CN115380046B - SARS-CoV-2中和抗体及其制备和应用 - Google Patents

SARS-CoV-2中和抗体及其制备和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115380046B
CN115380046B CN202180028238.3A CN202180028238A CN115380046B CN 115380046 B CN115380046 B CN 115380046B CN 202180028238 A CN202180028238 A CN 202180028238A CN 115380046 B CN115380046 B CN 115380046B
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
ser
val
leu
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202180028238.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115380046A (zh
Inventor
谢良志
孙春昀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sinocelltech Ltd
Original Assignee
Sinocelltech Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sinocelltech Ltd filed Critical Sinocelltech Ltd
Publication of CN115380046A publication Critical patent/CN115380046A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115380046B publication Critical patent/CN115380046B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
    • C07K16/1002—Coronaviridae
    • C07K16/1003—Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 [SARS‐CoV‐2 or Covid-19]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/42—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum viral
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明属于细胞免疫技术领域，提供了一种SARS‑CoV‑2中和人源化单克隆抗体。该抗体可封闭SARS‑CoV‑2刺突蛋白(S蛋白)同ACE2受体的结合，高效中和SARS‑CoV‑2病毒侵染细胞；制备的人源化中和抗体可作为特异性抗体药物用于预防和治疗SARS‑CoV‑2病毒引起的急性呼吸道传染病。

Description

SARS-COV-2中和抗体及其制备和应用
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年04月28日提交的中国专利申请202010349190.3的权益，该申请的内容通过引用被合并于本文。
技术领域
本发明涉及细胞免疫技术领域，提供可封闭SARS-CoV-2刺突蛋白(S蛋白)同ACE2受体的结合、高效中和SARS-CoV-2病毒侵染细胞的人源化抗体。其可用于治疗SARS-CoV-2引起的感染性疾病。本发明还提供了编码所述抗体的核酸序列、含有所述核酸序列的载体、细胞。
背景技术
SARS-CoV-2在人与人之间的传播途径与SARS-CoV(Severe Acute RespiratorySyndrome coronavirus)及MERS-CoV(Middle East Respiratory Syndrome)相似，主要为呼吸道飞沫传播，亦可通过接触传播。SARS-CoV-2主要传染源为COVID-19患者，无症状感染者也可能成为传染源。相关研究表明SARS-CoV-2的基本传染数(R0值)在2.24至3.58之间，提示其具有较强的传播能力[1]。人群对SARS-CoV-2普遍易感，潜伏期为1-14天，多为3-7天。
新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第七版)》将COVID-19分为轻型、普通型、重型和危重型。COVID-19的临床症状以发热、干咳、乏力为主，少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状。轻型患者仅表现为低热，轻微乏力等，无肺炎表现。重症患者多表现为在发病一周后出现呼吸困难和/或低氧血症，严重者可快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等[2，3]。
由于暴发突然、疫情传播迅速、应对时间有限，目前尚无针对SARS-CoV-2感染特异性的有效临床治疗方案，临床上仅能对症支持治疗，多以缓解症状、预防继发感染、减少并发症发生以及进行器官功能支持为主。许多治疗药物选择都来自SARS-CoV、MERS-CoV等感染的临床治疗经验，也有一些候选药物如瑞德西韦(一种核苷酸类似物，可抑制RNA聚合酶，阻断病毒复制)、洛匹那韦/利托那韦(克力芝)、干扰素、磷酸氯喹等正在进行临床试验。
SARS-CoV-2与SARS-CoV具有共同的宿主细胞受体蛋白，即血管紧张素转化酶2(ACE2)[4]。病毒的三聚体刺突蛋白(S蛋白)同ACE2受体结合后被宿主蛋白酶切割为包含受体结合域(Receptor binding domain，RBD)的S1多肽和负责介导病毒同细胞膜融合的S2多肽，进而侵入体内[5]。因而，寻找和制备有效的抗体阻止SARS-CoV-2 RBD蛋白和ACE2受体结合，进而抑制病毒侵染细胞，成为预防和治疗SARS-CoV-2病毒感染的重中之重。大量体外研究表明，针对SARS-CoV、MERS-CoV和Ebola等病毒表面蛋白受体结合区域的中和抗体，可有效阻断病毒与受体的结合，从而阻断病毒入侵宿主细胞。目前，临床上已经使用病人恢复期血浆治疗SARS-CoV-2的探索，并取得积极的治疗效果。但是，恢复期血浆来源有限，操作复杂，成本大且存在安全性等问题，如增加抗体依赖的增强作用(Antibody dependentenhancement，ADE)等风险。通过制备抗SARS-CoV-2 RBD蛋白单克隆抗体，筛选可与之特异性结合的中和抗体，进一步对其人源化已成为制备预防或治疗性抗体药物的有效手段。
由于尚无针对SARS-CoV-2感染的治疗药物，目前对于COVID-19的治疗方案多以缓解症状、预防继发感染、减少并发症发生以及进行器官功能支持为主。因此本领域迫切需要开发具有良好中和病毒效果的高亲和力的冠状病毒中和性抗体，尤其是单克隆抗体。本专利发明的人源化单克隆抗体能高效中和SARS-CoV-2病毒，可作为特异性抗体药物用于预防和治疗SARS-CoV-2病毒引起的急性呼吸道传染病。
发明内容
在一个方面，本发明提供一种分离的、封闭SARS-CoV-2刺突蛋白同ACE2受体的结合抗体或其抗原结合片段，其包含
i)重链可变区，其重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3域分别包含SEQ ID NO：13、14和15，和/或
ii)轻链可变区，其轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3域分别包含SEQ ID NO：10、11和12
在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段包含：
i)重链可变区，其序列包含SEQ ID NO：22或与其具有至少85％、88％、90％、95％、98％或99％序列同一性；和/或
ii)轻链可变区，其序列包含SEQ ID NO：23或与其具有至少85％、88％、90％、95％、98％或99％序列同一性。
在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段为人源化抗体、嵌合或鼠源抗体。
在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段，其抗体恒定区为IgG，IgM，IgA亚型，优选地，为IgG1、IgG2或IgG4亚型抗体；更优选地，为因其Fc区的氨基酸序列和/或糖基化形式改变造成其与Fc受体和/或C1q补体结合功能改变的IgG1、IgG2或IgG4亚型抗体。
在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段，
a)其与SARS-CoV-2 RBD的结合亲和力KD平均值为11.7E-11～～1.3E-11M，优选5.9E-11～2.6E-11M，更优选为3.9E-11M；和/或
b)其与SARS-CoV S1的结合亲和力KD平均值为11.1E-10～1.2E-10M，优选5.6E-10～2.5E-10M，更优选为3.7E-10M。
在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段表位为SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的N439和T500。
在一个实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段进一步包含：
i)重链恒定区，优选地，其序列包含SEQ ID NO：24或与其具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性；和/或
ii)轻链恒定区，优选地，其序列包含SEQ ID NO：25或与其具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性。
在一个实施方式中，所述抗体经单次静脉注射给予小鼠后，在体内的平均暴露量Cmax和AUClast分别为108.96μg/mL和9922.11h×μg/mL，平均半衰期t1/2为286.16h，清除率Cl为0.30mL/h/kg。
在一个实施方式中，所述抗体由fut8基因敲除的HEK-293表达。
在一个实施方式中，所述抗体进一步包含：
i)重链恒定区，优选地，其序列包含SEQ ID NO：45或与其具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性；和/或
ii)轻链恒定区，优选地，其序列包含SEQ ID NO：25或与其具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性。
在一个实施方式中，所述的抗体，其
同CD16a仅有极弱的结合；
同CD32a和CD32b几乎无结合；
同CD64仅有较弱的结合；
无ADCC作用；
无ADCP作用；
无CDC作用。
在一个实施方式中，所述抗体经单次静脉注射给予小鼠后，在体内的平均暴露量Cmax和AUClast分别为115.04μg/mL和11159.82h×μg/mL，平均半衰期t1/2为320.00h，清除率Cl为0.23mL/h/kg。
在一个实施方式中，所述抗体由fut8基因敲除的HEK-293表达。
在一个实施方式中，所述的抗体，其
同CD16a的结合能力强于IgG1亚型的CoV2-HB27抗体；
显著介导对表达SARS-CoV-2S的ADCC作用。
在一个实施方式中，所述抗体进一步包含
i)重链恒定区，优选地，其序列包含SEQ ID NO：49或与其具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性；和/或
ii)轻链恒定区，优选地，其序列包含SEQ ID NO：25或与其具有至少90％、92％、95％、98％或99％序列同一性。
在一个实施方式中，所述抗体由fut8基因敲除的HEK-293表达。
在一个实施方式中，所述的抗体，其
同CD16a的结合能力强于IgG1亚型的CoV2-HB27抗体；
同CD32a和CD32b强于IgG1亚型的CoV2-HB27抗体；
同CD64的结合能力强于IgG1亚型的CoV2-HB27抗体；
同C1q的结合能力强于IgG1亚型的CoV2-HB27抗体；
介导ADCC作用强于IgG1亚型的CoV2-HB27抗体；
在高浓度下可以介导较弱的ADCP作用；
在一个实施方式中，所述的抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体。
在一个实施方式中，所述抗原结合片段为Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd′片段、单链抗体分子或单域抗体；其中单链抗体分子优选为scFv、di-scFv、tri-scFv、双体抗体或scFab。
在另一个方面，本发明提供一种改构抗体-药物分子，其包含本发明的抗体或其抗原结合片段和与之共价或非共价连接的小分子或生物大分子，优选地通过接头连接。
在又一个方面，本发明提供一种核酸，其编码根据本发明所述的抗体或其抗原结合片段，其为mRNA和/或DNA。
在一个实施方式中，所述的核酸，其包含
i)分别如SEQ ID NO：30所示的重链可变区核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：31所示的轻链可变区核苷酸序列；和任选地
ii)分别如SEQ ID NO：32、44、48所示重链恒定区核苷酸序列和/或如SEQ ID NO：7所示的轻链恒定区核苷酸序列；
或i)和ii)的变体。
在又一个方面，本发明提供一种表达载体，其包含如本发明所述的核酸。
在又一个方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含如本发明所述的核酸或如本发明所述的表达载体。
在又一个方面，本发明提供一种用于产生如本发明所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在适合于抗体表达的条件下培养如本发明所述的宿主细胞，和从培养基中回收表达的抗体。
在又一个方面，本发明提供一种药物组合物，其包含
如本发明所述的抗体或其抗原结合片段或如本发明所述的改构抗体-药物分子或如本发明所述的核酸或如本发明所述的表达载体；
药学上可接受的载体；任选地
一种或多种其他治疗剂，优选地，其他治疗剂选自抗病毒药物或炎性因子抑制剂、其他机制的小分子化学药；优选地，抗病毒药物选自包含不限于I型干扰素药物、抗体类、蛋白酶抑制剂类、RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)抑制剂类、靶向宿主的抗病毒类药物。
在又一个方面，如本发明所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明所述的改构抗体-药物分子、如本发明所述的核酸、如本发明所述的表达载体、如本发明所述的药物组合物，其用于预防和治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病。
