KR20130121886A - Ｈｇｆ를 표적으로 하는 다중특이적 항원 결합 단백질 - Google Patents

Ｈｇｆ를 표적으로 하는 다중특이적 항원 결합 단백질 Download PDF

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라다 샤 파르마르
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Abstract

본 발명은 HGF 길항제와 VEGF 길항제의 조합물에 관한 것으로, 하나 이상의 에피토프-결합 도메인에 연결된 단백질 스캐폴드를 포함하는 HGF에 결합하는 항원-결합 단백질을 제공하며, 이러한 항원-결합 단백질은 적어도 2개의 항원 결합 부위를 갖고, 2개의 항원 결합 부위 중 적어도 하나는 에피토프 결합 도메인으로부터 유래되고, 2개의 항원 결합 부위 중 적어도 하나는 쌍을 이룬 VH/VL 도메인으로부터 유래된다. 본 발명은 또한 상기 조합물 및 항원-결합 단백질을 제조하는 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

ＨＧＦ를 표적으로 하는 다중특이적 항원 결합 단백질{MULTISPECIFIC ANTIGEN BINDING PROTEINS TARGETING HGF}
발명의 배경
항체는 치료적 적용에서 용도가 널리 공지되어 있다. 항체는 적어도 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 이종다합체 당단백질이다. IgM을 제외하고, 온전한 항체는 보통 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성된 약 150Kda의 이종사합체 당단백질이다. 통상적으로, 각각의 경쇄는 하나의 공유 이황화결합에 의해 중쇄에 연결되며, 다양한 면역글로불린 아이소형(isotype)의 중쇄 사이의 이황화결합의 수는 다양하다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 사슬내 이황화 브릿지를 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(VH), 및 그 뒤에 다수의 불변 영역을 갖는다. 각각의 경쇄는 이의 다른 말단에 가변 도메인(VL) 및 불변 영역을 가지며, 경쇄의 불변 영역은 중쇄의 첫번째 불변 영역과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 대부분의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는 불변 영역의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파 및 람다로 언급되는 2개 유형 중 하나로 지정될 수 있다. 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 인간 항체는 5개의 상이한 부류 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 지정될 수 있다. IgG 및 IgA는 하위부류 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4; 및 IgA1 및 IgA2로 추가로 세분될 수 있다. 적어도 IgG2a, IgG2b를 갖는 마우스 및 래트와 같이 종 변이체가 존재한다. 항체의 가변 도메인은 상보성 결정 영역(CDR)으로 언급되는 특정 변이성을 나타내는 특정 영역을 갖는 항체에 결합 특이성을 제공한다. 가변 영역의 더욱 보존된 부분은 프레임워크 영역(FR)으로 언급된다. 온전한 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 각각 3개의 CDR에 의해 연결된 4개의 FR을 포함한다. 각각의 사슬 내의 CDR은 FR 영역에 의해 근접하에 함께 고정되고, 다른 사슬로부터의 CDR은 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다. 불변 영역은 항원에 대한 항체의 결합에 직접적으로 관련되지는 않지만, 다양한 효과기 기능, 예를 들어, 항체 의존성 세포-매개 세포독성(ADCC)에서의 참여, Fcγ 수용체로의 결합을 통한 포식작용, 신생아 Fc 수용체(FcRn)를 통한 반감기/청소율 및 보체 캐스케이드의 C1q 성분을 통한 보체 의존성 세포독성을 나타낸다.
IgG 항체의 구조의 특성은 2개의 항원-결합 부위가 존재하고, 이들 둘 모두가 동일 에피토프에 특이적인 것이다. 따라서, 이들은 단일특이성이다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 상기 항체를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생성은 2개의 면역글로불린 H 사슬-L 사슬 쌍의 공동 발현을 기초로 하며, 2개의 H 사슬은 상이한 결합 특이성을 갖는다. 문헌[Millstein et al ., Nature 305 537-539(1983)], WO93/08829호 및 [Traunecker et al EMBO, 10, 1991, 3655-3659]을 참조하라. H 및 L 사슬의 무작위 분류로 인해, 10개의 상이한 항체 구조의 잠재적 혼합물이 생성되며, 이 중 하나만 요망되는 결합 특이성을 갖는다. 대안적 방법은 힌지 영역, CH2 및 CH3 영역 중 적어도 일부를 포함하는 중쇄 불변 영역에 대해 요망되는 결합 특이성을 갖는 가변 도메인을 융합시키는 것을 포함한다. 융합체 중 적어도 하나에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 CH1 영역을 갖는 것이 바람직하다. 상기 융합체를 엔코딩하는 DNA, 및 요망시 L 사슬이 별개의 발현 벡터로 삽입된 후, 적합한 숙주 유기체로 공동 트랜스펙션된다. 2개 또는 3개 모두의 사슬에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터로 삽입하는 것이 가능하다. 한 방법에서, 이중특이적 항체는 한 아암(arm)에 첫번째 결합 특이성을 갖는 H 사슬, 및 다른 아암에서 두번째 결합 특이성을 제공하는 H-L 사슬 쌍으로 구성된다. WO94/04690호를 참조하라. 또한, 문헌[Suresh et al Methods in Enzymology 121, 210, 1986]을 참조하라. 다른 방법은 WO2007/095338호에 기재된 단일 도메인 결합 부위를 포함하는 항체 분자를 포함한다. 이중특이적 항체의 다수의 포맷이 기재되었으며, 이중 일부는 한 단백질 도메인을 또 다른 단백질 도메인에 부착시키기 위해 링커를 이용한다. 상기 포맷의 예는 WO0190192호에 기재된 바와 같은 단쇄 Fv 도메인에 부착된 항체 분자, 예를 들어, WO2007/095338호에 기재된 바와 같은 단일 도메인 결합 부위에 부착된 항체 분자, WO2009/068649호에 기재된 바와 같은 mAbdAb 포맷, WO2007/024715호에 기재된 바와 같은 이중 가변 도메인 포맷, 및 WO2009/040562호에 기재된 바와 같은 이중-특이성 항체 융합체를 포함한다.
HGF(간세포 성장 인자 또는 산란 인자(Scatter Factor, SF))는 이의 수용체 MET(c-MET 또는 간세포 성장 인자 수용체로도 공지된 중간엽 상피 전이 인자)와 함께 이동 전(pro-migratory) 항-아폽토시스 및 분열촉진 전(pro-mitogenic) 신호의 독특한 조합을 세포 내에서 전달할 수 있는 다면발현 사이토카인(pleiotropic cytokine)이다. 대부분의 조직에 대해 자연적으로, HGF는 중간엽 기원의 세포에 의해 발현되고, 세포외 기질 내에 국소화되며, 여기서 HGF는 프로테아제에 의한 분해 때까지 이의 비활성(pro-HGF) 형태로 남아있다. 정상 생리학적 조건하에서, 이는 조직 손상에 반응하거나 배 발생 동안 일어난다. MET는 상피 기원의 세포에 의해 발현되고, 이들의 조직 국소화와 일치하게, HGF/MET 신호 전달의 효과는 성체에서 조직 복구 및 배아에서 기관발생에 필수적인 상피-중간엽 상호작용, 세포 동원, 이동 및 신속한 세포 분열에 중요하다. HGF/MET 신호전달의 활성화는 증식, 분산/이동, 세포 극성 및 혈관형성의 유도를 포함하는 광범위한 세포 과정을 조정하며, 상기 효과는 세포 유형 및 환경에 좌우된다. 성체 동물에서, 상기 경로는 비교적 비활동적이나, 이는 간 재생, 신장 손상에 대한 복구, 피부 치유 및 장 손상과 같은 과정에 필수적이며, 상처 가장자리의 세포에서 HGF/MET 신호전달에 의해 매개되는 침습성 성장의 조절된 과정이 조직 완전성의 회복에 필수적이다. 배 발생 및 조직 형태발생을 조직화시키는 조정된 유전 프로그램과 함께 조절된 HGF/MET가 정상 생리기능의 필수적인 특징인 반면, 암 세포에서의 조절되지 않는 HGF/MET 발현은 종양의 신생물성 파종의 중요 특징이다. 이러한 조절되지 않는 발현은 돌연변이 활성화, 유전 증폭, 전사 상향조절 및 주변분비 또는 자가분비 활성화의 결과로서 발생할 수 있다. 또한, HGF/MET-의존성 침습 성장 신호의 전파가 인접 조직으로 이동하고, 이에 침투하고, 원발성 종양의 원위 부위에 전이성 병소를 확립시키는 세포를 생성시킬 수 있는 고도로 공격적인 종양의 일반적인 특징인 것으로 밝혀졌다. HGF가 효능있는 혈관형성 인자이고, MET가 내피 세포에 의해 발현되는 것으로 공지된 사실과 함께, HGF/MET의 치료 표적화가 암 발병, 종양 진행 및 전이를 억제하는데 있어서 상당한 잠재성을 갖는다.
성장 인자의 혈관 내피 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 패밀리 및 이들의 수용체는 혈관형성 및 혈관 투과의 필수적인 조절인자이다. VEGF 패밀리는 VEGF-A, PIGF(태반 성장 인자), VEGF-B, VEGF-C, VEGF-E 및 뱀독 VEGF를 포함하며, 이들 각각은 혈관 패터닝(vascular patterning) 및 혈관 발달에서 명백한 역할을 갖는 것으로 생각된다. 단일 8-엑손 유전자로부터 전사된 mRNA의 대안적 스플라이싱으로 인해, VEGF-A는 신호 펩티드 절단 후에 남아있는 아미노산 수에 의해 확인된 적어도 9개의 서브타입(아이소형(isoform))을 갖는다. 예를 들어, 인간에서, 가장 현저한 아이소형은 가용성 형태 및 세포 결합 형태 사이에서 평형 상태로 존재하는 VEGF165이다. 보다 긴 아이소형(VEGF183, VEGF189 & VEGF206)은 고도로 양성으로 하전된 C-말단 영역을 갖고, 세포 표면 글리칸 및 생체이용률을 조절하는 헤파린과의 결합을 매개한다. 모든 VEGF-A 아이소형은 수용체-결합 VEGF 단편을 구성하는 약 110개의 N-말단 잔기의 코어를 통해 발생하는 결합을 갖는 동종이합체를 형성한다. 정상 환경 하에서, 및 고형 종양의 중심에서, VEGF의 발현은 주로 혈관 공급의 부족을 의미하는 저산소 조건에 의해 매개된다. 저산소증은 저산소증 유도성 인자 HIF-1α와 항시 발현되는 HIF-1α의 이합체화를 야기시켜, VEGF 유전자의 프로모터 영역 내의 저산소 반응 구성요소에 결합하는 전사 인자를 형성시킨다. 정상산소증 하에서, HIF-1α 단백질은 다수의 프롤린 하이드록실화 사건의 결과로서 유비퀴틴-매개 분해를 겪는다. 다른 종양-관련 VEGF 상향조절은 염증성 사이토카인 & 성장 인자를 통한 종양유전자 경로(즉, ras)를 통한 활성화로 인한 것 뿐만 아니라 기계적 힘에 의해 발생한다.
활성 VEGF 동종이합체는 VEGFR 패밀리의 수용체에 의해 세포 표면에 결합된다. VEGF-A에 대한 주요 혈관 내피 관련 수용체는 VEGFR1(Flt1) 및 VEGFR2(Flk-2; KDR)이다. 둘 모두의 수용체는 티로신 키나제 패밀리의 일원이며, 활성화를 위해 리간드-매개 이합체화를 필요로 한다. 이합체화 후, 키나제 도메인은 자가인산화를 겪지만, VEGFR2에서의 키나제 활성의 정도는 VEGFR1에서의 키나제 활성의 정도보다 크다. VEGF의 혈관형성 신호전달은 주로 VEGFR2를 통해 매개되지만, VEGF의 친화성이 VEGFR1에 대한 것보다 약 3배 더 큰 것이 입증되었다(VEGFR2에 대한 100pM에 비해 KD ~30pM). 이는 VEGFR1이 VEGF를 격리시키고, VEGFR2 활성화의 정도를 조절하는 디코이(decoy) 수용체로 주로 작용한다는 제안을 유도하였다. VEGFR1 발현이 일부 종양과 관련되어 있으나, 이의 주요 역할은 배 발생 & 기관형성 동안에 있는 것으로 보인다. VEGF-A165가 또한 뉴로필린 수용체 NRP1 & NRP2에 의해 결합된다. 이들 수용체는 TK 도메인이 결핍되어 있으나, 이들은 VEGFR2에 대한 공동-수용체로 작용하고, VEGFR2에 VEGF를 전달함으로써 신호전달을 증대시키는 것으로 생각된다.
다수의 연구가 종양 혈관형성에서 중요 인자로서 VEGF-A를 확인하는 것을 도왔다. 예를 들어, VEGF-A는 대부분의 종양 및 종양 관련 기질에서 발현된다. 성장을 뒷받침하는 잘 발달되고 확장되는 혈관구조 시스템의 부재하에서, 종양 세포는 괴사 및 아폽토시스가 발생하게 되며, 이에 의해 지속적 세포 증식으로부터 발생할 수 있는 종양 부피에서의 증가에 대한 제한(대개 1 mm3)이 부과된다. VEGF-A의 발현은 괴사 영역에 인접한 저산소 종양 세포에서 가장 높고, 이는 성장하는 종양에서의 저산소증에 의한 VEGF-A의 유도가 혈관형성의 활성제 및 억제제의 균형을 변경시켜 종양에서 새로운 혈관의 성장을 발생시킬 수 있는 것을 나타낸다. 이러한 가설과 일치하게, VEGF-A를 억제하거나 포획하거나, VEGF-A의 신호전달 수용체 VEGFR-2를 차단하는 소분자량 티로신 키나제 억제제, 모노클로날 항체, 안티센스 올리고누클레오티드 등을 포함하는 다수의 방법이 치료제로서 개발되었다.
따라서, 이중특이적 HGF 및 VEGF 길항제가 필요하다.
발명의 개요
본 발명은 신규한 항-인간 성장 인자(HGF) 길항제, 이중특이적 HGF 길항제 및 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제, 및 치료에서의 상기 길항제의 용도에 관한 것이다. 더욱 특히, 뮤린 항-HGF 항체 S260116C12(본원에서 "16C12"로도 확인됨)로부터 유래된 신규한 인간화 항-HGF 항체의 패널에 관한 것이다. 본 발명은 또한 하나 이상의 에피토프-결합 도메인에 연결된 적어도 하나의 쌍을 이룬 VH/VL 도메인을 포함하는 항원-결합 단백질에 관한 것으로, 이러한 항원-결합 단백질은 적어도 2개의 항원-결합 부위를 갖고, 이러한 항원-결합 부위 중 적어도 하나는 HGF 또는 VEGF에 결합하거나, 항원-결합 부위 중 적어도 하나는 HGF에 결합하고 항원 결합 부위 중 적어도 하나는 VEGF에 결합한다. 특히, 쌍을 이룬 VH/VL 도메인은 16C12로부터 유래된 VH 및 VL 영역을 포함할 수 있다.
따라서, 첫번째 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 에피토프-결합 도메인에 연결된 적어도 하나의 쌍을 이룬 VH/VL 도메인을 포함하는 항원-결합 단백질을 제공하며, 이러한 항원-결합 단백질은 적어도 2개의 항원 결합 부위, 적어도 하나의 에피토프 결합 도메인에 의해 제공되는 항원 결합 부위 중 적어도 하나, 및 적어도 하나의 쌍을 이룬 VH/VL 도메인에 의해 제공되는 항원 결합 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 쌍을 이룬 VH/VL 도메인 또는 각각의 쌍을 이룬 VH/VL 도메인은 HGF에 특이적으로 결합하고 SEQ ID NO:92, 94, 96 또는 98의 VH 아미노산 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 SEQ ID NO:21에 기재된 서열을 갖는 CDRH3를 포함하는 항-HGF 항체를 제공한다. 한 구체예에서, 항-HGF 항체는 CDRH1(SEQ ID NO:19), CDRH2(SEQ ID NO:20), CDRH3(SEQ ID NO:21), CDRL1(SEQ ID NO:22), CDRL2(SEQ ID NO:23), 및 CDRL3(SEQ ID NO:24)를 포함한다. 한 구체예에서, 항-HGF 항체는 SEQ ID NO:90, 92, 94, 96 또는 98 중 임의의 SEQ ID NO에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 SEQ ID NO:100 또는 102에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항-HGF 항체는 SEQ ID NO:76, 78, 80, 82 또는 84에 기재된 중쇄 서열, 및 SEQ ID NO:86 또는 88에 기재된 경쇄 서열을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 링커에 의해 에피토프 결합 도메인에 연결된 본 발명의 상기 언급된 양태에 따른 항-HGF 항체를 제공하며, 상기 에피토프 결합 도메인은 VEGF에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 임의로 SEQ ID NO:104, 106, 108, 110, 191, 192, 193 또는 194에 기재된 아미노산 서열, 또는 이러한 아미노산 서열과 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 이내의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항-VEGF 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.
한 특정 구체예에서, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 SEQ ID NO:194의 아미노산 서열을 갖는 도메인 항체이다.
한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 SEQ ID NO:163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 195 또는 196에 기재된 아미노산 서열을 갖는 링커에 의해 항-HGF 항체에 연결된다. 한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 임의로 항-HGF 항체의 C-말단 또는 N-말단에서 항-HGF 항체의 중쇄에 연결된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-VEGF 에피토프 결합 도메인에 연결된 항-HGF 항체를 포함하는 이중특이적 항원-결합 단백질을 제공하고, 상기 항-HGF 항체는 적어도 SEQ ID NO:21에 기재된 바와 같은 CDRH3를 포함하며, 상기 항-VEGF 에피토프 결합 도메인은 SEQ ID NO:104, 106, 108, 110, 191, 192, 193 또는 194에 기재된 서열을 갖는다. 한 구체예에서, 항-HGF 항체는 CDRH1(SEQ ID NO:19), CDRH2(SEQ ID NO:20), CDRH3(SEQ ID NO:21), CDRL1(SEQ ID NO:22), CDRL2(SEQ ID NO:23), 및 CDRL3(SEQ ID NO:24)를 포함한다. 한 구체예에서, 항-HGF 항체는 SEQ ID NO:76, 78, 80, 82 또는 84 중 임의의 SEQ ID NO에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 도메인, 및 SEQ ID NO:86 또는 88에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 한 특정 구체예에서, 항-HGF 항체는 SEQ ID NO:78의 중쇄 가변 도메인 및 SEQ ID NO:86의 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 항-HGF 항체를 포함하는 항원-결합 단백질을 제공하며, 상기 항-HGF 항체는 SEQ ID NO:90, 92, 94, 96 또는 98의 VH 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO:100 또는 102의 VL 서열을 갖는 경쇄, 및 1 내지 20개의 아미노산을 포함하는 링커에 의해 상기 항체에 연결된 적어도 하나의 에피토프 결합 도메인을 포함하고, 상기 에피토프 결합 도메인은 VEGF에 특이적으로 결합한다.
에피토프 결합 도메인은 SEQ ID NO:191, 192, 193 또는 194의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 한 특정 구체예에서, 항-HGF 항체는 SEQ ID NO:92의 VH 아미노산 서열 및 SEQ ID NO:100의 VL 도메인을 포함한다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항원-결합 단백질 중 임의의 항원-결합 단백질의 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드 서열, 및 본원에 기재된 항원-결합 단백질 중 임의의 항원-결합 단백질의 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 제공한다. 이러한 폴리누클레오티드는 동등한 폴리펩티드 서열에 해당하는 코딩 서열을 의미하나, 상기 폴리누클레오티드 서열이 시작 코돈, 적절한 신호 서열 및 정지 코돈과 함께 발현 벡터로 클로닝될 수 있음이 이해될 것이다.
본 발명은 또한 본원에 기재된 항원-결합 단백질 중 임의의 항원-결합 단백질의 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 하나 이상의 폴리누클레오티드를 포함하는 재조합의 형질전환되거나 트랜스펙션된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명은 적합한 배양 배지, 예를 들어, 혈청 비함유 배양 배지에서 본원에 기재된 항원-결합 단백질 중 임의의 항원-결합 단백질의 중쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 첫번째 벡터, 및 본원에 기재된 항원-결합 단백질 중 임의의 항원-결합 단백질의 경쇄를 엔코딩하는 폴리누클레오티드를 포함하는 두번째 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 항원-결합 단백질 중 임의의 항원-결합 단백질의 생성을 위한 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 본원에 기재된 바와 같은 항원-결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물을 추가로 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1 - VEGF 및 HGF에 대한 이중특이적 항체의 Biacore 결합 데이터.
도 2 - Mv1Lu 세포 세포증식 검정.
도 3 - HGF에 대한 인간 제대 내피 세포(HUVEC)에서의 PcMET.
도 4 - HGF 및 VEGF에 대한 인간 제대 내피 세포(HUVEC)에서의 PcMET.
도 5 - Bx-PC3 pMET 검출 검정.
도 6 - Bx-PC3 세포 이동 검정.
정의
본원에서 사용되는 용어 '단백질 스캐폴드'는 4개의 사슬 또는 2개의 사슬 항체일 수 있거나, 항체의 Fc 영역만을 포함할수 있거나, 항체로부터의 하나 이상의 불변 영역을 포함할 수 있는 면역글로불린(Ig) 스캐폴드, 예를 들어, IgG 스캐폴드를 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 상기 불변 영역은 인간 또는 영장류 기원일 수 있거나, 인간 및 영장류 불변 영역의 인공 키메라일 수 있다. 이러한 단백질 스캐폴드는, 예를 들어, 단백질 스캐폴드가 완전한 IgG를 포함하는 경우 하나 이상의 불변 영역에 더하여 항원-결합 부위를 포함할 수 있다. 이러한 단백질 스캐폴드는 다른 단백질 도메인, 예를 들어, 항원-결합 부위, 예를 들어, 에피토프-결합 도메인 또는 ScFv 도메인을 갖는 단백질 도메인에 연결될 수 있을 것이다. 본 발명의 구체예의 VH 및 VL 도메인 또는 중쇄 및 경쇄는 단백질 스캐폴드의 일부로 존재할 수 있다.
따라서 한 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 에피토프-결합 도메인에 연결된 적어도 하나의 쌍을 이룬 VH/VL 도메인을 포함하는 단백질 스캐폴드를 포함하는 항원-결합 단백질을 제공하며, 상기 쌍을 이룬 VH/VL 도메인은 HGF에 특이적으로 결합하고 에피토프 결합 도메인은 VEGF에 특이적으로 결합하고, 상기 적어도 하나의 쌍을 이룬 VH 도메인의 VH는 SEQ ID NO:92, 94, 96 또는 98의 아미노산 서열을 포함한다.
"도메인"은 단백질의 나머지와 독립적으로 3차 구조를 갖는 폴딩된 단백질 구조이다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 별개의 기능적 특성을 담당하며, 많은 경우에 단백질 및/또는 도메인의 나머지의 기능의 손실 없이 다른 첨가되거나, 제거되거나, 단백질에 전달될 수 있다. "항체 단일 가변 도메인"은 항체 가변 도메인의 특징적인 서열을 포함하는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 이는 완전한 항체 가변 도메인, 및, 예를 들어, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인의 특징이 아닌 서열로 대체된 변형된 가변 도메인, 또는 트렁케이션되거나 N-말단 또는 C-말단 연장을 포함하는 항체 가변 도메인, 뿐만 아니라 전장 도메인의 적어도 결합 활성 및 특이성을 보유한 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다.
구 "면역글로불린 단일 가변 도메인"은 상이한 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인(VH, VHH, VL)을 나타낸다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 다른 다양한 가변 영역 또는 가변 도메인을 갖는 포맷(예를 들어, 동종다합체 또는 이종다합체)로 제공될 수 있고, 상기 다른 영역 또는 도메인은 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원 결합에 필요하지 않다(즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인은 추가 가변 도메인과 독립적으로 항원에 결합한다). "도메인 항체" 또는 "dAb"는 본원에서 사용되는 용어인 항원에 결합할 수 있는 "면역글로불린 단일 가변 도메인"과 동일하다. 면역글로불린 단일 가변 도메인은 인간 항체 가변 도메인일 수 있으나, 이는 또한 설치류(예를 들어, WO 00/29004호에 개시되어 있음), 너스 샤크(nurse shark) 및 카멜리드(Camelid) VHH dAb와 같은 다른 종으로부터의 단일 항체 가변 도메인을 포함한다. 카멜리드 VHH는 경쇄가 자연적으로 결여된 중쇄 항체를 생성하는, 낙타, 라마, 알파카, 단봉낙타, 및 과나코를 포함하는 종으로부터 유래되는 면역글로불린 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 이러한 VHH 도메인은 당 분야에서 이용가능한 표준 기술에 따라 인간화될 수 있고, 이러한 도메인은 본 발명에 따른 "도메인 항체"인 것으로 여전히 간주된다. 본원에서 사용되는 "VH"는 카멜리드 VHH 도메인을 포함한다. NARV는 너스 샤크를 포함하는 연골성 어류에서 확인된 면역글로불린 단일 가변 도메인의 또 다른 유형이다. 이들 도메인은 또한 신규한 항원 수용체 가변 영역(통상적으로, V(NAR) 또는 NARV로 약어화됨)으로 공지되어 있다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Mol. Immunol. 44, 656-665 (2006)] 및 US20050043519A호를 참조하라.
용어 "에피토프-결합 도메인"은 상이한 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특별히 결합하는 도메인을 나타내고, 이는 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어, 인간, 카멜리드 또는 상어 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있거나, 이는 자연 리간드가 아닌 리간드에 대한 결합을 획득하기 위해 단백질 조작에 적용된 CTLA-4(에비바디(Evibody)); 리포칼린(lipocalin); 단백질 A 유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(아피바디, SpA), A-도메인(아비머(Avimer)/맥시바디(Maxibody)); 열 충격 단백질, 예를 들어, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(transferrin)(트랜스-바디(trans-body)); 앙키린(ankyrin) 반복 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머; C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴(Tetranectin)); 인간 γ-크리스탈린(γ-crystallin) 및 인간 유비퀴틴(아필린(affilin))); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 톡신쿠니츠(toxinkunitz) 유형 도메인; 및 피브로넥틴(애드넥틴(adnectin))으로 구성되는 군으로부터 선택된 비-면역글로불린 스캐폴드의 유도체인 도메인일 수 있다.
CTLA-4(세포독성 T 림프구-결합 항원 4)는 주로 CD4+ T-세포에서 발현되는 CD28-패밀리 수용체이다. 이의 세포외 도메인은 가변 도메인-유사 Ig 폴드를 갖는다. 항체의 CDR에 상응하는 루프는 다양한 결합 특성을 부여하는 이종성 서열로 치환될 수 있다. 다양한 결합 특이성을 갖도록 조작된 CTLA-4 분자는 또한 에비바디로 공지되어 있다. 추가 세부사항을 위해, 문헌[Journal of Immunological Methods 248 (1-2), 31-45 (2001)]을 참조하라.
리포칼린은 작은 소수성 분자, 예를 들어, 스테로이드, 빌린(bilin), 레티노이드 및 지질을 운반하는 세포외 단백질의 패밀리이다. 이들은 다양한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 원뿔 구조의 개방 말단에 다수의 루프를 갖는 단단한 β-시트 이차 구조를 갖는다. 안티칼린(anticalin)은 160 내지 180개의 아미노산 크기이고, 리포칼린으로부터 유래된다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Biochim Biophys Acta 1482: 337-350 (2000)], US7250297B1호 및 US20070224633호를 참조하라.
아피바디는 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스태필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 단백질 A로부터 유래된 스캐폴드이다. 도메인은 약 58개의 아미노산의 3-나선 다발로 구성된다. 표면 잔기의 무작위화에 의해 라이브러리가 생성되었다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 17, 455-462 (2004)] 및 EP1641818A1호를 참조하라.
아비머는 A-도메인 스캐폴드 패밀리로부터 유래된 다중도메인 단백질이다. 약 35개의 아미노산의 자연 도메인은 규정된 이황화결합된 구조를 채택한다. A-도메인의 패밀리에 의해 나타난 자연 변이의 셔플링(shuffling)에 의해 다양성이 생성된다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Nature Biotechnology 23(12), 1556 - 1561 (2005) and Expert Opinion on Investigational Drugs 16(6), 909-917 (June 2007)]을 참조하라.
트랜스페린은 단량체 혈청 운반 당단백질이다. 트랜스페린은 증식허용 표면 루프 내의 펩티드 서열의 삽입에 의해 다양한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 조작된 트랜스페린 스캐폴드의 예는 트랜스-바디를 포함한다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[J. Biol. Chem 274, 24066-24073 (1999)]을 참조하라.
지정된 앙키린 반복 단백질(Designed Ankyrin Repeat Proteins, DARPins)은 세포골격에 대한 온전한 막 단백질의 부착을 매개하는 단백질의 패밀리인 앙키린으로부터 유래된다. 단일 앙키린 반복은 2개의 α-나선 및 β-턴으로 구성되는 33개의 잔기의 모티프이다. 이들은 각 반복의 첫번째 α-나선 및 β-턴 내의 잔기를 무작위화시킴으로써 다양한 표적 항원에 결합하도록 조작될 수 있다. 이들의 결합 접촉면은 모듈의 수를 증가(친화성 성숙의 방법)시킴으로써 증가될 수 있다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[J. Mol. Biol. 332, 489-503 (2003), PNAS 100(4), 1700-1705 (2003) and J. Mol. Biol. 369, 1015-1028 (2007)] 및 US20040132028A1호를 참조하라.
피브로넥틴은 항원에 결합하도록 조작될 수 있는 스캐폴드이다. 애드넥틴은 인간 피브로넥틴 유형 III(FN3)의 15개의 반복 단위의 10번째 도메인의 자연 아미노산 서열의 백본으로 구성된다. β-샌드위치의 한 말단의 3개의 루프는 애드넥틴이 관심 치료 표적을 특이적으로 인지하는 것을 가능케 하도록 조작될 수 있다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Protein Eng. Des. Sel. 18, 435-444 (2005)], US20080139791호, WO2005056764호 및 US6818418B1호를 참조하라.
펩티드 앱타머는 활성 부위에 삽입된 속박 가변 펩티드 루프를 함유하는 불변 스캐폴드 단백질, 통상적으로 티오레독신(thioredoxin)(TrxA)으로 구성되는 조합 인지 분자이다. 추가 세부사항에 대해서는, 문헌[Expert Opin. Biol. Ther. 5, 783-797 (2005)]을 참조하라.
미세소체는 3-4개의 시스테인 브릿지를 함유하는 25-50개의 아미노산 길이의 자연 발생 미세단백질(microprotein)로부터 유래되며 - 미세단백질의 예는 KalataB1 및 코노톡신(conotoxin) 및 크노틴(knottin)을 포함한다. 미세단백질은 미세단백질의 전체 폴드에 영향을 미치지 않고 25개 이하의 아미노산을 포함하도록 조작될 수 있는 루프를 갖는다. 조작된 크노틴 도메인의 추가 세부사항에 대해서는, WO2008098796호를 참조하라.
다른 에피토프 결합 도메인은 다양한 표적 항원 결합 특성을 조작하기 위해 스캐폴드로 사용되는 단백질을 포함하고, 이는 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아필린)), 인간 프로테아제 억제제의 쿠니츠 유형 도메인, Ras-결합 단백질 AF-6의 PDZ-도메인, 전갈 독소(카리브도톡신(charybdotoxin)), C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴)을 포함하며, 이들은 문헌[Non-Antibody Scaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, edited by Stefan Dubel) and Protein Science 15:14-27 (2006)]의 챕터 7에 개관되어 있다. 본 발명의 에피토프 결합 도메인은 상기 대안적 단백질 도메인 중 임의의 대안적 단백질 도메인으로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "쌍을 이룬 VH 도메인", "쌍을 이룬 VL 도메인", 및 "쌍을 이룬 VH/VL 도메인"은 이들의 파트너 가변 도메인과 쌍을 이루는 경우에만 항원에 특이적으로 결합하는 항체 가변 도메인을 나타낸다. 어떠한 쌍에서도 항상 하나의 VH 및 하나의 VL이 존재하고, 용어 "쌍을 이룬 VH 도메인"은 VH 파트너를 나타내고, 용어 "쌍을 이룬 VL 도메인"은 VL 파트너를 나타내고, 용어 "쌍을 이룬 VH/VL 도메인"은 2개의 도메인을 함께 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "항원 결합 단백질"은 HGF 및/또는 VEGF에 결합할 수 있는 항체, 항체 단편, 예를 들어, 도메인 항체(dAb), ScFv, FAb, FAb2, 및 다른 단백질 작제물을 나타낸다. 항원 결합 분자는 적어도 하나의 Ig 가변 도메인, 예를 들어, 항체, 도메인 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, ScFv, 디아바디, mAbdAb, 아피바디, 헤테로컨쥬게이트 항체 또는 이중특이적 항체를 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 항원 결합 분자는 항체이다. 또 다른 구체예에서, 항원 결합 분자는 상이한 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 dAb, 즉, 면역글로불린 단일 가변 도메인, 예를 들어, VH, VHH 또는 VL이다. 항원 결합 분자는 2개의 표적에 결합할 수 있고, 즉, 이들은 이중 표적화 단백질일 수 있다. 항원 결합 분자는 항체 및 항원 결합 단편의 조합물, 예를 들어, 모노클로날 항체에 연결된 하나 이상의 도메인 항체 및/또는 하나 이상의 ScFv일 수 있다. 항원 결합 분자는 또한 비-면역글로불린 도메인, 예를 들어, HGF 또는 VEGF에 대한 결합을 획득하기 위해 단백질 조작에 적용된 CTLA-4(에비바디); 리포칼린; 단백질 A 유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(아피바디, SpA), A-도메인(아비머/맥시바디); 열 충격 단백질, 예를 들어, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(트랜스-바디); 앙키린 반복 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머; C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아필린); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 톡신쿠니츠 유형 도메인; 및 피브로넥틴(애드넥틴)으로 구성되는 군으로부터 선택된 스캐폴드의 유도체인 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 "항원 결합 단백질"은 인간 HGF 및/또는 VEGF를 길항시키고/시키거나 중화시킬 수 있을 것이다. 또한, 항원 결합 단백질은 HGF 및/또는 VEGF에 결합하고, 자연 리간드가 수용체에 결합하고/하거나 이를 활성화시키는 것을 방지함으로써 HGF 및/또는 VEGF 활성을 차단할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 "VEGF 길항제"는 VEGF의 적어도 하나의 활성을 감소시키고/시키거나 제거할 수 있는 임의의 화합물을 포함한다. 예를 들어, VEGF 길항제는 VEGF에 결합할 수 있고, 이러한 결합은 VEGF 활성을 직접적으로 감소시키거나 제거할 수 있거나, 이는 적어도 하나의 리간드를 수용체에 대한 결합으로부터 차단함으로써 간접적으로 작용할 수 있다.
