CZ299561B6 - Chinazolinaminový derivát a farmaceutický prostredek - Google Patents

Abstract

Predmetem rešení jsou ditosylátové soli 4-chinazolinaminu obecného vzorce II, jejich použití pro lécení onemocnení charakterizovaných odchylnou aktivitou proteinových kináz ze skupiny erbB a zpusob jejich výroby.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká chinazolinových sloučenin, jejich bezvodých a hydratovaných ditosylátových solí stejně jako použití uvedených sloučenin. Vynález se zvláště týká ditosylátových solí 4-chinazolinaminů. Tyto sloučeniny jsou inhibitory různých proteinových tyrosinkináz (PTK) skupiny receptorů epidermálního růstového faktoru (ErbB) a jsou tedy použitelné při léčení poruch podmíněných odchylnou aktivitou těchto kináz.

Dosavadní stav techniky

Proteinové tyrosinkinázy (kinázy PTK) katalyzují fosforylací specifických tyrosylových zbytků v různých proteinech, které se účastní regulace růstu a diferenciace buněk (A. F. Wilks, Progress in Growth Factor Research, 2:97-111, 1990; S. A. Courtneidge, Dev. dod. 1:57-64, 1993; J. A. Cooper, Semin. Cell Biol, 5(6):377-387, 1994; R. F. Paulson, Semin. Immunol, 7(4):267-277, 1995; A. C. Chán, Curr. Opin. Immunol., 8(3):394-401, 1996). Nesprávná nebo neřízená aktivace mnoha kináz PTK, tj. odchylná aktivita PTK, způsobená například nadměrnou expresí nebo mutací, vede podle výzkumů k nekontrolovanému růstu buněk.

Předpokládá se, že odchylná aktivita proteinových tyrosinkináz (PTK) má podíl na řadě poruch včetně lupénky, revmatoidní artritidy, bronchitidy i rakoviny. Vývoj účinných způsobů léčení těchto onemocnění má v oboru lékařství trvalý a stoupající trend. Skupina ErbB kináz PTK, která zahrnuje c-ErbB-2, homolog 2 virového onkogenu erythroblastické leukemie, EGFr, epidermální růstový faktor, a ErbB-4, homolog 4 virového onkogenu erythroblastické leukemie, je skupina kináz PTK, která vyvolává pozornost jako cíl terapeutického působení. V současnosti je zvláště zajímavé studium úlohy skupiny ErbB kináz PTK v hyperproliferativních onemocněních, zvláště lidských maligních onemocněních. Zvýšená aktivita EGFr se například předpokládá při rakovinách jiných než malých plicních buněk, močového měchýře, hlavy a krku. Navíc se předpokládá úloha zvýšené aktivity c-ErbB-2 při rakovině mléčné žlázy, vaječníků, žaludku a pankreatu.

Inhibice skupiny ErbB kináz PTK by mohla tedy poskytnout cestu k léčení onemocnění charakterizovaných odchylnou aktivitou skupiny ErbB kináz PTK. Biologická úloha skupiny ErbB kináz PTK a jejich předpokládaná účast v různých stavech onemocnění se diskutuje například v patentu US 5 773 476; mezinárodní patentové přihlášce WO 99/35146; článcích M.C. Hung a další, Seminars in Oncology, 26:4, dod. 12 (srpen) 1999, 51-59; Ullrich a další, Cell, 61:203-212, 20. duben 1990; Modjtahedi a další, Inťl. J. of Oncology, 13:335-342, 1998; a J. R. Woodbum, Pharmacol. Ther., 82:2-3, 241-250, 1999.

Mezinárodní patentová přihláška PCT/EP99/00048 podaná 8. ledna 1999 a zveřejněná jako WO 99/35146 15. července 1999 diskutuje kinázy PTK včetně skupiny ErbB kináz PTK. Tato zveřejněná přihláška popisuje bicyklické heteroaromatické sloučeniny včetně N-{3-chlor-A-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-({[2-(methansulfbnyl)ethyl]-aminojmethyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminu; N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[2-({[2-(methansulfonyl)ethyl]amino}methy 1 )-thiazoM-yl]-4-chinazolinaminu; a N-{ 3-brom-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl }-6-[5({[2-(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-furan-2-yl]-4-chinazolin-aminu, včetně jejich hydrochloridových solí. Tyto sloučeniny se vyznačují inhibiční aktivitou proti skupině ErbB kináz PTK. Problémy se však vyskytují u dihydrochloridových solí, které sorbují značná množství vody v rozmezí vlhkostí, kterým mohou být vystaveny (např. 20 až 75 % relativní vlhkosti (RH)), pokud se použijí jako farmaceutické prostředky. V důsledku toho se snižuje vhodnost této sloučeniny jako farmaceutického prostředku, pokud se nezavedou zvláštní opatření při manipulaci a skladování.

- 1 CZ 299561 B6

Autoři předkládaného vynálezu nyní identifikovali nové ditosylátové soli 4-chinazolinaminů, které jsou vhodné jako inhibitory skupiny ErbB kinázPTK. Tyto ditosylátové soli mají daleko lepší vlastnosti z hlediska sorpce vlhkosti ve srovnání s dihydrochloridovými solemi 4-chinazolinaminů popsanými v oboru. Navíc mohou být tyto sloučeniny připraveny v krystalické formě, a proto mají zlepšenou fyzikální stabilitu. To znamená, že ditosylátové soli podle předkládaného vynálezu sorbují mnohem nižší množství vody, pokud jsou vystaveny širokému rozmezí vlhkostí, a mohou být připraveny ve fyzikálně stabilní krystalické formě, což zlepšuje jejich vhodnost jako farmaceutických prostředků.

Podstata vynálezu

Sloučenina II podle předkládaného vynálezu je konkrétním provedením sloučeniny obecného vzorce I

O) a její bezvodé nebo hydrátové formy, kde Ri je Cl nebo Br; X je CH, N, nebo CF; a Het je thiazol nebo furan.

V prvním provedení předkládaného vynálezu se poskytuje sloučenina obecného vzorce II

2CZ 299561 B6

Ve druhém provedení předkládaného vynálezu se poskytuje farmaceutický prostředek obsahující terapeuticky účinné množství sloučeniny obecného vzorce II v bezvodé nebo hydrátové formě.

Ve třetím provedení předkládaného vynálezu se poskytuje sloučenina obecného vzorce II, nebo její bezvodé nebo hydrátové formy pro použití v lékařství.

Ve čtvrtém provedení předkládaného vynálezu se poskytuje použití sloučeniny obecného vzorce II a jejích bezvodých nebo hydrátových forem při výrobě farmaceutického prostředku pro použití pro léčení onemocnění charakterizovaného odchylnou aktivitou PTK ze skupiny ErbB.

Podrobný popis vynálezu

Jak se zde užívá, termín „účinné množství“ znamená takové množství léčiva nebo farmaceutického prostředku, které vyvolá biologickou nebo lékařskou odpověď tkáně, systému, zvířete nebo člověka, která je požadována například výzkumným pracovníkem nebo lékařem. Termín „terapeuticky účinné množství“ navíc znamená jakékoli množství, které v porovnání s odpovídajícím subjektem, který toto množství nedostal, vede ke zlepšenému léčení, hojení, prevenci nebo zmír20 nění onemocnění, poruchy nebo vedlejšího účinku, nebo pokles rychlosti postupu onemocnění nebo poruchy. Tento termín také zahrnuje množství účinné pro zlepšení normální fyziologické funkce.

Jak se zde používá, termín „alkyl“ označuje uhlovodík s přímým nebo rozvětveným řetězcem obsahující od 1 do 12 atomů uhlíku. Příklady termínu „alkyl“, jak se zde používá, zahrnují bez omezení methyl, ethyl, isopropyl, n-propyl, n-butyl, n-pentyl, isobutyl apod.

Je zřejmé, že následující provedení se týkají sloučenin v rámci obecného vzorce I a vzorců II, III nebo IV jak je zde definováno, pokud to není specificky omezeno definicí každého vzorce nebo specificky omezeno jiným způsobem. Je také zřejmé, že provedení předkládaného vynálezu včetně použití, prostředků a způsobů výroby popisované v přihlášce, i když se popisují na sloučeninách obecného vzorce I jsou použitelná na sloučeniny vzorců II, III a IV.

Jak je uvedeno výše, sloučeniny podle předkládaného vynálezu zahrnují sloučeniny obecného vzorce I nebo jejich bezvodé nebo hydrátové formy, kde Ri je Cl nebo Br; X je CH, N, nebo CF;

a Het je furan nebo thiazol.

Postranní řetězec CH3SO2CH2CH2NHCH2 sloučenin vzorce I může být navázán na jakoukoli vhodnou polohu skupiny Het. Podobně fenylová skupina chinazolinového jádra může být navázána na jakoukoli vhodnou polohu skupiny Het.

V jednom provedení Ri je Cl; X je CH; a Het je furan; s výhodou je sloučenina vzorce II a v bezvodé nebo hydrátové formě.

Sloučenina vzorce II má chemický název ditosylát N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6⁴⁵ [5-({[2-(methansuIfonyl)ethyl]amino}methyI)-2-furyl]^l-chinazolinaminu.

Vjednom provedení je sloučeninou monohydrátová forma vzorce II. Vjednom provedení má monohydrátová forma obsah vody 1,5 až 3,0, s výhodou 1,7 až 2,5, výhodněji 1,8 až 2,2% hmotnostního.

V dalším provedení je sloučeninou bezvodá forma sloučeniny vzorce II. V jednom provedení má bezvodá forma obsah vody menší než 1,5, s výhodou menší než 1,0, ještě výhodněji menší než 0,5 % hmotnostního.

-3CZ 299561 B6

V dalším provedení je sloučeninou sloučenina vzorce II charakterizovaná podle příkladu 9, viz také obr. 1, obrazem rentgenové práškové difrakce včetně vrcholů uvedených v tabulce I.

Tabulka I

Dvě theta (°) *	Vzdálenosti d (10 °m)
4,8	18
8,7	10
18,0	4,9
18,9	4,7
21,0	4,2
22,3	4,0

* Založeno na záření Cu Ka. Ka2 bylo před lokalizací vrcholu odstraněno, 1 Á=10 ^I0m

V dalším provedení je sloučeninou sloučenina vzorce II charakterizovaná podle příkladu 10, viz také obr. 2, obrazem rentgenové práškové difrakce včetně vrcholů uvedených v tabulce II.

Tabulka II

Dvě theta (°) *	Vzdálenosti d (io '°m)
6,6	13
8,3	10
11,5	7,7
18,1	4,9
21,1	4,2

* Založeno na záření Cu Ka. Ka2 bylo před lokalizací vrcholu odstraněno. 1 Á=10 ¹⁰m

V alternativním povedení Ri je Cl; X je CH; a Het je thiazol; s výhodou sloučenina vzorce III bezvodé nebo hydrátové formě.

OH)

-4CZ 299561 B6

V dalším alternativním provedení Rj je Br; X je CH; a Het je furan; s výhodou sloučenina vzorce IV v bezvodé nebo hydrátové formě.

Sloučenina vzorce IV je ditosylát 'N-{3-brom-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-(([2(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)furan-2-yl]-4-chinazolinaminu.

Sloučeniny obecného vzorce I včetně sloučenin vzorců II, III a IV zahrnují v podstatě čisté bezvodé nebo hydrátové formy stejně jako směsi hydrátových a bezvodých forem. Je také zřejmé, že tyto sloučeniny zahrnují krystalické nebo amorfní formy a směsi krystalických a amorfních forem.

I když je možné, aby byla pro použití v lékařství podávána terapeuticky účinná množství slouče15 niny obecného vzorce I stejně jako jejích bezvodých nebo hydrátových forem, ve formě čisté chemické sloučeniny, je možné předkládat účinnou složku ve formě farmaceutického prostředku. Vynález tedy dále poskytuje farmaceutické prostředky, které obsahují terapeuticky účinná množství sloučenin obecného vzorce I ajejich bezvodých nebo hydrátových forem, a jeden nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů, řediv nebo pomocných látek. Sloučeniny obecného vzorce I a jejich bezvodé nebo hydrátové formy jsou jak popsáno výše. Jeden nebo více nosičů, řediv nebo pomocných látek musí být přijatelné ve smyslu kompatibility s jinými složkami prostředku a nesmí mít škodlivé účinky na příjemce. Podle dalšího provedení vynálezu se také poskytuje způsob výroby farmaceutického prostředku zahrnující míchání sloučeniny obecného vzorce I, nebo jejích bezvodých nebo hydrátových forem s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči, ředivy nebo pomocnými látkami.

