KR20240058201A - 항체 이질성을 제어하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 배양 pCO2를 제어함으로써 세포 배양물, 특히 포유동물 세포 배양물에서 생산된 Fc-함유 단백질, 예컨대 항체의 이질성을 제어하는 방법뿐만 아니라, 이러한 방법에 의해 생산된 산물을 제공한다. 무엇보다도, 본 발명은 항체 산물 내 산성 전하 변이체의 비율을 낮추는 것을 제공한다. Fc 모이어티를 포함하는 단백질은 Fc-함유 단백질, 예컨대 항체 및 항체 유도체 및 둘 모두의 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
Description
본 출원은 2021년 9월 20일에 출원된 미국 출원 일련 번호 제63/246,047호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 참조로 본원에 포함된다.
기술분야
본 발명은 세포 배양물, 특히 포유동물 세포 배양물에서 생산된 Fc-함유 단백질의 이질성을 제어하는 방법뿐만 아니라 이러한 방법에 의해 생산된 단백질 산물 및 단백질을 제공한다. Fc 모이어티를 포함하는 단백질은 Fc-함유 단백질, 예컨대 항체를 포함한다.
세포 배양물에서 Fc-함유 단백질, 예컨대 항체의 생산은 산성 변이체 및 염기성 변이체로 지칭되는 2개의 유형으로 나타나는 전하 변이체를 생성할 수 있다. 또한, 주요 피크 형태가 있다. Fc는 "결정화 가능한 단편(fragment crystallizable)"을 지칭하는데, 이는 자연에서 발견되는 바와 같이 항체 중쇄에서 발견되는 불변 영역이며, 예를 들어 단일클론 항체에도 포함되어 있다.
산성 변이체는 전형적으로 항체에서 염기성 변이체보다 더 보편화되어 있으며 탈아미드화, 시알릴화, 당화 및 단편화를 초래할 수 있는데, 이는 Fc 모이어티 (항체의 결정화 가능한 단편 영역으로부터의 부분)을 포함하는 단백질의 안정성, 활성 및 효능을 변경한다. Sissolak 등, J. Indust . Microbiol . Biotech. 46: 1167-78 (2019). 염기성 변이체는 Fc 수용체에 대한 항체의 결합 증가를 초래할 수 있다. Hintersteiner 등, MABS 8: 1458-60 (2016).
Fc 글리칸은 또한 안정성, 생체활성, 약력학 및 약동학에서 역할을 한다. Reusch 및 Tejada, Glycobiol . 25: 1325-34 (2015). 발생할 수 있는 현상은 비글리코실화된 중쇄 (non-glycosylated heavy chain, NGHC)로 알려져 있다. NGHC 변이는 이펙터 기능, 예컨대 옵소닌화를 변경할 수 있다. 옵소닌화는 ADCC (항체-의존성 세포 독성), ADCP (항체-의존성 세포 식균작용) 및 CDC (보체-의존성 세포 독성)에 관여하는 Fc 부분과 관련이 있다. NGHC 변이는 일부 상황 (질환 상태, 투여 경로 및 Fc-함유 단백질의 유형에 따름)에서 문제가 될 수 있으며, 다른 상황에서는 덜 중요할 수 있다.
이에 따라, Fc 모이어티를 포함하는 단백질에서 전하 변이 및/또는 NGHC를 제어할 필요성이 존재한다. 그러나 이는 한 가지를 최적화하는 것이, 항상 그렇지는 않지만, 하기에서 더 자세히 논의되는 바와 같이, 다른 하나에 있어서는 덜 유리한 상태로 이어질 수 있는 상황을 발생시킬 수 있다. 항체에서 산성 전하 변이체의 영향으로 인해 일반적으로 이러한 변이체의 발생을 줄이고자 하는 바람이 있다. 궁극적으로, 전하 변이는 일부 상황 (질환 상태, 투여 경로 및 Fc-함유 단백질 유형에 따름)에서 문제가 될 수 있으며, 다른 상황에서는 덜 중요할 수 있다. 하기에 기술되는 본 발명은 이러한 요구와 다른 요구들을 해결한다.
본 발명은 배양물에서 포유동물 세포에 의해 생산된 Fc-함유 단백질, 예컨대 항체의 이질성을 제어하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 Fc-함유 단백질을 생산하는 포유동물 세포를 배지에 시딩하는 단계; 및 포유동물 세포가 Fc-함유 단백질을 생산할 수 있도록 하는 pCO2 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, CO2 분사는 배양물에서 pCO2를 증가시키는 데 사용된다. 또 다른 접근 방식은 pCO2 가 축적되도록 하고 공기 분사를 통해 제어되도록 하는 것이다. 생물반응기 내 압력 감소는 또한 pCO2를 제어하는 데에도 사용될 수 있다. CO2 분사, 공기/질소 분사 및 압력 감소의 조합이 이용될 수 있다. 전하 변이체는 주로 Fc 영역의 변경으로 인한 것이다.
통상의 기술자의 목적에 따라, 본원에 내포된 교시를 고려하여 CO2 분사, 공기/질소 분사 및 압력 감소의 조합이 이용될 수 있다.
본 발명은 또한 배양물에서 포유동물 세포에 의해 생산된 Fc-함유 단백질 산물, 예컨대 항체 내 산성 전하 변이체의 비율을 제어하고, 바람직하게는 감소시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 Fc-함유 단백질을 생산하는 포유동물 세포를 배지에 배양하는 단계; 및 포유동물 세포가 pCO2 조건 없이 얻을 수 있는 것보다 덜 산성인 변이체를 갖는 Fc-함유 단백질 산물을 생산할 수 있도록 하는 pCO2 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 여기서 pCO2 조건은 예를 들어, 배지에서 또는 본원에 달리 기술된 바와 같이 CO2 120 mmHg 내지 140 mmHg이다. pCO2 조건은 분사, 예컨대 CO2 분사에 의해 달성될 수 있다. 전하 변이체는 Fc 영역의 변경으로 인해 발생할 수 있다. pCO2 조건 하에서 생산된 Fc-함유 단백질은 예를 들어 pCO2 조건 없이 얻을 수 있는 것보다 0.5% 내지 4% 덜 산성인 변이체를 가질 수 있다. Fc-함유 단백질은 PD-1 인자 또는 IL-4 수용체에 결합할 수 있는 항체와 같은 항체일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간 단일클론 항체, 바람직하게는 IgG1 및 IgG4와 같은 서브클래스를 포함하는 IgG 항체이다. 포유동물 세포는 예를 들어, CHO, BHK, HEK293, HeLa, 인간 양막 (Human Amniotic), Per.C6 및 Sp2/0 세포일 수 있다. 세포는 본원에 개시된 다양한 pCO2 조건 하에서 10 내지 15일, 바람직하게는 약 14일 동안 배양될 수 있다.
본 발명은 Fc-함유 단백질, 예컨대 항체를 생산하는 포유동물 세포를 배지에 시딩하는 단계; 및 포유동물 세포가 Fc-함유 단백질을 생산할 수 있도록 하는 pCO2 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 제공하며, 여기서 세포에 의해 생산된 Fc-함유 단백질의 주요 피크 형태는 항체, 유도체 및 둘 모두의 단편일 수 있는 전체 Fc-함유 단백질의 약 38% 내지 약 65%를 포함하고, Fc-함유 단백질의 산성 변이체는 전체 Fc-함유 단백질의 약 20% 내지 약 47%를 포함하고, Fc-함유 단백질의 염기성 변이체는 전체 Fc-함유 단백질의 최대 약 36%를 포함한다. 세포는 약 10 내지 15일, 바람직하게는 약 14일 동안 배양될 수 있다. pCO2 조건은 배양 중에 약 30 mmHg 내지 약 210 mmHg, 50 mmHg 내지 200 mmHg, 60 mmHg 내지 190 mmHg, 70 mmHg 내지 180 mmHg, 80 mmHg 내지 170 mmHg, 90 mmHg 내지 160 mmHg, 100 mmHg 내지 150 mmHg, 110 mmHg 내지 140 mmHg, 120 mmHg 내지 140 mmHg, 120 mmHg 내지 130 mmHg 또는 이러한 범위 내의 임의의 값일 수 있으며, 이는 바람직하게는 CO2 분사에 의해 유지되고 CO2 전극을 사용하여 측정될 수 있다. 세포는 CHO, BHK, HEK293, HeLa, 인간 양막, Per.C6 및 Sp2/0 세포를 포함한 임의의 적합한 포유동물 세포일 수 있다.
Fc-함유 단백질은 PD-1 인자 또는 IL-4 수용체에 결합할 수 있는 항체와 같은 항체일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간 단일클론 항체, 바람직하게는 IgG1 및 IgG4와 같은 서브클래스를 포함하는 모든 IgG 항체이다.
본 발명은 또한 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 생산하는 포유동물 세포를 배지에 시딩하는 단계; 및 포유동물 세포가 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 생산할 수 있도록 하는 pCO2 조건 하에서 세포를 배양하는 단계에 의해, 배양물에서 포유동물 세포에 의해 생산된 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 이질성을 제어하는 방법을 제공하며, 여기서 세포에 의해 생산된 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 주요 피크 형태는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 약 50% 내지 약 70%를 포함하고, 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 산성 변이체는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 약 20% 내지 약 47%를 포함하고, 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 염기성 변이체는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 최대 약 15%를 포함한다. 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 염기성 변이체는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 최대 약 6%, 약 8% 또는 약 10%, 및 바람직하게는 약 15% 이하를 포함할 수 있다. 세포에 의해 생산된 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 주요 피크 형태는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 약 50% 내지 약 65%를 포함할 수 있고, 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 산성 변이체는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 약 23% 내지 약 46%, 약 23% 내지 약 39% 또는 약 31% 내지 약 46%를 포함한다. 예를 들어, 비글리코실화된 중쇄를 갖는 Fc-함유 단백질, 예컨대 항체의 비율은 약 5 내지 약 7%를 포함하며, 다른 범위가 본원에 제공되어 있다. 세포는 약 10-15일, 바람직하게는 약 14일 동안 배양될 수 있다. pCO2 조건은 배양 중에 약 30 mmHg 내지 약 210 mmHg, 50 mmHg 내지 200 mmHg, 60 mmHg 내지 190 mmHg, 70 mmHg 내지 180 mmHg, 80 mmHg 내지 170 mmHg, 90 mmHg 내지 160 mmHg, 100 mmHg 내지 150 mmHg, 110 mmHg 내지 140 mmHg, 120 mmHg 내지 140 mmHg, 120 mmHg 내지 130 mmHg 또는 이러한 범위 내의 임의의 값일 수 있고, 이는 바람직하게는 CO2 분사에 의해 유지되고 CO2 전극을 사용하여 측정될 수 있다. 본원에 내포된 교시를 고려하여 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같이, pCO2는 CO2 분사, 공기 또는 기타 분사, 및/또는 생물반응기 압력을 변경함으로써 배양 프로세스 중에 변경될 수 있다.
세포는 CHO, BHK, HEK293, HeLa, 인간 양막, Per.C6 및 Sp2/0 세포를 포함한 임의의 적합한 포유동물 세포일 수 있다. 이에 의해 생산된 Fc-함유 단백질, 예컨대 항체, 항체 유도체 및 항체 단편은 본원에 제공된 바와 같은 발명품이다.
Fc-함유 단백질은 PD-1 인자 또는 IL-4 수용체에 결합할 수 있는 항체와 같은 항체일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 인간 단일클론 항체, 바람직하게는 IgG1 및 IgG4와 같은 서브클래스를 포함한 모든 IgG 항체이다.
전형적으로, 본원에 내포된 본 발명의 교시에 따라 생산된 Fc-함유 단백질, 예컨대 항체는 전체 Fc-함유 단백질의 20% 내지 50%, 보다 특히 20% 내지 47%, 23% 내지 45%, 25% 내지 40%, 28% 내지 37%, 28% 내지 35%, 29% 내지 34%, 30% 내지 33% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값을 구성하는 산성 전하 변이체를 가질 것이다. Fc-함유 단백질은 전체 Fc-함유 단백질의 38% 내지 70%, 보다 특히 45% 내지 70%, 50% 내지 65%, 55% 내지 60% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값을 구성하는 주요 피크 형태를 가질 것이다. Fc-함유 단백질은 전체 Fc-함유 단백질의 1% 내지 40%, 보다 특히 2% 내지 35%, 3% 내지 30%, 4% 내지 25%, 5% 내지 20%, 6% 내지 15%, 7% 내지 12%, 7.5% 내지 10%, 8% 내지 9% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값을 구성하는 염기성 전하 변이체를 가질 것이다.
전체 산물의 산성 전하 변이체 분획은 0.1% 내지 10%의 범위 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값에 의해 본 발명에 따라 제어될 수 있고, 바람직하게는 감소될 수 있다. 예를 들어, 표 1 참조. 보다 특히, 산성 변이체 분획은 0.2% 내지 9%, 0.3% 내지 8%, 0.4% 내지 7%, 0.5% 내지 6%, 0.6% 내지 5%, 0.7% 내지 4.75%, 0.75% 내지 4.5%, 0.8% 내지 4.25%. 0.9% 내지 4%, 1% 내지 3.75%. 1% 내지 3.5%, 1% 내지 3.25%, 1% 내지 3%, 1% 내지 2.75%, 1.25% 내지 2.5%, 1.25% 내지 2.25%, 1.25% 내지 2%, 1.5% 내지 2%, 1.5% 내지 1.75% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값으로 낮춰질 수 있다. 추가적으로, 다른 범위에는 0.1% 내지 4%, 0.25% 내지 4%, 0.25% 내지 3.75%, 0.25% 내지 3.5%, 0.25% 내지 3%, 0.25% 내지 2.75%, 0.25% 내지 2.5%, 0.25% 내지 2.25%, 0.25% 내지 2%, 0.25% 내지 1.75%, 0.25% 내지 1.5%, 0.25% 내지 1.25%, 0.25% 내지 1%, 0.25% 내지 0.75%. 0.25% 내지 0.5%, 0.5% 내지 4%, 0.5% 내지 3.75%, 0.5% 내지 3.5%, 0.5% 내지 3%, 0.5% 내지 2.75%, 0.5% 내지 2.5%, 0.5% 내지 2.25%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 1.75%, 0.5% 내지 1.5%, 0.5% 내지 1.25%, 0.5% 내지 1%, 0.5% 내지 0.75%, 0.75% 내지 4%, 0.75% 내지 3.75%, 0.75% 내지 3.5%, 0.75% 내지 3%, 0.75% 내지 2.75%, 0.75% 내지 2.5%, 0.75% 내지 2.25%, 0.75% 내지 2%, 0.75% 내지 1.75%, 0.75% 내지 1.5%, 0.75% 내지 1.25%, 0.75% 내지 1%, 1% 내지 4%, 1% 내지 3.75%, 1% 내지 3.5%, 1% 내지 3%, 1% 내지 2.75%, 1% 내지 2.5%, 1% 내지 2.25%, 1% 내지 2%, 1% 내지 1.75%, 1% 내지 1.5%, 1% 내지 1.25%, 1.25% 내지 4%, 1.25% 내지 3.75%, 1.25% 내지 3.5%, 1.25% 내지 3%, 1.25% 내지 2.75%, 1.25% 내지 2.5%, 1.25% 내지 2.25%, 1.25% 내지 2%, 1.25% 내지 1.75%, 1.25% 내지 1.5% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값이 포함된다. 예를 들어. 산성 전하 변이체 분획은 적어도 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%. 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4.0%, 4.1%, 4.2%, 4.3%, 4.4%, 4.5% 이상, 예컨대 최대 5%, 6%, 7% ,8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% 이상 변경될 수 있고, 바람직하게는 낮춰질 수 있다.
전체 산물의 염기성 전하 변이체 분획은 0.1% 내지 15%의 범위 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값에 의해 본 발명에 따라 제어될 수 있다. 보다 특히, 염기성 전하 변이체 분획은 0.1% 내지 14%, 0.1% 내지 13%, 0.1% 내지 12%, 0.1% 내지 11%, 0.2% 내지 10%, 0.2% 내지 9%, 0.3% 내지 8%, 0.4% 내지 7%, 0.5% 내지 6%, 0.6% 내지 5%, 0.7% 내지 4.75%, 0.75% 내지 4.5%, 0.8% 내지 4.25%. 0.9% 내지 4%, 1% 내지 3.75%. 1% 내지 3.5%, 1% 내지 3.25%, 1% 내지 3%, 1% 내지 2.75%, 1% 내지 2.75%, 1.25% 내지 2.5%, 1.25% 내지 2.25%, 1.25% 내지 2%, 1.5% 내지 2%, 1.5% 내지 1.75% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값으로 변경될 수 있다. 추가적으로, 다른 범위에는 0.1% 내지 4%, 0.25% 내지 4%, 0.25% 내지 3.75%, 0.25% 내지 3.5%, 0.25% 내지 3%, 0.25% 내지 2.75%, 0.25% 내지 2.5%, 0.25% 내지 2.25%, 0.25% 내지 2%, 0.25% 내지 1.75%, 0.25% 내지 1.5%, 0.25% 내지 1.25%, 0.25% 내지 1%, 0.25% 내지 0.75%. 0.25% 내지 0.5%, 0.5% 내지 4%, 0.5% 내지 3.75%, 0.5% 내지 3.5%, 0.5% 내지 3%, 0.5% 내지 2.75%, 0.5% 내지 2.5%, 0.5% 내지 2.25%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 1.75%, 0.5% 내지 1.5%, 0.5% 내지 1.25%, 0.5% 내지 1%, 0.5% 내지 0.75%, 0.75% 내지 4%, 0.75% 내지 3.75%, 0.75% 내지 3.5%, 0.75% 내지 3%, 0.75% 내지 2.75%, 0.75% 내지 2.5%, 0.75% 내지 2.25%, 0.75% 내지 2%, 0.75% 내지 1.75%, 0.75% 내지 1.5%, 0.75% 내지 1.25%, 0.75% 내지 1%, 1% 내지 4%, 1% 내지 3.75%, 1% 내지 3.5%, 1% 내지 3%, 1% 내지 2.75%, 1% 내지 2.5%, 1% 내지 2.25%, 1% 내지 2%, 1% 내지 1.75%, 1% 내지 1.5%, 1% 내지 1.25%, 1.25% 내지 4%, 1.25% 내지 3.75%, 1.25% 내지 3.5%, 1.25% 내지 3%, 1.25% 내지 2.75%, 1.25% 내지 2.5%, 1.25% 내지 2.25%, 1.25% 내지 2%, 1.25% 내지 1.75%, 1.25% 내지 1.5% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값이 포함된다. 염기성 전하 변이체 분획은 적어도 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%. 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4.0%, 4.1%, 4.2%, 4.3%, 4.4%, 4.5% 이상, 예컨대 최대 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% 이상 변경될 수 있다.
본원에 내포된 본 발명의 교시에 따라 생산된 Fc-함유 단백질, 예컨대 항체는 전형적으로 전체 Fc-함유 단백질의 3% 내지 8%, 보다 특히 4% 내지 7%, 5% 내지 7% 및 5% 내지 6.5%, 5% 내지 6%, 5% 내지 5.75%, 5% 내지 5.5% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값에 존재하는 비글리코실화된 중쇄 (NGHC)의 비율을 가질 것이다.
본 발명의 방법에 의해 생산된 Fc-함유 단백질, 예컨대 항체, 및 Fc-함유 단백질의 유도체 및 단편 또한 본원에 제공된 본 발명의 일부이다. 항체는 PD-1 인자에 결합할 수 있는 항체 및 인터루킨 4 수용체에 결합할 수 있는 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
도 1은 실시예 1 및 3의 pCO2 수준을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 2는 실시예 2 및 4의 pCO2 수준을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 3은 표 6에 제시된 공기 분사 및 pH 조건에서 2리터 생물반응기의 생산일 중에 예측된 pH 수준을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 4는 실제 영역 1 (%)(y-축) 및 예측된 영역 1 (%)(x-축)을 도시한다. 영역 1은 산성 전하 변이체에 대한 것이다.
도 5는 도 4의 데이터의 적합성 요약, 분산 분석 및 매개변수 추정치를 설정한 것이다.
도 6은 실제 영역 2 (%)(y-축) 및 예측된 영역 2 (%) (x-축)를 도시한다. 영역 2는 주요 피크 형태에 대한 것이다.
도 7은 도 6의 데이터의 적합성 요약, 분산 분석 및 매개변수 추정치를 설정한 것이다.
도 8은 실제 영역 3 (%) (y-축) 및 예측된 영역 3 (%) (x-축)을 도시한다. 영역 3은 염기성 전하 변이체에 대한 것이다.
도 9는 도 8의 데이터에 대한 적합성 요약, 분산 분석 및 매개변수 추정치를 설정한 것이다.
도 10은 실제 NGHC (y-축) 및 예측된 NGHC (x-축)를 도시한다.
도 11은 도 10의 데이터의 적합성 요약, 분산 분석 및 매개변수 추정치정치를 설정한 것이다.
도 12는 프로세스 시간 (일)에 걸친 생존 세포 밀도 값을 도시한다. y-축은 최대 350 x 105 세포/ml 값을 갖는다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 13은 프로세스 시간 (일)에 걸친 세포 생존율 비율을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 14는 프로세스 시간 (일)에 걸친 pH 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 15는 프로세스 시간 (일)에 걸친 pCO2 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 16은 프로세스 시간 (일)에 걸친 글루코오스 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 17은 프로세스 시간 (일)에 걸친 칼륨 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 18은 프로세스 시간 (일)에 걸친 나트륨 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 19는 프로세스 시간 (일)에 걸친 오스몰농도 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 20은 프로세스 시간 (일)에 걸친 글루타메이트 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 21은 프로세스 시간 (일)에 걸친 락테이트 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 22는 프로세스 시간 (일)에 걸친 암모니아 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 23은 프로세스 시간 (일)에 걸친 글루타민 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 24는 실시예 6으로부터 프로세스 시간 (일)에 걸친 mmHg의 pCO2 (y-축)을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다. TEMP는 본원에 기술된 바와 같은 세포의 생리학적 온도를 지칭한다.
도 2는 실시예 2 및 4의 pCO2 수준을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 3은 표 6에 제시된 공기 분사 및 pH 조건에서 2리터 생물반응기의 생산일 중에 예측된 pH 수준을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 4는 실제 영역 1 (%)(y-축) 및 예측된 영역 1 (%)(x-축)을 도시한다. 영역 1은 산성 전하 변이체에 대한 것이다.
도 5는 도 4의 데이터의 적합성 요약, 분산 분석 및 매개변수 추정치를 설정한 것이다.
도 6은 실제 영역 2 (%)(y-축) 및 예측된 영역 2 (%) (x-축)를 도시한다. 영역 2는 주요 피크 형태에 대한 것이다.
도 7은 도 6의 데이터의 적합성 요약, 분산 분석 및 매개변수 추정치를 설정한 것이다.
도 8은 실제 영역 3 (%) (y-축) 및 예측된 영역 3 (%) (x-축)을 도시한다. 영역 3은 염기성 전하 변이체에 대한 것이다.
도 9는 도 8의 데이터에 대한 적합성 요약, 분산 분석 및 매개변수 추정치를 설정한 것이다.
도 10은 실제 NGHC (y-축) 및 예측된 NGHC (x-축)를 도시한다.
도 11은 도 10의 데이터의 적합성 요약, 분산 분석 및 매개변수 추정치정치를 설정한 것이다.
도 12는 프로세스 시간 (일)에 걸친 생존 세포 밀도 값을 도시한다. y-축은 최대 350 x 105 세포/ml 값을 갖는다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 13은 프로세스 시간 (일)에 걸친 세포 생존율 비율을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 14는 프로세스 시간 (일)에 걸친 pH 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 15는 프로세스 시간 (일)에 걸친 pCO2 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 16은 프로세스 시간 (일)에 걸친 글루코오스 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 17은 프로세스 시간 (일)에 걸친 칼륨 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 18은 프로세스 시간 (일)에 걸친 나트륨 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 19는 프로세스 시간 (일)에 걸친 오스몰농도 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 20은 프로세스 시간 (일)에 걸친 글루타메이트 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 21은 프로세스 시간 (일)에 걸친 락테이트 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 22는 프로세스 시간 (일)에 걸친 암모니아 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 23은 프로세스 시간 (일)에 걸친 글루타민 값을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다.
도 24는 실시예 6으로부터 프로세스 시간 (일)에 걸친 mmHg의 pCO2 (y-축)을 도시한다. 중간점 대조군으로서 중간 pCO2를 선택하였다. TEMP는 본원에 기술된 바와 같은 세포의 생리학적 온도를 지칭한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 숙련된 기술자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다.
정의
수치 값 및 범위의 맥락에서 용어 "약"은 본 발명이 본원에 내포된 교시로부터 명백한 바와 같이 추구하는 속도, 양, 밀도, 정도, 증가, 감소, 비율, 값 또는 형태의 존재, 변이, 온도 또는 시간의 양과 같은 것을 수행할 수 있도록 하는 언급된 값 또는 범위에 가깝거나 근접한 값 또는 범위를 지칭한다. 이에 따라, 이 용어는 단순히 체계적 오류로 인해 발생하는 값 이상의 값을 포함한다. 예를 들어, "약"은 수행 능력에 따라 대략 +/- 10% 이상 또는 그 이하의 범위에서 명시된 값보다 높거나 낮은 값을 의미할 수 있다.
"항체" ("면역글로불린"으로도 지칭됨)는 다중 폴리펩타이드 사슬 및 광범위한 번역 후 변형을 갖는 단백질의 예이다. 표준 면역글로불린 단백질 (예를 들어, IgG)은 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 이루어진 4개의 폴리펩타이드 사슬을 포함한다. 각 경쇄는 시스테인 이황화 결합을 통해 1개의 중쇄에 결합되고, 2개의 중쇄는 2개의 시스테인 이황화 결합을 통해 서로 결합된다. 포유동물 시스템에서 생산된 면역글로불린은 또한 다양한 다당류로 다양한 잔기 (예를 들어, 아스파라긴 잔기)에서 글리코실화되어 있으며, 종마다 다를 수 있고, 이는 치료용 항체의 항원성에 영향을 미칠 수 있다. Butler 및 Spearman, "The choice of mammalian cell host and possibilities for glycosylation engineering", Curr . Opin. Biotech. 30:107-112 (2014).
항체는 종종 치료용 생체분자로서 사용된다. 항체는 이황화 결합에 의해 상호 연결된 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)로 이루어진 4개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 면역글로불린 분자를 포함한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는 더욱 보존된 영역이 산재된 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변성 영역으로 추가로 세분화될 수 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카르복시-말단까지 다음의 순서로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 약칭될 수 있고; 경쇄 CDR은 LCDRl, LCDR2 및 LCDR3으로 약칭될 수 있음). 용어 "고친화성" 항체는 표면 플라즈몬 공명, 예를 들어, BIACORE™ 또는 용액-친화성 ELISA로 측정된 바와 같이 이들의 표적에 대해 적어도 10-9 M, 적어도 10-10 M; 적어도 10-11 M; 또는 적어도 10-12 M의 결합 친화성을 갖는 항체를 지칭한다.
"산성 전하 변이체"는 Fc-함유 단백질의 주요 피크 형태보다 더 낮은 pI를 갖는 Fc-함유 단백질 (예를 들어, 항체) 변이체이다. 산성 전하 변이체는 더 많은 음전하를 갖는 경향이 있다.
"염기성 전하 변이체"는 Fc-함유 단백질의 주요 피크 형태보다 더 높은 pI를 갖는 Fc-함유 단백질 (예를 들어, 항체) 변이체이다. 염기성 전하 변이체는 더 많은 양전하 또는 더 적은 음전하를 갖는 경향이 있다.
Fc-함유 단백질 (예를 들어, 항체)의 "주요 피크 형태"는 Fc-함유 단백질의 주요 형태이며, 산성 전하 변이체와 염기성 전하 변이체 사이에 pI을 갖는다.
문구 "이중특이성 항체"는 2개 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 항체를 포함한다. 이중특이성 항체는 일반적으로 2개의 서로 다른 중쇄를 포함하며, 여기서 각 중쇄는 2개의 서로 다른 분자 (예를 들어, 항원) 또는 동일한 분자 (예를 들어, 동일한 항원)의 서로 다른 에피토프에 특이적으로 결합한다. 이중특이성 항체가 2개의 서로 다른 에피토프 (제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합할 수 있는 경우, 제1 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화성은 일반적으로 제2 에피토프에 대한 제1 중쇄의 친화성보다 적어도 1 내지 2, 3 또는 4 자릿수가 더 낮을 것이며 그 반대도 마찬가지이다. 이중특이성 항체에 의해 인식되는 에피토프는 동일하거나 서로 다른 표적 (예를 들어, 동일하거나 서로 다른 단백질)에 있을 수 있다. 이중특이성 항체는 예를 들어, 동일한 항원의 서로 다른 에피토프를 인식하는 중쇄를 조합함으로써 만들어질 수 있다. 예를 들어, 동일한 항원의 서로 다른 에피토프를 인식하는 중쇄 가변 서열을 인코딩하는 핵산 서열은 서로 다른 중쇄 불변 영역을 인코딩하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중특이성 항체는 각각 3개의 중쇄 CDR을 갖는 2개의 중쇄, 이어서 (N-말단에서 C-말단까지) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인, 및 항원-결합 특이성을 부여하지 않지만 각 중쇄에 결합할 수 있거나, 각 중쇄와 결합할 수 있고 중쇄 항원-결합 영역에 의해 결합된 에피토프 중 하나 이상에 결합할 수 있거나, 각 중쇄와 결합하여 중쇄 중 하나 또는 둘 모두를 하나 또는 둘 모두의 에피토프에 결합시킬 수 있는 면역글로불린 경쇄를 갖는다.
문구 "중쇄" 또는 "면역글로불린 중쇄"는 임의의 유기체로부터의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하며, 달리 명시하지 않는 한 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 중쇄 가변 도메인은 달리 명시하지 않는 한 3개의 중쇄 CDR 및 4개의 FR 영역을 포함한다. 중쇄의 단편은 CDR, CDR 및 FR, 및 이들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 가변 도메인 뒤에 (N-말단에서 C-말단까지), CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인을 갖는다. 중쇄의 기능성 단편은 항원을 특이적으로 인식 (예를 들어, 마이크로몰, 나노몰 또는 피코몰 범위의 KD로 항원을 인식)할 수 있고, 세포로부터 발현 및 분비될 수 있으며, 적어도 1개의 CDR을 포함하는 단편을 포함한다.
문구 "경쇄"는 임의의 유기체로부터의 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열을 포함하며, 달리 명시하지 않는 한 인간 카파 및 람다 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 (VL) 도메인은 전형적으로 달리 명시하지 않는 한 3개의 경쇄 CDR 및 4개의 프레임워크 (FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전장 경쇄는 아미노 말단에서 카르복실 말단까지 FR1-CDR1- FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4을 포함하는 VL 도메인 및 경쇄 불변 도메인을 포함한다. 이러한 본 발명에 사용될 수 있는 경쇄는 예를 들어, 항원-결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 제1 항원 또는 제2 항원에 선택적으로 결합하지 않는 경쇄를 포함한다. 적합한 경쇄에는 기존 항체 라이브러리 (습식 라이브러리 또는 인실리코 (in silico))에서 가장 흔히 이용되는 경쇄를 스크리닝함으로써 식별될 수 있는 것들이 포함되며, 여기서 경쇄는 항원-결합 단백질의 항원-결합 도메인의 친화성 및/또는 선택성을 실질적으로 방해하지 않는다. 적합한 경쇄에는 항원-결합 단백질의 항원-결합 영역에 의해 결합된 하나 또는 둘 모두의 에피토프에 결합할 수 있는 것들이 포함된다.
문구 "가변 도메인"은 N-말단에서 C-말단까지 순서대로 (달리 명시하지 않는 한) 다음의 아미노산 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄 또는 중쇄 (원하는 대로 변형됨)의 아미노산 서열을 포함한다: FRl, CDRl, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. "가변 도메인"은 이중 베타 시트 구조를 갖는 표준 도메인 (VH 또는 VL)으로 접힐 수 있는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 베타 시트는 제1 베타 시트의 잔기와 제2 베타 시트 사이의 이황화 결합에 의해 연결된다.
문구 "상보성 결정 영역" 또는 용어 "CDR"은 면역글로불린 분자 (예를 들어, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역에 있는 2개의 프레임워크 영역 사이에서 일반적으로 (즉, 야생형 유기체에서) 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 인코딩된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은 예를 들어, 배선 서열 또는 재배열되거나 재배열되지 않은 서열, 및 예를 들어 순수 또는 성숙 B 세포 또는 T 세포에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 상황에서 (예를 들어, CDR3의 경우), CDR은 예를 들어 서열을 스플라이싱하거나 연결한 결과 (예를 들어, 중쇄 CDR3을 형성하는 V-D-J 재조합)로 인해 (예를 들어, 재배열되지 않은 핵산 서열에서는) 인접하지 않지만 B 세포 핵산 서열에서는 인접하는 2개 이상의 서열 (예를 들어, 배선 서열)에 의해 인코딩될 수 있다.
"항체 유도체 및 단편"에는 항체 단편 (예를 들어, ScFv-Fc, dAB-Fc, 절반 항체), 다중특이성 (예를 들어, IgG-ScFv, IgG-dab, ScFV-Fc-ScFV, 삼중특이성)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
문구 "Fc-함유 단백질"에는 항체, 이중특이성 항체, Fc를 함유하는 항체 유도체, Fc를 함유하는 항체 단편, Fc-융합 단백질, 면역부착소, 및 면역글로불린 CH2 및 CH3 영역의 적어도 기능성 부분을 포함하는 기타 결합 단백질이 포함된다. "기능성 부분"은 Fc 수용체 (예를 들어, FcyR; 또는 FcRn (신생아 Fc 수용체)에 결합할 수 있고/있거나 보체의 활성화에 참여할 수 있는 CH2 및 CH3 영역을 지칭한다. CH2 및 CH3 영역이 임의의 Fc 수용체에 결합할 수 없고 보체도 활성화할 수 없게 만드는 결실, 치환 및/또는 삽입 또는 기타 변형을 포함하는 경우, CH2 및 CH3 영역은 기능성이 아니다. Fc-융합 단백질은 예를 들어, Fc-융합 (N-말단), Fc-융합 (C-말단), 단일-Fc-융합 및 이중특이성 Fc-융합 단백질을 포함한다.
"Fc"는 결정화 가능한 단편을 나타내고, 종종 단편 상수로 지칭된다. 항체는 2개의 동일한 단백질 서열로 구성된 Fc 영역을 함유한다. IgG는 γ-사슬로 알려진 중쇄를 갖는다. IgA는 α-사슬로 알려진 중쇄를 가지며, IgM은 μ-사슬로 알려진 중쇄를 갖는다. IgD는 ο-사슬로 알려진 중쇄를 갖는다. IgE는 ε-사슬로 알려진 중쇄를 갖는다. 본질적으로, Fc 영역은 동일한 종의 특정 클래스 및 서브클래스의 모든 항체에서 동일하다. 인간 IgG는 4개의 서브클래스를 가지며, 서브클래스 간에 약 95%의 상동성을 공유한다. 각 서브클래스에서, Fc 서열은 동일하다. 예를 들어, 인간 IgG1 항체는 동일한 Fc 서열을 가질 것이다. 마찬가지로, IgG2 항체는 동일한 Fc 서열을 가질 것이고; IgG3 항체는 동일한 Fc 서열을 가질 것이며; IgG4 항체는 동일한 Fc 서열을 가질 것이다. Fc 영역 내 변경은 전하 변이를 생성한다.
Fc-함유 단백질, 예컨대 항체는 변형이 결합 단백질의 1개 이상의 이펙터 기능에 영향을 미치는 경우 (예를 들어, FcyR 결합, FcRn 결합 및 이에 따른 반감기, 및/또는 CDC 활성에 영향을 미치는 변형)를 포함하여 면역글로불린 도메인 내 변형을 포함할 수 있다. 이러한 변형에는 면역글로불린 불변 영역의 EU 넘버링과 관련하여 다음의 변형 및 이들의 조합이 포함되지만 이에 제한되지 않는다: 238, 239, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, 및 439.
예를 들어 및 제한 없이, 결합 단백질은 Fc-함유 단백질 (예를 들어, 항체)이고, (언급된 변형(들)이 없는 동일한 Fc-함유 단백질과 비교하여) 증진된 혈청 반감기를 나타내며, 위치 250 (예를 들어, E 또는 Q); 250 및 428 (예를 들어, L 또는 F); 252 (예를 들어, L/Y/F/W 또는 T), 254 (예를 들어, S 또는 T), 및 256 (예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 428 및/또는 433 (예를 들어, L/R/SI/P/Q 또는 K) 및/또는 434 (예를 들어, H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 307 또는 308 (예를 들어, 308F, V308F) 및 434에서의 변형을 갖는다. 또 다른 예에서, 변형에는 428L (예를 들어, M428L) 및 434S (예를 들어, N434S) 변형; 428L, 2591 (예를 들어, V259I), 및 308F (예를 들어, V308F) 변형; 433K (예를 들어, H433K) 및 434 (예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256 (예를 들어, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (예를 들어, T250Q 및 M428L); 307 및/또는 308 변형 (예를 들어, 308F 또는 308P)이 포함될 수 있다.
"배양 배지들 (배지)"은 수성이고, 생물반응기와 같은 배양물에서 세포의 성장 및 단백질의 생산을 지원하는 데 필요한 미네랄, 완충염, 영양분 및 기타 첨가제를 포함한다.
"피크 생존 세포 밀도" 또는 "피크 VCD"는 배양 중 세포의 피크 밀도를 지칭한다. 도 12 참조.
"분사"는 가스를 배양 배지에 펌핑하는 것을 지칭한다. 가스는 CO2, 공기 또는 기타 가스일 수 있다. CO2 분사는 pCO2를 증가시킬 것이다. 공기 분사 및 질소 분사는 pCO2를 감소시킬 것이다. 분사 속도는 생물반응기의 크기에 따라 결정되고, 소형 생물반응기에서는 전형적으로 분당 입방 센티미터 (ccm)로 측정된다. 상업적 생산에 활용되는 대형 생물반응기 (전형적으로 1,000 내지 10,000 리터)에서, 분사 속도는 분당 표준 리터 (slpm)로 측정된다.
"단백질 산물"은 관심 단백질, 예컨대 Fc-함유 단백질 (예를 들어, 항체)을 지칭한다. 단백질 산물은 배양물에서 세포, 보통 조작된 포유동물 세포에 의해 생산될 수 있다. 전형적으로, 생물반응기에서와 같은 배양물에서 세포는 관심 단백질을 생산할 것이고, 해당 단백질은 단백질 산물이 될 것이다. 단백질 산물은 이후의 정체, 특징화, 멸균, 제형화 및 기타 마무리 단계, 예컨대 농축 또는 동결을 거쳐 최종적으로 패키징되어 최종 단백질 산물을 형성할 수 있다. 단백질 산물은 제형화 약물 물질 (FDS)을 포함한다.
본원에 제시된 모든 수치 한계 및 범위는 그 근처 또는 범위 또는 한계의 수치 사이의 모든 숫자 또는 값을 포함한다. 본원에 기술된 범위 및 한계는 범위 또는 한계에 의해 정의되고 포함되는 모든 정수, 소수 및 분수 값을 명시적으로 지정하고 제시한다.
상세한 설명
항체 전하 변이체는 산성 변이체 및 염기성 변이체를 포함한다. 전하 변이체는 항체의 순 음전하를 증가시키는 탈아미드화 및 시알릴화를 포함한 효소 변형으로 인해 발생할 수 있으며, 이는 pI 값을 감소시키고 산성 변이체를 형성한다. 추가적으로, C-말단으로부터의 라이신 절단은 순 양전하의 손실을 초래하고 산성 변이체의 형성을 유도한다.
산성 변이체는 또한 글루코오스 또는 락토오스가 라이신 잔기의 1차 아민과 반응하는 당화와 같은 공유 결합 모이어티의 생성을 통해 발생할 수 있다.
염기성 변이체의 형성은 C-말단 라이신 또는 글리신 아미드화, 숙신이미드 형성, 아미노산 산화 또는 시알산의 제거의 존재로 인해 발생한다. 이들은 양전하의 추가 또는 음전하의 제거를 제공하고, 그에 따라 pI 값을 증가시킨다. Khawli 등, mAbs 2:6, 613-624 (2010) 참조.
본 발명은 포유동물 세포 배양물에서 생산된 단백질의 전하 변이체 (산성 및 염기성) 및 글리코실화 변이체의 집단을 제어하기 위한 접근 방식을 제공한다. 실시양태에는 항체 및 이의 단편 및 유도체를 포함하는 Fc-함유 단백질의 생산이 포함된다. 본 발명은 생산 중 배지의 이산화탄소 농도 (pCO2)를 선택함으로써 이러한 제어를 허용한다. NGHC 또한 제어될 수 있으나 pH를 통해 제어될 수 있다.
본원에 교시된 바와 같은 pCO2 수준 이외에도, 표준 조건 및 배지가 이용될 수 있다. 전형적으로, 세포는 대략 36℃ 내지 38℃, 바람직하게는 36℃ 내지 37℃의 온도와 같은 생리학적 조건 하에서 배양될 것이다.
전형적으로, 본원에 내포된 본 발명의 교시에 따라 생산된 Fc-함유 단백질 (예를 들어, 항체)은 전체 Fc-함유 단백질의 20% 내지 50%, 보다 특히 20% 내지 47%, 23% 내지 45%, 25% 내지 40%, 28% 내지 37%, 28% 내지 35%, 29% 내지 34%, 30% 내지 33% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값을 구성하는 산성 전하 변이체를 가질 것이다. Fc-함유 단백질은 전체 Fc-함유 단백질의 38% 내지 70%, 보다 특히 45% 내지 70%, 50% 내지 65%, 55% 내지 60% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값을 구성하는 주요 피크 형태를 가질 것이다. Fc-함유 단백질은 전체 Fc-함유 단백질의 1% 내지 40%, 보다 특히 2% 내지 35%, 3% 내지 30%, 4% 내지 25%, 5% 내지 20%, 6% 내지 15%, 7% 내지 12%, 7.5% 내지 10%, 8% 내지 10%, 8% 내지 9% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값을 구성하는 염기성 전하 변이체를 가질 것이다.
본원에 내포된 본 발명의 교시에 따라 생산된 Fc-함유 단백질 (예를 들어, 항체)은 전체 Fc-함유 단백질의 3% 내지 8%, 보다 특히 4% 내지 7%, 5% 내지 7% 및 5% 내지 6.5%, 5% 내지 6%, 5% 내지 5.75%, 5% 내지 5.5% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값에 존재하는 비글리코실화된 중쇄 (NGHC)의 비율을 가질 것이다.
전체 산물의 산성 전하 변이체 분획은 0.1% 내지 10%의 범위 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값에 의해 본 발명에 따라 제어될 수 있고, 바람직하게는 감소될 수 있다. 예를 들어, 표 1 참조. 보다 특히, 산성 변이체 분획은 0.2% 내지 9%, 0.3% 내지 8%, 0.4% 내지 7%, 0.5% 내지 6%, 0.6% 내지 5%, 0.7% 내지 4.75%, 0.75% 내지 4.5%, 0.8% 내지 4.25%. 0.9% 내지 4%, 1% 내지 3.75%. 1% 내지 3.5%, 1% 내지 3.25%, 1% 내지 3%, 1% 내지 2.75%, 1% 내지 2.75%, 1.25% 내지 2.5%, 1.25% 내지 2.25%, 1.25% 내지 2%, 1.5% 내지 2%, 1.5% 내지 1.75% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값으로 낮춰질 수 있다. 추가적으로, 다른 범위에는 0.1% 내지 4%, 0.25% 내지 4%, 0.25% 내지 3.75%, 0.25% 내지 3.5%, 0.25% 내지 3%, 0.25% 내지 2.75%, 0.25% 내지 2.5%, 0.25% 내지 2.25%, 0.25% 내지 2%, 0.25% 내지 1.75%, 0.25% 내지 1.5%, 0.25% 내지 1.25%, 0.25% 내지 1%, 0.25% 내지 0.75%. 0.25% 내지 0.5%, 0.5% 내지 4%, 0.5% 내지 3.75%, 0.5% 내지 3.5%, 0.5% 내지 3%, 0.5% 내지 2.75%, 0.5% 내지 2.5%, 0.5% 내지 2.25%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 1.75%, 0.5% 내지 1.5%, 0.5% 내지 1.25%, 0.5% 내지 1%, 0.5% 내지 0.75%, 0.75% 내지 4%, 0.75% 내지 3.75%, 0.75% 내지 3.5%, 0.75% 내지 3%, 0.75% 내지 2.75%, 0.75% 내지 2.5%, 0.75% 내지 2.25%, 0.75% 내지 2%, 0.75% 내지 1.75%, 0.75% 내지 1.5%, 0.75% 내지 1.25%, 0.75% 내지 1%, 1% 내지 4%, 1% 내지 3.75%, 1% 내지 3.5%, 1% 내지 3%, 1% 내지 2.75%, 1% 내지 2.5%, 1% 내지 2.25%, 1% 내지 2%, 1% 내지 1.75%, 1% 내지 1.5%, 1% 내지 1.25%, 1.25% 내지 4%, 1.25% 내지 3.75%, 1.25% 내지 3.5%, 1.25% 내지 3%, 1.25% 내지 2.75%, 1.25% 내지 2.5%, 1.25% 내지 2.25%, 1.25% 내지 2%, 1.25% 내지 1.75%, 1.25% 내지 1.5% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값이 포함된다. 예를 들어. 산성 전하 변이체 분획은 적어도 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%. 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4.0%, 4.1%, 4.2%, 4.3%, 4.4%, 4.5% 이상, 예컨대 최대 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% 이상 변경될 수 있고, 바람직하게는 낮춰질 수 있다.
전체 산물의 염기성 전하 변이체 분획은 0.1% 내지 10%의 범위 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값에 의해 본 발명에 따라 제어될 수 있다. 보다 특히, 염기성 전하 변이체 분획은 0.2% 내지 9%, 0.3% 내지 8%, 0.4% 내지 7%, 0.5% 내지 6%, 0.6% 내지 5%, 0.7% 내지 4.75%, 0.75% 내지 4.5%, 0.8% 내지 4.25%. 0.9% 내지 4%, 1% 내지 3.75%. 1% 내지 3.5%, 1% 내지 3.25%, 1% 내지 3%, 1% 내지 2.75%, 1% 내지 2.75%, 1.25% 내지 2.5%, 1.25% 내지 2.25%, 1.25% 내지 2%, 1.5% 내지 2%, 1.5% 내지 1.75% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값으로 변경될 수 있다. 추가적으로, 다른 범위에는 0.1% 내지 4%, 0.25% 내지 4%, 0.25% 내지 3.75%, 0.25% 내지 3.5%, 0.25% 내지 3%, 0.25% 내지 2.75%, 0.25% 내지 2.5%, 0.25% 내지 2.25%, 0.25% 내지 2%, 0.25% 내지 1.75%, 0.25% 내지 1.5%, 0.25% 내지 1.25%, 0.25% 내지 1%, 0.25% 내지 0.75%. 0.25% 내지 0.5%, 0.5% 내지 4%, 0.5% 내지 3.75%, 0.5% 내지 3.5%, 0.5% 내지 3%, 0.5% 내지 2.75%, 0.5% 내지 2.5%, 0.5% 내지 2.25%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 1.75%, 0.5% 내지 1.5%, 0.5% 내지 1.25%, 0.5% 내지 1%, 0.5% 내지 0.75%, 0.75% 내지 4%, 0.75% 내지 3.75%, 0.75% 내지 3.5%, 0.75% 내지 3%, 0.75% 내지 2.75%, 0.75% 내지 2.5%, 0.75% 내지 2.25%, 0.75% 내지 2%, 0.75% 내지 1.75%, 0.75% 내지 1.5%, 0.75% 내지 1.25%, 0.75% 내지 1%, 1% 내지 4%, 1% 내지 3.75%, 1% 내지 3.5%, 1% 내지 3%, 1% 내지 2.75%, 1% 내지 2.5%, 1% 내지 2.25%, 1% 내지 2%, 1% 내지 1.75%, 1% 내지 1.5%, 1% 내지 1.25%, 1.25% 내지 4%, 1.25% 내지 3.75%, 1.25% 내지 3.5%, 1.25% 내지 3%, 1.25% 내지 2.75%, 1.25% 내지 2.5%, 1.25% 내지 2.25%, 1.25% 내지 2%, 1.25% 내지 1.75%, 1.25% 내지 1.5% 또는 이러한 범위 내의 임의의 정수 또는 분수 값이 포함된다. 염기성 전하 변이체 분획은 적어도 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 1.1%, 1.2%, 1.3%, 1.4%, 1.5%, 1.6%, 1.7%, 1.8%, 1.9%, 2.0%, 2.1%, 2.2%, 2.3%, 2.4%, 2.5%, 2.6%, 2.7%, 2.8%, 2.9%, 3.0%, 3.1%, 3.2%, 3.3%, 3.4%, 3.5%, 3.6%, 3.7%, 3.8%, 3.9%, 4.0%, 4.1%, 4.2%, 4.3%, 4.4%, 4.5% 이상, 예컨대 최대 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15% 이상 변경될 수 있다.
전형적으로, 발효 중 CO2 농도는 두 가지 원인, 즉 대기 CO2 및 호흡을 통해 세포에 의해 생산된 CO2에서 비롯된다. 본 발명은 유리하게는 전하 변이체를 제어하기 위해 추가적인 CO2를 이용할 수 있다 어떠한 이론에도 구속되지는 않지만, 배지 내 CO2 수준의 증가는 세포내 CO2의 증가를 유도하며, 이는 전하 변이에 대해 단독으로 또는 공동으로 책임이 있다고 여겨진다. 이 효과는 탄산 또는 기타 산성 화학물질의 형성으로 인한 임의의 pH의 감소와는 별개이다.
이산화탄소 농도는 CO2 분사를 사용하거나, 또는 공기 분사를 낮춤으로써 증가될 수 있다. CO2 분사는 pCO2를 증가시킨다. 이산화탄소 농도의 감소가 필요한 경우, 공기를 포함한 기타 가스를 사용하여 분사를 수행할 수 있다. 공기 분사 및 질소 분사는 pCO2를 감소시킨다. 생산 생물반응기 내 압력을 감소시키면 산호의 용해도의 감소가 초래되는데; 이는 결국 용존 잔소 (DO) 설정점을 유지하기 위해 더 많은 산소를 분사와 가스 유량의 증가를 필요로 하고, 이는 배양 배지로부터 pCO2를 제거한다.
이산화탄소 농도는 세버링하우스 (Severinghaus) 전극으로도 지칭되는 CO2 전극을 사용하여 측정될 수 있다. BioProfile® FLEX 및 FLEX 2 분석기와 같은 더 첨단의 시스템을 상업적으로 이용할 수 있다. 전하 변이체는 이미지 모세관 등전점 전기영동 (Imaged Capillary Isoelectric Focusing, iCIEF) 및 염 구배에 의한 용출을 이용한 이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 측정될 수 있다. NGHC는 감소된 모세관 전기영동 (CE)-SDS에 의해 측정될 수 있다.
본 발명은 포유동물 세포 배양물에 사용될 수 있다. 예시적인 세포주는 CHO, Per.C6 세포, Sp2/0 세포, 및 HEK293 세포이다. CHO 세포에는 CHO-ori, CHO-K1, CHO-s, CHO-DHB11, CHO-DXB11, CHO-K1SV, 및 이들의 돌연변이 및 변이체가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. HEK293 세포에는 HEK293, HEK293A, HEK293E, HEK293F, HEK293FT, HEK293FTM, HEK293H, HEK293MSR, HEK293S, HEK293SG, HEK293SGGD, HEK293T 및 이들의 돌연변이 및 변이체가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 기타 적합한 세포에는 BHK (아기 햄스터 신장) 세포, HeLa 세포 및 인간 양막 세포, 예컨대 인간 양막 상피 세포가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 세포 배양물에서 생산된 기존의 생물학적 및 약제학적 산물의 차세대 버전을 포함한 생물학적 및 약제학적 산물을 생산하는데 이용될 수 있다. 광범위한 단백질-기반 치료제, 예컨대 단일클론 항체-기반 치료제가 본 발명에 따라 생산될 수 있다. 예를 들어, 하기에서 식별되는 항체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 항체를 인코딩하는 필수 DNA 서열을 포함하는 세포는 본 발명에 따른 배양물에서 성장될 수 있다.
다음은 본 발명에 따라 생산될 수 있는 세포 배양물에서 만들어진 단백질을 식별하고 기술한다. 이러한 단백질을 인코딩하는 필수 DNA를 포함하는 세포는 본 발명에 따른 생산을 위해 배양될 수 있다.
예를 들어, 항체 생산의 경우, 본 발명은 모든 주요 항체 클래스, 즉 IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE를 기반으로 하는 진단 및 치료를 위한 연구 및 생산 용도로 수정될 수 있다. IgG는 선호되는 클래스이며, 서브클래스 IgG1 (IgG1λ 및 IgG1κ 포함), IgG2, IgG3, 및 IgG4를 포함한다. 추가 항체 실시양태에는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일클론 항체, 다중특이성 항체, 이중특이성 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체가 포함된다. 일 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 일 실시양태에서, 항체는 IgG2 항체이다. 일 실시양태에서, 항체는 IgG4 항체이다. 일 실시양태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG4 항체이다. 일 실시양태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1 항체이다. 일 실시양태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1/IgG4 항체이다. 상기의 유도체, 구성성분, 도메인, 사슬 및 단편 또한 포함된다.
추가 항체 실시양태에는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 단일클론 항체, 다중특이성 항체, 이중특이성 항체, 삼중특이성 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 사슬 항체, 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체가 포함된다. 일 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 일 실시양태에서, 항체는 IgG2 항체이다. 일 실시양태에서, 항체는 IgG4 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG4 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1/IgG4 항체이다.
추가적인 실시양태에서, 항체는 항-프로그래밍된 세포 사멸 1 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제US2015/0203579A1호에 기술된 바와 같은 항-PD1 항체), 항-프로그래밍된 세포 사멸 리간드-1 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제US2015/0203580A1호에 기술된 바와 같은 항-PD-L1 항체), 항-Dll4 항체, 항-안지오포에틴-2 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 제9,402,898호에 기술된 바와 같은 항-ANG2 항체), 항- 안지오포에틴-유사 3 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 제9,018,356호에 기술된 바와 같은 항-AngPtl3 항체), 항-혈소판 유래 성장 인자 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 제9,265,827호에 기술된 바와 같은 항-PDGFR 항체), 항-Erb3 항체, 항-프로락틴 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 제9,302,015호에 기술된 바와 같은 항-PRLR 항체), 항-보체 5 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제US2015/0313194A1호에 기술된 바와 같은 25 항-C5 항체), 항-TNF 항체, 항-표피 성장 인자 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 제9,132,192호에 기술된 바와 같은 항-EGFR 항체 또는 미국 특허 출원 공개 번호 US2015/0259423A1에 기술된 바와 같은 항-EGFRvIII 항체), 항-프로단백질 전환효소 섭틸리신 켁신 (anti-Proprotein Convertase Subtilisin Kexin)-9 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 제8,062,640호 또는 미국 특허 출원 공개 번호 제US2014/0044730A1호에 기술된 바와 같은 항-PCSK9 항체), 항-성장 및 분화 인자-8 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 제8,871,209호 또는 제9,260,515호에 기술된 바와 같은 항-미오스타틴 항체로도 알려진 항-GDF8 항체), 항-글루카곤 수용체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제US2015/0337045A1호 또는 제US2016/0075778A1호에 기술된 바와 같은 항-GCGR 항체), 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 인터루킨 4 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제US2014/0271681A1호 또는 미국 특허 번호 제8,735,095호 또는 제8,945,559호에 기술된 바와 같은 항-IL4R 항체), 항-인터루킨 6 수용체 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 제7,582,298호, 제8,043,617호 또는 제9,173,880호에 기술된 바와 같은 항-IL6R 항체), 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-인터루킨 33 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제US2014/0271658A1호 또는 제US2014/0271642A1호에 기술된 바와 같은 항- IL33 항체), 항-호흡기 세포융합 바이러스 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제US2014/0271653A1호에 기술된 바와 같은 항-RSV 항체), 분화 항-클러스터 3 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제US2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호, 및 미국 출원 번호 제62/222,605호에 기술된 바와 같은 항-CD3 항체), 분화 항-클러스터 20 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제US2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호, 및 미국 특허 번호 제7,879,984호에 기술된 바와 같은 항-CD20 항체), 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 분화 항-클러스터 48 (예를 들어, 미국 특허 번호 제9,228,014호에 기술된 바와 같은 항-CD48 항체), 항-Fel d1 항체 (예를 들어, 미국 특허 번호 제9,079,948호에 기술된 바와 같음), 항-중동 호흡기 증후군 바이러스 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제US2015/0337029A1호에 기술된 바와 같은 항-MERS 항체), 항-에볼라 바이러스 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제US2016/0215040호에 기술된 바와 같음), 항-지카 바이러스 항체, 항-림프구 활성화 유전자 3 항체 (예를 들어, 항-LAG3 항체, 또는 항-CD223 항체), 항-신경 성장 인자 항체 (예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 제US2016/0017029호 및 미국 특허 번호 제8,309,088호 및 제9,353,176호에 기술된 바와 같은 항-NGF 항체) 및 항-액티빈 A 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 이중특이성 항체는 항-CD3 x 항-CD20 이중특이성 항체 (미국 특허 출원 공개 번호 제US2014/0088295A1호 및 제US20150266966A1호에 기술된 바와 같음), 항-CD3 x 항-뮤신 16 이중특이성 항체 (예를 들어, 항-CD3 x 항-Muc16 이중특이성 항체), 및 항-CD3 x 항-전립선-특이적 막 항원 이중특이성 항체 (예를 들어, 항-CD3 x 항-PSMA 이중특이성 항체)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 또한, 미국 특허 공개 번호 제US 2019/0285580 A1호 참조. 또한, Met x Met 항체, NPR1에 대한 작용제 항체, LEPR 작용제 항체, BCMA x CD3 항체, MUC16 x CD28 항체, GITR 항체, IL-2Rg 항체, EGFR x CD28 항체, 인자 XI 항체, SARS-CoC-2 변이체에 대한 항체, Fel d 1 다중-항체 요법, Bet v 1 다중-항체 요법도 포함된다. 상기의 유도체, 구성성분, 도메인, 사슬 및 단편 또한 포함된다.
예시적인 항체를 생산하는 세포는 본 발명에 따라 배양될 수 있다. 예시적인 항체에는 알리로쿠맙, 아톨티비맙, 마프티비맙, 오데시비맙, 오데시비맙-ebgn, 카시리비맙, 임데비맙, 세미플리맙 및 세미플리맙-rwlc (PD-1에 결합하는 인간 IgG4 단일클론 항체), 두필루맙 (IL-4R 알파 (α) 서브유닛에 결합하여 인터루킨 4 (IL-4) 및 인터루킨 13 (IL-13) 신호전달을 억제하는 IgG4 서브클래스의 인간 단일클론 항체), 에비나쿠맙, 에비나쿠맙-dgnb, 파시누맙, 피안리맙, 가레토스맙, 이테페키맙 네스바쿠맙, 오드로노넥타맙, 포젤리맙, 사릴루맙, 트레보그루맙, 리누쿠맙이 포함된다.
추가적인 예시적인 항체에는 라불리주맙-cwvz, 앱식시맙, 아달리무맙, 아달리무맙-아토, 아도-트라스투주맙, 알렘투주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 바실릭시맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브로달루맙, 카나키누맙, 카프로맙 펜데타이드, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 더발루맙, 에쿨리주맙, 엘로투주맙, 에미시주맙-kxwh, 엠탄신 알리로쿠맙, 에볼로쿠맙, 골리무맙, 구셀쿠맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 이다루시주맙, 인플릭시맙, 인플릭시맙-압다, 인플릭시맙-dyyb, 이필리무맙, 익세키주맙, 메폴리주맙, 네시투무맙, 니볼루맙, 오빌톡사시맙, 오비누투주맙, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 올라라투무맙, 오말리주맙, 파니투무맙, 펨브롤리주맙, 페르투주맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레슬리주맙, 리누쿠맙, 리툭시맙, 세쿠키누맙, 실툭시맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 우스테키누맙 및 베돌리주맙이 포함된다.
차세대 산물 외에도, 본 발명은 또한 바이오시밀러 (biosimilar)의 생산에도 적용 가능하다. 바이오시밀러는 관할권에 따라 다양한 방식으로 정의되지만, 해당 관할권에서 이전에 승인된, 보통 "참조 산물"이라고 지칭되는 생물학적 산물과 비교되는 공통된 특징을 공유한다. 세계 보건 기구에 따르면 바이오시밀러는 품질, 안정성 및 효능의 측면에서 이미 허가된 참조 바이오치료제와 유사한 바이오 치료제로, 필리핀과 같은 많은 국가에서 택하고 있다.
미국의 바이오시밀러는 현재 (A) 생물학적 산물이 임상적으로 불활성 성분의 사소한 차이에도 불구하고 참조 산물과 매우 유사하고; (B) 제품의 안정성, 순도 및 효력의 측면에서 생물학적 산물과 참조 산물 사이에 임상적으로 의미 있는 차이가 없는 것으로 기술된다. 미국에서, 이전 산물을 처방한 의료인의 개입 없이 이전 산물을 대체할 수 있는 상호 교환 가능한 바이오시밀러 또는 산물이 나타나있다. 유럽 연합에서 바이오시밀러는 EU에서 이미 승인된 또 다른 생물학적 의약품 ("대조 의약품"이라고 함)과 매우 유사한 생물학적 의약품으로, 특히 구조, 생물학적 활성, 유효성 및 안정성 등의 고려사항을 포함하며, 러시아도 이러한 지침을 따르고 있다. 중국에서 바이오시밀러 산물은 현재 원래의 생물학적 약물과 유사한 활성 물질을 함유하고 품질, 안정성 및 유효성의 측면에서 원래의 약물과 유사하며 임상적으로 유의미한 차이가 없는 생물학적 제제 (biologics)를 지칭한다. 일본에서 바이오시밀러는 현재 일본에서 이미 승인된 참조 산물과 생물학적 동등성/품질-동등 품질, 안정성 및 효능을 갖춘 산물이다. 인도에서 바이오시밀러는 현재 "유사한 생물학적 제제"로 지칭되며, 품질, 안정성 및 효능의 측면에서 비교가능성을 기반으로 승인된 참조 생물학적 산물과 유사한 생물학적 산물을 지칭한다. 호주에서 바이오시밀러 의약품은 현재 참조 생물학적 의약품과 매우 유사한 버전이다. 멕시코, 콜롬비아, 브라질에서 바이오시밀러는 현재 이미 허가된 참조 산물과 품질, 안정성 및 효능의 측면에서 유사한 바이오치료제이다. 아르헨티나에서 바이오시밀러는 현재 공통된 특징을 갖는 원래의 산물 (비교체)로부터 유래한다. 싱가포르에서 바이오시밀러는 현재 싱가포르에 등록된 기존의 생물학적 산물과 물리화학적 특징, 생물학적 활성, 안정성 및 효능이 유사한 생물학적 치료제이다. 말레이시아에서 바이오시밀러는 현재 이미 등록되어 잘 확립된 의약품과 품질, 안정성 및 효능의 측면에서 유사하도록 개발된 새로운 생물학적 의약품이다. 캐나다에서 바이오시밀러는 현재 이미 판매 승인을 받은 생물학적 약물과 매우 유사한 생물학적 약물이다. 남아프리카에서 바이오시밀러는 현재 이미 인간 용도로 승인된 생물학적 의약품과 유사하도록 개발된 생물학적 의약품이다. 본 발명에 따라 바이오시밀러와 이의 동의어의 생산 및 임의의 개정된 정의가 수행될 수 있다.
전형적으로, 배양은 약 10 내지 15일, 바람직하게는 약 12 내지 14일 동안 일어날 수 있다. pCO2 조건은 배양 중 CO2 30 mmHg 내지 210 mmHg, 50 mmHg 내지 200 mmHg, 60 mmHg 내지 190 mm Hg, 70 mmHg 내지 180 mmHg, 80 mmHg 내지 170 mmHg, 90 mmHg 내지 160 mmHg, 100 mmHg 내지 150 mmHg, 110 mmHg 내지 140 mmHg, 120 mmHg 내지 140 mmHg, 120 mmHg 내지 130 mmHg 또는 이러한 범위 내의 임의의 값이다. 본 발명은 Fc-함유 단백질 산물, 예컨대 항체를 제공할 수 있으며, 여기서 주요 피크 (중성으로 간주됨) 형태는 전체 Fc-함유 단백질의 38% 내지 65%를 포함하고, Fc-함유 단백질의 산성 변이체는 전체 Fc-함유 단백질의 20% 내지 47%를 포함하고, Fc-함유 단백질의 염기성 변이체는 전체 Fc-함유 단백질의 최대 36%를 포함한다. 항체의 경우, 본 발명은 세포에 의해 생산된 항체의 주요 피크 형태가 전체 항체의 50% 내지 70%를 포함하고, 항체의 산성 변이체가 전체 항체의 20% 내지 47%를 포함하고, 항체의 염기성 변이체가 전체 항체의 최대 15%를 포함하는 산물을 제공할 수 있다.
본 발명은 본 발명의 많은 측면을 예시하지만 임의의 방식으로 본 발명을 제한하지 않는 다음 실시예에 의해 추가로 기술된다.
실시예
1 -
프로그래밍된
세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 인자에 결합하는 인간 IgG4 단일클론 항체의
제조에 있어서
산성
변이체를
감소시키고 주요 피크 형태를 증가시키기 위해 배양 pCO
2
가 증가될 수 있다
배양 배지에 18 x 106 세포/ml의 농도로 CHO 세포를 접종하고 유가식 프로세스에서 성장하도록 하였다. 7일차에 세포가 피크 농도 (30 x 106 세포/ml)에 도달하면, 높은 pCO2 생물반응기에 추가적인 CO2를 분사하여 pCO2 수준을 120 mmHg 초과로 증가시켰다. 대조용 프로세스는 pCO2 수준을 105 mmHg 미만으로 유지하기 위해 표준 생산 프로세스를 구현하였다. 도 1 참조. 관찰된 산성 이질성은 하기 표 1에 정리되어 있으며, 이는 높은 pCO2에서 산성 전하 변이체의 경우 31% 내지 32%, 주요 피크 형태의 경우 57% 내지 60% 범위임을 뒷받침한다:
[표 1]
실시예
2 -PD-1 인자에 결합하는 인간
IgG4
단일클론 항체의
제조에 있어서
배양 pCO
2
가 감소하여 산성 변이체가 증가할 수 있다
배지에 18 x 106 세포/ml의 농도로 CHO 세포를 접종하고 유가식 방식으로 프로세스를 진행하였다. 배양 pCO2를 제거하고 감소시키기 위해 6.5일차에 복제 생물반응기의 공기 분사량을 24시간 동안 22 ccm에서 33 ccm까지 증가시켰고, 이어서 7.5일부터 수확까지 44 ccm으로 증가시켰다. 대조용 복제 생물반응기는 프로세스 기간 동안 22 ccm의 공기 분사량을 유지하였다. 도 2 참조. 관찰된 산성 변이체 이질성은 하기 표 2에 정리되어 있다:
[표 2]
이 실시예는 낮은 pCO2가 산성 전하 변이체의 비율을 더 높인다는 것을 입증하였다.
실시예
3 -PD-1 인자에 결합하는 인간
IgG4
단일클론 항체의
제조에 있어서
배양
pCO
2
의
증가는
NGHC의
유병률의 증가와 연관이
있다
배양 배지에 18 x 106 세포/ml의 농도로 CHO 세포를 접종하고 유가식 프로세스에서 성장하도록 하였다. 세포가 7일차에 피크 농도 (30 x 106 세포/ml)에 도달하면, 높은 pCO2 생물반응기는 추가적인 CO2를 분사하여 pCO2 수준을 120 mmHg 초과로 증가시켰다. 대조용 프로세스는 pCO2 수준을 105 mmHg 미만으로 유지하기 위해 표준 생산 프로세스를 구현하였다. 도 1 참조. 관찰된 NGHC 이질성은 하기 표 3에 정리되어 있다:
[표 3]
NGHC의 증가는 pCO2 자체의 영향이 아니라 배양 pH의 감소와 관련이 있는 것으로 결정되었다. 실시예 5 및 도 10 및 11 참조.
실시예
4 -PD-1 인자에 결합할 수 있는 인간
IgG4
단일클론 항체의
제조에
있어서 배양 pCO
2
의 감소는 NGHC의 유병률 감소와 연관이 있다
배지에 18 x 106 세포/ml의 농도로 CHO 세포를 접종하고 유가식 방식으로 프로세스를 진행하였다. 배양 pCO2를 제거하고 감소시키기 위해 6.5일차에 복제 생물반응기의 공기 분사량을 24시간 동안 22 ccm에서 33 ccm으로 증가시켰고, 이어서 7.5일차에서 수확까지 44 ccm으로 증가시켰다. 대조용 복제 생물반응기는 프로세스 기간 동안 22 ccm의 공기 분사량을 유지하였다. 도 2 참조. 관찰된 NGHC 이질성은 하기 표 4에 정리되어 있다:
[표 4]
NGHC의 감소는 pCO2 자체의 영향이 아니라 배양 pH의 증가와 관련이 있는 것으로 결정되었다. 실시예 5 및 도 10 및 11 참조.
실시예
5 -PD-1 인자에 결합하는 인간
IgG4
단일클론 항체의 생산에 대한 소규모 연구에서 배양 pCO
2
및 pH의 분석
CHO 세포를 사용한 Fc-함유 단백질 (예를 들어, 항체)의 전형적인 대규모 생산으로부터의 데이터는 하기 표 5에 나타나 있다.
[표 5]
제형화 약물 물질 (FDS)의 대규모 생산을 재현하기 위해 2L 발효기를 사용한 소규모 연구를 수행하였다. 본원에 기술된 연구로부터의 결과는 10,000 L 생산 생물반응기에서 관찰된 것과 유사한 배양 pCO2 및 pH의 변화가 PD-1에 결합하는 인간 IgG4 단일클론 항체에서 전하 변이체 프로파일 및 비글리코실화된 중쇄의 발생에 영향을 미친다는 것을 입증하는데 사용되었다.
소규모 연구에서는 생산 생물반응기 내 pCO2 수준의 상승으로 인해 iCIEF 영역 1 (산성 전하 변이체) 및 영역 3 (염기성 전하 변이체)의 감소가 관찰되고, 동시에 iCIEF 영역 2 (주요 피크 변이체로도 알려진 주요 피크 형태)의 증가에 기여한다는 사실이 결정되었다. 이 연구는 또한 pCO2 자체가 아닌 배양 pH가 NGHC 프로파일의 관찰된 변화를 일으킨다고 결론지었다. 이러한 결과는 하기에서 보다 구체적으로 논의된다. 공기 분사 및 pCO2 분사를 사용한 연구 매개변수는 하기 표 6에 요약되어 있다:
[표 6]
제어 조건과 관련된 공기 분사 및 CO2 분사
각 실행에 대한 전하 변이체 (iCIEF) 및 NGHC 결과는 표 7에 제시되어 있다. *참고 - 중간 pCO2 #3 (중간점 대조군으로 간주됨)은 데이터의 해석을 혼란스럽게 할 수 있는 이상치를 나타내므로 추가 분석에서 제외하였다.
[표 7]
전하 변이체 및 피크 형태, 즉 iCIEF 영역 1 (산성 전하 변이체), 영역 2 (주요 피크 형태) 및 영역 3 (염기성 전하 변이체)에 대한 원인은 하기에서 더 자세히 논의된다. NGHC는 또한 하기에서 논의된다.
도 3은 표 6에 따른 매개변수를 사용하여 예측된 pH 값을 나타낸다.
도 4는 배양 pCO2가 iCIEF 영역 1 (R1, 산성 전하 변이체 %)에 대한 모델에서 유일한 유의미한 항 (p<0.0001)이고 이 전하 변이체의 변동성의 87% (R2 : 0.87)를 설명하여 더 높은 pCO2가 더 낮은 영역 1 (%) (산성 전하 변이체)과 관련된 통계적으로 유일한 항임을 나타내는 데이터를 도시한다. 배양 pH는 산성 전하 변이체 (영역 1)의 통계적으로 유의미한 항이 아니었다. 도 5 참조.
도 6은 배양 pCO2 및 pH 둘 모두가 iCIEF 영역 2 (R2, 주요 피크 형태 %)에 대한 모델에서 유의미한 항 (p<0.0001)이었고 관찰된 변동성의 97% (R2 : 0.97)를 설명함을 나타내는 데이터를 도시한다. 이와 같이, 배양 pCO2가 더 높고 배양 pH가 더 낮을수록 주요 피크 형태가 증가한다. 도 7 참조.
도 8은 배양 pCO2가 모델에서 유의미한 항 (p =0.0352)이었고 영역 3 (R3, 염기성 전하 변이체 %)의 변동성의 38%를 설명했음을 보여주는 데이터를 도시한다. 그러나 이 모델은 유의미하지 않았으며(p = 0.0592), 데이터 포인트의 과도한 활용으로 인한 것일 수 있다. 도 9 참조.
상기 데이터는 일반적으로 pCO2 수준이 증가함으로써 전체적으로 또는 부분적으로 전하 변이체가 발생한다는 것을 나타낸다. 더 중요하게는, pH의 감소가 아닌 pCO2 증가가 산성 전하 변이체 (영역 1)의 비율을 낮추는 데 통계적으로 유의미한 유일한 항이었다. 이에 따라, 여기에서 인간 IgG4 단일클론 항체로 대표되는 IgG 클래스의 경우, pCO2가 증가하면 산성 전하 변이체의 비율이 낮아지며, 산성 전하 변이체의 비율이 낮아지는 것은 pH 값의 감소로 인해 발생하지 않는다. 도 4 및 5 참조.
마지막으로, 도 10 및 11은 pCO2 자체의 증가가 아닌 배양 pH 감소가 NGHC (R² : 0.38)의 변동성의 38%를 설명하는 모델에서 유의미한 항이었다는 것(p=0.0401)을 나타내는 데이터를 도시한다. 따라서, 더 낮은 배양 pH는 NGHC 프로파일에 영향을 미칠 수 있다. pCO2는 pH에 영향을 미칠 수 있지만, 다른 배지 성분 또한 pH에 영향을 미치므로 원인에 관계없이 pH가 NGHC를 변화시킨다. 따라서, 덜 산성인 산성 전하 변이체 (%)는 pCO2 자체 현상에 기인하며, 이는 모든 유형의 산성 분자에 의해 pH가 낮아짐으로써 발생하는 NGHC의 증가와 상이하다.
도 12 내지 23은 다음에 대한 데이터를 도시한다:
(a) 생존 세포 밀도 (VCD) (도 12);
(b) 생존 가능성 값 (도 13);
(c) pH 값 - pH는 표 6에 나타낸 구역 접근 방식에 따라 6.5일차부터 변경되었음 (도 14);
(d) pCO2 값 - pCO2는 표 6에 나타낸 구역 접근 방식에 따라 6.5일차부터 변경되었음 (도 15)
(e) 글루코오스 값 (도 16);
(f) 칼륨 값 (도 17);
(g) 나트륨 값 - 7일 후 나트륨 값의 변화는 센서 변경으로 인한 것일 가능성이 있으며 연구 결과에 영향을 미칠 것으로 예상되지 않음 (도 18);
(h) 오스몰농도 값 - 10일차의 비정형 값은 샘플 오류로 인한 것일 가능성이 있음 (도 19);
(i) 글루타메이트 값 - 6.5일차의 비정형 값은 샘플 오류로 인한 것일 가능성이 있음 (도 20);
(j) 락테이트 값 (도 21);
(k) 암모니아 값 - 암모니아 값은 pH의 영향을 받을 수 있음 (도 22); 및
(l) 글루타민 값 (도 23).
이러한 데이터는 여러 공기 분사 조건에서 증식된 세포 간의 유사성을 나타낸다. 표 6 참조.
실시예
6 -인터루킨 4 (IL-4) 수용체에 결합하는 인간
IgG4
단일클론 항체의 CO
2
분사를 사용한 배양물에서의 생산
IL-4R 알파 (α) 서브유닛에 결합하여 인터루킨 4 (IL-4) 및 인터루킨 13 (IL-13) 신호전달을 억제하는 인간 IgG4 단일클론 항체의 전하 변이체 프로파일에 대한 배양 pCO2의 영향을 평가하기 위해 다음 연구를 수행하였다.
생산 생물반응기 내의 배양 배지에 약 12 x 105 세포/ml의 농도로 CHO 세포를 접종하고, 유가식 프로세스에서 성장하도록 하였다. 5.5일차에 200 x 105 세포/mL의 피크 생존 세포 밀도 (VCD)가 도달하면, CO2 분사는 세포 배양물 내에서 pCO2 수준을 변화시키기 위해 표 8에 정의된 바와 같이 수정되었다. 3개의 실험 조건의 결과적인 pCO2 프로파일이 도 24에 제공되어 있다.
[표 8]
중간 pCO2 조건 (대조군)과 관련된 낮은 및 높은 pCO2 조건의 최소 CO2 분사 유속 비율
10.5일의 배양 후, 생물반응기를 수확하고 단일클론 항체를 정제하였다. 글리코실화 및 전하 변이체 프로파일을 결정하였다. 생산 생물반응기 내의 pCO2 수준이 증가함에 따라 이미지-모세관 등전점 전기영동 (iCIEF)으로 측정된 바와 같이 염기성 변이체의 수준이 동시에 감소한 것으로 나타났다 (표 9). 또한, pCO2가 증가하면 오목한 산성 변이체 프로파일을 생성하여 중간 pCO2 조건에서 피크에 도달했지만, 높은 pCO2 조건에서는 가장 낮은 비율로 떨어졌다 (표 10). 전반적인 추세는 산성 전하 변이체의 비율이 더 낮은 것이었고, 중간 pCO2 측정은 오류의 결과일 가능성이 있다.
[표 9]
염기성 전하 변이체에 대한 배양 pCO2의 영향
[표 10]
산성 전하 변이체에 대한 배양 pCO2의 영향
상기 실시예 5의 상세한 통계 분석으로 인해 pH의 감소가 아닌 pCO2의 증가가 인간 IgG4 단일클론 항체로 산성 전하 변이체 (영역 1)의 비율을 낮추는 데 통계적으로 유일한 유의미한 항이라는 것이 입증되었다. 이에 따라, 인간 IgG4 단일클론 항체로 대표되는 IgG 클래스의 경우, pCO2 자체의 증가는 산성 전하 변이체의 비율을 낮추고, IgG4 항체 내 산성 전하 변이체의 비율이 낮아지는 것은 pH 값의 감소로 인해 발생하지 않는다.
설명, 특정 실시예 및 데이터는 예시적인 실시양태를 나타내지만 예시로서 제공되며 본 발명을 제한하려는 의도가 없다는 것을 이해해야 한다. 전체 및 부분적으로 실시양태의 조합을 포함하여 본 발명 내의 다양한 변경 및 수정은 본원에 내포된 논의, 개시내용 및 데이터로부터 통상의 기술자에게 명백해질 것이며, 이에 따라 본 발명의 일부로 간주된다.
Claims (38)
- 배양물에서 포유동물 세포에 의해 생산된 항체 산물 내 산성 전하 변이체의 비율을 감소시키는 방법으로서, 상기 방법은
항체를 생산하는 포유동물 세포를 배지에 시딩하는 단계; 및
상기 포유동물 세포가 pCO2 조건 없이 얻을 수 있는 것보다 덜 산성인 산성 변이체를 갖는 항체 산물을 생산할 수 있도록 하는 pCO2 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 pCO2 조건은 상기 배지에서 CO2가 120 mmHg 내지 140 mmHg인, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 pCO2 조건은 분사에 의해 달성되는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 pCO2 조건은 CO2 분사에 의해 달성되는, 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pCO2 조건 하에서 생산된 상기 항체는 상기 pCO2 조건 없이 얻을 수 있는 것보다 0.5% 내지 4% 덜 산성인 변이체를 갖는, 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 항체는 PD-1 인자에 결합할 수 있는, 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 항체는 IL-4 수용체에 결합할 수 있는, 방법.
- 제5항 내지 제7항에 있어서, 상기 항체는 인간 단일클론 항체인, 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 항체는 IgG 항체인 인간 단일클론 항체인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 IgG 항체는 IgG4 항체인, 방법.
- 제1항 내지 제10항에 있어서, 상기 세포는 10 내지 15일 동안 배양되는, 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포인, 방법.
- 배양물에서 포유동물 세포에 의해 생산된 항체의 이질성을 제어하는 방법으로서, 상기 방법은
항체를 생산하는 포유동물 세포를 배지에 시딩하는 단계; 및
상기 포유동물 세포가 항체를 생산할 수 있도록 하는 pCO2 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 세포에 의해 생산된 항체의 주요 피크 형태는 전체 항체의 38% 내지 65%를 포함하고, 상기 항체의 산성 변이체는 전체 항체의 20% 내지 47%를 포함하고, 상기 항체의 염기성 변이체는 전체 항체의 최대 36%를 포함하는, 방법. - 제13항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 PD-1 인자에 결합할 수 있는, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 항체는 IL-4 수용체에 결합할 수 있는, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 단일클론 항체는 인간 단일클론 항체인, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체는 IgG1 항체인, 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 IgG 항체는 IgG4 항체인, 방법.
- 배양물에서 포유동물 세포에 의해 생산된 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 이질성을 제어하는 방법으로서, 상기 방법은
항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 생산하는 포유동물 세포를 배지에 시딩하는 단계; 및
상기 포유동물 세포가 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편을 생산할 수 있도록 하는 pCO2 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하고, 상기 세포에 의해 생산된 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 주요 피크 형태는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 50% 내지 70%를 포함하고, 상기 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 산성 변이체는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 20% 내지 47%를 포함하고, 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 염기성 변이체는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 최대 15%를 포함하는, 방법. - 제20항에 있어서, 상기 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 염기성 변이체는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 최대 10%를 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 염기성 변이체는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 최대 8%를 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 염기성 변이체는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 최대 6%를 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 세포에 의해 생산된 상기 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 주요 피크 형태는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 50% 내지 65%를 포함하고, 상기 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 산성 변이체는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 23% 내지 46%를 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 산성 변이체는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 23% 내지 39%를 포함하는, 방법.
- 제20항에 있어서, 상기 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 산성 변이체는 전체 항체, 항체 유도체 또는 항체 단편의 31% 내지 46%를 포함하는, 방법.
- 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 비글리코실화된 중쇄를 갖는 항체의 비율은 5 내지 7%인, 방법.
- 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 인간 단일클론 항체를 생산하는, 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 인간 단일클론 항체는 IgG1 항체인, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 IgG 항체는 IgG4 항체인, 방법.
- 제20항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 pCO2 조건은 배양 중에 30 mmHg 내지 210 mmHg인, 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 pCO2 조건은 CO2 분사를 사용하여 유지되는, 방법.
- 제20항 내지 제31항에 있어서, 상기 pCO2는 CO2 전극을 사용하여 측정되는, 방법.
- 제20항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 세포는 CHO 세포인, 방법.
- 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 항체 산물.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 항체 유도체 산물.
- 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 항체 단편 산물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 항체 산물.
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