CN116462754A

CN116462754A - 一种识别犬瘟热病毒n蛋白的单克隆抗体、检测试剂及应用

Info

Publication number: CN116462754A
Application number: CN202310688246.1A
Authority: CN
Inventors: 盛有鑫; 张琼林; 巩玉洁; 赵荣茂; 陈娟; 袁婷婷; 赵方圆; 杨晓霞; 杜帅龙
Original assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Current assignee: Beijing Nabai Bio Tech Co ltd
Priority date: 2023-06-12
Filing date: 2023-06-12
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2043-06-12
Also published as: CN116462754B

Abstract

本发明公开了一种识别犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体、检测试剂及应用，所述单克隆抗体含有名称为V_H的重链可变区和名称为V_L的轻链可变区，所述V_H和V_L均由互补决定区和框架区组成。试验证明，本发明提供的单克隆抗体在制备用于检测犬瘟热病毒夹心ELISA抗原检测试剂盒和犬瘟热病毒胶体金检测试纸条中，对犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒均无明显交叉反应，具有良好的特异性和更高的灵敏度，与病毒分离鉴定经典方法符合率高。

Description

一种识别犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体、检测试剂及应用

技术领域

本发明涉及动物疫病快速生物检测技术领域，具体涉及一种识别犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体、检测试剂及应用。

背景技术

犬瘟热（caninedistemper，CD）是由副黏病毒科麻疹病毒属的犬瘟热病毒（caninedistemper virus，CDV）引起的一类高度接触性、致死性传染病，常导致全身性包括呼吸系统、胃肠道、中枢神经系统等疾病，且容易继发其他细菌、病毒的混合感染和二次感染，死亡率高达80%。近几年，随着宠物犬养殖数量的增多，犬瘟热的发病率也在增加。

犬瘟热病毒颗粒的形状是不规则的圆形，在室温条件下病毒不稳定。犬瘟热病毒对紫外线的照射、干燥的空气和高温环境都很敏感，但在2~8℃可保存较长时间。犬瘟热病毒的抵抗力十分差，常规消毒方法如有机溶剂、紫外线照射、乙醚、来苏儿、甲醛等常规消毒剂可以快速灭活犬瘟热病毒，pH值4.5以下或pH值9.0以上的强酸或强碱性环境中均可以快速使其失活。

犬瘟热病毒是有囊膜的单股负链RNA病毒，其基因组全长约为15kb，包括38个核苷酸构成的5’端前导序列和55个核苷酸构成的3’端前导序列，前导序列具有启动调节序列、指导基因转录过程的功能，还能够调控犬瘟热病毒基因转录终止、重启的过程。犬瘟热病毒的整个基因组包括有6个非重叠编码区，6个开放阅读框分别编码6种结构蛋白，从3’到5’端依次为核衣壳蛋白（N）、膜蛋白（M）、磷蛋白（P）、融合蛋白（F）、血凝素蛋白（H）、大蛋白（L）。其中N蛋白是犬瘟热病毒的蛋白中含量最高的，N蛋白有包裹及保护内部基因的功能，在犬瘟热病毒感染的早期免疫应答中起着重要作用，与细胞核定位和病毒复制及其相关。不仅如此，N蛋白是保守性较强的免疫原性蛋白。

研究表明，N蛋白分子量约为58kDa，N蛋白共有1683个氨基酸，根据其保守性，N蛋白一共可以划分为三个区，第一个区是N末端（17aa-159aa）的一段可变序列，接着是一段高度保守的序列（160aa-407aa）和C端的一段可变区（408aa-519aa）。高度保守性的N蛋白含量最高，主要由NP蛋白构成，是麻疹病毒属的主要交叉抗原。犬瘟热病毒的RNA牢牢地缠绕在NP蛋白上，形成螺旋状的核衣壳结构。在犬瘟热病毒感染宿主细胞的过程中，N蛋白能够刺激机体产生强烈的体液免疫反应，在感染的早期就能检测到大量针对N蛋白的抗体，远远早于针对F、H等蛋白产生的中和抗体。