본원에서 사용되는 "HGF 길항제"는 HGF의 적어도 하나의 활성을 감소시키고/시키거나 제거할 수 있는 임의의 화합물을 포함한다. 예를 들어, HGF 길항제는 HGF에 결합할 수 있고, 이러한 결합은 HGF 활성을 직접적으로 감소시키거나 제거할 수 있거나, 이는 적어도 하나의 리간드를 수용체에 대한 결합으로부터 차단함으로써 간접적으로 작용할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 항원-결합 부위는 Biacore™에 의해 측정시 각각의 항원에 대해 적어도 1mM의 Kd, 예를 들어, 10nM, 1nM, 500pM, 200pM, 100pM의 Kd로 항원에 결합한다.
본원에서 사용되는 용어 "항원-결합 부위"는 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 작제물 상의 부위를 나타내고, 이는 단일 도메인, 예를 들어, 에피토프-결합 도메인일 수 있거나, 이는 표준 항체에서 발견될 수 있는 바와 같이 쌍을 이룬 VH/VL 도메인일 수 있다. 본 발명의 일부 양태에서, 단쇄 Fv(ScFv) 도메인은 항원-결합 부위를 제공할 수 있다.
용어 "불변 경쇄"는 면역글로불린 경쇄의 불변 도메인을 나타내는 것으로 본원에서 사용된다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 인간 성장 인자(HGF) 길항제 및/또는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 길항제를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 예를 들어, 치료에 사용하기 위한, HGF 길항제 및 VEGF 길항제의 조합물을 제공한다. 본 발명은 또한 VEGF 길항제와 조합된 HGF 길항제를 투여함으로써 질병을 치료하는 방법을 제공한다. HGF 길항제 및 VEGF 길항제는 별개로, 순차적으로, 또는 동시에 투여될 수 있다.
혈관형성의 억제는 성장하는 종양으로의 혈액 공급을 차단(이에 따라, 산소 및 영양소를 제한)하는 것을 목적으로 하는 확립된 치료 방법이다. 다수의 혈관형성 억제제가 전임상 암 모델 및 여러 임상 시험에서 치료적으로 유효하였다. VEGF를 표적으로 하는 모노클로날 항체인 아바스틴(Avastin)(베바시주맙(Bevacizumab))이 화학요법과 조합된 전이성 결장직장암(CRC) 및 비소세포폐암종(NSCLC)의 치료를 위한 제1선 치료제로서 승인되었으며, 많은 소분자 화합물이 전임상 및 임상 개발중이다. 유방암 및 결장암과 같은 특정 암에서, 상기와 같은 작용제는 화학요법과 조합하여 제공되는 경우 질병의 진행을 늦출 수 있고, 환자 생존 시간을 수개월로 증가시킬 수 있으나, 단독으로 제공되는 경우에는 그렇지 않다. 또한, 여러 임상 시험에서, 베바시주맙(Bevacizumab)-단독 아암(arm)은 플러스 화학요법(CT) 아암에 비해 열등한 성능으로 인해 조기에 종결되었다. 처음에, 이러한 관찰은 모순적인 것으로 보였는데, 이는 종양 혈액 공급을 감소시키는 것이 CT가 종양에 전달될 수 있는 정도를 제한하는 것으로 밝혀졌기 때문이다. 상기 관찰을 이론적으로 설명하려는 시도는 베바시주맙의 효과가 종양의 특징적으로 혼란된 혈관구조를 정상화시킨다는 제안을 기초로 한다. 혈관 정상화의 한 가정된 효과는 사이질액압(IFP)을 감소시켜, 증가된 혈류 및 종양의 코어로의 CT 작용제의 침투를 발생시키는 것이다. CT와 조합된 베바시주맙의 효과에 대한 한 대안적 이론은 VEGF의 차단이 영양소 및 산소 공급을 감소시키고, CT에 의해 유도되는 것을 증대시키는 아폽토시스전(pro-apoptotic) 사건을 촉발시키는 것을 제안한다.
생체내 모델에서의 최근의 연구는 임상에서 VEGF 경로의 표적 억제를 위해 단일요법으로 사용되는 경우 항-혈관형성 억제제의 장기간 효능의 결핍에 대해 더욱 빛을 비추기 시작했다. 여러 레포트는 상기 방법의 항-종양 효과를 입증하나, 이들은 또한 증대된 침습성 및 일부 경우에 증가된 림프 및 원위 전이와 함께 동반하는 종양 순응 및 더 큰 악성종양의 단계로의 진행을 또한 나타낸다. 따라서, 원발성 종양 성장에 대한 이로운 효과에 더하여 암세포의 산소 '고갈'(저산소증)의 결과는 산소의 탐색으로 인해 종양 세포를 다른 곳으로 유도하는 것으로 보인다. 즉, 항-종양 효과 및 혈관신생을 효과적으로 억제시킴에 의한 생존 이점을 발생시키는 항-혈관형성 요법은 침습 및 전이를 증가시킴으로써 종양의 표현형을 추가로 변경시킬 수 있다. 다른 레포트에서는 저산소증이 암세포가 MET를 생성하고 HGF/MET 매개 경로를 통해 증가된 신호전달을 갖도록 유도하고, 차례로 상기 세포가 고도로 운동성이 되고 원위 부위로 이동(전이 확산)하도록 야기시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, VEGF 억제제 단독의 연장된 사용은 대안적 혈관신생 경로의 사용을 촉진하여, 생존률이 증가함에 따라 약물 내성의 가능성을 열어 놓을 수 있다.
그러므로, 이중특이적 분자는 단일 작용제에서 HGF 항체의 활성(종양 성장, 혈관형성 및 전이의 억제)과 VEGF 차단의 항-혈관형성 효과를 조합시킬 것이며, 각각의 성분의 단독 사용에 비해 여러 장점을 가질 것이다. HGF 및 VEGF의 동시 중화가 개선된 혈관형성 조절을 전하면서 저산소증에 대한 세포의 전이성 반응을 억제할 수 있음에 따라 상승작용 효과의 잠재성이 있다. 또한, 상기 두 활성의 조합은 환자 생존율이 증가함에 따라 단일 작용제 항-혈관형성 요법에 대한 약물 내성의 잠재성을 제한할 수 있다.
상기 길항제는 항체 또는 에피토프 결합 도메인, 예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인일 수 있다. 길항제는 동시에 투여, 즉, 공동-투여되거나, 서로 24시간 이내, 예를 들어, 서로 20시간 이내, 또는 15시간 이내 또는 12시간 이내, 또는 10시간 이내, 또는 8시간 이내, 또는 6시간 이내, 또는 4시간 이내, 또는 2시간 이내, 또는 1시간 이내, 또는 30분 이내로 투여되는 별개의 분자의 혼합물로 투여될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 다른 HGF 길항제는 항-c-MET 항체, 예를 들어, WO2009/007427호에 기재된 항체를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96 또는 SEQ ID NO:98로부터 선택된 중쇄 가변 서열을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공된다. 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 모노클로날 항체이다. 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:100 또는 SEQ ID NO:102로부터 선택된 경쇄 가변 서열, 또는 SEQ ID NO:86 또는 88의 경쇄를 포함할 수 있다.
본원에 기재된 본 발명의 한 양태에서, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193 또는 SEQ ID NO:194로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공된다.
한 구체예에서, 본원에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질이 제공되며, 상기 항원 결합 단백질은 VEGF에 결합하고, 예를 들어, 항원 결합 단백질은 VEGF에 결합하는 에피토프-결합 도메인을 포함하고, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108 또는 SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193 또는 SEQ ID NO:194로부터 선택된 아미노산 서열과 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 항원 결합 단백질은 본 발명의 상기 기재된 양태에 따른 항-HGF 항체를 추가로 포함할 수 있다. 항-HGF 항체는 링커에 의해 VEGF 특이적 에피토프-결합 도메인에 연결될 수 있다.
한 구체예에서, 본원에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질이 제공되며, 상기 항원 결합 단백질은 HGF에 결합하고, 예를 들어, 항원 결합 단백질은 HGF에 결합하는 에피토프-결합 도메인을 포함하고, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80 또는 SEQ ID NO:82로부터 선택된 중쇄 서열과 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은 본 발명의 한 추가 구체예에서, 항원 결합 단백질은 링커 서열, 예를 들어, SEQ ID NO:163-170, SEQ ID NO:187-190, 또는 SEQ ID NO:195 또는 196으로부터 선택된 링커를 추가로 포함할 수 있다.
한 추가 구체예에서, 길항제는 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 하나의 분자로 존재하고, 예를 들어, 본 발명은 HGF 및 VEGF에 결합할 수 있거나, HGF 및 VEGFR2에 결합할 수 있거나, c-MET 및 VEGF에 결합할 수 있는 이중 표적화 분자를 제공한다.
본 발명은 하나 이상의 에피토프-결합 도메인에 연결된 쌍을 이룬 VH/VL 도메인을 포함하는 항원-결합 단백질을 제공하며, 이러한 항원-결합 단백질은 적어도 2개의 항원-결합 부위를 갖고, 이 중 적어도 하나는 에피토프 결합 도메인으로부터 유래되고, 항원-결합 부위 중 적어도 하나는 HGF에 결합한다.
본 발명은 하나 이상의 에피토프-결합 도메인에 연결된 쌍을 이룬 VH/VL 도메인을 포함하는 항원-결합 단백질을 제공하며, 이러한 항원-결합 단백질은 적어도 2개의 항원-결합 부위를 갖고, 이 중 적어도 하나는 에피토프 결합 도메인으로부터 유래되고, 적어도 하나는 쌍을 이룬 VH/VL 도메인으로부터 유래되고, 항원-결합 부위 중 적어도 하나는 VEGF에 결합한다.
이러한 항원-결합 단백질은 하나 이상의 에피토프-결합 도메인, 예를 들어, 도메인 항체에 연결된 쌍을 이룬 VH/VL, 예를 들어, 모노클로날 항체를 포함하며, 상기 결합 단백질은 적어도 2개의 항원-결합 부위를 갖고, 이 중 적어도 하나는 에피토프 결합 도메인으로부터 유래되고, 항원-결합 부위 중 적어도 하나는 HGF에 결합하며, 상기 항원-결합 단백질을 생성하는 방법 및 이의 용도, 특히 치료에서의 용도가 제공된다.
본 발명의 항원-결합 단백질은 또한 mAbdAb로 언급된다.
본 발명의 항원-결합 단백질은 적어도 2개의 항원-결합 부위를 갖고, 예를 들어, 이는 2개의 결합 부위를 가지며, 예를 들어, 첫번째 결합 부위는 항원 상의 첫번째 에피토프에 대한 특이성을 갖고, 두번째 결합 부위는 동일 항원 상의 두번째 에피토프에 대한 특이성을 갖는다. 한 추가 구체예에서, 4개의 항원-결합 부위, 또는 6개의 항원-결합 부위, 또는 8개의 항원-결합 부위, 또는 10개의 항원-결합 부위가 존재한다. 한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 하나 이상의 항원, 예를 들어, 2개의 항원, 또는 3개의 항원, 또는 4개의 항원에 대해 특이성을 갖는다.
본 발명의 한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 면역글로불린 단일 가변 도메인이다.
본원에 기재된 항원-결합 단백질 중 임의의 항원-결합 단백질이 하나 이상의 항원을 중화시킬 수 있을 것이며, 예를 들어, 이들은 HGF를 중화시킬 수 있을 것이며, 이들은 또한 VEGF를 중화시킬 수 있는 것이 이해될 것이다.
본 발명의 항원-결합 단백질과 관련하여 본 명세서 전체에 걸쳐 사용되는 용어 "중화시키다" 및 이의 문법적 변화는 본 발명의 항원-결합 단백질의 부재하에서 표적의 활성에 비해 상기 항원-결합 단백질의 존재하에서 표적의 생물학적 활성이 전체적으로 또는 부분적으로 감소되는 것을 의미한다. 중화는 리간드 결합 차단, 리간드가 수용체를 활성화시키는 것의 방지, 수용체의 하향 조절, 또는 효과기 기능의 영향 중 하나 이상으로 인한 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
중화의 수준은 여러 방식, 예를 들어, 하기 실시예에 기재되는 검정 중 임의의 검정의 이용에 의해 측정될 수 있고, 예를 들어, 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행될 수 있는 수용체에 대한 리간드 결합의 억제를 측정하는 검정으로 측정될 수 있다. 이러한 검정에서 HGF의 중화는 중화 항원-결합 단백질의 존재하에서 MET의 인산화(Met 인산화는 HGF에 의해 자극됨)에서의 감소를 평가함으로써 측정된다. 본 검정에서 사용하기에 적합한 HGF 단백질은 NCBI 참조 서열: NM_000601.4(UniProt ID P14210)의 서열을 포함하는 HGF 단백질을 포함한다. VEGF의 중화 수준은, 예를 들어, 실시예 11에 기재된 검정에 의해 측정될 수 있다. 본 검정에서 사용하기에 적합한 VEGF 단백질은 NCBI 참조 NP_001020539.2(UniProt ID: P15692)의 서열을 포함하는 VEGF165를 포함한다.
예를 들어, 중화 항원-결합 단백질의 존재하에서 리간드와 이의 수용체 사이의 감소된 결합을 평가함으로써 중화를 평가하는 다른 방법이 당 분야에 공지되어 있고, 이는, 예를 들어, Biacore™ 검정을 포함한다.
따라서, 한 구체예에서, HGF를 중화시키거나, VEGF를 중화시키는 본원에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질이 제공된다. 한 추가 구체예에서, 본원에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질이 제공되며, 이러한 항원 결합 단백질은 HGF 및 VEGF 둘 모두를 중화시킨다.
본 발명의 한 대안적 양태에서, 본원에 예시된 항원 결합 단백질에 대해 적어도 실질적으로 동등한 중화 활성을 갖는 항원-결합 단백질이 제공된다.
본 발명의 항원-결합 단백질은 HGF에 대한 특이성을 갖고, 예를 들어, 이들은 HGF에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하고/하거나, 이들은 HGF에 결합하는 쌍을 이룬 VH/VL을 포함한다. 항원-결합 단백질은 HGF에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원-결합 단백질은 HGF에 결합할 수 있는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 단백질은 VEGF에 대한 특이성을 갖고, 예를 들어, 이들은 VEGF에 결합할 수 있는 에피토프-결합 도메인을 포함하고/하거나, 이들은 VEGF에 결합하는 쌍을 이룬 VH/VL을 포함한다. 항원-결합 단백질은 VEGF에 결합할 수 있는 항체를 포함할 수 있다. 항원-결합 단백질은 VEGF에 결합할 수 있는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, 본원에 기재된 항원 결합 단백질과 경쟁하는 항원 결합 단백질이 제공된다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193 또는 SEQ ID NO:194로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 항원 결합 단백질과 VEGF로의 결합에 대해 경쟁한다.
예를 들어, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96 또는 SEQ ID NO:98로부터 선택된 가변 중쇄 서열을 포함하는 항원 결합 단백질과 HGF로의 결합에 대해 경쟁한다.
한 추가 구체예에서, HGF 및 VEGF 둘 모두로의 결합에 대해 경쟁하고, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96 또는 SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193 또는 SEQ ID NO:194로부터 선택된 가변 중쇄 서열을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공된다.
한 구체예에서, 본원에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질이 제공되며, 이러한 항원 결합 단백질은 VEGF에 결합하고, 예를 들어, 항원 결합 단백질은 VEGF에 결합하는 에피토프-결합 도메인을 포함하고, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:104, SEQ ID NO106, SEQ ID NO:108, SEQ ID NO:110, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193 또는 SEQ ID NO:194로부터 선택된 서열과 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 단백질은 하나 이상의 항원에 대해 특이성을 갖고, 예를 들어, 이는 HGF 및 VEGF에 결합할 수 있다. 한 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 단백질은 HGF 및 VEGF에 동시에 결합할 수 있다.
한 구체예에서, 본원에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질이 제공되며, 이러한 항원 결합 단백질은 HGF에 결합하고, 예를 들어, 항원 결합 단백질은 HGF에 결합하는 에피토프-결합 도메인을 포함하고, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80 또는 SEQ ID NO:82로부터 선택된 중쇄 서열과 적어도 70%, 또는 적어도 75%, 또는 적어도 80% 또는 적어도 85% 또는 적어도 90% 또는 적어도 95% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 항원-결합 단백질 중 임의의 항원-결합 단백질이, 예를 들어, 실시예 7에 기재된 것과 같은 적합한 검정을 이용하여 화학량론 분석에 의해 결정시 2개 이상의 항원에 동시에 결합할 수 있음이 이해될 것이다.
이러한 항원-결합 단백질의 예는 HGF 길항제인 에피토프 결합 도메인, 예를 들어, 중쇄의 C-말단 또는 N-말단 또는 경쇄의 C-말단 또는 N-말단에 부착된 항-HGF 면역글로불린 단일 가변 도메인을 갖는 항-VEGF 항체를 포함한다.
상기 항원-결합 단백질의 예는 중쇄의 C-말단 또는 N-말단 또는 경쇄의 C-말단 또는 N-말단에 부착된 VEGF 길항제인 에피토프 결합 도메인을 갖는 항-HGF 항체를 포함한다. 예로는 SEQ ID NO:76, 78, 80, 82 또는 84에 기재된 중쇄 서열 및/또는 SEQ ID NO:86 또는 88에 기재된 경쇄 서열을 포함하는 항원 결합 단백질을 포함하며, 상기 중쇄 및 경쇄 중 하나 또는 둘 모두는, 예를 들어, VEGF 또는 VEGF 수용체, 예를 들어, VEGFR2로의 결합에 의해 VEGF를 길항시킬 수 있는 하나 이상의 에피토프-결합 도메인을 추가로 포함한다. 이러한 에피토프-결합 도메인은 SEQ ID NO:181, 182 및 SEQ ID NO:104, 106, 108, 110, 191, 192, 193 또는 194에 기재된 것으로부터 선택될 수 있다.
한 특정 구체예에서, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:78의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:86의 경쇄 서열을 포함하며, 상기 중쇄 및 경쇄 중 하나 또는 둘 모두, 임의로 중쇄는 VEGF 또는 VEGF 수용체, 임의로 VEGF를 길항시킬 수 있는 상기 중쇄 및 경쇄 중 하나 또는 둘 모두, 임의로 중쇄에 결합된 에피토프-결합 도메인을 추가로 포함한다. 한 특정 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 SEQ ID NO:194에 기재된 서열을 갖는다. 에피토프 결합 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 1 내지 20개의 아미노산 길이의 링커에 의해 항원 결합 단백질에 부착될 수 있다.
상기 항원-결합 단백질의 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된 VEGF 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 에피토프 결합 도메인을 갖는 HGF 항체를 포함하며, 예를 들어, 항원 결합 단백질은 SEQ ID NO:112-162에 기재된 중쇄 서열, 및 SEQ ID NO:86 또는 88에 기재된 경쇄 서열을 갖는다.
한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 VEGF 길항제인 에피토프 결합 도메인에 연결된 항-HGF 항체를 포함할 것이며, 이러한 항-HGF 항체는 SEQ ID NO:78, 82 또는 84의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:86의 경쇄 서열을 갖는 항체, 또는 SEQ ID NO:48의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:50의 경쇄 서열을 갖는 항체, 또는 SEQ ID NO:52의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:54의 경쇄 서열을 갖는 항체, 또는 SEQ ID NO:56의 중쇄 서열 및 SEQ ID NO:58의 경쇄 서열을 갖는 항체와 동일한 CDR을 갖는다.
한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 VEGF 길항제인 에피토프 결합 도메인에 연결된 항-HGF 항체를 포함할 것이며, 여기서 중쇄 서열은 SEQ ID NO:112, 114, 115, 117, 118, 123, 125, 126, 131, 133 또는 134를 포함하고, 경쇄 서열은 SEQ ID NO:86 또는 88을 포함한다.
본 발명에서 사용되는 HGF 항체의 추가 세부사항은 WO2005/017107호, WO2007/143098호 및 WO2007/115049호에 제공된다. 상기 항원-결합 단백질의 다른 예는 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된 항-VEGF 에피토프 결합 도메인을 갖는 항-HGF 항체를 포함하며, 상기 VEGF 에피토프 결합 도메인은 SEQ ID NO:104, 106, 108, 110, 191, 192, 193 또는 194에 기재된 VEGF dAb 서열 중 임의의 VEGF dAb 서열로부터 선택되는 VEGF dAb이다.
한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 중쇄의 c-말단 또는 n-말단 또는 경쇄의 c-말단 또는 n-말단에 부착된 항-VEGF 에피토프 결합 도메인을 갖는 항-HGF 항체를 포함하며, 상기 VEGF 에피토프 결합 도메인은 SEQ ID NO:104, 106, 108, 110, 191, 192, 193 또는 194에 기재된 VEGF dAb 서열 중 임의의 VEGF dAb 서열로부터 선택되는 VEGF dAb이다.
본원에서 사용되는 용어 "효과기 기능"은 항체 의존성 세포 매개 세포독성 활성(ADCC), 보체-의존성 세포독성 활성(CDC) 매개 반응, Fc-매개 포식작용 및 FcRn 수용체를 통한 항체 재이용 중 하나 이상을 나타내는 것을 의미한다. IgG 항체에 대해, ADCC 및 ADCP를 포함하는 효과기 기능은 중쇄 불변 영역과 면역 세포의 표면 상에 존재하는 Fcγ 수용체의 패밀리의 상호작용에 의해 매개된다. 인간에서, 이들은 FcγRI(CD64), FcγRII(CD32) 및 FcγRIII(CD16)를 포함한다. 항원에 결합된 항원 결합 단백질과 Fc/Fcγ 복합체의 형성 사이의 상호작용은 세포독성, 면역 세포 활성화, 포식작용 및 염증성 사이토카인의 방출을 포함하는 광범위한 효과를 유도한다.
항원 결합 단백질의 불변 영역과 다양한 Fc 수용체(FcR) 사이의 상호작용은 항원 결합 단백질의 효과기 기능을 매개하는 것으로 생각된다. 유의한 생물학적 효과는 효과기 기능의 결과, 특히, 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC), 보체의 고정(보체 의존성 세포독성 또는 CDC), 및 항원 결합 단백질의 반감기/청소일 수 있다. 보통, 효과기 기능을 매개하는 능력은 항원에 대한 항원 결합 단백질의 결합을 필요로 하며, 모든 항원 결합 단백질이 모든 효과기 기능을 매개하지는 않을 것이다.
효과기 기능은 ADCC 효과기 기능을 측정하기 위해, 예를 들어, 자연살세포에 대해 FcγRIII의 결합을 통하거나 단핵구/대식세포에 대해 FcyRI을 통하는 것을 포함하는 다수의 방식으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항원 결합 단백질은 자연살세포 검정에서 ADCC 효과기 기능에 대해 평가될 수 있다. 상기 검정의 예는 문헌[Shields et al, 2001 The Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, p6591-6604; Chappel et al, 1993 The Journal of Biological Chemistry, Vol 268, p25124-25131; Lazar et al, 2006 PNAS, 103; 4005-4010]에서 발견될 수 있다.
CDC 기능을 결정하는 검정의 예는 문헌[1995 J Imm Meth 184:29-38]에 기재된 것을 포함한다.
인간 불변 영역의 일부 아이소형(isotype), 특히 IgG4 및 IgG2 아이소형은 본질적으로 a) 고전 경로에 의한 보체의 활성화, 및 b) 항체-의존성 세포 세포독성의 기능이 결핍되어 있다. 항원 결합 단백질의 중쇄 불변 영역에 대한 다양한 변형은 요망되는 효과기 특성에 따라 수행될 수 있다. Fc 수용체에 대한 결합을 감소시키고, 이에 따라 ADCC 및 CDC를 감소시키는 특정 돌연변이를 함유하는 IgG1 불변 영역이 따로 기재되었다(Duncan et al. Nature 1988, 332; 563-564; Lund et al. J. Immunol. 1991, 147; 2657-2662; Chappel et al. PNAS 1991, 88; 9036-9040; Burton and Woof, Adv. Immunol. 1992, 51;1-84; Morgan et al., Immunology 1995, 86; 319-324; Hezareh et al., J. Virol. 2001, 75 (24); 12161-12168).
본 발명의 한 구체예에서, 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 상기 항원 결합 단백질은 감소된 ADCC 및/또는 보체 활성화 또는 효과기 기능을 갖는다. 한 상기 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG2 또는 IgG4 아이소형의 자연적으로 불능화된 불변 영역 또는 돌연변이된 IgG1 불변 영역을 포함할 수 있다. 적합한 변형의 예는 EP0307434호에 기재되어 있다. 한 예는 위치 235 및 237에서 알라닌 잔기의 치환을 포함할 수 있다(EU 지표 넘버링).
잔기 Asn297에 특정 돌연변이 또는 변경된 당화를 함유하는 인간 IgG1 불변 영역은 또한 Fc 수용체에 대한 결합을 향상시키는 것으로 기재되었다. 일부 경우에, 이들 돌연변이는 또한 ADCC 및 CDC를 향상시키는 것으로 밝혀졌다(Lazar et al. PNAS 2006, 103; 4005-4010; Shields et al. J Biol Chem 2001, 276; 6591-6604; Nechansky et al. Mol Immunol, 2007, 44; 1815-1817).
본 발명의 한 구체예에서, 상기 돌연변이는 239, 332 및 330(IgG1)으로부터 선택된 위치 중 하나 이상, 또는 다른 IgG 아이소형 내의 동등한 위치에 존재한다. 적합한 돌연변이의 예는 S239D 및 I332E 및 A330L이다. 한 구체예에서, 본원에 기재된 본 발명의 항원 결합 단백질은 S239D 및 I332E와 같이 위치 239 및 332에서 돌연변이되거나, 한 추가 구체예에서, 이는 S239D 및 I332E 및 A330L과 같이 239 및 332 및 330으로부터 선택된 3개 이상의 위치에서 돌연변이된다(EU 지표 넘버링).
본 발명의 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 변경된 당화 프로파일을 갖는 중쇄 불변 영역을 포함하며, 상기 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 갖는다. 예를 들어, 항원 결합 단백질은 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC를 갖거나, 이는 향상된 ADCC 및 CDC 효과기 기능 둘 모두를 갖는다. 변경된 당화 프로파일을 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키기에 적합한 방법의 예는 WO2003/011878호, WO2006/014679호 및 EP1229125호에 기재되어 있으며, 상기 모두는 본 발명의 항원 결합 단백질에 적용될 수 있다.
본 발명은 또한 a) 본원에 기재된 바와 같은 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 엔코딩하는 FUT8 유전자가 재조합 숙주 세포에서 비활성화되는 단계; 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질의 생성을 위한 방법을 제공한다.
항원 결합 단백질의 생성을 위한 상기 방법은, 예를 들어, FUT8 유전자의 기능성 카피가 결핍된 CHOK1SV 세포가 기능성 FUT8 유전자를 갖는 세포에서 생성된 동일한 모노클로날 항체에 비해 증가되는 향상된 항체 의존성 세포 매개 세포독성(ADCC) 활성을 갖는 모노클로날 항체를 생성시키는, BioWa, Inc.(Princeton, NJ)로부터 이용가능한 POTELLIGENT™ technology system을 이용하여 수행될 수 있다. POTELLIGENT™ technology system의 양태는 모두 참조로서 본원에 포함되는 US7214775호, US6946292호, WO0061739호 및 WO0231240호에 기재되어 있다. 당업자는 또한 다른 적절한 시스템을 인지할 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질, 예를 들어, IgG3으로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인을 갖는 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 상기 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC, 또는 향상된 ADCC 및 CDC 기능을 갖는다. 한 상기 구체예에서, 항원 결합 단백질은 IgG3으로부터의 하나의 CH2 도메인을 포함할 수 있거나, 둘 모두의 CH2 도메인은 IgG3으로부터 유래될 수 있다.
또한, a) 본원에 기재된 바와 같은 분리된 핵산을 포함하는 발현 벡터를 포함하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 발현 벡터가 IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 Fc 도메인을 엔코딩하는 핵산 서열을 포함하는 단계; 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 생성하는 방법이 제공된다.
항원 결합 단백질의 생성을 위한 상기 방법은, 예를 들어, 재조합 숙주 세포가, IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 키메라 Fc 도메인을 엔코딩하는 핵산 서열이 발현되어 상기 키메라 Fc 도메인이 결핍된 달리 동일한 항원 결합 단백질에 비해 증가되는 향상된 보체 의존성 세포독성(CDC) 활성을 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키는 발현 벡터를 포함하는, BioWa, Inc.(Princeton, NJ) 및 Kyowa Hakko Kogyo(현재, Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd.) Co., Ltd.로부터 이용가능한 COMPLEGENT™ technology system을 이용하여 수행될 수 있다. COMPLEGENT™ technology system의 양태는 각각이 참조로서 본원에 포함되는 WO2007011041호 및 US20070148165호에 기재되어 있다. 한 대안적 구체예에서, CDC 활성은 IgG 사슬의 Fc 영역으로 서열 특이적 돌연변이를 도입시킴으로써 증가될 수 있다. 당업자는 또한 다른 적절한 시스템을 인지할 것이다.
이러한 변형은 단독으로 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 효과기 기능을 추가로 향상시키기 위해 서로 조합되어 사용될 수 있음이 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 한 상기 구체예에서, 돌연변이된 중쇄 불변 영역 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 IgG3으로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인 및 IgG1으로부터의 하나의 CH2 도메인을 포함하고, IgG1 CH2 도메인은 239 및 332 및 330으로부터 선택된 위치에 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 돌연변이는 S239D 및 I332E 및 A330L로부터 선택될 수 있음)를 가져, 상기 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC의 기능 중 하나 이상을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 및 향상된 CDC를 갖는다. 한 구체예에서, IgG1 CH2 도메인은 돌연변이 S239D 및 I332E를 갖는다.
본 발명의 한 대안적 구체예에서, 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하고, 변경된 당화 프로파일을 갖는 항원 결합 단백질이 제공된다. 한 상기 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG3으로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인 및 IgG1으로부터의 하나의 CH2 도메인을 포함하고, 푸코스 대 만노스의 비가 0.8:3 또는 그 미만이 되도록 하는 변경된 당화 프로파일을 가지며, 예를 들어, 상기 항원 결합 단백질은 탈푸코실화(defucosylation)되어 상기 항원 결합 단백질은 상기 돌연변이 및 변경된 당화 프로파일이 결핍된 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 갖는 동등한 항원 결합 단백질과 비교하여 향상된 효과기 기능을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC의 기능 중 하나 이상을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 및 향상된 CDC를 갖는다.
한 대안적 구체예에서, 항원 결합 단백질은 적어도 하나의 IgG3 CH2 도메인 및 IgG1으로부터의 적어도 하나의 중쇄 불변 도메인을 갖고, 둘 모두의 IgG CH2 도메인은 본원에 기재된 제한에 따라 돌연변이된다.
본 발명의 한 양태에서, a) 본원에 기재된 바와 같은 분리된 핵산을 함유하는 발현 벡터를 함유하는 재조합 숙주 세포를 배양하는 단계로서, 상기 발현 벡터가 IgG1 및 IgG3 Fc 도메인 아미노산 잔기 둘 모두를 갖는 키메라 Fc 도메인을 엔코딩하는 Fc 핵산 서열을 추가로 포함하고, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제를 엔코딩하는 FUT8 유전자가 재조합 숙주 세포에서 비활성화되는 단계; 및 b) 항원 결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본원에 기재된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질을 생성시키는 방법이 제공된다.
