CN116655786B - 广谱性抗SARS和SARS-CoV-2的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了广谱性抗SARS和SARS‑CoV‑2的抗体，所述抗体具有独特的3个互补决定区，分别为序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1，序列如SEQ ID NO:2所示的CDR2，序列如SEQ ID NO:3所示的CDR3。本发明还提供了所述抗体在检测SARS和SARS‑CoV‑2蛋白或其片段中的应用，以及制备检测SARS和SARS‑CoV‑2病毒感染相关疾病的产品中的应用。本发明还提供了制备所述抗体的多核苷酸或包含其的载体，改造的宿主细胞及生产抗体的宿主细胞的制备方法，还提供了所述抗体的衍生物，产品或组合物。

Description

广谱性抗SARS和SARS-CoV-2的抗体
技术领域
本发明属于细胞免疫学、分子生物学领域，涉及广谱性抗SARS和SARS-CoV-2的抗体。
背景技术
重症急性呼吸综合征（SARS）为一种由SARS冠状病毒（SARS-CoV）引起的急性呼吸道传染病，其命名为重症急性呼吸综合征。SARS为呼吸道传染性疾病，主要传播方式为近距离飞沫传播或接触患者呼吸道分泌物。SARS病毒呈球形，直径在100nm左右，是有包膜的单股正链RNA病毒，是所知道的最大的RNA病毒。与其他的冠状病毒一样，SARS病毒包膜上也有排列较宽、形如日冕的刺突蛋白（spikeprotein）。冠状病毒的S蛋白是该病毒的主要抗原成分和病毒与受体结合的部位，同时与病毒引起的细胞融合（cellfusion）有关。M蛋白是一种膜糖蛋白，参与病毒的出芽（budding）和包膜的形成（envelopeformation）。
SARS-CoV-2属于β冠状病毒属，冠状病毒科的Sarbecovirus亚属，并已被鉴定为SARS-CoV-2。SARS-CoV-2是多形性的或通常为球形的，直径范围为80-160nm。该病毒粒子包含一个约30kb的正链单链核糖核酸（RNA）基因组，具有5'-帽结构和一个3'-poly(A)尾巴。随着抗体工程技术的不断发展，抗体药物广泛应用于各种疾病的治疗中。由于纳米抗体结构简单，易于针对抗原（尤其是多聚体蛋白）的相同表位或不同表位设计二价或多价纳米抗体，形成强效的阻断剂。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供广谱性抗SARS和SARS-CoV-2的抗体。
在一个方面，本发明提供了一种广谱性抗SARS和SARS-CoV-2的抗体，所述抗体S009-F3包含：SEQ ID NO：1所示的重链可变区CDR1、SEQ ID NO：2所示的重链可变区CDR2、SEQ ID NO：3所示的重链可变区CDR3。
进一步，所述抗体S009-F3还包含具有与SEQ ID NO：4、5、6、7所示氨基酸序列至少90%序列一致性的重链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体也叫做单域抗体（sdAb），指仅含有重链可变区的抗体，所述抗体包括其抗原结合片段指任意具有能够结合目标抗原的抗体片段。
进一步，所述抗体S009-F3重链可变区具有与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少90%序列一致性。
术语“同一性”或“一致性”应解释为在比对序列并且必要时引入空位以实现整个序列的最大同一性百分比，并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分之后，候选序列中与所比较的相应序列的碱基或残基相同的核苷酸碱基或氨基酸残基的百分比。与另一个序列具有一定百分比 (例如80%、85%、90%或95%)的“序列同一性”的多核苷酸或多核苷酸区(多肽或多肽区)是指在比较这两个序列时，一定百分比的碱基(或氨基酸)在比对时是相同的。如本发明所用，术语“序列同一性”是指两条序列(氨基酸)对齐后在相同位置具有相同残基的程度。例如，“氨基酸序列与SEQ ID NO：Y是X%相同的”是指该氨基酸序列与SEQ ID NO：Y的同一性百分比，并被阐述为该氨基酸序列中X%的残基与SEQ ID NO：Y中公开的序列残基相同。
进一步，所述抗体包括纳米抗体。
进一步，所述纳米抗体还包括其功能性片段。
如本文中所使用的，术语“纳米抗体”具有本领域技术人员通常理解的含义，其是指由单个单体可变抗体结构域(例如单个重链可变区)所组成的抗体片段，通常来源于重链抗体(例如骆驼科动物抗体或鲨鱼抗体)的可变区。典型地，纳米抗体由4个构架区和3个互补性决定区组成，具有FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的结构。纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。纳米抗体也称为单域抗体，两者可互换使用。
术语纳米抗体的“功能性片段”是指包含纳米抗体的片段的多肽，其保持特异性结合纳米抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与纳米抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。可通过重组DNA技术或通过本发明纳米抗体的酶促或化学断裂产生本发明抗体的抗原结合片段。在一些实施方案中，所述纳米抗体的“功能性片段”与全长纳米抗体相比可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4，或缺少那些骨架区中的一个或两个，只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。
无论是否与其它序列连接，“片段”或“功能性片段”可包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其它选定修饰，条件是与未修饰的肽或蛋白质相比，片段的活性不会显著改变或受损。这些修饰可提供一些额外的性质，如除去或添加能够二硫化物结合的氨基酸，以增加其生物寿命，改变其分泌特性等。
在本文中，除非上下文明确指出，否则当提及术语“纳米抗体”时，其不仅包括完整纳米抗体，而且包括纳米抗体的抗原结合片段。
术语“CDR”和“互补决定区”可互换使用，并且是指抗体的参与结合至抗原的可变链的一部分。因此，CDR是“抗原结合位点”的一部分或者是“抗原结合位点”。在一些实施方案中，纳米抗体包含共同形成抗原结合位点的三个CDR。
在本发明公开的抗体的一些实施方案中，所述抗体S009-F3的重链可变区包含与SEQ ID NO：8具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%、或100%序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗体S009-F3的重链可变区包含如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
本发明的另一方面还提供了一种分离的多核苷酸或包含其的载体，所述多核苷酸编码前面任一项所述的抗体。
术语编码的“核酸”可以是包括编码的核酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的核酸。本发明的核酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括但不限于cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码本发明所述纳米抗体或其抗原结合片段的核酸包括但不限于只编码成熟纳米抗体或其抗原结合片段结构的编码序列；编码成熟纳米抗体或其抗原结合片段的编码序列和各种附加编码序列；编码成熟纳米抗体或其抗原结合片段结构的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列等。
