and Applications 1:34-8, 1991). A metodologia anti-sentido pode ser utilizada para inibir a transcrição de genes de BR43x2, TACI ou BCMA, de modo a inibir o desenvolvimento de células B e a sua interacção com outras células. Os polinucleótidos que são complementares a um segmento de um polinucleótido que codifica BR43x2, TACI ou BCMA (e.g., um polinucleótido como apresentado em SEQ ID NO:3) são desenhados para se ligarem a ARNm que codifica BR43x2, TACI ou BCMA e inibir a tradução deste ARNm. Estes polinucleótidos anti-sentido são utilizados para inibir a expressão de genes que codificam o polipéptido BR43x2, TACI ou BCMA em cultura celular ou num indivíduo. 70 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

Ratinhos manipulados para expressar BR43x2, TACI ou BCMA, referidos como "ratinhos transgénicos", e ratinhos que exibem uma ausência completa de função de BR43x2, TACI ou BCMA, referidos como "ratinhos knockout", podem também ser gerados (Snouwaert et al., Science 257:1083, 1992; Lowell et al., Nature 366:740-42, 1993; Capecchi, Science 244: 1288-92, 1989; Palmiter et al. Annu Rev Genet. 20: 465-99, 1986) . Por exemplo, ratinhos transgénicos que sobre-expressam BR43x2, TACI ou BCMA quer de modo ubíquo quer sob um promotor específico de tecidos ou restrito a tecidos, podem ser utilizados para procurar se a sobre-expressão causa um fenótipo. Por exemplo, a sobre-expressão de um polipéptido BR43x2, TACI ou BCMA de tipo selvagem, um fragmento polipeptídico ou um seu mutante, pode alterar processos celulares normais, resultando num fenótipo que identifica um tecido em que a expressão de BR43x2, TACI ou BCMA é funcionalmente relevante e pode indicar um alvo terapêutico para BR43x2, TACI, BCMA ou seus agonistas ou antagonistas. Por exemplo, um ratinho transgénico preferido para manipular é um que sobre-expressa BR43x2, TACI ou BCMA solúveis. Adicionalmente, esta sobre-expressão pode resultar num fenótipo que apresenta similaridade com doenças humanas. Similarmente, ratinhos knockout para BR43x2, TACI ou BCMA podem ser utilizados para determinar onde o BR43x2 é absolutamente necessário in vivo. O fenótipo de ratinhos knockout é preditivo dos efeitos in vivo que pode ter um antagonista de BR43x2, TACI ou BCMA, tal como os aqui descritos. O ADNc humano de BR43x2, TACI ou BCMA pode ser utilizado para isolar ARNm, ADNc e ADN genómico murino de BR43x2, TACI ou BCMA, que são subsequentemente utilizados para gerar ratinhos knockout. Estes ratinhos podem ser empregues para estudar o gene de BR43x2, TACI ou BCMA e a proteína por ele codificada num sistema in vivo, e podem ser utilizados como modelos in vivo para as doenças humanas correspondentes. Adicionalmente, a expressão transgénica de polipéptidos BR43x2, TACI ou BCMA anti-sentido ou ribozimas dirigidos contra BR43x2, TACI ou BCMA, aqui descrita, pode ser utilizada analogamente para os ratinhos transgénicos acima descritos.

Podem-se formular quantidades farmaceuticamente eficazes de polipéptidos BR43x2, TACI ou BCMA da presente invenção, com transportadores farmaceuticamente aceitáveis, para 71 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ administração parentérica, oral, nasal, rectal, tópica, transdérmica ou semelhante, de acordo com métodos convencionais. As formulações podem incluir ainda um ou mais diluentes, agentes de enchimento, emulsionantes, conservantes, tampões, excipientes e semelhantes e podem ser proporcionadas em formas como líquidos, pós, emulsões, supositórios, lipossomas, pachos transdérmicos e comprimidos, por exemplo. Os sistemas de fornecimento de libertação lenta ou prolongada, incluindo qualquer um de vários biopolímeros (sistemas de base biológica), sistemas que utilizam lipossomas e sistemas de fornecimento poliméricos, podem também ser utilizados com as composições aqui descritas, para proporcionar uma fonte contínua, ou a longo prazo, do polipéptido BR43x2 ou antagonista. Estes sistemas de libertação lenta são aplicáveis a formulações, por exemplo, para utilização oral, tópica e parentérica. 0 termo “transportador farmaceuticamente aceitável" refere-se a um meio transportador que não interfere com a eficácia da actividade biológica dos ingredientes activos e que não é tóxico para o hospedeiro ou paciente. Um perito na arte pode formular os compostos da presente invenção de um modo adequado, de acordo com práticas aceites, tais como as descritas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton PA, 19a ed., 1995.

Tal como aqui utilizado, "quantidade farmaceuticamente eficaz" de um polipéptido BR43x2, TACI ou BCMA, agonistas ou antagonistas, é uma quantidade suficiente para induzir um resultado biológico desejado. 0 resultado pode ser o alívio dos sinais, sintomas ou causas de uma doença, ou qualquer outra alteração desejada de um sistema biológico. Por exemplo, uma quantidade eficaz de um polipéptido BR43x2, TACI ou BCMA é a que proporciona quer um alívio subjectivo dos sintomas ou uma melhoria objectivamente identificável, tal como identificada pelo médico assistente ou outro observador qualificado. Por exemplo, uma quantidade eficaz de um polipéptido BR43x2, TACI ou BCMA ou fusão solúvel, iria proporcionar uma diminuição na resposta de células B durante a resposta imunitária, inibição ou diminuição na produção de auto-anticorpos, inibição da diminuição dos sintomas associados com LES, MG ou RA. As quantidades eficazes de BR43x2, TACI ou BCMA irão diminuir a percentagem de células B 72 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ no sangue periférico. As quantidades eficazes de polipéptidos BR43x2, TACI ou BCMA podem variar amplamente, dependendo da doença ou sintoma a ser tratado. A quantidade de polipéptido a ser administrada e a sua concentração nas formulações, depende do veiculo seleccionado, via de administração, potência do polipéptido particular, condição clinica do paciente, efeitos secundários e estabilidade do composto, na formulação. Assim, o médico assistente utilizará a preparação adequada, contendo a concentração adequada na formulação, bem como a quantidade de formulação administrada, dependendo da experiência clinica com o paciente em questão, ou com pacientes semelhantes. Estas quantidades dependerão, em parte, da condição particular a ser tratada, idade, peso e estado geral de saúde do paciente e outros factores evidentes para os peritos na arte. Tipicamente, uma dose será na gama de 0,1-100 mg/kg de indivíduo. As doses para compostos específicos podem ser determinadas a partir de estudos in vitro ou ex vivo, em combinação com estudos em animais experimentais. As concentrações de compostos que se verificou serem eficazes in vitro ou ex vivo, proporcionam um guia para estudos animais, em que as doses são calculadas para proporcionar concentrações semelhantes no local de acção. A invenção será melhor ilustrada pelos exemplos não limitantes que se seguem. EXEMPLOS Exemplo 1

Identificação de BR43x2

Clonou-se a isoforma TACI de uma biblioteca de série de RPMI, utilizando a abordagem de armadilha da secreção.

Ordenou-se uma biblioteca de RPMI 1788 (linha de células B activadas), utilizando 20 placas de 96 poços. Cada poço continha cerca de 100 colónias de E. coli, contendo cada colónia um clone de ADNc. As minipreparações de ADN foram preparadas no formato de 96 poços, utilizando TomTech

Quadra9600. O ADN isolado foi então reunido em 120 conjuntos, que representam 1600 clones cada. Estes conjuntos foram transfectados em células Cos-7 e plaqueados em placas de 12 poços. Misturaram-se 3 microlitros de ADN do conjunto e 73 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ 5 μΐ de LipofectAMINE, em 92 μΐ de meio DMEM isento de soro (55 mg de piruvato de sódio, 146 mg de L-glutamina, 5 mg de transferrina, 2,5 mg de insulina, 1 μρ de selénio e 5 mg de fetuína, em 500 ml de DMEM), incubou-se à temperatura ambiente durante 30 minutos, seguido da adição de 400 μΐ de meio DMEM isento de soro. A mistura ADN-LipofectAMINA foi adicionada a 220.000 células Cos-7/poço, plaqueadas em placas de cultura de tecidos de 12 poços e incubou-se durante 5 horas, a 37°C. Após a incubação, adicionaram-se 500 μΐ de meio DMEM FBS a 20% (100 ml de FBS, 55 mg de piruvato de sódio e 146 mg de L-glutamina, em 500 ml de DMEM) a cada poço e as células foram incubadas durante a noite. A pesquisa por armadilha da secreção foi realizada utilizando ztnf4 sinalizado com FLAG, biotinilado. As células foram lavadas com PBS e fixadas durante 15 minutos, com formaldeído a 1,8%, em PBS. As células foram então lavadas com TNT (Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,15 M e Tween-20 a 0,05% em H20) . As células foram permeadas com Triton-X a 0,1% em PBS, durante 15 minutos, seguido de uma lavagem em TNT. As células foram bloqueadas durante 1 hora com TNB (Tris-HCl 0,1 M) , NaCl 0,15 M e Reagente Bloqueador a 0,5%) utilizando um kit NEN Renaissance® TSA-directo (NEN, Boston, MA) , de acordo com as instruções do fabricante. As células foram lavadas com TNT e bloqueadas durante 15 minutos com avidina e em seguida biotina (Vector Labs Cat# SP-2001) lavando entretanto com TNT. As células foram incubadas durante 1 hora com 1 μρ/1 de ztnf4/Falg/Biotina em TNB, seguido de uma lavagem com TNT. As células foram então incubadas durante uma hora com uma diluição 1:300 de estreptavidina-HRP (NEN) em TNB e lavadas com TNT. As hibridações foram detectadas com reagente fluoresceina tiramida, diluído 1:50 em tampão de diluição (NEN) e incubadas durante 4,4 minutos e lavadas com TNT. As células foram preservadas com Vectashield Mounting Media (Vector Labs, Burlingame, CA) diluídas 1:5 em TNT.

As células foram visualizadas por microscopia de fluorescência, utilizando um filtro FITC. Doze conjuntos eram positivos para a ligação de ztnf4. O conjunto D8 (representando 1600 clones) foi degradado e isolou-se um único clone (D8-1), positivo para a ligação de ztnf4. A análise de sequenciação revelou que o clone D8-1 continha uma sequência 74 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ de polipéptido que codifica para uma isoforma de TACI, em que a primeira pseudo-unidade de repetição rica em cisterna Phe21-Arg67 de TACI, foi substituída por um único resíduo de aminoácido, triptofano. Esta isoforma foi designada por Br43x2, cuja sequência de polinucleótidos é apresentada na SEQ ID No:1.

Exemplo 2

Localização de BR43xl em linfócitos e monócitos

Utilizou-se PCR com transcriptase inversa para localizar a expressão de BR43xl em células T e B e monócitos. Utilizaram-se iniciadores oligonucleotídicos ZC19980 (SEQ ID NO:15) e ZC19981 (SEQ ID NO:16) para pesquisar ADNc de CD19+, CD3+ e de monócitos, para BR43. A reacção de transcriptase inversa foi realizada a 94°C durante 3 minutos, seguido de 30 ciclos a 94°C, durante 30 segundos, 68°C durante 2 minutos e 72°C durante 1 minuto, seguido de uma extensão de 7 minutos a 72°C. Detectou-se uma banda com o tamanho esperado de 720 pb, em células B apenas e não em células T activadas, como foi referido para TACI utilizando anticorpos (von Biilow e Bram, ibid.).

Exemplo 3

Teste de proliferação de células B, utilizando o ligando de BR43, ztnf4

Descongelou-se rapidamente um frasco contendo lxlO8 células mononucleares de sangue periférico, aferidas, congeladas (PBMC), num banho de água a 37°C, ressuspendeu-se em 25 ml de meio de células B (meio de Iscove modificado da Dulbecco, soro fetal de bovino inactivado pelo calor, a 10%, L-glutamina a 5%, 5% de Pen/Strep) num tubo de 50 ml. As células foram testadas quanto à viabilidade utilizando azul de tripano (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) . Colocou-se uma camada de dez mililitros de Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) sob a suspensão celular e centrifugou-se durante 30 minutos a 1800 rpm e deixou-se parar sem travão. A camada da interface foi então removida e transferida para um tubo de 50 ml novo, ajustado para um volume final de 40 ml, com PBS e centrifugado durante 10 minutos até um volume final de 40 ml, com PBS, e 75 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ centrifugado durante 10 minutos a 1200 rpm, com travão. A viabilidade das células B isoladas foi testada utilizando azul de tripano. As células B foram ressuspensas a uma concentração final de 1 x 106 células/ml em meio de células B e plaqueadas a 180 μΐ/poço, numa placa de fundo em U de 96 poços (Falcon, VWR, Seattle, WA).

Adicionou-se às células um dos seguintes estimuladores, para ajustar o volume final para 200 ml/poço: ztnf-4sCF ou ztnf-4sNF sinalizado com FLAG, solúvel, a diluições de 10 vezes, a partir de 1 mg-1 ng/ml, quer sozinho, com 10 μg/ml de anti-IgM (IgM de cabra anti-humano) diluído em NaíbCCú, pH 9,5 (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) ; ou com 10 μρ/ιηΐ de anti-IgM e 10 ng/ml de IL4 humano recombinante (diluído em PBS e BSA a 0,1%). Adicionalmente, também se testaram outras citóquinas como IL-3 e IL-6, bem como um anticorpo CD40 solúvel (sCD40) (Pharmigen, San Diego, CA). Como controlo, as células incubadas com albumina de soro bovino a 0,1% (BSA) e PBS, 10 μg/ml de anti-IgM ou 10 μg/ml de anti-IgM e 10 ng/ml IL4 (ou outras citóquinas) . As células foram então incubadas a 37°C num incubador humidificado, durante 72 horas. Dezasseis horas antes da recolha, adicionou-se 1 μ(3ί de 3H-timidina a todos os poços. As células foram recolhidas numa placa de filtro de 96 poços (Unifilter GF/C, Packard, Meriden, CT) em que foram recolhidas utilizando um recolhedor de células (Packard) e recolhidas de acordo com as instruções do fabricante. As placas foram secas a 55°C durante 20-30 minutos e o fundo dos poços foi selado com um selante de placas opaco. A cada poço, adicionaram-se 0,25 ml de fluido de cintilação (Microscint-O, Packard) e a placa foi lida utilizando um contador de cintilações TopCount Microplate (Packard).

Para medir a indução da produção de IgG em resposta a vários agentes mitogénicos de células B, após a estimulação de células B purificadas, as células foram preparadas como descrito e incubadas durante 9 dias. O sobrenadante da célula foi recolhido, para determinar a produção de IgG.

Para medir a activação de marcadores de superfície celular em resposta a vários agentes mitogénicos de células B, 76 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ após a estimulação de células B purificadas, as células foram preparadas como descrito acima, mas incubadas apenas 48 horas. Os marcadores de superfície celular foram medidos por análise de FACS. A proliferação de células B purificadas, humanas, estimuladas com os vários agentes mitogénicos de células B, está resumida na tabela 5:

Tabela 5

Estímulo índice proliferativo

Ztnf 4 1,5

Ztnf 4 + IL 4 9,9

Ztnf4 + anti-IgM + IL4 15,8

Observou-se um efeito sinergético do ztnf4 com IL4, IL3 (10 μg/ml) e IL6 (10 μg/ml), na proliferação de células B. Observou-se um aumento de duas vezes na sinalização de células B, quando se utilizou sCD40. A indução da produção de IgG (ng/ml) em resposta a vários agentes mitogénicos de células B após estimulação de células B purificadas, está resumida na tabela 6.

Tabela 6

Estímulo controlo ztnf4

Anti-IgM 3 7,5

Anti-IgM + IL4 13 32

Anti-IgM +IL-4 + IL-5 10 45

Observou-se um aumento nos marcadores de activação de superfície celular, após estimulação de células B purificadas, apenas com ztnf4 ou com anti-IgM ou anti-IgM + IL-4. Não houve nenhum efeito na proliferação de PBMNC na presença de agentes mitogénicos de células T, óptimos ou sub-óptimos. Igualmente, não se observou nenhum efeito na produção de TNFa, em monócitos purificados em resposta à estimulação com LPS. A Figura 3 mostra a co-activação de ztnf4 solúvel, de linfócitos B humanos, para proliferarem e segregar imunoglobulina. A Figura 3A mostra a proliferação de células B de sangue periférico humano, purificado, em resposta à 77 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ estimulação com ztnf4 solúvel (25 ng/ml), na presença de IL-4 sozinho e IL-4 com anti-IgM, anti-CD40 ou anti-CD19, após cinco dias em cultura. A Figura 3B mostra os níveis de IgM e IgG medidos em sobrenadantes obtidos a partir de células B humanas, estimuladas com ztnf4 solúvel, na presença de IL-4 ou IL-4 + IL-5, após nove dias em cultura.