在又一个方面，如本发明所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明所述的改构抗体-药物分子、如本发明所述的核酸、如本发明所述的表达载体、如本发明所述的药物组合物在用于制备用于预防和治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病的药物中的应用。
在又一个方面，本发明提供一种药物组合，其包含
如本发明所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明所述的改构抗体-药物分子、如本发明所述的核酸、如本发明所述的表达载体、如本发明所述的药物组合物；以及一种或多种另外的治疗剂。
在又一个方面，本发明提供一种试剂盒，其包含
如本发明所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明所述的改构抗体-药物分子、如本发明所述的核酸、如本发明所述的表达载体、如本发明所述的药物组合物；优选地，还进一步包含给药的装置。
在又一个方面，本发明提供一种预防和治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病的方法，其包含给予受治疗者如本发明所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明所述的改构抗体-药物分子、如本发明所述的核酸、如本发明所述的表达载体、如本发明所述的药物组合物、如本发明所述的药物组合、或如本发明所述的试剂盒。
在又一方面，本发明提供一种分离的、封闭SARS-CoV-2刺突蛋白同ACE2受体的结合抗体或其抗原结合片段，其结合表位是SARS-CoV-2刺突蛋白的N439和T500。
在又一方面，本发明提供一种SARS-CoV-2刺突蛋白的结合表位，其为SARS-CoV-2刺突蛋白的N439和T500。
附图说明
图1：结合SARS-CoV-2蛋白单克隆噬菌体的筛选。
图2：鼠源抗体同SARS-CoV-2 S1及ECD蛋白的结合能力。
图3：流式检测鼠源抗体同SARS-CoV-2 S1蛋白的结合。
图4：鼠源抗体竞争ACE2与SARS-CoV-2 RBD和S1蛋白的结合。
图5：鼠源抗体中和SARS-CoV-2假病毒。
图6：人源化抗体同SARS-CoV-2 RBD，S1及ECD蛋白的结合能力。
图7：人源化抗体竞争ACE2蛋白与SARS-CoV-2 S1蛋白的结合。
图8：人源化抗体同SARS-CoV-2 RBD蛋白及S1蛋白的亲和力检测。
图9：人源化源抗体中和SARS-CoV-2假病毒。
图10：CoV2-mhB27表位分析的表位示意图(A)和ELISA检测结果(B)。A中SARS-CoV-2RBD以白色表面模型表示，所有设计的突变位点以浅灰色表示，鉴定所得的mhB27高度显著表位以黑色表示。
图11：不同Fc功能形式CoV2-HB27抗体同CD16a的结合。
图12：不同Fc功能形式CoV2-HB27抗体同CD32的结合。
图13：不同Fc功能形式CoV2-HB27抗体同CD64的结合。
图14：不同Fc功能形式CoV2-HB27抗体同C1q的结合。
图15：不同Fc功能形式CoV2-HB27抗体对表达SARS-CoV-2 S蛋白靶细胞介导的ADCC作用。
图16：不同Fc功能形式CoV2-HB27抗体对表达SARS-CoV-2 S蛋白靶细胞介导的ADCP作用。
图17：不同Fc功能形式CoV2-HB27抗体对表达SARS-CoV-2 S蛋白靶细胞介导的CDC作用。
图18：小鼠单次静脉注射CoV2-HB27后血药浓度均值-时间曲线(n＝6)。
图19：小鼠单次静脉注射CoV2-HB27-Fd6-IgG1后血药浓度均值-时间曲线(n＝6)。
具体实施方式
定义
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属的技术领域的普通技术人员通常理解的含义。为了本发明的目的，进一步定义以下术语。
当用于本文和所附权利要求书中时，单数形式“一”、“一种”、“另一”和“所述”包括复数指代对象，除非上下文明确地另有指示。
术语“抗体”意指免疫球蛋白分子，是指表现所需生物学活性的抗体的任何形式。包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体和多特异性抗体(例如双特异性抗体)，甚至包括抗体片段。典型地，全长抗体结构优选包含4条多肽链，通常通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包含重链可变区和重链恒定区。每条轻链包含轻链可变区和轻链恒定区。在此典型全长抗体结构外，其结构还包括其他衍生形式。
术语“可变区”指抗体重链或轻链中涉及抗体结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)一般具有类似的结构，可进一步细分为穿插在更保守的区域(称为框架区(FR))中的高变区(称为互补决定区(CDR))。
术语“互补决定区”(CDR，例如CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的这样一些氨基酸残基，其存在对于抗原结合来说是必需的。每个可变区通常具有3个被鉴别为CDR1、CDR2和CDR3的CDR区域。每个互补决定区可包含来自如Kabat所定义的“互补决定区”的氨基酸残基(Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immulological Interest，5th Ed.PublicHealth Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.1991))和/或来自“高变环”的那些残基(Chothia and Lesk；J Mol Biol 196：901-917(1987))。
术语“构架”或“FR”残基是如本文中所定义的CDR残基之外的那些可变区残基。
每个重链可变区和轻链可变区通常包含3个CDR和最多达4个FR，所述CDR和FR从氨基末端至羧基末端以例如以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
给定抗体的互补性决定区(CDR)和框架区(FR)可以使用Kabat体系标识(Kabat等：Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，美国卫生和公众服务部，PHS，NIH，NIH出版编号91-3242，1991)。
术语“恒定区”是指抗体的轻链和重链上的这样一些氨基酸序列，不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，例如抗体依赖性细胞毒性。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，完整的抗体可归属于IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五类抗体，其中IgG和IgA还可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。相应地，五类抗体的重链分别归入α、δ、ε、γ和μ链。根据其轻链恒定区的氨基酸序列，抗体的轻链可归入κ和λ。。
“抗体的抗原结合片段”包含完整抗体分子的一部分，其保留母体抗体的至少某些结合特异性，通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)。抗原结合片段的实例包括但不限于Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2、Fd片段、Fd′片段、单链抗体分子(例如scFv，di-scFv或tri-scFv、双体抗体或scFab)、单域抗体。
“抗体片段”是保留母体抗体的至少某些生物学特性的非完整抗体分子，其实例除上述“抗原结合片段”所述及的那些之外，还包括但不限于Fc片段。
术语“改构药物分子”是指抗体或其片段，如抗原结合片段与另一分子形成共价或非共价连接物或形成重组多靶点融合药物，另一分子选自小分子化合物或生物大分子。
术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而其余部分来源于不同来源或物种的抗体。“人源化抗体”是“嵌合抗体”的子集。
术语“人源化抗体”或“人源化抗原结合片段”在本文中被定义为这样的抗体或抗体片段：(i)来源于非人来源(例如，携带异源免疫系统的转基因小鼠)且基于人种系序列的抗体；或(ii)可变区是非人来源而恒定区是人来源的嵌合抗体；或者(iii)CDR移植的，其中可变区的CDR来自非人来源，而可变区的一个或多个构架区为人来源的，并且恒定区(如果有的话)是人来源的。“人源化”的目的是消除非人来源抗体在人体内的免疫原性，而同时最大可能地保留亲和力。选择与非人来源抗体构架序列最相似的人构架序列为模板进行人源化改造是有利的。在某些情况下，可能需要用非人构架中相应的残基替换人类构架序列中的一个或多个氨基酸，以避免亲和性的丧失。
“单克隆抗体”是指获自基本上同质的抗体群体的抗体，即，所述包含单一抗体的群体除了可能以极少量存在的可能突变(例如天然突变)之外是相同的。因此，所述术语“单克隆”表明所述抗体的性质，即不是不相关抗体的混合物。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体均针对抗原上的单独一组决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体制剂的优点在于它们通常不会被其他抗体污染。所述术语“单克隆”不应被理解为需要通过任何特定的方法产生所述抗体。所述术语单克隆抗体具体地包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。
抗体“特异性结合”目的抗原例如病毒相关抗原蛋白(本文中，刺突蛋白S)，即以足够的亲和力结合所述抗原以使得所述抗体可用作治疗剂，靶向表达所述抗原的病毒或细胞，并且与其他蛋白质无显著交叉反应或者与除了上文提到的抗原靶的同源体和变体(例如突变形式、剪接变体，或蛋白水解作用截短的形式)以外的蛋白质无显著交叉反应。
术语“结合亲和力”是指分子的单个结合位点与其结合伴侣之间非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，用于本文时“结合亲和力”是指固有的结合亲和力，其反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间1∶1的相互作用。“KD”、“结合速率常数kon”和“解离速率常数koff”通常用于描述分子(例如抗体)与其结合伴侣(例如抗原)之间的亲和力，即，配体结合特定蛋白的紧密程度。结合亲和力受非共价分子间相互作用的影响，例如氢键，静电相互作用，两个分子之间的疏水和范德华力。另外，配体与其靶分子之间的结合亲和力可能受到其他分子的存在的影响。亲和力可通过本领域中已知的常规方法来分析，包括本文描述的ELISA。
术语“表位”包括能够特异性结合至抗体或T细胞受体的任何蛋白质决定簇。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链，或其组合)组成，并且通常具有特定三维结构特征以及特定的电荷特征。
“分离的”抗体是已经被鉴别并且从天然表达该抗体的细胞中分离的抗体。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体以及通常通过至少一个纯化步骤进行制备的抗体。
两条多肽或核酸序列之间的“序列同一性”表示所述序列之间相同的残基的数目占残基总数的百分比。在计算同一性百分数时，将正在比较的序列以产生序列之间最大匹配的方式比对，通过特定算法解决比对中的空位(如果存在的话)。确定两个序列之间同一性的优选计算机程序方法包括，但不限于，GCG程序包，包括GAP、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410)。上述程序可以公开地从国际生物技术信息中心(NCBI)和其他来源得到。熟知的Smith Waterman算法也可用于确定同一性。
术语“受体”，是一个生物化学上的概念，指一类能传导细胞外信号，并在细胞内产生特定效应的分子。产生的效应可能仅在短时间内持续，比如改变细胞的代谢或者细胞的运动。也可能是长效的效应，比如上调或下调某个或某些基因的表达。
术语“Fc受体”或“FcR”指与抗体Fc区结合的受体。优选天然序列的人FcR，且优选与IgG抗体结合的受体(γ受体)，其包括FcγRI，FcγRII和FcγRIII亚型，以及这些受体的变体。其它FcR均被包含在术语“FcR”中。该术语也包括新生儿受体(FcRn)，其负责将母体的IgG转运至胎儿(Guyer等，免疫学杂志117：587(1976)和Kim等，免疫学杂志24：249(1994))。
术语“新生儿Fc受体”、简称“FcRn”，其结合IgG抗体Fc区。新生儿Fc受体(FcRn)在体内IgG类抗体的代谢命运中起重要作用。FcRn行使功能以从溶酶体降解途径营救IgG，从而降低其在血清中的清除率并加长半衰期。因此，IgG体外FcRn结合性质/特征指示它在血液循环中的体内药代动力学性质。
术语“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，其随抗体同种型而不同。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和依赖补体的细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、细胞因子分泌、免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取、细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调和B细胞激活。
术语“效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应子功能的白细胞。在一个方面，所述效应细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、自然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从天然来源，例如，血液中分离。效应细胞通常是与效应子阶段相关联的淋巴细胞，并发挥作用，以产生细胞因子(辅助T细胞)、杀死被病原体感染的细胞(细胞毒性T细胞)或分泌抗体(分化的B细胞)。
“免疫细胞”包括具有造血的起源并在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞包括：淋巴细胞，例如B细胞和T细胞；天然杀伤细胞；髓样细胞，例如单核细胞、巨噬细胞、嗜曙红细胞、肥大细胞、嗜碱细胞和粒细胞。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指一种细胞毒性形式，其中结合到在某些细胞毒性细胞(例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fcγ受体上的分泌Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合至承载抗原的靶细胞，随后使用例如细胞毒素杀死所述靶细胞。为了评估目的抗体的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，例如记载于美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中的体外ADCC测定法、本申请的实施例中记载的方法。用于这类测定法的有用效应细胞包括PBMC和NK细胞。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体的存在下靶细胞的裂解。经典补体途径的活化由补体系统的第一组分(C1q)与(适当亚类的)抗体结合起始，其中该抗体与其相应抗原结合。为了评估补体活化，可进行CDC测定法，例如记载于Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol Methods 202：163(1996)中的CDC测定法、例如本申请的实施例中记载的方法、例如在美国专利No.6,194,551 Bl和WO1999/51642中记载的方法，其中描述了具有改变的Fc区氨基酸序列的多肽变体(具有变体Fc区的多肽)和具有增强或降低的C1q结合的多肽变体。
