ES2898372T3 - Anticuerpos humanos contra Fel d1 y métodos de uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al alérgeno Fel d1 de gato, en donde: el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (i) una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 306; y (ii) una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 314; y en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un isotipo distinto de un isotipo IgA.

Description

DESCRIPCIÓN
Anticuerpos humanos contra Fel d i y métodos de uso de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con anticuerpos humanos y fragmentos de unión a antígenos de anticuerpos humanos que se unen específicamente al alérgeno de gato Fel d1, composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos y métodos para usar esos anticuerpos.
Exposición de la técnica relacionada
La proteína Fel d1 es una proteína de gato secretada, que pertenece a la familia de las secretoglobinas de pequeñas proteínas heterodímeras unidas por disulfuro que se encuentran solo en mamíferos (Klug, J. et al. (2000), Ann. N.Y. Acad. Sci. 923:348-354). Es la principal causa de alergias a los gatos en seres humanos (Platts-Mills, T.A., et al. (1997), J. Allergy Clin. Immunol. 100:S2-S24). Alrededor del 90-95 % de los pacientes alérgicos a los gatos tienen una respuesta de IgE a la proteína Fel d1 (van Ree, et al. (1999), J. Allergy Clin. Immunol. 104:1223-1230). Los síntomas en un paciente que experimenta una respuesta alérgica a Fel d1 pueden variar desde rinitis y conjuntivitis leve hasta respuestas asmáticas potencialmente mortales. Fel d1 se produce por las glándulas sebáceas y las glándulas escamosas y las células epiteliales escamosas y se transfiere al pelaje lamiendo y acicalando (Bartholome et al., (1985), J. Allergy Clin. Immunol. 76:503-506; Charpin, C. et al. (1991), J. Allergy Clin. Immunol. 88:77-82; Dabrowski, A. J. (1990), et al. J. Allergy Clin. Immunol. 86:462-465). También está presente en las glándulas salivales, perianales y lacrimales (Andersen, M.C., et al. (1985), J. Allergy Clin. Immunol. 76:563-569; van Milligen, F.J. (1992), et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 92(4):375-378) y los reservorios principales parecen ser la piel y el pelaje (Mata, P. et al. (1992), Ann. Allergy 69(4):321-322).
Fel d1 natural es una glucoproteína heterodímera de aproximadamente 18 kDa. Cada heterodímero comprende dos cadenas polipeptídicas, que están unidas covalentemente mediante tres enlaces disulfuro intercatenarios y que están codificadas por dos genes separados (Duffort, OA, et al., (1991), Mol. Immunol. 28:301-309; Morgenstern, Jp , et al., (1991), PNAS 88:9690-9694; Griffith, I.J., et al. (1992), Gene 113:263-268; Kristensen, A.K. et al. (1997), Biol. Chem.
378:899-908). La cadena 1 comprende 70 restos de aminoácidos y la cadena 2 comprende aproximadamente 90-92 restos de aminoácidos. Estructuralmente, las dos cadenas son similares, pero solo tienen un 10-15 % de identidad de secuencia (Kaiser, L. et al. (2003), J. Biol. Chem. 278(39):37730-37735). Aunque a veces cada cadena se denomina individualmente Fel d1, ambas cadenas son necesarias para el alérgeno proteico completo.
La proteína Fel d1 tiene una función desconocida para el animal pero causa una reacción de IgG o IgE en seres humanos sensibles (ya sea como una respuesta alérgica o asmática). Aunque se conocen otros alérgenos de gatos, incluyendo Fel d2 (albúmina) y Fel d3 (cistatina), del 60 % al 90 % del anti-IgE de gato producido se dirige contra Fel d1 (Leitermann, K. et al., (1984), J Allergy Clin. Immunol. 74:147-153; Lowenstein, H. et al., (1985), Allergy 40:430-441; van Ree, R. et al., (1999), J. Allergy Clin. Immunol. 104:1223-1230; Ichikawa, K. et al., (2011), Clin. Exp. Allergy, 31:1279-1286).
La inmunoglobulina E (IgE) es responsable de la hipersensibilidad tipo 1, que se manifiesta en rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, fiebre del heno, asma alérgica, alergia al veneno de abeja y alergias alimentarias. La IgE circula en la sangre y se une a los receptores FcsR1a de alta afinidad para IgE en los basófilos y los mastocitos. En la mayoría de las respuestas alérgicas, los alérgenos se incorporan al cuerpo por inhalación, ingestión o por la piel. El alérgeno luego se une a la IgE formada previamente ya unida al receptor de alta afinidad en las superficies de los mastocitos y basófilos, lo que da como resultado la reticulación de varias moléculas de IgE y desencadena la liberación de histamina y otros mediadores inflamatorios que causan los diversos síntomas alérgicos.
El tratamiento para las alergias incluye esteroides para suprimir la actividad inmunitaria y dilatadores bronquiales para aliviar los síntomas del asma. La terapia de desensibilización también se usa para pacientes gravemente alérgicos. Las combinaciones de vacunas peptídicas han sido probadas para desensibilizar a individuos a alérgenos particulares, por ejemplo, Fel d1 (Véanse los documentos US2010/0239599A1 y EP2380591A2). Los anticuerpos se han propuesto como tratamiento para las alergias, ya que pueden ser capaces de bloquear la entrada de moléculas alergénicas en los tejidos de la mucosa, o pueden unir el alérgeno antes de que tenga la oportunidad de unirse a la IgE unida al receptor de alta afinidad en mastocitos o basófilos, evitando así la liberación de histamina y otros mediadores inflamatorios de estas células.
La patente de Estados Unidos n.° 5.670.626 describe el uso de anticuerpos monoclonales para el tratamiento de enfermedades alérgicas mediadas por IgE, tal como rinitis alérgica, asma alérgica y conjuntivitis alérgica mediante el bloqueo de la unión de los alérgenos al tejido mucoso. La patente de Estados Unidos n.° 6.849.259 describe el uso de anticuerpos específicos para alérgenos para inhibir la inflamación alérgica en un modelo de alergia in vivo en ratones. Se han descrito sistemas de anticuerpos a base de leche y huevo. Por ejemplo, el documento US20030003133A1 divulga el uso de leche como vehículo de alérgenos para inducir tolerancia oral a la caspa de gato y otros alérgenos. Las composiciones y métodos para reducir una respuesta alérgica en un animal a un alérgeno en el ambiente mediante el uso de una molécula que inhibe la capacidad del alérgeno para unirse a los mastocitos se describió en el documento US2010/0143266. Se describieron otros anticuerpos contra Fel d i por de Groot et. al. (de Groot et. al., (1988), J. Allergy Clin. Immunol. 82:778-786).
Uermosi et al (2010) Journal of Allergy and Clinical Immunology, 126, 375-383 divulga una investigación sobre los mecanismos por los cuales las IgG específicas de alérgenos inducidas por desensibilización específica de alérgenos inhiben las reacciones alérgicas.
Breve sumario de la invención
La invención proporciona anticuerpos monoclonales (AcM) completamente humanos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, como se define en las reivindicaciones, que se unen específicamente al alérgeno de gato, Fel d i. Dichos anticuerpos pueden ser útiles para unir el alérgeno Fel d i in vivo después de la exposición de un paciente sensibilizado al alérgeno del gato, y como tal, pueden actuar para promover la eliminación de Fel d i o para bloquear la unión del alérgeno a la IgE formada previamente en la superficie de mastocitos o basófilos. Con ello, los anticuerpos de la invención pueden evitar la liberación de histamina u otros mediadores inflamatorios de los mastocitos o basófilos, evitando o disminuyendo así los efectos adversos observados en pacientes sensibilizados al alérgeno del gato. En determinadas realizaciones, los anticuerpos pueden ser capaces de reducir, minimizar o evitar al menos un síntoma en un paciente sensible al alérgeno de gato Fel d i, tales como los estornudos, congestión, bloqueo nasal, tos, respiración sibilante, broncoconstricción, rinitis o conjuntivitis. En determinadas realizaciones, los anticuerpos pueden ser capaces de evitar complicaciones in vivo aún más graves asociadas con la exposición al alérgeno de gato en individuos sensibilizados, tales como respuestas asmáticas, anafilaxia o incluso la muerte.
Los anticuerpos de la invención pueden ser de longitud completa (por ejemplo, un anticuerpo IgGi o IgG4) o pueden comprender únicamente una parte de unión a antígeno (por ejemplo, un fragmento Fab, F(ab')2 o scFv) y pueden modificarse para afectar a la funcionalidad, por ejemplo, para eliminar las funciones efectoras residuales (Reddy et al., (2000), J. Immunol. i64:i925-i933).
Un primer aspecto de la invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d i, que comprende una región variable de cadena pesada (HCVR, por sus siglas en inglés) que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 306 y una región variable de cadena ligera (LCVR, por sus siglas en inglés) que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3i4.
El anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un isotipo distinto de un isotipo IgA.
En una realización, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene un isotipo seleccionado del grupo que consiste en una lgGi, una lgG2 y una lgG4.
El anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo se une específicamente a Fel d i con una Kd inferior a i ,8 nM.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las tres CDR de cadena pesada (HCDRi, HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de una cualquiera de las secuencias de región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las s Eq ID NO: 2, i 8, 34, 50, 66, 82, 98, i i4 , i30, i46, i62, i78, i94, 2 i0 , 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 y 460; y las tres CDR de cadena ligera (LCDRi, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de una cualquiera de las secuencias de región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las Se Q ID NO: i0 , 26, 42, 58, 74, 90, i06, i22, i38, i54, i70, i 86, 202, 2 i8 , 234, 250, 266, 282, 298, 3 i4 , 330, 346, 362, 378 y 468. Los métodos y técnicas para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácido de HCVR y LCVR son bien conocidos en la técnica y pueden usarse para identificar las CDR dentro de las secuencias de aminoácidos de HCVR y/o LCVR específicas divulgadas en el presente documento. Las convenciones ejemplares que pueden usarse para identificar los límites de las CDR incluyen, por ejemplo, la definición de Kabat, la definición de Chothia y la definición de AbM. En términos generales, la definición de Kabat se basa en la variabilidad de secuencia, la definición de Chothia se basa en la ubicación de las regiones de bucles estructurales y la definición de AbM es un compendio entre las estrategias de Kabat y Chothia. Véase, por ejemplo, Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institutes of Health, Bethesda, Md. ( i99 i); Al-Lazikani et al., (i997), J. Mol. Biol. 273:927-948; y Martin et al., (i989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272. También están disponibles bases de datos públicas para identificar las secuencias de CDR dentro de un anticuerpo.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende las tres CDR de cadena pesada (HCDRi, HCDR2 y HCDR3) contenidas dentro de una cualquiera de las secuencias de región variable de cadena pesada (HCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: i 8, 66, 130, i62, 242, 306, 322, 370 y 460; y las tres CDR de cadena ligera (LCDRi, LCDR2 y LCDR3) contenidas dentro de una cualquiera de las secuencias de región variable de cadena ligera (LCVR) seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 y 468.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 y 460.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 y 460.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 y 468.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 y 468.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: (a) una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 y 460; y (b) una LCVR que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 y 468.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende: (a) una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 y 460; y (b) una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 y 468.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende:
(a) un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356, 372 y 462;
(b) un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6 , 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358, 374 y 464;
(c) un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360, 376 y 466;
(d) un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364, 380 y 470;
(e) un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 30, 46,62,78,94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366, 382 y 472; y
(f) un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368, 384 y 474.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende:
(a) un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 20, 68, 132, 164, 244, 308, 324, 372 y 462;
(b) un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22, 70, 134, 166, 246, 310, 326, 374 y 464;
(c) un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 24, 72, 136, 168, 248, 312, 328, 376 y 466;
(d) un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 28, 76, 140, 172, 252, 316, 332, 380 y 470;
(e) un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 30, 78, 142, 174, 254, 318, 334, 382 y 472; y
(f) un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 32, 80, 144, 176, 256, 320, 336, 384 y 474.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2/10, 18/26, 34/42, 50/58, 66/74, 82/90, 98/106, 114/122, 130/138, 146/154, 162/170, 178/186, 194/202, 210/218, 226/234, 242/250, 258/266, 274/282, 290/298, 306/314, 322/330, 338/346, 354/362, 370/378 y 460/468.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 y 460/468.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138 y 162/170.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26 y 322/330.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26 y 306/314.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26 y 370/378.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 242/250 y 306/314.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 242/250 y 322/330.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, interactúa con al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en restos de aminoácidos que varían de aproximadamente la posición 15 a aproximadamente la posición 24 de la SEQ ID NO: 396; restos de aminoácidos que varían de aproximadamente la posición 85 a aproximadamente la posición 103 de la SEQ ID NO: 396; restos de aminoácidos que varían de aproximadamente la posición 85 a aproximadamente la posición 104 de la SEQ ID NO: 396; y restos de aminoácidos que varían de aproximadamente la posición 113 a aproximadamente la posición 116 de la SEQ ID NO: 396.
El anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, que se une a Fel d1, interactúa con restos de aminoácidos que varían de aproximadamente la posición 15 a aproximadamente la posición 24 de la SEQ ID NO: 396.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, interactúa con restos de aminoácidos que varían de aproximadamente la posición 85 a aproximadamente la posición 103 de la SEQ ID NO: 396.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, interactúa con restos de aminoácidos que varían de aproximadamente la posición 85 a aproximadamente la posición 104 de la SEQ ID NO: 396.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, interactúa con restos de aminoácidos que varían de aproximadamente la posición 113 a aproximadamente la posición 116 de la SEQ ID NO: 396.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, interactúa con al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 402, 403, 404 y 412.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, interactúa con la SEQ ID NO: 402.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, interactúa con la SEQ ID NO: 403.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, interactúa con la SEQ ID NO: 404.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, interactúa con la SEQ ID NO: 426.
El anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, que se une a Fel d1, interactúa con la SEQ ID NO: 412.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que interactúa con las SEQ ID NO: 402, 403, 404 y/o 426, comprende las tres HCDR contenidas en la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 18 y las tres LCDR contenidas en la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 26.
El anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención que interactúa con las SEQ ID NO: 402, 403, 404 y/o 426, comprende una HCDR1 de SEQ ID NO: 20; una HCDR2 de SEQ ID NO: 22; una HCDR3 de SEQ ID NO: 24; una LCDR1 de SEQ ID NO: 28; una LCDR2 de SEQ ID NO: 30 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 32.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que interactúa con la SEQ ID NO: 412, comprende las tres HCDR contenidas en la región variable de cadena pesada de SEQ ID NO: 306 y las tres LCDR contenidas en la región variable de cadena ligera de SEQ ID NO: 314.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que interactúa con la SEQ ID NO: 412, comprende una HCDR1 de SEQ ID NO: 308; una HCDR2 de SEQ ID NO: 310; una HCDR3 de SEQ ID NO: 312; una LCDR1 de SEQ ID NO: 316; una LCDR2 de SEQ ID NO: 318 y una LCDR3 de SEQ ID NO: 320.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 20, 22 y 24, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 28, 30 y 32, respectivamente.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 68, 70 y 72, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 76, 78 y 80, respectivamente.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 132, 134 y 136, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 140, 142 y 144, respectivamente.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 164, 166 y 168, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 172, 174 y 176, respectivamente.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 244, 246 y 248, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 252, 254 y 256, respectivamente.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 308, 310 y 312, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 316, 318 y 320, respectivamente.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 324, 326 y 328, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 332, 334 y 336, respectivamente.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a Fel d1, comprende las secuencias de aminoácidos HCDR1, HCDR2 y HCDR3 de SEQ ID NO: 372, 374 y 376, respectivamente, y las secuencias de aminoácidos de LCDR1, LCDR2 y LCDR3 de SEQ ID NO: 380, 382 y 384, respectivamente.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a Fel d1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo exhibe una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 y 460, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 y 468, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 24, 72, 136, 168, 248, 312, 328, 376 y 466, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 32, 80, 144, 176, 256, 320, 336, 384 y 474, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 20, 68, 132, 164, 244, 308, 324, 372 y 462, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 22, 70, 134, 166, 246, 310, 326, 374 y 464, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 28, 76, 140, 172, 252, 316, 332, 380 y 470, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID No : 30, 78, 142, 174, 254, 318, 334, 382 y 472, o una secuencia sustancialmente similar de las mismas que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (v) se une a Fel d1 con una Kd igual o inferior a 10-6 y, preferentemente, igual o inferior a 10-9; (vi) demuestra eficacia en al menos un modelo animal de anafilaxia o inflamación; o (vii) compite con un anticuerpo de referencia para unirse a Fel d1.
Un "anticuerpo de referencia" puede incluir, por ejemplo, anticuerpos que tienen una combinación de pares de secuencias de aminoácidos de cadena pesada y cadena ligera seleccionados del grupo que consiste en 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 y 460/468.
En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a Fel d1 comprende una secuencia HCDR1 que comprende la fórmula X1 - X2 - X3 - X4 - X5 - X6 - X7 - X8 (SEQ ID NO:386) en donde X1 es Gly, X2 es Phe, Tyr o Gly, X3 es Thr o Ser, X4 es Phe o lle, X5 es Ser, Arg, Thr o Asn, X6 es Asn, Thr, Asp o Ser, X7 es Tyr, y X8 es Asn, Tyr o Ala; una secuencia HCDR2 que comprende la fórmula X1 -X2 - X3 -X4 - X5 -X6-X7-X8(SEQ ID NO: 387), en donde X1 es Ile, X2 es Tyr, Ser o Asn, X3 es Tyr, Ser, Gly, Pro, o Asp, X4 es Asp, Arg o Ser, X5 es Gly, Val o Ser, X6 es Ser, Gly, Arg o Tyr, X7 es Tyr, Arg, Thr, Ser o Asn, y X8 es lle, Thr, Ala, Ser o está ausente; una secuencia HCDR3 que comprende la fórmula X1 -X2 -X3 -X4 - X5 - X6 - X7 - X8 - X9 - X10 - X11 - X12 - X13 - X14 - X15 - X16 (SEQ ID NO: 388), en donde X1 es Ala, X2 es Lys o Arg, X3 es Arg, Gly, His, Ser, Asp, Leu o Thr, X4 es Thr, Pro, Arg, Gly o Glu, X5 es Leu, Val, Gly, Lys, Tyr o Asn, X6 es Ser, Arg, Thr, Ala, Tyr, Phe o Trp, X7 es Tyr, Gly, Arg, Ala, Asn, Asp, His o Asn, X8 es Tyr, Thr, Ser o His, X9 es Val, Ser, Ala, Phe, Pro o está ausente, X10 es Met, Gly, Asp, Pro, Val o está ausente, X11 es Asp, Tyr, Ser, Gly, Phe o está ausente, X12 es Val, Asp, Phe o está ausente, X13 es Phe, Asp o está ausente, X14 es Phe, Tyr o está ausente, X15 es Asp o está ausente, X16 es Tyr o está ausente; una secuencia LCDR1 que comprende la fórmula X1-X2- X3 - X4 - X5 - X6- X7 - X8 - X9 - X10 - X11 - X12 (SEQ ID NO: 389), en donde X1 es Gin, X2 es Gly, Ser o Asp, X3 es lle o Val, X4 es Ser, Leu, Asn o Gly, X5 es Asn, Tyr, Gly o Ser, X6 es Tyr, Ser, Phe o Trp, X7 e s Ser o está ausente, X8 es Asn o está ausente, X9 es Asn o está ausente, X10 es Lys o está ausente, X11 es Gin o está ausente, X12 es Tyr o está ausente; una secuencia LCDR2 que comprende la fórmula X1 - X2 - X3 (SEQ ID NO: 390), en donde X1 es Ala, Trp, Asp, Tyr, Lys, Gly o Ser, X2 es Ala o Thr, y X3 es Ser; y una secuencia lCd R3 que comprende la fórmula X1 -X2 -X3 -X4-X5 -X6-X7-X8 -X9 (SEQ ID NO: 391), en donde X1 es Gin, Leu o His, X2 es Lys, Gin o His, X3 es Tyr, Ser o Leu, X4 es Tyr, Asn, Gly, Asp o Ser, X5 es Ser, Asp o Asn, X6 es Leu, Ala, Tyr, Thr o Phe, X7 es Pro o Arg, X8 es Leu, Phe, Tyr o Thr y X9 es Thr o está ausente.
En un aspecto, la divulgación presenta un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno específico para Fel d1, que comprende una HCVR codificada por segmentos de secuencia de nucleótidos procedentes de secuencias de línea germinal Vh, Dh y Jh, y una LCVr codificada por segmentos de secuencia de nucleótidos procedentes de secuencias de línea germinal Vk y Jk, con combinaciones como se muestra en la Tabla 2.
La invención abarca anticuerpos que tienen un patrón de glucosilación modificado. En algunas aplicaciones, la modificación para retirar sitios de glucosilación no deseables puede ser útil, o por ejemplo, retirada de una fracción de fucosa para aumentar la función de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) (véase, Shield et al., (2002) JBC 277:26733). En otras aplicaciones, puede hacerse modificación de la galactosilación para modificar la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
Un segundo aspecto de la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por la unión específica a Fel d i con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde la HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 y 460; y las CDR de una región variable de la cadena ligera (LCVR), en donde la LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID No : 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 y 468.
Un aspecto de la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por la unión específica a Fel d1 con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde la HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 y 460; y las CDR de una región variable de la cadena ligera (LCVR), en donde la LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, 74, 138, 170, 250, 314, 330, 378 y 468.
En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por la unión específica a Fel d1 con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las CDR de cadena pesada y ligera contenidas dentro de pares de secuencia de cadena pesada y ligera seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 y 460/468.
Un tercer aspecto de la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en Fel d1 que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde la HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354, 370 y 460; y las CDR de una región variable de la cadena ligera (LCVR), en donde la LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 y 468.
Un aspecto de la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en Fel d1 que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde la HCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18, 66, 130, 162, 242, 306, 322, 370 y 460; y las CDR de una región variable de la cadena ligera (LCVR), en donde la LCVR tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362, 378 y 468.
En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en Fel d1 que un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno que comprende las CDR de cadena pesada y ligera contenidas dentro de pares de secuencia de cadena pesada y ligera seleccionados del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 y 460/468.
Un cuarto aspecto de la divulgación proporciona una molécula biespecífica de unión a antígeno que se une específicamente a Fel d1, que comprende dos dominios de unión a antígeno (dos brazos) que comprenden una secuencia de aminoácidos de HCVR y una secuencia de aminoácidos de LCVR de cualquiera de dos o más anticuerpos descritos en el presente documento.