항원 결합 단백질의 생성을 위한 상기 방법은, 예를 들어, 키메라 Fc 도메인이 결핍되어 있고 올리고당류 상에 푸코스를 갖는 달리 동일한 모노클로날 항체에 비해 증가되는 ADCC 및 CDC 향상된 활성 둘 모두를 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키는, POTELLIGENT™ 및 COMPLEGENT™ technology systems을 조합시킨 BioWa, Inc.(Princeton, NJ)으로부터 이용가능한 ACCRETAMAB™ technology system을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 돌연변이된 중쇄 불변 영역 및 키메라 중쇄 불변 영역을 포함하는 항원 결합 단백질이 제공되며, 상기 항원 결합 단백질은 변경된 당화 프로파일을 가져 상기 항원 결합 단백질은 향상된 효과기 기능을 갖고, 예를 들어, 이는 향상된 ADCC 또는 향상된 CDC의 기능 중 하나 이상을 갖는다. 한 구체예에서, 돌연변이는 위치 239 및 332 및 330으로부터 선택되고, 예를 들어, 돌연변이는 S239D 및 I332E 및 A330L로부터 선택된다. 한 추가 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 IgG3으로부터의 적어도 하나의 CH2 도메인 및 IgG1으로부터의 하나의 Ch2 도메인을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 푸코스 대 만노스의 비가 0.8:3 또는 그 미만이 되도록 하는 변경된 당화 프로파일을 갖고, 예를 들어, 항원 결합 단백질은 탈푸코실화되어, 상기 항원 결합 단백질은 동등한 비-키메라 항원 결합 단백질 또는 상기 돌연변이 및 변경된 당화 프로파일이 결핍된 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 비해 향상된 효과기 기능을 갖는다.
본 발명의 항원 결합 단백질을 변형시키는 또 다른 수단은 면역글로불린 불변 도메인 또는 FcRn(Fc 수용체 신생아) 결합 도메인의 변형에 의해 상기 단백질의 생체내 반감기를 증가시키는 것을 포함한다.
성체 포유동물에서, 신생아 Fc 수용체로도 공지된 FcRn은 IgG 아이소형의 항체에 결합하고, 분해로부터 이를 지키는 보호 수용체로 작용함으로써 혈청 항체 수준을 유지시키는데 중요한 역할을 한다. IgG 분자는 내피세포에 의해 세포내이입되고, 이들이 FcRn에 결합하는 경우, 순환으로 재순환된다. 대조적으로, FcRn에 결합하지 않는 IgG 분자는 세포에 진입하고, 리소좀 경로로 표적화되고, 여기서 이들은 분해된다.
신생아 FcRn 수용체는 항체 청소 및 조직을 통한 세포질통과(transcytosis) 둘 모두와 관련된 것으로 생각된다(Junghans R.P (1997) Immunol. Res 16. 29-57 and Ghetie et al (2000) Annu.Rev.lmmunol. 18, 739-766 참조). 인간 FcRn과 직접적으로 상호작용하는 것으로 결정된 인간 IgG1 잔기는 Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 및 His435를 포함한다. 본 단락에 기재된 상기 위치 중 임의의 위치에서의 교환은 본 발명의 항원 결합 단백질의 증가된 혈청 반감기 및/또는 변경된 효과기 특성을 가능케 할 수 있다.
본 발명의 항원 결합 단백질은 FcRn에 대한 불변 도메인 또는 이의 단편의 친화성을 증가시키는 아미노산 변형을 가질 수 있다. 치료 및 진단 IgG 및 다른 생활성 분자의 반감기를 증가시키는 것은 상기 분자 투여의 양 및/또는 빈도의 감소를 포함하는 많은 이점을 갖는다. 한 구체예에서, 따라서, 본원에 제공된 본 발명에 따른 항원 결합 단백질 또는 상기 아미노산 변형 중 하나 이상을 갖는 IgG 불변 도메인의 전부 또는 일부(FcRn 결합 부분)를 포함하는 융합 단백질, 및 상기 변형된 IgG 불변 도메인에 컨쥬게이션된 비-IgG 단백질 또는 비-단백질 분자가 제공되며, 변형된 IgG 불변 도메인의 존재는 항원 결합 단백질의 생체내 반감기를 증가시킨다.
PCT 출원 번호 WO 00/42072호에는 변경된 FcRn 결합 친화성을 갖는 변이체 Fc 영역을 포함하는 폴리펩티드가 개시되어 있으며, 상기 폴리펩티드는 Fc 영역의 아미노산 위치 238, 252, 253, 254, 255, 256, 265, 272, 286, 288, 303, 305, 307, 309, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 386, 388, 400, 413, 415, 424, 433, 434, 435, 436, 439, 및 447 중 어느 하나 이상에서 아미노산 변형을 포함하고, Fc 영역 내의 잔기의 넘버링은 EU 지표의 넘버링이다(Kabat et al).
PCT 공개 번호 WO 02/060919 A2호에는 야생형 IgG 불변 도메인에 비해 하나 이상의 아미노산 변형을 포함하는 IgG 불변 도메인을 포함하는 변형된 IgG가 개시되어 있으며, 상기 변형된 IgG는 야생형 IgG 불변 도메인을 갖는 IgG의 반감기에 비해 증가된 반감기를 갖고, 상기 하나 이상의 아미노산 변형은 위치 251, 253, 255, 285-290, 308-314, 385-389, 및 428-435 중 하나 이상에 존재한다.
문헌[Shields et al. (2001, J Biol Chem; 276:6591-604)]에서는 인간 IgG1 항체의 Fc 영역 내의 잔기를 변경시킨 후, 인간 FcRn에 대한 결합을 평가하는 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 이용하였다. 알라닌으로 변경되는 경우 FcRn에 대한 결합을 효과적으로 폐기시키는 위치는 I253, S254, H435, 및 Y436을 포함한다. E233-G236, R255, K288, L309, S415, 및 H433과 같은 다른 위치는 결합에서 덜 현저한 감소를 나타내었다. 여러 아미노산 위치는 알라닌으로 변경된 경우 FcRn 결합에서 개선을 나타내었고, 특히 이들은 P238, T256, E272, V305, T307, Q311, D312, K317, D376, E380, E382, S424, 및 N434이다. 많은 다른 아미노산 위치는 FcRn 결합에서 약간의 개선(D265, N286, V303, K360, Q362, 및 A378)을 나타내거나, 변화를 나타내지 않았다(S239, K246, K248, D249, M252, E258, T260, S267, H268, S269, D270, K274, N276, Y278, D280, V282, E283, H285, T289, K290, R292, E293, E294, Q295, Y296, N297, S298, R301, N315, E318, K320, K322, S324, K326, A327, P329, P331, E333, K334, T335, S337, K338, K340, Q342, R344, E345, Q345, Q347, R356, M358, T359, K360, N361, Y373, S375, S383, N384, Q386, E388, N389, N390, K392, L398, S400, D401, K414, R416, Q418, Q419, N421, V422, E430, T437, K439, S440, S442, S444, 및 K447).
가장 현저한 효과는 조합 변이체가 FcRn에 대한 개선된 결합을 갖는 것을 발견하였다. pH 6.0에서, E380A/N434A 변이체는 자연 IgG1에 비해 FcRn에 대해 8배를 초과하는 결합을 나타내었고, E380A에 대해서는 2배 및 N434A에 대해서는 3.5배였다. 상기에 T307A를 추가하는 것은 자연 IgG1에 비해 결합에 있어서 12배 개선을 초래하였다. 한 구체예에서, 본 발명의 항원 결합 단백질은 E380A/N434A 돌연변이를 포함하며, FcRn에 대한 증가된 결합을 갖는다.
문헌[Dall'Acqua et al. (2002, J Immunol. ;169:5171-80)]에는 마우스 FcRn에 대한 인간 IgG1 힌지-Fc 단편 파지 디스플레이 라이브러리의 무작위 돌연변이유발 및 스크리닝이 기재되어 있다. 여기에는 위치 251, 252, 254-256, 308, 309, 311, 312, 314, 385-387, 389, 428, 433, 434, 및 436의 무작위 돌연변이유발이 개시되어 있다. IgG1-인간 FcRn 복합체 안정성에서의 주요 개선은 Fc-FcRn 접촉면 전체에 걸친 밴드 내에 위치된 잔기 치환(M252, S254, T256, H433, N434, 및 Y436), 및 V308, L309, Q311, G385, Q386, P387, 및 N389와 같이 주변의 잔기의 더 적은 정도의 치환에서 발생한다. 인간 FcRn에 대해 가장 높은 친화성을 갖는 변이체는 M252Y/S254T/T256E 및 H433K/N434F/Y436H 돌연변이를 조합시킴으로써 수득되었고, 이는 야생형 IgG1에 비해 친화성에서 57배 증가를 나타내었다. 상기 돌연변이된 인간 IgG1의 생체내 작용은 야생형 IgG1에 비해 시노몰구스 원숭이에서 혈청 반감기에서 거의 4배 증가를 나타내었다.
따라서, 본 발명은 FcRn에 대한 최적화된 결합을 갖는 항원 결합 단백질의 변이체를 제공한다. 한 바람직한 구체예에서, 항원 결합 단백질의 상기 변이체는 상기 항원 결합 단백질의 Fc 영역 내에 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하며, 상기 변형은 상기 모 폴리펩티드에 비해 Fc 영역의 226, 227, 228, 230, 231, 233, 234, 239, 241, 243, 246, 250, 252, 256, 259, 264, 265, 267, 269, 270, 276, 284, 285, 288, 289, 290, 291, 292, 294, 297, 298, 299, 301, 302, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 315, 317, 320, 322, 325, 327, 330, 332, 334, 335, 338, 340, 342, 343, 345, 347, 350, 352, 354, 355, 356, 359, 360, 361, 362, 369, 370, 371, 375, 378, 380, 382, 384, 385, 386, 387, 389, 390, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 403, 404, 408, 411, 412, 414, 415, 416, 418, 419, 420, 421, 422, 424, 426, 428, 433, 434, 438, 439, 440, 443, 444, 445, 446 및 447로 구성되는 군으로부터 선택되고, Fc 영역 내의 아미노산의 넘버링은 케이뱃 내의 EU 지표의 넘버링이다.
본 발명의 한 추가 양태에서, 변형은 M252Y/S254T/T256E이다.
추가로, 다양한 간행물에는 분자에 FcRn-결합 폴리펩티드를 도입(WO 97/43316; U.S. Patent N° 5,869,046; U.S. Patent N° 5,747,035; WO 96/32478; WO 91/14438)시키거나, FcRn-결합 친화성이 보존되나, 분자와 다른 Fc 수용체에 대한 친화성이 크게 감소된 항체를 융합(WO 99/43713)시키거나, 항체의 FcRn 결합 도메인과 융합(WO 00/09560; U.S. Patent N° 4,703,039)시킴에 의해 반감기가 변형된 생리학적 활성 분자를 수득하는 방법이 기재되어 있다.
추가로, 감소된 생물학적 반감기를 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키는 방법이 또한 제공된다. His435가 알라닌으로 돌연변이된 변이체 IgG는 FcRn 결합의 선택적 손실, 및 현저히 감소된 혈청 반감기를 발생시킨다(Firan et al. 2001, International immunology 13:993). 미국 특허 번호 6,165,745호에는 항원 결합 단백질을 엔코딩하는 DNA 세그먼트에 돌연변이를 도입시킴으로써 감소된 생물학적 반감기를 갖는 항원 결합 단백질을 생성시키는 방법이 개시되어 있다. 돌연변이는 Fc-힌지 도메인의 위치 253, 310, 311, 433, 또는 434에서 아미노산 치환을 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 도메인 항체(dAb)인 에피토프-결합 도메인을 포함하고, 예를 들어, 이러한 에피토프-결합 도메인은 인간 VH 또는 인간 VL, 또는 카멜리드 VHH(나노바디(nanobody)) 또는 상어 dAb(NARV)일 수 있다.
한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 자연 리간드가 아닌 리간드에 대한 결합을 획득하기 위해 단백질 조작에 적용된 CTLA-4(에비바디); 리포칼린; 단백질 A 유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(아피바디, SpA), A-도메인(아비머/맥시바디); 열 충격 단백질, 예를 들어, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(트랜스-바디); 앙키린 반복 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머; C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아필린); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 톡신쿠니츠 유형 도메인; 및 피브로넥틴(애드넥틴)으로 구성되는 군으로부터 선택된 스캐폴드의 유도체인 에피토프-결합 도메인을 포함한다.
본 발명의 항원-결합 단백질은 애드넥틴인 에피토프 결합 도메인에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 중쇄의 c-말단에 부착된 애드넥틴을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는 애드넥틴에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 중쇄의 n-말단에 부착된 애드넥틴을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는 애드넥틴에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 경쇄의 c-말단에 부착된 애드넥틴을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는 애드넥틴에 부착된 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 경쇄의 n-말단에 부착된 애드넥틴을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 이는 단백질 스캐폴드, 예를 들어, CTLA-4인 에피토프 결합 도메인에 부착된 IgG 스캐폴드, 예를 들어, 중쇄의 n-말단에 부착된 CTLA-4를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 중쇄의 c-말단에 부착된 CTLA-4를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 경쇄의 n-말단에 부착된 CTLA-4를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는 경쇄의 c-말단에 부착된 CTLA-4를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 이는 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 리포칼린인 에피토프 결합 도메인에 부착된 IgG 스캐폴드, 예를 들어, 중쇄의 n-말단에 부착된 리포칼린을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 중쇄의 c-말단에 부착된 리포칼린을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 경쇄의 n-말단에 부착된 리포칼린을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는 경쇄의 c-말단에 부착된 리포칼린을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 이는 단백질 스캐폴드, 예를 들어, SpA인 에피토프 결합 도메인에 부착된 IgG 스캐폴드, 예를 들어, 중쇄의 n-말단에 부착된 SpA를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 중쇄의 c-말단에 부착된 SpA를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 경쇄의 n-말단에 부착된 SpA를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는 경쇄의 c-말단에 부착된 SpA를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 이는 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 아피바디인 에피토프 결합 도메인에 부착된 IgG 스캐폴드, 예를 들어, 중쇄의 n-말단에 부착된 아피바디를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 중쇄의 c-말단에 부착된 아피바디를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 경쇄의 n-말단에 부착된 아피바디를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는 경쇄의 c-말단에 부착된 아피바디를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 이는 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 아피머(affimer)인 에피토프 결합 도메인에 부착된 IgG 스캐폴드, 예를 들어, 중쇄의 n-말단에 부착된 아피머를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 중쇄의 c-말단에 부착된 아피머를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 경쇄의 n-말단에 부착된 아피머를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는 경쇄의 c-말단에 부착된 아피머를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 이는 단백질 스캐폴드, 예를 들어, GroEI인 에피토프 결합 도메인에 부착된 IgG 스캐폴드, 예를 들어, 중쇄의 n-말단에 부착된 GroEI를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 중쇄의 c-말단에 부착된 GroEI를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 경쇄의 n-말단에 부착된 GroEI를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는 경쇄의 c-말단에 부착된 GroEI를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 이는 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 트랜스페린인 에피토프 결합 도메인에 부착된 IgG 스캐폴드, 예를 들어, 중쇄의 n-말단에 부착된 트랜스페린을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 중쇄의 c-말단에 부착된 트랜스페린을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 경쇄의 n-말단에 부착된 트랜스페린을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는 경쇄의 c-말단에 부착된 트랜스페린을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 이는 단백질 스캐폴드, 예를 들어, GroES인 에피토프 결합 도메인에 부착된 IgG 스캐폴드, 예를 들어, 중쇄의 n-말단에 부착된 GroES를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 중쇄의 c-말단에 부착된 GroES를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 경쇄의 n-말단에 부착된 GroES를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는 경쇄의 c-말단에 부착된 GroES를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 이는 단백질 스캐폴드, 예를 들어, DARPin인 에피토프 결합 도메인에 부착된 IgG 스캐폴드, 예를 들어, 중쇄의 n-말단에 부착된 DARPin을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 중쇄의 c-말단에 부착된 DARPin을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 경쇄의 n-말단에 부착된 DARPin을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는 경쇄의 c-말단에 부착된 DARPin을 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 이는 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 펩티드 앱타머인 에피토프 결합 도메인에 부착된 IgG 스캐폴드, 예를 들어, 중쇄의 n-말단에 부착된 펩티드 앱타머를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 중쇄의 c-말단에 부착된 펩티드 앱타머를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는, 예를 들어, 경쇄의 n-말단에 부착된 펩티드 앱타머를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있거나, 이는 경쇄의 c-말단에 부착된 펩티드 앱타머를 갖는 IgG 스캐폴드를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 4개의 에피토프 결합 도메인, 예를 들어, 4개의 도메인 항체가 존재하며, 에피토프 결합 도메인 중 2개는 동일 항원에 대한 특이성을 가질 수 있거나, 항원-결합 단백질에 존재하는 에피토프 결합 도메인 모두는 동일 항원에 대한 특이성을 가질 수 있다.
본 발명의 쌍을 이룬 VH/VL 도메인, 항체, 및 단백질 스캐폴드는 링커의 사용에 의해 에피토프-결합 도메인에 연결될 수 있다. 적합한 링커의 예는 1개의 아미노산 내지 150개의 아미노산 길이, 또는 1개의 아미노산 내지 140개의 아미노산, 예를 들어, 1개의 아미노산 내지 130개의 아미노산, 또는 1 내지 120개의 아미노산, 또는 1 내지 80개의 아미노산, 또는 1 내지 50개의 아미노산, 또는 1 내지 20개의 아미노산, 또는 1 내지 10개의 아미노산, 또는 5 내지 18개의 아미노산일 수 있는 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 서열은 이들 자체의 3차 구조를 가질 수 있고, 예를 들어, 본 발명의 링커는 단일 가변 도메인을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 링커의 크기는 단일 가변 도메인과 동등하다. 적합한 링커는 1 내지 20 옹스트롬, 예를 들어, 15 옹스트롬 미만, 또는 10 옹스트롬 미만, 또는 5 옹스트롬 미만의 크기일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인 중 적어도 하나는 1 내지 150개의 아미노산, 예를 들어, 1 내지 20개의 아미노산, 예를 들어, 1 내지 10개의 아미노산을 포함하는 링커를 갖는 Ig 스캐폴드에 직접 부착된다. 이러한 링커는 링커 "GS"일 수 있거나, SEQ ID NO:163-170, 195 또는 196에 기재된 링커, 또는 이러한 링커의 배수 중 어느 하나로부터 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 항원-결합 단백질에서 사용하는 링커는 단독을 포함할 수 있거나, 다른 링커, GS 잔기의 하나 이상의 세트, 예를 들어, 'GSTVAAPS' 또는 'TVAAPSGS' 또는 'GSTVAAPSGS'에 더하여 포함할 수 있다. 한 구체예에서, 링커는 SEQ ID NO:163을 포함한다.
한 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(PAS)n(GS)m'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(GGGGS)n(GS)m'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(TVAAPS)n(GS)m'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(GS)m(TVAAPSGS)n'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(PAVPPP)n(GS)m'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(TVSDVP)n(GS)m'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 '(TGLDSP)n(GS)m'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 모든 상기 구체예에서, n = 1-10, 및 m = 0-4이다.
상기 링커의 예는 (PAS)n(GS)m(여기서, n=1 및 m=1), (PAS)n(GS)m(여기서, n=2 및 m=1), (PAS)n(GS)m(여기서, n=3 및 m=1), (PAS)n(GS)m(여기서, n=4 및 m=1), (PAS)n(GS)m(여기서, n=2 및 m=0), (PAS)n(GS)m(여기서, n=3 및 m=0), (PAS)n(GS)m(여기서, n=4 및 m=0)을 포함한다.
이러한 링커의 예는 (GGGGS)n(GS)m(여기서, n=1 및 m=1), (GGGGS)n(GS)m(여기서, n=2 및 m=1), (GGGGS)n(GS)m(여기서, n=3 및 m=1), (GGGGS)n(GS)m(여기서, n=4 및 m=1), (GGGGS)n(GS)m(여기서, n=2 및 m=0), (GGGGS)n(GS)m(여기서, n=3 및 m=0), (GGGGS)n(GS)m(여기서, n=4 및 m=0)을 포함한다.
이러한 링커의 예는 (TVAAPS)n(GS)m(여기서, n=1 및 m=1)(SEQ ID NO:163), (TVAAPS)n(GS)m(여기서, n=2 및 m=1), (TVAAPS)n(GS)m(여기서, n=3 및 m=1), (TVAAPS)n(GS)m(여기서, n=4 및 m=1), (TVAAPS)n(GS)m(여기서, n=1 및 m=0)(SEQ ID NO:164), (TVAAPS)n(GS)m(여기서, n=2 및 m=0), (TVAAPS)n(GS)m(여기서, n=3 및 m=0)(SEQ ID NO:166), (TVAAPS)n(GS)m(여기서, n=4 및 m=0)을 포함한다.
이러한 링커의 예는 (GS)m(TVAAPSGS)n(여기서, n=1 및 m=1), (GS)m(TVAAPSGS)n(여기서, n=2 및 m=1), (GS)m(TVAAPSGS)n(여기서, n=3 및 m=1), 또는 (GS)m(TVAAPSGS)n(여기서, n=4 및 m=1), (GS)m(TVAAPSGS)n(여기서, n=5 및 m=1), (GS)m(TVAAPSGS)n(여기서, n=6 및 m=1), (GS)m(TVAAPSGS)n(여기서, n=1 및 m=0), (GS)m(TVAAPSGS)n(여기서, n=2 및 m=10), (GS)m(TVAAPSGS)n(여기서, n=3 및 m=0), (GS)m(TVAAPSGS)n(여기서, n=3 및 m=1)(SEQ ID NO:165), 또는 (GS)m(TVAAPSGS)n(여기서, n=0)을 포함한다.
이러한 링커의 예는 (PAVPPP)n(GS)m(여기서, n=1 및 m=1), (PAVPPP)n(GS)m(여기서, n=2 및 m=1), (PAVPPP)n(GS)m(여기서, n=3 및 m=1), (PAVPPP)n(GS)m(여기서, n=4 및 m=1), (PAVPPP)n(GS)m(여기서, n=2 및 m=0), (PAVPPP)n(GS)m(여기서, n=3 및 m=0), (PAVPPP)n(GS)m(여기서, n=4 및 m=0)을 포함한다.
이러한 링커의 예는 (TVSDVP)n(GS)m(여기서, n=1 및 m=1), (TVSDVP)n(GS)m(여기서, n=2 및 m=1), (TVSDVP)n(GS)m(여기서, n=3 및 m=1), (TVSDVP)n(GS)m(여기서, n=4 및 m=1), (TVSDVP)n(GS)m(여기서, n=2 및 m=0), (TVSDVP)n(GS)m(여기서, n=3 및 m=0), (TVSDVP)n(GS)m(여기서, n=4 및 m=0)을 포함한다.
이러한 링커의 예는 (TGLDSP)n(GS)m(여기서, n=1 및 m=1)(SEQ ID NO:57), (TGLDSP)n(GS)m(여기서, n=2 및 m=1), (TGLDSP)n(GS)m(여기서, n=3 및 m=1), (TGLDSP)n(GS)m(여기서, n=4 및 m=1), (TGLDSP)n(GS)m(여기서, n=2 및 m=0), (TGLDSP)n(GS)m(여기서, n=3 및 m=0)(SEQ ID NO:195), (TGLDSP)n(GS)m(여기서, n=4 및 m=0)(SEQ ID NO:196)을 포함한다.
또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인과 Ig 스캐폴드 사이에 링커가 존재하지 않는다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 'TVAAPS'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 'TVAAPSGS'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 'GS'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다. 또 다른 구체예에서, 에피토프 결합 도메인은 링커 'ASTKGPT'에 의해 Ig 스캐폴드에 연결된다.
링커, 예를 들어, SEQ ID NO:167, SEQ ID NO:168, SEQ ID NO:169, SEQ ID NO:170, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189 또는 SEQ ID NO:190에 기재된 링커는 인간 혈청 알부민으로부터 유래될 수 있다. 링커는 일부 추가 잔기를 추가로 포함할 수 있고, 예를 들어, 이들은 추가 글리신 및 세린 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 추가 잔기는 알부민-유래 서열의 시작부 또는 말단부에 존재할 수 있거나, 알부민-유래 서열 내에 존재할 수 있다. 이러한 링커의 예는 SEQ ID NO:167 및 SEQ ID NO:169에 기재된 것을 포함한다.
한 구체예에서, 본 발명의 항원-결합 단백질은 인간 혈청 알부민에 결합할 수 있는 적어도 하나의 항원-결합 부위, 예를 들어, 적어도 하나의 에피토프 결합 도메인을 포함한다.
한 구체예에서, 적어도 3개의 항원-결합 부위가 존재하고, 예를 들어, 4, 또는 5 또는 6 또는 8 또는 10개의 항원-결합 부위가 존재하고, 항원-결합 단백질은 적어도 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 8 또는 10개의 항원에 결합할 수 있고, 예를 들어, 이는 3 또는 4 또는 5 또는 6 또는 8 또는 10개의 항원에 동시에 결합할 수 있다.
본 발명은 또한 의약에서 사용하기 위한, 예를 들어, 혈관형성을 필요로 하거나 HGF(HGF/Met 신호전달) 및/또는 VEGF의 상승된 수준과 관련된 것으로 생각되는 고형 종양을 치료하기 위한 약물의 제조에서 사용하기 위한 항원-결합 단백질을 제공한다. 이러한 종양은 결장암, 유방암, 난소암, 폐암(소세포 또는 비소세포), 전립선암, 췌장암, 신장암, 간암, 위암, 두경부암, 흑색종, 육종을 포함한다. 또한, 신경아교종(뇌실막세포종을 포함함), 수막종, 올리고덴드로마(oligodendroma), 별아교세포종(저등급, 역형성 및 다형성아교모세포종), 속질모세포종, 신경절종, 슈반세포종 및 척삭종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 원발성 및 속발성(전이성) 뇌종양이 포함된다. 본 발명의 항원 결합 단백질을 이용한 치료에 적합한 요망되지 않는 혈관형성과 관련된 다른 질병은 연령-관련 황반 변성, 당뇨망막병증, RA 및 건선을 포함한다.
본 발명은 치료량의 본 발명의 항원-결합 단백질을 투여하는 것을 포함하는, 고형 종양(결장암, 유방암, 난소암, 폐암(소세포 또는 비소세포), 전립선암, 췌장암, 신장암, 간암, 위암, 두경부암, 흑색종, 육종을 포함함), 원발성 및 속발성(전이성) 뇌종양, 비제한적인 예로, 신경아교종(뇌실막세포종을 포함함), 수막종, 올리고덴드로마, 별아교세포종(저등급, 역형성 및 다형성아교모세포종), 속질모세포종, 신경절종, 슈반세포종 및 척삭종, 연령-관련 황반 변성, 당뇨망막병증, RA 및 건선으로 고통받는 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 항원-결합 단백질은 고형 종양(결장암, 유방암, 난소암, 폐암(소세포 또는 비소세포), 전립선암, 췌장암, 신장암, 간암, 위암, 두경부암, 흑색종, 육종을 포함함), 원발성 및 속발성(전이성) 뇌종양, 비제한적인 예로, 신경아교종(뇌실막세포종을 포함함), 수막종, 올리고덴드로마, 별아교세포종(저등급, 역형성 및 다형성아교모세포종), 속질모세포종, 신경절종, 슈반세포종 및 척삭종, 연령-관련 황반 변성, 당뇨망막병증, RA 또는 건선 또는 HGF 및/또는 VEGF의 과생성과 관련된 임의의 다른 질병의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 단백질 스캐폴드는 항체의 모든 도메인을 포함하는 완전한 모노클로날 항체 스캐폴드를 포함하거나, 본 발명의 단백질 스캐폴드는 비-통상적인 항체 구조, 예를 들어, 1가 항체를 포함할 수 있다. 이러한 1가 항체는 쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있고, 상기 중쇄의 힌지 영역은 변형되어, WO2007/059782호에 기재된 1가 항체와 같이 중쇄는 동종이합체화되지 않는다. 다른 1가 항체는 기능성 가변 영역 및 CH1 영역이 결핍된 두번째 중쇄와 이합체화되는 쌍을 이룬 중쇄 및 경쇄를 포함할 수 있고, 여기서 첫번째 및 두번째 중쇄는 변형되어 이들은 동종이합체가 아닌 이종이합체를 형성하여, WO2006/015371호에 기재된 1가 항체와 같은 2개의 중쇄 및 1개의 경쇄를 갖는 1가 항체가 생성될 것이다. 이러한 1가 항체는 에피토프 결합 도메인이 연결될 수 있는 본 발명의 단백질 스캐폴드를 제공할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 에피토프-결합 도메인은 상이한 V 영역 또는 도메인과 독립적으로 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합하는 도메인이고, 이는 자연 리간드가 아닌 리간드에 대한 결합을 획득하기 위해 단백질 조작에 적용된 CTLA-4(에비바디); 리포칼린; 단백질 A 유래 분자, 예를 들어, 단백질 A의 Z-도메인(아피바디, SpA), A-도메인(아비머/맥시바디); 열 충격 단백질, 예를 들어, GroEI 및 GroES; 트랜스페린(트랜스-바디); 앙키린 반복 단백질(DARPin); 펩티드 앱타머; C-유형 렉틴 도메인(테트라넥틴); 인간 γ-크리스탈린 및 인간 유비퀴틴(아필린); PDZ 도메인; 인간 프로테아제 억제제의 전갈 톡신쿠니츠 유형 도메인; 및 피브로넥틴(애드넥틴)으로 구성되는 군으로부터 선택된 비-면역글로불린 스캐폴드의 유도체인 도메인 항체 또는 도메인일 수 있다. 한 구체예에서, 이는 도메인 항체 또는 다른 적합한 도메인, 예를 들어, CTLA-4, 리포칼린, SpA, 아피바디, 아비머, GroEI, 트랜스페린, GroES 및 피브로넥틴으로 구성되는 군으로부터 선택된 도메인일 수 있다. 한 구체예에서, 이는 면역글로불린 단일 가변 도메인, 아피바디, 앙키린 반복 단백질(DARPin) 및 애드넥틴으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이는 아피바디, 앙키린 반복 단백질(DARPin) 및 애드넥틴으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이는 도메인 항체, 예를 들어, 인간, 카멜리드 또는 상어(NARV) 도메인 항체로부터 선택된 도메인 항체일 수 있다.
에피토프-결합 도메인은 하나 이상의 위치에서 단백질 스캐폴드에 연결될 수 있다. 이들 위치는 단백질 스캐폴드의 C-말단 및 N-말단, 예를 들어, IgG의 중쇄의 C-말단 및/또는 경쇄의 C-말단, 또는 IgG의 중쇄의 N-말단 및/또는 경쇄의 N-말단을 포함한다.
한 구체예에서, 첫번째 에피토프 결합 도메인은 쌍을 이룬 VH/VL을 포함하는 단백질 스캐폴드에 연결되고, 두번째 에피토프 결합 도메인은 첫번째 에피토프 결합 도메인에 연결되고, 예를 들어, 단백질 스캐폴드가 IgG 스캐폴드인 경우, 첫번째 에피토프 결합 도메인은 IgG 스캐폴드의 중쇄의 c-말단에 연결될 수 있고, 이러한 에피토프 결합 도메인은 이의 C-말단에서 두번째 에피토프 결합 도메인에 연결되거나, 예를 들어, 첫번째 에피토프 결합 도메인은 IgG 스캐폴드의 경쇄의 C-말단에 연결될 수 있고, 이러한 첫번째 에피토프 결합 도메인은 이의 C-말단에서 두번째 에피토프 결합 도메인에 추가로 연결될 수 있거나, 예를 들어, 첫번째 에피토프 결합 도메인은 IgG 스캐폴드의 경쇄의 N-말단에 연결될 수 있고, 이러한 첫번째 에피토프 결합 도메인은 이의 N-말단에서 두번째 에피토프 결합 도메인에 추가로 연결될 수 있거나, 예를 들어, 첫번째 에피토프 결합 도메인은 IgG 스캐폴드의 중쇄의 N-말단에 연결될 수 있고, 이러한 첫번째 에피토프 결합 도메인은 이의 N-말단에서 두번째 에피토프 결합 도메인에 추가로 연결될 수 있다.
에피토프-결합 도메인이 도메인 항체인 경우, 일부 도메인 항체는 스캐폴드의 특정 위치에 적합화될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 도메인 항체는 통상적인 IgG의 중쇄 및/또는 경쇄의 C-말단 단부에서 연결될 수 있다. 또한, 일부 면역글로불린 단일 가변 도메인은 통상적인 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 모두의 C-말단 단부에 연결될 수 있다.
면역글로불린 단일 가변 도메인의 N-말단이 항체 불변 도메인(CH3 또는 CL)에 융합되는 작제물에서, 펩티드 링커는 면역글로불린 단일 가변 도메인이 항원에 결합하는 것을 도울 수 있다. 또한, dAb의 N-말단 단부는 항원-결합 활성과 관련된 상보성-결정 영역(CDRS)에 근접하여 위치된다. 따라서, 짧은 펩티드 링커가 에피토프-결합 도메인과 단백질 스캐폴드에 대한 불변 도메인 사이에서 스페이서로 작용하며, 이는 dAb CDR이 항원에 보다 용이하게 도달하도록 할 수 있어, 이에 따라 높은 친화성으로 결합할 수 있도록 한다.
