JP2022172170A5 - - Google Patents
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[0001] EFS-WEBを介して提出された配列表の参照
[0002] 81.9kbサイズの「20180103_034044_169WOl_seq_ST25」と命名された配列表のASCIIテキストファイルの内容は、2018年1月3日に作成し、本出願とともにEFS-Webを介して電子的に提出され、参照により全体として本明細書に援用される。
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[0003] 政府支援の承認
[0004] 本発明は、National Institutes of Healthにより授与された助成金番号2R44AI102279-03A1のもと政府支援によりなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
[0004] 本発明は、National Institutes of Healthにより授与された助成金番号2R44AI102279-03A1のもと政府支援によりなされた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
[0005] 本発明の背景
[0006] 1.本発明の分野
[0007] 本発明は、一般に、IgGへの低親和性結合を有するヒト化抗体に関する。
[0006] 1.本発明の分野
[0007] 本発明は、一般に、IgGへの低親和性結合を有するヒト化抗体に関する。
[0008] 2.関連分野の説明
[0009] 免疫グロブリンE(IgE)は、ヒトにおける抗体の5つの主要なクラスの1つを構成する。IgEは、2つのε重鎖及び2つのκ軽鎖又は2つのλ軽鎖からなる単一の4鎖単位である。IgEは、μ重鎖産生からε重鎖産生への重鎖クラススイッチングを受けたB細胞により合成及び分泌される。IgEは血液中の総Igの1パーセント未満を占めるが、この免疫グロブリンは、アレルギー応答における中心的な役割を担うものである。
[0009] 免疫グロブリンE(IgE)は、ヒトにおける抗体の5つの主要なクラスの1つを構成する。IgEは、2つのε重鎖及び2つのκ軽鎖又は2つのλ軽鎖からなる単一の4鎖単位である。IgEは、μ重鎖産生からε重鎖産生への重鎖クラススイッチングを受けたB細胞により合成及び分泌される。IgEは血液中の総Igの1パーセント未満を占めるが、この免疫グロブリンは、アレルギー応答における中心的な役割を担うものである。
[0010] 即時型アレルギー応答、即時型過敏性又はI型アレルギー応答は、IgE及びFcεRI(IgEについての高親和性受容体)を含む複合体により媒介される。この複合体は、エフェクター細胞、例えば、肥満細胞及び好塩基球の表面上のFcεRI受容体への分泌IgE抗体のFc領域の結合時に形成される。次いで、結合したIgE抗体は、I型アレルギー応答を誘発するアレルゲンと称されるそれらの抗原についてのエフェクター細胞表面受容体として機能する。抗原(例えば、アレルゲン)がFcεRI結合IgEに結合して隣接IgE/FcεRI複合体を架橋する場合、それは、エフェクター細胞にヒスタミン及び他の生物活性メディエーターをエキソサイトーシスにより放出するようにシグナリングする。
[0012] 本発明の概要
[0013] 一部の実施形態において、本発明は、DTAVYYCAR(配列番号7)を含むVH鎖並びにLQAED(配列番号11)とAAPSV(配列番号12)、GTKL(配列番号13)、及びRFSGS(配列番号14)から選択される少なくとも1つの配列とを含むVL鎖を含むモノクローナル抗体(hLAAIGE)を提供する。
[0013] 一部の実施形態において、本発明は、DTAVYYCAR(配列番号7)を含むVH鎖並びにLQAED(配列番号11)とAAPSV(配列番号12)、GTKL(配列番号13)、及びRFSGS(配列番号14)から選択される少なくとも1つの配列とを含むVL鎖を含むモノクローナル抗体(hLAAIGE)を提供する。
[0014] 一部の実施形態において、VH鎖は、WVRQAPG(配列番号8)、及びGLEW(配列番号9)、及び/又はVTVSSA(配列番号10)を含む。一部の実施形態において、VH鎖は、
である。一部の実施形態において、VH鎖は、以下の配列VQLX1QSG(配列番号17)、PGX2SX3X4X5SCX6ASGX7TF(配列番号18)、WVRQAPGX8GLEW(配列番号19)、WGX9GTX10VTVSSA(配列番号20)、SLX11X12X13DAVYYCAR(配列番号21)、及びRX14X15X16X17X18DX19SX20X21T(配列番号22)のいずれか1つ以上を含み、X1~X21は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、VH鎖は、以下の配列VQLX1QSG(配列番号17)、PGX2SX3X4X5SCX6ASGX7TF(配列番号18)、WVRQAPGX8GLEW(配列番号19)、WGX9GTX10VTVSSA(配列番号20)、SLX11X12X13DTVYYCAR(配列番号21)、及びRX14X15X16X17X18DX19SX20X21T(配列番号22)のいずれか1つ以上を含み、XIは、V又はG、好ましくは、Vであり、X2は、A又はR、好ましくは、Aであり、X3は、L又はV、好ましくは、Vであり、X4は、K又はR、好ましくは、Kであり、X5は、L又はV、好ましくは、Vであり、X6は、A又はK、好ましくは、Kであり、X7は、F又はY、好ましくは、Yであり、X8は、K又はQ、好ましくは、Qであり、X9は、R又はQであり、X10は、L又はTであり、X11は、T、K、又はRであり、X12は、A又はSであり、X13は、E又はDであり、X14は、F又はVであり、X15は、T又はVであり、X16は、I、F、又はMであり、X17は、S又はTであり、X18は、L、R、又はTであり、X19は、N又はT、好ましくは、Tであり、X20は、K、T、又はVであり、X21は、N又はS、好ましくは、Sである。一部の実施形態において、VH鎖は、配列番号2に対して約75%~約100%、好ましくは、約80%~約100%、より好ましくは、約90%~100%、よりさらに好ましくは、約95%~約100%、最も好ましくは、約99%~100%の同一性パーセントを有する配列を含む。一部の実施形態において、VH鎖は、配列番号68、配列番号69、又は配列番号70を含む。一部の実施形態において、VH鎖は、配列番号1に対して少なくとも約90%から100%まで、好ましくは、約91%から100%まで、より好ましくは、約95%から100%まで、よりさらに好ましくは、約97%から100%まで、最も好ましくは、約99%から100%までの同一性パーセントを有する配列を含む。一部の実施形態において、VH鎖は、配列番号23の少なくとも10、20、30、40、又は50個の連続アミノ酸残基を含む。一部の実施形態において、VH鎖は、配列番号23を含む。
である。一部の実施形態において、VH鎖は、以下の配列VQLX1QSG(配列番号17)、PGX2SX3X4X5SCX6ASGX7TF(配列番号18)、WVRQAPGX8GLEW(配列番号19)、WGX9GTX10VTVSSA(配列番号20)、SLX11X12X13DAVYYCAR(配列番号21)、及びRX14X15X16X17X18DX19SX20X21T(配列番号22)のいずれか1つ以上を含み、X1~X21は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、VH鎖は、以下の配列VQLX1QSG(配列番号17)、PGX2SX3X4X5SCX6ASGX7TF(配列番号18)、WVRQAPGX8GLEW(配列番号19)、WGX9GTX10VTVSSA(配列番号20)、SLX11X12X13DTVYYCAR(配列番号21)、及びRX14X15X16X17X18DX19SX20X21T(配列番号22)のいずれか1つ以上を含み、XIは、V又はG、好ましくは、Vであり、X2は、A又はR、好ましくは、Aであり、X3は、L又はV、好ましくは、Vであり、X4は、K又はR、好ましくは、Kであり、X5は、L又はV、好ましくは、Vであり、X6は、A又はK、好ましくは、Kであり、X7は、F又はY、好ましくは、Yであり、X8は、K又はQ、好ましくは、Qであり、X9は、R又はQであり、X10は、L又はTであり、X11は、T、K、又はRであり、X12は、A又はSであり、X13は、E又はDであり、X14は、F又はVであり、X15は、T又はVであり、X16は、I、F、又はMであり、X17は、S又はTであり、X18は、L、R、又はTであり、X19は、N又はT、好ましくは、Tであり、X20は、K、T、又はVであり、X21は、N又はS、好ましくは、Sである。一部の実施形態において、VH鎖は、配列番号2に対して約75%~約100%、好ましくは、約80%~約100%、より好ましくは、約90%~100%、よりさらに好ましくは、約95%~約100%、最も好ましくは、約99%~100%の同一性パーセントを有する配列を含む。一部の実施形態において、VH鎖は、配列番号68、配列番号69、又は配列番号70を含む。一部の実施形態において、VH鎖は、配列番号1に対して少なくとも約90%から100%まで、好ましくは、約91%から100%まで、より好ましくは、約95%から100%まで、よりさらに好ましくは、約97%から100%まで、最も好ましくは、約99%から100%までの同一性パーセントを有する配列を含む。一部の実施形態において、VH鎖は、配列番号23の少なくとも10、20、30、40、又は50個の連続アミノ酸残基を含む。一部の実施形態において、VH鎖は、配列番号23を含む。
[0015] 一部の実施形態において、VL鎖は、LQAED(配列番号11)と(a)AAPSV(配列番号12)又は(b)RFSGS(配列番号14)及びGTKL(配列番号13)とを含む。一部の実施形態において、VL鎖は、
を含み、それぞれのXは、独立して、任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、VL鎖は、以下の配列RFSGSX22SG(配列番号24)、LTX23SX24LQAEDX25AX26YY(配列番号25)、FGX27GTKL(配列番号26)、AAPSVX28X29FPPSX30EX3lL(配列番号27)、AX32X33VCLX34X35X36FYP(配列番号28)、HX37X38YX39CX40VTHX41G(配列番号29)、PX42SX43X44X45SX46GX47X48X49TIX50C(配列番号30)、QX51X52PGX53X54PKLX55IY(配列番号31)のいずれか1つ以上を含み、X22~X55は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、VL鎖は、以下の配列RFSGSX22SG(配列番号24)、LTX23SX24LQAEDX254AX26YY(配列番号25)、FGX27GTKL(配列番号26)、AAPSVX28X29FPPSX30EX31L(配列番号27)、AX32X33VCLX34X35X36FYP(配列番号28)、HX37X38YX39CX40VTHX41G(配列番号29)、PX42SX43X44X45SX46GX47X48X49TIX50C(配列番号30)、QX51X52PGX53X54PKLX55IY(配列番号31)のいずれか1つ以上を含み、X22は、G又はKであり、X23は、I又はVであり、X24は、G又はSであり、X25は、E又はVであり、X26は、D又はVであり、X27は、G、S、又はQであり、X28は、F又はTであり、X29は、I又はLであり、X30は、D又はSであり、X31は、E又はQであり、X32は、S又はTであり、X33は、L又はVであり、X34は、I又はLであり、X35は、N又はSであり、X36は、D又はNであり、X37は、K又はRであり、X38は、S又はVであり、X39は、A又はSであり、X40は、E又はQであり、X41は、E又はQであり、X42は、A、D、又はPであり、X43は、A、L、又はVであり、X44は、A又はSであり、X45は、G又はVであり、X46は、L又はPであり、X47は、E又はQであり、X48は、R又はSであり、X49は、A、I、又はVであり、X50は、N又はSであり、X51は、H又はQ、好ましくは、Qであり、X52は、H又はKであり、X53は、K又はQであり、X54は、A又はPであり、X55は、L又はMである。一部の実施形態において、VL鎖は、配列番号4に対して少なくとも約65%から100%までの同一性パーセントを有する配列を含む。一部の実施形態において、VL鎖は、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態において、VL鎖は、配列番号32、配列番号65、又は配列番号67を含む。
を含み、それぞれのXは、独立して、任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、VL鎖は、以下の配列RFSGSX22SG(配列番号24)、LTX23SX24LQAEDX25AX26YY(配列番号25)、FGX27GTKL(配列番号26)、AAPSVX28X29FPPSX30EX3lL(配列番号27)、AX32X33VCLX34X35X36FYP(配列番号28)、HX37X38YX39CX40VTHX41G(配列番号29)、PX42SX43X44X45SX46GX47X48X49TIX50C(配列番号30)、QX51X52PGX53X54PKLX55IY(配列番号31)のいずれか1つ以上を含み、X22~X55は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、VL鎖は、以下の配列RFSGSX22SG(配列番号24)、LTX23SX24LQAEDX254AX26YY(配列番号25)、FGX27GTKL(配列番号26)、AAPSVX28X29FPPSX30EX31L(配列番号27)、AX32X33VCLX34X35X36FYP(配列番号28)、HX37X38YX39CX40VTHX41G(配列番号29)、PX42SX43X44X45SX46GX47X48X49TIX50C(配列番号30)、QX51X52PGX53X54PKLX55IY(配列番号31)のいずれか1つ以上を含み、X22は、G又はKであり、X23は、I又はVであり、X24は、G又はSであり、X25は、E又はVであり、X26は、D又はVであり、X27は、G、S、又はQであり、X28は、F又はTであり、X29は、I又はLであり、X30は、D又はSであり、X31は、E又はQであり、X32は、S又はTであり、X33は、L又はVであり、X34は、I又はLであり、X35は、N又はSであり、X36は、D又はNであり、X37は、K又はRであり、X38は、S又はVであり、X39は、A又はSであり、X40は、E又はQであり、X41は、E又はQであり、X42は、A、D、又はPであり、X43は、A、L、又はVであり、X44は、A又はSであり、X45は、G又はVであり、X46は、L又はPであり、X47は、E又はQであり、X48は、R又はSであり、X49は、A、I、又はVであり、X50は、N又はSであり、X51は、H又はQ、好ましくは、Qであり、X52は、H又はKであり、X53は、K又はQであり、X54は、A又はPであり、X55は、L又はMである。一部の実施形態において、VL鎖は、配列番号4に対して少なくとも約65%から100%までの同一性パーセントを有する配列を含む。一部の実施形態において、VL鎖は、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態において、VL鎖は、配列番号32、配列番号65、又は配列番号67を含む。
[0016] 一部の実施形態において、hLAAIGEは、ヒトIgEに結合する。一部の実施形態において、hLAAIGEは、ヒトFcεRI又は高親和性IgE受容体に結合しているヒトIgEに結合する。一部の実施形態において、hLAAIGEにより認識されるIgEエピトープは、配列番号33の少なくとも10個の連続アミノ酸残基を含む。一部の実施形態において、hLAAIGEにより認識されるIgEエピトープは、以下の配列:配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、及び配列番号45の1つ以上を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる。一部の実施形態において、hLAAIGEにより認識されるIgEエピトープは、以下の配列:配列番号35、配列番号39、配列番号42、及び配列番号36の少なくとも1つを含む。
[0017] 一部の実施形態において、hLAAIGEは、ヒト化抗体である。一部の実施形態において、hLAAIGEは、約1×10-5M~約1×10-9MのKd、約1×10-6M~約1×10-9MのKd、又は約5×10-5~約7×10-8MのKdの結合親和性でヒトIgEに結合する。一部の実施形態において、hLAAIGEは、本明細書に開示されるE59、E14、E17、E23、S91、又はH6.2である。
[0018] 一部の実施形態において、本発明は、1つ以上のhLAAIGEを含む組成物を提供する。一部の実施形態において、組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む。
[0019] 一部の実施形態において、本発明は、対象をIgE媒介障害について治療する方法であって、1つ以上のhLAAIGE又はその組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、IgE媒介障害は、アレルギー反応である。一部の実施形態において、アレルギー反応は、急性IgE媒介食物アレルギー反応である。一部の実施形態において、IgE媒介障害は、食物アレルギー、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、血管性浮腫、又はアナフィラキシー型過敏症である。一部の実施形態において、本発明は、対象を肥満細胞症について治療する方法であって、1つ以上のhLAAIGE又はその組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態において、1つ以上のhLAAIGE又はその組成物は、IgE媒介アレルギー反応の発症前に投与する。一部の実施形態において、本発明による1つ以上の抗体及び所与のアレルゲンを対象に同時投与して対象をアレルゲンに対して脱感作する。
[0020] 一部の実施形態において、1つ以上のhLAAIGE又はその組成物は、対象に3~10週間毎に投与する。一部の実施形態において、1つ以上のhLAAIGE又はその組成物は、対象に3~8週間毎に投与する。一部の実施形態において、1つ以上のhLAAIGE又はその組成物は、対象に4~8週間毎に投与する。一部の実施形態において、1つ以上のhLAAIGE又はその組成物は、対象に4~6週間毎に投与する。一部の実施形態において、1つ以上のhLAAIGE又はその組成物は、対象に4~5週間毎に投与する。一部の実施形態において、1つ以上のhLAAIGE又はその組成物は、対象に月1回投与する。一部の実施形態において、治療有効量の本発明による1つ以上のhLAAIGEを対象に投与する。
[0021] 上記の一般的な説明及び以下の詳細な説明の両方は、例示的及び説明的なものにすぎず、特許請求される本発明のさらなる説明を提供するものとする。添付の図面を含めて本発明のさらなる理解を提供し、それは本明細書に組み込まれ、その一部を構成し、本発明のいくつかの実施形態を説明し、詳細な説明と一緒に本発明の原理を説明する。
[0022] 図面の説明
[0023] 本発明は、以下の図面を参照してさらに理解される。
[0023] 本発明は、以下の図面を参照してさらに理解される。
[0034] 定義
[0035] 特に示されない限り、本明細書において使用される全ての科学及び技術用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味を有する。
