CN117700535B - 一种猫泛白细胞减少症病毒vp2蛋白单克隆抗体及其应用 - Google Patents
一种猫泛白细胞减少症病毒vp2蛋白单克隆抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体及其应用，属于生物技术领域。所述单克隆抗体含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区，所述VH和VL均由互补决定区和框架区组成；所述互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成。所述单克隆抗体可用于制备猫泛白细胞减少症病毒检测试剂盒和检测试纸条。本发明所提供的猫泛白细胞减少症病毒荧光定量检测试纸条用于检测猫泛白细胞减少症病毒的感染情况，大大提高了检测灵敏度，降低了检测成本以及缩短了检测时间。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体及其应用。
背景技术
猫泛白细胞减少症是由猫泛白细胞减少症病毒（FPV）引起的一种急性的、高传染性的病毒性疾病，又称猫瘟、猫传染性肠炎。本病毒除感染家猫外，还能感染其他猫科动物（如虎、豹）和鼬科动物（貂）及熊科的浣熊。各年龄的猫均可感染。本病一年四季均可发生，尤以冬春季多发。经粪—口传播，包括直接接触传播和间接接触传播。发病猫可从粪、尿、呕吐物及各种分泌物中排出大量病毒。
FPV是细小病毒科（Parvoviridae）的成员，病毒粒子呈圆形，为单股线状无囊DNA病毒，直径20nm-24nm，呈二十面体对称。在形态学和抗原性上和犬细小病毒（CPV）、貂肠炎病毒等都非常相似。FPV衣壳由VP1、VP2和VP3这3种结构蛋白组成，其中VP2蛋白是细小病毒外壳的主要成分，其不但具有血凝活性，而且也是该病毒诱导机体产生中和抗体的主要保护性抗原。由于VP2蛋白基因序列高度保守，利用VP2蛋白应用于快速检测，检测FPV抗体时具有良好的特异性和敏感性。
FPV的传染性极强，感染FPV的患猫需要隔离饲养，并且需要经常对饲养环境进行消毒，以降低环境中的病毒含量。目前对于该病多采用免疫预防，但是免疫幼猫仍会发生该病，因此除了要积极预防外，有必要进行有效的诊断和治疗。因此，需要通过免疫学等手段设计、筛选猫泛白细胞减少症病毒单克隆抗体来实现对猫泛白细胞减少症病毒快速准确特异性检测识别。
发明内容
为此，本发明提供了一种猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体及其应用。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体，其含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区，所述VH和VL均由互补决定区和框架区组成；
所述单克隆抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示；所述单克隆抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；
所述互补决定区由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述单克隆抗体的VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第48-52位所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第67-86位所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第119-129位所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第44-54位所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第70-76位所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第109-117位所示。
第二方面，编码所述猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示；编码所述单克隆抗体的轻链可变区核苷酸序列如SEQ IDNo. 4所示。
第三方面，所述的猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体，其特征在于制备过程包括：
(a)将猫泛白细胞减少症病毒VP2基因序列优化后构建猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白重组表达载体；
(b)将步骤(a)中的猫泛白细胞减少症病毒重组表达载体转染进入昆虫细胞中，传代表达，收集纯化重组蛋白；