면역글로불린 단일 가변 도메인이 IgG에 연결되는 환경은 이들이 융합되는 항체 사슬에 따라 상이할 것이다:
IgG 스캐폴드의 항체 경쇄의 C-말단 단부에서 융합되는 경우, 각각의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 항체 힌지 및 Fc 부분 부근에 위치되는 것이 예상된다. 상기 면역글로불린 단일 가변 도메인은 서로 멀리 떨어져 위치될 수 있다. 통상적인 항체에서, Fab 단편 사이의 각 및 각각의 Fab 단편과 Fc 부분 사이의 각은 매우 유의하게 다양할 수 있다. mAbdAb를 이용하여, Fab 단편 사이의 각은 크게 다양하지는 않을 것인 한편, 일부 각 제한이 각각의 Fab 단편과 Fc 부분 사이의 각에서 관찰될 수 있다.
IgG 스캐폴드의 항체 중쇄의 C-말단 단부에서 융합되는 경우, 각각의 면역글로불린 단일 가변 도메인은 Fc 부분의 CH3 도메인 부근에 위치되는 것이 예상된다. 이는 Fc 수용체(예를 들어, FcγRI, II, III FcRn)에 대한 Fc 결합 특성에 영향을 미칠 것으로 예상되지 않는데, 이는 상기 수용체가 CH2 도메인(수용체의 FcγRI, II 및 III 부류에 대함) 또는 CH2와 CH3 도메인 사이의 힌지(예를 들어, FcRn 수용체)와 연동되기 때문이다. 상기 항원-결합 단백질의 또 다른 특징은 둘 모두의 면역글로불린 단일 가변 도메인이 서로 공간적으로 가깝게 존재하는 것이 예상된다는 점이며, 적절한 링커의 제공에 의해 유연성이 제공되는 경우, 이들 면역글로불린 단일 가변 도메인은 동종이합체 종을 형성할 수 있어, 이에 따라 Fc 부분의 '지퍼가 채워진(zipped)' 4차 구조를 증대시켜, 작제물의 안정성을 향상시킬 수 있다.
이러한 구조적 고려는 에피토프-결합 도메인, 예를 들어, dAb를 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 항체 상에 연결시키기 위한 가장 적합한 위치의 선택을 도울 수 있다.
항원의 크기, 이의 국소화(혈액 내 또는 세포 표면 상), 이의 4차 구조(단량체 또는 다합체)는 다양할 수 있다. 통상적인 항체는 힌지 영역의 존재로 인해 앱타머 작제물로 작용하도록 자연 설계되며, Fab 단편의 첨단에서의 2개의 항원-결합 부위의 배향은 매우 다양할 수 있고, 이에 따라 항원 및 이의 주위의 분자 특징에 적합화될 수 있다. 대조적으로, 항체 또는 다른 단백질 스캐폴드, 예를 들어, 힌지 영역을 갖지 않는 항체를 포함하는 단백질 스캐폴드에 연결된 면역글로불린 단일 가변 도메인은 직접적 또는 간접적으로 덜 구조적인 유연성을 가질 수 있다.
용해 상태 및 면역글로불린 단일 가변 도메인에서의 결합의 방식을 이해하는 것이 또한 도움이 된다. 시험관내 dAb가 주로 용해 상태로 단량체, 동종이합체 또는 다합체 형태로 존재할 수 있는 증거가 축적되었다(Reiter et al. (1999) J Mol Biol 290 p685-698; Ewert et al (2003) J Mol Biol 325, p531-553, Jespers et al (2004) J Mol Biol 337 p893-903; Jespers et al (2004) Nat Biotechnol 22 p1161-1165; Martin et al (1997) Protein Eng. 10 p607-614; Sepulvada et al (2003) J Mol Biol 333 p355-365). 이는 벤스-존스 단백질(Bence-Jones protein)(면역글로불린 경쇄의 이합체)(Epp et al (1975) Biochemistry 14 p4943-4952; Huan et al (1994) Biochemistry 33 p14848-14857; Huang et al (1997) Mol immunol 34 pl291-1301) 및 아밀로이드 섬유(James et al . (2007) J Mol Biol . 367:603-8)와 같은 Ig 도메인을 이용하여 생체내에서 관찰되는 다합체화 사건을 매우 생각나게 한다.
예를 들어, 경쇄의 C-말단 단부에 우선하여 Fc 부분의 C-말단 단부에 용해 상태로 이합체화되는 경향이 있는 dab를 연결시키는 것이 요망될 수 있는데, 이는 Fc의 C-말단 단부에 연결시키는 것이 상기 dAb가 본 발명의 항원-결합 단백질의 상황에서 이합체화되는 것을 가능케 하기 때문이다.
본 발명의 항원-결합 단백질은 단일 항원에 특이적인 항원-결합 부위를 포함할 수 있거나, 2개 이상의 항원, 또는 단일 항원 상의 2개 이상의 에피토프에 특이적인 항원-결합 부위를 가질 수 있거나, 동일하거나 상이한 항원 상의 상이한 에피토프에 각각 특이적인 항원-결합 부위가 존재할 수 있다.
특히, 본 발명의 항원-결합 단백질은 HGF 및 VEGF와 관련된 질병, 예를 들어, 혈관형성을 필요로 하는 것으로 생각되거나 HGF(HGF/Met 신호전달) 및/또는 VEGF의 상승된 수준과 관련된 고형 종양을 치료하는데 유용할 수 있다. 이러한 종양은 결장암, 유방암, 난소암, 폐암(소세포 또는 비소세포), 전립선암, 췌장암, 신장암, 간암, 위암, 두경부암, 흑색종, 육종을 포함한다. 또한, 신경아교종(뇌실막세포종을 포함함), 수막종, 올리고덴드로마, 별아교세포종(저등급, 역형성 및 다형성아교모세포종), 속질모세포종, 신경절종, 슈반세포종 및 척삭종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 원발성 및 속발성(전이성) 뇌종양이 포함된다. 본 발명의 항원 결합 단백질을 이용한 치료에 적합한 요망되지 않는 혈관형성과 관련된 다른 질병은 연령-관련 황반 변성, 당뇨망막병증, RA 및 건선을 포함한다.
본 발명의 항원-결합 단백질은 본 발명의 항원-결합 단백질에 대한 코딩 서열을 포함하는 발현 벡터를 이용한 숙주 세포의 트랜스펙션에 의해 생성될 수 있다. 발현 벡터 또는 재조합 플라스미드는 상기 항원-결합 단백질에 대한 상기 코딩 서열을 숙주 세포에서의 복제 및 발현, 및/또는 숙주 세포로부터의 분비를 조절할 수 있는 통상적인 조절성 조절 서열과 작동가능하게 관련되도록 배치시킴으로써 생성된다. 조절성 서열은 프로모터 서열, 예를 들어, CMV 프로모터, 및 다른 공지된 항체로부터 유래될 수 있는 신호 서열을 포함한다. 유사하게, 상보적 항원-결합 단백질 경쇄 또는 중쇄를 엔코딩하는 DNA 서열을 갖는 두번째 발현 벡터가 생성될 수 있다. 특정 구체예에서, 상기 두번째 발현 벡터는 각각의 폴리펩티드 사슬이 기능적으로 발현되는 것을 보장하기 위해 코딩 서열 및 선택 마커가 관련된 것을 제외하고는 첫번째 발현 벡터와 동일하다. 대안적으로, 항원-결합 단백질에 대한 중쇄 및 경쇄 코딩 서열은 단일한 벡터 상, 예를 들어, 동일 벡터 내의 2개의 발현 카세트 내에 존재할 수 있다.
선택된 숙주 세포는 통상적인 기술에 의해 첫번째 및 두번째 벡터 둘 모두로 공동 트랜스펙션(또는 간단히 단일 벡터에 의해 트랜스펙션)되어, 재조합 또는 합성 경쇄 및 중쇄 둘 모두를 포함하는 본 발명의 트랜스펙션된 숙주 세포가 생성된다. 트랜스펙션된 세포는 이후 통상적인 기술에 의해 배양되어 본 발명의 조작된 항원-결합 단백질이 생성된다. 재조합 중쇄 및/또는 경쇄 둘 모두의 결합을 포함하는 항원-결합 단백질이 적절한 검정, 예를 들어, ELISA 또는 RIA에 의해 배양물로부터 스크리닝된다. 유사한 통상적 기술이 다른 항원 결합 단백질을 작제하기 위해 이용될 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물의 작제에서 사용되는 클로닝 및 서브클로닝 단계에 적합한 벡터는 당업자에 의해 선택될 수 있다. 예를 들어, 클로닝 벡터의 통상적인 pUC 시리즈가 이용될 수 있다. 한 벡터 pUC19는 Amersham(Buckinghamshire, United Kingdom) 또는 Pharmacia(Uppsala, Sweden)와 같은 공급처로부터 시판된다. 추가로, 용이하게 복제할 수 있는 임의의 벡터는 다수의 클로닝 부위 및 선택 유전자(예를 들어, 항생제 내성)를 가지며, 용이하게 조작되며, 클로닝에 대해 사용될 수 있다. 따라서, 클로닝 벡터의 선택은 본 발명에서 제한 요인이 아니다.
발현 벡터는 또한 이종성 DNA 서열, 예를 들어, 포유동물 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자(DHFR)의 발현을 증폭시키는데 적합한 유전자를 특징으로 할 수 있다. 다른 벡터 서열은 폴리 A 신호 서열, 예를 들어, 소 성장 호르몬(BGH)으로부터의 폴리 A 신호 서열 및 베타글로빈 프로모터 서열(betaglopro)을 포함한다. 본원에서 유용한 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지된 기술에 의해 합성될 수 있다.
상기 벡터의 구성요소, 예를 들어, 레플리콘, 선택 유전자, 인핸서, 프로모터, 신호서열 등은 시판 업체 또는 자연 공급원으로부터 수득될 수 있거나, 선택된 숙주에서 재조합 DNA의 생성물의 발현 및/또는 분비를 유도하는데 사용하기 위한 공지된 절차에 의해 합성될 수 있다. 다수의 유형이 포유동물, 박테리아, 곤충, 효모, 및 진균 발현을 위해 당 분야에 공지된 다른 적절한 발현 벡터가 또한 상기 목적을 위해 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 항원-결합 단백질의 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드로 트랜스펙션된 세포주를 포함한다. 상기 클로닝 벡터의 클로닝 및 다른 조작에 유용한 숙주 세포가 또한 통상적이다. 그러나, E. 콜라이(E. coli)의 다양한 균주로부터의 세포가 본 발명의 항원-결합 단백질의 작제에서 클로닝 벡터의 복제 및 다른 단계에 사용될 수 있다.
본 발명의 항원-결합 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포 또는 세포주는 포유동물 세포, 예를 들어, NS0, Sp2/0, CHO(예를 들어, DG44), COS, HEK, 섬유모세포 세포(예를 들어, 3T3), 및 골수종 세포를 포함하며, 예를 들어, 이는 CHO 또는 골수종 세포에서 발현될 수 있다. 인간 세포가 사용될 수 있고, 따라서 분자가 인간 당화 패턴으로 변형되는 것이 가능할 수 있다. 대안적으로, 다른 진핵생물 세포주가 이용될 수 있다. 적합한 포유동물 숙주세포의 선택, 및 형질전환, 배양, 증폭, 스크리닝 및 생성물 생성 및 정제를 위한 방법은 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 인용된 문헌[Sambrook et al.]을 참조하라.
박테리아 세포가 재조합 Fab의 발현 또는 본 발명의 다른 구체예에 적합한 숙주 세포로 유용한 것이 입증될 수 있다(예를 들어, Pluckthun, A., Immunol. Rev., 130:151-188 (1992) 참조). 그러나, 폴딩되지 않거나 부적절하게 폴딩된 형태 또는 당화되지 않은 형태로 박테리아 세포에서 발현되는 단백질의 경향으로 인해, 박테리아 세포에서 생성되는 임의의 재조합 Fab는 항원 결합 능력의 보유에 대해 스크리닝되어야 한다. 박테리아 세포에 의해 발현된 분자가 적절하게 폴딩된 형태로 생성된 경우, 박테리아 세포는 요망되는 숙주일 것이거나, 대안적 구체예에서, 분자는 박테리아 숙주에서 발현될 수 있고, 이후 재폴딩될 수 있다. 예를 들어, 발현에 사용되는 E. 콜리의 다양한 균주가 생물공학 분야에서 숙주 세포로 널리 공지되어 있다. B. 섭틸리스(B. subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 다른 바실러스 등의 다양한 균주가 또한 상기 방법에서 이용될 수 있다.
요망되는 경우, 당업자에게 공지된 효모 세포의 균주, 뿐만 아니라 곤충 세포, 예를 들어, 드로소필라(Drosophila) 및 레피돕테라(Lepidoptera) 및 바이러스 발현 시스템이 숙주 세포로서 또한 이용가능하다. 예를 들어, 문헌[Miller et al., Genetic Engineering, 8:277-298, Plenum Press (1986)] 및 이에 인용된 참고문헌을 참조하라.
벡터가 작제될 수 있는 일반적 방법, 본 발명의 숙주 세포를 생성시키는데 필요한 트랜스펙션 방법, 및 상기 숙주 세포로부터 본 발명의 항원-결합 단백질을 생성시키는데 필요한 배양 방법은 모두 통상적인 기술일 수 있다. 통상적으로, 본 발명의 배양 방법은 보통 현탁액 중에서 혈청액 비함유로 세포를 배양함에 의한 혈청 비함유 배양 방법이다. 마찬가지로, 생성된 후, 본 발명의 항원-결합 단백질은 암모늄 설페이트 침전, 친화성 컬럼, 컬럼 크로마토그래피, 겔 전기영동 등을 포함하는 당 분야의 표준 절차에 따라 세포 배양 내용물로부터 정제될 수 있다. 이러한 기술은 당 분야의 기술 범위 내이고, 본 발명을 제한하지 않는다. 예를 들어, 변경된 항체의 제조가 WO 99/58679호 및 WO 96/16990호에 기재되어 있다.
항원-결합 단백질의 또 다른 발현 방법은 미국 특허 번호 4,873,316호에 기재된 바와 같이 트랜스제닉 동물에서의 발현을 이용할 수 있다. 이는 포유동물로 트랜스제닉으로 통합되는 경우 암컷이 이의 모유에서 요망되는 재조합 단백질을 생성하는 것을 가능케 하는 동물 카세인 프로모터를 이용하는 발현 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 한 추가 양태에서, 본 발명의 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 엔코딩하는 벡터로 형질전환되거나 트랜스펙션된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 이에 의해 생성된 항체를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항체를 생성하는 방법이 제공된다.
본 발명에 따르면,
(a) 항원-결합 단백질의 중쇄를 엔코딩하는 첫번째 벡터를 제공하는 단계;
(b) 항원-결합 단백질의 경쇄를 엔코딩하는 두번째 벡터를 제공하는 단계;
(c) 상기 첫번째 및 두번째 벡터를 이용하여 포유동물 숙주 세포(예를 들어, CHO)를 형질전환시키는 단계;
(d) 상기 숙주 세포로부터 배양 배지로 항원-결합 단백질이 분비되도록 하는 조건하에서 단계 (c)의 숙주 세포를 배양하는 단계; 및
(e) 단계 (d)의 분비된 항원-결합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명의 항원-결합 단백질을 생성시키는 방법이 제공된다.
요망되는 방법에 의한 발현 후, 항원-결합 단백질은 적절한 검정의 사용에 의해 시험관내 활성에 대해 시험된다. 현재 통상적인 ELISA 검정 포맷이 표적에 대한 항원-결합 단백질의 정성적 및 정량적 결합을 평가하는데 이용된다. 추가로, 일반적인 청소 메커니즘에도 불구하고 신체 내의 항원-결합 단백질의 지속성을 평가하기 위해 수행되는 차후의 인간 임상 연구 전에 중화 효능을 확인하기 위해 다른 시험관내 검정이 또한 이용될 수 있다.
치료 용량 및 지속기간은 인간 순환에서 본 발명의 분자의 상대 지속기간에 관한 것이며, 이는 환자의 치료되는 조건 및 전반적 건강에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다. 연장된 기간(예를 들어, 4 내지 6개월)에 걸친 반복된 투여(예를 들어, 주 1회 또는 2주에 1회)가 최대 치료 효능을 달성하는데 필요할 수 있음이 예견된다.
본 발명의 치료제의 투여 방식은 숙주에게 작용제를 전달하는 임의의 적합한 경로일 수 있다. 본 발명의 항원 결합 단백질, 및 약학적 조성물은 비경구 투여, 즉, 피하(s.c), 수막강내, 복막내, 근내(i.m.) 또는 정맥내(i.v.), 또는 비내 투여에 특히 유용하다.
본 발명의 치료제는 약학적으로 허용되는 담체 중에 활성 성분으로서 유효량의 본 발명의 항원-결합 단백질을 함유하는 약학적 조성물로 제조될 수 있다. 본 발명의 예방적 작용제에서, 항원-결합 단백질을 함유하는 수성 현탁액 또는 수용액이 주사 준비 형태로 생리학적 pH에서 완충된다. 비경구 투여용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 예를 들어, 수성 담체에 용해된 본 발명의 항원-결합 단백질 또는 이의 칵테일의 용액을 통상적으로 포함할 것이다. 다양한 수성 담체, 예를 들어, 0.9% 염수, 0.3% 글리신 등이 이용될 수 있다. 이들 용액은 멸균 제조될 수 있고, 일반적으로 미립자 물질을 함유하지 않는다. 이들 용액은 통상적인 널리 공지된 멸균 기술(예를 들어, 여과)에 의해 멸균될 수 있다. 조성물은 생리학적 조건에 근접시키기 위해 필요한 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, pH 조정제 및 완충제 등을 함유할 수 있다. 상기 약학적 제형 내의 본 발명의 항원-결합 단백질의 농도는 약 0.5 중량% 미만, 보통 약 1 중량% 또는 그 이상 내지 약 15 중량% 또는 20 중량% 만큼 매우 다양할 수 있고, 이는 주로 선택된 특정 투여 방식에 따라 유체 부피, 점도 등을 기초로 하여 선택될 것이다.
따라서, 근내 주사용의 본 발명의 약학적 조성물은 약 1 mL의 멸균 완충수, 및 약 1 ng 내지 약 200 mg, 예를 들어, 약 50 ng 내지 약 30 mg, 또는 약 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항원-결합 단백질을 함유하도록 제조될 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입용의 본 발명의 약학적 조성물은 약 250 ml의 멸균 링거액, 및 링거액 ml 당 약 1 내지 약 30 또는 5 mg 내지 약 25 mg의 본 발명의 항원-결합 단백질을 함유하도록 제조될 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하는 실제 방법은 널리 공지되어 있거나, 당업자에게 명백할 것이며, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 더욱 상세히 기재되어 있다. 본 발명의 정맥내 투여가능한 항원-결합 단백질 제형의 제조를 위해, 전체 내용이 참조로서 본원에 포함되고, 독자가 특별히 참조하는 문헌[Lasmar U and Parkins D "The formulation of Biopharmaceutical products", Pharma. Sci.Tech. today, page 129-137, Vol.3 (3rd April 2000), Wang, W "Instability, stabilisation and formulation of liquid protein pharmaceuticals", Int. J. Pharm 185 (1999) 129-188, Stability of Protein Pharmaceuticals Part A and B ed Ahern T.J., Manning M.C., New York, NY: Plenum Press (1992), Akers,M.J. "Excipient-Drug interactions in Parenteral Formulations", J. Pharm Sci 91 (2002) 2283-2300, Imamura, K et al "Effects of types of sugar on stabilization of Protein in the dried state", J Pharm Sci 92 (2003) 266-274,Izutsu, Kkojima, S. "Excipient crystalinity and its protein-structure-stabilizing effect during freeze-drying", J Pharm. Pharmacol, 54 (2002) 1033-1039, Johnson, R, "Mannitol-sucrose mixtures-versatile formulations for protein lyophilization", J. Pharm. Sci, 91 (2002) 914-922. Ha,E Wang W, Wang Y.j. "Peroxide formation in polysorbate 80 and protein stability", J. Pharm Sci, 91, 2252-2264,(2002)]을 참조하라.
한 구체예에서, 약학적 제조물인 경우 본 발명의 치료제는 단위 용량 형태로 제공된다. 적절한 치료적 유효 용량은 당업자에 의해 용이하게 결정될 것이다. 적합한 용량은 환자의 체중에 따라 환자에 대해 계산될 수 있고, 예를 들어, 적합한 용량은 0.01 내지 20mg/kg, 예를 들어, 0.1 내지 20mg/kg, 예를 들어, 1 내지 20mg/kg, 예를 들어, 10 내지 20mg/kg 또는, 예를 들어, 1 내지 15mg/kg, 예를 들어, 10 내지 15mg/kg의 범위일 수 있다. 질환을 효과적으로 치료하기 위해, 인간에서 본 발명에서 사용되는 적합한 용량은 0.01 내지 1000 mg, 예를 들어, 0.1 내지 1000mg, 예를 들어, 0.1 내지 500mg, 예를 들어, 500mg, 예를 들어, 0.1 내지 100mg, 또는 0.1 내지 80mg, 또는 0.1 내지 60mg, 또는 0.1 내지 40mg, 또는, 예를 들어, 1 내지 100mg, 또는 1 내지 50mg의 본 발명의 항원-결합 단백질의 범위 내일 수 있으며, 이는 비경구, 예를 들어, 피하, 정맥내 또는 근내 투여될 수 있다. 이러한 용량은 필요시 의사에 의해 적절히 선택된 적절한 시간 간격으로 반복될 수 있다.
본원에 기재된 항원-결합 단백질은 저장을 위해 동결건조될 수 있고, 사용 전에 적절한 담체 중에서 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상적인 면역글로불린을 이용하여 효과적인 것으로 밝혀졌고, 당 분야에 공지된 동결건조 및 재구성 기술이 이용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 에피토프-결합 도메인을 찾아내기 위해 이용될 수 있는 여러 방법이 당 분야에 공지되어 있다.
용어 "라이브러리"는 이종성 폴리펩티드 또는 핵산의 혼합물을 나타낸다. 라이브러리는 각각이 단일한 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 갖는 일원들로 구성된다. 이렇게, "라이브러리"는 "레퍼토리"와 동의어이다. 라이브러리 일원 사이의 서열 차이가 라이브러리에 존재하는 다양성을 담당한다. 라이브러리는 폴리펩티드 또는 핵산의 간단한 혼합물의 형태를 취할 수 있거나, 핵산의 라이브러리로 형질전환된 유기체 또는 세포, 예를 들어, 박테리아, 바이러스, 동물 또는 식물 세포 등의 형태일 수 있다. 한 예에서, 각각의 개별적 유기체 또는 세포는 단지 하나 또는 제한된 수의 라이브러리 일원을 함유한다. 유리하게는, 핵산에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 발현을 가능케 하기 위해 핵산은 발현 벡터에 통합된다. 따라서, 한 양태에서, 라이브러리는 숙주 유기체의 집단의 형태를 취할 수 있고, 각각의 유기체는 해당 폴리펩티드 일원을 생성시키도록 발현될 수 있는 핵산 형태의 라이브러리의 단일한 일원을 함유하는 발현 벡터의 하나 이상의 카피를 함유한다. 따라서, 숙주 유기체의 집단은 다양한 폴리펩티드의 큰 레퍼토리를 엔코딩하는 잠재성을 갖는다.
"유니버셜 프레임워크"는 케이뱃(Kabat)("Sequences of Proteins of Immunological Interest", US Department of Health and Human Services)에 의해 정의된 바와 같은 서열 내에 보존된 항체의 영역에 해당하거나, 문헌[Chothia and Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196:910-917]에 정의된 바와 같은 인간 점라인 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 해당하는 단일 항체 프레임워크 서열이다. 과가변 영역 단독 내의 변화에도 불구하고 실질적인 임의의 결합 특이성의 유도를 허용하는 것으로 밝혀진 단일 프레임워크, 또는 이러한 프레임워크의 세트가 존재할 수 있다.
본원에 정의된 바와 같은 아미노산 및 누클레오티드 서열 정렬 및 상동성, 유사성 또는 동일성은 한 구체예에서 디폴트 파라미터를 이용하여 알고리즘 BLAST 2 Sequences를 이용하여 준비되고 결정된다(Tatusova, T.A. et al ., FEMS Microbiol Lett , 174:187-188 (1999)).
예를 들어, dAb 또는 다른 에피토프 결합 도메인의 선택에서 디스플레이 시스템(예를 들어, 핵산의 코딩 작용과 핵산에 의해 엔코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특징을 결부시키는 디스플레이 시스템)이 본원에 기재된 방법에서 사용되는 경우, 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 카피수를 증폭시키거나 증가시키는 것이 종종 유리하다. 이는 본원에 기재된 방법 또는 다른 적합한 방법을 이용하여 추가 라운드의 선택을 위해, 또는 추가 레퍼토리(예를 들어, 친화성 성숙 레퍼토리)를 제조하기 위해 충분한 양의 핵산 및/또는 펩티드 또는 폴리펩티드를 수득하는 효과적인 방식을 제공한다. 따라서, 일부 구체예에서, 에피토프 결합 도메인을 선택하는 방법은 디스플레이 시스템(예를 들어, 핵산의 코딩 작용과 핵산에 의해 엔코딩되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 기능적 특징을 결부시키는 디스플레이 시스템, 예를 들어, 파지 디스플레이)을 이용하는 것을 포함하고, 선택된 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 카피수를 증폭시키거나 증가시키는 것을 추가로 포함한다. 핵산은 임의의 적합한 방법을 이용하여 증폭될 수 있고, 예를 들어, 파지 증폭, 세포 성장 또는 중합효소 연쇄반응에 의해 증폭될 수 있다.
한 예에서, 상기 방법은 핵산의 코딩 기능과 핵산에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드의 물리적, 화학적 및/또는 기능적 특징을 결부시키는 디스플레이 시스템을 이용한다. 이러한 디스플레이 시스템은 복수의 복제가능한 유전 패키지, 예를 들어, 박테리오파지 또는 세포(박테리아)를 포함할 수 있다. 디스플레이 시스템은 라이브러리, 예를 들어, 박테리오파지 디스플레이 라이브러리를 포함할 수 있다. 박테리오파지 디스플레이는 디스플레이 시스템의 예이다.
다수의 적합한 박테리오파지 디스플레이 시스템(예를 들어, 1가 디스플레이 및 다가 디스플레이 시스템)이 기재되어 있다(예를 들어, Griffiths et al ., U.S. Patent No. 6,555,313 B1(참조로서 본원에 포함됨); Johnson et al ., U.S. Patent No. 5,733,743(참조로서 본원에 포함됨); McCafferty et al., U.S. Patent No. 5,969,108(참조로서 본원에 포함됨); Mulligan-Kehoe, U.S. Patent No. 5,702,892(참조로서 본원에 포함됨); Winter, G. et al., Annu . Rev . Immunol . 12:433-455 (1994); Soumillion, P. et al., Appl . Biochem . Biotechnol. 47(2-3):175-189 (1994); Castagnoli, L. et al., Comb . Chem . High Throughput Screen, 4(2):121-133 (2001)을 참조하라). 박테리오파지 디스플레이 시스템에서 디스플레이되는 펩티드 또는 폴리펩티드는 임의의 적합한 박테리오파지, 예를 들어, 필라멘트형 파지(예를 들어, fd, M13, F1), 용균 파지(예를 들어, T4, T7, 람다), 또는 RNA 파지(예를 들어, MS2) 상에서 디스플레이될 수 있다.
일반적으로, 적합한 파지 코트 단백질(예를 들어, fd pIII 단백질)과의 융합 단백질로서 펩티드 또는 파지폴리펩티드의 레퍼토리를 디스플레이하는 파지의 라이브러리가 생성되거나 제공된다. 융합 단백질은 파지 코트 단백질의 첨단, 또는 요망시 내부 위치에 펩티드 또는 폴리펩티드를 디스플레이할 수 있다. 예를 들어, 디스플레이된 펩티드 또는 폴리펩티드는 pIII의 도메인 1에 대해 아미노-말단인 위치에 존재할 수 있다(pIII의 도메인 1은 또한 N1으로 언급된다). 디스플레이된 폴리펩티드는 pIII(예를 들어, pIII의 도메인 1의 N-말단)에 직접 융합될 수 있거나, 링커를 이용하여 pIII에 융합될 수 있다. 요망시, 융합체는 태그(예를 들어, myc 에피토프, His 태그)를 추가로 포함할 수 있다. 파지 코트 단백질을 갖는 융합 단백질로 디스플레이되는 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하는 라이브러리는 임의의 적합한 방법을 이용하여 생성될 수 있고, 예를 들어, 적합한 숙주 박테리아로 디스플레이된 펩티드 또는 폴리펩티드를 엔코딩하는 파지 벡터 또는 파지미드 벡터의 라이브러리를 도입시키고, 파지를 생성하는 결과로서 발생한 박테리아를 배양(예를 들어, 요망시 적합한 헬퍼 파지 또는 상보성 플라스미드를 이용함)함으로써 생성될 수 있다. 파지의 라이브러리는 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 침전 및 원심분리를 이용하여 배양물로부터 회수될 수 있다.
디스플레이 시스템은 임의의 요망되는 양의 다양성을 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함할 수 있다. 예를 들어, 레퍼토리는 유기체, 유기체의 군, 요망되는 조직 또는 요망되는 세포 유형에 의해 발현되는 자연 발생 폴리펩티드에 해당하는 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 함유할 수 있거나, 무작위 또는 무작위화된 아미노산 서열을 갖는 펩티드 또는 폴리펩티드를 함유할 수 있다. 요망시, 폴리펩티드는 공통의 코어 또는 스캐폴드를 공유할 수 있다. 예를 들어, 레퍼토리 또는 라이브러리 내의 모든 폴리펩티드는 단백질 A, 단백질 L, 단백질 G, 피브로넥틴 도메인, 안티칼린(anticalin), CTLA4, 요망되는 효소(예를 들어, 중합효소, 셀룰라제), 또는 면역글로불린 상과로부터의 폴리펩티드, 예를 들어, 항체 또는 항체 단편(예를 들어, 항체 가변 도메인)으로부터 선택된 스캐폴드를 기초로 할 수 있다. 이러한 레퍼토리 또는 라이브러리 내의 폴리펩티드는 무작위 또는 무작위화된 아미노산 서열의 규정된 영역 및 공통의 아미노산 서열의 영역을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 레퍼토리 내의 모든 또는 실질적으로 모든 폴리펩티드는 요망되는 유형, 예를 들어, 요망되는 효소(예를 들어, 중합효소) 또는 항체의 요망되는 항원-결합 단편(예를 들어, 인간 VH 또는 인간 VL)이다. 일부 구체예에서, 폴리펩티드 디스플레이 시스템은 폴리펩티드의 레퍼토리를 포함하며, 여기서 각각의 폴리펩티드는 항체 가변 도메인을 포함한다. 예를 들어, 레퍼토리 내의 각각의 폴리펩티드는 VH, VL 또는 FV(예를 들어, 단쇄 Fv)를 함유할 수 있다.
아미노산 서열 다양성은 임의의 적합한 방법을 이용하여 펩티드 또는 폴리펩티드 또는 스캐폴드의 임의의 요망되는 영역으로 도입될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 서열 다양성은 임의의 적합한 돌연변이유발 방법(예를 들어, 저 정확도 PCR, 올리고누클레오티드-매개 또는 부위 특이적 돌연변이유발, NNK 코돈을 이용한 다양화) 또는 임의의 다른 적합한 방법을 이용하여 다양화된 폴리펩티드를 엔코딩하는 핵산의 라이브러리를 제조함으로써 항체 가변 도메인 또는 소수성 도메인의 상보성 결정 영역과 같은 표적 영역으로 도입될 수 있다. 요망시, 다양화되는 폴리펩티드의 영역은 무작위화될 수 있다.
레퍼토리를 구성하는 폴리펩티드의 크기는 주로 선택의 문제이며, 균일한 폴리펩티드 크기가 필요하지는 않다. 레퍼토리 내의 폴리펩티드는 적어도 3차 구조(적어도 하나의 도메인을 형성함)를 가질 수 있다.
선택/분리/회수
에피토프 결합 도메인 또는 도메인의 집단이 임의의 적합한 방법을 이용하여 레퍼토리 또는 라이브러리(예를 들어, 디스플레이 시스템 내)로부터 선택되고/되거나, 분리되고/되거나, 회수될 수 있다. 예를 들어, 도메인은 선택가능한 특징(예를 들어, 물리적 특징, 화학적 특징, 기능적 특징)을 기초로 하여 선택되거나 분리된다. 적합한 선택가능한 기능적 특징은 레퍼토리 내의 펩티드 또는 폴리펩티드의 생물학적 활성, 예를 들어, 제너릭 리간드(generic ligand)(예를 들어, 초항원)에 대한 결합, 표적 리간드(예를 들어, 항원, 에피토프, 기질)에 대한 결합, 항체에 대한 결합(예를 들어, 펩티드 또는 폴리펩티드 상에서 발현된 에피토프를 통함), 및 촉매 활성을 포함한다(예를 들어, Tomlinson et al., WO 99/20749; WO 01/57065; WO 99/58655를 참조하라).