“抗体依赖性细胞吞噬作用”(ADCP)是指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异的细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，并随之引起靶细胞的吞噬。
本发明的抗体的氨基酸序列和核苷酸序列，以及Fc功能改造。
本发明首先采用重组SARS-CoV RBD蛋白来免疫小鼠，然后通过噬菌体抗体库筛选获得1株与SARS-CoV-2 RBD蛋白结合scFv抗体克隆。之后采用PCR方法将编码scFv抗体的重链和轻链可变区的核苷酸序列分别与编码小鼠IgG1重链恒定区和小鼠kappa轻链恒定区的核苷酸序列进行拼接，插入瞬转表达载体，进行培养表达。采用蛋白A纯化柱进行纯化获得高纯度鼠抗体。
采用经典的CDR移植方法进行鼠抗体的人源化改造[8，9]。分别选择与鼠轻链和重链可变区相似性均在50％以上，且轻链和重链可变区的框架区与待改造抗体轻链和重链可变区的框架区氨基酸序列相似性在50％以上的抗体做为人源化模板，将鼠抗体轻链或重链的3个CDR序列置换人源化模板中相应的CDR氨基酸序列中。通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库，选择出用于轻、重链可变区移植的人源模板。将鼠源抗体轻链和重链的3个CDR序列分别移植到相应的人源模板中。由于鼠源框架区的关键位点对于支撑CDR的活性至关重要，因此将关键点回复突变为鼠抗体的序列。分别将轻链/重链信号肽序列、回复突变的人源化抗体轻链/重链的可变区序列、人IgG4重链恒定区/人kappa轻链恒定区序列依次拼接，获得人源化抗体CoV2-HB27的氨基酸序列和核苷酸序列。
本发明进一步对于CoV2-HB27做Fc功能改造。分别是：1)基因工程改造的重链IgG1恒定区，得到降低Fc功能IgG1亚型人源化抗体CoV2-HB27-Fd6-IgG1；2)用Fut8基因敲除的哺乳动物细胞表达的去岩藻糖基化IgG1亚型CoV2-HB27-Ae0-IgG1抗体；和3)基因工程改造的重链IgG1恒定区，得到增强Fc功能IgG1亚型人源化抗体CoV2-HB27-Fe4-IgG1。
本发明的核酸
本发明还涉及编码本发明的抗体或其部分的核酸分子。这些核酸分子的一些示例序列见序列表。
本发明的核酸分子不限于本文公开的序列，还包括变体及与其对应的其他核酸形式，如mRNA，cDNA以及其变体。本发明中变体可以参照它们在杂交中的物理特性来描述。本领域技术人员会认识到利用核酸杂交技术，核酸可用于鉴别其互补物以及其等同物或同系物。还会认识到杂交可以以低于100％互补性发生。然而，考虑到条件的适当选择，杂交技术可用于基于DNA序列与特定探针的结构相关性来区分所述DNA序列。对于这类条件的指导参见Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.；Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989和Ausubel，F.M.，Brent，R.，Kingston，R.E.，Moore，D.D.，Sedman，J.G.，Smith，J.A.，&Struhl，K.eds.(1995).CurrentProtocols in Molecular Biology.New York：John Wiley and Sons。
重组载体和表达
本发明还提供了包含本发明的一个或多个核苷酸序列的重组构建体。本发明的重组构建体可与载体一起使用，所述载体例如质粒、噬粒、噬菌体或病毒载体，编码本发明的抗体的核酸分子被插入所述载体中。
本文提供的抗体可通过在宿主细胞中重组表达编码轻链和重链或其部分的核苷酸序列来制备。为了以重组方法表达抗体，可用携带编码轻链和/或重链或其部分的核苷酸序列的一个或多个重组表达载体转染宿主细胞，以使得所述轻链和重链在所述宿主细胞中表达。标准重组DNA方法学被用于制备和/或获得编码重链和轻链的核酸、将这些核酸纳入重组表达载体中并且将所述载体引入至宿主细胞中，例如Sambrook，Fritsch andManiatis(eds.)，Molecular Cloning；A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor，N.Y.，(1989)、Ausubel，F.M.et al.(eds.)Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Associates，(1989)和Boss et al.的美国专利No.4,816,397中记载的那些。
此外，可将编码所述重链和/或轻链的可变区的核苷酸序列转化为例如编码全长抗体链、Fab片段或scFv的核苷酸序列：例如可以将编码轻链可变区或重链可变区的DNA片段可操作地连接(以使得所述两个DNA片段编码的氨基酸序列都在框架中)至编码例如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。人重链和轻链恒定区的序列是本领域中已知的(参见，例如Kabat，E.A.，el al.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Health and Human Services，NIH PublicationNo.91-3242)，包括这些区域的DNA片段可通过标准PCR扩增来获得。
为了表达所述抗体，可使用标准重组DNA表达方法(参见，例如Goeddel；GeneExpression Technology.Methods in Enzymology 185，Academic Press，San Diego，Calif.(1990))。例如，可将编码所需抗体的核苷酸序列插入至表达载体中，随后将所述表达载体转染至合适的宿主细胞中。合适的宿主细胞为原核细胞和真核细胞。原核宿主细胞的实例为细菌，真核宿主细胞的实例为酵母、昆虫或哺乳动物细胞。应理解，包括选择调节序列的表达载体的设计受到多种因素的影响，例如宿主细胞的选择、所需的蛋白质的表达水平以及表达是组成型的还是可诱导型的。
本发明的抗体可通过公知方法从重组细胞培养物回收和纯化，所述公知方法包括但不限于，硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、蛋白A亲和层析、蛋白G亲和层析、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟磷灰石色谱法以及凝集素色谱法。高效液相色谱法(“HPLC”)也可用于纯化。参见例如，Colligan，CurrentProtocols in Immunology，或Current Protocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，N.Y.，(1997-2001)，例如第1、4、6、8、9、10章，各自以引用的方式全文纳入本文。
本发明的抗体包括天然纯化的产物、化学合成方法的产物和通过重组技术从原核及真核宿主产生的产物，所述真核宿主包括，例如酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。本发明的抗体可以是糖基化的，或者可以是非糖基化的。这类方法记载于许多标准实验室手册中，例如上文的Sambrook，第17.37-17.42节；上文的Ausubel，第10、12、13、16、18和20章。
因此，本发明的实施方案还为包含所述载体或核酸分子的宿主细胞，其中所述宿主细胞可为高等真核宿主细胞例如哺乳动物及昆虫细胞、低等真核宿主细胞例如酵母细胞，并可为原核细胞例如细菌细胞。
本发明的抗体的特性和功能
ELISA测试表明，获得的鼠抗体CoV2-mhB27同瞬时表达SARS-CoV-2 S1蛋白HF-nCoV-SPIKE-8D3细胞有较好的结合，其结合EC50为2.77μg/mL；能有效的竞争ACE2蛋白同RBD和S1蛋白的结合，竞争EC50分别为44.0ng/mL和24.0ng/mL；可有效中和SARS-CoV-2的假病毒，并呈浓度依赖性，中和IC50为8.7ng/mL。
人源化抗体CoV2-HB27与SARS-CoV-2 RBD、S1及ECD蛋白均具有较好的结合，结合呈“S”型曲线增长，结合EC50分别为22.2ng/mL、183.3ng/mL和972.4ng/mL；可有效地抑制ACE2蛋白同SARS-CoV-2 S1蛋白的结合，抑制EC50为178.6ng/mL。CoV2-HB27同SARS-CoV-2RBD及S1蛋白均具有较高的亲和力。CoV2-HB27与SARS-CoV-2 RBD蛋白的亲和力为3.9E-11M，结合常数为3.7E+05 1/Ms，解离常数为1.4E-05 1/s，R2为1.000；与SARS-CoV-2 S1蛋白的亲和力为3.7E-10M，结合常数为1.1E+06 1/Ms，解离常数为3.9E-041/s，R2为0.997。CoV2-HB27可有效中和SARS-CoV-2的假病毒，并呈浓度依赖性，中和IC50为5.9ng/mL。CoV2-HB27经单次静脉注射给予小鼠后，在体内的平均暴露量Cmax和AUClast分别为108.96μg/mL和9922.11h×μg/mL，平均半衰期t1/2为286.16h，清除率Cl为0.30mL/h/kg。
不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体中，去岩藻糖基化的Ae0-IgG1形式抗体和增强Fc功能的Fe4-IgG1形式抗体同CD16a的结合能力相似，强于IgG1亚型的CoV2-HB27抗体；降低Fc功能的Fd6-IgG1形式抗体同CD16a仅有极弱的结合。
不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体中，增强Fc功能的Fe4-IgG1形式抗体同CD32a和CD32b的结合能力最强，优于去岩藻糖基化的Ae0-IgG1形式抗体及IgG1亚型的CoV2-HB27抗体；降低Fc功能的Fd6-IgG1形式抗体同CD32a和CD32b几乎无结合。
不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体中，增强Fc功能的Fe4-IgG1形式抗体同CD64的结合能力最强，优于去岩藻糖基化的Ae0-IgG1形式抗体及IgG1亚型的CoV2-HB27抗体；降低Fc功能的Fd6-IgG1形式抗体同CD64仅有较弱的结合。
不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体中，增强Fc功能的Fe4-IgG1形式抗体同C1q的结合能力最强，优于去岩藻糖基化的Ae0-IgG1形式抗体及IgG1亚型的CoV2-HB27抗体；降低Fc功能的Fd6-IgG1形式抗体同C1q仅有较弱的结合。
以Jurkat-NFAT/Luc2P-CD32A和Jurkat-NFAT/Luc2P-CD64为效应细胞时不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体中仅有增强Fc功能的Fe4-IgG1形式抗体在高浓度下可以介导较弱的ADCP作用，其余形式的抗体无ADCP作用。以Jurkat-NFAT/Luc2P-CD32B为效应细胞时，不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体均无ADCP作用。
不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体对表达SARS-CoV-2S蛋白的靶细胞均无CDC作用。
用途
本发明的抗体可用于治疗、预防或检测SARS-CoV-2病毒引起的疾病，如SARS-CoV-2病毒引起的急性呼吸道传染病。
药物组合物
可将本发明的抗体、抗原结合片段、改构抗体-药物分子、核酸、载体之一种或多种与至少一种其他化学剂制备成药物组合物，其包括上述活性成分和一种或多种药物可接受载体、稀释剂或赋形剂；任选地，还可以包含一种或多种其他治疗剂。
试剂盒
本发明还涉及药物包装和包含一个或多个容器的试剂盒，所述容器装有上文提到的本发明的药物组合物。与这类容器相关的可以是管理药物或生物制品的生产、使用或销售的政府机构所规定的形式的提示，其反映被所述产品的生产、使用或销售的机构批准用于人类给药。
制备和储存
本发明的药物组合物可以以本领域中已知的方式制备，例如通过常规的混合、溶解、造粒、研磨、乳化、包裹、包埋或冻干方法。
在已经制备包含配制于可接受的载体中的本发明化合物的药物组合物之后，可以将它们放置在适当的容器中并贴上标签用于治疗所标明的病症。这类标签会包括给药的量、频率和方法。
药物组合
上述包含本发明的抗体的药物组合物还与一种或多种其他治疗剂组合，其中所得组合不会引起不可接受的不利影响。
以下实施例用于示例性地说明本发明，而非对本发明进行限制。
实施例
实施例1：采用噬菌体抗体展示文库筛选结合SARS-CoV-2 RBD的鼠源抗体
1.1小鼠免疫
使用重组SARS-CoV-2-RBD-mFc蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司，Cat.40592-V05H，SEQ ID NO：1，下文同)免疫小鼠。具体方法为：将重组SARS-CoV-2-RBD-mFc蛋白与弗氏佐剂混合，使用混合物进行二次免疫，每次免疫剂量为50μg，皮下注射，免疫间隔为2周。第二次免疫后七天经眼眶内眦静脉丛采血。包被重组SARS-CoV-2-RBD-his蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司，Cat.40592-V08B)，采用ELISA方法检测小鼠免疫后的血清效价。第二次免疫血清滴度16000倍稀释达到2.228，10天之后处死小鼠，取小鼠的脾脏组织冻存于液氮中。
1.2噬菌体抗体库的构建
用TriPure Isolation Reagent试剂盒(来源：Roche，Cat.No.11 667 165 001)提取小鼠脾组织的RNA，用反转录试剂盒TriPure Isolation Reagent(来源：InvitrogenCat.No.18080-051)进行反转录后获得cDNA。PCR扩增小鼠抗体轻链和重链可变区核苷酸序列后再采用重叠延伸拼接PCR法将编码小鼠抗体轻链和重链可变区序列的核苷酸序列拼接成编码scFv的核苷酸序列，轻重链可变区通过接头(linker)：
进行连接[6]。通过限制性内切酶Sfi I(来源：Fermentas，下文同)酶切连接到噬菌体载体pComb3x(来源：北京义翘神州科技有限公司)中，电转化X-BLUE感受态(来源：Biomed，下文同)构建免疫小鼠的噬菌体展示scFv抗体库。
