CN118126168A - 一种禽流感np蛋白单克隆抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体及其应用，属于动物疫病检测领域。所述单克隆抗体含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区，所述VH和VL均由互补决定区和框架区组成；所述互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成。所述单克隆抗体可用于制备禽流感病毒检测试剂盒和禽流感病毒检测试纸条。本发明所提供的禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒和禽流感病毒胶体金检测试纸条用于对禽流感病毒NP蛋白特异性的检测识别，具有高特异性、高灵敏度、高精确性、高准确性、简便快速等优点，同时与病毒分离鉴定经典方法符合率高。
Description
技术领域
本发明涉及动物疫病检测领域，具体涉及一种禽流感NP蛋白单克隆抗体及其应用。
背景技术
禽流感（avian influenza，AI）是禽流感病毒（AIV）感染家禽后的一种传染性综合征疾病，临床症状主要表现为不同程度的呼吸症状、产蛋下降、水肿腹泻，甚至急性感染的禽只会死亡，感染该病毒后死亡率100%。根据禽类个体的发病症状分为高致病性禽流感（HPAI）和低致病性禽流感（LPAI）。同时，根据病毒粒子表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）抗性的不同，进一步划分为不同的亚型，目前以鉴定的HA亚型有16余种H1-H16、NA亚型有9种，N1-N9。禽流感病毒的HA和NA特别容易变异，且能通过交换基因片段实现病毒重新组合，从而产生各种亚型病毒，并且各亚型之间不存在交叉保护的作用。
AIV在电镜下观察其形态为球形，直径约为20-120nm，表面有囊膜和纤突。囊膜上有呈辐射状密集排列棒状纤突：血凝素和神经氨酸酶。基因组为含有８个片段的单股负链RNA，每个片段的RNA基因都含有高度保守的5’和3’核苷酸编码序列，这些保守序列中的部分核苷酸序列通过反相互补，形成杆状结构的RNA聚合酶结合位点，８个RNA片段编号1-8分别编码10种蛋白质（PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M1、M2、NS1和NS2）。
核蛋白NP（Nucleoprotein）是由RNA编码，基因长度1565bp，分子质量约60KDa。NP蛋白为单体磷酸化多肽，富含精氨酸，是病毒粒子核衣壳的主要构成部分，NP蛋白与病毒RNA结合形成核糖核衣壳蛋白复合体（RNP），影响病毒的转录、复制及装配。另外，NP蛋白基因十分的保守，不易突变，分子上还具有3个独立的抗体位点，其中有1个位点在不同型的流感病毒中是相同的，其抗性稳定，不易发生抗体漂移，是理想的禽流感病毒诊断靶标蛋白。NP蛋白能够诱导宿主产生非中和抗体，同时也能诱导机体产生淋巴细胞反应，通过细胞毒作用，达到清除病毒的效果。因此，基于NP蛋白研制的单克隆抗体，对于禽流感病毒的诊断具有重要的临床意义。
自1878年在意大利北部的某个养殖场首次报道了一种引起家禽群体死亡的疾病，在1901年确定该病是一种病毒性的疾病，直至1955年才鉴定为流感病毒。禽流感自爆发以来，不仅给养殖业带来巨大经济损失，并对人类的健康受到威胁。高致病性的H5和H7亚型禽流感已被世界卫生组织列为A类动物传染病，我国列为一类动物传染病。目前HPAI流行的主要为H5和H7两种亚型，LPAI主要是H9亚型；通过对近几年的流行病学调查，高致病性毒株存在严重的病毒突变，像H5N1、H7N9、H9N2等；低致病性的主要流行在国内的活禽市场。病毒的突变，不断地给防疫和疫苗的研制，带来了巨大挑战，同时将检测方法凸显的尤为重要。
目前对于禽流感病毒的检测方法，主要有三大类，病原学诊断、血清学诊断和分子生物诊断。传统的病原学诊断方法，主要是鸡胚分离。该方法对于试验周期和实验人员的操作十分重要，必须在三级实验室内操作进行。血清学检测实验目前在临床实验上主要应用的有HA和HI、ELISA、试纸卡等。HA和HI可以较准确的确定流感病毒亚型，试纸卡高效快速的检测对于临床紧急的普筛十分方便，而ELISA具有较高的敏感性和特异性，在科研和生产中都是应用极高的。
发明内容
为此，本发明提供了一种禽流感NP蛋白单克隆抗体及其应用。
为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：