Estes resultados sugerem que o ztnf4 solúvel é uma molécula de activação de células B, que actua em consonância com outros estímulos de células B e fracamente por si próprio. 0 ztnf4 solúvel promove a proliferação de células B e a produção de Ig. A supra-regulação de moléculas de adesão, moléculas co-estimuladoras e receptores de activação, sugere um papel para promover a função de APC de células B. A Figura 4 mostra a estimulação de células B de sangue periférico humano, com ztnf4 solúvel (25 ng/ml), ou uma proteína controlo (ubiquitina), na presença de 10 ng/ml de IL-4, durante 5 dias in vitro. Testaram-se TACI-Ig, BCMA-Ig ou Fc controlo, purificados, quanto à inibição da proliferação específica de ztnf4 solúvel.

Exemplo 4

Selecção de células BHK transformadas com TACI e BCMA, utilizando ligação de ztnf4

As células BHK que expressam um nível elevado de proteína TACI foram seleccionadas por clonagem de diluições de um conjunto de transfectante. As células transfectantes (2 x 105) foram incubadas em gelo durante 30 minutos com ztnf4 biotinilado, a 1 μg/ml em tampão de ligação (PBS, BSA a 2%, NaN3 0,02%). As células foram lavadas 2X com tampão de ligação, em seguida incubadas com AS-PE (Caltag) (diluição 1:1000 em tampão de ligação) em gelo, durante 30 minutos. As células foram então lavadas 2X em tampão de ligação, ressuspensas em tampão de ligação e lidas por FACS (FACS Vantage, Becton Dickinson). Seleccionam-se os clones com a ligação de TNF4 mais elevada.

As células BHK que expressam um nível elevado de proteína BCMA foram seleccionadas por marcação à superfície, do conjunto de transfectantes que expressa BCMA, com ztnf4 biotinilado. Isto foi seguido de estreptavidina-Ficoeritrina 78 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ (SA-PE Caltag Burlingame, CA) e discriminação estéril de células brilhantes, em FL2, no FACS Vantage (Becton Dickinson). As colónias individuais foram então pesquisadas quanto à ligação de ztnf4.

Exemplo 5

Distribuição tecidular

Utilizaram-se sondas em transferências de Northern de tecidos múltiplos humanos (MTN I, MTN II e MTN III, Clontech) para determinar a distribuição tecidular da expressão de BR43x2 e TACI, humanos. Amplificou-se uma sonda derivada de PCR de aproximadamente 500 pb (SEQ ID NO:21), utilizando BR43x2 (SEQ ID NO:l) como modelo e o oligonucleótido ZC20061 (SEQ ID NO:22) e ZC20062 (SEQ ID NO:23) como iniciadores. Esta sequência é idêntica à região homóloga de TACI. A amplificação foi realizada como se segue: 1 ciclo a 94°C durante 1,0 minutos, 30 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos e 72°C durante 30 segundos, seguido de 1 ciclo a 72°C, durante 10 minutos. Os produtos de PCR foram visualizados por electroforese em gel de agarose e o produto de PCR de 500 pb foi purificado utilizando um kit de extracção de Gel (Qiagen, Chatsworth, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A sonda foi marcada radioactivamente utilizando o kit de marcação de ADN MUKTIPRIME (Amersham, Arlington Heights, IL) de acordo com as instruções do fabricante. A sonda foi purificada utilizando uma coluna push NUCTRAP (Stratagene). Utilizou-se a solução EXPRESSHYB (Clontech) para a pré-hibridação e como uma solução de hibridação, para as transferências de Northern. A hibridação ocorreu durante a noite a 65°C, utilizando 106 cpm/ml de sonda marcada. As manchas foram então lavadas em 2X SSC e SDS a 1% à temperatura ambiente, seguido de 2 lavagens em 0,1X SSC e 0,1% de SDS a 50°C. Detectou-se uma molécula transcrita de aproximadamente 1,5 kb, no baço, nódulo linfático e intestino delgado.

Utilizaram-se sondas nas transferências de Northern de tecidos múltiplos humanos (MTN I, MTN II e MTN III; Clontech), para determinar a distribuição tecidular da expressão de BCMA humano. Amplificaram-se aproximadamente 257 pb da sonda derivada por PCR (SEQ ID NO:24), utilizando ADNc de células Daudi como um modelo e o oligonucleót ido ZC21065 (SEQ ID 79 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ ΝΟ:25) e ZC21067 (SEQ ID ΝΟ:26) como iniciadores. A amplificação foi realizada como se segue: 1 ciclo a 94°C durante 1,0 minutos, 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos e 72°C durante 30 segundos, seguido de um ciclo a 72°C, durante 10 minutos. Os produtos de PCR foram visualizados por electroforese em gel de agarose e purificou-se um produto de PCR de 257 pb, utilizando um kit de extracção de Gel (Qiagen, Cahtsworth, CA) , de acordo com as instruções do fabricante. A sonda foi marcada radioactivamente utilizando um kit de marcação de ADN MULTIPRIME (Amersham, Arlington Heights, IL) de acordo com as instruções do fabricante. A sonda foi purificada utilizando uma coluna push NUCTRAP (Stratagene). Utilizou-se a solução EXPRESSHYB (Clontech) para a pré-hibridação e como uma solução de hibridação para as transferências de Northern. A hibridação ocorreu durante a noite a 65°C, utilizando 106 cpm/ml de sonda marcada. As manchas foram então lavadas em 2X SSC e SDS a 0,1% à temperatura ambiente, seguido de 2 lavagens em 0,1 X SSC e SDS a 0,1%, a 50°C. Detectou-se uma molécula transcrita de aproximadamente 1,2 kb no estômago, intestino delgado, nódulo linfático, traqueia, baço e testículos.

As transferências “Dot Blot" principais de ARN (Clontech) que continham ARN de vários tecidos, que foram normalizadas para 8 genes de manutenção, também foram testadas, quer com a sonda TACI (SEQ ID NO:2) quer com a sonda BCMA (SEQ ID NO:24) e hibridados como descrito acima. A expressão de BR43x2/TACI foi observada no baço, nódulo linfático, intestino delgado, estômago, glândula salivar, apêndice, pulmão, medula óssea e baço fetal. A expressão de BCMA foi detectada no intestino delgado, baço, estômago, cólon, nódulo linfático e apêndice.

Analisou-se uma mancha do painel de tumor humano V (Invitrogen Inc., San Diego, CA) e uma mancha de linfoma humano (Invitrogen) como descrito acima, quer com uma sonda BR43x2/TACI (SEQ ID NO:21), quer com uma sonda BCMA (SEQ ID NO:24). Detectou-se uma molécula transcrita de 1,5 kb, correspondente a TACI, num linfoma não-hodgkiano e num tumor da paratiróide. Detectou-se uma molécula transcrita de 1,3 kb, correspondente a BCMA, num adenolinforna, linfoma não-hodgkiano e tumor da paratiróide. 80 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ Ο ARN total de células CD4+, CD8+, CD19+ e de reacção mista de linfócitos (CellPro, Bothell, WA) foi preparado utilizando isotiocianato de guanidinio (Chirgwin et ai., Biochemistry 18:52-94, 1979), seguido de um passo de centrifugação em CsCl. Isolou-se ARN poli(A)+ utilizando cromatografia em oligod(T)-celulose (Aviv e Leder, Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 69:1408-12, 1972). A análise de transferência de Northern foi então realizada como se segue.

Cerca de 2 mg de cada um dos ARN poliA+ foram desnaturados em formaldeído 2,2 M /tampão fosfato (Na2HP04 50 mM, NaH2P04 50 mM, NaOAc 50 mM, EDTA 1 mM e formaldeído 2,2 M) e separadas por electroforese em minigel de agarose a 1,5% (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) em formaldeído/tampão fosfato. O ARN foi transferido durante a noite para um filtro nytran (Schleicher & Schuell, Keene, NH) e o filtro foi reticulado sob UV (1.200 mJoules) num reticulador de UV STRATALINKERa (Stratagene Cloning Systems) e em seguida cozido a 80°C, durante 1 hora.

As manchas foram analisadas quer com uma sonda TACI (SEQ ID NO:21), quer BCMA (SEQ ID NO:24). Detectou-se uma banda de 1,5 kb representando TACI, apenas em células CD19+. Detectou-se fracamente, uma molécula transcrita de 1,2 kb, representando BCMA, em células CD8+, CD19+ e MLR.

Fez-se outra análise de transferência de Northern em transferências realizadas com ARN poli(A) de células K-562 (eritróide, ATCC CCL 243), células HUT78 (células T, ATCC TIB-161), células Jurkat (células T), DAUDI (linfoma humano de Burkitt, Clontech, Paio alto, CA), RAJI (linfoma humano de Burkitt, Clontech) e HL60 (Monócitos), como descrito acima. As manchas foram analisadas quer com uma sonda TACI (SEQ ID NO:21), quer BCMA (SEQ ID NO:24). Detectou-se uma molécula transcrita de 1,5 kb, correspondendo a TACI, em células Raji. Detectou-se uma molécula transcrita, de 1,2 kb, correspondente a BCMA, em células Daudi, Raji e Hut 78.

Utilizou-se uma pesquisa baseada em PCR, para identificar tecidos que expressam TACI humano ou de murídeo e BCMA humano. Pesquisaram-se painéis de expressão de genes Rapid-Scan™ de humano e murídeo (OriGene Technologies, Inc., Rockville, MD), 81 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores oligonucleotidicos ZC24200 (SEQ ID NO:27) e ZC24201 (SEQ ID NO:28) foram concebidos para abranger uma junção de exões e produzir um fragmento de 2 72 pb, correspondente ao TACI de murideo. A expressão foi detectada no baço, timo, pulmão, mama, coração, músculo, pele, glândula supra-renal, estômago, intestino delgado, cérebro, ovário, glândula da próstata e embrião. Detectaram-se bandas adicionais de -500 e 800 pb, em muitos tecidos.

Os iniciadores oligonucleotidicos ZC24198 (SEQ ID NO:29) e ZC24199 (SEQ ID NO:30) foram concebidos para abranger uma junção de exões e produzir um fragmento de 204 pb, correspondente a TACI humano. A expressão foi detectada no baço, cérebro, coração, fígado, cólon, pulmão, intestino delgado, músculo, estômago, testículos, placenta, glândula salivar, glândula supra-renal, pâncreas, próstata, linfócitos de sangue periférico e medula óssea.

Os iniciadores oligonucleotidicos ZC24271 (SEQ ID NO:31) e ZC24272 (SEQ ID NO:32) foram concebidos para abranger uma junção de exões e produzir um fragmento de 329 pb, correspondente a BCMA humano. A expressão foi detectada no cérebro, baço, cólon, pulmão, intestino delgado, estômago, ovário, testículos, glândulas salivares, glândula supra-renal, próstata, linfócitos de sangue periférico, medula óssea e fígado fetal.

Os iniciadores oligonucleotidicos ZC24495 (SEQ ID NO:33) e ZC24496 (SEQ ID NO:34) foram concebidos para abranger uma junção de exões e produzir um fragmento de 436 pb, correspondente a BCMA de murideo. A expressão foi detectada no fígado.

Exemplo 6

Preparação de vectores de fusão TACI-Ig e BCMA-Ig

Construção do fragmento Fc4 de Ig gamai

Para preparar a proteína de fusão TACI-Ig, a região Fc da IgGl humana (a região dobradiça e os domínios CH2 e CH3) foi modificada, de modo a remover o receptor Fc (FcgRI) e as 82 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ funções de ligação ao complemento (Clq). Esta versão modificada de Fc de IgGl humano foi designada por Fc4. A região Fc foi isolada a partir de uma biblioteca de figado fetal humano (clontech) por PCR, utilizando iniciadores oligo, ZC10,134 (SEQ ID NO:43) e ZC10,135 (SEQ ID NO:44). Utilizou-se PCR para introduzir mutações na região Fc, para reduzir a ligação a FcgRI. 0 local de ligação a FcgRI (Leu-Leu-Gly-Gly) foi mutado para Ala-Glu-Gly-ala (resíduos de aminoácido 38-41 da SEQ ID NO: 45), de acordo com Baum et al. (EMBO J. L3: 3992-4001, 1994), para reduzir a ligação de FcRl (Duncan et al., Nature 332:563-4, 1988). Os iniciadores oligonucleotídicos ZC15,345 (SEQ ID NO:46) e ZC15,347 (SEQ ID NO:47) foram utilizados para introduzir a mutação. Adicionou-se a um volume final de 50 μΐ, 570 ng do modelo de IgFc, 5 μΐ de 10X tampão de reacção Pfu (Stratagene), 8 μΐ de dNTP 1,25 mM, 31 μΐ dH20, 2 μΐ ZC115,345 20 mM (SEQ ID NO:46) e ZC15,347 (SEQ ID NO:47). Adicionou-se um volume igual de óleo mineral e a reacção foi aquecida a 94°C durante 1 minuto. Adicionou-se polimerase de Pfu (2,5 unidades, Stratagene), seguido de 25 ciclos a 94°C, durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto, seguido de uma extensão de 7 minutos a 72°C. Os produtos de reacção foram analisados por electroforese e foi detectada uma banda correspondente ao tamanho previsto de -6 76 pb. A banda foi cortada do gel e recuperada, utilizando um kit de extracção de gel QIAGEN QIAquickTM (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante.

Também se utilizou PCR, para introduzir uma mutação de Ala para Ser (resíduo de aminoácido 134 da SEQ ID NO:45) e Pro para Ser (resíduo de aminoácido 135 da SEQ ID NO:45), para reduzir a ligação do complemento Clq e/ou a fixação do complemento (Duncan e Winter, Nature 332:788, 1988) e o codão de stop TAA. Fizeram-se duas primeiras reacções de ciclo, utilizando a sequência de IgFc mutada para o local de ligação FcTRI, como modelo. Adicionou-se a um volume final de 50 μΐ, 1 μΐ do modelo de IgFc mutado para o local de ligaçao de FcyRI, 5 μΐ de 10X tampao de reacçao Rfu (Stratagene) ; 8 μΐ de dNTP 1,25 mM, 31 μΐ dH20, 2 μΐ ZC15,517 20 mM (SEQ ID NO:48), um iniciador 5', que começa no nucleótido 26 da SEQ ID NO: 45 e 83 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ 2 μΐ de ZC15, 530 20 mM (SEQ ID ΝΟ:49), um iniciador 3' que começa no complemento do nucleótido 405 da SEQ ID NO:45. A segunda reacção continha 2 μΐ cada de estoques 20 mM de iniciadores oligonucleotidicos ZC15,518 (SEQ ID NO:50), um iniciador 5' que começa no nucleótido 388 de SEQ ID NO: 45 e ZC15,347 (SEQ ID NO:47), um iniciador 3', para introduzir a mutação Ala para Ser, um local de restrição Xba I e um codão de stop. Adicionou-se um volume igual de óleo mineral e as reacções foram aquecidas a 94°C durante 1 minuto. Adicionou-se polimerase Pfu (2,5 unidades, Stratagene), seguido de 25 ciclos a 94°C, durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos, 72°C durante 2 minutos, seguido de uma extensão de 7 minutos, a 72°C. Os produtos de reacção forma analisados por electroforese e detectaram-se as bandas correspondentes aos tamanhos previstos, -370 e -395 pb, respectivamente. As bandas foram cortadas do gel e extraídas utilizando um kit de extracção de Gel QIAGEN QIAquickTM (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante. Fez-se uma segunda reacção de ciclo, para ligar os fragmentos acima descritos e adicionar o local de restrição Bam Hl, 5'. Adicionou-se, a um volume final de 50 μΐ, 30 μΐ de dH20, 8 μΐ de dNTP 1,25 mM, 5 μΐ do tampão de reacção de polimerase Pfu (Stratagene) e 1 μΐ cada dos dois primeiros produtos de PCR. Adicionou-se um volume igual de óleo mineral e a reacção foi aquecida a 94°C, durante 1 minuto. Adicionou-se polimerase Pfu (2,5 unidades, Stratagene), seguido de 5 ciclos a 94°C, durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C, durante 2 minutos. A temperatura foi mais uma vez levada a 94°C e adicionaram-se 2 μΐ cada de estoques 20 mM de ZC15,516 (SEQ ID NO:51), um iniciador 5' que começa no nucleótido 1 da SEQ ID NO: 45 e ZC15,347 (SEQ ID NO:47), seguido de 25 ciclos a 94°C, durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos e 72°C durante 2 minutos e uma extensão final de 7 minutos, a 72 °C. Uma porção da reacção foi visualizada utilizando electroforese em gel. Detectou-se uma banda de 789 pb, correspondendo ao tamanho previsto.