本发明的具体实施方案中，所述抗体的核酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、纳米抗体及其抗原结合片段、多价纳米抗体等)包括以分离的形式存在的生物分子。
进一步，所述载体包括：病毒载体，如腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺相关病毒载体；非病毒载体，如质粒、转座子载体。在一些优选的实施方案中，所述载体是表达载体。
进一步，所述载体包括质粒载体。
进一步，所述载体包括pComb3XTT质粒载体。
病毒载体的其他实施例包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。此类重组病毒可通过本领域技术人员熟知的技术生产，例如通过包装细胞的转染或通过辅助质粒或病毒的瞬时转染。病毒包装细胞的典型实施例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。
在多个实施方案中，所述载体为表达载体。在某些实施方案中，所述表达载体还包含有编码免疫球蛋白的Fc段的核苷酸序列。
在另一具体的实施方案中，所述免疫球蛋白是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
本发明的另一方面还提供了一种已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，所述已改造的宿主细胞包括前面任一项所述的抗体，或前面所述的多核苷酸或包含其的载体。
进一步，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
进一步，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、鸟类细胞、真菌细胞。
进一步，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体。
在本发明的具体实施方案中，所述宿主细胞包括但不限于哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、真菌细胞、原核细胞等。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
本发明的另一方面还提供了一种广谱抗SARS和SARS-CoV-2的抗体衍生物，所述抗体衍生物包含前面任一项所述的抗体直接或间接的偶联到可检测标记物或药物形成的复合物。
进一步，所述抗体衍生物包括前面所述的特异性抗体或其抗原结合片段直接或间接的偶联至可检测标记物形成的复合物。
进一步，所述可检测标记物包括荧光色素、亲和素、顺磁原子、放射性同位素、酶标记物。
进一步，所述荧光色素包括荧光素、罗丹明、Texas红、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、多甲藻黄素-叶绿素蛋白。
进一步，所述亲和素包括生物素、卵白亲和素、链亲和素、卵黄亲和素、类亲和素。
进一步，所述放射性同位素包括放射性碘、放射性铯、放射性铱、放射性钴。
进一步，所述酶标记物包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、溶菌酶、苹果酸脱氢酶。
在一些具体的实施方案中，所述抗体衍生物包括与抗体缀合的试剂。在一些实施方案中，所述试剂是治疗剂。在一些实施方案中，所述试剂是是可检测部分。在一些实施方案中，所述可检测部分是诊断剂。在一些实施方案中，所述试剂经由接头与所述抗体缀合。在一些实施方案中，所述接头是可切割接头。在一些实施方案中，所述接头是不可切割接头。
在一些实施方案中，所述S009-F3抗体天然含有一个或多个二硫键。在一些实施方案中，所述S009-F3抗体可以进行工程改造以包括一个或多个二硫键。
术语“可检测标记物”在本文中意指产生可检测信号的化合物。当它连接到示踪剂时，它可以监视体内示踪剂变成什么。可检测标记物可以是MRI造影剂、闪烁扫描造影剂、X射线成像造影剂、超声造影剂、光学成像造影剂。可检测标记物的实施例包括放射性元素，荧光团如荧光素、Alexa或花青；化学发光化合物，如鲁米诺；生物发光化合物，如荧光素酶或碱性磷酸酶；和造影剂，如纳米颗粒或钆。合适的可检测标记物的选择取决于所用的检测系统，在本领域技术人员的能力范围内。例如，当检测系统是MRI时，可检测标记物优选是氧化铁纳米颗粒或钆；当检测系统是荧光成像时，可检测标记物优选为荧光素，Alexa或花青；当检测系统为化学发光成像时，可检测标记优选为鲁米诺；当检测系统是生物发光成像时，可检测标记物优选为荧光素酶或碱性磷酸酶；当检测系统是核成像时，可检测标记物优选是放射性元素，例如用于PET成像的镓(68Ga)，或用于SPECT成像的锝99m(99mTc)。
本发明的另一方面还提供了一种检测SARS和SARS-CoV-2的产品或组合物，所述产品或组合物包含前面任一项所述的抗体、前面所述的多核苷酸或包含其的载体、前面所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体、或前面所述的抗体衍生物。
“组合物”是指具有有益生物效应的任何剂。有益生物效应包括治疗效应(例如，治疗病症或其它非期望的生理疾患)和预防效应(例如，预防病症或其它非期望的生理疾患)两者。所述术语还涵盖本文具体提及的有益剂的药学上可接受的、药理学活性的衍生物，包括但不限于细菌、载体、多核苷酸、细胞、盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“组合物”时，或者当具体鉴定特定组合物时，则应理解所述术语包括组合物本身以及药学上可接受的药理学活性的载体、多核苷酸、盐、酯、酰胺、前药、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
进一步，所述产品包括试剂盒、试纸、核酸膜条、芯片、系统、或装置。
进一步，所述组合物包括药学上可接受的载体。
进一步，所述的药学上可接受的载体包括药学上可接受的材料、组合物或载体。
进一步，所述药学上可接受的载体包括液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。
进一步，所述药学上可接受的材料、组合物或载体能够参与将药剂从一个器官或身体的某一部位运载或运送到另一个器官或身体的另一部分。
在本发明的上下文中，“患者”表示人或非人哺乳动物，例如啮齿动物(大鼠、小鼠、兔)、灵长类动物(黑猩猩)、猫科动物(猫)或犬(狗)。优选地，个体是人类。
可以使用本领域技术人员已知的任何施用方法将根据本发明的纳米抗体施用于患者。特别地，纳米抗体可以例如口服、通过吸入或肠胃外施用(特别是通过静脉内注射)。当选择肠胃外途径时，纳米抗体可以是可注射溶液和悬浮液的形式，包装在小瓶或瓶中。肠胃外施用形式通常通过将根据本发明的纳米抗体与缓冲剂、稳定剂、防腐剂、增溶剂、等渗剂和悬浮剂混合而获得。根据已知技术，这些混合物可以静脉内注射的形式进行灭菌和包装。本领域技术人员可以例如使用基于磷酸盐的缓冲液作为缓冲剂。悬浮剂的实施例包括甲基纤维素、阿拉伯树胶和羧甲基纤维素钠。稳定剂的实施例包括亚硫酸钠和偏亚硫酸钠，防腐剂的实施例包括对羟基苯甲酸钠、山梨酸、甲酚和氯甲酚。