第一方面，本发明提供一种禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区；
所述单克隆抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示；
所述单克隆抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；
所述VH和VL均由互补决定区和框架区组成，所述互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述单克隆抗体的VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 6所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。
第二方面，本发明提供上述禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体，其特征在于：
编码所述单克隆抗体的VH的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示；
编码所述单克隆抗体的VL的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示。
第三方面，本发明提供下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：
（a1）含有编码上述单克隆抗体核苷酸序列的表达盒；
（a2）含有编码上述单克隆抗体核苷酸序列的重组载体；
（a3）含有编码上述单克隆抗体核苷酸序列的重组菌；
（a4）含有编码上述单克隆抗体核苷酸序列的转基因细胞系。
第四方面，本发明提供上述的禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体在制备禽流感病毒检测试剂盒和检测试纸条中的应用。
优选地，所述试纸条为胶体金检测试纸条，或荧光微球检测试纸条，或乳胶微球检测试纸条；
优选地，所述试剂盒竞争ELISA抗体检测试剂盒。
第五方面，本发明提供一种禽流感检测试剂盒，其特征在于，活性成分包含上述禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体。
第六方面，本发明提供一种禽流感检测试纸条，其特征在于：T线包被上述禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体及其应用，以应用于对NP蛋白的检测，不仅特异性强、灵敏度高，而且具有良好的广谱性。所述单抗能够与不同亚型的禽流感病毒发生反应，为生产养殖、临床和实验室的快速检测提供有力工具。利用该抗体制备的禽流感病毒检测试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点，具有较高的实用价值和推广价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容能涵盖的范围内。
图1为本发明实施例提供的纯化的禽流感病毒NP蛋白的SDS-PAGE电泳分析图；
图2为本发明实施例提供的纯化的禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体的SDS-PAGE电泳分析图；
图3为本发明实施例提供的禽流感病毒胶体金检测试纸条特异性鉴定结果图；
图4为本发明实施例提供的禽流感病毒胶体金检测试纸条灵敏度鉴定结果图。
其中，图3中从左至右依次为H5（Re-13株）亚型血凝血抑抗原、H7（Re-4株）亚型血凝血抑抗原、H9（H9N2）亚型血凝血抑抗原及禽白血病、禽传染性法氏囊、禽传染性支气管炎、禽传染性喉气管炎、禽新城疫标准抗原检测结果；
图4中从左至右依次为禽流感病毒NP蛋白稀释10倍、100倍、500倍、1000倍、2000倍的检测结果。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、禽流感NP蛋白的制备
1.重组载体的构建
根据GenBank中登录的禽流感病毒NP序列（MF280196.1），将密码子进行优化能够更好的适应昆虫细胞表达，合成优化后的NP全长基因于pFastBac™1-HTB载体，选择BamHI、SalI为酶切位点，将合成的重组质粒转化进入DH10Bac工程菌中，涂布在有三抗的培养基平板上，48小时后平板上出现蓝色和白色两种颜色的菌落，挑取白色菌落使用LB培养基稀释后划线，待48小时后，挑取单菌落，提取质粒，使用M13引物进行鉴定正确后，即重组穿梭载体Bacmid DNA。