Construção do vector de expressão TACI-Fc4 e BCMA-Fc4

Os plasmídeos de expressão contendo proteínas de fusão TACI-Fc4 e BCMA-Fc4, foram construídos por recombinação homóloga em leveduras. Isolou-se um fragmento de ADNc de TACI, 84 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ utilizando PCR, que incluía a sequência de polinucleótidos desde o nucleótido 15 ao nucleótido 475 da SEQ ID NO: 5. Os dois iniciadores utilizados na produção do fragmento TACI eram: (1) um iniciador contendo 40 pb da sequência flanqueadora do vector 5' e 17 pb correspondentes ao terminal amino do fragmento TACI (SEQ ID NO:52); (2) 40 pb da extremidade 3', correspondente à sequência Fc4 flanqueadora e 17 pb correspondentes ao terminal carboxilo do fragmento TACI (SEQ ID NO: 53) . A um volume final de 100 μΐ, adicionaram-se 10 ng do modelo TACI, 10 μΐ de 10X tampão de reacção de polimerase de Taq (Perkin Elmer) , 8 μΐ de dNTP 2,5 nM, 78 μΐ dH20, 2 μΐ cada de estoques 20 mM de iniciadores oligonucleotídicos SEQ ID NO:52 e SEQ ID NO:53 e polimerase de Taq (2,5 unidades, Life Technology). Adicionou-se um volume igual de óleo mineral e a reacção foi aquecida a 94°C durante 2 minutos, seguido de 25 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto, seguido de uma extensão de 5 minutos a 72°C.

Isolou-se um fragmento de ADNc de BCMA utilizando PCR, que inclui a sequência de polinucleótidos desde o nucleótido 219 ao nucleótido 362, da SEQ ID NO: 7. Os dois iniciadores utilizados na produção do fragmento de BCMA eram um iniciador de oligonucleótido contendo 40 pb da sequência flanqueadora do vector 5' e 17 pb correspondendo ao terminal amino do fragmento BCMA (SEQ ID NO:54) e um iniciador oligonucleotídico contendo 40 pb da extremidade 3', correspondente à sequência Fc4 flanqueadora e 17 pb correspondentes ao terminal carboxilo do fragmento BCMA (SEQ ID NO:55). A um volume final de 100 μΐ, adicionaram-se 10 ng de modelo BCMA, 10 μΐ de 10X tampão de reacção de polimerase Taq (Perkin Elmer), 8 μΐ de dNTP 2,5 mM, 78 μΐ Η20, 2 μΐ cada de soluções estoque 20 mM de iniciadores de oligonucleótidos de SEQ ID NO:54 e SEQ ID NO:55. Adicionou-se um volume igual de óleo mineral e a reacção foi aquecida a 94°C durante 2 minutos, seguido de 25 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto, seguido de uma extensão de 5 minutos a 72°C. O fragmento contendo o ADNc que codifica para o fragmento Fc4 foi construído de um modo semelhante, um para cada uma das construções de fusão de TACI e BCMA. Para TACI, os dois 85 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ iniciadores utilizados na produção do fragmento Fc4 eram (a montante e a jusante), um iniciador de oligonucleótido contendo 40 pb da seguência flanqueadora de TACI 5' e 17 pb correspondentes ao terminal amino do fragmento Fc4 (SEQ ID NO:56) e um iniciador oligonucleotidico contendo 40 pb da extremidade 3', correspondente à sequência do vector flanqueador e 17 pb correspondentes ao terminal carboxilo do fragmento Fc4 (SEQ ID NO:57). Para o BCMA, o iniciador a montante na produção do fragmento Fc4 era um iniciador oligonucleotidico contendo 40 pb da sequência flanqueadora de BCMA 5' e 17 pb correspondentes ao terminal amino do fragmento Fc4 (SEQ ID NO:58) . O iniciador a jusante para a construção Fc4-BCMA era o mesmo que o descrito acima para TACI-Fc4 (SEQ ID NO:57).

Adicionou-se a um volume final de 100 μΐ, 10 ng do modelo Fc4 descrito acima, 10 μΐ de tampão de reacção de polimerase Taq (Perkin Elmer), 8 μΐ de dNTP 2,5 nM, 78 μΐ dH20, 2 μΐ cada de estoques 20 mM de oligonucleótidos de SEQ ID NO:56 e SEQ ID NO:57, para TACI e oligonucleótidos SEQ ID NO:58 e SEQ ID NO: 57 para BCMA e polimerase Taq (2,5 unidades, Life Technology). Adicionou-se um volume igual de óleo mineral e a reacção foi aquecida a 94°C durante 2 minutos, em seguida 25 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 30 segundos, 72°C durante 1 minuto, seguido de uma extensão de 5 minutos a 72°C.

Correram-se dez microlitros de cada 100 μΐ de reacçoes de PCR acima descritas, num gel de agarose LMP a 0,8% (Seaplaque GTG) com 1 x tampão TBE, para análise. Os restantes 90 μΐ de cada reacção de PCR foram precipitados por adição de 5 μΐ de NaCl 1 M e 250 μΐ de etanol absoluto. O plasmídeo pZMP6 foi cortado com Smal para o linearizar no poliligante. O plasmídeo pZMP6 foi derivado do plasmídeo pCZR199 (American Type Culture Collection Manassas, VA, ATCC# 98668) e é um vector de expressão de mamífero que contém uma cassete de expressão com o promotor precoce imediato de CMV, um intrão de consenso da região variável do locus de cadeia pesada de imunoglobulina de ratinho, locais de restrição múltiplos para inserção de sequências codificantes, um codão de stop e uma sequência de terminação de hormona de crescimento humana. O plasmídeo tem 86 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ também uma origem de replicação de E. coli, uma unidade de expressão de um marcador seleccionável de mamífero com um promotor, potenciador e origem de replicação de SV40, um gene DHFR e a sequência de terminação de SV40. 0 vector pZMP6 foi construído a partir de pCZRl99, por substituição do promotor de metalotioneína com o promotor precoce imediato de CMV e as sequências Kozac, na extremidade 5' da sequência de leitura aberta.

Combinaram-se cem microlitros de células de levedura competentes (S. cerevisiae) com 10 μΐ contendo aproximadamente 1 μρ cada, quer do domínio extracelular de TACI, quer de BCMA e os fragmentos de PCR de Fc4 adequados para recombinação com cada e 100 ng do vector pZMP6 digerido com Smal e transferido para uma cuvete de electroporação de 0,2 cm. As misturas de levedura/ADN forma electropulsadas a 0,75 kV (5 kV/cm), °° ohms, 25 μΡ. A cada cuvete, adicionaram-se 600 μΐ de sorbitol 1,2 M e as leveduras foram plaqueadas em duas alíquotas de 300 μΐ em placas URA-D e incubadas a 30°C.

Após cerca de 48 horas, os transformantes de levedura Ura+ de uma única placa, foram ressuspensos em 1 ml de H2O e centrifugados ligeiramente para sedimentar as células de levedura. A pelete celular foi ressuspensa em 1 ml de tampão de lise (Triton x-100 a 2%, SDS a 1%, NaCl 100 mM, Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM). Adicionaram-se 500 microlitros da mistura de lise a um tubo eppendorf contendo pérolas de vidro lavadas com 300 μΐ de ácido e 200 μΐ de fenol-clorofórmio, agitados no vortex durante intervalos de 1 minuto, duas a três vezes, seguido de uma centrifugação de 5 minutos numa centrífuga de eppendorf, à velocidade máxima. Transferiram-se 300 microlitros da fase aquosa para um tubo fresco e o ADN foi precipitado com 600 μΐ de etanol (EtOH) , seguido de centrifugação durante 10 minutos a 4°C. O sedimento de ADN foi ressuspenso em 100 μΐ de H20. A transformação de células E. coli electrocompetentes (DH10B, GibcoBRL) foi realizada com 0,5-2 ml de ADN prep de levedura e 40 μΐ de células DH10B. As células foram electropulsadas a 2,0 kV, 25 mF e 400 ohms. Após a electroporação, plaquearam-se 1 ml de SOC (Bacto Triptona a 2% 87 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ (Difco, Detroit, ΜΙ), extracto de levedura a 0,5% (Difco), NaCl 10 mM, KC1 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgS04 10 mM, glucose 20 mM) em alíquotas de 250 μΐ, em quatro placas de LB AMP (caldo LB (Lennox), Bacto Agar a 1,8% (Difco), Ampicilina 100 mg/ml).

Os clones individuais que possuem a construção de expressão correcta para TACI-Fc4 ou BCMA-Fc4, foram identificados por digestão com enzimas de restrição, para verificar a presença da inserção e confirmar que as várias sequências de ADN foram ligadas correctamente umas às outras. As inserções de clones positivos foram submetidas a análise de sequência. O ADN de plasmídeo de escala maior é isolado utilizando um kit Qiagen Maxi, de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 7

Expressão de TACI-Fc4 e BCMA-Fc4 em mamíferos

Plaquearam-se células BHK 570 (ATCC NO:CRL-10314) em placas de cultura de tecidos de 10 cm e deixou-se crescer até aproximadamente 50 a 70% de confluência, durante a noite, a 37°C, C02 a 5% em meio DMEM/FBS (DMEM, Gibco/BRL High Glucose, Gibco BRL, Gaithersburg, MD) , soro fetal de bovino a 5% (Hyclone, Logan, UT), L-glutamina 1 mM (JRH Biosciences, Lenexa, RS), piruvato de sódio 1 mM (Gibco BRL) . As células foram então transfectadas, quer com o plasmídeo TACI-Fc4/pZMP6 ou BCMA-Fc4/pZMP6, utilizando Lipofectamine™ (Gibco BRL), numa formulação de meio isento de soro (SF) (DMEM, transferrina 10 mg/ml, insulina 5 mg/ml, fetuína 2 mg/ml, L-glutamina a 1% e piruvato de sódio a 1%). Diluiu-se TACI-Fc4/pZMP6 ou BCMA-Fc4/ρΖΜΡβ em tubos de 15 ml, para um volume final total de 640 μΐ, com meio SF. 35 μΐ de

Lipof ectamine™ (Gibco BRL) foram misturados com 605 μΐ de meio SF. A mistura de Lipofectamine™ foi adicionada à mistura de ADN e deixou-se incubar durante aproximadamente 30 minutos, à temperatura ambiente. Adicionaram-se cinco mililitros de meio SF à mistura ADN:Lipofectamine™. As células foram lavadas uma vez com 5 ml de meio SF, aspiradas e a mistura de ADN:Lipofectamine™ foi adicionada. As células foram incubadas a 37°C durante cinco horas, em seguida adicionaram-se 6,4 ml de DMEM/FBS a 10%, meio PSN a 1%, a cada placa. As placas 88 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ foram incubadas a 37°C durante a noite e a mistura ADN:Lipofectamine™ foi substituída com meio FBS/DMEM a 5%, fresco, no dia seguinte. No dia 5 após a transfecção, as células foram divididas em frascos 1-162 em meio de selecção (DMEM/FBS a 5%, L-GLU a 1%, NaPyr a 1%) . Aproximadamente 10 dias após a transfecção, tripsinizaram-se duas placas de cultura de 150 mm de colónias resistentes a metotrexato, de cada transfecção, e as células foram reunidas e plaqueadas em frascos T-162 e transferidas para culturas em grande escala.

Exemplo 9

Expressão transgénica de Ztnf4

Produziram-se animais transgénicos que expressam os genes ztnf4, utilizando machos férteis (B6C3fl), adultos, fêmeas férteis pré-pubescentes (B6C3fl), machos vasectomizados (B6D2fl) e fêmeas férteis adultas (B6D2fl) (todos da Traconic Farms, Germatown, NY). As fêmeas férteis pré-pubescentes foram superovuladas utilizando gonadotrofina de soro de égua grávida (Sigma, St. Louis, MO) e gonadotrofina coriónica humana (hCG (Sigma)). As fêmeas superovuladas foram subsequentemente acasaladas com machos férteis, adultos e a cópula foi confirmada pela presença de rolhões vaginais.

Os óvulos fertilizados foram recolhidos sob microscópio cirúrgico (Leica MZ12 Stereo Microscope, Leica, Wetzlar, Alemanha). Os óvulos foram então lavados em hialuronidase e meio W640 de Whitten (Tabela 8, todos os reagentes disponíveis da Sigma Chemical Co.) que tinha sido incubado com C02 a 5%, O2 a 5% e N2 a 90%, a 37°C. Os óvulos foram armazenados num incubador a 37°C/5% de CO2, até à micro-injecção. 89 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

Tabela 8 MEIO 640 de WHITTEN mg/200 ml mg/500 ml NaCl 1280 3200 KC1 72 180 KH2P04 32 80 MgS04-7H20 60 150 Glucose 200 500 Ca2+ Lactato 106 265 Benzilpenicilina 15 37,5 Estreptomicina S04 10 25 NaHC03 380 950 Piruvato de Na 5 12,5 h2o 200 ml 500 ml EDTA 500 mM 100 μΐ 250 μΐ Vermelho de fenol a 5% 200 μΐ 500 μΐ BSA 600 1500 A sequência de leitura aberta de 856 pb, que codifica para o ligando de TACI humano de comprimento total, Blys (SEQ ID NO:35) foi amplificada por PCR, de modo a introduzir um codão de iniciação optimizado e locais Pmel 5' e AscI 3', flanqueadoras, utilizando os iniciadores oligonucleotídicos de SEQ ID NO:36 e SEQ ID NO:37.

Este fragmento Pmel/AscI foi subclonado em pKF024, um vector transgénico restrito a células-B e/ou T, contendo o potenciador Em de Ig (690 pb NotI/Xbal de pEmSR; (Bodrug et al., EMBO J. 13:2124-30, 1994), o promotor Vh de Ig (356 pb do fragmento HincII/Xhol de pJHlX(-); Hu et al., J. Exp. Med. 177; 1691-90, 1993), o intrão 16S de SV40 (171 pb Xhol / HindlII de pEmSR), um poliligante Pmel/Asei e o sinal de poliadenilação do gene da hormona de crescimento humana (fragmento de 627 pb Smal/EcoRI; Seeburg, ADN 1:239-49, 1982). A inserção do transgene foi separada do esqueleto do plasmídeo, por digestão com Not I e purificação em gel de agarose e os óvulos fertilizados, de acasalamentos de ratinhos B6C3FlTac descritos acima, foram micro-injectados e implantados em fêmeas pseudo-grávidas, essencialmente como descrito anteriormente (Malik et al., Molec. Cell. Biol. 15:2349-58, 1995). 90 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

Os receptores foram colocados de novo na gaiola, aos pares e deixaram-se decorrer 19-21 de gestação. Após o nascimento, deixaram-se decorrer 19-21 dias pós-parto, antes definição do sexo e desmame, e fez-se uma biópsia de 0,5 cm da cauda (utilizada para determinação do genótipo), com tesouras limpas.

Preparou-se ADN genómico a partir de cortes de cauda, utilizando um kit disponível no mercado (kit DNeasy 96 Tissue; Qiagen, Valência, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Analisou-se o ADN genómico por PCR, utilizando iniciadores concebidos para a porção 3' UTR da hormona de crescimento humana (hGH), do vector transgénico. Os iniciadores ZC17251 (SEQ ID NO:38) e ZC17252 (SEQ ID NO:39) amplificam um fragmento de hGH de 386 pares de bases. A utilização de uma região única à sequência humana (identificada a partir de um alinhamento das sequência de ADN de 3' UTR da hormona de crescimento, humana e de ratinho) assegura que a reacção de PCR não amplificou a sequência de ratinho. Além disso, os iniciadores ZC17156 (SEQ ID NO:40) e ZC17157 (SEQ ID NO:41), que hibridam com sequências de vector e amplificam a inserção de ADNc, podem ser utilizados juntamente com iniciadores de hGH. Nestas experiências, o ADN de animais positivos para o transgene, geraram duas bandas, uma banda de 386 pares de bases correspondente ao fragmento 3' UTR de hGH e uma banda de tamanho variável, correspondente à inserção de ADNc.