[0035] 特に示されない限り、本明細書において使用される全ての科学及び技術用語は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解される意味を有する。
[0036] 用語「抗体」及び「免疫グロブリン」は、任意のアイソタイプの抗体又は免疫グロブリン、全抗体(例えば、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの2つの二量体から順次構成される四量体から構成される抗体);半抗体;単鎖抗体;IgEへの特異的結合を保持する抗体の断片(例えば、全、半、又は単鎖抗体の断片)、例として、限定されるものではないが、Fab、Fv、scFv、及びダイアボディ;キメラ抗体;ヒト化抗体(例えば、ヒト化全抗体、ヒト化半抗体、又はヒト化抗体断片)並びに抗体の抗原結合部分及び非抗体タンパク質を含む融合タンパク質を含む。抗体は、例えば、放射性同位体、検出可能な生成物を生成する酵素、蛍光タンパク質などにより検出可能に標識することができる。抗体は、他の部分、例えば、特異的結合ペアのメンバー、例えば、ビオチン(ビオチン-アビジン特異的結合ペアのメンバー)などにさらにコンジュゲートすることができる。抗体は、固体支持体、例として、限定されるものではないが、ポリスチレンプレート又はビーズなどに結合させることもできる。Fab’、Fv、F(ab’)2及び又は抗原への特異的結合を保持する他の抗体断片、並びにモノクローナル抗体も本用語に包含される。抗体は、一価(例えば、半抗体の場合)又は二価であり得る。
[0037] 「抗体断片」は、インタクト抗体の一部、例えば、インタクト抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例としては、Fab、Fab’、F(ab’)2及びFv断片;ダイアボディ;直鎖抗体(Zapata, et al, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995));並びに抗体断片から形成される多重特異的抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化は、それぞれが単一の抗原結合部位を有する「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映する表記である残留「Fc」断片とを産生する。ペプシン処理は、2つの抗原結合部位を有し、抗原を依然として架橋し得るF(ab’)2断片を生じさせる。
[0038] 「半抗体」は、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの二量体から構成され、重鎖及び軽鎖は非共有及び/又は共有結合(例えば、ジスルフィド)結合により結合していてよい抗体を指す。半抗体は、ヒト重鎖定常領域を含む重鎖、及びヒト軽鎖定常領域を含む軽鎖を含み得る。2つの同一の重鎖及び2つの同一の軽鎖からなり、したがって、2つの同一の抗原結合部位を有する「全」又は「完全」抗体と対照的に、半抗体は、単一の抗原結合部位を有する(すなわち、一価である)。以下により詳述されるとおり、半抗体は、抗IgE抗体の重鎖をコードする核酸を遺伝子改変することにより、例えば、重鎖二量体化を促進する1つ以上の重鎖アミノ酸残基(例えば、1、2、又はそれ以上のシステイン)を、そのような二量体化を促進しない(例えば、妨げる)アミノ酸で置換することにより、又はアミノ酸が異なる重鎖の残基ともはや相互作用し得ないように重鎖二量体化を促進する1つ以上の重鎖アミノ酸残基(例えば、1、2、又はそれ以上のシステイン)を翻訳後改変することにより生成することができる。
[0039] 抗体に関して使用される「一価」は、単一抗原結合領域を含有する抗体を指す。抗体に関して使用される「二価」は、2つの抗原結合領域を含有する抗体を指す。
[0040] 「Fv」は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体断片である。この領域は、1つの重鎖可変ドメイン及び1つの軽鎖可変ドメインのタイトな非共有結合の二量体からなる。この構成において、それぞれの可変ドメインの3つのCDRが相互作用してVH-VL二量体の表面上の抗原結合部位を画定する。全体として、6つのCDRが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン(又は抗原について特異的な3つのみのCDRを含むFvの半分)であっても、親和性は結合部位全体よりも低くなるが、抗原を認識し、それに結合する能力を有する。
[0041] 「Fab」断片も、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第1の定常ドメイン(CH1)を含有する。Fab断片は、重鎖CH1ドメインのカルボキシル末端における、抗体ヒンジ領域からの1つ以上のシステインを含む数個の残基の付加の点で、Fab’断片とは異なる。Fab’-SHは、定常ドメインのシステイン残基がフリーチオール基を担持するFab’の本明細書における表記である。F(ab’)2抗体断片は、元来、断片間にヒンジシステインを有するFab’断片のペアとして産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも公知である。
[0042] 任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ及びラムダと呼ばれる2つの明確に異なるタイプの1つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスに割り当てることができる。5つの主要なクラスの免疫グロブリン:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMが存在し、それらのいくつかは、サブクラス(アイソタイプ)、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA及びIgA2にさらに分類することができる。
[0043] 「単鎖Fv」又は「sFv」抗体断片は、抗体のVH及びVLドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖中に存在する。一部の実施形態において、Fvポリペプチドは、VHドメイン及びVLドメイン間に、sFvの抗原結合に望ましい構造の形成を可能とするポリペプチドリンカーをさらに含む。
[0044] 用語「ダイアボディ」は、同一のポリペプチド鎖(VH-VL)中で軽鎖可変ドメイン(VL)に連結している重鎖可変ドメイン(VH)を含む、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を指す。同一鎖上の2つのドメイン間の対合を許容しないほど短いリンカーを使用することにより、ドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対合させ、2つの抗原結合部位を作出する。例えば、Hollinger, et al, PNAS USA, 90:6444-6448(1993)参照。
[0045] 本明細書において使用される用語「親和性」は、2つの作用物質の可逆的結合についての平衡定数を指し、解離定数(Kd)として表現される。親和性は、無関連アミノ酸配列についての抗体の親和性よりも少なくとも1倍大きく、少なくとも2倍大きく、少なくとも3倍大きく、少なくとも4倍大きく、少なくとも5倍大きく、少なくとも6倍大きく、少なくとも7倍大きく、少なくとも8倍大きく、少なくとも9倍大きく、少なくとも10倍大きく、少なくとも20倍大きく、少なくとも30倍大きく、少なくとも40倍大きく、少なくとも50倍大きく、少なくとも60倍大きく、少なくとも70倍大きく、少なくとも80倍大きく、少なくとも90倍大きく、少なくとも100倍大きく、若しくは少なくとも1,000倍大きく又はそれ以上大きいものであり得る。標的タンパク質に対する抗体の親和性は、例えば、約100ナノモル濃度(nM)~約0.1nM、約100nM~約1ピコモル濃度(pM)、若しくは約100nM~約1フェムトモル濃度(fM)又はそれ以上であり得る。本明細書において使用される用語「アビディティ」は、希釈後の2つ以上の作用物質の複合体の解離に対する抵抗性を指す。用語「免疫反応性」、「優先的に結合する」、及び「特異的に結合する」は、抗体及び/又は抗原結合断片に関して、本明細書において互換的に使用される。用語「結合」は、例えば、共有結合性、静電性、疎水性、並びにイオン性及び/又は水素結合相互作用、例として、塩橋及び水橋のような相互作用に起因する2つの分子間の直接的会合を指す。対象の抗IgEは、IgEポリペプチド内のエピトープに特異的に結合する。
[0046] 「CDR」又は「相補性決定領域」は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される不連続抗原結合部位を意味する。CDRは、Kabat, et al., J. Biol. Chem. 252:6609-6616(1977);Kabat, et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of proteins of immunological interest”(1991)により;Chothia, et al., J. Mol. Biol. 196:901-917(1987);及びMacCallum, et al., J. Mol. Biol. 262:732-745(1996)により記載されており、この定義は互いに対して比較した場合のアミノ酸残基の重複又は下位集団を含む。
[0047] 本明細書において使用され、抗体可変領域に関して使用される用語「フレームワーク」は、抗体の可変領域内のCDR領域外の全てのアミノ酸残基を意味するものとする。可変領域フレームワークは、一般に、約100~120アミノ酸長の不連続アミノ酸配列であるが、CDR外のそれらのアミノ酸のみを言及するものとする。本明細書において使用される用語「フレームワーク領域」は、CDRにより離隔されるフレームワークのそれぞれのドメインを意味するものとする。
[0048] 「単離」抗体は、その天然環境の構成成分から同定及び分離並びに/又は回収された抗体である。その天然環境の汚染構成成分は、抗体についての診断又は治療的使用を妨害する材料であり、それとしては、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を挙げることができる。一部の実施形態において、hLAAIGEは、(1)ローリー法により決定して90重量%超、95重量%超、若しくは98%重量超、例えば、99重量%超の抗体に精製され、(2)スピニングカップシークエネーター(spinning cup sequenator)の使用によりN末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも15個の残基を得るために十分な程度に精製され、又は(3)クーマシーブルー若しくは銀染色を使用して還元若しくは非還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により均一に精製される。単離抗体としては、組換え細胞内のインサイチューの抗体が挙げられる。それというのも、抗体の天然環境の少なくとも1つの構成成分が存在しないためである。一部の実施形態において、単離抗体は、少なくとも1つの精製ステップにより精製される。
[0049] 本明細書において使用される用語「ヒト化抗体」は、非ヒト種に由来し、ヒト抗体との類似性を増加させるように改変されたタンパク質配列を有する抗体を指す。ヒト化抗体を作製する方法は、当分野において公知である。例えば、米国特許出願第7,256,273号参照。ヒト化抗体は、レシピエント抗体中でも、インポートCDR又はフレームワーク領域中でも見出されない残基を含み得る。Queen, et al., PNAS USA 86:10029 10033(1989)、米国特許第5, 530,101号、米国特許第5,585,089号、米国特許第5,693,761号、国際公開第90/07861号、及び米国特許第5,225,539号参照。ヒト化抗体は、天然存在ヒト抗体の配列を有し得、又はいくつかのヒト抗体のコンセンサス配列であり得る。Kettleborough, et al., Protein Engineering 4:773(1991);Kolbinger, et al., Protein Engineering 6:971(1993)参照。
[0050] 本明細書において使用される用語、配列「同一性」パーセントは、下記の配列比較アルゴリズムの1つ(例えば、BLASTP及びBLASTN又は当業者が利用可能な他のアルゴリズム)を使用して又は目視調査により計測して、最大対応について比較及びアラインして同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の規定の割合を有する2つ以上の配列又は下位配列を指す。用途に応じて、「同一性」パーセントは、比較される配列の領域にわたり、例えば、機能ドメインにわたり存在し、或いは、比較すべき2つの配列の全長にわたり存在し得る。
[0051] 配列比較のため、典型的には、ある配列は、試験配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験及び参照配列をコンピュータ中に入力し、必要により下位配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定プログラムパラメータに基づき、参照配列に対する試験配列についての配列同一性パーセントを計算する。
[0052] 比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482(1981)の局所相同性アルゴリズムにより、Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443(1970)の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson & Lipman, PNAS USA 85:2444(1988)の類似性検索法により、それらのアルゴリズム(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、及びTFASTA)のコンピュータ化実装により、又は目視調査により実施することができる。
[0053] 配列同一性パーセント及び配列類似性の決定に好適なアルゴリズムの一例は、BLASTアルゴリズムであり、それは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410(1990)に記載されている。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information(ncbi.nlm.nih.gov)を介して公的に利用可能である。
[0054] 本明細書において使用される用語「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」は、ヒト及び非ヒト動物を指すために互換的に使用される。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物及び非哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物(例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、及びヤギ)、げっ歯類、及び他の獣医学的対象及び試験動物を含む。
[0055] 「生物試料」は、個体から得られる種々の試料タイプを包含し、診断又はモニタリングアッセイにおいて使用することができる。この定義は、血液及び生物起源の他の液体試料、固体組織試料、例えば、生検標本又は組織培養物若しくはそれに由来する細胞及びその子孫を包含する。この定義は、それらの調達後に任意の手法で、例えば、試薬による処理、可溶化、又はある構成成分、例えば、ポリヌクレオチドの濃縮により操作された試料も含む。用語「生物試料」は、臨床試料を包含し、それとしては、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物体液、及び組織試料が挙げられる。一部の例において、生物試料としては、肥満細胞、好塩基球、好酸球、B細胞などが挙げられる。
[0056] 本明細書において使用される用語「I型アレルギー反応」、「即時型過敏症」、「アトピー性アレルギー」、「I型過敏症」などは、身体に流入した抗原が、細胞上の高親和性受容体FcεRIに付着しているIgEにより感作された肥満細胞又は好塩基球に遭遇する場合に生じる生理学的応答を指す。アレルゲンが感作肥満細胞又は好塩基球に到達した場合、それは表面結合IgEを架橋し、細胞内カルシウム(Ca2+)の増加を引き起こし、それが事前に形成されたメディエーター、例えば、ヒスタミン及びプロテアーゼ、並びに新たに合成された脂質由来メディエーター、例えば、ロイコトリエン及びプロスタグランジンの放出を誘発する。これらのオータコイドは、アレルギーの臨床症状を産生する。さらに、サイトカイン、例えば、IL-4、TNF-アルファが脱顆粒好塩基球及び肥満細胞から放出され、IgE反応を伴う炎症応答を増大させるように機能する(例えば、Immunology, Fifth Edition, Roitt, et al., eds., 1998, pp. 302-317参照)。感受性又はアレルギー対象における過敏症反応の具体的な顕在化は、アレルゲン曝露の部位、アレルゲン曝露の用量、対象における器官(例えば、過剰反応性の肺又は鼻腔)の反応性及びその対象におけるアレルゲンに対する免疫応答の完全武装に依存する。
[0057] I型過敏症応答に伴う症状及び徴候は、関与し得る広範な組織及び器官に起因して極端に変動する。これらの症状及び徴候としては、皮膚、眼、及び咽喉の掻痒、皮膚の腫れ及び発赤(血管性浮腫及び蕁麻疹/ハイブス(hives))、声帯区域の腫れに起因する嗄声及び呼吸困難、身体のあらゆる箇所で生じ得る持続性の凹凸でかさつきを伴う赤い発疹、息切れ及び喘鳴(気道中の筋肉の緊張及び気道の閉塞、すなわち、気管支収縮から)、さらに粘液及び体液産生の増加、気道筋の構築に起因する胸部圧迫感及び疼痛、悪心、嘔吐下痢、低血圧からの眩暈及び失神、頻拍又は不整脈及びさらには気道及び/又は心臓障害の結果としての死亡を挙げることができる。
[0058] ある範囲の値が提供される場合、文脈がそうでないことを明確に記述しない限り、その範囲の上限及び下限間の、下限の単位の10分の1までのそれぞれの介在値並びにその記述範囲中の任意の他の記述又は介在値は、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲に含めることができ、同様に本発明内に包含され、記述範囲中の任意の具体的に除外される限界の対象となる。
[0059] 本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される単数形「a」、「an」、及び「the」は、文脈がそうでないことを明確に記述しない限り、複数の参照対象を含む。したがって、例えば、「抗体」又は「半抗体」への言及は、複数のこのような抗体又は半抗体を含み、「CDR」への言及は、1つ以上のCDR及び当業者に公知のその等価物への言及を含む、などである。特許請求の範囲は、任意の任意選択要素を除外するように起草することができることがさらに留意される。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の引用に関する「専ら」、「のみ」などのような排他的な用語の使用、又は「負の」限定の使用のための先行詞として機能するものとする。
[0060] 「又は」の使用は、文脈がそうでないことを記述しない限り、「及び/又は」を含む。本明細書において使用される「及び/又は」は、「及び」又は「又は」を意味する。例えば、「A及び/又はB」は、「A、B、又はA及びBの両方」を意味し、「A、B、C、及び/又はD」は、「A、B、C、D、又はそれらの組合せ」を意味し、前記「それらの組合せ」は、A、B、C、及びDの任意の下位集団、例えば、単一メンバー下位集団(例えば、A又はB又はC又はD)、2メンバー下位集団ト(例えば、A及びB;A及びC;など)、又は3メンバー下位集団(例えば、A、B、及びC;又はA、B、及びD;など)、又は4つ全てのメンバー(例えば、A、B、C、及びD)を意味する。
