BR122019023685B1 - Anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a fel d1, molécula de ácido nucleico, composição farmacêutica e uso dos mesmos - Google Patents

Anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a fel d1, molécula de ácido nucleico, composição farmacêutica e uso dos mesmos Download PDF

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Abstract

A presente invenção refere-se a anticorpo que se ligam ao alérgeno de gato, Fel d1, composições compreendendo os anticorpos, ácidos nucleicos codificando os anticorpos e métodos de uso dos anticorpos. De acordo com certas modalidades da invenção, os anticorpos são anticorpos monoclonais integralmente humanos que se ligam à Fel d1. Os anticorpos da invenção são úteis para ligação ao alérgeno Fel d1 in vivo, desta maneira prevenindo ligação do alérgeno Fel d1 à IgE pré-formada na superfície de mastócitos ou basófilos. Ao fazer isso, os anticorpos agem para prevenir a liberação de histamina e outros mediadores inflamatórios a partir de mastócitos e/ou basófilos, desta maneira melhorando a resposta indevida ao alérgeno de gato em indivíduos sensibilizados. Os anticorpos da invenção podem ser também úteis para propósitos de diagnóstico para determinar se um paciente é alérgico ao alérgeno de gato Fel d1.

Description

Campo da Invenção
[001] A presente invenção refere-se a anticorpos humanos e fragmentos de ligação ao antígeno de anticorpos humanos que se ligam especificamente ao alérgeno de gato Fel d1, composições terapêuticas compreendendo os anticorpos e métodos de uso desses anticorpos.
Declaração da Técnica Relacionada
[002] A proteína Fel d1 é uma proteína de gato secretada, que pertence à família secretoglobina de proteínas heterodiméricas ligadas a dissulfeto pequenas encontradas apenas em mamíferos (Klug, J. e outros (2000), Ann. N.Y. Acad. Sci. 923:348-354). Ela é a principal causa de alergia a gatos em humanos (Platts-Mills, T.A. e outros (1997), J. Allergy Clin. Immunol. 100: S2-S24). Cerca de 90-95% de pacientes alérgicos a gatos têm uma resposta IgE à proteína Fel d1 (van Ree e outros (1999), J. Allergy Clin. Immunol. 104:1223-1230). Os sintomas em um paciente que sofre uma resposta alérgica à Fel d1 podem variar de rinite e conjuntivite leves a respostas asmáticas ameaçadoras à vida. Fel d1 é produzida por glândulas sebáceas e glândulas escamosas e células epiteliais escamosas e é transferida para a pele através de lambida e carinho (Bartholome, K. e outros (1985), J. Allergy Clin. Immunol. 76: 503-506; Charpin, C. e outros (1991), J. Allergy Clin. Immunol. 88: 77-82; Dabrowski, A.J. (1990) e outros, J. Allergy Clin. Immunol. 86: 462-465). Ela está também presente nas glândulas salivar, perianal e lacrimal (Andersen, M.C. e outros (1985), J. Allergy Clin. Immunol. 76: 563-569; van Milligen, F.J. (1992) e outros, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 92(4): 375-378) e os reservatórios principais parecem ser a pele e o pelo (Mata, P. e outros (1992), Ann. Allergy 69(4): 321-322).
[003] Fel d1 natural é uma glicoproteína heterodimérica de 18 kDa. Cada heterodímero compreende duas cadeias de polipeptídeo, que são covalentemente ligadas por três ligações dissulfeto intercadeia e que são codificadas por dois genes separados (Duffort, O.A. e outros (1991), Mol. Immunol. 28:301-309; Morgenstern, J.P. e outros (1991), PNAS 88: 9690-9694; Griffith, I.J. e outros (1992), Gene 113: 263-268; Kristensen, A.K. e outros (1997), Biol. Chem. 378: 899-908). A cadeia 1 compreende 70 resíduos de aminoácido e a cadeia 2 compreende cerca de 90-92 resíduos de aminoácido. Estruturalmente as duas cadeias são similares, mas têm apenas 10-15% de identidade de sequência (Kaiser, L. e outros (2003), J. Biol. Chem. 278(39): 37730-37735). Embora cada cadeia seja algumas vezes individualmente referida como Fel d1, ambas as cadeias são necessárias para o alérgeno de proteína inteiro.
[004] A proteína Fel d1 é de uma função desconhecida para o animal, mas causa uma reação IgG ou IgE em humanos sensíveis (ou como uma resposta alérgica ou asmática). Embora outros alérgenos de gato sejam conhecidos, incluindo Fel d2 (albumina) e Fel d3 (cistatina), 60% a 90% da IgE antigato produzida são direcionados contra Fel d1 (Leitermann, K. e outros (1984), J. Allergy Clin. Immunol. 74: 147-153; Lowenstein, H. e outros (1985), Allergy 40: 430-441; van Ree, R. e outros (1999), J. Allergy Clin Immunol. 104: 1223-1230; Ichikawa, K. e outros (2011), Clin. Exp. Allergy, 31: 1279-1286).
[005] A imunoglobulina E (IgE) é responsável pela hipersensibilidade tipo 1, que se manifesta em rinite alérgica, conjuntivite alérgica, febre do feno, asma alérgica, alergia a veneno de abelha e alergias alimentares. IgE circula no sangue e se liga a receptores FcεR1α de alta afinidade para IgE em basófilos e mastócitos. Na maioria das respostas alérgicas, os alérgenos entram no corpo através de inalação, ingestão ou através da pele. O alérgeno então se liga à IgE pré-formada já ligada ao receptor de alta afinidade nas superfícies de mastócitos e basófilos, resultando em ligação cruzada de várias moléculas de IgE e disparo da liberação de histamina e outros mediadores inflamatórios causando os vários sintomas alérgicos.
[006] O tratamento para alergias inclui esteroides para supressão da atividade imune e broncodilatadores para alívio de sintomas da asma. Terapia de dessensibilização é também usada para pacientes severamente alérgicos. Combinações de vacina de peptídeo foram testadas para dessensibilização de indivíduos para alérgenos particulares, por exemplo, Fel d1 (vide US2010/0239599A1 e EP2380591A2). Anticorpos foram propostos como um tratamento para alergias, uma vez que eles podem ser capazes de bloquear a entrada de moléculas alergênicas nos tecidos de mucosas, ou podem se ligar ao alérgeno antes dele ter a oportunidade de se ligar à IgE ligada ao receptor de alta afinidade em mastócitos ou basófilos, desta maneira prevenindo a liberação de histamina e outros mediadores inflamatórios a partir dessas células.
[007] A Patente U.S. número 5.670.626 descreve o uso de anticorpos monoclonais para o tratamento de doenças alérgicas mediadas por IgE tais como rinite alérgica, asma alérgica e conjuntivite alérgica através do bloqueio da ligação de alérgenos ao tecido de mucosa. A Patente U.S. número 6.849.259 descreve o uso de anticorpos específicos de alérgeno para inibir inflamação alérgica em um modelo de alergia de camundongo in vivo. Sistemas de anticorpo baseados em leite e baseados em ovo foram descritos. Por exemplo, a US20030003133A1 revela uso de leite como um carreador para alérgenos para indução de tolerância oral à caspa de gato e outros alérgenos. Composições e métodos para redução de uma resposta alérgica em um animal a um alérgeno no ambiente através do uso de uma molécula que inibe a habilidade do alérgeno em se ligar a mastócitos foram descritos na US2010/0143266. Outros anticorpos para Fel d1 foram descritos por Groot e outros (de Groot e outros (1988), J. Allergy Clin. Immunol. 82:778-786).
Breve Sumário da Invenção
[008] A invenção provê anticorpos monoclonais integralmente humanos (mAbs) e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente ao alérgeno de gato, Fel d1. Tais anticorpos podem ser úteis para se ligarem ao alérgeno Fel d1 in vivo seguindo exposição de um paciente sensibilizado ao alérgeno do gato e, desta maneira, podem agir para ou promover eliminação de Fel d1 ou bloquear a ligação do alérgeno à IgE pré-formada na superfície de mastócitos ou basófilos. Ao fazer isso, os anticorpos da invenção podem prevenir a liberação de histamina ou outros mediadores inflamatórios de mastócitos ou basófilos, desta maneira prevenindo ou diminuindo os efeitos indesejáveis observados em pacientes sensibilizados ao alérgeno de gato. Em certas modalidades, os anticorpos podem ser capazes de reduzir, minimizar ou prevenir pelo menos um sintoma em um paciente sensível ao alérgeno de gato Fel d1, tais como espirros, congestão, bloqueio nasal, tosse, chiado no peito, broncoconstrição, rinite ou conjuntivite. Em certas modalidades, os anticorpos podem ser capazes de prevenir complicações in vivo ainda mais sérias associadas com exposição ao alérgeno do gato em indivíduos sensibilizados, tais como respostas asmáticas, anafilaxia e até mesmo morte.
[009] Os anticorpos da invenção podem ser de comprimento integral (por exemplo, um anticorpo IgG1 ou IgG4) ou podem compreender apenas uma porção de ligação ao antígeno (por exemplo, um fragmento Fab, F(ab’)2 ou scFv) e podem ser modificados para afetar funcionalidade, por exemplo, eliminar funções efetoras residuais (Reddy e outros (2000), J. Immunol. 164:1925-1933).
[0010] Um primeiro aspecto da invenção provê um anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1.
[0011] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um isótipo que não um isótipo IgA.
[0012] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo tem um isótipo selecionado do grupo consistindo em uma IgG1, uma IgG2 e uma IgG4.
[0013] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente à Fel d1 com uma KD igual a ou menos do que 10-6 M. Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente à Fel d1 com uma KD igual a ou menos do que 1,8 nM.
[0014] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende três CDRs de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências de região variável de cadeia pesada (HCVR) (Heavy Chain Variable Region) selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 e 460; e as três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências de região variável de cadeia leve (LCVR) (Light Chain Variable Region) selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 e 468. Métodos e técnicas para identificação de CDRs dentro de sequências de aminoácido de HCVR e LCVR são bem conhecidos na técnica e podem ser usados para identificar CDRs dentro das sequências de aminoácido de HCVR e/ou LCVR reveladas aqui. Convenções exemplares que podem ser usadas para identificar os limites de CDRs incluem, por exemplo, a definição Kabat, a definição Chothia e a definição AbM. Em termos gerais, a definição Kabat é baseada em variabilidade de sequência, a definição Chothia é baseada na localização das regiões de alça estruturais e a definição de AbM é uma combinação entre as abordagens Kabat e Chothia. Vide, por exemplo, Kabat "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991); Al-Lazikani e outros (1997), J. Mol. Biol. 273: 927-948; e Martin e outros (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9268-9272. Bancos de dados públicos estão também disponíveis para identificação de sequências de CDR dentro de um anticorpo.
[0015] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende as três CDRs de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências de região variável de cadeia pesada (HCVR) selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18, 66, 130, 242, 306, 322, 370 e 460; e as três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas dentro de qualquer uma das sequências de região variável de cadeia leve (LCVR) selecionadas do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 e 468.
[0016] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 e 460.
[0017] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendem uma HCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 e 460.
[0018] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma LCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 e 468.
[0019] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende uma LCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 e 468.
[0020] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma HCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 e 460; e (b) uma LCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 e 468.
[0021] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (a) uma HCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 e 460; e (b) uma LCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 e 468.
[0022] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio de HCDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372 e 462; um domínio de HCDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374 e 464; um domínio de HCDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376 e 466; um domínio de LCDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380 e 470; um domínio de LCDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382 e 472; e um domínio de LCDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384 e 474.
[0023] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: um domínio de HCDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 20, 68, 132, 164, 244, 308, 324, 372 e 462; um domínio de HCDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 22, 70, 134, 166, 246, 310, 326, 374 e 464; um domínio de HCDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 24, 72, 136, 168, 248, 312, 328, 376 e 466; um domínio de LCDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 28, 76, 140, 172, 252, 316, 332, 380 e 470; um domínio de LCDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 30, 78, 142, 174, 254, 318, 334, 382 e 472; e um domínio de LCDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 32, 80, 144, 176, 256, 320, 336, 384 e 474.
[0024] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378 e 460/468.
[0025] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 e 460/468.
[0026] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18/26, 66/74, 130/18 e 162/170.
[0027] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende o par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18/26 e 322/330.
[0028] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende o par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18/26 e 306/314.
[0029] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18/26 e 370/378.
[0030] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende o par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 242/250 e 306/314.
[0031] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende o par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 242/250 e 322/330.
[0032] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1 interage com pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em resíduos de aminoácido variando mais ou menos da posição 15 até mais ou menos a posição 24 de SEQ ID NO: 396; os resíduos de aminoácido variando mais ou menos da posição 85 até mais ou menos a posição 103 da SEQ ID NO: 396; e resíduos de aminoácido variando mais ou menos da posição 85 até mais ou menos a posição 104 de SEQ ID NO: 396; e resíduos de aminoácido variando mais ou menos da posição 113 até mais ou menos a posição 116 de SEQ ID NO: 396.
[0033] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 interage com resíduos de aminoácido variando mais ou menos da posição 15 até mais ou menos a posição 24 de SEQ ID NO: 396.
[0034] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 interage com resíduos de aminoácido variando mais ou menos da posição 85 até mais ou menos a posição 103 de SEQ ID NO: 396.
[0035] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 interage com resíduos de aminoácido variando mais ou menos da posição 85 até mais ou menos a posição 104 de SEQ ID NO: 396.
[0036] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 interage com resíduos de aminoácido variando mais ou menos da posição 113 até mais ou menos a posição 116 de SEQ ID NO: 396.
[0037] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 interage com pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 402, 403, 404 e 412.
[0038] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 interage com SEQ ID NO: 402.
[0039] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 interage com SEQ ID NO: 403.
[0040] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 interage com SEQ ID NO: 404.
[0041] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 interage com SEQ ID NO: 426.
[0042] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 interage com SEQ ID NO: 412.
[0043] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que interage com SEQ ID NOs: 402, 403, 404 e/ou 426 compreende as três HCDRs contidas na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 18 e as três LCDRs contidas na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 26.
[0044] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que interage com SEQ ID NOs: 402, 403, 404 e/ou 426 compreende uma HCDR1 de SEQ ID NO: 20; uma HCDR2 de SEQ ID NO: 22; uma HCDR3 de SEQ ID NO: 24; uma LCDR1 de SEQ ID NO: 28; uma LCDR2 de SEQ ID NO: 30 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 32.
[0045] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que interage com SEQ ID NO: 412 compreende as três HCDRs contidas na região variável de cadeia pesada de SEQ ID NO: 36 e as três LCDRs contidas na região variável de cadeia leve de SEQ ID NO: 314.
[0046] Em uma modalidade, o anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que interage com SEQ ID NO: 412 compreende uma HCDR1 de SEQ ID NO: 308; uma HDCR2 de SEQ ID NO: 310; uma HCDR3 de SEQ ID NO: 312; uma LCDR1 de SEQ ID NO: 316; uma LCDR2 de SEQ ID NO: 318 e uma LCDR3 de SEQ ID NO: 320.
[0047] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende as sequências de aminoácido de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 20, 22 e 24, respectivamente, e sequências de aminoácido de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 28, 30 e 32, respectivamente.
[0048] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende as sequências de aminoácido de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 68, 70 e 72, respectivamente, e sequências de aminoácido de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 76, 78 e 80, respectivamente.
[0049] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende as sequências de aminoácido de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 132, 134 e 136, respectivamente, e sequências de aminoácido de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 140, 142 e 144, respectivamente.
[0050] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende as sequências de aminoácido de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 164, 166 e 168, respectivamente, e sequências de aminoácido de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 172, 174 e 176, respectivamente.
[0051] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende as sequências de aminoácido de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 244, 246 e 248, respectivamente, e sequências de aminoácido de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 252, 254 e 256, respectivamente.
[0052] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende as sequências de aminoácido de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 308, 310 e 312, respectivamente, e sequências de aminoácido de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 316, 318 e 320, respectivamente.
[0053] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende as sequências de aminoácido de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 324, 326 e 328, respectivamente, e sequências de aminoácido de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 332, 334 e 336, respectivamente.
[0054] Em uma modalidade, o anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende as sequências de aminoácido de HCDR1, HCDR2 e HCDR3 de SEQ ID NOs: 372, 374 e 376, respectivamente, e sequências de aminoácido de LCDR1, LCDR2 e LCDR3 de SEQ ID NOs: 380, 382 e 384, respectivamente.
[0055] Em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo monoclonal totalmente humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1, onde o anticorpo ou fragmento do mesmo exibe uma ou mais das características que seguem: (i) compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 e 460, ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (ii) compreende uma LCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 e 468, ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, de identidade de sequência; (iii) compreende um domínio de HCDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 24, 72, 136, 168, 248, 312, 328, 376 e 466 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, de identidade de sequência; e um domínio de LCDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 32, 80, 144, 176, 256, 320, 336, 384 e 474, ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, de identidade de sequência; (iv) compreende um domínio de HCDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 20, 68, 132, 164, 244, 308, 324, 372 e 462, ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, de identidade de sequência; um domínio de HCDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 22, 70, 134, 166, 246, 310, 326, 374 e 464, ou uma sequência do mesmo substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, de identidade de sequência; um domínio de LCDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 28, 76, 140, 172, 252, 316, 332, 380 e 470, ou uma sequência do mesmo substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, de identidade de sequência; e um domínio de LCDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 30, 78, 142, 174, 254, 318, 334, 382 e 472, ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, de identidade de sequência; (v) se liga à Fel d1 com uma KD igual a ou menos do que 10-6 e preferivelmente igual a ou menos do que 10-9; (vi) demonstra eficácia em pelo menos um modelo animal de anafilaxia ou inflamação; ou (vii) compete com um anticorpo de referência para ligação a Fel d1.
[0056] Em uma modalidade, um "anticorpo de referência" pode incluir, por exemplo, anticorpos tendo uma combinação de pares de aminoácido de cadeia pesada e cadeia leve selecionados do grupo consistindo em 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 e 460/468.
[0057] Em uma modalidade, o anticorpo monoclonal integralmente humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à Fel d1 compreende uma sequência de HCDR1 compreendendo a fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO:386) onde X1 é Gly, X2 é Phe, Tyr ou Gly, X3 é Thr ou Ser, X4 é Phe ou Ile, X5 é Ser, Arg, Thr ou Asn, X6 é Asn, Thr, Asp ou Ser, X7 é Tyr e X8 é Asn, Tyr ou Ala; uma sequência de HCDR2 compreendendo a fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO: 387), onde X1 é Ile, X2 é Tyr, Ser ou Asn, X3 é Tyr, Ser, Gly, Pro ou Asp, X4 é Asp, Arg ou Ser, X5 é Gly, Val ou Ser, X6 é Ser, Gly, Arg ou Tyr, X7 é Tyr, Arg, Thr, Ser ou Asn e X8 é Ile, Thr, Ala, Ser ou ausente; uma sequência de HCDR3 compreendendo a fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 - X10 - X11 - X12 - X13 - X14 - X15 - X16 (SEQ ID NO: 388), onde X1 é Ala, X2 é Lys ou Arg, X3 é Arg, Gly, His, Ser, Asp, Leu ou Thr, X4 é Thr, Pro, Arg, Gly ou Glu, X5 é Leu, Val, Gly, Lys, Tyr ou Asn, X6 é Ser, Arg, Thr, Ala, Tyr, Phe ou Trp, X7 é Tyr, Gly, Arg, Ala, Asn, Asp, His ou Asn, X8 é Tyr, Thr, Ser ou His, X9 é Val, Ser, Ala, Phe, Pro ou ausente, X10 é Met, Gly, Asp, Pro, Val ou ausente, X11 é Asp, Tyr, Ser, Gly, Phe ou ausente, X12 é Val, Asp, Phe ou ausente, X13 é Phe, Asp ou ausente, X14 é Phe, Tyr ou ausente, X15 é Asp ou ausente, X16 é Tyr ou ausente; uma sequência de LCDR1 compreendendo a fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 - X10 - X11 - X12 (SEQ ID NO: 389), onde X1 é Gln, X2 é Gly, Ser ou Asp, X3 é Ile ou Val, X4 é Ser, Leu, Asn ou Gly, X5 é Asn, Tyr, Gly ou Ser, X6é Tyr, Ser, Phe ou Trp, X7 é Ser ou ausente, X8 é Asn ou ausente, X9 é Asn ou ausente, X10 é Lys ou ausente, X11 é Gln ou ausente, X12 é Tyr ou ausente; uma sequência de LCDR2 compreendendo a fórmula X1 - X2 - X3 (SEQ ID NO: 390), onde X1 é Ala, Trp, Asp, Tyr, Lys, Gly ou Ser, X2 é Ala ou Thr e X3 é Ser; e uma sequência de LCDR3 compreendendo a fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 (SEQ ID NO: 391), onde X1 é Gln, Leu ou His, X2 é Lys, Gln ou His, X3 é Tyr, Ser ou Leu, X4 é Tyr, Asn, Gly, Asp ou Ser, X5 é Ser, Asp ou Asn, X6é Leu, Ala, Tyr, Thr ou Phe, X7 é Pro ou Arg, X8 é Leu, Phe, Tyr ou Thr e X9 é Thr ou ausente.
[0058] Em uma modalidade, a invenção refere-se a um anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno específico para Fel d1 compreendendo uma HCVR codificada por segmentos de sequência de nucleotídeo derivados de sequências de linhagem germinativa VH, DH e JH e uma LCVR codificada por segmentos de sequência de nucleotídeo derivados de sequências de linhagem germinativa VK e JK, com combinações conforme mostrado na Tabela 2.
[0059] A invenção compreende anticorpos tendo um padrão de glicosilação modificado. Em algumas aplicações, modificação para remover sítios de glicosilação indesejáveis pode ser útil, ou, por exemplo, remoção de uma porção fucose para aumentar a função de citotoxidez celular dependente de anticorpo (ADCC) (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity) (vide Shield e outros (2002) JBC 277:26733). Em outras aplicações, modificação de galactosilação pode ser feita a fim de modificar citotoxidez dependente de complemento (CDC) (Complement Dependent Cytotoxicity).
[0060] Um segundo aspecto provê um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compete para ligação específica à Fel d1 com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo as regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de uma região variável de cadeia pesada (HCVR), onde a HCVR tem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 e 460; e as CDRs de uma região variável de cadeia leve (LCVR), onde a LCVR tem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 e 468.
[0061] Uma modalidade provê um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compete para ligação específica à Fel d1 com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendendo a região de determinação de complementaridade (CDRs) de uma região variável de cadeia pesada (HCVR), onde a HCVR tem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 e 460; e as CDRs de uma região variável de cadeia leve (LCVR), onde a LCVR tem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 e 468.
[0062] Em uma modalidade relacionada, a invenção provê um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compete por ligação específica à Fel d1 com um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo as CDRs de cadeias pesada e leve contidas dentro dos pares de sequência de cadeias pesada e leve selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 e 460/468.
[0063] Um terceiro aspecto provê um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao mesmo epítopo em Fel d1 que um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo as regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de uma região variável de cadeia pesada (HCVR), onde a HCVR tem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 e 460; e as CDRs de uma região variável de cadeia leve (LCVR), onde a LCVR tem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 e 468.
[0064] Uma modalidade provê um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao mesmo epítopo em Fel d1 que um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo as regiões de determinação de complementaridade (CDRs) de uma região variável de cadeia pesada (HCVR), onde a HCVR tem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 e 460; e as CDRs de uma região variável de cadeia leve (LCVR), onde a LCVR tem uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 e 468.