Sloučeniny obecného vzorce I v bezvodé nebo hydrátové formě mohou být formulovány pro podávání jakýmkoli způsobem, přičemž vhodný způsob bude záviset na léčeném onemocnění i na léčeném pacientovi. Vhodné farmaceutické prostředky zahrnují prostředky pro orální, rektální, nazální, topické (včetně bukálního, sublingválního a transdermálního), vaginální nebo parenterální (včetně intramuskulámího, subkutánního, intravenózního, a podání přímo do postižené tkáně) podávání, nebo prostředky ve formě vhodné pro podávání inhalací nebo insuflací. Tyto prostředky mohou být v případě potřeby předkládány v diskrétních dávkových jednotkách a mohou být připraveny jakýmkoli způsobem známým v oboru farmacie.

Farmaceutické prostředky upravené pro orální podávání mohou být předkládány jako diskrétní jednotky jako jsou kapsle nebo tablety; prášky nebo granule; roztoky nebo suspenze ve vodných nebo nevodných kapalinách; jedlé pěny nebo našlehané hmoty; nebo kapalné emulze typu olej ve vodě nebo voda v oleji.

-5CZ 299561 B6

Například pro orální podávání ve formě tablet nebo kapslí, může být určená složka léčiva kombinována s orálním netoxickým farmaceuticky přijatelným inertním ředivem jako je ethanol, glycerol, voda apod. Prášky jsou připravovány rozdrcením sloučeniny na vhodnou jemnozmnou velikost a mícháním s podobně rozdrceným farmaceutickým nosičem jako je jedlý sacharid, jako například škrob nebo mannitol. Mohou být také přítomny barviva, ochranné látky, dispergační látky a příchuti.

Kapsle se vyrábějí přípravou práškové směsi jak bylo popsáno výše a plněním hotových želati10 nových obálek. Do práškové směsi před plněním mohou být přidána mazadla a kluzné látky jako je koloidní oxid křemičitý, talek, stearan hořečnatý, stearan vápenatý nebo pevný polyethylenglykol. Pro zlepšení dostupnosti léčiva při spolknutí kapsle může být také přidán desintegrující nebo solubilizační prostředek jako je agar-agar, uhličitan vápenatý nebo uhličitan sodný.

Do směsi mohou být navíc v případě potřeby přidány vhodná pojivá, kluzné látky, rozvolňovadla a barviva. Mezi vhodná pojivá patří škrob, želatina, přírodní cukry jako je glukóza nebo betalaktóza, kukuřičná sladidla, přírodní a syntetické gumy jako je akácie, tragakant nebo alginát sodný, karboxymethylcelulóza, polyethylenglykol, vosky apod. Mazadla použitá v těchto dávkových formách zahrnují oleát sodný, stearan sodný, stearan hořečnatý, benzoan sodný, octan sodný, chlorid sodný apod. Mezi rozvolňovadla patří bez omezení škrob, methylcelulóza, agar, bentonit, xantanová guma apod. Tablety se formulují například připravením práškové směsi, granulaci nebo vytvořením kaše, přidáním kluzné látky a rozvolňovadla a vylisováním do tablet. Prášková směs se připraví míšením vhodně rozdrcené sloučeniny s ředivem nebo základem jako bylo popsáno výše, a popřípadě s pojivém jako je karboxymethylcelulóza, alginát, želatina nebo polyvinylpyrrolidon, látkou zpomalující rozpouštění jako je parafin, látkou urychlující resorpci jako je kvarterní sůl a/nebo absorpčním prostředkem jako je bentonit, kaolin nebo hydrogenfosforečnan vápenatý. Prášková směs může být granulována navlhčením s pojivém jako je sirup, škrobová pasta, akáciový sliz nebo roztoky celulózy nebo polymemích materiálů, a protlačením přes síto. Alternativně ke granulaci může být prášková směs zpracována na tabletovacím stroji a výsledkem jsou nedokončené výlisky rozbité na granule. Granule mohou být mazány pro zabránění nalepení na raznice pro tvorbu tablet přídavkem kyseliny stearové, stearanové soli, talku nebo minerálního oleje. Mazaná směs se potom lisuje na tablety. Sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také kombinovány se sypkým inertním nosičem a lisovány do tablet přímo bez granulace nebo lisování. Mohou být opatřeny čirým nebo průsvitným ochranným povlakem složeným z těsnicího povlaku šelaku, povlaku cukru nebo polymemího materiálu a lešticím povlakem na bázi vosku. Do těchto povlaků mohou být přidávána barviva, aby bylo možné rozlišit mezi různými jednotkovými dávkami.

Orální kapaliny jako jsou roztoky, sirupy a elixíry, mohou být připraveny v dávkové jednotce vytvořené tak, že dané množství obsahuje určené množství sloučeniny. Sirupy mohou být připraveny rozpuštěním sloučeniny ve vhodně ochuceném vodném roztoku, zatímco elixíry se připravují použitím netoxického alkoholového vehikula. Suspenze mohou být vytvořeny dispergací sloučeniny v netoxickém vehikulu. Mohou být také přidány solubilizační látky a emulgátory jako jsou ethoxylované isostearylalkoholy a polyoxyethylensorbitolethery, ochranné látky, ochucovací aditiva jako je mátový olej nebo přírodní sladidla nebo sacharin nebo jiná umělá sladidla apod.

V případě potřeby mohou být jednotkové dávkové formy pro orální podávání převedeny do formy mikropouzder. Tato formulace může být také připravena pro prodloužení nebo zpomalení uvolňování, jako například potažením nebo zapouzdřením materiálu ve formě částic do polyme50 rů, vosku apod.

Sloučeniny obecného vzorce I a bezvodé nebo hydrátové formy mohou být také podávány ve formě dodávacích systémů na bázi liposomů, jako jsou malé jednovrstvé váčky, velké jednovrstvé váčky a vícevrstvé váčky. Liposomy mohou být vytvořeny z řady fosfolipidů jako je cholesterol, stearylamin nebo fosfatidylcholiny.

-6CZ 299561 B6

Sloučeniny obecného vzorce I a jejich bezvodé a hydrátové formy mohou být také dodávány použitím monoklonálních protilátek jako individuálních nosičů, na které jsou molekuly sloučeniny navázány. Sloučeniny mohou být také spojeny s vhodnými polymery nebo nosiči léčiv umožňujícími cílené působení. Tyto polymery mohou zahrnovat polyvinylpyrrolidon, pyranový kopolymer, polyhydroxypropyl-methakrylamidfenol, polyhydroxyethylaspartamidfenol, nebo polyethylenoxidpolylysin substituovaný palmitoylovými zbytky. Sloučeniny mohou být navíc navázány na skupinu biologicky degradovatelných polymerů použitelných pro dosažení řízeného uvolňování léčiva, jako je například kyselina polymléčná, polepsilonkaprolakton, kyselina poly10 hydroxymáselná, polyorthoestery, polyacetaly, polydihydropyrany, polykyanoakryláty a zesítěné nebo amfipatické blokové kopolymery hydrogelů.

Farmaceutické prostředky upravené pro transdermální podávání mohou být ve formě diskrétních náplastí určených pro udržení těsného kontaktu s epidermis příjemce po delší dobu. Účinná složka může být z náplasti dodávána iontoforézou, jak se obecně popisuje v článku Pharmaceutical Research, 3(6), 318 (1986).

Farmaceutické prostředky upravené pro místní podávání mohou být formulovány jako masti, krémy, suspenze, mléka, prášky, pudry, roztoky, pasty, gely, spreje, aerosoly nebo oleje.

Pro léčení oka nebo jiných vnějších tkání, např. ústní dutiny a kůže, se formulace s výhodou aplikují ve formě masti nebo krému pro místní použití. Při formulaci ve formě masti může být účinná složka použita buď spolu s parafinovým, nebo s vodou mísitelným masťovým základem. Účinná složka může být alternativně formulována ve formě krému s krémovým základem typu olej ve vodě nebo základem typu voda v oleji.

Farmaceutické prostředky upravené pro místní podávání do oka zahrnují oční kapky, ve kterých je účinná složka rozpuštěná nebo suspendovaná ve vhodném nosiči, zvláště ve vodném rozpouštědle.

Mezi farmaceutické prostředky upravené pro místní podávání v ústech patří pilulky, pastilky a ústní vody.

Farmaceutické prostředky upravené pro rektální podávání mohou být ve formě čípků nebo nálevů.

Farmaceutické prostředky upravené pro nosní podávání, kde nosičem je pevná látka, zahrnují hrubý prášek s velikostí částic například v rozmezí 20 až 500 pm, který se podává způsobem podobným šňupání, tj. rychlým vdechnutím přes nosní dutinu z nádobky obsahující prášek držené těsně u nosu. Vhodné formulace, ve kterých je nosičem kapalina a které jsou vhodné pro podávání jako nosní sprej nebo nosní kapky, zahrnují vodné nebo olejové roztoky účinné složky.

Farmaceutické prostředky upravené pro inhalační podávání zahrnují jemnozmné prášky nebo mlhy, které mohou být vytvářeny pomocí různých typů tlakových aerosolů s odměřovanou dávkou, nebulizátorů nebo insuflátorů.

Farmaceutické prostředky upravené pro vaginální podávání mohou být ve formě tamponů, krémů, gelů, past, pěn nebo ve formě spreje.

Mezi farmaceutické prostředky upravené pro parenterální podání patří vodné a nevodné sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostatické látky a rozpuštěné látky, které umožní dosažení isotonického stavu s krví zamýšleného příjemce; a vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou obsahovat suspendující prostředky a zahušťující látky. Tyto formulace mohou být předkládány v zásobnících pro jednu dávku nebo větší počet dávek, například v uzavřených ampulích a lahvičkách, a mohou být uchovávány v lyofilizovaném stavu, který

-7CZ 299561 B6 vyžaduje pouze přidání sterilního kapalného nosiče, například vody pro injekce, bezprostředně před použitím. Injekční roztoky a suspenze připravované před použitím mohou být připraveny ze sterilních prášků, granulí a tablet.

Je třeba rozumět, že navíc ke složkám, které byly konkrétně uvedeny výše, mohou formulace obsahovat další v oboru běžné prostředky, přičemž se bere ohled na typ příslušné formulace, například prostředky vhodné pro orální podávání mohou obsahovat ochucovací látky.

Popisovaná odchylná aktivita PTK je jakákoli aktivita PTK ze skupiny ErbB, která se liší od normální aktivity proteinových kináz ze skupiny ErbB očekávané u konkrétního savce. Odchylná aktivita PTK skupiny ErbB může být například ve formě abnormálního zvýšení aktivity nebo odchylného načasování a/nebo řízení aktivity PTK. Tato odchylná aktivita může být důsledkem například nadměrné exprese nebo mutace proteinkinázy vedoucí k nevhodné nebo neřízené aktivaci. Navíc je také zřejmé, že nežádoucí aktivita PTK může být založena na abnormálním zdroji, jako je například maligní stav. To znamená, že hladina aktivity PTK nemusí být abnormální, aby byla považována za odchylnou, ale aktivita může pocházet z abnormálního zdroje.

Sloučeniny obecného vzorce I v bezvodé nebo hydrátové formě jsou inhibitory jedné nebo více kináz skupiny ErbB, a jako takové jsou použitelné při léčení onemocnění u savců charakteri20 zovaných odchylnou aktivitou PTK, zvláště u lidí. V jednom provedení předkládaného vynálezu je léčené onemocnění charakterizováno alespoň jednou PTK ze skupiny ErbB zvolenou z EGFr, c-ErbB-2 a c-ErbB-4, která vykazuje odchylnou aktivitu. V dalším provedení je léčené onemocnění charakterizováno alespoň dvěma kinázami PTK ze skupiny ErbB zvolenými ze skupiny EGFr, c-ErbB-2 a c-ErbB^l s odchylnou aktivitou. V jednom provedení způsobu léčení mají sloučeniny obecného vzorce I nebo jejich bezvodé nebo hydrátové formy inhibiční účinek na alespoň jednu PTK ze skupiny ErbB zvolenou ze skupiny EGFr, c-ErbB-2 a c-ErbB-4. V dalším provedení způsobu léčení mají sloučeniny vzorce I nebo jejich bezvodé nebo hydrátové formy inhibiční účinek na alespoň dvě kinázy PTK ze skupiny ErbB zvolené ze skupiny EGFr, c-ErbB-2 a c-ErbB^l.

Popisuje se zde také způsob léčení onemocnění zprostředkovaného odchylnou aktivitou proteinové tyrosinkinázy u savce, který zahrnuje podávání uvedenému savci množství sloučeniny obecného vzorce I nebo její bezvodé nebo hydrátové formy účinné pro inhibicí alespoň jednoho proteinu ze skupiny ErbB. V jednom provedení tento způsob zahrnuje podávání množství slou35 čeniny obecného vzorce I nebo její bezvodé nebo hydrátové formy účinné pro inhibicí alespoň dvou proteinů ze skupiny ErbB.

