JPH08501799A

JPH08501799A - アレルゲン特異的ＩｇＡモノクローナル抗体及びアレルギー治療のための関連物質

Info

Publication number: JPH08501799A
Application number: JP6515422A
Authority: JP
Inventors: ツェウェンチャン
Original assignee: Tanox Inc
Current assignee: Tanox Inc
Priority date: 1992-12-21
Filing date: 1993-12-20
Publication date: 1996-02-27
Also published as: EP0675734A1; AU5958494A; EP0675734A4; US5670626A; WO1994014475A1

Abstract

(57)【要約】ブタクサ、家庭塵ダニ及び猫や犬のフケに含まれる主なアレルギー性タンパク質に特異的なヒトモノクローナルＩｇＡ又はＩｇＧ抗体を必須成分として含む医薬製剤が開示されている。また、生理学的な適合性を有するポリマーバックボーン又はマイクロビーズと、共有結合により結合された複数のアレルゲン特異的結合分子とを含む結合体も開示されている。適当な結合分子は、上述したようなアレルギー性タンパク質に特異的なＩｇＧ若しくはＩｇＡ又はそれらのF(ab')₂断片、Fab断片若しくはFv断片であり得る。また、患者が感作されているアレルギー性分子に対して特異的な抗体又は結合体を含む医薬製剤を、鼻腔内表面、気管又は目のような、影響を受けている粘膜組織に対して投与することによる、アレルギー性鼻炎、喘息又は結膜炎を治療する方法も開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】アレルゲン特異的ＩｇＡモノクローナル抗体及びアレルギー治療のための関連物質発明の分野本発明は、アレルゲン特異的ＩｇＡ及びＩｇＧモノクローナル抗体並びに関連物質並びに診断、アレルゲンの精製及びＩｇＥ媒介アレルギーの治療のための用途に関する。発明の背景免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）は１型過敏症の主な原因物質である。この型の過敏症は、アレルギー性鼻炎、アレルギー性喘息及びアレルギー性結膜炎のような多くの一般的な疾病症状として現れる。ＩｇＥ媒介アレルギー患者における１型過敏症のメカニズムは、アレルゲン特異的ＩｇＥが合成されるという事実に起因する。ＩｇＥは血液中を循環し、循環液中の好塩基球上及び種々の組織中のマスト細胞上にある高親和性ＩｇＥＦｃレセプター（ＦｃεＲＩ）に結合する。アレルゲンは吸入、接種又は経皮的に体内に侵入する。アレルゲン分子は、マスト細胞及び好塩基球の表面上のＩｇＥの結合部位（Ｆａｂ）に結合し、その下のＦｃ εＲＩを凝集させ、ヒスタミン及び他の薬理学的媒介物質の放出を引き起こし、周知のアレルギー徴候を引き起こす。局所的ＩｇＥ媒介アレルギー反応に最もさらされやすい組織は鼻腔内表面（アレルギー性鼻炎患者において）、気管内粘膜（アレルギー性喘息の患者において）及び目の血膜の粘膜表面（アレルギー性結膜炎の患者において）である。この局所的感受性は、アレルゲンが吸入により気管を通して鼻腔内表面及び気管の粘膜表面に捕獲されることに起因する。目及び耳もまた、アレルゲンの侵入にさらされやすく局所的アレルギー反応を起こしやすい。空気中に含まれるアレルゲンが目又は耳の湿った表面に接触し、粘膜組織により保持される。マスト細胞は、外部環境にさらされる粘膜組織に多く存在する。粘膜上皮細胞により吸収され、これらの細胞を通って間質に輸送されたアレルゲンは、循環液中に入る前にマスト細胞上のＩｇＥに結合する。ＩｇＥは、不快で時々非常に重く命さえ脅かし得るが、体内に存在するＩｇＥの量はごく僅かである。血清中のＩｇＥ濃度は、健常人よりもアトピー患者の方が一般的に高いが、ほとんどのヒトにおいて体内のＩｇＥの総量は１ｍｇ未満であると見積もられる。従って、ＩｇＥにより媒介される免疫機構並びにマスト細胞及び好塩基球の感作は、鋭敏な生物学的系であり、重大なアレルギー反応を誘起するのにごく僅かの抗原／アレルゲンしか必要とされない。例えば、ハチの毒に対して非常に敏感な人では、アレルギー性タンパク質はHymenoptera毒液中のマイナーな化学成分でしかないが、ハチの一刺しがアナフィラクティクショク又は死さえ引き起こす。あるいは、例えば、少数の花粉粒子又は動物のフケ粒子は、鼻腔内表面及び気管におけるアレルギー反応を引き起こすことができる。通常の状態では、人の体内に侵入するアレルゲンは純粋な形態にはない。吸入される花粉粒子、家塵ダニ及び動物のフケ中のアレルギー性分子は、粒子全体の中では比較的マイナーな成分である。例えば、塵ダニ（Dermatophagoides ptero nyssinus）が多数住み着いている家財の主なアレルギー性タンパクである抗原Ｐ₁ （Der p I）は、１グラムの塵中に約１０〜２０μｇ含まれる。Lau-Schadendor f，S．et al.，J．Allergy Clini．Immunol．87:41-47（1991）。アレルギー性タンパク質は、ダニの糞便中に含まれるシステインプロテアーゼである。診断や免疫治療に用いられるアレルギー性物質は、ほとんどの場合、草又は木の花粉、家塵及び猫や犬のフケのようなアレルギー性物質の抽出物である。これらの抽出物は粗雑であるので、世界保健機構のインターナショナル・ユニオン・オブ・イムノロジカル・ソサエティは、アレルゲンの生産、包装及び予備試験の標準を監督するアレルゲン標準化サブ委員会を設立した。多くのアレルギー性物質にとって、標準試験は抽出物中の主なアレルギー性タンパク質を定量するための分析である。過去数年間、増大するアレルギー性物質から主なアレルギー性タンパク質を同定し精製するより一層の努力が払われている。例えば、犬のフケから主なアレルゲンCan f I（抗原１３）が精製された。De Groot H.，et al.，Allergy Clin． Immunol．87：1056-1065（1991）。数ケ所のアカデミックな実験室では、抗原として精製アレルゲンタンパク質を用いた、アレルゲン特異的ＩｇＥ及びＩｇＧのための免疫化学的分析を提供している。Hamilton，R.G．及びAdkinson，Jr.， N.f．in Manual of Clinical Laboratory Immunology，eds．Rose，N.r．et al. ，pp.689-701，4th ed.，American Society of Microbiology，Washington，D.C ．（1992）；Hamilton，R.G．及びAdkinso，Jr.，N.F．ibid.，pp.702-708。これらの精製アレルゲンタンパク質及びヒトアレルゲン特異的ＩｇＧのための免疫化学的分析法の確立は、アレルゲンに特異的なＢ細胞クローン及びモノクローナル抗体の同定に有用である。より最近、数種類の主なアレルギー性タンパク質をコードする遺伝子がクローニングされた。例えば、主なダニ抗原Der p IのｃＤＮＡ（Chua，K.Y．et al.， J．Exp．Med．167：175-182（1988））及び猫の唾液中の主なアレルゲンFel d I ．（Morgenstrn，J.P．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．88:9690-9694 （1991）がクローニングされている。これらの遺伝子のクローニングにより、それらの発現及び組換えタンパク質の生産が可能になった。アレルゲン特異的ＩｇＥの生産がＩｇＥ媒介過敏症の主たる決定因子であるが、これが唯一の因子ではない。アレルゲンにさらされてはいるが感作されていない人は、該アレルゲンに特異的なＩｇＧを生産することが知られている。これらのアレルゲン特異的ＩｇＧは、防護的なブロッキング抗体として作用するものと信じられる。ＩｇＡに欠陥のある人達はＩｇＥ媒介アレルギーを起こしやすい。このことは、気管の粘膜表面に分泌されたＩｇＡが、捕獲されたアレルゲン粒子又は分子を中和又はブロックし、組織内への侵入を阻害することを示唆している。広く用いられている脱感作免疫治療においては、患者は、長期間にわたり少量のアレルゲンにより免疫される。患者の半数では、徴候を緩和するためにこの治療が有効であるが、この作用のメカニズムはよくわかっていない。１つの仮説として、治療によりＩｇＧブロッキング抗体が誘起されるということが考えられる。なぜなら、これらの効果体の濃度は、治療を受けている患者体内で高くなっているからである。アレルギーの治療はこの８０年間ほとんど変わっていない。脱感作免疫治療は、アレルギー性鼻炎患者にとっての主な治療法である。免疫活性を抑制するステロイドのような免疫抑制剤及びα−アルブテロールのような気管支拡張剤を用いた治療がアレルギー性喘息患者の主な治療法である。医学の進歩は、アレルギー性物質の分類の改良、患者のアレルゲンプロフィールを決定するための診断方法の改良及び免疫治療のためのアレルゲン抽出物の管理及びライブラリーの拡張に限定されてきた。研究サイドでは、アレルギー性物質中の主なアレルゲン分子成分の同定及び単離に進歩があった。例えば、ブタクサ（秋の花粉症における最も重要なアレルゲン）、家塵ダニ（アレルギー性喘息を引き起こす最も重要なアレルゲン）及び猫や犬のフケや唾液中の主なタンパク質成分が同呈され単離されている。数種類の主なアレルゲンをコードする遺伝子もまたクローニングされている。細胞融合又はエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）による形質転換を用いたヒトＢ細胞の不死化方法の開発により、目的の抗原特異性を有するヒトモノクローナル抗体を同定することが可能になった。ヒトＶ_H及びＶ_Lライブラリーを含む組換えファージの構築、結合Ｖ_H／Ｖ_Lの発現、及び抗原特異性を有する発現した抗体断片のスクリーニングのより最近の開発により、目的の抗体種を同定する強力な道具が加わった。さらに、遺伝子トランスフェクション及びミエローマ又は他のセルライン中での抗体遺伝子の発現の改良により、ヒトモノクローナル抗体を大量に生産することが可能になった。アレルギー治療のためにアレルゲン特異的抗体を用いることは、有望で実行可能であると思われる。発明の概要本発明は、アレルゲン特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ、好ましくはモノクローナルＩｇＡ又はＩｇＧ、より好ましくはヒトモノクローナルＩｇＡ及びＩｇＧ、並びに、これらの抗体を用いてアレルギー性分子が粘膜組織に侵入することを阻害する（「免疫排除」）ことによる、アレルギー性鼻炎、アレルギー性（外因性）喘息及びアレルギー性結膜炎のようなＩｇＥ媒介アレルギー性疾患の治療を行う、上記抗体の用途を包含する。ＩｇＡは粘液中のプロテアーゼによるタンパク分解に対して抵抗性がより高いので、ＩｇＡがより好ましい。本発明はまた、ポリマバックボーン又はマイクロビーズに結合された、アレルゲン特異的ＩｇＡ若しくはＩｇＧ又はF(ab')₂、Fab若しくはFvのような上記抗体の抗原結合性断片をも包含する。これらのポリマは非アレルギー性で無毒であり、適切に修飾することにより多くの抗体分子を結合させることが可能である。適当なポリマの例としてデキストラン、アガロース及びセルロースを挙げることができる。好ましいマイクロビーズはこれらのポリマーを架橋することにより製造することができる。ポリマとの結合体は、結合していない抗体又はその断片と比較して、粘膜上皮細胞によって吸収されにくく、また、粘膜の分泌物により洗い流されにくいのでより好ましい。アレルゲン特異的ＩｇＡ若しくはＩｇＧ又はそれらの関連構築物は、当該アレルゲンに対してアレルギー性の患者の粘膜組織に対して医薬溶液又は懸濁液の形態で投与される。該溶液又は懸濁液は、水、保存剤、界面活性剤及び他の標準的な成分を含むことができる。抗体は吸入された粒子から放出されるアレルギー性タンパク質（又は標的となる他の分子）に結合する。この結合により、アレルゲンが粘膜上皮組織細胞により吸収されることが防止され、従って、アレルギー性徴候が阻害される。アレルゲン特異的ＩｇＡ若しくはＩｇＧ又はそれらの関連構築物の好ましい医薬製剤は、これらと生理学的緩衝液を含むものであり、これらは滴下器による投与に適している。治療を行うべき鼻腔、目又は耳あたり約１〜２滴が投与される。該溶液中の活性成分の濃度は、１ｍｌあたり２０ないし１０００μｇ、すなわち１滴当たり約１〜５０μｇである。活性成分はまた、気管の一番下の粘膜に届くように、計量目盛り付き吸入器により投与される溶液の形態に製剤することも好ましい。濃度は上記と同様な範囲であり、溶液は２〜４時間毎に投与することができる。この場合、所望ならば消炎剤と共に投与してもよい。アレルゲンＩｇＡ若しくはＩｇＧ又はこれらのポリマ若しくはマイクロビーズとの結合体はアレルギー性物質の製造にも用いることができる。アレルギー性物質は、診断、及び脱感作免疫治療に用いることができる。本発明のアレルゲン特異的物質をアフィニティカラム上に吸着させ、ブタクサ、家庭塵及び犬や猫のフケのようなアレルギー性物質の粗抽出物から特異的アレルゲンを精製するために用いることができる。精製されたアレルゲンは、診断用途、すなわち、ある患者がその特定のアレルゲンに対してアレルギーであるか否かを調べること、及び脱感作免疫治療において、粗抽出物よりも良い抗原である。精製されたアレルゲン特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ並びにそれらの結合体はまた、患者中のアレルゲン特異的抗体の濃度を調べる診断分析における標準物質として用いることもできる。この分析は、その患者に脱感作免疫治療が有効であるか否かを決定するため、及び該治療が成功しつつあるか否かを決定するために有用である。本発明の物質が典型的に標的とするアレルゲンは、短ブタクサ（Ambrosia ela tor）中の主なアレルゲンであるAmb a I、家庭塵ダニ種（Dermatophagoides pte ronyssinus及びDermatophagoides farinae）からの主なアレルゲンであるDerp I 及びDer f I、家猫の唾液からの主なアレルゲンであるFel d I、家畜犬（Canis familiaris）のフケからの主なアレルゲンであるCan f Iを包含する。これらのアレルゲンは、好ましくはモノクローナル抗体の標的とされる。モノクローナル抗体は、当該アレルゲンに対して正常な感受性を有する患者又は当該アレルゲンによる脱感作免疫治療を受けている患者からのＢ細胞により生産される。これらのドナーからのＢ細胞は、ＮＳＯ又はＳｐ２／Ｏ細胞のようなミエローマ細胞と融合することにより、又はＥＢＶで形質転換することにより不死化される。これらの不死化セルラインにより分泌される抗体は、ＥＬＩＳＡ又は同等な免疫化学的分析により、目的のアレルゲンに対する特異的反応性がスクリーニングされる。抗体断片のＶ_H及びＶ_Lもまた、後述する結合Ｖ_H／Ｖ_Lライブラリー発現及びスクリーニング方法により同定することができる。本発明のＩｇＡ抗体を製造するために、所望の特異性を有する抗体のＶ_H領域をコードする領域を含むゲノムＤＮＡ断片が、ヒトα鎖の定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする領域を含むゲノムＤＮＡ断片と連結される。Ｖ_L のゲノム性ＤＮＡ断片は、ヒトκ又はλ鎖のゲノムＤＮＡ断片と連結される。得られた組換えＤＮＡ種を適当なプラスミドに導入し、これを用いてＮＳＯ又はＳｐ２／Ｏのような非生産性ミエローマセルラインの細胞をトランスフェクトする。上記複合ＤＮＡ断片の構築、該ＤＮＡによる受容セルラインのトランスフェクション及びアレルゲン／抗原に対して特異的なモノクローナルＩｇＡ抗体を生産しているトランスフェクタントをスクリーニングするための方法は、キメラ抗体を産生するトランスフェクトーマセルラインの調製方法と類似しており、周知である。発明の詳細な説明環境中に存在するアレルギー性分子の量及び生体中に存在するＩｇＥの量が少ないことから、アレルギー性分子が粘膜組織内に侵入することを防止又はブロックする特異的抗体を用いた治療は、少量の抗体を用いても有効に行えることが示唆される。もっとも、アレルギー性分子は、これが粘膜組織内に入ることがうまく阻害されるように、アレルゲン特異的抗体と接触可能でなければならない。アレルギー性タンパク質は、一旦粒子から放出されれば水溶液及び粘液に可溶である。粘膜は、粒子の内容物を消化し緩めることを助けるであろう加水分解酵素の宿主を含む。いずれにせよ、粘膜上皮は、花粉やダニ粒子の全体を吸収するのではなく、これらから放出された可溶性のアレルギー性分子がアレルギー反応を引き起こすことが推測される。花粉粒子や家塵粒子が重大なアレルギー性タンパク質を粘液中に分泌するという仮説は容易に試験することができる。例えば、集めた家塵をインビトロで鼻の分泌粘液と一緒に、種々の時間（１分〜３０分）インキュベートする。次いでこの混合物を遠心して粒子をペレット化する。上清中のDer p Iタンパク質の含量を、Der p Iの標準的な免疫化学的分析（後述）により測定する。この濃度が高いほど、本発明の治療がより有効であろう。上記のように、アレルギーのヒトはアレルゲン物質に対するＩｇＥを作るが、このようなアレルゲン特異的ＩｇＥの濃度は極めて低い。従って、アレルゲン特異的ＩｇＡ又はＩｇＧ抗体を作るために、アレルゲン特異的ＩｇＥを発現するＢ細胞クローンを単離し、Ｖ_H及びＶ_L遺伝子領域を単離し、これらの領域をＩｇＡ又はＩｇＧモノクローナル抗体の構築に用いることができる。また、キメラ抗体を作るための従来の技術を用いることもできる。しかしながら、アレルギー患者中のアレルゲン特異的ＩｇＥの濃度が低いので、アレルゲン特異的ＩｇＥを産生するＢ細胞を単離することは困難である。しかしながら、上記のように、あるアレルギー性タンパク質により感作されている患者は、アレルゲン特異的ＩｇＥのみならずアレルゲン特異的ＩｇＧも合成する。アレルゲン特異的ＩｇＧの濃度はアレルゲン特異的ＩｇＥの濃度よりもはるかに高い。Ishizaka，K．in A11ergy+ Principles and Practice，eds．Middleton， Jr.，E.，et al.，pp.52-70，3rd ed.，The C.V．Mosby Co.，St．Louis（1988 ）。 Hamilton，R.G.及びAdkinson，Jr．N.F.により、Manual of Clinical Laborator y Immunology，eds．Rose，N.R．et al.，pp.702-708，4th ed．American Socie ty of Microbiology，Washington，D.C．（1992）において報告されているように、アレルゲンで繰り返し免疫されている、脱感作免疫治療を受けた患者中のアレルゲン特異的ＩｇＧ濃度は、非免疫患者中のアレルゲン特異的ＩｇＧ濃度よりもはるかに高い。従って、アレルゲンで免疫されている患者は、アレルゲン特異的ＩｇＧを産生するＢ細胞クローン及び／又は抗体遺伝子を単離するためのリンパ球を提供する論理的な供給源である。アレルゲン特異的ＩｇＧ産生Ｂ細胞クローンの実際的な供給源の１つは、あるアレルゲンに対して感受性を有し、該アレルゲンにより免疫されたことがある又は免疫されつつある患者である。これらの患者は、彼らを治療しているアレルギスト／医師により特定することができる。免疫による改善の程度は、その患者が当該アレルゲン／免疫原に対するかなりの免疫応答を起こしたことを示している。これらの患者中のアレルゲン特異的ＩｇＧの濃度は、アレルゲン特異的ＩｇＧのための分析方法を用いることにより定量することができる。Hamilton，R.G.及びAdkinson，Jr．N.F.、Manual of Clinical Laboratory Immunology，eds．Ros e，N.R．et al.，pp.702-708，4th ed．American Society of Microbiology，Wa shington，D.C．（1992）参照。これらの患者からの末梢血は、それからアレルゲン特異的ＩｇＧのＶ_H及びＶ_Lをコードする遺伝子を単離することができる、アレルゲン特異的ＩｇＧ産生Ｂ細胞の供給源として用いることができる。ＥＢＶ形質転換若しくはミエローマ細胞（ＮＳＯ細胞のような）との融合又はこれらの組合せによるヒトＢ細胞の不死化のための確立された方法は、不死化細胞を作るために用いることができる。Ｂ細胞クローンを作るためのＥＢＶ形質転換方法は、最近、ステップ・バイ・ステップ形式にまとめられた。Tosato，G.， Current Protocols in Immunology，eds．Coligan，J.E．et al.，§7.22.1，Jo hn Wiley and Sons，new York（1991）。同様に、ネズミ科動物又はヒトリンパ球に対して用いることができる、ハイブリドーマを調製するためのステップ・バイ・ステップ形式の操作方法はYokoyama，W.M．ibid．at §2.5に記載されている。これらの方法はまた、所望の抗原特異性を有する抗体を分泌している不死化Ｂ細胞クローンをスクリーニングする方法、Ｂ細胞クローンの連続的サブクローニング及び抗体の生産のための方法をも記載している。実施例２には、アレルゲン特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの検出及び測定のための酵素結合免疫吸着分析（ＥＬＩＳＡ）の設計及び使用が記載されている。アレルゲン特異的抗体をコードする遺伝子を同定し単離する別の方法としては、「Ｖ_H／Ｖ_L結合ライブラリー」法を採用する方法がある。先ず、ドナーの末梢血からＢ細胞を単離する。Ｖ領域の５’末端をカバーする縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）法によりＶ_H 及びＶ_Lライブラリーを個々に調製する。次いで、Ｖ_H断片及びＶ_L断片が共に発現されて抗体結合領域を形成するように、これら両断片を１つの発現ベクターに組み込む。ユニークなスクリーニング方法を用いる数種類の発現系が開発されている。バクテリオファージλベクター中で結合Ｖ_H／Ｖ_Lライブラリーを発現させ、これを大腸菌コロニーの溶解物中にＦａｂ断片の形で表す方法が詳細に記載された。Ba rbas，C.F.及びLearner，R.A.，Methods：Companion Methods Enzymol．2：119- 124（1991）。抗原結合アフィニティマトリックスにより単離することができるＶ_H／Ｖ_Lを、糸状ファージｆｄの表面上に発現させる方法がMcCafferty J．et a l.によりNature 348：552-554（1990）に記載された。吸入された又は接触するアレルゲンを排除する生物学的効果を達成するためには、アレルゲン特異的ＩｇＡもＩｇＧも良く機能する。しかしながら、粘膜表面いおいてはＩｇＡが主なアイソタイプであるので、粘膜に適用するための好ましいアレルゲン特異的抗体はＩｇＡアイソタイプである。アレルゲン特異的ＩｇＧ抗体のＶ_H及びＶ_LのゲノムＤＮＡ断片を制限酵素を用いてクローニングする方法、これらの断片をヒトα及びκ（又はλ）のゲノムＤＮＡ領域と連結する方法、ＮＳＯ又はＳＰ２／Ｏのような非生産ミエローマ細胞に上記ＤＮＡをトランスフェクトする方法、アレルゲン特異的ＩｇＡを分泌するトランスフェクタントをスクリーニングする方法、及び安定な分泌者を選抜するための連続的クローニング方法は、キメラ抗体を分泌するトランスフェクトーマを調製する方法と同様にして行うことができる。これらの方法は、種々の研究者により詳細に記載されており、この分野において周知である。Morrison，S.L．et al.，Proc．Natl．Aca d．Sci U.S.A．81：6851-6855（1984）；Liou，R.S．et al.，J．Immunol．143 ：3967-3975（1989）参照。ＩｇＡはモノマーの形態でもダイマーの形態でも存在する。循環液中のＩｇＡはほとんどモノマーであり、一方、粘膜及び他の外部液中に分泌されるＩｇＡはほとんどダイマーである。ダイマーの形態は、さらにＪ鎖（１５０００ダルトン）及び分泌成分（７００００ダルトン）を有し、これらは両方ともＩｇＡ分子の α鎖に共有結合により結合されている。Ｊ鎖はＩｇＡを生産する細胞と同一の細胞により生産され、２個のＩｇＡモノマー分子の間を架橋する。分泌成分は上皮細胞により合成され、ＩｇＡ−Ｊ鎖ダイマーが粘膜の上皮細胞を通過する間に、ＩｇＡ−Ｊ鎖ダイマーのＦｃ領域に結合する。ダイマー性ＩｇＡはモノマー性ＩｇＡよりも粘液中で安定であるので、生体内での治療用途のためにはＩｇＡダイマーを用いることが好ましい。ダイマー形態のＩｇＡを製造するためには、組換えα及びκ（又はλ）鎖のための遺伝子と共にＪ鎖をコードする遺伝子でもミエローマ宿主細胞をトランスフェクトしなければならない。そうすると、宿主細胞はダイマー性ＩｇＡを生産するであろう。モノマー性又はダイマー性ヒトモノクローナルＩｇＡ抗体は、おそらく粘膜表面に導入することができる外来性抗体分子としては最もネイティブであり最も良く許容できるものである。これらの分子は「免疫排除」機能を達成し、アレルギー性分子が粘膜組織に侵入することを防ぐものと予想される。外来性アレルギー性分子とＩｇＡにより形成される複合体は粘膜上皮細胞により吸収されないという性質を免疫系は進化により獲得した。鼻腔内表面上の免疫複合物は、鼻腔を通した粘液排泄物が外に向って排除されるので、これにより排泄される。気管及び気管支の気道上の免疫複合物及び他の吸入粒子は、口の中に排除されるであろう。口に入った粘液は、唾液と混合され、嚥下され、胃腸管により消化されるであろう。粘膜表面上の粘液からアレルギー性分子をよりよく吸着し排除し、複合化したアレルゲンが粘膜上皮細胞によって吸収されることを防止するために、アレルゲン特異的ＩｇＡ又はF(ab')₂、Fab若しくはFvのようなその抗原結合性部位をポリマバックボーン又はマイクロビーズに結合することができる。アレルゲン特異的ＩｇＧ及びその断片もまたこのような結合体に用いることができる。好ましいポリマはデキストラン、アガロース、セルロース及び、不活性で、非アレルギー性で非免疫原性であることが知られている他のポリマ物質を包含する。化学的修飾により活性部位を生成させると、ポリマバックボーンは多数の抗体分子を結合するための部位を提供することができる。マイクロビーズは好ましくは０．１〜１０μｍの直径を有し、上記ポリマから成る。これらのマイクロビーズの懸濁液は静かに振盪することにより均一にすることができるので、影響を受けた粘膜組織に適用するのに好ましい。アレルゲン特異的モノクローナル抗体を投与する形態は数種類の因子に依存する。アレルゲン特異的製剤が適当か否かを決定するために、その特定のアレルゲンがその患者にとっての主なアレルギー誘起分子であるか否かを診断する必要がある。患者が数種類のアレルギー性分子に対して感受性である場合には、これらのアレルゲンの１つずつに対してそれぞれ特異的な複数のＩｇＡモノクローナル抗体を含む製剤を用いることもできる。上述のように、ほとんどの場合、粘膜表面に入るアレルゲンの量は極めて僅かである。しかしながら、分泌粘液は粘膜組織により定常的に排出される。このことから、アレルゲン特異的免疫グロブリン（ＩｇＡ又はＩｇＧ）を含む溶液又は懸濁液は、少量でよいが頻繁に投与すべきであることが示唆される。鼻腔内表面、目又は耳に対する個々の適用において、鼻腔、目又は耳当たり１〜５０μｇの免疫グロブリンで十分であると見積もられる。各患者の鼻又は目からの分泌の速さに応じて、製剤を約２時間ないし６時間毎に投与することができる。アレルギー性喘息に関与する粘膜表面の面積ははるかに大きいので、喘息治療のためにこれらの表面に適用される免疫グロブリンは、より多くの量が必要であろう。製剤は、鼻腔内表面、目及び耳に対して、滴下器、好ましくは、鼻腔、目及び耳に対して１〜２滴を配給することができる滴下器により投与することができる。免疫グロブリンの濃度は２０ないし１０００μｇ／ｍｌである。溶液は２〜５ｍｌのビンに入れて冷蔵庫中で保存できる。一旦開封すると、そのビンは１週間以内に使用するべきである。喘息治療のためには、ほぼ同濃度のアレルゲン特異的免疫グロブリンを含む溶液又は懸濁液を、計量目盛り付き吸入器を用いて気道の下部に投与することができる。アレルゲン特異的ＩｇＡ及びＩｇＧ並びにそれらのポリマ及びマイクロビーズとの結合体はまた、純粋で安全なアレルギー性物質の製造に用いることができる。製造されるアレルギー性物質は種々の診断分析及び脱感作免疫治療に用いることができる。アレルゲン特異的抗体は、ブタクサ、草及び木の花粉、猫や犬のフケのようなアレルギー性物質の粗抽出物からの、原因となる特異的アレルゲンを精製するためのアフィニティカラム上へ吸着することができる。精製されたアレルゲンはアレルゲン抽出物を作るために用いることができる。精製されたアレルゲンは診断分析及び脱感作免疫治療のためには粗抽出物よりも良い抗原である。精製されたアレルゲン特異的ＩｇＡ及びＩｇＧはまた、免疫治療を受けている患者の体内のアレルゲン特異的抗体を測定するための診断分析における標準として用いることもできる。これらの分析は免疫治療の有効性をモニタする上で有用である。実施例１：Der p Iに対して特異的なＩｇＧを産生する血液ドナーの選択家庭塵ダニに対して高い感受性を有する患者及びダニ抽出物による脱感作免疫治療を受けた又は受けている患者は、アレルギークリニック、例えば、Thomas R ．Woehler博士により経営される、テキサス州、ヒューストンにあるテキサスアレルギー喘息免疫学アソシエーツにおいて特定することができる。患者の血液サンプルの研究を行うためのプロトコールは、このクリニックを監督するインスティチューショナル・レビュー・ボードにより容認されている。患者からの血清が Der p Iに対して特異的なＩｇＧを含むか否かの試験は、例えばDer p I特異的ＩｇＧ分析を日常的に行っている、ジョン・ホプキンス・ユニバシティ・オブ・メディシン（メリーランド州ボルチモア）のレファレンス・ラボラトリ・フォア・ダーマトロジー、アレルギー・アンド・クリニカル・イムノロジーにおいて行われるであろう。血清中のDer p I 異的ＩｇＧはまた、下記実施例２に記載したＥＬＩＳＡを用いて調べられる。 Der p I 特異的ＩｇＧの血清力価の高い患者を血液ドナーーとしてリクルートされるであろう。血液は、抗原特異的免疫グロブリン産生Ｂ細胞クローンを単離するために用いられるであろう。実施例２：Der p l 特異的ＩｇＧ及びＩｇＡのためのＥＬＩＳＡの確立オーストラリア国パークビルのコモンウェルス・シーラム・ラボラトリーズから購入した家ダニの試料から、ルーチンなＰＣＲ法によりDer p I のｃＤＮＡがクローニングされる。このｃＤＮＡの配列は出版されており、当業者に知られている。Chua, K.Y. et al., J. Exp. Med. 167： 175-182 (1988)。ＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドプライマーの配列は、利用できるｃＤＮＡ配列から容易に設計することができる。数種類の市販のシステムの１つを用いることにより、ｃＤＮＡを大量に発現させることができる。好ましい発現系は、昆虫のウイルスであるバキュロウイルス (Autographa californica) の核多面体タンパク質遺伝子から誘導された発現ベクターを用いる系である。このウイルスは、Sprodoptera frugiperdaからの昆虫細胞であるｓｆ９細胞中で増殖させることができる。Luck ow，V.A.及びSummers, M.D. Virology 167:31 (1989)。この発現系は便利なキットにパッケージされており（商品名「Max Bac Baculovirus Express System」）、インビトロジェン社（カリフォルニア州サンジエゴ）から市販されている。十分な量のDer p I が調製された後、精製されたタンパク質は不死化Ｂ細胞クローン又はトランスフェクトーマの培養上清中のヒトＩｇＧ又はＩｇＡを検出す分析するＥＬＩＳＡのための固相抗原として用いられるであろう。ＥＬＩＳＡの好ましい態様では、ビオチン標識抗ヒトＩｇＧヤギＩｇＧ及び抗ヒトＩｇＡヤギＩｇＧ並びにセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合アビジンが用いられる。Harl ow, E. and Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual. pp.553-612,Cold Spr ing Harbor Laboratory (1988)。ＥＬＩＳＡはまた、ヒト血清中のDerp I特異的ＩｇＧを定量するために用いることもできる。実施例３：Amb a I 特異的ＩｇＡの調製１．患者末梢血リンパ球からのセルラインの確立ブタクサ抽出物を包含するアレルゲンで免疫化されていた１５人の患者から合計１６の血液試料を採取した。精製した末梢血リンパ球を先ずＥＢＶによる形質転換により不死化し、次いでマウスミエローマセルライン６５３と融合した。得られたクローンからの培養上清は、プラスチックコートAmb a I タンパク質（Gr eer Laboratoryにより９５％の純度に調製されたもの）及びセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ (Ｆｃ) ヤギ抗体を用いたＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。合計１３のセルラインを増殖させ、サブクローニングによりさらに特徴付けした。Amb a1特異的ＩｇＧ４，κ抗体を分泌している単一の細胞サブクローンAL 16-5.2 を、組換えＤＮＡ技術によるＩｇＡ１へのクラス変更のために選んだ。２．Al 16-5.2 のＨ鎖及びＬ鎖遣伝子のクローニング Al 16-5.2 細胞から全ＲＮＡを調製し、オリゴｄＴプライマーを用いて第１鎖ｃＤＮＡを調製した。該第１鎖ｃＤＮＡを鋳型とし、５’及び３’κＬ鎖プライマー（表１）を用いてＰＣＲを行ったところ、予想したサイズの増幅バンドが得られた。この増幅されたＤＮＡ断片を含む数種類のサブクローンのＤＮＡ配列を決定した。このヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列が配列番号１に示されている。ヒトＨ鎖Ｖ遺伝子のリーダー領域又はフレームワーク領域から誘導されたオリゴヌクレオチドプライマーのセットを５’プライマーとして用い、ヒトＣγ領域から誘導されたオリゴヌクレオチドを３’プライマーとして用いてＰＣＲを行うと、Ｖ_Hとして予想されるサイズのＤＮＡ断片は増幅されなかった。 AL 16-5.2 細胞のＶ_H遺伝子を以下のようにしてアンコールド (anchored) ＰＣＲによりクローン化した。オリゴNotI-CG1（表１）をプライマーとして用いて AL16-5.2 の二本鎖ｃＤＮＡを調製した。アニールしたアダプター（表１）をｃＤＮＡの５’末端及び３’末端の両方に加えた。３’からＣ領域までのアダプターはＮｏｔＩ消化により除去した。消化物を鋳型とし、アダプタープライマーを５’プライマーとし、ＣＧ２を３’プライマーとして（表１）ＰＣＲを行った。次いでオリゴＡＮＣを５’プライマーとし、ＣＧ３を３’プライマーとして、反応混合物について２回目のＰＣＲを行った。５００ｂｐないし６５０ｂｐの長さのＤＮＡ断片を精製し、ｐｕｃ１９にサブクローニングした。コロニーをγ−³² Ｐ標識オリゴＣＧ４プローブ（表１）とハイブリダイズした。完全長ｃＤＮＡ挿入物を含む陽性クローンのＤＮＡ配列を分析した。４種類のオリゴヌクレオチドNotI-CG1、ＣＧ２、ＣＧ３及びＣＧ４は全て４種類のヒトＩｇＧサブクラスのコンセンサス領域から誘導されたものであった。該Ｖ_H遺伝子のヌクレオチド配列及びその推定アミノ酸配列を配列番号２に示す。 AL 16-5.2の推定Ｌ鎖配列をヒトＶ領域配列と比較することにより、AL 16-5.2 のＬ鎖はヒトＶ_KIIIサブグループに属することが示される。AL 16-5.2 Ｈ鎖配列は、これがヒトＶ_HIIIサブグループに属することを示している。３．発現ベクターの構築免疫グロブリンプロモーター、エンハンサーエレメント及び高生産ネズミ科動物ハイブリドーマＴＢ１０２細胞のＨ鎖部位から誘導されたリーダー配列を含むＴＢ１０２ホローベクターにAL 16-5.2 のＶ_K遺伝子を挿入した。ヒトＣ_K領域及びｎｅｏ遺伝子を含むベクターに、プロモーター、エンハンサー及びＴＢ１０２Ｈ鎖部位のリーダー並びにAL 16-5.2 のＶ_K遺伝子のコード領域を含むＤＮＡ断片をクローニングし、κＬ鎖発現プラスミドpSV neo 16-5.2 V_K-hC_Kを得た。同様に、ヒトＣγ１領域及びｇｐｔ遺伝子を含むベクター中にAL 16-5.2 のＶ_H遺伝子のコード配列及びＴＢ１０２のフランキング配列を含むＤＮＡ断片をクローニングし、γＨ鎖発現プラスミドpSV2 gpt 16-5.2V_H-h Ｃγ１を得た。４．Amba1結合ＩｇＡを分泌するセルラインの生成 κＬ鎖及びγＨ鎖の発現ベクターの両方の直線化したプラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションによりマウスミエローマＮＳＯ細胞に導入した。トランスフェクトした細胞は、κ及びγ鎖プラスミドＤＮＡの取り込みを行うために、０．１５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８、０．１μｇ／ｍｌのミコフェノール酸及び５０μｇ／ｍｌのキサンチンを含む培地中で増殖した。プラスチックコートAmb a1及びセイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＡヤギ抗体を用いたＥＬＩＳＡにより、トランスフェクタントの培養上清中にAmb a1結合ＩｇＡが生産されているか否かを調べた。数種類のセルラインからの培養上清が、さらなる分析のための精製ＩｇＡの調製に用いられるであろう。表１（Ａ）Ｌ鎖及び（Ｂ）Ｈ鎖クローニングのための合成オリゴヌクレオチドプライマーの設計なお、用語、表現及び実施例は例示のためのみであって限定的なものではなく、当業者はここに記載した本発明の特定の具体例の多くの均等物を認識し、またルーチンな実験を行うことにより確かめることができるであろう。このような全ての均等物は下記請求の範囲に含まれることを意図する。配列表配列番号：１配列の長さ：３２５配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：２配列の長さ：３７６配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：３配列の長さ：３５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：４配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：５配列の長さ：１６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：６配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：７配列の長さ：２４配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：８配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：９配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列配列番号：１０配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/08 9358−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＵ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＤ

Claims

【特許請求の範囲】１．粘膜組織への投与に適した、アレルゲン特異的ＩｇＡの医薬懸濁液又は溶液。２．前記アレルゲンはAmb a I、Der p I、Der f I、Can f I又はFel d Iである請求項１記載の医薬懸濁液又は溶液。３．水及び保存料をさらに含む請求項１記載の医薬懸濁液又は溶液。４．界面活性剤をさらに含む請求項３記載の医薬懸濁液又は溶液。５．ポリマバックボーンと、共有結合により結合された複数のアレルゲン特異的結合分子を含む結合体。６．前記ポリマはデキストラン、アガロース又はセルロースである請求項５記載の結合体。７．前記アレルゲン結合分子はアレルゲン特異的ＩｇＡ若しくはＩｇＧ又はこれらのＦ(ab')₂断片、Fab断片若しくはFv断片である請求項５記載の結合体。８．前記アレルゲンは、Amb a I、Der p I、Der f I、Can f I又はFel d Iである請求項５記載の結合体。９．ポリマバックボーンと、共有結合により結合された複数のアレルゲン特異的結合分子を含む医薬製剤。１０．水、界面活性剤及び保存料をさらに含む請求項９記載の医薬製剤。