[0065] Em uma modalidade relacionada, a invenção provê um anticorpo isolado ou fragmento de ligação ao antígeno que se liga ao mesmo epítopo em Fel d1 que um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno compreendendo as CDRs de cadeias pesada e leve contidas dentro dos pares de sequência de cadeias pesada e leve selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 e 460/468.
[0066] Um quarto aspecto provê uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que se liga especificamente à Fel d1, que compreende dois domínios de ligação ao antígeno (dois braços) que compreendem uma sequência de aminoácido de HCVR e uma sequência de aminoácido de LCVR de quaisquer dois ou mais anticorpos descritos aqui.
[0067] Em uma modalidade, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma sequência de aminoácido de HCVR conforme mostrado na SEQ ID NO:370 e uma sequência de aminoácido de LCVR conforme mostrado na SEQ ID NO:378 e um segundo domínio de ligação ao antígeno que compreende uma sequência de aminoácido de HCVR conforme mostrado na SEQ ID NO: 18 e uma sequência de aminoácido de LCVR conforme mostrado na SEQ ID NO: 378.
[0068] Em uma modalidade, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende três regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) consistindo nas sequências de aminoácido conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 372, 374 e 376, respectivamente, e três regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) consistindo nas sequências de aminoácido conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 380, 382 e 384, respectivamente; e onde o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende três regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) consistindo nas sequências de aminoácido conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 20, 22 e 24, respectivamente, e três regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) consistindo nas sequências de aminoácido conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 380, 382 e 384, respectivamente.
[0069] Em uma modalidade, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma sequência de aminoácido de HCVR conforme mostrado na SEQ ID NO: 306 e uma sequência de aminoácido de LCVR conforme mostrado na SEQ ID NO: 314 e um segundo domínio de ligação ao antígeno que compreende uma sequência de aminoácido de HCVR conforme mostrado na SEQ ID NO: 18 e uma sequência de aminoácido de LCVR conforme mostrado na SEQ ID NO: 314.
[0070] Em uma modalidade, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende três regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) consistindo nas sequências de aminoácido conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 308, 310 e 312, respectivamente, e três regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) consistindo nas sequências de aminoácido conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 316, 318 e 320, respectivamente; e onde o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende três regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) consistindo nas sequências de aminoácido conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 20, 22 e 24, respectivamente, e três regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) consistindo nas sequências de aminoácido conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 316, 318 e 320, respectivamente.
[0071] Em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo isolado específico para Fel d1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que compete para ligação à Fel d1 com qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção.
[0072] Em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo isolado específico para Fel d1 ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga ao mesmo epítopo em Fel d1 como qualquer uma das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção.
[0073] Em uma modalidade, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é um anticorpo monoclonal humano isolado que se liga especificamente à Fel d1.
[0074] Em uma modalidade, a molécula de ligação ao antígeno biespecífica é um anticorpo monoclonal humano isolado que se liga especificamente à Fel d1, onde o anticorpo monoclonal humano é um anticorpo monoespecífico ou um anticorpo biespecífico.
[0075] Em uma modalidade, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica conforme aqui descrito e um carreador ou diluente farmaceuticamente aceitável.
[0076] Em uma modalidade, a invenção provê um método para tratamento de um paciente que demonstra uma sensibilidade a, ou uma reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, pelo de gato ou um extrato do mesmo, ou à proteína Fel d1, ou para tratamento de pelo menos um sintoma ou complicação associado com uma sensibilidade a, ou uma reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, pelo de gato ou um extrato do mesmo, ou à proteína Fel d1, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de uma ou mais das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, ou uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de uma ou mais moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção, a um paciente com necessidade do mesmo, onde o paciente demonstra uma sensibilidade reduzida a, ou uma reação alérgica diminuída contra, um gato, caspa de gato, pelo de gato ou um extrato do mesmo, ou à proteína Fel d1, ou não sofre nenhuma sensibilidade a, ou reação alérgica a um, gato, caspa de gato, pelo de gato ou um extrato do mesmo, ou à proteína Fel d1, ou onde o paciente demonstra uma redução em pelo menos um sintoma ou complicação associado com uma sensibilidade a, ou uma reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, pelo de gato ou um extrato do mesmo, ou à proteína Fel d1, ou uma redução na frequência e/ou duração de pelo menos um sintoma ou complicação associado com uma sensibilidade a, ou uma reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, pelo de gato ou um extrato do mesmo, ou à proteína Fel d1 seguindo administração das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas ou uma composição compreendendo as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção.
[0077] Em uma modalidade, a invenção provê administração de uma quantidade eficaz de um segundo agente terapêutico junto com pelo menos uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção útil para diminuição de uma reação alérgica a um gato, caspa de gato ou à proteína Fel d1. O segundo agente terapêutico pode ser selecionado do grupo consistindo em um corticosteroide, um broncodilatador, uma anti-histamina, epinefrina, um descongestionante, um corticosteroide, outro anticorpo diferente para Fel d1 e uma vacina de peptídeo.
[0078] Em uma modalidade, o tratamento com uma ou mais moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da invenção sozinhas, ou em combinação com um segundo agente terapêutico, pode resultar em uma redução em rinite alérgica, conjuntivite alérgica, asma alérgica ou uma resposta anafilática seguindo exposição do paciente a um gato, caspa de gato ou à proteína Fel d1.
[0079] Em um quinto aspecto, a invenção provê moléculas de ácido nucleico codificando anticorpos para Fel 1d ou fragmentos dos mesmos. Vetores de expressão recombinantes carregando os ácidos nucleicos da invenção, e células hospedeiro nas quais tais vetores foram introduzidos, são também compreendidos pela invenção, bem como métodos de produção dos anticorpos através de cultura das células hospedeiro sob condições que permitem a produção dos anticorpos, e recuperação dos anticorpos produzidos.
[0080] Em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo ou fragmento do mesmo compreendendo uma HCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369 e 459 ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%, de homologia com a mesma.
[0081] Em uma modalidade, a HCVR é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 17, 65, 129, 161, 241, 305, 321, 369 e 459.
[0082] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo compreende ainda uma LCVR codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233 ,249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377 e 467 ou uma sequência substancialmente idêntica tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia com a mesma.
[0083] Em uma modalidade, a LCVR é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 25, 73, 137, 169, 249, 313, 329, 377 e 467.
[0084] Em uma modalidade, a invenção também provê um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreendendo um domínio de HCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375 e 465, ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de LCDR3 codificado por uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191, 207, 223, 239, 255, 271, 287, 303, 319, 335, 351, 367, 383 e 473, ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0085] Em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo ou fragmento do mesmo compreendendo ainda um domínio de HCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371 e 461, ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de HCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373 e 463 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de LCDR1 codificado por uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 11, 27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251, 267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379 e 469 ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de LCDR2 codificado por uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61, 77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381 e 471 ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência.
[0086] Um sexto aspecto provê uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais anticorpos humanos isolados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente à Fel d1, junto com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0087] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de dois ou mais anticorpos humanos isolados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente à Fel d1 junto com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[0088] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende: um primeiro anticorpo monoclonal integralmente humano isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, que compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO: 18; e uma LCVR tendo uma sequência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO: 26; um segundo anticorpo monoclonal integralmente humano isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, que compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 66, 130, 162, 306, 322, 370 e 460; e uma LCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 74, 138, 170, 314, 330, 378 e 468.
[0089] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende: um primeiro anticorpo monoclonal integralmente humano isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, que compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO: 242; e uma LCVR tendo uma sequência de aminoácido conforme mostrado na SEQ ID NO: 250; e um segundo anticorpo monoclonal integralmente humano isolado, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, que compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 306, 322 e 460; e uma LCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 314, 330 e 468.
[0090] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende: um primeiro anticorpo monoclonal integralmente humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo em SEQ ID NOs: 18/26; e um segundo anticorpo monoclonal integralmente humano isolado ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 66/74, 130/138, 162/170, 306/314, 322/330, 307/378 e 460/468.
[0091] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende: um primeiro anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo em SEQ ID NOs:18/26; e um segundo anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo nas SEQ ID NOs: 130/138.
[0092] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende: um primeiro anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo em SEQ ID NOs: 18/26; e um segundo anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo em SEQ ID NOs: 322/330.
[0093] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende: um primeiro anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo em SEQ ID NOs: 18/26; e um segundo anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo em SEQ ID NOs: 306/314.
[0094] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende: um primeiro anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo em SEQ ID NOs: 18/26; e um segundo anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo em SEQ ID NOs: 370/378.
[0095] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende: um primeiro anticorpo monoclonal integralmente humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo em SEQ ID NOs: 242/250; um segundo anticorpo monoclonal integralmente humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo em SEQ ID NOs: 306/314 e 322/330.
[0096] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende: um primeiro anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo em SEQ ID NOs: 242/250; e um segundo anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo em SEQ ID NOs: 306/314.
[0097] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende: um primeiro anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo em SEQ ID NOs: 242/250; e um segundo anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente à Fel d1, compreendendo um par de sequência de aminoácido HCVR/LCVR consistindo em SEQ ID NOs: 322/330.
[0098] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende dois ou mais anticorpos monoclonais humanos isolados que se ligam especificamente à Fel d1, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, compreendendo pares de sequência de aminoácido HCVR/LCVR selecionados do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 e 460/468.
[0099] Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende quatro anticorpos monoclonais humanos isolados que se ligam especificamente à Fel d1, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, onde os anticorpos humanos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos compreendem os pares de sequência de aminoácido HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 18/26, 66/74, 130/138 e 162/170.
[00100] Em uma modalidade, a invenção refere-se a uma composição, que é uma combinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um ou mais anticorpos anti-Fel d1 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da invenção e uma quantidade terapeuticamente eficaz de um segundo agente terapêutico.
[00101] O segundo agente terapêutico pode ser um fármaco de molécula pequena, uma proteína/polipeptídeo, um anticorpo, uma molécula de ácido nucleico, tal como uma molécula de antissenso, ou um siRNA. O segundo agente terapêutico pode ser sintético ou naturalmente derivado.
[00102] O segundo agente terapêutico pode ser qualquer agente que seja vantajosamente combinado com um anticorpo ou fragmento do mesmo da invenção, por exemplo, um segundo anticorpo que não aqueles descritos aqui que seja capaz de bloquear a ligação de Fel d1 à IgE presente em mastócitos ou basófilos. Um segundo agente terapêutico pode ser também qualquer agente que seja usado como um padrão de cuidado em tratamento de resposta alérgica a qualquer alérgeno. Tal segundo agente terapêutico pode ser uma anti-histamina, epinefrina, um descongestionante, um corticosteroide ou uma vacina de peptídeo.
[00103] Em certas modalidades, o segundo agente terapêutico pode ser um agente que ajuda a combater ou reduzir qualquer possível efeito(s) colateral associado com o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da invenção, se tal efeito(s) colateral ocorrer.
[00104] Será também compreendido que os anticorpos e composições farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção podem ser empregados em terapias de combinação, isto é, os anticorpos e composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser administrados concomitantemente com, antes de ou subsequente a um ou mais outros agentes terapêuticos ou procedimentos médicos desejados. A combinação particular de terapias (agentes terapêuticos ou procedimentos) para empregar em um regime de combinação levará em consideração compatibilidade dos agentes terapêuticos e/ou procedimentos desejados e o efeito terapêutico desejado a ser obtido. Será também compreendido que as terapias empregadas podem obter um efeito desejado para o mesmo distúrbio (por exemplo, um anticorpo pode ser administrado concomitantemente com outro agente usado para tratar o mesmo distúrbio) ou elas podem obter efeitos diferentes (por exemplo, controle de quaisquer efeitos adversos). Conforme aqui usado, agentes terapêuticos adicionais que são normalmente administrados para tratar ou prevenir uma doença, ou condição, particular são apropriados para a doença, ou condição, sendo tratada.
[00105] Quando agentes terapêuticos múltiplos são co- administrados, as dosagens podem ser ajustadas em conformidade, como é reconhecido na técnica pertinente.
[00106] Um sétimo aspecto provê um método para tratamento de um paciente que demonstra uma sensibilidade a, ou uma reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou à proteína Fel d1, ou para tratamento de pelo menos um sintoma ou complicação associado com uma sensibilidade a, ou reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou à proteína Fel d1, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de um ou mais anticorpos monoclonais humanos isolados ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente à Fel d1, ou uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um ou mais anticorpo monoclonais humanos isolados ou fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente à Fel d1, ou uma quantidade eficaz de uma ou mais das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam especificamente à Fel d1, ou uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de uma ou mais moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam especificamente à Fel d1, a um paciente com necessidade do mesmo, onde a sensibilidade a, ou uma reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou à proteína Fel d1 é ou prevenida, ou diminuída em severidade e/ou duração, ou pelo menos um sintoma ou complicação associado com a sensibilidade a, ou reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou à proteína Fel d1 é prevenido, ou melhorado, ou que a frequência e/ou duração de, ou a severidade da severidade a ou reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou à proteína Fel d1 é reduzida seguindo administração de um ou mais dos anticorpos monoclonais humanos isolados ou fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente à Fel d1, ou seguindo administração de uma ou mais moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam especificamente à Fel d1, ou seguindo administração de uma composição compreendendo qualquer um ou mais dos anticorpos acima ou moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas.
[00107] Em uma modalidade, a invenção provê uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais dos anticorpos da invenção, um ou mais das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam especificamente à Fel d1 para uso no tratamento de um paciente que demonstra uma sensibilidade à, ou uma reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou à proteína Fel d1, ou para tratamento de pelo menos um sintoma ou complicação associado com uma sensibilidade à, ou reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou proteína Fel d1, onde a sensibilidade à, ou uma reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou à proteína Fel d1 é ou prevenida, ou diminuída em severidade e/ou duração, ou pelo menos um sintoma ou complicação associado com a sensibilidade à, ou reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou à proteína Fel d1 é prevenida, ou melhorada, ou que a frequência e/ou duração de, ou a severidade da sensibilidade a ou reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou à proteína Fel d1 é reduzida.
[00108] Em uma modalidade, a invenção provê o uso de uma composição farmacêutica compreendendo um o mais dos anticorpos da invenção, ou uma ou mais das moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam especificamente à Fel d’ na fabricação de um medicamento para uso no tratamento de um paciente que demonstra uma sensibilidade a, ou uma reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou à proteína Fel d1, ou para tratamento de pelo menos um sintoma ou complicação associado com uma sensibilidade a, ou reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou à proteína Fel d1, onde a sensibilidade a, ou uma reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou à proteína Fel 1d é ou prevenida, ou diminuída em severidade e/ou duração, ou pelo menos um sintoma ou complicação associado com a sensibilidade a, ou reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou à proteína Fel d1 é prevenido, ou melhorado, ou que a frequência e/ou duração de, ou a severidade da sensibilidade a ou reação alérgica contra, um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato, ou à proteína Fel d1 é reduzida.
[00109] Em uma modalidade, a invenção provê uso de uma composição farmacêutica conforme acima descrito, onde a composição é administrada em combinação com um segundo agente terapêutico útil para diminuição de uma reação alérgica a um gato, caspa de gato, extrato de pelo de gato ou à proteína Fel d1. Em uma modalidade, a invenção provê o uso da composição farmacêutica conforme acima descrito, onde o segundo agente terapêutico é selecionado de um corticosteroide, um broncodilatador, uma anti-histamina, epinefrina, um descongestionante, outro anticorpo diferente para Fel d1 ou uma vacina de peptídeo.
[00110] Em certas modalidades, os anticorpos da invenção, ou as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam especificamente à Fel d1, podem ser capazes de reduzir, minimizar ou prevenir pelo menos um sintoma em um paciente sensível ao alérgeno de gato Fel d1, tal como espirro, congestão, bloqueio nasal, tosse, chiado no peito, broncoconstrição, rinite ou conjuntivite.
[00111] Em uma modalidade, os anticorpos da invenção, ou as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas que se ligam especificamente à Fel d1, ou uma composição compreendendo um ou mais anticorpos da invenção ou uma ou mais das moléculas de ligação ao antígeno que se ligam especificamente à Fel d1 podem ser usados para prevenir complicações in vivo mais sérias associadas com alergia à Fel d1, incluindo respostas asmáticas, choque anafilático ou até mesmo morte resultante de anafilaxia.
[00112] Em uma modalidade, a composição farmacêutica é administrada ao paciente em combinação com um segundo agente terapêutico.
[00113] Em outra modalidade, o segundo agente terapêutico é selecionado do grupo consistindo em uma anti-histamina, epinefrina, um descongestionante, um corticosteroide, outro anticorpo diferente para Fel d1, uma vacina de peptídeo e qualquer outra terapia paliativa útil para redução da severidade da reação alérgica ou para melhora de pelo menos um sintoma associado com reação alérgica.
[00114] Outras modalidades se tornarão aparentes a partir de uma revisão da descrição detalhada que segue.
Descrição Detalhada
[00115] Antes dos presentes métodos serem descritos, deve ser compreendido que a presente invenção não é limitada a métodos particulares, e condições experimentais descritas, uma vez que tais métodos e condições podem variar. Deve ser também compreendido que a terminologia usada aqui é para o propósito de descrição de modalidades particulares apenas, e não pretende ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado apenas pelas reivindicações apensas.
[00116] A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significa que geralmente compreendido por um versado comum na técnica à qual a invenção pertence. Conforme aqui usado, o termo "cerca de", quando usado em referência a um valor numérico mencionado particular, significa que o valor pode variar do valor mencionado em não mais do que 1%. Por exemplo, conforme aqui usado, a expressão "cerca de 100" inclui 99 e 101 e todos os valores entre eles (por exemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).
[00117] Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais preferidos são agora descritos.
Definições
[00118] O termo "Fel d1" ou "FELD1", conforme aqui usado, se refere a pelo menos uma proteína Fel d1, ou em forma natural/nativa, ou recombinantemente produzida. As proteínas Fel d1 compreendem, ou alternativamente consistem em cadeia 1 (também referida como cadeia A) de Fel d1 (SEQ ID NO: 392) e cadeia 2 (também referida como cadeia B) de Fel d1 (SEQ ID NO: 393). A proteína Fel d1 natural é uma glicoproteína heterodimérica de 18 kDa aproximadamente composta de duas cadeias derivadas de dois genes independentes (Vide Duffort, O. A. e outros (1991), Mol. Immunol. 28:301-309; Kristensen, A. K. e outros (1997), Biol. Chem. 378:899-908; Kaiser, L. e outros (2003), J. Biol. Chem. 278(39):37730-37735). Uma proteína Fel d1 recombinantemente produzida é também mostrada como SEQ ID NO: 396, onde esta sequência contém resíduos de aminoácido 18 a 109 da cadeia B de Fel d1 do número de acesso GenBank NP_001041619.1 (sem a sequência de sinal) fundidos em linha com resíduos de aminoácido 19-188 da cadeia A de Fel d1 de número de acesso GenBank NP_001041618.1 (sem a sequência de sinal e com uma mutação D27G, que corresponde à glicina na posição 101 da SEQ ID NO: 396). Outras construções de Fel d1 recombinantemente produzidas da invenção são exemplificadas nas SEQ ID NOs: 385, 394, 395 e 397.
[00119] A "Cadeia 1" ou "cadeia A" de Fel d1 é um polipeptídeo compreendendo, ou alternativamente consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 392 ou uma sequência homóloga à mesma. O termo sequência homóloga de SEQ ID NO: 392, conforme aqui usado, se refere a um polipeptídeo que tem uma identidade para SEQ ID NO: 392 que é maior do que 70%, preferivelmente maior do que 80%, mais preferivelmente maior do que 90% e ainda mais preferivelmente maior do que 95%. A sequência de aminoácido de cadeia 1 de Fel d1 é também provida no GenBank como número de acesso P30438, ou como número de acesso NP_001041618.1, que também inclui o peptídeo de sinal que é removido na proteína madura.
[00120] "Cadeia 2" ou "cadeia B" de Fel d1 é um polipeptídeo compreendendo, ou alternativamente consistindo em uma sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 393 ou uma sequência homóloga à mesma. O termo sequência homóloga de SEQ ID NO: 393, conforme aqui usado, se refere a um polipeptídeo que tem uma identidade para SEQ ID NO: 393 que é maior do que 70%, preferivelmente maior do que 80%, mais preferivelmente maior do que 90% e ainda mais preferivelmente maior do que 95%. A sequência de aminoácido de cadeia 2 de Fel d’ é também provida no GenBank como número de acesso P30440, ou como número de acesso NP_001041619.1, que inclui o peptídeo de sinal que é removido na proteína madura.
[00121] O termo "fragmento de Fel d1" conforme aqui usado se refere a um polipeptídeo compreendendo ou alternativamente consistindo em pelo menos um sítio antigênico de Fel d1. Em uma modalidade, o termo "fragmento de Fel d1" conforme aqui usado se refere a um polipeptídeo compreendendo ou alternativamente consistindo em pelo menos dois sítios antigênicos de Fel d1. Em uma modalidade, os sítios antigênicos são covalentemente ligados. Em uma modalidade, os sítios antigênicos são ligados por pelo menos uma ligação peptídeo. Em uma modalidade, os dois sítios antigênicos são ligados por pelo menos uma ligação peptídeo e um espaçador entre os sítios antigênicos. Em uma modalidade, os pelo menos dois sítios antigênicos derivados de ambas a cadeia 1 de Fel d1 e a cadeia 2 de Fel d1. Em uma modalidade, os pelo menos dois sítios antigênicos compreendem sequências de aminoácido 23-92 de número de acesso GenBank P30438 e sequências de aminoácido 18-109 de número de acesso GenBank P30440. Em uma modalidade, os pelo menos dois sítios antigênicos derivam de ambas a cadeia 1 de Fel d1 e a cadeia 2 de Fel d1. Em uma modalidade, os pelo menos dois sítios antigênicos compreendem sequências de aminoácido 19-88 de número de acesso GenBank NP_001041618.1 e sequências de aminoácido 18-109 de número de acesso GenBank NP_001041619.1. Em uma modalidade, os pelo menos dois sítios antigênicos compreendem uma sequência de aminoácido dentro de qualquer uma SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 ou 397. Em uma modalidade, qualquer um dos fragmentos de Fel d1 é capaz de induzir a produção de anticorpos in vivo que especificamente se ligam à Fel d1 de ocorrência natural ou à Fel d1 recombinantemente produzida.
[00122] O termo "anticorpo", conforme aqui usado, significa qualquer molécula de ligação ao antígeno ou complexo molecular compreendendo pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) que se liga especificamente a ou interage com um antígeno particular (por exemplo, Fel d1). O termo "anticorpo", conforme aqui usado, pretende se referir a moléculas de imunoglobulina compreendidas de quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L), interconectadas por ligações dissulfeto (isto é, "moléculas de anticorpo inteiras"), bem como seus multímeros (por exemplo, IgM) ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada ("HCVR" ou "VH") e uma região constante de cadeia pesada (compreendida de domínios CH1, CH2 e CH3). Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve ("LCVR ou VL") e uma região constante de cadeia leve (CL). As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, chamadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), interespaçadas com regiões que são mais conservadas, chamadas regiões de estrutura principal (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do terminal amino para o C- terminalarbóxi na ordem que segue: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Em certas modalidades da invenção, as FRs do anticorpo (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) podem ser idênticas às sequências de linhagem germinativa humana ou podem ser naturalmente ou artificialmente modificadas. Uma sequência de consenso de aminoácido pode ser definida com base em uma análise lado a lado de duas ou mais CDRs.