[0061] 語句「~を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる」は、過剰な頁及び翻訳料を回避するためのツールとして使用され、一部の実施形態において、当該の所与のものが何らかのものを含み、一部の実施形態において、当該の所与のものが何らかのものからなることを意味する。例えば、文章「一部の実施形態において、組成物は、Aを含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる」は、以下の2つの別個の文章が記載されていると解釈すべきである:「一部の実施形態において、組成物は、Aを含む。一部の実施形態において、組成物は、本質的にAからなる。一部の実施形態において、組成物は、Aからなる」。同様に、一連の代替物を引用する文章は、それぞれの所与の代替物が1つの文章でそれ自体で提供されるように一連の文章が提供されるものと解釈すべきである。例えば、文章「一部の実施形態において、組成物は、A、B、又はCを含む」は、以下の3つの別個の文章が記載されているものと解釈すべきである:「一部の実施形態において、組成物は、Aを含む。一部の実施形態において、組成物は、Bを含む。一部の実施形態において、組成物は、Cを含む」。
[0062] 本発明の詳細な説明
[0063] 本発明は、ヒトIgEに対する約1×10-5M~約1×10-9MのKd、好ましくは、約1×10-6M~約1×10-9MのKd、より好ましくは、約1×10-6M~約1×10-8MのKd(「Biacore法」、すなわち、骨髄腫IgEと結合しているCM5センサーチップを有するBiacore T2000機器を使用する表面プラズモン共鳴により計測(参照により全体として本明細書に援用されるZhang, et al. J. Immunol. (2017)DOI:10. 4049/j immunol. 1602022参照)の低い結合親和性を示すヒト化抗体を提供する。本発明によるヒト化低親和性抗IgE抗体は、本明細書において「hLAAIGE」と称される。
[0063] 本発明は、ヒトIgEに対する約1×10-5M~約1×10-9MのKd、好ましくは、約1×10-6M~約1×10-9MのKd、より好ましくは、約1×10-6M~約1×10-8MのKd(「Biacore法」、すなわち、骨髄腫IgEと結合しているCM5センサーチップを有するBiacore T2000機器を使用する表面プラズモン共鳴により計測(参照により全体として本明細書に援用されるZhang, et al. J. Immunol. (2017)DOI:10. 4049/j immunol. 1602022参照)の低い結合親和性を示すヒト化抗体を提供する。本発明によるヒト化低親和性抗IgE抗体は、本明細書において「hLAAIGE」と称される。
[0064] hLAAIGEの安全性プロファイル
[0065] 本明細書に例示されるhLAAIGEの安全性プロファイルを上記の複数のアプローチ及び方法により重点的に評価し、図1~図8にまとめた。フローサイトメトリーベースの好塩基球活性化試験(BAT)については、BAT活性化のマーカーとしての血液好塩基球の強力なCD63発現を誘導した陽性BAT対照(E4.15、高親和性抗ヒトIgE mAb、及びfMLP、非IgE-FcεRI経路を介する好塩基球アクチベーター)とは対照的に、hLAAIGEクローンE59(図1)、E14、E17、E23、及びS91(図2)は、50μg/mlまでの濃度で好塩基球CD63発現も誘導せず、好塩基球ヒスタミン放出も誘発しない(図3)。E14、E17、E23、及びE59はファウンダーE17から誘導し、S91はファウンダーF11から誘導し、H6.2はファウンダーP6.2から誘導した。100μg/mlまでの濃度におけるこれらのhLAAIGEは、培養皮膚肥満細胞(図4)及び新たに単離された肺肥満細胞(図5)の脱顆粒(脱顆粒マーカーとしてβ-ヘキソアミニダーゼ-αを使用)を誘発しなかった。hFcεRIα Tgマウスモデルについては、hLAAIGEは、50μg/mlまで局所PCA反応を誘発せず(図6)、全身性アナフィラキシー(データ示さず、一例としてE59からのデータを使用、図7及び図8)も誘発しない。これらの包括的データは、選択されたhLAAIGEが脱顆粒/アレルギーエフェクター細胞からのメディエーター放出を誘発する能力を欠くことを実証した。
[0065] 本明細書に例示されるhLAAIGEの安全性プロファイルを上記の複数のアプローチ及び方法により重点的に評価し、図1~図8にまとめた。フローサイトメトリーベースの好塩基球活性化試験(BAT)については、BAT活性化のマーカーとしての血液好塩基球の強力なCD63発現を誘導した陽性BAT対照(E4.15、高親和性抗ヒトIgE mAb、及びfMLP、非IgE-FcεRI経路を介する好塩基球アクチベーター)とは対照的に、hLAAIGEクローンE59(図1)、E14、E17、E23、及びS91(図2)は、50μg/mlまでの濃度で好塩基球CD63発現も誘導せず、好塩基球ヒスタミン放出も誘発しない(図3)。E14、E17、E23、及びE59はファウンダーE17から誘導し、S91はファウンダーF11から誘導し、H6.2はファウンダーP6.2から誘導した。100μg/mlまでの濃度におけるこれらのhLAAIGEは、培養皮膚肥満細胞(図4)及び新たに単離された肺肥満細胞(図5)の脱顆粒(脱顆粒マーカーとしてβ-ヘキソアミニダーゼ-αを使用)を誘発しなかった。hFcεRIα Tgマウスモデルについては、hLAAIGEは、50μg/mlまで局所PCA反応を誘発せず(図6)、全身性アナフィラキシー(データ示さず、一例としてE59からのデータを使用、図7及び図8)も誘発しない。これらの包括的データは、選択されたhLAAIGEが脱顆粒/アレルギーエフェクター細胞からのメディエーター放出を誘発する能力を欠くことを実証した。
[0066] 好塩基球活性化を誘導するポリクローナル抗IgEとは対照的に、E59は、CD63発現を誘導しなかった(図9)。E59は、弱いCD203c発現も誘発した(図10)。
[0067] hLAAIGEの治療効果
[0068] ピーナッツ及びネコアレルギー対象の血液好塩基球活性化試験(BAT)、ヒトFcεRIαトランスジェニックマウスモデルにおけるピーナッツアレルギーIgE媒介受動皮膚アナフィラキシー(PCA)並びにダンシル-IgE媒介全身性アナフィラキシーを用いてhLAAIGEの治療効果を評価した。図11~図14に提示されるBATデータは、ピーナッツ(図11及び図12)及びネコ(図13及び図14)アレルギー対象BATの両方がhLAAIGEにより用量依存的にかなり抑制されることを示し、それらの選択されたhLAAIGEがピーナッツ及びネコアレルギーBATの両方に対するかなりの遮断効果を示すことを実証した。hFcεRIα Tgマウスモデルにおいて、hLAAIGEは、ピーナッツアレルギーIgE媒介PCA(図15~図17)及びダンシル-IgE媒介全身性アナフィラキシー(図18及び図19)を抑制した。
[0068] ピーナッツ及びネコアレルギー対象の血液好塩基球活性化試験(BAT)、ヒトFcεRIαトランスジェニックマウスモデルにおけるピーナッツアレルギーIgE媒介受動皮膚アナフィラキシー(PCA)並びにダンシル-IgE媒介全身性アナフィラキシーを用いてhLAAIGEの治療効果を評価した。図11~図14に提示されるBATデータは、ピーナッツ(図11及び図12)及びネコ(図13及び図14)アレルギー対象BATの両方がhLAAIGEにより用量依存的にかなり抑制されることを示し、それらの選択されたhLAAIGEがピーナッツ及びネコアレルギーBATの両方に対するかなりの遮断効果を示すことを実証した。hFcεRIα Tgマウスモデルにおいて、hLAAIGEは、ピーナッツアレルギーIgE媒介PCA(図15~図17)及びダンシル-IgE媒介全身性アナフィラキシー(図18及び図19)を抑制した。
[0069] hLAAIGEの作用機序の確認
[0070] hLAAIGEクローンE59が優れた安全性プロファイル及び治療効果を呈したため、E59を使用してhLAAIGEの作用機序を確認した。FITC標識ヒトIgE感作hFcεRIα陽性骨髄由来肥満細胞(BMMC)については、IgEは大部分が細胞表面中で確認され、対照hIgG1処理BMMCにおいて細胞内緑色シグナルは最小であった。対照的に、E59処理BMMCは、共焦点セクションにおける全てのレベルを介して分散した有意な細胞内IgE(緑色シグナル)を呈したが、hIgG1対照処理BMMCは呈さず(図20及び図21)、E59は表面IgEの内在化を誘発するが、対照hIgG1は誘発しないことを実証した。
[0070] hLAAIGEクローンE59が優れた安全性プロファイル及び治療効果を呈したため、E59を使用してhLAAIGEの作用機序を確認した。FITC標識ヒトIgE感作hFcεRIα陽性骨髄由来肥満細胞(BMMC)については、IgEは大部分が細胞表面中で確認され、対照hIgG1処理BMMCにおいて細胞内緑色シグナルは最小であった。対照的に、E59処理BMMCは、共焦点セクションにおける全てのレベルを介して分散した有意な細胞内IgE(緑色シグナル)を呈したが、hIgG1対照処理BMMCは呈さず(図20及び図21)、E59は表面IgEの内在化を誘発するが、対照hIgG1は誘発しないことを実証した。
[0071] 皮膚肥満細胞の顆粒の表現型の電子顕微鏡観察試験において、PBS(対照として)処理皮膚肥満細胞は、大部分が、インタクトな電子密度顆粒(緑色矢印)を示し、緩徐型脱顆粒(PD、赤色矢印)の徴候は最小であり(図22)、正常皮膚肥満細胞も肥満細胞の生物学的な正常機能として低レベルのPDを受けることを示した。E59処理肥満細胞(30分間50μg/ml)は、顆粒の見かけ上典型的なPD変化を呈し(図23)、E59が顆粒のPD様変化を誘導することを示した。アナフィラキシー型脱顆粒についての陽性対照として、ポリクローナル抗IgE抗体により処理された皮膚肥満細胞は、細胞内顆粒のほとんどを融合した明らかなアナフィラキシー型脱顆粒を示し、PD表現型の残留量は電子顕微鏡観察において可視的であった(図24)。まとめると、これらのデータは、hLAAIGE E59が表面IgE内在化、及び緩徐型脱顆粒を誘発することを実証した。
[0072] BLAST配列アラインメントツール及び分析の使用を使用してヒト化クローンE59、E14、E17、E23、及びS91の配列を分析した。ヒト化クローンのVH配列の最小同一性パーセント(配列全体にわたる)は、約91%である。したがって、一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、以下の配列番号1に対して少なくとも約90%から100%まで、好ましくは、約91%から100%まで、より好ましくは、約95%から100%まで、よりさらに好ましくは、約97%から100%まで、最も好ましくは、約99%から100%までの同一性パーセントを有するVH配列を有する:
[0074] したがって、一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、配列番号2に対して約75%~約100%、好ましくは、約80%~約100%、より好ましくは、約90%~100%、よりさらに好ましくは、約95%~約100%、最も好ましくは、約99%~100%の同一性パーセントを有するVH配列の一部を有する。
[0075] したがって、一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、配列番号1に対して少なくとも約90から100%までの同一性パーセントを有するVH配列を有し、VH配列の一部は、配列番号2に対して約75%~約100%、好ましくは、約80%~約100%、より好ましくは、約90%~100%、よりさらに好ましくは、約95%~約100%、最も好ましくは、約99%~100%の同一性パーセントを有する。
[0077] したがって、一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、配列番号3に対して少なくとも約99%から100%までの同一性パーセントを有するVL配列を有する。
[0078] しかしながら、第5のヒト化クローンは、VL配列の一部、すなわち、以下の配列番号4にわたり4つのヒト化クローンと約65%~約68%の同一性パーセントを有する:
YMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLESGVPDRFSGS(配列番号4)。
YMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLESGVPDRFSGS(配列番号4)。
[0079] したがって、一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、配列番号4に対して少なくとも約65%から100%までの同一性パーセントを有するVL配列の一部を有する。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、配列番号4に対して約65%~約70%の同一性パーセントを有するVL配列の一部を有する。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、
YMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLESGVPDRFSGS(配列番号4)
YMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLKAGVPDRFSGS(配列番号5)
YVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGS(配列番号6)
からなる群から選択されるVL配列の一部を有する。
YMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLESGVPDRFSGS(配列番号4)
YMHWYQQKPGQPPKLLIYYASNLKAGVPDRFSGS(配列番号5)
YVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSKRPSGVPDRFSGS(配列番号6)
からなる群から選択されるVL配列の一部を有する。
[0080] 一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、配列番号3に対して少なくとも約99%から100%までの同一性パーセントを有するVL配列、及び配列番号2に対して約75%~約100%、好ましくは、約80%~約100%、より好ましくは、約90%~100%、よりさらに好ましくは、約95%~約100%、最も好ましくは、約99%~100%の同一性パーセントを有するVH配列を有する。
[0081] BLASTアラインメントを使用するさらなる配列分析は、本発明によるhLAAIGEが、DTAVYYCAR(配列番号7)、WVRQAPG(配列番号8)、GLEW(配列番号9)、及びVTVSSA(配列番号10)を含むVH鎖、並びにLQAED(配列番号11)、AAPSV(配列番号12)、GTKL(配列番号13)、及びRFSGS(配列番号14)を含むVL鎖を含むことを明らかにした。
[0083] 一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、VQLX1QSG(配列番号17)、PGX2SX3X4X5SCX6ASGX7TF(配列番号18)、WVRQAPGX8GLEW(配列番号19)、WGX9GTX10VTVSSA(配列番号20)、SLX11X12X13DTAVYYCAR(配列番号21)、及びRX14X15X16X17X18DX19SX20X21T(配列番号22)を含むVH鎖を含み、X1~X21は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、X1は、V又はG、好ましくは、Vであり、X2は、A又はR、好ましくは、Aであり、X3は、L又はV、好ましくは、Vであり、X4は、K又はR、好ましくは、Kであり、X5は、L又はV、好ましくは、Vであり、X6は、A又はK、好ましくは、Kであり、X7は、F又はY、好ましくは、Yであり、X8は、K又はQ、好ましくは、Qであり、X9は、R又はQであり、X10は、L又はTであり、X11は、T、K、又はRであり、X12は、A又はSであり、X13は、E又はDであり、X14は、F又はVであり、X15は、T又はVであり、X16は、I、F、又はMであり、X17は、S又はTであり、X18は、L、R、又はTであり、X19は、N又はT、好ましくは、Tであり、X20は、K、T、又はVであり、X21は、N又はS、好ましくは、Sである。一部の実施形態において、VH鎖は、
の少なくとも10、20、30、40、又は50個の連続アミノ酸残基を含む。
の少なくとも10、20、30、40、又は50個の連続アミノ酸残基を含む。
[0084] 一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、RFSGSX22SG(配列番号24)、LTX23SX24LQAEDX25AX26YY(配列番号25)、FGX27GTKL(配列番号26)、AAPSVX28X29FPPSX30EX31L(配列番号27)、AX32X33VCLX34X35X36FYP(配列番号28)、HX37X38YX39CX40VTHX41G(配列番号29)、PX42SX43X44X45SX46GX47X48X49TIX50C(配列番号30)、QX51X52PGX53X54PKLX55IY(配列番号31)を含むVL鎖を含み、X22~X55は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である。一部の実施形態において、X22は、G又はKであり、X23は、I又はVであり、X24は、G又はSであり、X25は、E又はVであり、X26は、D又はVであり、X27は、G、S、又はQであり、X28は、F又はTであり、X29は、I又はLであり、X30は、D又はSであり、X31は、E又はQであり、X32は、S又はTであり、X33は、L又はVであり、X34は、I又はLであり、X35は、N又はSであり、X36は、D又はNであり、X37は、K又はRであり、X38は、S又はVであり、X39は、A又はSであり、X40は、E又はQであり、X41は、E又はQであり、X42は、A、D、又はPであり、X43は、A、L、又はVであり、X44は、A又はSであり、X45は、G又はVであり、X46は、L又はPであり、X47は、E又はQであり、X48は、R又はSであり、X49は、A、I、又はVであり、X50は、N又はSであり、X51は、H又はQ、好ましくは、Qであり、X52は、H又はKであり、X53は、K又はQであり、X54は、A又はPであり、X55は、L又はMである。一部の実施形態において、VL鎖は、
を含み、X56は、A又はSであり、X57は、E又はKであり、X58は、A又はSである。
を含み、X56は、A又はSであり、X57は、E又はKであり、X58は、A又はSである。
[0085] 一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、約1×10-5M~約1×10-9MのKd(Biacore法により計測)の低親和性でヒトIgEに結合する。具体的には、本明細書において例示されるhLAAIGEは、約5×10-5M~約7×10-8MのKdの親和性でヒトIgEに結合する。一部の実施形態において、hLAAIGEにより認識されるIgEエピトープは、