Uma vez confirmado que os animais são transgénicos (TG), estes são cruzados de novo com uma estirpe melhorada, colocando as fêmeas TG com um macho do tipo selvagem ou um macho TG com uma ou duas fêmeas do tipo selvagem. À medida que os ratinhos iam nascendo e eram desmamados, os sexos eram separados e as suas caudas eram cortadas para determinação do genótipo.

Para averiguar da expressão de um transgene num animal vivo, faz-se uma biópsia de sobrevivência. A análise do nível de expressão de ARNm de cada transgene, foi realizada utilizando um teste de hibridação da solução de ARN ou PCR em tempo real, num ABI Prism 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster city, CA) de acordo com as instruções do fabricante. 91 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

Preparaçao de células e citometria de fluxo

Analisaram-se ratinhos Founder, de várias idades. Para análises de citometria de fluxo (FACS) de tecidos linfóides, isolaram-se células de medula óssea (BM), a partir de fémures e tíbias, por rompimento cuidadoso em solução salina tamponada com fosfato (PBS), utilizando um almofariz. As células foram ressuspensas, eliminaram-se os fragmentos de osso por sedimentação passiva e sedimentou-se a 1000 x g. Os esplenócitos, timócitos ou células de nódulos linfáticos foram obtidos esmagando tecidos intactos entre lâminas de vidro, em seguida ressuspendendo e sedimentando as células, tal como para BM. As células forma ressuspensas em tampão de lavagem de FACS (FACS WB) (solução salina balanceada de Hank, BSA a 1%, Hepes 10 mM, pH 7,4) a uma concentração de 20 x 106 células/ml, antes da coloração. Para a coloração, transferiram-se 1 x 106 células para tubos de 5 ml e lavaram-se com 1 ml de FACS WB, em seguida sedimentou-se a 1000 x g. As células foram então incubadas em gelo durante 20 minutos, na presença de quantidades saturantes de mAc conjugados com FITC-, PE- e/ou TriColor (TC), adequados, num volume total de 100 ml de FACS WB. As células foram lavadas com 1,5 ml de WB, sedimentadas, em seguida ressuspensas em 400 ml de WB e analisadas num citómetro de fluxo FACSCalibur utilizando o software CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . Os detectores para dispersão de luz directa (FSC) e lateral (SSC) foram ajustados para uma escala linear, enquanto que se utilizaram detectores logarítmicos para todos os três canais de fluorescência (FL-1, FL-2 e FL-3). A compensação para sobreposição espectral entre os canais FL, foi realizada para cada experiência, utilizando populações de células coradas com uma única cor. Todas as células foram recolhidas sem fenda, para o disco, e os dados foram analisados utilizando o software CellQuest. OS RBC e as células mortas foram excluídos, controlando electronicamente os dados, com base nos perfis de FSC vs SSC.

Anticorpos O anticorpo monoclonal anti-CD8 conjugado com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (mAc) (clone 53-6,7) e os 92 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ mAc anti-CD4 (cloneRM4-5), anti-CD5 (clone 53-7,3) anti-CD19 (clone 1D3) e anti-syndecan (clone 281-2) conjugados com ficoeritrina (PE), foram adquiridos da PharMingen (San Diego, CA) . 0 mAc anti-CD45R/B220 conjugado com TriColor (TC) (clone RA3-6B2) foi adquirido da Caltag.

Os ratinhos transgénicos que sobre-expressam ztnf4 no compartimento linfóide, desenvolveram números aumentados de células B periféricas, células plasmáticas aumentadas e níveis elevados de imunoglobulina no soro. Estes animais transgénicos têm um número aumentado de células B200+ no baço, nódulos linfáticos e timo. 0 número aumentado de células B de baço inclui, quer células B-2 convencionais, quer a população normalmente rara de células B-l. Em geral, as células B-l estão grandemente confinadas à cavidade peritoneal e outras cavidades corporais, produzem anticorpos auto-reactivos de afinidade baixa e observou-se muitas vezes a sua associação com o desenvolvimento de doenças auto-imunes, tais como lúpus eritematoso sistémico, LES.

Os animais transgénicos mais velhos produzem auto-anticorpos, desenvolvem proteinúria e glomérulos escleróticos, característicos do lúpus eritematoso sistémico. A Figura 5A mostra suspensões de células individuais de baço (painel superior), nódulo linfático mesentérico (painel do meio) e medula óssea (painel inferior), preparados como descrito a seguir, corados com anti-B220-TC e analisados por citometria de fluxo. 0 número de células B2220+ em cada tecido foi calculado multiplicando a percentagem de células B220+ pelo número total de células vivas (exclusão de azul de tripano), contadas num hemocitómetro. Cada barra representa os dados de indivíduos ztnf4 transgénicos (Tg, barras a sombreado) ou ratinhos controlo, pares de gaiola, não TG (barras abertas). A Figura 5B mostra células isoladas de pares de gaiola ztnf4 TG (painéis da direita) ou não TG (painéis da esquerda). Os nódulos linfáticos (linha de cima), baço (linhas do meio) e timo (linha de baixo) foram corados com mAc contra as moléculas indicadas (DC5, CD4 e CD8) e em seguida analisados 93 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ por citometria de fluxo. Os dados apresentados foram filtrados para excluir células mortas e RBC. A Figura 5C mostra os níveis de IgG, IgM e IgE totais no soro de ratinhos transgénicos para ztnf4, com idades entre 6 a 23 semanas. A Figura 5D mostra a deposição de amilóide e mesângio espessado, dos glomérulos identificados em secções de rim coradas com H&E, de ratinhos transgénicos ztnf4, comparados com glomérulos normais, de pares de gaiola, controlo. A Figura 5E mostra um aumento nas células T efectoras em ratinhos transgénicos para ztnf4, semelhante ao referido por Mackay et al. (J. Exp. Med. 190:1697-1710, 1999).

As fusões TACI(BR43x2) ou BCMA-Ig solúveis são injectadas (IP, IM ou IV) em ratinhos transgénicos que sobre-expressam ztnf4. A análise de citometria de fluxo (FACS) de tecidos linfóides será utilizada para identificar qualquer alteração no número de células B220+ no baço, nódulos linfáticos e timo.

Exemplo 10 ELISA de ligação directa

Desenvolveu-se um ELISA de ligação directa para caracterizar a capacidade quer do TACI-Ig solúvel, quer BCMA-Ig solúvel se ligarem e inibir a actividade biológica do ztnfr4 in vitro.

Revestiu-se uma placa de 96 poços com 1 μρ/πιΐ de Ig anti-humano de cabra (Jackson Labs, Bar Harbor, MA) em tampão A de ELISA (Na2HCC>3 0,1 M, pH 9,6, NaN3 0,02%) e incubou-se durante a noite a 4°C. Titulou-se TACI, BCMA e um receptor de TNF não relacionado, tal como ztnfrlO (SEQ ID NO:42) como um controlo, a partir de 10 μρ/πιΐ por diluições de 5 vezes até 320 ng/ml mais um zero e co-incubou-se com 2,5, 0,5 ou 0,1 μρ/ιηΐ de ztnf4 biotinilado ou ovalbumina, como um controlo negativo e incubou-se 1 hora à temperatura ambiente. A mistura de ligando receptor biotinilado co-incubada foi então adicionada a placas de 96 poços revestidos com Ig anti- 94 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ humano de cabra. As placas foram então lavadas (ELISA C, 500 μΐ Tween 20 (Sigma Chemical Co., Mo.), 200 mg NaN3, PBS a um volume final de 1 litro) e bloqueou-se com Superblock (Pierce, Rockford, IL). As placas foram então incubadas a 37°C durante 2 horas.

As placas foram lavadas mais uma vez com ELISA C, seguido da adição de 100 μΙ/poço de neutr-avidina-HRP a 1 : 10.000 em ELISA B (5 ou 10 μg de BSA (Sigma) para BSA a 1% ou 2%, respectivamente, 250 μΐ Tween 20 (Sigma), 100 mg NaN3, solução salina tamponada com fosfato pH 7,2 (PBS, Sigma) a um volume final de 500 ml. Alternativamente, o tampão pode ser ajustado para 1% ou 2% de BSA em tampão de ELISA C) . As placas são então desenvolvidas com OPD durante 10 minutos à temperatura ambiente e lidas a 492.

Exemplo 11

Teste de actividade biológica

Desenvolveu-se um teste de actividade biológica, para medir a inibição pelo TACI-FC solúvel da estimulação de células B humanas por ztnf4 solúvel. As células B foram isoladas a partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMNC), utilizando pérolas magnéticas CD19 e o sistema de separação magnético VarioMacs (Miltenyi Biotec Auburn, CA), de acordo com as instruções do fabricante. As células B purificadas foram misturadas com ztnf4 solúvel (25 ng/ml) e IL-4 humana recombinante (10 ng/ml Pharmingen) e foram plaqueadas (em triplicado) em placas de 96 poços de fundo redondo, a lxlO5 células por poço.

Diluiu-se o TACI-FC solúvel a partir de 5 μρ/ιηΐ a 6 ng/ml e incubou-se com células B durante 5 dias, pulsou-se durante a noite no dia 4 com 1 μοί de 3H-timidina (Amersham) por poço. Como controlo, também se incubou TACI-FC solúvel com células B e IL-4, sem a presença de ztnf4.

As placas foram recolhidas utilizando um recolhedor de placas Packard e contadas utilizando o leitor Packard. O receptor solúvel TACI-Ig inibiu a capacidade do ztnf4 solúvel estimular a proliferação de células B in vitro, de um modo dependente da dose. Um excesso molar de 10 vezes de TACI-Ig, 95 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ inibe completamente a proliferação de células B humanas em resposta a ztnf4 solúvel, na presença de IL-4.

Exemplo 12 Teste ORIGIN

Os níveis de ztnf4 em indivíduos com uma condição de doença (tal como LES, artrite reumatóide, por exemplo) em relação a indivíduos normais, foram determinados utilizando um teste de electroquimioluminescência. Preparou-se uma curva padrão, preparada a partir de ztnf4 humano, solúvel, a 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,01 ng/ml e 0 ng/ml em tampão ORIGIN (Igen, Gatithersburg, MD). As amostras de soro foram diluídas em tampão ORIGIN. Os padrões e amostras foram incubados à temperatura ambiente durante 2 horas com anticorpo anti-ztnf4 BV humano, de coelho, biotinilado, diluído com 1 μg/ml em tampão de teste Origin (IGEN) e anticorpo policlonal anti-ztnf4 Bv humano, de coelho, rutenilado, diluído para 1 μg/ml em tampão de teste Origin (IGEN). Após a incubação, as amostras foram agitadas num vortex e adicionaram-se Dynabeads de estreptavidina 0,4 mg/ml (Dynal, Oslo, Noruega), a cada um dos padrões e amostras, a 50 μΐ/tubo e incubou-se durante 30 minutos, à temperatura ambiente. As amostras foram agitadas no vortex e as amostras foram lidas num analisador Origin (Igen), de acordo com as instruções do fabricante. O teste Origin baseia-se em electroquimioluminescência e produz uma leitura em ECL-o que é isto, como trabalha e o que é que isto diz.

Detectou-se um nível elevado de ztnf4 em amostras de soro, quer de ratinhos NZBWF1/J e MRL/Mp j-Faslpr, que progrediram para estados avançados de glomerulonefrite e doença auto-imune.

Exemplo 13

TACI-Ig solúvel num modelo espontâneo de LES

Os ratinhos NZBW ficam assintomáticos para LES espontânea a aproximadamente 7-9 meses de idade. Administrou-se TACI-Fc a ratinhos NZBW, para monitorizar o seu efeito supressor em células B, no período de 5 semanas quando, em média, se pensa 96 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ que a produção de auto-anticorpos de células B está em níveis elevados em ratinhos NZBW.

Dividiram-se 100 ratinhos fêmea (NZB x NZW)F! de 8 semanas de idade (Jackson Labs) em 6 grupos de 15 ratinhos. Antes do tratamento, os ratinhos foram monitorizados uma vez por mês, quanto a proteínas na urina, e recolheu-se sangue para banco de CBC e soro. Os soro será analisado quanto à presença de auto-anticorpos. Uma vez que a proteinúria é o sinal típico da glomerulonefrite, os níveis de proteína na urina foram monitorizados por fita de imersão, a intervalos regulares durante o estudo. Antes do tratamento, os animais foram pesados. O doseamento foi iniciado quando os ratinhos tinham aproximadamente 5 meses de idade. Os ratinhos receberam injecções intraperitoneais apenas de veículo (PBS), ou de IgG-Fc (proteína controlo) ou TACI-FC4 (proteína de teste), três vezes por semana, durante 5 semanas.

Grupo (5 ratinhos cada) Tratamento Dose 1 Controlo não tratado 2 Apenas veículo 3 IgG-Fc humano 20 μρ 4 IgG-Fc humano 100 μρ 5 TACI-FC4 humano 20 μρ 6 TACI-FC4 humano 10 0 μρ

Recolheu-se sangue duas vezes durante o doseamento e recolher-se-á pelo menos duas vezes após o doseamento. Os valores de urina da fita de imersão, para a proteinúria, e os pesos corporais foram avaliados a cada duas semanas após o início do doseamento. O sangue, valor de fita de imersão de urina e peso corporal foram avaliados na altura da eutanásia. Avaliou-se o peso do baço, timo, fígado com vesícula, rim esquerdo e cérebro. O baço e timo foram divididos para análise FACS e histologia. As glândulas salivares sub-mandibulares, cadeia de nódulo linfático mesentérico, lobo do fígado com vesícula, cego e intestino grosso, estômago, intestino delgado, pâncreas, rim direito, glândula supra-renal, língua com traqueia e esófago, coração e pulmões também serão recolhidos para histologia. 97 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ A Figura 6 mostra um nível elevado de ztnf4 no soro de ratinhos NZBWF1 e MRL/lpr/lpr, que se correlaciona com o desenvolvimento de LES. A Figura 6A, painel superior, mostra a correlação dos níveis séricos de ztnf4 com a idade, 68 ratinhos NZBWF1 com idades entre 10 a 40 semanas e ratinhos controlo NZB/B com 10 semanas e 30 semanas de idade. O painel do meio mostra a correlação com a proteinúria em três gamas, vestígio a 20 mg/dl (T-30), 100-300 ng/dl e 2000 mg/dl em ratinhos NZBWF1, em comparação com ratinhos NZB/B controlo. O painel inferior mostra os níveis de ztnf4 com vários títulos de anticorpos anti-ADNcd em ratinhos NZBWF1, em comparação com ratinhos NZB/B controlo. A Figura 6B mostra as mesmas correlações feitas em 23 ratinhos MRL/lpr/lpr, entre 18-24 semanas de idade e 10 ratinhos MRL/MpJ controlo, de 11 semanas de idade. A Figura 7 mostra os resultados da análise de urina. Considerou-se que os ratinhos tinham proteinúria quando a leitura da fita de imersão era > 100 mg/dl. (A) PBS, (B) IgG humano FC, 100 mg, (C) IgG humano FC, 20 mg, (D) TACI-IgG humano 100 mg, e (E) TACI-IgG humano, 20 mg. Os ratinhos tratados com a fusão TACI-IgG solúvel mostraram uma redução na proteinúria. A análise do sangue periférico de animais tratados, revelou que as contagens de glóbulos brancos e linfócitos eram menores em ratinhos tratados com TACI-FC (20 e 100 mg), em comparação com ratinhos tratados com FC (20 e 100 mg) e com PBS, 2 semanas após o início do tratamento. A análise FAC (fenda para linfócitos) de sangue periférico retirado seis semanas após o tratamento ter começado (duas semanas após o último tratamento ser administrado)revelou um decréscimo acentuado na percentagem de células B presentes nas amostras. Os níveis de células B estavam ainda em declínio, 5 semanas após o último tratamento ser administrado, mas não tão acentuadamente. A tabela 9 mostra a média (e desvio padrão) para ratinhos em cada grupo de tratamento (Tabela 9). O declínio na percentagem de células B no sangue periférico também foi observado a duas semanas em tratamento. 98 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

Tratamento PBS 100 mg FC 20 mg FC 100 mg TACI-FC 20 mg TACI-FC

Tabela 9 Semana

células B 26,05(6,52) 23,34 (5,77) 24,09 (6,26) 11,07(5,03) 16,37 (7,27) % células T 67,05(6,80) 68,23 (7,30) 65,27 (7,18) 79, 06 (6, 71) 69,72(8,90)

Semana 5 % células B 20, 83 (3,14) 25, 04 (8, 07) 18,96(6,42) 14,79(4,76) 19,14(5,27)

Exemplo 14 TACI-Ig solúvel em ratinhos normais

Administrou-se TACI-FC a ratinhos Balb/c, para monitorizar o seu efeito em ratinhos normais. Sessenta ratinhos Balb/c (HSD), fêmea de 8 semanas de idade, foram divididos em 12 grupos de 5 ratinhos. Antes do tratamento, os ratinhos foram pesados em recolheu-se sangue para banco de CBC e soro. Os grupos 1-9 receberam injecções intraperitoneais (IP) de apenas veiculo (PBS) ou IgG-FC humano (proteína controlo), ou TACI-FC4 (proteína de teste) diariamente, durante 12 dias e foram sacrificados no dia 14. Os grupos 10 e 11 receberam injecções IP três vezes por semana durante duas semanas e foram sacrificados no dia 14.