[00123] Substituição de um ou mais resíduos de CDR ou omissão de uma ou mais CDRs é também possível. Anticorpos foram descritos na literatura científica onde uma ou duas CDRs podem ser aplicadas para ligação. Padlan e outros (1995, FASEB J. 9: 133-139) analisaram as regiões de contato entre anticorpos e seus antígenos, com base em estruturas de cristal publicadas, e concluíram que apenas cerca de um quinto a um terço de resíduos de CDR realmente contatam o antígeno. Padlan também encontrou muitos anticorpos onde uma ou duas CDRs não têm quaisquer aminoácidos em contato com um antígeno (vide também Vajdos e outros (2002), J. Mol. Biol. 320: 415-428).
[00124] Resíduos de CDR não contatando antígeno podem ser identificados com base em estudos anteriores (por exemplo, resíduos H60-H65 em CDRH2 frequentemente não são requeridos), das regiões de CDRs de Kabat que se encontram fora das CDRs de Chothia, através de modelagem molecular e/ou empiricamente. Se uma CDR ou seu resíduo(s) for omitida, esta é geralmente substituída com um aminoácido ocupando a posição correspondente em outra sequência de anticorpo humana ou um consenso de tais sequências. Posições para substituição dentro de CDRs e aminoácidos para substituir podem ser também selecionados empiricamente. Substituições empíricas podem ser substituições conservativas ou não conservativas.
[00125] Os anticorpos monoclonais integralmente humanos que se ligam especificamente à Fel d1, conforme aqui revelado, podem compreender uma ou mais substituições, inserções e/ou deleções de aminoácido na estrutura principal e/ou regiões de CDR dos domínios variáveis de cadeias pesada e leve comparado com as sequências de linhagem germinativa correspondentes. Tais mutações podem ser prontamente determinadas comparando as sequências de aminoácido reveladas aqui a sequências de linhagem germinativa disponíveis de, por exemplo, bancos de dados de sequência de anticorpo públicos. A presente invenção inclui anticorpos, e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, que são derivados de qualquer uma das sequências de aminoácido reveladas aqui, onde um ou mais aminoácidos dentro de uma ou mais estrutura principal e/ou regiões de CDR são mutados para o resíduo(s) correspondente da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo foi derivado, ou para o resíduo(s) correspondente de outra sequência de linhagem germinativa humana, ou para uma substituição de aminoácido conservativa do resíduo(s) de linhagem germinativa correspondente (tais mudanças de sequência são referidas aqui coletivamente como "mutações de linhagem germinativa"). Um versado comum na técnica, começando com as sequências de região variável de cadeias pesada e leve reveladas aqui, pode facilmente produzir vários anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que compreendem uma ou mais mutações de linhagem germinativa individuais ou combinações das mesmas. Em certas modalidades, todos dos resíduos de estrutura principal e/ou CDR dentro dos domínios VH e/ou VL são mutados de volta para os resíduos encontrados na sequência de linhagem germinativa original da qual o anticorpo foi derivado. Em outras modalidades, apenas certos resíduos são mutados de volta para a sequência de linhagem germinativa original, por exemplo, apenas os resíduos mutados encontrados dentro dos 8 primeiros aminoácidos de FR1 ou dentro dos 8 últimos aminoácidos de FR4, ou apenas os resíduos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 ou CDR3. Em outras modalidades, um ou mais do resíduo(s) de estrutura principal e/ou CDR são mutados para o resíduo(s) correspondente de uma sequência de linhagem germinativa diferente (isto é, uma sequência de linhagem germinativa que é diferente da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo foi originalmente derivado). Ainda, os anticorpos da presente invenção podem conter qualquer combinação de duas ou mais mutações de linhagem germinativa dentro das regiões de estrutura principal e/ou CDR, por exemplo, onde certos resíduos individuais são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência de linhagem germinativa particular enquanto certos outros resíduos que diferem da sequência de linhagem germinativa original são mantidos ou são mutados para o resíduo correspondente de uma sequência de linhagem germinativa diferente. Uma vez obtidos, anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno que contêm uma ou mais mutações de linhagem germinativa podem ser facilmente testados quanto a uma ou mais propriedade desejada tal como especificidade de ligação aperfeiçoada, afinidade de ligação aumentada, propriedades biológicas antagonísticas ou agonísticas aperfeiçoadas ou aumentadas (conforme for o caso), imunogenicidade reduzida, etc. Anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno obtidos desta maneira geral são compreendidos na presente invenção.
[00126] A presente invenção também inclui anticorpos monoclonais integralmente humanos compreendendo variantes de qualquer uma das sequências de aminoácido HCVR, LCVR e/ou CDR reveladas aqui tendo uma ou mais substituições conservativas. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos tendo sequências de aminoácido de HCVR, LCVR e/ou CDR com, por exemplo, 10 ou menos, 8 ou menos, 6 ou menos, 4 ou menos, etc., substituições de aminoácido conservativas com relação a qualquer uma das sequências de aminoácido de HCVR, LCVR e/ou CDR reveladas aqui.
[00127] O termo "anticorpo humano", conforme aqui usado, pretende incluir anticorpos tendo regiões variáveis e constantes derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Os mAbs humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas através de mutagênese aleatória ou específica de tecido in vitro ou através de mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e em particular CDR3. No entanto, o termo "anticorpo humano", conforme usado aqui, não pretende incluir mAbs onde sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de outra espécie de mamífero (por exemplo, camundongo) foram enxertadas em sequências de FR humanas.
[00128] Conforme aqui usado, a expressão "molécula de ligação ao antígeno" significa uma proteína, polipeptídeo ou complexo molecular compreendendo ou consistindo em pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) que sozinha, ou em combinação com uma ou mais regiões de CDRs e/ou estrutura principal (FR) adicionais, se liga especificamente a um antígeno particular. Em certas modalidades, uma molécula de ligação ao antígeno é um anticorpo ou um fragmento de um anticorpo, como esses termos são definidos em outro ponto aqui.
[00129] Conforme aqui usado, a expressão "molécula de ligação ao antígeno biespecífica" significa uma proteína, polipeptídeo ou complexo molecular compreendendo pelo menos um primeiro domínio de ligação ao antígeno e um segundo domínio de ligação ao antígeno (isto é, dois braços). Cada domínio de ligação ao antígeno dentro da molécula de ligação ao antígeno biespecífica compreende pelo menos uma CDR que, sozinha, ou em combinação com uma ou mais CDRs e/ou FRs adicionais, se liga especificamente a um antígeno particular. No contexto da presente invenção, o primeiro domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a um primeiro antígeno em Fel d1 e o segundo domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente a um segundo antígeno, distinto, em Fel d1.
[00130] O termo "se liga especificamente" ou "se liga especificamente a", ou similar, significa que um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo forma um complexo com um antígeno que é relativamente estável sob condições fisiológicas. Ligação específica pode ser caracterizada por uma constante de dissociação de equilíbrio de pelo menos cerca de 1x10-6 M ou menos (por exemplo, uma KD menor significa uma ligação mais firme). Métodos para determinação de se duas moléculas se ligam especificamente são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, diálise de equilíbrio, ressonância de plasmon de superfície e similar. Conforme aqui descrito, anticorpos foram identificados através de ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, BIACORE®, que se ligam especificamente à Fel d1. Além disso, anticorpos multiespecíficos que se ligam à Fel d1 e um ou mais antígenos adicionais ou um biespecífico que se liga a duas regiões diferentes de Fel d1 (por exemplo, cadeia 1 e/ou cadeia 2 de Fel d1) são, não obstante, considerados anticorpos que "se ligam especificamente", conforme usado aqui.
[00131] O termo anticorpo "de alta afinidade" se refere àqueles mAbs tendo uma afinidade de ligação à Fel d1, expressa como KD, de pelo menos 10-8 M; preferivelmente, 10-9 M; mais preferivelmente 10-10 M, ainda mais preferivelmente 10-11 M, ainda mais preferivelmente 10-12 M, conforme medido através de ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, BIACORE® ou ELISA de afinidade de solução.
[00132] Pelo termo "taxa de retardo", "Koff" ou "kd" quer dizer um anticorpo que se dissocia de Fel d1 com uma constante de taxa de 1 x 10-3 s-1 ou menos, preferivelmente 1 x 10-4 s-1 ou menos, conforme determinado através de ressonância de plasmon de superfície, por exemplo, BIACORE®.
[00133] Os termos "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo, e similar, conforme aqui usado, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzimaticamente obtenível, sintético ou sinteticamente engenheirado que liga especificamente um antígeno para formar um complexo. Os termos "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo ou "fragmento de anticorpo", conforme aqui usado, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a habilidade em se ligar à Fel d1.
[00134] As modalidades específicas, anticorpo ou fragmentos de anticorpo da invenção, podem ser conjugadas a uma porção terapêutica ("imunoconjugado"), tal como um corticosteroide, um segundo anticorpo anti-Fel d1, ou epinefrina, uma vacina, ou qualquer outra porção terapêutica útil para tratamento de uma resposta alérgica à Fel d1.
[00135] Um "anticorpo isolado", conforme aqui usado, pretende se referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos (Abs) tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente à Fel d1, ou um fragmento do mesmo, é substancialmente livre de Abs que especificamente se liga a antígeno outros que não Fel d1).
[00136] Um "anticorpo de bloqueio" ou "um anticorpo de neutralização", conforme aqui usado (ou um "anticorpo que neutraliza atividade de Fel d1"), pretende se referir a um anticorpo, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, cuja ligação à Fel d1 resulta em inibição de pelo menos uma atividade biológica de Fel d1. Por exemplo, um anticorpo da invenção pode auxiliar na prevenção da resposta alérgica primária à Fel d1. Alternativamente, um anticorpo da invenção pode demonstrar a habilidade em prevenir uma resposta alérgica secundária à Fel d1, ou pelo menos um sintoma de uma resposta alérgica à Fel d1, incluindo espirros, tosse, uma condição asmática ou uma resposta anafilática causada por Fel d1. Esta inibição da atividade biológica de Fel d1 pode ser avaliada medindo um ou mais indicadores de atividade biológica de Fel d1 através de um ou mais de vários ensaios in vitro ou in vivo padrão (tal como um ensaio de anafilaxia cutânea passivo, conforme descrito aqui) ou outros ensaios in vivo conhecidos na técnica (por exemplo, outros modelos animais para observar proteção de provocação com Fel d1 seguindo administração de um ou mais dos anticorpos descritos aqui).
[00137] O termo "ressonância de plasmon de superfície", conforme aqui usado, se refere a um fenômeno óptico que permite a análise de interações biomoleculares em tempo real através de detecção de alterações em concentrações de proteína dentro de uma matriz de biossensor, por exemplo, usando o sistema BIACORE® (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suécia e Piscataway, N.J.).
[00138] O termo "KD", conforme aqui usado, pretende se refere à constante de dissociação de equilíbrio de uma interação anticorpo- antígeno particular.
[00139] O termo "epítopo" se refere a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação ao antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecida como parátopo. Um antígeno único pode ter mais de um epítopo. Desta maneira, anticorpos diferentes podem se ligar a áreas diferentes em um antígeno e podem ter efeitos biológicos diferentes. O termo "epítopo" se refere também a um sítio em um antígeno ao qual células B e/ou T respondem. Ele também se refere a uma região de um antígeno que é ligada por um anticorpo. Epítopos podem ser ou lineares ou conformacionais. Um epítopo linear é um produzido por resíduos de aminoácido adjacentes em uma cadeia de polipeptídeo. Um epítopo conformacional é produzido por aminoácidos espacialmente justapostos de segmentos diferentes da cadeia de polipeptídeo linear. Em certas modalidades, epítopos podem incluir determinantes que são agrupamentos quimicamente tensoativos de moléculas tais como aminoácidos, cadeias laterais de açúcar, grupos fosforila ou grupos sulfonila e, em certas modalidades, podem ter características estruturais tridimensionais específicas e/ou características de carga específicas. Epítopos podem também ser definidos como estruturais ou funcionais. Epítopos funcionais são geralmente um subconjunto dos epítopos estruturais e têm aqueles resíduos que contribuem diretamente para a afinidade da interação. Epítopos formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos em exposição a solventes desnaturantes, enquanto epítopos formados por dobra terciária são tipicamente perdidos em tratamento com solventes desnaturantes. Um epítopo inclui tipicamente pelo menos 3, e mais comumente, pelo menos 5 ou 8-10 aminoácidos em uma conformação espacial única.
[00140] O termo "identidade substancial" ou "substancialmente idêntico", quando se referindo a um ácido nucleico ou fragmento do mesmo, indica que, quando otimamente alinhados com inserções ou deleções de nucleotídeo apropriadas com outro ácido nucleico (ou seu filamento complementar), há identidade de sequência de nucleotídeo em pelo menos cerca de 90%, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%, das bases de nucleotídeo, conforme medido através de qualquer algoritmo conhecido de identidade de sequência, tal como FASTA, BLAST ou GAP, conforme discutido abaixo. Uma molécula de ácido nucleico tendo identidade substancial com uma molécula de ácido nucleico de referência pode, em certos casos, codificar um polipeptídeo tendo a mesma sequência de aminoácido ou substancialmente similar que o polipeptídeo codificado pela molécula de ácido nucleico de referência.
[00141] Conforme aplicado a polipeptídeos, o termo "similaridade substancial" ou "substancialmente similar" significa que duas sequências de peptídeo, quando otimamente alinhadas, tal como através do programa GAP ou BESTFIT usando pesos de lacuna default, compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência, com mais preferência ainda pelo menos 95%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Preferivelmente, posições de resíduo, que não são idênticas, diferem por substituições de aminoácido conservativas. Uma "substituição de aminoácido conservativa" é uma onde um resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral (grupo R) com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservativa não mudará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteína. Em casos onde duas ou mais sequências de aminoácido diferem uma da outra por substituições conservativas, a porcentagem ou grau de similaridade pode ser ajustado para cima para corrigir a natureza conservativa da substituição. Meios para realização deste ajuste são bem conhecidos daqueles de habilidade na técnica. (Vide, por exemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331). Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem 1) cadeias laterais alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais alifáticas-hidroxila: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: aspartato e glutamato e 7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteína e metionina. Grupos de substituição de aminoácidos conservativa preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina- valina, glutamato-aspartato e asparagina-glutamina. Alternativamente, uma substituição conservativa é qualquer mudança tendo um valor positivo na matriz de probabilidade log PAM250 revelada em Gonnet e outros (1992) Science 256: 143-45). Uma substituição "moderadamente conservativa" é qualquer mudança tendo um valor não negativo na matriz de probabilidade log PAM250.
[00142] Similaridade de sequência para polipeptídeos é tipicamente medida usando software de análise de sequência. Software de análise de proteína combina sequências similares usando medidas de similaridade designadas para várias substituições, deleções ou outras modificações, incluindo substituições de aminoácido conservativas. Por exemplo, o software GCG contém programas tais como GAP e BESTFIT que podem ser usados com parâmetros default para determinar homologia de sequência ou identidade de sequência entre polipeptídeos intimamente relacionados, tais como polipeptídeos homólogos de espécies diferentes de organismos ou entre uma proteína do tipo selvagem e uma muteína da mesma. Vide, por exemplo, GCG Versão 6.1. Sequências de polipeptídeo podem ser também comparadas usando FASTA com parâmetros default ou recomendados; um programa em GCG Versão 6.1 FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) provê alinhamentos e identidade de sequência percentual das regiões da melhor sobreposição entre as sequências de investigação e pesquisa (Pearson (2000) supra). Outro algoritmo preferido quando comparando uma sequência da invenção a um banco de dados contendo um número grande de sequências de organismos diferentes é o programa de computador BLAST, especialmente BLASTP ou TBLASTN, usando parâmetros default. (Vide, por exemplo, Altschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 e (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-402).
[00143] Em modalidades específicas, o anticorpo ou fragmento de anticorpo para uso no método da invenção pode ser monoespecífico, biespecífico ou multiespecífico. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para epítopos diferentes de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios de ligação ao antígeno específicos para epítopos de mais de um polipeptídeo alvo. Um formato de anticorpo biespecífico exemplar que pode ser usado no contexto da presente invenção envolve o uso de um primeiro domínio CH3 de imunoglobulina (Ig) e um segundo domínio CH3, onde os primeiro e segundo domínios CH3 de Ig diferem um do outro em pelo menos um aminoácido, e onde diferença de pelo menos um aminoácido reduz ligação do anticorpo biespecífico à Proteína A comparado com um anticorpo biespecífico sem a diferença de aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 de Ig se liga à Proteína A e o segundo domínio CH3 de Ig contém uma mutação que reduz ou abole ligação à Proteína A tal como uma modificação H95R (através de numeração de éxon IMGT; H435R através de numeração EU). O segundo CH3 pode compreender ainda uma modificação Y96F (através de IMGT; Y436F através de EU). Modificações adicionais que podem ser encontradas dentro do segundo CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M e V82I (através de IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M e V422I através de EU) no caso de mAbs de IgG; N44S, K52N e V82I (IMGT; N384S, K392N e V422I através de EU) no caso de mAbs de IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q e V82I (através de IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q e V422I através de EU) no caso de mAbs de IgG4. Variações no formato de anticorpo biespecífico descrito acima são compreendidas dentro do escopo da presente invenção.
[00144] Com expressão "quantidade terapeuticamente eficaz" quer dizer uma quantidade que produz o efeito desejado para o qual ele é administrado. A quantidade exata dependerá do propósito do tratamento e será determinada por um versado na técnica usando técnicas conhecidas (vide, por exemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
[00145] Os anticorpos da invenção podem ser usados para "dessensibilizar" um indivíduo sensível a gato. O termo "dessensibilizar" é definido aqui diminuir a reatividade alérgica de um indivíduo sensível a gato a exposições a gato, caspa de gato ou produtos do mesmo, por exemplo, Fel d1 (para um nível menor do que aquele que o indivíduo sensível a gato sofreria de outra maneira).
Descrição Geral
[00146] O gato doméstico é uma fonte de muitos alérgenos internos e a severidade dos sintomas em indivíduos que demonstram uma sensibilidade a alérgenos de gato varia de uma rinite e conjuntivite relativamente leves a uma condição asmática potencialmente ameaçadora à vida (Lau, S. e outros (2000), Lancet 356: 1392-1397). Embora muitos pacientes que demonstram tal sensibilidade a gatos pareçam ser responsivos a moléculas diferentes encontradas em caspa e peles de gato, o principal alérgeno parece ser Fel d1 (Felis domesticus allergen 1). Foi mostrado que mais de 80% de pacientes que são alérgicos a gatos têm anticorpos para IgE para este alérgeno (van Ree, R. e outros (1999), J. Allergy Clin. Immunol. 104: 1223-1230).
[00147] A proteína Fel d1 é uma glicoproteína ácida heterodimérica de aproximadamente 18 kDa que contém cerca de 10-20% de carboidratos N-ligados. Cada heterodímero compreende duas cadeias de polipeptídeo que são codificadas por dois genes separados (Duffort, O.A. e outros (1991), Mol. Immunol. 28:301-309; Morgenstern, J.P. e outros (1991), PNAS 88: 9690-9694; Griffith, I.J. e outros (1992), Gene 113:263-268). A Cadeia 1 compreende cerca de 70 resíduos de aminoácido e a cadeia 2 compreende cerca de 90-92 resíduos de aminoácido. Três ligações dissulfeto intercadeia ligando as duas cadeias em Fel d1 natural foram propostas (Kristensen, A.K. e outros (1997), Biol. Chem. 378: 899-908) e confirmadas para Fel 1d recombinante na estrutura de cristal (Kaiser, L. e outros (2003), J. Biol. Chem. 278: 37730-37735; Kaiser, L. e outros (2007), J. Mol. Biol. 370: 714-727). Embora cada cadeia seja algumas vezes individualmente referida como "Fel d1", ambas as cadeias são necessárias para o alérgeno de proteína integral.
[00148] Fel d1 é produzida por glândulas sebáceas, glândulas escamosas e células epiteliais escamosas e é transferida para a pele através de lambida e acariciando (Bartholome, K. e outros (1985), J. Allergy Clin. Immunol. 76: 503-506; Charpin, C. e outros (1991), J. Allergy Clin. Immunol. 88: 77-82; Dabrowski, A. J. (1990) e outros. J. Allergy Clin. Immunol. 86: 462-465). Ela também está presente em glândulas salivar, perianal e lacrimal (Andersen, M. C. e outros (1985), J. Allergy Clin. Immunol. 76: 563-569; van Milligen, F. J. e outros (1992), Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 92: 375-378) e os reservatórios principais parecem estar na pele e no pelo (Mata, P. e outros (1992), Ann. Allergy 69(4): 321-322).
[00149] A proteína Fel d1 é de uma função desconhecida para o animal, mas causa uma reação IgG ou IgE em humanos sensíveis (ou como uma resposta alérgica ou asmática). Embora outros alérgenos de gato sejam conhecidos, incluindo Fel d2 (albumina) e Fel d3 (cistatina, 60% a 90% da IgE antigato produzida são direcionados contra Fel d1 (Leitermann, K. e outros (1984), J. Allergy Clin. Immunol. 74: 147-153; Lowenstein, H. e outros (1985), Allergy 40: 430-441; van Ree, R. e outros (1999), J. Allergy Clin. Immunol. 104: 1223-1230; Ichikawa, K. e outros (2011), Clin. Exp. Allergy, 31: 1279-1286).
[00150] A imunoglobulina E (IgE) é responsável pela hipersensibilidade tipo 1, que se manifesta em rinite alérgica, conjuntivite alérgica, febre do feno, asma alérgica, alergia a veneno de abelha e alergias alimentares. IgE circula no sangue e se liga a receptores Fc de alta afinidade para IgE em basófilos e mastócitos. Na maioria das respostas alérgicas, os alérgenos entram no corpo através de inalação, ingestão ou através da pele. O alérgeno então se liga à IgE pré-formada já ligada ao receptor de alta afinidade nas superfícies de mastócitos e basófilos, resultando em ligação cruzada de várias moléculas de IgE e disparo da liberação de histamina e outros mediadores inflamatórios causando os vários sintomas alérgicos.
[00151] O tratamento para alergias a gato inclui terapia de dessensibilização, que envolve injeções repetidas com dosagens altas ou de um extrato de caspa de gato bruto ou peptídeos curtos derivados de Fel d1. Usando o extrato bruto de caspa de gato, Lilja e outros demonstraram que após três anos de tal tratamento, pacientes alérgicos a gatos ainda exibem sintomas sistêmicos (Lilja, Q. e outros (1989), J. Allergy Clin. Immunol. 83: 37-44 e Hedlin e outros (1991), J. Allergy Clin. Immunol. 87: 955-964). Uso de peptídeos curtos derivados de Fel d1 para dessensibilização resultou em uma diferença não significante entre o grupo de peptídeo e o grupo controle de placebo (Oldfield, W.L. e outros (2002), Lancet, 360: 47-53). A eficácia foi apenas observada quando grandes quantidades (750 ug) do peptídeo curto foram administradas a pacientes (Norman, P.S. e outros (1996), Am. J. Respir. Crit. Care Med. 154: 1623-1628). Ainda, reações asmáticas foram relatadas em pacientes que receberam ambos os extratos brutos de caspa de gato, bem como em pacientes que receberam tratamento com peptídeo de Fel d1 curto. Desta maneira, há uma necessidade na técnica de tratamento de alergia a gato de estratégias alternativas para tratamento de paciente sensíveis a alérgenos de gato, em particular Fel d1.