1.3结合SARS-CoV-2 RBD噬菌体的筛选
采用固相筛选法，筛选与SARS-CoV-2 RBD蛋白结合的噬菌体。第一轮筛选将浓度为10μg/mL的SARS-CoV-2-RBD-mFc蛋白包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h后，加入噬菌体库，37℃孵育2h。洗板去除未结合噬菌体，加入800μLElution buffer(来源：神州细胞工程有限公司)孵育8min，然后每孔加入10μL 2M Trisbuffer(来源：神州细胞工程有限公司，下文同)中和。将洗脱下的噬菌体浸染到X-BLUE菌种并加入辅助噬菌体表达，第二天收取表达后的噬菌体库。第二轮筛选方法同上。
从富集的文库中挑取单克隆噬菌体进行表达，用ELISA方法检测其与SARS-CoV-2S及RBD蛋白的结合。将浓度为2μg/mL的SARS-CoV-2-S1-his蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司，下文同)、SARS-CoV-2-RBD-mFc蛋白及阴性对照CD155(D1)-mFc(来源：神州细胞工程有限公司)蛋白分别包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭2h后，洗板去除未结合蛋白，再加入10倍稀释的噬菌体单克隆孵育，洗板去除未结合的噬菌体，加入M13/HRP孵育后重复洗板。加入底物显色液进行显色，终止后酶标仪读取OD450。以检测蛋白为横坐标，OD450为纵坐标，利用GraphPad Prism软件分析并绘图。
结果如图1所示，从富集的文库中筛选获得1株与SARS-CoV-2 S1和RBD蛋白特异性结合的scFv克隆，CoV2-mB27，经测序获得scFv抗体的核苷酸序列(SEQ ID NO：3)。
1.4鼠源抗体的生产
PCR扩增CoV2-mB27 scFv抗体的重链可变区核苷酸序列，通过In-fusion方法插入到带重链信号肽(SEQ ID NO：40)和人IgG1恒定区(SEQ ID NO：6)的经过ScaI+Nhe I(来源：Fermentas)酶切的pSE载体(来源：神州细胞工程有限公司，下文同)中获得人鼠嵌合抗体CoV2-mhB27重链(SEQ ID NO：36)的表达载体。PCR扩增CoV2-mB27 scFv的轻链可变区核苷酸序列，通过In-fusion方法插入到带轻链信号肽(SEQ ID NO：41)和人kappa恒定区(SEQID NO：7)的经过ScaI+BsiWI(来源：Fermentas，下文同)酶切的pSE载体中获得人鼠嵌合CoV2-mhB27轻链(SEQ ID NO：37)的表达载体。
扩增可变区引物：
用SCD4-4-TC2培养基(来源：北京义翘神州科技有限公司)传代293E细胞至200mL/瓶，起始接种密度为0.3～0.4×106cell/mL，37℃转速为175rpm的CO2摇床中进行细胞培养。待细胞密度达到1.5～3×106cells/mL后，加入总量100μg按1∶1混合的轻重链质粒DNA和800μL的TF2转染试剂(来源：北京义翘神州科技有限公司)，在摇床中继续培养至第7天收料。培养液4000rpm离心25min，收集上清，加入1/5上清体积的stock buffer(来源：神州细胞工程有限公司)。用PBS将蛋白A层析柱(来源：神州细胞工程有限公司，下文同)平衡5～10倍柱体积，将过滤后的培养上清加入层析柱，再次平衡5～10倍柱体积后，用醋酸钠缓冲液(来源：神州细胞工程有限公司)洗脱样品。样品洗脱后用Tris buffer中和至中性备用。
实施例2：结合SARS-CoV-2 RBD鼠源抗体的功能检测
2.1鼠源抗体同SARS-CoV-2 S蛋白的结合
将不同浓度的SARS-CoV-2 S1蛋白(1000ng/mL、333.3ng/mL、111.1ng/mL、37.0ng/mL、12.4ng/mL、4.12ng/mL和1.37ng/mL)或SARS-CoV-2 ECD蛋白(9000ng/mL、3000ng/mL、1000ng/mL、333.3ng/mL、111.1ng/mL、37.0ng/mL、12.4ng/mL和4.12ng/mL，来源：北京义翘神州科技有限公司，下文同)包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h后，加入100μL 1μg/mL的鼠源抗体CoV2-mhB27孵育1h，之后洗板去除未结合抗体，加入0.25μg/mL Goat anti-human IgG Fc/HRP(来源：KPL公司，下文同)孵育后重复洗板，加入底物显色液进行显色，终止后检测OD450。
结果如图2所示，CoV2-mhB27抗体与SARS-CoV-2 S1蛋白和ECD蛋白的结合均呈“S”型曲线增长，其结合EC50分别为116.4ng/mL和306.6ng/mL。
本实施例进一步通过流式验证了鼠源抗体同瞬时表达SARS-CoV-2 S1蛋白HF-nCoV-SPIKE-8 D3细胞的结合能力。取处于对数生长期HF-nCoV-SPIKE-8 D3细胞(来源：神州细胞工程有限公司)置于流式管，5×105cell/管。加入不同浓度的鼠源抗体CoV2-mhB27(33.3μg/mL、16.7μg/mL、8.3μg/mL、4.2μg/mL、2.1μg/mL、1.04μg/mL和0.52μg/mL)，同时以H7N9-R1为阴性对照抗体(来源：神州细胞工程有限公司，下文同)。4℃混合孵育20min后PBS洗液清洗，离心去除未结合的抗体。加入FITC标记的Goat anti-Human IgG Fc二抗(来源：KPL公司)，4℃混合孵育20min后PBS重复清洗。200μLPBS重悬细胞，400目过滤后流式细胞仪上机检测。结果如图3所示，CoV2-mhB27抗体与HF-nCoV-SPIKE-8 D3细胞有较好的结合，其结合EC50为2.77μg/mL，阴性对照无结合。
2.2鼠源抗体竞争ACE2受体同SARS-CoV-2 RBD蛋白的结合
将浓度为1μg/mL的SARS-CoV-2 RBD或S1蛋白包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h后，加入100μL 0.08μg/mL的ACE2蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司，下文同)和不同浓度的CoV2-mhB27抗体(2500ng/mL、625ng/mL、156.3ng/mL、39.1ng/mL、9.8ng/mL和2.4ng/mL)共同孵育。洗板去除未结合抗体，加入0.5μg/mL C-his-R023/HRP(来源：神州细胞工程有限公司)孵育后重复洗板，最后加入底物显色液进行显色，终止后检测OD450。抑制率PI％＝(OD空白-OD样品)/OD空白×100％，其中OD空白表示正常包被只加ACE2不加抗体组的OD值，OD样品表示正常包被同时加ACE2和抗体的检测组OD值。
结果如图4所示，ACE2蛋白可结合包被的SARS-CoV-2的RBD和S1蛋白，CoV2-mhB27抗体均能有效的竞争ACE2蛋白同RBD和S1蛋白的结合，竞争EC50分别为44.0ng/mL和24.0ng/mL。
2.3鼠源抗体鼠源抗体中和试验
使用Lennti-X 293(来源：Clontech)包装表达SARS-CoV-2 S全长蛋白的假病毒。将总量为62μg的PSD、pWPXL-Luc与pCMV3-SARS-CoV-2-S质粒(来源：神州细胞工程有限公司)按照3∶4∶2的比例混合，加入72μL的Sinofection TF02(来源：北京义翘神州科技有限公司)转染试剂。混匀后室温放置10min，随后加入至Lenti-X 293细胞中。将细胞板置于37℃、5％CO2的培养箱中培养6h后换液。继续培养48h后收取上清，用0.45μm的滤膜过滤去除细胞碎片，获得假病毒液，-80℃保存。
利用有限稀释法对病毒进行10倍梯度稀释，共设置10个病毒浓度，各6个复孔。96孔板中接种密度为3×104cell/mL过表达ACE2的293FT细胞(293FT-ACE2，来源：神州细胞工程有限公司，下文同)悬浮液，100μL/孔。每孔加入50μL梯度稀释的病毒，以细胞培养基作为阴性对照，混匀后置于37℃、5％CO2的培养箱中静置培养24h。培养结束后加入5×passivelysis buffer(来源：Promega)，30μL/孔，混匀裂解细胞。取10μL/孔转入96孔白底板检测荧光信号，Reed-Muench法计算TCID50值。
96孔细胞培养板中加入不同浓度的CoV2-mhB27抗体(2000ng/mL、571.4ng/mL、163.3ng/mL、46.6ng/mL、13.3ng/mL、3.8ng/mL、1.1ng/mL、0.31ng/mL和0.089ng/mL)，50μL/孔。每孔加入100TCID50的假病毒，50μL/孔。以加病毒、不加抗体组作为阳性对照，不加病毒和抗体组为阴性对照。混匀后置于37℃、5％CO2培养箱孵育1h。孵育完成后按照100μL/孔接入密度为3×104cell/mL的293FT-ACE2细胞悬浮液，混匀后置于37℃、5％CO2培养箱中静置培养24h。培养结束后，加入5×passive lysis buffer(来源：Promega，下文同)，30μL/孔，混匀裂解细胞。取10μL/孔转入96孔白底板荧光信号值(RLU)，计算中和率。中和率％＝(阳性对照RLUs-样品RLUs)/(阳性对照RLUs-阴性对照RLUs)×100％。结果如图5所示，CoV2-mhB27可有效中和SARS-CoV-2的假病毒，并呈浓度依赖性，中和IC50为8.7ng/mL。
实施例3：鼠抗体的人源化改造及生产
3.1鼠抗体轻链及重链的CDR确定
根据实施例1.3中测定的核苷酸序列推导出CoV2-mhB27中和抗体的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：8)和轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：9)。参考Kabat[7]以及IMGT编号方式确定CoV2-mhB27中和抗体轻链及重链各3个CDR的氨基酸序列，序列详见SEQ IDNO：10-15及表1。上述抗体的轻链及重链CDR在后续人源化步骤中直接移植到最终获得的人源化抗体CoV2-HB27中。
表1鼠源抗体和人源化抗体的轻链及重链CDR序列
3.2鼠抗体人源化CDR移植
采用经典的CDR移植方法进行鼠抗体的人源化改造[8，9]。分别选择与鼠轻链和重链可变区相似性均在50％以上，且轻链和重链可变区的框架区与待改造抗体轻链和重链可变区的框架区氨基酸序列相似性在50％以上的抗体做为人源化模板，将鼠抗体轻链或重链的3个CDR序列置换人源化模板中相应的CDR氨基酸序列中。本实施例中通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库，选择出用于CoV2-mhB27的轻链可变区移植的人源模板为IGKV3D-11*02，该模板与CoV2-mhB27轻链的同源性为62.8％；重链可变区的人源模板为IGHV3-21*01，该模板与CoV2-mhB27重链的同源性为78.9％。
3.3人源化可变区序列框架区的回复突变
由于鼠源框架区的关键点对于维持CDR空间结构的稳定性具有至关重要的作用，因此需将关键点回复突变为鼠抗体的相应氨基酸。按照IMGT编号，将轻链的第42位回复突变为F，第71位回复突变为V，第83位回复突变为S，第88位回复突变为S，第103位回复突变为F；重链的第3位回复突变为K，第49位回复突变为R，第54位回复突变为A，第86位回复突变为T。经CDR人源化移植和框架区回复突变获得人源化抗体CoV2-HB27，其重链和轻链可变区氨基酸序列分别如SEQ ID NO：22/23所示；其含有信号肽的重链和轻链氨基酸序列分别如SEQID NO：18/19所示，分别包含依次连接的重链/轻链信号肽氨基酸序列(SEQ ID NO：20/21)；其人源化抗体重链/轻链的可变区氨基酸序列(SEQ ID NO：22/23)；其人源化抗体的恒定区为人IgG1重链恒定区/人kappa轻链恒定区序列(SEQ ID NO：32/33)。
3.4人源化抗体的生产
通过全基因合成的方法获得CoV2-HB27重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：30)。通过In-fusion方法插入到带重链信号肽(SEQ ID NO：28)和重链IgG1恒定区(SEQ ID NO：32)的经ScaI+NheI(来源：Fermentas，下文同)酶切的pSE载体中获得CoV2-HB27重链(SEQID NO：26)表达载体。
通过全基因合成的方法分别获得CoV2-HB27轻链可变区(SEQ ID NO：31)核苷酸序列。通过In-fusion方法插入到带轻链信号肽(SEQ ID NO：29)和轻链kappa恒定区核苷酸序列(SEQ ID NO：33)的经ScaI+BsiWI(来源：Fermentas)酶切的pSE载体中获得CoV2-HB27轻链(SEQ ID NO：27)表达载体。
提质粒后转染HEK-293细胞(来源：Invitrogen，下文同)进行培养表达7天，采用蛋白A纯化柱纯化获得高纯度抗体。
全基因合成CoV2-HB27重链可变区引物：
拼接CoV2-HB27-IgG1重链引物：
全基因合成CoV2-HB27轻链可变区引物：
实施例4：人源化抗体的抗原结合及中和能力检测
4.1人源化抗体同SARS-CoV-2蛋白的结合
将不同浓度的SARS-CoV-2 RBD蛋白(777.8ng/mL、259.3ng/mL、86.4ng/mL、28.8ng/mL、9.6ng/mL和3.2ng/mL)或S1蛋白(21000ng/mL、7000ng/mL、2333.3ng/mL、777.8ng/mL、259.3ng/mL、86.4ng/mL、28.8ng/mL、9.6ng/mL和3.2ng/mL)或ECD蛋白(21000ng/mL、7000ng/mL、2333.3ng/mL、777.8ng/mL、259.3ng/mL、86.4ng/mL、28.8ng/mL和9.6ng/mL)包被于96孔板上，每孔100μL，4℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h后，加入100μL1μg/mL的人源化抗体孵育1h，之后洗板去除未结合抗体，加入0.25μg/mL Goat anti-humanIgG Fc/HRP孵育后重复洗板，加入底物显色液进行显色，终止后检测OD450。
结果如图6所示，人源化抗体CoV2-HB27与SARS-CoV-2 RBD、S1及ECD蛋白均具有较好的结合，结合呈“S”型曲线增长，结合EC50分别为22.2ng/mL、183.3ng/mL和972.4ng/mL。
4.2人源化抗体竞争ACE2受体同SARS-CoV-2 S1蛋白的结合
参照实施例2.2检测人源化抗体竞争ACE2受体同SARS-CoV-2 RBD蛋白结合的能力。结果如图7所示，人源化抗体CoV2-HB27可有效地抑制ACE2蛋白同SARS-CoV-2 S1蛋白的结合，抑制EC50为178.6ng/mL。
4.3人源化抗体同SARS-CoV-2 S蛋白亲和力检测