Grupo (5 ratinhos cada) Tratamento Dose 1 TACI-FC4 humano 2 0 0 mg 2 TACI-FC4 humano 10 0 mg 3 TACI-FC4 humano 2 0 μg 4 TACI-FC4 humano 5 μg 5 FC4 humano 200 μg 6 FC4 humano 10 0 mg 7 FC4 humano 2 0 mg 8 FC4 humano 5 mg 9 Apenas veículo Como utilizado 10 TACI-FC4 humano 100 mg 11 FC4 humano 100 mg 12 Controlo não tratado

Recolheu-se sangue nos dias 7 e 12. O sangue e o peso corporal forma recolhidos na altura da eutanásia. Avaliou-se o peso do baço, timo e cérebro. O baço e o timo foram divididos para análise FACS e histologia. A pele, baço, cadeia de LN 99 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ mesentérico, glândulas salivares sub-mandibulares, ovários, útero, cérvix, bexiga, cadeia de nódulos linfáticos mesentéricos, lobo do figado vesícula, cego e intestino grosso, estômago, intestino delgado, pâncreas, rim direito, glândula supra-renal, língua com traqueia e esófago, coração, timo, músculo da coxa, fémur direito e esquerdo, cérebro, também serão recolhidos para histologia.

Como descrito acima no exemplo 13, observou-se uma redução significativa na percentagem de células B aos dias 7 (para CBC) e 12 (utilizando FACS) em células de sangue periférico recolhidas de todas as amostras tratadas com TACI-FC4, em comparação com as tratadas apenas com FC4 ou PBS e analisadas por CBC ou FACS. Adicionalmente, houve um decréscimo de cerca de 50% em células B, nos baços recolhidos de animais tratados com TACI-FC4, em comparação com os de ratinhos tratados com FC4, no dia 14.

Exemplo 15 ELISA anti-ADNcd A auto-imunidade caracteriza-se por níveis elevados de anticorpos anti-ADN de cadeia dupla. Para medir os níveis de anticorpos anti-ADN cd em ambos, os ratinhos transgénicos que sobre-expressam ztnf4 e os ratinhos NZBW, desenvolveu-se um teste ELISA. Revestiu-se uma placa de microtítulo de 96 poços (Nunc) com poli-L-lisina (Sigma) (20 μΐ/ml em tampão Tris 0,1 M, pH 7,3) a 75 μΐ/poço e incubou-se durante a noite à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas em dH20 e revestidas com poli dAdT (Sigma) (20 μΐ/ml em tampão Tris 0,1 M pH 7,3), a 75 μΐ/poço e incubou-se à temperatura ambiente durante 60 minutos. As placas foram então lavadas com dH20 e bloqueadas com BSA a 2% (Sigma) em tampão Tris, durante 30 minutos à temperatura ambiente, seguido de uma lavagem final em dH20.

As amostras de soro foram recolhidas de ratinhos transgénicos para ztnf4, descritos no Exemplo 10 e os ratinhos NZBW descritos no Exemplo 11. As amostras de soro foram diluídas 1:50 em BSA a 1%/BGG a 2% (Calbiochem) em tampão Tris. As amostras diluídas foram então tituladas nas placas revestidas, a 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:3200 e 100 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ 1:6400 (50 μΐ/poço) e incubadas durante 90 minutos à temperatura ambiente.

As placas foram então lavadas em dBbO e adicionou-se anti-IgG-Fc-HRP (Cappel) de ratinho, de cabra, diluído 1:1000 em BSA a 1%/BGG a 2%, a 50 μΐ/poço. As placas foram incubadas durante 60 minutos à temperatura ambiente. As placas foram lavadas 5X em dH2<3 e desenvolvidas com OPD, 1 comprimido/10 ml de Novo D e plaqueadas a 100 μΐ/poço. O aparelho revelador foi parado com H2SO4 IN, 100 μΐ/poço e a DO foi lida a 492 nm. A Figura 8 mostra os níveis de anti-ADNcd em dois ratinhos transgénicos para ztnf4 (23 semanas de idade), dois pares de gaiola não transgénicos, em comparação com os níveis detectados no soro para NZBWF1 (32 semanas de idade) e MRL/lpr/lpr (19 semanas de idade)

Exemplo 16 TACI-Ig solúvel num modelo de ELE espontâneo

Administrou-se a 25 ratinhos fêmea PLxSLJ F1 (12 semanas de idade, Jackson Labs) uma injecção subcutânea de 125 μρ/^ίίηίαο de antigénio (proteolípido proteína mielina, PLP, resíduos 139-151), formulada em adjuvante de Freund completo. Os ratinhos são divididos em 5 grupos de 5 ratinhos. Administram-se injecções intraperitoneais de toxina de tosse convulsa (400 ng) , nos dias 0 e 2. Os grupos irão receber uma dose de lx, lOx ou lOOx de TACI, BCMA ou BR43x2, um grupo irá receber apenas veículo e um grupo não irá receber tratamento. A terapia de prevenção começará no dia 0, a terapia de intervenção começará no dia 7 ou no início dos sinais clínicos. Os sinais da doença, perda de peso e paralisia, manifestam-se em aproximadamente 10-14 dias e duram cerca de 1 semana. Os animais são avaliados diariamente, recolhendo os dados de peso corporal e atribuindo uma pontuação clínica para corresponder à extensão dos seus sintomas. Os sinais clínicos de EAE surgem em 10-14 dias de inoculação e persistem durante aproximadamente 1 semana. No final do estudo, todos os animais são submetidos a eutanásia por overdose de gás e faz-se a sua necropsia. O cérebro e medula espinal são recolhidos para histologia ou congelados para análise de ARNm. O peso corporal 101 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ e os dados da pontuação clínica são representados num gráfico, por indivíduo e por grupo.

Pontuação clínica 0 Normal 0,5 Fraco, a tensão da cauda poderá estar diminuída, mas não ausente 1 Cauda coxa (não consegue levantar a cauda quando o ratinho é pegado pela base da cauda) 2 cauda coxa, pernas fracas (não consegue levantar a cauda, consegue ficar direito nas pernas de trás mas as pernas estão trémulas) 3 paresia (não se consegue sentar com as pernas sob o corpo, anda num movimento oscilante, com as pernas para trás) 4 paralisia (não consegue mover as pernas de trás, arrasta as pernas quando tenta andar) 5 quadriplegia (paralisia das pernas dianteiras ou anda de um modo circular, pode ter abanar de cabeça) 6 Moribundo (completamente paralisado, não consegue alcançar água ou comida, sacrifício do animal)

Exemplo 17 TACI-FC e o modelo CIA para a artrite reumatóide

Dividem-se ratinhos DBA/1J macho (Jackson Labs), de oito semanas de idade, em grupos de 5 ratinhos/grupo e são-lhes administradas duas injecções subcutâneas de 50-100 μΐ de 1 mg/ml de colagénio (originário de galinha ou bovino), a intervalos de 3 semanas. Um controlo não receberá injecções de colagénio. A primeira injecção é formulada em adjuvante de Freund completo e a segunda injecção é formulada em adjuvante de Freund incompleto. O TACI-FC será administrado profilacticamente na ou antes da segunda injecção ou após o animal desenvolver uma pontuação clínica de 2 ou mais, que persiste pelo menos 24 horas. Os animais começam a apresentar sintomas de artrite após a segunda injecção de colagénio, normalmente em 2-3 semanas. A extensão da doença é avaliada em cada pata, utilizando um calibrador para medir a espessura da pata e atribuindo uma pontuação clínica (0-3) a cada pata. A pontuação clínica, 0 normal, 1 dedo(s) inflamado(s), 2 inflamação média das patas, 3 inflamação moderada das patas e 4 inflamação grave das patas. Os animais serão submetidos a eutanásia após terem a doença estabelecida durante um período 102 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ de tempo determinado, normalmente 7 dias. As patas são recolhidas para histologia ou análise de ARNm e o soro é recolhido para teste de imunoglobulina e citóquinas.

Exemplo 18

Neutralização de anticorpos de TACI

Prepararam-se anticorpos policlonais anti-péptido, imunizando 2 coelhos brancos da Nova Zelândia, fêmea, com o péptido, huztnf4-1 SAGIAKLEEGPELQLAIPRE (SEQ ID NO:59) ou huztnf4-2 SFKRGSALEEKENKELVKET(SEQ ID NO:60). Os péptidos foram sintetizados utilizando um sintetizador de péptidos Modelo 431A da Applied Biosystems (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. Os péptidos foram em seguida conjugados com a proteína transportadora, hemocianina de lapa buraco de fechadura (KLH) com activação por maleimida. Os coelhos receberam, cada um, uma injecção intraperitoneal inicial (ip) de 200 μρ de péptido em adjuvante de Freund completo, por injecções de reforço ip, de 100 μρ de péptido em adjuvante de Freund incompleto, a cada três semanas. Sete a dez dias após a administração da segunda injecção de reforço (3 injecções totais), os animais foram sangrados e o soro foi recolhido. Os animais levaram um reforço e foram sangrados a cada três semanas.

Os soros de coelhos específicos para o péptido ztnf4 foram caracterizados por uma análise de título ELISA, utilizando 1 μρ/ml dos péptidos utilizados para produzir o anticorpo (SEQ ID NO:59 e 60), como alvo do anticorpo. Os 2 soros de coelho contra o péptido huztnf4-l (SEQ ID NO:59) têm título para o seu péptido específico, a uma diluição de 1:1E5 (1:100000). Os dois soros de coelho para o péptido huztnf4-2 (SEQ ID NO:60) tinham título contra o seu péptido específico, a uma diluição de 1:5E6 e para as proteínas de comprimento total, recombinantes (ztnf4 sinalizado com FLAG no terminal-N, produzido em baculovírus (huztnf4s-NF-Bv) e ztnf4 sinalizado com FLAG no terminal C, produzidos em células BHK) a uma diluição de 1:5E6.

Os anticorpos policlonais específicos para o péptido ztnf4 foram purificados por afinidade a partir de soro de coelho, utilizando colunas de proteína CNBR-SEPHAROSE 4B 103 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ (Pharmacia LKB), que foram preparadas utilizando 10 mg de péptidos específicos (SEQ ID Nos 59 ou 60) por grama de CNBr-SEPHAROSE, seguido de diálise 20 X em PBS, durante a noite. Os anticorpos específicos para ztnf4 foram caracterizados por uma análise de título ELISA, utilizando 1 μρ/πιΐ do antigénio peptídico adequado ou proteína de comprimento total, recombinante (huztnf4-NF-Bv) como alvos do anticorpo. O limite inferior de detecção (LLD) do anticorpo de coelho anti-huztnf4-l, purificado por afinidade, no seu antigénio específico (péptido huztnf4-1, SEQ ID NO:59) é uma diluição de 5 ng/ml. O limite inferior de detecção (LLD) do anticorpo de coelho anti-huztnf4, purificado por afinidade, no seu antigénio específico (péptido huztnf4-2, SEQ ID NO:60) é uma diluição de 0,5 ng/ml. O limite inferior de detecção (LLD) do anticorpo de coelho anti-huztnf4, purificado por afinidade, na proteína recombinante huztnf4s-NF-Bv, é uma diluição de 5 ng/ml.

Os anticorpos monoclonais foram produzidos e seleccionados para inibição de ztnf4 solúvel marcado com biotina. Nenhum dos anticorpos monoclonais para TACI (248,14,

248.23 ou 246,3) bloqueiam a ligação de ztnf4 em BCMA. O 248.23 monoclonal reduz a ligação de ztnf4-biotina 10 ng/ml em cerca de 50%, quando o meio condicionado é diluído 1:243 e reduz a ligação em cerca de 2X em meio não diluído. O 246,3 monoclonal reduz a ligação de ztnf4-biotina 10 ng/ml em cerca de 50%, entre uma diluição 1:243 e 1:181 de meio condicionado e reduz a ligação 5X em meio não diluído.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> ZymoGenetics, Inc.

<120> RECEPTOR BR43X2 SOLÚVEL E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO <130> 98-75 <150> 09/226,533 <151> 1999-01-07 <16 0 > 6 0 <170> FastSEQ for Windows Versão 3.0

<210 > 1 <211> 1192 <212> ADN <213> Homo sapiens <2 2 0 > <221> CDS <222> (6) . . . (746) <400> 1 gagta atg agt ggc ctg ggc cgg age agg cga ggt ggc cgg age cgt gtg 50

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Vai 1 5 10 15 gac cag gag gag ege tgg tea ctc age tgc ege aag gag caa ggc aag 98 Asp Gin Glu Glu Arg Trp Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys 20 25 30 ttc tat gac cat etc ctg agg gac tgc ate age tgt gee tcc ate tgt 146 Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys 35 40 45 gga cag cac cct aag caa tgt gea tac ttc tgt gag aac aag ctc agg 194 Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg 50 55 60 age cca gtg aac ctt cca cca gag ctc agg aga cag cgg agt gga gaa 242 Ser Pro Vai Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gin Arg Ser Gly Glu 65 70 75 105 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ gtt gaa aac aat tca gac aac teg gga agg tac ca a gga ttg gag cac 290 Vai Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gin Gly Leu Glu His 80 85 90 95 aga ggc tca gaa gca agt cca gct ctc ccg ggg ctg aag ctg agt gca 338 Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala 100 105 110 gat cag gtg gcc ctg gtc tac age acg ctg ggg ctc tgc ctg tgt gcc 386 Asp Gin Vai Ala Leu Vai Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala 115 120 125 gtc ctc tgc tgc ttc ctg gtg gcg gtg gcc tgc ttc ctc aag aag agg 434 Vai Leu Cys Cys Phe Leu Val Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg 130 135 140 ggg gat ccc tgc tcc tgc cag ccc ege tca agg ccc cgt caa agt ccg 482 Gly Asp Pro Cys Ser Cys Gin Prn Arg Ser Arg Pro Arg Gin Ser Pro 145 150 155 gcc aag tct tcc cag gat cac gcg atg gaa gcc ggc age cct gtg age 530 Ala Lys Ser Ser Gin Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val Ser 160 165 170 175 aca tcc ccc gag cca gtg gag acc tgc age ttc tgc ttc cct gag tgc 578 Thr Ser Pro Glu Pro Vai Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu cys 180 185 190 agg gcg ccc acg cag gag age gca gtc acg cct ggg acc ccc gac ccc 626 Arg Ala Pro Thr Gin Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro 195 200 205 act tgt gct gga agg tgg ggg tgc cac acc agg acc aca gtc ctg cag 674 Thr Cys Ala Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val Leu Gin 210 215 220 cct tgc cca cac ate cca gac agt ggc ctt ggc att gtg tgt gtg cct 722 Pro Cys Pro His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Val Cys Val Pro 225 230 235 gcc cag gag ggg ggc cca ggt gca taaatggggg tcagggaggg aaaggaggag 776 Ala Gin Glu Gly Gly Pro Gly Ala 240 245 106 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ 106 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ 836 896 956 1016 1076 1136 1192 ggagagagat ggagaggagg ggagagagaa agagaggtgg ggagagggga gagagatatg aggagagaga gacagaggag gcagagaggg agagaaacag aggagacaga gagggagaga gagacagagg gagagagaga cagaggggaa gagaggcaga gagggaaaga ggcagagaag gaaagaggca gagagggaga gaggcagaga gggagagagg cagagagaca gagagggaga gagggacaga gagagataga gcaggaggtc ggggcactct gagtcccagt tcccagtgca gctgtaggtc gtcatcacct aaccacacgt gcaataaagt cctcgtgcct gctgctcaca gcccccgaga gcccctcctc ctggagaata aaacctttgg cagctgccct tcctca