En un aspecto de la divulgación, la molécula biespecífica de unión a antígeno comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR como se establece en la SEQ ID NO: 370 y una secuencia de aminoácidos de LCVR como se establece en la SEQ ID NO: 378, y un segundo dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR como se establece en la SEQ ID NO: 18 y una secuencia de aminoácidos de LCVR como se establece en la SEQ ID NO: 378.
En un aspecto de la divulgación, la molécula biespecífica de unión a antígeno comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos como se establece en las SEQ ID NO: 372, 374 y 376, respectivamente, y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos como se establece en las SEQ ID NO: 380, 382 y 384, respectivamente; y en donde el segundo dominio de unión a antígeno comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos como se establece en las SEQ ID NO: 20, 22 y 24, respectivamente, y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos como se establece en las SEQ ID NO: 380, 382 y 384, respectivamente.
En un aspecto de la divulgación, la molécula biespecífica de unión a antígeno comprende un primer dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR como se establece en la SEQ ID NO: 306 y una secuencia de aminoácidos de LCVR como se establece en la SEQ ID NO: 314, y un segundo dominio de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de HCVR como se establece en la SEQ ID NO: 18 y una secuencia de aminoácidos de LCVR como se establece en la SEQ ID NO: 314.
En un aspecto de la divulgación, la molécula biespecífica de unión a antígeno comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos como se establece en las SEQ ID NO: 308, 310 y 312, respectivamente, y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos como se establece en las SEQ ID NO: 316, 318 y 320, respectivamente; y en donde el segundo dominio de unión a antígeno comprende tres regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada (HCDR1, HCDR2 y HCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos como se establece en las SEQ ID NO: 20, 22 y 24, respectivamente, y tres regiones determinantes de complementariedad de cadena ligera (LCDR1, LCDR2 y LCDR3) que consisten en las secuencias de aminoácidos como se establece en las SEQ ID NO: 316, 318 y 320, respectivamente.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado específico para Fel d1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que compite por unirse a Fel d1 con una cualquiera de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno de la divulgación.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado específico para Fel d1, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al mismo epítopo en Fel d1 que cualquiera de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno de la divulgación.
En un aspecto, la molécula biespecífica de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une específicamente a Fel d1.
En un aspecto, la molécula biespecífica de unión a antígeno es un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une específicamente a Fel d1, en donde el anticuerpo monoclonal humano es un anticuerpo monoespecífico o un anticuerpo biespecífico.
En un aspecto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende al menos una molécula biespecífica de unión a antígeno como se describe en el presente documento y un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
En un aspecto, la divulgación proporciona un método para tratar a un paciente que muestra sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo, o a la proteína Fel d1, o para tratar al menos un síntoma o complicación asociada con una sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo, o a la proteína Fel d1, que comprende administrar una cantidad eficaz de una o más de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno de la divulgación, o una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de una o más de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno de la divulgación, a un paciente que lo necesita, en donde el paciente muestra una sensibilidad reducida a, o una reacción alérgica disminuida a, un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo, o a la proteína Fel d1, o no experimenta ninguna sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo, o a la proteína Fel d1, o en donde el paciente muestra una reducción en al menos un síntoma o complicación asociada con una sensibilidad a, o una reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo, o a la proteína Fel d1, o una reducción en la frecuencia y/o duración de al menos un síntoma o complicación asociada con una sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo, o a la proteína Fel d1 después de la administración de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno o una composición que comprende las moléculas biespecíficas de unión a antígeno de la divulgación.
En un aspecto, la divulgación proporciona la administración de una cantidad eficaz de un segundo agente terapéutico junto con al menos una molécula biespecífica de unión a antígeno de la divulgación útil para disminuir una reacción alérgica a un gato, caspa de gato o a la proteína Fel d1. El segundo agente terapéutico puede seleccionarse del grupo que consiste en un corticoesteroide, un dilatador bronquial, un antihistamínico, epinefrina, un descongestionante, un corticoesteroide, otro anticuerpo diferente contra Fel d1 y una vacuna peptídica.
En un aspecto, el tratamiento con una o más moléculas biespecíficas de unión a antígeno de la divulgación sola, o en combinación con un segundo agente terapéutico, puede dar como resultado una reducción de la rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, asma alérgica o una respuesta anafiláctica después de la exposición del paciente a un gato, caspa de gato o a la proteína Fel d1.
En un quinto aspecto, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos Fel d1 o fragmentos de los mismos de la invención. Los vectores de expresión recombinante que portan los ácidos nucleicos de la invención, y células hospedadoras en que se han introducido dichos vectores, también están abarcados por la invención. También se proporcionan también métodos de producción de los anticuerpos mediante el cultivo de las células hospedadoras en condiciones que permiten la producción de los anticuerpos y la recuperación de los anticuerpos producidos.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende una HCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 1, 17, 33, 49, 65, 81, 97, 113, 129, 145, 161, 177, 193, 209, 225, 241, 257, 273, 289, 305, 321, 337, 353, 369 y 459, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.
En un aspecto, la HCVR está codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 17, 65, 129, 161,241, 305, 321, 369 y 459.
En un aspecto, el anticuerpo o fragmento del mismo comprende además una LCVR codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 9, 25, 41, 57, 73, 89, 105, 121, 137, 153, 169, 185, 201, 217, 233, 249, 265, 281, 297, 313, 329, 345, 361, 377 y 467, o una secuencia sustancialmente idéntica que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de homología de la misma.
En un aspecto, la LCVR está codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 25, 73, 137, 169, 249, 313, 329, 377 y 467.
En un aspecto, la divulgación también proporciona un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo que comprende un dominio HCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 7, 23, 39, 55, 71, 87, 103, 119, 135, 151, 167, 183, 199, 215, 231, 247, 263, 279, 295, 311, 327, 343, 359, 375 y 465, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 15, 31, 47, 63, 79, 95, 111, 127, 143, 159, 175, 191,207, 223, 239, 255, 271,287, 303, 319, 335, 351,367, 383 y 473, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo o fragmento del mismo que comprende además un dominio HCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3, 19, 35, 51, 67, 83, 99, 115, 131, 147, 163, 179, 195, 211, 227, 243, 259, 275, 291, 307, 323, 339, 355, 371 y 461, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 5, 21, 37, 53, 69, 85, 101, 117, 133, 149, 165, 181, 197, 213, 229, 245, 261, 277, 293, 309, 325, 341, 357, 373 y 463, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 11,27, 43, 59, 75, 91, 107, 123, 139, 155, 171, 187, 203, 219, 235, 251,267, 283, 299, 315, 331, 347, 363, 379 y 469, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 codificado por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 13, 29, 45, 61,77, 93, 109, 125, 141, 157, 173, 189, 205, 221, 237, 253, 269, 285, 301, 317, 333, 349, 365, 381 y 471, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia.
Un sexto aspecto proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos humanos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención que se unen específicamente a Fel d1, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
En una realización, la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de dos o más anticuerpos humanos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a Fel d1 junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
En un aspecto de la divulgación, la composición farmacéutica comprende:
a) un primer anticuerpo monoclonal completamente humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 18; y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 26; y
b) un segundo anticuerpo monoclonal completamente humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ iD NO: 66, 130, 162, 306, 322, 370 y 460; y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 74, 138, 170, 314, 330, 378 y 468.
En un aspecto, la composición farmacéutica comprende:
a) un primer anticuerpo monoclonal completamente humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 242; y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 250; y
b) un segundo anticuerpo monoclonal completamente humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 306, 322 y 460; y una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 314, 330 y 468.
En un aspecto de la divulgación, la composición farmacéutica comprende:
a) un primer anticuerpo monoclonal completamente humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 18/26; y
b) un segundo anticuerpo monoclonal completamente humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las Se Q ID NO: 66/74, 130/138, 162/170, 306/314, 322/330, 370/378 y 460/468.
En un aspecto de la divulgación, la composición farmacéutica comprende:
a) un primer anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 18/26; y
b) un segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 130/138.
En un aspecto de la divulgación, la composición farmacéutica comprende:
a) un primer anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 18/26; y
b) un segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 322/330.
En un aspecto de la divulgación, la composición farmacéutica comprende:
a) un primer anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 18/26; y
b) un segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 306/314.
En un aspecto de la divulgación, la composición farmacéutica comprende:
a) un primer anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 18/26; y
b) un segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 370/378.
En un aspecto de la divulgación, la composición farmacéutica comprende:
a) un primer anticuerpo monoclonal completamente humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 242/250; y
b) un segundo anticuerpo monoclonal completamente humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 306/314 y 322/330.
En un aspecto de la divulgación, la composición farmacéutica comprende
a) un primer anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 242/250; y
b) un segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 306/314.
En un aspecto de la divulgación, la composición farmacéutica comprende
a) un primer anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 242/250; y
b) un segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, que comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 322/330.
En un aspecto de la divulgación, la composición farmacéutica comprende dos o más anticuerpos monoclonales humanos aislados que se unen específicamente a Fel d1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que comprenden pares de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 242/250, 306/314, 322/330, 370/378 y 460/468.
En una realización, la composición farmacéutica comprende cuatro anticuerpos monoclonales humanos aislados que se unen específicamente a Fel d1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, en donde los anticuerpos humanos o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden los pares de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138 y 162/170.
En una realización, la invención presenta una composición, que es una combinación de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos anti-Fel d1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención, y una cantidad terapéuticamente eficaz de un segundo agente terapéutico.
El segundo agente terapéutico puede ser un fármaco de molécula pequeña, una proteína/polipéptido, un anticuerpo, una molécula de ácido nucleico, tal como una molécula antisentido o un ARNip. El segundo agente terapéutico puede ser sintético o de origen natural.
El segundo agente terapéutico puede ser cualquier agente que se combine ventajosamente con un anticuerpo o fragmento del mismo de la invención, por ejemplo, un segundo anticuerpo distinto de los descritos en el presente documento que sea capaz de bloquear la unión de Fel d1 a IgE presente en mastocitos o basófilos. Un segundo agente terapéutico también puede ser cualquier agente que se use como tratamiento habitual en el tratamiento de una respuesta alérgica a cualquier alérgeno. Dicho segundo agente terapéutico puede ser un antihistamínico, epinefrina, un descongestionante, un corticoesteroide o una vacuna peptídica.
En determinadas realizaciones, el segundo agente terapéutico puede ser un agente que ayude a contrarrestar o reducir cualquier posible efecto(s) secundario asociado con el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la invención, si dicho efecto(s) secundario ocurriera.
T ambién se apreciará que los anticuerpos y las composiciones farmacéuticamente aceptables de la presente invención se pueden emplear en tratamientos combinados, esto es, los anticuerpos y las composiciones farmacéuticamente aceptables se pueden administrar simultáneamente con, antes o posteriormente a, uno o más de los diferentes procedimientos terapéuticos o médicos deseados. La combinación particular de terapias (tratamientos o procedimientos terapéuticos) que han de emplearse una posología combinada tendrá en cuenta la compatibilidad de los tratamientos y/o procedimientos terapéuticos deseados y el efecto terapéutico deseado que han de conseguirse. También se apreciará que los tratamientos empleados pueden conseguir un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, se puede administrar un anticuerpo de forma simultánea con otro agente utilizado para tratar el mismo trastorno), o se pueden conseguir diferentes ejemplos (por ejemplo, el control de cualesquiera efectos adversos). Como se emplea en el presente documento, los agentes terapéuticos adicionales que se administran normalmente para tratar o evitar una enfermedad, o dolencia concreta, son apropiados para la enfermedad, o afección, que se está tratando.
Cuando se administran de forma simultánea múltiples agentes terapéuticos, las dosis se pueden ajustar en consecuencia, como se reconoce en el campo pertinente.
Un séptimo aspecto de la invención proporciona una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos o fragmento de unión a antígeno de los mismos de la invención o una composición farmacéutica de la invención para su uso en un método para tratar a un paciente que muestra sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1, o para tratar al menos un síntoma o complicación asociada con una sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1, que comprende administrar una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos monoclonales humanos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la invención que se unen específicamente a Fel d1, o una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos monoclonales humanos aislados o fragmentos de los mismos de la invención que se unen específicamente a Fel d1, a un paciente que lo necesita, en donde la sensibilidad a, o una reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1 se evita o disminuye en gravedad y/o duración, o al menos un síntoma o complicación asociada con la sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1 se evita o mejora o que la frecuencia y/o duración de, o la gravedad de la sensibilidad a, o la reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato, o a la proteína Fel d1 se reduce después de la administración de uno o más de los anticuerpos monoclonales humanos aislados o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a Fel d1, o después de la administración de una composición que comprende uno o más de los anticuerpos anteriores de la invención.
En una realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más de los anticuerpos de la invención para su uso en el tratamiento de un paciente que muestra sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1, o para tratar al menos un síntoma o complicación asociada con una sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1, en donde la sensibilidad a, o una reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1 se evita o disminuye en gravedad y/o duración, o al menos un síntoma o complicación asociada con la sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1 se evita o mejora o que la frecuencia y/o duración de, o la gravedad de la sensibilidad a, o la reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1 se reduce.
En un aspecto, la divulgación proporciona el uso de una composición farmacéutica que comprende uno o más de los anticuerpos de la invención, o una o más de las moléculas biespecíficas de unión a antígeno que se unen específicamente a Fel d1 en la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de un paciente que muestra sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1, o para tratar al menos un síntoma o complicación asociada con una sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1, en donde la sensibilidad a, o una reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1 se evita o disminuye en gravedad y/o duración, o al menos un síntoma o complicación asociada con la sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1 se evita o mejora o que la frecuencia y/o duración de, o la gravedad de la sensibilidad a, o la reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1 se reduce.
En una realización, la invención proporciona el uso de una composición farmacéutica como se describe anteriormente, en donde la composición se administra en combinación con un segundo agente terapéutico útil para disminuir una reacción alérgica a un gato, caspa de gato, extracto de pelo de gato o a la proteína Fel d1. En una realización, la invención proporciona el uso de la composición farmacéutica como se describe anteriormente, en donde el segundo agente terapéutico se selecciona de un corticoesteroide, un dilatador bronquial, un antihistamínico, epinefrina, un descongestionante, otro anticuerpo diferente contra Fel d1 y una vacuna peptídica.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención pueden ser capaces de reducir, minimizar o evitar al menos un síntoma en un paciente sensible al alérgeno de gato Fel d1, tales como los estornudos, congestión, bloqueo nasal, tos, respiración sibilante, broncoconstricción, rinitis o conjuntivitis.
En una realización, los anticuerpos de la invención, o una composición que comprende uno o más anticuerpos de la invención o una o más de las moléculas de unión a antígeno que se unen específicamente a Fel d1 pueden usarse para prevenir complicaciones in vivo más graves asociadas con un alergia a Fel d1, incluyendo respuestas asmáticas, shock anafiláctico o incluso la muerte como resultado de la anafilaxia.
En una realización, la composición farmacéutica se administra a un paciente junto con un segundo agente terapéutico.
En otra realización, el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un antihistamínico, epinefrina, un descongestionante, un corticoesteroide, otro anticuerpo diferente contra Fel d1, una vacuna peptídica y cualquier otra terapia paliativa útil para reducir la gravedad de la reacción alérgica o para mejorar al menos un síntoma asociado con la reacción alérgica.
Otras realizaciones se harán evidentes tras la revisión de la siguiente descripción detallada.
Descripción detallada
Antes de describir los presentes métodos, se ha de entender que la presente invención no se limita a los métodos ni a las condiciones experimentales descritos en particular, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitante, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Como se emplea en el presente documento, el término "aproximadamente", cuando se usa en referencia a un valor numérico indicado particular, significa que el valor puede variar del valor indicado en no más de 1 %. Por ejemplo, como se usa en el presente documento, la expresión "aproximadamente 100" incluye 99 y 101 y todos los valores intermedios (por ejemplo, 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).
Aunque se puede usar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o ensayo de la presente invención, a continuación, se describen métodos y materiales preferidos.
Definiciones
El término "Fel d1" o "FELD1", como se usa en el presente documento, se refiere a al menos una proteína Fel d1, ya sea en forma natural/nativa, o producida de forma recombinante. La proteína Fel d1 comprende, o alternativamente, consiste en, la cadena 1 (también denominada cadena A) de Fel d1 (SEQ ID NO: 392) y la cadena 2 (también denominada cadena B) de Fel d1 (SEQ ID NO: 393). La proteína Fel d1 natural es una glucoproteína heterodímera de aproximadamente 18 kDa compuesta de dos cadenas procedentes de dos genes independientes (véase Duffort, O.A. et al., (1991), Mol. Immunol. 28:301-309; Kristensen, A.K. et al., (1997), Biol. Chem. 378:899-908; Kaiser L. et al. (2003), J. Biol. Chem. 278(39):37730-37735). Una proteína Fel d1 producida de forma recombinante también se muestra como SEQ ID NO: 396, en donde esta secuencia contiene los restos de aminoácidos 18 a 109 de la cadena B de Fel d1 del número de registro de GenBank NP_001041619.1 (sin la secuencia señal) fusionada en línea con los restos de aminoácidos 19-88 de la cadena A de Fel d1 del número de registro de GenBank NP_001041618.1 (sin la secuencia de señal y con una mutación D27G, que corresponde a la glicina en la posición 101 de la SEQ ID NO: 396). Otras construcciones Fel d1 producidas de manera recombinante de la invención se ejemplifican en las SEQ ID NO: 385, 394, 395 y 397.
La "cadena 1" o "cadena A" de Fel d1 es un polipéptido que comprende, o que consiste alternativamente en, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 392, o una secuencia homóloga de la misma. La expresión secuencia homóloga de SEQ ID NO: 392, como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una identidad con la SEQ ID NO: 392 que es mayor de un 70 %, preferentemente mayor de un 80 %, más preferentemente mayor de un 90 % e incluso, más preferentemente, mayor de un 95 %. La secuencia de aminoácidos de la cadena 1 de Fel d1 también se proporciona en GenBank como número de registro P30438, o como número de registro NP_001041618.1, que también incluye el péptido señal que se elimina en la proteína madura.
La "cadena 2" o "cadena B" de Fel d1 es un polipéptido que comprende, o que consiste alternativamente en, una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 393, o una secuencia homóloga de la misma. La expresión secuencia homóloga de SEQ ID NO: 393, como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que tiene una identidad con la SEQ ID NO: 393 que es mayor de un 70 %, preferentemente mayor de un 80 %, más preferentemente mayor de un 90 % e incluso, más preferentemente, mayor de un 95 %. La secuencia de aminoácidos de la cadena 2 de Fel d1 también se proporciona en GenBank como número de registro P30440, o como número de registro NP_001041619.1, que incluye el péptido señal que se elimina en la proteína madura.
La expresión "fragmento Fel d1", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende o que consiste alternativamente en, al menos un sitio antigénico de Fel d1. En un aspecto, la expresión "fragmento Fel d1", como se usa en el presente documento, se refiere a un polipéptido que comprende o que consiste alternativamente en al menos dos sitios antigénicos de Fel d1. En un aspecto, los sitios antigénicos están unidos covalentemente. En un aspecto, los sitios antigénicos están unidos mediante al menos un enlace peptídico. En un aspecto, los dos sitios antigénicos están unidos mediante al menos un enlace peptídico y un separador entre los sitios antigénicos. En un aspecto, los al menos dos sitios antigénicos proceden tanto de la cadena 1 de Fel d1 como de la cadena 2 de Fel d1. En un aspecto, los al menos dos sitios antigénicos comprenden las secuencias de aminoácidos 23-92 del número de registro GenBank P30438 y las secuencias de aminoácidos 18-109 del número de registro GenBank P30440. En un aspecto, los al menos dos sitios antigénicos proceden tanto de la cadena 1 de Fel d1 como de la cadena 2 de Fel d1. En un aspecto, los al menos dos sitios antigénicos comprenden las secuencias de aminoácidos 19-88 del número de registro GenBank NP_001041618.1 y las secuencias de aminoácidos 18-109 del número de registro GenBank NP_001041619.1. En un aspecto, los al menos dos sitios antigénicos comprenden una secuencia de aminoácidos dentro de cualquiera de las SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 o 397. En un aspecto, cualquiera de los fragmentos Fel d1 es capaz de inducir la producción de anticuerpos in vivo que se unen específicamente a Fel d1 de origen natural, o a Fel d1 producido de forma recombinante.
El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, significa cualquier molécula o complejo molecular de unión a antígeno que comprende al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que se une específicamente a o interactúa con un antígeno particular (por ejemplo, Fel d1). El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina compuestas por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas mediante enlaces disulfuro (es decir, "moléculas de anticuerpo completas"), así como multímeros de los mismos (por ejemplo, IgM) o fragmentos de unión a antígeno de los mismos. Cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada ("HCVR" o "Vh") y una región constante de cadena pesada (compuesta por los dominios Ch1, Ch2 y Ch3). Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera ("LCVR" o "Vl") y una región constante de cadena ligera (Cl). Las regiones Vh y Vl pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco conservadas (FR). Cada Vh y Vl está compuesta por tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: Fr 1, CDR1, f R2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En determinados aspectos de la divulgación, las FR del anticuerpo (o fragmento de unión a antígeno del mismo) pueden ser idénticas a las secuencias de la línea germinal humana o pueden modificarse de manera natural o artificial. Una secuencia consenso de aminoácidos se puede definir basándose en un análisis paralelo de dos o más CDR.
También es posible la sustitución de uno o más restos de CDR o la omisión de una o más CDR. Se han descrito anticuerpos en la bibliografía científica en los que se puede prescindir de una o dos CDR para la unión. Padlan et al. (1995 FASEB J. 9:133-139) analizaron las regiones de contacto entre los anticuerpos y sus antígenos, basándose en estructuras cristalinas publicadas, y concluyeron que solo aproximadamente de un quinto a un tercio de los restos de CDR realmente entran en contacto con el antígeno. Padlan también descubrió muchos anticuerpos en los que una o dos CDR no tenían aminoácidos en contacto con un antígeno (véase también, Vajdos et al. (2002), J Mol Biol 320:415-428).
Los restos de CDR que no entran en contacto con el antígeno se pueden identificar basándose en estudios anteriores (por ejemplo, los restos H60-H65 en CDRH2 a menudo no son necesarios), de regiones de CDR de Kabat que se encuentran fuera de CDR de Chothia, por modelización molecular y/o empíricamente. Si se omite una CDR o uno o más restos de la misma, generalmente se sustituye con un aminoácido que ocupa la posición correspondiente en otra secuencia de anticuerpo humano o un consenso de dichas secuencias. Las posiciones para la sustitución dentro de CDR y los aminoácidos a sustituir también pueden seleccionarse empíricamente. Las sustituciones empíricas pueden ser sustituciones conservativas o no conservativas.