采用生物分子相互作用分析系统(型号：OctetRED96e，厂家：Fortebio)测定人源化抗体CoV2-HB27与生物素化的SARS-CoV-2 RBD和S1蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司)的结合亲和力。选用SA Sensor，平衡60s后加入2μg/mL的生物素化SARS-CoV-2 RBD和S1蛋白，再次平衡100s洗去未结合蛋白。加入不同浓度的人源化抗体(4.0μg/mL、2.0μg/mL、1.0μg/mL、0.5μg/mL、0.25μg/mL、0.13μg/mL和0.06μg/mL)300s，解离300s。用DataAnalysis Octet软件对数据进行处理计算得到抗体亲和力(KD)、结合常数(kon)、解离常数(kdis)。
结果如表2所示，CoV2-HB27同SARS-CoV-2 RBD及S1蛋白均具有较高的亲和力。CoV2-HB27与SARS-CoV-2 RBD蛋白的亲和力为3.9E-11M，结合常数为3.7E+05 1/Ms，解离常数为1.4E-05 1/s，R2为1.000；与SARS-CoV-2 S1蛋白的亲和力为3.7E-10M，结合常数为1.1E+06 1/Ms，解离常数为3.9E-041/s，R2为0.997。具体动力学特征参数曲线见图8。
表2 CoV2-HB27同SARS-CoV-2 RBD及S1蛋白亲和力检测
4.4人源化抗体中和SARS-CoV-2假病毒能力检测
参照实施例2.3评价人源化抗体CoV2-HB27(500ng/mL、200ng/mL、80ng/mL、32ng/mL、12.8ng/mL、5.12ng/mL、2.05ng/mL、0.82ng/mL和0.33ng/mL)在293FT-ACE2细胞中和100TCID50 SARS-CoV-2假病毒的能力。结果如图9所示，CoV2-HB27可有效中和SARS-CoV-2的假病毒，并呈浓度依赖性，中和IC50为5.9ng/mL。
实施例5：人源化抗体CoV2-HB27的药物质量和药物稳定性分析
5.1 CoV2-HB27的纯度和颗粒大小分析
应用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)、分子排阻高效液相色谱(size-exclusion highperformance liquid chromatograph，SEC-HPLC)分析CoV2-HB27的纯度。SDS-PAGE具体操作步骤：(1)SDS-PAGE胶配制：3.9％浓缩胶，7.5％分离胶(非还原电泳)，13％分离胶(还原电泳)；(2)样品100℃煮沸2min，离心后上样8μg；(3)100V电泳15min后，调整电压为150V，继续电泳40min；(4)考马斯亮蓝染色后脱色，应用BandScan软件计算样品条带纯度。SEC-HPLC操作步骤为：(1)仪器：液相色谱系统(Agilent公司，型号：Agilent1260)，亲水硅胶高效分子排阻色谱柱(Tosoh公司，型号：TSK-GEL G3000SWXL(7.8×300mm，5μm))；(2)流动相：200mMNaH2PO4，100mM Arginine，pH6.5；(2)上样量为80μg；(3)检测波长280nM，分析时间为30min，流速为0.5mL/min，柱温度为25℃；(4)按面积归一化法计算各峰比例。
CoV2-HB27的还原SDS-PAGE、非还原SDS-PAGE的纯度分别为98.5％、83.9％；SEC-HPLC主峰比例为99.7％，聚集体比例为0.3％(表3)。两种检测结果均说明CoV2-HB27的纯度较高，除含有极少量聚集体外，无其他成分。
进一步应用动态光散射(dynamic light scattering，DLS)检测CoV2-HB27的颗粒大小和均一性，具体操作步骤：(1)仪器：动态光散射仪(Wyatt Technology公司，型号：DynaProNanoStar)；(2)上样量为50μL；(3)采集数据后，应用Dynamics 7.1.8软件分析数据。
CoV2-HB27的DLS检测结果显示，半径为5.8nM，百分分散度(％Pd)为9.8％，说明CoV2-HB27颗粒较小，为正常IgG1抗体颗粒大小，且均一性良好(表3)。
表3 CoV2-HB27的SEC-HPLC和DLS检测结果
5.2 CoV2-HB27的热稳定性分析
应用差示扫描荧光法(differential scanning fluorimetry，DSF)检测CoV2-HB27的热稳定性。具体操作步骤：(1)仪器：Uncle系统(Unchained Labs公司，型号：UNCLE-0330)；(2)上样量为9μL；(3)设置检测参数：温度范围为25℃～95℃，升温速度0.3℃/min，每个温度下孵育30s；(4)应用UNcle Analysis软件分析数据，取UV266下内部荧光变化曲线的中点值为Tm，取UV266/Blue473下静态光散射信号形成的聚集体变化曲线的聚合起始温度为Tagg266和Tagg473。
CoV2-HB27在组氨酸缓冲液(40mM Histidine，120mM NaCl，0.02％Tween80，pH6.0)中的热稳定性检测结果见表4，表现出了良好的热稳定性。
表4 CoV2-HB27的热稳定性检测结果
5.3 CoV2-HB27的酸碱异构体分析
IgG1抗体因存在天冬酰胺(Asn)脱酰胺、赖氨酸(Lys)糖化、甲硫氨酸(Met)氧化等情况，故会出现电荷不均一的情况，表现出酸性和碱性异构体。我们分别应用阳离子交换高效液相色谱(cation exchange high performance liquid chromatograph，CEX-HPLC)、毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing，cIEF)分析CoV2-HB27的酸、碱性异构体水平。CEX-HPLC操作步骤：(1)仪器：液相色谱系统(Agilent公司，型号：Agilent1260)，阳离子交换色谱柱(Thermo公司，型号：ProPacTMWCX-10(4×250mm，5μM))；(2)流动相A：buffer A，pH 5.6(Thermo公司，货号：083273)；(3)流动相B：buffer B，pH 10.2(Thermo公司，货号：083275)；(4)上样量为80μg；(5)检测波长为280nM，分析时间为50min，流速为0.5mL/min，柱温度为25℃；(6)按面积归一化法计算各峰比例。cIEF操作步骤：(1)仪器：成像毛细管电泳仪(Proteinsimple公司，型号：iCE3)；(2)取10μL 5mg/ml样品与8μLPharmalyte 3-10、70μL 1％methyl cellulose(MC)、2μL PI marker以及ddH2O配制成分析液，总体积200μL；(3)将样品置于iCE3仪器中，1500V预聚焦1min，之后3000V聚集6min；(4)应用Chrom Perfect软件分析数据。
CoV2-HB27经CEX-HPLC检测后的酸性峰比例为9.7％，碱性峰比例为4.2％；经cIEF检测后的酸性峰比例为11.5％，碱性峰比例为4.5％(表5)。两种检测结果均表明，CoV2-HB27的酸性异构体、碱性异构体均处于较低的水平。
表5 CoV2-HB27的CEX-HPLC和cIEF检测结果
5.4 CoV2-HB27的热加速稳定性分析
CoV2-HB27样品置于45℃中保存1周后，应用SDS-PAGE、SEC-HPLC分析样品的纯度，应用DLS分析样品颗粒大小的变化，具体操作步骤同5.1。
CoV2-HB27在45℃保存1周后，还原SDS-PAGE、非还原SDS-PAGE纯度均未下降；SEC-HPLC纯度下降1％，聚集体水平无变化，出现少量片段，说明CoV2-HB27在热加速后有较小的片段倾向，但热加速后的纯度仍较高。DLS检测结果显示，CoV2-HB27在热加速后的颗粒大小、％Pd均无变化，说明CoV2-HB27热加速后未出现聚集情况(表6)。总之，CoV2-HB27表现出了良好的热加速稳定性。
表6 CoV2-HB27的热加速稳定性检测结果
5.5 CoV2-HB27的冻融稳定性分析
CoV2-HB27样品置于-80℃条件保存3h后转移至45℃条件解冻1h，如此进行五次反复冻融。应用SDS-PAGE、SEC-HPLC分析样品的纯度，应用DLS分析样品颗粒大小的变化，具体操作步骤同5.1。
CoV2-HB27经五次反复冻融后，SDS-PAGE、SEC-HPLC纯度无明显变化，聚集体、片段水平也无明显增加；DLS颗粒大小、％Pd也无明显增大(表7)。说明CoV2-HB27具有良好的冻融稳定性。
表7 CoV2-HB27的冻融稳定性检测结果
5.6 CoV2-HB27的高浓度稳定性分析
将11.1mg/mL CoV2-HB27样品应用50kDa超滤管分别浓缩至26.0mg/mL、51.4mg/mL、85.5mg/mL、103.9mg/mL，应用SDS-PAGE、SEC-HPLC分析样品的纯度，应用DLS分析样品颗粒大小的变化，具体操作步骤同5.1。
CoV2-HB27浓度逐渐增加时，SDS-PAGE、SEC-HPLC纯度均无明显变化，聚集体、片段水平也无明显增加；但DLS颗粒半径随着浓度的增加而缓慢增大，最大半径为11.1nM(表8)。说明CoV2-HB27具有良好的高浓度稳定性。
表8 CoV2-HB27的高浓度稳定性检测结果
实施例6：CoV2-mhB27的表位分析
实施例2.2的结果表明，CoV2-mhB27可竞争ACE2受体同SARS-CoV-2 RBD和S1蛋白的结合。低温电镜结晶表明437-508号残基位点是SARS-CoV-2 RBD与ACE2结合所需的关键氨基酸残基[10]。基于上述信息推测，在CoV2-mhB27结合RBD后，会与ACE2的结构构象形成空间位阻冲突。因此，本实施例选取了17个位于ACE2结合区及其附近的残基位点，将其突变为和原残基类型性质差异较大的其他残基类型，产生15个突变体，即E340R、T345Y、V367F、K378D、T385Y、N439R、N440Y、Y449A/N450、Y489R、T500Y、Y505E、A372Y、S375Y、D405R/R408和V503Y。
本实施例以SARS-CoV-2 RBD-His作为模板(序列来源：https：//www gisaidorg/)，使用PCR进行定点突变，并进行测序验证。瞬时转染表达突变型及野生型(WT)SARS-CoV-2 RBD蛋白并用ELISA检测CoV2-mhB27抗体同突变蛋白的结合能力。另外，为了检查抗体结合SARS-CoV-2 RBD突变体与WT相比的结合值差异的独特性，并排除潜在的突变体质量的影响，在研究中同时加入了一株非ACE2竞争的SARS-CoV中和抗体R007(来源：北京义翘神州科技有限公司)作为对照。
对于ELISA检测结果(图10)，先以WT SARS-CoV-2 RBD的ELISA读数作为标准，标准化各抗体检测结果。再针对某个特定的SARS-CoV-2 RBD突变体，以最高的抗体结合读数(设为100％)进一步标准化针对该突变体的ELISA结合信号。当mhB27针对特定突变体的ELISA结合信号相对于WT SARS-CoV-2 RBD下降到75％以下时，将该残基位点定义为显著结合表位。同样，若CoV2-mhB27针对特定突变体的ELISA结合信号下降到50％以下时，定义为高度显著表位。如图10所示，SARS-CoV-2 RBD中的N439和T500为CoV2-mhB27的高度显著表位。
实施例7：不同Fc功能形式人源化抗体CoV2-HB27的构建及生产
7.1降低Fc功能IgG1亚型人源化抗体CoV2-HB27的构建及生产
为降低抗体Fc片段介导的免疫功能，参照文献对IgG1亚型的恒定区进行核苷酸突变[11]，得到基因工程改造的重链IgG1恒定区核苷酸序列(Fd6-IgG1，SEQ ID NO：44)。
通过PCR获得CoV2-HB27-Fd6-IgG1重链序列(SEQ ID NO：46)，其包含重链信号肽核苷酸序列(SEQ ID NO：28)，重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：30)和Fd6-IgG1恒定区核苷酸序列(SEQ ID NO：44)。通过In-fusion方法插入经HindIII+XbaI酶切的pSE载体中获得含有CoV2-HB27-Fd6-IgG1重链(SEQ ID NO：46)的表达载体。
拼接CoV2-HB27-Fd6-IgG1重链引物：
提取CoV2-HB27-Fd6-IgG1重链(SEQ ID NO：46)表达载体、CoV2-HB27轻链(SEQ IDNO：27)表达载体质粒，转染HEK-293细胞进行培养表达7天，采用蛋白A纯化柱纯化获得降低Fc功能的CoV2-HB27-Fd6-IgG1抗体。
7.2去岩藻糖基化IgG1亚型人源化抗体CoV2-HB27的构建及生产
提取CoV2-HB27重链(SEQ ID NO：26)表达载体、CoV2-HB27轻链(SEQ ID NO：27)表达载体质粒，转染HEK-293(fut8基因敲除)细胞进行培养表达7天，采用蛋白A纯化柱纯化获得去岩藻糖基化IgG1亚型的CoV2-HB27-Ae0-IgG1抗体。
7.3增强Fc功能IgG1亚型人源化抗体CoV2-HB27的构建及生产
为增强抗体Fc片段介导的免疫功能，参照文献对IgG1亚型的恒定区进行核苷酸突变[12，13]，得到基因工程改造的重链IgG1恒定区核苷酸序列(Fe4-IgG1，SEQ ID NO：48)。
通过PCR获得CoV2-HB27-Fe4-IgG1重链序列(SEQ ID NO：50)，其包含重链信号肽核苷酸序列(SEQ ID NO：28)，重链可变区核苷酸序列(SEQ ID NO：30)和Fe4-IgG1恒定区核苷酸序列(SEQ ID NO：48)。通过In-fusion方法插入经HindIII+XbaI酶切的pSE载体中获得CoV2-HB27-Fe4-IgG1重链(SEQ ID NO：50)表达载体。
拼接CoV2-HB27-Fe4-IgG1重链引物：
提取CoV2-HB27-Fe4-IgG1重链(SEQ ID NO：50)表达载体、CoV2-HB27轻链(SEQ IDNO：27)表达载体质粒，转染HEK-293(fut8基因敲除)细胞进行培养表达7天，采用蛋白A纯化柱纯化获得增强Fc功能的CoV2-HB27-Fe4-IgG1抗体。
实施例8：不同形式人源化抗体CoV2-HB27的Fc功能
8.1不同Fc功能形式人源化抗体CoV2-HB27的CD16a结合功能
将浓度为10μg/mL的Avidin蛋白(来源：Thermo，下文同)包被于96孔板上，每孔100μL，2-8℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h后，加入100μL浓度为5μg/mL生物素标记的CD16a-AVI-His(V158)+BirA蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司)，室温孵育1h后洗板。分别加入100μL不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体，抗体加入浓度为40000ng/mL、10000ng/mL、2500ng/mL、625ng/mL、156.3ng/mL、39.1ng/mL、9.8ng/mL、2.44ng/mL、0.61ng/mL和0.15ng/mL。孵育1h后洗板去除未结合抗体，加入山羊抗人IgG F(ab)2/HRP(来源：JacksonImmunoResearch公司，下文同)孵育后重复洗板，最后加入底物显色液进行显色，终止后酶标仪读取OD450。
结果如图11所示，不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体中，去岩藻糖基化的Ae0-IgG1形式抗体和增强Fc功能的Fe4-IgG1形式抗体同CD16a的结合能力相似，强于IgG1亚型的CoV2-HB27抗体；降低Fc功能的Fd6-IgG1形式抗体同CD16a仅有极弱的结合。