[00152] Anticorpos foram propostos como uma estratégia de tratamento geral para alergias, uma vez que eles podem ser capazes de bloquear a entrada de moléculas alergênicas nos tecidos de mucosas, ou podem se ligar ao alérgeno antes dele ter a oportunidade de se ligar à IgE ligada ao receptor de alta afinidade em mastócitos ou basófilos, desta maneira prevenindo a liberação de histamina e outros mediadores inflamatórios a partir dessas células. A Patente U.S. número 5.670.626 descreve o uso de anticorpos monoclonais para o tratamento de doenças alérgicas mediadas por IgE tais como rinite alérgica, asma alérgica e conjuntivite alérgica através do bloqueio da ligação de alérgenos ao tecido de mucosa. A Patente U.S. número 6.849.259 descreve o uso de anticorpos específicos de alérgeno para inibir inflamação alérgica em um modelo de camundongo in vivo de alergia. Sistemas de anticorpo baseados em leite e baseados em ovo foram descritos. Por exemplo, a US20030003133A1 revela uso de leite como um carreador para alérgenos para indução de tolerância oral à caspa de gato e outros alérgenos. Composições e métodos para redução de uma resposta alérgica em um animal a um alérgeno no ambiente através do uso de uma molécula que inibe a habilidade do alérgeno em se ligar a mastócitos foram descritos na US2010/0143266. Outros anticorpos para Fel d1 foram descritos por Groot e outros (de Groot e outros (1988), J. Allergy Clin. Immunol. 82: 778-786).
[00153] Os anticorpos integralmente humanos descritos aqui demonstram ligação específica à Fel d1 e podem ser úteis para tratamento de pacientes sofrendo de alergias a gato, em particular em pacientes que demonstram sensibilidade ao alérgeno Fel d1. O uso de tais anticorpos pode ser um meio eficaz de tratamento de pacientes sofrendo de alergias à caspa de gato ou eles podem ser usados para prevenir uma resposta aumentada à Fel d1 quando da exposição secundária, ou os sintomas acompanhantes associados com a alergia, ou podem ser usados para diminuir a severidade e/ou a duração da resposta alérgica associada com uma exposição primária a um gato carregando o alérgeno Fel 1d ou com a recorrência dos sintomas quando da exposição secundária. Eles podem ser usados sozinhos ou como terapia adjuvante com outras porções ou modalidades terapêuticas conhecidas na técnica para tratamento de tais alergias, tal como, mas não limitado a tratamento com corticosteroides ou epinefrina. Eles podem ser usados em conjunto com um segundo ou terceiro anticorpo diferente específico para Fel d1. Eles podem ser usados com imunoterapia específica de alérgeno (SIT) (Specific Immunotheraphy).
[00154] Em certas modalidades, os anticorpos da invenção são obtidos de camundongos imunizados com um imunógeno primário, tal como Fel d1 natural, que pode ser comprado comercialmente (vide, por exemplo, Indoor Biotech, #NA-FD1-2) ou pode ser produzido recombinantemente. Em certas modalidades, o imunógeno pode ser cadeia 1 de Fel d1, ou cadeia 2 de Fel d2, ou pode ser uma combinação de ambas as cadeias 1 e cadeia 2 administradas sequencialmente, ou concomitantemente. A sequência de aminoácido de comprimento integral de cadeia 1 (também referida como FELD1 A) é mostrada como SEQ ID NO: 392. Sequências de aminoácido de comprimento integral para cadeia 1 podem também ser encontradas nos números de acesso GenBank P30438 e NP_001041618.1. A sequência de aminoácido de comprimento integral de cadeia 2 (também referida como FELD1 B) é mostrada como SEQ ID NO: 393. Sequências de aminoácido de comprimento integral para cadeia 2 podem também ser encontradas em números de acesso GenBank PP30440 e NP_001041619.1.
[00155] Em certas modalidades, o imunógeno para Fel d1 recombinantemente produzido pode ser feito através de fusão direta das duas cadeias de Fel d1, conforme descrito em Kaiser e outros, para produzir um produto de fusão que tem padrão de redobra similar àquele de Fel d1 natural (Kaiser, L. e outros (2003), J. Biol. Chem. 278(39): 37730-37735). Em certas modalidades, o imunógeno pode ser uma proteína de fusão tal como aquela mostrada nas construções de SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 ou 397, seguido por imunização com um imunógeno secundário, ou com um fragmento imunogenicamente ativo da Fel d1 natural ou recombinantemente produzida.
[00156] O imunógeno pode ser um fragmento biologicamente ativo e/ou fragmento imunogênico de Fel d1 natural ou recombinantemente produzida ou DNA codificando o fragmento ativo da mesma. O fragmento pode ser derivado ou do N-terminal ou C-terminal de cadeia 1 ou cadeia 2 ou do N-terminal ou do C-terminal de ambas a cadeia 1 e cadeia 2. Fragmentos podem ser obtidos de qualquer sítio dentro da cadeia 1 ou cadeia 2 a ser usada como um imunógeno para preparação de anticorpos para Fel d1.
[00157] Em certas modalidades, o imunógeno pode ser uma proteína de fusão compreendendo qualquer um ou mais do que segue: i) resíduos de aminoácido 18-109 da cadeia 2 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank P30440 e também SEQ ID NO: 393) fundidos através do C-terminal diretamente com o N-terminal de resíduos de aminoácido 23-92 de cadeia 1 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank P30438 e também SEQ ID NO: 392); ii) resíduos de aminoácido 23-92 de cadeia 1 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank P30438 e também SEQ ID NO: 392) fundidos através do C-terminal ao N-terminal de resíduos de aminoácido 18-109 de cadeia 2 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank P30440 e também SEQ ID NO: 393); iii) resíduos de aminoácido 18-109 de cadeia 2 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank NP_001041619.1) fundidos através do C-terminal diretamente com o N-terminal de resíduos de aminoácido 19-88 de cadeia 1 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank NP_001041618.1), tal como a construção mostrada em SEQ ID NO: 394 ou 396; iv) resíduos de aminoácido 19-88 de cadeia 1 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank NP_001041618.1) fundidos através do C-terminal ao N- terminal de resíduos de aminoácido 18-109 de cadeia 2 de Fel 1d (vide número de acesso GenBank NP_001041619.1). Vide também SEQ ID NO: 395. Em certas modalidades, a proteína de fusão pode ter um marcador na extremidade C-terminal da construção, tal como um marcador myc-myc-hexaistidina (vide SEQ ID NO: 385, 396 ou 397 para tais construções). Em modalidades relacionadas, a proteína de fusão pode ter uma região Fc de anticorpo de camundongo acoplada à extremidade C-terminal da construção (vide SEQ ID NO: 394 ou 395 para tais construções). Em certas modalidades, as cadeias 1 e 2 são acopladas via um ligante conhecido daqueles versados na técnica, por exemplo (G4S)3 (vide SEQ ID NOs: 395 e 397 para tal construção).
[00158] Em certas modalidades, os anticorpos que se ligam especificamente à Fel d1 podem ser preparados usando fragmentos das regiões mencionadas acima, ou peptídeos que se estendem além das regiões designadas em cerca de 5 a cerca de 20 resíduos de aminoácido a partir de uma, ou ambas, as extremidades N ou C terminais das regiões descritas aqui. Em certas modalidades, qualquer combinação das regiões mencionadas acima ou fragmentos das mesmas pode ser usada na preparação de anticorpos específicos para Fel d1. Em certas modalidades, qualquer uma ou mais das regiões mencionadas acima de Fel 1d, ou fragmentos das mesmas, pode ser usada para preparação de anticorpos monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos.
Fragmentos de Anticorpos de Ligação ao antígeno
[00159] A menos que especificamente indicado de outro modo, o termo "anticorpo", conforme aqui usado, deve ser entendido compreender moléculas de anticorpo compreendendo duas cadeias pesadas de imunoglobulina e duas cadeias leves de imunoglobulina (isto é, "moléculas de anticorpo inteiras") bem como fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos. Os termos "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo, e similar, conforme aqui usado, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína de ocorrência natural, enzimaticamente obtenível, sintético ou geneticamente engenheirado que se liga especificamente a um antígeno para formar um complexo. O termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo ou "fragmento de anticorpo", conforme aqui usado, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retêm a habilidade em se ligar especificamente ou à cadeia 1 e/ou cadeia 2 de Fel d1. Um fragmento de anticorpo pode incluir um fragmento Fab, um fragmento F(ab’)2, um fragmento Fv, um fragmento dAb, um fragmento contendo uma CDR ou uma CDR isolada. Fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpo integrais usando quaisquer técnicas padrão adequadas tais como técnicas de digestão proteolítica ou engenharia genética recombinante envolvendo a manipulação e expressão de DNA codificando domínios variáveis e constantes (opcionais) de anticorpo. Tal DNA é conhecido e/ou está prontamente disponível de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fago-anticorpo) ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou usando técnicas de biologia molecular, por exemplo, para dispor um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou introduzir códons, criar resíduos cisteína, modificar, adicionar ou deletar aminoácidos, etc.
[00160] Exemplos não limitantes de fragmentos de ligação ao antígeno incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2); (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas de Fv de cadeia simples (scFv); (vi) fragmentos dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimas consistindo nos resíduos de aminoácido que imitam a região hipervariável de um anticorpo (por exemplo, uma região de determinação de complementaridade (CDR) isolada tal como um peptídeo de CDR3) ou um peptídeo FR3-CDR3-FR4 restrito. Outras moléculas engenheiradas, tais como anticorpos específicos de domínio, anticorpos de domínio únicos, anticorpos deletados de domínio, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc), imunofarmacêuticos modulares pequenos (SMIPs) (Small Modular Immunopharmaceuticals) e domínios IgNAR variáveis de tubarão, estão também compreendidos dentro da expressão "fragmento de ligação ao antígeno", conforme aqui usado.
[00161] Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreenderá tipicamente pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácido e compreenderá geralmente pelo menos uma CDR, que está adjacente a ou em estrutura com uma ou mais sequências de estrutura principal. Em fragmentos de ligação ao antígeno tendo um domínio VH associado com um domínio VL, os domínios VH e VL podem estar situados em relação um ao outro em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH-VH, VH-VL ou VLVL. Alternativamente, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter um domínio VH ou VL monomérico.
[00162] Em certas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter pelo menos um domínio variável covalentemente ligado a pelo menos um domínio constante. Configurações exemplares, não limitantes, de domínios variáveis e constantes que podem ser encontrados dentro de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção incluem: (i) VH -CH1; (ii) VH -CH2; (iii) VH -CH3; (iv) VH -CH1-CH2; (v) VH -CH1-CH2-CH3; (vi) VH -CH2- CH3; (vii) VH -CL; (viii) VL -CH1; (ix) VL -CH2; (x) VL -CH3; (xi) VL -CH1-CH2; (xii) VL -CH1-CH2-CH3; (xiii) VL -CH2-CH3; e (xiv) VL -CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplares listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser ou diretamente ligados uns aos outros ou podem ser ligados por uma região de dobra ou ligante inteira ou parcial. Uma região de dobra pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos, que resultam em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma molécula de polipeptídeo única. Além disso, um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínios variável e constante listadas acima em associação não covalente um com o outro e/ou com um ou mais domínio VH ou VL monomérico (por exemplo, ligação(ões) dissulfeto).
[00163] Como com moléculas de anticorpo inteiras, fragmentos de ligação ao antígeno podem ser monoespecíficos ou multiespecíficos (por exemplo, biespecíficos). Um fragmento de ligação ao antígeno multiespecífico de um anticorpo compreenderá tipicamente pelo menos dois domínios variáveis diferentes, onde cada domínio variável é capaz de se ligar especificamente a um antígeno separado ou a um epítopo diferente no mesmo antígeno. Qualquer formato de anticorpo multiespecífico, incluindo os formatos de anticorpo biespecífico exemplares revelados aqui, pode ser adaptado para uso no contexto de um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo da presente invenção usando técnicas de rotina disponíveis no campo.
Preparação de Anticorpos Humanos
[00164] Métodos para geração de anticorpos humanos em camundongos transgênicos são conhecidos na técnica. Quaisquer tais métodos conhecidos podem ser usados no contexto da presente invenção para produzir anticorpos humanos que se ligam especificamente à Fel d1.
[00165] Usando tecnologia VELOCIMMUNE® (vide, por exemplo, US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) ou qualquer outro método conhecido para geração de anticorpos monoclonais, anticorpos quiméricos de alta afinidade para Fel d1 são inicialmente isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. A tecnologia VELOCIMMUNE® envolve geração de um camundongo transgênico tendo um genoma compreendendo regiões variáveis de cadeias pesada e leve humanas operadas ligadas a loci constantes de camundongo endógenos de maneira que o camundongo produz um anticorpo compreendendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo em resposta à estimulação antigênica. Os DNAs codificando as regiões variáveis das cadeias pesada e leve do anticorpo são isolados e operacionalmente ligados a DNA codificando as regiões constantes de cadeias pesada e leve humanas. O DNA é então expresso em uma célula capaz de expressar o anticorpo integralmente humano.
[00166] Em geral, um camundongo VELOCIMMUNE® é provocado com o antígeno de interesse e células linfáticas (tais como células B) são recuperadas dos camundongos que expressam anticorpos. As células linfáticas podem ser fundidas com uma linhagem de célula de mieloma para preparar linhagens de célula de hibridoma imortais, e tais linhagens de célula de hibridoma são avaliadas e selecionadas para identificadas linhagens de célula de hibridoma que produzem anticorpos específicos para o antígeno de interesse. DNA codificando as regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve pode ser isolado e ligado às regiões constantes isotípicas desejáveis da cadeia pesada e da cadeia leve. Tal proteína de anticorpo pode ser produzida em uma célula, tal como uma célula CHO. Alternativamente, DNA codificando os anticorpos quiméricos específicos de antígeno ou os domínios variáveis das cadeias leve e pesada pode ser isolado diretamente de linfócitos específicos de antígeno.
[00167] Inicialmente, anticorpos quiméricos de alta afinidade são isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Como na seção experimental abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados quanto a características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas com uma região constante humana desejada para gerar o anticorpo integralmente humano da invenção, por exemplo, IgG1 ou IgG4 do tipo selvagem ou modificada. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com uso específico, características de ligação ao antígeno de alta afinidade e especificidade de alvo residem na região variável.
[00168] Em geral, os anticorpos da presente invenção possuem afinidades muito altas, possuindo KD de a partir de cerca de 10-12 a cerca de 10-9 M, quando medidos ligando a antígeno ou imobilizados em fase sólida ou em fase de solução. As regiões constantes de camundongo são substituídas com regiões constantes humanas desejadas para gerar os anticorpos integralmente humanos da invenção. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com uso específico, características de ligação ao antígeno de alta afinidade e especificidade de alvo residem na região variável.
Bioequivalentes
[00169] Os anticorpos anti-Fel d1 e fragmentos de anticorpo da presente invenção compreendem proteínas tendo sequências de aminoácido que variam daquelas dos anticorpos descritos, mas que retêm a habilidade em se ligar à Fel d1. Tais anticorpos variantes e fragmentos de anticorpo compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de aminoácidos quando comparado com a sequência parental, mas exibem atividade biológica que é essencialmente equivalente àquela dos anticorpos descritos. Da mesma maneira, as sequências de DNA de codificação de anticorpo da presente invenção compreendem sequências que compreendem uma ou mais adições, deleções ou substituições de nucleotídeos quando comparado com a sequência revelada, mas que codificam um anticorpo ou fragmento de anticorpo que é essencialmente bioequivalente a um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção.
[00170] Duas proteínas de ligação ao antígeno, ou anticorpos, são considerados bioequivalentes se, por exemplo, eles forem equivalentes farmacêuticos ou alternativas farmacêuticas cujas taxas e grau de absorção não mostram uma diferença significante quando administrados na mesma dose molar sob condições experimentais similares, ou em dose única ou dose múltipla. Alguns anticorpos serão considerados equivalentes ou alternativas farmacêuticos se eles forem equivalentes no grau de sua absorção, mas não em sua taxa de absorção e ainda podem ser considerados bioequivalentes porque tais diferenças na taxa de absorção são intencionais e são refletidas na marcação, não são essenciais para a obtenção de concentrações de fármaco no corpo essenciais em, por exemplo, uso crônico, e são consideradas medicinalmente insignificantes para o produto de fármaco particular estudado.
[00171] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se não houver quaisquer diferenças clinicamente significantes em sua segurança, pureza e potência.
[00172] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se um paciente puder ser mudado uma ou mais vezes entre o produto de referência e o produto biológico sem um aumento esperado no risco de eventos adversos, incluindo uma mudança clinicamente significante em imunogenicidade, ou eficácia diminuída, comparado com terapia continuada sem tal mudança.
[00173] Em uma modalidade, duas proteínas de ligação ao antígeno são bioequivalentes se elas agirem ambos através de um mecanismo ou mecanismos de ação comuns para a condição ou condições de uso, até o ponto que tais mecanismos forem conhecidos.
[00174] Bioequivalência pode ser demonstrada através de métodos in vivo e/ou in vitro. Medições de bioequivalência incluem, por exemplo, (a) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos, onde a concentração do anticorpo ou seus metabolitos é medida em sangue, plasma, soro ou outro fluido biológico como uma função de tempo; (b) um teste in vitro que foi relacionado com e é razoavelmente previsível de dados de biodisponibilidade in vivo humana; (c) um teste in vivo em humanos ou outros mamíferos onde o efeito farmacológico agudo apropriado do anticorpo (ou seu alvo) é medido como uma função de tempo; e (d) em um teste clínico bem controlado que estabelece segurança, eficácia ou biodisponibilidade ou bioequivalência de um anticorpo.
[00175] Variantes bioequivalentes dos anticorpos da invenção podem ser construídas através de, por exemplo, realização de várias substituições de resíduos ou sequências ou deletando resíduos ou sequências terminais ou internos não necessários para atividade biológica. Por exemplo, resíduos cisteína não essenciais para atividade biológica podem ser deletados ou substituídos com outros aminoácidos para prevenir formação de pontes dissulfeto intramoleculares desnecessárias ou incorretas quando da renaturação. Em outros contextos, anticorpos bioequivalentes podem incluir variantes de anticorpo compreendendo mudanças de aminoácido, que modificam as características de glicosilação dos anticorpos, por exemplo, mutações que eliminam ou removem glicosilação.
Características Biológicas dos Anticorpos
[00176] Em geral, os anticorpos da presente invenção podem funcionar através de ligação ou à cadeia 1 ou à cadeia 2 de Fel d1 ou a ambas a cadeia 1 e a cadeia 2 de Fel d1 ou a um fragmento ou da cadeia 1 ou da cadeia 2.
[00177] Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem se ligar a um epítopo localizado pelo menos na região C-terminal ou da cadeia 1 ou da cadeia 2 de Fel d1. Em uma modalidade, os anticorpos podem ser ligar a um epítopo dentro da região N-terminal da cadeia 1 ou cadeia 2 de Fel d1.
[00178] Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem funcionar bloqueando ou inibindo a ligação de IgE a mastócitos ou basófilos em um paciente sensível ao alérgeno Fel d1.
[00179] Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem funcionar através de ligação a qualquer outra região ou fragmento da cadeia 1 ou cadeia 2 de comprimento integral da proteína Fel d1 natural, cuja sequência de aminoácido é mostrada na SEQ ID NO: 392 (cadeia 1) e na SEQ ID NO: 393 (cadeia 2).
[00180] Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos biespecíficos. Os anticorpos biespecíficos da invenção podem se ligar a um epítopo na cadeia 1 e podem também se ligar a um epítopo na cadeia 2. Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos da invenção podem se ligar a dois epítopos diferentes na cadeia 1. Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos da invenção podem se ligar a dois epítopos diferentes na cadeia 2. Em certas modalidades, os anticorpos biespecíficos da invenção podem ser ligar a dois sítios diferentes dentro da mesma hélice em qualquer uma da cadeia 1 ou cadeia 2 ou podem se ligar à mesma hélice em ambas a cadeia 1 e a cadeia 2. A estrutura de Fel d1 é descrita em mais detalhes em Kaiser e outros (Kaiser, L. e outros (2003), J. Biol. Chem. 278 (39): 37730-37735), enquanto os autores notam que Fel d1 consiste em oito hélices, H1-H4 e H5-H8, que correspondem às cadeias 2 e 1, respectivamente, em Fel d1 natural.
[00181] Em uma modalidade, a invenção provê um anticorpo monoclonal integralmente humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga à cadeia 1 e/ou cadeia 2 de Fel d1, onde o anticorpo ou fragmento do mesmo exibe uma ou mais das características que seguem: (i) compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354 e 370 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (ii) compreende uma LCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362 e 378 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (iii) compreende um domínio HCDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232,248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360 e 376 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio LCDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368 e 384 ou uma sequência substancialmente similar da mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (iv) compreende um domínio HCDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356 e 372 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio HCDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358 e 374 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio LCDR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364 e 380 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio LCDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366 e 382 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (v) se liga à cadeia 1 e/ou cadeia 2 de Fel d1 com uma KD igual a ou menos do que 10-9; (vi) não reage cruzado com, ou se liga à, uteroglobina; ou (vii) bloqueia extravasamento de corante in vivo em um modelo de camundongo de anafilaxia cutânea passiva (PCA) (Passive Cutaneous Anaphylaxis) usando IgE de camundongo específica de Fel d1.
[00182] Em uma modalidade, a invenção provê o uso de uma combinação de dois ou mais anticorpos integralmente humanos da invenção, ou fragmentos dos mesmos, para preparação de uma composição, onde os anticorpos se ligam à cadeia 1 e/ou cadeia 2 de Fel d1, e onde cada anticorpo ou fragmento do mesmo contido na composição exibe uma ou mais das características que seguem: (i) compreende uma HCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354 e 370 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (ii) compreende uma LCVR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362 e 378 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (iii) compreende um domínio HCDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360 e 376 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de LCDR3 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368 e 384 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (iv) compreende um domínio HCDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356 e 372 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de HCDR tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358 e 374 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; um domínio de LCDR1 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364 e 380 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; e um domínio de LCDR2 tendo uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366 e 382 ou uma sequência substancialmente similar à mesma tendo pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência; (v) se liga à cadeia 1 e/ou cadeia 2 de Fel d1 com uma KD igual a ou menos do que 10-9; (vi) não reage cruzado com, ou se liga à, uteroglobina; (vii) bloqueia extravasamento de corante in vivo em um modelo de camundongo de anafilaxia cutânea passiva (PCA) usando IgE de camundongo específica de Fel d1; ou (viii) quando combinado com um anticorpo secundário ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo da invenção diminui a frequência de células de secreção de muco nos pulmões de animais provocados com Fel d1.
[00183] Certos anticorpos para Fel d1 da presente invenção, quando usados sozinhos, ou em combinação são capazes de se ligar a e neutralizar pelo menos um efeito biológico de Fel d1, conforme determinado através de ensaios in vitro ou in vivo. A habilidade dos anticorpos da invenção em se ligar a e neutralizar a atividade de Fel d1 pode ser medida usando qualquer método padrão conhecido daqueles versados na técnica, incluindo ensaios de ligação, ou neutralização de ensaios de atividade (por exemplo, proteção de anafilaxia), conforme aqui descrito.
[00184] Ensaios in vitro exemplares, não limitantes, para medição da atividade de ligação são ilustrados nos Exemplo 4, aqui. Nos Exemplos 4, as afinidades de ligação e as constantes cinéticas de anticorpos anti- Fel d1 humanos foram determinadas através de ressonância de plasmon de superfície e as medições foram conduzidas em um instrumento T200 Biacore.
[00185] As proteínas ou peptídeos Fel d1 podem ser modificados para incluir adição ou substituição de certos resíduos para marcação ou para propósitos de conjugação a moléculas carreadoras, tal como KLH. Por exemplo, uma cisteína pode ser adicionada à extremidade N terminal ou C terminal de um peptídeo ou uma sequência ligante pode ser adicionada para preparar o peptídeo para conjugação a, por exemplo, KLH para imunização. Os anticorpos específicos para Fel d1 podem conter quaisquer marcadores ou porções adicionais ou eles podem conter um marcador ou porção N-terminal ou C-terminal. Em uma modalidade, o marcador ou porção é biotina. No ensaio de ligação, a localização do marcador (se algum) pode determinar a orientação do peptídeo com relação à superfície à qual o peptídeo está ligado. Por exemplo, se a superfície for revestida com avidina, um peptídeo contendo uma biotina N-terminal será orientado de maneira que a porção C-terminal do peptídeos será distal à superfície.