(c)将（b）制备的重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮筛选得到杂交瘤细胞株后制备腹水；
(d)对收集得到的单克隆抗体进行纯化并鉴定。
第四方面，下述（a1）-（a3）中任一种生物材料：
（a1）含有所述猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体编码核苷酸序列的重组穿梭载体；
（a2）含有所述猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体编码核苷酸序列的重组菌；
（a3）含有所述猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体编码核苷酸序列的转基因细胞系。
第五方面，猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体在在制备猫泛白细胞减少症病毒检测试剂盒和/或检测试纸条中的应用。
优选地，所述试纸条为胶体金检测试纸条，或荧光微球检测试纸条，或乳胶微球检测试纸条；
优选地，所述试剂盒为夹心ELISA抗原检测试剂盒或竞争ELISA抗体检测试剂盒。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体，利用该抗体制备的猫泛白细胞减少症病毒荧光定量检测试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。而且可以减少购买商品化FPV单克隆抗体昂贵的成本。本发明试纸条可实现猫泛白细胞减少症病毒的快速检测，为诊断猫泛白细胞减少症提供依据，具有较高的实用价值和推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白纯化后SDS-PAGE鉴定图；
图2为本发明实施例提供的猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体纯化后SDS-PAGE鉴定图。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、猫泛白细胞减少症病毒VP2的制备
1.猫泛白细胞减少症病毒基因合成
根据NCBI上公布的FPV VP2基因序列（GenBank Accession No. X55115.1），将该基因序列做密码子优化后交由武汉金开瑞生物工程有限公司进行基因合成，合成至pFastBac1载体上，选择BamHⅠ和SalⅠ酶切位点，将合成的重组质粒转化至DH10Bac工程菌中，提取重组杆粒，即重组穿梭载体Bacmid DNA，转染进入昆虫细胞中。
2.表达及纯化
（1）重组质粒的制备：对转染后的细胞进行观察，24小时内未出现污染情况，96小时后观察出现病变，收集培养液上清，800rpm 5min进行离心去除沉淀细胞和细胞碎片，留取上清即为P1代杆状病毒。此时病毒滴度通常为1×106~1×107pfu/mL。P1代病毒分装于含2% FBS的培养液中后在-80℃较长期保存。随后用P1代病毒继续感染sf9细胞上清以获得P2代病毒，取P2代病毒细胞和上清进行SDS-PAGE分析，以分析确定目的蛋白是否已经正常表达。以此类推，盲传三代，获得P3代病毒，冻存于-80℃冰箱。
（2）蛋白纯化：将上述得到的重组蛋白进行亲和层析纯化，用Ni预装柱（科诺赛）对破碎后上清液进行纯化。先用10倍柱体积已过滤的双蒸水清洗柱子，再用10倍柱体积的已过滤缓冲A液（20mM PB+300mM NaCl，pH8.0）平衡柱子，然后将已过滤的细胞上清液用0.45μm滤膜过滤后开始上样。上样结束后，再用已过滤的缓冲A液平衡柱子，直至UV峰值基线平稳，先用14% B液洗杂，直至UV峰值基线平稳，再用100% B液（20mM PB+300mM NaCl+500mM咪唑，pH8.0）洗脱目的蛋白，当UV值升高时开始收集洗脱液，直到UV峰值基线下降至100mAu以下停止收集。收集到的目的蛋白洗脱液用A液透析，透析后收集目的蛋白测浓度并于-20℃保存备用。
3.SDS-PAGE检测
使用SDS-PAGE检测纯化效果，如图1所示，发现在70kDa左右有一道明显的条带，与预期蛋白大小相符，且该重组蛋白为可溶性表达，证明已成功表达目的蛋白。经检测后发现，该重组蛋白纯度约95%，可用于制备单克隆抗体。
实施例2、猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备
1.动物免疫
取4只6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，每只免疫50μg实施例1中制备的重组FPV VP2蛋白。首次免疫时，将重组FPV VP2蛋白与弗氏完全佐剂做等体积乳化，皮下多点注射免疫小鼠。共免疫三次，每两周免疫一次，二次免疫和三次免疫均用弗氏不完全佐剂进行抗原乳化，免疫剂量和方式不变。三次免疫后一周对小鼠进行尾静脉采血，取血清并通过间接ELISA方法测其效价。小鼠尾静脉采血，待析出血清后，取血清并用PBS进行倍比稀释，同时空白小鼠血清作为对照。实验组与对照组OD450nm比值大于2.1时最大血清稀释倍数，即小鼠血清效价。选取效价高的小鼠，通过腹膜内注射50μg抗原和弗氏不完全佐剂的等体积1×PBS的乳剂（200μL）进行加强免疫。3天后可进行细胞融合。