일부 구체예에서, 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드는 실질적으로 모든 도메인이 공통의 선택가능한 특징을 공유하는 펩티드 또는 폴리펩티드의 라이브러리 또는 레퍼토리로부터 선택되고/되거나 분리된다. 예를 들어, 도메인은 실질적으로 모든 도메인이 공통의 제너릭 리간드에 결합하거나, 공통의 표적 리간드에 결합하거나, 공통의 항체에 결합되거나(또는 공통의 항체에 의해 결합되거나), 공통의 촉매 활성을 갖는 라이브러리 또는 레퍼토리로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 단일 가변 도메인의 친화성 성숙을 수행하는 경우 요망되는 생물학적 활성을 갖는 모(parental) 펩티드 또는 폴리펩티드를 기초로 하는 상기 선택 유형은 도메인의 레퍼토리를 제조하는데 특히 유용하다.
공통의 제너릭 리간드에 대한 결합을 기초로 한 선택은 본래의 라이브러리 또는 레퍼토리의 구성요소인 모든 또는 실질적으로 모든 도메인을 함유하는 도메인의 집합 또는 집단을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 표적 리간드 또는 제너릭 리간드, 예를 들어, 단백질 A, 단백질 L 또는 항체에 결합하는 도메인은 패닝(panning)에 의하거나 적합한 친화성 매트릭스를 이용하여 선택되고/되거나, 분리되고/되거나, 회수될 수 있다. 패닝은 적합한 용기(예를 들어, 튜브, 페트리 접시)에 리간드(예를 들어, 제너릭 리간드, 표적 리간드)의 용액을 첨가하고, 리간드가 용기의 벽에 부착되거나 코팅되도록 함으로써 달성될 수 있다. 과량의 리간드가 세척될 수 있고, 도메인이 용기에 첨가될 수 있고, 용기는 펩티드 또는 폴리펩티드가 고정된 리간드에 결합하기에 적합한 조건하에서 유지될 수 있다. 결합되지 않은 도메인은 세척될 수 있고, 결합된 도메인은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 스크래핑(scraping) 또는 pH 저하를 이용하여 회수될 수 있다.
적합한 리간드 친화성 매트릭스는 일반적으로 리간드가 공유적 또는 비공유적으로 부착되는 고체 지지체 또는 비드(예를 들어, 아가로스)를 함유한다. 친화성 매트릭스는 매트릭스 상의 리간드에 대한 도메인의 결합에 적합한 조건하에서 배치 공정, 컬럼 공정 또는 임의의 다른 적합한 공정을 이용하여 펩티드 또는 폴리펩티드(예를 들어, 레퍼토리는 프로테아제와 함께 인큐베이션됨)와 조합될 수 있으며, 친화성 매트릭스에 결합되지 않는 도메인은 세척될 수 있고, 결합된 도메인은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, 낮은 pH 완충액을 이용한 용리, 약한 변성제(예를 들어, 우레아), 또는 리간드에 대한 결합과 경쟁하는 펩티드 또는 도메인을 이용하여 용리되고 회수될 수 있다. 한 예에서, 비오티닐화된 표적 리간드는 레퍼토리 내의 도메인이 표적 리간드에 결합하기에 적합한 조건하에서 레퍼토리와 조합된다. 결합된 도메인은 고정된 아비딘 또는 스트렙타비딘(예를 들어, 비드 상)을 이용하여 회수된다.
일부 구체예에서, 제너릭 또는 표적 리간드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 라이브러리 또는 레퍼토리의 펩티드 또는 폴리펩티드 내에 실질적으로 보존된 펩티드 또는 폴리펩티드의 구조 특징부에 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편은 제너릭 리간드로서 특히 유용하다. 프로테아제 내성 펩티드 또는 폴리펩티드를 분리하고/하거나, 선택하고/하거나, 회수하기 위한 리간드로 사용하기에 적합한 항체 및 항원 결합 단편은 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조될 수 있다.
라이브러리/레퍼토리
프로테아제 에피토프 결합 도메인을 엔코딩하고/하거나 함유하는 라이브러리는 임의의 적합한 방법을 이용하여 제조되거나 수득될 수 있다. 라이브러리는 관심 도메인 또는 스캐폴드(예를 들어, 라이브러리로부터 선택된 도메인)를 기초로 한 도메인을 엔코딩하도록 설계될 수 있거나, 본원에 기재된 방법을 이용하여 또 다른 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 도메인 내에 부화된 라이브러리는 적합한 폴리펩티드 디스플레이 시스템을 이용하여 제조될 수 있다.
요망되는 유형의 도메인의 레퍼토리를 엔코딩하는 라이브러리는 임의의 적합한 방법을 이용하여 용이하게 생성될 수 있다. 예를 들어, 요망되는 유형의 폴리펩티드(예를 들어, 면역글로불린 가변 도메인)를 엔코딩하는 핵산 서열이 수득될 수 있고, 하나 이상의 돌연변이를 각각 함유하는 핵산의 집합물이, 예를 들어, 오류-빈발 중합효소 연쇄반응(PCR) 시스템을 이용하여 핵산을 증폭시키거나, 화학적 돌연변이유발(Deng et al ., J. Biol . Chem ., 269:9533 (1994))에 의하거나, 박테리아 변이유발 균주(Low et al ., J. Mol . Biol, 260:359 (1996))를 이용하여 제조될 수 있다.
다른 구체예에서, 핵산의 특정 영역이 다양화에 대해 표적화될 수 있다. 선택된 위치를 돌연변이시키는 방법은 또한 당 분야에 널리 공지되어 있으며, 이는, 예를 들어, PCR의 사용과 함께 또는 PCR의 사용 없이 미스매치된 올리고누클레오티드 또는 축퇴성 올리고누클레오티드의 사용을 포함한다. 예를 들어, 합성 항체 라이브러리가 항원 결합 루프에 대한 표적화 돌연변이에 의해 생성되었다. 무작위 또는 반-무작위 항체 H3 및 L3 영역이 점라인 면역글로불린 V 유전자 세그먼트에 첨부되어 돌연변이되지 않은 프레임워크 영역을 갖는 큰 라이브러리가 생성되었다(Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al . (1994) supra; Griffiths et al . (1994) supra; DeKruif et al . (1995) supra). 상기 다양화는 다른 항원 결합 루프의 일부 또는 전부를 포함하도록 연장되었다(Crameri et al . (1996) Nature Med ., 2:100; Riechmann et al . (1995) Bio / Technology, 13:475; Morphosys, WO 97/08320, supra). 다른 구체예에서, 핵산의 특정 영역은, 예를 들어, "메가-프라이머(mega-primer)"로서 첫번째 PCR의 생성물을 이용하는 2-단계 PCR 방법에 의해 다양화를 위해 표적화될 수 있다(예를 들어, Landt, 0. et al ., Gene 96:125-128 (1990) 참조). 표적화된 다양화는 또한, 예를 들어, SOE PCR에 의해 달성될 수 있다(예를 들어, Horton, R.M. et al ., Gene 77:61-68 (1989) 참조).
선택된 위치에서의 서열 다양성은 폴리펩티드의 서열을 특정하는 코딩 서열을 변경시켜 다수의 가능한 아미노산(예를 들어, 20개 모두 또는 이의 서브셋)이 상기 위치에 통합될 수 있도록 함으로써 달성될 수 있다. IUPAC 명명법을 이용하여, 가장 다능성인 코돈은 모든 아미노산 뿐만 아니라 TAG 정지 코돈을 엔코딩하는 NNK이다. 요구되는 다양성을 도입시키기 위해 NNK 코돈이 이용될 수 있다. 추가 정지 코돈 TGA 및 TAA의 생성을 발생시키는 NNN 코돈을 포함하는 동일한 말단을 달성하는 다른 코돈이 또한 사용된다. 이러한 표적화된 방법은 표적 영역 내의 충분한 서열 공간이 조사되는 것을 가능케 할 수 있다.
일부 라이브러리는 면역글로불린 상과의 일원(예를 들어, 항체 또는 이의 일부)인 도메인을 포함한다. 예를 들어, 라이브러리는 공지된 주쇄 형태를 갖는 도메인을 포함할 수 있다(예를 들어, Tomlinson et al., WO 99/20749 참조). 라이브러리는 적합한 플라스미드 또는 벡터에서 제조될 수 있다. 본원에서 사용되는 벡터는 발현 및/또는 복제를 위해 세포로 이종성 DNA를 도입시키는데 사용되는 독립된 구성요소를 나타낸다. 플라스미드(예를 들어, 박테리아 플라스미드), 바이러스 또는 박테리오파지 벡터, 인공 염색체 및 에피솜 벡터를 포함하는 임의의 적합한 벡터가 이용될 수 있다. 간단한 클로닝 및 돌연변이유발을 위해 상기 벡터가 이용될 수 있거나, 라이브러리의 발현을 유도하기 위해 발현 벡터가 이용될 수 있다. 벡터 및 플라스미드는 보통 하나 이상의 클로닝 부위(예를 들어, 폴리링커), 복제 기점 및 적어도 하나의 선택 마커 유전자를 함유한다. 발현 벡터는 폴리펩티드의 전사 및 번역을 유도하는 구성요소, 예를 들어, 인핸서 구성요소, 프로모터, 전사 종료 신호, 신호 서열 등을 추가로 함유할 수 있다. 이들 구성요소는 폴리펩티드를 엔코딩하는 클로닝된 삽입물에 작동가능하게 연결되는 방식으로 배열될 수 있어, 상기 폴리펩티드는 상기 발현 벡터가 발현에 적합한 조건하에서 유지(예를 들어, 적합한 숙주 세포 내)되는 경우에 발현되고 생성된다.
클로닝 및 발현 벡터는 일반적으로 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제되는 것을 가능케 하는 핵산 서열을 함유한다. 통상적으로, 클로닝 벡터에서, 상기 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제되는 것을 가능케 하고, 복제 기점 또는 자율적으로 복제하는 서열을 포함하는 서열이다. 이러한 서열은 다양한 박테리아, 효모 및 바이러스에 대해 널리 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 기점은 대부분의 그람-음성 박테리아에 대해 적합하고, 2 마이크론의 플라스미드 기점이 효모에 대해 적합하고, 다양한 바이러스 기점(예를 들어, SV40, 아데노바이러스)이 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 기점은 이들이 높은 수준의 DNA를 복제할 수 있는 포유동물 세포, 예를 들어, COS 세포에서 사용되지 않는 한 포유동물 발현 벡터에 필요하지 않다.
클로닝 또는 발현 벡터는 선택 마커로 또한 언급되는 선택 유전자를 함유할 수 있다. 이러한 마커 유전자는 선택 배양 배지에서 성장된 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장에 필요한 단백질을 엔코딩한다. 따라서, 선택 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 배양 배지에서 생존하지 않을 것이다. 통상적 선택 유전자는 항생제 및 다른 독소, 예를 들어, 앰피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린, 보충적 영양요구 결핍, 또는 성장 배지에서 이용가능하지 않은 공급이 필요한 영양소에 대해 내성을 부여하는 단백질을 엔코딩한다. 적합한 발현 벡터는 다수의 구성요소, 예를 들어, 복제 기점, 선택 마커 유전자, 하나 이상의 발현 조절 구성요소, 예를 들어, 전사 조절 구성요소(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 종료자) 및/또는 하나 이상의 번역 신호, 신호 서열 또는 선도 서열 등을 함유할 수 있다. 발현 조절 구성요소 및 신호 또는 선도 서열은 존재시 벡터 또는 다른 공급원에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 항체 사슬을 엔코딩하는 클로닝된 핵산의 전사 및/또는 번역 조절 서열이 발현을 유도하는데 사용될 수 있다.
프로모터는 요망되는 숙주 세포에서의 발현을 위해 제공될 수 있다. 프로모터는 항시성 또는 유도성일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 항체, 항체 사슬 또는 이의 일부를 엔코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결될 수 있어, 이는 핵산의 전사를 유도한다. 원핵생물(예를 들어, E. 콜리(E. coli)에 대한 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템, 알칼리성 포스파타제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템, lac, tac, T3, T7 프로모터) 및 진핵생물(예를 들어, 원숭이 바이러스 40 조기 또는 후기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 긴 말단 반복 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, EG-1a 프로모터) 숙주에 대해 다양한 적합한 프로모터가 이용가능하다.
또한, 발현 벡터는 통상적으로 벡터를 갖는 숙주 세포의 선택을 위한 선택 마커, 및 복제가능한 발현 벡터의 경우 복제 기점을 포함한다. 항생제 또는 약물 내성을 부여하는 생성물을 엔코딩하는 유전자는 통상적인 선택 마커이며, 이는 원핵생물(예를 들어, β-락타마제 유전자(앰피실린 내성), 테트라사이클린 내성에 대한 Tet 유전자) 및 진핵생물 세포(예를 들어, 네오마이신(G418 또는 제네티신), gpt(미코페놀산), 앰피실린, 또는 하이그로마이신 내성 유전자)에서 사용될 수 있다. 디하이드로폴레이트 환원효소 마커 유전자는 다양한 숙주에서 메토트렉세이트를 이용한 선택을 가능케 한다. 숙주의 영양요구 마커의 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전자(예를 들어, LEU2 , URA3 , HIS3)가 종종 효모에서 선택 마커로 사용된다. 바이러스(예를 들어, 배큘로바이러스) 또는 파지 벡터, 및 숙주 세포의 유전체로 통합될 수 있는 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터의 사용이 또한 고려된다.
원핵생물(예를 들어, 박테리아 세포, 예를 들어, E. 콜리) 또는 포유동물 세포에서의 발현에 적합한 발현 벡터는, 예를 들어, pET 벡터(예를 들어, pET-12a, pET-36, pET-37, pET-39, pET-40, Novagen 등), 파지 벡터(예를 들어, pCANTAB 5 E, Pharmacia), pRIT2T(단백질 A 융합 벡터, Pharmacia), pCDM8, pCDNA1.1/amp, pcDNA3.1, pRc/RSV, pEF-1(Invitrogen, Carlsbad, CA), pCMV-SCRIPT, pFB, pSG5, pXT1(Stratagene, La Jolla, CA), pCDEF3(Goldman, L.A., et al ., Biotechniques , 21:1013-1015 (1996)), pSVSPORT(GibcoBRL, Rockville, MD), pEF-Bos(Mizushima, S., et al ., Nucleic Acids Res ., 18:5322 (1990)) 등을 포함한다. 다양한 발현 숙주, 예를 들어, 원핵생물 세포(E. 콜리), 곤충 세포(드로소필라 슈니더(Drosophila Schnieder) S2 세포, Sf9), 효모(P. 메타놀리카(P. methanolica), P. 파스토리스(P. pastoris), S. 세레비지에(S. cerevisiae)) 및 포유동물 세포(예를 들어, COS 세포)에서 사용하기에 적합한 발현 벡터가 이용가능하다.
벡터의 일부 예는 폴리펩티드 라이브러리 일원에 해당하는 누클레오티드 서열의 발현을 가능케 하는 발현 벡터이다. 따라서, 제너릭 및/또는 표적 리간드를 이용한 선택은 폴리펩티드 라이브러리 일원을 발현하는 단일 클론의 개별적 증식 및 발현에 의해 수행될 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 특정 선택 디스플레이 시스템은 박테리오파지 디스플레이이다. 따라서, 파지 또는 파지미드 벡터가 사용될 수 있고, 예를 들어, 벡터는 E. 콜리 복제 기점(이중 가닥 복제를 위함) 및 또한 파지 복제 기점(단일 가닥 DNA의 생성을 위함)을 갖는 파지미드 벡터일 수 있다. 상기 벡터의 조작 및 발현은 당 분야에 널리 공지되어 있다(Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al . (1994) supra). 간단히, 벡터는 파지미드에 대한 선택성을 부여하는 β-락타마제 유전자 및 적합한 선도 서열, 다수의 클로닝 부위, 하나 이상의 펩티드 태그, 하나 이상의 TAG 정지 코돈 및 파지 단백질 pIII을 함유할 수 있는 발현 카세트의 lac 프로모터 업스트림을 함유할 수 있다. 따라서, E. 콜리의 다양한 억제인자 및 비-억제인자 균주를 이용하고, 글루코스, 이소-프로필 티오-β-D-갈락토시드(IPTG) 또는 헬퍼 파지, 예를 들어, VCS M13의 첨가를 이용하여, 상기 벡터는 발현이 없는 플라스미드로 복제될 수 있고, 많은 양의 폴리펩티드 라이브러리 일원 단독 또는 생성물 파지를 생성시킬 수 있으며, 이중 일부는 이들의 표면 상에 폴리펩티드-pIII 융합체의 적어도 하나의 카피를 함유한다.
항체 가변 도메인은 표적 리간드 결합 부위 및/또는 제너릭 리간드 결합 부위를 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 제너릭 리간드 결합 부위는 초항원, 예를 들어, 단백질 A, 단백질 L 또는 단백질 G에 대한 결합 부위이다. 가변 도메인은 임의의 요망되는 가변 도메인, 예를 들어, 인간 VH(예를 들어, VH 1a, VH 1b, VH 2, VH 3, VH 4, VH 5, VH 6), 인간 VL(예를 들어, VLI, VLII, VLIII, VLIV, VLV, VLVI 또는 VK1) 또는 인간 VK(예를 들어, VK2, VK3, VK4, VK5, VK6, VK7, VK8, VK9 또는 VK10)를 기초로 할 수 있다.
또 다른 추가 부류의 기술은 유전자와 이의 유전자 생성물의 결합을 가능케 하는 인공 구획 내의 레퍼토리의 선택을 포함한다. 예를 들어, 요망되는 유전자 생성물을 엔코딩하는 핵산이 유중수 에멀젼에 의해 형성된 마이크로캡슐에서 선택될 수 있는 선택 시스템은 WO99/02671호, WO00/40712호 및 문헌[Tawfik & Griffiths (1998) Nature Biotechnol 16(7), 652-6]에 기재되어 있다. 요망되는 활성을 갖는 유전자 생성물을 엔코딩하는 유전 구성요소는 마이크로캡슐 내로 구획화되고, 이후 마이크로캡슐 내에서 이들의 각각의 유전자 생성물(RNA 또는 단백질)을 생성시키기 위해 전사되고/되거나 번역된다. 요망되는 활성을 갖는 유전 생성물을 생성하는 유전 구성요소가 이후에 분류된다. 이러한 방법은 다양한 수단에 의해 요망되는 활성을 검출함으로써 관심 유전자 생성물을 선택한다.
에피토프 결합 도메인의 특징
도메인의 이의 특정 항원 또는 에피토프에 대한 결합은 당업자에게 친숙한 방법에 의해 시험될 수 있고, 이는 ELISA를 포함한다. 한 예에서, 결합은 모노클로날 파지 ELISA를 이용하여 시험된다.
파지 ELISA가 임의의 적합한 절차에 따라 수행될 수 있고, 예시적 프로토콜이 하기에 기재된다.
각각의 라운드의 선택에서 생성된 파지의 집단은 "폴리클로날" 파지 항체를 확인하기 위해 선택된 항원 또는 에피토프에 대해 ELISA에 의해 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 이후, 상기 집단으로부터의 단일한 감염된 박테리아 집단으로부터의 파지가 ELISA에 의해 스크리닝되어 "모노클로날" 파지 항체가 확인될 수 있다. 또한, 항원 또는 에피토프에 대한 결합에 대해 가용성 항체 단편을 스크리닝하는 것이 요망되며, 이는 또한, 예를 들어, C-말단 태그 또는 N-말단 태그에 대한 시약을 이용한 ELISA에 의해 수행될 수 있다(예를 들어, Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 및 이에 인용된 참고문헌 참조).
선택된 파지 모노클로날 항체의 다양성은 또한 PCR 생성물의 겔 전기영동(Marks et al . 1991, supra; Nissim et al . 1994 supra), 프로빙(Tomlinson et al., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776) 또는 벡터 DNA의 서열분석에 의해 평가될 수 있다.
dAb의 구조
dAb가, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 기술을 이용하여 선택된 V-유전자 레퍼토리로부터 선택되는 경우에서, 상기 가변 도메인은 유니버셜 프레임워크 영역을 포함하여, 이들은 본원에 기재된 바와 같은 특정 제너릭 리간드에 의해 인지될 수 있다. 유니버셜 프레임워크, 제너릭 리간드 등의 사용은 WO99/20749호에 기재되어 있다.
V-유전자 레퍼토리가 사용되는 경우, 폴리펩티드 서열 내의 변화는 가변 도메인의 구조적 루프 내에 위치될 수 있다. 각각의 가변 도메인과 이의 상보적 쌍의 상호작용을 향상시키기 위해 어느 하나의 가변 도메인의 폴리펩티드 서열이 DNA 셔플링 또는 돌연변이에 의해 변경될 수 있다. DNA 셔플링은 당 분야에 공지되어 있고, 예를 들어, 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391] 및 미국 특허 번호 6,297,053호에 교시되어 있다. 다른 돌연변이유발 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
dAb를 작제하는데 사용하기 위한 스캐폴드
i. 주쇄 형태의 선택
면역글로불린 상과의 일원 모두는 이들의 폴리펩티드 사슬에 대해 유사한 폴드를 공유한다. 예를 들어, 항체는 이들의 일차 서열과 관련하여 고도로 다양하나, 서열 및 결정학적 구조의 비교는 예상과 반대로 항체의 6개의 항원 결합 루프 중 5개(H1, H2, L1, L2, L3)가 제한된 수의 주쇄 형태, 또는 정준 구조를 채택하는 것을 나타냈다(Chothia and Lesk (1987) J. Mol . Biol ., 196: 901; Chothia et al . (1989) Nature, 342: 877). 따라서, 루프 길이 및 중요 잔기의 분석은 인간 항체 대부분에서 발견되는 H1, H2, L1, L2 및 L3의 주쇄 형태의 예측을 가능케 한다(Chothia et al . (1992) J. Mol . Biol ., 227: 799; Tomlinson et al . (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al . (1996) J. Mol . Biol., 264: 220). 서열, 길이 및 구조와 관련하여 H3 영역이 훨씬 더 다양하나(D 세그먼트의 사용으로 인함), 이는 또한 루프 및 항체 프레임워크 내의 중요 위치에서 특정 잔기의 길이 및 존재, 또는 잔기의 유형에 따라 짧은 루프 길이에 대해 제한된 수의 주쇄 형태를 형성한다(Martin et al . (1996) J. Mol . Biol , 263: 800; Shirai et al . (1996) FEBS Letters, 399:1).
dAb는 유리하게는 도메인의 라이브러리, 예를 들어, VH 도메인의 라이브러리 및/또는 VL 도메인의 라이브러리로부터 어셈블리된다. 한 양태에서, 도메인의 라이브러리는 일원의 주쇄 형태가 공지되는 것을 보장하도록 특정 루프 길이 및 중요 잔기가 선택되도록 설계된다. 유리하게는, 이들은 이들이 상기 논의된 바와 같이 비-기능성일 가능성을 최소화시키기 위해 자연 상태로 발견되는 면역글로불린 상과 분자의 실제 형태가 존재한다. 점라인 V 유전자 세그먼트는 항체 또는 T-세포 수용체 라이브러리를 작제하기 위한 하나의 적합한 기본 프레임워크로 작용하며, 다른 서열이 또한 사용된다. 변화는 낮은 빈도로 발생할 수 있어, 작은 수의 기능성 일원이 이의 기능에 영향을 미치지 않는 변경된 주쇄 형태를 가질 수 있다.
정준 구조 이론은 리간드 서열을 기초로 하여 주쇄 형태를 예측하고, 정준 구조에 영향을 미치지 않는 다양화를 위한 잔기를 선택하기 위해 리간드에 의해 엔코딩되는 다양한 주쇄 형태의 수를 평가하는데 이용된다. 인간 Vκ 도메인에서, L1 루프는 4개의 정준 구조 중 하나를 채택할 수 있고, L2 루프는 하나의 정준 구조를 갖고, 인간 Vκ 도메인의 90%는 L3 루프에 대해 4 또는 5개의 정준 구조 중 하나를 채택하는 것이 공지되어 있어(Tomlinson et al . (1995) supra), 따라서, Vκ 도메인 단독에서, 다양한 정준 구조가 조합되어 광범위하게 다양한 주쇄 형태가 생성될 수 있다. V□ 도메인이 L1, L2 및 L3 루프에 대해 광범위하게 다양한 정준 구조를 엔코딩하고, Vκ 및 V□ 도메인이 H1 및 H2 루프에 대해 여러 정준 구조를 엔코딩할 수 있는 임의의 VH 도메인과 쌍을 이룰 수 있는 경우, 상기 5개의 루프에 대해 관찰된 정준 구조 조합의 수는 매우 크다. 이는 주쇄 형태에서의 다양성의 생성이 광범위한 결합 특이성의 생성에 필수적일 수 있음을 의미한다. 그러나, 공지된 단일한 주쇄 형태를 기초로 하여 항체 라이브러리를 작제함으로써, 예상과 반대로, 주쇄 형태에서의 다양성이 실질적으로 모든 항원을 표적화하기에 충분한 다양성을 발생시키는데 필요하지 않은 것으로 밝혀졌다. 더욱 더 놀랍게도, 단일한 주쇄 형태는 컨센서스 구조인 것을 필요로 하지 않으며, 전체 라이브러리에 대한 기초로서 단일한 자연 발생 형태가 이용될 수 있다. 따라서, 한 특정 양태에서, dAb는 단일한 공지된 주쇄 형태를 갖는다.
선택되는 단일한 주쇄 형태는 당해 면역글로불린 상과 유형의 분자에서 통상적인 것일 수 있다. 유의한 수의 자연 발생 분자가 이를 채택하는 것으로 관찰되는 경우 형태는 통상적인 것이다. 따라서, 한 양태에서, 면역글로불린 도메인의 각각의 결합 루프에 대해 다양한 주쇄 형태의 자연 발생이 개별적으로 고려되며, 이후 다양한 루프에 대해 주쇄 형태의 요망되는 조합을 갖는 자연 발생 가변 도메인이 선택된다. 아무것도 이용가능하지 않은 경우, 가장 가까운 동등물이 선택될 수 있다. 다양한 루프에 대해 주쇄 형태의 요망되는 조합은 요망되는 주쇄 형태를 엔코딩하는 점라인 유전자 세그먼트를 선택함으로써 생성될 수 있다. 한 예에서, 선택된 점라인 유전자 세그먼트는 종종 자연 상태로 발현되고, 특히 이들은 가장 빈번히 모두 자연 점라인 유전자 세그먼트로 발현될 수 있다.
라이브러리를 설계하는데 있어서, 6개의 항원 결합 루프 각각에 대한 다양한 주쇄 형태의 발생률은 개별적으로 고려될 수 있다. H1, H2, L1, L2 및 L3에 대해, 자연 발생 분자의 항원 결합 루프의 20% 내지 100%에 의해 채택되는 제공된 형태가 선택된다. 통상적으로, 이의 관찰된 발생률은 35% 이상(즉, 35% 내지 100%), 및 이상적으로 50% 이상 또는 심지어 65% 이상이다. H3 루프의 광대한 대부분이 정준 구조를 갖지 않으므로, 정준 구조를 나타내는 루프 중에서 통상적인 주쇄 형태를 선택하는 것이 바람직하다. 따라서, 루프 각각에 대해, 자연 레퍼토리에서 가장 흔하게 관찰되는 형태가 선택된다. 인간 항체에서, 각각의 루프에 대해 가장 통상적인 정준 구조(CS)는 다음과 같다: H1 - CS 1(발현된 레퍼토리의 79%), H2 - CS 3(46%), L1 - Vκ의 CS 2(39%), L2 - CS 1(100%), L3 - Vκ의 CS 1(36%)(계산은 70:30의 □:□비를 가정함, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp . Quant . Biol., 48: 133). 정준 구조를 갖는 H3 루프에 대해, 잔기 94로부터 잔기 101까지의 염-브릿지를 갖는 7개 잔기의 CDR3 길이(Kabat et al . (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services)가 가장 통상적인 것으로 보인다. 항체 모델링을 위한 기초로 사용될 수 있는 단백질 데이터 뱅크에서 상기 형태 및 적어도 2개의 결정학적 구조를 형성시키는, 필요한 H3 길이 및 중요 잔기를 갖는 적어도 16개의 인간 항체 서열이 EMBL 데이터 라이브러리에 존재한다(2cgr 및 1tet). 상기 정준 구조의 조합에서 가장 빈번히 발현된 점라인 유전자 세그먼트는 VH 세그먼트 3-23(DP-47), JH 세그먼트JH4b, V□ 세그먼트 O2/O12(DPK9) 및 J□ 세그먼트 J□1이다. VH 세그먼트 DP45 및 DP38이 또한 적합하다. 따라서, 이들 세그먼트는 요망되는 단일 주쇄 형태를 갖는 라이브러리를 작제하기 위한 기초로서 조합하여 사용될 수 있다.
대안적으로, 분리된 결합 루프 각각에 대해 상이한 주쇄 형태의 자연 발생을 기초로 하여 단일 주쇄 형태를 선택하는 것 대신에, 주쇄 형태의 조합의 자연 발생이 단일한 주쇄 형태를 선택하기 위한 기초로 사용된다. 항체의 경우, 예를 들어, 항원 결합 루프의 임의의 2개, 3개, 4개, 5개, 또는 6개 모두에 대한 정준 구조 조합의 자연 발생이 결정될 수 있다. 여기서, 선택된 형태는 자연 발생 항체에서 통상적인 것일 수 있고, 자연 레퍼토리에서 가장 빈번하게 관찰될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 인간 항체에서, 5개의 항원 결합 루프 H1, H2, L1, L2 및 L3의 자연 조합이 고려되는 경우, 정준 구조의 가장 빈번한 조합이 결정된 후, 단일 주쇄 형태를 선택하기 위한 기초로서 H3 루프에 대해 가장 통상적인 형태와 조합된다.
정준 서열의 다양화
여러 공지된 주쇄 형태 또는 단일한 공지된 주쇄 형태를 선택하고, 구조적 및/또는 기능적 다양성을 갖는 레퍼토리를 생성시키기 위해 분자의 결합 부위를 다양화시킴으로써 dAb가 작제될 수 있다. 이는 변이체가 이들이 이들의 구조 및/또는 이들의 기능에서 충분한 다양성을 갖도록 생성되어, 이들이 광범위한 활성을 제공할 수 있는 것을 의미한다.
요망되는 다양성은 통상적으로 하나 이상의 위치에서 선택된 분자를 다양화시킴으로써 발생된다. 변경되는 위치는 무작위로 선택되거나, 이들은 선택될 수 있다. 이후, 변화는 존재하는 아미노산이 자연 또는 합성의 임의의 아미노산 또는 이의 유사체로 대체되는 동안 매우 많은 수의 변이체를 발생시키는 무작위화에 의하거나, 존재하는 아미노산을 아미노산의 규정된 서브셋 중 하나 이상으로 대체시켜 보다 제한된 수의 변이체를 발생시킴으로써 달성될 수 있다.
상기 다양성을 도입시키기 위해 다양한 방법이 보고되었다. 오류-빈발 PCR(Hawkins et al . (1992) J. Mol . Biol ., 226: 889), 화학적 돌연변이유발(Deng et al . (1994) J. Biol . Chem ., 269: 9533) 또는 박테리아 변이유발 균주(Low et al. (1996) J. Mol . Biol, 260: 359)가 분자를 엔코딩하는 유전자에 무작위 돌연변이를 도입시키는데 이용될 수 있다. 선택된 위치를 돌연변이시키는 방법은 또한 당 분야에 널리 공지되어 있고, 이는 PCR의 사용과 함께 또는 PCR의 사용 없이 미스매치된 올리고누클레오티드 및 축퇴성 올리고누클레오티드의 사용을 포함한다. 예를 들어, 항원 결합 루프에 대해 돌연변이를 표적화시킴으로써 여러 합성 항체 라이브러리가 생성되었다. 인간 테타누스 톡소이드-결합 Fab의 H3 영역이 무작위화되어 광범위한 새로운 결합 특이성이 생성되었다(Barbas et al . (1992) Proc . Natl. Acad . Sci . USA, 89: 4457). 무작위 또는 반-무작위 H3 및 L3 영역이 점라인 V 유전자 세그먼트에 첨부되어 돌연변이되지 않은 프레임워크 영역을 갖는 큰 라이브러리가 생성되었다(Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol . Biol, 227: 381; Barbas et al . (1992) Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 89: 4457; Nissim et al . (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al . (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al . (1995) J. Mol Biol, 248: 97). 이러한 다양화는 다른 항원 결합 루프의 일부 또는 전부를 포함하도록 연장되었다(Crameri et al . (1996) Nature Med, 2: 100; Riechmann et al . (1995) Bio / Technology, 13: 475; Morphosys, WO97/08320, supra).
루프 무작위화는 H3 단독에 대해 약 1015개를 초과하는 구조 및 다른 5개의 루프에 대해 유사하게 많은 수의 변이체를 발생시킬 잠재성을 가지므로, 모든 가능한 조합을 나타내는 라이브러리를 생성시키기 위해 현재의 형질전환 기술을 이용하거나, 무세포 시스템을 이용하여 실행할 수 없다. 예를 들어, 현재까지 작제된 가장 큰 라이브러리 중 하나에서, 상기 설계의 라이브러리에 대한 잠재적 다양성의 단지 일부인 6 x 1010개의 상이한 항체가 생성되었다.(Griffiths et al . (1994) supra).