在本发明的某些具体的实施方案中，所述载体必须是“可接受的”，即指其与配方的其他成分相容且不损害患者。在药学上可接受的载体的部分示例如下：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物和类似物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯；西黄蓍胶粉；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，如可可油和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇类，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；褐藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲液；以及药物制剂中使用的其他无毒且相容的物质。润湿剂、乳化剂和润滑剂，如十二烷基磺酸钠、硬脂酸镁、和聚氧乙烯-聚环氧丙烷共聚物以及着色剂、脱模剂、涂层剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。
术语“药学上”或“药学上可接受的”是指分子实体和组合物，当它们施用于哺乳动物，特别是人时，不产生副反应、过敏反应或否则麻烦的反应。
在本发明的上下文中，表述“药学上可接受的载体”包括任何溶剂、分散介质、包衣、抗细菌或抗真菌剂、等渗剂或吸收延迟剂等。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域技术人员公知的。除了常规介质或试剂与活性成分不相容的情况之外，可以设想其在药物组合物中的用途。另外的活性成分也可以掺入组合物中。
本发明前面任一项所述的抗体、前面所述的多核苷酸或包含其的载体，或前面所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体、前面所述的抗体衍生物在检测SARS和SARS-CoV-2蛋白或其片段中的应用。
本发明前面任一项所述的抗体、前面所述的多核苷酸或包含其的载体，或前面所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备检测SARS和SARS-CoV-2病毒感染相关疾病的产品中的应用。
进一步，所述产品包括试剂盒、试纸、核酸膜条、芯片、系统、或装置。
本发明前面任一项所述的抗体、前面所述的多核苷酸或包含其的载体，或前面所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备预防或治疗SARS和SARS-CoV-2病毒感染相关疾病的药物中的应用。
进一步，所述药物包括药学上可接受的载体。
进一步，所述的药学上可接受的载体包括药学上可接受的材料、组合物或载体。
进一步，所述药学上可接受的载体包括液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料。
进一步，所述药学上可接受的材料、组合物或载体能够参与将药剂从一个器官或身体的某一部位运载或运送到另一个器官或身体的另一部分。
本发明前面任一项所述的抗体、前面所述的多核苷酸或包含其的载体，或前面所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备调节SARS和SARS-CoV-2蛋白活性或水平的药物中的应用。
进一步，所述药物包括调节有效量的前面所述的抗体。
“有效量”涵盖但不限于可改善、逆转、减轻、预防或诊断医学疾患或病症(例如，癌症)的症状或病征的量。除非另外明确地或通过上下文来规定，否则“有效量”不限于足以改善疾患的最小量。疾病或病症的严重性以及治疗预防、治疗或减轻疾病或病症的能力可通过生物标志物或通过临床参数来测量，而不暗示任何限制。
在某些具体的实施方案中，所述药物包括药物及药物组合物，其包括药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂包括一下中的一种或多种：药学上可接受的溶剂、分散剂、附加剂、塑形剂等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质中。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括但并不限于：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。
在一些具体的实施方案中，药物组合物可以以任何合适的剂型施用至受试者/患者，施用方式没有特别限制。本发明中，所述药物组合物的剂型的实例包括但不限于如混悬剂、溶液剂、乳膏剂、栓剂、凝胶剂、气雾剂、喷雾剂和粉雾剂。
本发明提供了一种生产前面任一项所述的抗体的方法，所述方法包括如下步骤：将前面所述的多核苷酸或包含其的载体转化到宿主细胞；在适合条件下培养转化所得宿主细胞；在宿主细胞培养液中分离纯化得到前面所述的抗体。
进一步，所述抗体包括具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
本发明提供了一种制备前面所述的已改造的宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将前面任一项所述的抗体，或前面所述的多核苷酸或包含其的载体导入到宿主细胞中；
本发明提供了一种体外抑制SARS和SARS-CoV-2蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：将前面任一项所述的抗体，或前面所述的多核苷酸或包含其的载体导入到生物体细胞中，通过表达前面任一项所述的抗体抑制SARS和SARS-CoV-2蛋白的活性；
本发明提供了一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中SARS和SARS-CoV-2蛋白或编码其的核酸分子的方法，所述方法包括如下步骤：将待测样品与前面任一项所述的抗体，或将待测样品与前面所述的抗体衍生物接触；检测SARS和SARS-CoV-2蛋白或编码其的核酸分子与前面任一项所述的抗体，或前面所述的抗体衍生物的复合物的形成。
除非另有说明或定义，否则所使用的所有术语都具有技术人员所熟知的本领域通常的含义。例如参考标准手册，例如Leuenberger,H.G.W,Nagel,B.和Klbl,H.编辑，“Amultilingualglossaryofbiotechnologicalterms：(IUPACRecommendations)”，HelveticaChimicaActa(1995)，瑞士巴塞尔CH-4010；Sambrook等人，“Molecular Cloning：ALaboratoryManual”(第2版)，卷1-3，冷泉港实验室出版社(1989)；F.Ausubel等人编辑，“Currentprotocolsinmolecularbiology”，GreenPublishingandWileyInterScience，纽约(1987年)；Roitt等人，“Immunology”(第6版)，Mosby/Elsevier，爱丁堡(2001年)；和Janeway等人，“Immunobiology”(第6版)，GarlandSciencePublishing/ChurchillLivingstone，纽约(2005年)，以及上面引用的通常背景技术。
如本发明所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包含复数对象，除非上下文另有明确说明。除非另有说明或定义，否则术语“包含”及其变体诸如“包括”和“含有”应理解为意味着包括所述元素或步骤或者元素或步骤的组，但不排除任何其他元素或步骤或着元素或步骤的组。
术语“表位”是指抗原上抗体结合的位点。表位可以由连续氨基酸或通过一种或多种蛋白质的三级折叠而并置的非连续氨基酸形成。由连续氨基酸形成的表位(也称为线性表位)通常在暴露于变性溶剂后保留，而通过三级折叠形成的表位(也称为构象表位)通常在变性溶剂的处理中丢失。表位通常包含处于独特空间构象的至少3个，更通常地至少5个或8-10个氨基酸。表位限定了抗体的最小结合位点，因此是抗体或其抗原结合片段的特异性靶标。
附图说明
图1是多序列比对分析纳米抗体序列分布特点图；
图2是Kabat 和 IMGT 分析纳米抗体可变区框架区的氨基酸分布特点图；