2.SP2/0骨髓瘤细胞的培养
将冻存在液氮中的SP2/0骨髓瘤细胞取出一支，立即将其转移到37℃恒温水浴锅中，不时轻柔晃动冻存管，当细胞融化至半冰晶状态时取出。在无菌环境内操作，把冻存管中的SP2/0细胞转入50mL无菌离心管中，取预热的1640完全培养基10mL缓慢滴加入离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清。将细胞团轻柔打散，取5mL培养基重悬细胞并将其转移至T75细胞培养瓶中。另外补加5mL培养基，“十字”方向晃动细胞瓶，放入CO2细胞培养箱，37℃环境下培养。显微镜观察细胞状态，当密度约为80%时，对SP2/0细胞进行传代培养。
3.细胞融合
（1）收集血清：取加强免疫后的实验鼠进行眼眶采血，收集在EP管中，37℃静置2h后，4000rpm离心10min，收集血清为后续筛选单克隆抗体作为阳性对照使用。小鼠脱颈处死并将其放在75%酒精中浸泡消毒。
（2）脾细胞的制备：在生物安全柜内使用已灭菌的剪刀和镊子剪开小鼠外皮，更换一套新的已灭菌的剪刀和镊子剪开小鼠腹腔，再用一套已灭菌的剪刀和镊子小心取出整个脾脏，剔除多余的脂肪。准备一支无菌的15mL离心管，加入10mL DMEM培养基，将脾脏放入该离心管中，脾脏润湿后小心弃去多余培养基。再吸取10mL的DMEM培养基置于无菌平皿中，用无菌注射器末端研磨脾脏，制成单细胞悬液并通过200目尼龙网过滤到无菌离心管中，在50mL无菌离心管中加入30mL的DMEM，用吸管冲洗尼龙网，将装有脾细胞悬液的离心管离心，1500rpm 5min，弃去上清，用手轻轻打散细胞团，再加入30mL DMEM培养基重悬后再离心一次，弃去上清，用手轻轻打散细胞团，再加入10mL DMEM培养基重悬。
（3）细胞融合：将生长良好的SP2/0细胞1000rpm 5min离心，收集于50mL离心管中，轻轻打散SP2/0细胞团，加入30mL DMEM培养基进行重悬，再次离心后，加入10mL DMEM培养基进行重悬。再将脾细胞悬液与SP2/0细胞悬液混合，1000rpm 5min离心，弃去上清，轻轻打散细胞团。置于37℃水浴环境中，吸取1mL PEG融合剂滴加到离心管中，1min内加完1mL，此时细胞状态为红色均质流沙状，转动管壁感觉像毛玻璃状。
（4）终止融合：吸取9mL预热的DMEM培养基进行终止融合，共分为三个阶段。第一阶段为前1min内滴加1mL，第二阶段为1min内滴加1mL，第三阶段为3min内滴加完剩余的7mL培养基。然后在37℃水浴中静置稳定5min后，800rpm 5min离心。
（5）铺板：弃去上清，轻轻打散细胞团，加入HAT培养基100μL/孔，混匀细胞后，将融合细胞悬液均匀铺于已加入饲养层细胞的96孔细胞板中，100μL/孔，放入CO2细胞培养箱37℃条件下培养。
4.阳性杂交瘤细胞的筛选
细胞融合后7天，观察到细胞团比较大时，用间接ELISA法对细胞上清进行检测。以1μg/mL的重组FPV VP2蛋白和重组猫血清淀粉样蛋白A（SAA重组蛋白）分别作为检测用的抗原，阳性对照是融合小鼠的血清，阴性对照为PBS免疫小鼠血清。选取显色反应最强、同时与猫SAA重组蛋白不反应的杂交瘤细胞孔确定为阳性孔。将筛选到的阳性杂交瘤细胞进行有限稀释法亚克隆。将亚克隆后鉴定得到的能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株扩大培养，转移至T75细胞瓶中，培养至细胞数量约80%时，可收集为制备腹水做准备。
5.腹水制备
细胞瓶中加入10mL的无菌1×PBS，将细胞层吹下，重悬后将其转移到15mL离心管中，1000rpm 10min离心。弃上清，沉淀另取1mL无菌1×PBS重悬混匀，用1mL注射器吸取。每只小鼠注射约500μL的细胞悬液，注意小鼠生长状态，一周后待小鼠腹部涨大时方可收集腹水。收集小鼠腹水于离心管中，8000rpm 20min离心，吸取中间腹水层。
6.单克隆抗体的纯化
对收集到的腹水先进行辛酸-硫酸铵法粗纯化，再使用Protein G预装柱对粗纯化的单抗进行二次纯化。SDS-PAGE鉴定纯化后的单克隆抗体纯度，结果见图2，纯度约96%。测该单抗浓度为1.53mg/mL。
实施例3、猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体的鉴定
1.单克隆抗体亚类鉴定
使用Sigma公司的IgG亚类鉴定试剂盒对实施例2中得到的猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体进行检测，结果表明实施例2中得到的猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体重链为IgG1型，轻链为κ链。