Popisovaná onemocnění mohou být jakékoli poruchy, které jsou charakterizovány odchylnou aktivitou PTK. Jak je uvedeno výše, taková onemocnění zahrnují bez omezení rakovinu a lupénku. Ve výhodném provedení je onemocněním rakovina. V ještě výhodnějším provedení je rakovinou rakovina jiných než malých plicních buněk, rakovina močového měchýře, prostaty, mozku, hlavy a krku, mléčné žlázy, vaječníků, žaludku, kolorektální rakovina nebo rakovina pankreatu.

Terapeuticky účinné množství sloučeniny obecného vzorce I a jejích bezvodých nebo hydrátových forem bude záviset na řadě faktorů včetně bez omezení věku a hmotnosti savce, konkrétního onemocnění vyžadujícího léčení a jeho vážnosti, povahy formulace a způsobu podávání, a bude nakonec záviset na rozhodnutí ošetřujícího lékaře nebo veterinárního lékaře. Sloučeniny obecného vzorce I a jejich bezvodé nebo hydrátové formy se budou typicky podávat pro účely léčení v množství v rozmezí od 0,1 až 100 mg/kg tělesné hmotnosti příjemce (savce) na den, a obvykleji v rozmezí 1 až 10 mg/kg tělesné hmotnosti na den. Přijatelné denní dávky mohou být od přibližně 0,1 do přibližně 1000 mg/den, a s výhodou od přibližně 0,1 do přibližně 100 mg/den.

Sloučeniny obecného vzorce I a jejich bezvodé nebo hydrátové formy popisované výše jsou použitelné při léčení a při výrobě farmaceutických prostředků pro léčení takové poruchy u savce,

-8CZ 299561 B6 která je charakterizována odchylnou aktivitou alespoň jedné PTK ze skupiny ErbB. V jednom provedení předkládaného vynálezu je připravený farmaceutický prostředek použitelný při léčení poruchy charakterizované alespoň jednou PTK ze skupiny ErbB zvolenou ze skupiny EGFr, c-ErbB-2 a c-ErbB-4, která vykazuje odchylnou aktivitu. V dalším provedení je připravený farmaceutický prostředek použitelný pro léčení onemocnění charakterizovaného alespoň dvěma kinázami PTK ze skupiny ErbB zvolenými ze skupiny EGFr, c-ErbB-2 a c-ErbB-4 s odchylnou aktivitou. V jednom provedení tohoto použití inhibují sloučeniny obecného vzorce I nebo jejich bezvodé nebo hydrátové formy, které se používají pro výrobu farmaceutického prostředku, alespoň jednu PTK ze skupiny ErbB, zvolenou ze skupiny EGFr, c-ErbB-2 a c-ErbB-4. ίο V dalším provedení tohoto použití inhibují sloučeniny obecného vzorce I nebo jejich bezvodé nebo hydrátové formy, které se používají pro výrobu farmaceutického prostředku, alespoň dvě kinázy PTK ze skupiny ErbB zvolené ze skupiny EGFr, c-ErbB-2 a c-ErbB-4.

Léčená onemocnění jsou uvedena výše.

Volné báze a hydrochloridové soli sloučenin vzorců I, II, III a IV, mohou být připraveny způsoby popsanými v WO 99/35146, která již byla uvedena výše. Schéma těchto postupů je uvedeno v následujícím schématu A. Odkazy na stránky uvedené v příkladech se týkají dokumentu WO 99/35146. Volná báze sloučeniny vzorce II se používá jako příklad obecného schématu.

Schéma A

Postup Á-Reakce aminu s bicyklickou sloučeninou obsahující 4-chlorpyrimidinový kruh (str. 55, řádky 21 až 33, str. 69, řádky 30 až 34 a str. 74, řádek 35 až str. 75, řádek 4).

(str. 60, řádky 15 až 16) (str. 64 až 65)

Postup 5-Reakce produktu z postupu A s heteroarylovou sloučeninou cínu (str. 55, řádek 33str. 56, řádek 9).

Postup C-Odstranění 1,3-dioxolan-2-ylové ochranné skupiny pro uvolnění aldehydové skupiny (str. 56, řádky 11-18).

-9CZ 299561 B6

Postup D-Reakce aldehydu s aminem redukční aminací (str. 56, řádky 20-32; příklad 29str. 100, řádky 18-29).

J 2-m*thansutfonyl«thylamln

Sloučenina vzorce II, tj. N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-({[2-(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminditosylát, byla připravena ve dvou odchylných formách, bezvodé formě (vzorec 11' ve schématu B) a ve formě monohydrátu (vzorec II ve schématu B). Vztah těchto forem je znázorněn na následujícím schématu B. Bezvodá forma N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-({[2-(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-2furyl]-4-chinazolinaminditosylátu se může připravit (a) reakcí tosylátové soli 5-(4-[3-chlor-4(3-fluorbenzyloxy)anilino]-6-chinazolinyl)furan-2-karbaldehydu (vzorec B ve schématu B) s 2-(methylsulfon)ethylaminem v tetrahydrofuranu v přítomnosti diisopropylethylaminu s následným (b) zavedením tohoto roztoku do kaše triacetoxyborohydridu sodného v tetrahydrofuranu při teplotě laboratoře, přidáním (c) 5N hydroxidu sodného pro úpravu pH na 10 až 11, (d) oddělením organické tetrahydrofuranové fáze, a potom (e) přidáním hydrátu kyseliny paratoulensulfonové k organické fázi, za získání bezvodého ditosylátu. Vnitřní přeměna na monohydrát a zpět na bezvodou formu ditosylátových solí podle vynálezu je znázorněna ve schématu B. Tosylátová sůl 5-(4-[3-chlor-4-(3-fluorbenzyloxy)anilino]-6-chinazolinyl)furan2-karbaldehydu se připraví z hydrochloridové soli karbaldehydu (vzorec A schématu B). Příprava N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-({[2(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyl]^t-chinazolinaminditosylátu a jeho bezvodých a monohydrátových forem se používá jako příklad. Jakje odborníkům v oboru zřejmé, podobnými způsoby lze připravit i jiné sloučeniny vzorce I ajejich bezvodé a hydrátové formy.

Schéma B

THF:lPrjNEt lPA.NaBH(OAc>j zaatavitfextrahovat 5N NaOH potem pňdat pTaOH (3-6okv.) 89%

II*-bezvodý

4:1THF/HjO KS”C až lib. topí.

80%

-10CZ 299561 B6

II* - bezvodý __ voda, lab. topí.

MeOH, tab. tepl.

α

ΙΓ - monohydrát

Sloučenina A schématu B může být připravena použitím různých strategií syntézy, které mohou být odchylné od strategie uvedené ve schématu A výše, s použitím vazby zprostředkované paladiem(O) chinazolinu a substituovaných furanových meziproduktů.

Schéma C znázorňuje pět strategií reakcí prostřednictvím paladia(O) pro syntézu sloučeniny A podle schématu B. Syntéza (1), což je způsob podle dosavadního stavu techniky, zahrnuje použití komerčně dostupné kyseliny 5-formyl-2-furylboronové v Suzukiho reakci. Syntéza (2) až (5) ío představuje různá provedení předkládaného vynálezu, která zahrnují: (2) vytvoření kyseliny

5-(diethoxymethyl)-2-furylboronové a její použití při Suzukiho reakci, (3) tvorbu kyseliny

5-formyl-2-furylboronové z 2-furaldehydu prostřednictvím ochrany formylové skupiny in šitu pomocí Ν,Ο-dimethylhydroxylaminu, a její použití in šitu při Suzukiho reakci, (4) tvorbu kyseliny 5-formyl-2-furylboronové z 5-brom-2-furaldehydu chráněním formylové skupiny in šitu

N,(3-dimethylhydroxylaminem a její použití in šitu při Suzukiho reakci, a konečně (5) reverzní

Suzukiho reakci kyseliny 4-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]anilino}-6-chinazolinylboronové (připravené zN-{3-chlor-4[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-jod-4-chinazolinaminu) vytvářené in šitu s 5-brom-2-furaldehydem.

Schéma C

-11 CZ Ul

Reakce ze schématu C jsou následně popsány, přičemž se odkazuje na vzorce C, A a B

V případu (1) schématu C podléhá komerčně dostupná kyselina 5-formyl-2-furylboronová, tj.

sloučenina vzorce A, kde R je -C(O)H a Zje -B(OH)₂, (Frontier Scientific, Inc.; Logan UT) katalytické reakci zprostředkované paladiem(O) (Pure Appl. Chem. 66:213, 1994; Synth. Commun 11:513, 1981) za vytvoření požadované sloučeniny C s vysokým výtěžkem. Konkrétně se sloučenina vzorce C vyrobí mícháním sloučeniny vzorce B, kde L je jod nebo brom, s výhodou jod, a U znamená organickou skupinu jak se zde popisuje a 1,0 až 1,5 molámího ekvivalentu kyseliny 510 formyl-2-furylboronové vetherovém rozpouštědle jako je bez omezení diethylether, tetrahydrofuran, dioxan, ethylenglykoldiethylether známý také jako 1,2-diethoxyethan a ethylenglykoldimethylether, známý také jako 1,2-dimethoxyethan nebo DME. Potom se přidá paladiový katalyzátor ze skupiny octan paladnatý, chlorid paladnatý, paladium na uhlí, dichlor—[ 1,1 '-bis(difenylfosfino)ferocen]paladium(II), tetrakis(trifenylfosfm)paladium(0), tris(dibenzylidenaceton)dipala15 dium(O), transdichlorbis(trifenylfosfm)paladium(n). Výhodným katalyzátorem je paladium na uhlí. Reakční směs se potom zahřívá na teplotu mezi 25 a 120 °C 1 až 24 h a potom se ohladí na laboratorní teplotu a zfiltruje. Roztok se potom smísí s minerální kyselinou nebo organickou kyselinou, jako je monohydrát kyseliny p-toluensulfonové, a sloučenina vzorce C se izoluje ve vysokém výtěžku jako sůl s minerální kyselinou nebo sůl s kyselinou p-toluensulfonovou.

Další přístup pro získání sloučeniny vzorce C používá přivedení surového roztoku sloučeniny vzorce A, kde zje B(OH)₂ a R je _C(Q)(T)W, kde Q a T jsou O-alkyl, kde alkyl je jak je zde definováno a s výhodou ethyl, a W je atom vodíku, při biarylové reakci zprostředkované paladiem(0) (Suzukiho cross-coupling reakce s boronovými kyselinami vytvářenými in šitu se popisuje v J. Org. Chem., 61:9 556, 1996 a tam uvedených odkazech) do reakce se sloučeninou vzorce B; kde L je jod nebo brom, a U znamená organickou skupinu, s použitím „bezligandové“ (ligand-less) heterogenní katalýzy paladiem na uhlí. Toto použití „bezligandového“ paladia se o

popisuje v článcích Org. Lett. 1:965, 1999; Org. Process Res. Dev. 3:248, 1999; a Tetrahedron Lett. 35:3 277,1994. Výhodné provedení tohoto způsobu, které je částečně znázorněno v části (2) schématu C, poskytuje (i) tvorbu furanyllithiátu in šitu, sloučeniny vzorce A, kde Z je Li a R je -C(Q)(T)W, kde Q a T jsou O-alkyl, s výhodou ethoxy, a W je atom vodíku, (ii) následnou tvorbu odpovídající boronové kyseliny, kde Z je B(OH)₂ a R je -C(Q)(T)W, kde Q a T jsou O-alkyl, s výhodou ethoxy, a W je atom vodíku, a (iii) biarylovou reakci zprostředkovanou paladiem(O) pro konstrukci požadované sloučeniny vzorce C. Při tomto postupu se používají etherová rozpouštědla. Tato etherová rozpouštědla mohou bez omezení zahrnovat diethylether, tetrahydrofuran, dioxan, 1,2-diethoxyethan a DME. Výhodné rozpouštědlo je DME. Bylo pozoio rováno, že toto výhodné rozpouštědlo poskytuje významná zlepšení ve srovnání se zveřejněnými postupy (Synth. Commun. 28:1 013, 1998) při vytváření kyseliny 5-formyl-2-furylboronové syntetizované z 2-furaldehyddiethylacetalu. Další vhodný prekurzor pro kyselinu 5-formyl-2furylboronovou vytvářenou in šitu zahrnoval 2—(2—furyl)—1,3-dioxolan. Výhody tohoto postupu spočívají v deprotonaci sloučeniny vzorce A, kde Z je atom vodíku a R je -C(Q)(T)W, kde Q a T jsou O-alkyl, s výhodou ethoxy, a W je atom vodíku, s alkyUithiovými sloučeninami, s výhodou n-butyllithiem, při vyšších teplotách (-20 °C v DME ve srovnání s -40 °C v tetrahydrofuranu). Následné zpracování sloučeniny vzorce A; kde Z je Li a R je -C(Q)(T)W, kde Q a T jsou O-alkyl, s výhodou ethoxy, a W je atom vodíku, s trialkylborátem, s výhodou triisopropylborátem v DME, poskytlo také vyšší konverzi na borátový ester sloučeniny vzorce A, kde Z je

B(0-isopropyl)₃Lí a R je -C(Q)(T)W, kde Q a T jsou O-alkyl, s výhodou ethoxy, a W je atom vodíku. Při přípravě na následující Suzukiho reakci byl borátový ester vytvářený in šitu hydrolyzován na kyselinu boronovou sloučeniny vzorce A, kde Z je B(OH)₂ a R je -C(Q)(T)W, kde Q a T jsou O-alkyl, kde alkyl je jak definováno výše, s výhodou ethyl, a W je atom vodíku, nejprve působením kyselinou octovou a následným přidáním vody v tomto uvedeném pořadí při teplotě laboratoře. Bylo také pozorováno, že významná zlepšení procesu způsobená použitím DME ve srovnání s tetrahydrofuranem se projevila i při biarylové reakci zprostředkované paladiem(O) s meziproduktem kyseliny boronové za poskytnutí sloučeniny vzorce C. Tato zlepšení způsobu poskytují reprodukovatelnější výsledky, kratší doby reakce a zlepšené profily z hlediska čistoty.