<210> 2 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Vai Asp 1 5 10 15 Gin Glu Glu Arg Trp Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe 20 25 30 Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly 35 40 45 Gin His Pro Lys Gin cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser 50 55 60 Pro Vai Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gin Arg Ser Gly Glu Vai 65 70 75 80 Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gin Gly Leu Glu His Arg 85 90 95 Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp 100 105 110 Gin Vai Ala Leu Vai Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Vai 115 120 125 Leu Cys Cys Phe Leu Vai Ala Vai Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly 130 135 140 Asp Pro Cys Ser Cys Gin Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gin Ser Pro Ala 145 150 155 160 Lys Ser Ser Gin Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Vai Ser Thr 165 170 175 Ser Pro Glu Pro Vai Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg 180 185 190 Ala Pro Thr Gin Glu Ser Ala Vai Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro Thr 195 200 205 Cys Ala Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Vai Leu Gin Pro 210 215 220 Cys Pro His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Vai Cys Vai Pro Ala 225 230 235 240 Gin Glu Gly Gly Pro Gly Ala 245 107 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ <210> 3 <211> 360 <212> ADN <213> Homo <220> <221> CDS <222> (D . <4 0 0 > 3 sapiens . . (360) atg agt ggc ctg ggc cgg age agg cga ggt ggc cgg age cgt gtg gac 48 Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp 1 5 10 15 cag gag gag cgc tgg tca ctc age tgc cgc aag gag caa ggc aag ttc 96 61 π Glu Glu Arg Trp Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe 20 25 30 tat gac cat ctc ctg agg gac tgc ate age tgt gcc tcc ate tgt gga 144 Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly 35 40 45 cag cac cct aag caa tgt gca tac ttc tgt gag aac aag ctc agg age 192 Gin His Pro Uys Gin cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser 50 55 60 cca gtg aac ctt cca cca gag ctc agg aga cag cgg agt gga gaa gtt 240 Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gin Arg Ser Gly Glu Val 65 70 75 80 gaa aac aat tca gac aac teg gga agg tac caa gga ttg gag cac aga 288 Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gin Gly Leu Glu His Arg 85 90 95 ggc tca gaa gca agt cca gct ctc ccg ggg ctg aag ctg agt gca gat 336 Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp 100 105 110 cag gtg gcc ctg gtc tac age acg Tfin Gin Val Ala Leu Val Tyr Ser Thr ouu 115 120 108 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

<210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg Ser Arg Vai Asp 1 5 10 15 Gin Glu Glu Arg Trp Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin Gly Lys Phe 20 25 30 Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly 35 40 45 Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser 50 55 60 Pro Vai Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gin Arg Ser Gly Glu Vai 65 70 75 80 Glu Asm Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gin Gly Leu Glu His Arg 85 90 95 Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp 100 105 110 Gin Vai Ala Leu Vai Tyr Ser Thr 115 120

<210> 5 <211> 1377 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (14)...(895) <400> 5 agcatcctga gta atg agt ggc ctg ggc cgg age agg cga ggt ggc cgg 49

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly Arg 15 10 age cgt gtg gac cag gag gag ege ttt cca cag ggc ctg tgg acg ggg 97

Ser Arg Vai Asp Gin Glu Glu Arg Phe Pro Gin Gly Leu Trp Thr Gly 15 20 25 gtg gct atg aga tcc tgc ccc gaa gag cag tac tgg gat cct ctg ctg

Vai Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp Asp Pro Leu Leu 30 35 40 145 193 109 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ 193 109 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ ggt acc tgc atg tcc tgc aaa acc att tgc aac cat cag age cag ege Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His Gin Ser Gin Arg 45 50 55 60 acc tgt gca gcc ttc tgc agg tea ctc age tgc ege aag gag caa ggc Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin Gly 65 70 75 aag ttc tat gac cat etc ctg agg gac tgc ate age tgt gcc tcc ate Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile 80 85 90 tgt gga cag cac cct aag caa tgt gca tac ttc tgt gag aac aag ctc Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu 95 100 105 agg age cca gtg aac ctt cca cca gag ctc agg aga cag cgg agt gga Arg Ser Pro Val Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arq Gin Arg Ser Gly 110 115 120 gaa gtt gaa aac aat tea gac aac teg gga agg tac caa gga ttg gag Glu Vai Glu Asn Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gin Gly Leu Glu 125 130 135 140 cac aga ggc tea gaa gca agt cca gct ctc ccg ggg ctg aag ctg agt Hi s Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser 145 150 155 gca gat cag gtg gcc ctg gtc tac age acg ctg ggg ctc tgc ctg tgt Ala Asp Gin Val Ala Leu Val Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys 160 165 170 gcc gtc etc tgc tgc ttc ctg gtg gcg gtg gcc tgc ttc ctc aag aag Ala Vai Leu Cys Cys Phe Leu Val Ala Val Ala Cys Phe Leu Lys Lys 175 180 185 ayy ggg ydu ccc tyL uCC tgc cag CCC <-y>- LLfl ayy CCC cgt l a a ayt Arg Gly Asp Pro Cys Ser Cys Gin Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gin Ser 190 195 200 ccg gcc aag tet tcc cag gat cac gcg atg gaa gcc ggc age cct gtg Pro Ala Lys Ser Ser Gin Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Val 205 210 215 220 ΓΊΓ 241 289 337 385 433 481 529 577 ΌάΟ 673 110 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ age aca tcc ccc gag cca gtg gag acc tgc age ttc tgc ttc cct gag 721 Ser Thr Ser Pro GlU Pro Val Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu 225 230 235 tgc agg gcg ccc acg cag gag age gea gtc acg cct ggg acc ccc gac 769 Cys Arg Ala Pro Thr Gin Glu Ser Ala Val Thr Pro Gly Thr Pro Asp 240 245 250 ccc act tgt gct gga agg tgg ggg tgc cac acc agg acc aca gtc ctg 817 Pro Thr Cys Ala Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Val Leu 255 260 265 cag cct tgc cca cac ate cca gac agt ggc ctt ggc att gtg tgt gtg 865 Gin Pro Cys Pro His lie Pro Asp Ser Gly Leu Gly 11 e Val Cys val 270 275 280 cct gee cag gag ggg ggc cca ggt gea taa atgggggtca gggagggaaa 915 Pro Ala Gin Glu Gly Gly Pro Gly Ala ★ 285 290 ggaggaggga gagagatgga agatatgagg agagagagac ggagagagag acagagggag agagaaggaa agagacaggc agagaggcag agagacagag gcactctgag tcccagttcc ataaagtcct cgtgcctgct cctttggcag ctgcccttcc gaggagggga gagagaaaga agaggaggca gaaagggaga agagagacag aggggaagag agagaaggag agaggcagag agggagagag ggacagagag cagtgcagct gtaggtcgtc gctcacagcc cccgagagcc tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa gaggtgggga gaggggagag gaaacagagg agacagagag aggcagagag ggaaagaggc agggagagag gcagagaggg agatagagca ggaggtcggg atcacctaac cacacgtgca cctcctcctg gagaataaaa aa 975 1035 1095 1155 1215 1275 1335 1377

<210> 6 <211> 293 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Met Ser Gly Leu Gly Arg Ser Arg 1 5 Gin Glu Glu Arg Phe Pro Gin Gly 20 Ser Cys Pro Glu Glu Gin Tyr Trp 35 40 Ser Cys Lys Thr Ile Cys Asn His 50 55 Phe Cys Arg Ser Leu Ser Cys Arg 65 70

Arg Gly Gly Arg Ser Arg Val Asp 10 15 Leu Trp Thr Gly Val Ala Met Arg 25 30 Asp Pro Leu Leu Gly Thr Cys Met 45 Gin Ser Gin Arg Thr Cys Ala Ala 60 Lys Glu Gin Gly Lys Phe Tyr Asp 75 80 111 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

His Leu Leu Arg Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser Ile Cys Gly Gin His 85 90 95 Pro Lys Gin Cys Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys Leu Arg Ser Pro Vai 100 105 110 Asn Leu Pro Pro Glu Leu Arg Arg Gin Arg Ser Gly Glu Vai Glu Asn 115 120 125 Asn Ser Asp Asn Ser Gly Arg Tyr Gin Gly Leu Glu His Arg Gly Ser 130 135 140 Glu Ala Ser Pro Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu Ser Ala Asp Gin Vai 145 150 155 160 Ala Leu Vai Tyr Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu Cys Ala Vai Leu Cys 165 170 175 Cys Phe Leu Vai Ala Vai Ala Cys Phe Leu Lys Lys Arg Gly Asp Pro 180 185 190 Cys Ser Cys Gin Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gin Ser Pro Ala Lys Ser 195 200 205 Ser Gin Asp His Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro Vai Ser Thr Ser Pro 210 215 220 Glu Pro Vai Glu Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Cys Arg Ala Pro 225 230 235 240 Thr Gin Glu Ser Ala Vai Thr Pro Gly Thr Pro Asp Pro Thr Cys Ala 245 250 255 Gly Arg Trp Gly Cys His Thr Arg Thr Thr Vai Leu Gin Pro Cys Pro 260 265 270 His Ile Pro Asp Ser Gly Leu Gly Ile Vai Cys Vai Pro Ala Gin Glu 275 280 285 Gly Gly Pro Gly Ala 290

<210> 7 <211> 995 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (219) ... (773) <400> 7 aagactcaaa cttagaaact tgaattagat gtggtattca aatccttacg tgccgcgaag 60 acacagacag cccccgtaag aacccacgaa gcaggcgaag ttcattgttc tcaacattct 120 agctgctctt gctgcatttg ctctggaatt cttgtagaga tattacttgt ccttccaggc 180 tgttctttct gtagctccct tgttttcttt ttgtgatc atg ttg cag atg gct ggg 236

Met Leu Gin Met Ala Gly 1 5 112 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ cag tgc tcc caa aat gaa tat ttt gac agt ttg ttg cat gct tgc ata 284 Gin Cys Ser Gin Asn Glu Tyr Phe Asp Ser Leu Leu His Ala Cys Ile 10 15 20 cct tgt caa ctt cga tgt tet tet aat act cct cct cta aca tgt cag 332 Pro Cys Gin Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr Pro Pro Leu Thr Cys Gin 25 30 35 cgt tat tgt aat gca agt gtg acc aat tea gtg aaa gga acg aat gcg 380 Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Vai Thr Asn Ser Vai Lys Gly Thr Asn Ala 40 45 50 att etc tgg acc tgt ttg gga ctg age tta ata att tet ttg gca gtt 428 11e Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu Ile Ile Ser Leu Ala Vai 55 60 65 70 ttc gtg cta atg ttt ttg cta agg aag ata age tet gaa cca tta aag 476 Phe Vai Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile Ser Ser Glu Pro Leu Lys 75 80 85 gac gag ttt aaa aac aca gga tea ggt ctc ctg ggc atg gct aac att 524 Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu Leu Gly Met Ala Asn Ile 90 95 100 gac ctg gaa aag age agg act ggt gat gaa att att ctt ccg aga ggc 572 Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu Ile Ile Leu Pro Arg Gly 105 110 115 ctc gag tac acg gtg gaa gaa tgc acc tgt gaa gac tgc ate aag age 620 Leu Glu Tyr Thr Vai Glu Glu Cys Thr Cys Glu Asp Cys Ile Lys Ser 120 125 130 aaa ccg aag gtc gac tet gac cat tgc ttt cca ctc cca gct atg gag 668 Lys Pro Lys Vai Asp Ser Asp His Cys Phe Pro Leu Pro Ala Met Glu 135 140 145 150 gaa ggc gca acc att ctt gtc acc acg aaa acg aat gac tat tgc aag 716 Glu Gly Ala Thr Ile Leu Vai Thr Thr Lys Thr Asn Asp Tyr Cys Lys 155 160 165 age ctg cca gct gct ttg agt gct acg gag ata gag aaa tea att tet 764 Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu Ile Glu Lys Ser Ile Ser 170 175 180 gct agg taa ttaaccattt cgactcgagc agtgccactt taaaaatctt 813 AI a Arg * ttgtcagaat agatgatgtg tcagatctct ttaggatgac tgtatttttc agttgccgat 873 acagcttttt gtcctctaac tgtggaaact ctttatgtta gatatatttc tctaggttac 933 tgttgggagc ttaatggtag aaacttcctt ggtttcatga ttaaagtctt tttttttcct 993 ga 995 113 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

<210> 8 <211> 184 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8

Met Leu Gin Met Ala Gly Gin Cys Ser Gin Asn Glu Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 15 Leu Leu His Ala Cys Ile Pro Cys Gin Leu Arg Cys Ser Ser Asn Thr 20 25 30 Pro Pro Leu Thr Cys Gin Arg Tyr Cys Asn Ala Ser Vai Thr Asn Ser 35 40 45 Vai Lys Gly Thr Asn Ala Ile Leu Trp Thr Cys Leu Gly Leu Ser Leu 50 55 60 Ile Ile Ser Leu Ala Vai Phe Vai Leu Met Phe Leu Leu Arg Lys Ile 65 70 75 80 Ser Ser Glu Pro Leu Lys Asp Glu Phe Lys Asn Thr Gly Ser Gly Leu 85 90 95 Leu Gly Met Ala Asn Ile Asp Leu Glu Lys Ser Arg Thr Gly Asp Glu 100 105 110 Ile Ile Leu Pro Arg Gly Leu Glu Tyr Thr Vai Glu Glu Cys Thr Cys 115 .120 125 Glu Asp Cys Ile Lys Ser Lys Pro Lys Vai Asp Ser Asp His Cys Phe 130 135 140 Pro Leu Pro Ala Met Glu Glu Gly Ala Thr Ile Leu Vai Thr Thr Lys 145 150 155 160 Thr Asn Asp Tyr Cys Lys Ser Leu Pro Ala Ala Leu Ser Ala Thr Glu 165 170 175 lie Glu Lys Ser Ile Ser Ala Arg 180 114 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ 114 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ Arg Ser Arg Vai Asp Gin Glu Glu Arg 10 15 Gly Vai Ala Met Arg Ser Cys Pro Glu 25 30 Leu Gly Thr Cys Met Ser Cys Lys Thr 40 45 Arg Thr Cys Ala Ala Phe Cys Arg Ser 60 Gly Lys Phe Tyr Asp His Leu Leu Arg 75 80 Ile Cys Gly Gin His Pro Lys Gin Cys 90 95 Leu Arg Ser Pro Vai Asn Leu Pro Pro 105 110 Gly Glu Vai Glu Asn Asn Ser Asp Asn 120 125 Glu His Arg Gly Ser Glu Ala Ser Pro 140 Ser Ala Asp Gin Vai Ala Leu Vai Tyr 155 160 Cys Ala Vai Leu Cys Cys Phe Leu Vai 170 175 Lys Arg Gly Asp Pro Cys Ser Cys Gin 185 190 Ser Pro Ala Lys Ser Ser Gin Asp His 200 205 Vai Ser Thr Ser Pro Glu Pro Vai Glu 220 Glu Cys Arg Ala Pro Thr Gin Glu Ser 235 240