2.单克隆抗体特异性鉴定
分别取猫泛白细胞减少症病毒VP2（FPV VP2）、猫血清淀粉样蛋白A（SAA）、猫杯状病毒VP1（FCV VP1）和猫肠道冠状病毒S蛋白（FCoV-S）按照1μg/mL进行包被，1mg/mL的实施例2中制备的单克隆抗体做1:5000稀释，验证单抗的特异性。结果如表1所示，实施例2中制备的猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体与猫SAA、猫FCV VP1和猫FCoV-S均不发生特异性反应，表示其特异性良好。
表1单克隆抗体特异性鉴定结果
3.单克隆抗体灵敏性鉴定
采用间接ELISA方法检测FPV VP2单克隆抗体灵敏度。FPV VP2蛋白按照1μg/mL进行包被，将1mg/mL的实施例2中制备的单克隆抗体做梯度稀释，验证单抗的灵敏度，结果见表2。结果表明，该单克隆抗体灵敏度良好，灵敏度可达到1:51200倍稀释。
表2单克隆抗体灵敏性鉴定结果
实施例4、猫泛白细胞减少症病毒VP2单克隆抗体重链和轻链可变区基因克隆
1.杂交瘤细胞培养及总RNA提取
用RPMI 1640完全培养基在37℃、5%二氧化碳条件下培养杂交瘤细胞，使细胞数量达到1×107时用总RNA提取试剂盒（购自天根）提取细胞中的总RNA。
2.cDNA第一链的合成
使用反转录试剂盒（购自TAKARA），以提取到的总RNA为扩增模板来合成cDNA第一链。
3.基因扩增
设计Light链，Heavy链的上游及下游引物。
引物序列如下所示：
F（SEQ ID No. 5）: AAGCAGTGGTATCAACGCAGA；
Rκ（SEQ ID No. 6）: AACATTGATGTCTTTGGGGTAGAA；
Rλ（SEQ ID No. 7）: AATCGTACACACCAGTGTGTGGG；
RH（SEQ ID No. 8）: AGGGATCCAGAGTTCCAGGT。
以cDNA第一链为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL。模板3μL，上游引物（10μM）2.5μL，下游引物（10μM）2.5μL，2×Taq酶25μL，无菌水17μL。
降落PCR反应条件为：98℃ 30s；98℃ 15s，64℃-58℃ 30s，每次下降0.5℃，直到58℃，循环10次；72℃ 30s；98℃ 15s，56℃ 30s，72℃ 30s，循环15次；72℃ 7min结束程序。
4.PCR扩增产物的克隆和筛选
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用PCR产物回收试剂盒（购自天根）回收Kappa链，Lambda链和Heavy链扩增片段，用pLB零背景快速克隆试剂盒（购自天根）将回收纯化的目的片段插入pLB载体中，转化至DH5α感受态细胞（氨苄抗性）中，筛选重组阳性克隆并进行测序。
Kappa链和Heavy链测序结果如下：
Heavy链氨基酸序列（SEQ ID No. 1）
MQLLSCIALSLALVTNSQVQLQQSGAELVKPGASVRMSCRAFGYTFSSYLIEWMKQNHGKSLEWIGNFYSYDHQATAKKYYEKFKGKAKLTVEKSSSTVYLELSRLTSDDSAVYYCARRGYGRFYHFDYWGQGTTLTVSS。
Heavy链核苷酸序列（SEQ ID No. 2）
ATGCAGCTGCTGTCTTGCATCGCCCTGTCTCTGGCTCTGGTGACCAATAGCCAGGTGCAGCTGCAGCAGAGCGGAGCAGAACTGGTGAAGCCAGGAGCCAGCGTGAGAATGTCTTGCAGGGCCTTCGGCTACACCTTCAGCAGCTACCTCATCGAGTGGATGAAGCAGAACCACGGCAAGAGCCTCGAGTGGATCGGAAACTTCTACAGCTACGACCACCAAGCCACCGCCAAGAAGTACTACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCAAGCTGACCGTGGAGAAGAGCAGCAGCACCGTGTACCTGGAGCTGAGCAGACTGACCAGCGACGATAGCGCCGTGTACTATTGCGCCAGAAGAGGCTACGGCCGGTTCTACCACTTCGACTATTGGGGCCAGGGAACCACCCTGACAGTGTCTTCT。
Kappa链氨基酸序列（SEQ ID No. 3）
MYRMQLLSCIALSLALVTNSDIQMTQTTFSLSVFLGDRVTISCRASKDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTCRLYSGVPSRFSGSGSGTDYSLLISNLEQEDIATYFCQQGKTLPWTFGGGTKLELK。
Kappa链核苷酸序列（SEQ ID No. 4）