Los anticuerpos monoclonales completamente humanos que se unen específicamente a Fel d1, como se divulga en el presente documento, pueden comprender una o más sustituciones, inserciones y/o deleciones de aminoácidos en las regiones marco y/o CDR de los dominios variables de cadena pesada y ligera en comparación con las secuencias de la línea germinal correspondientes. Dichas mutaciones pueden averiguarse fácilmente comparando las secuencias de aminoácidos divulgadas en este documento con secuencias de la línea germinal disponibles en, por ejemplo, bases de datos de secuencias de anticuerpos públicas. La presente divulgación incluye anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que se obtienen a partir de cualquiera de las secuencias de aminoácidos divulgadas en el presente documento, en las que uno o más aminoácidos dentro de una o más regiones marco y/o CDR están mutados en el resto o restos correspondientes de la secuencia de la línea germinal de la que se obtuvo el anticuerpo, o en el resto o restos correspondientes de otra secuencia de la línea germinal humana, o en una sustitución de aminoácidos conservativa del resto o restos de la línea germinal correspondientes (dichos cambios de secuencia se mencionan en el presente documento colectivamente como "mutaciones de la línea germinal"). Un experto en la técnica, partiendo con las secuencias de la región variable de cadena pesada y ligera divulgadas en el presente documento, puede producir fácilmente numerosos anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que comprenden una o más mutaciones de la línea germinal individuales o combinaciones de las mismas. En determinados aspectos, todos los restos marco y/o CDR dentro de los dominios Vh y/o Vl mutan de vuelta a los restos encontrados en la secuencia de la línea germinal humana de la que se obtuvo el anticuerpo. En otros aspectos, únicamente determinados restos mutan de vuelta a la secuencia de la línea germinal original, por ejemplo, únicamente los restos mutados encontrados dentro de los primeros 8 aminoácidos de FR1 o dentro de los últimos 8 aminoácidos de FR4, o únicamente los restos mutados encontrados dentro de CDR1, CDR2 o CDR3. En otros aspectos, uno o más de los restos marco y/o CDR se mutan al resto o restos correspondientes de una secuencia de la línea germinal diferente (es decir, una secuencia de la línea germinal que es diferente de la secuencia de la línea germinal de la que se obtuvo originalmente el anticuerpo). Adicionalmente, los anticuerpos de la presente divulgación pueden contener cualquier combinación de dos o más mutaciones de la línea germinal dentro de las regiones marco y/o CDR, por ejemplo, en las que determinados restos individuales están mutados al resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal particular mientras que otros restos determinados que difieren de la secuencia de la línea germinal original se mantienen o están mutados al resto correspondiente de una secuencia de la línea germinal diferente. Una vez obtenidas, los anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno que contienen una o más mutaciones de la línea germinal pueden ensayarse fácilmente con respecto a una o más propiedades deseadas tales como, mejor especificidad de unión, mayor afinidad de unión, propiedades biológicas antagonista o agonistas mejoradas o potenciadas (según pueda ser el caso), menor inmunogenicidad, etc. Dentro de la presente divulgación se incluyen anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno obtenidos de esta manera general.
La presente divulgación también incluye anticuerpos monoclonales completamente humanos que comprenden variantes de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento que tienen una o más sustituciones conservativas. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos que tienen secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR con, por ejemplo, 10 o menos, 8 o menos, 6 o menos, 4 o menos, etc. sustituciones de aminoácidos conservativas en relación con cualquiera de las secuencias de aminoácidos de HCVR, LCVR y/o CDR divulgadas en el presente documento.
La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los AcM humanos de la divulgación pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulinas de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria y específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir AcM en los que las secuencias CDR procedentes de la línea germinal de otra especie de mamífero (por ejemplo, ratón), se han injertado en secuencias FR humanas.
Como se emplea en el presente documento, la expresión "molécula de unión a antígeno" significa una proteína, polipéptido o complejo molecular que comprende o que consiste en al menos una región determinante de complementariedad (CDR) que sola o en combinación con una o más CDR adicionales y/o regiones marco (FR), se une específicamente a un antígeno particular. En determinados aspectos, una molécula de unión a antígeno es un anticuerpo o un fragmento de un anticuerpo, tal como esos términos se definen en otra parte del presente documento.
Como se emplea en el presente documento, la expresión "molécula biespecífica de unión a antígeno" significa una proteína, polipéptido o complejo molecular que comprende al menos un primer dominio de unión a antígeno y un segundo dominio de unión a antígeno (es decir, dos brazos). Cada dominio de unión a antígeno dentro de la molécula biespecífica de unión a antígeno comprende al menos una CDR que sola, o en combinación con una o más CDR y/o FR adicionales, se une específicamente a un antígeno particular. En el contexto de la presente invención, el primer dominio de unión a antígeno se une específicamente a un primer antígeno en Fel d1 y el segundo dominio de unión a antígeno se une específicamente a un segundo antígeno distinto en Fel d1.
La expresión "se une específicamente", o "se une específicamente a", o similares, significa que un anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo forma un complejo con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica se puede caracterizar por una constante de disociación de equilibrio de al menos aproximadamente 1x10-6 M o menos (por ejemplo, una Kd más pequeña indica una unión más estrecha). Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis en equilibrio, resonancia de plasmón superficial y similares. Tal como se describe en el presente documento, los anticuerpos se han identificado mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™, que se une específicamente a Fel d1. Además, los anticuerpos multiespecíficos que se unen a Fel d1 y uno o más antígenos adicionales o uno biespecífico que se une a dos regiones diferentes de Fel d1 (por ejemplo, la cadena 1 y/o la cadena 2 de Fel d1) se consideran, sin embargo, anticuerpos que "se unen específicamente", como se usa en el presente documento.
La expresión anticuerpo "de alta afinidad" se refiere a aquellos AcM que tienen una afinidad de unión a Fel d1, expresada como Kd, de al menos 10-8 M; preferentemente 10-9 M; más preferentemente 10-10 M, incluso más preferentemente de 10-11 M, incluso más preferentemente de 10-12 M, tal como se mide mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™ o ELISA por afinidad en solución.
Por la expresión "disociación lenta", "Koff" o "kd" se refiere a un anticuerpo que se disocia de Fel d1, con una velocidad constante de 1 x 10-3 s-1 o menos, preferentemente 1 x 10-4 s-1 o menos, tal como se determina mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, BIACORE™.
Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usa en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo o "fragmento de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse a Fel d1.
Las realizaciones específicas, un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de la invención pueden conjugarse con una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como un corticoesteroide, un segundo anticuerpo anti-Fel d1, o epinefrina, una vacuna, o cualquier otra fracción terapéutica útil para tratar una respuesta alérgica a Fel d1.
Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos (Ac) que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a Fel d1, o un fragmento del mismo, está sustancialmente libre de Ac que se unen específicamente a antígenos diferentes de Fel d1).
Un "anticuerpo de bloqueo" o un "anticuerpo neutralizante", como se usa en el presente documento (o un "anticuerpo que neutraliza la actividad de Fel d1"), pretende referirse a un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, cuya unión a Fel d1 da como resultado la inhibición de al menos una actividad biológica de Fel d1. Por ejemplo, un anticuerpo de la invención puede ayudar a evitar la respuesta alérgica primaria a Fel d1. Como alternativa, un anticuerpo de la invención puede demostrar la capacidad para evitar una respuesta alérgica secundaria a Fel d1, o al menos un síntoma de una respuesta alérgica a Fel d1, que incluye estornudos, tos, una afección asmática o una respuesta anafiláctica causada por Fel d1. Esta inhibición de la actividad biológica de Fel d1 se puede evaluar mediante la medición de uno o más indicadores de la actividad biológica de Fel d1 mediante uno o más de varios ensayos estándar in vitro o in vivo (tal como un ensayo de anafilaxia cutánea pasiva, como se describe en el presente documento) u otros ensayos in vivo conocidos en la técnica (por ejemplo, otros modelos animales para observar la protección contra la exposición con Fel d1 después de la administración de uno o más de los anticuerpos descritos en el presente documento).
La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones biomoleculares en tiempo real mediante la detección de alteraciones en concentraciones de proteína dentro de una matriz biodetectora, por ejemplo usando el sistema BIACORE™ (Pharmacia Biosensor a B, Uppsala, Suecia y Piscataway, N.J.).
El término "Kd", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación en equilibrio de una interacción particular de anticuerpo-antígeno.
El término "epítopo" se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno o puede tener diferentes efectos biológicos. El término "epítopo"también se refiere a un lugar sobre un antígeno al que responden linfocitos B y/o T. También se refiere a una región de un antígeno a la que se une un anticuerpo. Los epítopos pueden ser lineales o conformacionales. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. Un epítopo conformacional se produce por yuxtaposición espacial de aminoácidos de diferentes segmentos de la cadena de polipéptido lineal. En determinadas realizaciones, los epítopos pueden incluir determinantes que son grupos de moléculas químicamente activas en la superficie tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, grupos fosforilo o grupos sulfonilo y, en determinadas realizaciones, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Los epítopos también pueden definirse como estructurales o funcionales. Los epítopos funcionales son generalmente un subconjunto de los epítopos estructurales y tienen aquellos restos que contribuyen directamente a la afinidad de la interacción. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos normalmente se mantienen al tratarlos con disolventes desnaturalizantes, mientras que los epítopos formados mediante plegamiento terciario normalmente se pierden en el tratamiento con disolventes desnaturalizantes. Un epítopo normalmente incluye al menos 3, y más habitualmente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial única.
La expresión "identidad sustancial" o "sustancialmente idéntico", cuando hace referencia a un ácido nucleico o fragmento del mismo, indica que, cuando se alinean de forma óptima con inserciones o eliminaciones de nucleótidos apropiadas con otro ácido nucleico (o su hebra complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en al menos aproximadamente un 90 % y, más preferentemente, al menos aproximadamente un 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de las bases nucleotídicas, medida por cualquier algoritmo bien conocido de identidad de secuencias, tal como FASTA, BLAST o GAP, como se analiza a continuación. Una molécula de ácido nucleico que tiene identidad sustancial con una molécula de ácido nucleico de referencia puede, en determinados casos, codificar un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos o una secuencia de aminoácidos sustancialmente similar al polipéptido codificado mediante la molécula de ácido nucleico de referencia.
Aplicada a polipéptidos, la expresión "similitud sustancial" o "sustancialmente similar" significa que dos secuencias peptídicas, cuando se alinean de forma óptima, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT usando ponderaciones de hueco predeterminadas, comparten al menos un 90 % de identidad de secuencia, incluso más preferentemente al menos un 95 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia. Preferentemente, las posiciones de los restos, que no son idénticas, difieren mediante sustituciones de aminoácidos conservativas. Una "sustitución de aminoácido conservativa" es una en la que un resto de aminoácido está sustituido por otro resto de aminoácido que tiene una cadena lateral (grupo R) con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad). En general, una sustitución de aminoácidos conservativa no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En los casos en los que dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de grado de similitud puede ajustarse a la alza para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos por los expertos en la técnica. (Véase, por ejemplo, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331). Los ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares incluyen i) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo-alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales ácidas: aspartato y glutamato, y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Son grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos: valinaleucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina.
Como alternativa, un remplazo conservativo es cualquier cambio que tenga un valor positivo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250 divulgada en Gonnet et al. (1992) Science 256:1443 45. Un remplazo "moderadamente conservativo" es cualquier cambio que tenga un valor no negativo en la matriz de probabilidad logarítmica PAM250.
La similitud de secuencia para polipéptidos se mide normalmente usando un software de análisis de secuencia. El programa informático de análisis de proteínas empareja secuencias similares usando medidas de similitud asignadas a diversas sustituciones, eliminaciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones de aminoácidos conservativas. Por ejemplo, el programa informático GCG contiene programas tales como GAP y BESTFIT que pueden usarse con parámetros por defecto para determinar la homología de secuencia o la identidad de secuencia entre polipéptidos muy relacionados, tales como polipéptidos homólogos de diferentes especies de organismos o entre una proteína de tipo silvestre y una muteína de la misma. Véase, por ejemplo, g Cg Versión 6.1. Las secuencias polipeptídicas también pueden compararse usando FASTA con parámetros por defecto o recomendados; un programa en GCG Versión 6.1. FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) proporciona alineaciones y porcentajes de identidad de secuencia de las regiones del mejor solapamiento entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson (2000) anteriormente citado). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene una gran cantidad de secuencias de diferentes organismos es el programa informático BLAST, especialmente BLASTP o TBLASTN, usando parámetros por defecto. Véase, por ejemplo, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403410 y (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389402).
El anticuerpo o fragmento de anticuerpo para su uso en los métodos puede ser monoespecífico, biespecífico o multiespecífico. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para epítopos de más de un polipéptido diana. Un formato de anticuerpo biespecífico ejemplar que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio Ch3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ch3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. En una realización, el primer dominio Ch3 de Ig está unido a proteína A y el segundo dominio Ch3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo Ch3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo Ch3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de AcM IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de AcM IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de AcM IgG4. Se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.
Por la frase "cantidad terapéuticamente eficaz" se entiende una cantidad que produce el efecto deseado para el que se administra. La cantidad exacta dependerá del propósito del tratamiento y la podrá averiguar un experto en la materia usando técnica conocidas (véase, por ejemplo, Lloyd (1999) The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding).
Los anticuerpos de la invención pueden usarse para "desensibilizar" a un individuo sensible a los gatos. El término "desensibilizar" se define en el presente documento como una disminución de la reactividad alérgica de un individuo sensible a los gatos a la exposición a gatos, caspa de gato o productos de los mismos, por ejemplo, Fel d1 (a un nivel inferior al que experimentaría el individuo sensible a los gatos).
Descripción general
El gato doméstico es una fuente de muchos alérgenos de interior y la gravedad de los síntomas en las personas que muestran sensibilidad a los alérgenos del gato varía desde una rinitis y conjuntivitis relativamente leve hasta una afección asmática potencialmente mortal (Lau, S. et al. (2000), Lancet 356:1392-1397). Mientras que los pacientes que muestran dicha sensibilidad a los gatos parecen responder a diferentes moléculas que se encuentran en la caspa y las pieles de los gatos, el alérgeno principal parece ser Fel d1 (alérgeno 1 de Felis domesticus). Se ha demostrado que más de un 80 % de los pacientes alérgicos a los gatos tienen anticuerpos IgE contra este alérgeno (van Ree, R. et al. (1999), J. Allergy Clin. Immunol 104:1223-1230).
La proteína Fel d1 es una glucoproteína ácida heterodímera de aproximadamente 18 kDa que contiene aproximadamente un 10-20 % de hidratos de carbono unidos a N. Cada heterodímero comprende dos cadenas polipeptídicas que están codificadas por dos genes separados (Duffort, OA, et al., (1991), Mol. Immunol. 28:301-309; Morgenstern, JP, et al., (1991), PNAS 88:9690-9694; Griffith, I.J., et al. (1992), Gene 113:263-268). La cadena 1 comprende aproximadamente 70 restos de aminoácidos y la cadena 2 comprende aproximadamente 90-92 restos de aminoácidos. Se han propuesto tres enlaces disulfuro intercatenarios que unen las dos cadenas en Fel d1 natural (Kristensen, AK et al. (1997), Biol. Chem. 378:899-908) y se confirmó para Fel d1 recombinante en la estructura cristalina (Kaiser, L. et al. (2003), J. Biol. Chem. 278:37730-37735; Kaiser, L. et al., (2007), J. Mol. Biol. 370:714-727). Aunque a veces cada cadena se denomina individualmente "Fel d1", ambas cadenas son necesarias para el alérgeno proteico completo.
Fel d i se produce por las glándulas sebáceas, las glándulas escamosas y las células epiteliales escamosas y se transfiere a la piel lamiendo y acicalando (Bartholome, K. et al. (1985), J. Allergy Clin. Immunol. 76:503-506; Charpin, C. et al. (1991), J. Allergy Clin. Immunol. 88:77-82; Dabrowski, A. J. (1990), et al. J. Allergy Clin. Immunol. 86:462-465). También está presente en las glándulas salivales, perianales y lacrimales (Andersen, M.C., et al. (1985), J. Allergy Clin. Immunol. 76:563-569; van Milligen, F.J. et al., (1992), Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 92:375-378) y los reservorios principales parecen ser la piel y el pelaje (Mata, P. et al. (1992), Ann. Allergy 69(4):321-322).
La proteína Fel d1 tiene una función desconocida para el animal pero causa una reacción de IgG o IgE en seres humanos sensibles (ya sea como una respuesta alérgica o asmática). Aunque se conocen otros alérgenos de gatos, incluyendo Fel d2 (albúmina) y Fel d3 (cistatina), del 60 % al 90 % del anti-IgE de gato producido se dirige contra Fel d1 (Leitermann, K. et al., (1984), J Allergy Clin. Immunol. 74:147-153; Lowenstein, H. et al., (1985), Allergy 40:430-441; van Ree, R. et al., (1999), J. Allergy Clin. Immunol. 104:1223-1230; Ichikawa, K. et al., (2011), Clin. Exp. Allergy, 31:1279-1286).
La inmunoglobulina E (IgE) es responsable de la hipersensibilidad tipo 1, que se manifiesta en rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, fiebre del heno, asma alérgica, alergia al veneno de abeja y alergias alimentarias. La IgE circula en la sangre y se une a los receptores Fc de alta afinidad para IgE en los basófilos y los mastocitos. En la mayoría de las respuestas alérgicas, los alérgenos se incorporan al cuerpo por inhalación, ingestión o por la piel. El alérgeno luego se une a la IgE formada previamente ya unida al receptor de alta afinidad en las superficies de los mastocitos y basófilos, lo que da como resultado la reticulación de varias moléculas de IgE y desencadena la liberación de histamina y otros mediadores inflamatorios que causan los diversos síntomas alérgicos.
El tratamiento para las alergias a los gatos incluye la terapia de desensibilización, que implica inyecciones repetidas con dosis crecientes de extracto bruto de caspa de gato o péptidos cortos procedentes de Fel d1. Usando el extracto bruto de caspa de gato, Lilja et. al. demostraron que después de tres años de dicho tratamiento, los pacientes alérgicos a los gatos aún exhibían síntomas sistémicos (Lilja, Q. et al. (1989), J. Allergy Clin. Immunol. 83:37-44 y Hedlin, et al. (1991), J. Allergy Clin. Immunol. 87:955-964). El uso de péptidos cortos procedentes de Fel d1 para la desensibilización dio como resultado una diferencia no significativa entre el grupo tratado con péptidos y el grupo de control tratado con placebo (Oldfield, W.L. et al., (2002), Lancet, 360:47-53). La eficacia solo se observó cuando se administraron grandes cantidades (750 |jg) del péptido corto a los pacientes (Norman, P.S. et al. (1996), Am. J. Respir. Crit. Care Med.
154:1623-1628). Adicionalmente, se han informado reacciones asmáticas en pacientes que recibieron extractos brutos de caspa de gato, así como en pacientes que recibieron un breve tratamiento con péptido Fel d1. En consecuencia, existe una necesidad en el campo del tratamiento de la alergia al gato de estrategias alternativas para el tratamiento de pacientes sensibles a los alérgenos del gato, en particular Fel d1.
Se han propuesto anticuerpos como una estrategia de tratamiento general para las alergias, ya que pueden ser capaces de bloquear la entrada de moléculas alergénicas en los tejidos de la mucosa, o pueden unir el alérgeno antes de que tenga la oportunidad de unirse a la IgE unida al receptor de alta afinidad en mastocitos o basófilos, evitando así la liberación de histamina y otros mediadores inflamatorios de estas células. La patente de Estados Unidos n.° 5.670.626 describe el uso de anticuerpos monoclonales para el tratamiento de enfermedades alérgicas mediadas por IgE, tal como rinitis alérgica, asma alérgica y conjuntivitis alérgica mediante el bloqueo de la unión de los alérgenos al tejido mucoso. La patente de Estados Unidos n.° 6.849.259 describe el uso de anticuerpos específicos para alérgenos para inhibir la inflamación alérgica en un modelo de alergia in vivo en ratones. Se han descrito sistemas de anticuerpos a base de leche y huevo. Por ejemplo, el documento US20030003133A1 divulga el uso de leche como vehículo de alérgenos para inducir tolerancia oral a la caspa de gato y otros alérgenos. Las composiciones y métodos para reducir una respuesta alérgica en un animal a un alérgeno en el ambiente mediante el uso de una molécula que inhibe la capacidad del alérgeno para unirse a los mastocitos se describió en el documento US2010/0143266. Se describieron otros anticuerpos contra Fel d1 por de Groot et. al. (de Groot et. al., (1988), J. Allergy Clin. Immunol. 82:778-786).
Los anticuerpos completamente humanos descritos en el presente documento demuestran una unión específica a Fel d1 y pueden ser útiles para tratar pacientes que padecen alergias a gatos, en particular, en pacientes que muestran sensibilidad al alérgeno Fel d1. El uso de dichos anticuerpos puede ser un medio eficaz para tratar a pacientes que padecen alergias a la caspa de gato, o pueden usarse para evitar una respuesta aumentada a Fel d1 en una exposición secundaria, o los síntomas que acompañan asociados con la alergia, o pueden usarse para disminuir la gravedad y/o la duración de la respuesta alérgica asociada con una exposición primaria a un gato que alberga el alérgeno Fel d1 o con la recurrencia de los síntomas en una exposición secundaria. Se pueden usar solos o como terapia complementaria con otras fracciones terapéuticas o modalidades conocidas en la técnica para tratar dichas alergias, tales como, pero sin limitación, tratamiento con corticoesteroides o epinefrina. Se pueden usar junto con un segundo o tercer anticuerpo diferente específico para Fel d1. Se pueden usar con inmunoterapia específica (SIT, por sus siglas en inglés) para alérgenos.