2.重组质粒的制备
将M13引物鉴定正确的质粒进行扩大培养，培养昆虫细胞SF9细胞，待细胞汇合率为50%时，将步骤一中的重组穿梭载体Bacmid DNA，转染进入昆虫细胞中，每天观察细胞，3天后细胞发生明显病变，细胞膨胀，漂浮，第五天收集P1代杆状病毒。转染96小时后，收集培养液上清，800rpm离心5分钟，弃去沉淀细胞和细胞碎片，取上清即为P1代杆状病毒。
此时病毒滴度通常为1×106~1×107pfu/ml。P1代病毒可短期保存于4℃，或分装于含2% FBS的培养液中后在-80℃较长期保存。反复冻融会大大降低病毒活力，其滴度有可能降低10至100倍。
P1代病毒再次感染昆虫细胞可获得P2代病毒。如果采用悬浮培养的昆虫细胞进行病毒扩增，建议使用10ml培养液并且控制细胞密度为2×106/ml。27℃培养48-72小时后，70-80%的细胞死亡时，收集细胞和上清，800rpm离心5分钟，取上清即为P2代病毒。此时病毒滴度约为1×107~1×108pfu/ml，可收集本步骤离心后的细胞碎片沉淀，进行SDS-PAGE电泳分析以确定目的蛋白已经正常表达。
3.蛋白纯化
将获得的重组蛋白进行亲和层析纯化后，使用SDS-PAGE检测纯化效果，如图1所示，发现在57kDa左右有一道明显的条带，条带清晰，与预期蛋白大小相符，证明已成功表达目的蛋白。
实施例2、禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备
1.动物免疫
将实施例1中杆状病毒表达系统制备并纯化后的禽流感病毒NP蛋白作为免疫原，首次免疫用，使用弗氏完全佐剂等量1:1混合，充分乳化后，每只BALB/C小鼠50μg。后续以同样的方法用弗氏不完全佐剂乳化蛋白，每支小鼠50μg，采用皮下多点免疫。每次免疫间隔2~3周。第3次免疫后第7天进行小鼠尾尖采血测试效价，小鼠尾血采集后放入4℃静置30min。待析出血清后，将血清用无菌生理盐水进行倍比稀释，同时空白小鼠血清作为对照，处理方法同小鼠血清，实验组与对照组OD450nm比值大于2.1时最大血清稀释倍数即小鼠血清效价。选取效价高的小鼠，通过腹膜内注射50μg抗体和弗氏不完全佐剂的等体积乳剂（200μl）来加强免疫。3天后将小鼠处死，进行细胞融合。
2.细胞融合
将完成加强免疫的小鼠眼球采血，分离血清作为阳性对照。小鼠断颈处死后放入75%乙醇中浸泡10min，在生物安全柜内将小鼠固定于解剖台上。用消毒后的小镊子提起腹部皮肤，使用无菌剪刀从腹部下方向上剪开小块皮肤，分离皮肤和腹膜，小心拨开其他内脏，分离脾脏，将其轻轻取出，放入含有20ml不完全DMEM培养液的培养皿中。使用吸满20ml不完全DMEM培养液的注射器从脾脏顶端刺入，贯穿脾脏，轻推注射器，吹出脾细胞于培养皿中，反复几次直到脾脏不再变色，使用过滤网过后，即为脾细胞。对SP2/0和脾细胞计数，按照8∶1的细胞数比例将脾细胞与SP2/0混合，颠倒混匀后1000rpm离心4min；在37℃水浴的状态下，拍打沉淀的细胞使其均匀分布于管底，静置1 min，在1 min内向离心管中加入1mlPEG1450，并静置1 min，30s内沿着管壁加完1ml 37℃预热的不完全DMEM培养液，以终止细胞融合反应；将枪头伸入液面下，1min加完1ml不完全DMEM，重复该步骤，直到加完20ml不完全DMEM培养液；缓慢加入30ml不完全DMEM培养基后800rpm离心4 min，弃掉上清，再加入50ml不完全DMEM培养基，800rpm离心4min，弃掉上清，加入HAT培养基，轻柔地吹起细胞并加入96孔细胞培养板（200μl/孔），做好标记；7天后进行间接ELISA鉴定。
3.阳性杂交瘤细胞的筛选
取杂交瘤细胞上清，用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。选取OD450nm值高，且只有单个细胞团块的孔，弃掉培养基，加入200μl HT培养基，吹打细胞并计数，取大约200个细胞铺半块96孔板，剩余细胞传代至48孔板继续扩大培养，并冻存。7d后对单克隆的细胞进行ELISA鉴定，采用上述方法再次进行亚克隆，经过3次亚克隆后，选出OD450nm值较高的单个细胞团块，按上述方法再进行克隆，若有细胞的孔OD450nm值都较高，无细胞团块的孔OD450nm值不高于阴性对照，则视其为可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
4.单克隆抗体的制备
将步骤三中所得到的细胞株注射小鼠至腹腔，对小鼠进行培养，从小鼠腹腔抽取腹水进行纯化。具体操作步骤如下：
向小鼠腹腔注射500μl弗氏不完全佐剂，24h后，取大约1×107个杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，7d后，采集腹水。利用商品化抗体纯化试剂盒纯化抗体，具体操作如下：将腹水10000rpm离心10min，收集上清，取20μl制成样品；向离心管中加入60μl 1M Tris-HCl（pH=9.0）；用0.45μm的过滤器将Binding buffer和Elution buffer过滤备用；用Bindingbuffer两倍稀释的腹水；用注射器吸满10ml Binding buffer，将其连在纯化柱上，排除气泡后缓慢推动活塞，除去贮存液；吸取10ml Binding buffer，流速为1ml/min，平衡柱子；注射器吸取稀释后的腹水，流速为0.2ml/min，使抗体与柱子结合；吸满10ml Bindingbuffer，洗掉未结合的抗体，直到流出的液体为无色即可；吸取5ml Elution buffer，洗脱结合在柱子上的抗体，滴加至上述加有Tris-HCl的离心管中，8滴/管。每管取样20μl制成样品备用，对纯化后的单克隆抗体进行鉴定。
实施例3、禽流感NP蛋白单克隆抗体的鉴定
1.单克隆抗体亚类鉴定
使用鼠源单抗IgG类/亚类鉴定用的ELISA试剂盒，检测禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体的亚类。结果显示，禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体重链为IgG1型，轻链为κ链。
2.单克隆抗体浓度测定
采用核酸蛋白浓度测定仪对纯化后的单克隆抗体进行浓度测定，结果单克隆抗体浓度为9.86mg/ml。
3.单克隆抗体纯度测定
对纯化后的单克隆抗体进行SDS-PAGE电泳分析。如图2所示，在25kDa和50kDa附近出现2条清晰条带，25kDa处为抗体轻链，50kDa处为抗体重链，没有其他杂带，纯度达到预期要求。
4.单克隆抗体灵敏度测定
利用间接ELISA方法进行灵敏度鉴定。结果如表1所示，纯化后的单克隆抗体在稀释102400倍时仍呈阳性，灵敏度高。
表1单克隆抗体灵敏度鉴定
5.单克隆抗体特异性测定
利用间接ELISA方法进行特异性鉴定。结果如表2所示，纯化后的单克隆抗体与犬禽白血病病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽传染性法氏囊病病毒、禽传染性喉气管炎、禽新城疫病毒均不发生特异性反应，表明纯化的单克隆抗体特异性良好。
表2单克隆抗体特异性鉴定
实施例4、禽流感NP蛋白单克隆抗体重链和轻链可变区基因克隆
1.杂交瘤细胞培养及总RNA提取
用RPMI 1640完全培养基在37℃、5%二氧化碳条件下培养杂交瘤细胞，使细胞数量达到1×107时用总RNA提取试剂盒（购自天根）提取细胞中的总RNA。
2.cDNA第一链的合成
使用反转录试剂盒（购自TAKARA），以提取到的总RNA为扩增模板来合成cDNA第一链。
3.基因扩增
设计轻链，重链的上游及下游引物。
重链上游引物（SEQ ID No. 11）：TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCC;
重链下游引物（SEQ ID No. 12）：AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG。
轻链上游引物1（SEQ ID No. 13）：CCGTTTGATTTCCAGCTTGGTGCC;
轻链上游引物2（SEQ ID No. 14）：CCGTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC;
轻链上游引物3（SEQ ID No. 15）：CCGTTTTATTTCCAACTTTGTCCC;
轻链上游引物4（SEQ ID No. 16）：CCGTTTCAGCTCCAGCTTGGTCCC;
轻链下游引物（SEQ ID No. 17）：GACATTGAGCTCACCCAGTCTCCA。
应用RT-PCR试剂盒扩增出重链和轻链，将其连接在pMD18-T克隆载体上，进行基因测序。
4.PCR扩增产物的克隆和筛选
重链和轻链可变区测序结果如下：
重链可变区氨基酸序列（SEQ ID No. 1）
EVRLQESRPELVEPGASVKISCNASAYTFSDYWMNCVKQSHGKSLECIGDISPTYDRTSYNHKFKGYATLTVDKSSSSAYIELRSLTSDDSAVYYCARGGYGNYRDYWGKRTTRTVSS。
重链可变区核苷酸序列（SEQ ID No. 2）
GAGGTGCGGCTGCAGGAGTCTAGACCTGAGCTCGTGGAGCCTGGCGCTTCAGTGAAGATATCCTGTAACGCTTCTGCATACACATTCTCTGACTACTGGATGAATTGCGTGAAGCAGAGCCATGGAAAGAGCCTTGAGTGTATTGGAGATATTAGTCCTACCTATGATCGTACTAGCTACAACCATAAGTTCAAGGGCTACGCCACATTGACTGTAGACAAGTCCTCCAGCTCAGCCTACATTGAGCTCCGCAGCCTGACATCTGACGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCCAGAGGCGGGTATGGTAATTACCGTGACTACTGGGGCAAACGCACCACTCGCACAGTCTCCTCA。
轻链可变区氨基酸序列（SEQ ID No. 3）
MKYLLATAAAGILLLAAQPAMADVVMSQTTRTLSVSIEQPASISCKSSQSLLHSDGKSYLNWLLQRPRQSPKCLSYLVSRRDSGVPDRVTGSSSGTDVTLGISSVEAEDLRVYYYWQRTHCPITVGSGTKLDIK。
轻链可变区核苷酸序列（SEQ ID No. 4）
ATGAAATACCTATTGGCTACGGCAGCCGCTGGAATATTATTACTCGCGGCGCAGCCGGCCATGGCCGATGTAGTGATGAGCCAGACCACGCGTACCCTGAGCGTGAGCATTGAGCAGCCGGCGAGCATTAGCTGCAAGTCCAGCCAGAGCCTTCTGCATAGCGATGGCAAGTCCTATCTGAACTGGCTGCTGCAACGCCCGCGCCAGAGCCCGAAATGCCTGAGTTATCTCGTGAGCAGACGAGATAGCGGAGTGCCGGATCGCGTTACCGGCAGCAGCAGCGGCACCGATGTTACCCTGGGAATTAGCAGCGTGGAAGCGGAAGATCTGCGCGTGTATTATTACTGGCAGCGCACCCATTGTCCGATTACCGTTGGCAGCGGCACCAAACTGGACATTAAA。
5.可变区核苷酸序列和氨基酸序列及同源性分析
将重链和轻链可变区基因序列分别在NCBI数据库中进行比对分析，分析结果显示，单克隆抗体重链可变区氨基酸序列与小家鼠部分免疫球蛋白重链可变区氨基酸序列（Sequence ID: AML30989.1）同源性最高，同源性为96/118，同源性百分比为88%。单克隆抗体重链可变区基因序列与小家鼠克隆免疫球蛋白重链可变区序列（Sequence ID:MF942155.1）同源性最高，同源性为323/354，同源性百分比为91%。单克隆抗体轻链可变区基因序列与小家鼠细胞系4D11免疫球蛋白轻链可变区基因序列（Sequence ID:KY038040.1）同源性最高，同源性为364/402，同源性百分比为91%。单克隆抗体轻链可变区氨基酸序列与小家鼠免疫球蛋白轻链可变区序列（Sequence ID: AQQ81286.1）同源性最高，同源性为117/134，同源性百分比为87%。编码禽流感NP蛋白单克隆抗体的重链和轻链可变区的基因序列和氨基酸序列同源性分析结果表明，未发现与本发明相同的序列。
6.CDR区分析
本发明实施例的禽流感NP蛋白单克隆抗体VH和VL均由互补决定区和框架区组成；互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成。
将重链可变区和轻链可变区序列，在https://www.novopro.cn/tools/cdr.html用Kabat定义方案进行分析，得出其CDR区。
抗体重链CDR区：
CDR-H1（SEQ ID No. 5）：DTYMH；
CDR-H2（SEQ ID No. 6）：RVDHANVNTKCDPEFQG；
CDR-H3（SEQ ID No. 7）：FGYYGYNYAMDY。
抗体轻链CDR区：
CDR-L1（SEQ ID No. 8）：RLPTWFSHNLH；
CDR-L2（SEQ ID No. 9）：YASQSIS；
CDR-L3（SEQ ID No. 10）：QQSNSWPWT。
实施例5、禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒的制备及特性鉴定
1、禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒制备
本实施例的禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒的组成部分：1）包被禽流感病毒NP蛋白用于捕获禽流感病毒抗体的固相载体酶标板；2）辣根过氧化物酶标记的禽流感病毒单克隆抗体；3）阳性抗体；4）阴性抗体；5）底物显色液TMB；6）洗涤液PBST；7）终止液2M硫酸。
禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒组分的制备方法包括：
1）包被禽流感病毒NP蛋白用于捕获禽流感病毒抗体的固相载体酶标板：CB包被液和NP蛋白按照合适的浓度混合均匀后，100μl/孔加入到酶标板中，4℃过夜包被约16h，次日弃掉包被液并用洗涤液洗板1次，于室温中加入1%BSA的封闭液200μl/孔，封闭2h，弃掉封闭液加入2%蔗糖溶液，200μl/孔，室温孵育30min，即为包被有禽流感病毒NP蛋白酶标板。
2）制备辣根过氧化物酶标记的禽流感病毒的单克隆抗体：配制含有0.06M高碘酸钠和0.16M乙二醇的溶液加入需要标记总量的辣根过氧化物酶固体粉末，加入需要标记的纯化后的单克隆抗体，混匀转入透析袋，透析液为0.05M的碳酸盐，4℃透析16-18h；取出透析后的抗体溶液加入（5mg/ml）硼氢化钠溶液室温放置2h后，再一次装入透析袋透析液为0.2M的PBS，4℃ 16-18h透析，取出透析后的溶液加入优质甘油分装保存。
3）制备阳性抗体：已知背景的阳性临床血清。
4）制备阴性抗体：已知背景的阴性临床血清。
5）底物显色液TMB：商品化的底物显色液。
6）制备洗涤液PBST：含有0.1%吐温-20的0.01M PBS pH7.2溶液。
7）制备终止液2M H2SO4：28ml硫酸加到900ml去离子水中，定容至1000ml，即为2MH2SO4。
将各组分组装后，得到本实施例的禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒。
判读标准：
试验成立条件 阴性对照OD450nm均值≥1.2，阳性对照孔的抑制率均值应＞60%，试验成立。
抑制率（IN值）的计算 IN=【（阴性对照OD450nm均值-待测样品OD450nm均值）/（阴性对照OD450nm均值）】×100%
判定标准 样品检测结果的IN值≤50%判定为阴性；
样品检测结果的IN值≥50%判定为阳性。
2、禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒特异性鉴定
用本实施例制备的竞争ELISA抗体检测试剂盒检测禽白血病阳性血清质控品、禽传染性支气管炎阳性血清质控品、禽传染性法氏囊阳性血清质控品、禽传染性喉气管炎阳性血清质控品、禽新城疫阳性血清质控品分析特异性。结果如表3所示，上述四份样品检测结果均为阴性，均没有交叉反应，该试剂盒特异性良好。
表3禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒特异性鉴定结果
3、禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒灵敏性鉴定
用本实施例制备的竞争ELISA抗体检测试剂盒检测禽流感阳性血清质控品，将阳性质控品分别稀释20倍、40倍、80倍、160倍、320倍、640倍、1280倍、2560倍。结果如表4所示，该试剂盒灵敏度达1:160，灵敏度较好。
表4禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒灵敏性鉴定结果
4、禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒符合率鉴定
用本实施例制备的竞争ELISA抗体检测试剂盒与经外购的商品化竞争ELISA试剂盒鉴定确认背景的20份临床样本，比较两种方法的符合率。结果如表5所示，20份样本中阳性样本16份，阴性4份，该试剂盒与商品化试剂盒符合率为100%。
表5禽流感病毒竞争ELISA抗体检测试剂盒符合率鉴定结果
实施例6、禽流感病毒胶体金检测试纸条的制备及特性鉴定
1、本发明实施例采用常规双抗体夹心法制备禽流感病毒胶体金检测试纸条，制备方法不再赘述。
2、本发明实施例试纸条特异性鉴定
用本实施例制备的禽流感病毒胶体金检测试纸检测H5（Re-13株）亚型血凝血抑抗原、H7（Re-4株）亚型血凝血抑抗原、H9（H9N2）亚型血凝血抑抗原及禽白血病、禽传染性法氏囊、禽传染性支气管炎、禽传染性喉气管炎、禽新城疫灭活病毒分析交叉性及特异性。结果如图3所示，上述样品中，仅与H5（Re-13株）、H7（Re-4株）、H9亚型和发生反应，与其他5种病原均没有交叉反应，该方法特异性良好。
3、本发明实施例试纸条灵敏度鉴定
用本实施例制备的禽流感病毒胶体金检测试纸条检测禽流感病毒NP蛋白，将180μg/ml的禽流感病毒NP蛋白稀释10倍、100倍、500倍、1000倍、2000倍。结果如图4所示，本发明实施例试纸条灵敏度为0.18μg/ml。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述单克隆抗体含有名称为VH的重链可变区和名称为VL的轻链可变区；
所述单克隆抗体的VH的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示；
所述单克隆抗体的VL的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示；
所述VH和VL均由互补决定区和框架区组成，所述互补决定区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；
所述单克隆抗体的VH的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 5所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 6所示；
所述单克隆抗体的VH的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 7所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No. 8所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No. 9所示；
所述单克隆抗体的VL的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No. 10所示。
2.根据权利要求1所述的禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体，其特征在于：
编码所述单克隆抗体的VH的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示；
编码所述单克隆抗体的VL的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No. 4所示。
3.下述（a1）-（a4）中任一种生物材料：
（a1）含有编码权利要求1所述单克隆抗体核苷酸序列的表达盒；
（a2）含有编码权利要求1所述单克隆抗体核苷酸序列的重组载体；
（a3）含有编码权利要求1所述单克隆抗体核苷酸序列的重组菌；
（a4）含有编码权利要求1所述单克隆抗体核苷酸序列的转基因细胞系。
4.根据权利要求1-3任一所述的禽流感病毒NP蛋白单克隆抗体在制备禽流感病毒检测制品中的应用。
5.一种禽流感检测试剂盒，其特征在于，活性成分包含权利要求1所述的禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体。
6.一种禽流感检测试纸条，其特征在于：T线包被权利要求1所述的禽流感病毒NP蛋白的单克隆抗体。
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| CN101885757A (zh) * | 2009-05-11 | 2010-11-17 | 中国医学科学院基础医学研究所 | 禽流感病毒血凝素、表位肽和抗它们的单克隆抗体及其应用 |
| EP2450379A1 (en) * | 2006-09-07 | 2012-05-09 | Crucell Holland B.V. | Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus H5N1 and uses thereof |
| CN117820483A (zh) * | 2024-03-01 | 2024-04-05 | 北京纳百生物科技有限公司 | 一种猫n-端脑利钠肽前体蛋白单克隆抗体、检测试纸条及应用 |
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