8.2不同Fc功能形式人源化抗体CoV2-HB27的CD32结合功能
将浓度为10μg/mL的Avidin蛋白包被于96孔板上，每孔100μL，2-8℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h后，加入100μL浓度为5μg/mL的生物素标记的CD32a-AVI-His(R131)+BirA蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司)或CD32b-AVI-HIS+BirA(来源：北京义翘神州科技有限公司)蛋白，室温孵育1h后洗板。加入100μL不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体，抗体加入浓度为40000ng/mL、10000ng/mL、2500ng/mL、625ng/mL、156.3ng/mL、39.1ng/mL和9.77ng/mL。孵育1h后洗板去除未结合抗体，加入山羊抗人IgG F(ab)2/HRP孵育后重复洗板，加入底物显色液进行显色，终止后酶标仪读取OD450。
结果如图12所示，不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体中，增强Fc功能的Fe4-IgG1形式抗体同CD32a和CD32b的结合能力最强，优于去岩藻糖基化的Ae0-IgG1形式抗体及IgG1亚型的CoV2-HB27抗体；降低Fc功能的Fd6-IgG1形式抗体同CD32a和CD32b几乎无结合(图12A，12B)。
8.3不同Fc功能形式人源化抗体CoV2-HB27的CD64结合功能
将浓度为10μg/mL的Avidin蛋白包被于96孔板上，每孔100μL，2-8℃包被过夜。次日洗板，室温封闭1h后，加入100μL浓度为0.5μg/mL的生物素标记的CD64-AVI-His+BirA蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司)，室温孵育1h后洗板。加入100μL不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体，抗体加入浓度为2500ng/mL、625ng/mL、156.3ng/mL、39.1ng/mL、9.77ng/mL、2.44ng/mL、0.61ng/mL、0.15ng/mL、0.04ng/mL和0.01ng/mL。孵育1h后洗板去除未结合抗体，加入山羊抗人IgG F(ab)2/HRP孵育后重复洗板，最后加入底物显色液进行显色，终止后酶标仪读取OD450。
结果如图13所示，不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体中，增强Fc功能的Fe4-IgG1形式抗体同CD64的结合能力最强，优于去岩藻糖基化的Ae0-IgG1形式抗体及IgG1亚型的CoV2-HB27抗体；降低Fc功能的Fd6-IgG1形式抗体同CD64仅有较弱的结合。
8.4不同Fc功能形式人源化抗体CoV2-HB27的C1q结合功能
将不同浓度的不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体分别包被于96孔板上，100μL/孔，4℃包被过夜，抗体包被浓度为40000ng/mL、10000ng/mL、2500ng/mL、625ng/mL、156.3ng/mL、39.1ng/mL和9.77ng/mL。次日洗板，室温封闭1h后，加入5μg/mL的C1q补体蛋白(来源：北京义翘神州科技有限公司)，100μg/孔，孵育1h。洗板去除未结合的蛋白，加入0.5μg/mLanti-His-MM02T/HRP(来源：北京义翘神州科技有限公司)孵育后重复洗板，最后加入底物显色液进行显色，终止后检测OD450。
结果如图14所示，不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体中，增强Fc功能的Fe4-IgG1形式抗体同C1q的结合能力最强，优于去岩藻糖基化的Ae0-IgG1形式抗体及IgG1亚型的CoV2-HB27抗体；降低Fc功能的Fd6-IgG1形式抗体同C1q仅有较弱的结合。
8.5不同Fc功能形式人源化抗体CoV2-HB27介导的ADCC功能
以稳定表达SARS-CoV-2全长蛋白的HEK293FT单克隆细胞株(HEK293FT-SARS-CoV-2-S，来源：神州细胞工程有限公司，下文同)为靶细胞，以稳定转染CD16AV和NFAT-Luc2P的Jurkat细胞(Jurkat-NFAT/Luc2P-CD16AV)为效应细胞，利用报告基因法检测人源化抗体的ADCC功能。
在96孔板中按照50μL/孔接入密度为1×105cell/mL的靶细胞和等体积等密度的效应细胞。之后加入50μL不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体和H7N9-R1阴性对照抗体。CoV2-HB27-Ae0-IgG1、CoV2-HB27-He5-IgG1抗体加入浓度为6.25ng/mL、0.78ng/mL、0.097ng/mL、0.012ng/mL、0.0015ng/mL和0.00019ng/mL，其余抗体加入浓度为50ng/mL、6.25ng/mL、0.78ng/mL、0.097ng/mL、0.012ng/mL、0.0015ng/mL和0.00019ng/mL。混匀后37℃、5％CO2培养箱中孵育6h。最后加入5×passive lysis buffer，30μL/孔，混匀裂解细胞。取10μL/孔细胞样品检测RLU值。利用GraphPad Prism软件分析并绘制量效曲线，横坐标为样品的浓度，纵坐标为RLU值。生物发光强度诱导倍数＝样品组RLU值/阴性对照组RLU值。
结果如图15所示，不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体中，增强Fc功能的Fe4-IgG1形式抗体可介导最强的ADCC作用，优于去岩藻糖基化的Ae0-IgG1形式抗体及IgG1亚型抗体介导的ADCC作用；降低Fc功能的Fd6-IgG1形式抗体无ADCC作用。
8.6不同Fc功能形式人源化抗体CoV2-HB27介导的ADCP功能
以HEK293FT-SARS-CoV-2-S为靶细胞，以稳定转染CD32A，CD32B或CD64和NFAT-Luc2P的Jurkat细胞(Jurkat-NFAT/Luc2P-CD32A，Jurkat-NFAT/Luc2P-CD32B或Jurkat-NFAT/Luc2P-CD64)为效应细胞，利用报告基因法检测人源化抗体介导的ADCP功能。
在96孔板中按照50μL/孔接入密度为1×105cell/mL的靶细胞和等体积等密度的效应细胞。之后加入50μL不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体和H7N9-R1阴性对照抗体。以Jurkat-NFAT/Luc2P-CD32A，Jurkat-NFAT/Luc2P-CD32B为效应细胞时抗体加入浓度为50ng/mL、6.25ng/mL、0.78ng/mL、0.097ng/mL、0.012ng/mL、0.0015ng/mL、0.00019ng/mL、0.000024ng/mL和0.000003ng/mL；以Jurkat-NFAT/Luc2P-CD64为效应细胞时抗体加入浓度为6.25ng/mL、0.78ng/mL、0.097ng/mL、0.012ng/mL、0.0015ng/mL、0.00019ng/mL、0.000024ng/mL和0.000003ng/mL。混匀后37℃、5％CO2培养箱中孵育6h。最后加入5×passive lysis buffer，30μL/孔，混匀裂解细胞。取10μL/孔细胞样品检测RLU值。利用GraphPad Prism软件分析并绘制量效曲线，横坐标为样品的浓度，纵坐标为RLU值。生物发光强度诱导倍数＝样品组RLU值/阴性对照组RLU值。
结果如图16所示，以Jurkat-NFAT/Luc2P-CD32A和Jurkat-NFAT/Luc2P-CD64为效应细胞时(图16A和图16C)，不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体中仅有增强Fc功能的Fe4-IgG1形式抗体在高浓度下可以介导较弱的ADCP作用，其余形式的抗体无ADCP作用。以Jurkat-NFAT/Luc2P-CD32B为效应细胞时(图16B)，不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体均无ADCP作用。
8.7不同Fc功能形式人源化抗体CoV2-HB27介导的CDC功能
以HEK293FT-SARS-CoV-2-S为靶细胞，利用WST-8法检测人源化抗体的CDC功能。
在96孔板中按照50μL/孔接入密度为2×106cell/mL的靶细胞。加入50μL的兔补体(来源：One lambda)和不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体并设置检测空白孔(无细胞)、阳性对照组(只接种细胞)对照和H7N9-R1阴性对照抗体组，抗体加入浓度为20ng/mL、4ng/mL、0.8ng/mL、0.16ng/mL、0.032ng/mL、0.0064ng/mL和0.00128ng/mL。混匀后37℃、5％CO2培养箱中孵育2h。培养结束后加入WST-8显色液，10μL/孔。将96孔板置CO2培养箱孵育，显色稳定后置酶标仪上于450nm、630nm处测定吸光度。以吸光度值(OD450-OD630)，并减去空白孔的读值来计算抗体的CDC的杀伤效应。杀伤率％＝(阳性对照OD值-样品OD值)/阳性对照OD值×100％。
结果如图17所示，不同Fc功能形式的CoV2-HB27抗体对表达SARS-CoV-2S蛋白的靶细胞均无CDC作用。
实施例9：不同Fc功能形式人源化抗体CoV2-HB27的小鼠药代动力学评价
9.1 IgG1型人源化抗体CoV2-HB27给予小鼠药代动力学试验
选用C57BL/6小鼠(共6只，雌雄各半，来源：北京维通利华实验动物技术有限公司)，单次尾静脉注射给予CoV2-HB27，给药剂量为5mg/kg，给药容积为10mL/kg。于给药前及给药后5min、30min、1h、3h、6h、10h、24h、32h、48h、72h、96h、120h、168h、240h、336h、504h和672h对所有小鼠进行眼眶采血，离心取血清。利用ELISA法检测血药浓度，并采用Phoenix-WinNonlin 8.1软件中非房室模型(NCA)计算药代动力学参数。
实验过程中所有小鼠均状态正常，药时曲线如图18所示，小鼠体内药物浓度随时间不断变化，早期下降较快，但之后降低较缓慢，且无明显性别差异。单次药代动力学参数如表9所示，CoV2-HB27经单次静脉注射给予小鼠后，在体内的平均暴露量Cmax和AUClast分别为108.96μg/mL和9922.11h×μg/mL，平均半衰期t1/2为286.16h，清除率Cl为0.30mL/h/kg。
表9小鼠单次静脉注射CoV2-HB27的药代动力学参数(0～336h)
9.2 CoV2-HB27-Fd6-IgG1给予小鼠药代动力学试验
选用C57BL/6小鼠(共6只，雌雄各半，来源：北京维通利华实验动物技术有限公司)，单次尾静脉注射给予CoV2-HB27-Fd6-IgG1抗体，给药剂量为5mg/kg，给药容积为10mL/kg。于给药前及给药后5min、30min、1h、3h、6h、10h、24h、32h、48h、72h、96h、120h168h、240h、336h、504h和672h对所有小鼠进行眼眶采血，离心取血清。利用ELISA法检测血药浓度，并采用Phoenix-WinNonlin 6.4软件中非房室模型(NCA)计算药代动力学参数。
实验过程中所有小鼠均状态正常，药时曲线如图19所示。小鼠体内药物浓度随时间不断降低，早期下降较快，但之后较长时间内变化较缓慢，且无明显性别差异。药代动力学参数如表10所示，CoV2-HB27-Fd6-IgG1经单次静脉注射给予小鼠后，在体内的平均暴露量Cmax和AUClast分别为115.04μg/mL和11159.82h×μg/mL，平均半衰期t1/2为320.00h，清除率Cl为0.23mL/h/kg。
表10小鼠单次静脉注射CoV2-HB27-Fd6-IgG1的药代动力学参数(0～336h)
序列清单
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
参考文献
1.Zhao，S.，et al.，Preliminary estimation of the basic reproductionnumber of novel coronavirus(2019-nCoV)in China，from 2019to 2020：A data-drivenanalysis in the early phase of the outbreak.International Journal ofInfectious Diseases，2020.
2.Chen，N.，et al.，Epidemiological and clinical characteristics of 99cases of 2019 novel coronavirus pneumonia in Wuhan，China：a descriptivestudy.The Lancet，2020.
3.Jiang，S.，et al.，A novel coronavirus(2019-nCoV)causing pneumonia-associated respiratory syndrome.Cellular&Molecular Immunology，2020：p.1-1.
4.Zhou，P.，et al.，Discovery of a novel coronavirus associated with therecent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin.BioRxiv，2020.
5.Wan，Y.，et al.，Receptor recognition by novel coronavirus from Wuhan：An analysis based on decade-long structural studies of SARS.Journal ofvirology，2020.
6.Jones，S.T.and M.M.Bendig，Rapid PCR-cloning of full-length mouseimmunoglobulin variable regions.Biotechnology(N Y)，1991.9(6)：p.579.
7.Kabat，E.A.，et al.，Sequences ofproteins of immunologicalinterest.1992：DIANE publishing.
8.Jones，P.T.，et al.，Replacing the complementarity-determining regionsin a human antibody with those from a mouse.Nature，1986.321(6069)：p.522.
9.Verhoeyen，M.and L.Riechmann，Engineering of antibodies.BioEssays，1988.8(2-3)：p.74-78.