<210> 9 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapíens <400> 9

Gly Arg Ser Arg Arg Gly Gly 1 5

Phe Pro Gin Gly Leu Trp Thr 20

Glu Gin Tyr Trp Asp Pro Leu 35

Ile Cys Asn His Gin Ser Gin 50 55

Leu Ser Cys Arg Lys Glu Gin 65 70

Asp Cys Ile Ser Cys Ala Ser 85

Ala Tyr Phe Cys Glu Asn Lys 100

Glu Leu Arg Arg Gin Arg Ser 115 _

Ser Gly Arg Tyr Gin Gly Leu 130 135

Ala Leu Pro Gly Leu Lys Leu 145 150

Ser Thr Leu Gly Leu Cys Leu 165

Ala Vai Ala Cys Phe Leu Lys 180

Pro Arg Ser Arg Pro Arg Gin 195

Ala Met Glu Ala Gly Ser Pro 210 215

Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro 225 230

Ala Vai Thr Pro Gly 245

<210 > 10 <211> 40 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Motivo que descreve o domínio de pseudo-repetição rica ci steína <221> VARIANTE <222> (1)...(2) <223> Cada Xaa é independentemente qualquer resíduo de aminoác excepto cisteína, ou está ausente. <221> VARIANTE <222> (4)...(4) <223> Xaa é qualquer resíduo de aminoácido excepto cisteína. em ido 115 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ <221> VARIANTE <222> (5)...(5) <223> Xaa é glutamina, ácido glutâmico ou lisina. <221> VARIANTE <222> (6)...(6) <223> Xaa é glutamina, ácido glutâmico, lisina, asparagina, arginina, ácido aspártico, histidina ou serina. <221> VARIANTE <222> (7)...(7) <223> Xaa é glutamina ou ácido glutâmico. <221> VARIANTE <222> (8)...(9) <223> Cada Xaa é independentemente qualquer resíduo de aminoácido excepto cisteína, ou está ausente. <221> VARIANTE <222> (10)...(11) <223> Xaa é tirosina, fenilalanina ou triptofano. <221> VARIANTE <222> (13)...(13) <223> Xaa é qualquer resíduo de aminoácido excepto cisteína. <221> VARIANTE <222> (16)...(17) <223> Cada Xaa é independentemente qualquer resíduo de aminoácido excepto cisteína. <221> VARIANTE <222> (19)...(19) <223> Xaa é isoleucina, metionina, leucina ou valina. <221> VARIANTE <222> (20)...(20) <223> Xaa é qualquer resíduo de aminoácido excepto cisteína. <221> VARIANTE <222> (22)...(24) <223> Cada Xaa é independentemente qualquer resíduo de aminoácido excepto cisteína. <221> VARIANTE <222> (26)...(31) <223> Cada Xaa é independentemente qualquer resíduo de aminoácido excepto cisteína. <221> VARIANTE <222> (32)...(33) <223> Cada Xaa é independentemente qualquer resíduo de aminoácido excepto cisteína, ou está ausente. <221> VARIANTE <222> (35)...(36) <223> Cada Xaa é independentemente qualquer resíduo de aminoácido excepto cisteína. <221> VARIANTE <222> (37)...(37) <223> Xaa é tirosina ou fenilalanina. 116 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ <221> VARIANTE <222> (39)...(40) <223> Cada Xaa é independentemente qualquer resíduo de aminoácido excepto cisteína, ou está ausente. <400> 10

Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Asp Xaa Leu Leu Xaa 1 5 10 15

Xaa Cys Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 20 25 30

Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa 35 40

<210> 11 <211> 360 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Sequência de oligonucleótidos degenerada que codifica para o polipéptido de SEQ ID NO: 4 <221> variação <222> (1)...(360) <223> Cada N é independentemente A, T, G ou C. <400> 11 atgwsnggny tnggnmgnws nmgnmgnggn ggnmgnwsnm gngtngayca rgargarmgn 60 tggwsnytnw sntgymgnaa rgarcarggn aarttytayg aycayytnyt nmgngaytgy 120 athwsntgyg cnwsnathtg yggncarcay ccnaarcart gygcntaytt ytgygaraay 180 aarytnmgnw snccngtnaa yytnccnccn garytnmgnm gncarmgnws nggngargtn 240 garaayaayw sngayaayws nggnmgntay carggnytng arcaymgngg nwsngargcn 300 wsnccngcny tnccnggnyt naarytnwsn gcngaycarg tngcnytngt ntaywsnacn 360 <210> 12 <211> 741

<212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sequência de oligonucleótidos degenerada que codifica para um polipéptido de SEQ ID NO:2 <221> variação <222> (1) . .. (741) <223> Cada N é independentemente A, T. G ou C. 117 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ < 4 Ο Ο > 12 atgwsnggny tnggnmgnws nmgnmgnggn ggnmgnwsnm gngtngayca rgargarmgn 60 tggwsnytnw sntgymgnaa rgarcarggn aarttytayg aycayytnyt nmgngaytgy 120 athwsntgyg cnwsnathtg yggncarcay ccnaarcart gygcntaytt ytgygaraay 180 aarytnmgnw snccngtnaa yytnccnccn garytnmgnm gncarmgnws nggngargtn 240 garaayaayw sngayaayws nggnmgntay carggnytng arcaymgngg nwsngargcn 300 wsnccngcny tnccnggnyt naarytrtwsn gcngaycarg tngcnytngt ntaywsnacn 360

ytnggnytnt gyytntgygc ngtnytntgy tgyttvvtng tngcngtngc ntgvttyytn 42Q aaraarmgng gngayccntg ywsntgycar ccnmgnwsnm gnccnmgnca rwsnccngcn 480 aarwsnwsnc argaycaygc natggargcn ggnwsnccng tnwsnacnws nccngarccn 540 gtngaracnt gywsnttytg yttyccngar tgymgngcnc cnacncarga rwsngcngtn 600 acnccnggna cnccngaycc nacntgygcn ggnmgntggg gntgycayac nmgnacnacn 660 gtnytncarc cntgyccnca yathccngay wsnggnytng gnathgtntg ygtnccngcn 720 cargarggng gnccnggngc n 741

<210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sinalizador FLAG <400> 13

Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5

<210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sinalizador Glu-Glu <400> 14

Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu 1 5

<210> 15 <211> 24 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido ZC19980 <400> 15 cgaagagcag tactgggatc ctct 24

<210> 16 <211> 23 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido ZC19981 118 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ <4 Ο Ο > 16 gccaaggcca ctgtctggga tgt 23

<210> 17 <211> 1149 <212> ADN <213> Homo sapiens <220>

<221> CDS <222> (236)...(1027) <400> 17 gaattcggca cgaggcagaa aggagaaaat tcaggataac tctcctgagg ggtgagccaa 60 gccctgccat gtagtgcacg caggacatca acaaacacag ataacaggaa atgatccatt 120 ccctgtggtc acttattcta aaggccccaa ccttcaaagt tcaagtagtg atatggatga 180 ctccacagaa agggagcagt cacgccttac ttcttgcctt aagaaaagag aagaa atg 238

Met aaa ctg aag gag tgt gtt tcc ate ctc cca cgg aag gaa age ccc 1 tct 286 Lys Leu Lys Glu Cys Vai Ser 11 e Leu Pro Arg Lys Glu Ser Pro Ser 5 10 15 gtc cga tcc tcc aaa gac gga aag ctg ctg gct gca acc ttg ctg ctg 334 Vai Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu Ala Ala Thr Leu Leu Leu 20 25 30 gca ctg ctg tct tgc tgc ctc acg gtg gtg tct ttc tac cag gtg gcc 382 Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Vai Vai Ser Phe Tyr Gin Vai Ala 35 40 45 gcc ctg caa ggg gac ctg gcc age ctc cgg gca gag ctg cag ggc cac 430 Ala Leu Gin Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ala Glu Leu Gin Gly Hi s 50 55 60 65 cac gcg gag aag ctg cca gca gga gca gga gcc ccc aag gcc ggc ctg 478 Hís Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly Ala Pro Lys Ala Gly Leu 70 75 80 gag gaa gct cca gct gtc acc gcg gga ctg aaa ate ttt gaa cca cca 526 Glu Glu Ala Pro Ala Vai Thr Ala Gly Leu Lys Ile Phe Glu Pro Pro 85 90 95 gct cca gga gaa ggc aac tcc agt cag aac age aga aat aag cgt gcc 574 Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gin Asn Ser Arg Asn Lys Arg Ala 100 105 110 119 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ gtt cag ggt cca gaa gaa aca gtc act caa gac tgc ttg caa ctg att 622 vai Gin Gly Pro Glu Glu Thr Vai Thr Gin Asp Cys Leu Gin Leu Ile 115 120 125 gca gac agt gaa aca cca act ata caa aaa gga tet tac aca ttt gtt 670 Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr lie Gin Lys Gly Ser Tyr Thr Phe Vai 130 135 140 145 cca tgg ctt ctc age ttt aaa agg gga agt gee cta gaa gaa aaa gag 718 Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys Glu 150 155 160 aat aaa ata ttg gtc aaa gaa act ggt tac ttt ttt ata tat ggt cag 766 Asn Lys Ile Leu Vai Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Gly Gin 165 170 175 gtt tta tat act gat aag acc tac gee atg gga cat cta att cag agg 814 Vai Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu Ile Gin Arg 180 185 190 aag aag gtc cat gtc ttt ggg gat gaa ttg agt ctg gtg act ttg ttt 862 Lys Lys Vai His Vai Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Vai Thr Leu Phe 195 200 205 cga tgt att caa aat atg cct gaa aca cta ccc aat aat tcc tgc tat 910 Arg Cys Ile Gin Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys Tyr 210 215 220 225 tca gct ggc att gca aaa ctg gaa gaa gga gat gaa ctc caa ctt gca 958 Ser Ala. Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gin Leu Ala 230 235 240 ata cca aga gaa aat gca caa ata tca ctg gat gga gat gtc aca ttt 1006 lie Pro Arg Glu Asn Ala Gin Ile Ser Leu Asp Gly Asp Vai Thr Phe 245 250 255 ttt ggt gca ttg aaa ctg ctg tgacctactt acaccatgtc tgtagctatt 1057 Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu 260 ttcctccctt tctctgtacc tctaagaaga aagaatctaa ctgaaaatac caaaaaaaaa 1117 aaaaaaaaaa aaaaaaccct cgagcggccg cc 1149

<210> 18 <211> 264 <212> PRT <213> Homo sapiens 120 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ <400> 18

Met Lys Leu Lys Glu Cys Vai Ser Ile Leu Pro Arg Lys Glu Ser Pro 1 5 10 15 Ser Vai Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu Ala Ala Thr Leu Leu 20 25 30 Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Vai Vai Ser Phe Tyr Gin Vai 35 40 45 Ala Ala Leu Gin Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg Ala Glu Leu Gin Gly 50 55 60 His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly Ala Pro Lys Ala Gly 65 70 75 80 Leu Glu Glu Ala Pro Ala Vai Thr Ala Gly Leu Lys 11 e Phe Glu Pro 85 90 95 Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gin Asn Ser Arg Asn Lys Arg 100 105 110 Ala Vai Gin Gly Pro Glu Glu Thr Vai Thr Gin Asp Cys Leu Gin Leu 115 120 125 Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gin Lys Gly Ser Tyr Thr Phe 130 135 140 Vai Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys 145 150 155 160 Glu Asn Lys Ile Leu Vai Lys Glu Thr Gly Tyr Phe Phe Ile Tyr Gly 165 170 175 Gin Vai Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met Gly His Leu Ile Gin 180 185 190 Arg Lys Lys Vai His Vai Phe Gly Asp Glu Leu Ser Leu Vai Thr Leu 195 200 205 Phe Arg Cys Ile Gin Asn Met Pro Glu Thr Leu Pro Asn Asn Ser Cys 210 215 220 Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly Asp Glu Leu Gin Leu 225 230 235 240 Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gin Ile Ser Leu Asp Gly Asp Vai Thr 245 250 255 Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu 260

<210 > 19 <211> 1430 <212> ADN <213> Mus musculus <2 2 0 >

<221> CDS <222> (102)...(848) 121 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ <400> 19 ttggcgcagg agcgtgcgta ggattgctcg ctcacaacag gcacctgact ggtattgaaa 60 gccgagtctt cccttcctct ttaaaggatt ggtgaccagg c atg gct atg gca ttc 116

Met Ala Met Ala Phe 1 5 tgc ccc aaa gat cag tac tgg gac tcc tca agg aaa tcc tgt gtc tcc Cys Pro Lys Asp Gin Tyr Trp Asp Ser Ser Arg Lys Ser Cys Vai Ser 10 15 20 tgt gca ctg acc tgc age cag agg age cag ege acc tgt aca gac ttc Cys Ala Leu Thr Cys Ser Gin Arg Ser Gin Arg Thr Cys Thr Asp Phe 25 30 35 tgc aaa ttc ate aat tgc cga aaa gag caa ggc agg tac tac gac cat Cys Lys Phe Ile Asn Cys Arg Lys Glu Gin Gly Arg Tyr Tyr Asp His 40 45 50 ctc ctg ggg gcc tgc gtc age tgt gac tcc acc tgc aca cag cac cct Leu Leu Gly Ala Cys Vai Ser Cys Asp Ser Thr Cys Thr Gin His Pro 55 60 65 cag cag tgt gcc cac ttc tgt gag aaa agg ccc aga age cag gcg aac Gin Gin Cys Ala His Phe Cys Glu Lys Arg Pro Arg Ser Gin Ala Asn 70 75 80 85 ctc cag ccc gag ctc ggg aga cca cag gcc ggg gag gtg gaa gtc agg Leu Gin Pro Glu Leu Gly Arg Pro Gin Ala Gly Glu Vai Glu Vai Arg 90 95 100 tca gac aac tca gga agg cac cag gga tet gag cat ggt cca gga ttg Ser Asp Asn Ser Gly Arg His Gin Gly Ser Glu His Gly Pro Gly Leu 105 110 115 agg cta agt age gac cag ctg act ctc tac tgc aca ctg ggg gtc tgc Arg Leu Ser Ser Asp Gin Leu Thr Leu Tyr Cys Thr Leu Gly Vai Cys 120 125 130 ctc tgc gcc ate ttc tgc tgt ttc ttg gtg gcc ttg gcc tcc ttc ctc Leu Cys Ala Ile Phe Cys Cys Phe Leu Vai Ala Leu Ala Ser Phe Leu 135 140 145 164 212 260 308 356 404 452 500 548 596 122 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ agg cgt aga gga gag cca cta ccc age cag cct gcc ggg cca cgt ggg Arg Arg Arg Gly Glu Pro Leu Pro Ser Gin Pro Ala Gly Pro Arg Gly 150 155 160 165 tca caa gca aac tct ccc cac gcc cac cgc ccc gtg aca gag gct tgc Ser Gin Ala Asn Ser Pro His Ala His Arg Pro Val Thr Glu Ala Cys 170 175 180 gac gag gtg acc gcg tca ccc cag cct gtg gaa acg tgt age ttc tgc Asp Glu Vai Thr Ala Ser Pro Gin Pro Vai Glu Thr Cys Ser Phe Cys 185 190 195 ttc ccg gag cgc agt tct ccc act cag gag age gcg ccg cgt teg ctc Phe Pro Glu Arg Ser Ser Pro Thr Gin Glu Ser Ala Pro Arg Ser Leu 200 205 210 ggg ata cac ggc ttc gcg ggc act gcc gcc ccg cag ccc tgt atg cgt Gly Ile His Gly Phe Ala Gly Thr Ala Ala Pro Gin Pro Cys Met Arg 215 220 225 gca aca gta ggc ggc ctg ggt gtc ctg cgc gca tcc act ggg gac gct Ala Thr Vai Gly Gly Leu Gly Vai Leu Arg Ala Ser Thr Gly Asp Ala 230 235 240 245 cgt ccg gca act tgacagcccg aaaaataaaa aagacaattt agaggatgga Arg Pro Ala Thr 644 692 740 788 836 888 gtgacagagg gggaaaggga tggagaagag acagatgaag acacgataaa ggaagcccgg ctgcacccac gcagagcaac aaagcaacca cctgcagcgc ccacgttccc agcaccgcct gtgcctgccg ctgtgtccta tactttccag agcagtcaac ctgtgccttt tttctttagt cgagaaagat ggagaatgac cggcacctag cattaccctt acaattctta caaacaagtg gtctttccta tggccttagg cagatagctg agtgcagtgt ggatgtattt gtgatttaag taacttgtat gtgtatgtgc agattcgggg ttatgtcata tgtgcatgta tacgtgagtt gtgtgtctgt atgagttgtg tgtatatgtg cgcctataaa tatgtgtgtg aattctgtgc atgcagatgt gtgtgtacat atgtgtctgg ctgatgtggt atagccagaa agatgagggc ccttctaggt gaaggccaaa catctaaaaa ccatctaggt gatgggtgct cgtgccgaat tc

<210> 20 <211> 249 <212> PRT <213> Mus musculus 948 1008 1068 1128 1188 1248 1308 1368 1428 1430 123 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ <4 Ο Ο > 20