图3是SARS、SARS-CoV-2及其变异株S蛋白结构域空间结构飘带模式图，其中，A为SARS核心蛋白S空间构象图，B为SARS-CoV-2核心蛋白S空间构象图，C为Alpha核心蛋白S空间构象图，D为Beta核心蛋白S空间构象图，E为Gamma核心蛋白S空间构象图，F为Delta核心蛋白S空间构象图；
图4是纳米抗体合成库的构建图；
图5是纳米抗体合成库S009突变氨基酸出现频率分析图；
图6是S009库噬菌体淘洗的投入产出比图；
图7是384个克隆噬菌体上清的结合活性图，其中，深灰色为假阳性克隆，浅灰色为结合活性较强克隆；
图8是48个候选合成纳米抗体的DNA凝胶电泳图；
图9是48个候选纳米抗体分子的交叉结合活性图，其中暗色代表OD450nm>1；
图10是11个候选纳米抗体的CDR3序列氨基酸分布图；
图11是11个候选纳米抗体的交叉结合活性图；
图12是11个候选纳米抗体的假病毒中和活性图；
图13是候选纳米抗体S009-F3的空间理论结构图；
图14是ELISA验证候选纳米抗体的特异性图；
图15是ELISA测定候选纳米抗体S009-F3的结合活性图，其中，A为候选纳米抗体S009-F3与SARS、SARS-CoV-2及前4种变异株的结合活性图，B为候选纳米抗体S009-F3与Omicron及亚谱系变异株的结合活性图，C为对照S309与SARS、SARS-CoV-2及前4种变异株的结合活性图，D为对照S309与Omicron及亚谱系变异株的结合活性图；
图16是竞争ELISA测定候选分子竞争阻断与ACE2的结合活性图，其中，A为候选纳米抗体S009-F3对Omicron及其亚谱系变异株S蛋白与ACE2结合的影响图，B为候选纳米抗体S009-F3对SARS、SARS-CoV-2及前4种VOC变异株S蛋白与ACE2 结合的影响图；
图17是候选纳米抗体的HIV假病毒中和活性图，其中，A为S009-F3的HIV假病毒中和活性图，B为S309的假病毒中和活性图；
图18是候选纳米抗体对可复制型SARS-CoV-2假病毒感染的抑制活性图；
图19是候选纳米抗体对可复制型Delta假病毒感染的抑制活性图；
图20是候选纳米抗体的体内Delta假病毒感染模型预防保护效果图，其中，A为可复制型VSV-nLuc-Delta假病毒感染叙利亚金黄地鼠的生物发光拍照图，B为血清纳米荧光素酶活性测定结果图，LXY8为同型对照抗体，给药浓度为10 mg/kg，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，n=5，mean±SEC；
图21是候选纳米抗体对真病毒进入细胞的抑制活性图。
具体实施方式
参照以下实施例可以更好地理解本发明。但是，应理解，以下实施例仅用于举例说明目的，而不应被理解为以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1抗SARS和SARS-CoV-2纳米抗体S009-F3的筛选
一、实验方法
1、纳米抗体合成库的设计
1）人源框架区的设计
收集纳米抗体序列及结构数据，利用序列聚类以及结构匹配分析纳米抗体特征性结构和氨基酸分布。具体的，查询Pubmed、PDB、SwissProt和IMGT等数据库，收集并整理纳米抗体库序列及结构信息，利用多序列比对、结构叠合等方法，针对收集的纳米抗体进行序列及结构信息比对分析，同时与人源抗体HV3进行比较分析，综合考量确认具有良好成药性的人源纳米抗体支架FR1、FR2、FR3、FR4序列及结构特性，建立一套结构稳定、适合表达的纳米抗体柔性通用框架组合库。
2）SARS、SARS-CoV-2S蛋白空间结构模拟及氨基酸特性分析
利用PDB数据库收集SARS、SARS-CoV-2的RBD序列及结构信息；结合不同状态下的抗原-抗体复合物结构综合判别RBD结构域特性，并从理论上确认结构域理化性质和优势表位信息。具体的，借助SARS核心蛋白S的晶体结构模型，选择合适的分子力场对S蛋白结构进行动力学模拟，动态分析S蛋白结构特征以及发挥生物学活性的三聚体结构模式。利用距离几何学、计算机图形学技术动态分析RBD结构域的理论特点。收集核心蛋白S晶体结构信息和序列信息（SARS、SARS-CoV-2、Alpha、Beta、Gamma和Delta），通过动力学模拟探讨SARS、SARS-CoV-2核心蛋白S空间结构特色以及RBD结构域的特征。针对获得的SARS、SARS-CoV-2确定的S蛋白及RBD结构域的构象特性，利用序列比对和结构叠合，动态分析二者RBD结构域的相似性及表观理化特性，比对和分析晶体结构信息，选择合适的分子力场对S蛋白空间结构和三聚体结构进行动态模拟，建立起可用于设计和虚拟筛选的计算模型，即对多种冠状病毒RBD参与ACE2识别关键的核心保守区域进行精细的结构计算和优化，借助结构特征、表观性质及理化特性获得具有广泛代表性的RBD结构模式。
3）纳米抗体合成库的CDR移植和设计
基于已确认的RBD动态结构特点以及表观理化特性，借助计算机辅助药物设计、高通量虚拟筛选技术从头设计与RBD“结构互补、性质匹配”的多肽序列，并利用前期建立的基于结构的亲和力成熟的方法，同时参考ACE2参与作用的关键氨基酸分布信息，将其与已确认的支架组装后设计纳米合成库；进一步利用计算机辅助开展纳米抗体库的结构模拟并与通用RBD结构模式进行合理刚性对接，获得靶向性较强的纳米库。利用冠状病毒核心蛋白S结构域RBD数学模型，基于“结构匹配和静电互补”设计原则设计相应的多肽序列，并形成对应的数学模型；借助结构合理搭配的原则构建虚拟纳米抗体结构库。通过分子对接、高通量虚拟筛选模式从理论上针对建立的RBD数学模型及纳米抗体数学模型进行结构、能量的判别分析。具体的，利用已建立基于结构的抗体优化平台，对接触面关键位点进行定点突变，并计算相互作用自由能、主链碳原子均方根位移、可及性表面积、表观静电分布等多种理化参数，综合考虑纳米抗体的成药性、结构特点、作用模式等进一步设计和优化纳米抗体文库。
2、靶向SARS-CoV-2噬菌体展示纳米抗体库的构建
1）纳米抗体合成库的分子构建
基于计算机辅助药物设计获得的纳米抗体虚拟文库，考虑密码子偏好性、RNA二级结构特征优化核苷酸序列，5’端添加信号肽序列，3’端添加终止密码，两端分别设计酶切位点和保护碱基，委托金斯瑞生物科技股份有限公司开展纳米抗体库的基因合成工作，要求突变位点氨基酸出现频率均等且将氨基酸序列翻译为大肠杆菌最优密码子基因序列，并命名为S009库基因。获得S009库基因后，借助酶切位点“SfiI”将其克隆至pComb3XTT噬菌体展示载体中。
2）噬菌体展示合成纳米抗体库的构建
将-80℃保存的TG1电击感受态细胞置于冰上5min，将5μL的连接产物加至感受态中，转移至电转杯，立即插回冰中。设置电转仪的参数为：C=25μF，PC=200Ω，V=1.8kV，将电击杯迅速放入电转槽中，电击完成后立即放回冰中，2min后从冰中取出电击杯，将电转产物转移到50mL离心管，并补加10mL无抗性S.O.C.培养基，37℃，200r/min，恢复培养60min。然后，分别取10mL中的0.1μL、1μL和10μL进行滴定涂板，4000r/min，离心15min，弃去上清，弹匀后将沉淀涂于2-YT固体培养基（2%葡萄糖+100μg/mLAmp），37℃，过夜培养扩增，依据滴定涂板菌落计数情况，判定电转效率。
3、噬菌体展示合成纳米抗体库的扩增和制备
1）将200μL本实验室保存的天然噬菌体库菌液接种于50mL的2-YT抗性培养基（100μg/mLAmp+2%葡萄糖），此时培养液的OD600nm读数约为0.1。2）37℃，220r/min培养3h，当培养液的OD600nm读数为0.8左右时，将1mL的M13KO7加至培养瓶中，37℃，静置孵育0.5h。3）将培养液转移至50mL离心管中，20℃，4000r/min离心15min，弃去上清，收集菌体。4）将菌体重悬至800mL的2-YT抗性培养基（含100μg/mLAmp和70μg/mLKana）培养基中，28℃，220r/min过夜培养。
4、噬菌体展示合成纳米抗体库的浓缩分离
1）将过夜培养的菌液转移至离心管中，4℃，6000r/min离心15min，以去除菌体。（2）向上清中加入200mL的PEG/NaCl溶液，冰浴，1h，然后，4℃，6000r/min离心15min。（3）轻轻弃去上清，将沉淀重悬于20mL的PBS中，再次向上清中加入4mL的PEG/NaCl溶液，冰浴，20min。（4）将上述混合物转移至离心管中，4℃，6000r/min离心15min。（5）将沉淀重悬于20%甘油中并分装，储存于-80℃冰箱，即为可用于下一步SARS-CoV-2N蛋白抗体筛选的天然噬菌体抗体库。
5、噬菌体展示纳米抗合成体库的质量评价
1）测序及结果分析
随机挑取300个克隆并测序，然后，利用ExPASy-Translatetool（https://web.expasy.org/translate/）翻译比对抗冠状病毒纳米抗体合成库的测序结果，除去测序失败、套峰、移码、碱基的缺失和插入以及由于PCR过程中引入的非目的碱基突变等错误序列，统计分析正确的测序结果。
（2）突变位点氨基酸频率分布分析
借助The European Bioinformatics Institute网站（https://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/ncbiblast/nucleotide.html）多序列分析模块分析比较所得序列的多样性。利用http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi网站分析突变位点关键氨基酸出现的理论频率和实际频率。
6、广谱抗冠状病毒纳米抗体的噬菌体筛选
1）包被：将500µL的20µgSARS-CoV-2RBD蛋白PBS溶液包被于Immuno管，4℃，过夜。2）分别用1mL4%的脱脂牛奶同时封闭Immuno管和合成纳米抗体噬菌体库，室温1h。3）孵育：向封闭后的Immuno管中投入S009噬菌体库，室温孵育1h，弃去Immuno管中的S009噬菌体库。4）淘洗：使用0.1%的PBST（吐温-20，v/v%）洗15次，PBS洗10次。5）洗脱：1mLGly-HCl（0.1M，pH2.2），室温，10min，并加入66.6μLTris-HCl（1M，pH9.2）中和洗脱的噬菌体。6）吸取10µL洗脱溶液测定噬菌体滴度，取500μL的洗脱噬菌体感染处于对数生长期的TG1感受态细胞并进行扩增和噬菌体沉淀，以备后续筛选。共进行3轮淘洗和富集特异性结合的阳性噬菌体，3轮淘洗的实验条件如表1所示。然后，挑取384个第3轮产出的阳性噬菌体克隆，扩增培养4h，吸取50μL菌液以备测序，然后，制备阳性克隆噬菌体上清液，以进行下一步的噬菌体ELISA的测定。
表1淘洗实验条件
7、噬菌体ELISA
1）包被：1μg/mLSARS-CoV-2及其变异株S蛋白（Alpha、Beta、Gamma、Delta和SARS），100μL/孔，4℃，过夜，PBST洗3次。2）封闭：4%脱脂牛奶，200μL/孔，37℃，1h，PBST洗3次。3）加样品：吸取克隆的噬菌体上清，100μL/孔，37℃，1h，PBST洗3次。4）加检测抗体：anti-M13-HRP，100μL/孔，室温，45min，PBST洗3次。5）显色：TMB，100μL/孔，90s。6）终止：2NH2SO4，100μL/孔。7）数据获取：MolecularDevicesSpectraMax190酶标仪读取OD450nm数值，保存数据。8）挑取交叉结合活性较好的阳性克隆，委托公司进行测序并返还质粒。
8、候选合成纳米抗体的鉴定
1）结合ELISA
①包被：1μg/mLSARS-CoV-2RBD蛋白，100μL/孔，4℃，过夜，PBST洗3次。②封闭：4%脱脂牛奶，200μL/孔，37℃，1h，PBST洗3次。③加样品：合成纳米抗体表达上清，100μL/孔，37℃，1h，PBST洗3次。④加检测抗体：GAH-HRP，100μL/孔，37℃，30min，PBST洗3次。⑤显色：TMB，100μL/孔，90s。⑥终止：2NH2SO4，100μL/孔。⑦数据获取：MolecularDevicesSpectraMax190酶标仪读取OD450nm数值，保存数据。
2）竞争ELISA
①包被：SARS-CoV-2RBD蛋白，1μg/mL，100μL/孔，4℃，过夜，PBST洗3次。②封闭：4%脱脂牛奶，200μL/孔，37℃，1h，PBST洗3次。③加样品：50μL/孔ACE2-biotin（2μg/mL）溶液与候选的合成纳米抗体表达上清按1:1混合，37℃，1h，PBST洗3次。④加检测抗体：Streptavidin-HRP，100μL/孔，37℃，30min，PBST洗3次。⑤显色：TMB，100μL/孔，90s。⑥终止：2NH2SO4，100μL/孔。⑦数据读取：MolecularDevicesSpectraMax190酶标仪读取OD450nm数值，并保存数据。⑧数据处理：借助GraphPadPrism9分析结合情况。
3）假病毒中和活性的测定
①细胞复苏：将冻存的ACE2-OE293T细胞取出，迅速放至37℃恒温水浴锅中解冻，将其加至10mLDMEM培养基中，1000r/min，离心5min，弃上清，轻轻弹匀沉淀细胞，利用10mL培养基将其重悬，加至10cm细胞培养皿中，于37℃，5%CO2恒温细胞培养箱中培养。②将7种假病毒（SARS-CoV-2，Alpha，Beta，Gamma，Delta，Omicron和SARS）置于冰上融化，按1:1的比例与候选合成纳米抗体孵育，37℃，1h，设置3个复孔。③将用胰酶消化后的ACE2-OE细胞的密度调整为2×105个/mL，50μL/孔加至步骤②中的假病毒与瞬时表达上清的混合液中。④将样品板放置于细胞孵育箱中，37℃，培养48h。⑤弃去细胞上清，然后，利用Bright-Lumi™II萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒测定细胞的RLU值。
二、实验结果
1、纳米抗体合成库框架区的分析及设计
通过生物信息学、结构生物学方法收集纳米抗体序列1185套，其中羊驼（Alpaca）195套，阿拉伯驼（ArabianCamel）257套，美洲驼（Llama）668套，双峰驼（BactrianCamel）65套，多序列比对分析如图1所示。
利用Kabat、IMGT对纳米抗体序列的FR和CDR进行分类，聚类分析如图2所示。进一步通过与人源VH3通用序列进行分析，选择分析纳米抗体可变区FR常用氨基酸分布，去除羊驼中多出的氨基酸残基，最终确定人源纳米抗体可变区中框架区FR的氨基酸组成模式为：
FR1：QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSC
FR2：WY(F)RQAPGKEREW(G/F)VA(S)A(C/S/V)IS(Y/N/R)
FR3：ADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYY
FR4：WGQGTQVTVSS
2、SARS、SARS-CoV-2及其变异株S蛋白理论构象分析
通过计算机辅助分子模拟技术、CVFF力场下的力学优化、动力学模拟技术获得了SARS、SARS-Cov-2及其变异株核心蛋白S理论空间构象（图3）。
3、计算机辅助纳米抗体合成库的设计
依据SARS、SARS-Cov-2及其突变株核心蛋白S空间结构中RBD结构域特点，RBD与ACE2作用模式合理设计纳米抗体CDR区特定氨基酸，并考察选择的FR区结构特点。在选择过程中，考虑到纳米抗体CDR3结构特点以及内部二硫键的可能性，综合分析，并经理论设计确定人源纳米抗体库氨基酸序列如下：
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGF(R/S/N)TF(V/S)S(D/Y/N)S(R/D/N/H)I(Y/S/N)Y(N/S)AMGWY(F)RQAPGKEREW(G/F)VA(S)A(C/S/V)IS(Y/N/R)S(W/T/R/N)DGS(N/R/G)G(D/S/Y)S(R/G/N)G(D/T/Y)S(N/Y/R/I/H)TY(N/S)YADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAD(R/G/S)P(R/S/D/A)G(Y/W/S/R)T(S/V/P/W/Y)Y(S/R/V)V(Y/R/S)Y(W/T/H)VKP(S/V/N)DS(Y/E/R)GS(E/Q/Y)S(Y/R/F)G(D/N/R)Y(H/D/Q)R(G/S)Y(A/R/L)Y(S/E/N)Y(G/W/F)P(S/Y/C)L(S/Y/R)W(C/S/R)P(S/Y/D)E(S/V)R(G/D)DYDYWGQGTQVTVSS，经排列组合计算理论库容量为8.86×1023。
4、合成纳米抗体库的构建及质量评价
为了获得纳米抗体合成库的S009分子文库，考虑反向翻译、密码子优化、并考虑密码子简并和二级结构特点等进行设计。首先，在上述纳米抗体合成库S009序列的N端添加信号肽序列，C端填加His标签并用(GGGS)4连接，然后，在其两端设计酶切位点（SfiI）和保护碱基，N端如SEQ ID NO: 9所示，具体序列为5’-CCGTGGCCCAGGCGGCC-3’，C端如SEQ ID NO:10所示，具体序列为5’-TGCTGGCCGGCCTGGCC-3’，并委托公司将其优化为大肠杆菌最适密码子后进行基因文库的合成，获得纳米抗体合成库的DNA片段，DNA凝胶电泳结果（图4）可以看出，实际所得DNA片段大小与理论大小一致。进一步，我们将上述目的片段克隆至pComb3XTT载体，获得pComb3XTT-S009重组质粒，即为可用于S009库噬菌体展示质粒。将S009库电转至TG1感受态细胞，涂板后过夜培养并挑取384个克隆测序。由测序结果可知：384个测序结果中，测序成功335个，其中212条正确的序列，正确率为63.28%，实际库容量约为1.15×1011，进一步证明S009库噬菌体展示质粒构建成功。
5、S009库的聚类分析和突变位点氨基酸出现频率分析
为分析S009库突变氨基酸出现频率和序列多样性是否与理论设计一致，我们进行了多序列比对及可视化分析，结果（图5）表明：共获得237条正确序列，正确序列的所有氨基酸突变位点均发生在S009库的理论氨基酸突变位点，且与理论设计的氨基酸一致，实际出现频率也与理论设计基本一致，可以证明S009分子库构建成功。
6、纳米抗体合成库的噬菌体筛选
借助噬菌体展示技术，将S009-pComb3XTT重组质粒电击转化至TG1感受态细胞，经制备、扩增及分离浓缩后获得纳米抗体合成库噬菌体展示库，共3轮噬菌体淘洗，3轮噬菌体淘洗的富集情况详见表2，计算3轮噬菌体淘洗的投入产出比如图6所示，最终获得了与SARS-CoV-2S蛋白结合的噬菌体颗粒。
表2淘洗投入产出比
7、候选合成纳米抗体的鉴定
将第3轮淘洗产出的噬菌体颗粒感染TG1感受态细胞并涂板，过夜培养后，挑取384个阳性菌落进行扩增和测序。菌落扩增并制备384个克隆噬菌体上清，然后利用噬菌体ELISA测定结合活性，结果表明，与阴性对照相比，384个克隆噬菌体上清阳性结合的为182个，阳性率为47.39%，如图7所示，去除重复序列后，RBD-WT筛选所得共26个，OmicronS蛋白共3个，OmicronRBD共2个，SARS共17个，共获得48个不同的合成纳米抗体序列用于测定交叉结合活性，384个克隆的序列的1条序列重复出现51次出现频率最高，占比为13.28%。
与VHH相比，在与人IgGFc结构域融合后，Fc融合的纳米抗体的中和活性提高了10倍。接着，我们将48个候选合成纳米抗体进行真核表达制备。首先是真核表达质粒的构建，通过PCR扩增钓取了48个合成纳米抗体基因，DNA凝胶电泳结果如图8所示，然后经分子克隆构建和测序鉴定后，成功获得了48个候选分子真核表达质粒，将其转染至293T细胞，进行瞬时表达，获得48个候选合成纳米抗体的瞬时表达上清。最后，我们利用结合ELISA测定了48个表达上清与SARS、SARS-CoV-2、Delta和Omicron的S蛋白的结合活性。依据结果（图9）选取结合活性最强11个候选分子，分别为RBD-C1、RBD-C4、RBD-C6、RBD-C7、RBD-D10、SARS-C1、SARS-G1、SARS-F3、OS-E1、OS-E2和OS-E6（挑取噬菌体阳性克隆的编号），11个候选分子CDR3的氨基酸分布如图10所示。
将上述11个候选合成纳米抗体进行真核表达，经蛋白纯化后获得纯度较高的候选合成纳米抗体，纯度达到95%以上，符合用于下游功能评价的纯度标准。为确定候选纳米抗体，我们测定了11个候选分子与5种S蛋白（SARS、SARS-CoV-2、Alpha、Delta和Omicron）的结合活性，结果如图11所示，结果表明：11个候选分子中，RBD-C7保留了与3种S蛋白的结合活性，而SARS-F3与4种S蛋白均具有较高的结合活性。假病毒中和活性的测定结果如图12所示，结果表明SARS-F3展现出更加广谱的假病毒中和活性，且均具有浓度依赖效应。综合以上筛选结果，确定SARS-F3为纳米抗体合成库筛选所得的广谱抗冠状病毒纳米抗体，并正式命名为S009-F3，S009-F3的序列信息如表3所示。
表3 抗体序列
实施例2候选纳米抗体的生物活性评价
一、实验方法
1、候选纳米抗体的分子模拟
针对获得的纳米抗体 S009-F3可变区氨基酸序列，选择蛋白质结构数据库经序列比对分析 BlastP（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）确定纳 米 抗 体 的 最 佳 结 构模 板 。 通 过 在 线 模 拟 软 件 swissModel搭建抗体 S009-F3的空间结构。在 CVFF力场下，选择 Discovery Studio 2000 软件包中的 Discover 程序对抗体 S009-F3的空间结构进行最小化处理。
2、间接 ELISA 测定候选纳米抗体的抗体特异性
（1）包被：2 μg/mL蛋白（分别为：PD-1、PD-L1、h-FGL1、ROR1、CD27、ACE2、Her2、CGRP、PCSK9、αvβ8、Siglec15、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-229E、TNF-α、SEB、CD20、EBOV-sGp 和 SARS-CoV-2），100 μL/孔，4℃，过夜，PBST洗3次。（2）封闭：4%脱脂牛奶，200 μL/孔，37℃，1 h，PBST洗3次。（3）加样品：候选纳米抗体（S009-F3），2 μg/mL，100 μL/孔，37℃，1h，PBST洗3次。（4）加检测抗体：GAH-HRP，100 μL/孔，37℃，30 min，PBST洗3次。（5）显色：TMB，100 μL/孔，90 s。（6）终止：2NH2SO4，100 μL/孔。（7）数据获取：酶标仪读取 OD 450nm数值，保存数据。
3、间接ELISA测定候选纳米抗体与S蛋白的结合活性
（1）分别包被SARS、SARS-CoV-2及变异株S或RBD蛋白（1 μg/mL），100 μL/孔，4℃，过夜，PBST洗3次。（2）封闭：4%脱脂牛奶，200 μL/孔，37℃，1 h，PBST洗3次。（3）加样品：将候选纳米抗体稀释至初始浓度为100 nM，设置S309为对照抗体，3倍稀释，12个梯度，100 μL/孔，37℃，1 h，PBST洗3次。（4）加检测抗体：GAH-HRP，100 μL/孔，室温，45 min，PBST洗3次。（5）显色：TMB，100 μL/孔，90 s。（6）终止：2NH2SO4，100 μL/孔。（7）数据读取：酶标仪读取OD450nm数值，保存数据。（8）数据处理：分析和拟合数据。
4、BLI测定候选纳米抗体与S蛋白结合的亲和力
将待测分子用运行缓冲液稀释至 10 μg/mL，Protein A 探针分别捕获候选纳米抗体及对照抗体（S009-F3、S309和ACE2-Fc），时间设置为90 s；分析物SARS、SARS-CoV-2及其变异株S或RBD蛋白同样用运行缓冲液梯度稀释至一定的浓度（100 nM、50 nM、25 nM、12.5 nM、6.25 nM、3.125 nM 和1.56 nM），设置待测分子与分析物结合时间180 s，解离时间240 s；探针的再生：10 mM甘氨酸 HCl（pH=1.7）溶液，脉冲5s，重复3次。将测定数据拟合成1:1结合模型，并计算平衡解离常数KD。
5、竞争ELISA测定候选分子与ACE2竞争活性的测定
（1）分别包被SARS、SARS-CoV-2及变异株S蛋白，1 μg/mL，100 μL/孔，4℃，过夜，PBST洗3次。（2）封闭：4%脱脂牛奶，200 μL/孔，37℃，1 h，PBST 洗3次。（3）样品稀释：将候选纳米抗体稀释至初始浓度为 500 nM，3倍稀释，12个梯度。
（4）加样品：50 μL/孔ACE2-biotin（2 μg/mL）溶液与候选纳米抗体按1:1 混合，37℃，1 h，PBST洗3次。（5）加检测抗体：Streptavidin-HRP，100 μL/孔，37℃，30 min，PBST洗3次。（6）显色：TMB，100 μL/孔，90 s。（7）终止：2NH2SO4，100 μL/孔。（8）数据读取：酶标仪读取OD450nm 数值，保存数据。分析结合情况。
6、候选纳米抗体的HIV假病毒中和活性测定
将候选纳米抗体稀释不同的起始浓度后，进行4倍稀释9个梯度，参照实施例1实验方法第8点。
7、候选纳米抗体的可复制型VSV假病毒中和活性测定
（1）细胞培养：将Vero-E6细胞培养至对数生长期，以1×104个/孔铺于96 孔细胞培养板，培养18-20 h。（2）样品稀释：将候选纳米抗体和对照抗体S309 稀释5个浓度，依次为15 μg/mL，5 μg/mL，0.5 μg/mL，0.1 μg/mL和0.01 μg/mL。（3）预孵育：将步骤（1）中的样品与可复制型VSV假病毒混合后，37℃，孵育1 h。（4）弃去Vero-E6细胞培养上清，将步骤（3）中的样品加至细胞中。（5）36 h 后，倒置荧光显微镜拍照，并保存图片。
8、候选纳米抗体的可复制型VSV假病毒感染的预防效果评价
（1）将叙利亚金黄地鼠于SPF级动物房饲养7-10天，记录体重并观察有无脱毛等异常，以适应饲养环境，待叙利亚金黄地鼠体重约为100 g时，根据体重大小，利用随机数表法进行随机分组。（2）分组方案：PBS组、S309（10 mg/kg）组、S009-F3（10 mg/kg）组和无关对照组，每组5只。（3）给药及测量方案：将待测样品用PBS稀释成对应的浓度，腹腔注射，12 h后，感染VSV可复制型假病毒（Delta 或 Omicron），12 h（Omicron）或 24 h（Delta）后第一次采取血样测定纳米荧光素酶活性，并将小鼠麻醉后进行荧光成像拍照，而后每隔24 h 采样，第7天时，将老鼠安乐死。利用 GraphPad Prism 9软件分析数据，采用的统计学方法为One-way ANOVA。
9、候选纳米抗体的真病毒中和活性的测定
（1）细胞培养与铺板：将Vero-E6细胞培养至对数生长期，以1×104个/孔铺至96孔细胞培养板中，培养18-20 h，待其长至约80%时备用。（2）样品稀释：首先将样品的初始浓度稀释至4000 nM，然后，按照4倍倍比稀释获得8个稀释梯度，依次为4000 nM、1000 nM、250nM、62.5 nM、15.63 nM、3.91nM、0.98 nM、0.24 nM，IgG 同型对照仅设置最高浓度（4000nM）。（3）将每个稀释度样品100 μL分别与100 μL滴度为103×TCID50的病毒（SARS-CoV-2、Delta 或 BA.2）混匀，此时，样品终浓度为2000 nM、500 nM、125 nM、31.25 nM、7.82 nM、1.96 nM、0.49 nM和0.12 nM，5% CO2，37℃，孵育1 h。（4）DMEM 培养基洗 2次，弃去上清液。（5）将100 μL步骤（4）中各稀释度的混合液加入到96孔板中，补加100 μL含4% FBS DMEM 培养基，设置3个复孔，同时设立阳性和阴性对照以及IgG同型对照。（6）5% CO2，37℃培养72h，显微镜下观察致细胞病变效应（Cytopathic effect，CPE）并拍照。
10、竞争ELISA测定候选分子的识别表位
（1）包被：SARS、SARS-CoV-2及其变异株S或RBD蛋白，1 μg/mL，100 μL/孔，4℃，过夜，PBST洗3次。（2）封闭：4%脱脂牛奶，200 μL/孔，37℃，1 h，PBST洗3次。（3）加样品：50 μL/孔的生物素化的ZF-B11分别与候选纳米抗体按1:1混合，37℃，1 h，PBST洗3次。（4）加检测抗体：Streptavidin-HRP，100 μL/孔，37℃，30 min，PBST洗3次；（5）显色：TMB，100 μL/孔，90 s。（6）终止：2NH2SO4，100 μL/孔。（7）数据读取：酶标仪读取 OD450nm 数值，保存数据。（8）数据处理：分析结合情况。
二、实验结果
1、候选纳米抗体的空间理论结构及潜在的评估分析
通过与PDB数据库的序列比对，确定了与获得的纳米抗体S009-F3的最佳结构模板为7NOW，其序列相似性为80.47%。经计算机辅助同源模建技及力学优化获得的稳定构象如图13所示，S009-F3中存在CDR1与CDR3正常的二硫键模式，CDR3区长度较长，连接FR3和FR4的茎环部被CDR1和CDR2包围，CDR3核心部位暴露在外侧，能够以纳米抗体突出结构模式识别RBD结构。
2、候选纳米抗体的特异性分析
抗体的特异性是指抗体只能与其靶标抗原结合的专一性能。为验证候选纳米抗体的特异性，我们利用间接ELISA测定了候选纳米抗体分别与非SARS、SARS-CoV-2及其变异株S蛋白的18种其他靶标蛋白的结合活性，包括EBOV表面蛋白、SEB、10种人体细胞表面蛋白、3种其他冠状病毒和3种体内其他分子蛋白。从结果图14可以看出，候选纳米抗体仅与SARS-CoV-2RBD蛋白结合，而与18种其他靶标蛋白均不结合。在一定程度上提示候选纳米抗体与其他蛋白（包括β冠状病毒属的其他3种蛋白：HCoV-229E、HCoV-HKU1和HCoV-NL63）不存在明显的交叉，证明了S009-F3与SARS、SARS-CoV-2及其变异株的识别具有特异性。
3、候选纳米抗体与SARS、SARS-CoV-2S蛋白的结合活性
利用间接ELISA评价候选纳米抗体与SARS、SARS-CoV-2及主要变异株S蛋白的结合活性。由于Omicron变异株累积大量突变，与前期变异株明显不同，所以，按Omicron出现前后来展示实验结果。图15所示的结果表明，阳性对照抗体S309仅能与Omicron出现之前的变异株结合，却丧失了与Omicron及其亚谱系变异株的结合活性。与S309相比，候选纳米抗体表现出更广谱的结合活性，S009-F3与SARS、SARS-CoV-2及前4种VOC变异株均有较好的结合，EC50值在1-8nM之间，而与Omicron及其亚谱系的变异株S蛋白的结合活性有所降低，EC50值在2-28nM之间。候选纳米抗体结合活性的EC50值见表4。
表4候选纳米抗体结合活性的EC50值（nM）
4、候选纳米抗体与SARS、SARS-CoV-2S蛋白的亲和力
借助BLI测定抗原-抗体结合后在探针表面反射干涉光谱的信号改变，以计算抗体的亲和力常数，并采用GatorPrime非标记生物分析系统来测定候选纳米抗体与8种突变株RBD蛋白的亲和力。BLI测定的结果表明，与ELISA结合活性测定所得结果相似，候选分子与RBD蛋白的亲和力如表5所示，S009-F3与SARS-CoV-2的亲和力强于ACE2，而与Omicron及其亚谱系的变异株亲和力较弱，亲和力常数在20-1000nM之间。
表5 候选纳米抗体与 S 蛋白结合的亲和力常数（nM）
5、候选纳米抗体竞争性阻断ACE2与S蛋白相互作用