の少なくとも10個の連続アミノ酸残基を含む。一部の実施形態において、hLAAIGEにより認識されるIgEエピトープは、以下の配列YQCRVTHPHLPR(配列番号34)、YQCRVTHPHLPRALM(配列番号35)、EYQCRVTHPHLPR(配列番号36)、ETYQCRVTHPHLPRALM(配列番号37)、PRGVSAYLSR(配列番号38)、NPRGVSAYLSR(配列番号39)、PSPFDLFIRK(配列番号40)、RPSPFDLFI(配列番号41)、RPSPFDLFIRK(配列番号42)、PRGVSAYLSRPSPFDLFI(配列番号43)、PRGVSAYLSRPSPFDLFIRK(配列番号44)、及びNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRK(配列番号45)の1つ以上を含み、又は本質的にそれからなり、又はそれからなる。
の少なくとも10個の連続アミノ酸残基を含む。一部の実施形態において、hLAAIGEにより認識されるIgEエピトープは、以下の配列YQCRVTHPHLPR(配列番号34)、YQCRVTHPHLPRALM(配列番号35)、EYQCRVTHPHLPR(配列番号36)、ETYQCRVTHPHLPRALM(配列番号37)、PRGVSAYLSR(配列番号38)、NPRGVSAYLSR(配列番号39)、PSPFDLFIRK(配列番号40)、RPSPFDLFI(配列番号41)、RPSPFDLFIRK(配列番号42)、PRGVSAYLSRPSPFDLFI(配列番号43)、PRGVSAYLSRPSPFDLFIRK(配列番号44)、及びNPRGVSAYLSRPSPFDLFIRK(配列番号45)の1つ以上を含み、又は本質的にそれからなり、又はそれからなる。
[0086] 一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、FcεRIを発現するエフェクター細胞、例えば、肥満細胞、好塩基球、好酸球などの活性化(例えば、脱顆粒)を阻害する。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、FcεRI結合IgEに結合することによりエフェクター細胞の活性化(例えば、脱顆粒)を阻害する。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、受容体結合IgEへの結合時、それ自体、細胞活性化をもたらさない(例えば、隣接IgE-FcεRI複合体の架橋をもたらさない)。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、循環及び受容体結合IgEに特異的に結合し、低親和性でIgEに結合し、高親和性IgE受容体(FcεRI)を発現する細胞の活性化を阻害する。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、高親和性IgE受容体(FcεRI)を発現する細胞の表面に結合しているIgEの量を低減させる。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、エフェクター細胞(例えば、好塩基球、肥満細胞、好酸球など)によるIgE(例えば、IgE-FcεRI複合体として存在し得る)の内在化を誘発することにより表面結合IgEの量を低減させる。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、細胞(例えば、エフェクター細胞)の表面上の高親和性IgE受容体(FcεRI)の量を低減させる。このようなhLAAIGEは、例えば、エフェクター細胞(例えば、好塩基球、肥満細胞、好酸球など)によるFcεRI(例えば、IgE-FcεRI複合体として存在し得る)の内在化を誘発することにより表面FcεRIの量を低減させ得る。
[0087] 一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、エフェクター細胞(例えば、好塩基球、肥満細胞、好酸球など)における緩徐型脱顆粒を活性化させる。「緩徐型脱顆粒」において、顆粒タンパク質は、(i)エキソサイトーシスにおけるような顆粒含有物の大規模分泌を含まず;(ii)部分的に空の膜結合顆粒の房(granule chamber)を置き去りにし;(iii)小ベシクルのトラフィッキングに依存する機序により動員及び放出される。例えば、Bandeira-Melo & Weller(2005)Mem. Inst. Oswaldo Cruz 100(Supp. I):73-81参照。緩徐型脱顆粒は、アレルギー/エフェクター細胞の脱感作を伴うが、アナフィラキシー型脱顆粒を伴わない。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、エフェクター細胞(例えば、好塩基球、肥満細胞、好酸球など)において緩徐型脱顆粒を活性化させるが、アナフィラキシー型脱顆粒を活性化させない。抗体が緩徐型脱顆粒を活性化させるか否かを決定するために好適なアプローチは公知であり、それとしては、例えば、抗体に曝露される細胞におけるCD203cの上方調節についてのアッセイが挙げられる。具体的には、エクスビボ好塩基球上のCD203cの上方調節は、緩徐型脱顆粒についてのバイオマーカーとして機能し得る。CD203c上方調節は、治療潜在性のバイオマーカーとしても機能し得る一方、好塩基球からのCD63発現を誘発するhLAAIGEの能力喪失を使用してhLAAIGEの安全性をモニタリングすることができる。
[0088] 一部の実施形態において、循環及び受容体結合IgEに結合する本発明によるhLAAIGEは、膜IgE(又は「mIgE」)にも結合する。IgEは、B細胞膜固定形態(膜IgE)で、及びいくつかの分泌形態で存在する。Zhang, et al. (1994)J. Biol. Chem. 269:456-462参照。これらの区別される形態は、スプライスバリアントである。IgEの主な分泌形態は、一般に、Cε4ドメインにおいて本質的に終結するFc領域を有するより短い形態である一方、膜IgEは、M1/M1’及びM2として公知のエキソンによりコードされるペプチドを含む追加のC末端残基を含む。本発明による抗IgEのhLAAIGEは、循環及び受容体結合IgEにおける結合にも利用可能であるmIgEの任意のエピトープに結合し得る。例えば、抗IgE抗体は、循環、受容体結合及び膜IgEにおける結合に利用可能なCε1、Cε2、Cε3、又はCε4ドメインのいずれかにおけるエピトープに結合し得る。膜IgEへの結合において、抗体は、例えば、IgE発現B細胞の成熟を阻害することによりIgE産生を阻害し得る。
[0089] 本発明によるhLAAIGEのエピトープは、IgEが受容体に結合(例えば、FcεRI又はFcεRII(CD23)に結合)している結合にエピトープがアクセス可能である限り、IgEの任意の好適な領域中に存在し得る。IgEの構造に関する詳細は、開示が全ての目的のために参照により全体として本明細書に援用されるZheng, et al.(Biochemistry(1991)30:9125-9132)、Wan, et al.(Nature Immunology(2002)3:681-686)及びGould and Sutton(Nature Reviews Immunology(2008)8:205-217)に見出される。IgEのε重鎖は5つのドメインに分割することができ、C末端からN末端まで、Cε4ドメイン、Cε3ドメイン、Cε2ドメイン、Cε1ドメイン、及び可変重鎖領域/ドメイン(VH)を含む。本開示による抗体は、例えば、IgEのCε4ドメイン、Cε3ドメイン、Cε2ドメイン、又はCε1ドメイン中のエピトープを認識し得る。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、ヒトIgEのCε3ドメイン中のエピトープを認識しない。
[0090] 5つのhLAAIGEにより結合される2つのIgEエピトープを、CLIP技術(Pepscan Inc)によりマッピングした。線形及び単一ループエピトープ模倣体を含有するPepscanアレイを使用して抗体を試験した。線形エピトープ候補は、E17、E59、及びS91について決定した。H6.2により結合されるIgEエピトープは、決定することができなかった。検出に使用されたHRPコンジュゲートは陰性対照として試験し、アレイ上のいくつかのペプチドに弱く結合した。抗体E17及びE59は、一般に、比較的低い強度の1つの優勢なピークを有する極めて類似の結合プロファイルを生じさせた。特筆すべきことに、両方の抗体について、配列YQCRVTHPHLPRALM(配列番号35)を含有する単一ループペプチドを用いて記録されたシグナル強度は、一般に、それらの線形アナログを用いて記録されたシグナル強度よりも高かった。抗体S91は、類似のシグナル強度の複数のピークを有する結合プロファイルを繰り返し呈した。このような結果は、不連続エピトープ、例えば、立体構造エピトープの認識を示す。しかしながら、記録データは3つのエピトープ候補の提案を可能とし、その1つはE17及びE59について同定されたエピトープと部分的に重複する。
[0091] 一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、循環及び受容体結合IgEに特異的に結合し、高親和性IgE受容体(FcεRI)を発現するエフェクター細胞、例えば、好塩基球、肥満細胞、及び/又は好酸球の抗原媒介(例えば、アレルゲン媒介)活性化(例えば、脱顆粒)を阻害する。例えば、抗体は、エフェクター細胞活性化を、抗体の不存在下でのエフェクター細胞活性化の程度と比較して5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、又は95%以上だけ阻害し得る。エフェクター細胞活性化は、目的エフェクター細胞についての任意の慣用のアプローチ、例として、実施例セクションにより詳細に以下に記載される好塩基球活性化試験(BAT)及び受動皮膚アナフィラキシー(PCA)アッセイを使用して決定することができる。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、0.01~5μg/ml、例えば、0.03~2.5μg/ml、例えば、0.05~1μg/mlの濃度において存在する場合、エフェクター細胞活性化を遮断し、又は低減させる。
[0092] 架橋、すなわち、抗hLAAIGE/hLAAIGE複合体が活性化/有害反応を誘導するか否かを試験するため、hFcεRIα TgマウスにヒトIgEを全身負荷し、それをhLAAIGE(ヒトIgG1)により全身処理した。次いで、動物にポリクローナル抗ヒトIgGを与えてhLAAIGEを架橋させた。全身反応性は生じず(図25)、すなわち、架橋はアナフィラキシー型脱顆粒を誘導しなかった。さらに、ヒト肥満細胞を、hLAAIGE又は抗ヒトIgGとインキュベート/架橋したhLAAIGEによりインビトロ処理し、いずれの条件下でも活性化の証拠もメディエーター放出の証拠も観察されなかった。このデータは、インビトロ、エクスビボ、及びインビボでhLAAIGEが脱顆粒/アレルギーエフェクター細胞からのメディエーター放出を誘発する能力を欠くことを実証する。
[0093] したがって、一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、循環及び受容体結合IgEに特異的に結合し、エフェクター細胞、例えば、好塩基球、肥満細胞又は好酸球などの表面上の隣接IgE/FcεRI複合体の抗原媒介(例えば、アレルゲン媒介)架橋を低減させ、又は排除する。例えば、抗体は、隣接IgE/FcεRI複合体の架橋を、抗体の不存在下でのIgE/FcεRI複合体架橋の程度と比較して5%以上、10%以上、15%以上、20%以上、25%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、又は95%以上だけ低減させ得る。
[0094] 一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、FcεRIを発現する細胞の表面上のIgEの量を、抗体の不存在下での細胞の表面に結合しているIgEの量と比較して10%以上、20%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、又は95%以上だけ低減させる。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、0.01~10μg/ml、例えば、0.05~5μg/ml、例えば、0.1~2μg/mlの濃度において存在する場合、細胞の表面に結合しているIgEの量を低減させ得る。
[0095] 一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、低用量のアレルゲンの投与から得られるもののような完全FcεRI活性化シグナリングを減衰させるアンタゴニストとして機能する部分FcεRI経路シグナリングを誘導する。例えば、Rotiroti, et al.(2012)J Allergy Clin Immunol. 130:918参照。syk、ERK、p38-MAPK、及びAKTの適切なリン酸化は、アナフィラキシー型脱顆粒をもたらすFcεRI活性化シグナリングを伴う。E59は、FcεRI活性化シグナリングを減衰させる部分的FcεRI経路シグナリングを誘導することが見出された。E59は、比較的高濃度(10~50μg/ml)において、ポリクローナル抗IgE Ab誘導リン酸化のものと比較してsyk、ERK、p38-MAPK、及びAKTのリン酸化を弱く誘導する(10μg/mlにおけるE59、図26)。ヒト好塩基球は、E59により30分間前処理した場合、続いて高親和性ポリクローナル抗IgE抗体により刺激した場合、syk、ERK、p38-MAPK、及びAKTのリン酸化の減衰を示す(PAE対2μg/mlにおけるE59、図26)。このリン酸化の減衰は、好塩基球をE59及び高親和性ポリクローナル抗IgE抗体により並行して刺激した場合、観察されなかった。E59はFcεRIシグナリングの部分的活性化を誘導し、それはそれらのアレルギーエフェクター細胞をFcεRI架橋を介する後の完全活性化に対して不応性にした。
[0096] したがって、一部の実施形態において、本発明による1つ以上のhLAAIGEを対象に投与してFcεRI活性化シグナリング及び/又はアナフィラキシー型脱顆粒を減衰させる。一部の実施形態において、本発明による1つ以上のhLAAIGEを対象に投与してsyk、ERK、p38-MAPK、及び/又はAKTのリン酸化を減衰させる。
[0097] 本発明によるhLAAIGEは、1つ以上の(例えば、1又は2つの)重鎖可変領域(VH)及び/又は1つ以上(例えば、1又は2つ)の軽鎖可変領域(VL)、又はエピトープに結合し得るそれらの下位断片を含み得る。VH及びVL領域は、CDRよりも保存される領域であるフレームワーク領域(FR)が散在している超可変性の領域である相補性決定領域(CDR)にさらに下位分類することができる。CDR及びFRの範囲は、正確に定義されている(Kabat, et al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Chothia, et al. (1987)J. Mol. Biol. 196:901-917参照)。VHは、3つのCDR及び4つのFRを含み得、N末端からC末端まで以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置されている。同様に、VLは、3つのCDR及び4つのFRを含み得、N末端からC末端まで以下の順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4で配置されている。
[0098] 抗体のVH又はVL鎖は、重鎖又は軽鎖定常領域の全部又は一部をさらに含み、それにより重鎖又は軽鎖免疫グロブリン鎖をそれぞれ形成し得る。一部の実施形態において、hLAAIGEは、2つの重鎖及び2つの軽鎖の四量体であり、重鎖及び軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合により連結されている。重鎖定常領域は、3つのドメインCH1、CH2及びCH3を含む。軽鎖定常領域は、1つのドメインCLを含む。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合領域を含む。抗体の定常領域は、典型的には、宿主組織及び因子、例として、免疫系及び補体系の第1成分の種々の細胞への抗体の結合を媒介する。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、IgG(例えば、IgG1)アイソタイプ抗体である。
[0099] 用語「免疫グロブリン」は、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる1つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指し得る。認識されるヒト免疫グロブリン遺伝子としては、カッパ、ラムダ、アルファ(IgA1及びIgA2)、ガンマ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、デルタ、イプシロン、及びミュー定常領域遺伝子;並びに多数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長免疫グロブリン軽鎖(約25kD又は214個のアミノ酸)は、N末端における可変領域遺伝子(約110個のアミノ酸)及びC末端におけるカッパ又はラムダ定常領域によりコードされる。全長免疫グロブリン重鎖(約50kD又は446個のアミノ酸)は、N末端における可変領域遺伝子(約116個のアミノ酸)及びC末端における他の上記定常領域遺伝子の1つ、例えば、ガンマ(約330個のアミノ酸をコード)によりコードされる。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、全長免疫グロブリン重鎖及び全長免疫グロブリン軽鎖を含む。
[0100] 一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、全長免疫グロブリン重鎖及び全長免疫グロブリン軽鎖を含まないが、代わりに全長免疫グロブリン重鎖及び/又は全長免疫グロブリン軽鎖の抗原結合断片を含む。一部の実施形態において、抗原結合断片は、別個のポリペプチド鎖上に含有され;他の実施形態において、抗原結合断片は、単一ポリペプチド鎖内に含有される。例えば、一部の実施形態において、IgE結合断片は、循環及び受容体結合IgEに特異的に結合し、低親和性でIgEに結合し、高親和性IgE受容体(FcεRI)を発現する細胞の活性化を阻害する。一部の実施形態によれば、IgE結合断片は、循環及び受容体結合IgEに特異的に結合し、高親和性IgE受容体(FcεRI)を発現する細胞の活性化を阻害する。
[0101] 抗原結合断片の例としては、(i)Fab断片(VL、VH、CL及びCH1ドメインからなる一価断片);(ii)F(ab’)2断片(ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋により結合している2つのFab断片を含む二価断片);(iii)Fd断片(VH及びCH1ドメインからなる);(iv)Fv断片(抗体の単一アームのVH及びVLドメインからなる);(v)dAb断片(VHドメインからなる);(vi)単離CDR;(vii)単鎖Fv(scFv)(VH及びVLドメインが対合して一価分子を形成するように組換え手段を使用する合成リンカーにより結合している抗体の単一アームのVH及びVLドメインからなる);(viii)ダイアボディ(VH及びVLドメインが対合して一価分子を形成しないように結合している2つのscFvからなる;scFvのそれぞれの1つのVHは、他のscFvのVLドメインと対合して二価分子を形成する);(ix)二重特異的抗体(それぞれの領域が異なるエピトープに結合する少なくとも2つの抗原結合領域からなる)が挙げられる。一部の実施形態において、断片は、Fab断片であり、又は単鎖抗体(scFv)である。