Met Ala Met Ala Phe Cys Pro Lys Asp Gin Tyr Trp Asp Ser Ser Arg 1 5 10 15 Lys Ser Cys Vai Ser Cys Ala Leu Thr Cys Ser Gin Arg Ser Gin Arg 20 25 30 Thr Cys Thr Asp Phe Cys Lys Phe Ile Asn Cys Arg Lys Glu Gin Gly 35 40 45 Arg Tyr Tyr Asp His Leu Leu Gly Ala Cys Vai Ser Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Cys Thr Gin HiS Pro Gin Gin Cys Ala His Phe Cys Glu Lys Arg Pro 65 70 75 80 Arg Ser Gin Ala Asn Leu Gin Pro Glu Leu Gly Arg Pro Gin Ala Gly 85 90 95 Glu Vai Glu Vai Arg Ser Asp Asn Ser Gly Arg His Gin Gly Ser Glu 100 105 110 His Gly Pro Gly Leu Arg Leu Ser Ser Asp Gin Leu Thr Leu Tyr Cys 115 120 125 Thr Leu Gly Vai Cys Leu Cys Ala Ile Phe Cys Cys Phe Leu Vai Ala 130 135 140 Leu Ala Ser Phe Leu Arg Arg Arg Gly Glu Pro Leu Pro Ser Gin Pro 145 150 155 160 Ala Gly Pro Arg Gly Ser Gin Ala Asn Ser Pro His Ala His Arg Pro 165 170 175 Vai Thr Glu Ala Cys Asp Glu Vai Thr Ala Ser Pro Gin Pro Vai Glu 180 185 190 Thr Cys Ser Phe Cys Phe Pro Glu Arg Ser Ser Pro Thr Gin Glu Ser 195 200 205 Ala Pro Arg Ser Leu Gly Ile His Gly Phe Ala Gly Thr Ala Ala Pro 210 215 220 Gin Pro Cys Met Arg Ala Thr Vai Gly Gly Leu Gly Vai Leu Arg Ala 225 230 235 240 Ser Thr Gly Asp Ala Arg Pro Ala Thr 245

<210> 21 <211> 473 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sonda de Transferência de Northern <400> 21 ctgtggacgg gggtggctat gagatcctgc cccgaagagc agtactggga tcctctgctg 60 ggtacctgca tgtcctgcaa aaccatttgc aaccatcaga gccagcgcac ctgtgcagcc 120 ttctgcaggt cactcagctg ccgcaaggag caaggcaagt tctatgacca tctcctgagg 180 gactgcatca gctgtgcctc catctgtgga cagcacccta agcaatgtgc atacttctgt 240 gagaacaagc tcaggagccc agtgaacctt ccaccagagc tcaggagaca gcggagtgga 300 gaagttgaaa acaattcaga caactcggga aggtaccaag gattggagca cagaggctca 360 gaagcaagtc cagctctccc ggggctgaag ctgagtgcag atcaggtggc cctggtctac 420 agcacgctgg ggctctgcct gtgtgccgtc ctctgctgct tcctggtggc ggt 473 124 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

<210> 22 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 Ο > <223> ZC20061 <400> 22 ctgtggacag gggtggctat gagat 25

<210> 23 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 Ο > <223> Oligonucleótido ZC20062 <400> 23 accgccacca ggaagcacag aggac 25

<210> 24 <211> 256 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Sonda de Transferência de Northern <400> 24 tgcgattctc tggacctgtt tgggactgag cttaataatt tctttggcag ttttcgtgct . 60 aatgtttttg ctaaggaaga taagctctga accattaaag gacgagttta aaaacacagg 120 atcaggtctc ctgggcatgg ctaacattga cctggaaaag agcaggactg gtgatgaaat 180 tattcttccg agaggcctcg agtacacggt ggaagaatgc acctgtgaag actgcatcaa 240 gagcaaaccg aaggtc 256

<210> 25 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 O > <223> Oligonucleótido ZC21065 <400> 25 tgcgattctc tggacctgtt tg 22

<210> 26 <211> 22 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido ZC21067 <400> 26 gaccttcggt ttgctcttga tg 22 125 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ <210 > 27 <211 > 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido ZC24200 <400> 27 acactggggg tctgcctctg 20 <210 > 28 <211> 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido ZC24201 <400> 28 gcgaagccgt gtatccc 17 <210> 29 <211 > 17 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido ZC24198 <4 0 0 > 29 tctacagcac gctgggg 17 <210 > 30 <211 > 16 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido ZC24199 <400> 30 gcacaagtgg ggtcgg 16 <210 > 31 <211> 19 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido ZC24271 <400> 31 ttattgtaat gcaagtgtg 19 <210> 32 <211 > 17 <212> ADN <213> Sequência Artificial 126 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ <220> <223> Oligonucleótido ZC24272 <400> 32 tagctgggag tggaaag 17

<210> 33 <211> 20 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido ZC24495 <400> 33 tccaagcgtg accagttcag 20

<210> 34 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido ZC24496 <400> 34 agttggcttc tccatccc 18

<210> 35 <211> 1090 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 35 taactctcct gaggggtgag ccaagccctg ccatgtagtg cacgcaggac atcaacaaac 60 acagataaca ggaaatgatc cattccctgt ggtcacttat tctaaaggcc ccaaccttca 120 aagttcaagt agtgatatgg atgactccac agaaagggag cagtcacgcc ttacttcttg 180 ccttaagaaa agagaagaaa tgaaactgaa ggagtgtgtt tccatcctcc cacggaagga 240 aagcccctct gtccgatcct ccaaagacgg aaagctgctg gctgcaacct tgctgctggc 300 actgctgtct tgctgcctca cggtggtgtc tttctaccag gtggccgccc tgcaagggga 360 cctggccagc ctccgggcag agctgcaggg ccaccacgcg gagaagctgc cagcaggagc 420 aggagccccc aaggccggcc tggaggaagc tccagctgtc accgcgggac tgaaaatctt 480 tgaacçacca gctccaggag aaggcaactc cagtcagaac agcagaaata agcgtgccgt 540 tcagggtcca gaagaaacag tcactcaaga ctgcttgcaa ctgattgcag acagtgaaac 600 accaactata caaaaaggat cttacacatt tgttccatgg cttctcagct ttaaaagggg 660 aagtgcccta gaagaaaaag agaataaaat attggtcaaa gaaactggtt acttttttat 720 atatggtcag gttttatata ctgataagac ctacgccatg ggacatctaa ttcagaggaa 780 gaaggtccat gtctttgggg atgaattgag tctggtgact ttgtttcgat gtattcaaaa 840 tatgcctgaa acactaccca ataattcctg ctattcagct ggcattgcaa aactggaaga 900 aggagatgaa ctccaacttg caataccaag agaaaatgca caaatatcac tggatggaga 960 tgtcacattt tttggtgcat tgaaactgct gtgacctact tacaccatgt ctgtagctat 1020 tttcctccct ttctctgtac ctctaagaag aaagaatcta actgaaaata ccaaaaaaaa 1080 aaaaaaaaaa 1090

<210> 36 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial 127 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ <2 2 Ο > <223> Oligonucleótido <400> 36 cgcgcggttt aaacgccacc atggatgact ccaca 35

<210> 37 <211> 32 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido <400> 37 gtatacggcg cgcctcacag cagtttcaat gc 32

<210> 38 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido ZC17251 <400> 38 tctggacgtc ctcctgctgg tatag 25

<210> 39 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido ZC17252 <400> 39 ggtatggagc aaggggcaag ttggg 25

<210> 40 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido ZC17156 <400> 40 gagtggcaac ttccagggcc aggagag 27

<210> 41 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido ZC17157 <400> 41 cttttgctag cctcaaccct gactatc 27 128 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

<210> 42 <211> 813 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 42 ggcacagcac ggggcgatgg gcgcgtttcg ggccctgtgc ggcctggcgc tgctgtgcgc 60 gctcagcctg ggtcagcgcc ccaccggggg tcccgggtgc ggccctgggc gcctcctgct 120 tgggacggga acggacgcgc gctgctgccg ggttcacacg acgcgctgct gccgcgatta 180 cccgggcgag gagtgctgtt ccgagtggga ctgcatgtgt gtccagcctg aattccactg 240 cggagaccct tgctgcacga cctgccggca ccacccttgt cccccaggcc agggggtaca 300 gtcccagggg aaattcagtt ttggcttcca gtgtatcgac tgtgcctcgg ggaccttctc 360 cgggggccac gaaggccact gcaaaccttg gacagactgc acccagttcg ggtttctcac 420 tgtgttccct gggaacaaga cccacaacgc tgtgtgcgtc ccagggtccc cgccggcaga 480 gccgcttggg tggctgaccg tcgtcctcct ggccgtggcc gcctgcgtcc tcctcctgac 540 ctcggcccag cttggactgc acatctggca gctgaggagt cagtgcatgt ggccccgaga 600 gacccagctg ctgctggagg tgccgccgtc gaccgaagac gccagaagct gccagttccc 660 cgaggaagag cggggcgagc gatcggcaga ggagaagggg cggctgggag acctgtgggt 720 gtgagcctgg ctgtcctccg gggccaccga ccgcagccag cccctcccca ggagctcccc 780 aggccgcagg gctctgcgtt ctgctctggg ccg 813

<210> 43 <211> 44 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido ZC10,134 <400> 43 atcagcggaa ttcagatctt cagacaaaac tcacacatgc ccac 44

<210> 44 <211> 35 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido ZC10135 <400> 44 ggcagtctct agatcattta cccggagaca gggag 35 <210> 45

<211> 768 <212> ADN <213> Homo sapiens <2 2 0 > <221> CDS <222> (7) . .. (759) <223> Sequência de Fc de Ig 129 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ <400> 45 ggatcc atg aag cac ctg tgg ttc ttc ctc ctg ctg gtg gcg gct ccc 48

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Vai Ala Ala Pro 1 5 10 aga tgg gtc ctg tcc gag ccc aga tct tca gac aaa act cac aca tgc Arg Trp Vai Leu Ser Glu Pro Arg Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys 15 20 25 30 cca ccg tgc cca gca cct gaa gcc gag ggg gca ccg tca gtc ttc ctc Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Vai Phe Leu 35 40 45 ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc atg ate tcc cgg acc cct gag Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 50 55 60 130 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ gtc aca tgc gtg gtg gtg gac 9tg age cac gaa gac cct gag gtc aag 240 Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys 65 70 75 ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag gtg cat aat gcc aag aca aag 288 Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 80 85 90 ccg cgg gag gag cag tac aac age acg tac cgt gtg gtc age gtc ctc 336 Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 95 100 105 110 acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat ggc aag gag tac aag tgc aag 384 Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 115 120 125 gtc tcc aac aaa gcc ctc cca tcc tcc ate gag aaa acc ate tcc aaa 432 Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 130 135 140 gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag gtg tac acc ctg ccc cca tcc 480 Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 145 150 155 cgg gat gag ctg acc aag aac cag gtc age ctg acc tgc ctg gtc aaa 528 Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 160 165 170 ggc ttc tat ccc age gac ate gcc gtg gag tgg gag age aat ggg cag 576 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin 175 180 185 190 ccg gag aac aac tac aag acc acg cct ccc gtg ctg gac tcc gac ggc 624 pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 195 200 205 tcc ttc ttc ctc tac age aag ctc acc gtg gac aag age agg tgg cag 672 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin 210 215 220 cag ggg aac gtc ttc tea tgc tcc gtg atg cat gag gct ctg cac aac 720 Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 225 230 235 cac tac acg cag aag age ctc tcc ctg tet ccg ggt aaa taatetaga 768 His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 240 245 250

<210> 46 <211> 52 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido ZC15345 131 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ <400> 46 ccgtgcccag cacctgaagc cgagggggca ccgtcagtct tcctcttccc cc 52

<210> 47 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido ZC15347 <400> 47 ggattctaga ttttataccc ggagacaggg a 31 <210 > 48 <211 > 55 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido ZC15517 <400> 48 ggtggcggct cccagatggg tcctgtccga gcccagatct tcagacaaaa ctcac 55

<210> 49 <211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Oligonucleótido ZC15530 <400> 49 tgggagggct ttgttgga 18 <210 > 50 <211 > 42 <212> ADN Λ 00 \—1 CN1 V Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido ZC15518 <400> 50 tccaacaaag ccctcccatc ctccatcgag aaaaccatct cc 42 <210 > 51 <211> 57 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Oligonucleótido ZC15516 <400> 51 ggatggatcc atgaagcacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcggctc ccagatg 57 132 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ

<210> 52 <211> 59 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> iniciador oligonucleotidico <400> 52 ctcagccagg aaatccatgc cgagttgaga cgcttccgta gaatgagtgg cctgggccg 59

<210> 53 <211> 48 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico <400> 53 gcatgtgtga gttttgtctg aagatctggg ctccttcagc cccgggag 48

<210> 54 <211> 59 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico <400> 54 ctcagccagg aaatccatgc cgagttgaga cgcttccgta gaatgagtgg cctgggccg 59

<210> 55 <211> 59 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador oligonucleotidico <400> 55 gcacggtggg catgtgtgag ttttgtctga agatctgggc tccttcagcc ccgggagag 59

<210> 56 <211> 60 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Iniciador oligonucleotidico <400> 56 gcacagaggc tcagaagcaa gtccagctct cccggggctg aaggagccca gatcttcaga 60

<210> 57 <211> 56 <212> ADN <213> Sequência Artificial 133 ΕΡ 1 642 972/ΡΤ <220> <223> Iniciador oligonucleotídico <400> 57 ggggtgggta caaccccaga gctgttttaa tctagattat <210 > 58 <211> 59 <212> ADN <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Iniciador oligonucleotídico <400> 58 ctaacatgtc agcgttattg taatgcaagt gtgaccaatt <210 > 59 <211 > 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Péptido de anticorpo <400> 59 Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu i Gly Pro Glu 1 5 10 Ile Pro Arg Glu 20 <210 > 60 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <2 2 0 > <223> Péptido de anticorpo <400> 60 15

Ser Phe Lys Arg Gly Ser Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Glu Leu 1Vai Lys Glu Thr 20 10 15

Lisboa 2010-03-30

Claims

ΕΡ 1 642 972/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 10 para o fabrico de um medicamento para o tratamento de asma, bronquite, enfisema, nefrite, pielonefrite, neoplasmas renais, neuropatia de cadeia leve, amiloidose, Doença de Crohn ou inflamação associada a dor das articulações, inchaço ou choque séptico num mamífero.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polipéptido compreende os resíduos de aminoácido 34-66 de SEQ ID NO:6.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o referido polipéptido compreende os resíduos de aminoácido 71-104 de SEQ ID NO:6.
4. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1-3, em que o referido polipéptido está ligado a um segundo polipéptido através de uma ligação peptídica para formar uma proteína de fusão.
5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o segundo polipéptido é uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina.
6. Utilização de acordo com a reivindicação 5, em que a referida região constante da cadeia pesada de imunoglobulina é uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina humana.
7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que a referida região constante da cadeia pesada de imunoglobulina humana é uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina humana de IgGl.
8. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o segundo polipéptido é um fragmento Fc da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina, que contém dois domínios da região constante e não tem a região variável. ΕΡ 1 642 972/ΡΤ 2/3
9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o referido fragmento Fc é derivado de IgGl humana.
10. Utilização de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que o referido fragmento Fc é modificado de modo a remover a função de ligação ao receptor de Fc e a função de ligação ao complemento (Clq).
11. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 4-10, em que o referido medicamento compreende um multimero das referidas proteínas de fusão.
12. Polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID NO:10 para utilização no tratamento de asma, bronquite, enfisema, nefrite, pielonefrite, neoplasmas renais, neuropatia de cadeia leve, amiloidose, Doença de Crohn ou inflamação associada com dor das articulações, inchaço ou choque séptico num mamífero.
13. Polipéptido para utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o referido polipéptido compreende os resíduos de aminoácido 34-66 de SEQ ID NO:6.
14. Polipéptido para utilização de acordo com a reivindicação 12 ou 13, em que o referido polipéptido compreende os resíduos de aminoácido 71-104 de SEQ ID NO:6.
15. Polipéptido para utilização de acordo com as reivindicações 12-14, em que o referido polipéptido é ligado a um segundo polipéptido através de uma ligação peptídica para formar uma proteína de fusão.
16. Polipéptido para utilização de acordo com a reivindicação 15, em que o segundo polipéptido é uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina.
17. Polipéptido para utilização de acordo com a reivindicação 16, em que a referida região constante da cadeia pesada de imunoglobulina é uma região constante da cadeia pesada de uma imunoglobulina humana.
18. Polipéptido para utilização de acordo com a reivindicação 17, em que a referida região constante da cadeia ΕΡ 1 642 972/ΡΤ 3/3 pesada de imunoglobulina humana é uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina humana de IgGl.
19. Polipéptido para utilização de acordo com a reivindicação 15, em que o segundo polipéptido é um fragmento Fc da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina, que contém dois domínios de região constante e não tem a região variável.
20. Polipéptido para utilização de acordo com a reivindicação 19, em que o referido fragmento Fc é derivado de IgGl humana.
21. Polipéptido para utilização de acordo com a reivindicação 19 ou 20, em que o referido fragmento Fc é modificado de modo a remover a função de ligação ao receptor de Fc e a função de ligação ao complemento (Clq).
22. Polipéptido para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 15-21, em que o referido medicamento compreende um multímero das referidas proteínas de fusão. Lisboa, 2010-03-30