한 구체예에서, 분자의 요망되는 기능을 발생시키거나 변경시키는 것과 직접적으로 관련된 잔기만이 다양화된다. 많은 분자에 대해, 상기 기능은 표적에 결합되고, 이에 따라 분자의 전체 패킹에 중요한 잔기를 변화시키는 것을 피하거나, 선택된 주쇄 형태를 유지시키면서 다양성이 표적 결합 부위 내에 집중될 것이다.
한 양태에서, 단지 항원 결합 부위 내의 잔기가 변화된 dAb의 라이브러리가 사용된다. 이들 잔기는 인간 항체 레퍼토리에서 극도로 다양하고, 고-분해능 항체/항원 복합체와 접촉을 이루는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, L2에서, 자연 발생 항체에서 위치 50 및 53이 다양하고, 항원과 접촉을 이루는 것으로 관찰되는 것이 공지되어 있다. 대조적으로, 통상적인 방법은 문헌[Kabat et al . (1991, supra)]에 정의된 바와 같이 상응하는 상보성 결정 영역(CDR1) 내의 모든 잔기를 다양화시키는 것이며, 일부 7개의 잔기가 라이브러리에서 다양화된 2개와 비교된다. 이는 광범위한 항원 결합 특이성을 발생시키는데 필요한 기능적 다양성과 관련하여 유의한 개선을 나타낸다.
사실상, 항체 다양성은 나이브 1차 레퍼토리(소위, 점라인 및 연접 다양성(junctional diversity))를 발생시키는 점라인 V, D 및 J 유전자 세그먼트의 체세포 재조합, 및 발생된 재배열된 V 유전자의 체세포 초돌연변이의 2개의 과정의 결과이다. 인간 항체 서열의 분석은 1차 레퍼토리에서의 다양성이 항원 결합 부위의 중심에 집중되는 반면, 체세포 초돌연변이는 1차 레퍼토리에 고도로 보존된 항원 결합 부위 주변의 영역에 다양성을 보급하는 것을 나타냈다(Tomlinson et al . (1996) J. Mol ., Biol ., 256: 813 참조). 이러한 상보성은 아마 서열 공간을 찾기 위한 효과적인 방법으로 발달되어 왔을 것이며, 항체에 대해 명백히 독특함에도 불구하고, 이는 다른 폴리펩티드 레퍼토리에 용이하게 적용될 수 있다. 다양화되는 잔기는 표적에 대한 결합 부위를 형성하는 잔기의 서브셋이다. 표적 결합 부위 내의 잔기의 다양한(중첩 포함) 서브셋이 요망시 선택 동안 다양한 단계에서 다양화된다.
항체 레퍼토리의 경우에서, 항원 결합 부위 내의 잔기의 전부가 아닌 일부가 다양화되는 최초 '나이브(naive)' 레퍼토리가 생성된다. 상기 상황에서, 본원에서 사용되는 용어 "나이브" 또는 "더미(dummy)"는 미리 결정되지 않은 표적을 갖는 항체 분자를 나타낸다. 이들 분자는 면역계가 매우 다양한 항원성 자극에 의해 아직 공격받지 않은 태아 및 신생아 개체의 경우에서와 같이 면역 다양화를 겪지 않은 개체의 면역글로불린 유전자에 의해 엔코딩되는 분자와 유사하다. 이러한 레퍼토리는 이후 광범위한 항원 또는 에피토프에 대해 선택된다. 필요시, 추가의 다양성이 이후 최초 레퍼토리에서 다양화된 영역 외부에 도입될 수 있다. 이러한 성숙된 레퍼토리가 변경된 기능, 특이성 또는 친화성에 대해 선택될 수 있다.
본원에 기재된 서열이 본원에 기재된 서열과 실질적으로 동일한 서열, 예를 들어, 적어도 90% 동일한 서열, 예를 들어, 적어도 91%, 또는 적어도 92%, 또는 적어도 93%, 또는 적어도 94% 또는 적어도 95%, 또는 적어도 96%, 또는 적어도 97% 또는 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.
핵산에 대해, 용어 "실질적 동일성"은 2개의 핵산 또는 이의 지정된 서열이 최적으로 정렬되고 비교되는 경우에 적절한 누클레오티드 삽입 또는 결실과 함께 누클레오티드의 적어도 약 80%, 보통 누클레오티드의 적어도 약 90% 내지 95%, 또는 적어도 약 98% 내지 99.5%에서 동일한 것을 나타낸다. 대안적으로, 실질적 동일성은 세그먼트가 선택적 하이브리드화 조건하에서 가닥의 상보체에 하이브리드화되는 경우에 존재한다. 누클레오티드 및 아미노산 서열에 대해, 용어 "동일한"은 최적으로 정렬되고, 적절한 삽입 또는 결실과 함께 비교되는 경우 2개의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 동일성의 정도를 나타낸다. 대안적으로, 실질적 동일성은 DNA 세그먼트가 선택적 하이브리드화 조건하에서 가닥의 상보체에 하이브리드화되는 경우에 존재한다.
2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되는 것이 필요한 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려한, 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수(즉, 동일성 % = 동일한 위치의 # / 위치의 전체 # × 100)이다. 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 동일성 퍼센트의 결정은 하기 비제한적인 예에 기재된 바와 같이 수학적 알고리즘을 이용하여 달성될 수 있다.
2개의 누클레오티드 서열 사이의 동일성 퍼센트는 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 이용하여 결정될 수 있다. 2개의 누클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 또한 PAM120 가중치 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 이용하는 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 통합된 문헌[E. Meyers and W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또한, 2개의 아미노산 서열 사이의 동일성 퍼센트는 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 이용하는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 통합된 문헌[Needleman and Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)]의 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 서열은 SEQ ID NO:38에 의해 엔코딩되는 참조 서열과 동일, 즉, 100% 동일할 수 있거나, 이는 % 동일성이 100% 미만이 되도록 하는 참조 서열에 비한 특정 정수 수 이하의 아미노산 변경을 포함할 수 있다. 상기 변경은 적어도 하나의 아미노산 결실, 보존성 및 비-보존성 치환을 포함하는 치환, 또는 삽입으로 구성되는 군으로부터 선택되고, 상기 변경은 참조 폴리펩티드 서열의 아미노-말단 또는 카르복시-말단 위치, 또는 참조 서열 내의 아미노산 중 개별적으로 산재된 상기 말단 위치 사이 또는 참조 서열 내의 하나 이상의 연속적 군 내에 어디에서도 발생할 수 있다. 제공된 동일성 %에 대한 아미노산 변경의 수는 SEQ ID NO:38에 의해 엔코딩되는 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 전체수에 (100으로 나누어진) 각각의 동일성 퍼센트의 숫자상 퍼센트를 곱한 후, SEQ ID NO:38에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 상기 전체수로부터의 상기 곱을 공제하거나, 하기 식에 의해 결정된다:
na≤xa - (xa·y),
상기 식에서, na는 아미노산 변경의 수이고, xa는 SEQ ID NO:38에 의해 엔코딩된 폴리펩티드 서열 내의 아미노산의 전체 수이고, y는, 예를 들어, 70%에 대해 0.70, 80%에 대해 0.80, 85%에 대해 0.85 등이고, xa 및 y의 임의의 비-정수 곱은 xa로부터 이를 공제시키기 전에 가장 가까운 정수로 반내림된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는" 및 이의 문법적 변화는 치료적 요법을 의미한다. 특정 질환과 관련하여, "치료하는"은 (1) 질환의 생물학적 증상 중 하나 이상의 상태를 개선시키거나 예방하거나, (2) (a) 질환을 발생시키거나 질환에 책임이 있는 생물학적 캐스케이드 내의 하나 이상의 지점, 또는 (b) 질환의 생물학적 증상 중 하나 이상을 간섭하거나, (3) 질환 또는 이의 치료와 관련된 증상, 효과 또는 부작용 중 하나 이상을 경감시키거나, (4) 질환의 진행 또는 질환의 생물학적 증상 중 하나 이상을 늦추는 것을 의미한다. 예방적 요법이 또한 이에 의해 고려된다. 당업자는 "예방"이 절대적 용어가 아님을 인지할 것이다. 의약에서, "예방"은 질환 또는 이의 생물학적 증상의 가능성 또는 중증도를 실질적으로 감소시키거나, 상기 질환 또는 이의 생물학적 증상의 발생을 지연시키는 약물의 예방적 투여를 나타내는 것이 이해된다. 예방적 요법은, 예를 들어, 피검체가 암이 발생할 위험이 높은 것으로 간주되는 경우, 예를 들어, 피검체가 확실한 암의 가족력을 갖거나, 피검체가 발암물질에 노출된 경우에 적절하다.
당 분야에서 이해되는 바와 같은 용어 "완전한 완화", "완전한 반응" 및 "완전한 회귀"는 치료에 반응한 암의 모든 검출가능한 신호 및/또는 증상의 소실을 의미한다. 또한, 당 분야에서 이해되는 바와 같이, 암의 검출가능한 증후 또는 증상은 치료되는 암의 유형 및 단계를 기초로 하여 규정될 수 있다. 예를 들어, 간세포 암종으로 고통받는 환자에서의 치료에 대한 "완전한 반응"은 X-선 또는 CT 스캔으로 가시적인 간 종양이 관찰되지 않는 것으로 규정될 수 있다. 일부 예에서, 임상 반응은 하기 기재되는 바와 같은 RECIST 1.0 기준(Therasse P, Arbuck SG, Eisenhauer EA, Wanders J, Kaplan RS, Rubinstein L, et al. New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors. European Organization for Research and Treatment of Cancer, National Cancer Institute of the United States, National Cancer Institute of Canada. J Natl Cancer Inst. 2000;92:205-16)에 의해 규정될 수 있다.
적합하게는, 본 발명은 뇌암(신경아교종), 아교모세포종, 반나얀-조나나 증후군(Bannayan-Zonana syndrome), 코든병(Cowden disease), 레미트-두크로스병(Lhermitte-Duclos disease), 유방암, 염증성 유방암, 윌름스 종양, 유잉 육종, 횡문근육종, 뇌실막종, 속질모세포종, 결장암, 두경부암, 신장암, 폐암, 간암, 예를 들어, 간세포 암종, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종, 골육종, 뼈의 거대세포 종양, 갑상선암, 림프모구 T 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 털세포 백혈병, 급성 림프모구 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 호중구성 백혈병, 급성 림프모구 T 세포 백혈병, 형질세포종, 면역모세포 대세포 백혈병, 외투세포 백혈병, 다발골수종 거대모구성 백혈병, 다발골수종, 급성 거대핵세포 백혈병, 전골수구세포 백혈병, 적백혈병, 악성 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 림프모구성 T 세포 림프종, 버킷 림프종, 소포 림프종, 신경모세포종, 방광암, 요로상피암, 폐암, 외음암, 자궁경부암, 자궁내막암, 신장암, 중피종, 식도암, 타액선암, 간세포암, 위암, 비인두암, 볼암, 구강암, GIST(위장관 기질 종양) 및 고환암으로부터 선택된 암을 치료하거나 이러한 암의 중증도를 경감시키는 방법에 관한 것이다.
적합하게는, 본 발명은 뇌암(신경아교종), 아교모세포종, 반나얀-조나나 증후군, 코든병, 레미트-두크로스병, 유방암, 결장암, 두경부암, 신장암, 폐암, 간암, 흑색종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 육종 및 갑상선암으로부터 선택된 암을 치료하거나 이러한 암의 중증도를 경감시키는 방법에 관한 것이다.
"암"은 심장암: 육종(혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종, 지방육종), 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종 및 기형종; 폐암: 기관지원성 암종(편평세포암종, 미분화 소세포 암종, 미분화 대세포 암종, 샘암종), 폐포(세기관지) 암종, 기관지 샘종, 육종, 림프종, 연골종성 과오종(chondromatous hanlartoma), 이네소텔리오마(inesothelioma); 위장관암: 식도암(편평세포 암종, 샘암종, 평활근육종, 림프종), 위암(암종, 림프종, 평활근육종), 췌장암(도관 샘암종, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 카르시노이드 종양, 비포마(vipoma)), 소장암(샘암종, 림프종, 카르시노이드 종양, 카포시 육종, 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종, 섬유종), 대장암(샘암종, 관상선종, 관상선종, 융모샘종, 과오종, 평활근종); 비뇨생식관암: 신장암(샘암종, 윌름스 종양[신장모세포종], 림프종, 백혈병), 방광암 및 요도암(편평세포 암종, 이행세포 암종, 샘암종), 전립선암(샘암종, 육종), 고환암(고환종, 기형종, 배아암종, 기형암종, 융모막암종, 육종, 사이질 세포 암종, 섬유종, 선유샘종, 샘종모양 종양, 지방종); 간암: 간세포암(간세포 암종), 담관암종, 간모세포종, 혈관육종, 간세포 샘종, 혈관종; 골암: 골형성 육종(골육종), 섬유육종, 악성 섬유조직구종, 연골육종, 유잉 육종, 악성 림프종(그물세포 육종), 다발골수종, 악성 거대세포 종양 척삭종, 골연골종(골연골성 뼈돌출증((osteocartilaginous exostoses)), 양성 연골종, 연골모세포종, 연골점액유사섬유종(chondromyxofibroma), 유골골종 및 거대세포 종양; 신경계암: 두개골암(골연화증, 혈관종, 육아종, 황색종, 변형뼈염), 수막암(수막종, 수막육종(meningiosarcoma), 신경아교종증), 뇌암(별아교세포종, 속질모세포종, 신경아교종, 뇌실막종, 종자세포종[송과체종], 다형성아교모세포종, 희소돌기아교세포종, 신경집종, 망막모세포종, 선천 종양), 척수 신경섬유종, 수막종, 신경아교종, 육종); 부인과암: 자궁암(자궁내막 암종), 자궁경부암(자궁경부 암종, 종양전 자궁목형성이상), 난소암(난소 암종[장액낭샘종, 점액낭샘종, 미분류 암종], 과립난포막세포종양, 세르톨리라이디히 세포 종양(SertoliLeydig cell tumor), 미분화세포종(dysgerminoma), 악성 기형종), 외음암(편평세포 암종, 상피내 암종, 샘암종, 섬유육종, 흑색종), 질암(투명세포 암종, 편평세포 암종, 포도육종(배아형횡문근육종], 자궁관암(암종); 혈액학적 암: 혈액암(골수성 백혈병[급성 및 만성], 급성 림프모세포성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 골수증식 질병, 다발골수종, 골수형성이상 증후군), 호지킨병, 비-호지킨 림프종[악성 림프종]; 피부암: 악성 흑색종, 기저세포 암종, 편평세포 암종, 카포시 육종, 몰레스 형성이상 모반(moles dysplastic nevi), 지방종, 혈관종, 피부섬유종, 켈로이드, 건선; 및 부신암: 신경모세포종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 세포-증식 질병 상태를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "암", "신생물" 및 "종양"은 상호교환적으로 사용되며, 단수 또는 복수 형태이건 간에, 세포가 숙주 유기체에 대해 병변이 되도록 하는 악성 전환을 겪는 세포를 나타낸다. 원발성 암세포(즉, 악성 전환 부위 근처로부터 수득된 세포)는 널리 확립된 기술, 특히 조직학적 검사에 의해 비암성 세포로부터 용이하게 구별될 수 있다. 본원에서 사용되는 암세포의 정의는 원발성 암세포 뿐만 아니라 암세포 원형으로부터 유래된 임의의 세포를 포함한다. 이는 전이된 암세포, 및 암세포로부터 유래된 시험관내 배양물 및 세포주를 포함한다. 고형 종양으로 보통 나타나는 암세포의 유형을 언급하는 경우, "임상적으로 검출가능한" 종양은, 예를 들어, CAT 스캔, MR 이미징, X-선, 초음파 또는 촉진과 같은 절차에 의해 종양 부피를 기초로 하여 검출가능하고/하거나, 환자로부터 수득가능한 샘플 내의 하나 이상의 암-특이적 항원의 발현으로 인해 검출가능한 종양이다. 종양은 고형 종양, 예를 들어, 간세포암종(HCC) 병변일 수 있다. 종양은 조혈 종양, 예를 들어, 액체 종양을 의미하는 혈액 세포 등의 종양일 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 단백질 또는 폴리펩티드의 "과발현된" 및 "과발현" 및 이의 문법적 변화는 제공된 세포가 정상 세포에 비해 증가된 수의 특정 단백질을 생성하는 것을 의미한다. 예를 들어, c-Met 단백질은 비-종양 세포에 비해 종양 세포에 의해 과발현될 수 있다. 추가로, 돌연변이 c-Met 단백질이 세포에서 야생형 c-Met 단백질에 비해 과발현될 수 있다. 당 분야에서 이해되는 바와 같이, 세포 내의 폴리펩티드의 발현 수준은 하우스키핑 유전자(housekeeping gene), 예를 들어, 액틴에 대해 표준화될 수 있다. 일부 예에서, 특정 폴리펩티드는 비-종양 세포에 비해 종양 세포에서 과발현될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "증폭" 및 이의 문법적 변화는 염색체 상보체 내의 하나 이상의 여분의 유전자 카피의 존재를 나타낸다. 특정 구체예에서, c-Met 단백질을 엔코딩하는 유전자가 세포에서 증폭될 수 있다. HER2 유전자의 증폭은 특정 유형의 암과 관련이 있다. HER2 유전자의 증폭이 인간 타액선 및 위 종양 유래 세포주, 위 및 결장 샘암종, 및 유선 샘암종에서 발견되었다. 문헌[Semba et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:6497-6501 (1985); Yokota et al., Oncogene, 2:283-287 (1988); Zhou et al., Cancer Res., 47:6123-6125 (1987); King et al., Science, 229:974-976 (1985); Kraus et al., EMBO J, 6:605-610 (1987); van de Vijver et al., Mol. Cell. Biol., 7:2019-2023 (1987); Yamamoto et al., Nature, 319:230-234 (1986)]을 참조하라.
통상적으로, 치료되는 민감한 종양에 대해 활성을 갖는 임의의 항-신생물 작용제는 본 발명의 암의 치료제와 공동 투여될 수 있다. 상기 작용제의 예는 문헌[Cancer Principles and Practice of Oncology by V.T. Devita and S. Hellman (editors), 6th edition (February 15, 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers]에서 발견될 수 있다. 당업자는 약물 및 관련된 암의 특정 특징을 기초로 하여 유용할 수 있는 작용제의 조합을 식별할 수 있을 것이다. 본 발명에서 유용한 통상적인 항-신생물 작용제는 항-미세관 작용제, 예를 들어, 디터페노이드(diterpenoid) 및 빈카 알칼로이드; 백금 배위결합 복합체; 알킬화제, 예를 들어, 질소 머스타드(nitrogen mustard), 옥사자포스포린, 알킬설포네이트, 니트로소우레아, 및 트리아젠; 항생제, 예를 들어, 안트라사이클린, 악티노마이신 및 블레오마이신; 국소이성화효소 II 억제제, 예를 들어, 에피포도필로톡신; 항대사물질, 예를 들어, 퓨린 및 피리미딘 유사체 및 항-폴레이트 화합물; 국소이성화효소 I 억제제, 예를 들어, 캄프토테신(camptothecin); 호르몬 및 호르몬 유사체; 신호전달 경로 억제제; 수용체 티로신 키나제 억제제; 세린-트레오닌 키나제 억제제; 비-수용체 티로신 키나제 억제제; 혈관형성 억제제, 면역요법제; 프로아폽토시스 작용제(proapoptotic agent); 및 세포 주기 신호전달 억제제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명은 또한 또 다른 항-신생물 작용제(화합물 B)와 함께 또는 이러한 작용제 없이 본 발명의 적어도 하나의 항원 결합 단백질(본원에서, 화합물 A로 언급됨) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는 암을 치료하는 방법을 제공한다.
본원에서 사용되는 용어 "특정 기간" 및 이의 문법적 변화는 화합물 A2 및 화합물 B2 중 하나의 투여와 화합물 A2 및 화합물 B2 중 나머지의 투여 사이의 시간 간격을 의미한다. 달리 정의하지 않는 한, 특정 기간은 동시 투여를 포함할 수 있다. 달리 정의하지 않는 한, 특정 기간은 하루 동안의 화합물 A2 및 화합물 B2의 투여를 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어 "기간" 및 이의 문법적 변화는 본 발명의 화합물이 지정된 수의 연속적 일수 동안 투여되는 것을 의미한다. 달리 정의하지 않는 한, 연속적 일수의 수는 치료 시작시에 개시되거나 치료 종료시에 종결되지는 않으며, 이는 단지 연속적 일수의 수가 치료 과정 동안 일부 지점에서 발생하는 것을 필요로 한다.
화합물 A 또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 조합되거나 공동 투여하는데 사용하기 위한 추가 활성 성분 또는 성분들(항-신생물 작용제)의 예는 화학요법제이다.
항-미세관 또는 항-유사분열 작용제는 세포 주기의 M 또는 유사분열 단계 동안 종양 세포의 미세관에 대해 활성인 단계 특이적 작용제이다. 항-미세관 작용제의 예는 디터페노이드 및 빈카 알칼로이드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
자연 공급원으로부터 유래되는 디터페노이드는 세포 주기의 G2/M 단계에서 작용하는 단계 특이적 항암제이다. 디터페노이드는 미세관과의 결합에 의해 미세관의 β-튜불린 서브유닛을 안정화시키는 것으로 생각된다. 이후, 단백질의 분해가 억제되고, 유사분열이 정지되고, 세포 사멸이 후속되는 것으로 보인다. 디터페노이드의 예는 파클리탁셀(paclitaxel) 및 이의 유사체 도세탁셀(docetaxel)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
파클리탁셀, (2R,3S)-N-벤조일-3-페닐이소세린을 갖는 5β,20-에폭시-1,2α,4,7β,10β,13α-헥사-하이드록시탁스-11-엔-9-온 4,10-디아세테이트 2-벤조에이트 13-에스테르는 대서양의 주목 탁수스 브레비폴리아(Taxus brevifolia)로부터 분리된 자연 디터펜 생성물이며, 주사용액 TAXOL®로 시판된다. 이는 터펜의 탁산과의 일원이다. 이는 화학적 및 X-선 결정학 방법에 의해 구조를 특성규명한 문헌[Wani et al. J. Am. Chem, Soc, 93:2325. 1971]에 의해 1971년에 처음 분리되었다. 이의 활성에 대한 한 메커니즘은 튜불린에 결합함으로써 암세포 성장을 억제하는 파클리탁셀의 능력에 관한 것이다. 문헌[Schiff et al., Proc. Natl, Acad, Sci. USA, 77:1561-1565 (1980); Schiff et al., Nature, 277:665-667 (1979); Kumar, J. Biol, Chem, 256: 10435-10441 (1981)]을 참조하라. 일부 파클리탁셀 유도체의 합성 및 항암 활성의 개관을 위해서는, 문헌[D.G.I. Kingston et al., Studies in Organic Chemistry vol. 26, entitled "New trends in Natural Products Chemistry 1986", Attaur-Rahman, P.W. Le Quesne, Eds. (Elsevier, Amsterdam, 1986) pp 219-235]을 참조하라.
파클리탁셀은 미국에서 난치성 난소암의 치료(Markman et al., Yale Journal of Biology and Medicine, 64:583, 1991; McGuire et al., Ann. Intern, Med., 111:273,1989) 및 유방암의 치료(Holmes et al., J. Nat. Cancer Inst., 83:1797,1991)에서 임상적 용도에 대해 승인되었다. 이는 피부(Einzig et. al., Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 20:46) 및 두경부 암종(Forastire et. al., Sem. Oncol., 20:56, 1990)에서 신생물의 치료를 위한 잠재적 후보자이다. 화합물은 또한 다낭성 신장 질병(Woo et. al., Nature, 368:750. 1994), 폐암 및 말라리아의 치료를 위한 잠재성을 나타낸다. 파클리탁셀을 이용한 치료는 역치 농도(50nM) 초과에서의 투여 기간(Kearns, CM. et. al., Seminars in Oncology, 3(6) p.16-23, 1995)과 관련하여 골수 억제(multiple cell lineages, Ignoff, R.J. et. al, Cancer Chemotherapy Pocket Guide, 1998)를 발생시켰다.
도세탁셀, 5β-20-에폭시-1,2α,4,7β,10β,13α-헥사하이드록시탁스-11-엔-9-온 4-아세테이트 2-벤조에이트, 트리하이드레이트를 갖는 (2R,3S)-N-카르복시-3-페닐이소세린, N-3차-부틸 에스테르, 13-에스테르는 주사용액 TAXOTERE®로 시판된다. 도세탁셀은 유방암의 치료에 대해 지정된다. 도세탁셀은 유럽 주목의 잎으로부터 추출된 자연 전구체 10-데아세틸-바카틴 III를 이용하여 제조된 파클리탁셀(파클리탁셀 참조)의 반합성 유도체이다. 도세탁셀의 용량 제한 독성은 호중구감소증이다.
빈카 알칼로이드는 페리윙클(periwinkle) 식물로부터 유래되는 단계 특이적 항-신생물 작용제이다. 빈카 알칼로이드는 튜불린에 특이적으로 결합함으로써 세포 주기의 M 단계(유사분열)에서 작용한다. 결과로서, 결합된 튜불린 분자는 미세관으로 중합될 수 없다. 유사분열은 중기에서 정지되는 것으로 생각되며, 세포 사멸이 후속된다. 빈카 알칼로이드의 예는 빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 비노렐빈을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
빈블라스틴, 빈카류코블라스틴 설페이트는 주사용액 VELBAN®으로 시판된다. 비록, 다양한 고형 종양의 제2선 치료제로서 지정 가능하나, 이는 주로 고환암 및 다양한 림프종, 예를 들어, 호지킨병; 및 림프구성 및 조직구성 림프종의 치료에 지정된다. 골수억제가 주사용액 ONCOVIN®으로 시판되는 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈카류코블라스틴, 22-옥소-, 설페이트의 용량 제한 부작용이다. 빈크리스틴은 급성 백혈병의 치료에 지정되며, 또한, 호지킨 및 비-호지킨 악성 림프종의 치료 요법에서 사용된다. 탈모 및 신경학적 효과가 빈크리스틴의 가장 흔한 부작용이며, 다소 덜한 정도로 골수억제 및 위장관 점막염 결과가 발생한다.
비노렐빈 타르트레이트의 주사용액(NAVELBINE®)으로 시판되는 비노렐빈, 3',4'-디데하이드로-4'-데옥시-C'-노르빈카류코블라스틴 [R-(R*,R*)-2,3-디하이드록시부탄디오에이트(1:2)(염)]은 반합성 빈카 알칼로이드이다. 비노렐빈은 다양한 고형 종양, 특히, 비소세포폐암, 진행된 유방암, 및 호르몬 난치성 전립선암의 치료에서 단일 작용제로 또는 다른 화학요법제, 예를 들어, 시스플라틴과 조합하여 지정된다. 골수억제가 비노렐빈의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
백금 배위결합 복합체는 DNA와 상호작용하는 비-단계 특이적 항암제이다. 백금 복합체는 종양 세포로 진입하고, 물이온화를 겪고, DNA와 가닥내 및 가닥간 가교를 형성하여 종양에 대해 유해한 생물학적 효과를 야기시킨다. 백금 배위결합 복합체의 예는 시스플라틴 및 카르보플라틴을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
시스플라틴, 시스-디아민디클로로백금은 주사용액 PLATINOL®로 시판된다. 시스플라틴은 주로 전이성 고환암 및 난소암 및 진행된 방광암의 치료에 지정된다. 시스플라틴의 주요 용량 제한 부작용은 수화 및 이뇨에 의해 조절될 수 있는 신독성, 및 내이독성이다.
카르보플라틴, 백금, 디아민 [1,1-사이클로부탄-디카르복실레이트(2-)-O,O']은 주사용액 PARAPLATIN®로 시판된다. 카르보플라틴은 주로 진행된 난소 암종의 제1 및 제2선 치료에 지정된다. 골수 억제가 카르보플라틴의 용량 제한 독성이다.
알킬화제는 비-단계 특이적 항암제 및 강한 친전자체이다. 통상적으로, 알킬화제는 알킬화에 의해 DNA 분자의 친핵성 모이어티(moiety), 예를 들어, 포스페이트기, 아미노기, 설프하이드릴기, 하이드록실기, 카르복실기, 및 이미다졸기를 통해 DNA에 대해 공유결합을 형성한다. 이러한 알킬화는 핵산 기능을 파괴하여 세포 사멸을 야기시킨다. 알킬화제의 예는 질소 머스타드, 예를 들어, 사이클로포스파미드, 멜팔란, 및 클로람부실; 알킬 설포네이트, 예를 들어, 부술판; 니트로소우레아, 예를 들어, 카르무스틴; 및 트리아젠, 예를 들어, 다카르바진을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
사이클로포스파미드, 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]테트라하이드로-2H-1,3,2-옥사자포스포린 2-옥사이드 모노하이드레이트는 주사용액 또는 정제 CYTOXAN®로 시판된다. 사이클로포스파미드는 악성 림프종, 다발골수종, 및 백혈병의 치료에서 단일 작용제로 또는 다른 화학요법제와 함께 지정된다. 탈모, 구역, 구토 및 백혈구감소증이 사이클로포스파미드의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
멜팔란, 4-[비스(2-클로로에틸)아미노]-L-페닐알라닌은 주사용수 또는 정제 ALKERAN®으로 시판된다. 멜팔란은 다발골수종 및 난소의 적출불가능한 상피 암종의 완화 치료에 지정된다. 골수 억제가 멜팔란의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
클로람부실, 4-[비스(2-클로로에틸)아미노]벤젠부탄산은 LEUKERAN® 정제로 시판된다. 클로람부실은 만성 림프성 백혈병, 및 악성 림프종, 예를 들어, 림프육종, 거대소포 림프종, 및 호지킨병의 완화 치료에 지정된다. 골수 억제가 클로람부실의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
부술판, 1,4-부탄디올 디메탄설포네이트는 MYLERAN® 정제로 시판된다. 부술판은 만성 골수성 백혈병의 완화 치료에 지정된다. 골수 억제가 부술판의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
카르무스틴, 1,3-[비스(2-클로로에틸)-1-니트로소우레아는 동결건조된 물질의 단일 바이얼 BiCNU®로 시판된다. 카르무스틴은 뇌종양, 다발골수종, 호지킨병, 및 비-호지킨 림프종에 대해 단일 작용제로 또는 다른 작용제와 함께 완화 치료에 대해 지정된다. 지연 골수억제가 카르무스틴의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
다카르바진, 5-(3,3-디메틸-1-트리아제노)-이미다졸-4-카르복사미드는 단일 바이얼 물질 DTIC-Dome®으로 시판된다. 다카르바진은 전이성 악성 흑색종의 치료에 대해 지정되고, 호지킨병의 제2선 치료에 대해 다른 작용제와 함께 지정된다. 구역, 구토, 및 식욕부진이 다카르바진의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
항생제 항-신생물제는 DNA에 결합하거나 DNA 사이에 삽입되는 비-단계 특이적 작용제이다. 통상적으로, 상기 작용은 안정적인 DNA 복합체 또는 가닥 파괴를 발생시키고, 이는 핵산의 통상적인 기능을 파괴하여 세포 사멸을 야기시킨다. 항생제 항-신생물제의 예는 악티노마이신, 예를 들어, 닥티노마이신, 안트라사이클린, 예를 들어, 다우노루비신 및 독소루비신; 및 블레오마이신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
악티노마이신 D로도 공지된 닥티노마이신은 주사형태 COSMEGEN®으로 시판된다. 닥티노마이신은 윌름스 종양 및 횡문근육종의 치료에 대해 지정된다. 구역, 구토, 및 식욕부진이 닥티노마이신의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
다우노루비신, (8S-시스-)-8-아세틸-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥소피라노실)옥시]-7,8,9,10-테트라하이드로-6,8,11-트리하이드록시-1-메톡시-5,12 나프타센디온 하이드로클로라이드는 리포솜 주사형태 DAUNOXOME® 또는 주사용 CERUBIDINE®으로 시판된다. 다우노루비신은 급성 비림프성 백혈병 및 진행된 HIV 관련 카포시 육종의 치료에서 완화 유도에 지정된다. 골수억제가 다우노루비신의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
독소루비신, (8S, 10S)-10-[(3-아미노-2,3,6-트리데옥시-α-L-릭소-헥소피라노실)옥시]-8-글리콜로일, 7,8,9,10-테트라하이드로-6,8,11-트리하이드록시-1-메톡시-5,12 나프타센디온 하이드로클로라이드가 주사형태 RUBEX® 또는 ADRIAMYCIN RDF®로 시판된다. 독소루비신은 주로 급성 림프모구 백혈병 및 급성 골수모구 백혈병의 치료에 지정되나, 이는 또한 일부 고형 종양 및 림프종의 치료에서 유용한 성분이다. 골수억제가 독소루비신의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
스트렙토마이세스 버티실루스(Streptomyces verticillus) 균주로부터 분리된 세포독성 당펩티드 항생제의 혼합물인 블레오마이신은 BLENOXANE®으로 시판된다. 블레오마이신은 단일 작용제로 또는 다른 작용제와 함께 편평세포 암종, 림프종, 및 고환 암종의 완화 치료에 지정된다. 폐 및 피부 독성이 블레오마이신의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
국소이성화효소 II 억제제는 에피포도필로톡신을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 에피포도필로톡신은 맨드레이크 식물로부터 유래된 단계 특이적 항-신생물 작용제이다. 에피포도필로톡신은 통상적으로 국소이성화효소 II 및 DNA와 3차 복합체를 형성하여 DNA 가닥을 파괴시킴으로써 세포 주기의 S 및 G2 단계에서 세포에 영향을 미친다. 가닥 파괴가 누적되고, 세포 사멸이 후속된다. 에피포도필로톡신의 예는 에토포시드 및 테니포시드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
에토포시드, 4'-데메틸-에피포도필로톡신 9[4,6-O-(R)-에틸리덴-β-D-글루코피라노시드]는 주사용액 또는 캡슐 VePESID®로 시판되고, VP-16으로 일반적으로 공지되어 있다. 에토포시드는 고환암 및 비소세포폐암의 치료에서 단일 작용제로 또는 다른 화학요법제와 함께 지정된다. 골수억제가 에토포시드의 가장 흔한 부작용이다. 백혈구감소의 발생이 저혈소판증보다 더욱 중증인 경향이 있다.