V dalším provedení mohou být vytvořeny sloučeniny vzorce C z biarylové reakce zprostředkované paladiem(O) kyseliny 5-formyl-2-furylboronové, tedy sloučeniny vzorce A, kde Z je -B(OH)₂, vytvořené in šitu, a sloučeniny vzorce B, kde L je jod nebo brom a U znamená organickou skupinu (viz část (3) schématu C). Tento způsob využívá ochrany aldehydové funkční skupiny in šitu ve formě aminalového lithiátu (Synlett. 615:1992), jako například reakcí

2-furaldehydu s lithiovým aniontem sekundárního aminu ze skupiny morfolin, Ν,Ο-dimethylhydroxylamin, 1-methylpiperizin nebo N^N^NMrimethyl-lJ-ethandiamin. Výhodný amin při tomto procesu je Ν,Ο-dimethylhydroxylamin. Tvorba aminového lithiátu se provede reakcí aminu s alkyllithným činidlem, s výhodou n-butyllithiem, v etherovém rozpouštědle jako je tetrahydrofuran nebo DME při nízké teplotě. Roztok aminlithiového aniontu se potom smíchá s

2-furaldehydem za vytvoření aminalového lithiátu in šitu, sloučeniny vzorce A, kde Z je atom vodíku, R je -C(Q)(T)W, kde Q je NR'R, kde R'je O-alkyl, s výhodou methoxy a R je alkyl jak je zde definováno, s výhodou methyl, nebo R' a R” jsou nezávisle alkyl, jak je zde definováno; T je Ο-Li a W je H. Tento roztok se potom ponechá reagovat s dalším molámím ekvivalentem alkyllithia, s výhodou n-butyllithiem, při nízké teplotě za vytvoření furanyllithátu, sloučeniny vzorce A, kde Z je Li a R je -C(Q)(T)W, kde Q je NRR , kde R' je O-alkyl, s výhodou methoxy a R je alkyl, s výhodou methyl nebo R' a R jsou nezávisle alkyl jak je zde definováno, T je Ο-Li a W je H. Tento roztok se potom smísí při nízké teplotě s trialkylborátem, s výhodou triisopropylborátem, za vytvoření sloučeniny vzorce A, kde Z je B (O-isopropyl)₃Li, Rje -C(Q)(T)W, kde Q je NRR, kde R' může být O-alkyl, s výhodou methoxy a R je alkyl jak je zde definováno, s výhodou methyl nebo R' a R jsou nezávisle alkyl jak je zde definováno; T je Ο-Li a W je atom vodíku, a provede se hydrolýza na kyselinu 5-formyl-2-furylboronovou v roztoku přidáním buď minerální, nebo organické kyseliny jako je kyselina octová. Kyselina 5-formyl-2-furylboronová vytvářená in šitu snadno podléhá biarylové reakci zprostředkované paíadiem(O) za vytvoření sloučeniny vzorce C.

- 13 CZ 299561 B6

Tento způsob popsaný v předcházejícím odstavci pro získání sloučeniny vzorce C je možno také použít, jestliže se použijí halogenem (Z je brom nebo jod) substituované deriváty 2-furaldehydu, s výhodou 5-brom-2-formylfuran. V tomto případě je ve sloučenině vzorce A skupina Z atom bromu a Rje -C(O)H (viz část (4) schématu C).

Alternativně je možno vytvořit jinou strategii syntézy vedoucí ke sloučeninám vzorce C, vytvořených z biarylové reakce N-heteroarylboronových kyselin jako je sloučenina vzorce B; kde L je B(OH)₂ a U znamená organickou skupinu, zprostředkované paladiem(O) s deriváty 5-halogen-2formylfuranu, tj. sloučeninou vzorce A, kde Z je brom nebo jod a R je -C(O)H (viz část (5) ío schématu C). Způsob výroby meziproduktu kyseliny N-heteroarylboronové vzorce B zahrnuje zpracování sloučeniny vzorce B, kde L je jod a U znamená organickou skupinu, alkylmagnesiumhalogenidovým činidlem, s výhodou ethylmagnesium-bromidem. Tato reakce se provádí v etherovém rozpouštědle jako je tetrahydrofuran nebo DME při nízké teplotě. Tato směs se potom smísí s trialkylborátem, s výhodou triisopropylborátem a následně se pomalu přidá alkyl15 lighium, s výhodou n-butyllithium, přičemž se udržuje nízká teplota reakční směsi. Potom se přidá minerální kyselina nebo organická kyselina, s výhodou kyselina octová. Tak se získá meziprodukt N-heteroarylboronové kyseliny vzorce B, kde L je B(OH)₂ a U znamená organickou skupinu v roztoku. K tomuto roztoku se potom přidá 5-halogen-2-furaldehyd (halogen je brom nebo jod), s výhodou 5-brom-2-furaldehyd, pomocné rozpouštědlo jako je N,N-dimethylacet20 amid, vodná báze jako je uhličitan sodný a paladiový katalyzátor, jako je dichlormethanový addukt dichlor[l,r-bis-(difenylfosfmo)ferocen]paladia(n). Tento roztok se potom zahřívá na dostatečnou teplotu pro dosažení konverze na požadovanou sloučeninu vzorce C.

Rozdílná strategie syntézy pro vytvoření sloučeniny vzorce C je použití reakce Heckova typu (Bull. Chem. Soc. Jpn. 46:1 220, 1973; Heterocycles, 31:1 951, 1990; Synthesis, 488:1984; J. Org. Chem. 50:5 272, 1985) pro vazbu 2-furaldehydu, sloučeniny vzorce A, kde Z je atom vodíku a R je -C(O)H, prostorově selektivním způsobem s meziproduktem vzorce B, kde L je jod nebo brom a U znamená organickou skupinu. Prostorově selektivní arylace 2-furaldehydu katalyzovaná paladiem v poloze 5 nebyla ještě v chemické literatuře popsána. Další vhodné náhrady za 2-furafdehyd při tomto postupu jsou 2-furaldehyddiethylacetal, 2-(2-furyl)l,3dioxolan, kyselina 2-furanová estery kyseliny 2-furanové jako je methyl-2-furanoát nebo ethyl-2furanoát. Postup syntézy sloučeniny vzorce C využívající této strategie zahrnuje míchání ve vhodném rozpouštědle jako je ΛζΑ-dimethylformamid, N-methylpyrrolidinon, toluen, dimethylacetamid, voda, acetonitril nebo jejich směsi, s výhodou Ν,Ν-dimethylformamid, s organickou aminovou bází, jako je triethylamin a diisopropylethylamin, nebo karboxylátovou bází alkalického kovu jako je uhličitan sodný, uhličitan draselný, uhličitan česný, uhličitan vápenatý, octan sodný a octan draselný, s výhodou octan draselný, a 2-furaldehyd. Potom následuje přidání trialkyl- nebo triarylfosfinu, jako je tri-o-tolylfosfin, trifenylfosfin, tri-terc-butylfosfin, tri-2-furylfosfm, tricyklohexylfosfin, s výhodou tricyklohexylfosfm. Přidá se paladiový kataly40 zátor, který je zvolený ze skupiny bez omezení octan paladnatý, chlorid paladnatý, paladium na uhlí, dichlor[l,l'-bis(difenyl-fosfino)ferocen]paladium(II), tetrakis(trifenylfosfin)paladium(0), tris(dibenzylidenaeeton)dipaladium(0), trans-dichlorbis(trifenyl-fosfm)paladium(II), s výhodou chlorid paladnatý. Tato směs se potom zahřeje a pomalu se přidá roztok sloučeniny vzorce B, kde L je jod nebo brom, s výhodou jod. Tato reakční směs se potom zahřívá 10 až 20 h a reakční směs se potom ochladí na laboratorní teplotu a zfiltruje. Přídavek minerální kyseliny nebo organické kyseliny jako je kyselina p-toluensulfonová, poskytne izolovanou sloučeninu vzorce C ve formě soli.

Následující příklady jsou určeny pouze pro ilustraci, a nemají jakýmkoli způsobem omezovat rozsah vynálezu. Fyzikální údaje uvedené pro sloučeniny v příkladech jsou v souladu se stanovenou strukturou těchto sloučenin.

- 14CZ 299561 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 ukazuje obraz rentgenové práškové difrakce bezvodé formy N-{3-chlor-4—[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}—6—[5—({[2-(methansulfonyl)ethyl]amino }methyl)-2-furyl]-4-chinazolin5 aminditosylátu.

Obr. 2 ukazuje obraz rentgenové práškové difrakce monohydrátu N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-({[2-(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminditosylátu.

io

Obr. 3 (a) a (b) ukazují křivky sorpce vody pro (a) monohydrát N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl {[2-(methansulfonyl)ehtyl]amino}methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminditosylátu, a (b) dihydrochloridovou sůl N-3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-{5-({[2-(methansulfo15 nyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminu.

Obr. 4 ukazuje porovnání křivek sorpce vody pro monohydrát ditosylátu a pro dihydrochlorid N-{3-chlor-A-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-({[2-(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-2furyl]-4-chinazolinaminu.

Obr. 5 ukazuje obrazy rentgenové práškové difrakce pro bezvodé a monohydrátové krystalické formy N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-({[2-(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminii před a po testování stability. Horní obrázek ukazuje křivky pro čisté krystalické formy. Střední obrázek ukazuje výsledky na počátku a po jednom dnu u kaše s aktivitou vody ekvivalentní 7 % relativní vlhkosti. Dolní obrázek ukazuje výsledky na počátku a po jednom dnu pro kaši s aktivitou vody ekvivalentní 15 % relativní vlhkosti.

Příklady provedení vynálezu

Jak se zde používá, symboly a běžné značky používané v těchto postupech, schématech a příkladech jsou v souladu se značkami používanými v současné vědecké literatuře, jako je například Journal of the American Chemical Society nebo Journal of Biological Chemistry. Pro označení aminokyselinových zbytků se obecně používají standardní jednopísmenové nebo třípismenové zkratky, přičemž aminokyseliny se považují za sloučeniny s konfigurací L, pokud není uvedeno jinak. Pokud není uvedeno jinak, veškeré výchozí látky byly získány od komerčních dodavatelů a byly používány bez dalšího čištění. V příkladech a popisu mohou být konkrétně použity následující zkratky:

g (gramy) (litry) μΐ (mikrolitry) mM (milimolámí) kg (kilogram)

Hz (Hertz)

TLC (chromatografíe na tenké vrstvě) Tr (retenční čas)

THF (tetrahydrofuran)

DMSO (dimethylsulfoxid)

EtOAc (ethylacetát)

DME (1,2-dimethoxyethan)

DCM (dichlormethan)

DCE (dichlorethan) mg (miligramy) ml (mililitry)

M (molámí)

N (normální)

i.v. (intravenózní)

MHz (megahertz)

RP (reverzní (obrácené) fáze)

- 15 CZ 299561 B6

DMF (V,V-dimethylformam id)

HOAc (kyselina octová)

TMSE (2-(trimethylsilyl)ethyl)

TMS (trimethylsilyl)

TIPS (triisopropylsilyl)

TBS (í-butyld imethylsilyl)

HPLC (vysokotlaká kapalinová chromatografíe)

Pokud není uvedeno jinak, všechny teploty jsou vyjádřeny ve stupních Celsia. Všechny reakce se provádějí v inertní atmosféře při laboratorní teplotě, pokud není uvedeno jinak.

Spektra 'HNMR byla zaznamenávána na přístrojích Varian VXR-300 a Varian Unity-300 a Varian Unity-400, nebo generál Electric QE-300. Chemické posuvy jsou vyjádřeny v částech na milion (ppm, jednotky δ). Vazebné konstanty jsou v jednotkách Hertz (Hz). Obrazy štěpení popisují zdánlivé multiplicity a jsou označeny jako s (singlet), d (dublet), t (triplet), q (kvartet), m (multiplet), br (široký).

Hmotnostní spektra s nízkým rozlišením (MS) byla zaznamenávána na spektrometru JOEL JMSAX505HA, JOEL SX-102, nebo a SCIEX-APIiii; hmotnostní spektra s vysokým rozlišením byla získána na spektrometru JOEL SX-102A. Všechna hmotnostní spektra byla prováděna s elektrorozprašovací ionizací (ESI), chemickou ionizací (Cl), ionizací nárazem elektronů (El) nebo nárazem rychlých atomů (FAB). Infračervená (IR) spektra byla získána na spektrometru Nicolet 510FT-IR s použitím 1 mm kyvetyNaCl. Všechny reakce byly monitorovány chromatografií na tenké vrstvě na 0,25 mm deskách silikagelu E. Merck (60F-254), s vizualizací UV světlem, 5% ethanolickou fosfomolybdenovou kyselinou nebo roztokem p-anisaldehydu. Blesková chromatografíe na koloně byla prováděna na silikagelu (230 až 400 mesh, Merck). Optické rotace byly měřeny na polarimetru Perkin Elmer Model 241. Teploty tání byly zjištěny na zařízení Mel-Temp II ajsou nekorigované.

Příklad 1

Příprava 5-(4-[3-chlor-4-(3-fluorbenzyloxy)-anilino]-6-chinazolinyl)-furan-2-karbaldehydu

Do reakční nádoby byly přidány N-{3-chlor-M-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-jod-4-chinazo35 linamin (100 mg; 0,198 mmol), kyselina 2-formylfuran-5-boronová (Frontier Scientific, 42 mg; 0,297 mmol), 10% paladium na aktivním uhlí (5 mg; 0,05 hmotnostních dílů), DME (2,0 ml), MeOH (1,0 ml) a triethylamin (83 μΐ). Po zahřívání na 50 °C 14 h ukázala HPLC 98,5 % čisté konverze. 'HNMR (d_é-DMSO) δ: 11,44 (s, 1H), 9,38 (s, 2H), 9,11 (s, 1H), 8,90 (s, 1H), 8,39 (dd, 1H, J=8 a 4Hz), 7,89 (d, 1H, J=12Hz), 7,84 (d, 1H, J=4 Hz), 7,60 (dd, 1H, J=8 a 4 Hz), 7,4740 7,42 (m, 2H), 7,44 (ΑΑΈΒ', 2H, JAB=8 Hz), 7,35-7,25 (m, 3H), 7,24 (d, 1H, J=4 Hz), 7,16 (dt,

1H, J=8 a 4 Hz), 7,06 (ΑΑ'ΒΒ', 2H, J_AB=8 Hz, 6,84 (d, 1H, J=4 Hz), 5,27 (s, 2H), 4,43 (s, 2H), 3,61-3,50 (m, 2H), 3,47-3,36 (m, 2H), 3,09 (s, 3H), 2,23 (s, 6H).

Příklad 2

Příprava 5-(4-[3-chlor-4-(3-fluorbenzyloxy)-anilino]-6-chinazolinyl)-furan-2-karbaldehydu (i) Příprava kyseliny 2-diethylacetalfuran-5-boronové in sítu

Do dvacetilitrové reakční nádoby bylo vloženo 6,7 objemu DME a 0,67 hmotnostního dílu (740 g, 410 ml, 4,35 mol) 2-furaldehyddiethylacetalu a byla ochlazena na -40 °C za kontroly průběhu reakce/obsahu. V průběhu přibližně 40 min bylo přidáno n-butyl lithium, 1,32 hmotnostního dílu (2,5M v hexanech, 1,45 kg, 5,22 mol) s použitím odměřovacího čerpadla ChemTech CP120 s keramickou hlavou. Vnitřní teplota stoupla na -31 °C. Reakční směs značně ztmavla,

-16CZ 299561 B6 ale byla homogenní. Po ukončení přidávání byla potrubí propláchnuta přibližně 0,17 objemy hexanu přímo do reakční nádoby. Když poklesla vnitřní teplota na -40 °C, reakční směs byla míchána další 2,5 h. Po 2,5 h bylo přidáno odměřovacím čerpadlem během 20 min 1,1 objemu (0,89 hmotnostního dílu, 982 g, 5,22 mol) triisopropylborátu. V první polovině přidávání byl pozorován mírně exotermický průběh reakce, přičemž maximální teplota byla přibližně -31 °C. Pro propláchnutí potrubí čerpadla do reakčního tanku bylo použito dalších 0,15 objemu hexanu. Po 2 h (30 min při -40 °C) byla zvyšována reakční teplota na 25 °C v průběhu 60 min. Když dosáhla vnitřní teplota 25 °C byl odstraněn 1 ml alikvot pro kontrolu procesu (příprava vzorku: dvě kapky reakční směsi byly zředěny 1 ml CH₃CN a 100 μΐ IN HCI a testovány chromaío tografií LC při 280 nm). Poměr boronová kyselina:2-furfural byl 119:1. V tomto okamžiku bylo přidáno 0,29 objemu kyseliny octové a reakční směs byla míchána 30 min. Po 30 min byla přidána voda, 0,36 objemu. Tato reakční směs byla ihned použita v dalším kroku.

(ii) Příprava 5-(4-[3-chlor-4-(3-fluorbenzyloxy)anÍlino]-6-chinazolinyl)-furan-2-karbalde15 hyd-4-methylbenzensulfonátu s použitím 2-diethyl-acetal-5-boronové kyseliny připravené in šitu

Do výše získané reakční směsi bylo přidáno 3,4 objemu (3,7 1) ethanolu v průběhu 5 min přidáváním ve vakuu. Byl přidán triethylamin, 0,69 objemu (760 ml, 5,45 mol) a potom 1 hmotnostní díl (1100 g, 2,18 mol) N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-jod-4-chinazolinaminu a

3 % hmotnostní 10% Pd/C [paladium, 10 % hmotnostních (vztaženo na sušinu) na aktivním uhlí,

50% namočení vodou, Degussa Type E101NE/W]. Reaktor byl nastaven na řízení na teplotu 62 °C. Bylo zjištěno, že vnitřní teplota stoupla v průběhu přibližně 2 h na 58 °C. Po přibližně 14 h byl odebrán alikvot pro kontrolu v průběhu procesu. (Příprava vzorku: 15 μΐ bylo zředěno 1 ml MeOH a 250 μΐ IN HCI a testováno metodou Fast LC při 220 nm.) Reaktor byl potom ochlazen na 25 °C. Tmavá reakční směs byla převedena do druhého reaktoru nerezovou trubkou vyloženou teflonem opatřenou průtokovým patronovým filtrem 5,0 pm (Pall part no. R1Í050, lot no. FJ0807) a průtokovým 0,45 pm filtrem (Meisner CLMF 0,4-662, lot no. 4087 R-#F). První reaktor byl vypláchnut 0,5 objemy DME a byl převeden pomocí potrubí tak, aby se promyly pevné podíly přes filtrační patrony. Monohydrát kyseliny p-toluensulfonové, 1,55 hmotnostního dílu (1700 g, 8,72 mol) byl rozpuštěn v 2,27 objemu deionizované vody a roztok byl přidán do reakční směsi v průběhu 5 min. Po míchání při 25 °C 1 h byl produkt oddělen na keramickém filtru vyloženém středním filtračním papírem. Reaktor a filtrační koláč byly propláchnuty 0,9 objemu roztoku 1:1 DME:voda. Po odsátí do sucha v průběhu 4h byl žlutý filtrační koláč převeden na dva skleněné tácy a umístěn v sušárně (50 až 55 °C) pod vakuem z laboratorního rozvodu (61 kPa) s proplachováním dusíkem. Tyto dva skleněné tácy byly vyjmuty ze sušárny a ponechány ochladit na laboratorní teplotu a byly odebrány příslušné vzorky. Izolovaný výtěžek sloučeniny uvedené v názvu byl 1230 g (1,12 hmotnostního dílu, 87 % teorie; 1410 g Th) žlutavé pevné látky. ’HNMR (d₆-DMSO) δ: 11,44 (s, 1H), 9,38 (s, 2H), 9,11 (s, 1H), 8,90 (s, 1H), 8,39 (dd, 1H, J=8 a 4 Hz), 7,89 (d, 1H, J=12 Hz), 7,84 (d, 1H, J=4 Hz), 7,60 (dd, 1H, J=8 a 4 Hz),

7,47-7,42 (m, 2H), 7,44 (ΑΑ'ΒΒ', 2H, Jab=8 Hz), 7,35-7,25 (m, 3H), 7,24 (d, 1H, J=4 Hz), 7,16 (dt, 1H, J=8 a 4 Hz), 7,06 (ΑΑ'ΒΒ', 2H, J_AB=8 Hz, 6,84 (d, 1H, J=4 Hz), 5,27 (s, 2H), 4,43 (s, 2H), 3,61-3,50 (m, 2H), 3,47-3,36 (m, 2H), 3,09 (s, 3H), 2,23 (s, 6H).

Příklad 3

Příprava 5-(4-[3-chlor-4-(3-fluorbenzyloxy)anilino]-6-chinazolinyl)furan-2-karbaldehydu s použitím in šitu chráněného 2-furaldehydu

Hydrochlorid MO-dimethylhydroxylaminu (629 mg; 6,32 mmol) byl suspendován v THF 50 (19 ml; 40 objemů) a baňka byla ochlazena na —40 °C (isopropanolová lázeň se systémem řízení teploty Cryocool). Po kapkách bylo přidáno n-butyllithium (2,5M roztok v hexanech; 5,3 ml;

13,2 mmol), přičemž vnitřní teplota stoupla na -12 °C. Směs se však rychle ochladila zpět na -40 °C. Po 30 min při -40 °C byl rychle přidán 2-furaldehyd (481 μΙ; 5,74 mmol) ke směsi, což

- 17CZ 299561 B6 způsobilo zvýšení vnitřní teploty na -28 °C. Teplota opět rychle klesla zpět na -40 °C. Po 15 min při -40 °C bylo po kapkách přidáno n-butyllithium (2,5M roztok v hexanech; 2,8 ml; 6,89 mmol), přičemž vnitřní teplota byla udržována nižší než -35 °C. V průběhu přidávání směs zežloutla. Po ukončení přidávání byla směs ponechána míchat při -40 °C 1 h. Po kapkách byl přidán triisopropylborát (2,0 ml; 8,62 mmol), přičemž vnitřní teplota byla udržována nižší než -35 °C. Po ukončení přidávání bylo chlazení vypnuto. HPLC ukázala 83,7 % požadované boronové kyseliny, 6,2 % výchozího materiálu. Když vnitřní teplota dosáhla -20 °C, reakce byla ukončena přidáním kyseliny octové (462 μΐ; 8,04 mmol) a ponechána ohřát na laboratorní teplotu. Materiál byl použit dále bez čištění nebo izolace přímo pro Suzukiho reakci.

Do reakční nádoby s obsahem surové kyseliny boronové byl přidán N,/V-dimethylacetamid (13 ml), 1,16M vodný roztok Na₂CO₃ (7,3 ml; 7,38 mmol), /V-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-jod-4-chinazolinamin (1,87 g; 3,69 mmol) a dichlormethanový addukt [1,1'-bis(difenylfosfino)ferocen]paladia(ll) (15 mg; 0,0185 mmol). Po přidání báze vzrostla vnitřní teplota na přibližně 28 °C. Reakční směs byla zahřáta na 50 °C (vnitřní teplota) v olejové lázni. Reakční směs byla zfiltrována přes stlačené lože celitu a pevné podíly byly promyty THF. Izolovaný roztok byl potom zředěn ethylacetátem a byla přidána vodná kyselina chlorovodíková. Vrstvy byly odděleny a vodná vrstva byla neutralizována a zředěna ethylacetátem. Vrstvy byly odděleny a organická vrstva byla sušena nad síranem sodným, zfiltrována a zakoncentrována ve vakuu za poskytnutí v názvu uvedené sloučeniny. LC retenční čas v názvu uvedené sloučeniny: 4,9 min.

Příklad 4

Příprava hydrochloridu 5-(4-[3-chlor-T-(3-fluorbenzyloxy)anilino]-6-chinazolinyl)furan-225 karbaldehydu s použitím 5-brom-2-furaldehydu chráněného in šitu

Hydrochlorid V,O-dimethyl hydroxy lam inu (3,04 g; 30,49 mmol) byl suspendován v THF (40 ml) a baňka byla ochlazena na -78 °C (lázeň suchý led-aceton). N-butyllithium (2,5M roztok v hexanech; 24,4 ml; 60,98 mmol) bylo přidáno po kapkách k chladné suspenzi, která se stala homogenní. Lázeň aceton/CO₂ byla nahrazena lázní voda/led (0 °C) a směs změnila barvu na bledě žlutou. Po míchání 15 min při 0 °C byl roztok ochlazen znovu na -78 °C, a po kapkách byl přidán 5-brom-2-furaldehyd (5,00 g rozpuštěných v 10 ml THF; 27,72 mmol). Patnáct minut poté bylo přidávání ukončeno a reakční směs byla ponechána ohřát na 0 °C v lázni voda/led a o 15 min později byla směs ochlazena znovu na -78 °C. O 10 min později byl k chladné směsi najednou přidán triisopropylborát (18,8 ml; 83,16 mmol), potom po kapkách n-butyllithium (2,5M roztok v hexanech; 27,7 ml; 69,30 mmol). Po 30 min při -78 °C byla přidána kyselina octová (6,5 ml; 102,6 mmol) k chladné směsi, která byla potom ponechána ohřát na laboratorní teplotu. Materiál byl použit bez čištění nebo izolace přímo pro Suzukiho reakci.

Do reakční nádoby obsahující surovou kyselinu boronovou byl přidán Λ/A-dimethylacetamid (54 ml), voda (11 ml), jV-{3-chlor^4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fěnyl}-6-jod-4-chinazoIinamin (10,78 g; 21,32 mmol), pevný Na₂CO₃ (6,85 g; 63,97 mmol), a dichlormethanový addukt [1,1bis(difenylfosfino)ferocen]paladia(II) (174 mg; 0,21 mmol) za získání oranžové reakční směsi. Reakční směs byla zahřáta na 80 °C a nebyla zaznamenána změna barvy. Po 28,5 h celkového reakěního času byla reakční směs ponechána ochladit na laboratorní teplotu. Směs byla zředěna THF (54 ml), smísena s aktivním uhlím 100 mesh Darco®G-60 Activated Carbon (696 mg), Hyflo Super Cel® (348 mg) a míchána při teplotě laboratoře >2 h. Sraženiny byly odstraněny odsátím s filtrací přes nálevku s fritou, na které byl nanesen Hyflo Super Cel® a promyty THF (5x22 ml), dokud nebyl již THF zbarven. Filtrát byl smísen s koncentrovanou vodnou HC1 (7,1 ml; 85,3 mmol) a vodou (80 ml) a ponechán míchat při teplotě laboratoře 2 h. Sraženina byla odfiltrována přes nálevku s fritou a propláchnuta 33% směsí isopropanol/voda (54 ml), vodou (54 ml) a 33% směsí isopropanol/voda (54 ml), a potom ponechána sušit na vzduchu 2 h. Žlutavě hnědá pevná látka byla převedena do vakuového exsikátoru a ponechána sušit ve vakuu přes noc.

-18CZ 299561 B6

Reakce poskytla 9,01 g v názvu uvedené sloučeniny (83% výtěžek) jako béžovohnědého prášku. LC retenční čas v názvu uvedené sloučeniny: 4,9 min.

Příklad 5

Příprava 5-(4-[3-chlor-4-(3-fluorbenzyloxy)anilino]-6-chinazolinyl)furan-2-karbaldehydu s použitím in šitu vytvořené kyseliny 4-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]anilino}6-chinazolinylboronové ío 7V-{3-Chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenylJ-6-jod^l-chinazolinamin (200 mg; 0,395 mmol) byl rozpuštěn v THF (2,0 ml) za získání žlutavého roztoku. Směs byla ochlazena na 0 °C (lázeň voda/led) a potom smísena s ethylmagnesiumbromidem (1,0M roztok v THF; 475 μΐ; 0,475 mmol) za získání homogenního jasně žlutého roztoku, který byl ochlazen na -78 °C. Rychle byl přidán triisopropylborát (373 μΐ; 1,582 mmol), potom pomalu n-butyllithium (2,5M roztok v hexanech; 395 μΐ; 0,989 mmol). Když byla reakce podle HPLC u konce, byla přidána kyselina octová (84 μΐ; 1,463 mmol) pro zastavení reakce. Do surové žluté kaše kyseliny boronové v THF byl přidán 5-brom-2-furaldehyd (107 mg; 0,593 mmol), potom N,N-dimethylacetamid (2,0 ml), což způsobilo přechod směsi na homogenní, 1,016N vodný Na₂CO₃ (1,2 ml; 1,185 mmol) a nakonec dichlormethanový addukt [l,l'-bis(difenylfosfino)ferocen]20 paladia(II) (16 mg; 0,020 mmol). Směs byla zahřáta na 80 °C. Kontrola pomocí HPLC po 15 h ukázala 95% čistou konverzi na v názvu uvedenou sloučeninu. LC retenční čas: t=4,9 min.

Příklad 6

Prostorově selektivní příprava 5-(4-[3-chlor-4-(3-fluorbenzyloxy)-anilino]-6-chinazolinyl)furan-2-karbaldehyd-4-methylbenzensulfonátu

Směs 2-furaldehydu (5,7 ml, 69 mmol), octanu draselného (1,4 g, 14 mmol), chloridu paladnatého (61 mg, 0,35 mmol) v 35 ml DMF byla odplyňována 10 min důkladným probubláváním N₂ směsí za míchání. Katalytická směs byla postupně ohřátá na 110 °C. Roztok N-{3-chlor-^l-[(3fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-jod-4-chinazolinaminu (3,5 g, 6,9 mmol) v 55 ml DMF byl odplyněn podobným způsobem a potom přidán ke katalytické směsi pomocí pístové pumpy v průběhu 10 h. Když bylo přidávání ukončeno, byla teplota reakční směsi udržována na 110 °C 2 h. Po ochlazení na teplotu laboratoře byla reakční směs vlita do 125 ml vody. Sraženina byla oddělena na hrubém filtračním papíru a promyta vodou (přibližně 7 ml). Pevná látka byla znovu rozpuštěna v horkém (50 °C) DME. Do tohoto roztoku byl přidán monohydrát kyseliny p-toluensulfonové (2,0 g; 10,4 mmol). Teplota byla snížena na 35 °C a směs byla míchána při této teplotě přes noc. Byla přidána voda (60 ml) pro vyvolání dalšího srážení. Produkt byl oddělen na hrubém filtračním papíru a potom promyt 30 až 40 ml směsi DME: voda (1:1). Filtrační koláč byl sušen při 50 °C s použitím laboratorního rozvodu vakua přes noc za poskytnutí 2,5 g (55 %) v názvu uvedené sloučeniny. 'HNMR (d₆-DMSO) δ: 11,44 (s, 1H), 9,38 (s, 2H), 9,11 (s, 1H), 8,90 (s, 1H), 8,39 (dd, 1H, J=8 a 4 Hz), 7,89 (d, 1H, J=12 Hz), 7,84 (d, 1H, J=4 Hz), 7,60 (dd, 1H, J=8 a 4 Hz), 7,47-7,42 (m, 2H), 7,44 (ΑΑ'ΒΒ', 2H, J_AB=8 Hz), 7,35-7,25 (m, 3H), 7,24 (d, 1H, J=4 Hz), 7,16 (dt, 1H, J=8 a 4 Hz), 7,06 (ΑΑ'ΒΒ', 2H, J_AB=8 Hz, 6,84 (d, 1H, J=4 Hz), 5,27 (s,

2H), 4,43 (s, 2H), 3,61-3,50 (m, 2H), 3,47-3,36 (m, 2H), 3,09 (s, 3H), 2,23 (s, 6H).

Příklad 7

Příprava 5-(4-[3-chlor-4-(3-fluorbenzyloxy)anilino]-6-chinazolinyl)furan-2-karbaldehyd-450 methylbenzensulfonátu

Do dvoulitrové trojhrdlé kulové baňky opatřené mechanickým míchadlem bylo umístěno 74,95 g HCI soli 5-(4-[3-chlor-A-(3-fluorbenzyloxy)anilino]-6-chinazolinyl)furan-2-karbaldehydu

-19CZ 299561 B6 (připravený podobně jako v postupu C, str. 56 WO 99/35146: viz schéma A, postup C výše) a 749,5 ml THF. Do kaše bylo vloženo 84,45 ml 2M NaOH a reakční směs byla míchána 30 min. Vrstvy byly odděleny a organická vrstva byla promyta 160 ml H₂O. Organická vrstva byla rozetřena na kaši s 3,75 g Darco G60 a zfiltrována přes celit. Filtrát byl oddělen a pomalu byl přidán k 33,54 g monohydrátu p-toluensulfonové kyseliny za důkladného míchání. Pevné podíly se pomalu vysrážely při teplotě laboratoře. Směs byla ochlazena na 0 °C a míchána 10 min. Směs byla zfiltrována a vymačkána do sucha gumovou přepážkou, potom sušena ve vakuu při 50 °C přes noc. Výtěžek 5-(4-[3-chlor-4-(3-fluorbenzyloxy)anilino]-6-chinazolinyl)furan-2-karbaldehyd-4-methylbenzensulfonátu byl 84,25 g (88,8 %).

Příklad 8

Příprava bezvodého N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl }-6-[5-({ [2-ýmethansulfbny 1)ethyl]amino}methyl)-2-furyl-4-chinazolinaminditosylátu (bezvodá forma sloučeniny vzorce II)

Do 201itrového reaktoru bylo přidáno 13,3 objemu THF a 0,62 hmotnostního dílu (2,93 mol) NaBH(Oac)₃. 201itrový reaktor byl nastaven pro udržování teploty obsahu na 20 °C. Do druhého 201itrového reaktoru bylo vloženo 1000 g (1,55 mol) 5-(4-[3-chlor-4-(3-fluorbenzyloxy)anilino]-6-chinazolinyl)furan-2-karbaldehyd-4-methylbenzensulfonátu připraveného pos20 tupém z příkladu 7 a 6,7 objemu THF. Do THF roztoku 5-(4-[3-chlor-4-(3-fluorbenzyloxy)anilino]-6-chinazolinyl)furan-2-karbaldehyd-4-methylbenzenesulfonátu bylo přidáno 0,325 objemu (1,86 mol) diisopropylethylaminu a 0,32 hmotnostního dílu 2-(methylsulfon)ethylaminu (321 g, 2,6 mol) a 0,15 objemu IPA. Po 1 h byl získaný roztok imin/THF převeden pomocí vakua do míchané suspenze NaBH(OAc)₃ v prvním 201itrovém reaktoru v průběhu

10 min. Po 90 min byly přidány 4 objemy 5N NaOH v průběhu 40 min pomocí čerpadla. Tento roztok byl ponechán míchat 15 min, a potom bylo míchadlo vypnuto a vrstvy byly ponechány oddělit. Vodná vrstva byla odsáta ode dna reaktoru a organická vrstva byla převedena do prázdného 201itrového reaktoru teflonem vyloženým nerezovým potrubím opatřeným průtokovým filtrem 0,45 pm. K tomuto roztoku byly přidány 2 objemy roztoku THF 4 hmotnostních dílů (1180 g, 6,2 mol) monohydrátu kyseliny p-toluensulfonové v průběhu 5 min. V roztoku se objevila žlutavá sraženina a směs byla ponechána míchat při teplotě laboratoře 12 h. Reakční směs byla odsáta ode dna reaktoru a zfiltrována přes keramický filtr vyložený papírem. Žlutý filtrační koláč byl promyt 1 objemem roztoku směsi 95:5 THF:voda a ponechán sušit na vzduchu přes noc. Po odsávání do sucha 12 h byl žlutý filtrační koláč převeden do dvou skleněných táců a vložen do sušárny (42 °C) napojené na laboratorní rozvod vakua (61 kPa) s promýváním dusíkem. Tyto dva skleněné tácy byly vyjmuty ze sušárny a ponechány ochladit na teplotu laboratoře a byly odebrány příslušné vzorky. Izolovaný výtěžek N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-({[2-(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyl^Hl-chinazolinamindiftosylátu (bezvodý) byl 1264 g (1,3 hmotnostního dílu, 88%; 1 443 g Th) žluté pevné látky.

Přibližně 50 mg produktu bylo převedeno do zařízení pro stanovení vlhkosti Karl Fisher Volumetric Moisture Apparatus (model DL35, Mettler, Hightstown, NJ), přičemž bylo použito postupu doporučeného výrobcem. Obsah vody v bezvodé látce byl 0,31 %.

Příklad 9

Rentgenová difrakce bezvodé ditosylátové soli

Vzorek bezvodé ditosylátové soli připravené podle příkladu 8 byl naprášen na destičku s nulo50 vým pozadím křemíku difraktometru Scintag XDS2000 Diffractometer. Pro získání rentgenového difrakčního obrazu vzorku byly na přístroji nastaveny následující parametry:

-20CZ 299561 B6

45kV 40 mA

0,02 deg

0,1 deg20/min

ON (1 rotation/s)

Geometry: 0/0

Asset: 0038018

Seifert High Voltage ID3000 generátor, S/N 90 67 1422

X-ray tube tower: Seifert type V4,60 kV max, 40 mA max,

X-ray diffraction tube: AEG FK-60 -10 copper anodě tube, 60 kV max, kW max, normál focus (1x10 mm)

Scintag Peltier cooled Si(Li) Solid Stát Detector Model B3A,

Goniometer rádius: 250 mm

Operating Conditions: ío X-ray tube voltage:

X-ray tube current:

Scan Conditions: chopper:

continuous scan modescan rate:

sample spinner:

DS=1 mm; SS(i)=2 mm SS(d)=0,5 mm; RS=0,3 mm DS=divergent slit (incident beam)

SS(i)=scatter slit (incident)

SS(d)=scatter slit (diffracted)

RS=receiving slit

Získané údaje byly analyzovány použitím softwaru DMSNT v. 1,37 firmy Scintag, lne. Získaný obraz rentgenové difrakce je ukázán na obr. 1.

Příklad 10

Příprava monohydrátu N-{3-chlor-N-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-({[2(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminditosylátu (monohydrátová forma sloučeniny vzorce II)

Do 201itrového reaktoru byl vložen 1 hmotnostní díl (930 g, 1,0 mol) bezvodého N-{3-chlor-4[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-({[2-(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminditosylátu připraveného použitím postupu z příkladu 8. K této látce bylo přidáno

10 objemů předem vytvořené směsi 8:2 THF:deionizované vody a reaktor byl zahřát na 65 °C.

Úplné rozpuštění bylo pozorováno při 50 °C. Čirá reakční směs byla převedena do jiného 201itrového reaktoru nerezovým potrubím s pláštěm, které bylo opatřeno průtokovým patronovým filtrem 5,0 pm. Prázdný 201itrový reaktor a potrubí s filtrem byly promyty 0,2 objemu předem smíchaného roztoku 8:2 THF:deionizovaná voda. Pro vymytí materiálu do reakční směsi byl použit další 1 objem předem smíchaného roztoku 8:2 THFNeionizovaná voda. 201itrový reaktor byl zahřát na přibližně -80 °C. Reakční teplota byla potom snížena na 55 °C v průběhu 2 h a potom na 45 °C v průběhu 10 h. Po 10 h byla teplota nastavena na 25 °C a reakční směs byla ponechána míchat při teplotě laboratoře 45 min. Žlutá sraženina byla odsáta ze dna 201itrového reaktoru na keramický filtr vyložený papírem. Průtok byl rychlý a snadný a rychlost filtrace byla velmi dobrá. Žlutý filtrační koláč byl promyt 0,6 objemu předem smíchaného roztoku 8:2 THFNeionizovaná voda a žlutá pevná látka byla sušena vzduchem 4 h a umístěna na skleněný tác. Skleněný tác byl vložen do vakuové sušárny napojené na laboratorní rozvod vakua (přibližně 61 kPa) při 60 °C promývané dusíkem na 2 dny. Po vyjmutí ze sušárny byly provedeny odpovídající odběry vzorků. Výtěžek byl 743 g (0,8 hmotnostního dílu, 80 %; 930 gth) jako jasně žlutá krystalická pevná látka.

Přibližně 50 mg produktu bylo převedeno do přístroje pro stanovení vlhkosti Karl Fisher Volumetric Moisture Apparatus (model DL35, Mettler, Hightstown, NJ), který byl použit podle

-21 CZ 299561 B6 doporučení výrobce. Obsah vody v monohydrátu byl 1,99%, což je v souladu s teoretickou hodnotou 1,92 %.

Příklad 11

Rentgenová difrakce monohydrátu ditosylátové soli

Monohydrát ditosylátové soli připravený podle příkladu 10 byl naprášen na destičku s nulovým pozadím křemíku difraktometru Scintag XDS2000 Diffractometer. Obraz rentgenové práškové ío difrakce vzorku byl získán s použitím následujících parametrů nastavených na přístroji:

Geometry: Θ/Θ

Asset: 0038018

Seifert High Voltage ID3000 generátor, S/N 90 67 1422 15 X-ray tube tower: Seifert type V4,60 kV max, 40 mA max,

X-ray diffraction tube: AEG FK-60 -10 copper anodě tube, 60 kV max, kW max, normál focus (1x10 mm)

Scintag Peltier cooled Si(Li) Solid State Detector Model B3A Goniometer rádius: 250 mm

Operating Conditions:

X-ray tube voltage:

X-ray tube current:

Scan Conditions: chopper:

continuous scan mode scan rate:

sample spinner:

DS=1 mm; SS(i)=2 mm SS(d)=0,5 mm; RS=0,3 mm DS=divergent slit (incident beam)

SS(i)=scatter slit (incident)

SS(d)=scatter slit (diffracted)

RS=receiving slit

45kV 40 mA

0,02 deg 0,25 deg 20/min ON (1 rotation/s)

Údaje byly získány a analyzovány pomocí softwaru DMSNT verze 1.37 získaného od firmy Scintag, Inc. Obraz rentgenové difrakce je ukázán na obr. 2.

Příklad 12

Příprava ditosylátu N—{3—brom—4—[(3—fluorbenzyl)oxy]fenyl}— 6— [5—({[2-{methansulfonyl)40 ethyl]amino}methyl)-furan-2-yl]-4-chinazolinaminu (sloučenina vzorce IV)

HCI sůl 5-(4-[3-bronwt-(3-fluorbenzyloxy)-anilino]-6-chinazolin-yl)-furan-2-karbaldehydu (připravená postupem jako v příkladu C, str. 56 WO 99/35146) byla převedena na tosylátovou sůl podobně jako v postupu z příkladu 7. Získaný furan-2-karbaldehydtosylátový produkt byl použit pro přípravu ditosylátu N-{3-brom—4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-(([2-(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-furan-2-yl]-4-chinazolinaminu postupem jako v příkladu 8.

Příklad 13

Příprava ditosylátu N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[2-({ [2-(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-thiazol-4-yl]^l-chinazolinaminu (sloučenina vzorce III)

-22CZ 299561 B6

HC1 sůl N-{3-chlor-A-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[2-({[2-(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-thiazol-4-yl]-4-chinazolinaminu byla připravena jako v postupu F, str. 57-59 WO 99/35146 a potom byla převedena na ditosylátovou sůl N-{3-chlor-A-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[2-(([2-(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)thiazoM-yl]^4-chinazolinaminu podobně jako v postupu v příkladu 7.

Příklad 14

Konverze monohydrátu ditosylátu N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5ío ({[2(methansulfbnyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminu na bezvodou formu

Přibližně 50 mg monohydrátu ditosylátu N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzylj-oxy]fenyl }-6-[5-({[2(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminu připraveného postupem jako v příkladu 10 bylo naváženo do 1,8 ml lahvičky, do které byl přidán 1 ml MeOH nebo

2-methoxyethanolu. Kaše byla míchána při 25 °C ve vodní lázni 4 dny, potom byla pevná látka oddělena filtrací a sušena s použitím laboratorního rozvodu vakua při 40 °C 1 den. Obraz rentgenové práškové difrakce vysušené pevné látky jak z MeOH, tak i z 2-methoxyethanolu, odpovídal bezvodé formě ditosylátu N-{3-chlor-4-[(3-fIuorbenzyI)oxy]fenyl}-6-[5-({[2(methansulfonyl)-ethyl]amino}-metliyl)-2-fuiyl]-4-chinazolinaminu.

Příklad 15

Konverze bezvodé formy ditosylátu N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5({[2(methansulfonyl)ethyl]amino} methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminu na monohydrát

Do 1 litrové trojhrdlé kulové baňky opatřené vrchním míchadlem bylo vloženo 77,0 g (0,08 mol) bezvodého ditosylátu N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl]-6-[5-(l-[2-(methansulfonyl)ethyl]amino}-methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminu připraveného postupem jako v příkladu 12. Ke žluté pevné látce byla přidána deionizovaná voda (10 objemů) a kaše byla ponechána míchat při laboratorní teplotě. V jednohodinových intervalech byly odebírány malé alikvoty, filtrovány na papíru na Buchnerově nálevce a sušeny ve vakuové sušárně při 60 °C 12 h. Každý vzorek byl analyzován XRD [t=45 min, bezvodá forma; t=2,5 h; bezvodá forma; t=3,5 h, směs bezvodé formy/monohydrátu; t=> 12 h, monohydrát], Reakční kaše byla ponechána stát při teplotě laboratoře 36 h. Jasně žlutý materiál byl potom zfiltrován přes papír na Buchnerově nálevce a sušen na vzduchu přes noc. Tento materiál byl vložen do vakuové sušárny při 55 °C s promýváním dusíkem na 96 h. Izolovaný výtěžek byl 74 g (96 % teorie). Vzorek byl analyzován XRD, která ukázala, že jde o monohydrát ditosylátu N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5—({[2—(methansulfonyl)—ethyl]amino}methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminu.

Příklad 16

Testování sorpce vlhkosti monohydrátu ditosylátu N-{3-chlor-A-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6[5-({[2(methansulfonyl)ethyl]-amino}methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminu

Přibližně 12 mg monohydrátu ditosylátu N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-(([2(methansulfonyl)-ethyl]amino}methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminu připraveného podle příkladu 10 bylo naváženo do lodičky pro vzorky zařízení pro testování sorpce vlhkosti (model č. SGA-100, vyrobený VTI). Vzorek byl sušen při 60 °C v proudu dusíku, dokud nebyl úbytek hmotnosti nižší než 0,015 % v 5 min. Potom byla zvyšována relativní vlhkost (RH) (adsorpce) na

5, 15, 25, 35 , 45 , 55, 65, 75 , 85 a 95% v jednotlivých krocích, přičemž rovnováha byla definována jako hmotnostní změna nižší než 0,015% v 5 min. Potom byla relativní vlhkost snižována (desorpce) na 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 a 20 % za stejných podmínek pro dosažení

-23CZ 299561 B6 rovnováhy. Sorpční křivka (osa y: hmotnost-procenta změny proti ose x: % RH) je ukázána v obr. 3(a).

Příklad 17

Testování sorpce vlhkosti dihydrochloridové soli N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6[5-({[2-(methansulfonyl)ethyl]-amino}methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminu

Přibližně 15 mg dihydrochloridové soli N-13-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-({[210 (methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyl]-4-chinazolinaminu bylo naváženo do lodičky na vzorek zařízení pro zjišťování sorpce vlhkosti (model č. SGA-100, vyrobený VTI). Vzorek byl sušen při 60 °C v proudu dusíku, dokud nebyl úbytek hmotnosti nižší než 0,015 % v 5 min. Potom byla zvyšována relativní vlhkost (RH) (adsorpce) na 5, 15, 25, 35, 45, 55, 65, 75, 85 a 95 % v jednotlivých krocích, přičemž rovnováha byla definována jako hmotnostní změna nižší než 0,015 % v 5 min. Potom byla relativní vlhkost snižována (desorpce) na 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30 a 20 % za stejných podmínek pro dosažení rovnováhy. Sorpční křivka (osa y: hmotnostprocenta změny proti ose x: % RH) je ukázána v obr. 3(b).

Příklad 18

Relativní fyzikální stabilita bezvodé a monohydrátové krystalické formy ditosylátu N-{3-chlor4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-{{[2(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)-2-furyl]-4chinazolinaminu

Pro zjištění relativní fyzikální stability bezvodé a monohydrátové krystalické formy ditosylátu N-{3-chlor-4-[(3-fluorbenzyl)oxy]fenyl}-6-[5-(l-[2-(methansulfonyl)ethyl]amino}methyl)2-furylj^l-chinazolinaminu byla použita metoda rovnováhy v kašovité formě. Tento způsob spočívá v přípravě organických/vodných kaší se známou aktivitou vody obsahující směsi bezvodé a monohydrátové formy. V kaších se vytvoří rovnováha na formu s nejnižší volnou energií, ze které byla zjištěna relativní fyzikální stabilita jako funkce relativní vlhkosti.

Směsi methanolu a vody (MeOH/H₂O) byly připraveny objemovým měřením a koncentrace směsi byla převedena na molámí podíl (X_w) s použitím molekulových hmotností a hustot při laboratorní teplotě (0,787 g/ml pro MeOH a 1,00 g/ml pro H₂O). Aktivita vody (a_w) byla vypočtena z rovnice a_w = 0,0056 + 1,398 X_w - 0,647 X²W + 0,153 X³W + 0,0845 X⁴W (Zhu, H., Yuen, C., Grant, D. J. W., 1996. Influence of water activity in organic solvent + water mixtures on the nátuře of the crystallizing drug phase. 1. Theophylline. Int. J. Pharm. 135, 151— 160).

Do lahviček byly přidány obě krystalické formy v poměru 1:1a byly rekonstituovány se směsmi MeOH/H₂O. Po počátečním smíchání byl odebrán alikvot a byl použit pro analýzu práškovou rentgenovou difrakcí (model PADV, Scintag, Cupertino, CA) pro zjištění, zda jsou detekovatelné vrcholy obou krystalických forem. Vzorky byly míchány a ekvilibrovány při 25 °C ve vodní lázni.

Výsledky v tabulce III ilustrují konverzní obraz krystalické formy jako funkci vypočtené aktivity vody/RH. Rychlost přeměny byla velmi rychlá, jak bylo pozorováno rentgenovou práškovou difrakcí (pXRD), a od prvního dne dále se již neměnila. Obrazy pXRD jsou ukázány na obr. 5.

Homí obrázek ukazuje výsledky pro čisté krystalické bezvodé a monohydrátové formy. Prostřední obrázek ukazuje, že směs 1:1 přecházela v kapalné fázi na bezvodou formu, jestliže aktivita vody byla ekvivalentní 7 % RH. Podobně dolní obrázek ukazuje, že monohydrát je stabilní forma, jestliže aktivita vody je rovna 15 % RH. Souhrn v tabulce III ukazuje, že obecně

-24CZ 299561 B6 přechází monohydrát do termodynamicky stabilní formy v oblasti mezi 7 až 15 % RH, a zůstává stabilní až do 100 % RH.

Tabulka III

Objem vody (%)	Molární podlí vody	Relativní vlhkost (%)	Rovnovážná forma
0	0,00	0	bezvodá
2	0,04	7	bezvodá
5	0,11	15	monohydrát
10	0,20	26	monohydrát
20	0,36	43	monohydrát
40	0,60	66	monohydrát
60	0,77	80	monohydrát
80	0,90	91	monohydrát
90	0,95	95	monohydrát
100	1,00	100	monohydrát

Biologické údaje ío Sloučeniny podle předkládaného vynálezu byly testovány na inhibiční aktivitu vůči proteinovým tyrosinkinázám skupiny ErbB při testech fosforylace substrátu a testech proliferace buněk.

Test fosforylace substrátu

Testy fosforylace substrátu využívají rekombinantní konstrukty exprimované bakulovirem intracelulámích domén c-ErbB-2 a c-ErbB^l, které jsou konstitutivně aktivní, a EGFr izolovaný ze solubilizovaných buněčných membrán A431. Tento způsob měří schopnost izolovaných enzymů katalyzovat přenos g-fosfátu z ATP na tyrosinové zbytky biotinylovaného syntetického peptidů (Biotin-GluGluGluGluTyrFeGluLeuVal). Fosforylace substrátu byla detekována některým z ná20 sledujících dvou postupů:

a) c-ErbB-2, c-ErbB4 nebo EGFr byly inkubovány 30 min, při teplotě laboratoře slOmm MnCl₂, 10 mm ATP, 5 mm peptidem a testovanou sloučeninou (naředěná z 5 mm zásobního roztoku v DMSO, konečná koncentrace DMSO 2 %) ve 40 mm pufru HEPES, pH 7,4. Reakce byla zastavena přidáním EDTA (konečná koncentrace 0,15 mm) a vzorek byl převeden do 96jamkové destičky potažené streptavidinem. Destička byla promyta a hladina fosfotyrosinu v peptidů byla zjištěna použitím antifosfotyrosinové protilátky značené europiem a kvantifikována fluorescenční technikou s časovým rozlišením.

b) ErbB2 byl inkubován 50 min při teplotě laboratoře s 15 mm MnCl₂, 2 mm ATP, 0,25 mCi (9,25 MBq) [g-^{30 * * 33}p]ATP/jamka, 5 mm peptidovým substrátem a testovanou sloučeninou (zředěnou z 10 mm zásobního roztoku v DMSO, konečná koncentrace DMSO 2 %) v 50 mm MOPS, pH 7,2. Reakce byla zastavena přidáním 200 ml PBS s obsahem 2,5 mg/ml kuliček SPA

-25CZ 299561 B6 potažených streptavidinem (Amersham lne.), 50 mm ATP, 10 mm EDTA a 0,1% TX-100. Mikrotitrační destičky byly uzavřeny a kuličky SPA byly ponechány usadit alespoň 6 hodin. Signál SPA byl měřen na scintilačním čítači pro 96-jamkové destičky Packard Topcount (Packard Instrument Co., Meriden, CT).

Testované sloučeniny byly produkty příkladů 8, 12 a 13, v pufrovaném roztoku jak bylo uvedeno. Reprezentativní výsledky jsou ukázány v tabulce IV pro inhibici tyrosinkináz EGFR, ErbB2, a ErbB4. Jsou uvedeny také struktury volné báze solí sloučenin z příkladů 8, 12 a 13.

ío Tabulka IV

Příklad č.	Struktura	EGFR	ErbB2	ErbB4
8		+++	tli	++·
12		+++		++
13		+++	<1 i TT”	+

Hodnoty IC50	Symbol
< 0,10 μΜ	+++
0,10-1,0 μΜ	++
1,0-10,0 μΜ	+
> 10,0 μΜ	-
Nebylo zjištěno	ND

Buněčné testy: Test inhibice růstu s použitím methylenové modři 15

Buněčné linie lidské mléčné žlázy (BT474), hlavy a krku (HN5) a tumoru žaludku (N87) a fibroblasty lidské předkožky (HFF) byly kultivovány v médiu DMEM s nízkým obsahem glukózy

-26CZ 299561 B6 (Life Technologies 12320-032) s obsahem 10% fetálního bovinního séra(FBS) při 37 °C ve zvlhčené atmosféře 10 % CO₂, 90 % vzduchu. Lidská epiteliální buněčná linie HB4a transformovaná SV40 byla transfekovaná buď lidskou H-ras cDNA (HB4a r4.2), nebo lidskou cErbB2 cDNA (HB4a c5.2). Klony HB4a byly kultivovány v médiu RPMI s obsahem 10% FBS, inzulinu (5 pg/ml), hydrokortisonu (5 pg/ml), doplněném selekčním prostředkem hygromycinem B (50 pg/ml). Buňky byly sklizeny použitím směsi trypsin/EDTA, počítány na hemocytometru a vysety do 100 ml vodného média při následujících hustotách do 96 jamkových destiček pro tkáňovou kultivaci (Falcon 3075): BT474 10 000 buněk/jamku, HN5 3000 buněk/jamku, N87 10 000 buněk/jamku, HB4a c5.2 3000 buněk/jamku, HB4a r4.2 3000 buněk/jamku, HFF 2500 buněk/jamku. Následující den byly sloučeniny zředěny DM EM s obsahem 100 mg/ml gentamycinu, na dvojnásobnou koncentraci než je konečná požadovaná koncentrace, z 10 mm zásobních roztoků v DMSO. lOOml/jamku těchto ředění bylo přidáno do 100 ml média, které bylo na destičkách s buňkami. Do kontrolních jamek bylo přidáno médium s obsahem 0,6 % DMSO. Sloučeniny zředěné DMEM byly přidány do všech buněčných linií včetně buněčných linií HB4a r4.2 a HB4ac5.2. Konečná koncentrace DMSO ve všech jamkách byla 0,3%. Buňky byly inkubovány při 37 °C, 10 % CO₂ 3 dny. Médium bylo odstraněno odsátím. Buněčná biomasa byla odhadována barvením buněk ΙΟΟμΙ/jamku methylenové modři (Sigma M9140, 0,5% v 50 : 50 směsi ethanol: voda) a inkubací při teplotě laboratoře alespoň 30 min. Barvivo bylo odstraněno a destičky byly promyty pod mírným proudem vody a sušeny na vzduchu. Pro uvol20 nění barviva z buněk bylo přidáno 100 pl solubilizačního roztoku (1 % N-laurylsarkosin, sodná sůl, Sigma L5125, v PBS) a destičky byly mírně třepány po dobu 30 min. Optická hustota při 620 nm byla měřena na odečítacím zařízení pro mikrotitraění destičky. Procento inhibice růstu buněk bylo vypočteno proti kontrolním jamkám, do kterých bylo přidáno vehikulum. Koncentrace sloučeniny, která inhibuje 50 % růstu buněk (IC₅o) byla interpolována použitím nelineár25 ní regrese (Levenberg-Marquardt) a rovnice y=V_max* (l-(x/(K+x))) + Y2, kde „K“ byla rovna IC50.

Tabulka V ilustruje inhibiční aktivitu sloučenin podle předkládaného vynálezu jako hodnoty IC50 v pM proti řadě tumorových buněčných liniích. Použitím HFF jako reprezentativní lidské normální buněčné linie se hodnoty cytotoxicity uvádí jako IC₅₀ v pM. Uvádí se také míra selektivity mezi normální a tu morovou buněčnou linií.

Tabulka V

Příklad č.	Buňky N87 ICsopM	Buňky BT474 IC50 pM	Buňky HN5 ΙΟΜ pM
8	+++	+++	+++
12	+++	+++	+++
13		4.4.4.	4.4.4.

Hodnota IC50	Symbol
< 5 pM	+++
5 - 25 pM	++
25 - 50 pM	+
> 50 pM	-
Nebylo zjištěno	ND

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Chinazolinaminový derivát vzorce II nebo jeho bezvodá nebo hydrátová forma.
2. 2. Sloučenina podle nároku 1, kde tato sloučenina je v bezvodé formě.

   ío
3. 3. Sloučenina podle nároku 1, kde tato sloučenina je charakterizována obrazem rentgenové práškové difrakce obsahujícím následující vrcholy:

   Dvě theta (°) * Vzdálenosti d (to“m) 4.8 18 8.7 10 18,0 4.9 18,9 4,7 21,0 4,2 22,3 4,0
4. 4. Sloučenina podle nároku 1, kde tato sloučenina je ve formě monohydrátu.
5. 5. Sloučenina podle nároku 1, kde tato sloučenina je charakterizována obrazem rentgenové práškové difrakce obsahujícím následující vrcholy:

   Dvě theta (°) * Vzdálenosti d (io ^l0m) 6,6 13 8,3 10 11,5 7,7 18,1 4,9 21,1 4,2

   -28CZ 299561 B6
6. 6. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství sloučeniny nebo její bezvodé nebo hydrátové formy podle některého z nároků 1 až 5 a jeden nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů, řediv a pomocných látek.
7. 7. Sloučenina nebo její bezvodá nebo hydrátová forma podle některého z nároků 1 až 5 pro použití v lékařství.
8. 8. Použití sloučeniny nebo její bezvodé nebo hydrátové formy podle některého z nároků 1 až 5 ío pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení poruchy charakterizované odchylnou aktivitou proteinové tyrosinkinázy, PTK, ze skupiny receptoru epidermálního růstového faktoru, ErbB.
9. 9. Použití podle nároku 8, kde PTK ze skupiny ErbB je zvolena ze skupiny epidermálního růstového faktoru, EGFr, homologů 2 virového onkogenu erythroblastické leukemie, c-ErbB-2,

   15 a homologů 4 virového onkogenu erythroblastické leukemie, c-ErbB-4.
10. 10. Použití podle nároku 8, kde odchylnou aktivitu mají alespoň dvě kinázy PTK ze skupiny ErbB zvolené ze skupiny EGFr, c-ErbB-2 a c-ErbB—4.

    20
11. 11. Použití sloučeniny nebo její bezvodé nebo hydrátové formy podle některého z nároků 1 až 5 pro výrobu farmaceutického prostředku pro inhibici alespoň jedné PTK ze skupiny ErbB zvolené ze skupiny EGFr, c-ErbB-2 a c-ErbB-4.
12. 12. Použití sloučeniny nebo její bezvodé nebo hydrátové formy podle některého z nároků 1 až 5

    25 pro výrobu farmaceutického prostředku pro inhibici alespoň dvou kináz PTK ze skupiny ErbB zvolené ze skupiny EGFr, c-ErbB-2 a c-ErbB-4.
13. 13. Použití podle nároku 8, kde onemocněním je rakovina nebo lupénka.

    30 14. Použití podle nároku 8, kde onemocněním je rakovina.