Mapeamento de Epítopo e Tecnologias Relacionadas
[00186] O termo "epítopo", conforme aqui usado, se refere a um determinante antigênico que interage com um sítio de ligação ao antígeno específico na região variável de uma molécula de anticorpo conhecido como um parátopo. Um antígeno único pode ter mais de um epítopo. Desta maneira, anticorpos diferentes podem se ligar a áreas diferentes em um antígeno e podem ter efeitos biológicos diferentes. Epítopos podem ser ou conformacionais ou lineares. Um epítopo conformacional é produzido por aminoácidos espacialmente justapostos a partir de segmentos diferentes da cadeia de polipeptídeo linear. Um epítopo linear é um produzido por resíduos de aminoácido adjacentes em uma cadeia de polipeptídeo. Em certas circunstâncias, um epítopo pode incluir porções de sacarídeos, grupos fosforila ou grupos sulfonila no antígeno.
[00187] A presente invenção inclui anticorpos anti-Fel d1 que interagem com um ou mais aminoácidos encontrados em uma ou mais regiões de cadeia 1 ou cadeia 2 da molécula de Fel d1 incluindo, por exemplo, cadeia 1 (cadeia A) conforme mostrado na SEQ ID NO: 392 ou cadeia 2 (cadeia B) conforme mostrado na SEQ ID NO: 393, ou dentro de regiões comparáveis de uma proteína Fel d1 recombinantemente produzida, conforme mostrado em qualquer uma da SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 ou 397. O epítopo ao qual os anticorpos se ligam pode consistir em uma sequência contígua única de 3 ou mais (por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais) aminoácidos localizados dentro de qualquer uma das regiões ou segmentos mencionados acima da molécula de Fel d1 (por exemplo, um epítopo linear ou na cadeia 1 ou cadeia 2 ou em uma região que se estende por ambas a cadeia 1 e cadeia 2). Alternativamente, o epítopo pode consistir em uma pluralidade de aminoácidos não contíguos (ou sequências de aminoácido) localizados dentro de uma ou ambas as regiões ou segmentos mencionados acima da molécula de Fel d1 (por exemplo, um epítopo conformacional).
[00188] Várias técnicas conhecidas de pessoas de habilidade comum na técnica podem ser usadas para determinar se um anticorpo "interage com um ou mais aminoácidos" dentro de um polipeptídeo ou proteína. Técnicas exemplares incluem, por exemplo, ensaios de bloqueio cruzado de rotina, tais como aqueles descritos em Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Outros métodos incluem análise mutacional por varredura de alanina, análise blot de peptídeo (Reineke (2004) Methods Mol. Biol. 248:44363), estudos cristalográficos de análise de clivagem de peptídeo e análise de NMR. Ainda, métodos tais como excisão de epítopo, extração de epítopo e modificação química de antígenos podem ser empregados (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). Outro método que pode ser usado para identificar os aminoácidos dentro de um polipeptídeo com o qual um anticorpo interage é troca de hidrogênio/deutério detectada através de espectrometria de massa. Em termos gerais, o método de troca de hidrogênio/deutério envolve marcação com deutério da proteína de interesse, seguido por ligação do anticorpo à proteína marcada com deutério. Em seguida, o complexo proteína/anticorpo é transferido para água e prótons permutáveis dentro de aminoácidos que são protegidos pelo complexo de anticorpo sofrem troca inversa de deutério-para-hidrogênio em uma taxa mais lenta do que prótons permutáveis dentro de aminoácidos que não são parte da interface. Como resultado, aminoácidos que fazem parte da interface proteína/anticorpo podem reter deutério e desta maneira exibem massa relativamente maior comparado com os aminoácidos não incluídos na interface. Após dissociação do anticorpo, a proteína alvo é submetida à clivagem por protease e análise de espectrometria de massa, desta maneira revelando os resíduos marcados com deutério que correspondem aos aminoácidos específicos com os quais o anticorpo interage. Vide, por exemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen and Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. Cristalografia de raio-X do complexo antígeno/anticorpo pode ser também usada para propósitos de mapeamento de epítopo.
[00189] Modification-Assisted Profiling (MAP), também conhecido como Antigen Structure-based Antibody Profiling (ASAP) é um método que categoriza grandes números de anticorpos monoclonais (mAbs) direcionados contra o mesmo antígeno de acordo com as similaridades do perfil de ligação de cada anticorpo a superfícies de antígeno quimicamente ou enzimaticamente modificadas (US 2004/0101920). Cada categoria pode refletir um epítopo único ou distintamente diferente de ou parcialmente se sobrepondo ao epítopo representado por outra categoria. Esta tecnologia permite filtragem rápida de anticorpos geneticamente idênticos, de maneira que caracterização pode ser focada em anticorpos geneticamente distintos. Quando aplicado à avaliação de hibridoma, MAP pode facilitar identificação de clones de hibridoma raros que produzem mAbs tendo as características desejadas. MAP pode ser usado para classificar os anticorpos da invenção em grupos de anticorpos se ligando a epítopos diferentes.
[00190] Em certas modalidades, os anticorpos anti-Fel d1 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos se ligam a um epítopo dentro de qualquer uma ou mais das regiões exemplificadas na cadeia 1 ou cadeia 2 de Fel d1, ou em forma natural, conforme exemplificado na SEQ ID NO: 392 (cadeia 1) e na SEQ ID NO: 393 (cadeia 2), ou recombinantemente produzidos, conforme exemplificado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 385, 394, 395, 396 e 397 ou a um fragmento do mesmo. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção, conforme mostrado na Tabela 1, interagem com pelo menos uma sequência de aminoácido selecionada do grupo consistindo em resíduos de aminoácido variando mais ou menos da posição 15 até mais ou menos a posição 24 de SEQ ID NO: 396; resíduos de aminoácido variando mais ou menos da posição 85 até mais ou menos a posição 103 de SEQ ID NO: 396; resíduos de aminoácido variando mais ou menos da posição 85 até mais ou menos a posição 104 de SEQ ID NO: 396; resíduos de aminoácido variando mais ou menos da posição 113 até mais ou menos a posição 116 da SEQ ID NO: 396. Essas regiões são exemplificadas adicionalmente nas SEQ ID NOs: 402, 403, 404, 412 e 426.
[00191] A presente invenção também inclui anticorpos anti-Fel d1 que se ligam ao mesmo epítopo, ou uma porção do epítopo, como qualquer um dos anticorpos exemplares específicos descritos aqui na Tabela 1, ou um anticorpo tendo as sequências de CDR de qualquer um dos anticorpos exemplares descritos na Tabela 1. Da mesma maneira, a presente invenção também inclui anticorpos anti-Fel d1 que competem pela ligação à Fel d1 ou um fragmento de Fel d1 com qualquer um dos anticorpos exemplares específicos descritos aqui na Tabela 1, ou um anticorpo tendo as sequências de CDR de qualquer um dos anticorpos exemplares descritos na Tabela 1.
[00192] Pode ser determinado com facilidade se um anticorpo se liga ao mesmo epítopo que, ou compete para ligação com um anticorpo anti- Fel d1 de referência usando métodos de rotina conhecidos na técnica. Por exemplo, para determinar se um anticorpo de teste se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-Fel d1 de referência da invenção, o anticorpo de referência é deixado se ligar a uma proteína Fel d1 ou peptídeo sob condições de saturação. Em seguida, a habilidade de um anticorpo de teste em se ligar à molécula de Fel d1 é avaliada. Se o anticorpo de teste for capaz de se ligar à Fel d1 seguindo saturação se ligando com o anticorpo anti-Fel d1 de referência, pode ser concluído que o anticorpo de teste se liga a um epítopo diferente do anticorpo anti- Fel d1 de referência. Por outro lado, se o anticorpo de teste não for capaz de se ligar à molécula de Fel d1 seguindo saturação se ligando com o anticorpo anti-Fel d1 de referência, então o anticorpo de teste pode se ligar ao mesmo epítopo que o epítopo ligado pelo anticorpo anti-Fel 1d de referência da invenção.
[00193] Para determinar se um anticorpo compete para ligação com um anticorpo anti-Fel 1d de referência, a metodologia de ligação descrita acima é realizada em duas orientações: em uma primeira orientação, o anticorpo de referência é deixado se ligar a uma molécula de Fel d1 sob condições de saturação seguido por avaliação de ligação do anticorpo de teste à molécula de Fel d1. Em uma segunda orientação, o anticorpo de teste é deixado se ligar a uma molécula de Fel d1 sob condições de saturação seguido por avaliação de ligação do anticorpo de referência à molécula de Fel d1. Se, em ambas as orientações, apenas o primeiro anticorpo (de saturação) for capaz de se ligar à molécula de Fel d1, então é concluído que o anticorpo de teste e o anticorpo de referência competem para ligação à Fel d1. Como será compreendido por um versado comum de habilidade na técnica, um anticorpo que compete para ligação com um anticorpo de referência pode não necessariamente se ligar ao epítopo idêntico ao anticorpo de referência, mas pode bloquear estericamente ligação do anticorpo de referência através de ligação de um epítopo de sobreposição ou adjacente.
[00194] Dois anticorpos se ligam ao mesmo epítopo ou de sobreposição se cada um inibir competitivamente (bloquear) ligação do outro ao antígeno. Isto é, um excesso de 1, 5, 10, 20 ou 100 vezes de um anticorpo inibe ligação do outro em pelo menos 50%, mas preferivelmente 75%, 90% ou até mesmo 99%, conforme medido em um ensaio de ligação competitivo (vide, por exemplo, Junghans e outros, Cancer Res. 1990 50:1495-1502). Alternativamente, dois anticorpos têm o mesmo epítopo se essencialmente todas as mutações de aminoácido no antígeno que reduzem ou eliminam ligação de um anticorpo reduzirem ou eliminarem ligação do outro. Dois anticorpos têm epítopos de sobreposição se algumas mutações de aminoácido que reduzem ou eliminam ligação de um anticorpo reduzirem ou eliminarem ligação do outro.
[00195] Experimentação de rotina adicional (por exemplo, mutação de peptídeo e análises de ligação) pode então ser realizada para confirmar se a falta observada de ligação do anticorpo de teste é de fato devido à ligação ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência ou se bloqueio estérico (ou outro fenômeno) é responsável pela falta de ligação observada. Experimentos deste tipo podem ser realizados usando ELISA, RIA, ressonância de plasmon de superfície, citometria de fluxo ou qualquer outro ensaio de ligação de anticorpo quantitativo ou qualitativo disponível da técnica.
Imunoconjugados
[00196] A invenção compreende um anticorpo monoclonal anti-Fel d1 humano conjugado a uma porção terapêutica ("imunoconjugado"), tal como um agente que é capaz de reduzir a severidade de uma resposta alérgica ao alérgeno Fel d1 presente em caspa de gato ou em gatos, ou em uma área do ambiente onde gatos podem residir, ou para melhorar pelo menos um sintoma associado com exposição a gatos, caspa de gato ou ao alérgeno Fel d1, incluindo rinite, conjuntivite ou dificuldades respiratórias ou a sua severidade. Tal agente pode ser um corticosteroide, um segundo anticorpo diferente para Fel d1 ou uma vacina. O tipo de porção terapêutica que pode ser conjugada ao anticorpo Fel d1 levará em consideração a condição a ser tratada e o efeito terapêutico desejado a ser obtido. Alternativamente, se o efeito terapêutico desejado for tratar as sequências ou sintomas associados com exposição ao alérgeno Fel d1, ou qualquer outra condição resultante de tal exposição, tal como, mas não limitado a, rinite ou conjuntivite, pode ser vantajoso conjugar um agente apropriado para tratar as sequelas ou sintomas da condição ou aliviar quaisquer efeitos colaterais dos anticorpos da invenção. Exemplos de agentes adequados para formação de imunoconjugados são conhecidos na técnica, vide, por exemplo, WO 05/103081.
Anticorpos Multiespecíficos
[00197] Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos. Anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para epítopos diferentes de um polipeptídeo alvo ou podem conter domínios de ligação ao antígeno específicos para mais de um polipeptídeo alvo. Vide, por exemplo, Tutt e outros, 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer e outros, 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Os anticorpos da presente invenção podem ser ligados a ou coexpressos com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou outra maneira) a uma ou mais outras entidades moleculares, tal como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo para produzir um anticorpo biespecífico ou multiespecífico com uma segunda especificidade de ligação. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos biespecíficos onde um braço de uma imunoglobulina pode ser específico para a cadeia 1 de Fel 1d, ou um fragmento da mesma, e o outro braço da imunoglobulina pode ser específico para cadeia 2 de Fel d1, ou um segundo alvo terapêutico, ou pode ser conjugado a uma porção terapêutica.
[00198] Certas modalidades exemplares da presente invenção incluem uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, que é um anticorpo biespecífico. Cada domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo biespecífico compreende um domínio variável de cadeia pesada (HCVR) e um domínio variável de cadeia leve (LCVR). A HCVR pode também ser referida como uma região VH e a LCVR pode ser também referida como uma região VL. Tipicamente, cada HCVR e LCVR compreende três CDRS interespaçadas com quatro FRs, dispostas do terminal amino para o C-terminalarbóxi na ordem que segue: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As três CDRs dentro de uma HCVR podem ser referidas aqui como HCDR1, HCDR2 e HCDR3; enquanto as três CDRs com uma LCVR podem ser referidas aqui como LCDR1, LCDR2 e LCDR3.
[00199] Nas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção, cada domínio de ligação ao antígeno pode compreender ou consistir em uma molécula de anticorpo integral ou um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo. Os termos "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo, "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo, e similar, conforme aqui usado, incluem qualquer polipeptídeo ou glicoproteína enzimaticamente obtenível, sintético ou geneticamente engenheirado que liga especificamente um antígeno para formar um complexo. Fragmentos de ligação ao antígeno de um anticorpo podem ser derivados, por exemplo, de moléculas de anticorpo integrais usando quaisquer técnicas padrão adequadas tais como técnicas de digestão proteolítica ou de engenharia genética recombinante envolvendo a manipulação e a expressão de DNA codificando domínios variáveis e opcionalmente constantes de anticorpo. Tal DNA é conhecido e/ou está prontamente disponível de, por exemplo, fontes comerciais, bibliotecas de DNA (incluindo, por exemplo, bibliotecas de fago-anticorpo) ou pode ser sintetizado. O DNA pode ser sequenciado e manipulado quimicamente ou usando técnicas de biologia molecular, por exemplo, para dispor um ou mais domínios variáveis e/ou constantes em uma configuração adequada, ou para introduzir códons, criar resíduos cisteína, modificar, adicionar ou deletar aminoácidos, etc.
[00200] Exemplos não limitantes de fragmentos de ligação ao antígeno que podem ser incluídos nas moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção incluem: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab’)2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadeia simples (scFv); (vi) fragmentos dAb; e (vii) unidades de reconhecimento mínimas consistindo nos resíduos de aminoácido que imitam a região hipervariável de um anticorpo. Outras moléculas engenheiradas, tais como anticorpos específicos de domínio, anticorpos de domínio único, anticorpos com domínio deletado, anticorpos quiméricos, anticorpos enxertados com CDR, diacorpos, triacorpos, tetracorpos, minicorpos, nanocorpos (por exemplo, nanocorpos monovalentes, nanocorpos bivalentes, etc), imunofarmacêuticos modulares pequenos (SMIPs) (Small Modular Immunopharmaceuticals) e domínios IgNAR variáveis de tubarão, estão também compreendidos na expressão "fragmento de ligação ao antígeno", conforme aqui usado.
[00201] Um fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo compreenderá tipicamente pelo menos um domínio variável. O domínio variável pode ser de qualquer tamanho ou composição de aminoácido e geralmente compreenderá pelo menos uma CDR, que é adjacente a ou em estrutura com uma ou mais sequências de estrutura principal. Em fragmentos de ligação ao antígeno tendo um domínio VH associado com um domínio VL, os domínios VH e VL podem estar situados um com relação ao outro em qualquer disposição adequada. Por exemplo, a região variável pode ser dimérica e conter dímeros VH-VH, VH-VL ou VLVL. Alternativamente, o fragmento de ligação ao antígeno de um anticorpo pode conter um domínio VH ou VL monomérico.
[00202] Em certas modalidades, um fragmento de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode conter pelo menos um domínio variável covalentemente ligado a pelo menos um domínio constante. Configurações exemplares, não limitantes, de domínios variáveis e constantes que podem ser encontradas dentro de um domínio de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica podem incluir: (i) VH-CH1; (ii) VH-CH2; (iii) VH-CH3; (iv) VH-CH1-CH2; (v) VH-CH1-CH2-CH3; (vi) VH- CH2-CH3; (vii) VH-CL; (viii) VL-CH1; (ix) VL-CH2; (x) VL-CH3; (xi) VL-CH1- CH2; (xii) VL-CH1-CH2-CH3; (xiii) VL-CH2-CH3; e (xiv) VL-CL. Em qualquer configuração de domínios variáveis e constantes, incluindo qualquer uma das configurações exemplares listadas acima, os domínios variáveis e constantes podem ser ou diretamente ligados uns aos outros ou podem ser ligados por uma região de dobra ou ligante integral ou parcial. Uma região de dobra pode consistir em pelo menos 2 (por exemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 ou mais) aminoácidos, que resulta em uma ligação flexível ou semiflexível entre domínios variáveis e/ou constantes adjacentes em uma molécula de polipeptídeo única. Além disso, o domínio de ligação ao antígeno de uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica pode compreender um homodímero ou heterodímero (ou outro multímero) de qualquer uma das configurações de domínios variável e constante listadas acima em associação não covalente um com o outro e/ou com um ou mais domínio VH ou VL monomérico (por exemplo, através de ligações dissulfeto).
[00203] O primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno podem ser diretamente ou indiretamente conectados um ao outro para formar uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Alternativamente, o primeiro domínio de ligação ao antígeno e o segundo domínio de ligação ao antígeno podem ser cada um conectado a um domínio de multimerização separado. A associação de um domínio de multimerização com outro domínio de multimerização facilita a associação entre os dois domínios de ligação ao antígeno, desta maneira formando uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica. Conforme aqui usado, um "domínio de multimerização" é qualquer macromolécula, proteína, polipeptídeo, peptídeo ou aminoácido que tem a habilidade em se associar com um segundo domínio de multimerização de estrutura ou constituição igual ou similar. Por exemplo, um domínio de multimerização pode ser um polipeptídeo compreendendo um domínio CH3 de imunoglobulina. Um exemplo não limitante de um componente de multimerização é uma porção Fc de uma imunoglobulina, por exemplo, um domínio Fc de uma IgG selecionada dos isótipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, bem como qualquer alótipo dentro de cada grupo de isótipo. Em certas modalidades, o domínio de multimerização pode ser um fragmento Fc ou uma sequência de aminoácido de 1 a cerca de 200 aminoácidos de comprimento contendo pelo menos um resíduo cisteína. Em outras modalidades, o domínio de multimerização pode ser um resíduo cisteína ou um peptídeo contendo cisteína curto. Outros domínios de multimerização incluem peptídeos ou polipeptídeos compreendendo ou consistindo em um zíper de leucina, um motivo de hélice-alfa ou um motivo com espiral espiralada.
[00204] Qualquer formato ou tecnologia de anticorpo biespecífico pode ser usado para produzir as moléculas de ligação ao antígeno biespecíficas da presente invenção. Por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo tendo uma primeira especificidade de ligação ao antígeno pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, através de acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou outra maneira) a uma ou mais entidades de molécula, tal como outro anticorpo ou fragmento de anticorpo tendo uma segunda especificidade de ligação ao antígeno para produzir uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica.
[00205] Um formato de anticorpo biespecífico exemplar que pode ser usado no contexto da presente invenção envolve o uso de um primeiro domínio CH3 imunoglobulina (Ig) e um segundo domínio CH3, onde os primeiro e segundo domínios CH3 de Ig diferem um do outro em pelo menos um aminoácido, e onde pelo menos uma diferença de aminoácido reduz ligação do anticorpo biespecífico à Proteína A comparado com um anticorpo biespecífico sem a diferença de aminoácido. Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 de Ig se liga à Proteína A e o segundo domínio CH3 de Ig contém uma mutação que reduz ou abole ligação de Proteína A tal como uma modificação H95R (através da numeração de éxon IMGT; H435R através de numeração EU). O segundo CH3 pode compreender ainda uma modificação U96F (através de IMGT; Y436F através de EU). Modificações adicionais que podem ser encontradas dentro do segundo CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M e V82I (através de IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M e V422I através de EU) no caso de anticorpos para IgG1; N44S, K52N e V82I (IMGT; N384S, K392N e V422I através de EU) no caso de anticorpos de IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q e V82I (através de IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q e V422I através de EU) no caso de anticorpos para IgG4. Variações no formato de anticorpo biespecífico descrito acima são compreendidas no escopo da presente invenção.
[00206] Outros formatos biespecíficos exemplares que podem ser usados no contexto da presente invenção incluem, sem limitação, por exemplo, formatos biespecíficos baseados em scFv ou diacorpo, fusões de IgG-scFv, domínio variável duplo (DVD)-Ig, Quadroma, knobs-into- holes, cadeia leve comum (por exemplo, cadeia leve comum com knobs- into-holes, etc), CrossMab, CrossFab, (SEED)corpo, zíper de leucina, Duobody, IgG1/IgG2, FAB de ação dupla (DAF)-IgG e formatos biespecíficos Mab2 (vide, por exemplo, Klein e outros, 2012, mAbs 4:6, 1-11, e referências mencionadas no mesmo, quanto a uma revisão dos formatos acima). Anticorpos biespecíficos podem também ser construídos usando conjugação de peptídeo/ácido nucleico, por exemplo, onde aminoácidos não naturais com reatividade química ortogonal são usados para gerar conjugados de anticorpo- oligonucleotídeo específicos de sítio que então realizam automontagem em complexos multiméricos com composição, valência e geometria definidas. (Vide, por exemplo, Kazane e outros, J. Am. Chem. Soc. [Epub: 4 de dezembro de 2012]).
Administração e Formulações Terapêuticas
[00207] A invenção provê composições terapêuticas compreendendo os anticorpos anti-Fel d1 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da presente invenção. A administração de composições farmacêuticas de acordo com a invenção será realizada através de uma via adequada incluindo, mas não limitado a, intravenosamente, subcutaneamente, intramuscularmente, intranasalmente, com carreadores, excipientes e outros agentes adequados que são incorporados a formulações para prover transferência, administração, tolerância e similar aperfeiçoadas. Uma variedade de formulações apropriadas pode ser encontrada no formulário conhecido de todos os químicos farmacêuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA. Essas formulações incluem, por exemplo, pós, pastas, unguentos, geleias, ceras, óleos, lipídeos, vesículas contendo lipídeo (catiônico ou aniônico) (tal como LIPOFECTINA®), conjugados de DNA, pastas de absorção anidras, emulsões óleo-em-água ou água-em-óleo, emulsões carbowax (polietileno glicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos e misturas semissólidas contendo carbowax. Vide também Powell e outros, "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J. Pharm. Sci. Technol. 52:238-311.