테니포시드, 4'-데메틸-에피포도필로톡신 9[4,6-O-(R)-테닐리덴-β-D-글루코피라노시드]는 주사용액 VUMON®로 시판되고, 이는 통상적으로 VM-26으로 공지되어 있다. 테니포시드는 아동에서 급성 백혈병의 치료에서 단일 작용제로 또는 다른 화학요법제와 함께 지정된다. 골수억제가 테니포시드의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다. 테니포시드는 백혈구감소증 및 저혈소판증 둘 모두를 유도할 수 있다.
항대사물질 신생물 작용제는 DNA 합성을 억제하거나, 퓨린 또는 피리미딘 염기 합성을 억제하여 DNA 합성을 제한함으로써 세포 주기의 S 단계(DNA 합성)에서 작용하는 단계 특이적 항-신생물 작용제이다. 결과로서, S 단계는 진행되지 않고, 세포 사멸이 후속된다. 항대사물질 항-신생물 작용제의 예는 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 사이타라빈, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 및 젬시타빈을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 5-플루오로우라실, 5-플루오로-2,4-(1H,3H) 피리미딘디온이 플루오로우라실로 시판된다. 5-플루오로우라실의 투여는 티미딜레이트 합성의 억제를 발생시키며, 이는 또한 RNA 및 DNA 둘 모두로 통합된다. 결과는 통상적으로 세포 사멸이다. 5-플루오로우라실은 유방, 결장, 직장, 위 및 췌장의 암종의 치료에서 단일 작용제로 또는 다른 화학요법제와 함께 지정된다. 골수억제 및 점막염이 5-플루오로우라실의 용량 제한 부작용이다. 다른 플루오로피리미딘 유사체는 5-플루오로데옥시우리딘(플록스우리딘) 및 5-플루오로데옥시우리딘 모노포스페이트를 포함한다.
사이타라빈, 4-아미노-1-β-D-아라비노푸라노실-2 (1H)-피리미디논은 CYTOSAR-U®로 시판되며, Ara-C로 통상적으로 공지되어 있다. 사이타라빈은 증대하는 DNA 사슬로의 사이타라빈의 말단 통합에 의해 DNA 사슬 신장을 억제함으로써 S-단계에서 세포 단계 특이성을 나타내는 것으로 생각된다. 사이타라빈은 급성 백혈병의 치료에서 단일 작용제로 또는 다른 화학요법제와 함께 지정된다. 다른 사이티딘 유사체는 5-아자사이티딘 및 2',2'-디플루오로데옥시사이티딘(젬시타빈)을 포함한다. 사이타라빈은 백혈구감소증, 저혈소판증, 및 점막염을 유도한다.
머캅토퓨린, 1,7-디하이드로-6H-퓨린-6-티온 모노하이드레이트는 PURINETHOL®로 시판된다. 머캅토퓨린은 아직 특정되지 않은 메커니즘에 의해 DNA 합성을 억제함으로써 S-단계에서 세포 단계 특이성을 나타낸다. 머캅토퓨린은 급성 백혈병의 치료에서 단일 작용제로 또는 다른 화학요법제와 함께 지정된다. 골수억제 및 위장관 점막염이 고용량에서 머캅토퓨린의 예상되는 부작용이다. 유용한 머캅토퓨린 유사체는 아자티오프린이다.
티오구아닌, 2-아미노-1,7-디하이드로-6H-퓨린-6-티온은 TABLOID®로 시판된다. 티오구아닌은 아직 특정되지 않은 메커니즘에 의해 DNA 합성을 억제함으로써 S-단계에서 세포 단계 특이성을 나타낸다. 티오구아닌은 급성 백혈병의 치료에서 단일 작용제로 또는 다른 화학요법제와 함께 지정된다. 백혈구감소증을 포함하는 골수억제, 저혈소판증, 및 빈혈이 티오구아닌 투여의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다. 그러나, 위장관 부작용이 발생하며, 이는 용량 제한적일 수 있다. 다른 퓨린 유사체는 펜토스타틴, 에리트로하이드록시노닐아데닌, 플루다라빈 포스페이트, 및 클라드리빈을 포함한다.
젬시타빈, 2'-데옥시-2',2'-디플루오로사이티딘 모노하이드로클로라이드(β-이성질체)는 GEMZAR®로 시판된다. 젬시타빈은 G1/S 경계를 통해 세포의 진행을 차단함으로써 S-단계에서 세포 단계 특이성을 나타낸다. 젬시타빈은 국소적으로 진행된 비소세포폐암의 치료에서 시스플라틴과 함께 지정되고, 국소적으로 진행된 췌장암의 치료에서 단독으로 지정된다. 백혈구감소증을 포함하는 골수억제, 저혈소판증, 및 빈혈이 젬시타빈 투여의 가장 흔한 용량 제한 부작용이다.
메토트렉세이트, N-[4[[(2,4-디아미노-6-프테리디닐)메틸]메틸아미노]벤조일]-L-글루탐산은 메토트렉세이트 소듐으로 시판된다. 메토트렉세이트는 퓨린 누클레오티드 및 티미딜레이트의 합성에 필요한 디하이드로폴산 환원효소의 억제를 통해 DNA 합성, 복구 및/또는 복제를 억제함으로써 S-단계에서 특이적으로 작용한다. 메토트렉세이트는 융모막암종, 수막성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 및 유방, 두경부, 난소 및 방광의 암종의 치료에서 단일 작용제로 또는 다른 화학요법제와 함께 지정된다. 골수억제(백혈구감소증, 저혈소판증, 및 빈혈) 및 점막염이 메토트렉세이트 투여의 예상되는 부작용이다.
캄프토테신 및 캄프토테신 유도체를 포함하는 캄프토테신은 국소이성화효소 I 억제제로 이용가능하고, 개발중이다. 캄프토테신 세포독성 활성은 이의 국소이성화효소 I 억제 활성과 관련된 것으로 생각된다. 캄프토테신의 예는 이리노테칸, 토포테칸, 및 하기 기재되는 7-(4-메틸피페라지노-메틸렌)-10,11-에틸렌디옥시-20-캄프토테신의 다양한 광학 형태를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
이리노테칸 HCl, (4S)-4,11-디에틸-4-하이드록시-9-[(4-피페리디노피페리디노)카르보닐옥시]-1H-피라노[3',4',6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,14(4H,12H)-디온 하이드로클로라이드가 주사용액 CAMPTOSAR®로 시판된다.
이리노테칸은 이의 활성 대사물 SN-38과 함께 국소이성화효소 I - DNA 복합체에 결합하는 캄프토테신의 유도체이다. 세포독성은 국소이성화효소 I : DNA : 이리노테칸 또는 SN-38 3원 복합체와 복제 효소의 상호작용에 의해 야기되는 복구불가능한 이중가닥 파괴의 결과로서 발생하는 것으로 생각된다. 이리노테칸은 결장 또는 직장의 전이성 암의 치료에 지정된다. 이리노테칸 HCl의 용량 제한 부작용은 호중구감소증을 포함하는 골수억제, 설사를 포함하는 GI 영향이다.
토포테칸 HCl, (S)-10-[(디메틸아미노)메틸]-4-에틸-4,9-디하이드록시-1H-피라노[3',4',6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-3,14-(4H,12H)-디온 모노하이드로클로라이드는 주사용액 HYCAMTIN®로 시판된다. 토포테칸은 국소이성화효소 I - DNA 복합체에 결합하는 캄프토테신의 유도체이며, DNA 분자의 비틀림 스트레인에 반응하여 국소이성화효소 I에 의해 야기되는 단일 가닥 파괴의 재결찰을 방지한다. 토포테칸은 난소 및 소세포폐암의 전이성 암종의 제2선 치료에 지정된다. 토포테칸 HCl의 용량 제한 부작용은 골수억제, 주로 호중구감소증이다.
VOTRIENT®로 시판되는 파조파니브는 티로신 키나제 억제제(TKI)이다. 파조파니브는 화학명 5-[[4-[(2,3-디메틸-2H-인다졸-6-일)메틸아미노]-2-피리미디닐]아미노]-2-메틸벤젠설폰아미드 모노하이드로클로라이드를 갖는 하이드로클로라이드 염으로 제공된다. 파조파니브는 진행된 신세포 암종을 갖는 환자의 치료에 승인되어 있다.
리툭시맙은 RITUXAN® 및 MABTHERA®로 시판되는 키메라 모노클로날 항체이다. 리툭시맙은 B 세포 상의 CD20에 결합하고, 세포 아폽토시스를 야기시킨다. 리툭시맙은 정맥내 투여되고, 류머티스 관절염 및 B-세포 비-호지킨 림프종의 치료에 승인되어 있다.
오파투무맙은 ARZERRA®로 시판되는 완전한 인간 모노클로날 항체이다. 오파투무맙은 B 세포 상의 CD20에 결합하고, 플루다라빈(Fludara) 및 알렘투주맙(Campath)을 이용한 치료에 난치성인 성인에서 만성 림프성 백혈병(CLL; 백혈구의 암 유형)을 치료하는데 사용된다.
mTOR 억제제는 라파마이신(FK506) 및 라파로그(rapalog), RAD001 또는 에버롤리무스(everolimus)(Afinitor), CCI-779 또는 템시롤리무스(temsirolimus), AP23573, AZD8055, WYE-354, WYE-600, WYE-687 및 Pp121을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
벡사로텐은 Targretin®로 시판되며, 레티노이드 X 수용체(RXR)를 선택적으로 활성화시키는 레티노이드의 서브클래스의 일원이다. 이들 레티노이드 수용체는 레티노산 수용체(RAR)의 생물학적 활성과 별개의 생물학적 활성을 갖는다. 화학명은 4-[1-(5,6,7,8-테트라하이드로-3,5,5,8,8-펜타메틸-2-나프탈레닐)에테닐]벤조산이다. 벡사로텐은 질병이 적어도 하나의 다른 약제로 성공적으로 치료될 수 없는 사람에서 피부 T-세포 림프종(CTCL, 피부암의 한 유형)을 치료하는데 사용된다.
Nexavar®로 시판되는 소라페니브는 멀티키나제 억제제로 언급되는 약제의 한 부류이다. 이의 화학명은 4-[4-[[4-클로로-3-(트리플루오로메틸)페닐]카르바모일아미노]페녹시]-N-메틸-피리딘-2-카르복사미드이다. 소라페니브는 진행된 신세포 암종(신장에서 양성인 암의 한 유형)을 치료하는데 사용된다. 소라페니브는 또한 절개불가능한 간세포 암종(수술로 치료될 수 없는 간암의 한 유형)을 치료하는데 사용된다.
erbB 억제제의 예는 라파티니브, 에를로티니브, 및 제피티니브를 포함한다. 라파티니브, N-(3-클로로-4-{[(3-플루오로페닐)메틸]옥시}페닐)-6-[5-({[2-(메틸설포닐)에틸]아미노}메틸)-2-푸라닐]-4-퀴나졸린아민(하기 예시되는 바와 같이 화학식 II로 표현됨)은 HER2-양성 전이성 유방암의 치료에 대해 카페시타빈과 함께 승인된 erbB-1 및 erbB-2(EGFR 및 HER2) 티로신 키나제의 효능있는 경구용 소분자 이중 억제제이다.
Figure pct00001
화학식 (II)의 화합물의 자유 염기, HCl 염, 및 디토실레이트 염은 1999년 7월 15일에 공개된 WO 99/35146호, 및 2002년 1월 10일에 공개된 WO 02/02552호에 개시된 절차에 따라 제조될 수 있다.
에를로티니브, N-(3-에티닐페닐)-6,7-비스{[2-(메틸옥시)에틸]옥시}-4-퀴나졸린아민(제품명 타르세바(Tarceva)로 시판됨)은 하기 예시되는 바와 같이 화학식 III로 표현된다:
Figure pct00002
에를로티니브의 자유 염기 및 HCl 염은, 예를 들어, U.S. 5,747,498호의 실시예 20에 따라 제조될 수 있다.
제피티니브, 4-퀴나졸린아민,N-(3-클로로-4-플루오로페닐)-7-메톡시-6-[3-4-모르폴린)프로폭시]는 하기 예시되는 바와 같이 화학식 IV로 표현된다:
Figure pct00003
제품명 IRESSA®(Astra-Zenenca)로 시판되는 제피티니브는 백금-기반 및 도세탁셀 화학요법 둘 모두의 실패 후에 국소적으로 진행되거나 전이성인 비소세포폐암을 가진 환자의 치료에 대해 단일요법으로 지정되는 erbB-1 억제제이다. 제피티니브의 자유 염기, HCl 염, 및 diHCl 염은 1996년 4월 23일에 출원되고, 1996년 10월 31일에 WO 96/33980호로 공개된 국제 특허 출원 번호 PCT/GB96/00961호의 절차에 따라 제조될 수 있다.
실시예
실시예 1 - 인간 HGF 에 대한 중화 mAb 의 생성
마우스 골수종 NSO-유래 세포에서 생성된 재조합 인간 HGF 단백질(카탈로그 번호 294-HGN/CF)을 R&D Systems로부터 구입하였다. 2마리의 SJL/OlaHsd 마우스를 R&D 재조합 인간 HGF를 이용하여 0, 6 및 11일에 면역화시켰다. 비장세포 및 림프절을 14일에 분리시키고, P3X63/Ag8.653-유래 융합 파트너를 이용하여 마우스 골수종 세포에 융합시켰다. 무한증식 항체-생성 세포를 생성시켰다. 융합되지 않은 골수종 세포를 선별제거하기 위해 HAT 선택을 이용하였다.
활성 배양물로부터 생성되는 하이브리도마 상층액을 HGF-cMet에 대한 특정 결합 및 이의 중화에 대해 스크리닝하였다. 히트(hit)를 동정하고, 확인하고, 제한 희석 또는 반고체 배지에서의 성장에 의해 단클론성으로 클로닝하였다. 요망되는 특징을 갖는 모노클로날 항체를 액체 배양으로 규모를 확대시키고, 항체를 표준 크로마토그래피 방법으로 정제하였다. 이후, 생성된 정제된 항체를 결합 친화성 및 기능적 효능에 대해 추가로 특성규명하였다.
실시예 2 - 항체 인간화 - 하이브리도마 가변 영역의 클로닝
전체 RNA를 S260116C12, S260105B02, S260115C11 및 S265109B10 하이브리도마 세포로부터 추출하였다. 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 cDNA 서열을 역전사 및 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)으로 생성시켰다. RT-PCR을 위한 정방향 프라이머는 뮤린 면역글로불린 유전자 선도-서열에 특이적인 축퇴성 프라이머의 혼합물이었고, 역방향 프라이머는 항체 불변 영역에 특이적이고, 이러한 경우, S260116C12, S260105B02, S265109B10에 대해서는 아이소형 IgG1 및 S260115C11에 대해서는 아이소형 IgG2b에 특이적이었다. 프라이머를 문헌[Jones and Bendig (Bio/Technology 9:88, 1991)]에 기재된 방법을 기초로 하여 설계하였다. RT-PCR을 정확한 V-영역 서열의 이후의 확인을 가능케 하기 위해 둘 모두의 V-영역 서열에 대해 수행하였다. DNA 서열 데이터를 RT-PCR에 의해 생성된 V-영역 생성물에 대해 수득하였다.
실시예 3 - 항체 인간화 - 키메라 항체의 클로닝
키메라 항체를 엔코딩하는 DNA 발현 작제물을 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 제한 부위 뿐만 아니라 인간 신호 서열을 포함하는 중첩 올리고누클레오티드의 조성에 의해 새로이 제조하였다. 인간 γ1 불변 영역을 함유하는 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 신호 서열(SEQ ID NO:1)을 함유하는 VH 도메인을 구성하기 위해 HindIII 및 SpeI 제한 부위를 도입시켰다. 인간 카파 불변 영역을 함유하는 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 신호 서열(SEQ ID NO:1)을 함유하는 VL 도메인을 구성하기 위해 HindIII 및 BsiWI 제한 부위를 도입시켰다.
실시예 4 - 항체 인간화 - 인간화 변이체의 클로닝
인간화 항체 변이체를 엔코딩하는 DNA 발현 작제물을 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 제한 부위 뿐만 아니라 인간 신호 서열을 포함하는 중첩 올리고누클레오티드의 조성에 의해 새로이 제조하였다. 인간 γ1 불변 영역을 함유하는 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 신호 서열(SEQ ID NO:1)을 함유하는 VH 도메인을 구성하기 위해 HindIII 및 SpeI 제한 부위를 도입시켰다. 인간 카파 불변 영역을 함유하는 포유동물 발현 벡터로의 클로닝을 위한 신호 서열(SEQ ID NO:1)을 함유하는 VL 도메인을 구성하기 위해 HindIII 및 BsiWI 제한 부위를 도입시켰다.
실시예 5 - 재조합 항체의 발현
관련 중쇄 및 경쇄를 엔코딩하는 발현 플라스미드(하기 표 1에 나열됨)를 HEK 293 6E 세포에 일시적으로 공동-트랜스펙션시키고, 작은 규모로 발현시켜 항체를 생성시켰다. 항체는 상층액으로부터 정제되고, Nanodrop 분광광도계를 이용하여 정량된 단백질 A였다.
표 1: 키메라 및 인간화 항체 변이체
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 6 - Biacore 상의 HGF 에 대한 항체의 결합
항-인간 IgG(Biacore BR-1008-39)를 일차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에 고정시키고, 이러한 표면을 항체 분자를 포획하는데 이용하였다. 인간 HGFv1 및 인간 HGFδ5(GRITS38813)를 256nM, 64nM, 16nM, 4nM, 및 1nM에서 분석물로 사용하였다. 3M 마그네슘 클로라이드를 이용하여 재생을 수행하였다. 모든 결합 곡선을 완충액 주사(즉, 0nM)와 함께 이중 참조하였고, 데이터를 1:1 모델을 이용하여 A100 평가 소프트웨어에 적합시켰다. 작업을 VEGF 작업에 대한 런닝 완충액으로서 HBS-EP, 및 0.1M 리튬 클로라이드, 0.1M 구아니딘, 0.1% (v/v) 트리톤 X705, 0.1%(w/v) 3-(N,N-디메틸미리스틸-암모니오)프로판설포네이트(Sigma T7763)가 첨가된 HBS-N을 이용하여 37℃에서 수행하였다. 데이터는 모든 분자가 HGF(전장 및 짧아진 형태)에 결합할 수 있음을 나타내었다. 시험된 대부분의 작제물에 대해, 친화성 측정은 HGF(전장 및 짧아진 형태)에 대해 Biacore에 의해 측정가능한 범위 내로 달성되었으나, BPC1880 결합에 대해서는 Biacore에 의해 측정가능한 친화성 값을 발생시키는데 실패하였으며, 이는 상기 검정에서 기계의 민감도를 넘어서는 분리 속도로 인한 것이었으나, 이는 HGF에 대한 BPC1880의 결합이 매우 단단함을 나타낸다.
표 2는 인간화 mAbs BPC1873, 1880, 1881, 1884, 1885 및 키메라 mAb BPC1856의 HGF 결합을 나타낸다.
표 2: HGF 에 대한 항체의 결합
Figure pct00006
실시예 7 - Biacore 에서의 HGF 및 VEGF 에 대한 HGF - VEGF 이중특이적 항체의 결합
단백질 A를 일차 아민 커플링에 의해 CM5 칩 상에 고정시키고, 이러한 표면을 이후 항체 분자를 포획하는데 이용하였다. 인간 HGFv1(GRITS35238) 및 인간 HGFδ5(GRITS38813)를 64nM, 16nM, 4nM, 1nM 및 0.25nM로 사용하였고, 인간 VEGF를 256nM, 64nM, 16nM, 4nM 및 1nM으로 사용하였다. 50mM NaOH를 이용하여 재생을 수행하였다. 모든 결합 곡선을 완충액 주사(즉, 0nM)와 함께 이중 참조하였고, 데이터를 HGF 분석에 대해 1:1 모델, 및 VEGF 분석에 대해 1:1 및 2가 분석물 모델을 이용하여 T100 평가 소프트웨어에 적합시켰다. 작업을 VEGF 작업에 대한 런닝 완충액으로서 HBS-EP, 및 HGF 작업에 대해 0.1M 리튬 클로라이드, 0.1M 구아니딘, 0.1% (v/v) 트리톤 X705, 0.1%(w/v) 3-(N,N-디메틸미리스틸-암모니오)프로판설포네이트(Sigma T7763)가 첨가된 HBS-N을 이용하여 25℃에서 수행하였다. 데이터는 이중특이적 분자가 HGF(전장 및 짧아진 형태) 및 VEGF 둘 모두에 결합할 수 있음을 나타내었다. HGF(전장 및 짧아진 형태) 결합에 대한 데이터는 Biacore에 의해 측정가능한 친화성 값을 발생시키는데 실패하였으며, 이는 상기 검정에서 기계의 민감도를 넘어서는 분리 속도로 인한 것이었으나, 이는 시험된 분자(BPC1923, BPC1924, BPC1925 및 BPC1926)가 HGF에 단단히 결합하는 것을 나타낸다.
표 3은 Biacore 수행의 결과를 나타내며, 이는 BPC1923, BPC1924, BPC1925 및 BPC1926이 VEGF에 결합할 수 있는 것을 입증한다.
표 3: VEGF 에 대한 항체의 결합
Figure pct00007
전체적으로, 데이터는 16C12의 인간화 유도체, 특히 16C12 Ha4La0(BPC1880)이 HGF에 대해 매우 친화성인 항체이며, 잠재적 치료 항체임을 암시한다. 중요하게는, 16C12Ha4LaO의 이중특이적(mAb-dAb) 포맷(BPC1923, BPC1924, BPC1925 및 BPC1926에서 예시됨)에서 HGF에 대한 상기 높은 친화성이 보유되고, VEGF에 대한 높은 친화성이 부가된다.
실시예 8 - HGF 및 VEGF 브릿징 ( Bridging ) ELISA
96-웰 고 결합 플레이트를 PBS 중 5μg/ml의 재조합 인간 hVEGF-165(TB090219, Domantis, PBS 중 1.9mg/mL)로 코팅하고, 4℃에서 밤새 저장하였다. 플레이트를 PBS로 2회 세척하였다. 200μL의 차단 용액(PBS 완충액 중 5% BSA)을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이후, 또 다른 세척 단계를 수행하였다. BPC1923, BPC1924, BPC1925, BPC1926, BPC1880을 51.4nM 또는 60nM로부터의 차단 용액 중에 플레이트 전역에서 연속적으로 희석시켰다. HGF-VEGF mAbdAb의 세부사항은 하기 표에 나열되어 있다. 검정과 관련이 없는 단백질(DMS4000로 명명됨)에 특이적인 mAb와 함께 포맷화된(in-format) 항-VEGF dAb 모이어티를 함유하는 mAbdAb 대조군을 또한 포함시켰다. 1시간의 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하였다. 비오티닐화된 hHGF-v1(GRITS37567, 1.62mg/mL, N13185-12)을 차단 용액 중에서 5μg/mL로 희석시키고, 50μL를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세척하였다. 스트렙타비딘-HRP(GE Healthcare, RPN4401V)을 차단 용액 중에서 1/4000로 희석시키고, 50μL를 각각의 웰에 첨가하였다. 또 다른 세척 단계 후, 50μl의 OPD SigmaFast 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하고, 15분 후에 50μL의 2M 황산의 첨가에 의해 반응을 정지시켰다. 기본 종점 프로토콜을 이용하는 VersaMax Tunable Microplate Reader(Molecular Devices)를 이용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
도 1은 HGF 및 VEGF 브릿징 ELISA의 결과를 도시하며, 이는 BPC1923, BPC1924, BPC1925 및 BPC1926이 동시에 HGF 및 VEGF 둘 모두에 결합할 수 있고, BPC1880 및 DMS4000이 둘 모두의 표적에 결합을 나타내지 않는 것을 입증한다.
실시예 9 - Mv1Lu 증식 검정
추정 HGF 길항제의 효능을 평가하기 위해 Mv1Lu 세포 증식 검정이 이용될 수 있다. TGF-베타는 Mv1Lu 세포 증식을 억제하고, 이는 HGF의 첨가에 의해 극복된다(J. Immunol Methods 1996, Jan 16, Vol 189 (1); 59-64). 그러므로, HGF-처리된 세포와 HGF-처리되지 않은 세포 사이의 세포 증식에서의 차이는 HGF-매개 세포 증식을 반영한다. 상기 효과를 억제하는 추정 HGF 길항제의 능력은 정량될 수 있다.
S260116C12 및 이의 인간화 변이체의 HGF-중화 능력을 시험하기 위해, Mv1Lu 세포(ATCC)를 40ng/ml 인간 HGF, 1ng/ml TGF-베타(R&D Systems) 및 시험 항체가 보충된 혈청 비함유 배지에서 인큐베이션하였다. HGF를 적절히 대조군 웰로부터 생략시켰다. 모든 검정을 TGF-베타의 존재하에서 수행하였다. "-HGF"로 명명된 음성 대조 조건을 제외하고는 모든 검정을 HGF의 존재하에서 수행하였다. 항체를 1.3x10-08, 6.7x10-09, 3.3x10-09, 1.7x10-09, 8.3x10-10, 4.2x10-10, 2.1x10-10, 1.0x10-10 M의 최종 농도로 첨가하였다. 관련이 없는 아이소형 대조군(하이브리드 대조군 항체로 명명됨)이 사용되는 경우, 이는 1.3x10-08 M의 최종 농도로 적용시켰다. 전체 세포수를 생물발광 신호가 살아있는 세포주에 비례하는 발광 ATP-의존성 검정(CellTiterGlo™, Promega)을 이용하여 48시간 후에 결정하였다. 모든 조건을 삼중으로 시험하였다. 제시되는 데이터는 평균 +/- SD로 표현되며, 이는 적어도 2회의 독립적 실험의 대표이다.
인간화 항-HGF 모노클로날 항체 BPC1880, BPC1881, BPC1884 및 BPC1885는 각각 뮤린 항체 S260116C12와 구별할 수 없는 프로파일과 함께 용량-의존 방식으로 HGF-매개 Mv1Lu 세포 증식을 파괴시켰다. 하이브리드 대조 항체는 HGF-매개 세포 증식에 대해 효과가 없었다(도 2a-d).
상기 HGF-중화 능력이 mAbdAb 포맷에서 보유된 것을 확인하기 위해, 뮤린 항-HGF mAb S260116C12와 대표적 인간화 항-HGF mAbdAb 작제물 BPC1923 및 BPC1924(각각 인간화 mAb 변이체 BPC1880 및 BPC1881에 해당함) 사이를 직접 비교하였다. 이들 mAbdAb는 항-VEGF dAb 모이어티와 함께 포맷화된 항-HGF 모노클로날 항체 성분을 함유한다. 항체를 3.3x10-08, 1.7x10-08, 8.3x10-09, 4.2x10-09, 2.1x10-09, 1.0x10-09, 5.2x10-10 M의 최종 농도로 첨가하였다. 하이브리드 대조 항체 및 관련되지 않은 mAbdAb 대조군(DMS4000으로 명명됨)을 사용하였고, 각각을 3.3x10-08 M의 최종 농도로 적용하였다. 제시되는 데이터는 평균 +/- SD로 표현되며, 이는 적어도 2회의 독립적 실험의 대표이다.
mAbdAb 작제물을 이용한 처리는 상응하는 mAb 반응 프로파일과 구별할 수 없는 HGF-매개 Mv1Lu 세포 증식의 용량-의존적 파괴를 발생시켰다(도 2e-f). 관련이 없는 하이브리드 대조군 항체 또는 검정과 관련이 없는 단백질을 표적으로 하는 모노클로날 항체 모이어티 및 항-VEGF dAb 모이어티를 포함하는 아이소형 대조군 mAb(DMS4000)를 이용한 처리는 HGF-매개 세포 증식에 효과가 없었으며, 이는 시험 항체의 관찰된 효과가 HGF의 특정 중화로 인한 것임을 입증한다.
전체적으로, 상기 데이터는 BPC1880, BPC1881, BPC1884 및 BPC1885로 명명된 뮤린 항-HGF mAb S260116C12 및 이의 인간화 변이체가 용량-의존 방식으로 HGF-의존성 세포 증식을 파괴하고, 이러한 활성이 BPC1923 및 BPC1924로 예시되는 mAbdAb 포맷에서 보유되는 것을 나타낸다.
실시예 10 - 인간 제대 내피세포( HUVEC ) c- MET 인산화 검정
재조합 HGF를 이용한 혈청-고갈 HUVEC 단층의 처리는 세포 용해질에서 검출가능한 HGF 수용체 cMET의 인산화를 발생시켰다. 그러므로, HGF의 중화는 추정 HGF 길항제와 함께 예비 인큐베이션된 HGF로 처리된 세포로부터의 인산화된 cMET의 정량에 의해 평가될 수 있다.
푸울링된 공여 HUVECs(Lonza)를 Bulletkit 배지(Lonza) 중 5,000 세포/웰로 젤라틴-코팅된 96 웰 플레이트(Becton Dickenson) 상에 시딩하고, 37℃/5% C02에서 밤새 인큐베이션하였다. 배지를 첨가물 비함유 기본 배지(예를 들어, EGM-2, Lonza)로 대체하고, 세포를 약 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 시험 항체의 농도 적정액을 15분 동안 재조합 HGF와 함께 예비인큐베이션시키고, 세포에 첨가하여, 25ng/ml HGF의 최종 농도 및 2.0, 1.0, 0.5, 0.25, 0.125, 0.06μg/ml 시험 항체의 최종 농도를 달성하였다. 세포를 세척 전에 20-25분 동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 제조업체의 설명서(Mesoscale Discovery)에 따라 MSD ELISA 방법을 이용한 p-cMET 분석을 위해 전체 세포 용해질을 제조하였다. 모든 조건을 적어도 삼중으로 수행하였다. 제시된 데이터는 평균 +/- SD이며, 이는 적어도 2회의 독립적 실험의 대표이다.
HGF와 뮤린 항-HGF 항체 S260116C12의 예비인큐베이션은 HGF-매개 c-MET 인산화의 용량-의존적 중화를 발생시켰다. BPC1873, BPC1880, BPC1881, BPC1884 및 BPC1885로 명명된 S260116C12의 인간화 변이체 각각을 이용한 예비인큐베이션에 의해 유사한 데이터가 수득되었고, 이는 S260116C12의 HGF-중화 능력 및 인간화 후의 이의 보유를 입증한다. 하이브리드 대조군 항체와의 예비인큐베이션은 c-MET 인산화에 대해 효과가 없었다. 데이터는 미가공 MSD 값으로 제공된다(도 3a-c).
상기 HGF-중화 능력이 mAbdAb 포맷에서 보유된 것을 확인하기 위해, 인간화 항-HGF mAb BPC1880 및 BPC1881과 상응하는 항-HGF/항-VEGF mAbdAb 작제물 BPC1923 및 BPC1924 사이를 직접 비교하였다. 이들 mAbdAb는 항-VEGF dAb 모이어티와 함께 포맷화된 항-HGF 모노클로날 항체 구성요소를 함유한다. 항체를 농도 범위(예를 들어, 1.3x10-08, 6.7x10-09, 3.3x10-09, 1.7x10-09, 8.3x10-10, 4.2x10-10 M)에 걸쳐 첨가하였다. 관련이 없는 하이브리드 대조군 항체를 사용하였고, 1.3x10-08 M의 최종 농도로 적용하였다. 제시된 데이터는 삼중 샘플의 평균 +/- SD로 표현되고, 이는 적어도 2회의 독립적 실험의 대표이다.
mAbdAb 작제물을 이용한 처리는 상응하는 mAb 반응 프로파일과 매우 유사한 HGF-매개 cMET 인산화의 용량-의존적 파괴를 발생시켰다(도 3d-e). 관련이 없는 하이브리드 대조군 항체를 이용한 처리는 HGF-매개 c-Met 인산화에 효과가 없었다.
데이터는 HUVEC 내의 HGF-매개 c-Met 인산화를 중화시키는 BPC1880, BPC1881로 명명된 뮤린 항-HGF mAb S260116C12 및 이의 인간화 변이체의 능력이 BPC1923 및 BPC1924에 의해 예시된 바와 같은 mAbdAb 포맷에서 보유된 것을 나타낸다.