En determinados casos, los anticuerpos se obtienen de ratones inmunizados con un inmunógeno primario, tal como Fel d1 natural, que se puede comprar comercialmente (véase, por ejemplo, Indoor Biotech, n.° NA-FD1-2), o se puede producir de forma recombinante. En determinados casos, el inmunógeno puede ser la cadena 1 de Fel d1 o la cadena 2 de Fel d1, o puede ser una combinación de la cadena 1 y la cadena 2 administradas secuencialmente o simultáneamente. La secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena 1 (también denominada FELD1 A) se muestra como la SEQ ID NO: 392. Las secuencias de aminoácidos de longitud completa para la cadena 1 también se pueden encontrar en los números de registro de GenBank P30438 y NP_001041618.1. La secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena 2 (también denominada FELD1 B) se muestra como la SEQ ID NO: 393. Las secuencias de aminoácidos de longitud completa para la cadena 2 también se pueden encontrar en los números de registro de GenBank PP30440 y NP_001041619.1.
En determinados casos, el inmunógeno Fel d1 producido de forma recombinante puede prepararse mediante fusión directa de las dos cadenas de Fel d1, como se describe en Kaiser et. al., para producir un producto de fusión que tenga un patrón de replegamiento similar al del Fel d1 natural (Kaiser, L. et al., (2003), J. Biol. Chem. 278(39):37730-37735). En determinados casos, el inmunógeno puede ser una proteína de fusión tal como la que se muestra en las construcciones de las SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 o 397, seguido de inmunización con un inmunógeno secundario o con un fragmento inmunogénicamente activo de Fel d1 natural o producida de forma recombinante.
El inmunógeno puede ser un fragmento biológicamente activo y/o inmunogénico de Fel d1 natural o producido de forma recombinante, o ADN que codifica el fragmento activo del mismo. El fragmento puede proceder del extremo N o del extremo C de la cadena 1 o de la cadena 2, o del extremo N o del extremo C de la cadena 1 y la cadena 2. Se pueden obtener fragmentos de cualquier sitio dentro de la cadena 1 o la cadena 2 para usar como inmunógeno para preparar anticuerpos para Fel d1.
En determinados casos, el inmunógeno puede ser una proteína de fusión que comprende uno o más de los siguientes: i) restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank P30440 y también la SEQ ID NO: 393) fusionados a través del extremo C directamente con el extremo N de los restos de aminoácidos 23-92 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank P30438 y también la SEQ ID NO: 392); ii) restos de aminoácidos 23-92 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank P30438 y también la SEQ ID NO: 392) fusionados a través del extremo C al extremo N de los restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank P30440 y también la SEQ ID NO: 393); iii) restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank NP_001041619.1) fusionados a través del extremo C directamente con el extremo N de los restos de aminoácidos 19-88 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank NP_001041618.1), tal como la construcción mostrada en la SEQ ID NO: 394 o 396; iv) restos de aminoácidos 19-88 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank NP_001041618.1) fusionados a través del extremo C al extremo N de los restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank NP_001041619.1). Véase también la SEQ ID NO: 395. En determinados casos, la proteína de fusión puede tener un marcador en el extremo C terminal de la construcción, tal como u marcador de mycmyc-hexahistidina (véanse las SEQ ID NO: 385, 396 o 397 para dichas construcciones). En casos relacionados, la proteína de fusión puede tener una región Fc de anticuerpo de ratón acoplada en el extremo C terminal de la construcción (Véase la SEQ ID NO: 394 o 395 para dichas construcciones). En determinados casos, las cadenas 1 y 2 se acoplan a través de un conector conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo (G4S)3 (Véanse las SEQ ID NO: 395 y 397 para dicha construcción).
En determinados casos, los anticuerpos que se unen específicamente a Fel d1 pueden prepararse usando fragmentos de las regiones mencionadas anteriormente, o péptidos que se extienden más allá de las regiones designadas por aproximadamente 5 a aproximadamente 20 restos de aminoácidos de uno, o ambos, extremos terminales N o C de las regiones descritas en el presente documento. En determinados casos, cualquier combinación de las regiones mencionadas anteriormente o fragmentos de las mismas puede usarse en la preparación de anticuerpos específicos para Fel d1. En determinados casos, se puede usar una cualquiera o más de las regiones de Fel d1 mencionadas anteriormente, o fragmentos de las mismas para preparar anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos.
Fragmentos de anticuerpos de unión a antígeno
A menos que se indique específicamente de otra manera, el término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, entenderá que abarca moléculas de anticuerpo que comprenden dos cadenas pesadas de inmunoglobulina y dos cadenas ligeras de inmunoglobulina (es decir, "moléculas de anticuerpo completas"), así como fragmentos de unión a antígeno de las mismas. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usa en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo o "fragmento de anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente ala cadena 1 y/o la cadena 2 de Fel d1. Un fragmento de anticuerpo puede incluir un fragmento Fab, un fragmento de F(ab')2, un fragmento Fv, un fragmento de dAb, un fragmento que contiene una CDR o una CDR aislada. Los fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo pueden obtenerse, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas, usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables, y (opcionalmente) constantes, de anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente de, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos), o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o suprimir aminoácidos, etc.
Los ejemplos no limitantes de fragmentos de unión al antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimo que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo (por ejemplo, una región determinante de complementariedad (CDR) aislada, tal como un péptido CDR3) o un péptido FR3-CDR3-FR4 restringido. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de dominio suprimido, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se abarcan dentro de la expresión "fragmento de unión al antígeno", como se usa en el presente documento.
Un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR, que está adyacente o en marco con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión al antígeno que tienen un dominio Vh asociado con un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. Como alternativa, el fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.
En determinados casos, un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente con al menos un dominio constante. Las configuraciones ejemplares no limitantes de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo incluyen: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh -Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1 - Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl -Ch1-Ch2; (xii) Vl -Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xiv) Vl-CL. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o conectora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos, lo que da como resultado un enlace flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una sola molécula polipeptídica. Además, un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, mediante uno o más enlaces disulfuro).
Como ocurre con las moléculas de anticuerpo completas, los fragmentos de unión a antígeno pueden ser monoespecíficos o multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos). Un fragmento de unión a antígeno multiespecífico de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos dos dominios variables diferentes, en donde cada dominio variable puede unirse específicamente con un antígeno distinto o con un epítopo diferente en el mismo antígeno. Cualquier formato de anticuerpo multiespecífico, incluyendo los formatos de anticuerpo biespecífico ejemplares divulgados en el presente documento, puede adaptarse para su uso en el contexto de un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo de la presente invención usando técnicas rutinarias disponibles en la técnica.
Preparación de anticuerpos humanos
Los métodos para generar anticuerpos humanos en ratones transgénicos se conocen en la técnica. Cualquiera de dichos métodos conocidos se puede usar en el contexto de la presente invención para preparar anticuerpos humanos que se unan específicamente a Fel d1.
Usando la tecnología VELOCIMMUNE™ (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®) o cualquier otro método conocido para generar anticuerpos monoclonales, inicialmente se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad contra Fel d1 que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. La tecnología VELOCIMMUNE® implica la generación de un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende regiones variables de cadena pesada y ligera humana unidas operativamente a loci de región constante de ratón endógeno de modo que el ratón produce un anticuerpo que comprende una región variable humana y una región constante de ratón en respuesta a la estimulación antigénica. El ADN que codifica las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo se aísla y se une operativamente al ADN que codifica las regiones constantes humanas de cadena pesada y ligera. El ADN luego se expresa en una célula capaz de expresar el anticuerpo completamente humano.
En general, un ratón VELOCIMMUNE® se expone con el antígeno de interés, y las células linfáticas (tales como los linfocitos B) se recuperan de los ratones que expresan anticuerpos. Las células linfáticas pueden fusionarse con una línea celular de mieloma para preparar líneas celulares de hibridoma inmortales, y dichas líneas celulares de hibridoma se criban y seleccionan para identificar líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos específicos para el antígeno de interés. El ADN que codifica las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera puede aislarse y unirse a regiones isotípicas constantes deseables de la cadena pesada y la cadena ligera. Dicha proteína de anticuerpo puede producirse en una célula, tal como una célula CHO. Como alternativa, el ADN que codifica los anticuerpos quiméricos específicos de antígeno o los dominios variables de las cadenas ligeras y pesadas se puede aislar directamente de los linfocitos específicos de antígeno.
Inicialmente, se aíslan anticuerpos quiméricos de alta afinidad que tienen una región variable humana y una región constante de ratón. Como en la siguiente sección experimental, los anticuerpos se caracterizan y seleccionan para las características deseables, entre las que se incluyen la afinidad, selectividad, epítopo, etc. Las regiones constantes de ratón se remplazan con una región constante humana deseada para generar el anticuerpo completamente humano de la invención, por ejemplo, IgG1 o IgG4 de tipo silvestre o modificada. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.
En general, los anticuerpos de la presente invención poseen afinidades muy altas, poseyendo normalmente una Kd de aproximadamente 10-12 M a aproximadamente 10-9 M, cuando se miden mediante unión a antígeno inmovilizado sobre fase sólida o en fase en solución. Las regiones constantes de ratón se remplazan con regiones constantes humanas deseadas para generar los anticuerpos completamente humanos de la invención. Aunque la región constante seleccionada puede variar de acuerdo con el uso específico, las características de unión a antígeno de alta afinidad y especificidad de diana residen en la región variable.
Bioequivalentes
Los anticuerpos anti-Fel d1 y fragmentos de anticuerpo de la presente divulgación abarcan proteínas que tienen secuencias de aminoácidos que varían respecto a las de los anticuerpos descritos, pero que conservan la capacidad de unión a Fel d1. Dichos anticuerpos variantes y fragmentos de anticuerpo comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de aminoácidos cuando se comparan con la secuencia precursora, pero muestran actividad biológica que es esencialmente equivalente a la de los anticuerpos descritos. De manera análoga, las secuencias de ADN que codifican el anticuerpo de la presente divulgación abarcan secuencias que comprenden una o más adiciones, eliminaciones o sustituciones de nucleótidos en comparación con la secuencia divulgada, pero que codifican un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que es esencialmente bioequivalente a un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la divulgación.
Dos proteínas de unión a antígeno, o anticuerpos, se consideran bioequivalentes si, por ejemplo, son equivalentes farmacéuticos o alternativas farmacéuticas cuya tasa y grado de absorción no muestran una diferencia significativa cuando se administran a la misma dosis molar en condiciones experimentales similares, en una sola dosis o en múltiples dosis. Algunos anticuerpos se considerarán equivalentes o alternativas farmacéuticas si son equivalentes en el grado de su absorción pero no en su tasa de absorción y aún pueden considerarse bioequivalentes porque dichas diferencias en la tasa de absorción son intencionadas y se reflejan en el marcaje, no son esenciales para obtener las concentraciones eficaces del fármaco en el organismo en, por ejemplo, el uso crónico, y se consideran médicamente insignificantes para el producto farmacológico particular estudiado.
Dos proteínas de unión a antígeno pueden ser bioequivalentes si no hay diferencias clínicamente importantes en su seguridad, pureza y potencia.
Dos proteínas de unión a antígeno pueden ser bioequivalentes si un paciente puede cambiarse una o más veces entre el producto de referencia y el producto biológico sin un aumento esperado en el riesgo de efectos adversos, incluyendo un cambio clínicamente significativo en la inmunogenicidad, o eficacia disminuida, en comparación con la terapia continuada sin dicho cambio.
Dos proteínas de unión a antígeno pueden ser bioequivalentes si ambas actúan por un mecanismo o mecanismos comunes de acción para la afección o afecciones de uso, en la medida en que dichos mecanismos sean conocidos.
La bioequivalencia puede demostrarse por métodos in vivo y/o in vitro. Las medidas de bioequivalencia incluyen, por ejemplo, (a) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos, en los que se mide la concentración del anticuerpo o sus metabolitos en sangre, plasma, suero u otro líquido biológico como una función del tiempo; (b) un ensayo in vitro que se ha correlacionado con y es razonablemente predictivo de datos de biodisponibilidad in vivo en seres humanos; (c) un ensayo in vivo en seres humanos u otros mamíferos en el que se mide el efecto farmacológico agudo apropiado del anticuerpo (o su diana) como una función del tiempo; y (d) en un ensayo clínico bien controlado que establece la seguridad, eficacia o biodisponibilidad o bioequivalencia de un anticuerpo.
Las variantes bioequivalentes de los anticuerpos de la invención pueden construirse, por ejemplo, generando diversas sustituciones de restos o secuencias o eliminando restos terminales o internos o secuencias no necesarias para la actividad biológica. Por ejemplo, pueden eliminarse restos de cisteína no esenciales para la actividad biológica, o remplazarse con otros aminoácidos, para evitar la formación de puentes disulfuro intramoleculares innecesarios o incorrectos tras la renaturalización. En otros contextos, los anticuerpos bioequivalentes pueden incluir variantes de anticuerpos que comprenden cambios de aminoácidos, que modifican las características de glucosilación de los anticuerpos, por ejemplo, mutaciones que eliminan o suprimen la glucosilación.
Características biológicas de los anticuerpos
En general, los anticuerpos de la presente divulgación pueden funcionar mediante la unión a la cadena 1 o a la cadena 2 de Fel d1, o tanto a la cadena 1 como a la cadena 2 de Fel d1 o a un fragmento de la cadena 1 o la cadena 2.
En determinados aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden unirse a un epítopo ubicado en al menos la región C-terminal de la cadena 1 o la cadena 2 de Fel d1. En un aspecto, los anticuerpos pueden unirse a un epítopo dentro de la región N-terminal de la cadena 1 o la cadena 2 de Fel d1.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la presente invención pueden funcionar bloqueando o inhibiendo la unión de IgE a mastocitos o basófilos en un paciente sensible al alérgeno Fel d1.
En determinados aspectos, los anticuerpos de la presente divulgación pueden funcionar uniéndose a cualquier otra región o fragmento de la cadena 1 o cadena 2 de longitud completa de la proteína Fel d1 natural, cuya secuencia de aminoácidos se muestra en la SEQ ID NO: 392 (cadena 1) y la SEQ ID n O: 393 (cadena 2).
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a un epítopo en la cadena 1 y también pueden unirse a un epítopo en la cadena 2. Los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes en la cadena 1. Los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos epítopos diferentes en la cadena 2. Los anticuerpos biespecíficos pueden unirse a dos sitios diferentes dentro de la misma hélice en cualquiera de la cadena 1 o la cadena 2 , o pueden unirse a la misma hélice tanto en la cadena 1 como en la cadena 2. La estructura de Fel d1 se describe con mayor detalle en Kaiser et. al. (Kaiser, L. et. al. (2003), J. Biol. Chem. 278 (39):37730-37735), por lo que los autores señalan que Fel d1 consta de ocho hélices, H1-H4 y H5-H8, que corresponden a las cadenas 2 y 1, respectivamente, en Fel d1 natural.
En un aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo monoclonal completamente humano o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a la cadena 1 y/o la cadena 2 de Fel d1, en donde el anticuerpo o fragmento del mismo exhibe una o más de las siguientes características: (i) comprende una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354 y 370, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362 y 378, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las Se Q ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360 y 376, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368 y 384, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356 y 372, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358 y 374, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364 y 380, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366 y 382, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (v) se une a la cadena 1 y/o la cadena 2 de Fel d1 con una Kd igual o inferior a 10'9; (vi) no reacciona de forma cruzada, ni se une a, la uteroglobina; o (vii) bloquea la extravasación de colorante in vivo en un modelo de ratón de anafilaxia cutánea pasiva (PCA, por sus siglas en inglés) usando IgE de ratón específica de Fel d1.
En un aspecto, la divulgación proporciona el uso de una combinación de dos o más anticuerpos completamente humanos, o fragmentos de los mismos, para la preparación de una composición, en donde los anticuerpos se unen a la cadena 1 y/o la cadena 2 de Fel d1, y en donde cada uno el anticuerpo o fragmento del mismo contenido dentro de la composición exhibe una o más de las siguientes características: (i) comprenden una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 2, 18, 34, 50, 66, 82, 98, 114, 130, 146, 162, 178, 194, 210, 226, 242, 258, 274, 290, 306, 322, 338, 354 y 370, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (ii) comprende una LCVR que tiene una secuencia de aminoácido seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 10, 26, 42, 58, 74, 90, 106, 122, 138, 154, 170, 186, 202, 218, 234, 250, 266, 282, 298, 314, 330, 346, 362 y 378, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iii) comprende un dominio HCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 8, 24, 40, 56, 72, 88, 104, 120, 136, 152, 168, 184, 200, 216, 232, 248, 264, 280, 296, 312, 328, 344, 360 y 376, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR3 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 16, 32, 48, 64, 80, 96, 112, 128, 144, 160, 176, 192, 208, 224, 240, 256, 272, 288, 304, 320, 336, 352, 368 y 384, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (iv) comprende un dominio HCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 4, 20, 36, 52, 68, 84, 100, 116, 132, 148, 164, 180, 196, 212, 228, 244, 260, 276, 292, 308, 324, 340, 356 y 372, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio HCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 6, 22, 38, 54, 70, 86, 102, 118, 134, 150, 166, 182, 198, 214, 230, 246, 262, 278, 294, 310, 326, 342, 358 y 374, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; un dominio LCDR1 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 12, 28, 44, 60, 76, 92, 108, 124, 140, 156, 172, 188, 204, 220, 236, 252, 268, 284, 300, 316, 332, 348, 364 y 380, o una secuencia sustancialmente similar a la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; y un dominio LCDR2 que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 14, 30, 46, 62, 78, 94, 110, 126, 142, 158, 174, 190, 206, 222, 238, 254, 270, 286, 302, 318, 334, 350, 366 y 382, o una secuencia sustancialmente similar de la misma que tiene al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % de identidad de secuencia; (v) se une a la cadena 1 y/o la cadena 2 de Fel d1 con una Kd igual o inferior a 10-9; (vi) no reacciona de forma cruzada, ni se une a, la uteroglobina; (vii) bloquea la extravasación de colorante in vivo en un modelo de ratón de anafilaxia cutánea pasiva (PCA, por sus siglas en inglés) usando IgE de ratón específica de Fel d1; o (viii) cuando se combina con un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención, disminuye la frecuencia de células secretoras de mucosa en los pulmones de animales expuestos a Fel d1.
Los anticuerpos Fel d1 de la presente invención, cuando se usan solos o en combinación, son capaces de unirse y neutralizar al menos un efecto biológico de Fel d1, según se determina mediante ensayos in vitro o in vivo. La capacidad de los anticuerpos de la invención para unirse y neutralizar la actividad de Fel d1 se puede medir utilizando cualquier método estándar conocido por los expertos en la técnica, incluyendo los ensayos de unión o ensayos de neutralización de la actividad (por ejemplo, protección contra la anafilaxia), tal como se describe en el presente documento.
Ensayos in vitro ejemplares no limitantes para medir la actividad de unión se ilustran en el Ejemplo 4, en el presente documento. En el Ejemplo 4, las afinidades de unión y las constantes cinéticas de los anticuerpos humanos anti-Fel d1 se determinaron mediante resonancia de plasmón superficial y las mediciones se realizaron en un instrumento T200 Biacore.
Las proteínas o péptidos Fel d1 pueden modificarse para incluir la adición o sustitución de determinados restos para el marcado o para fines de conjugación con moléculas transportadoras, tales como, KLH. Por ejemplo, se puede añadir una cisteína en el extremo N terminal o C terminal de un péptido, o se puede añadir una secuencia enlazadora para preparar el péptido para la conjugación a, por ejemplo, KLH para la inmunización. Los anticuerpos específicos para Fel d1 pueden no contener marcadores o fracciones adicionales, o pueden contener un marcador o fracción N-terminal o C-terminal. En una realización, el marcador o fracción es biotina. En un ensayo de unión, la ubicación de un marcador (si lo hay) puede determinar la orientación del péptido con respecto a la superficie sobre la cual se une el péptido. Por ejemplo, si una superficie está recubierta con avidina, un péptido que contiene una biotina N-terminal estará orientado de tal manera que la porción C-terminal del péptido estará distal a la superficie.
Mapeo de epítopos y tecnologías relacionadas
El término "epítopo", como se usa en el presente documento, se refiere a un determinante antigénico que interactúa con un sitio de unión a antígeno específico en la región variable de una molécula de anticuerpo conocida como parátopo. Un único antígeno puede tener más de un epítopo. Por lo tanto, diferentes anticuerpos pueden unirse a diferentes áreas en un antígeno o puede tener diferentes efectos biológicos. Los epítopos pueden ser conformacionales o lineales. Un epítopo conformacional se produce por yuxtaposición espacial de aminoácidos de diferentes segmentos de la cadena de polipéptido lineal. Un epítopo lineal es uno producido por restos de aminoácidos adyacentes en una cadena polipeptídica. En determinadas circunstancias, un epítopo puede incluir restos de sacáridos, grupos fosforilo o grupos sulfonilo en el antígeno.
La presente divulgación incluye anticuerpos anti-Fel d1 que interactúan con uno o más aminoácidos encontrados dentro de una o más regiones de la cadena 1 o la cadena 2 de la molécula Fel d1 que incluye, por ejemplo, la cadena 1 (cadena A) como se muestra en la SEQ ID NO: 392, o la cadena 2 (cadena B) como se muestra en la SEQ ID NO: 393, o dentro de regiones comparables de una proteína Fel d1 producida de forma recombinante, como se muestra en una cualquiera de las SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 o 397. El epítopo al que se unen los anticuerpos puede consistir en una sola secuencia contigua de 3 o más (por ejemplo, 3, 4, 5, 6 , 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más) aminoácidos ubicados dentro de cualquiera de las regiones o segmentos antes mencionados de la molécula Fel d1 (por ejemplo, un epítopo lineal en la cadena 1 o la cadena 2, o en una región que abarca tanto la cadena 1 como la cadena 2). Como alternativa, el epítopo puede consistir en una pluralidad de aminoácidos no contiguos (o secuencias de aminoácidos) ubicados dentro de una o ambas de las regiones o segmentos de la molécula Fel d1 mencionados anteriormente (por ejemplo, un epítopo conformacional).
Pueden usarse diversas técnicas conocidas para los expertos en la materia para determinar si un anticuerpo "interacciona con uno o más aminoácidos" dentro de un polipéptido o proteína. Las técnicas ejemplares incluyen, por ejemplo, ensayos rutinarios de bloqueo cruzado, tal como el descrito en Antibodies, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY). Otros métodos incluyen análisis mutacional de barrido de alanina, análisis de transferencia de péptidos (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63), estudio cristalográfico de análisis de escisión de péptidos y análisis de RMN. Adicionalmente, pueden emplearse métodos tales como escisión de epítopos, extracción de epítopos y modificación química de antígenos (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). Otro método que puede usarse para identificar los aminoácidos dentro de un polipéptido con el que interacciona un anticuerpo es el intercambio de hidrógeno/deuterio detectado por espectrometría de masas. En términos generales, el método de intercambio hidrógeno/deuterio implica el marcaje con deuterio de la proteína de interés, seguido de la unión del anticuerpo a la proteína marcada con deuterio. A continuación, el complejo proteína/anticuerpo se transfiere al agua y los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que están protegidos por el complejo de anticuerpos experimentan un retroceso de deuterio a hidrógeno a una velocidad menor que los protones intercambiables dentro de los aminoácidos que no forman parte de la interfaz. Como resultado, los aminoácidos que forman parte de la interfaz proteína/anticuerpo pueden retener el deuterio y, por lo tanto, exhiben una masa relativamente mayor en comparación con los aminoácidos no incluidos en la interfaz. Después de la disociación del anticuerpo, la proteína diana se somete a escisión por proteasa y análisis de espectrometría de masas, revelando de esta manera los restos marcados con deuterio que corresponden a los aminoácidos específicos con los que interacciona el anticuerpo. Véase, por ejemplo, Ehring (1999) Analytical Biochemistry 267(2):252-259; Engen y Smith (2001) Anal. Chem. 73:256A-265A. La cristalografía de rayos X del complejo antígeno/anticuerpo también puede usarse para fines de mapeo de epítopos.
El perfilado asistido por modificación (MAP), también conocido como perfilado de anticuerpos basado en la estructura del antígeno (ASAP) es un método que categoriza grandes números de anticuerpos monoclonales (AcM) dirigidos contra el mismo antígeno de acuerdo con las similitudes del perfil de unión de cada anticuerpo a superficies de antígenos modificadas química o enzimáticamente (US 2004/0101920). Cada categoría puede reflejar un epítopo único diferente o parcialmente superpuesto con el epítopo representado por otra categoría. Esta tecnología permite el filtrado rápido de anticuerpos genéticamente idénticos, de modo que la caracterización se puede centrar en anticuerpos genéticamente distintos. Cuando se aplica al cribado de hibridomas, MAP puede facilitar la identificación de clones de hibridomas raros que producen AcM que tienen las características deseadas. MAP se puede usar para clasificar los anticuerpos de la invención en grupos de anticuerpos que se unen a diferentes epítopos.
En determinados aspectos, los anticuerpos anti-Fel d1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos se unen a un epítopo dentro de una cualquiera o más de las regiones ejemplificadas en la cadena 1 o la cadena 2 de Fel d1, ya sea en forma natural, como se ejemplifica en la SEQ ID NO: 392 (cadena 1) y la SEQ ID NO: 393 (cadena 2), o producido de forma recombinante, como se ejemplifica en cualquiera de las SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 y 397, o en un fragmento de las mismas. En determinados aspectos, los anticuerpos de la divulgación, tal como se muestran en la Tabla 1, interactúan con al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en restos de aminoácidos que varían de aproximadamente la posición 15 a aproximadamente la posición 24 de la SEQ ID NO: 396; restos de aminoácidos que varían de aproximadamente la posición 85 a aproximadamente la posición 103 de la SEQ ID NO: 396; restos de aminoácidos que varían de aproximadamente la posición 85 a aproximadamente la posición 104 de la SEQ ID NO: 396; restos de aminoácidos que varían de aproximadamente la posición 113 a aproximadamente la posición 116 de la SEQ ID NO: 396. Estas regiones se ejemplifican adicionalmente en las SEQ ID NO: 402, 403, 404, 412 y 426.
La presente descripción también incluye anticuerpos anti-Fel d1 que se unen al mismo epítopo, o una porción del epítopo, cualquiera de los anticuerpos ejemplares específicos descritos en el presente documento en la Tabla 1, o un anticuerpo que tiene las secuencias c Dr de cualquiera de los anticuerpos ejemplares descritos en la Tabla 1. De manera análoga, la presente divulgación también incluye anticuerpos anti-Fel d1 que compiten por la unión de Fel d1 o un fragmento de Fel d1 con cualquiera de los anticuerpos ejemplares específicos descritos en el presente documento en la Tabla 1, o un anticuerpo que tiene las secuencias CDR de cualquiera de los anticuerpos ejemplares descritos en la Tabla 1.
Se puede determinar fácilmente si un anticuerpo se une al mismo epítopo que, o compite por la unión con, un anticuerpo anti-Fel d1 de referencia usando métodos rutinarios conocidos en la técnica. Por ejemplo, para determinar si un anticuerpo de ensayo se une al mismo epítopo que un anticuerpo anti-Fel d1 de referencia de la invención, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una proteína o péptido Fel d1 en condiciones de saturación. A continuación, se evalúa la capacidad de un anticuerpo de ensayo de unirse a la molécula Fel d1. Si el anticuerpo de ensayo puede unirse a Fel d1 después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-Fel d1 de referencia, puede concluirse que el anticuerpo de ensayo se une a un epítopo diferente del anticuerpo anti-Fel d1 de referencia. Por otro lado, si el anticuerpo de ensayo no puede unirse a la molécula Fel d1 después de la unión por saturación con el anticuerpo anti-Fel d1 de referencia, entonces el anticuerpo de ensayo puede unirse al mismo epítopo al que se une el anticuerpo anti-Fel d1 de referencia de la invención.
Para determinar si un anticuerpo compite por la unión con un anticuerpo anti-Fel d1 de referencia, se realiza la metodología de unión descrita anteriormente en dos orientaciones: En una primera orientación, se permite que el anticuerpo de referencia se una a una molécula Fel d1 en condiciones de saturación seguido por la evaluación de la unión del anticuerpo de ensayo a la molécula Fel d1. En una segunda orientación, se permite que el anticuerpo de ensayo se una a una molécula Fel d1 en condiciones de saturación seguido por la evaluación de la unión del anticuerpo de referencia a la molécula Fel d1. Si, en ambas orientaciones, únicamente el primer anticuerpo (de saturación) puede unirse a la molécula Fel d1, entonces se concluye que el anticuerpo de ensayo y el anticuerpo de referencia compiten por la unión a Fel d1. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo de referencia puede que no se una necesariamente al epítopo idéntico al anticuerpo de referencia, sino que puede bloquear estéricamente la unión del anticuerpo de referencia mediante la unión a un epítopo solapante o adyacente.
Dos anticuerpos se unen al mismo epítopo o epítopos solapantes si cada uno inhibe (bloquea) competitivamente la unión del otro al antígeno. Esto es, un exceso en un factor de 1, 5, 10, 20 o 100 de un anticuerpo inhibe la unión del otro en al menos un 50 %, pero preferentemente en un 75 %, 90 % o incluso un 99 %, medida en un ensayo de unión competitiva (véase, por ejemplo, Junghans et al., Cancer Res. 199050:1495-1502). Como alternativa, dos anticuerpos tienen el mismo epítopo si esencialmente todas las mutaciones de aminoácido en el antígeno que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro. Dos anticuerpos tienen epítopos solapantes si algunas mutaciones de aminoácido que reducen o eliminan la unión de un anticuerpo reducen o eliminan la unión del otro.
Entonces puede realizarse experimentación rutinaria adicional (por ejemplo, mutación de péptidos y análisis de unión) para confirmar si la ausencia observada de unión del anticuerpo de ensayo se debe, de hecho, a la unión al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia o si el bloqueo estérico (u otro fenómeno) es responsable de la ausencia de la unión observada. Los experimentos de este tipo pueden realizarse usando ELISA, RIA, resonancia del plasmón superficial, citometría de flujo o cualquier otro ensayo cuantitativo o cualitativo de unión de anticuerpos disponible en la técnica.
Inmunoconjugados
La invención abarca un anticuerpo monoclonal humano anti-Fel d1 conjugado con una fracción terapéutica ("inmunoconjugado"), tal como un agente que es capaz de reducir la gravedad de una respuesta alérgica al alérgeno Fel d1 presente en la caspa de gatos o en gatos, o en un área del entorno donde pueden residir los gatos, o para mejorar al menos un síntoma asociado con la exposición a gatos, caspa de gatos o al alérgeno Fel d1, que incluye rinitis, conjuntivitis o dificultades respiratorias, o la gravedad de los mismos. Dicho agente puede ser un corticoesteroide, un segundo anticuerpo diferente contra Fel d1 o una vacuna. El tipo de fracción terapéutica que puede conjugarse con el anticuerpo Fel d1 tendrá en cuenta la afección a tratar y el efecto terapéutico deseado que se logrará. Como alternativa, si el efecto terapéutico deseado es tratar las secuelas o síntomas asociados con la exposición al alérgeno Fel d1, o cualquier otra afección resultante de dicha exposición, tal como, pero sin limitación, rinitis o conjuntivitis, puede ser ventajoso conjugar un agente apropiado para tratar las secuelas o síntomas de la afección, o para aliviar cualquier efecto secundario de los anticuerpos de la invención. En la técnica se conocen ejemplos de agentes adecuados para formar inmunoconjugados, véase, por ejemplo, el documento WO 05/103081.
Anticuerpos multiespecíficos
Los anticuerpos de la presente invención pueden ser monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos. Los anticuerpos multiespecíficos pueden ser específicos para diferentes epítopos de un polipéptido diana o pueden contener dominios de unión a antígeno específicos para más de un polipéptido diana. Véase, por ejemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147:60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22:238-244. Los anticuerpos de la presente invención pueden unirse a o expresarse conjuntamente con otra molécula funcional, por ejemplo, otro péptido o proteína. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo puede unirse de forma funcional (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo para producir un anticuerpo biespecífico o multiespecífico con una segunda especificidad de unión. Por ejemplo, la presente divulgación incluye anticuerpos biespecíficos en donde un brazo de una inmunoglobulina puede ser específico para la cadena 1 de Fel d i o un fragmento de la misma, y el otro brazo de la inmunoglobulina puede ser específico para la cadena 2 de Fel d i o una segunda diana terapéutica o puede estar conjugado con una fracción terapéutica.
Determinados aspectos ejemplares de la presente divulgación incluyen una molécula biespecífica de unión a antígeno, que es un anticuerpo biespecífico. Cada dominio de unión a antígeno de un anticuerpo biespecífico comprende un dominio variable de cadena pesada (HCVR) y un dominio variable de cadena ligera (LCVR). E1HCVR también puede denominarse región Vh, y el LCVR también puede denominarse región Vl. Normalmente, cada HCVR y LCVR comprende tres CDR intercaladas con cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las tres CDR dentro de una HCVR pueden denominarse en el presente documento HCDR1, HCDR2 y HCDR3; mientras que las tres CDR dentro de una LCVR pueden denominarse en el presente documento LCDR1, LCDR2 y LCDR3.
En las moléculas biespecíficas de unión a antígeno, cada dominio de unión a antígeno puede comprender o consistir en una molécula de anticuerpo completa o un fragmento de unión a antígeno de un anticuerpo. Las expresiones "parte de unión a antígeno" de un anticuerpo, "fragmento de unión a antígeno" de un anticuerpo y similares, como se usa en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido o glucoproteína de origen natural, obtenible enzimáticamente, sintético o modificado por ingeniería genética que se une específicamente a un antígeno para formar un complejo. Los fragmentos de unión al antígeno de un anticuerpo pueden obtenerse, por ejemplo, de moléculas de anticuerpo completas, usando cualquier técnica convencional adecuada tal como digestión proteolítica o técnicas de ingeniería genética recombinante que implican la manipulación y expresión de ADN que codifica dominios variables, y opcionalmente constantes, de anticuerpo. Dicho ADN se conoce y/o se puede adquirir fácilmente de, por ejemplo, fuentes comerciales, bibliotecas de ADN (incluyendo, por ejemplo, fagotecas de anticuerpos), o puede sintetizarse. El ADN puede secuenciarse y manipularse químicamente o usando técnicas de biología molecular, por ejemplo, para disponer uno o más dominios variables y/o constantes en una configuración adecuada, o para introducir codones, crear restos de cisteína, modificar, añadir o suprimir aminoácidos, etc.
Ejemplo no limitantes de fragmentos de unión a antígeno que pueden incluirse en las moléculas biespecíficas de unión a antígeno incluyen: (i) fragmentos Fab; (ii) fragmentos F(ab')2; (iii) fragmentos Fd; (iv) fragmentos Fv; (v) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv); (vi) fragmentos dAb; y (vii) unidades de reconocimiento mínimas que consisten en los restos de aminoácidos que imitan la región hipervariable de un anticuerpo. Otras moléculas modificadas por ingeniería genética, tales como anticuerpos específicos de dominio, anticuerpos de un solo dominio, anticuerpos de dominio suprimido, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, minicuerpos, nanocuerpos (por ejemplo, nanocuerpos monovalentes, nanocuerpos bivalentes, etc.), agentes inmunofarmacéuticos modulares pequeños (SMIP) y dominios IgNAR variables de tiburón, también se abarcan dentro de la expresión "fragmento de unión al antígeno", como se usa en el presente documento.
Un fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo normalmente comprenderá al menos un dominio variable. El dominio variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácidos y generalmente comprenderá al menos una CDR, que está adyacente o en marco con una o más secuencias marco. En fragmentos de unión al antígeno que tienen un dominio Vh asociado con un dominio Vl, los dominios Vh y Vl pueden situarse uno con respecto al otro en cualquier disposición adecuada. Por ejemplo, la región variable puede ser dimérica y contener los dímeros Vh-Vh, Vh-Vl o Vl-Vl. Como alternativa, el fragmento de unión al antígeno de un anticuerpo puede contener un dominio Vh o Vl monomérico.
Un fragmento de unión al antígeno de una molécula biespecífica de unión a antígeno puede contener al menos un dominio variable unido covalentemente con al menos un dominio constante. Las configuraciones ejemplares no limitantes de dominios variables y constantes que pueden encontrarse dentro de un dominio de unión a antígeno de una molécula biespecífica de unión a antígeno pueden incluir: (i) Vh-Ch1; (ii) Vh-Ch2; (iii) Vh-Ch3; (iv) Vh-Ch1-Ch2; (v) Vh-Ch1-Ch2-Ch3; (vi) Vh-Ch2-Ch3; (vii) Vh-Cl; (viii) Vl-Ch1; (ix) Vl-Ch2; (x) Vl-Ch3; (xi) Vl-Ch1-Ch2; (xii) Vl-Ch1-Ch2-Ch3; (xiii) Vl-Ch2-Ch3; y (xiv) Vl-Cl. En cualquier configuración de dominios variables y constantes, incluyendo cualquiera de las configuraciones ilustrativas enumeradas anteriormente, los dominios variables y constantes pueden estar unidos directamente entre sí o pueden estar unidos mediante una región bisagra o conectora completa o parcial. Una región bisagra puede consistir en al menos 2 (por ejemplo, 5, 10, 15, 20, 40, 60 o más) aminoácidos, lo que da como resultado un enlace flexible o semiflexible entre dominios variables y/o constantes adyacentes en una sola molécula polipeptídica. Además, un dominio de unión a antígeno de una molécula biespecífica de unión a antígeno puede comprender un homodímero o heterodímero (u otro multímero) de cualquiera de las configuraciones de dominio variable y constante enumeradas anteriormente en asociación no covalente entre sí y/o con uno o más dominios Vh o Vl monoméricos (por ejemplo, mediante uno o más enlaces disulfuro).
El primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar conectados directa o indirectamente entre sí para formar una molécula biespecífica de unión a antígeno. Como alternativa, el primer dominio de unión a antígeno y el segundo dominio de unión a antígeno pueden estar conectados cada uno a un dominio multimerizante separado. La asociación de un dominio multimerizante con otro dominio multimerizante facilita la asociación entre los dos dominios de unión a antígeno, formando así una molécula biespecífica de unión a antígeno. Como se emplea en el presente documento, un "dominio multimerizante" es cualquier macromolécula, proteína, polipéptido, péptido o aminoácido que tiene la capacidad de asociarse con un segundo dominio multimerizante de estructura o constitución igual o similar. Por ejemplo, un dominio multimerizante puede ser un polipéptido que comprende un dominio Ch3 de inmunoglobulina. Un ejemplo no limitante de un componente multimerizante es una porción Fc de una inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio Fc de una IgG seleccionada de los isotipos lgG1, lgG2, lgG3 e lgG4, así como cualquier alotipo dentro de cada grupo de isotipos. El dominio multimerizante puede ser un fragmento Fc o una secuencia de aminoácidos de 1 a aproximadamente 200 aminoácidos de longitud que contiene al menos un resto de cisteína. El dominio multimerizante puede ser un resto de cisteína o un péptido corto que contiene cisteína. Otros dominios multimerizantes incluyen péptidos o polipéptidos que comprenden o consisten en una cremallera de leucina, un motivo de hélice-bucle o un motivo de superhélice.
Se puede usar cualquier formato o tecnología de anticuerpos biespecíficos para fabricar las moléculas biespecíficas de unión a antígeno. Por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una primera especificidad de unión a antígeno se puede unir de forma funcional (por ejemplo, por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más entidades moleculares diferentes, tal como otro anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene una segunda especificidad de unión a antígeno para producir una molécula biespecífica de unión a antígeno.
Un formato de anticuerpo biespecífico ejemplar que puede usarse en el contexto de la presente invención implica el uso de un primer dominio Ch3 de inmunoglobulina (Ig) y un segundo dominio Ch3 de Ig, en donde el primer y el segundo dominio Ch3 de Ig difieren entre sí en al menos un aminoácido, y en donde al menos una diferencia de aminoácido reduce la unión del anticuerpo biespecífico a proteína A en comparación con un anticuerpo biespecífico que carece de la diferencia de aminoácido. El primer dominio Ch3 de Ig puede unirse a proteína A y el segundo dominio Ch3 de Ig contiene una mutación que reduce o anula la unión a proteína A tal como una modificación H95R (por numeración de exones IMGT; H435R por numeración EU). El segundo Ch3 puede comprender además una modificación Y96F (por IMGT; Y436F por EU). Otras modificaciones adicionales que pueden encontrarse dentro del segundo Ch3 incluyen: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M y V82I (por IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG1; N44S, K52N y V82I (IMGT; N384S, K392N y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG2; y Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q y V82I (por IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q y V422I por EU) en el caso de anticuerpos IgG4. Se contemplan variaciones en el formato de anticuerpo biespecífico descrito anteriormente.
Otros formatos biespecíficos ejemplares que pueden usarse en el contexto de la presente invención incluyen, pero sin limitación, por ejemplo, formatos biespecíficos basados en scFv o de diacuerpo, fusiones IgG-scFv, dominio variable doble (DVD)-lg, cuadroma, botón en ojal, cadena ligera habitual (por ejemplo, cadena ligera habitual con botón en ojal, etc.), CrossMab, CrossFab, (SEED)cuerpo, cremallera de leucina, duocuerpo, lgG1/lgG2, Fab de acción doble (dA f , dual acting Fab)-IgG y formatos biespecíficos de Mab2 (véase, por ejemplo, Klein et al. 2012, mAbs4:6,1-11, y referencias citadas en el presente documento, para una revisión de los formatos anteriores). También se pueden construir anticuerpos biespecíficos usando conjugación de péptido/ácido nucleico, por ejemplo, en donde se usan aminoácidos no naturales con reactividad química ortogonal para generar conjugados de anticuerpo-oligonucleótido específicos de sitio que después se autoensamblan en complejos multiméricos con composición, valencia y geometría definidas. Véase, por ejemplo, Kazane et al., J. Am. Chem. Soc. [Epub: 4 de diciembre de 2012]).
Adm inistración terapéutica y formulaciones
La invención proporciona composiciones terapéuticas que comprenden los anticuerpos anti-Fel d1 o fragmentos de unión a antígeno de los mismos de la presente invención. La administración de composiciones terapéuticas de acuerdo con la invención se administrará a través de una ruta adecuada que incluye, pero sin limitación, por vía intravenosa, por vía subcutánea, por vía intramuscular, por vía intranasal, con vehículos, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan a las formulaciones para proporcionar una transferencia, administración, tolerancia y similares mejoradas. Puede encontrarse una multitud de formulaciones apropiadas en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Company, Easton, PA. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, pomadas, gelatinas, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípidos (catiónicos o aniónicos) (tales como LIPOFECTIN™), conjugados de ADN, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua en aceite, emulsiones de Carbowax (polietilenglicoles de diversos pesos moleculares), geles semisólidos y mezclas semisólidas que contienen Carbowax. Véase también Powell et al., "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA (1998) J Pharm Sci Technol 52:238-311.
La dosis de anticuerpo puede variar dependiendo de la edad y el tamaño de un sujeto a recibir la administración, enfermedad diana, afecciones, la vía de administración y similares. Cuando el anticuerpo de la presente invención se usa para tratar la rinitis o la conjuntivitis asociada con la exposición a un gato, o a la caspa de gato en un individuo que tiene sensibilidad a Fel d1, o para prevenir una respuesta anafiláctica al alérgeno del gato, o para disminuir la gravedad de la respuesta alérgica, es ventajoso administrar por vía intravenosa el anticuerpo de la presente invención normalmente a una dosis única de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 30 mg/kg de peso corporal, más preferentemente de aproximadamente 0,02 a aproximadamente 7, de aproximadamente 0,03 a aproximadamente 5 o de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal. Dependiendo de la gravedad de la afección, pueden ajustarse la frecuencia y la duración del tratamiento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo de la invención puede administrarse como una dosis inicial de al menos aproximadamente 0,1 mg a aproximadamente 800 mg, aproximadamente 1 a aproximadamente 500 mg, aproximadamente 5 a aproximadamente 300 mg, o aproximadamente 10 a aproximadamente 200 mg, hasta aproximadamente 100 mg, o hasta aproximadamente 50 mg. En determinadas realizaciones, la dosis inicial puede ir seguida de la administración de una segunda o una pluralidad de dosis posteriores del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo en una cantidad que puede ser aproximadamente la misma o menor que la de la dosis inicial, en la que las dosis posteriores están separadas por al menos 1 día a 3 días; al menos una semana, al menos 2 semanas; al menos 3 semanas; al menos 4 semanas; al menos 5 semanas; al menos 6 semanas; al menos 7 semanas; al menos 8 semanas; al menos 9 semanas; al menos 10 semanas; al menos 12 semanas; o al menos 14 semanas.
Se conocen diversos sistemas de administración y pueden usarse para administrar la composición farmacéutica de la invención, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar los virus mutantes, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu et al. (1987) J. Biol. Chem.
262:4429-4432). Los métodos de introducción incluyen, pero sin limitación, ruta intradérmica, transdérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, epidural y oral. La composición puede administrarse por cualquier vía conveniente, por ejemplo, por infusión o inyección en bolo, por absorción a través de revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y pueden administrarse junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.
La composición farmacéutica también puede administrarse en una vesícula, en particular, un liposoma (véase, por ejemplo, Langer (1990) Science 249:1527-1533).
En determinadas situaciones, la composición farmacéutica puede suministrarse en un sistema de liberación controlada. En una realización, se puede usar una bomba. En otra realización, se puede usar materiales poliméricos. En otra realización más, un sistema de liberación controlada puede ubicarse en las proximidades de la diana de la composición, siendo necesaria, por tanto, solo una fracción de la dosis sistémica.
Las preparaciones inyectables pueden incluir formas farmacéuticas para la vía intravenosa, subcutánea, inyecciones intracutáneas e intramusculares, infusiones por goteo, etc. Estas preparaciones inyectables pueden prepararse por métodos conocidos para el público. Por ejemplo, las preparaciones inyectables pueden prepararse, por ejemplo, disolviendo, suspendiendo o emulsionando el anticuerpo o su sal descrita anteriormente en un medio acuoso estéril o un medio oleoso usado convencionalmente para inyecciones. Como medio acuoso para inyecciones, existen, por ejemplo, solución salina fisiológica, una solución isotónica que contiene glucosa y otros coadyuvantes, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol, polietilenglicol), un tensioactivo no iónico [por ejemplo, polisorbato 80, HCO-50 (aducto de polioxietileno (50 mol) de aceite de ricino hidrogenado)], etc. Como el medio oleoso, se emplean, por ejemplo, aceite de sésamo, aceite de soja, etc., que pueden usarse en combinación con un agente solubilizante tal como benzoato de bencilo, alcohol bencílico, etc. La inyección preparada de este modo se carga preferentemente en una ampolla apropiada.
Una composición farmacéutica de la presente invención puede suministrarse por vía subcutánea o por vía intravenosa con una aguja y una jeringa convencionales. Adicionalmente, con respecto a la administración subcutánea, un dispositivo inyector de pluma tiene fácilmente aplicaciones en la administración de una composición farmacéutica de la presente invención. Dicho dispositivo inyector de pluma puede ser reutilizable o desechable. Un dispositivo inyector de pluma reutilizable usa en general un cartucho reemplazable que contiene una composición farmacéutica. Una vez que se ha administrado toda la composición farmacéutica dentro del cartucho y que el cartucho está vacío, el cartucho vacío puede desecharse fácilmente y remplazarse con un nuevo cartucho que contiene la composición farmacéutica. El dispositivo inyector de pluma puede entonces reutilizarse. En un dispositivo inyector de pluma desechable, no hay cartucho reemplazable. Más bien, el dispositivo inyector de pluma desechable viene precargado con la composición farmacéutica mantenida en un depósito dentro del dispositivo. Una vez que el depósito se vacía de la composición farmacéutica, el dispositivo completo se desecha.
Numerosos dispositivos de administración de pluma y autoinyector reutilizables tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención. Los ejemplos incluyen, aunque ciertamente sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, RU), DISETRo N iC ™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly y Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenhague, Dinamarca), pluma Bd ™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTlPEN PRO™, OPTlPEN STARLET™ y OpTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania), por nombrar solo algunos. Los ejemplos de dispositivos de administración de pluma desechables que tienen aplicaciones en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, aunque ciertamente sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), el FLEXPEN™ (Novo Nordisk) y el KWIKPEN™ (Eli Lilly), el autoinyector SU RECLICK™ (Amgen, Thousands Oaks, CA), el PENLET ™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L.P.) y la pluma h Um IRA™ (Abbott Labs, Abbott Park, IL), por nombrar solo algunos.
Ventajosamente, las composiciones farmacéuticas para su uso oral o parenteral descritas anteriormente se preparan en formas farmacéuticas en una dosis unitaria adecuada para ajustarse a una dosis de los principios activos. Dichas formas farmacéuticas en una dosis unitaria incluyen, por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, inyecciones (ampollas), supositorios, etc. La cantidad del anticuerpo mencionado anteriormente contenida generalmente es de aproximadamente 5 a aproximadamente 500 mg por forma de dosificación en una dosis unitaria; especialmente en forma de inyección, se prefiere que el anticuerpo mencionado anteriormente esté contenido en aproximadamente 5 a aproximadamente 100 mg y en aproximadamente 10 a aproximadamente 250 mg para las otras formas farmacéuticas.
Usos terapéuticos de los anticuerpos
Debido a su interacción con Fel d1, los presentes anticuerpos son útiles para tratar la respuesta primaria después de la exposición de un individuo a un gato, caspa de gato o a un entorno que contiene la proteína Fel d1, o al menos un síntoma asociado con la respuesta alérgica, tal como picazón en los ojos, conjuntivitis, rinitis, respiración sibilante, dificultades para respirar o para evitar una respuesta secundaria al alérgeno Fel d1, incluyendo una respuesta anafiláctica más grave, o para disminuir la gravedad, la duración y/o la frecuencia de los síntomas después de la reexposición al alérgeno de gato. En consecuencia, se prevé que los anticuerpos de la presente invención se puedan usar de forma profiláctica o terapéutica.
En otra realización más de la invención, los presentes anticuerpos se usan para la preparación de una composición farmacéutica para tratar pacientes que padecen una sensibilidad a gatos, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo, y/o a la proteína Fel d1. En otra realización más de la invención, los presentes anticuerpos se usan para la preparación de una composición farmacéutica para reducir la gravedad de la exposición primaria a Fel d1, o para reducir la gravedad, la duración y/o el número de respuestas alérgicas a Fel d1. En una realización adicional de la invención, los presentes anticuerpos se usan como terapia complementaria con cualquier otro agente útil para tratar alérgenos de gatos, incluyendo corticoesteroides, vacunas, inmunoterapia específica para alérgenos (SIT), o cualquier otra terapia paliativa conocida por los expertos en la técnica.
Terapias de combinación
Las terapias combinadas pueden incluir un anticuerpo anti-Fel d1 de la invención y cualquier agente terapéutico adicional que pueda combinarse ventajosamente con un anticuerpo de la invención, o con un fragmento biológicamente activo de un anticuerpo de la invención.
Por ejemplo, se puede emplear un segundo agente terapéutico para ayudar a reducir los síntomas alérgicos después de la exposición a un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo o Fel d1, o estar expuesto a un entorno en el que reside un gato, tal como un corticoesteroide. Los anticuerpos también se pueden usar junto con otras terapias, como una vacuna específica para el alérgeno Fel d1. El componente o componentes terapéuticamente activos adicionales pueden administrarse antes de, simultáneamente con o después de la administración del anticuerpo anti-Fel d1 de la presente invención. Para los fines de la presente divulgación, dichos regímenes de administración se consideran la administración de un anticuerpo anti-Fel d1 "en combinación con" un segundo componente terapéuticamente activo.
Regímenes de administración
De acuerdo con determinadas realizaciones de la presente invención, se pueden administrar dosis múltiples de uno o más anticuerpos anti-Fel d1 (una combinación de anticuerpos) o una molécula biespecífica de unión a antígeno a un sujeto durante un curso de tiempo definido. Los métodos de acuerdo con este aspecto comprenden administrar secuencialmente a un sujeto múltiples dosis de un anticuerpo, combinación de anticuerpos o una molécula biespecífica de unión a antígeno de la invención. Como se emplea en el presente documento, "administrar secuencialmente" significa que cada dosis de un anticuerpo, combinación de anticuerpos o una molécula biespecífica de unión a antígeno se administra al sujeto en un momento diferente, por ejemplo, en días diferentes separados por un intervalo predeterminado (por ejemplo, horas, días, semanas o meses). La presente divulgación incluye métodos, que comprenden administrar secuencialmente al paciente una única dosis inicial de un anticuerpo, combinación de anticuerpos o una molécula biespecífica de unión a antígeno, seguida por una o más dosis secundarias del anticuerpo y, opcionalmente, seguida por una o más dosis terciarias del anticuerpo.
Las expresiones "dosis inicial", "dosis secundarias", y "dosis terciarias", se refieren a la secuencia temporal de administración de un anticuerpo, combinación de anticuerpos o una molécula biespecífica de unión a antígeno de la invención. Por lo tanto, la "dosis inicial" es la dosis que se administra al inicio del régimen de tratamiento (también mencionada como la "dosis de referencia"); las "dosis secundarias" son las dosis que se administran después de la dosis inicial; y las "dosis terciarias" son las dosis que se administran después de las dosis secundarias. Las dosis iniciales, secundarias y terciarias pueden contener todas la misma cantidad de un anticuerpo, combinación de anticuerpos o una molécula biespecífica de unión a antígeno, pero generalmente pueden diferir entre sí en términos de frecuencia de administración. En determinadas realizaciones, sin embargo, la cantidad de un anticuerpo, combinación de anticuerpos o una molécula biespecífica de unión a antígeno contenida en las dosis iniciales, secundarias y/o terciarias varían entre sí (por ejemplo, ajustadas al alza o a la baja según lo apropiado) durante el curso de tratamiento. En determinadas realizaciones, dos o más (por ejemplo, (por ejemplo, 2, 3, 4 o 5) dosis se administran al inicio del régimen de tratamiento como "dosis de carga" seguidas por dosis posteriores que se administran en una base menos frecuente (por ejemplo, "dosis de mantenimiento").
En una realización ejemplar de la presente invención, cada dosis secundaria y/o terciaria se administra de 1 a 26 (por ejemplo, 1, 1 / , 2, 2 / , 3, 3 / , 4, 41/ 2, 5, 51/ 2, 6, 61/ 2, 7, 71/ 2, 8, 81/ 2, 9, 91/ 2, 10, 101/ 2, 11, 11 /, 12, 121/ 2, 13, 131/ 2, 14, 141/ 2, 15, 15 /, 16, 16 /, 17, 17 /, 18, 18 /, 19, 19 /, 20, 20 /, 21 ,21 /, 22, 22 /, 23, 23 /, 24, 24 /, 25, 25 /, 26, 26 / o más) semanas después de la dosis inmediatamente anterior. La expresión "la dosis inmediatamente anterior", como se usa en el presente documento, significa, en una secuencia de administraciones múltiples, la dosis de un anticuerpo, combinación de anticuerpos o una molécula biespecífica de unión a antígeno, que se administra a un paciente antes de la administración de la siguiente dosis en la secuencia sin dosis intermedias.
Los métodos de acuerdo con este aspecto pueden comprender administrar a un paciente cualquier cantidad de dosis secundarias y/o terciarias de un anticuerpo, combinación de anticuerpos o una molécula biespecífica de unión a antígeno que se une específicamente a Fel d1. Por ejemplo, en determinadas realizaciones, se administra únicamente una sola dosis secundaria al paciente. En otras realizaciones, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis secundarias se administran al paciente. De manera análoga, en determinadas realizaciones, se administra únicamente una sola dosis terciaria al paciente. En otras realizaciones, dos o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más) dosis terciarias se administran al paciente.
En realizaciones que implican múltiples dosis secundarias, cada dosis secundaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis secundarias. Por ejemplo, cada dosis secundaria puede administrarse al paciente de 1 a 2 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. De forma similar, en realizaciones que implican múltiples dosis terciarias, cada dosis terciaria puede administrarse a la misma frecuencia que las otras dosis terciarias. Por ejemplo, cada dosis terciaria puede administrarse al paciente de 2 a 4 semanas después de la dosis inmediatamente anterior. Como alternativa, la frecuencia a la que se administran las dosis secundarias y/o terciarias a un paciente puede variar sobre el curso del régimen de tratamiento. La frecuencia de administración también puede ajustarse durante el curso de tratamiento por un médico dependiendo de las necesidades del paciente individual después de examen clínico.
Usos de diagnóstico de los anticuerpos
Los anticuerpos anti-Fel d1 de la presente invención también pueden usarse para detectar y/o medir Fel d1 en una muestra, por ejemplo, con fines de diagnóstico. Se prevé que la confirmación de una respuesta alérgica que se cree que es causada por Fel d1 puede hacerse midiendo la presencia de Fel d1 mediante el uso de uno cualquiera o más de los anticuerpos de la invención. Los ensayos de diagnóstico ejemplares para Fel d1 pueden comprender, por ejemplo, poner en contacto una muestra, obtenida de un paciente, con un anticuerpo anti-Fel d1 de la invención, en donde el anticuerpo anti-Fel d1 está marcado con un marcador detectable o molécula informadora o se usa como un ligando de captura para aislar selectivamente la proteína Fel d1 de las muestras del paciente. Como alternativa, se puede usar un anticuerpo anti-Fel d1 no marcado en aplicaciones de diagnóstico en combinación con un anticuerpo secundario que está marcado de forma detectable por sí mismo. El marcador detectable o molécula indicadora puede ser un radioisótopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I; un resto fluorescente o quimioluminiscente tal como isotiocianato de fluoresceína o rodamina; o una enzima tal como una fosfatasa alcalina, p-galactosidasa, peroxidasa de rábano rusticano o luciferasa. Los ensayos ejemplares específicos que pueden usarse para detectar o medir Fel d1 en una muestra incluyen ensayo de inmunoadsorción enzimática (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).
Las muestras que se pueden usar en los ensayos de diagnóstico de Fel d1 incluyen cualquier muestra de tejido o líquido obtenible de un paciente, que contenga cantidades detectables de proteína Fel d1, o fragmentos de la misma, en condiciones normales o patológicas. En general, se medirán los niveles de Fel d1 en una muestra particular obtenida de un paciente sano/no alérgico (por ejemplo, un paciente no afectado por una sensibilidad asociada con la presencia de Fel d1) para establecer inicialmente un nivel de referencia, o patrón, de Fel d1. Este nivel de referencia de Fel d1 después puede compararse con los niveles de Fel d1 medidos en muestras obtenidas de individuos de los que se sospecha que tienen una sensibilidad a Fel d1 en la caspa de gato, o los síntomas asociados con dicha afección.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la materia una divulgación y descripción completa de cómo preparar y usar los métodos y las composiciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para garantizar la precisión con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero deben tenerse en cuenta algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique otra cosa, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular promedio, la temperatura está en grados centígrados y la presión es atmosférica o cercana a la atmosférica.
Ejemplo 1. Generación de anticuerpos humanos contra Fel d i
Se puede usar un inmunógeno que comprenda uno cualquiera de los siguientes para generar anticuerpos contra Fel d1. En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención se obtienen de ratones inmunizados con un inmunógeno primario, tal como Fel d1 natural de longitud completa (nFel d1), que puede adquirirse comercialmente (por ejemplo, de Indoor Biotechnologies, # LTN-FD1-1), o aislarse del pelo o caspa de gato mediante cromatografía en columna de múltiples etapas (Véase, por ejemplo, Chapman MD, et al. (1988), J. Immunol. 140:812-818), o que puede producirse de manera recombinante (Véanse los número de registro de GenBank P30438 o NP_001041618.1 para la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena 1 de Fel d1 (también denominada cadena A o FELD1 A; véase también la SEQ ID NO: 392) y el número de registro de GenBank P30440, o NP_001041619.1 para la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena 2 de Fel d1 (también denominada cadena B o FELD B; véase también la SEQ ID NO: 393), o fragmentos de la cadena 1 o la cadena 2, o fragmentos de la cadena 1 y la cadena 2 de la proteína Fel d1, seguido de inmunización con un inmunógeno secundario, o con un fragmento inmunogénicamente activo de la proteína natural. Los animales pueden inmunizarse con proteína de cadena 1 sola o proteína de cadena 2 sola, o con proteínas de cadena 1 y cadena 2 , administradas secuencialmente o simultáneamente. Se pueden preparar varias construcciones usando porciones de la cadena 1 y la cadena 2 junto con diversas estrategias de enlace o espaciador conocidas por los expertos en la técnica. Estas construcciones pueden usarse solas o en diversas combinaciones para provocar respuestas de anticuerpos in vivo. Por ejemplo, las construcciones Fel d1 recombinantes, tales como las ejemplificadas en las SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 o 397, o fragmentos de las mismas, pueden usarse como inmunógenos.
En determinadas realizaciones, los anticuerpos de la invención se obtienen de ratones inmunizados con un inmunógeno primario, tal como un fragmento biológicamente activo y/o inmunogénico de Fel d1 natural o producido, o ADN que codifica el fragmento activo del mismo. El fragmento puede proceder del dominio N-terminal o C-terminal de la cadena 1 y/o la cadena 2 de Fel d1.
En determinadas realizaciones, el inmunógeno Fel d1 producido de forma recombinante puede prepararse mediante fusión directa de las dos cadenas de Fel d1, como se describe en Kaiser et. al., para producir un producto de fusión que tenga un patrón de replegamiento similar al del Fel d1 natural (Kaiser, L. et al., (2003), J. Biol. Chem.
278(39):37730-37735). En determinadas realizaciones, el inmunógeno puede ser una proteína de fusión tal como la que se muestra en las construcciones de las SEQ ID NO: 385, 394, 395, 396 o 397, seguido de inmunización con un inmunógeno secundario o con un fragmento inmunogénicamente activo de Fel d1 natural o producida de forma recombinante.
En determinadas realizaciones, las construcciones de la proteína Fel d1 recombinante utilizadas en los estudios descritos en el presente documento comprenden i) la cadena B de Fel d1 (cadena 2) y la cadena A de Fel d1 (cadena 1) unidas como una fusión continua en línea (con la cadena B de Fel d1 en el extremo N) o ii) una fusión continua en línea con la cadena A de Fel d1 en el extremo N seguido de un conector flexible [(Gly4Ser)3] seguido de Fel d1B. Estas construcciones también pueden incluir un marcador C-terminal (myc-myc-His6 o región Fc de ratón de lgG2a), como se indica a continuación. Las proteínas se expresaron en células de ovario de hámster chino (CHO). Una secuencia de señal exógena utilizada para promover la expresión en células CHO no se incluye en los listados de secuencias.
En determinadas realizaciones, el inmunógeno puede ser una proteína de fusión que comprende uno o más de los siguientes: i) restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank P30440 y también la SEQ ID NO: 393) fusionados a través del extremo C directamente con el extremo N de los restos de aminoácidos 23-92 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank P30438 y también la SEQ ID NO: 392); ii) restos de aminoácidos 23-92 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank P30438 y también la SEQ ID NO: 392) fusionados a través del extremo C al extremo N de los restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank P30440 y también la SEQ ID NO: 393); iii) restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank NP_001041619.1) fusionados a través del extremo C directamente con el extremo N de los restos de aminoácidos 19-88 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank NP_001041618.), tal como la construcción mostrada en la SEQ ID NO: 394 o 396; iv) restos de aminoácidos 19-88 de la cadena 1 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank NP_001041618.1) fusionados a través del extremo C al extremo N de los restos de aminoácidos 18-109 de la cadena 2 de Fel d1 (véase el número de registro de GenBank NP_001041619.1). Véase también la SEQ ID NO: 395). En determinadas realizaciones, la proteína de fusión puede tener un marcador en el extremo C terminal de la construcción, tal como u marcador de myc-myc-hexahistidina (véanse las SEQ ID NO: 385, 396 o 397 para dichas construcciones). En realizaciones relacionadas, la proteína de fusión puede tener un Fc de ratón acoplado en el extremo C terminal de la construcción (Véanse la SEQ ID NO: 394 o 395 para dichas construcciones). En determinadas realizaciones, las cadenas 1 y 2 se acoplan a través de un conector conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo (G4S)3 (Véanse las SEQ ID NO: 395 y 397 para dicha construcción).
En determinadas realizaciones, los anticuerpos que se unen específicamente a Fel d1 pueden prepararse usando fragmentos de las regiones mencionadas anteriormente, o péptidos que se extienden más allá de las regiones designadas por aproximadamente 5 a aproximadamente 20 restos de aminoácidos de uno, o ambos, extremos terminales N o C de las regiones descritas en el presente documento. En determinadas realizaciones, cualquier combinación de las regiones mencionadas anteriormente o fragmentos de las mismas puede usarse en la preparación de anticuerpos específicos para Fel d1. En determinadas realizaciones, se puede usar una cualquiera o más de las regiones de Fel d1 mencionadas anteriormente, o fragmentos de las mismas para preparar anticuerpos monoespecíficos, biespecíficos o multiespecíficos.
Las proteínas de longitud completa, o fragmentos de las mismas, que se usaron como inmunógenos, como se señaló anteriormente, se administraron directamente, con un adyuvante para estimular la repuesta inmunitaria, a un ratón VELOCIMMUNE® que comprende ADN que codifica las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera kappa de inmunoglobulina humana. La respuesta inmunitaria de anticuerpo se controló mediante un inmunoensayo específico de Fel d1. Cuando se consiguió una respuesta inmunitaria deseada, se recogieron los esplenocitos y se fusionaron con células de mieloma de ratón para conservar su viabilidad y formar líneas celulares de hibridoma. Las líneas celulares de hibridoma se cribaron y seleccionaron para identificar líneas celulares que producían anticuerpos específicos para Fel d1. Usando esta técnica, y los diversos inmunógenos descritos anteriormente, se obtuvieron varios anticuerpos quiméricos anti-Fel d1 (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes de ratón); determinados anticuerpos ejemplares generados de esta manera se denominaron como H1M1230N, H1M1234N, H1M1241N, H2M1233N, H2M1236N, H2M1237N y H2M1242N.
También se aislaron anticuerpos anti-Fel d1 directamente de linfocitos B positivos a antígeno sin fusión a células de mieloma, como se describe en el documento US 2007/0280945A1. Usando este método, se obtuvieron varios anticuerpos anti-Fel d1 completamente humanos (es decir, anticuerpos que poseen dominios variables humanos y dominios constantes humanos); los anticuerpos ejemplares generados de esta manera se denominaron del siguiente modo: H4H2574P, H4H2590S, H4H2592B, H4H2594S, H4H2597P, H4H2606B, H4H2607B, H4H2608B, H4H2636P, H4H2645P, H4H2793P, H4H2797P y H4H2864P.
Las propiedades biológicas de los anticuerpos ejemplares generados de acuerdo con los métodos de este ejemplo se describen en detalle en los ejemplos expuestos a continuación.
Ejemplo 2. Secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera
La tabla 1 expone las parejas de secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpos específicos para Fel d1 seleccionados y sus identificadores de anticuerpo correspondientes. Los anticuerpos se denominan normalmente en el presente documento de acuerdo con la siguiente nomenclatura: prefijo Fc (por ejemplo, "H4H", "H1M, "H2M"), seguido por un identificador numérico (por ejemplo, "1232" como se muestra en la tabla 1), seguido por un sufijo "P" o "N". Por lo tanto, de acuerdo con esta nomenclatura, un anticuerpo puede denominarse como, por ejemplo, "H1M1232N". Los prefijos H4H, H1M y H2M en las denominaciones de anticuerpo usadas en el presente documento indican la región Fc particular del anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo "H2M" tiene una Fc de IgG2 de ratón, mientras que un anticuerpo "H4H" tiene una Fc de IgG4 humana. Como apreciará un experto en la materia, un anticuerpo H1M o H2M puede convertirse en un anticuerpo H4H, y viceversa, pero en cualquier caso, los dominios variables (incluyendo las CDR), que se indican mediante los identificadores numéricos que se muestran en la Tabla 1, seguirán siendo los mismos. Los anticuerpos que tienen la misma denominación numérica de anticuerpos, pero que difieren en un sufijo de letras N, B, S o P se refieren a anticuerpos que tienen cadenas pesadas y ligeras con secuencias CDR idénticas pero con variaciones de secuencia en regiones que quedan fuera de las secuencias CDR (es decir, en las regiones marco). Por lo tanto, las variantes N, B, S y N de un anticuerpo particular tienen secuencias CDR idénticas dentro de sus regiones variables de cadena pesada y ligera, pero difieren entre sí dentro de sus regiones marco.
Tabla 1
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continuación
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Ejemplo 3. Análisis de utilización de genes variables
Para analizar la estructura de los anticuerpos producidos, los ácidos nucleicos que codifican las regiones variables del anticuerpo se clonaron y secuenciaron. A partir de la secuencia de ácido nucleico y la secuencia de aminoácidos predicha de los anticuerpos, se identificó el uso de genes (Vh, D, Jh, Vk o Jk) para cada región variable de cadena pesada (HCVR) y región variable de cadena ligera (LCVR). La Tabla 2 expone el uso de genes para anticuerpos seleccionados de acuerdo con la invención.
Tabla 2
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Ejemplo 4. Unión del anticuerpo a Fel d1 según lo determinado por la resonancia de plasmón superficial
Se determinaron las constantes de velocidad asociativa y disociativa de unión (ka y kd, respectivamente) y las constantes de disociación en equilibrio calculadas y las semividas disociativas (Kd y ty2, respectivamente) para la unión del antígeno a los anticuerpos monoclonales anti-Fel d1, utilizando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real (Biacore T200 o Biacore 2000). La superficie del sensor Biacore se derivatizó con anticuerpo policlonal de conejo anti-ratón (GE Healthcare, n.° BR-1008-38) o con anticuerpo monoclonal de ratón anti-Fc humano (GE Healthcare, n.° BR-1008-39) para capturar anticuerpos anti-Fel d1, expresados con Fc de ratón (prefijo de ID de anticuerpo H1M, H2M, H2aM, H2bM) o Fc de lgG4 humana (prefijo de ID de anticuerpo H4H), respectivamente. Para ajustes cinéticos, al menos dos concentraciones diferentes (que varían de 390 pM a 67 nM) de Fel d i natural (Indoor Biotech, n.° NA-FD1-2) o una versión recombinante de la proteína, Fel d i (B-A)-mmH (SEQ ID NO: 396) se inyectaron sobre la superficie capturada con anticuerpo monoclonal anti-Fel d i a 25 °C a un caudal de 50 ml/min en tampón en funcionamiento (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, P20 al 0,05 %, MgCh 3 mM, CaCb 3 mM). Fel d i (B-A)-mmH se expresó en células de ovario de hámster chino (CHO) y está compuesto por los aminoácidos 18-109 de Fel dIB (número de registro P30440) fusionados en línea con los aminoácidos 23-92 de Fel d1 A (registro n.° P30438) con un marcador myc-myc-hexahistidine C-terminal. La asociación anticuerpo-antígeno se controló durante 3 a 5 minutos, y la disociación del antígeno del anticuerpo monoclonal capturado (en tampón de ejecución solo a 25 °C) se controló durante 10 o 15 minutos. Las constantes de velocidad de asociación (ka) y disociación (kd) cinéticas se determinaron procesando y ajustando los datos a un modelo de unión 1:1 usando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0. Las constantes en equilibrio de disociación de unión (Kd) y las semividas disociativas (ty2) se calcularon a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: Kd = kd/ka y ty2 = ln(2)/kd. Los parámetros de unión para diferentes anticuerpos monoclonales anti-Fel d1 se tabulan en la Tabla 3 y la Tabla 4. La Tabla 3 muestra las afinidades de Biacore a 25 °C para la unión de Fel d1 natural a los anticuerpos monoclonales anti-Fel d1 capturados y la Tabla 4 muestra las afinidades de Biacore a 25 °C para la unión de Fel d1 recombinante a los anticuerpos monoclonales anti-Fel d1 capturados.
Como se muestra en la Tabla 3, 10 de los 25 anticuerpos probados exhibieron valores de Kd inferiores a 1 nM para la unión a Fel d1 natural, que variaron entre 207 pM y 982 pM. Como se muestra en la Tabla 4, 17 de los 25 anticuerpos probados exhibieron valores de Kd inferiores a 1 nM para la unión a Fel d1 recombinante, que variaron entre 144 pM y 924 pM. Dos de los anticuerpos, H4H2574B y H4H2793P, se unieron a Fel d1 recombinante, pero no natural, en estas condiciones experimentales.
Tabla 3
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Tabla 4
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continuación
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Ejemplo 5. Competencia cruzada de anticuerpos anti-Fel d i para la unión a (n) Fel d i natural
Se realizó un experimento de unión usando un sistema biosensor Octet Red (Fortebio Inc.) para determinar la competencia cruzada para un perfil de 8 anticuerpos anti-Fel d i que se unen a Fel d i natural (nFel d i; Indoor Biotechnologies, n.° NAFD1-2). El experimento se realizó a 25 °C en tampón HBST (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, tensioactivo P20 al 0,05 % v/v) que contenía 0,1 mg/ml de BSA. Se realizó una etapa de lavado con el tampón HBST entre cada etapa de unión, y las placas se agitaron durante las etapas de unión y lavado usando un agitador de placa orbital a 1000 rpm. Se capturó un primer anticuerpo anti-Fel d i (AcM-1) durante 2 minutos en la superficie del biosensor anti-hFc a partir de soluciones madre de anticuerpo a 10 pg/ml (niveles de captura finales ~ unidades de respuesta de 1,5 nm). Las puntas del sensor recubiertas se bloquearon luego durante 5 minutos con una solución de 100 pg/ml de un anticuerpo irrelevante. Las puntas de los sensores se sumergieron luego en pocillos que contenían 500 nM de nFel d i durante 5 minutos, y luego en pocillos que contenían soluciones de 50 pg/ml de un segundo anticuerpo anti-Fel d i (AcM-2). Las soluciones de AcM-2 se complementaron con 100 pg/ml de un anticuerpo irrelevante para minimizar la unión no específica. Las respuestas de unión para la unión de AcM-2 a nFel d i que previamente forma complejo con AcM-1 se midieron para la matriz de anticuerpo 8x8 (Tabla 5). Cada valor de unión para la unión de AcM-2 a una superficie de captura de AcM-1/Fel d i diferente (abajo de una columna en la Tabla 5) fue restado por el valor de autocompetencia de AcM-1/Fel di/AcM-2 (donde AcM-1 = AcM-2; a través de la diagonal en la Tabla 5). Los valores inferiores a 0,10 nm indican la competencia cruzada de AcM-1 y AcM-2 por un sitio de unión común en Fel d i.
Cuatro anticuerpos, H4H2636P, H4H1616N, H4H2645P y H4H2864P, compiten bidireccionalmente entre sí para unirse a nFel d i, pero no compiten con ninguno de los otros anticuerpos anti-Fel d i. Dos anticuerpos, H4H1232N y H4H2597P, compiten bidireccionalmente entre sí para unirse a nFel d i. Tanto H4H1232N como H4H2597P compiten unidireccionalmente con H4H1300N. No se pudo determinar la competencia bidireccional con H4H1300N porque H4H1300N no formó complejo previamente con nFel d i. H4H1238N no compitió con ninguno de los anticuerpos anti-Fel d i para unirse a nFel d i.
Tabla 5
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continuación
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Ejemplo 6. Efecto de los anticuerpos anti-Fel d i en un modelo in vivo de anafilaxia cutánea pasiva (PCA)
El modelo in vivo de anafilaxia cutánea pasiva (PCA) se usó para evaluar la desgranulación de mastocitos in vivo. El modelo implica la inyección intradérmica de un antisuero específico para alérgenos en un área local de la piel seguido de la inyección intravenosa de un antígeno junto con un colorante. La reacción alérgica causa dilatación capilar y aumento de la permeabilidad vascular en el sitio de sensibilización, lo que da como resultado una acumulación preferencial de colorante en este sitio. El colorante se puede extraer del tejido y cuantificarse mediante espectrofotometría. La extravasación de colorante en el tejido sensibilizado con antisuero de prueba se compara con la extravasación en el tejido sensibilizado con un antisuero no relevante.
Los antisueros se generaron mediante la inmunización de ratones Balb/c con 5 mg de proteína Fel d1 natural purificada a partir de extracto de pelo de gato (Indoor Biotechnologies, n.° LTN-FD1-1), 5 mg de extracto bruto de alérgeno de maní (Greer Laboratories, n.° XPF171D3A25), o 1250 de unidades de alergia bioequivalente (BAU, por sus siglas en inglés) de extracto de pelo de gato estandarizado (Greer Laboratories, n.° GTE3A01) en una solución de 1 mg/ml de alumbre (Pierce, n.° 77161) en solución salina tamponada con fosfato 1X. Dos semanas más tarde (día 14), los ratones sensibilizados se reforzaron con dosis de alérgenos idénticos a los utilizados para la inmunización inicial. Dos semanas después del refuerzo (día 28), se sacrificaron los ratones y se recogió el suero. La concentración total de IgE en los antisueros aislados se determinó mediante ELISA. La concentración final de antisuero se diluyó a 2400 ng/ml de IgE en solución salina tamponada con fosfato 1X.
Para determinar el efecto de los anticuerpos anti-Fel d1 sobre la desgranulación de mastocitos en el modelo de PCA, antes de la sensibilización de la oreja con antisuero generado como se describió anteriormente, los grupos de ratones Balb/c se inyectaron primero por vía subcutánea con un anticuerpo de control de isotipo lgG4 humano, un anticuerpo anti-Fel d1, o una combinación de anticuerpos anti-Fel d1 a dosis de 5 mg/kg (dosis de anticuerpo total, 2,5 mg/kg de cada anticuerpo) para experimentos de un solo punto a menos que se indique lo contrario o a concentraciones que oscilan entre 0,06 mg/kg y 2 mg/kg para experimentos que varían de dosis. Tres días después del tratamiento previo con anticuerpos, un grupo de ratones ("grupo Fel d1 natural") se sensibilizó mediante inyección intradérmica con 10 ml de antisuero procedente de Fel d1 natural o 10 ml de antisuero procedente de maní (control negativo) en las orejas derecha e izquierda, respectivamente, de cada ratón. Un segundo grupo de ratones ("grupo de extracto de gato") se sensibilizó con 20 ml de antisuero procedente de extracto de pelo de gato o 20 ml de antisuero procedente de maní (control negativo) en las orejas derecha e izquierda, respectivamente, de cada ratón. Veinticuatro horas después de la sensibilización, los ratones del grupo Fel d1 natural se expusieron mediante inyección intravenosa (100 ml por ratón) de una solución de 0,25 mg/ml de Fel d1 natural (Indoor Biotechnologies, n.° LTN-FD1-1) disuelto en solución salina tamponada con fosfato 1X que contiene colorante azul de Evan al 0,5 % (p/v) (Sigma, n.° E2129). De forma similar, 24 horas después de la sensibilización, los ratones en el grupo de extracto de gato se expusieron con 250 BAU de extracto de pelo de gato estandarizado [extracto de pelo de gato estandarizado (Greer Laboratories, n.° GTE3A01)] disuelto en solución salina tamponada con fosfato 1X que contiene colorante azul de Evan al 0,5 % (p/v) (Sigma, n.° E2129). Una hora después de la exposición con el antígeno, se sacrificaron los ratones, se extirparon las orejas y se colocaron en 1 ml de formamida y se incubaron durante 3 días a 56 °C para extraer el colorante azul de Evan del tejido. Luego se retiró el tejido de la oreja a partir de formamida, se secó para eliminar el exceso de líquido y se pesó. Se transfirieron alícuotas de doscientos microlitros de cada extracto de formamida a placas de 96 pocillos por duplicado. La absorbancia de los sobrenadantes resultantes se midió a 620 nm. La DO se convirtió a la concentración de colorante azul de Evan usando una curva estándar. La concentración promedio del colorante azul de Evan extravasada en el tejido de la oreja sensibilizado con antisuero (normalizado por el peso del tejido de la oreja) se calculó para el grupo tratado con el anticuerpo de control de isotipo y se definió como F(isotipo.pro). La reducción en la extravasación de colorante azul de Evan resultante del tratamiento previo de anticuerpos se calculó por ratón restando la cantidad de colorante azul de Evan para Fel d1 del grupo tratado con anticuerpo o la oreja sensibilizada con extracto, definido como F(AcM,i), de F(isotipo,promedio). Este número se dividió luego por la diferencia entre F(isotipo.promedio) y la cantidad de colorante para la oreja sensibilizada con maní del grupo tratado con anticuerpos [P(AcM,i)] y se multiplicó por 100 para dar el porcentaje de reducción general en la extravasación de colorante para cada ratón (% de reducción).
% de reducción (por ratón) = 100*[F(isotipo,promedio)-F(AcM,i)]/[F(isotipo,promedio)-P(AcM,i)]
Luego se calculó el porcentaje de reducción promedio en la pérdida de colorante para cada grupo de anticuerpos. Los resultados, expresados como (media ± DE) del porcentaje de reducción de azul de Evan se muestran en la Tabla 6 y la Tabla 7 para el grupo Fel d i natural y en la Tabla 8 para el grupo de extracto de pelo de gato.
Tal como se muestra en la Tabla 6, siete grupos de ratones del grupo Fel d1 natural, cuando se trataron con combinaciones específicas de anticuerpos anti-Fel d1 a concentraciones fijas, exhibieron reducciones en las extravasaciones de colorantes que van de un 79 % a un 103 % en comparación con los ratones que recibieron anticuerpos de control. Los ratones tratados con combinaciones de anticuerpos por parejas H4H2590S/H4H1238N, H4H2590S/H4H2574P o H4H1232N/H4H1616N mostraron una reducción de menos del 3 % en la extravasación de colorante en comparación con los ratones que recibieron el anticuerpo de control, demostrando que no todos los anticuerpos anti-Fel d1 probados en este modelo fueron eficaces.
Adicionalmente, se realizaron experimentos de variación de dosis con ratones del grupo Fel d1 natural, como se muestra en la Tabla 7. Los anticuerpos individuales no fueron tan eficaces para reducir la extravasación de colorantes como las combinaciones de anticuerpos anti-Fel d1 a las dosis probadas.
Un par específico de anticuerpos anti-Fel d1 (H4H2636P y H4H1232N) a niveles de dosis múltiples, así como cada uno de estos anticuerpos anti-Fel d1 solo a un nivel de dosis único (más alto), se probó adicionalmente en el modelo de PCA usando ratones que fueron sensibilizados y expuestos con extracto de pelo de gato como se muestra en la Tabla 8. A 2 mg/kg, estos anticuerpos únicos anti-Fel d1 solos no fueron tan eficaces para reducir la extravasación de colorante como una combinación de los dos anticuerpos. La combinación de H4H2636P y H4H1232N a dosis de 2 mg/kg y 1 mg/kg redujo la extravasación de colorante en más de un 90 % en comparación con el control de isotipo en el modelo de PCA que usa extracto de pelo de gato como antígeno.
Todas las reducciones que fueron estadísticamente significativas (p < 0,05) en comparación con el control de isotipo según lo determinado por ANOVA bidireccional con la prueba posterior de Bonferroni se señalan con un asterisco (*). El número de ratones utilizados por grupo (n) se indica entre paréntesis en las tablas.
Tabla 6
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Tabla 7
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continuación
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Tabla 8
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Ejemplo 7. Efecto de los anticuerpos anti-Fel d i en un modelo in vivo de inflamación pulmonar
El modelo de ratón in vivo de inflamación pulmonar se usa para evaluar la inflamación pulmonar inducida por alérgenos y la acumulación de moco que podría estar asociada con asma o rinoconjuctivitis. El modelo implica la administración intranasal repetida de un alérgeno en ratones previamente sensibilizados con alérgenos. La inflamación asociada a alérgenos puede causar un aumento en la acumulación de moco pulmonar, migración de eosinófilos al pulmón, IgE total en suero y niveles de lgG1 específicos de alérgenos.
Se inmunizaron ratones Balb/c intraperitonealmente con 1 |jg de proteína Fel d i natural purificada a partir de extracto de pelo de gato (Indoor Biotechnologies, n.° LTN-FD1-1) en una solución de 1 mg/ml de alumbre (Pierce, n.° 77161) en solución salina tamponada con fosfato 1X. Siete días después, los ratones sensibilizados se reforzaron intraperitonealmente con 1 jg de Fel d1 natural en una solución de 1 mg/ml de alumbre en solución salina tamponada con fosfato 1X. Los días 17, 21 y 25, se inyectaron grupos de ratones (n = 5) subcutáneamente con un anticuerpo de control de isotipo humano lgG4 o una combinación 1:1 de anticuerpos anti-Fel d1, H4H1232N y H4H2636P, a 20 mg/kg (dosis total de anticuerpos). Los días 20, 24 y 28, los ratones se expusieron por vía intranasal con 0,05 jg de Fel d1 natural diluida en 20 j l de solución salina tamponada con fosfato 1X. Los ratones de control se expusieron a 20 j l de solución salina tamponada con fosfato 1X en los mismos días. El día 32, se sacrificaron todos los ratones y se recogieron sus pulmones. La dosificación experimental y el protocolo de tratamiento para grupos de ratones se muestran en la Tabla 9.
Para determinar la IgE total circulante y la lgG1 específica de Fel d1 en el suero de los ratones, se recogieron muestras de suero para cada ratón mediante punción cardíaca terminal usando una jeringa de TB 27G1/2 de 1 ml (Becton Dickinson, n.° 309306) con una aguja unida. Se colocaron muestras de sangre en tubos separadores de suero BD microtainer® (Becton Dickinson, n.° 365956), se centrifugaron, y luego el suero se transfirió a un tubo nuevo para su almacenamiento hasta el análisis.
Para determinar la concentración total de IgE en las muestras de suero para cada ratón, se utilizó un kit sándwich ELISA OPTEIA (BD Biosciences, n.° 555248) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las muestras de suero se diluyeron y se incubaron con anticuerpo de captura anti-lgE recubierto en placas de 96 pocillos. La IgE total se detectó mediante el anticuerpo secundario anti-IgE de ratón biotinilado. Se usó IgE de ratón marcada con peroxidasa de rábano (HRP) purificada como modelo. El cromógeno 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (conjunto de reactivos de sustrato BD OPTEIA, BD, n.° 555214) se usó para detectar la actividad de HRP. Luego se añadió una solución de parada de ácido sulfúrico 1 M y se midió la absorbancia a 450 nm en un lector de placas Molecular Devices SpectraMax M5. El análisis de datos se realizó utilizando el programa informático Prism™. Las cantidades medias de los niveles de IgE circulante en suero para cada grupo experimental se expresan como ng/ml (± EEM) como se muestra en la Tabla 10. Los ratones expuestos a Fel d1 por vía intranasal cuando se trataron con la combinación de anticuerpos anti-Fel d1 mostraron una disminución significativa en la cantidad de IgE circulante [6683 (± 1394) ng/ml] en comparación con los ratones que recibieron el anticuerpo de control de isotipo [14080 (± 1505) ng/ml].
Para determinar los niveles de lgG1 específicos de Fel d1 en las muestras de suero de cada ratón, se utilizó un ELISA.
Las placas recubiertas con Fel d i se incubaron con muestras de suero de ratón diluidas en serie, seguido de incubación con anticuerpo conjugado anti-lgG1-HRP de ratón (BD Biosciences, n.° 559626). Todas las muestras se desarrollaron con una solución TMB y se analizaron como se describió anteriormente. Los niveles relativos de lgG1 circulante en suero se representaron como unidades de valor (las unidades de valor se calcularon multiplicando la DO medida por un factor de dilución requerido para lograr DO450 que era mayor que dos veces el antecedente). Los niveles de lgG1 específicos de Fel d1 circulantes en suero para cada grupo experimental se expresan como valor x 103 (± EEM) como se muestra en la Tabla 11. Los ratones expuestos a Fel d1 por vía intranasal cuando se trataron con la combinación de anticuerpos anti-Fel d1 exhibieron una disminución significativa en la cantidad de niveles de lgG1 específicos de Fel d1 en suero [valor de 105,3 (± 31,33) x103] en comparación con los ratones que recibieron anticuerpo de control de isotipo [valor de 526,1 (± 144,0) x103].