目前犬瘟热病毒病原诊断的方法有病毒分离鉴定、免疫酶检测、免疫组织化学检测、RT-PCR等多种检测手段，犬瘟热病毒抗体诊断的方法有血清中和试验、酶联免疫吸附试验、免疫层析分析等免疫学检测手段。但病毒分离鉴定等经典方法涉及病毒感染，细胞培养等试验过程，对试验人员要求高，操作时间长，可重复性低，更适用于实验室检测，不适用于临床检测中的广泛应用。

通过基因工程表达系统制备高保守性的N蛋白，免疫小鼠利用杂交瘤细胞技术筛选灵敏度高、特异性高的单克隆抗体，获得优质的抗原抗体原料后利用酶联免疫吸附试验、胶体金免疫层析等免疫学技术，为建立特异性强，敏感性高，简便快速的试纸条及ELISA方法，用于犬临床样品中犬瘟热病毒抗原或抗体的批量检测。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种识别犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体、检测试剂及应用，具体包括如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种抗犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体含有名称为V_H的重链可变区和名称为V_L的轻链可变区，所述V_H和V_L均由互补决定区和框架区组成；

所述互补决定区由CDR1、CDR2、CDR3组成；

所述单克隆抗体的V_H的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第31-35位所示；

所述单克隆抗体的V_H的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第50-66位所示；

所述单克隆抗体的V_H的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 1中第99-111位所示；

所述单克隆抗体的V_L的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 2中第24-34位所示；

所述单克隆抗体的V_L的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 2中第50-56位所示；

所述单克隆抗体的V_L的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 2中第89-97位所示。

第二方面，所述单克隆抗体的V_H的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示；

所述单克隆抗体的V_L的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示。

第三方面，编码所述单克隆抗体的V_H的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示；

编码所述单克隆抗体的V_L的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示。

第四方面，所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体。

第五方面，本发明提供一种抗犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体在制备检测犬瘟热病毒N蛋白的试纸条或试剂盒中的应用。

优选地，所述试纸条为胶体金检测试纸条，或荧光微球检测试纸条，或乳胶微球检测试纸条；

优选地，所述试剂盒为夹心ELISA抗原检测试剂盒或竞争ELISA抗体检测试剂盒。

本发明实施例具有如下优点：

试验证明，本发明提供的单克隆抗体在制备用于检测犬瘟热病毒夹心ELISA抗原检测试剂盒和犬瘟热病毒胶体金检测试纸条中，对犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒均无明显交叉反应，具有良好的特异性和更高的灵敏度，与病毒分离鉴定经典方法符合率高。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。

图1为本发明实施例提供的纯化的犬瘟热病毒N蛋白的SDS-PAGE电泳分析图；

图2为本发明实施例提供的纯化的犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳分析图；

图3为本发明实施例提供的犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体重链可变区核苷酸序列同源性分析图；

图4为本发明实施例提供的犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列同源性分析图；

图5为本发明实施例提供的犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体重链可变区氨基酸序列同源性分析图；

图6为本发明实施例提供的犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列同源性分析图；

图7为本发明实施例提供的犬瘟热病毒胶体金检测试纸条特异性鉴定结果图；

图8为本发明实施例提供的犬瘟热病毒胶体金检测试纸条灵敏度鉴定结果图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、犬瘟热病毒N蛋白的制备

本实施例提供一种犬瘟热病毒N蛋白的制备方法，具体步骤为：

步骤一、重组载体的构建

根据GenBank中登录的犬瘟热病毒CDV序列（NC_001921.1），将密码子进行优化能够更好的适应昆虫细胞表达，合成优化后的CDV-N全长基因于pFastBac™1-HTB载体，选择BamHI、SalI为酶切位点，将合成的重组质粒转化进入DH10Bac工程菌中，涂布在有三抗的培养基平板上，48小时后平板上出现蓝色和白色两种颜色的菌落，挑取白色菌落使用LB培养基稀释后划线，待48小时后，挑取单菌落，提取质粒，使用M13引物进行鉴定正确后，即重组穿梭载体Bacmid DNA。

步骤二、重组质粒的制备

将M13引物鉴定正确的质粒进行扩大培养，培养昆虫细胞SF9细胞，待细胞汇合率为50%时，将步骤一中的重组穿梭载体Bacmid DNA，转染进入昆虫细胞中，每天观察细胞，3天后细胞发生明显病变，细胞膨胀，漂浮，第五天收集P1代杆状病毒。转染96小时后，收集培养液上清，800rpm离心5分钟，弃去沉淀细胞和细胞碎片，取上清即为P1代杆状病毒。此时病毒滴度通常为1×10⁶-1×10⁷pfu/ml。P1代病毒可短期保存于4℃，或分装于含2% FBS的培养液中后在-80℃较长期保存。反复冻融会大大降低病毒活力，其滴度有可能降低10至100倍。

P1代病毒再次感染昆虫细胞可获得P2代病毒。如果采用悬浮培养的昆虫细胞进行病毒扩增，建议使用10ml培养液并且控制细胞密度为2×10⁶/ml。如果使用6孔板贴壁培养的细胞进行扩增，细胞密度应为2×10⁶/well，MOI （multiplicity of infection）为0.05-0.1，即每100个细胞用5-10pfu的病毒进行感染。27℃培养48-72小时后，70-80%的细胞死亡时，收集细胞和上清，800rpm心5分钟，取上清即为P2代病毒。此时病毒滴度约为1×10⁷-1×10⁸pfu/ml，可收集本步骤离心后的细胞碎片沉淀，进行SDS-PAGE电泳分析以确定目的蛋白是否已经正常表达。

步骤三、重组蛋白的纯度鉴定

将步骤二获得的重组蛋白进行亲和层析纯化，对纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，测定蛋白的纯度，具体步骤如下：

配制得到12%的分离胶，5%的浓缩胶。将分离胶液体小心注入1.5mm玻璃板间隙内，至高度为10cm，纯水封顶，室温静止20min，弃纯水，在上面加入浓缩胶液体，高度为1cm，小心插入梳子，避免胶内混入气泡，室温凝固10min。待胶体凝固后，固定于电泳槽中，加入电泳液。将20μl样品加入1/4体积5×上样缓冲液混匀，100℃煮沸10min。每孔上样20μl，电压为80V，20min后将电压调整为120V。50min后待溴酚蓝抵达分离胶底部处，结束电泳。取出胶体，完全浸入考马斯亮蓝染液中，振荡染色1 h，然后清水洗涤胶体，去除多余染色液后换脱色液脱色，每1h更换一次脱色液，直至蛋白条带清晰，分析蛋白的条带。如图1所示，可看到在71kDa处出现目的条带，条带清晰，没有杂带，达到纯化要求。

实施例2、犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体制备

本实施例提供犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体的制备方法，具体步骤为：

步骤一、动物免疫

将实施例1中杆状病毒表达系统制备并纯化后的犬瘟热病毒N蛋白作为免疫原，与弗氏完全佐剂等量混合，充分乳化。首次免疫剂量为每只BALB/C小鼠50μg，后续以同样的方法用弗氏不完全佐剂乳化蛋白，每支小鼠50μg，皮下多点免疫。每次免疫间隔2~3周。第3次免疫后第7天进行小鼠尾尖采血测试效价，小鼠尾血采集后放入4℃静置30min，析出血清，取血清用PBS进行倍比稀释，同时空白小鼠血清作为对照，处理方法同小鼠血清，实验组与对照组OD_450nm比值大于2.1时最大血清稀释倍数即小鼠血清效价。选取效价高的小鼠，通过腹膜内注射50μg抗原和弗氏不完全佐剂的等体积PBS的乳剂（200μl）来加强免疫。3天后将小鼠处死，进行细胞融合。

步骤二、细胞融合

将完成加强免疫的小鼠眼球采血，分离血清作为阳性对照。小鼠断颈处死后放入75%乙醇中浸泡10min，在超净台内将小鼠固定于解剖台上。用消毒后的小镊子提起腹部皮肤，使用无菌剪刀从腹部下方向上剪开小块皮肤，分离皮肤和腹膜，小心拨开其他内脏，分离脾脏，将其轻轻取出，放入含有20ml不完全DMEM培养液的培养皿中。使用吸满20ml不完全DMEM培养液的注射器从脾脏顶端刺入，贯穿脾脏，轻推注射器，吹出脾细胞于培养皿中，反复几次直到脾脏不再变色，用过滤网过滤脾细胞。对SP2/0和脾细胞计数，按照8∶1的细胞数比例将脾细胞与SP2/0混合，颠倒混匀后1000rpm离心4min；在37℃水浴的状态下，拍打沉淀的细胞使其均匀分布于管底，静置1min，在1min内向离心管中加入1ml PEG1450，并静置1min，30s内沿着管壁加完1ml 37℃预热的不完全DMEM培养液，以终止细胞融合反应；将枪头伸入液面下，1min加完1ml不完全DMEM，重复该步骤，直到加完20ml不完全DMEM培养液；缓慢加入30ml不完全DMEM培养基后800rpm离心4min，弃掉上清，再加入50ml不完全DMEM培养基，800rpm离心4min，弃掉上清，加入HAT培养基，轻柔地吹起细胞并加入96孔细胞培养板（200μl/孔），做好标记；7天后进行间接ELISA鉴定。

步骤三、筛选阳性杂交瘤细胞

取杂交瘤细胞上清，用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。选取OD_450nm值高，且只有单个细胞团块的孔，弃掉培养基，加入200μl HT培养基，吹打细胞并计数，取大约200个细胞铺半块96孔板，剩余细胞传代至48孔板继续扩大培养，并冻存。7d后对单克隆的细胞进行ELISA鉴定，采用上述方法再次进行亚克隆，经过3次亚克隆后，选出OD_450nm值较高的单个细胞团块，按上述方法再进行克隆，若有细胞的孔OD_450nm值都较高，无细胞团块的孔OD_450nm值不高于阴性对照，则视其为可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

步骤四、单克隆抗体腹水的制备

将步骤三中所得到的细胞株注射小至鼠腹腔，对小鼠进行培养，从小鼠腹腔抽取腹水进行纯化。具体操作步骤如下：

向小鼠腹腔注射500μl弗氏不完全佐剂，24h后，取大约1×10⁷个杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，7d后，采集腹水。利用商品化抗体纯化试剂盒纯化抗体，具体操作如下：将腹水10000rpm离心10min，收集上清，取20μl制成样品；向离心管中加入60μl 1M Tris-HCl（pH=9.0）；用0.45μm的过滤器将Binding buffer和Elution buffer过滤备用；用Bindingbuffer两倍稀释的腹水；用注射器吸满10ml Binding buffer，将其连在纯化柱上，排除气泡后缓慢推动活塞，除去贮存液；吸取10ml Binding buffer，流速为1ml/min，平衡柱子；注射器吸取稀释后的腹水，流速为0.2ml/min，使抗体与柱子结合；吸满10ml Bindingbuffer，洗掉未结合的抗体，直到流出的液体为无色即可；吸取5ml Elution buffer，洗脱结合在柱子上的抗体，滴加至上述加有Tris-HCl的离心管中，8滴/管。每管取样20μl制成样品，备用，对纯化后的单克隆抗体进行鉴定。

实施例3、犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体的特性鉴定

本实施例提供犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体的特性鉴定，包括浓度测定、纯度鉴定、灵敏度鉴定、特异性鉴定、亚类鉴定：

1、犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体的浓度测定

采用核酸蛋白浓度测定仪对纯化后的单克隆抗体进行浓度测定，结果单克隆抗体浓度为10mg/ml。

2、犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体的纯度鉴定

对纯化后的单克隆抗体进行SDS-PAGE电泳分析。如图2所示，在25kDa和50kDa附近出现2条清晰条带，25kDa处为抗体轻链，50kDa处为抗体重链，没有其他杂带，纯度达到预期要求。

3、犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体的灵敏度鉴定

利用间接ELISA方法进行灵敏度鉴定。具体步骤为：将实施例一中的犬瘟热病毒N蛋白用包被液稀释至1μg/ml，按100μl/孔包被酶标板，工作洗涤液洗涤3次，最后一次拍干。将纯化后的单克隆抗体进行梯度稀释，100μl/孔，37℃温育1h，洗涤液洗涤3次后，加入1∶1000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃反应30min，洗涤3次后，加入底物显色液，50μl/孔，浓硫酸终止反应之后，用酶标仪测每孔OD_450nm读值。同时设SP2/0细胞的培养上清作为阴性对照，单克隆抗体OD_450nm值高于阴性对照的2.1倍，判为阳性。如表1所示，纯化后的单克隆抗体为稀释102400倍仍呈阳性，灵敏度高。

表1单克隆抗体灵敏度鉴定

4、犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体的特异性鉴定

利用间接ELISA方法进行特异性鉴定。具体步骤为：分别将灭活的犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒用包被液稀释至1μg/ml，按100μl/孔包被酶标板，工作洗涤液洗涤3次，最后一次拍干。将纯化后的单克隆抗体稀释10000倍作为一抗，100μl/孔，37℃温育1h，洗涤液洗涤3次后，加入1∶1000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，100μl/孔，37℃反应30min，洗涤3次后，加入底物显色液，50μl/孔，浓硫酸终止反应之后，用酶标仪测每孔OD_450nm读值。同时设SP2/0细胞的培养上清作为阴性对照，单克隆抗体的OD_450nm值小于阴性对照的2.1倍，判为阴性。如表2所示，纯化后的单克隆抗体与犬细小病毒、犬传染性肝炎病毒、犬冠状病毒、犬副流感病毒均不发生特异性反应，表明纯化的单克隆抗体特异性良好。

表2单克隆抗体特异性鉴定

5、犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体亚类鉴定

使用鼠源单抗IgG类/亚类鉴定用的ELISA试剂盒，检测犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体的亚类。结果显示，犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体重链为IgG1型，轻链为κ链。

实施例4、犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体可变区基因PCR扩增与序列鉴定

本实施例提供犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体可变区基因PCR扩增与序列鉴定，具体步骤为：

步骤一、用RPMI 1640完全培养基在37℃、5%二氧化碳条件下培养分泌犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，使细胞数量达到1×10⁷时用总RNA提取试剂盒（购自天根）提取细胞中的总RNA。

步骤二、设计鼠源重链抗体基因和轻链抗体基因特异性上下游通用引物。

重链上游引物：TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC，

重链下游引物：AGGTSMAＲCTGCAGSAGTCWGG。

轻链上游引物1：CCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC，

轻链上游引物2：CCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC，

轻链上游引物3：CCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC，

轻链上游引物4：CCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC，

轻链下游引物：GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA。

步骤三、应用RT-PCR试剂盒扩增出重链和轻链，将其连接在pMD18-T克隆载体上，进行基因测序。

犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体可变区基因序列和氨基酸序列如下：

1、犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体重链可变区核苷酸序列（SEQ ID No. 3）：

gagaccacgctgggggagtctacacctgagctggtgaagcctggggcttcagtccagacgtcctgtaaggctccaggatacacgttcacacgctactacacgaaccaagtgaagcagagccatgtggcgagccttgagtggattagcgatattaatcctaacaatggtggcgggaagtacaaccaggcaaacaagggcaaggccacattgactgtagacaagtcctccagcacagcctacatggagctccgcaatatcacatctgaggactctgcagtctattactgtgcaagatggggactagcgaccagggacgatgggaattttgggtacagcagccaaggcaccactctcacagtctcctca；如图3所示，为本发明实施例提供的犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体重链可变区核苷酸序列同源性分析图。

2、犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列（SEQ ID No. 4）：

gcacttgtggggacccagagccatccagttatgaaaaccagcgtgcaggatcgcggcagcgtgaactgcaagccgagccagaacgtgggcaccaacgtggcgtggtatcagcagaaaccgggccagagcccgaaagcgctgacgaatagcgcgagcacccgctatagcggcgtgccggatcgctttaccggcagcggcagcggcaccgattttaccctgaccattagcaacgtgcagagcgaagatctggcggaatatttttgccagcagtataacagctatccgtataccgttggccccggcaccaaactggaaattaaa；如图4所示，为本发明实施例提供的犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体轻链可变区核苷酸序列同源性分析图。

3、犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体重链可变区氨基酸序列（SEQ ID No. 1）：

ETTLGESTPELVKPGASVQTSCKAPGYTFTRYYTNQVKQSHVASLEWISDINPNNGGGKYNQANKGKATLTVDKSSSTAYMELRNITSEDSAVYYCARWGLATRDDGNFGYSSQGTTLTVSS；如图5所示，为本发明实施例提供的犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体重链可变区氨基酸序列同源性分析图。

本发明实施例的犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体V_H和V_L均由互补决定区和框架区组成；互补决定区由CDR1、CDR2和CDR3组成。如表3所示，为犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体的V_H的互补决定区氨基酸序列。

表3犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体的V_H的互补决定区氨基酸序列

名称	序列
		CDR-H1	RYYTN
CDR-H2	DINPNNGGGKYNQANKG
		CDR-H3	WGLATRDDGNFGY

4、犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列（SEQ ID No. 2）：

ALVGTQSHPVMKTSVQDRGSVNCKPSQNVGTNVAWYQQKPGQSPKALTNSASTRYSGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLAEYFCQQYNSYPYTVGPGTKLEIK；如图6所示，为本发明实施例提供的犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列同源性分析图。如表4所示，为犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体的V_L的互补决定区氨基酸序列。

表4犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体的V_L的互补决定区氨基酸序列

名称	序列
		CDR-L1	KPSQNVGTNVA
CDR-L2	SASTRYS
		CDR-L3	QQYNSYPYT

实施例5、犬瘟热病毒夹心ELISA抗原检测试剂盒的制备

本实施例的犬瘟热病毒夹心ELISA抗原检测试剂盒的制备方法，包括：

1、本实施例的犬瘟热病毒夹心ELISA抗原检测试剂盒的组成部分：1）包被犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体用于捕获犬瘟热病毒抗原的固相载体酶标板；2）辣根过氧化物酶标记的犬瘟热病毒N蛋白单克隆抗体；3）阳性抗原；4）阴性抗原；5）底物显色液TMB；6）洗涤液PBST；7）终止液稀硫酸。

2、犬瘟热病毒夹心ELISA抗原检测试剂盒组分的制备方法包括：

1）包被犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体用于捕获犬瘟热病毒抗原的固相载体酶标板：CB包被液和单克隆抗体混合均匀后，100μl/孔加入到酶标板中，4℃过夜包被16h，次日弃掉包被液并用洗涤液洗板，于室温中加入1%BSA的封闭液200μl/孔，封闭2h，弃掉封闭液加入2%蔗糖溶液，200μl/孔，室温孵育1h，即为包被有犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体酶标板。

2）制备辣根过氧化物酶标记的犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体：配制含有0.06M高碘酸钠和0.16M乙二醇的溶液加入需要标记总量的辣根过氧化物酶固体粉末，加入需要标记的纯化后的单克隆抗体，混匀转入透析袋，透析液为0.05M的碳酸盐，4℃透析16-18h；取出透析后的抗体溶液加入（5mg/ml）硼氢化钠溶液室温放置2h后，再一次装入透析袋透析液为0.2M的PBS，4℃16-18h透析，取出透析后的溶液加入优质甘油分装保存。

3）制备阳性抗原：灭活后的犬瘟热病毒。

4）制备阴性抗原：不含犬瘟热病毒的细胞培养液。

5）底物显色液TMB：商品化的底物显色液。

6）制备洗涤液PBST：含有0.1%吐温-20的0.01M PBS pH7.2溶液。

7）制备终止液2M H₂SO₄：28ml硫酸加到900ml去离子水中，定容至1000ml，即为2MH₂SO₄。

将各组分组装后，得到本实施例的犬瘟热病毒夹心ELISA抗原检测试剂盒。

实施例6、犬瘟热病毒夹心ELISA抗原检测试剂盒的特性鉴定

1、本发明实施例试剂盒特异性鉴定

用建立好的夹心ELISA抗原检测试剂盒检测灭活犬冠状病毒、灭活犬传染性肝炎病毒、灭活犬细小病毒、灭活犬副流感病毒分析特异性。结果表明，上述四份样品检测结果均为阴性，均没有交叉反应，该方法特异性良好。如表5所示。

表5试剂盒特异性鉴定

试剂盒结果判定：以2.1倍的阴性对照OD_450nm平均值作为待检样本阴性和阳性结果的判断标准（Cut-off值）。

2、本发明实施例试剂盒灵敏度鉴定

用建立好的夹心ELISA抗原检测试剂盒检测犬瘟热病毒N蛋白，将制备的犬瘟热病毒N蛋白稀释至1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml、31.25ng/ml、15.625ng/ml、7.812ng/ml、3.9ng/ml、1.95ng/ml。结果表明，本发明实施例试剂盒灵敏度达3.9ng/ml。如表6所示。

表6试剂盒灵敏度鉴定

3、本发明实施例试剂盒符合率鉴定

经病毒分离鉴定方法确认背景的19份临床样本，再用建立好的夹心ELISA抗原检测试剂盒检测，比较两种方法的符合率。结果表明，19份样本中阳性样本17份，阴性2份，两种方法符合率为100%。如表7所示。

表7试剂盒符合率鉴定

因此，本发明采用上述一种犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体制备的夹心ELISA抗原检测试剂盒，具有良好的特异性，较高的灵敏度，与病毒分离鉴定经典方法符合率高。

实施例7、犬瘟热病毒胶体金检测试纸条的制备及特性鉴定

1、本发明实施例采用常规双抗体夹心法制备犬瘟热病毒胶体金检测试纸条，制备方法不再赘述。

2、本发明实施例试纸条特异性鉴定

用制备好的犬瘟热病毒胶体金检测试纸检测灭活犬瘟热病毒、灭活犬冠状病毒、灭活犬传染性肝炎病毒、灭活犬细小病毒、灭活犬副流感病毒分析特异性。结果表明，上述五份样品中，仅与犬瘟热病毒发生反应，与其他4种病毒均没有交叉反应，该方法特异性良好。如图7所示，从左至右依次为灭活犬瘟热病毒、灭活犬冠状病毒、灭活犬传染性肝炎病毒、灭活犬细小病毒、灭活犬副流感病毒检测结果。

3、本发明实施例试纸条灵敏度鉴定

用制备好的犬瘟热病毒胶体金检测试纸条检测犬瘟热病毒N蛋白，将3mg/ml的犬瘟热病毒N蛋白稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍。结果表明，本发明实施例试纸条灵敏度为3μg/ml。如图8所示，从左至右依次为犬瘟热病毒N蛋白稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍的检测结果。

因此，本发明采用上述一种犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体制备的胶体金检测试纸条，具有良好的特异性和灵敏度，可以与其他犬常见病毒进行区分。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims

1.一种抗犬瘟热病毒N蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体含有名称为V_H的重链可变区和名称为V_L的轻链可变区，所述V_H和V_L均由互补决定区和框架区组成；

所述互补决定区由CDR1、CDR2和CDR3组成；

2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，

所述单克隆抗体的V_H的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 1所示；

所述单克隆抗体的V_L的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示；

编码所述单克隆抗体的V_H的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 3所示；

3.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体。

4.如权利要求1-3任一项所述的单克隆抗体在制备检测犬瘟热病毒N蛋白的试纸条或试剂盒中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，

所述试纸条为胶体金检测试纸条，或荧光微球检测试纸条，或乳胶微球检测试纸条；

所述试剂盒为夹心ELISA抗原检测试剂盒或竞争ELISA抗体检测试剂盒。