[00208] A dose de anticorpo pode variar dependendo da idade e do tamanho de um indivíduo a ser administrado, doença alvo, condições, via de administração e similar. Quando o anticorpo da presente invenção é usado para tratamento da rinite ou conjuntivite associada com exposição a um gato, ou à caspa de gato em um indivíduo tendo uma sensibilidade à Fel d1, ou para prevenção de uma resposta anafilática ao alérgeno de gato, ou para diminuição da severidade da resposta alérgica, é vantajoso administrar intravenosamente o anticorpo da presente invenção normalmente em uma dose única de cerca de 0,01 a cerca de 30 mg/kg de peso corporal, mais preferivelmente cerca de 0,02 a cerca de 7, cerca de 0,03 a cerca de 5 ou cerca de 0,05 a cerca de 3 mg/kg de peso corporal. Dependendo da severidade da condição, a frequência e a duração do tratamento podem ser ajustados. Em certas modalidades, o fragmento de ligação a anticorpo ou antígeno do mesmo da invenção pode ser administrado como uma dose inicial de pelo menos cerca de 0,1 mg a cerca de 800 mg, cerca de 1 a cerca de 500 mg, cerca de 5 a cerca de 300 mg ou cerca de 10 a cerca de 200 mg, a cerca de 100 mg ou a cerca de 50 mg. Em certas modalidades, a dose inicial pode ser seguida pela administração de uma segunda ou uma pluralidade de doses subsequentes do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo em uma quantidade que pode ser aproximadamente a mesma ou menor do que aquela da dose inicial, onde as doses subsequentes são separadas por pelo menos 1 dia a 3 dias; pelo menos uma semana, pelo menos duas semanas; pelo menos 3 semanas; pelo menos 4 semanas; pelo menos 5 semanas; pelo menos 6 semanas; pelo menos 7 semanas; pelo menos 8 semanas; pelo menos 9 semanas; pelo menos 10 semanas; pelo menos 12 semanas; ou pelo menos 14 semanas.
[00209] Vários sistemas de administração são conhecidos e podem ser usados para administrar a composição farmacêutica da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressão dos vírus mutantes, endocitose mediada por receptor (vide, por exemplo, Wu e outros (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432). Métodos de introdução incluem, mas não estão limitados a vias intradérmica, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural e oral. A composição pode ser administrada através de qualquer via conveniente, por exemplo, através de injeção de infusão ou bolo, através de absorção pelo revestimento epitelial ou mucocutâneo (por exemplo, mucosa oral, mucosas retal e intestinal, etc) e pode ser administrada junto com outros agentes biologicamente ativos. Administração pode ser sistêmica ou local.
[00210] A composição farmacêutica pode ser também administrada em uma vesícula, em particular um lipossoma (vide, por exemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533).
[00211] Em certas situações, a composição farmacêutica pode ser administrada em um sistema de liberação controlada. Em uma modalidade, uma bomba pode ser usada. Em outra modalidade, materiais poliméricos podem ser usados. Em ainda outra modalidade, um sistema de liberação controlada pode ser posto em proximidade do alvo da composição, desta maneira requerendo apenas uma fração da dose sistêmica.
[00212] As preparações injetáveis podem incluir formas de dosagem para injeções intravenosas, subcutâneas, intracutâneas e intramusculares, infusões por gotejamento, etc. Essas preparações injetáveis podem ser preparadas através de métodos publicamente conhecidos. Por exemplo, as preparações injetáveis podem ser preparadas, por exemplo, dissolvendo, suspendendo ou emulsificando o anticorpo ou seu sal descrito acima em um meio aquoso estéril ou um meio oleoso convencionalmente usado para injeções. Como o meio aquoso para injeções, há, por exemplo, solução salina fisiológica , uma solução isotônica contendo glicose e outros agentes auxiliares, etc., que podem ser usados em combinação com um agente de solubilização apropriado tal como um álcool (por exemplo, etanol), um poliálcool (por exemplo, propileno glicol, polietileno glicol), um tensoativo não iônico [por exemplo, polissorbato 80, HCO-50 (aduto de polioxietileno (50 mol) de óleo de rícino hidrogenado)], etc. Como o meio oleoso, são empregados, por exemplo, óleo de sésamo, óleo de soja, etc, que podem ser usados em combinação com um agente de solubilização tais como benzoato de benzila, álcool benzílico, etc. A injeção então preparada é preferivelmente cheia em uma ampola apropriada.
[00213] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada subcutaneamente ou intravenosamente com agulha e seringa padrão. Ainda, com relação à administração subcutânea, um dispositivo de administração em caneta tem prontas aplicações na administração de uma composição farmacêutica da presente invenção. Tal dispositivo de administração em caneta pode ser reutilizável ou descartável. Um dispositivo de administração em caneta reutilizável geralmente utiliza um cartucho substituível que contém uma composição farmacêutica. Uma vez toda a composição farmacêutica dentro do cartucho tendo sido administrada e o cartucho está vazio, o cartucho vazio pode ser prontamente descartado e substituído com um cartucho novo que contém a composição farmacêutica. O dispositivo de administração em caneta pode ser então reutilizado. Em um dispositivo de administração em caneta descartável, não há nenhum cartucho substituível. Ao contrário, o dispositivo de administração em caneta descartável vem pré-cheio com a composição farmacêutica mantida em um reservatório dentro do dispositivo. Uma vez o reservatório estando vazio, todo o dispositivo é descartado.
[00214] Vários dispositivos de administração em caneta e autoinjetores reutilizáveis têm aplicações na administração subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção. Exemplos incluem, mas certamente não estão limitados a, AUTOPEN® (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), caneta DISETRONIC® (Disetronic Medical Systems, Burghdorf, Suíça), caneta HUMALOG MIX 75/25®, caneta HUMALOG®, caneta HUMALIN 70/30® (Eli Lilly and Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN® I, II e III (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR® (Novo Nordisk, Copenhagen, Dinamarca), caneta BD® (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN®, OPTIPEN PRO®, OPTIPEN STARLET® eOPTICLIK® (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemanha), para mencionar alguns. Exemplos de dispositivos de administração em caneta tendo aplicações em administração subcutânea de uma composição farmacêutica da presente invenção incluem, mas certamente não estão limitados a caneta SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), a FLEXPEN® (Novo Nordisk) e a KWIKPEN® (Eli Lilly), o Autoinjetor SURECLICK® (Amgen, Thousands Oaks, CA), a PENLET® (Haselmeier, Stuttgart, Alemanha), a EPIPEN (Dey, L.P.) e Caneta HUMIRA® (Abbott Labs, Abbott Park, IL), para mencionar alguns.
[00215] Vantajosamente, as composições farmacêuticas para uso oral ou parenteral descritas acima são preparadas em formas de dosagem em uma dose unitária adequada para se ajustar a uma dose dos ingredientes ativos. Tais formas de dosagem em uma dose unitária incluem, por exemplo, comprimidos, pílulas, cápsulas, injeções (ampolas), supositórios, etc. A quantidade do anticorpo mencionado acima contido é geralmente cerca de 5 a cerca de 500 mg por forma de dosagem em uma dose unitária; especialmente na forma de injeção, é preferido que o anticorpo mencionado acima esteja contido em cerca de 5 a cerca de 100 mg e em cerca de 10 a cerca de 250 mg para as outras formas de dosagem. Usos Terapêuticos dos Anticorpos
[00216] Devido à sua interação com Fel d1, os presentes anticorpos são úteis para tratamento da resposta primária seguindo exposição de um indivíduo a um gato, caspa de gato ou a um ambiente contendo a proteína Fel d1, ou pelo menos um sintoma associado com a resposta alérgica, tais como olhos coçando, conjuntivite, rinite, espirros, dificuldades de respirar ou para prevenção de uma resposta secundária ao alérgeno Fel d1, incluindo uma resposta anafilática mais séria, ou para diminuição da severidade, duração e/ou frequência de sintomas seguindo reexposição ao alérgeno de gato. Desta maneira, é pretendido que os anticorpos da presente invenção possam ser usados profilaticamente ou terapeuticamente.
[00217] Em uma modalidade adicional da invenção os presentes anticorpos são usados para a preparação de uma composição farmacêutica para tratamento de pacientes sofrendo de uma sensibilidade a gatos, caspa de gato, pelo de gato ou um extrato do mesmo e/ou à proteína Fel d1. Em ainda outra modalidade da invenção os anticorpos presentes são usados para a preparação de uma composição farmacêutica para redução da severidade de exposição primária à Fel d1 ou para redução da severidade, duração de e/ou número de respostas alérgicas à Fel d1. Em uma modalidade adicional da invenção, os presentes anticorpos são usados como terapia adjunta com outro agente útil para tratamento de alérgenos de gato, incluindo corticosteroides, vacinas, imunoterapia específica de alérgeno (SIT) ou qualquer outra terapia paliativa conhecida daqueles versados na técnica.
Terapias de Combinação
[00218] Terapias de combinação podem incluir um anticorpo anti-Fel d1 da invenção e qualquer agente terapêutico adicional que pode ser vantajosamente combinado com um anticorpo da invenção ou com um fragmento biologicamente ativo de um anticorpo da invenção.
[00219] Por exemplo, um segundo agente terapêutico pode ser empregado para auxiliar na redução dos sintomas alérgicos seguindo exposição a um gato, caspa de gato, pelo de gato ou um extrato do mesmo ou Fel d1, ou sendo exposto a um ambiente onde um gato reside, tal como um corticosteroide. Os anticorpos podem ser também usados em conjunto com outras terapias, tal como uma vacina específica para o alérgeno Fel d1. O componente(s) terapeuticamente ativo adicional pode ser administrado antes da, concomitante com ou após a administração do anticorpo anti-Fel d1 da presente invenção. Para propósitos da presente invenção, tais regimes de administração são considerados a administração de um anticorpo anti-Fel d1 "em combinação com" um segundo componente terapeuticamente ativo.
Regimes de Administração
[00220] De acordo com certas modalidades da presente invenção, doses múltiplas de um ou mais anticorpos anti-Fel d1 (uma combinação de anticorpo) ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica podem ser administradas a um indivíduo durante um curso de tempo definido. Os métodos de acordo com este aspecto da invenção compreendem administrar sequencialmente a um indivíduo doses múltiplas de um anticorpo, combinação de anticorpo ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção. Conforme aqui usado, "administrar sequencialmente" significa que cada dose de um anticorpo, combinação de anticorpo ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica é administrada ao indivíduo em um ponto de tempo diferente, por exemplo, em dias separados por um intervalo predeterminado (por exemplo, horas, dias, semanas ou meses). A presente invenção inclui métodos que compreendem administrar sequencialmente ao paciente uma dose inicial única de um anticorpo, combinação de anticorpo ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, seguido por uma ou mais doses secundárias do anticorpo, e opcionalmente seguido por uma ou mais doses terciárias do anticorpo.
[00221] Os termos "dose inicial", "doses secundárias" e "doses terciárias" se referem à sequência temporal de administração de um anticorpo, combinação de anticorpo ou um a molécula de ligação ao antígeno biespecífica da invenção. Desta maneira, a "dose inicial" é a dose que é administrada no início do regime de tratamento (também referida como a "dose de linha de base"); as "doses secundárias" são as doses que são administradas após a dose inicial; e as "doses terciárias" são as doses que são administradas após as doses secundárias. As doses inicial, secundária e terciária podem todas conter a mesma quantidade de um anticorpo, combinação de anticorpo ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica, mas geralmente podem diferir umas das outras em termos de frequência de administração. Em certas modalidades, no entanto, a quantidade de um anticorpo, combinação de anticorpo ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica contida nas doses inicial, secundária e/ou terciária varia uma da outra (por exemplo, ajustada para cima e para baixo conforme apropriado) durante o curso do tratamento. Em certas modalidades, duas ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) doses são administradas no início do regime de tratamento como "doses de carga" seguido por doses subsequentes que são administradas em uma base menos frequente (por exemplo, "doses de manutenção").
[00222] Em uma modalidade exemplar da presente invenção, cada dose secundária e/ou terciária é administrada 1 a 26 (por exemplo, 1, 17, 2, 27, 3, 37, 4, 47, 5, 57, 6, 67, 7, 77, 8, 87, 9, 97, 10, 107, 11, 117, 12, 127, 13, 137, 14, 147, 15, 157, 16, 167, 17, 177, 18, 187, 19, 197, 20, 207, 21, 217, 22, 227, 23, 237, 24, 247, 25, 257, 26, 267 ou mais) semanas após a dose mediatamente precedente. A expressão "a dose imediatamente precedente", conforme aqui usado, significa, em uma sequência de administrações múltiplas, a dose de um anticorpo, combinação de anticorpo ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que é administrada a um paciente antes da administração da próxima dose imediata na sequência sem quaisquer doses intervenientes.
[00223] Os métodos de acordo com este aspecto da invenção podem compreender administração a um paciente de qualquer número de doses secundárias e/ou terciárias de um anticorpo, combinação de anticorpo ou uma molécula de ligação ao antígeno biespecífica que se liga especificamente à Fel d1. Por exemplo, em certas modalidades, apenas uma dose secundária única é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais doses secundárias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) são administradas ao paciente. Da mesma maneira, em certas modalidades, apenas uma dose terciária única é administrada ao paciente. Em outras modalidades, duas ou mais doses terciárias (por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou mais) são administradas ao paciente.
[00224] Em modalidades envolvendo doses secundárias múltiplas, cada dose secundária pode ser administrada na mesma frequência que as outras doses secundárias. Por exemplo, cada dose secundária pode ser administrada ao paciente 1 a 2 semanas após a dose imediatamente precedente. Similarmente, em modalidades envolvendo doses terciárias múltiplas, cada dose terciária pode ser administrada na mesma frequência que as outras doses terciárias. Por exemplo, cada dose terciária pode ser administrada ao paciente 2 a 4 semanas após a dose imediatamente precedente. Alternativamente, a frequência na qual as doses secundárias e/ou terciárias são administradas a um paciente pode variar durante o curso do regime de tratamento. A frequência de administração pode também ser ajustada durante o curso de tratamento por um médico dependendo das necessidades do paciente individual seguindo exame clínico.
Usos para Diagnóstico dos Anticorpos
[00225] Os anticorpos anti-Fel d1 da presente invenção podem ser também usados para detectar e/ou medir Fel d1 em uma amostra, por exemplo, para propósitos de diagnóstico. É pretendido que confirmação de uma resposta alérgica imaginada ser causada por Fel d1 possa ser feita através de medição da presença de qualquer Fel d1 através do uso de qualquer um ou mais dos anticorpos da invenção. Ensaios de diagnóstico exemplares para Fel d1 podem compreender, por exemplo, contato de uma amostra, obtida de um paciente com um anticorpo anti- Fel d1 da invenção, onde o anticorpo anti-Fel d1 é marcado com um marcador ou molécula repórter detectável ou usado como um ligante de captura para seletivamente isolar proteína Fel d1 de amostras de paciente. Alternativamente, um anticorpo anti-Fel d1 não marcado pode ser usado em aplicações de diagnóstico em combinação com um anticorpo secundário que é sozinho detectavelmente marcado. O marcador ou molécula repórter detectável pode ser um radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S ou 125I; uma porção fluorescente ou quimioluminescente tal como isotiocianato de fluoresceína ou rodamina; ou uma enzima tal como fosfatase alcalina, β-galactosidase, peroxidase de rábano silvestre ou luciferase. Ensaios exemplares específicos que podem ser usados para detectar ou medir Fel d1 em uma amostra incluem ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA) e classificação de célula ativada por fluorescência (FACS).
[00226] Amostras que podem ser usadas em ensaios de diagnóstico de Fel d1 de acordo com a presente invenção incluem qualquer amostra de tecido ou fluido obtenível de um paciente, que contém quantidades detectáveis de proteína Fel d1, ou fragmentos da mesma, sob condições normais ou patológicas. Em geral, os níveis de Fel d1 em uma amostra particular obtida de um paciente saudável/não alérgico (por exemplo, um paciente não afligido com uma sensibilidade associada com a presença de Fel d1) serão medidos para inicialmente estabelecer um nível de linha de base, ou padrão, de Fel d1. Este nível de linha de base de Fel d1 pode ser então comparado com os níveis de Fel d1 medidos em amostras obtidas de indivíduos suspeitos de ter uma sensibilidade à Fel d1 em caspa de gato, ou sintomas associados com tal condição. Exemplos
[00227] Os exemplos que seguem são mostrados de maneira a prover aqueles de habilidade comum na técnica com revelação e descrição completas de como fazer e usar os métodos e composições da invenção e não pretendem limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção. Esforços foram feitos para assegurar precisão com relação a números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc), mas alguns erros experimentais e desvios devem ser levados em consideração. A menos que de outro modo indicado, partes são partes em peso, peso molecular é peso molecular médio, temperatura é em graus Centígrados e pressão é na ou próximo da atmosférica.
Exemplo 1. Geração de Anticorpos Humanos para Fel d1
[00228] Um imunógeno compreendendo qualquer um dos acima pode ser usado para gerar anticorpos para Fel d1. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção são obtidos de camundongos imunizados com um imunógeno primário, tal como Fel d1 natural de comprimento integral (nFel d1), que pode ser comprado comercialmente (por exemplo, da Indoor Biotechnologies, # LTN-FD1-1), ou isolado de pelo de gato ou caspa de gato através de cromatografia de coluna em multietapa (vide, por exemplo, Chapman, M.D. e outros (1988), J. Immunol. 140:812-818), ou que pode ser produzido recombinantemente (vide número de acesso GenBank P30438 ou NP_001041618.1 para a sequência de aminoácido de comprimento integral de cadeia 1 de Fel d1 (também referida como cadeia A de FELD 1A; vide também SEQ ID NO: 392) e número de acesso GenBank P30440 ou NP_001041619.1 para a sequência de aminoácido de comprimento integral de cadeia 2 de Fel d1 (também referida como cadeia B de FELD B; vide também SEQ ID NO: 393) ou fragmentos ou de cadeia 1 ou cadeia 2 ou fragmentos de ambas as cadeias 1 e 2 da proteína Fel d1, seguido por imunização com um imunógeno secundário, ou com um fragmento imunogenicamente ativo da proteína natural. Os animais podem ser imunizados ou com proteína da cadeia 1 sozinha ou proteína de cadeia 2 sozinha, ou com ambas as proteínas de cadeia 1 e cadeia 2, administradas sequencialmente ou concomitantemente. Várias construções podem ser preparadas usando porções de cadeia 1 e cadeia 2 junto com várias estratégias de ligação ou espaçadoras conhecidas daqueles versados na técnica. Essas construções podem ser usadas sozinhas ou em várias combinações para desencadear respostas de anticorpo in vivo. Por exemplo, construções de Fel d1 recombinantes, tais como aquelas exemplificadas em SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 ou 397, ou fragmentos das mesmas, podem ser usadas como imunógenos.
[00229] Em certas modalidades, os anticorpos da invenção são obtidos de camundongos imunizados com um imunógeno primário, tal como fragmento biologicamente ativo e/ou imunogênico de Fel d1 natural ou DNA codificando o fragmento ativo do mesmo. O fragmento pode ser derivado do domínio N-terminal ou C-terminal da cadeia 1 e/ou cadeia 2 de Fel d1.
[00230] Em certas modalidades, o imunógeno de Fel d1 recombinantemente produzido pode ser feito através de fusão direta das duas cadeias de Fel d1, conforme descrito em Kaiser e outros, para produzir um produto de fusão que tem um padrão de redobra similar àquele de Fel d1 natural (Kaiser, L. e outros (2003), J. BIol. Chem. 278(39): 37730-37735). Em certas modalidades, o imunógeno pode ser uma proteína de fusão tais como aquelas mostradas nas construções de SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 ou 397, seguido por imunização com um imunógeno secundário, ou com um fragmento imunogenicamente ativo da Fel d1 natural ou recombinantemente produzida.
[00231] Em certas modalidades, as construções de proteína Fel d1 recombinante usadas nos estudos descritos aqui são compreendidas de qualquer uma de i) cadeia B de Fel 1d (cadeia 2) e cadeia A de Fel d1 (cadeia 1) ligadas como uma fusão em linha, contínua (com a cadeia B de Fel d1 no N-terminal) ou ii) uma fusão em linha, contínua, com a cadeia A de Fel d1 no N-terminal seguido por um ligante flexível [(Gly4Ser)3] seguido por B Fel d1. Essas construções podem também incluir um marcador C-terminal (myc-myc-His6 ou região Fc de IgG2a de camundongo), conforme indicado abaixo. As proteínas foram expressas em células de ovário de Hamster Chinês (CHO) (Chinese Hamster Ovary). Uma sequência de sinal exógena usada para promover expressão em células CHO não está incluída nessas listagens de sequência.
[00232] Em certas modalidades, o imunógeno pode ser uma proteína de fusão compreendendo qualquer um ou mais do que segue: i) resíduos de aminoácido 18-109 da cadeia 2 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank P30440 e também SEQ ID NO: 393) fundidos através do C-terminal diretamente com o N-terminal de resíduos de aminoácido 23-92 de cadeia 1 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank P30438 e também SEQ ID NO: 392); ii) resíduos de aminoácido 23-92 de cadeia 1 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank P304438 e também SEQ ID NO: 392) fundidos através do C-terminal ao N-terminal de resíduos de aminoácido 18-109 de cadeia 2 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank P30440 e também SEQ ID NO: 393); iii) resíduos de aminoácido 18-109 de cadeia 2 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank NP_001041619.1) fundidos através do C-terminal com o N- terminal de resíduos de aminoácido 19-88 de cadeia 1 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank NP_001041618.1), tal como a construção mostrada na SEQ ID NO: 394 ou 396; iv) resíduos de aminoácido 19-88 de cadeia 1 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank NP_001041618.1) fundidos através do C-terminal ao N-terminal de resíduos de aminoácido 18-109 de cadeia 2 de Fel d1 (vide número de acesso GenBank NP_001041619.1). Vide também SEQ ID NO: 395. Em certas modalidades, a proteína de fusão pode ter um marcador na extremidade C terminal da construção, tal como um marcador myc-myc- hexaistidina (vide SEQ ID NO: 385, 396 ou 397 para tais construções). Em modalidades relacionadas, a proteína de fusão pode ter um Fc de camundongo acoplado à extremidade C terminal da construção (vide SEQ ID NO: 394 ou 395 para tais construções). Em certas modalidades, as cadeias 1 e 2 são acopladas através de um ligante conhecido daqueles de habilidade na técnica, por exemplo, (G4S)3 (vide SEQ ID NOs: 395 e 397 para tal construção).
[00233] Em certas modalidades, anticorpos que se ligam especificamente à Fel d1 podem ser preparados usando fragmentos das regiões mencionadas acima ou peptídeos que se estendem além das regiões designadas por cerca de 5 a cerca de 20 resíduos de aminoácido de uma, ou ambas, as extremidades N ou C terminais das regiões descritas aqui. Em certas modalidades, qualquer combinação das regiões mencionadas acima ou fragmentos das mesmas pode ser usada na preparação de anticorpos específicos para Fel d1. Em certas modalidades, qualquer uma ou mais das regiões mencionadas acima de Fel d1, ou seus fragmentos, pode ser usada para a preparação de anticorpos monoespecíficos, biespecíficos ou multiespecíficos.
[00234] As proteínas de comprimento integral, ou fragmentos das mesmas, que foram usadas como imunógenos, conforme mencionado acima, foram administradas diretamente, com um adjuvante para estimular a resposta imune, a um camundongo VELOCIMMUNE® compreendendo DNA codificando regiões variáveis de cadeia pesada de imunoglobulina e leve kappa humanas. A resposta imune de anticorpo foi monitorada através de um imunoensaio específico para Fel d1. Quando uma resposta imune desejada foi obtida esplenócitos foram coletados e fundidos com células de mieloma de camundongo para preservar sua viabilidade e formar linhagens de célula de hibridoma. As linhagens de célula de hibridoma foram avaliadas e selecionadas para identificar linhagens de célula que produzem anticorpos específicos para Fel d1. Usando esta técnica, e os vários imunógenos descritos acima, vários anticorpos quiméricos, anti-Fel d1 (isto é, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes de camundongo) foram obtidos; certos anticorpos exemplares gerados desta maneira foram chamados H1M1230N, H1M1234N, H1M1241N, H2M1233N, H2M1236N, H2M1237N e H2M1242N.