为明确候选纳米抗体是否通过阻断SARS、SARS-CoV-2及变异株S蛋白与ACE2的结合来发挥生物学功能，我们利用竞争ELISA测定了候选纳米抗体的竞争阻断活性。图16所示的结果表明，在Omicron之前的变异株（共6种）方面，S009-F3能有效的抑制S蛋白与ACE2的结合，且具有浓度依赖效应。在Omicron及其亚谱系变异株方面，由于S009-F3的结合活性降低，与结合ELISA结果一致的是，其丧失了阻断Omicron及变异株S蛋白与ACE2结合的作用，但在竞争ACE2与BA.5的结合时，显现出较弱的阻断效应。由以上结果可知，S009-F3是通过竞争性阻断ACE2与S蛋白相互作用而发挥功能。
6、候选纳米抗体的HIV假病毒中和活性
我们已建立了18种HIV骨架的荧光素酶报告基因的假病毒系统，用于评价候选纳米抗体的中和活性。由图17所示的结果可知，S009-F3对Omicron出现之前的变异株均具有较强的中和效应，IC50值均小于50nM，而对Omicron及其后的变异株的中和活性有所降低，仅在较高浓度（>100nM）时展现出较弱的中和活性。上述结果证明候选纳米抗体具有较好的中和活性。
7、候选纳米抗体的广谱可复制型VSV假病毒中和活性
为更加直观地检测纳米抗体抑制病毒感染细胞的过程，我们获得了基于VSV骨架的可复制型假病毒系统（不仅能够感染细胞，其基因组能够借助宿主细胞复制并释放假病毒颗粒），该系统在感染细胞后会通过绿色荧光蛋白（GFP）的表达活性来反应病毒感染的强弱，主要包括SARS-CoV-2、Delta和Omicron。由荧光显微镜拍照的结果可知，候选纳米抗体抗病毒活性与HIV假病毒系统测定的基本一致，具体而言，在SARS-CoV-2假病毒评价（图18）中，包括对照抗体S309在内的抗体均表现出一定的中和活性，且浓度为15μg/mL时中和效应较为明显。
抑制可复制型Delta假病毒进入细胞方面（图19），纳米抗体表现出一定的中和效应，且15μg/mL的S009-F3，几乎完全抑制假病毒感染细胞。值得注意的是，Delta假病毒感染的细胞明显增大，这也与之前报道的Delta毒株的S蛋白会诱导合胞体的形成一致，表明所构建的VSV-GFP-Delta假病毒与真病毒在感染后细胞形态方面具有高度相似性。
8、候选纳米抗体的可复制型VSV假病毒的预防和治疗效果
为评估候选纳米抗体的体内中和活性，我们获得了含纳米荧光素酶报告基因的可复制型VSV假病毒感染叙利亚金黄地鼠的动物模型，观察VSV-nLuc-Delta或VSV-nLuc-Omicron假病毒的体内感染情况，并通过纳米荧光素酶水平动态监测新冠假病毒在金黄地鼠体内发光和分布情况。首先，验证了候选纳米抗体对VSV-nLuc-Delta假病毒感染的影响，结果如图20所示，与空白对照组和同型对照组相比，预先腹腔注射候选纳米抗体S009-F3能有效保护VSV-nLuc-Delta假病毒感染叙利亚金黄地鼠且由血清纳米荧光酶的测定结果如图20所示，由结果可知，在感染VSV-nLuc-Delta的第48h的血清纳米荧光素酶的水平达到峰值，与同型对照抗体（LXY8）组相比，感染48h时，S009-F3能显著抑制血清纳米荧光素酶的表达，P值为0.0003，且在感染假病毒96h，S009-F3组的血清纳米荧光素酶水平明显低于S309组（P=0.0123），进一步证明S009-F3能有效抑制假病毒进入叙利亚金黄地鼠的体内细胞，且S009-F3的保护效果略强于对照抗体S309。
9、候选纳米抗体的真病毒中和活性
理论上，假病毒中和活性的强弱能在一定程度上反应候选纳米抗体对真病毒的中和效果，但二者表面S蛋白的数量差异且真病毒在宿主不断复制和释放，因此，开展纳米抗体真病毒中和活性的研究是十分必要的。我们进一步在BSL-3实验条件下验证了候选纳米抗体的真病毒中和活性，主要包括SARS-CoV-2、Delta和BA.2。真病毒的对细胞感染程度依据CPE评价病毒感染导致的细胞损伤程度，并拍照记录。如图21所示的结果可知，S009-F3对3种病毒均具有中和活性，浓度为250nM时，S009-F3具有较好的SARS-CoV-2和Delta中和效应，但仅在浓度为4000nM时能中和BA.2。候选纳米抗体对不同真病毒中和活性能力如表6所示。
表6 候选纳米抗体对真病毒感染的CPE的影响
注：“++++”代表 CPE 严重，“+++”代表 CPE 中等，“++”代表 CPE 轻度，“+”代表CPE 较轻微，“--”代表无 CPE
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种广谱性抗SARS和SARS-CoV-2的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体的名称为单域抗体S009-F3，包含：SEQ ID NO：1所示的重链可变区CDR1、SEQ ID NO：2所示的重链可变区CDR2、SEQ ID NO：3所示的重链可变区CDR3。
2.根据权利要求1所述的单域抗体，其特征在于，所述单域抗体S009-F3重链可变区具有与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少90%序列一致性。
3.一种分离的多核苷酸或包含其的载体，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1-2任一项所述的单域抗体。
4.一种已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体，其特征在于，所述已改造的宿主细胞能够表达权利要求1-2任一项所述的单域抗体，或已改造的宿主细胞包括权利要求3所述的多核苷酸或包含其的载体。
5.一种广谱抗SARS和SARS-CoV-2 的单域抗体衍生物，其特征在于，所述单域抗体衍生物包含权利要求1-2任一项所述的单域抗体直接或间接的偶联到可检测标记物或药物形成的复合物。
6.一种检测SARS和SARS-CoV-2 的S蛋白的产品，其特征在于，所述产品包含权利要求1-2任一项所述的单域抗体、权利要求3所述的多核苷酸或包含其的载体、权利要求4所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体、或权利要求5所述的单域抗体衍生物。
7.权利要求1-2任一项所述的单域抗体、权利要求3所述的多核苷酸或包含其的载体，或权利要求4所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备检测SARS和SARS-CoV-2 的S蛋白或诊断SARS和SARS-CoV-2病毒感染的产品中的应用。
8.权利要求1-2任一项所述的单域抗体、权利要求3所述的多核苷酸或包含其的载体，或权利要求4所述的已改造的宿主细胞或包含其的宿主细胞群体在制备预防或治疗SARS和SARS-CoV-2病毒感染的药物中的应用。
9.一种体外抑制SARS和SARS-CoV-2的S蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求3所述的多核苷酸或包含其的载体导入到生物体细胞中，表达权利要求1-2任一项所述的抗体，或直接将权利要求1-2任一项所述的单域抗体导入到生物体细胞中，抑制SARS和SARS-CoV-2的S蛋白的活性。
10.一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中SARS和SARS-CoV-2 的S蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将待测样品与权利要求1-2任一项所述的单域抗体，或将待测样品与权利要求5所述的单域抗体衍生物接触；检测SARS和SARS-CoV-2 的S蛋白与权利要求1-2任一项所述的单域抗体，或权利要求5所述的单域抗体衍生物的复合物的形成。
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