Cosecha pulmonar para análisis de infiltrado celular:
Después del desangrado, se extrajo el pulmón derecho de cada ratón y se colocó en una pequeña placa de Petri que contenía Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM, por sus siglas en inglés) (Irvine Scientific, n.° 9033) y se cortó en cubos de aproximadamente 2 a 3 mm de tamaño. Luego, los cubos se transfirieron a un tubo que contenía una solución de 20 mg/ml de DNAsa (Roche, n.° 10104159001) y 0,7 U/ml de Liberase TH (Roche, n.° 05401151001) diluido en la solución de sal equilibrada de Hank (HBSS, por sus siglas en inglés) (Gibco, n.° 14025) y se colocó en un baño de agua a 37 °C durante 20 minutos con agitación vorticial cada 5 minutos. Esta reacción se detuvo luego mediante la adición de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (Gibco, n.° 15575) a una concentración final de 10 mM. Se purgó cada pulmón, se filtró a través de un filtro de 70 mm, se centrifugó y luego se resuspendió el sedimento pulmonar en 4 ml de tampón de lisis ACK (Gibco, n.° 10492) para eliminar los glóbulos rojos. Después de 3 minutos de incubación a temperatura ambiente, se añadió DMEM para desactivar el tampón ACK. Las suspensiones celulares se centrifugaron y los sedimentos celulares se volvieron a suspender en 10 ml de solución tampón MACS [una mezcla de Solución de enjuague MACS de Miltenyi auto (Militenyi Biotec, n.° 130-091-222) y BSA MACS (Militenyi Biotec, n.° 130-091-376)]. Las muestras resuspendidas se filtraron a través de un filtro de 70 mm y se colocaron 1x106 células en una placa de 96 pocillos de fondo en V. Luego, las células se centrifugaron y los sedimentos se resuspendieron en un bloque Fc de rata anti-CD16/CD32 de ratón purificado, (BD Biosciences Clone: 2.4G2, n.° 553142) diluido en tampón MACs durante 15 minutos a 40 °C. Las células se lavaron dos veces y luego se incubaron en la mezcla de anticuerpos apropiada (descrita en la Tabla 12) diluida en tampón MACS durante 30 minutos a 4 °C protegida de la luz. Después de la incubación de anticuerpos, las células se lavaron dos veces en tampón MACS y se resuspendieron en BD cytofix (BD Biosciences, n.° 554655) durante 15 minutos a 4 °C mientras se protegían de la luz. Las células se lavaron, se resuspendieron en tampón MACS y luego se transfirieron a tubos b D FACS (BD Biosciences, n.° 352235) para el análisis de eosinófilos mediante citometría de flujo. Los eosinófilos se definieron como células que eran CD45+, GR1-, CD11clD, SiglecFhi. Los datos se expresan como frecuencia de eosinófilos en células CD45+ (± EEM) en la Tabla 13.
Los ratones expuestos con Fel d1 por vía intranasal cuando se trataron con la combinación de anticuerpos anti-Fel d1 exhibieron una disminución significativa en la frecuencia de eosinófilos en la población de células CD45+ en comparación con los ratones que no recibieron anticuerpos (disminución del 67 %) o que recibieron anticuerpos de control de isotipo (disminución del 46%) como se muestra en la Tabla 13.
Cosecha pulmonar para análisis histológico:
Después del desangrado, se extrajeron los pulmones izquierdos y se colocaron en tubos que contenían una solución de 5 ml de paraformaldehído al 4 % (p/v) (Boston Bioproducts, n.° BM-155) en solución salina tamponada con fosfato 1X y se almacenaron a temperatura ambiente durante 3 días. Las muestras de pulmón se secaron y se transfirieron a tubos que contenían etanol al 70 % para análisis histológico. Las muestras se enviaron a Histoserv, Inc (Germantown, MD) para seccionar y tinción con ácido peryódico de Schiff (PAS, por sus siglas en inglés).
Se obtuvieron aproximadamente 35 imágenes digitales en toda el área de cada sección pulmonar teñida con PAS utilizando un microscopio de luz Zeiss Axioplan 2 Imaging con una cámara Zeiss AxioCam MRc. Luego se construyó una imagen pulmonar completa a partir de las imágenes más pequeñas y se analizó utilizando el programa informático ImageJ con la ayuda de un complemento de umbral de color. Las regiones de acumulación de moco en la luz bronquial se identificaron y cuantificaron a través de un umbral de color elegido por el usuario y se normalizaron al área total de la luz que se identificó y cuantificó mediante un ajuste de umbral de color separado. El porcentaje de luz bronquial ocupada por la acumulación de moco para cada pulmón se expresó como [(área mucosa/área de luz) x 100] y se calculó para cada grupo de tratamiento. Los resultados, expresados como porcentaje medio de obstrucción pulmonar (± EEM) se muestran en la Tabla 14.
Los ratones tratados con la combinación de anticuerpos anti-Fel d1 mostraron una tendencia hacia una acumulación reducida de moco en los bronquios pulmonares (5,21 /- 0,81 % de acumulación de moco) en comparación con los ratones que recibieron anticuerpo de control (10,81 /- 1,13 % de acumulación de moco) en el modelo de inflamación pulmonar como se muestra en la Tabla 14. No se observaron diferencias en el tamaño de luz bronquial o el tamaño global de los pulmones entre los grupos de ratones.
Tabla 9: Protocolo experimental de dosificación y tratamiento para grupos de ratones Balb/c
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Tabla 10: Niveles totales de I E circulante en suero de ratón
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Tabla 11: l G1 es ecífica de Fel d1 circulante en suero de ratón
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T 12 Ani r iliz r l n li i i m rí fl
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T l 1 Fr n i in fil n l l D4 n l rmin m i n i m rí fl f
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Tabla 14: Obstrucción pulmonar (área mucosa/área de luz, %)
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Ejemplo 8. Mapeo del epítopo de intercambio de hidrógeno-deuterio
Para determinar los epítopos de Fel d i (una proteína heterodímera compuesta por la cadena A de Fel d i y la cadena B de FELD1) reconocidos por dos anticuerpos anti-Fel d i, se realizaron estudios de intercambio de hidrógeno-deuterio (H/D) para cada anticuerpo que forma complejo conjuntamente con Fel d i. Antes de los experimentos de intercambio H/D, Fel d i recombinante expresada en células CHO compuesta por aminoácidos 18-109 de la cadena B de Fel d i (número de registro de GenBank N P _ 00 i04 i6 i9.i) fusionados en línea con los aminoácidos i9-88 de FELDi A (número de registro de GenBank N P _ 00 i04 i6 i8.i) expresada con un marcador C-terminal myc-myc-hexahistidina y con una mutación D27G (Fel diB-A-mmH; SEQ ID: 396) se desglucosiló a 37 °C durante 4 horas en condiciones nativas utilizando PNGase F (New England BioLabs, n.° 0704). Para este estudio, dos anticuerpos anti-FELDi (H4Hi232N y H4H2636P) se unieron covalentemente a perlas de agarosa de N-hidroxisuccinimida (NHS) (GE Lifescience, n.° i7-0906-0i) de acuerdo con el protocolo del fabricante.
Para mapear el epítopo de unión Fel diB-A-mmH reconocido por H4Hi232N, se llevaron a cabo dos conjuntos de experimentos de intercambio H/D (todas las reacciones de unión e intercambio se llevaron a cabo a temperatura ambiente). El primer experimento usó un formato "solución activa/perlas inactivas" (intercambio activo en solución seguido de intercambio inactivo en perlas). Para el intercambio activo, la proteína Fel diB-A-mmH desglucosilada se deuteró durante 5 y i0 minutos (en dos subexperimentos separados) en tampón PBS a pH 7,4 preparado con D2O (PBS-D) y luego se unió a las perlas H4Hi232N durante una incubación de 2 minutos en PBS-D. El complejo conjunto de Fel diB-A-mmH unido a perlas H4Hi232N se lavó luego con tampón PBS a pH 7,4 preparado con H2O (PBS-H) y se incubó en PBS-H durante la mitad del tiempo de intercambio activo (intercambio inactivo), permitiendo que solo los epítopos en Fel diB-A-mmH protegidos por la unión del anticuerpo H4Hi232N permanezcan deuterados. Después del intercambio inactivo, el Fel diB-A-mmH unido se eluyó de las perlas usando una solución acuosa de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,i % enfriada con hielo. El Fel diB-A-mmH eluido se digirió luego con pepsina inmovilizada (Thermo Scientific, n.° 20343) durante 5 minutos a 4 °C. Los péptidos resultantes se desalaron a 4 °C utilizando puntas de pipeta cromatográficas ZipTip (Millipore, n.° ZTCi8S096) de acuerdo con el protocolo del fabricante y luego se analizaron inmediatamente en un espectrómetro de masas (MS) de tiempo de vuelo de ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF) UltrafleXtreme.
El segundo experimento se conoce como "perlas activas/perlas inactivas" (intercambio activo en perlas seguido de intercambio inactivo en perlas). Para este experimento, el Fel diB-A-mmH desglucosilado se unió primero a las perlas H4Hi232N, y luego se incubó durante 5 o i0 minutos (en subexperimentos separados) en PBS-D para permitir el intercambio activo. La siguiente etapas (intercambio inactivo, digestión con pepsina y análisis MS) se realizaron como se describe para el procedimiento de "solución activa/perlas inactivas" anterior. Los valores centroides o las relaciones de masa a carga promedio (m/z) de todos los péptidos detectados se calcularon y compararon entre los experimentos solución activa/perlas inactivas y perlas activas/perlas inactivas. Los péptidos que muestran una masa aumentada después del procedimiento de solución activa/perlas inactivas en comparación con el procedimiento de perlas activas/perlas inactivas incluyen aminoácidos dentro de la proteína Fel d i protegida del intercambio como resultado de la unión del anticuerpo y, por lo tanto, revelan regiones de epítopo de unión.
El experimento de intercambio H/D para la unión de Fel diB-A-mmH al anticuerpo anti-Fel d i H4H2636P se realizó utilizando el mismo procedimiento descrito anteriormente para H4Hi232N, pero con perlas H4H2636P reemplazando las perlas H4Hi232N.
En la Tabla i5 se muestra una comparación de los valores de centroide m/z para todos los péptidos detectados en el experimento de intercambio H/D de Fel diB-A-mmH con H4Hi232N. Estos péptidos se identificaron mediante cromatografía líquida- ionización por desorción láser asistida por matriz (LC-MALDl) MS. La mayoría de los péptidos pepsínicos dieron valores de centroides similares (diferencias < 0,3 m/z unidades) tanto para los protocolos de solución activa/perlas inactivas como de perlas activas/perlas inactivas, para cada uno de los dos tiempos de intercambio activo e intercambio inactivo diferentes. Sin embargo, tres péptidos con aminoácidos que abarcan desde 85-i03, 85-i04 hasta i i3 - i27 de Fel diB-A-mmH (SEQ ID NO: 396) tuvieron diferencias en los valores de centroide m/z > 0,3 en los experimentos de 5 minutos y 10 minutos. Las diferencias entre estos valores de centroide del protocolo de solución activa/perlas inactivas y de perlas activas/perlas inactivas se resaltan en negrita en la Tabla 15. Dado que otro péptido, los aminoácidos 117-127 de la SEQ ID NO: 396, no mostraron retención de deuterón después del intercambio inactivo, la región de protección contra el intercambio en el péptido 113-127 puede reducirse a los restos 113-116 de la SEQ ID NO: 396. Las dos regiones, los restos 85-104 (s Eq ID NO: 403) y 113-116 (SEQ ID NO: 426), están protegidas del intercambio inactivo completo como resultado de la unión de H4H1232N a Fel d1B-A-mmH después del intercambio activo. Por lo tanto, estos dos segmentos se definen mediante el método de intercambio h /d como un epítopo discontinuo para la unión del anticuerpo H4H1232N a la proteína Fel d1B-A-mmH.
En la Tabla 16 se muestran las comparaciones de los valores de centroide m/z para todos los péptidos detectados en el experimento de intercambio H/D de Fel d1B-A-mmH que forma complejo con H4H2636P. Solo un péptido, los aminoácidos 15-24 de FELD1B-A-mmH, mostraron un aumento en los valores del centroide m/z > 0,3 m/z para la condición de solución activa/perlas inactivas en comparación con la condición de perlas activas/perlas inactivas, lo que indica que este segmento estaba protegido del intercambio inactivo completo mediante la unión de H4H2636P. Las diferencias de valor del centroide mayores de 0,3 m/z se resaltan en negrita en la Tabla 16. Por lo tanto, los aminoácidos dentro de esta región 15-24 (SEQ ID NO: 412) basados en el método de intercambio H/D incluyen un epítopo para el anticuerpo H4H2636P que se une a la proteína Fel d1B-A-mmH.
Tabla 15: El efecto sobre el intercambio H/D de la unión de H4H1232N a Fel d1B-A-mmH medido por los valores de n r i mz i íni
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Tabla 16: El efecto sobre el intercambio H/D de la unión de H4H2636P a Fel d1B-A-mmH medido por los valores de n r i mz i íni
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continuación
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Ejemplo 9. Generación de anticuerpos biespecíficos
Descripción de los anticuerpos biespecíficos Fel d1 producidos
Los anticuerpos biespecíficos que comprenden dominios de unión de cadena pesada y ligera a partir de pares de algunos de los anticuerpos anti-Fel d1 descritos en la presente invención se construyeron usando metodologías estándar. Los anticuerpos anti-Fel d1 utilizados para construir los anticuerpos biespecíficos de este ejemplo se obtuvieron mediante la inmunización de un ratón Veloclmmune® con un inmunógeno primario, tal como Fel d1 natural de longitud completa, que se puede comprar comercialmente (por ejemplo, de Indoor Biotechnologies, n.° LTN-FD1-1), o aislarse del pelo o caspa de gato mediante cromatografía en columna de múltiples etapas (Véase, por ejemplo, Chapman MD, et al. (1988), J. Immunol. 140:812-818), o que puede producirse de manera recombinante (Véanse los números de registro de GenBank P30438 o NP_001041618.1 para la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena 1 de Fel d1 (también denominada cadena A o FELD1 A; véase también la SEQ ID NO: 392) y el número de registro de GenBank P30440, o NP_001041619.1 para la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la cadena 2 de Fel d1 (también denominada cadena B o FELD B; véase también la SEQ ID NO: 393), o fragmentos de la cadena 1 o la cadena 2, o fragmentos de la cadena 1 y la cadena 2 de la proteína Fel d1, seguido de inmunización con un inmunógeno secundario, o con un fragmento inmunogénicamente activo de la proteína natural. En una realización, el inmunógeno utilizado se ejemplifica en la SEQ ID NO: 394 (fusión en línea de la cadena 2 de Fel d1-cadena 1-mFc) o SEQ ID NO: 395 (fusión de la cadena 1 de Fel d1 usando un enlazador y cadena 2 - mFc).
Los anticuerpos biespecíficos producidos de acuerdo con el presente Ejemplo comprenden dos dominios de unión a antígeno (es decir, "brazos de unión 1 y 2").
Uno de los anticuerpos biespecíficos, denominado H4H3467D, comprende una cadena ligera kappa común en ambos brazos Fab, procedente del anticuerpo H4H2864P (SEQ ID NO: 378). Un brazo Fab de H4H3467D utiliza la región variable de cadena pesada (Vh) del anticuerpo H4H2864P (SEQ ID NO: 370), mientras que el otro brazo Fab utiliza la región Vh de H4H1232N (SEQ ID NO: 18).
Un segundo anticuerpo biespecífico de la invención, denominado H4H8751 D, comprende una cadena ligera kappa común en ambos brazos Fab, procedente del anticuerpo H4H2636P (SEQ ID NO: 314). Un brazo Fab de H4H8751 D utiliza la región Vh de FI4H2636P (SEQ ID NO: 306), mientras que el otro brazo Fab utiliza la región Vh de FI4H1232N (SEQ ID NO: 18).
La Tabla 17 a continuación proporciona las partes componentes de los dominios de unión a antígeno de los dos anticuerpos biespecíficos hechos de acuerdo con el Ejemplo 9. Los identificadores de secuencia de aminoácidos para las diversas regiones variables de cadena pesada y ligera procedentes de los anticuerpos parentales (utilizados para preparar los anticuerpos biespecíficos) también se proporcionan en la Tabla 17.
T l 1 P r m n n l r z l n i r i ífi r i
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Las tablas 18A y 18B a continuación establecen los identificadores de secuencia de aminoácidos para las diversas regiones variables de cadena pesada (Tabla 18A) y las regiones variables de cadena ligera (Tabla 18B) y sus correspondientes secuencias de región determinante de complementariedad (CDR) para los dos anticuerpos biespecíficos descritos en el presente documento.
T l 1 A I n ifi r n i H R H DR r n i r i ífi r i
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Tabla 18B. Identificadores de secuencia de LCVR LCDR ara anticuer os bies ecíficos roducidos
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Análisis Biacore de anticuerpos biespecíficos para determinar los valores de asociación y disociación
Se determinaron las constantes de velocidad de asociación y de disociación de unión (ka y kd, respectivamente), las constantes de disociación en equilibrio y las semividas de disociación (Kd y ty, respectivamente) para la unión de la Fel d1 natural (posteriormente denominada nFel d1) a los anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos anti-Fel d1 purificados, utilizando un ensayo de biosensor de resonancia de plasmón superficial en tiempo real en un instrumento Biacore 2000. En un chip CM5, utilizando la química EDC-NHS, la superficie del sensor Biacore se derivatizó con un anticuerpo monoclonal de ratón anti-Fc humano (GE, n.° BR-1008-39) para capturar anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos anti-Fel d1. Todos los estudios de unión de Biacore se realizaron a 25 °C en tampón de ejecución HBSP+ (HEPES 0,01 M pH 7,4, NaCI 0,15 M, CaCb 3 mM, MgCl 23 mM, Tensioactivo P20 al 0,05 % v/v). Se inyectaron diferentes concentraciones de nFel d1 (Indoor Biotech, n.° NA-FD1-2) (que varían desde 600 nM a 2,34 nM, diluciones de 6 veces) preparadas en tampón de ejecución HBSP+ sobre la superficie capturada con anticuerpo anti-Fel d1 a un caudal de 50 ml/min. La asociación de nFel d1 a los anticuerpos monoclonales capturados se controló durante 4 minutos y la disociación de nFel d1 en tampón de ejecución HBSP+ se controló durante 7 minutos. Las constantes de velocidad de asociación cinética (ka) y disociación (kd) se determinaron ajustando los sensorgramas en tiempo real a un modelo de unión 1:1 con limitación de transporte de masa utilizando el programa informático de ajuste de curvas Scrubber 2.0c. Las constantes en equilibrio de disociación de unión (Kd) y las semividas disociativas (ty) se calcularon luego a partir de las constantes de velocidad cinéticas como: Kd (M) = kd/ka y ty2 (min) = [In2/(60*kd)].
La cinética de unión de la unión de nFel d1 a diferentes anticuerpos monoespecíficos y biespecíficos anti-Fel d1 a 25 °C se muestra en la Tabla 19. Los tres anticuerpos monoespecíficos anti-Fel d1 se unen a nFel d1 con valores de Kd que varían de 155 pM a 1,6 nM. Los dos anticuerpos biespecíficos anti-Fel d1, H4H3467D y H4H8751 D, se unieron a nFel d1 con valores de Kd de 250 pM y 347 pM respectivamente.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al alérgeno Fel d1 de gato, en donde:
el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno comprende: (i) una HCVR que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 306; y (ii) una LCVR que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 314;
y en donde el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno es un isotipo distinto de un isotipo IgA.
2. El anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo de la reivindicación 1 que tiene un isotipo seleccionado del grupo que consiste en una lgG1, una lgG2 y una lgG4.
3. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más anticuerpos monoclonales humanos aislados, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la reivindicación 1 o 2, que se unen específicamente a Fel d1, junto con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables.
4. La composición farmacéutica de la reivindicación 3, que comprende además un segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1.
5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde:
(i) el segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138, 162/170, 322/330 y 370/378;
(ii) el segundo anticuerpo monoclonal humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26 y 322/330;
(iii) el segundo anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 66/74;
(iv) el segundo anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 130/138;
(v) el segundo anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 322/330;
(vi) el segundo anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 18/26; o
(vii) el segundo anticuerpo monoclonal humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a Fel d1, comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR que consiste en las SEQ ID NO: 370/378.
6. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, que comprende dos o más anticuerpos monoclonales humanos aislados que se unen específicamente a Fel d1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, en donde el segundo anticuerpo humano aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a Fel d1, comprende un par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 18/26, 66/74, 130/138 y 162/170.
7. Una molécula de ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal humano, o un fragmento del mismo que se une específicamente a Fel d1, de acuerdo con la reivindicación 1 o 2; un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico; o una célula hospedadora que contiene el vector de expresión.
8. Una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos monoclonales humanos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos que se unen específicamente a Fel d1, de acuerdo con la reivindicación 1 o 2; o una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos monoclonales humanos aislados o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a Fel d1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-6, para su uso en un método para tratar:
(a) un paciente que muestra una sensibilidad a, o una reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo, o a la proteína Fel d1, comprendiendo dicho método administrar el anticuerpo, fragmento del mismo o composición farmacéutica a un paciente que lo necesita, en donde la sensibilidad a, o una reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo o a la proteína Fel d1 se evita o disminuye en gravedad y/o duración, o que la gravedad de la sensibilidad a, o la reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo o a la proteína Fel d1 se reduce después de la administración de uno o más de los anticuerpos monoclonales humanos aislados o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a Fel d1, o después de la administración de una composición que comprende uno cualquiera o más de los anticuerpos anteriores; o
(b) al menos un síntoma o complicación asociada con una sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo, o a la proteína Fel d1, comprendiendo dicho método administrar el anticuerpo, fragmento del mismo o composición farmacéutica a un paciente que lo necesita, en donde al menos un síntoma o complicación asociada con una sensibilidad a, o reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo o a la proteína Fel d1 se evita o mejora o que la frecuencia y/o duración de, o la gravedad de la sensibilidad a, o la reacción alérgica a, un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo o a la proteína Fel d1 se reduce después de la administración de uno o más de los anticuerpos monoclonales humanos aislados o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a Fel d1, o después de la administración de una composición que comprende uno cualquiera o más de los anticuerpos anteriores.
9. El uno o más anticuerpos monoclonales humanos aislados o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, o composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos monoclonales humanos aislados o fragmentos de los mismos que se unen específicamente a Fel d1, para su uso de acuerdo con el método (a) o (b) de la reivindicación 8:
(a) en donde dicho método comprende además administrar una cantidad eficaz de un segundo agente terapéutico útil para disminuir una reacción alérgica a un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo, o a la proteína Fel d1, en donde, opcionalmente, el segundo agente terapéutico se selecciona del grupo que consiste en un corticoesteroide, un dilatador bronquial, un antihistamínico, epinefrina, un descongestionante, otro anticuerpo diferente contra Fel d1 y una vacuna peptídica; y/o
(b) en donde el tratamiento da como resultado una reducción de la rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, asma alérgica o una respuesta anafiláctica después de la exposición del paciente a un gato, caspa de gato, pelo de gato o un extracto del mismo, o a la proteína Fel d1.
10. La composición farmacéutica de la reivindicación 3 que comprende dos o más anticuerpos monoclonales humanos aislados que se unen específicamente a Fel d1, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, en donde el primer anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende el par de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR de la SEQ ID NO: 306/314, y en donde el uno o más anticuerpos humanos adicionales o fragmentos de unión a antígeno de los mismos comprenden los pares de secuencias de aminoácidos de HCVR/LCVR seleccionados del grupo que consiste en las SEQ iD NO: 18/26, 66/74, 130/138 y 162/170.
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