실시예 11 - HUVEC에서 mAbdAb에 의한 HGF-매개 cMET 인산화 및 VEGF-매개 VEGFR2 인산화의 동시 억제
재조합 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF)를 이용한 혈청-고갈된 HUVEC 단층의 처리는 세포 용해질 내에서 검출가능한 VEGF 수용체 VEGFR2의 인산화를 발생시켰다. 그러므로, VEGF의 중화는 추정 VEGF 길항제와 함께 예비-인큐베이션된 VEGF로 처리된 세포로부터의 인산화된-VEGFR2의 정량에 의해 평가될 수 있다. 또한, VEGF-매개 VEGFR2 인산화 및 HGF-매개 cMET 인산화를 동시에 억제하는 항-HGF, 항-VEGF mAbdAb의 능력은 VEGF, HGF 및 추정상 이중특이적 VEGF/HGF 길항제, 예를 들어, mAbdAb의 예비인큐베이션된 조합물을 이용한 세포의 처리에 의해 유사하게 평가될 수 있다.
푸울링된 공여 HUVEC(Lonza)를 Bulletkit 배지(Lonza) 중 5,000 세포/웰로 젤라틴-코팅된 96 웰 플레이트(Becton Dickenson) 상에 시딩하고, 37℃/5% C02에서 밤새 인큐베이션하였다. 배지를 첨가물-비함유 기본 배지(예를 들어, EGM-2, Lonza)로 대체하고, 세포를 약 4시간 동안 인큐베이션하였다. 시험 항체의 농도 적정액을 15분 동안 재조합 HGF와 함께 예비인큐베이션하고, 세포에 첨가하여, 25ng/ml의 HGF 및 10ng/ml의 VEGF165의 최종 농도, 및 1.3x10-08, 6.7x10-09, 3.3x10-09, 1.7x10-09, 8.3x10-10, 4.2x10-10 M의 시험 항체의 최종 농도를 달성하였다. 세포를 세척 전에 20-25분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 제조업체의 설명서(Mesoscale Discovery)에 따라 MSD ELISA 방법을 이용한 p-cMET 및 p-VEGFR2 분석을 위해 전체 세포 용해질을 제조하였다. 모든 조건을 적어도 삼중으로 수행하였다. 제시되는 데이터는 평균 +/- SD이며, 적어도 2회의 독립적 실험의 대표이다.
HGF 또는 HGF 및 VEGF의 조합물을 이용한 세포의 처리는 미처리된 세포 또는 VEGF 단독으로 처리된 세포에 비해 p-cMET에서 검출가능한 증가를 발생시켰다. 인간화 항-HGF 항체 BPC1884 또는 상응하는 mAbdAb BPC1925와 함께 HGF 및 VEGF의 조합물의 예비인큐베이션은 HGF-중화 능력이 mAbdAb 포맷에서 보유된 것을 나타내는 실시예 10의 발견과 일치하게 HGF-매개 c-MET 인산화의 용량-의존적 중화를 발생시켰다(도 4a).
p-VEGFR2의 수준을 동일 세포 용해질 샘플에서 정량하였다. VEGF 또는 VEGF 및 HGF의 조합물을 이용한 세포의 처리는 미처리된 세포 또는 HGF 단독으로 처리된 세포에 비해 p-VEGFR2에서 검출가능한 증가를 발생시켰다. 항-HGF, 항-VEGF mAbdAb BPC1925와 함께 HGF 및 VEGF의 조합물의 예비인큐베이션은 검출가능한 VEGFR2의 감소를 발생시켰고, 이는 도 4a에 기재된 HGF 중화와 동시에 VEGF의 중화를 반영한다. 대조적으로, 상응하는 인간화 항-HGF mAb BPC1884를 이용한 처리는 p-VEGFR2 수준에 영향을 미치지 않았고, 이는 VEGF 중화가 mAbdAb의 VEGF-표적화 모이어티에 의해 특이적으로 달성된 것을 입증한다(도 4b).
데이터는 VEGF 및 HGF가 BPC1925에 의해 예시된 바와 같이 항-HGF/항-VEGF mAbdAb에 의해 동시에 중화될 수 있고, HUVEC에서 HGF-매개 p-cMET 및 VEGF-매개 p-VEGFR2의 측정에 의해 결정될 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 12 - 혈관형성 검정
본 실시예는 예언적 실시예이다. 이는 본 발명의 항원 결합 단백질이 시험될 수 있는 추가 검정을 수행하기 위한 지침을 제공한다. 이러한 검정은 항-HGF/항-VEGF mAbdAb 또는 시험관내 세포 검정에서 혈관형성을 억제하는 다른 항원 결합 단백질의 능력을 평가한다.
Angiokit™은 내피세포 및 섬유모세포의 시판되는 공동-배양 검정이며, 이는 시험관내에서 내피 네트워크 형성과 관련된 하나 이상의 파라미터를 억제하는 추정 항-혈관형성 작용제의 능력을 시험하는데 사용될 수 있다. 이들 파라미터는 이미지 분석을 이용하여 정량되며, 이는, 예를 들어, 전체 내피세포 영역(필드 영역), 혈관 가지 지점의 수, 평균 세관 길이 등을 포함한다.
통상적인 검정에서, 혈관형성 공동-배양 검정(Angiokit™)은 제조업체(TCS Cellworks)에 의해 직접 수행된다. 간단히, 배지가 24 웰 포맷 Angiokit™ 공동-배양 플레이트로부터 흡인되고, 인간 HGF 및/또는 VEGF가 보충되거나 보충되지 않은 완전한 성장 배지로 대체된다. 시험 화합물이 적절한 농도로 첨가될 수 있다. 배지 및 시험 화합물이 통상적으로 4, 7 및 9일에 대체된다. 세포가 통상적으로 11일에 고정되고, 내피세포 네트워크가 제조업체에 의해 직접 항-CD31 면역세포화학에 의해 시각화된다. 이미지는 광학 현미경에 의해 기록되고, 이미지 분석은 다양한 혈관형성 파라미터의 정량을 달성하기 위해 적절한 소프트웨어(예를 들어, AngioSys, TCS Cellworks)를 이용하여 수행된다. 다양한 혈관형성 과정에 대한 시험 항원 결합 단백질에 의한 HGF-길항작용, VEGF-길항작용 또는 동시적 HGF-길항작용 및 VEGF-길항작용의 효과가 이에 의해 평가되고, 적절한 양성 및 음성 대조군과 비교될 수 있다.
실시예 13 - 동물 모델에서의 종양 성장의 억제
본 실시예는 예언적 실시예이다. 이는 본 발명의 항원 결합 단백질이 시험될 수 있는 추가 검정을 수행하기 위한 지침을 제공한다. 이러한 검정은 항-HGF/항-VEGF mAbdAb 또는 동물 모델에서 실험 종양 성장을 억제하는 다른 항원 결합 단백질의 능력을 평가한다. 한 통상적 실험에서, 동물(예를 들어, 마우스)에 종양 세포의 현탁액 또는 절개된 종양 단편이 접종되어 종양 성장이 개시된다. 이러한 접종 또는 이식은, 예를 들어, 피하, 근내로 특정 조직으로 수행되어, 동소 종양이 정맥내 생성될 수 있다(종양 세포 유형에 따라, 예를 들어, 두개내 또는 유방 지방 패드 내 생성). 예를 들어, 인간 종양 세포주로부터의 종양 이종이식편의 성장을 가능케 하기 위해 면역손상된 동물이 이용될 수 있다.
적절한 경로(예를 들어, 정맥내, 복막내)에 의한 mAbdAb 또는 다른 항원 결합 단백질의 투여는 종양 세포 접종 전, 종양 세포 접종과 동시, 또는 종양 세포 접종 후에 개시될 수 있다. 시험 화합물의 추가 투여는 통상적으로 실험 기간 동안 주기적으로 수행된다. 종양 성장을 억제하는데 있어서 mAbdAb 또는 다른 항원 결합 단백질의 치료 효과는 촉진가능한 종양 치수의 물리적 측정, 종양 생활력의 생물발광 이미징(적절한 루시퍼라제-발현 종양 세포주가 이용되는 경우)을 포함하는 다양한 수단, 및 면역조직화학 및 조직학적 시험을 포함하는 원발성 및 속발성 종양의 사후 검사(post mortem examination)에 의해 평가될 수 있다. 사후 검사는 항원 결합 단백질의 표적에 특이적인 다양한 종양 특징, 예를 들어, 혈관형성/미세혈관 밀도, 괴사, 인산화된 VEGF 수용체 또는 HGF 수용체의 검출에 대해 추정 치료제의 효과를 평가하는 수단을 제공할 수 있다. 추가 생물표지자의 정량은 또한, 예를 들어, 종양 부하(tumour burden) 또는 종양 성장 특징을 반영할 수 있는 HGF, VEGF 또는 다른 종양-유래 인자의 순환 수준의 검출로 수행될 수 있다.
mAbdAb로 처리된 동물의 군에서의 종양 성장의 상기 파라미터는 대조군 물질 또는 항원 결합 단백질의 조합물로 처리된 동물의 군과 비교될 수 있다.
실시예 14 - Bx - PC3 세포 cMET 인산화 검정
재조합 HGF를 이용한 혈청-고갈된 Bx-PC3 세포의 처리는 세포 용해질에서 검출가능한 HGF 수용체 cMET의 인산화를 발생시켰다. 그러므로, HGF의 중화는 추정 HGF 길항제와의 예비 인큐베이션 후에 HGF 처리된 세포로부터의 인산화된-cMET의 정량에 의해 평가될 수 있다.
Bx-PC3 세포를 글루타민 및 10% FCS가 보충된 RPMI에서 웰 당 10,000개의 세포로 Costar 96 웰 플레이트에 시딩하고, 37℃/5% C02에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 100μl PBS로 세척하고, 100μl RPMI 혈청 비함유 배지를 첨가하고, 37℃/5% C02에서 16시간 동안 추가로 인큐베이션하였다. 시험 항체를 농도 범위(6.67x10-07, 1.67x10-07, 4.2x10-08, 1.0x10-08, 2.6x10-09, 6.5x10-10, 1.6x10-10, 4.1x10-11, 1.0x10-11 M)에 걸쳐 이중으로 세포에 첨가하였다. 15분 후, 재조합 HGF를 200ng/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 37℃/5% C02에서의 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 세포를 100μl 얼음 냉각된 PBS로 세척하고, 제조업체의 설명서(Mesoscale Discovery)에 따라 MSD ELISA 방법에 의한 cMET/포스포-cMET 검출을 위해 세포 용해질을 제조하였다. 데이터는 세포 용해질 내의 전체 검출가능한 cMET의 백분율, 이중 값의 +/- SE로 표현되며, 이는 적어도 2회의 독립적 실험의 대표이다.
뮤린 항-HGF mAb S260116C12의 첨가는 HGF-매개 cMET 인산화의 용량-의존적 중화를 발생시켰다. BPC1880, BPC1881, BPC1884 및 BPC1885로 명명된 S260116C12의 인간화된 변이체를 이용한 처리에 의해 유사한 데이터가 수득되었고, 이는 HGF 중화 능력이 인간화 후에 보유된 것을 입증한다. 하이브리드 항체 대조군을 이용한 처리는 cMET 인산화에 대해 실질적 효과가 없었다. 이러한 HGF-중화 능력이 mAbdAb 포맷에서 보유된 것을 확인하기 위해, 세포를 항-HGF/항-VEGF mAbdAb 작제물 BPC1923, BPC1924, BPC1925, BPC1926(mAbs BPC1880, BPC1881, BPC1884, BPC1885에 각각 해당함)으로 처리하였다. 이들 mAbdAb는 항-VEGF dAb 모이어티와 함께 포맷화된 항-HGF 모노클로날 항체 구성요소를 함유한다. mAbdAb 작제물을 이용한 처리는 상응하는 mAb 반응 프로파일과 구별할 수 없는 HGF-매개 cMET 인산화의 용량-의존적 파괴를 발생시켰다. 관련이 없는 mAbdAb 아이소형 대조군(DMS4000)을 이용한 처리는 HGF-매개 c-Met 인산화에 효과가 없었다(도 5).
이들 데이터는 Bx-PC3 세포에서 HGF-매개 cMET 인산화를 억제하는 뮤린 항-HGF mAb S260116C12의 능력을 나타내며, 이는 인간화 후의 이의 활성 및 항-HGF/항-VEGF mAbdAb로서의 형태의 보유를 입증한다.
실시예 15 - Bx - PC3 세포 이동 검정
Oris 세포 이동 검정(Amsbio™)은 각각의 웰 내에 미리 삽입된 실리콘 시딩 마개를 갖는 멸균된 96 웰 조직 배양 플레이트로 구성된다. 세포가 첨가되고, 컨플루언스(confluence)까지 성장된다. 마개가 제거되어 원형의 세포를 함유하지 않는 영역이 남겨진다. 이동 억제제 또는 촉진물의 첨가 후에 상기 영역으로의 세포 이동이 시간 경과에 따라 모니터된다. 그러므로, 이러한 검정은 세포 이동을 조절할 수 있는 HGF를 포함하는 인자의 추정 억제제를 평가하는 수단을 제공한다.
Bx-PC3 췌장 세포를 RPMI 완전 배지 중에 웰 당 100,000개의 세포로 Oris 세포 이동 96 웰 플레이트에 플레이팅하고, 컨플루언스까지 72시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 마개를 제거하여 세포 비함유 영역을 생성시켰다. 세포를 25ng/ml HGF의 최종 농도의 재조합 HGF와 함께 다양한 농도(6.67x10-07, 1.67x10-07, 4.2x10-08, 1.0x10-08, 2.6x10-09, 6.5x10-10, 1.6x10-10, 4.1x10-11, 1.0x10-11 M)의 시험 항체와 함께 RPMI 혈청 비함유 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 비함유 영역으로의 세포 이동을 CellTracker(CellTracker™ Green CMFDA, Invitrogen #C2925)를 이용하여 세포를 형광 표지하고, 플레이트 판독기(Envision)를 이용하여 형광을 측정함으로써 정량하였다. 본래의 세포 비함유 영역의 외부의 세포로부터 유래된 형광의 배제를 제조업체의 설명서(Amsbio)에 따라 플레이트 마스크의 적용에 의해 달성하였다. 데이터는 최대 이동의 백분율로 표현되며, 이는 적어도 2회의 독립적 실험의 대표이다.
HGF를 이용한 세포의 처리는 HGF-비처리 대조군에 비해 세포 비함유 영역으로의 세포 이동의 실질적 증가를 발생시켰다. 이러한 HGF-매개 세포 이동은 뮤린 항-HGF mAb S260116C12에 의해 용량-의존적 방식으로 억제되었다. 인간화 S260116C12 변이체 BPC1873, BPC1880, BPC1881, BPC1884 및 BPC1885를 이용한 처리는 매우 유사한 억제 프로파일을 발생시켰고, 이는 인간화 후의 HGF-중화 능력의 보유를 입증한다(도 6).
실시예 16 - Vk 항- VEGF dAb의 생성
USSN 61/512,143호에 기재된 바와 같이 Vk dAb를 생성시켰다. 간단히, 인간 VEGF에 결합하는 능력을 갖는 도메인 항체(dAb)를 생성시키기 위해, Vk dAb를 디스플레이하는 파지 디스플레이 라이브러리를 이용하여 선택을 수행하였다. 비오티닐화된 rhVEGF15("가용성 선택") 및 플라스틱 표면에 고정된 rhVEGF165("수동 선택") 둘 모두에 대해 선택을 수행하였다. 증가하는 농도의 항원에 대해 통상적인 파지 패닝 기술 및 3 라운드의 선택을 이용하여, VEGF 결합 dAb의 패널을 확인하였다. 서열 분석은 76개의 독특한 Vk 서열을 확인하였다.
적절한 구조의 dAb를 확인하기 위해, dAb 서열을 포유동물 발현 벡터 내의 인간 IgG1 아이소형(파스콜리주맙(Pascolizumab); 항-IL4)의 제너릭 mAb의 중쇄의 C-말단에 클로닝하였다. dAb를 서열 GSTVAAPST로 구성된 짧은 링커 및 서열 GSTVAAPSGSTVAAPSGSTVAAPSGS로 구성된 긴 링커의 2개의 링커 중 하나를 이용하여 mAb에 연결시켰다.
dAb를 분석하여 rhVEGF에 결합하고, 재조합 VEGFR1(flt-1) 또는 VEGFR2(KDR)에 대한 VEGF 결합을 차단하는 이들의 능력을 결정하였다. 수용체 결합 검정(RBA) 데이터는 DT02-K-044 dAb(SEQ ID NO:191)가 VEGF에 단단하게 결합할 수 있을 뿐만 아니라, 플레이트-기반 검정에서 자연 수용체로의 VEGF 결합을 방지할 수 있는 것을 나타내었다.
DT02-K-044의 분리 속도(Kd)를 개선시키기 위한 시도에서, HEK 세포에서 파스콜리주맙 경쇄와 공동 발현된 파스콜리주맙-(GSTVAAPS)3-T mAb 중쇄 발현 벡터의 상황에서 친화성 성숙을 수행하고, 후보 리드(lead)를 평가하였다. 트랜스펙션 상층액 내에서 발현된 mAb-dAb를 SPR 기술(Proteon)을 이용하여 VEGF에 대한 결합에 대해 분석하였다. 샘플을 정량하지 않고, 함께 발현된 모 mAb-dAb와 비교하였다. Proteon 분석에서, 돌연변이된 클론을 각 플레이트 상의 동일 방식으로 발현된 모 클론과 비교하였다. 모든 개선은 13개의 다양화된 CDR 잔기 중 3개(S34, G51, H96(넘버링은 잔기 1로서 Vk dAb의 첫번째 잔기(Asp)를 기초로 함))에 집중되었다. 이들 3개의 위치 중, 위치 S34 및 H96에서의 치환이 가장 현저(Proteon 분석 및 HUVE 증식 검정에서 KD 개선 관련)했다. 하기 표 4는 DT02-K-044 모 dAb에 비해 친화성이 현저하게 향상된 특정 위치에 대한 KD(nM 단위)의 Proteon 평가를 나타낸다(표 4).
표 4: DT02-K-044(SEQ ID NO:191)의 친화성 성숙된 변이체
Figure pct00008
단독으로 이로운 상기 돌연변이가 추가로 이로울 수 있는지의 여부를 결정하기 위해, 특히 DT02-K-044-251(S34K + H96E, SEQ ID NO:192) 및 DT02-K-044-255 (S34K + H96K, SEQ ID NO:193)로 확인된 이중 돌연변이를 확인하는, 상기 변화를 조합시킨 조합 돌연변이를 작제하였다.
바람직한 단일 돌연변이 DT02-K-044-085(S34K, SEQ ID NO:194)와 함께 상기 두 dAb를 인간 혈청 알부민으로부터 유래된 21개의 아미노산 링커 서열을 포함하는 다양한 링커를 이용하여 파스콜리주맙에 대한 융합체로 발현시켰다. 이들 3개의 작제물을 수용체 결합 검정, HUVEc 증식 검정에서 효능, 및 Biacore SPR에 의한 운동 친화성에 대해 시험하였다. 3개 모두의 분자는 낮은 pM 범위에서 모 분자에 비해 현저하게 향상된 친화성을 나타내었다.
서열 인식자
표 5: 아미노산 및 DNA 서열의 서열 인식자 번호
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
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서열
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Figure pct00030
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Figure pct00032
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Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
SEQUENCE LISTING <110> Griggs, Jeremy Shah, Radha Steward, Michael <120> ANTIGEN BINDING PROTEINS <130> PB64390 <140> US 61/416844 <141> 2010-11-24 <160> 196 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 57 <212> DNA <213> Homo Sapiens <400> 1 atgggctggt cctgcatcat cctgtttctg gtggccaccg ccaccggcgt gcacagc 57 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400> 2 Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly 1 5 10 15 Val His Ser <210> 3 <211> 340 <212> DNA <213> Mus-musculus <400> 3 cagattcagc tgcggcagtc tggagctgga ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagctt 60 tcctgcaagg ctactggcta cacattcact ggctactgga tagagtgggt aaagcagagg 120 cctggacatg accttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtac tactaactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac aactgaggac tctgccatct attactgtgc aagggggggt 300 tattactacg gtagtagcta cgactcctgg ggccaaggca 340 <210> 4 <211> 113 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 4 Gln Ile Gln Leu Arg Gln Ser Gly Ala Gly Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly <210> 5 <211> 336 <212> DNA <213> Mus-musculus <400> 5 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atctcctgca gagccagtga aagtgtcagt attcatggta ctcatttaat gcactggtac 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa cctagaatct 180 ggagtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgagacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatgc tgcaacctat ttctgtcagc aaagtattga ggatccgtac 300 acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaacgg 336 <210> 6 <211> 112 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 6 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His 20 25 30 Gly Thr His Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Ile 85 90 95 Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 7 <211> 343 <212> DNA <213> Mus-musculus <400> 7 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagctt 60 tcctgcaagg ctactggcta cacattcact ggctactgga tagagtgggt aaagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtag tactaactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac aactgaggac tctgccatct attactgtgc aagagggggg 300 tatggttacc acgacgcctg gtttgcttac tggggccaag gac 343 <210> 8 <211> 114 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Gly Tyr His Asp Ala Trp Phe Ala Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly <210> 9 <211> 315 <212> DNA <213> Mus-musculus <400> 9 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 atgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca atcaaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 ccgtacacgt tcgga 315 <210> 10 <211> 105 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 10 Asp Ile Val Met Ser Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser 20 25 30 Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln 35 40 45 Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80 Ile Ser Ser Val Lys Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln 85 90 95 Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly 100 105 <210> 11 <211> 339 <212> DNA <213> Mus-musculus <400> 11 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagctt 60 tcctgcaagg ctactggcta cacattcact ggctactgga tagagtgggt aaagcagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagtggtag tactaactac 180 aatgagaagt tcaagggcaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac aactgaggac tctgccatct attactgtgc aagggggggt 300 tattactacg gtagtagctt tgactactgg ggccaaggc 339 <210> 12 <211> 113 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 12 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly <210> 13 <211> 327 <212> DNA <213> Mus-musculus <400> 13 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctctagggga acgggtcacc 60 atgacctgca ctgccagctc aagtgtaagt tccagttact tgcactggta ccagcagaag 120 ccaggatcct cccccaaact ctggatttat agcacatcca acctggcttc tggagtccca 180 gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc tcttactctc tcacaatcag cagcatggag 240 gctgaagatg ctgccactta ttactgccac cagtatcatc gttccccgct cacgttcggt 300 gctgggacca agctggagct gaaacgg 327 <210> 14 <211> 109 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 14 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45 Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80 Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr His Arg Ser Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 <210> 15 <211> 360 <212> DNA <213> Mus-musculus <400> 15 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctgatgaagc ctggggcctc agtgaagctt 60 tcctgcaagg ctactggcta cacattcact ggctactgga tagagtgggt aaaacagagg 120 cctggacatg gccttgagtg gattggagag attttacctg gaagttctag tactaactac 180 aatgagaagt tcaaggacaa ggccacattc actgcagata catcctccaa cacagcctac 240 atgcaactca gcagcctgac aactgaggac tctgccatct attactgtgc aagaggggga 300 tattactacg gtagtcctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 16 <211> 120 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 16 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Ser Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 17 <211> 318 <212> DNA <213> Mus-musculus <400> 17 caaattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60 atgacctgca gtgccaggtc aagtgtaagt tacatgcact ggtaccagca gaagtcaggc 120 acctccccca aaagatggat ttatgacaca tccaaactgg cttctggagt ccctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacctcttac tctctcacaa tcagcagcat ggaggctgaa 240 gatgctgcca cttattactg ccagcagtgg agtagtaacc cacccacgtt cggtggaggc 300 accaagctgg aaatcaaa 318 <210> 18 <211> 106 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 18 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 19 Gly Tyr Trp Ile Glu 1 5 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 20 Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 21 <211> 11 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 21 Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Asp Ser 1 5 10 <210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 22 Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Ile His Gly Thr His Leu Met His 1 5 10 15 <210> 23 <211> 7 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 23 Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 24 Gln Gln Ser Ile Glu Asp Pro Tyr Thr 1 5 <210> 25 <211> 5 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 25 Gly Tyr Trp Ile Glu 1 5 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 26 Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 12 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 27 Gly Gly Tyr Gly Tyr His Asp Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 28 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 29 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 30 Gln Gln Tyr Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 31 <211> 5 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 31 Gly Tyr Trp Ile Glu 1 5 <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 32 Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 33 <211> 11 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 33 Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 34 <211> 12 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 34 Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu His 1 5 10 <210> 35 <211> 7 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 35 Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 36 <211> 9 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 36 His Gln Tyr His Arg Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 37 Gly Tyr Trp Ile Glu 1 5 <210> 38 <211> 17 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 38 Glu Ile Leu Pro Gly Ser Ser Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Asp <210> 39 <211> 11 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 39 Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Pro Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 40 Ser Ala Arg Ser Ser Val Ser Tyr Met His 1 5 10 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 41 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 42 <211> 9 <212> PRT <213> Mus-musculus <400> 42 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 43 <211> 1350 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> murine-human chimeric heavy chain <400> 43 cagatccagc tgcgccagtc cggcgccggc ctgatgaagc ccggcgcctc cgtgaagctg 60 tcctgcaagg ccaccggcta caccttcacc ggctactgga tcgagtgggt gaagcagcgc 120 cccggccacg acctggagtg gatcggcgag atcctgcccg gctccggcac caccaactac 180 aacgagaagt tcaagggcaa ggccaccttc accgccgaca cctcctccaa caccgcctac 240 atgcagctgt cctccctgac caccgaggac tccgccatct actactgcgc ccgcggcggc 300 tactactacg gctcctccta cgactcctgg ggccagggca cactagtgac cgtgtccagc 360 gccagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 420 ggcacagccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgaaccggt gaccgtgtcc 480 tggaacagcg gagccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 540 ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc 600 tacatctgta acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 660 aagagctgtg acaagaccca cacctgcccc ccctgccctg cccccgagct gctgggaggc 720 cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagcct aaggacaccc tgatgatcag cagaaccccc 780 gaggtgacct gtgtggtggt ggatgtgagc cacgaggacc ctgaggtgaa gttcaactgg 840 tacgtggacg gcgtggaggt gcacaatgcc aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 900 agcacctacc gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggattggct gaacggcaag 960 gagtacaagt gtaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgccc ctatcgagaa aaccatcagc 1020 aaggccaagg gccagcccag agagccccag gtgtacaccc tgccccctag cagagatgag 1080 ctgaccaaga accaggtgtc cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 1140 gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccctgtg 1200 ctggacagcg atggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcagatgg 1260 cagcagggca acgtgttcag ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa tcactacacc 1320 cagaagagcc tgagcctgtc ccctggcaag 1350 <210> 44 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> murine-human chimeric heavy chain <400> 44 Gln Ile Gln Leu Arg Gln Ser Gly Ala Gly Leu Met Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Thr Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Trp Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly His Asp Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Phe Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Thr Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Asp Ser Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 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Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp 530 535 540 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Pro Arg Lys Leu Asp Tyr Trp 545 550 555 560 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 565 570 <210> 173 <211> 642 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> domain antibody <400> 173 gatatccaga tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcct ctgtgggcga tagagtgacc 60 atcacctgcc gggccagcca gggcatcaga aactacctgg cctggtatca gcagaagcct 120 ggcaaggccc ctaagctgct gatctacgcc gccagcaccc tgcagagcgg cgtgcccagc 180 agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240 gaggacgtgg ccacctacta ctgccagcgg tacaacagag ccccttacac cttcggccag 300 ggcaccaagg tggagatcaa gcgtacggtg gccgccccca gcgtgttcat cttccccccc 360 agcgatgagc agctcaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gtctgctgaa caacttctac 420 ccccgggagg ccaaagtgca gtggaaagtg gacaacgccc tgcagagcgg caacagccag 480 gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac tccacctaca gcctgagcag caccctgacc 540 ctgagcaagg ccgactacga gaagcacaaa gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 600 ctgtccagcc ccgtgaccaa gagcttcaac cggggcgagt gc 642 <210> 174 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> domain antibody <400> 174 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr 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gaaggtggag 660 cccaagagct gtgacaagac ccacacctgc cccccctgcc ctgcccccga gctgctggga 720 ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cctaaggaca ccctgatgat cagcagaacc 780 cccgaggtga cctgtgtggt ggtggatgtg agccacgagg accctgaggt gaagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaat gccaagacca agcccaggga ggagcagtac 900 aacagcacct accgggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggattg gctgaacggc 960 aaggagtaca agtgtaaggt gtccaacaag gccctgcctg cccctatcga gaaaaccatc 1020 agcaaggcca agggccagcc cagagagccc caggtgtaca ccctgccccc tagcagagat 1080 gagctgacca agaaccaggt gtccctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac caccccccct 1200 gtgctggaca gcgatggcag cttcttcctg tacagcaagc tgaccgtgga caagagcaga 1260 tggcagcagg gcaacgtgtt cagctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caatcactac 1320 acccagaaga gcctgagcct gtcccctggc aag 1353 <210> 176 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> antibody heavy chain <400> 176 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 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191 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Pro Glu 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Gly Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Tyr Tyr Pro His 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 192 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> domain antibody <400> 192 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Pro Glu 20 25 30 Leu Lys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Gly Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 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Claims (16)

  1. 하나 이상의 에피토프-결합 도메인에 연결된 적어도 하나의 쌍을 이룬 VH/VL 도메인을 포함하는 항원-결합 단백질로서,
    상기 항원-결합 단백질이 적어도 2개의 항원 결합 부위를 포함하고, 이러한 항원 결합 부위 중 적어도 하나가 적어도 하나의 에피토프 결합 도메인에 의해 제공되고, 항원 결합 부위 중 적어도 하나가 적어도 하나의 쌍을 이룬 VH/VL 도메인에 의해 제공되며,
    쌍을 이룬 VH/VL 도메인 또는 각각의 쌍을 이룬 VH/VL 도메인이 HGF에 특이적으로 결합하고, SEQ ID NO:92, 94, 96 또는 98의 VH 아미노산 서열을 포함하는, 항원-결합 단백질.
  2. 제 1항에 있어서, 쌍을 이룬 VH/VL 도메인 또는 각각의 쌍을 이룬 VH/VL 도메인이 SEQ ID NO:100 또는 102의 VL 아미노산 서열을 포함하는 항원-결합 단백질.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 에피토프-결합 도메인에 연결된 2개의 쌍을 이룬 VH/VL 도메인을 포함하는 항원-결합 단백질.
  4. 제 3항에 있어서, IgG 스캐폴드를 포함하며, 이러한 IgG 스캐폴드가 쌍을 이룬 VH/VL 도메인의 하나의 VH를 각각이 포함하는 2개의 중쇄, 및 쌍을 이룬 VH/VL 도메인의 하나의 VL을 각각이 포함하는 2개의 경쇄를 포함하는 항원-결합 단백질.
  5. 제 3항에 있어서, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 항체를 포함하며, 상기 중쇄가 SEQ ID NO:78, 80, 82 또는 84의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄가 SEQ ID NO:86 또는 88의 아미노산 서열을 포함하는 항원-결합 단백질.
  6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 에피토프 결합 도메인 중 하나가 각각의 중쇄의 N-말단 또는 C-말단에 연결된 항원-결합 단백질.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 에피토프 결합 도메인 중 하나가 각각의 중쇄의 C-말단에 연결된 항원-결합 단백질.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프 결합 도메인이 1 내지 20개의 아미노산의 링커에 의해 항원-결합 도메인에 연결된 항원-결합 단백질.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 결합 도메인이 하나 이상의 항원에 대해 특이성을 가지며, 임의로 항원-결합 단백질이 HGF 및 VEGF에 결합할 수 있는 항원-결합 단백질.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프 결합 도메인 중 적어도 하나가 VEGF에 대해 특이성을 갖는 항원 결합 단백질.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 4개의 에피토프 결합 도메인을 포함하고, 임의로 에피토프 결합 도메인 중 2개가 동일 항원에 대해 특이성을 갖는 항원-결합 단백질.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 4개의 항원 결합 부위를 갖는 항원-결합 단백질.
  13. 제 8항에 있어서, 에피토프 결합 도메인 중 적어도 하나가 SEQ ID NO:163 내지 170 또는 187-190, 195 또는 196에 기재된 링커, 또는 이의 임의의 다합체 또는 조합물 중 어느 하나로부터 선택된 링커를 추가로 포함하는 항원-결합 단백질.
  14. 제 1항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 에피토프 결합 도메인 중 적어도 하나가 인간 혈청 알부민에 결합하는 항원-결합 단백질.
  15. SEQ ID NO:90, 92, 94, 96 또는 98의 VH 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO:100 또는 102의 VL 서열을 갖는 경쇄를 포함하는 항-HGF 항체, 및 1 내지 20개의 아미노산을 포함하는 링커에 의해 상기 항체에 연결된 적어도 하나의 에피토프 결합 도메인을 포함하며, 이러한 에피토프 결합 도메인이 VEGF에 특이적으로 결합하는, 항원-결합 단백질.
  16. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 항원-결합 단백질 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물.
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