[0102] 一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、組換え又は改変抗体、例えば、キメラ、脱免疫化(deimmunized)、及び/又はインビトロ生成抗体である。抗体に適用され、本明細書において使用される用語「組換え」又は「改変」は、組換え手段により調製、発現、作出、又は単離された全ての抗体、例えば、(i)宿主細胞中に形質移入された組換え発現ベクターを使用して発現された抗体;(ii)組換えコンビナトリアル抗体ライブラリーから単離された抗体;(iii)ヒト免疫グロブリン遺伝子についてトランスジェニックである動物(例えば、マウス)から単離された抗体;又は(iv)他のDNA配列へのヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、作出、又は単離された抗体を含むものとする。このような組換え抗体としては、ヒト化、CDRグラフト化、キメラ、脱免疫化、及びインビトロ生成抗体が挙げられ;任意選択的に、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域を含み得る。
[0103] 一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、scFv多量体を含む。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、免疫グロブリンの定常領域(例えば、Fc領域)を含む。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、カルボキシル末端におけるフリーチオール(-SH)基を含み、そのフリーチオール基を使用して抗体を第2のポリペプチド(例えば、別の抗体、例として、対象抗体)、足場、担体などに付着することができる。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、1つ以上の非天然存在アミノ酸を含む。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、それに付着している目的部分、例えば、検出可能標識、薬物、毒素、半減期延長部分などを有する。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、グリコシル化されており、例えば、hLAAIGEは、共有結合炭水化物又は多糖部分を含む。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、例えば、グルタルアルデヒド、ホモ二官能性架橋剤、又はヘテロ二官能性架橋剤を使用して第2の部分(例えば、脂質、対象抗体以外のポリペプチド、合成ポリマー、炭水化物など)に共有結合している。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、固体支持体上で固定化されている。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、検出可能標識を含む。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、造影剤又は放射性同位体を含む。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、「放射線不透過性」標識、例えば、例えばx線を使用して容易に可視化することができる標識を含む。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、融合パートナー、例えば、リガンド;エピトープタグ;ペプチド;抗体以外のタンパク質などに(例えば、共有又は非共有結合)結合している。一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、炭水化物部分に共有結合している。一部の実施形態において、本発明のhLAAIGEは、脂質部分に共有結合している。一部の実施形態において、本発明のhLAAIGEは、リポソーム中に取り込まれる。これらの及び他の実施形態は、国際公開第2015/013668号に記載の抗体について企図されるとおり、本発明によるhLAAIGEについて本明細書において企図される。
[0104] 抗体を産生する方法
[0105] 本発明によるhLAAIGEは、当分野における任意の方法、例えば、タンパク質合成、組換え技術などにより産生することができる。
[0105] 本発明によるhLAAIGEは、当分野における任意の方法、例えば、タンパク質合成、組換え技術などにより産生することができる。
[0106] 本発明によるhLAAIGEの産生に組換え技術を使用することができる。例えば、任意選択的に定常領域に結合している軽鎖及び重鎖可変領域をコードする核酸は、発現ベクター中に挿入される。軽鎖及び重鎖は、同一又は異なる発現ベクター中でクローニングすることができる。免疫グロブリン鎖をコードするDNAセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確保する発現ベクター中の制御配列に作動可能に結合している。発現制御配列としては、プロモーター(例えば、天然関連又は異種プロモーター)、シグナル配列、エンハンサーエレメント、及び転写終結配列が挙げられる。発現制御配列は、真核生物宿主細胞(例えば、COS又はCHO細胞)を形質転換又は形質移入し得るベクター中の真核生物プロモーター系であり得る。ベクターが適切な宿主中に取り込まれたら、宿主はヌクレオチド配列の高レベル発現、並びに抗体の回収及び精製に好適な条件下で維持される。
[0107] 一部の実施形態において、本発明によるhLAAIGEは、単鎖ポリペプチドであり、当分野における化学ペプチド合成法を使用して合成することができる。例えば、固相合成についての技術は、Barany and Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; pp. 3-284 in The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A., Merrifield, et al. J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2156(1963);Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed. Pierce Chem. Co., Rockford, III.(1984);及びGanesan A. 2006 Mini Rev. Med Chem. 6:3-10及びCamarero JA, et al. 2005 Protein Pept Lett. 12:723-8により記載されている。
[0108] 本発明によるhLAAIGEは、(化学的に又は組換えにより)合成されたら、当分野における方法、例として、硫酸アンモニウム沈殿、親和性カラム、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー(UPLC)精製、ゲル電気泳動などを使用して精製することができる(一般に、Scopes, Protein Purification(Springer-Verlag, N.Y., (1982)参照)。本明細書において使用される「合成」抗体は、当分野において公知の化学合成法又は組換え法のいずれかを使用して作製された抗体又はその結合断片を指す。
[0109] 核酸分子
[0110] 一部の実施形態において、本発明は、hLAAIGEの1つ以上のアミノ酸配列をコードする核酸分子を対象とする。このような核酸分子は、目的標的細胞(例えば、コード抗体を合成するように遺伝子改変された細胞)中でのヌクレオチド配列の発現を可能とする1つ以上の調節エレメント、例えば、プロモーター及びエンハンサーに作動可能に結合させることができる。好適なプロモーター及びエンハンサーは、当分野において公知である。
[0110] 一部の実施形態において、本発明は、hLAAIGEの1つ以上のアミノ酸配列をコードする核酸分子を対象とする。このような核酸分子は、目的標的細胞(例えば、コード抗体を合成するように遺伝子改変された細胞)中でのヌクレオチド配列の発現を可能とする1つ以上の調節エレメント、例えば、プロモーター及びエンハンサーに作動可能に結合させることができる。好適なプロモーター及びエンハンサーは、当分野において公知である。
[0111] ベクター
[0112] 一部の実施形態において、核酸分子は、発現ベクター及び/又はクローニングベクター中に存在する。本発明のhLAAIGEが2つの別個のポリペプチドを含む場合、その2つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を同一又は別個のベクター中でクローニングすることができる。好適なベクターは、当分野において公知であり、それとしては、選択マーカー、複製起点、並びにベクターの複製及び/又は維持を提供する他の特徴部を挙げることができる。
[0112] 一部の実施形態において、核酸分子は、発現ベクター及び/又はクローニングベクター中に存在する。本発明のhLAAIGEが2つの別個のポリペプチドを含む場合、その2つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を同一又は別個のベクター中でクローニングすることができる。好適なベクターは、当分野において公知であり、それとしては、選択マーカー、複製起点、並びにベクターの複製及び/又は維持を提供する他の特徴部を挙げることができる。
[0113] 細胞
[0114] 一部の実施形態において、本発明による宿主細胞は、本発明による1つ以上の核酸分子を含有する。一部の実施形態において、宿主細胞は、本発明によるhLAAIGEを産生し得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、ハイブリドーマである。
[0114] 一部の実施形態において、本発明による宿主細胞は、本発明による1つ以上の核酸分子を含有する。一部の実施形態において、宿主細胞は、本発明によるhLAAIGEを産生し得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、ハイブリドーマである。
[0115] 組成物
[0116] 一部の実施形態において、本発明による組成物は、1つ以上のhLAAIGEを含む。一部の実施形態において、組成物は、有効量の1つ以上のhLAAIGEを含む。一部の実施形態において、組成物は、実質的に純粋、例えば、少なくとも約80%~85%純粋、少なくとも約85%~90%純粋、少なくとも約90%~95%純粋、又は98%~99%以上純粋であり、例えば、汚染物質、例えば、細胞残屑、1つ以上のhLAAIGEの合成から生じる副生物、及びhLAAIGE以外の生体分子を有さない。一部の実施形態において、本発明による組成物は、塩、例えば、NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4など;緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N’-(2-エンタンスルホン酸)(HEPES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩(MES)、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)など;可溶化剤;洗浄剤、例えば、非イオン性洗浄剤、例えば、Tween-20など;プロテアーゼ阻害剤;グリセロールなどの1つ以上を含む。
[0116] 一部の実施形態において、本発明による組成物は、1つ以上のhLAAIGEを含む。一部の実施形態において、組成物は、有効量の1つ以上のhLAAIGEを含む。一部の実施形態において、組成物は、実質的に純粋、例えば、少なくとも約80%~85%純粋、少なくとも約85%~90%純粋、少なくとも約90%~95%純粋、又は98%~99%以上純粋であり、例えば、汚染物質、例えば、細胞残屑、1つ以上のhLAAIGEの合成から生じる副生物、及びhLAAIGE以外の生体分子を有さない。一部の実施形態において、本発明による組成物は、塩、例えば、NaCl、MgCl2、KCl、MgSO4など;緩衝剤、例えば、トリス緩衝液、N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N’-(2-エンタンスルホン酸)(HEPES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸ナトリウム塩(MES)、3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)、N-トリス[ヒドロキシメチル]メチル-3-アミノプロパンスルホン酸(TAPS)など;可溶化剤;洗浄剤、例えば、非イオン性洗浄剤、例えば、Tween-20など;プロテアーゼ阻害剤;グリセロールなどの1つ以上を含む。
[0117] 一部の実施形態において、本発明による組成物は、医薬組成物である。一部の実施形態において、医薬組成物は、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEを含む。本明細書において使用される「医薬組成物」は、対象における医薬使用に好適な組成物を指す。医薬組成物は、一般に、有効量の活性剤及び薬学的に許容可能な担体、例えば、緩衝剤、アジュバントなどを含む。本明細書において使用される「薬学的に許容可能な担体」は、活性成分と適合性であり、適用可能な規格及び規制、例えば、医薬投与のためにUnited States Pharmacopeia and the National Formulary(USP-NF)書籍に記載の薬局方規格に従う溶媒、分散媒、コーティング、抗菌及び抗真菌剤、等張及び吸収遅延剤などを指す。したがって、例えば、非滅菌水は、少なくとも静脈内投与のための薬学的に許容可能な担体から除外される。薬学的に許容可能なビヒクルとしては、当分野において公知のものが挙げられる。例えば、REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY. 20th ed.(2000)Lippincott Williams & Wilkins. Baltimore, MD参照。
[0118] 本明細書において使用される「有効量」は、所望の結果を産生するために十分な投与量又は量を指す。所望の結果は、例えば、例えばインビトロアッセイにおける対照群と比較した処理群における客観的又は主観的応答を含み得る。一部の実施形態において、有効量は、「治療有効量」である。本明細書において使用される「治療有効量」は、対象における有益な又は所望の治療(予防を含む)結果、例えば、対照又は治療前の症状のベースライン計測値と比較したIgE媒介障害の症状の低減を提供するために十分な量を指す。治療有効量は、単一用量として、又は一連のいくつかの用量として投与することができる。当業者は、ある因子、例として、症状の程度、前治療、対象の全身健康状態及び年齢などが、対象を有効に治療するために要求される投与量に影響し得ることを認識する。これにもかかわらず、有効量及び治療有効量は、当分野において公知の方法を使用して容易に決定することができる。
[0119] 一部の実施形態において、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEは、対象の体重1kg当たり約0.1mg~約10mgである。一部の実施形態において、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEは、対象の体重1kg当たり約0.2mg~約10mgである。一部の実施形態において、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEは、対象の体重1kg当たり約0.3mg~約10mgである。一部の実施形態において、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEは、対象の体重1kg当たり約0.4mg~約7mgである。一部の実施形態において、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEは、対象の体重1kg当たり約0.5mg~約5mgである。一部の実施形態において、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEは、対象の体重1kg当たり約0.5mg~約3mgである。一部の実施形態において、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEを対象に投与する。
[0120] 一部の実施形態において、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEは、対象に3~10週間毎に投与する。一部の実施形態において、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEは、対象に3~8週間毎に投与する。一部の実施形態において、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEは、対象に4~8週間毎に投与する。一部の実施形態において、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEは、対象に4~6週間毎に投与する。一部の実施形態において、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEは、対象に4~5週間毎に投与する。一部の実施形態において、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEは、対象に月1回投与する。
[0121] 一部の実施形態において、組成物は、1つ以上のhLAAIGEを約1mg/ml~約200mg/ml、約50mg/ml~約200mg/ml、又は約150mg/ml~約200mg/mlの濃度において含む。一部の実施形態において、組成物は、1つ以上のhLAAIGEを約10mg/ml~約1000mg/ml、例えば、約25mg/ml~約500mg/ml、約50mg/ml~約250mg/ml、約75mg/ml~約200mg/ml、又は約100mg/ml~約150mg/ml(例えば、約125mg/ml)の濃度において含む。
[0122] 本発明の医薬組成物は、当分野において公知の方法を使用して目的の送達経路、例として、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、眼内、髄腔内、関節内、滑液嚢内、脳槽内、肝内、病巣内注射、頭蓋内注射、注入、及び/又は吸入の投与経路のために配合することができる。本発明による医薬組成物は、以下の1つ以上:pH緩衝溶液、アジュバント(例えば、保存剤、湿潤剤、乳化剤、及び分散剤)、リポソーム配合物、ナノ粒子、分散液、懸濁液又はエマルション及び無菌注射液又は分散液への再構成のための無菌粉末を含み得る。本発明の組成物及び配合物は、当分野において公知の方法を使用して安定性及び効力の増加について最適化することができる。
[0123] 投与量及びレジメン
[0124] 本発明の医薬組成物は、単位剤形で提供することができる。本明細書において使用される「単位剤形」は、治療すべき対象のための単位投与量として適合された物理的に区別される単位を指し;それぞれの単位は、要求される薬学的に許容可能な担体との関連で所望の治療効果を産生するように計算された所定量の活性成分を含有する。本発明の単位剤形についての仕様は、活性成分の特有の特徴及び達成すべき特定の治療効果、並びに個体の治療のためのそのような活性成分の配合の分野における固有の制限により定められる。
[0124] 本発明の医薬組成物は、単位剤形で提供することができる。本明細書において使用される「単位剤形」は、治療すべき対象のための単位投与量として適合された物理的に区別される単位を指し;それぞれの単位は、要求される薬学的に許容可能な担体との関連で所望の治療効果を産生するように計算された所定量の活性成分を含有する。本発明の単位剤形についての仕様は、活性成分の特有の特徴及び達成すべき特定の治療効果、並びに個体の治療のためのそのような活性成分の配合の分野における固有の制限により定められる。
[0125] 本発明による組成物の毒性及び治療効力は、細胞培養又は実験動物における標準的医薬手順により決定することができる。例えば、致死用量LC50(集団の50%の致死である濃度×曝露時間として表現される用量)又はLD50(集団の50%の致死用量)、及びED50(集団の50%における治療有効用量)を当分野において公知の方法により決定することができる。毒性及び治療効果間の用量比は治療指数であり、それは比LD50/ED50として表現することができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。毒性副作用を示す組成物を使用することができる一方、そのような組成物を罹患組織の部位に標的化する送達系を使用して副作用を低減させることに留意すべきである。
[0126] 細胞培養アッセイ及び動物試験から得られるデータは、ヒトにおける使用のための1つ以上のhLAAIGEの種々の組合せについての投与量の範囲の配合において使用することができる。投与量は、好ましくは、毒性をほとんど有さず、又は有さないED50を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。治療有効用量は、細胞培養アッセイから推定することができる。用量は、細胞培養物中で決定されたIC50(すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度範囲を達成するように動物モデルにおいて配合することができる。このような情報を使用してヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、当分野において公知の方法を使用して計測することができる。
[0127] さらに、所与の対象についての好適な投与量は、医師又は別の有資格医療専門家により、種々の臨床学的因子に基づき決定することができる。医学分野において周知のとおり、任意の1つの対象についての投与量は、多くの因子、例として、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与すべき特定の化合物、対象の性別、投与の時間及び経路、全身健康状態、並びに並行投与される他の薬物に依存する。1つ以上のhLAAIGEを、1用量当たり体重1kg当たり1ng~体重1kg当たり20mg、例えば、体重1kg当たり0.1mg~体重1kg当たり10mg、体重1kg当たり0.5mg~体重1kg当たり8mg、体重1kg当たり1mg~体重1kg当たり6mg、例えば、体重1kg当たり2mg~体重1kg当たり5mgの量で投与することができるが、特に上記因子を考慮してそれらの範囲未満又はそれを超える用量が想定される。レジメンが連続注入である場合、それは、1分当たり体重1キログラム当たり1μg~10mgの範囲であってもよい。1つ以上のhLAAIGEを、単一用量として、又は複数用量で投与することができる。例えば、1つ以上のhLAAIGEは、1日当たり2回、1日当たり1回、2日毎に1回、3日毎に1回、1週間当たり1回、2週間毎に1回、1ヵ月当たり1回、2ヵ月毎に1回などで投与することができる。
[0128] 当業者は、用量レベルが規定の抗体、症状の重症度及び副作用に対する対象の感受性に応じて変動し得ることを容易に認識する。これにもかかわらず、好ましい投与量は、当業者により容易に決定することができる。
[0129] IgE媒介障害を治療する方法
[0130] 一部の実施形態において、本発明は、IgEにより媒介される疾患又は障害を治療する方法を提供する。本方法は、一般に、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEを単独で(例えば、単剤療法で)又は1つ以上の追加の治療剤との組合せで(組合せ療法で)対象に投与することを含む。一部の実施形態において、1つ以上の抗体は、医薬組成物の形態で投与する。「治療すること」、「治療する」、又は「治療」は、IgE媒介障害及び/又はその付随症状の少なくとも1つを軽減させ、又は解消することを意味する。本明細書において使用される、疾患、障害、又は病態を「軽減させる」ことは、その疾患、障害、又は病態の症状の重症度及び/又は発生頻度を低減させることを意味する。本明細書における「治療すること」、「治療する」、又は「治療」への言及は、治癒的、緩和的、及び予防的治療への言及を含むことが理解される。一部の実施形態において、1つ以上のhLAAIGEの治療有効量は、単独で(例えば、単剤療法で)又は1つ以上の追加の治療剤との組合せで(例えば、組合せ療法で)投与される場合、対象におけるIgE媒介障害の症状を、対照又は治療前に取られたベースライン計測値と比較して少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%又はそれ以上だけ低減させる量である。
[0130] 一部の実施形態において、本発明は、IgEにより媒介される疾患又は障害を治療する方法を提供する。本方法は、一般に、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEを単独で(例えば、単剤療法で)又は1つ以上の追加の治療剤との組合せで(組合せ療法で)対象に投与することを含む。一部の実施形態において、1つ以上の抗体は、医薬組成物の形態で投与する。「治療すること」、「治療する」、又は「治療」は、IgE媒介障害及び/又はその付随症状の少なくとも1つを軽減させ、又は解消することを意味する。本明細書において使用される、疾患、障害、又は病態を「軽減させる」ことは、その疾患、障害、又は病態の症状の重症度及び/又は発生頻度を低減させることを意味する。本明細書における「治療すること」、「治療する」、又は「治療」への言及は、治癒的、緩和的、及び予防的治療への言及を含むことが理解される。一部の実施形態において、1つ以上のhLAAIGEの治療有効量は、単独で(例えば、単剤療法で)又は1つ以上の追加の治療剤との組合せで(例えば、組合せ療法で)投与される場合、対象におけるIgE媒介障害の症状を、対照又は治療前に取られたベースライン計測値と比較して少なくとも約5%、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%又はそれ以上だけ低減させる量である。
[0131] 本明細書において使用される「IgE媒介障害」は、IgE受容体、例として、高親和性IgE受容体(FcεRI)及び/又は低親和性IgE受容体(FcεRII;CD23)を介するシグナル伝達により特徴づけられる障害、病態、又は疾患である。IgE媒介障害としては、I型アレルギー反応又はI型過敏症が主な事象であるもの、例えば、アレルギー性喘息、アレルギー性鼻炎、食物アレルギー、アレルギー性結膜炎、アトピー性皮膚炎、アナフィラキシー又はアナフィラキシー型過敏症、好酸球性食道炎/胃腸炎、肥満細胞症、ハチ刺され反応、薬物反応、特発性蕁麻疹、血管性浮腫などが挙げられる。IgE媒介障害としては、I型アレルギー反応又はI型過敏性が発病機序における重要な二次的役割を担うそれらの障害、例えば、アレルギー性肺アスペルギルス症、アレルギー性紫斑症、高IgE免疫欠損症候群(HIES又はヨブ症候群)、関節リウマチ、IgE骨髄腫、炎症性腸疾患(例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎、不確定大腸炎、及び感染性大腸炎)、乾癬、水疱性類天疱瘡なども挙げられる。
[0132] 一部の実施形態において、本発明の方法は、喘息を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEを対象に投与することを含む方法である。喘息は、感受性個体における喘鳴、息切れ、胸部圧迫感、及び/又は咳嗽の再発エピソードを引き起こす気道の慢性炎症障害である。当業者は、種々のタイプの喘息、例として、環境アレルゲンに対する過敏性を発症した対象において生じると考えられるアレルギー性喘息;典型的にはアスピリン又は他のCOX阻害剤に対する感受性により誘発される薬物誘発性喘息;運動誘発性喘息;亜致死性及び超急性喘息;夜間喘息;一般に仕事場におけるある化学物質に対する曝露により引き起こされる職業性喘息を区別する。したがって、喘息は、種々の刺激、例として、空中アレルゲン(例えば、イエダニ、花粉、動物の鱗屑、真菌胞子、羽毛)、非特異的刺激物質、例えば、タバコの煙、化学物質の煙霧、汚染、二酸化硫黄などにより誘発され得る。
[0133] 一部の実施形態において、本発明の方法は、アレルギー性鼻炎を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEを対象に投与することを含む方法である。アレルギー性鼻炎は、典型的には、一群の症状、例として、主に、空中粒子に対する曝露後に生じる鼻腔、副鼻腔、及び眼球における炎症症状を含む。症状としては、くしゃみ;鼻詰まり;鼻水(及び場合により鼻血);咳嗽;頭痛;アレルゲンに曝露された鼻腔、口腔、眼、咽喉、皮膚、又は任意の区域の掻痒;嗅覚障害(及びしたがって、香味料に対する感受性);鼻詰まり(鼻閉);結膜炎;流涙;咽喉炎;及び喘鳴が挙げられる。アレルギー性鼻炎は、通年性及び/又は季節性であり得る。通年性アレルギー性鼻炎は、1年を通して継続するアレルギー性鼻炎である。これは、典型的には、アレルゲン、例えば、動物の鱗屑、室内のカビ胞子、又はイエダニへの連続的曝露により引き起こされる。季節性アレルギー性鼻炎は、1年のある時期の間にのみ生じるアレルギー性鼻炎である。これは、一般に、季節的に産生される木、草、及び雑草花粉に対するアレルギーにより引き起こされる。
[0134] 一部の実施形態において、本発明の方法は、1つ以上のIgE媒介食物アレルギーを有する対象を治療する方法であって、治療有効量の1つ以上のhLAAIGEを対象に投与することを含む方法である。IgE媒介食物アレルギーは、卵、ピーナッツ、牛乳、又は一部の他の規定の食物により誘発される過剰免疫応答である。あらゆる食物がアレルギー反応を引き起こし得るが、いくつかの食物が主な原因である。小児において、最も一般的な食物アレルギーは、卵、ピーナッツ、牛乳、ダイズ、木堅果、小麦、及び甲殻類(例えば、エビ、カニ、ロブスター、カタツムリ、及びハマグリ)に対するものである。年長児及び成人において、最も一般的な食物アレルギーは、ピーナッツ、木堅果、甲殻類、及び魚類である。症状は、主に胃及び腸に限定され得、又は食物が消化若しくは吸収された後には身体の多くの部分に関わり得る。症状としては、炎症気味の咽喉、アナフィラキシー(死亡をもたらし得る重度の全身アレルギー反応);腹痛;下痢;悪心;嘔吐;胃痙攣;口腔、咽喉、眼、皮膚、又は任意の区域の掻痒;ハイブス;血管性浮腫(特に瞼、顔面、口唇、及び舌の腫れ);立ち眩み又は失神;鼻閉;鼻水;息切れ;喘鳴;嚥下困難;口腔アレルギー症候群を挙げることができる。口腔アレルギー症候群は、典型的には、口唇、舌、及び咽喉の掻痒、並びに時に口唇の腫れも含む。
[0135] 一部の実施形態において、治療方法は、1つ以上の追加の治療剤を対象に投与することをさらに含む。好適な追加の治療剤としては、第2の抗IgE抗体、例えば、オマリズマブ、ルミリキシマブ、及び/又は抗体CIA-E-7.12(ATCCアクセッション番号HB-236))、免疫抑制剤、抗炎症剤などが挙げられる。一部の実施形態において、追加の治療剤は、1つ以上のhLAAIGEと同時投与又は同時配合することができる。一部の実施形態において、1つ以上のhLAAIGEは、ステロイド、例として、コルチコステロイド(吸入、経口);気管支拡張剤(例えば、長時間作用型ベータ-2アゴニスト;短時間作用型ベータ-2アゴニスト);ロイコトリエンアンタゴニスト/阻害剤;メチルキサンチン;気道炎症に関与するインターロイキンに対して指向される抗体、例えば、IL-4又はIL-13又はTNFに対して指向されるhLAAIGE;クロモリン、例えば、クロモリンナトリウム;ネドクロミルナトリウム;並びに抗コリン作動薬及びPDE阻害剤からなる群から選択される1つ以上の成分と同時投与又は同時配合する。本発明による組合せ治療としては、同時(並行)及び任意の順序での連続投与が挙げられる。
[0136] 一部の実施形態において、1つ以上のhLAAIGEにより治療すべき対象は、それが必要とされる対象である。一般に、hLAAIGEによる治療が「必要とされる」対象は、IgE媒介障害を有する対象である。治療が必要とされる対象としては、IgE媒介障害を有し、又は有しやすい可能性が高い対象、及びIgE媒介障害を予防すべき対象も挙げられる。IgE媒介障害を有しやすい対象は、総及び/又はアレルゲン特異的IgEの決定、アレルゲン皮膚試験、臨床及び/又は家族歴などにより同定することができる。
[0137] E14、E17、E23、E59、及びS91のインビボ半減期は、FcRnベース結合アッセイを使用して決定した。E14、E17、E23、及びE59は、約40日間超(約960時間超)の顕著に長い半減期を示す一方、S91の半減期は約25日間であった(図27)。したがって、一部の実施形態において、対象に、治療有効量の本発明による1つ以上のhLAAIGEを約3週間~約6週間の間隔において投与する。一部の実施形態において、対象に、治療有効量の本発明による1つ以上のhLAAIGEを約4週間~約5週間の間隔において投与する。一部の実施形態において、対象に、治療有効量の本発明による1つ以上のhLAAIGEに約1ヵ月間の間隔において投与する。
[0138] 本明細書に開示されるhLAAIGEの潜在的な免疫原性(B及びT細胞エピトープ)は、La Jolla Institute of Allergy and Immunology(tools.immuneepitope.org)により開発されたIEBDツールを使用してインシリコで決定して陰性である。
[0139] キット
[0140] 一部の実施形態において、本発明は、1つ以上のhLAAIGEを含むキット(例えば、治療キット)である。このようなキットは、例えば、本発明による方法の実施において有用である。
[0140] 一部の実施形態において、本発明は、1つ以上のhLAAIGEを含むキット(例えば、治療キット)である。このようなキットは、例えば、本発明による方法の実施において有用である。
[0141] 一部の実施形態において、キットは、1つ以上のhLAAIGE、1つ以上の抗体をコードする核酸分子、又はその核酸を含む細胞の1つ以上を含み得る。一部の実施形態において、1つ以上の抗体は、医薬組成物として、例えば、単一用量、2つ以上の投与量単位などで提供される。
[0142] 本発明によるキットは、例えば、本発明による治療方法を実施するためにキットの構成成分を使用するための説明書を含み得る。説明書は、添付文書として、キット又はその構成成分の容器のラベリング(例えば、包装又は下位包装に伴う)などにおいてキット中に存在し得る。一部の実施形態において、説明書は、好適なコンピュータ可読記憶媒体、例えば、コンパクトディスク読取専用メモリ(CD-ROM)、デジタルバーサタイルディスク(DVD)、フラッシュドライブなどに存在する電子記憶データファイルとして存在する。一部の実施形態において、実物の説明書はキット中に存在しないが、遠隔源から、例えば、インターネットを介して説明書を得る手段が提供される。この実施形態の一例は、説明書を閲覧することができ、及び/又は説明書をダウンロードすることができるウェブアドレスを含むキットである。説明書と同様、説明書を入手するこの手段は好適な基板上に記録される。
[0143] 以下の実施例は、本発明を説明するものであり、限定するものではない。
[0144] 実施例
[0145] 以下の実施例は、当業者に本発明を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を提供するために記載され、本発明者らが発明としてみなすものの範囲を限定するものではなく、本発明者らが以下の実験が全て又は実施された唯一の実験であることを表すものでもない。使用数字(例えば、量、温度など)に関して精度を確保するための労力がなされてきたが、いくらかの実験誤差及び偏差を考慮すべきである。特に示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。標準的な略語を使用することができ、例えば、bp、塩基対;kb、キロベ-ス;pl、ピコリットル;s又はsec、秒;min、分;h又はhr、時間;aa、アミノ酸;kb、キロベース;bp、塩基対;nt、ヌクレオチド;i.m.、筋肉内(筋肉内に);i.p.、腹腔内(腹腔内に);s.c.、皮下(皮下に);~、約、など、及びアミノ酸一文字及び三文字コード。
[0145] 以下の実施例は、当業者に本発明を作製及び使用する方法の完全な開示及び説明を提供するために記載され、本発明者らが発明としてみなすものの範囲を限定するものではなく、本発明者らが以下の実験が全て又は実施された唯一の実験であることを表すものでもない。使用数字(例えば、量、温度など)に関して精度を確保するための労力がなされてきたが、いくらかの実験誤差及び偏差を考慮すべきである。特に示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧又はほぼ大気圧である。標準的な略語を使用することができ、例えば、bp、塩基対;kb、キロベ-ス;pl、ピコリットル;s又はsec、秒;min、分;h又はhr、時間;aa、アミノ酸;kb、キロベース;bp、塩基対;nt、ヌクレオチド;i.m.、筋肉内(筋肉内に);i.p.、腹腔内(腹腔内に);s.c.、皮下(皮下に);~、約、など、及びアミノ酸一文字及び三文字コード。
[0146] 本実施例に言及される市販の試薬は、特に示されない限り、製造業者の説明書に従って使用した。例示的な方法及び材料が以下に記載されるが、本明細書に記載のものと類似又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験において使用することもできる。材料、方法、及び実施例は説明にすぎず、範囲を限定するものではない。
[0147] 実施例1
ヒト化抗ヒトIgE抗体の生成
[0148] 低親和性抗ヒトIgE(LAAIGE)ファウンダーマウスmAb、すなわち、ファウンダーE17、ファウンダーF11、及びファウンダーP6.2を産生するハイブリドーマ細胞系を、国際公開第2015/013668号に開示の方法に従って作製した。
ヒト化抗ヒトIgE抗体の生成
[0148] 低親和性抗ヒトIgE(LAAIGE)ファウンダーマウスmAb、すなわち、ファウンダーE17、ファウンダーF11、及びファウンダーP6.2を産生するハイブリドーマ細胞系を、国際公開第2015/013668号に開示の方法に従って作製した。
[0149] ファウンダーE17のcDNA及び予測タンパク質配列は、以下である:
ファウンダーE17 VH cDNA:
ファウンダーE17 VHタンパク質:
ファウンダーE17 VL cDNA:
ファウンダーE17 VLタンパク質:
ファウンダーE17 VH cDNA:
ファウンダーE17 VHタンパク質:
ファウンダーE17 VL cDNA:
ファウンダーE17 VLタンパク質:
[0150] ファウンダーF11のcDNA及び予測タンパク質配列は、以下である:
ファウンダーF11 VH cDNA:
ファウンダーF11 VHタンパク質:
ファウンダーF11 VL cDNA:
ファウンダーF11 VLタンパク質:
ファウンダーF11 VH cDNA:
ファウンダーF11 VHタンパク質:
ファウンダーF11 VL cDNA:
ファウンダーF11 VLタンパク質:
[0151] ファウンダーP6.2のcDNA及び予測タンパク質配列は、以下である:
ファウンダーP6.2 VH cDNA:
ファウンダーP6.2 VHタンパク質:
ファウンダーP6.2 VL cDNA:
ファウンダーP6.2 VLタンパク質:
ファウンダーP6.2 VH cDNA:
ファウンダーP6.2 VHタンパク質:
ファウンダーP6.2 VL cDNA:
ファウンダーP6.2 VLタンパク質:
[0152] ファウンダーF11、ファウンダーE17、及びファウンダーP6.2は、それぞれ約6.92×10-7、8.19×10-8、及び約2.54×10-6ΜのヒトIgEについての結合親和性を有する。それぞれの重鎖可変(VH)及び軽鎖可変(VL)領域の相補性決定領域(CDR)配列及び特異性決定領域(SDR)を、最も相同的なヒト生殖系列配列のフレームワーク(FR)領域中に移植した。全ての組換えmAbを、スモールスケール(50mlの形質移入容量)で293細胞中で一過的に発現させ、下流適用のためにプロテインA親和性カラムにより精製した。組換え抗体を発現せず、又は<1μg/mlの組換え抗体を発現するヒト化mAbを排除した。α-IgEへのヒト化LAAIGE(hLAAIGE)の親和性は、アミンカップリングにより骨髄腫IgEと結合しているCM5センサーチップを有するBiacore T2000機器(Biacore AB, Uppsala, Sweden)を使用する表面プラズモン共鳴により決定した。0.15MのNaCl、10mMのHEPES、pH7.4、3mMのEDTA、及び0.005%のポリソルベート20を含有するHBS-EPアッセイ緩衝液中で精製hLAAIGEを溶解させた。溶液は結合分析のために50μl/分の流量においてセンサを横断させた。結合結果は、共鳴単位で表現した。速度論的試験をBIAevaluation Software Version 4.1により分析した。Biacore T2000の感度限界(<5×10-5M)よりも低いIgEに対する親和性を有するクローンはさらに分析せず、約7×10-6M~約7×10-8Mの範囲のIgE親和性を有する抗体を、それらの治療潜在性及び安全性プロファイルのさらなる評価のために選択した。細胞表面結合IgEへの選択hLAAIGEの結合は、骨髄腫IgEにより感作されたヒトFcεRIα発現3D10細胞を使用して確認した。
[0153] hLAAIGEのタンパク質配列は、以下のとおりである:
E59 VH:
E59 VL:
E14 VH:
E14 VL:
E17 VH:
E17 VL:
E23 VH:
E23 VL:
S91 VH:
S91 VL:
H6.2 VH:
H6.2 VL:
E59 VH:
E59 VL:
E14 VH:
E14 VL:
E17 VH:
E17 VL:
E23 VH:
E23 VL:
S91 VH:
S91 VL:
H6.2 VH:
H6.2 VL:
[0154] Biacore法により計測されたヒトIgEに対するhLAAIGEの結合親和性は、以下である:E23=1.09×10-7M、E14=6.72×10-8M、E59=1.64×10-7M、E17=1.4×10-7M、S91=7.41×10-6M、及びH6.2約5×10-5MのKd。
[0156] 実施例2
活性及び効力アッセイ
[0157] 所与のhLAAIGEの活性及び治療効力は、1)ピーナッツ及びネコアレルギー対象の血液好塩基球活性化試験(BAT)の阻害;2)hFcεRIαトランスジェニックマウスモデルにおけるピーナッツアレルギーIgE媒介受動皮膚アナフィラキシー(PCA)の阻害;及び3)hFcεRIαトランスジェニックマウスモデルにおけるダンシル-IgE媒介全身性アナフィラキシーの阻害により決定した。
活性及び効力アッセイ
[0157] 所与のhLAAIGEの活性及び治療効力は、1)ピーナッツ及びネコアレルギー対象の血液好塩基球活性化試験(BAT)の阻害;2)hFcεRIαトランスジェニックマウスモデルにおけるピーナッツアレルギーIgE媒介受動皮膚アナフィラキシー(PCA)の阻害;及び3)hFcεRIαトランスジェニックマウスモデルにおけるダンシル-IgE媒介全身性アナフィラキシーの阻害により決定した。
[0158] 1)好塩基球活性化試験アッセイ
[0159] 好塩基球活性化試験(BAT)アッセイを実施して種々の濃度における好塩基球活性化を誘導するそれぞれのヒト化mAbの能力を決定した。所与のhLAAIGEが好塩基球を活性化させるか否かを試験するため、ネコ又はピーナッツアレルギー対象からの血液(100μl)を、1~50μg/mlの範囲の変動量の所与のhLAAIGEと37℃において20分間インキュベートした。活性化反応をEDTAにより停止させ、次いで細胞を氷上でCD123-FITC/CD63-PE HLA-Dr-PerCPのカクテルにより20分間染色した。次いで赤血球の溶解を行い、染色細胞をフローサイトメトリーにより分析した。好塩基球集団をCD123陽性HLA-Dr陰性集団においてゲーティングした。好塩基球集団におけるCD63発現を計算及び分析した。
[0159] 好塩基球活性化試験(BAT)アッセイを実施して種々の濃度における好塩基球活性化を誘導するそれぞれのヒト化mAbの能力を決定した。所与のhLAAIGEが好塩基球を活性化させるか否かを試験するため、ネコ又はピーナッツアレルギー対象からの血液(100μl)を、1~50μg/mlの範囲の変動量の所与のhLAAIGEと37℃において20分間インキュベートした。活性化反応をEDTAにより停止させ、次いで細胞を氷上でCD123-FITC/CD63-PE HLA-Dr-PerCPのカクテルにより20分間染色した。次いで赤血球の溶解を行い、染色細胞をフローサイトメトリーにより分析した。好塩基球集団をCD123陽性HLA-Dr陰性集団においてゲーティングした。好塩基球集団におけるCD63発現を計算及び分析した。
[0160] 所与のヒト化mAbがアレルゲン誘発好塩基球活性化を遮断するか否かの決定のため、血液試料を一定で振盪させてヒト化mAbと37℃において24時間及び/又は48時間インキュベートし、次いでネコアレルゲンFel d1(0.02~0.2μg/ml)又はピーナッツアレルゲン(Ara h1、2及び6の組合せ、0.1~1.0μg/ml)を血液中に37℃における15分間のインキュベーションの間添加して好塩基球を活性化させた。
[0161] 2)受動皮膚アナフィラキシー(PCA)アッセイ
[0162] 受動皮膚アナフィラキシー(PCA)アッセイを実施してピーナッツ及びネコアレルギーIgE媒介PCAを遮断するそれぞれのヒト化mAbの能力を調査した。hFcεRIα Tgマウスの背中皮膚に、一晩~4日間の局所感作のためにピーナッツアレルギー対象の血漿から精製されたIgEを皮内注射した(1つのマウス皮膚当たり8~10個のスポット)。所与のhLAAIGEが肥満細胞を活性化させるか否かを試験するため、感作スポットに、種々の量の所与のhLAAIGE(1~100μg/mlの範囲)の局所注射を与え、PBS陰性対照;及び陽性対照としてのポリクローナルウサギ抗ヒトIgE(0.1~1μg/ml)を用いた。15分後、100μlの2%のエバンスブルー色素を静脈内注射して局所アレルギー反応性を評価した。
[0162] 受動皮膚アナフィラキシー(PCA)アッセイを実施してピーナッツ及びネコアレルギーIgE媒介PCAを遮断するそれぞれのヒト化mAbの能力を調査した。hFcεRIα Tgマウスの背中皮膚に、一晩~4日間の局所感作のためにピーナッツアレルギー対象の血漿から精製されたIgEを皮内注射した(1つのマウス皮膚当たり8~10個のスポット)。所与のhLAAIGEが肥満細胞を活性化させるか否かを試験するため、感作スポットに、種々の量の所与のhLAAIGE(1~100μg/mlの範囲)の局所注射を与え、PBS陰性対照;及び陽性対照としてのポリクローナルウサギ抗ヒトIgE(0.1~1μg/ml)を用いた。15分後、100μlの2%のエバンスブルー色素を静脈内注射して局所アレルギー反応性を評価した。
[0163] 所与のhLAAIGEがアレルゲン媒介PCAを遮断するか否かを試験するため、hFcεRIα Tgマウスを精製ピーナッツアレルギーIgE及び組換えダンシル特異的IgEにより2、1、0.5、及び0.125μg/mlにおいて背中皮膚上の皮内注射を介して2時間感作し、次いでマウスに所与のhLAAIGEを体重1グラム当たり2μgにおいて腹腔内注射し、アイソタイプ対照として同量のヒトIgG1を用いた。4又は5日後、生理食塩水中で溶解させた100μlの2%のエバンスブルー色素(EBD)と混合したAra h1、2、及び6の組合せ又は粗製ピーナッツ抽出物(CPE、10μg)、又はダンシル-BSA(100μg)を動物に静脈内チャレンジした。マウスを写真撮影によるPCA反応の評価のためにアレルゲンチャレンジの30分後に安楽死させた。マウス皮膚を一晩乾燥させ、注射皮膚区域を切り取り、秤量し、EBDをホルムアミドにより55℃において一晩抽出した。溢出EBDを分光光度計により620nm又は650nmのいずれかの波長においてマイクロタイターELISAリーダーにより定量した。両方の方法からの定量的結果は十分フィットした。それぞれのPCAスポットからのEBD量を、皮膚組織1ミリグラム当たりとして正規化した。
[0164] 3)全身性アナフィラキシーアッセイ
[0165] FcεRIα Tgマウスを、合計40μg(16時間間隔において20μgを2回)の組換えダンシル特異的IgEにより一晩(約24時間)感作し、次いで所与のhLAAIGE又は対照としてのヒトIgG1アイソタイプを体重1グラム当たり2μgにおいて注射した。4日後、マウスにダンシル-BSA(100μg/マウス)を静脈内チャレンジして全身性アナフィラキシーを誘導した。中核温変化及びアナフィラキシー臨床指数(スコア)を全身性アナフィラキシー反応性の指標として計測した。中核温変化は、ダンシル-BSAチャレンジ後の最初の1時間、5分毎にモニタリングした。温度変化を比較及び統計分析のためにプロットして全身性アナフィラキシーに対する所与のhLAAIGE及び対照IgG1の効果を決定した。
[0165] FcεRIα Tgマウスを、合計40μg(16時間間隔において20μgを2回)の組換えダンシル特異的IgEにより一晩(約24時間)感作し、次いで所与のhLAAIGE又は対照としてのヒトIgG1アイソタイプを体重1グラム当たり2μgにおいて注射した。4日後、マウスにダンシル-BSA(100μg/マウス)を静脈内チャレンジして全身性アナフィラキシーを誘導した。中核温変化及びアナフィラキシー臨床指数(スコア)を全身性アナフィラキシー反応性の指標として計測した。中核温変化は、ダンシル-BSAチャレンジ後の最初の1時間、5分毎にモニタリングした。温度変化を比較及び統計分析のためにプロットして全身性アナフィラキシーに対する所与のhLAAIGE及び対照IgG1の効果を決定した。
[0166] 実施例3
hFcεRIα Tgマウスからの骨髄由来肥満細胞(BMMC)
[0167] 0.22μmフィルターフラッシング培地(10%のウシ胎児血清、2mMのL-グルタミン、50U/mlのペニシリン及び50μg/mlのストレプトマイシン、5×10-5Mのβ-メルカプトエタノールが補給されたDMEM)によりhFcεRIα Tgマウスの大腿骨及び脛骨から骨髄をフラッシュアウトした。回収した骨髄細胞を、10mlの培養培地(フラッシング培地と10ng/mlの組換えマウスIL-3)を有する2つのT75フラスコ中でそれぞれ培養した。3日後、それぞれのフラスコからの懸濁細胞を、新鮮培養培地を有する2つのフラスコ中に移し、拡張した。1週間後、それぞれのフラスコからの懸濁細胞を、約1×106個の細胞/mlの細胞密度を維持しながら2~3つのフラスコ中に拡張した。培養培地の半分を新鮮培地と3~4日毎に交換し、接着細胞が観察されなくなるまで懸濁細胞を新たなフラスコに移した。6週間後、懸濁細胞を抗マウスCD117-FITC及び抗ヒトhFcεRIα-PEにより染色して培養BMMCの成熟性を評価した。
hFcεRIα Tgマウスからの骨髄由来肥満細胞(BMMC)
[0167] 0.22μmフィルターフラッシング培地(10%のウシ胎児血清、2mMのL-グルタミン、50U/mlのペニシリン及び50μg/mlのストレプトマイシン、5×10-5Mのβ-メルカプトエタノールが補給されたDMEM)によりhFcεRIα Tgマウスの大腿骨及び脛骨から骨髄をフラッシュアウトした。回収した骨髄細胞を、10mlの培養培地(フラッシング培地と10ng/mlの組換えマウスIL-3)を有する2つのT75フラスコ中でそれぞれ培養した。3日後、それぞれのフラスコからの懸濁細胞を、新鮮培養培地を有する2つのフラスコ中に移し、拡張した。1週間後、それぞれのフラスコからの懸濁細胞を、約1×106個の細胞/mlの細胞密度を維持しながら2~3つのフラスコ中に拡張した。培養培地の半分を新鮮培地と3~4日毎に交換し、接着細胞が観察されなくなるまで懸濁細胞を新たなフラスコに移した。6週間後、懸濁細胞を抗マウスCD117-FITC及び抗ヒトhFcεRIα-PEにより染色して培養BMMCの成熟性を評価した。
[0168] 実施例4
共焦点顕微鏡観察
[0169] BMMCを1500RPMにおいて3分間遠心分離し、上清を慎重に吸引し、細胞ペレットをPBSにより2回洗浄し、次いで10%の正常マウス血清によりブロッキングし、氷上で30分間インキュベートし、次いで感作のために希釈FITC標識骨髄腫IgE(PS IgE)を5μg/mlにおいて2時間添加した。洗浄後、FITC-IgE感作BMMC(1×106個の細胞/ml)を、対照mIgG1及びhLAAIGEとそれぞれ2μg/mlにおいて37℃において24又は48時間インキュベートした。BMMCを0.5mlの2%のホルムアルデヒドにより30分間固定した。上記の染色手順を完了した後、チューブを室温(暗所)において20分間保持した。細胞をPBSにより2回洗浄し、次いで50μlの透過化培地を、Alexa 647標識抗hFcεRIαとともに30分間の室温におけるインキュベーションのために添加した。次いで、洗浄した細胞を0.5mlの2%のホルムアルデヒドにより固定し、サイトスピンを500rpmにおいて5分間使用してポリリジンコートスライドガラスにスピンさせた。スライド上の細胞をDAPIを有する1滴のprolong gold褪色防止試薬により染色した。スライドを、Leica SP2-1P-FCS共焦点顕微鏡により試験した。
共焦点顕微鏡観察
[0169] BMMCを1500RPMにおいて3分間遠心分離し、上清を慎重に吸引し、細胞ペレットをPBSにより2回洗浄し、次いで10%の正常マウス血清によりブロッキングし、氷上で30分間インキュベートし、次いで感作のために希釈FITC標識骨髄腫IgE(PS IgE)を5μg/mlにおいて2時間添加した。洗浄後、FITC-IgE感作BMMC(1×106個の細胞/ml)を、対照mIgG1及びhLAAIGEとそれぞれ2μg/mlにおいて37℃において24又は48時間インキュベートした。BMMCを0.5mlの2%のホルムアルデヒドにより30分間固定した。上記の染色手順を完了した後、チューブを室温(暗所)において20分間保持した。細胞をPBSにより2回洗浄し、次いで50μlの透過化培地を、Alexa 647標識抗hFcεRIαとともに30分間の室温におけるインキュベーションのために添加した。次いで、洗浄した細胞を0.5mlの2%のホルムアルデヒドにより固定し、サイトスピンを500rpmにおいて5分間使用してポリリジンコートスライドガラスにスピンさせた。スライド上の細胞をDAPIを有する1滴のprolong gold褪色防止試薬により染色した。スライドを、Leica SP2-1P-FCS共焦点顕微鏡により試験した。
[0170] 追加の実施形態
[0171] 実施形態1.配列番号1に対して少なくとも約90%から100%まで、好ましくは、約91%から100%まで、より好ましくは、約95%から100%まで、よりさらに好ましくは、約97%から100%まで、最も好ましくは、約99%から100%までの同一性パーセントを有するVH配列を含む抗体。
[0171] 実施形態1.配列番号1に対して少なくとも約90%から100%まで、好ましくは、約91%から100%まで、より好ましくは、約95%から100%まで、よりさらに好ましくは、約97%から100%まで、最も好ましくは、約99%から100%までの同一性パーセントを有するVH配列を含む抗体。
[0172] 実施形態2.VH配列の一部は、配列番号2に対して約75%~約100%、好ましくは、約80%~約100%、より好ましくは、約90%~100%、よりさらに好ましくは、約95%~約100%、最も好ましくは、約99%~100%の同一性パーセントを有する、実施形態1に記載の抗体。
[0173] 実施形態3.配列番号4に対して少なくとも約65%から100%までの同一性パーセントを有するVL配列の一部をさらに含む、実施形態1又は実施形態2に記載の抗体。
[0174] 実施形態4.VL配列の一部の配列同一性は、配列番号4の約65%~約70%である、実施形態1又は実施形態2に記載の抗体。
[0175] 実施形態5.VL配列の一部の配列は、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6からなる群から選択される、実施形態4に記載の抗体。
[0176] 実施形態6.モノクローナル抗体である、実施形態1~5のいずれか1つに記載の抗体。
[0177] 実施形態7.ヒト化抗体である、実施形態6に記載の抗体。
[0178] 実施形態8.約1×10-5M~約1×10-9MのKd、約1×10-6M~約1×10-9MのKd、又は約5×10-5M~約7×10-8Mの結合親和性でヒトIgEに結合する、実施形態7に記載の抗体。
[0179] 実施形態9.E59、E14、E17、E23、又はS91である、実施形態1に記載の抗体。
[0180] 実施形態10.実施形態1~9のいずれか1つに記載の1つ以上の抗体を含む組成物。
[0181] 実施形態11.実施形態1~9のいずれか1つに記載の1つ以上の抗体、及び薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
[0182] 実施形態12.対象をIgE媒介障害について治療する方法であって、実施形態1~9のいずれか1つに記載の1つ以上の抗体、実施形態10に記載の組成物、又は実施形態11に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む方法。
[0183] 実施形態13.IgE媒介障害は、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、血管性浮腫、又はアナフィラキシー型過敏症である、実施形態12に記載の方法。
[0184] 実施形態14.対象におけるアレルギー反応を治療又は阻害する方法であって、実施形態1~9のいずれか1つに記載の1つ以上の抗体、実施形態10に記載の組成物、又は実施形態11に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む方法。
[0185] 実施形態15.1つ以上の抗体を治療有効量で前記対象に投与する、実施形態12~14のいずれか1つに記載の方法。
[0186] 実施形態16.DTAVYYCAR(配列番号7)を含むVH鎖を含むVH鎖、並びにLQAED(配列番号11)とAAPSV(配列番号12)、GTKL(配列番号13)、及びRFSGS(配列番号14)から選択される少なくとも1つの配列とを含むVL鎖を含み、好ましくは、VL配列は、LQAED(配列番号11)と(a)AAPSV(配列番号12)又は(b)RFSGS(配列番号14)及びGTKL(配列番号13)とを含むモノクローナル抗体。
[0188] 実施形態18.VL鎖は、以下の配列RFSGSX22SG(配列番号24)、LTX23SX24LQAEDX25AX26YY(配列番号25)、FGX27GTKL(配列番号26)、AAPSVX28X29FPPSX30EX3IL(配列番号27)、AX32X33VCLX34X35X36FYP(配列番号28)、HX37X38YX39CX40VTHX41G(配列番号29)、PX42SX43X44X45SX46GX47X48X49TIX50C(配列番号30)、QX51X52PGX53X54PKLX55IY(配列番号31)のいずれか1つ以上を含み、X22~X55は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である、実施形態16に記載のモノクローナル抗体。
[0189] 実施形態19.VL鎖は、以下の配列RFSGSX22SG(配列番号24)、LTX23SX24LQAEDX25AX26YY(配列番号25)、FGX27GTKL(配列番号26)、AAPSVX28X29FPPSX30EX3IL(配列番号27)、AX32X33VCLX34X35X36FYP(配列番号28)、HX37X38YX39CX40VTHX41G(配列番号29)、PX42SX43X44X45SX46GX47X48X49TIX50C(配列番号30)、QX51X52PGX53X54PKLX55IY(配列番号31)のいずれか1つ以上を含み、X22は、G又はKであり、X23は、I又はVであり、X24は、G又はSであり、X25は、E又はVであり、X26は、D又はVであり、X27は、G、S、又はQであり、X28は、F又はTであり、X29は、I又はLであり、X30は、D又はSであり、X31は、E又はQであり、X32は、S又はTであり、X33は、L又はVであり、X34は、I又はLであり、X35は、N又はSであり、X36は、D又はNであり、X37は、K又はRであり、X38は、S又はVであり、X39は、A又はSであり、X40は、E又はQであり、X41は、E又はQであり、X42は、A、D、又はPであり、X43は、A、L、又はVであり、X44は、A又はSであり、X45は、G又はVであり、X46は、L又はPであり、X47は、E又はQであり、X48は、R又はSであり、X49は、A、I、又はVであり、X50は、N又はSであり、X51は、H又はQ、好ましくは、Qであり、X52は、H又はKであり、X53は、K又はQであり、X54は、A又はPであり、X55は、L又はMである、実施形態16に記載のモノクローナル抗体。
[0190] 実施形態20.VL鎖は、配列番号4に対して少なくとも約65%から100%までの同一性パーセントを有する配列を含む、実施形態16に記載のモノクローナル抗体。
[0191] 実施形態21.VL鎖は、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6からなる群から選択される配列を含む、実施形態16に記載のモノクローナル抗体。
[0192] 実施形態22.VL鎖は、配列番号32、配列番号65、又は配列番号67を含む、実施形態16に記載のモノクローナル抗体。
[0193] 実施形態23.VH鎖は、WVRQAPG(配列番号8)、GLEW(配列番号9)、及び/又はVTVSSA(配列番号10)を含む、実施形態16~22のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0194] 実施形態24.VH鎖は、以下の配列VQLX1QSG(配列番号17)、PGX2SX3X4X5SCX6ASGX7TF(配列番号18)、WVRQAPGX8GLEW(配列番号19)、WGX9GTX10VTVSSA(配列番号20)、SLX11X12X13DTAVYYCAR(配列番号21)、及びRX14X15X16X17X18DX19SX20X21T(配列番号22)のいずれか1つ以上を含み、X1~X21は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である、実施形態16~22のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0195] 実施形態25.VH鎖は、以下の配列VQLX1QSG(配列番号17)、PGX2SX3X4X5SCX6ASGX7TF(配列番号18)、WVRQAPGX8GLEW(配列番号19)、WGX9GTX10VTVSSA(配列番号20)、SLX11X12X13DAVYYCAR(配列番号21)、及びRX14X15X16X17X18DX19SX20X21T(配列番号22)のいずれか1つ以上を含み、X1は、V又はG、好ましくは、Vであり、X2は、A又はR、好ましくは、Aであり、X3は、L又はV、好ましくは、Vであり、X4は、K又はR、好ましくは、Kであり、X5は、L又はV、好ましくは、Vであり、X6は、A又はK、好ましくは、Kであり、X7は、F又はY、好ましくは、Yであり、X8は、K又はQ、好ましくは、Qであり、X9は、R又はQであり、X10は、L又はTであり、X11は、T、K、又はRであり、X12は、A又はSであり、X13は、E又はDであり、X14は、F又はVであり、X15は、T又はVであり、X16は、I、F、又はMであり、X17は、S又はTであり、X18は、L、R、又はTであり、X19は、N又はT、好ましくは、Tであり、X20は、K、T、又はVであり、X21は、N又はS、好ましくは、Sである、実施形態16~22のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0196] 実施形態26.VH鎖は、配列番号2に対して約75%~約100%、好ましくは、約80%~約100%、より好ましくは、約90%~100%、よりさらに好ましくは、約95%~約100%、最も好ましくは、約99%~100%と同一性パーセントを有する配列を含む、実施形態16~22のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0197] 実施形態27.VH鎖は、配列番号68、配列番号69、又は配列番号70を含む、実施形態16~22のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0198] 実施形態28.VH鎖は、配列番号1に対して少なくとも約90%から100%まで、好ましくは、約91%から100%まで、より好ましくは、約95%から100%まで、よりさらに好ましくは、約97%から100%まで、最も好ましくは、約99%から100%までの同一性パーセントを有する配列を含む、実施形態16~22のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0199] 実施形態29.VH鎖は、配列番号23の少なくとも10、20、30、40、又は50個の連続アミノ酸残基を含む、実施形態16~28のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0200] 実施形態30.VH鎖は、配列番号23を含む、実施形態16~28のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0201] 実施形態31.モノクローナル抗体により認識されるIgEエピトープは、配列番号33の少なくとも10個の連続アミノ酸残基を含む、実施形態16~30のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0202] 実施形態32.モノクローナル抗体により認識されるIgEエピトープは、以下の配列:配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、及び配列番号45の1つ以上を含み、本質的にそれからなり、又はそれからなる、実施形態16~30のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0203] 実施形態33.モノクローナル抗体により認識されるIgEエピトープは、以下の配列:配列番号35、配列番号39、配列番号42、及び配列番号36の少なくとも1つを含む、実施形態16~30のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0204] 実施形態34.ヒト化抗体である、実施形態16~33のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0205] 実施形態35.ヒトFcεRI又は高親和性IgE受容体に結合しているヒトIgEに結合する、実施形態16~34のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0206] 実施形態36.約1×10-5M~約1×10-9MのKd、約1×10-6M~約1×10-9MのKd、又は約5×10-5~約7×10-8MのKdの結合親和性でヒトIgEに結合する、実施形態16~34のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0207] 実施形態37.E59、E14、E17、E23、S91、又はH6.2である、実施形態16~36のいずれか1つに記載のモノクローナル抗体。
[0208] 実施形態38.実施形態16~37のいずれか1つに記載の1つ以上のhLAAIGEを含む組成物。
[0209] 実施形態39.薬学的に許容可能な担体をさらに含む、実施形態38に記載の組成物。
[0210] 実施形態40.対象をIgE媒介障害について治療する方法であって、実施形態16~37のいずれか1つに記載の1つ以上のhLAAIGE又は実施形態38若しくは実施形態39に記載の組成物を対象に投与することを含む方法。
[0211] 実施形態41.IgE媒介障害は、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、血管性浮腫、又はアナフィラキシー型過敏症である、実施形態40に記載の方法。
[0212] 実施形態42.対象におけるアレルギー反応を治療又は阻害する方法であって、実施形態16~37のいずれか1つに記載の1つ以上のhLAAIGE又は実施形態38若しくは実施形態39に記載の組成物を対象に投与することを含む方法。
[0213] 実施形態43.1つ以上の抗体を治療有効量で対象に投与する、実施形態40~42のいずれか1つに記載の方法。
[0214] 本発明の開示を理解し、又は完結させるために必要な程度に、本明細書に挙げられる全ての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれが個々に本明細書に援用されるのと同程度に参照により本明細書に明示的に援用される。
[0215] このように本発明の例示的な実施形態を記載してきたが、本開示内のものは例示にすぎないこと、並びに種々の他の代替、適合、及び改変を本発明の範囲内で行うことができることが当業者により留意されるべきである。したがって、本発明は、本明細書に説明される具体的な実施形態に限定されるものではなく、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
Claims (15)
- 抗体であって、
(a)
(i)(X) 0-1 VQLXQSG(X) 5 PGXS(X) 3 SCXASGXTF(X) 6 WVRQAPGXGLEW(X) 3 I(X) 4 G(X) 3 Y(X) 6 R(X) 5 DXS(X) 2 T(X) 6 SL(X) 3 DTAVYYCAR(X) 9-11 WGXGTXVTVSSAS(配列番号15)
(式中、それぞれのXは、独立して、任意のアミノ酸であり、前記配列番号15は、PGX2SX3X4X5SCX6ASGX7TF(配列番号18)を含み、式中、X2はA又はRであり、好ましくはAであり、X3はL又はVであり、好ましくはVであり、X4はK又はRであり、好ましくはKであり、X5はL又はVであり、好ましくはVであり、X6はA又はKであり、好ましくはKであり、X7はF又はYである)と、
a)以下の配列VQLX1QSG(配列番号17)、WVRQAPGX8GLEW(配列番号19)、WGX9GTX10VTVSSA(配列番号20)、SLX11X12X13DTAVYYCAR(配列番号21)、及びRX14X15X16X17X18DX19SX20X21T(配列番号22)のいずれか1つ以上(式中、X1~X21は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である);又は
b)以下の配列VQLX1QSG(配列番号17)、WVRQAPGX8GLEW(配列番号19)、WGX9GTX10VTVSSA(配列番号20)、SLX11X12X13DTAVYYCAR(配列番号21)、及びRX14X15X16X17X18DX19SX20X21T(配列番号22)(式中、X1はV又はGであり、好ましくはVであり、X8はK又はQであり、好ましくはQであり、X9はR又はQであり、X10はL又はTであり、X11はT、K、又はRであり、X12はA又はSであり、X13はE又はDであり、X14はF又はVであり、X15はT又はVであり、X16はI、F、又はMであり、X17はS又はTであり、X18はL、R、又はTであり、X19はN又はTであり、好ましくはTであり、X20はK、T、又はVであり、X21はN又はSであり、好ましくはSである)とを含むアミノ酸配列、
(ii)配列番号2に対して約75%~約100%、好ましくは、約80%~約100%、より好ましくは、約90%~100%、よりさらに好ましくは、約95%~約100%、最も好ましくは、約99%~100%の同一性パーセントを有する配列を含むアミノ酸配列、
(iii)配列番号68、配列番号69又は配列番号70を含むアミノ酸配列、あるいは
(iv)配列番号1に対して少なくとも約90%から100%まで、好ましくは、約91%から100%まで、より好ましくは、約95%から100%まで、よりさらに好ましくは、約97%から100%まで、最も好ましくは、約99%から100%までの同一性パーセントを有する配列を含むアミノ酸配列と、
(b)
(i)以下の配列RFSGSX22SG(配列番号24)、LTX23SX24LQAEDX25AX26YY(配列番号25)、FGX27GTKL(配列番号26)、AAPSVX28X29FPPSX30EX31L(配列番号27)、AX32X33VCLX34X35X36FYP(配列番号28)、HX37X38YX39CX40VTHX41G(配列番号29)、PX42SX43X44X45SX46GX47X48X49TIX50C(配列番号30)、QX51X52PGX53X54PKLX55IY(配列番号31)(式中、X22~X55は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である)を含むアミノ酸配列;
(ii)以下の配列RFSGSX22SG(配列番号24)、LTX23SX24LQAEDX25AX26YY(配列番号25)、FGX27GTKL(配列番号26)、AAPSVX28X29FPPSX30EX31L(配列番号27)、AX32X33VCLX34X35X36FYP(配列番号28)、HX37X38YX39CX40VTHX41G(配列番号29)、PX42SX43X44X45SX46GX47X48X49TIX50C(配列番号30)、QX51X52PGX53X54PKLX55IY(配列番号31)(式中、X22はG又はKであり、X23はI又はVであり、X24はG又はSであり、X25はE又はVであり、X26はD又はVであり、X27はG、S、又はQであり、X28はF又はTであり、X29はI又はLであり、X30はD又はSであり、X31はE又はQであり、X32はS又はTであり、X33はL又はVであり、X34はI又はLであり、X35はN又はSであり、X36はD又はNであり、X37はK又はRであり、X38はS又はVであり、X39はA又はSであり、X40はE又はQであり、X41はE又はQであり、X42はA、D、又はPであり、X43はA、L、又はVであり、X44はA又はSであり、X45はG又はVであり、X46はL又はPであり、X47はE又はQであり、X48はR又はSであり、X49はA、I、又はVであり、X50はN又はSであり、X51はH又はQであり、好ましくはQであり、X52はH又はKであり、X53はK又はQであり、X54はA又はPであり、X55はL又はMである)を含むアミノ酸配列、
(iii)配列番号4に対して少なくとも約65%から100%までの同一性パーセントを有する配列を含むアミノ酸配列、
(iv)配列番号4、配列番号5、及び配列番号6からなる群から選択される配列を含むアミノ酸配列、あるいは
(v)配列番号32、配列番号65、又は配列番号67を含むアミノ酸配列、
を含み、約5×10 -5 ~約7×10 -8 MのKdの結合親和性を有する、抗体。 - 前記アミノ酸配列が、以下の配列RFSGSX22SG(配列番号24)、LTX23SX24LQAEDX25AX26YY(配列番号25)、FGX27GTKL(配列番号26)、AAPSVX28X29FPPSX30EX31L(配列番号27)、AX32X33VCLX34X35X36FYP(配列番号28)、HX37X38YX39CX40VTHX41G(配列番号29)、PX42SX43X44X45SX45GX47X48X49TIX50C(配列番号30)、QX51X52PGX53X54PKLX55IY(配列番号31)のいずれか1つ以上を含み、X22~X55は、それぞれ独立して、任意のアミノ酸である、請求項1に記載の抗体。
- 前記アミノ酸配列が、以下の配列RFSGSX22SG(配列番号24)、LTX23SX24LQAEDX25AX26YY(配列番号25)、FGX27GTKL(配列番号26)、AAPSVX28X29FPPSX30EX31L(配列番号27)、AX32X33VCLX34X35X36FYP(配列番号28)、HX37X38YX39CX40VTHX41G(配列番号29)、PX42SX43X44X45SX45GX47X48X49TIX50C(配列番号30)、QX51X52PGX53X54PKLX55IY(配列番号31)のいずれか1つ以上を含み、、X22はG又はKであり、X23はI又はVであり、X24はG又はSであり、X25はE又はVであり、X26はD又はVであり、X27はG、S、又はQであり、X28はF又はTであり、X29はI又はLであり、X30はD又はSであり、X31はE又はQであり、X32はS又はTであり、X33はL又はVであり、X34はI又はLであり、X35はN又はSであり、X36はD又はNであり、X37はK又はRであり、X38はS又はVであり、X39はA又はSであり、X40はE又はQであり、X41はE又はQであり、X42はA、D、又はPであり、X43はA、L、又はVであり、X44はA又はSであり、X45はG又はVであり、X46はL又はPであり、X47はE又はQであり、X48はR又はSであり、X49はA、I、又はVであり、X50はN又はSであり、X51はH又はQであり、好ましくはQであり、X52はH又はKであり、X53はK又はQであり、X54はA又はPであり、X55はL又はMである、請求項1に記載の抗体。
- 前記アミノ酸配列は、配列番号4に対して少なくとも約65%から100%までの同一性パーセントを有する配列を含む、請求項1に記載の抗体。
- 前記アミノ酸配列は、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6からなる群から選択される配列を含む、請求項1に記載の抗体。
- 前記アミノ酸配列は、配列番号32、配列番号65、又は配列番号67を含む、請求項1に記載の抗体。
- 前記VH鎖は、配列番号23の少なくとも10、20、30、40、又は50個の連続アミノ酸残基を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の抗体。
- 前記VH鎖は、配列番号23を含む、請求項1~6のいずれか一項に記載の抗体。
- 配列番号1を含むアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号3を含むアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む抗体。
- 前記抗体が抗体断片である、請求項1~9のいずれか一項に記載の抗体。
- 請求項1~10のいずれか一項に記載の1又は複数の抗体を含む組成物。
- 薬物として使用するための、請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体又は請求項11に記載の組成物。
- 食物アレルギー、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、蕁麻疹、血管浮腫、アナフィラキシー性過敏症、アレルギー性結膜炎、アナフィラキシー、好酸球性食道炎/胃腸炎、肥満細胞症、ハチ刺され反応、アレルギー性肺アスペルギルス症、アレルギー性紫斑症、高IgE免疫欠損症候群(HIES又はヨブ症候群)、関節リウマチ、IgE骨髄腫、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、不確定大腸炎、感染性大腸炎、乾癬又は水疱性天疱瘡の治療における使用のための、請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体又は請求項11に記載の組成物。
- アレルギー反応の治療又は阻害における使用のための、請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体又は請求項11に記載の組成物。
- I型アレルギー反応又はI型過敏症の治療又は阻害における使用のための、請求項1~10のいずれか一項に記載の抗体又は請求項11に記載の組成物。
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