ATGTACCGCATGCAGCTGCTGTCTTGCATCGCTCTGTCTCTGGCCCTGGTGACCAATAGCGACATCCAGATGACCCAGACCACCTTCAGCCTGAGCGTGTTTCTGGGCGACAGAGTGACCATCTCTTGCAGAGCCAGCAAGGACATCCGGAACTACCTGAATTGGTACCAGCAGAAGCCCGACGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACTACACCTGCAGACTGTACAGCGGCGTGCCTTCTAGATTCAGCGGCAGCGGAAGCGGCACCGATTACAGCCTGCTGATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTCTGCCAGCAGGGAAAGACCCTGCCTTGGACATTTGGCGGAGGCACCAAGCTGGAGCTGAAG。
5.可变区核苷酸序列和氨基酸序列及同源性分析
将重链和轻链基因序列分别在NCBI数据库中进行比对分析，分析结果显示单克隆抗体重链氨基酸序列与小鼠免疫球蛋白重链氨基酸序列（Sequence ID:BAN13749.1）同源性最高，同源性为99/124，同源性百分比为80%。单克隆抗体重链基因序列与BLAST结果未有与其相匹配的。单克隆抗体轻链氨基酸序列与小鼠免疫球蛋白Kappa链氨基酸序列（Sequence ID: AAT76279.1）同源性最高，同源性为97/107，同源性百分比为91%。单克隆抗体轻链基因序列与小鼠免疫球蛋白Kappa链（Sequence ID:OK564404.1）同源性最高，同源性为271/323，同源性百分比为84%。编码单克隆抗体的重链和轻链基因序列和氨基酸序列同源性分析结果表明，未发现与本发明相同的序列。
6.CDR区分析
本发明实施例的猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体的VH和VL均由互补决定区和框架区组成；互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成。
将重链可变区和轻链可变区序列，在HTTP://www.novopro.cn/tools/cdr.html用Kabat定义方案进行分析，得出其CDR区。
抗体重链CDR区：
CDR-H1：SYLIE；
CDR-H2：NFYSYDHQATAKKYYEKFKG；
CDR-H3：RGYGRFYHFDY。
抗体轻链CDR区：
CDR-L1：RASKDIRNYLN；
CDR-L2：YTCRLYS；
CDR-L3：QQGKTLPWT。
实施例5、猫泛白细胞减少症病毒荧光定量检测试纸条的制备
猫泛白细胞减少症病毒荧光定量检测试纸条结构由底板、样品吸收垫、硝酸纤维素膜、吸水纸、检测线、质控线和结合物释放垫组成。
具体制作步骤：
步骤一：时间分辨荧光微球标记FPV VP2蛋白单克隆抗体和鸡IgY
1.猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白标记物的制备
1）时间分辨荧光微球的稀释：取粒径为200nm的时间分辨荧光微球超声5min，取100μL微球加入900μL MES（50mmol/L，pH 6.0）。16000r/min离心10min，去掉上清，加入1mLMES重悬微球，再次16000r/min离心10min，去掉上清，加入MES重悬微球；
2）微球的活化：各称取20mg NHS和EDC，用标记缓冲液溶解，现用现配，即20mg/mLNHS和EDC；取10μL NHS，加入到清洗后的微球中，快速混匀；然后再取5μL EDC加入到微球中，快速混匀，室温孵育20min；
3）清洗去除残留的EDC：将活化后的微球16000r/min离心10min，去掉上清，加入相1mL MES重悬微球；16000r/min离心10min，弃上清，加入1mL MES重悬微球，备用；
4）时间分辨荧光微球与抗体的偶联：加入0.02mg猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体，加入活化后的微球，快速混匀后，室温孵育2h；
5）封闭：加入与量取的微球的相同体积加入封闭液（10% BSA），室温孵育1 h；
6）去除未结合的抗体：16000r/min离心10min，弃上清，加入1mL MES重悬微球。重复两次，去除未结合的抗体；
7）重悬复溶：最后用1mL（0.02M Tris-HCL+20%蔗糖+20%海藻糖，pH 8.0）重悬微球，即为抗体-微球标记复合物，4℃放置备用。
2.鸡IgY标记物的制备
1）时间分辨荧光微球的稀释：取粒径为200nm的时间分辨荧光微球超声5min，取100μL微球加入900μL MES（50mmol/L，pH 6.0）。16000r/min离心10min，去掉上清，加入1mLMES重悬微球，再次16000r/min离心10min，去掉上清，加入的MES重悬微球；
2）微球的活化：各称取20mg NHS和EDC，用标记缓冲液溶解，现用现配，即20mg/mLNHS和EDC；取10μL NHS，加入到清洗后的微球中，快速混匀；然后再取5μL EDC加入到微球中，快速混匀，室温孵育20min；
3）清洗去除残留的EDC：将活化后的微球16000r/min离心10min，去掉上清，加入相1mL MES重悬微球；16000r/min离心10min，弃上清，加入1mL MES重悬微球，备用；
4）时间分辨荧光微球与抗体的偶联：加入0.01mg鸡IgY，加入活化后的微球，快速混匀后，室温孵育2h；
5）封闭：加入与量取的微球的相同体积加入封闭液（10% BSA），室温孵育1h；
6）去除未结合的抗体：16000r/min离心10min，弃上清，加入1mL MES重悬微球。重复两次，去除未结合的抗体；
7）重悬复溶：最后用1mL复溶液重悬微球，即为抗体-微球标记复合物，4℃放置备用。
复溶液：含20％海藻糖、20%蔗糖（质量分数）、pH 8.0的0.02mol/L的Tris-HCl缓冲液。
步骤二：结合物释放垫的制备
结合物释放垫的前处理：配制含5%蔗糖、5%海藻糖、0.5%国药Tween 20、0.1%酪蛋白、pH 8.0的0.02M Tris-HCL结合垫处理液）。将玻璃纤维放入上述配制的结合垫处理液中，要求液体淹没过纸张，然后在轨道摇床上摇晃30min后脱水，40℃烘箱过夜烘干。
用金标喷金仪将制备好的时间分辨荧光微球标记的猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体和鸡IgY均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂2.5μL有时间分辨荧光微球标记的猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体和鸡IgY的结合物，然后置于40℃环境中16h后取出，置于干燥环境中保存备用。
步骤三：样品垫的处理
样品垫处理液：配制含0.8% BSA（IgG Free）、0.1%酪蛋白、0.6%曲拉通-100、0.03%PC-300、pH 8.0的0.1M Tris-HCL样品垫处理液。将玻璃纤维放入上述配制的样品垫处理液中，要求液体淹没过纸张，然后在轨道摇床上摇晃30min后脱水，40℃烘箱过夜烘干。
步骤四：硝酸纤维素膜的制备
将猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，将兔抗鸡IgY包被在硝酸纤维素膜上构成质控线。
包被过程：用0.05mol/L、pH 7.2磷酸缓冲液将猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体稀释到0.5mg/mL，用金标划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T），包被量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH 7.2的磷酸盐缓冲液将鸡IgY稀释到20μg/mL，用金标划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C），包被量为1.0μL/cm。将包被好的硝酸纤维素膜置于40℃条件下干燥16h，备用。
步骤五：各部件的组装
将样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水纸依次按顺序粘贴在PVC底板上；结合物释放垫从起始端有1/4区域被样品吸收垫覆盖，硝酸纤维素膜从起始端有1/4区域被结合物释放垫覆盖，硝酸纤维素膜的末端与吸水纸的始端相连，样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，吸水纸的末端与PVC底板的末端对齐；硝酸纤维素膜上有检测线（T）和质控线（C），检测线和质控线均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧。将试纸条用机器切成4.05mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。
实施例6、实施例5中所述试纸条的使用
步骤一：样本的制备
将试纸条和样本稀释液恢复至室温（20~25℃）。用一次性棉签在猫肛门旋转3圈采集样本，将棉签在样本稀释液中充分搅拌，手持棉签杆使棉签头部来回挤压管壁5次头丢弃，盖紧管盖，充分混匀后，静置，上层澄清部分即为待测液。样本采集后应立即检测，若采样后不立即使用可于2~8℃暂存2天；若长期保存，应放于-20℃及以下保存。
步骤二：试纸条检测
长按荧光免疫分析仪开机键开机。取已恢复至室温的上述样本，以移液器准确吸取100μL垂直加入样本稀释液中混匀，加样后立即将试纸条插入荧光免疫分析仪检测孔内，按下“标准测试”，仪器倒计时5min自动读值。样本加入不足或液体未完全爬过检测线，仪器将出现“无效”结果，此时，应使用新卡重新测试。
步骤三：检测结果判读
数值≤10IU，判定为阴性；数值>10IU且≤30IU，判定为弱阳性；数值>30IU，判定为阳性。
具体结果解释如表3所示。
表3猫泛白细胞减少症病毒荧光定量检测试纸条具体检测结果判读
实施例7、实施例5中所述试纸条的评价
1.灵敏度测定
将FPV VP2阳性质控品用样本稀释液配制成系列浓度（mg/L）：12.5mg/L、6.25mg/L、3.125mg/L、1.56mg/L、0.78mg/L、0.39mg/L，0mg/L，分别用试纸条进行检测，T线发光值随阳性质控样浓度的增高而增加，说明该检测试纸条灵敏度较好，见表4。
表4猫泛白细胞减少症病毒荧光定量检测试纸条灵敏度测试
2.特异性测定
用猫泛白细胞减少症病毒荧光定量检测试纸条测试5倍稀释的猫杯状病毒、猫疱疹病毒和猫冠状病毒，T线发光值都很低，见表5。结果表明该检测试纸条和猫杯状病毒、猫疱疹病毒和猫冠状病毒没有交叉，特异性较好。
表5猫泛白细胞减少症病毒荧光定量检测试纸条的特异性鉴定
3.重复性测定
用3个批次的猫泛白细胞减少症病毒荧光定量检测试纸条测试质控品3.125mg/L、1.56mg/L、0.78mg/L，每批次平行测试5条，T线发光值无明显差异（见表6），说明该检测试剂盒批内和批间重复性良好。
表6猫泛白细胞减少症病毒荧光定量检测试纸条的重复性鉴定
4.稳定性测定
试纸条的稳定性验证通常采取37℃老化60天进行监控检测，最终判断结果以37℃与4℃的检测结果进行对比，同时符合产品性能要求。分别在4℃与37℃老化直至60天，分别在0天、3天、7天、14天、30天及60天取出，并用其检测实际样品，与第0天产品相比，T值无明显变化，表明该检测试纸条稳定性合格，CV均<10%，见表7。
表7猫泛白细胞减少症病毒荧光定量检测试纸条的稳定性鉴定
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (4)
1.一种猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区；
所述单克隆抗体的VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示；
所述单克隆抗体的VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示；
所述VH和VL均由互补决定区和框架区组成，所述互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述单克隆抗体的VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第48-52位所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第67-86位所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第119-129位所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第44-54位所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第70-76位所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 3中第109-117位所示。
2.根据权利要求1所述的猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体，其特征在于：
编码所述单克隆抗体的VH的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示；
编码所述单克隆抗体的VL的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示。
3.根据权利要求1-2任一项所述的猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体，其特征在于制备过程包括：
(a)将猫泛白细胞减少症病毒VP2基因序列优化后构建猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白重组表达载体；
(b)将步骤(a)中的猫泛白细胞减少症病毒重组表达载体转染进入昆虫细胞中，传代表达，收集纯化重组蛋白；
(c)将（b）制备的重组蛋白多次免疫Balb/c小鼠后，取其脾脏细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经过多轮筛选得到杂交瘤细胞株后制备腹水；
(d)对收集得到的单克隆抗体进行纯化并鉴定。
4.根据权利要求1-3任一所述的猫泛白细胞减少症病毒VP2蛋白单克隆抗体在制备猫泛白细胞减少症病毒检测试剂盒和/或检测试纸条中的应用。
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