[00235] Anticorpos anti-Fel d1 foram também isolados diretamente de células B positivas para antígeno sem fusão a células de mieloma, conforme descrito na U.S. 2007/0280945A1. Usando este método, vários anticorpos anti-Fel d1 integralmente humanos (isto é, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes humanos) foram obtidos; anticorpos exemplares gerados desta maneira foram chamados como segue: H4H2574P, H4H2590S, H4H2592B, H4H2594S, H4H2597P, H4H2606B, H4H2607B, H4H2608B, H4H2636P, H4H2645P, H4H2793P, H4H2797P e H4H2864P.
[00236] As propriedades biológicas dos anticorpos exemplares gerados de acordo com os métodos deste Exemplo são descritas em detalhes nos Exemplos mostrados abaixo.
Exemplo 2. Sequências de Aminoácido de Região Variável de Cadeias Pesada e Leve
[00237] A Tabela 1 mostra os pares de sequência de aminoácido de região variável de cadeias pesada e leve de anticorpos selecionados específicos para Fel d1 e seus identificadores de anticorpo correspondentes. Anticorpos são tipicamente referidos aqui de acordo com a nomenclatura que segue: prefixo Fc (por exemplo, "H4H", "H1M", "H2M", seguido por um identificador numérico (por exemplo, "1232" conforme mostrado na Tabela 1), seguido por um sufixo "P" ou "N". Desta maneira, de acordo com sua nomenclatura, um anticorpo pode ser referido como, por exemplo, "H1M1232N". Os prefixos H4H, H1M e H2M nas designações de anticorpo usadas aqui indicam a região Fc particular do anticorpo. Por exemplo, um anticorpo "H2M" tem uma Fc de IgG2 de camundongo, enquanto um anticorpo "H4H" tem uma Fc HgG4 humana. Como será compreendido por um versado comum na técnica, um anticorpo H1M ou H2M pode ser convertido em um anticorpo H4H, e vice-versa, mas em qualquer caso, os domínios variáveis (incluindo as CDRs), que são indicados pelos identificadores numéricos mostrados na Tabela 1, permanecerão os mesmos. Anticorpos tendo a mesma designação de anticorpo numérica, mas diferindo por um sufixo de letra de N, B, S ou P se referem a anticorpos tendo cadeias pesada e leve com sequências de CDR idênticas, mas com variações de sequência em regiões que estão fora da sequência de CDR (isto é, as regiões de estrutura principal). Desta maneira, variantes N, B, S e P de um anticorpo particular têm sequências de CDR idênticas dentro de suas regiões variáveis de cadeias pesada e leve, mas diferentes umas das outras dentro de suas regiões de estrutura principal.
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Exemplo 3. Análise de Utilização de Gene Variável
[00238] Para analisar a estrutura de anticorpos produzidos, os ácidos nucleicos codificando regiões variáveis de anticorpo foram clonados e sequenciados. A partir da sequência de ácido nucleico e sequências de aminoácido previstas dos anticorpos, uso de gene (VH, D, JH, VK ou JK) foi identificado para cada Região Variável de Cadeia Pesada (HCVR) e Região Variável de Cadeia Leve (LCVR). A Tabela 2 mostra o uso de gene para anticorpos selecionados de acordo com a invenção. Tabela 2
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Exemplo 4: Ligação de Anticorpo à Fel d1 Conforme Determinado através de Ressonância de Plasmon de Superfície
[00239] Constantes de taxa associativas e dissociativas de ligação (Ka e kd, respectivamente) e constantes de dissociação de equilíbrio calculadas e meias-vidas dissociativas (KD e t1/2, respectivamente) para ligação de antígeno a anticorpos monoclonais anti-Fel d1 foram determinadas usando um ensaio biossensor de ressonância de plasmon de superfície em tempo real (Biacore T200 ou Biacore 2000). A superfície do sensor Biacore foi derivatizada ou com anticorpo anti- camundongo de coelho policlonal (GE Healthcare, # BR-1008-38) ou com anticorpo Fc anti-humano de camundongo monoclonal (GE Healthcare, # BR-1008-39) para capturar anticorpos anti-Fel d1, expressos com Fc de camundongo (prefixo ID do anticorpo H1M, H2M, H2aM, H2bM) ou Fc de IgG4 humana (prefixo ID do anticorpo H4H), respectivamente. Para ajustes cinéticos, pelo menos duas concentrações diferentes (variando de 390 pM a 67 nM) de Fel d1 natural (Indoor Biotech, # NA-FD1-2) ou uma versão recombinante da proteína, Fel dl (B-A) -mmH (SEQ ID NO: 396), foram injetadas na superfície de captura de anticorpo monoclonal anti-Fel d1 a 25°C em uma taxa de fluxo de 50 μl/min em tampão de atividade (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, P2O 0,05%, MgCl2 3 mM, CaCl2 3 mM). Fel d1 (B-A)- mmH foi expressa em células de ovário de hamster Chinês (CHO) e é compreendida de aminoácidos 18-109 de Fel d1 B (No. acesso P30440) fundidos em linha com aminoácidos 23-92 de Fel d1 A (No. de acesso P30438) com um marcador de myc-myc-hexaistidina C-terminal. Associação de anticorpo-antígeno foi monitorada por 3 a 5 minutos e a dissociação de antígeno do anticorpo monoclonal de captura (em tampão de atividade sozinho a 25°C) foi monitorada por 10 a 15 minutos. Constantes de taxa de associação (Ka) e dissociação (Kd) cinéticas foram determinadas através do processamento e ajuste dos dados a um modelo de ligação 1:1 usando software de ajuste de curva Scrubber 2.0. Meias-vidas de constantes de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) e dissociativas (t1/2) foram calculadas a partir das constantes de taxa cinética como: KD = Kd/Ka e t1/2 = In(2)/kd. Parâmetros de ligação para anticorpos monoclonais anti-Fel d1 diferentes são tabulados na Tabela 3 e na Tabela 4. A Tabela 3 mostra as afinidades Biacore a 25°C para ligação de Fel d1 natural a anticorpos monoclonais anti-Fel d1 capturados e a Tabela 4 mostra as afinidades Biacore a 25°C para Fel d1 recombinante se ligando a anticorpos monoclonais anti-Fel d1 capturados.
[00240] Conforme mostrado na Tabela 3, 10 dos 25 anticorpos testados exibiram valores KD abaixo de 1 nM para ligação à Fel d1 natural, variando de 207 pM a 982 pM. Conforme mostrado na Tabela 4, 17 dos 25 anticorpos testados exibiram valores KD abaixo de 1 nM para ligação à Fel d1 recombinante, variando de 144 pM a 924 pM. Os dois anticorpos, H4H2574B e H4H2793P, se ligaram a à Fel d1 recombinante, mas não natural, sob essas condições experimentais. Tabela 3
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*Devido à afinidade de ligação menor observada, concentrações injetadas maiores de Fel d1 natural (67 nM, 200 nM e 600 nM) foram usadas para esta amostra. Tabela 4
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*Devido à afinidade de ligação menor observada, concentrações injetadas maiores de Fel d1 natural (67 nM, 200 nM e 600 nM) foram usadas para esta amostra.
Exemplo 5: Competição Cruzada de Anticorpos anti-Fel d1 para Ligação à Fel d1 Natural (n)
[00241] Um experimento de ligação foi realizado usando um Octet Red biosensor system (Fortebio Inc.) para determinar competição cruzada para um painel de 8 anticorpos anti-Fel d1 se ligando à Fel d1natural (nFel d1; Indoor Biotechnologies, #NA-FD1-2). O experimento foi realizado a 25°C em tampão HBST (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15M, EDTA 3 mM, Surfactant P20 0,05% v/v) contendo BSA 0,1 mg/mL. Uma etapa de lavagem com o tampão de HBST foi realizada entre cada etapa de ligação, e as placas foram agitadas durante as etapas de ligação e lavagem usando um agitador de placa orbital a 1000 rpm. Um primeiro anticorpo anti-Fel d1 (mAb-1) foi capturado por 2 minutos na superfície do biossensor anti-hFc a partir das soluções de estoque de anticorpo a 10 ug/mL (níveis de captura finais de unidades de resposta de ~1,5 nm). As ponteiras do sensor revestidas foram então bloqueadas por 5 minutos com uma solução 100 ug/mL de um anticorpo irrelevante. As ponteiras do sensor foram então submersas em cavidades contendo 500 nM de nFel d1 por 5 minutos e então em cavidades contendo soluções 50 ug/mL de um segundo anticorpo anti-Fel d1 (mAb-2). As soluções de mAb-2 foram suplementadas com 100 ug/mL de um anticorpo irrelevante para minimizar ligação não específica. As respostas de ligação para mAb- 2 se ligando à nFel-d1 pré-complexado com mAb-1 foram medidas para a matriz de anticorpo 8x8 (Tabela 5). Cada valor de ligação para mAb-2 se ligando a uma superfície de captura de mAb-1/Fel d1 diferente (uma coluna inferior na Tabela 5) foi subtraído pelo valor de autocompetição mAb-1/Fel d1/mAb-2 (onde mAb-1 = mAb-2; na diagonal na Tabela 5). Os valores abaixo de 0,10 nm indicam competição cruzada de mAb-1 e mAb-2 para um sítio de ligação comum em Fel d1.
[00242] Quatro anticorpos, H4H2636P, H4H1616N, H4H2645P e H4H2864P, competem bidirecionalmente um com o outro para ligação à nFel d1, mas não competem com nenhum dos outros anticorpos anti- Fel d1. Dois anticorpos, H4H1232N e H4H2597P, competem bidireccionalmente um com o outro para ligação à nFel d1. Ambos o H4H1232N e H4H2597P competem unidirecionalmente com H4H1300N. Competição bidirecional com H4H1300N não foi possível ser determinada porque H4H1300N não pré-complexou com nFel d1. H4H1238N não competiu com nenhum dos anticorpos anit-Fel d1 para ligação à nFel d1.
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Exemplo 6. Efeito de Anticorpos anti-Fel d-1 em um Modelo in vivo de Anafilaxia Cutânea Passiva (PCA)
[00243] O modelo in vivo de anafilaxia cutânea passiva (PCA) foi usado para avaliar desgranulação de mastócito in vivo. O modelo envolve injeção intradérmica de um antissoro específico de alérgeno em uma área local na pele seguido por injeção intravenosa de um antígeno junto com um corante. A reação alérgica causa dilatação capilar e permeabilidade vascular aumentada no sítio de sensibilização, resultando em acúmulo preferencial de corante neste sítio. O corante pode ser extraído do tecido e quantificado espectrofotometricamente. Extravasamento de corante para tecido sensibilizado com antissoro de teste é comparado com extravasamento para tecido sensibilizado com um antissoro não relevante.
[00244] Antissoros foram gerados imunizando camundongos Balb/c com 5 μg de proteína Fel di natural purificada de extrato de pelo de gato (Indoor Biotechnologies, No. LTN-FD1-1), 5 μg de extrato de alérgeno de amendoim bruto (Greer Laboratories, No. XPF171D3A25), ou 1250 de Unidades de alergia bioequivalentes (BAU) (Bioequivalent Allergy Unitis) de extrato de pelo de gato padronizado (Greer Laboratories, No. GTE3A01) em uma solução de 1 mg/ml de alume (Pierce, No. 77161) em solução salina tamponada com fosfato 1X. Duas semanas depois (dia 14) camundongos sensibilizados foram reforçados com doses de alérgeno idênticas àquelas usadas para a imunização inicial. Duas semanas depois do reforço (dia 28), os camundongos foram sacrificados e soro foi coletado. Concentração de IgE total nos antissoros isolados foi determinada através de ELISA. A concentração final de antissoro foi diluída para 2400 ng/mL de IgE em solução salina tamponada com fosfato 1X.
[00245] Para determinar o efeito de anticorpos anti-Fel d1 sobre desgranulação de mastócito no modelo de PCA, antes da sensibilização da orelha com antissoro gerado conforme acima descrito, grupos de camundongos Balb/c foram primeiro injetados subcutaneamente ou com anticorpo controle isótipo IgG4 humano, um anticorpo anti-Fel d1, ou uma combinação de anticorpos anti-Fel d1 em doses de 5 mg/kg (dose de anticorpo total, 2,5 mg/kg de cada anticorpo) para experimentos de ponto único a menos que de outro modo indicado ou em concentrações variando de 0,06 mg/kg a 2 mg/kg para experimentos de variação de dose. Três dias depois do pré-tratamento com anticorpos, um grupo de camundongos ("grupo Fel d1 natural") foi sensibilizado através de injeção intradérmica com 10 μl de antissoro derivado de Fel d1 ou 10 μl de antissoro derivado de amendoim (controle negativo) nas orelhas direita e esquerda, de cada camundongo. Um segundo grupo de camundongo ("grupo de extrato de gato") foi sensibilizado com 20 μL de antissoro derivado de extrato de pelo ou 20 μL de antissoro derivado de amendoim (controle negativo) nas orelhas direita e esquerda, respectivamente, de cada camundongo. Vinte e quatro horas após a sensibilização, os camundongos no grupo de Fel d1 natural foram provocados através de injeção intravenosa (100 μL por camundongo) de uma solução de 0,25 μg/mL de Fel d1 natural (Indoor Biotechnologies, No. LTN-FD1-1) dissolvida em solução salina tamponada com fosfato 1X dissolvida contendo corante azul de Evan 0,5 (p/v) (Sigma, No. E2129). Similarmente, 24 horas após a sensibilização, os camundongos no grupo de extrato de gato foram provocados com 250BAU de extrato de pelo de gato padronizado (extrato de pelo de gato padronizado (Greer Laboratories, No. GTE3A01)] dissolvido em solução salina tamponada com fosfato 1X contendo corante azul de Evan 0,5% (p/v) (Sigma, N°. E2129). Uma hora após provocação com antígeno, os camundongos foram sacrificados, as orelhas foram excisadas e postas em 1 mL de formamida e incubadas por 3 dias a 56° C para extrair o corante azul de Evan do tecido. Tecido da orelha foi então removido da formamida, seco usando um material absorvente (blotted) para remover líquido em excesso e pesado. Alíquotas de duzentos microlitros de cada extrato de formamida foram transferidas para placas de 96 cavidades em duplicata. Absorbância dos sobrenadantes resultantes foi medida a 620 nm. O OD foi convertido para concentração de corante azul de Evans usando uma curva padrão. A concentração média de corante azul de Evan extravasado para o tecido da orelha sensibilizada com antissoro (normalizada por peso de tecido da orelha) foi calculada para o grupo tratado com o anticorpo controle de isótipo e definida como F(isótipo,média). A redução em extravasamento de corante azul de Evan resultante do pré-tratamento de anticorpo foi calculada por camundongo subtraindo a quantidade de corante de azul de Evan para a orelha sensibilizada com Fel d1 ou extrato do grupo tratado com anticorpo, definido como F(mAb,i) de F(isótipo,média). Este número foi então dividido pela diferença entre F(isótipo,média) e a quantidade de corante para a orelha sensibilizada para amendoim do grupo tratado com anticorpo [P(mAb,i)] e multiplicado por 100 para fornecer a redução percentual total em extravasamento de corante para cada camundongo (Redução %).
[00246] Redução % (por camundongo) = 100*[F(isótipo,média) - F(mAb,i)]/[F(isótipo,média) - P(mAb,i)].
[00247] A redução percentual média em vazamento de corante foi então calculada para cada grupo de anticorpo. Os resultados, expressos como (média ± SD) de redução de azul de Evan percentual, são mostrados na Tabela 6 e na Tabela 7 para o grupo de Fel d1 natural e na Tabela 8 para o grupo de extrato de pelo de gato.
[00248] Conforme mostrado na Tabela 6, sete grupos de camundongos do grupo Fel d1 natural, quando tratados com combinações específicas de anticorpos anti-Fel d1 em concentrações fixas, exibiram reduções em extravasamento de corante variando de 79% a 103% comparado com camundongos recebendo anticorpo controle. Os camundongos tratados com H4H2590S/H4H1238N, H4N2590S/H4H2574P ou H4H1232N/H4H1616N em combinações de anticorpo em par exibiram redução de menos de 3% em extravasamento de corante comparado com camundongos recebendo anticorpo controle, demonstrando que nem todos os anticorpos anti-Fel d1 testados neste modelo foram eficazes.
[00249] Ainda, experimentos de variação de dose foram realizados com camundongos do grupo de Fel d1 natural, conforme mostrado na Tabela 7. Anticorpos únicos não foram tão eficazes na redução de extravasamento de corante quanto as combinações de anticorpo anti- Fel d1 nas doses testadas.
[00250] Um par específico de anticorpos anti-Fel d1 (H4H2636P e H4H1232N) em níveis de dose múltiplos, bem como cada um desses anticorpos anti-Fel d1 sozinhos em um nível de dose único (mais alto), foi testado adicionalmente no modelo PCA usando camundongos que foram sensibilizados e provocados com extrato de pelo de gato conforme mostrado na Tabela 8. A 2 mg/kg, esses anticorpos anti-Fel d1 únicos sozinhos não foram tão eficazes na redução de extravasamento de corante como uma combinação dos dois anticorpos. A combinação de H4H2636P e H4H1232N em ambas 2 mg/kg e 1 mg/kg reduziu o extravasamento de corante em mais de 90% comparado com controle de isótipo no modelo PCA usando extrato de pelo de gato como o antígeno.
[00251] Todas as reduções que foram estatisticamente significantes (p<0,05) comparado com controle de isótipo conforme determinado através de ANOVA de duas vias com pós-teste de Bonferroni são marcadas com um asterisco (*). O número de camundongos usado por grupo (n) é escrito dentro de parênteses nas tabelas. Tabela 6
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§Concentração de anticorpo total 10mg/kg; **Concentração de anticorpo total 0,5 mg/kg Tabela 7 Redução Percentual em Extravasamento de Corante
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Exemplo 7. Efeito de anticorpos anti-Fel d1 em um modelo in vivo de inflamação de pulmão
[00252] O modelo de camundongo in vivo de inflamação de pulmão é usado para avaliar inflamação de pulmão induzida por alérgeno e acúmulo de muco que poderia ser associado com asma ou rinoconjuntivite. O modelo envolve administração intranasal repetida de um alérgeno a camundongos sensibilizados com alérgeno previamente. A inflamação associada com alérgeno pode causar aumentos em acúmulo de muco no pulmão, migração de eosinófilo para o pulmão, IgE total no soro e níveis de IgG1 específicos de alérgeno.
[00253] Camundongos Balb/c foram intraperitonealmente imunizados com 1 ug de proteína Fel d1 natural purificada de extrato de pelo de gato (Indoor Biotechnologies, N°. LTN-FD1-1) em uma solução de 1 mg/mL de alume (Pierce, N°. 77161) em solução salina tamponada com fosfato. Sete dias depois, os camundongos sensibilizados foram reforçados intraperitonealmente com 1 ug de Fel d1 natural em uma solução de 1 mg/mL de alume em solução salina tamponada com fosfato 1X. Nos dias 17, 21 e 25, grupos de camundongos (n=5) foram injetados subcutaneamente com um anticorpo controle de isótipo IgG4 humano ou uma combinação 1:1 de anticorpos anti-Fel d1, H4H1232N e H4H2636P, a 20 mg/kg (dose de anticorpo total). Nos dias 20, 24 e 28, os camundongos foram intranasalmente provocados com 0,05 ug de Fel d1 natural diluída em 20 uL de solução salina tamponada com fosfato 1X. Camundongos controle foram provocados com 20 uL de solução salina tamponada com fosfato 1X nos mesmos dias. No dia 32, todos os camundongos foram sacrificados e seus pulmões foram coletados. Protocolo de dosagem e tratamento experimental para grupos de camundongos é mostrado na Tabela 9.
[00254] Para determinar a circulação de IgE e IgG1 específica para Fel d1 total no soro dos camundongos, amostras de soro foram coletadas para cada camundongo através de punção cardíaca terminal usando uma seringa TB 27G1/2 de 1 mL (Becton Dickinson, N°. 309306) com uma agulha junto. Amostras de sangue foram postas em tubos separados de soro microtainer® BD (Becton Dickinson, N°. 365956), centrifugadas e então o soro foi transferido para um tubo fresco para armazenamento até a análise.
[00255] Para determinar a concentração de IgE total nas amostras de soro para cada camundongo, um sandwich ELISA OPTEIA kit (BD Biosciences, N°. 555248) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Amostras de soro foram diluídas e incubadas com anticorpo de captura anti-IgE revestido em placas de 96 cavidades. IgE total foi detectada através anticorpo secundário para IgE anticamundongo biotinilado. IgE de camundongo marcada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) purificada foi usado como um padrão. O Chromagen (3,3'-5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) (conjunto de reagente de substrato BD OPTEIA, BD, N° 555214) foi usado para detectar atividade de HRP. Uma solução de parada de ácido sulfúrico 1M foi então adicionada e absorbância a 450 nm foi medida em uma leitora de placa Molecular Devices SpectraMax M5. Análise de dados foi realizada usando software Prism®. As quantidades médias de níveis de IgE em circulação em soro para cada grupo experimental são expressas como ng/mL (± SEM) conforme mostrado na Tabela 10. Os camundongos provocados com Fel d1 intranasalmente quando tratados com a combinação de anticorpos anti-Fel d1 exibiram uma diminuição significante na quantidade de IgE em circulação (±1394) ng/mL] comparado com camundongos recebendo anticorpo controle de isótipo [14080 (±1505) ng/mL].
[00256] Para determinar os níveis de IgG1 específicas para Fel d1 nas amostras de soro de cada camundongo, um ELISA foi utilizado. Placas revestidas com Fel d1 foram incubadas com amostras de soro de camundongo serialmente diluídas, seguido por incubação com anticorpo conjugado a IgG1-HRP anticamundongo (BD Biosciences, N°. 559626). Todas as amostras foram desenvolvidas com uma solução de TMB e analisadas conforme acima descrito. Níveis relativos de IgG1 em circulação em soro foram representados como suas unidades de título (unidades de título foram calculadas multiplicando o OD medido por um fator de diluição requerido para obter o D450 que era maior do que duas vezes a base). Os níveis de IgG1 específica para Fel d1 em circulação média em soro para cada grupo experimental são expressos como título x 103 (±SEM) conforme mostrado na Tabela 11. Os camundongos provocados com Fel d1 intranasalmente quando tratados com a combinação de anticorpos anti-Fel d1 exibiram uma diminuição significante na quantidade de níveis de IgG1 específica para Fel d1 em soro [título de 105,3 (±31,33) x103] quando comparado com camundongos recebendo anticorpo controle de isótipo [título de 526,1 (±144,0) x103].