10.Yan，R.，et al.，Structural basis for the recognition of the SARS-CoV-2by full-length human ACE2.Science，2020.
11.叶鑫，et al.，Cd47 antibody，antigen-binding fragment and medical usethereof.2018，Google Patents.
12.de Jong，R.N.，et al.，A novel platform for the potentiation oftherapeutic antibodies based on antigen-dependent formation of IgG hexamersat the cell surface.PLoS biology，2016.14(1).
13.Parren，P.，et al.，Antibody variants and uses thereof.2014，GooglePatents.
SEQUENCE LISTING
<110> 神州细胞工程有限公司
<120> SARS-CoV-2中和抗体的制备及应用
<130> PCT69125SXB
<160> 103
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 223
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially synthesized.
<400> 1
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 2
tctagtggtg gcggtggttc gggcggtggt ggaggtggta gttctagatc ttcc 54
<210> 3
<211> 750
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 3
gacattgtgc tgacacaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gaactggttc 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240
cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttcctcgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaatctagtg gtggcggtgg ttcgggcggt 360
ggtggaggtg gtagttctag atcttccgag gtgaagctgg tggagtctgg gggaggctta 420
gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc tgtgcagcct ctggattcac tttcagtaac 480
tatggcatgt cttgggttcg ccagtctcca gagaagaggc tggagtgggt cgcagaaatt 540
agtagtggtg gtagttacac ctactatcca gacactgtga cgggccgatt caccatctcc 600
agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg gaaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg 660
gccatgtatt actgtgcaag gtttaggtac gacgggggag ggggtactgt ggactactgg 720
ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 750
<210> 4
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 4
gaggtgaagc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aactatggca tgtcttgggt tcgccagtct 120
ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcagaa attagtagtg gtggtagtta cacctactat 180
ccagacactg tgacgggccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240
ctggaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aaggtttagg 300
tacgacgggg gagggggtac tgtggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 5
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 5
gacattgtgc tgacacaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60
atctcctgca gagccagcga aagtgttgat aattatggca ttagttttat gaactggttc 120
caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180
ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240
cctatggagg aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttcctcgg 300
acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaa 333
<210> 6
<211> 993
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 6
gcaagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993
<210> 7
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 7
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg ttag 324
<210> 8
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 8
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Gly Gly Gly Gly Thr Val Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 9
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 9
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 10
<211> 15
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 10
Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn
1 5 10 15
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 11
Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1 5
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 12
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Arg Thr
1 5
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 13
Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ser
1 5 10
<210> 14
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 14
Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val Thr
1 5 10 15
Gly
<210> 15
<211> 14
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 15
Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Gly Gly Gly Gly Thr Val Asp Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 16
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Gly Gly Gly Gly Thr Val Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 17
<211> 218
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 18
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 18
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Thr Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Gly Gly Gly Gly Thr Val Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 19
<211> 237
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 19
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu
20 25 30
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
35 40 45
Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu
85 90 95
Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln
100 105 110
Gln Ser Lys Glu Val Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 20
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 20
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys
<210> 21
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 21
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 22
<211> 121
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 22
Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Gly Gly Gly Gly Thr Val Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 23
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
35 40 45
Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 24
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 25
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 26
<211> 1413
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 26
atggagttgg gactgagctg gattttcctt ttggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgaaactgg tggagtctgg aggaggactg gtgaagcctg gaggctccct gagactgtcc 120
tgtgctgcct ctggcttcac cttcagcaac tatgggatga gttgggtgag acaggctcct 180
ggcaagagat tggagtgggt ggctgagatt tcctctggag gctcctacac ctactaccct 240
gacacagtga caggcaggtt caccatcagc agggacaatg ccaagaacac cctctacctc 300
caaatgaact ccctgagggc tgaggacaca gcagtctact actgtgccag gttcagatat 360
gatggaggag gaggcacagt ggactactgg ggacaaggca ccctggtgac agtgtccagc 420
gcaagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413
<210> 27
<211> 714
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 27
atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgag 60
attgtgctga cccagagccc tgccaccctg tccctgagcc ctggagagag ggctaccctg 120
tcctgtaggg catctgagtc tgtggacaac tatggcatct cctttatgaa ctggttccaa 180
cagaagcctg gacaagcccc aagactgctg atttatgctg ccagcaacca gggctctgga 240
gtgcctgcca ggttctctgg ctctggctct ggcacagact tctccctgac catctcctcc 300
ttggaacctg aggactttgc tgtctacttc tgtcaacaga gcaaggaggt gccaaggacc 360
tttggacaag gcaccaaggt ggagattaag cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttag 714
<210> 28
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 28
atggagttgg gactgagctg gattttcctt ttggctattt taaaaggtgt ccagtgt 57
<210> 29
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 29
atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagt 57
<210> 30
<211> 363
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 30
gaggtgaaac tggtggagtc tggaggagga ctggtgaagc ctggaggctc cctgagactg 60
tcctgtgctg cctctggctt caccttcagc aactatggga tgagttgggt gagacaggct 120
cctggcaaga gattggagtg ggtggctgag atttcctctg gaggctccta cacctactac 180
cctgacacag tgacaggcag gttcaccatc agcagggaca atgccaagaa caccctctac 240
ctccaaatga actccctgag ggctgaggac acagcagtct actactgtgc caggttcaga 300
tatgatggag gaggaggcac agtggactac tggggacaag gcaccctggt gacagtgtcc 360
agc 363
<210> 31
<211> 333
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 31
gagattgtgc tgacccagag ccctgccacc ctgtccctga gccctggaga gagggctacc 60
ctgtcctgta gggcatctga gtctgtggac aactatggca tctcctttat gaactggttc 120
caacagaagc ctggacaagc cccaagactg ctgatttatg ctgccagcaa ccagggctct 180
ggagtgcctg ccaggttctc tggctctggc tctggcacag acttctccct gaccatctcc 240
tccttggaac ctgaggactt tgctgtctac ttctgtcaac agagcaagga ggtgccaagg 300
acctttggac aaggcaccaa ggtggagatt aag 333
<210> 32
<211> 993
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 32
gcaagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993
<210> 33
<211> 324
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 33
cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60
ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120
tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240
aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300
agcttcaaca ggggagagtg ttag 324
<210> 34
<211> 250
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 34
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser
100 105 110
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg Ser
115 120 125
Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly
130 135 140
Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn
145 150 155 160
Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp
165 170 175
Val Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr
180 185 190
Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu
195 200 205
Tyr Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Gly Gly Gly Gly Thr Val Asp Tyr Trp
225 230 235 240
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 35
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 35
Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Gly Ser Ser Arg
1 5 10 15
Ser Ser
<210> 36
<211> 1413
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 36
atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgagtgag 60
gtgaagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgaagcctg gagggtccct gaaactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac tttcagtaac tatggcatgt cttgggttcg ccagtctcca 180
gagaagaggc tggagtgggt cgcagaaatt agtagtggtg gtagttacac ctactatcca 240
gacactgtga cgggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300
gaaatgagca gtctgaggtc tgaggacacg gccatgtatt actgtgcaag gtttaggtac 360
gacgggggag ggggtactgt ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 420
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413
<210> 37
<211> 714
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 37
atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgac 60
attgtgctga cacaatctcc agcttctttg gctgtgtctc tagggcagag ggccaccatc 120
tcctgcagag ccagcgaaag tgttgataat tatggcatta gttttatgaa ctggttccaa 180
cagaaaccag gacagccacc caaactcctc atctatgctg catccaacca aggatccggg 240
gtccctgcca ggtttagtgg cagtgggtct gggacagact tcagcctcaa catccatcct 300
atggaggagg atgatactgc aatgtatttc tgtcagcaaa gtaaggaggt tcctcggacg 360
ttcggtggag gcaccaagct ggaaatcaaa cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420
ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat 480
aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540
aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600
accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 660
catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttag 714
<210> 38
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 38
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1 5 10 15
Val Leu Ser Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Thr Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Gly Gly Gly Gly Thr Val Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 39
<211> 237
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 39
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val
20 25 30
Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val
35 40 45
Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly
50 55 60
Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly
65 70 75 80
Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu
85 90 95
Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr Phe Cys Gln
100 105 110
Gln Ser Lys Glu Val Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu
115 120 125
Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser
130 135 140
Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn
145 150 155 160
Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala
165 170 175
Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys
180 185 190
Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp
195 200 205
Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu
210 215 220
Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230 235
<210> 40
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 40
atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgagt 57
<210> 41
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 41
atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagt 57
<210> 42
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 42
Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg
1 5 10 15
Val Leu Ser
<210> 43
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 43
Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 44
<211> 993
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 44
gcaagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgccggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993
<210> 45
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 45
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 46
<211> 1413
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 46
atggagttgg gactgagctg gattttcctt ttggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgaaactgg tggagtctgg aggaggactg gtgaagcctg gaggctccct gagactgtcc 120
tgtgctgcct ctggcttcac cttcagcaac tatgggatga gttgggtgag acaggctcct 180
ggcaagagat tggagtgggt ggctgagatt tcctctggag gctcctacac ctactaccct 240
gacacagtga caggcaggtt caccatcagc agggacaatg ccaagaacac cctctacctc 300
caaatgaact ccctgagggc tgaggacaca gcagtctact actgtgccag gttcagatat 360
gatggaggag gaggcacagt ggactactgg ggacaaggca ccctggtgac agtgtccagc 420
gcaagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgccggggga 780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413
<210> 47
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 47
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Thr Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Gly Gly Gly Gly Thr Val Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 48
<211> 993
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 48
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatggcg ctctgcacaa ccactacacg 960
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993
<210> 49
<211> 330
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 49
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
225 230 235 240
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 50
<211> 1413
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 50
atggagttgg gactgagctg gattttcctt ttggctattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgaaactgg tggagtctgg aggaggactg gtgaagcctg gaggctccct gagactgtcc 120
tgtgctgcct ctggcttcac cttcagcaac tatgggatga gttgggtgag acaggctcct 180
ggcaagagat tggagtgggt ggctgagatt tcctctggag gctcctacac ctactaccct 240
gacacagtga caggcaggtt caccatcagc agggacaatg ccaagaacac cctctacctc 300
caaatgaact ccctgagggc tgaggacaca gcagtctact actgtgccag gttcagatat 360
gatggaggag gaggcacagt ggactactgg ggacaaggca ccctggtgac agtgtccagc 420
gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 480
ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 1140
ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatggcg ctctgcacaa ccactacacg 1380
cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 1413
<210> 51
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 51
Met Glu Leu Gly Leu Ser Trp Ile Phe Leu Leu Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Asn Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Trp Val Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Thr Val Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Arg Tyr Asp Gly Gly Gly Gly Thr Val Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Gly Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 52
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 52
gctaccaggg tgctgagtga ggtgcagttg cagcag 36
<210> 53
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 53
tgggcccttg gtgctagctg cagagacagt gaccag 36
<210> 54
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 54
gccacaggag tgcatagtca agctgtggtg actcag 36
<210> 55
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 55
cactgtcagc ttggtacctc caccgaa 27
<210> 56
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 56
gctaccaggg tgctgagtga ggtgaaactg gtggagtctg gaggaggact g 51
<210> 57
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 57
cagggagcct ccaggcttca ccagtcctcc tcc 33
<210> 58
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 58
cctggaggct ccctgagact gtcctgtgct gcc 33
<210> 59
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 59
gttgctgaag gtgaagccag aggcagcaca gga 33
<210> 60
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 60
ttcaccttca gcaactatgg gatgagttgg gt 32
<210> 61
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 61
ctcttgccag gagcctgtct cacccaactc atc 33
<210> 62
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 62
ggctcctggc aagagattgg agtgggtggc tg 32
<210> 63
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 63
aggagcctcc agaggaaatc tcagccaccc act 33
<210> 64
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 64
cctctggagg ctcctacacc tactaccctg ac 32
<210> 65
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 65
ggtgaacctg cctgtcactg tgtcagggta gta 33
<210> 66
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 66
acaggcaggt tcaccatcag cagggacaat gcc 33
<210> 67
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 67
ttggaggtag agggtgttct tggcattgtc cct 33
<210> 68
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 68
accctctacc tccaaatgaa ctccctgagg gct 33
<210> 69
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 69
gtagtagact gctgtgtcct cagccctcag gga 33
<210> 70
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 70
acagcagtct actactgtgc caggttcaga tat 33
<210> 71
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 71
cactgtgcct cctcctccat catatctgaa cct 33
<210> 72
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 72
ggaggaggca cagtggacta ctggggacaa ggc 33
<210> 73
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 73
tgggcccttg gtgcttgcgc tggacactgt caccagggtg ccttgtcccc a 51
<210> 74
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 74
gtcaccgtcc tgacacgaag cttgccgcca ccatggagtt 40
<210> 75
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 75
aagcttgccg ccaccatgga gttgggactg agctggattt tccttttggc tattttaaaa 60
gg 62
<210> 76
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 76
ttttcctttt ggctatttta aaaggtgtcc agtgtgaggt gaaactggtg gagtctg 57
<210> 77
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 77
actatagaat agggccctct aga 23
<210> 78
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 78
gccacaggag tgcatagtga gattgtgctg acccagagcc ctgccaccct g 51
<210> 79
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 79
cctctctcca gggctcaggg acagggtggc agg 33
<210> 80
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 80
agccctggag agagggctac cctgtcctgt agg 33
<210> 81
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 81
gttgtccaca gactcagatg ccctacagga cag 33
<210> 82
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 82
gagtctgtgg acaactatgg catctcc 27
<210> 83
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 83
ggaaccagtt cataaaggag atgccata 28
<210> 84
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 84
ttatgaactg gttccaacag aagcctg 27
<210> 85
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 85
agtcttgggg cttgtccagg cttctgtt 28
<210> 86
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 86
acaagcccca agactgctga tttatgc 27
<210> 87
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 87
gccctggttg ctggcagcat aaatcagc 28
<210> 88
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 88
gccagcaacc agggctctgg agtgcctgcc agg 33
<210> 89
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 89
gccagagcca gagccagaga acctggcagg cac 33
<210> 90
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 90
ggctctggct ctggcacaga cttctccctg acc 33
<210> 91
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 91
ctcaggttcc aaggaggaga tggtcaggga gaa 33
<210> 92
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 92
tccttggaac ctgaggactt tgctgtctac ttc 33
<210> 93
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 93
cacctccttg ctctgttgac agaagtagac agc 33
<210> 94
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 94
cagagcaagg aggtgccaag gacctttgga caa 33
<210> 95
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 95
tggtgcagcc accgtacgct taatctccac cttggtgcct tgtccaaagg t 51
<210> 96
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 96
gtcaccgtcc tgacacgaag cttgccgcca ccatggagtt 40
<210> 97
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 97
aagcttgccg ccaccatgga gttgggactg agctggattt tccttttggc tattttaaaa 60
gg 62
<210> 98
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 98
ttttcctttt ggctatttta aaaggtgtcc agtgtgaggt gaaactggtg gagtctg 57
<210> 99
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 99
actatagaat agggccctct aga 23
<210> 100
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 100
gtcaccgtcc tgacacgaag cttgccgcca ccatggagtt 40
<210> 101
<211> 62
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 101
aagcttgccg ccaccatgga gttgggactg agctggattt tccttttggc tattttaaaa 60
gg 62
<210> 102
<211> 57
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 102
ttttcctttt ggctatttta aaaggtgtcc agtgtgaggt gaaactggtg gagtctg 57
<210> 103
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> The sequence is artificially sequence.