[00257] Coleta de pulmão para análise de infiltrado de célula:
[00258] Após exsanguinação, o pulmão direito de cada camundongo foi removido e posto em uma pequena placa de Petri contendo Meio da Eagle Modificado com da Dulbecco (DMEM) (Irvine Scientific, N°. 9033) e cortado em cubos que eram de aproximadamente 2 a 3 mm de tamanho. Os cubos foram então transferidos para um tubo contendo uma solução de 20 μg/mL de DNAse (Roche, N°. 10104159001) e 0,7 U/mL de Liberase TH (Roche, N°. 05401151001) diluída em Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) (Gibco, N°. 14025) e postos em um banho de água de 37°C por 20 minutos com vortexação a cada 5 minutos. Esta reação foi então parada adicionando ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA) (Gibco, N°. 15575) em uma concentração final de 10 mM. Cada pulmão foi amassado, filtrado em um filtro de 70 μm, centrifugado e então o pelete de pulmão foi ressuspenso em 4 mL de tampão de lise ACK (Gibco, N°. 10492) para remover células vermelhas do sangue. Depois de uma incubação em temperatura ambiente por 3 minutos, DMEM foi adicionado para desativar o tampão ACK. As suspensões de célula foram centrifugadas e os peletes de célula foram então ressuspensos em 10 mL de solução de tampão MACS [uma mistura de Militenyi auto MACS Rinsing Solution (Militenyi Biotec, N° 130-091-222) e MACS BSA (Militenyi Biotech, No. 130-091-376)]. As amostras ressuspensas foram filtradas em um filtro de 70 μm e 10 x 106 células foram plaqueadas em uma placa de fundo em V de 96 cavidades. As células foram então centrifugadas e os peletes foram ressuspensos em CD16/CD32 Fc Block anticamundongo de rato purificado, (BD Biosciences Clone: 2.4G2, N°. 553142) diluído em Tampão MACS por 15 minutos a 40°C. As células foram lavadas duas vezes e foram então incubadas na mistura de anticorpo apropriada (descrito na Tabela 12) diluída em tampão MACS por 30 minutos a 4°C protegido da luz. Após incubação do anticorpo, as células foram lavadas duas vezes em tampão MACS e ressuspensas em BD Cytofix (BD Biosciences, No. 554655) por 15 minutos a 4°C enquanto sendo protegidas da luz. As células foram lavadas, ressuspensas em tampão MAS e foram então transferidas para tubos BD FACS (BD Biosciences, N°. 352235) para análise de eosinófilos através de citometria de fluxo. Os eosinófilos foram definidos como células que eram CD45+, GR1-, CD11c10, SigleFhi. Os dados são expressos como frequência de eosinófilos em células CD45+ (±SEM) na Tabela 13.
[00259] Os camundongos provocados com Fel d1 intranasalmente quando tratados com a combinação de anticorpos anti-Fel d1 exibiram uma diminuição significante na frequência de eosinófilos na população de célula CD45+ comparado com camundongos não recebendo nenhum anticorpo (67% de diminuição) ou recebendo anticorpo controle de isótipo (diminuição de 46%) conforme mostrado na Tabela 13.
[00260] Pulmão coletado para análise histológica:
[00261] Após exsanguinação, os pulmões esquerdos foram removidos e postos em tubos contendo uma solução de 5 mL de paraformaldeído 4% (p/v) (Boston Bioproducts, No. BM-155) em solução salina tamponada com fosfato 1X e armazenados em temperatura ambiente por 3 dias. As amostras de pulmão foram então secas com material absorvente e transferidas para tubos contendo etanol 70% para análise histológica. As amostras foram enviadas para Histoserv, Inc. (Germantown, MD) para seccionamento e tingimento com ácido periódico Schiff (PAS) (Periodic Acid Schiff).
[00262] Aproximadamente 35 imagens digitais em toda a área de cada seção de pulmão tingida com PAS foram adquiridas usando um microscópio de luz de Zeiss Axioplan 2 Imaging com uma câmera Zeiss AxioCam MRc. Uma imagem de pulmão integral foi então construída a partir das imagens pequenas e analisada usando software ImageJ com o auxílio de um plugin de limiar de cor. As regiões de acúmulo de muco no lúmen bronquial foram identificadas e quantificadas através de um limiar de cor escolhido pelo usuário e normalizadas para a área total do lúmen que foi identificada e quantificada por um ajuste de limiar de cor separado. A porcentagem do lúmen bronquial ocupada por acúmulo de muco para cada pulmão foi expressa como [(área de muco/área de lúmen) x 100] e foi calculada para cada grupo de tratamento. Os resultados, expressos como obstrução pulmonar percentual média (±SEM), são mostrados na Tabela 14.
[00263] Os camundongos tratados com a combinação de anticorpos anti-Fel d1 exibiram uma tendência a acúmulo de muco reduzido nos brônquios pulmonares (5,21 +/- 0,81% de acúmulo de muco) comparado com camundongos recebendo anticorpo controle (10,81 +/- 1,13% de acúmulo de muco) no modelo de inflamação de pulmão conforme mostrado na Tabela 14. Quaisquer diferenças foram observadas em tamanho de lúmen brônquico ou tamanho de pulmão total entre os grupos de camundongos. Tabela 9: Protocolo de dosagem e tratamento experimental para grupos de camundongos Balb/c
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Tabela 10: Níveis de IgE em Circulação Total em Soro de Camundongo
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Tabela 11: IgG1 Específico de Fel d1 em circulação em Soro de Camundongo
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Tabela 12: Anticorpos Usados para Análise de Citometria de Fluxo
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Tabela 13: Frequência de eosinófilos em células CD45+ conforme determinado através de citometria de fluxo
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Tabela 14: Obstrução Pulmonar (área de muco/área de lúmen, %)
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Exemplo 8: Mapeamento de Epítopo de Troca de Hidrogênio- Deutério
[00264] A fim de determinar os epítopos de Fel d1 (uma proteína heterodimérica compreendida de cadeia de A Fel d1 e cadeia B de FELD1) reconhecidos por dois anticorpos anti-Fel d1, estudos de troca de hidrogênio-deutério (H/D) foram realizados para cada anticorpo co- complexado com Fel d1. Antes dos experimentos de troca de H/D, Fel d1 recombinante expressa por célula CHO compreendida de aminoácidos 18-190 de cadeia B de Fel d1 (número de acesso GenBank NP_001041619.1) fundidos em linha com aminoácidos 19-88 de A de FELD1 (Número de acesso GenBank NP_001041618.1) expressa com um marcador de myc-myc-hexaistidina C-terminal e com uma mutação D27G (Fel d1 B-A-mmH; SEQ ID NO: 396) foi desglicosilada a 37°C por 4 horas sob condições nativas usando PNGase F (New England BioLabs, N°. 0704). Para este estudo, dois anticorpos anti-FELD1 (H4H1232N e H4H2636P) foram covalentemente ligados a contas de agarose de N-hidroxissuccinimida (GE Lifescience, No. 17-0906-01) de acordo com o protocolo do fabricante.
[00265] Para mapear o epítopo de ligação Fel d1B-A-mmH reconhecido por H4H1232N, dois conjuntos de experimentos de troca de H/D foram realizados (todas as reações de ligação e troca realizadas em temperatura ambiente). O primeiro experimento usou um formato 'on-solution/off-beads' (troca em solução ativada seguido por troca em contas desativada). Para a troca ativada, a proteína Fel d1B-A-mmH desglicosilada foi deuterada por 5 a 10 minutos (em dois subexperimentos separados) em tampão de PBS em pH 7,4 preparado com D2O (PBS-D) e foi então ligada às contas de H4H1232N durante uma incubação de 2 minutos em PBS-D. O complexo de Fel d1B-A- mmH ligado a contas de H4H1232N foi então lavado com tampão de PBS em pH 7,4 preparado com H2O (PBS-H) e incubado em PBS-H pela metade do tempo de troca ativada (troca desativada), permitindo que os epítopos em Fel d1B-A-mmH protegidos pela ligação do anticorpo H4H1232N permanecessem deuterados. Após a troca desativada, a Fel d1B-A-mmH foi eluída das contas usando uma solução de ácido trifluoracético aquosa 0,1% gelada (TFA). A Fel d1B-A-mmH eluída foi então digerida com pepsina imobilizada (Thermo Scientific, No. 20343) por 5 minutos a 4°C. Os peptídeos resultantes foram dessalinizados a 4°C usando pontas de pipeta cromatográficas ZipTip (Millipore, N°. ZTC18S096) de acordo com o protocolo do fabricante e então imediatamente analisados em um espectrômetro de massa (MS) de ionização por dessorção a laser auxiliada por matriz de tempo de voo (MALDI-TOF) UltrafleXtreme.
[00266] O segundo experimento é referido como o ‘on-beads/off- beads’ (troca ativada em contas seguido por troca desativada em contas). Para este experimento, a Fel d1B-A-mmH desglicosilada foi primeiro ligada às contas H4H1232N, e então incubada por 5 ou 10 minutos (em subexperimentos separados) em PBS-D para permitir troca ativada. As etapas que seguem (troca desativada, digestão com pepsina e análise MS) foram realizadas conforme descrito para o procedimento ‘on-solution/off-beads' acima. Os valores centroides ou razões massa- para-carga médias (m/z) de todos os peptídeos detectados foram calculados e comparados entre os experimentos on-solution/off beads e on-beads/off-beads. Os peptídeos exibindo massa aumentada após o procedimento de on-solution/off-beads comparado com o procedimento on-beads/off-beads incluem aminoácidos dentro da proteína Fel d1 protegida de troca como um resultado de ligação de anticorpo e então revelam regiões de epítopo de ligação.
[00267] O experimento de troca de H/D para Fel d1B-A-mmH se ligando ao anticorpo anti-Fel d1 H4H2636P foi realizado usando o mesmo procedimento descrito acima para H4H1232N, mas com contas H4H2636P substituindo as contas H4H1232N.
[00268] Uma comparação dos valores m/z centroides para todos os peptídeos detectados no experimento de troca de H/D de Fel D1B-A- mmH com H4H1232N é mostrada na Tabela 15. Esses peptídeos foram identificados através de MS de cromatografia líquida-ionização por dessorção a laser auxiliada por matriz (LC-MALDI). Peptídeos mais específicos deram valores centroides similares (diferenças < 0,3 m/z unidades) para ambos os protocolos de on-solution/off-solution e on- beads/off-beads, para cada um de dois tempos de troca ativada e troca desativada diferentes. No entanto, três peptídeos com aminoácidos se estendendo de 85-103, 85-104 e 113-127 de Fel d1B-A-mmH (SEQ ID NO: 396) têm diferenças em valores centroides m/z > 0,3 em ambos os experimentos de 5 minutos e 10 minutos. As diferenças entre esses valores centroides do protocolo de on-solution/off-beads e on-beads/off- beads são destacadas em negrito na Tabela 15. Uma vez que outro peptídeo, aminoácidos 117-127 de SEQ ID NO: 396, não mostrou nenhuma retenção de deutério após troca desativada, a região de proteção de troca no peptídeo 113-127 pode ser reduzida para resíduos 113-116 de SEQ ID NO: 396. As duas regiões, resíduos 85-104 (SEQ ID NO: 403) e 113-116 (SEQ ID NO: 426), são protegidas de troca inativada como um resultado de H4H1232N se ligando à Fel d1B-A- mmH após troca ativada. Desta maneira, esses dois segmentos são definidos pelo método de troca de H/D como um epítopo descontínuo para anticorpo H4H1232N se ligando à proteína Fel d1B-A-mmH.
[00269] Comparações dos valores m/z centroides para os peptídeos detectados no experimento de troca de H/D de Fel d1B-A-mmH complexada com H4H2636P são mostradas na Tabela 16. Apenas um peptídeo, aminoácidos 15-24 de FELD1B-A-mmH, exibiu um aumento nos valores m/z centroides > 0,3 m/z para a condição de on-solution/off- beads comparado com condição on-beads/off-beads, indicando que este segmento era protegido de troca desativada pela ligação a H4H2636P. As diferenças de valor centroide maiores do que 0,3 m/z são destacadas em negrito na Tabela 16. Desta maneira, aminoácidos dentro desta região 15-24 (SEQ ID NO: 412) com base no método de troca de H/D incluem um epítopo para anticorpo H4H2636P se ligando à proteína Fel d1B-A-mmH. Tabela 15: O efeito de Troca de H/D de H4H1232N se Ligando à Fel d1B-A-mmH conforme Medido através de Valores m/z Centroides de Peptídeos Pépticos
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Tabela 16: O Efeito de Troca de H/D de H4H2636P se ligando à Fel d1- B-A-mmH conforme Medido através de Valores m/z Centroides de Peptídeos Pépticos
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Exemplo 9: Geração de Anticorpos Biespecíficos Descrição dos Anticorpos Biespecíficos para Fel d1 Produzidos
[00270] Anticorpos biespecíficos compreendendo domínios de ligação de cadeias pesada e leve de pares de certos dos anticorpos anti- Fel d1 descritos na presente invenção foram construídos usando metodologias padrão. Os anticorpos anti-Fel d1 usados para construir os anticorpos biespecíficos deste exemplo foram obtidos através de imunização de um camundongo VelocImmune® com um imunógeno primário, tal como Fel d1 de comprimento integral, que pode ser comprado comercialmente (por exemplo, da Indoor Biotechnologies, No. LTN-FD1-1), ou isolado de pelo ou caspa de gato através de cromatografia de coluna de multietapa (vide, por exemplo, Chapman, M.D. e outros (1988), J. Immunol. 140:812-818) ou que pode ser produzido recombinantemente (vide número de acesso GenBank P30438 ou NP_001041618.1) para a sequência de aminoácido de comprimento integral de cadeia 1 de Fel d1 (também referida como cadeia A de FELD1A; vide também SEQ ID NO: 391) e número de acesso GenBank P30440 ou NP_001041619.1 para a sequência de aminoácido de comprimento integral de cadeia 2 de Fel d1 (também referida como cadeia B ou FELD B; vide também SEQ ID NO: 393), ou fragmentos ou da cadeia 1 ou da cadeia 2, ou fragmentos de ambas a cadeia 1 e da cadeia 2 da proteína Fel d1, seguido por imunização com um imunógeno secundário, ou com um fragmento imunogenicamente ativo da proteína natural. Em uma modalidade, o imunógeno usado é exemplificado na SEQ ID NO: 394 (fusão em linha da Cadeia 2-Cadeia 1-mFc de Fel d1) ou SEQ ID NO: 395 (fusão de Cadeia 1 de Fel d1 usando um ligante e Cadeia 2-mFc).
[00271] Os anticorpos biespecíficos produzidos de acordo com o presente Exemplo compreendem dois domínios de ligação ao antígeno (isto é, "braços de ligação 1 e 2").
[00272] Um dos anticorpos biespecíficos, chamado H4H3467D, compreende uma cadeia leve kappa comum em ambos os braços Fab, derivada do anticorpo H4H2864P (SEQ ID NO: 378). Um braço Fab de H4H3467D utiliza a região variável de cadeia pesada (VH) do anticorpo H4H2864P (SEQ ID NO: 370), enquanto o outro braço Fab utiliza a região VH de H4H1232N (SEQ ID NO: 18).
[00273] Um segundo anticorpo biespecífico da invenção, chamado H4H8751D, compreende uma cadeia leve kappa comum em ambos os braços Fab, derivada do anticorpo H4H2636P (SEQ ID NO: 314). Um braço Fab de H4H8751D utiliza a região VH de H4H2636P (SEQ ID NO: 306), enquanto o outro braço utiliza a região VH de H4H1232N (SEQ ID NO: 18).
[00274] A Tabela 17 abaixo provê as partes componentes dos domínios de ligação ao antígeno dos dois anticorpos biespecíficos feitos de acordo com o Exemplo 9. Os identificadores de sequência de aminoácido para as várias regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leve que foram derivados dos anticorpos parentais (usados para preparar os anticorpos biespecíficos) são também providos na Tabela 17. Tabela 17. Partes componentes dos dois braços dos anticorpos biespecíficos produzidos
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[00275] As Tabelas 18A e 18B abaixo mostram os identificadores de sequência de aminoácido para as várias regiões variáveis de cadeia pesada (Tabela 18A) e as regiões variáveis de cadeia leve (Tabela 18B) e suas sequências de região de determinação de complementaridade (CDRs) correspondentes para os dois anticorpos biespecíficos descritos aqui. Tabela 18A. Identificadores de Sequência de HCVR e HCDR para anticorpos biespecíficos produzidos
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Tabela 18B. Identificadores de Sequência de LCVR e LCDR para anticorpos biespecíficos produzidos
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Associação e Dissociação
[00276] Constantes de taxa de associação e dissociação de ligação (ka e kd, respectivamente), constantes de dissociação de equilíbrio e meias-vidas de dissociação (KD e t1/2, respectivamente) para Fel d1 natural (subsequentemente referida como nFEl d1) se ligando a anticorpos monoespecíficos e biespecíficos anti-Fel d1 purificados foram determinadas usando o ensaio de biossensor de ressonância de plasmon de superfície em tempo real em um instrumento Biacore 2000. No chip CM5, usando química EDC-NHS, a superfície do sensor Biacore foi derivatizada com um anticorpo Fc anti-humano de camundongo monoclonal (GE, N°. BR-1008-39) para capturar anticorpos monoespecíficos e biespecíficos anti-Fel d1. Todos os estudos de ligação Biacore foram realizados a 25°C em HBSP + tampão de atividade (HEPES 0,01M pH 7,4, NaCl 0,15 M, CaCl2 3 mM, MgCl 3 mM, Tensoativo P20 0,05% v/v). Concentrações diferentes de nFel d1 (Indoor Biotech, No. NA-FD1-1) (variando de 600 nM a 2,34 nM, diluições de 6 vezes) preparadas em HBSP + tampão de atividade foram injetadas na superfície capturada de anticorpo anti-Fel d1 em uma taxa de fluxo de 50 μL/min. Associação de nFel dl aos anticorpos monoclonais capturados foi monitorada por 4 minutos e a dissociação de nFel d1 em HBSP+ tampão de atividade foi monitorada por 7 minutos. Constantes de taxa de associação cinética (ka) e dissociação (kd) foram determinadas através de ajuste dos sensorgramas em tempo real para um modelo de ligação 1:1 com limitação de transporte de massa usando software de ajuste de curva Scrubber 2.0c. Constantes de equilíbrio de dissociação de ligação (KD) e meias-vidas dissociativas (t1/2) foram então calculadas a partir das constantes de taxa cinética: KD (M) = kd / ka e t1/2 (min) = [In2/60(*kd)].
[00277] Cinéticas de ligação da ligação de nFel d1 a anticorpos monoespecíficos e biespecíficos anti-Fel d1 diferentes a 25°C são mostradas na Tabela 19. Os três anticorpos anti-Fel d1 monoespecíficos ligados à nFel d1 com valores KD variando de 155 pM a 1,6 nM. Os dois anticorpos anti-Fel d1 biespecíficos, H4H3467D e H4H8751D, ligados à nFel d1 com valores de Kd de 250 pM e 347 pM, respectivamente. Tabela 19: Cinéticas de Ligação de anticorpos monoespecíficos e biespecíficos anti-Fel d1 se ligando à nFel d1 a 25°C
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[00278] Para determinar a eficácia in vivo dos biespecíficos anti-Fel d1 comparado com seus anticorpos parentais monoespecíficos, esses anticorpos junto com um anticorpo controle de isótipo foram testados no modelo in vivo de PCA usando Fel d1 natural para ambos sensibilização e provocação, que foi anteriormente descrito (vide Exemplo 6). Os anticorpos neste estudo foram administrados em uma concentração de 1 mg/kg de anticorpo total (0,5 mg/kg de cada anticorpo foi usado quando dois anticorpos foram administrados simultaneamente) usando 8 camundongos por grupo experimental. Os dados para cada grupo experimental expressos como redução percentual em extravasamento de corante ± SD são mostrados na Tabela 20.
[00279] Os anticorpos monoespecíficos H4H1232N e H4H2864P causaram uma redução de 67 (± 26)% e 81 (± 26)% em extravasamento de corante, respectivamente. A combinação dos anticorpos monoespecíficos, H4H1232N e H4H2864P, causou uma redução de 98 (± 3,5)% em extravasamento de corante, enquanto o biespecífico, H4H3467D, composto dos anticorpos monoespecíficos, H4H1232N e H4H2864P, causou uma redução de 93 (± 11)% em extravasamento de corante.
[00280] Os anticorpos monoespecíficos H4H1232N e H4H2636P causaram uma redução de 64 (± 33%) e 8,7 (± 79)% em extravasamento de corante, respectivamente, em outro experimento. A combinação dos anticorpos monoespecíficos, H4H1232N e H4H2636P, causou uma redução de 90 (± 15)% em extravasamento de corante, enquanto o biespecífico, H4H8751D, composto dos anticorpos monoespecíficos, H4H1232N e H4H2636P, causou uma redução de 77 (± 20)% em extravasamento de corante. Tabela 20: Efeito de anticorpos biespecíficos anti-Fel d1 e seus anticorpos monoespecíficos parentais no modelo in vivo de anafilaxia cutânea passiva (PCA)
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Claims (9)

1. Anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a Fel d1, caracterizado pelo fato de que compreende as três CDRs de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) contidas na sequência da região variável de cadeia pesada (HCVR) de SEQ ID NO: 306 e as três CDRs de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) contidas na região variável de cadeia leve (LCVR) sequência de SEQ ID NO: 314.
2. Anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que: (a) possui um isotipo selecionado a partir do grupo consistindo em IgG1, IgG2 e IgG4; e/ou (b) o anticorpo humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a Fel d1 com um KD igual ou inferior a 10-6 M, tal como medido por ressonância de plasma de superfície.
3. Anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo: (a) compreende uma HCVR tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 306; (b) compreende uma LCVR tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 314; (c) compreende uma combinação de sequência de aminoácidos HCDR1/HCDR2/HCDR3/LCDR1/LCDR2/LCDR3 de SEQ ID NOs: 308/310/312/316/318/320; e/ou (d) compreende um par de sequências de aminoácidos de HCVR/LCVR de SEQ ID NOs: 306/314.
4. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal humano isolado, ou fragmentos de ligação ao antígeno do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em conjunto com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
5. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende ainda uma quantidade terapeuticamente eficaz de um segundo anticorpo monoclonal humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a Fel d1.
6. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica um anticorpo monoclonal humano ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a Fel d1 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma primeira sequência de SEQ ID NO: 305 que codifica o HCVR e uma segunda sequência de SEQ ID NO: 313 que codifica o LCVR; ou um vetor de expressão compreendendo a referida molécula de ácido nucleico.
7. Molécula de ligação ao antígeno biespecífica que se liga especificamente a Fel d1, caracterizada pelo fato de que compreende: um primeiro domínio de ligação ao antígeno que compreende uma sequência de aminoácidos de HCVR como apresentada em SEQ ID NO: 306 e uma sequência de aminoácidos de LCVR como apresentada em SEQ ID NO: 314, e um segundo domínio de ligação ao antígeno que compreende uma sequência de aminoácidos de HCVR como apresentada em SEQ ID NO: 18 e uma sequência de aminoácidos de LCVR como apresentada em SEQ ID NO: 314, opcionalmente em que o primeiro domínio de ligação ao antígeno compreende três regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) consistindo nas sequências de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NOs: 308, 310 e 312, respectivamente, e três regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) consistindo nas sequências de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NOs: 316, 318 e 320, respectivamente; e em que o segundo domínio de ligação ao antígeno compreende três regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada (HCDR1, HCDR2 e HCDR3) consistindo em sequências de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NOs: 20, 22 e 24, respectivamente, e três regiões de determinação de complementaridade de cadeia leve (LCDR1, LCDR2 e LCDR3) consistindo em sequências de aminoácidos como apresentadas em SEQ ID NOs: 316, 318 e 320, respectivamente.
8. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula biespecífica de ligação ao antígeno como definida na reivindicação 7 e um veículo farmaceuticamente aceitável ou diluente.
9. Uso de um anticorpo humano isolado ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo que se liga especificamente a Fel d1 como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, composição farmacêutica como definida na reivindicação 4 ou 5, molécula de ligação ao antígeno biespecífica como definida na reivindicação 7 ou composição como definida na reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para tratar alergia a gato.
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