<400> 103
actatagaat agggccctct aga 23

Claims (32)

1.一种分离的、封闭SARS-CoV-2刺突蛋白同ACE2受体结合的抗体或其抗原结合片段，其包含
i)重链可变区，其重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3分别为SEQ ID NO:13、14和15所示的序列，和
ii)轻链可变区，其轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3分别为SEQ ID NO:10、11和12所示的序列。
2.权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包含：
i)重链可变区，其序列包含SEQ ID NO:22或与其具有至少90％、95％、98％或99％序列同一性；和
ii)轻链可变区，其序列包含SEQ ID NO:23或与其具有至少85％、88％、90％、95％、98％或99％序列同一性。
3.权利要求1-2之任一所述的抗体或其抗原结合片段，其为人源化抗体、嵌合或鼠源抗体。
4.权利要求1-2之任一所述的抗体或其抗原结合片段，其抗体恒定区为IgG，IgM或IgA亚型。
5.权利要求1-2之任一所述的抗体或其抗原结合片段，其抗体恒定区为IgG1或IgG2亚型抗体。
6.权利要求1-2之任一所述的抗体或其抗原结合片段，其抗体恒定区为IgG4亚型抗体。
7.权利要求1-2中任一所述的抗体或其抗原结合片段，其表位包含SARS-CoV-2病毒刺突蛋白的N439和/或T500。
8.权利要求1-2之任一所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体进一步包含:
i)重链恒定区，其序列包含SEQ ID NO:24所示的序列；和
ii)轻链恒定区，其序列包含SEQ ID NO:25所示的序列。
9.权利要求1-2之任一所述的抗体或其抗原结合片段，
a)其与SARS-CoV-2 RBD的结合亲和力KD平均值为3.9E-11M；和/或
b)其与SARS-CoV-2 S1的结合亲和力KD平均值为3.7E-10M。
10.权利要求9所述的抗体，其经单次静脉注射给予小鼠后，在体内的平均暴露量Cmax和AUClast分别为108.96μg/mL和9922.11h·μg/mL，平均半衰期t1/2为286.16h，清除率Cl为0.30mL/h/kg。
11.权利要求1-2之任一所述的抗体，其中所述抗体进一步包含:
i)重链恒定区，其序列包含SEQ ID NO:45；和
ii)轻链恒定区，其序列包含SEQ ID NO:25。
12.权利要求11所述的抗体，其经单次静脉注射给予小鼠后，在体内的平均暴露量Cmax和AUClast分别为115.04μg/mL和11159.82h·μg/mL，平均半衰期t1/2为320.00h，清除率Cl为0.23mL/h/kg。
13.权利要求8的抗体，其由fut8基因敲除的HEK-293表达。
14.权利要求1-2任一所述的抗体，其中所述抗体进一步包含
i)重链恒定区，其序列包含SEQ ID NO:49；和
ii)轻链恒定区，其序列包含SEQ ID NO:25。
15.权利要求14的抗体，其由fut8基因敲除的HEK-293表达。
16.权利要求1-2中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为单克隆抗体。
17.权利要求1-2任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含Fv、Fab、Fab′、Fab′-SH、F(ab′)2或单链抗体分子。
18.权利要求17所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述单链抗体分子包含scFv、di-scFv、tri-scFv、双体抗体或scFab。
19.一种核酸，其编码根据权利要求1-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段，所述核酸为mRNA或DNA。
20.权利要求19所述的核酸，其包含
分别如SEQ ID NO:30所示的重链可变区核苷酸序列，和如SEQ ID NO:31所示的轻链可变区核苷酸序列。
21.如权利要求20所述的核酸，其包含
分别如SEQ ID NO:32、44、48所示的重链恒定区核苷酸序列，和如SEQ ID NO:7所示的轻链恒定区核苷酸序列。
22.一种表达载体，其包含权利要求19-21中任意一项所述的核酸。
23.一种宿主细胞，其包含权利要求19-21中任意一项所述的核酸或权利要求22所述的表达载体。
24.一种用于产生权利要求1-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括在适合于所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下培养权利要求23所述的宿主细胞，和从培养基中回收表达的抗体或其抗原结合片段。
25.一种药物组合物，其包含
权利要求1-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求19-21任一项所述的核酸或权利要求22所述的表达载体，以及药学上可接受的载体。
26.根据权利要求25所述的药物组合物，其包含一种或多种其他治疗剂。
27.权利要求26的药物组合物，其中，所述其他治疗剂选自抗病毒药物或炎性因子抑制剂、其他机制的小分子化学药。
28.权利要求27的药物组合物，其中，所述的抗病毒药物选自包含I型干扰素药物、抗体、蛋白酶抑制剂、RNA依赖性RNA聚合酶（RdRP）抑制剂。
29.权利要求1-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求19-21任一项所述的核酸、权利要求22所述的表达载体或权利要求25-28中任一项所述的药物组合物在制备用于预防和治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病的药物中的应用。
30.一种药物组合物，其包含
权利要求1-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求19-21任一项所述的核酸、权利要求22所述的表达载体或权利要求25-28中任一项所述的药物组合物；以及一种或多种另外的治疗剂。
31.一种试剂盒，其包含
权利要求1-18任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求19-21任一项所述的核酸、权利要求22所述的表达载体或权利要求25-28之任一所述的药物组合物。
32.权利要求31的试剂盒，其还进一步包含给药的装置。
CN202180028238.3A 2020-04-28 2021-04-26 SARS-CoV-2中和抗体及其制备和应用 Active CN115380046B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010349190 2020-04-28
CN2020103491903 2020-04-28
PCT/CN2021/089748 WO2021218879A1 (zh) 2020-04-28 2021-04-26 Sars-cov-2中和抗体及其制备和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115380046A CN115380046A (zh) 2022-11-22
CN115380046B true CN115380046B (zh) 2024-02-23

Family

ID=78331765

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180028238.3A Active CN115380046B (zh) 2020-04-28 2021-04-26 SARS-CoV-2中和抗体及其制备和应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN115380046B (zh)
WO (1) WO2021218879A1 (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023031437A1 (en) * 2021-09-03 2023-03-09 Isar Bioscience Gmbh Methods and kit for determining the antibody status and t-cell immunity against sars-cov-2
EP4145132A1 (en) * 2021-09-03 2023-03-08 ISAR Bioscience GmbH Methods and kit for determining the antibody status and t-cell immunity against sars-cov-2
CN116178527A (zh) * 2021-11-26 2023-05-30 深圳先进技术研究院 抗sar-cov-2全人源单克隆抗体6g18及其制法与应用
CN116655786B (zh) * 2023-07-26 2023-10-27 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 广谱性抗SARS和SARS-CoV-2的抗体
CN117783524B (zh) * 2024-02-26 2024-05-03 中国医学科学院医学生物学研究所 一种双抗体夹心法间接定量检测柯萨奇a10型病毒抗原的建立与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1815234A (zh) * 2004-11-22 2006-08-09 香港大学 靶向引起病毒感染的sars相关冠状病毒刺突蛋白上的关键位点的合成肽以及其使用方法
CN1884303A (zh) * 2005-06-20 2006-12-27 中国医学科学院基础医学研究所 SARS－CoV病毒结构蛋白的融合蛋白及其高量表达与纯化和用途
EP2193802A2 (en) * 2005-02-08 2010-06-09 The New York Blood Center, Inc. Neutralizing monoclonal antibodies against severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus
CN110951756A (zh) * 2020-02-23 2020-04-03 广州恩宝生物医药科技有限公司 表达SARS-CoV-2病毒抗原肽的核酸序列及其应用
CN110974950A (zh) * 2020-03-05 2020-04-10 广州恩宝生物医药科技有限公司 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1815234A (zh) * 2004-11-22 2006-08-09 香港大学 靶向引起病毒感染的sars相关冠状病毒刺突蛋白上的关键位点的合成肽以及其使用方法
EP2193802A2 (en) * 2005-02-08 2010-06-09 The New York Blood Center, Inc. Neutralizing monoclonal antibodies against severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus
CN1884303A (zh) * 2005-06-20 2006-12-27 中国医学科学院基础医学研究所 SARS－CoV病毒结构蛋白的融合蛋白及其高量表达与纯化和用途
CN110951756A (zh) * 2020-02-23 2020-04-03 广州恩宝生物医药科技有限公司 表达SARS-CoV-2病毒抗原肽的核酸序列及其应用
CN110974950A (zh) * 2020-03-05 2020-04-10 广州恩宝生物医药科技有限公司 一种用于预防SARS-CoV-2感染的腺病毒载体疫苗

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2;Yan, R.H.等;Science;第367卷(第6485期);参见全文，尤其图4，图5,第1448页左栏第二段 *
Yan, R.H.等.Structural basis for the recognition of SARS-CoV-2 by full-length human ACE2.Science.2020,第367卷(第6485期),参见全文，尤其图4，图5,第1448页左栏第二段. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115380046A (zh) 2022-11-22
WO2021218879A1 (zh) 2021-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111592594B (zh) 一种抗新型冠状病毒的单克隆抗体及其应用
CN115380046B (zh) SARS-CoV-2中和抗体及其制备和应用
CN109563157B (zh) 特异性地结合至寨卡病毒表位的新型抗体和其用途
KR101931591B1 (ko) 항－ｉｌ－２３ 항체
CN113512114B (zh) 针对SARS-CoV-2突变株的抗体及其用途
KR20190059958A (ko) 항-lag-3 항체 및 조성물
CN107406500B (zh) 抗甲状腺素运载蛋白抗体
CN107428822B (zh) 抗甲状腺素运载蛋白抗体
JP7332627B2 (ja) 最適化された抗ｔｌ１ａ抗体
KR101453462B1 (ko) Her2에 특이적으로 결합하는 항체
CN115636880A (zh) 抗il-2抗体及其组合物和用途
CN106795223B (zh) 针对Fcγ受体IIB及Fcε受体的抗体
KR20200042499A (ko) 지카 바이러스 에피토프에 특이적으로 결합하는 다중특이적 항체 및 이의 용도
KR20160131073A (ko) Lg4-5에 대해 특이적인 항-라미닌4 항체
KR20150081289A (ko) 항체 또는 항체 조성물의 제조 방법
KR20160131082A (ko) Lg1-3에 특이적인 항-라미닌4 항체
CN114685660A (zh) 抗cldn18.2抗体及其制备方法和应用
CN113906052B (zh) 一种抗ceacam5的单克隆抗体及其制备方法和用途
CN115151570A (zh) 抗人cd19抗体
US20030194405A1 (en) Antibody inhibiting stem cell factor activity and use for treatment of asthma
CN107406511B (zh) Pcsk9抗体、其抗原结合片段及其医药用途
KR20160072268A (ko) 항-efna4 항체-약물 접합체
CN113135994A (zh) 一种激活型抗ox40抗体、生产方法及应用
AU2021209282B2 (en) Anti-Sars-Cov-2 Neutralizing Antibodies
TW202235437A (zh) 含抗tslp抗體的藥物組合物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant